Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la B-N-acetilhexosaminidasa en distintos medios biológicos

UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Departamento de Bioquímica y Biología Molecular ESTUDIO TERMODINÁMICO DE LA HETEROGENEIDAD ENZIMÁTICA DE LA β -N-ACETILHEXOSAMINIDASA EN DISTINTOS MEDIOS BIOLÓGICOS TESIS DOCTORAL EN FARMACIA José Antonio Casal Antelo Santiago de Compostela, Junio 2009 D. Germán Sierra Marcuño, Catedrático emérito de la Facultad de Medicina, como PONENTE de la Tesis Doctoral de D. José Antonio Casal Antelo, titulada: “Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la β-Nacetilhexosaminidasa en distintos medios biológicos”, realizada bajo la dirección de los Drs. José Carlos Tutor Valcarce y Juan Manuel Paz Fernández, cumple las condiciones exigidas para optar al grado de Doctor. Santiago de Compostela Junio de 2009 Fdo.: Germán Sierra Marcuño D. José Carlos Tutor Valcarce, Doctor en Farmacia, y D. Juan Manuel Paz Fernández, Doctor en Ciencias Químicas Hacen constar: Que el trabajo de investigación recogido en la presente Memoria titulada “Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la β-Nacetilhexosaminidasa en distintos medios biológicos”, presentada por D. José Antonio Casal Antelo para optar al Grado de Doctor en Farmacia, ha sido realizado bajo nuestra dirección en el Laboratorio Central del Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela, y consideramos que cumple los requisitos exigidos para ser juzgada por el tribunal correspondiente. Santiago de Compostela, Junio de 2009. Dr. José Carlos Tutor Valcarce Dr. Juan Manuel Paz Fernández AGRADECIMIENTOS Al Dr. J. Carlos Tutor Valcarce, que me propuso el tema de investigación desarrollado, por todas sus enseñanzas y estímulos durante la realización de este proyecto. Al Dr. J. Manuel Paz Fernández por su inestimable colaboración y su continuo ejemplo de rigor y perseverancia. Quisiera agradecer a los dos el haber depositado en mí su amistad y confianza al permitirme trabajar a su lado y poner todo su empeño y los medios necesarios para que este trabajo llegara a buen término. A mi mujer y mi hijo por su paciencia, su compañía y por saber renunciar a todo el tiempo que no he podido dedicarles. A mis padres que siempre me han alentado y servido de apoyo en los momentos de desánimo. Al Dr. LF Pérez del Laboratorio Central del Hospital Clínico de Santiago por su ayuda en el desarrollo y puesta a punto de las técnicas termodinámicas y cromatográficas utilizadas para el estudio de la heterogeneidad enzimática de la β-Nacetilhexosaminidasa. Al Dr. J Hermida del Laboratorio Central del Hospital Clínico de Santiago por su colaboración en el estudio del efecto de la proteólisis parcial de las formas enzimáticas precursoras y maduras de la β-N-acetilhexosaminidasa sobre la energía de activación. A la Dra. MC Sá Miranda y al Dr. R Pinto de la Unidade de Enzimología del Instituto de Genética Médica "Jacinto Magalhaes" de Oporto por su colaboración en el estudio de pacientes con gangliosidosis GM2 variante B1. Al Dr. Jesús García Devesa del Laboratorio Central del Hospital Clínico de Santiago por su colaboración en el estudio de los plasmas seminales. Al Dr. X. Lens del Servicio de Nefrología del Hospital Clínico de Santiago por su colaboración en el estudio de pacientes con poliquistosis renal. A la Dra. Olga Louro del Laboratorio del Hospital Gil Casares por haberme animado y apoyado durante la realización de este trabajo. A todo el personal del Laboratorio Central del CHUS (auxiliares, ATS, técnicos, residentes y adjuntos), que siempre han estado dispuestos a colaborar con agrado en este trabajo y especialmente a mis amigos y compañeros Julio Rodríguez y Javier Fernández. Acercaos hasta el borde. Podríamos caernos. Acercaos hasta el borde. ¡Está demasiado alto!. Acercaos hasta el borde. Y ellos se acercaron. Y El los empujó. Y ellos volaron. Fragmento del poema “Acércate al borde” de Cristopher Logue. INTRODUCCIÓN Introducción 3 La energía de activación como marcador de heterogeneidad enzimática Desde un punto de vista termodinámico, la magnitud que determina si una reacción química puede tener lugar espontáneamente es el cambio de energía libre de Gibbs (ΔG), que expresa la capacidad del sistema para realizar trabajo. Para que la transformación química de un substrato S en un producto de la reacción P pueda tener lugar de forma espontánea, ΔG (GP-GS) ha de ser negativo (reacción exoergónica), es decir que la energía libre asociada a P (GP) debe ser menor que la asociada a S (GS), y su magnitud fija las concentraciones relativas de S y P cuando se alcanza el estado de equilibrio. Sin embargo, el que una reacción química pueda tener lugar en base a criterios termodinámicos no implica que pueda hacerlo a una velocidad apreciable. Según la teoría del estado de transición, la transformación de S en P tiene lugar a través de un estado intermedio de transición (S≠), en equilibrio con S y presentando una energía libre mayor. La diferencia entre la energía libre de S≠ y S es por tanto siempre positiva y se denomina energía de activación (Ea), y constituye una barrera energética para el transcurso de la reacción entre S y P. Sólo las moléculas de S que posean un exceso de energía suficiente como para salvar la barrera energética y llegar a S≠, pueden llegar a formar el producto de reacción P. Evidentemente, la proporción de moléculas de S capaces de cumplir este requerimiento es tanto menor cuanto mayor sea la Ea para la reacción considerada. Estas variables termodinámicas que explican la dirección y extensión de una reacción química, han de ser consideradas, incluso a nivel docente (1), al tratar de la acción enzimática en las distintas vías metabólicas. Como cualquier catalizador, las enzimas aceleran las reacciones químicas disminuyendo la Ea asociada al estado de transición, existiendo por tanto un mayor número de moléculas de S con una energía suficiente que les permita salvar la barrera energética de S≠ y tenga lugar la reacción para formar P. Como las enzimas no modifican la naturaleza de P, la ΔG asociada a una reacción determinada es idéntica en presencia o ausencia de la enzima; asimismo, ΔG determina la constante de equilibrio de la reacción, y los sistemas enzimáticos únicamente aumentan la velocidad con que se alcanza dicho equilibrio. Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 4 De acuerdo con Arrhenius, la determinación de la Ea aparente se basa en la dependencia de la actividad enzimática con la temperatura (2): ln Kcat= -Ea/RT + ln A= ln (U/L), donde Kcat es la constante de la reacción catalizada por la enzima, Ea la energía de activación aparente (kJ/mol), R la constante de los gases (8.3143 x 10-3 kJ/mol x grado), T la temperatura absoluta (ºK) y A el factor de colisión. En las condiciones usuales de las reacciones enzimáticas Kcat puede ser sustituida por la actividad catalítica (U/L), y el factor de colisión se asume que es constante para el intervalo 293-313 ºK. En la parte lineal de la representación de ln actividad (U/L) frente al inverso de la temperatura (1/T) puede calcularse la Ea aparente a partir de la pendiente b de la ecuación determinada por regresión lineal: -Ea/RT= b/T; Ea= -8.13143 x 10-3 x b (kJ/mol). La proporcionalidad entre la cantidad de enzima y su actividad catalítica es un requisito necesario para la utilización de la actividad enzimática como ayuda en el diagnóstico clínico. Esta proporcionalidad depende del pH, fuerza iónica y temperatura del medio de reacción, presencia de activadores etc, por lo que estas variables deben ser estandarizadas, pero además el factor de proporcionalidad depende también de la estructura tridimensional de la molécula enzimática, cuya alteración puede conducir a su inactivación o incluso su desnaturalización irreversible. La proporcionalidad puede también ser afectada por la participación simultánea de distintas isoenzimas con diferentes actividades catalíticas específicas (actividad catalítica por unidad de masa de proteína enzimática). Como la frecuencia de colisión entre las moléculas de S para que tenga lugar la formación de P puede considerarse constante, la cantidad (concentración) de enzima puede ser calculada a partir de la actividad catalítica y la Ea (3). Una elevada Ea equivale a una baja actividad catalítica específica, y la variación de Ea tiene un efecto mucho mayor sobre la actividad catalítica específica que la variación del factor de frecuencia de colisión (3). Los estudios termodinámicos, preferentemente de la Ea, han mostrado su interés en enzimología, tanto desde un punto de vista práctico como puramente académico. Hace años se concedió un gran interés al estudio termodinámico de reacciones enzimáticas con vistas a una posible relación con la adaptación bioquímica de las especies a las condiciones de temperatura (4, 5). Las enzimas de los animales ectotermos (de sangre fría) son más eficientes para reducir la barrera energética (menor Ea), que los sistemas enzimáticos homólogos de las aves y mamíferos (homeotermos), lo que podría ser debido Introducción 5 a diferentes cambios conformacionales de la proteína durante la catálisis (4). Asimismo, para distintas especies de peces se ha descrito una correlación positiva significativa de las Ea de una ATPasa miofribilar con las temperaturas del medio en que habitan, aunque también podría sugerirse una explicación no directamente relacionada con la evolución (5). En el campo de la enzimología clínica, la determinación de la Ea de distintas enzimas de utilidad diagnóstica ha aportado datos de indudable interés. A continuación se hace una síntesis de los datos bibliográficos previamente publicados sobre el tema. Creatina-quinasa (CK, EC 2.7.3.2) La CK es una enzima con localización mayoritariamente citosólica, presentando una estructura dimérica compuesta por subunidades polipeptídicas B (cerebro) y M (músculo), y habiéndose caracterizado las tres isoenzimas posibles: CKBB (predominante en cerebro), CKMB (predominante en músculo cardiaco y esquelético), y CKMM (predominante en músculo esquelético). Modificaciones post-traduccionales de la CK conducen a una mayor heterogeneidad enzimática con la existencia de tres isoformas de la CKMM y dos de la CKMB. Las formas tisulares CKMM3 y CKMB2 son transformadas después de su cesión a la circulación por la N-carboxipeptidasa plasmática formándose las isoformas CKMM2, CKMM1 y CKMB1 respectivamente. Los estudios de Hagelauer y cols (3, 6) pusieron de manifiesto un aumento de la Ea para las distintas isoenzimas de la CK en el orden CKMM (49 kJ/mol), CKMB (58 kJ/mol) y CKBB (62 kJ/mol), un orden isoenzimático coincidente con el obtenido para su termolabilidad (3). En mezclas de isoenzimas CKMM y CKBB se encontró una adecuada concordancia entre los valores experimentales y los calculados para la Ea aparente (3), lo que permitiría estimar la proporción relativa de ambas isoenzimas en función de la Ea; sin embargo, el asunto se complica al considerar la posible presencia en la mezcla de la isoenzima CKMB con una Ea intermedia. En el envejecimiento in vitro durante 72h a 37ºC en una matriz sérica en condiciones fisiológicas de pH, las isoenzimas CKMM y CKMB, presentan una disminución de su actividad catalítica (inactivación) acompañada de un aumento gradual de las Ea, sin que se encontrasen cambios significativos para las concentraciones estimadas de ambas isoenzimas (3). Consecuentemente, la inactivación de la CK podría ser explicada por una disminución de la actividad catalítica específica debida a la formación de una mezcla de formas enzimáticas intermedias más o menos inactivas, y no de acuerdo con un proceso Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 6 de todo o nada (3). Si así fuese, moléculas enzimáticas normales activas podrían coexistir con moléculas completamente inactivas, y dado que estas no contribuirían a la transformación del substrato y al incremento de velocidad temperatura-dependiente de la reacción, la Ea se mantendría constante. En pacientes con infarto de miocardio la concentración estimada de CK total aumentó inicialmente de forma paralela a la actividad catalítica, pero alcanzando el máximo aproximadamente 24h más tarde y disminuyendo después más lentamente que la actividad enzimática (6). Asimismo, se encontró un aumento gradual de la Ea aparente desde un valor aproximado de 51 kJ/mol inmediatamente después del infarto hasta 68 kJ/mol tres días después (6, 7), presentando un perfil coincidente con el obtenido en el estudio de inactivación por envejecimiento in vitro (6). El posible efecto de distintas proporciones de isoenzima CKMB con respecto a la CK total sobre el valor de Ea aparente es despreciable, debido a su pequeña actividad catalítica comparada con la de la isoenzima CKMM, pudiendo establecerse que el aumento de Ea se debería a modificaciones de la subunidad M (7). La CKMM cedida al plasma sería la forma nativa CKMM3 (49.8 kJ/mol), con la consiguiente transformación en CKMM2 (60.3 kJ/mol) y CKMM1 (67.5 kJ/mol) (7). La evolución de la actividad sérica de CK en pacientes con infarto miocárdico, es el resultado del solapamiento de dos procesos: el escape de la enzima al medio extracelular y su inactivación en el compartimento plasmático, existiendo una correlación entre la concentración enzimática y la actividad catalítica únicamente en la fase inicial post-infarto (6). Delanghe y cols (8), encontraron que durante las 4-72h post-infarto la actividad específica de la isoenzima CKMB disminuía desde 0.88 U/μg hasta 0.71 U/μg, al tiempo que la Ea aumentaba desde 53.4 kJ/mol hasta 66.5 kJ/mol. Este incremento de la Ea es consistente con la desnaturalización de esta isoenzima después de su cesión al plasma; sin embargo, la disminución de la actividad específica es menor que la que podría esperarse en función del aumento de Ea observado, sugiriendo que los cambios conformacionales inducidos en la CKMB son multifactoriales (8). Tanto en músculo cardíaco como esquelético la CK puede estar parcialmente glicada con manosa, galactosa y N-acetil-glucosamina en su porción glucídica, y residuos terminales de ácido siálico y sulfato. Como han demostrado Langlois y cols (9), las formas glicadas de la CK sérica presentan una Ea significativamente mayor que las formas no glicadas (105.6 kJ/mol vs 58.1 kJ/mol). Asimismo, la glicación de la CK cardíaca y Introducción 7 muscular está asociada con un aumento de la Ea, existiendo una correlación significativa de la unión relativa de la CK a las lectinas concanavalina A (r= 0.911) y Ricinus communis (r= 0.912) con la Ea (9). La presencia de restos ácido siálico y sulfato contribuyen a la estabilidad de la molécula glicada de CK, y el tratamiento de las muestras con neuraminidasa o sulfatasa conduce a una disminución de la actividad catalítica CK, con aumento de la Ea y de la unión a la lectina Ricinus communis (9). De acuerdo con Langlois y cols (9), la Ea de la CK sérica presentaría una disminución transitoria en el curso de las primeras 12 horas después de infarto miocárdico o trauma muscular, que correspondería a la perdida de la porción glucídica de las formas enzimáticas tisulares durante su transporte a la circulación. A esta disminución inicial de la Ea, seguiría un progresivo aumento de la Ea en función del envejecimiento de CK, de acuerdo con el concepto general de la desnaturalización de enzimas tisulares después de su cesión al medio extracelular (3, 6). Con el término de macroenzimas se denomina a formas enzimáticas séricas presentando una masa molecular mucho mayor que la de la enzima correspondiente normalmente encontrada tanto en condiciones fisiológicas como fisiopatológicas (10, 11). Estas formas macromoleculares pueden formarse por asociación de la enzima con inmunoglobulinas (generalmente IgG e IgA y sólo ocasionalmente IgM), denominadas macroenzímas tipo 1, o bien por asociación con otros componentes séricos (lípidos, fragmentos celulares…) o por polimerización de la propia molécula enzimática, denominadas macroenzimas tipo 2. Como estas formas son aclaradas mucho más lentamente que las correspondientes enzimas, se acumulan en plasma, con el resultado de una aumentada actividad catalítica y una posible interpretación diagnóstica errónea, lo que concede un gran interés a la detección y caracterización de macroenzimas en el laboratorio clínico. Se ha descrito la posible formación de macroenzimas de la CK tanto de tipo 1 como de tipo 2. La macro-CK tipo 1 es un complejo de la CK con inmunoglobulinas, mientras que la más infrecuente macro-CK tipo 2 es probablemente la forma oligomérica de la enzima mitocondrial, y detectada en suero de pacientes con intensa degradación tisular por tumores (12). La prevalencia de una elevada actividad CK debida a macro-CK tipo 1 es de aproximadamente el 2%, habiéndose recomendado la introducción de una prueba para su detección sistemática, como puede ser la precipitación con polietilen-glicol que es relativamente especifica para la precipitación de los complejos con inmunoglobulinas (12). Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 8 Ambos tipos de macro-CK pueden ser evidenciados en suero humano mediante cromatografía de exclusión, pero no diferenciados entre si. Stein y cols describieron un procedimiento para diferenciar los tipos de macro-CK basado en sus diferentes Ea (13). Para la macro-CK tipo 1 (CKBB-IgG) encontraron una Ea= 53 kJ/mol, un valor semejante de la CKBB con una Ea= 58 kJ/mol. Para la macro-CK tipo 2 una Ea= 142 kJ/mol, semejante a las obtenidas para la CK mitocondrial de corazón (142 kJ/mol) y de músculo esquelético (130 kJ/mol). La comparación de los resultados obtenidos en 22 sueros normales, 31 macro-CK tipo 1 y 25 macro-CK tipo 2, permitió a estos autores concluir que, tras obtener en la prueba de inactivación térmica (20 min a 45ºC) una actividad catalítica residual >50%, una Ea <75 kJ/mol indicaría una macro-CK tipo 1, mientras una Ea> 75 kJ/mol una macro-CK tipo 2 (13). α-Amilasa (AMIL, EC 3.2.1.1) La AMIL es una endoglucosidasa que forma parte de la secreción exocrina del páncreas y glándulas salivales. Presenta dos isoenzimas la pancreática (AMILP) y la salival (AMILS), que son codificadas por dos genes distintos, si bien se pueden encontrar diferentes formas moleculares para cada una de las dos isoenzimas, resultado de modificaciones post-traduccionales (desaminaciones,glicosilaciones o desglicosilaciones). Hafkenscheid y Hessels encontraron una considerable variación para la Ea de la AMIL sérica al utilizar distintos substratos, y sugirieron que a esta variabilidad podría contribuir la proporción relativa de las isoenzimas (14). En efecto, estos autores encontraron en 12 sueros unos valores medios para las Ea de la AMIL total de 40.7 kJ/mol, para la AMILP de 44.8 kJ/mol y para la AMILS de 38.1 kJ/mol (14). Las Ea obtenidas para las dos isoenzimas séricas son análogos a los valores encontrados para esta variable termodinámica en las formas tisulares purificadas de AMILP (45.0 kJ/mol) y AMILS (40.1 kJ/mol) (15). El hecho de que no se encontrase una diferencia significativa entre las Ea de las isoenzimas séricas y las formas purificadas, demuestra la buena estabilidad de la AMIL en el compartimento plasmático. Aunque la Ea de la AMILP es significativamente mayor que la de AMILS, la magnitud de esta diferencia no parece que pueda permitir la estimación de la proporción relativa en suero de ambas isoenzimas. Lactato-deshidrogenasa (LDH, EC 1.1.1.27) La LDH es una oxidoreductasa localizada en la fracción citosólica de prácticamente todos los tejidos del organismo. La molécula de la LDH es un tetrámero de 4 cadenas polipeptídicas de tipo H (corazón) y M (músculo), lo que conduce a la existencia de 5 Introducción 9 isoenzimas LDH1 (HHHH), LDH2 (HHHM), LDH3 (HHMM), LDH4 (HMMM) y LDH5 (MMMM). La LDH1 y LDH2 son predominantes en músculo cardíaco, riñón y eritrocitos y la LDH5 en hígado y músculo esquelético, presentando otros órganos y tejidos distribuciones isoenzimáticas intermedias. Los resultados de Buhl y cols (16) evidencian una distinta Ea para las isoenzimas LDH1 y LDH5, sin embargo, en nuestro conocimiento, este hecho no ha sido aún utilizado como marcador de la heterogeneidad enzimática de la LDH sérica en condiciones fisiopatológicas en que interese discriminar el predominio del homotetrámero HHHH ó del MMMM. Aspartato-aminotransferasa (AST, EC 2.6.1.1) La AST es una enzima ampliamente distribuida en los distintos tejidos del organismo, siendo particularmente abundante en hígado, músculo esquelético y cardíaco. Presenta dos isoenzimas, una de localización citosólica (ASTcit) que es mayoritaria en suero, y otra mitocondrial (ASTmit), cuyo aumento en suero indica un daño parenquimatoso severo. En su clásico estudio Rej y Vanderlinde (17) pusieron de manifiesto que las isoenzimas humanas purificadas ASTcit y ASTmit presentan igual Ea (52.3 kJ/mol), un valor análogo al de la AST sérica (50.6 kJ/mol), sin que la adición de piridoxal fosfato al medio de reacción tenga efecto sobre los diagramas de Arrhenius obtenidos para la AST sérica y sus isoenzimas purificadas. Estos resultados imposibilitan la utilización de la Ea para el estudio de la composición isoenzimática de la AST. Se ha descrito la posible presencia en suero de complejos macromoleculares de la AST con inmunoglobulinas (macroenzimas tipo 1); sin embargo, teniendo en cuenta los resultados obtenidos para la macro-CK tipo 1 (13), no parece tampoco probable que la determinación de la Ea tenga un interés práctico para la detección de macro-AST. Fosfatasa alcalina (FAL, EC 3.1.3.1) La FAL, como la gamma-glutamiltransferasa, 5’-nucleotidasa y alanino aminopeptidasa (impropiamente denominadas de forma colectiva “enzimas de tracto biliar”), está ligada por anclajes hidrofóbicos a las membranas plasmáticas celulares. La FAL constituye una familia de numerosas formas enzimáticas, algunas de ellas verdaderas isoenzimas codificadas por genes distintos, mientras otras son el resultado de muy diferentes modificaciones post-traduccionales que conducen a una gran variedad de isoformas. Las formas de origen intestinal y placentario son dos verdaderas isoenzimas, Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 16 la determinación de la Ea de la Hex (25). Con la finalidad de eliminar esta interferencia, en una primera etapa se intentó hacer un pretratamiento de las muestras de orina con ureasa, pero desgraciadamente las preparados purificados comerciales de esta enzima utilizados presentaron una elevada contaminación con Hex. La adición de urea a distintas muestras de orina, en las que previamente se habían eliminado los componentes de baja masa molecular (<7.5 kDa), condujo a un incremento lineal de la Ea de la Hex con la concentración de urea adicionada de acuerdo con ecuaciones de regresión del tipo: Ea= bU+Eao, en donde U es la concentración de urea (g/L) y Eao corresponde a la Ea en ausencia de urea. A medida que Eao (y también la proporción relativa de Hex B) aumenta, las pendiente de las ecuaciones de regresión (b) disminuyen gradualmente (25), existiendo una correlación negativa altamente significativa entre ambas variables (r= -0.960, p< 0.001). A partir de estos éstos resultados, es posible deducir una expresión matemática que permite el cálculo de la Ea en ausencia de urea (Eao) en función de la Ea obtenida para una muestra particular de orina: Eao= Ea-(78.0Ea/100.0-U)U. El valor estimado de Eao puede ser utilizado para la determinación de la proporción relativa de isoenzima Hex B urinaria, sin necesidad de eliminar la urea de las muestras, con una buena concordancia con los resultados obtenidos por fraccionamiento electroforético (25). Introducción 17 Bibliografía 1. Karimi R. Teaching glycolysis with the student´s perspective in mind. Am J Pharm Education 2005; 69 (5): article 85. 2. Arrhenius S. Uber die reactionsgeschwindigkeit bei der inversion von rohrzucker durch säuren. Z Phys Chem 1974; 27: 913-15. 3. Hagelauer U, Faust U. The catalytic activity and activation energy of creatine kinase isoenzymes. J Clin Chem Clin Biochem 192; 20: 633-38. 4. Low PS, Bada JL, Somero GN. 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La utilización de estos substratos requiere en general, tras la reacción de hidrólisis enzimática a pH ácido, una alcalinización (pH> 9.0) para la obtención de un cromóforo coloreado que absorba a una longitud de onda conveniente. Evidentemente, para su adaptación a los modernos sistemas analíticos automáticos, estos métodos discontinuos (punto final) presentarían ciertas desventajas con respecto a los métodos continuos (cinéticos) para la determinación de la Hex (3). En 1988, Noto y cols sintetizaron la sal disódica del 3,3´-diclorofenolsulfonftaleinilN-acetil-β-D-glucosaminido (CPR-NAG) proponiéndolo como un substrato adecuado para la determinación de la Hex en orina (4). El CPR-NAG es hidrolizado por la Hex con liberación del aglicón (rojo de clorofenol, CPR), tal como se indica en la Figura 1, que presenta un máximo de absorción a 575 nm. En la técnica analítica, la reacción enzimática se conduce a pH= 6.25, un valor intermedio entre el pH óptimo y el pH de máxima absorción del cromóforo (5). Figura 1. Hidrólisis del CPR-NAG por acción de la ß-N-acetilhexosaminidasa dando lugar al cromóforo coloreado rojo de clorofenol (CPR). Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 22 El estudio de la energía de activación aparente ha aportado datos de interés en relación a la heterogeneidad de distintos sistemas enzimáticos (5-13). En el caso de la Hex, esta variable termodinámica, utilizando el substrato CPR-NAG, está directamente relacionado con las proporciones relativas de las isoenzimas Hex A y Hex B como han puesto de manifiesto trabajos previos llevados a cabo en nuestro laboratorio (12). La presencia de una subunidad α en el heterodímero (αβ) de Hex A hace que su energía de activación (Ea≈ 41.8 kJ/mol) sea significativamente menor que la del homodímero (ββ) de Hex B (Ea≈ 75.1 kJ/mol) (12, 13) sin que afecte el grado de sialilación de la molécula enzimática (12). Se utilizaron viales de reactivo proporcionados por Shionogi and Co. Ltd. (Chuo-Ku, Osaka, Japón), adicionando al liofilizado 8.2 mL de agua destilada para la adaptación de la técnica manual al analizador centrífugo Cobas Bio (Roche Diagnostics, Basilea, Suiza). En estas condiciones, la concentración de CPR-NAG es de 3.9 mmol/L, bórax 6.7 mmol/L en tampón citrato 67 mmol/L, pH 6.25. El analizador centrífugo Cobas Bio fue programado como se indica: Actividad (U/L); calculation factor (su valor depende del tipo de muestra biológica); type of análisis, 2; wavelength, 575nm; simple volume, 10μl; diluent volume, 50μl; reagent volume, 150μl; incubation time, 0 sec; time of first reading, 300 sec; time interval, 30 sec; number of readings, 10; blanking mode, 1; printout mode, 2. En esta programación del analizador se incluye un blanco de reactivo en todas las series para corregir el efecto de una posible hidrólisis espontánea del substrato. Al aumentar la concentración de albúmina se produce un efecto de inhibición gradual (de tipo no competitivo) sobre la actividad de la β-N-acetilhexosaminidasa en la formación del cromóforo tal y como se describe en un trabajo previo (11). Consecuentemente se hace necesario la aplicación de un distinto factor de cálculo para la determinación de la actividad enzimática de β-N-acetilhexosaminidasa en función de la concentración de albúmina existente en el fluido biológico utilizado. En el análisis de orina, saliva, líquido cefalorraquídeo, plasma seminal, y lisados de leucocitos o plaquetas, el factor de cálculo utilizado en la programación del analizador fue de 863, mientras que en muestras de suero o plasma el factor de cálculo utilizado fue de 1029 (863x1.1923). El establecimiento de dichos factores de cálculo se realizó a partir de la actividad obtenida para el Stand NAG® control (Shionogi and Co.) reconstituido con 1mL de agua destilada o de disolución de albúmina bovina (Ektachem Solution Bovine Serum Albumin®) (BSA) (Johnson and Johnson Clinical Diagnostics) cuya concentración era de 4.5 g/dL, que produce una Material y métodos 23 inhibición aproximada del 16% (actividad residual del 84 %). Esta aproximación evidentemente introduce cierta inexactitud, que para concentraciones de albúmina en el intervalo de referencia podría alcanzar un máximo error del 2.5 %. En 35 muestras de suero de pacientes con distintas enfermedades hepáticas, presentando una concentración media de albúmina de 3.6 g/dL (rango 1.85.1 g/dL), las actividades obtenidas para la Hex utilizando el factor de cálculo general de 1029 presentaron una correlación altamente significativa con las actividades corregidas individualmente de acuerdo con la concentración de albúmina de las muestras (r= 0.997; Syx= 0.45 U/L), sin que existiese una diferencia significativa entre las medias (11.4 U/L vs 11.0 U/L) (11). La determinación de las actividades enzimáticas se hizo por duplicado a 25, 30, 35 y 37ºC y la pendiente de Arrhenius y las energías de activación aparentes fueron calculadas de acuerdo con Rej y Vanderlide (14). Tanto el espectrofotómetro como el control de la temperatura en el analizador fueron revisados periódicamente por el servicio técnico de Roche Diagnostics. En fluidos biológicos que tienen una baja actividad enzimática, como líquido cefalorraquídeo, es conveniente incrementar el volumen de muestra programado en el analizador hasta 40 μL para lograr que la energía de activación pueda ser determinada de forma más precisa y en conformidad con las proporciones de Hex A y Hex B, evitando de esta forma la concentración previa de las muestras. El aumento del volumen de muestra no produce modificaciones significativas en la energía de activación obtenidas para muestras de suero, LCR, lisados leucocitarios y plaquetarios. Por el contrario cuando el volumen se incrementó en muestras de orina, se obtuvo un aumento significativo de la energía de activación de Hex. Con la eliminación de los componentes urinarios de baja masa molecular a través de una membrana de permeabilidad selectiva Centricom YM-30 (Millipore Corporation U.S.) las energías de activación obtenidas son menores que las encontradas en las correspondientes muestras de orina nativa, siendo esta diferencia proporcional a la concentración de urea en las muestras. La concentración de estos metabolitos endógenos en la mezcla de reacción parece tener un efecto significativo en el aumento de la energía de activación de Hex. Una vez que los componentes urinarios de bajo peso molecular son eliminados por filtración selectiva, el valor de la energía de activación de Hex no se modifica significativamente cuando se incrementa el volumen de muestra. Para la determinación de la Hex y sus isoenzimas en orina sin necesidad de Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 24 eliminar los compuestos endógenos de baja masa molecular se ha puesto a punto un procedimiento altamente reproducible (15). El tratamiento estadístico de los datos se realizó con el programa SPSS (SPSS Inc; Chicago, USA). Para comprobar el ajuste de los datos muestrales a la distribución gaussiana se utilizaron los coeficientes de sesgo y curtosis, la prueba de Shapiro-wilk o el test de Kolmogorov-Smirnov en función del tamaño muestral. Para realizar estudios de comparación de medias, análisis de la varianza y análisis de regresión y correlación, se utilizaron pruebas estadísticas paramétricas, pero cuando se incumplió alguna de las condiciones de aplicabilidad, que resultó ser la mayoría de las veces, se emplearon test no paramétricos (16). Así, al comparar dos muestras o series de datos para investigar la superponibilidad de valores, se utilizó el test t-student cuando las variables se ajustaban a la normalidad, y en el caso contrario se aplicaron la prueba de rangos de signos de Wilcoxon para datos apareados o la U de Mann-Whitney para muestras independientes. El nivel de significación estadística fue aceptado con valores de p< 0.05. La naturaleza e intensidad de la relación y asociación entre variables se estudió por medio del análisis de regresión y correlación. El coeficiente de correlación de Pearson se aplicó sólo si las distribuciones eran normales; pero en la mayoría de los casos se obtuvieron distribuciones no gausianas, por lo que se utilizó el coeficiente de correlación de Spearman. En alguna situación se usó la correlación parcial cuando se pretendió desenmascarar la existencia de relaciones espúreas, así como identificar variables intervinientes y detectar relaciones ocultas. El método de regresión utilizado cuando ambas variables se ajustaron a la distribución normal y sólo una estaba sujeta a error aleatorio fue la regresión lineal simple, ajustándose en la recta por el método de mínimos cuadrados. En la situación más frecuente con ausencia de normalidad y con ambas variable sujetas a error aleatorio se utilizó el método de Passing-Bablok (17 - 20). Material y métodos 25 Bibliografía 1. Price R.G. New colorimetric substrates for the assay of hydrolytic enzymes: N-acetyl-βD-glucosaminidase (NAG). Chimica Oggi 1991; 6: 15-19. 2. Price R.G. Measurement of N-acetyl-β-D-glucosaminidase and its isoenzymes in urine: methods and clinical applications. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1992; 30: 693-705. 3. Jung K, Priem F. What are the criteria to introduce new methods for the determination of urinary N-acetyl-β-Dglucosaminidase activity?. Ann Clin Biochem 1993; 30: 501-03. 4. Noto A Nakajima K, Sasakura K, Sugasawa T. Method for determination of NAGasa and reagent therefore. Eur Patent Appl 0294804, 1988. 5. Jung K. Priem F. Klein G. A new kinetic method for the measurement of β-Nacetylglucosaminidase activity in urine. Wien Klin Wochensch 1991; 103 (Suppl. 189): 3742. 6. Jung K. Priem F. Klotzek S. Becker S. Henke W. Methods compared for determining activity of N-acetyl-β-Dglucosaminidase in urine without pretreatment of sample: Different sensitivity and species effect. Enzyme 1991; 45: 215-21. 7. Jung K. Priem F. A practical new assay for determining N-acetyl-β-Dglucosaminidase activity in urine. Clin Chim Acta 1991; 203: 405-08. 8. Klein G. Results of the multicenter evaluation of a new method for the determination of βN-acetylglucosaminidasein urine. Wien Klin Wochensch 1991; 103 (Suppl. 189): 30-37. 9. Meier M. Wilke B. Junge W. Determination of βN-acetylglucosaminidase and albumin in urine: Method comparison and the effect of gel filtration in human and rat urine. Wien Klin Wochensch 1991; 103(Suppl. 189): 37-42. 10. Klein G. results of multicenter evaluation of provisional reference ranges for β-Nacetylglucosaminidase in the urine of adults. Wien Klin Wochensch 1991; 103 (Suppl. 189):48-50. 11. Pérez LF, Tutor JC. Assay of serum/plasma β-N-acetylhexosaminidase by heat inactivation using a continuous spectrophotometric method adapted to a centrifugal analyzer. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1997; 6: 445-52. 12. Pérez LF, Tutor JC. Assay of β-N-acetylhexosaminidase isoenzymes in different biological specimens by the determination of their activation energies. Clin Chem 1998; 44: 226-31. Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 32 Figura 2. Correlación y regresión entre las actividades a 30ºC ({) y 37ºC (z) obtenidas para la Hex plasmática en los analizadores Cobas Bio e Hitachi 717 (A), y entre la proporción de isoenzima Hex B y el FCT 37/30ºC obtenidos en el analizador Hitachi 717 (B). Resultados y discusión 33 Los resultados del estudio de heterogeneidad enzimática de la Hex mediante la determinación de su energía de activación están en pleno acuerdo con los obtenidos utilizando métodos de inactivación térmica, electroforéticos o utilizando substratos específicos para la isoenzima Hex A (9, 10). Teniendo en cuenta los datos antes indicados, puede concluirse que, mediante el cálculo de los FCT 37/25 ºC, puede determinarse la composición isoenzimática de la Hex plasmática con unos resultados análogos a los obtenidos mediante el cálculo de su energía de activación utilizando 4 temperaturas. El uso de FCT 37/30 ºC conduce a peores resultados, ya que su correlación con la proporción en porcentaje de Hex B es peor y la dispersión de los valores es más amplia (Figura 1). Las actividades obtenidas para la Hex plasmática en el Cobas Bio y en el Hitachi 717 son transferibles; sin embargo, los FCT 37/30 ºC presentan una diferencia estadísticamente significativa. Debe tenerse en cuenta que la selección de la longitud de onda (575 nm) en el Hitachi 717 se hace mediante un filtro interferencial, mientras el Cobas Bio utiliza un monocromador. La determinación en duplicado de las actividades enzimáticas en el Hitachi 717 podría reducir la dispersión obtenida al correlacionar los FCT con la proporción de isoenzima Hex B (Figura 2B) y proporcionar unos resultados análogos a los encontrados en el Cobas Bio (Figura 1A). Sin embargo, la utilización de FCT 37/30 ºC no parece que pueda cumplir las exigencias mínimas requeridas para la determinación de las isoenzimas de la Hex, ya que los errores de la estima son mucho mayores que el valor clínicamente aceptable. Por el contrario, el cálculo de FCT 37/25 ºC permitiría la evaluación simple y económica de la heterogeneidad enzimática de la Hex. En cualquier caso los resultados recogidos en la presente memoria para la heterogeneidad enzimática de la Hex fueron obtenidos en todos los casos a partir del cálculo de la energía de activación aparente. Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 34 Bibliografía 1. Isaksson A, Hultberg B. Immunoassay of β-hexosaminidase isoenzymes in serum in patients with raised total activities. Clin Chim Acta 1989; 183: 155-62. 2. Costanci E, Beccari T, Francisci D, Orlacchio A. Lysosomal hydrolases in serum from human immunodeficiency virus-infected patients. Clin Chim Acta 1996; 255: 57-65. 3. Hultberg B, Isaksson A, Berglund M, Moberg AL. Serum β-hexosaminidase isoenzymes: A sensitive marker for alcohol abuse. Alcohol Clin Exp Res 1991; 15: 549-52. 4. Hultberg B, Isaksson A, Berglund M, Alling C. Increases and time-course variations in β-hexosaminidase isoenzyme B and carbohydrate-deficient transferrin in serum from alcoholics are similar. 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Assay of β-N-acetylhexosaminidase isoenzymes in different biological specimens by means of determination of their activation energies. Clin Chem 1998; 44: 226-31. 10. Pérez LF, Tutor JC. Assay of β-N-acetylhexosaminidase isoenzymes in urine by means of determination of their activation energy without removing endogenous low molecular mass components. Clin Chim Acta 1998; 277: 39-49. 11. Knoll E, Hafner F, Dettmer K, Wisser H. The determination of calcium, urea and uric acid using the Kodak Ektachem multilayer film technology: An evaluation. J Clin Chem Clin Biochem 1982; 20: 491-97. Resultados y discusión 35 II. Efecto de la proteólisis parcial sobre la energía de activación aparente de precursores de alta masa molecular y formas maduras de la β-N-acetilhexosaminidasa*1 Al igual que en el caso de otras enzimas lisosómicas, las cadenas polipeptídicas α y β de la Hex son sintetizadas sobre los polisomas asociados al retículo endoplásmico rugoso, y el plegamiento de las cadenas, glicosilación, formación de enlaces disulfuro y dimerización, son etapas cuyo fin es la vehiculización de proenzima hasta los lisosomas. La unión de las subunidades es un proceso crítico, ya que la dimerización es necesaria para la adquisición de actividad catalítica (1, 2). En los lisosomas las cadenas polipeptídicas pro α y pro β experimentan nuevos procesos proteolíticos y glucosídicos que las trasforman en subunidades maduras (1-3). Consecuentemente las formas precursoras de la Hex tienen un mayor peso molecular (Mr≈ 150 kDa) que las formas maduras (Mr≈ 120 kDa) (4), aunque ninguna de estas rupturas en las cadenas polipeptídicas son un prerrequisito para la adquisición de actividad catalítica, ya que las formas precursoras son completamente activas (1, 2). Una pequeña proporción (5-20%) de precursores enzimáticos recién sintetizados no se incorpora a los lisosomas y es secretada al medio extracelular (1, 2). El estudio de la energía de activación aparente ha aportado datos de interés en relación a la heterogeneidad de distintos sistemas enzimáticos (5-13). En el caso de la Hex, esta variable termodinámica, utilizando el substrato cromogénico 3,3´- diclorofenolsulfonftaleinil-N-acetil-β-D-glucosaminido, está directamente relacionado con las proporciones relativas de las isoenzimas Hex A y Hex B (10). La presencia de una subunidad α en el heterodímero Hex A hace que su energía de activación (Ea≈ 41.8 kJ/mol) sea significativamente menor que la del homodímero Hex B (Ea≈ 75.1 kJ/mol) (10,12) sin que afecte el grado de sialilación de la molécula enzimática (10). En el presente apartado se estudió el efecto de la proteólisis parcial con papaína (EC 3.4.22.2) sobre la energía de activación de las isoenzimas de la Hex plasmática, urinaria, leucocitaria y plaquetaria. 1*Hermida J, Casal JA, Tutor JC. Effect of partial proteolysis on the activation anergy of β-Nacetylhexosaminidase precursor and mature forms. Clin Chem Lab Med 2003; 41: 302-05. Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 36 Material y métodos Para el estudio del efecto de la proteólisis parcial de la molécula enzimática sobre sus propiedades catalíticas, a 200 μL de plasma o lisados de leucocitos o plaquetas (a los que se incorporó 0.8 g/dL de albúmina bovina) se adicionaron 60 μL de una suspensión de papaína procedente de Carica papaya (Cat. Nº.108014, Roche Diagnostics) con una actividad específica de 30 U/mg. La incubación se hizo a temperatura ambiente durante distintos tiempos hasta un máximo de 8 horas, deteniéndose la digestión enzimática por congelación. Posteriormente las muestras fueron descongeladas, centrifugadas y se determinaron las actividades de la Hex en los sobrenadantes. Las muestras de orina se concentraron por ultrafiltración con membranas Centricon YM-10 (Millipore Corporation, Bedford, USA) con un cut-off de 10.000 MW, y al concentrado se adicionó albúmina (0.8 g/dL), incubando 200 μL de muestra con 60 μL de suspensión de papaína. En todos los casos, la digestión enzimática se realizó en unas condiciones de pH análogas al valor óptimo de la proteasa utilizada (pH≈ 6-7). La inactivación térmica de la Hex A plasmática se hizo siguiendo un procedimiento previamente descrito (14). Resultados y discusión La digestión con papaína de las muestras de plasma produjo un aumento de la energía de activación aparente de la Hex en la primera hora de incubación, alcanzándose un valor que se mantiene para tiempos de hasta al menos 8 horas de incubación (Figura 1). El incremento de la energía de activación está directamente relacionado con la proporción relativa de Hex A plasmática, y en la Figura 2 se indican los resultados obtenidos con distintos plasmas nativos, así como con diferentes grados de inactivación térmica de la Hex A, para un tiempo de incubación con papaína de 4 horas, que produce un descenso de la actividad enzimática de aproximadamente 10%. La regresión lineal obtenida permite estimar que la proteólisis parcial con papaína produce un aumento de la energía de activación de 3.0 kJ/mol para la isoenzima Hex A, mientras que para la Hex B no se produciría una modificación significativa de esta variable termodinámica. Resultados y discusión 37 Figura 1. Relación entre la energía de activación aparente de la Hex y el tiempo de tratamiento con papaína en un pool de plasmas. 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 0 20 40 60 80 100 Hex A (%) ∆ Ea (kJ/mol) y= 0.03x-0.02 r= 0.975 Figura 2. Relación entre el incremento de la energía de activación de la Hex después del tratamiento con papaína y la proporción relativa de la isoenzima Hex A en muestras de plasma nativo (○) y tratadas térmicamente (●). Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 38 En el caso de la Hex en lisados de leucocitos y plaquetas, el tratamiento con papaína condujo a un incremento de la energía de activación mucho menor, sea cual sea el tiempo de incubación. En la Tabla 1 se indican los resultados obtenidos para distintas muestras de plasma y lisados de leucocitos y plaquetas para un tiempo de incubación con papaína de 4 horas. En el caso de los lisados de leucocitos o plaquetas no se produjo un descenso significativo de la actividad enzimática después del tratamiento con papaína. Tabla 1. Incrementos de la energía de activación de la Hex después del tratamiento con papaína. n Hex (ж) Hex A (%) ∆ Ea (kJ/mol) Plasma 5 8.2 ± 1.4 (9.6) 70.4 ± 3.7 (69.3) 2.57 ± 0.27 (2.27) Plaquetas 2 6.4 ± 0.4 (6.4) 61.2 ± 0.7 (61.2) 0.22 ± 0.22 (0.22) Leucocitos 3 18.9 ± 2.5 (19.9) 57.5 ± 0.9 (58.2) 0.33 ± 0.19 (0.42) (ж) U/L (plasma), U/g proteína (leucocitos y plaquetas). Los resultados son expresados como media ± SEM (mediana). Se hizo un estudio de la Hex en muestras de orina de 11 controles clínicamente sanos y de 28 pacientes con distintas enfermedades renales, en los que no se detectó hematuria en ninguno de los casos. Se encontraron correlaciones significativas de la actividad total de la Hex (expresada en U/g creatinina) con las actividades de Hex A (r= 0.991, p< 0.001) y Hex B (r= 0.937, p< 0.001), así como con la proporción en porcentaje de Hex B (r= 0.471, p< 0.001). Aunque el aumento de ambas isoenzimas es en paralelo, los incrementos de actividad total serían por tanto preferentemente a expensas de Hex B. La actividad total de Hex presentó una correlación significativa con la albuminuria (r= 0.513, p< 0.001) y la proteinuria (r= 0.428, p< 0.001), obteniéndose análogos coeficientes de correlación al considerar las actividades de las isoenzimas Hex A y Hex B. Los resultados del estudio del efecto de digestión con papaína sobre la energía de activación de la Hex urinaria se indican en la Tabla 2, en la que los distintos pacientes se distribuyeron en tres grupos según presentasen normoalbuminuria (< 30 mg/g creatinina), microalbuminuria (30-300 mg/g creatinina) o macroalbuminuria (> 300 mg/g creatinina) (15). Los incrementos de la energía de activación aparente de la Hex urinaria Resultados y discusión 39 en ninguno de los grupos de pacientes o controles presentaron una diferencia estadísticamente significativa con respecto a los encontrados para los lisados de leucocitos o plaquetas. En el total de individuos estudiados (n= 39) no se alcanzó la significación estadística en la correlación de los incrementos de la energía de activación aparente de la Hex urinaria con la proporción relativa de Hex A (r= 0.039), la proteinuria (r= 0.209) o la albuminuria (r= 0.193). En un estudio de la unión de la Hex a DEAE-celulosa realizado por Gupta y Raina utilizando enzima purificada procedente de testículo caprino (13), encontraron que la isoenzima Hex A presenta una energía de activación mayor en su forma soluble (libre) que en la forma insoluble (ligada). Sin embargo para la isoenzima Hex B no encontraron diferencias termodinámicas significativas entre las formas enzimáticas libre y ligada a la carboximetilcelulosa (CM-celulosa). De acuerdo con estos autores este hecho podría ser debido a que los estados de transición de la Hex A en sus formas ligada y libre impliquen diferentes configuraciones, y proporcionaría información sobre las propiedades termodinámicas de las fracciones microsomal (forma ligada) y lisosomal (forma libre) de la Hex (13). Estudios previos han mostrado que la Hex está presente en suero / plasma en sus formas precursoras de alta masa molecular (4, 16). Aunque formas tisulares maduras fuesen cedidas al plasma, estas son rápidamente aclaradas de la circulación mediante receptores específicos, localizados principalmente en las células hepáticas no parenquimatosas (células de Kuppfer y endoteliales), que reconocen los residuos manosa/N-acetilglucosamina terminales presentes en las cadenas de oligosacaridos (17). Como se ha indicado antes, el tratamiento con papaína produce un aumento de la energía de activación aparente de la Hex plasmática. Este incremento se debería a una proteólisis parcial de la forma precursora de alta masa molecular de la isoenzima Hex A, cuya energía de activación aumentaría aproximadamente 3.0 kJ/mol, como se desprende de los resultados indicados en la Figura 2. Sin embargo, el tratamiento con papaína no parece producir un cambio significativo en la energía de activación de la Hex B plasmática, la cual está de acuerdo con resultados de otros autores que señalan la estabilidad extrema de la Hex B frente a la acción de enzimas proteolíticos (18). En leucocitos y plaquetas la Hex está incorporada a los lisosomas, encontrándose por tanto en sus formas maduras, y en el tratamiento con papaína de los lisados celulares no se encontraron incrementos significativos de la energía de activación de la Hex (Tabla 1). Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 40 Resultados y discusión 41 Estos resultados muestran que la proteólisis parcial con papaína produce un discreto aumento de la energía de activación en las formas precursoras de la isoenzima Hex A, pero no en las formas maduras de la misma; aunque éste hecho per se no permitiría afirmar que tras la incorporación de la isoenzima Hex A al lisosoma aumente su energía de activación. Por el contrario para la Hex B tanto las formas precursoras como maduras parecen verse poco afectadas, al menos desde un punto de vista termodinámico, por la digestión con papaína. El tratamiento de la Hex plasmática y leucocitaria con Tritón X100, ha puesto de manifiesto una respuesta semejante de la energía de activación enzimática (datos no presentados). Podría suponerse por tanto que la calidad catalítica de la forma precursora de la isoenzima Hex A, posiblemente debido a la presencia de una subunidad α, es más sensible a los cambios conformacionales que la de Hex B. En condiciones normales, la actividad de la Hex urinaria se origina exclusivamente a nivel renal y es secretada por exocitosis del contenido lisosomal. La alta proporción de Hex A en muestras de orina puede ser debido a la localización de esta isoenzima en el compartimento soluble intralisosomal, mientras que la Hex B se encuentra unida a la membrana del lisosoma (19). La excreción de la Hex urinaria aumenta con el daño celular renal preferentemente por lesiones a nivel del túbulo proximal (20), con un incremento en la proporción de la Hex B (Tabla 2). Sin embargo, aunque el peso molecular de la Hex imposibilita su filtración a través del glomérulo, para el uso de la actividad de la Hex como un índice de daño tubular, debe excluirse la posible presencia en orina de formas enzimáticas filtradas procedentes del plasma en pacientes con proteinuria. Hace más de 20 años Kunin y cols señalaron que probablemente la Hex urinaria no sería resultado de un daño de la membrana basal glomerular (21). Más recientemente los resultados de Shibasaki y cols (22) y Costigan y cols (23) sugirieron que la Hex urinaria es básicamente de procedencia renal incluso en pacientes con proteinuria. Nuestros resultados también apuntan en este sentido, ya que en ninguno de los grupos de pacientes con enfermedades renales estudiados (Tabla 2), se encontró una variación de la energía de activación de la Hex con el tratamiento con papaína que pueda indicar la presencia de una significativa cantidad de formas precursoras de Hex A plasmática en las muestras de orina. Estos resultados son así mismo compatibles con los obtenidos por Zühlsdorf y cols para las formas moleculares de Hex en orina (16). Sin embargo en muestras de orina de pacientes con hematuria si podrían encontrarse isoenzimas de la Hex de origen plasmático. Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 48 Tabla 1. Imprecisión día a día obtenida para el Stand NAG Control® en la energía de activación aparente de la β-hexosaminidasa. Lote n Media ± SEM (kJ/mol) CV (%) Intervalo (kJ/mol) 6003 87 65.75 ± 0.10 1.40 63.80 – 67.80 8001 38 65.32 ± 0.11 1.06 63.90 – 66.55 8002 55 65.58 ± 0.11 1.22 64.00 – 67.04 Asimismo, los resultados obtenidos para la energía de activación aparente de la Hex en lisados de leucocitos PMN y MN (n= 86) utilizando dos analizadores Cobas Bio distintos mostró una regresión lineal de y= 0.98x + 1.10 con un coeficiente de correlación de r= 0.989 (p< 0.001) y energías de activación medias de 58.16 y 58.01 kJ/mol, no existiendo una diferencia estadísticamente significativa entre ellas (Figura 1). Figura 1. Correlación y regresión encontrada para la energía de activación aparente de la Hex en dos Cobas Bio diferentes. Resultados y discusión 49 El posible efecto de la concentración de leucocitos en las muestras sobre los resultados obtenidos para la proporción en porcentaje de Hex A, se estudió haciendo distintas diluciones de una suspensión de leucocitos MN y otra de PMN con solución 9.0 g/L NaCl y sometiéndolas posteriormente al procedimiento general. Como se indica en la Tabla 2, la concentración de leucocitos no afectó de modo significativo a los valores obtenidos para la energía de activación aparente de la enzima y por lo tanto para la proporción de Hex A. Estas variables bioquímicas se mantienen al menos durante 60 días en los pellets leucocitarios congelados a –36 ºC, siendo la imprecisión día-día de los resultados obtenidos para la proporción relativa de Hex A en MN (CV= 1.76%) y en PMN (CV= 2.87%) muy satisfactoria. La imprecisión en la misma serie para esta variable bioquímica en lisados de leucocitos MN y PMN (n= 10) fue también satisfactoria con un coeficiente de variación ≤ 1.6%. Tabla 2. Efecto de la cantidad de muestra sobre los resultados obtenidos para la actividad específica y composición isoenzimática de la β-hexosaminidasa en leucocitos MN y PMN. Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 50 Al comparar la proporción en porcentaje de isoenzima Hex A en leucocitos MN y PMN obtenido mediante el método termodinámico con el cociente de actividades enzimáticas utilizando los substratos fluorogénicos sulfatado y neutro (4MU-NAG-SO4 / 4MU-NAG), se encontró una correlación altamente significativa (Figura 2). Figura 2. Correlación entre la proporción en porcentaje de la isoenzima β-hexosaminidasa A determinada mediante el método termodinámico y la relación de actividades enzimáticas utilizando substratos fluorogénicos sulfatados y neutros (4MU-NAGSO4 / 4MU-NAG) en leucocitos MN (●) y PMN (○). En la Tabla 3 se indican los valores de referencia encontrados en 163 individuos control, (82 hombres y 81 mujeres) con una edad media (± SD) de 31.7 ± 1.1 años (rango 18 – 68 años) para la actividad específica de Hex y la proporción relativa de la isoenzima Hex A en leucocitos MN y PMN. Los leucocitos PMN presentaron valores significativamente mayores que los MN para la actividad específica de Hex total (p< 0,01) y la proporción relativa de isoenzima Hex A (p< 0.001). Estas diferencias también son clínicamente significativas al ser mayores que los correspondientes errores clínicamente aceptables establecidos de acuerdo con los criterios descritos previamente (17 – 18), utilizando los intervalos de referencia encontrados por nosotros para las diferentes Resultados y discusión 51 variables bioquímicas. La actividad específica media de la isoenzima Hex A fue significativamente mayor (p< 0.001) en leucocitos PMN que en MN (15.11 ± 5.21 U/g proteína vs 10.37 ± 2.84 U/g proteína). Por su parte la actividad específica de la isoenzima Hex B fue significativamente mayor (p< 0.001) en MN que en PMN (8.67 ± 2.22 U/g proteína vs 5.95 ± 2.01 U/g proteína). Las proporciones relativas de isoenzima Hex A en leucocitos MN y PMN presentaron una correlación estadísticamente significativa entre sí (r= 0.273, p< 0.001). Tabla 3. Actividad específica y variación interindividual de la Hex total y sus isoenzimas en leucocitos MN y PMN. Células MN (n= 163) Células PMN (n= 163) Media ± SD (Mediana) CV (%) Media ± SD (Mediana) CV (%) Hex Total (U/g proteína) 19.01 ± 4.92* (19.37) 25.88 21.06 ± 6.99 (20.50) 33.19 Hex A (U/g proteína) 10.37 ± 2.84** (10.31) 27.38 15.11 ± 5.21 (14.86) 34.48 Hex B (U/g proteína) 8.67 ± 2.22** (8.82) 25.60 5.95 ± 2.01 (5.72) 33.78 Hex A (%) 54.28 ± 3.06** (54.64) 5.64 71.56 ± 3.86 (71.65) 5.39 Significación: *p< 0.01 **p<0.001. En 10 individuos controles sanos (6 hombres y 4 mujeres) se tomaron muestras de sangre a las 9 h y a las 18 h, indicándose en la Tabla 4 los resultados obtenidos para la Hex en leucocitos MN, PMN y plasma. No se alcanzó una diferencia estadísticamente significativa para ninguna de las variables bioquímicas en función de la hora de toma de muestra. Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 52 Tabla 4. Resultados obtenidos en leucocitos y plasma para la actividad específica y composición isoenzimática de la β-hexosaminidasa en muestras recogidas por la mañana y por la tarde de 10 sujetos clínicamente sanos En 33 individuos, con una proporción relativa de leucocitos PMN del 59.6 ± 15.2% (rango 34% - 90%), se determinaron las actividades específicas de Hex total, Hex A y Hex B en los lisados de leucocitos totales no fraccionados (Tabla 5). Aunque como se indicó anteriormente, la proporción relativa de isoenzima Hex A es mayor en leucocitos PMN que MN, en los 33 casos estudiados no se alcanzó la significación estadística en la correlación entre las proporciones relativas de isoenzima Hex A leucocitaria y de PMN (r= 0.225). Tabla 5. Actividad específica y variación interindividual de la Hex total y sus isoenzimas en leucocitos totales no fraccionados. Mezcla de Leucocitos (n= 33) Media ± SD (Mediana) CV (%) Hex Total (U/g proteína) 20.6 ± 5.5 (20.0) 26.7 Hex A (U/g proteína) 12.2 ± 3.4 (11.8) 27.9 Hex B (U/g proteína) 8.3 ± 2.4 (8.7) 28.9 Hex A (%) 59.4 ± 4.2 (59.8) 7.1 Resultados y discusión 53 En los 163 controles estudiados se encontró una actividad plasmática media para la Hex total de 8.76 ± 1.88 U/L (mediana 8.53 U/L, rango 5.6 – 16.1 U/L) con una proporción media de isoenzima Hex A de 68.58 ± 4.52 % (mediana 68.25 %, rango 56.4 – 80.9 %). La proporción de Hex A plasmática no presentó una correlación significativa con la proporción de esta isoenzima en leucocitos MN (r= 0.013) y PMN (r= -0.013). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas para la Hex leucocitaria o plasmática en función del sexo. En los individuos mayores de 51 años se encontró un aumento estadísticamente significativo en la actividad de la Hex total en plasma (p< 0.005) sin que varíe significativamente la proporción relativa de Hex A. En 81 individuos de ambos sexos (controles, embarazadas y pacientes con distintas enfermedades), y que no presentaban la enfermedad de Tay-Sachs, se determinaron las actividades de la Hex en muestras de suero y plasma. Como se indica en la Figura 3A, se encontró una elevada correlación entre los valores (r= 0.953, p< 0.001), pero la actividad enzimática en suero es significativamente mayor que en plasma (p< 0.001). La diferencia de actividad suero/plasma presentó una correlación altamente significativa con el número de plaquetas (r= 0.846, p< 0.001). No se encontró una diferencia estadísticamente significativa entre las energías de activación aparente de la Hex en suero y plasma, presentando los valores una elevada correlación entre si (Figura 3B). Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 54 Figura 3. Relación entre la actividad de la Hex total (A) y la energía de activación aparente (B) en muestras de suero y plasma. Resultados y discusión 55 Estos resultados sugieren que, aunque en suero las actividades de la Hex total y sus isoenzimas son mayores que en el plasma, no se modifica la proporción relativa de las isoenzimas Hex A y Hex B como se indica en Tabla 6. Sin embargo el cociente de actividades enzimáticas de la Hex en suero/plasma presentó correlaciones significativas con el cociente de energías de activación en suero/plasma (r= 0.303, p< 0.01) y con el cociente de las proporciones relativas de Hex B en suero/plasma (r= 0.257, p< 0.05). Esto podría sugerir, que cuanto mayor es el aumento proporcional de la actividad enzimática en suero en relación al plasma, la proporción de isoenzima Hex B en suero tendería asimismo a aumentar. Tabla 6. Variaciones interindividuales de la actividad de la Hex total y sus isoenzimas en suero y plasma. Suero (n= 81) Plasma (n= 81) Media ± SD (Mediana) CV (%) Media ± SD (Mediana) CV (%) Hex Total (U/L) 22.2 ± 15.7** (17.5) 70.7 19.1 ± 15.9 (12.5) 83.1 Hex A (U/L) 11.8 ± 6.5** (10.3) 55.1 9.9 ± 6.4 (7.4) 64.4 Hex B (U/L) 10.3 ± 9.7* (6.5) 93.5 9.3 ± 9.9 (4.7) 107.3 Hex A (%) 57.7 ± 12.7 (58.0) 21.9 57.4 ± 13.4 (58.6) 23.4 Significación: *p< 0.05 **p<0.01. En la Tabla 7 se indican los resultados encontrados para la Hex y sus isoenzimas en lisados de plaquetas de 31 controles sanos, 23 mujeres embarazadas y 21 pacientes diabéticos. Aunque para las actividades enzimáticas específicas se encontraron ocasionales diferencias significativas, para la proporción relativa de isoenzima Hex A no se encontraron diferencias significativas para los grupos de embarazadas y diabéticos en relación al grupo control (Tabla 7). En el grupo total (n= 75) no se encontró una correlación significativa entre el volumen plaquetar medio y la actividad específica total de la Hex (r= - 0.115), Hex A (r= -0.085), Hex B (r= -0.179) o la proporción relativa de esta isoenzima (r= 0.048). Tampoco se encontraron correlaciones significativas entre el número de plaquetas y la actividad específica total de la Hex (r= 0.092), Hex A (r= 0.089) y Hex B (r= -0.055) o Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 56 su proporción relativa (r= 0.048). Para el total de casos considerados las variaciones interindividuales de las actividades plasmáticas de la Hex y sus isoenzimas fueron análogas a las indicadas en la Tabla 6. Resultados y discusión 57 Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 64 12. Prence E M, Natowicz M R, Zalewski I. Unusual thermolability of leukocyte βhexosaminidase: Implications in screening for carriers of Tay-Sachs disease. Clin. Chem. 1993; 39: 1811 – 14. 13. Prence E M, Zalewski I, Natowicz M R; Unusual thermolability properties of betahexosaminidase: Studies of enzyme from cultured cells and clinical implications. Am J Med Genet 1996; 65: 320 - 24 14. 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Las gangliosidosis GM2 son un grupo de enfermedades neurodegenerativas de carácter autosómico recesivo, causadas por la incapacidad para la metabolización del gangliósido GM2 por la isoenzima Hex A. Se pueden diferenciar tres tipos principales en función de la implicación de los distintos genes que codifican la subunidad α con deficiencia de isoenzimas Hex A (variante B), la subunidad β, con deficiencia de isoenzima Hex A y Hex B (variante 0), y el activador proteico (variante AB) (1). Una variante del tipo B, denominada B1, se caracteriza por la presencia de isoenzima Hex A mutada que es incapaz de hidrolizar el gangliósido GM2 y los substratos artificiales sulfatados (con carga negativa), debido a una funcionalidad catalítica alterada del centro activo de la subunidad α. En los demás aspectos catalíticos, esta isoenzima es aparentemente normal frente a los substratos artificiales neutros convencionales (1, 3-5). Utilizando el substrato neutro 3,3´-diclorofenolsulfonftaleinil-N-acetil-β-Dglucosaminido la energía de activación de la isoenzima Hex B (Ea≈ 75.1 kJ/mol) es significativamente mayor que la de la Hex A (Ea≈ 41.8 kJ/mol) debido a la presencia en esta de la subunidad α en su molécula (6). El objetivo fue comprobar si este hecho podría permitir la caracterización termodinámica de la isoenzima Hex A mutada en la variante B1 de gangliosidosis GM2, una vez aislada a partir de diferentes medios biológicos de pacientes homocigotos. *Pérez LF, Ribeiro HM, Casal JA, Pinto RA, Sá Miranda MC, Tutor JC. Thermodynamic characterisation of the mutated isoenzyme A of β-N-acetylhexosaminidase in GM2 gangliosidosis B1 variant. Clin Chim Acta 1999; 285: 45-51. Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 68 Material y métodos Se aislaron cromatográficamente las isoenzimas de la Hex de muestras de plasma y leucocitos de una niña de nacionalidad portuguesa de 10 años, homocigoto para la mutación G533→A (Arg 178 His) (7), así como de sus padres portadores heterocigotos para esta mutación y de dos controles clínicamente sanos. El paciente presentaba las características clínicas del fenotipo juvenil de la variante B1, con comienzo a la edad de 4 años de dificultades del habla como primer síntoma (5). La mutación de la Hex A en el paciente con gangliosidosis GM2 variante B1 estudiado, designada como “DN-alelo”, es una transición G→A en el nucleótido 533, implicando una sustitución arginina→histidina en el residuo 178 (9). Esta mutación (R178H) es la más frecuente en el norte de Portugal y posiblemente en Galicia. La separación de las isoenzimas de la Hex a partir de lisados leucocitarios y plasma (≈ 200μL) por cromatografía en columna de DEAE-celulosa (DE-52, Whatman Laboratory División), se realizó sobre columnas de 0.6X6.5 siendo equilibradas con tampón fosfato sódico (10 mmol/L, pH= 6.0). La actividad enzimática no retenida se eluyó con el tampón de la columna y entonces se aplicó un gradiente lineal de concentración de ClNa (0.00.35 mol/L) en 12 mL del tampón de la columna. La actividad de la Hex en las diferentes fracciones cromatográficas (≈ 0.8 mL), recogidas en tubos con albúmina bovina (concentración final 0.1 g/L) se determinó utilizando 4-metilumbeliferil-2-acetamido-2deoxi-β-D-glucopiranósido (Sigma Chemical) como substrato, así como con 4metilumbeliferil-2-acetamido-2-deoxi-β-D-glucopiranósido-6-sulfato. Después de una incubación a 37 ºC durante 15 y 60 minutos respectivamente, la reacción se detuvo adicionando tampón glicina-NaOH (pH= 10.0) y la fluorescencia de la 4metilumbeliferona liberada se determinó en un fluorímetro Hitachi F2000 (excitación= 365nm, emisión= 445nm). El substrato 4-metilumbeliferil-2-acetamido-2-deoxi-β-Dglucopiranósido es hidrolizado por las isoenzimas Hex A y Hex B, pero su derivado sulfatado es únicamente hidrolizado por el centro activo de la subunidad α de la isoenzima Hex A normal (1, 8). Las fracciones del eluído de la columna correspondientes a los picos de actividad enzimática fueron concentradas por permeabilidad selectiva (Centricon 10, Amicon) para su análisis electroforético y la determinación de la energía de activación de las diferentes isoenzimas de la Hex. La electroforesis se realizó sobre tiras de acetato de celulosa (Cellogel, Chemetron) utilizando 4-metilumbeliferil-2-acetamido-2-deoxi-β-D- Resultados y discusión 69 glucopiranósido (5), y para la determinación de la energía de activación de los fracciones isoenzimáticas se utilizó 3,3´-diclorofenilsulfonftaleinil-N-acetil-β-D-glucosaminido como se indicó anteriormente. Resultados y discusión La Figura 1 muestra los perfiles isoenzimáticos obtenidos cromatográficamente para la Hex plasmática del paciente homocigoto para la variante B1 de gangliosidosis GM2, un portador heterocigoto y un control sano. No se detectó actividad enzimática para la Hex A utilizando el substrato sulfatado en el paciente homocigoto, pero si utilizando el substrato neutro. En los portadores heterocigotos el cociente de actividad substrato sulfatado/neutro fue de 0.08, mientras que en los controles fue 0.15. En el análisis electroforético de los eluídos de la columna, correspondientes a las isoenzimas Hex A y Hex B plasmáticas, se obtuvo una banda simple bien diferenciada con las características electroforéticas de estas isoenzimas. Sin embargo, cuando las isoenzimas de la Hex fueron aisladas cromatográficamente de lisados leucocitarios, el análisis de los eluídos correspondientes a la Hex A, puso de manifiesto dos bandas electroforéticas debido a la conversión parcial de esta isoenzima en Hex B en el eluato. Por tanto, la determinación de las energías de activación de la Hex A y la Hex B en todos los individuos estudiados se llevo a cabo después de su aislamiento cromatográfico a partir de muestras de plasma. En la Tabla 1 se indican los resultados obtenidos. Los resultados presentados en la Figura 1 son concordantes con los recogidos en la bibliografía (1, 3-5), mostrando como el substrato fluorogénico sulfatado es únicamente hidrolizado por el centro activo de la subunidad α de la isoenzima Hex A normal, mientras el substrato neutro es preferentemente hidrolizado por el centro activo de la subunidad β (8) presente tanto en Hex A como Hex B. Por el contrario, la Hex A mutada presenta un cambio de especificidad de substrato, siendo incapaz de hidrolizar el substrato sulfatado al estar afectada su subunidad α, cuyo modelo molecular revela alteraciones en la estructura tridimensional de la proteína (10). Los resultados obtenidos en los portadores heterocigotos y en los controles para la relación de actividades substrato sulfatado/neutro, sugieren que en el plasma de los portadores existe una mezcla aproximadamente equimolecular de las isoenzimas Hex A normal y mutada. Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 70 Figura 1. Separación cromatográfica en DEAE-celulosa de las isoenzimas plasmáticas de la Hex en paciente homocigoto para gangliosidosis GM2 variante B1, portador heterocigoto y control sano. Actividades enzimáticas obtenidas en las fracciones utilizando 4MU-NAG (●) y 4MU-NAG-SO4 (○). Resultados y discusión 71 Los valores obtenidos para la energía de activación de la Hex B fueron análogos en todos los casos estudiados a los estimados previamente para esta isoenzima (6). Sin embargo, la Hex A mutada del paciente homocigoto presentó una energía de activación significativamente aumentada con respecto a la de la Hex A normal de los individuos control (Tabla 1), cuyos valores son análogos a los previamente calculados para esta isoenzima (6). En los portadores heterocigotos, se obtuvieron valores intermedios para las energías de activación de la Hex A, lo que sugiere asimismo la presencia en plasma de una mezcla equimolecular de isoenzimas mutada y normal, con secreción análoga de ambas formas al medio extracelular. Tabla 1. Energías de activación de las isoenzimas para la Hex plasmática aisladas por cromatografía en DEAE-celulosa. Pacientes Homocigotos Portadores Heterocigotos Controles Hex A (kJ/mol) 71.5 55.3-55.5 41.1-41.5 Hex B (kJ/mol) 73.8 76.1-74.9 74.8-74.5 Las subunidades α y β de la Hex poseen diferentes centros activos (8), aunque la formación de los dímeros resultando las isoenzimas Hex A y Hex B es una condición necesaria para la adquisición de actividad catalítica (1, 11). La mutación R178H de la subunidad α inactiva el polipéptido, pero no interfiere en la asociación de estas subunidades y su vehiculización hasta el lisosoma (1, 3). Consecuentemente la Hex A mutada presenta una actividad derivada de la subunidad β, lo que explicaría que su energía de activación sea análoga a la de la isoenzima Hex B (Tabla 1). Cuando se utilizaron lisados de leucocitos para la separación de las isoenzimas de la Hex, se observó una significativa conversión de Hex A en Hex B en los eluatos. Un hecho análogo se encontró cuando se utilizaron muestras de orina (resultados no presentados). Por el contrario, la isoenzima Hex A es razonablemente estable en los eluatos obtenidos al utilizar muestras de plasma para el aislamiento cromatográfico de las isoenzimas. Esto podría deberse a que, tanto en leucocitos como en orina la Hex A y Hex B se encuentran como formas maduras de tipo tisular parcialmente proteolizadas (12), mientras en el plasma se encuentran como precursores de alta masa molecular (12, Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 72 13). La conversión espontánea de la Hex A en Hex B, por reordenación de sus subunidades en las formas tisulares purificadas, es un hecho bien documentado (1, 14). Teniendo en cuenta la mucha mayor energía de activación de la Hex A mutada comparada con la de la Hex A normal, la determinación de esta variable termodinámica utilizando el substrato cromogénico neutro 3,3´-diclorofenolsulfonftaleinil-N-acetil-β-Dglucosaminido permite la caracterización termodinámica de la isoenzima mutada, y puede ser la base para el desarrollo de un método simple y económico para la caracterización bioquímica de la variante B1 de gangliosidosis GM2. Resultados y discusión 73 Bibliografía 1. Gravel RA, Clarke JTR, Kaback MM, Maduran D, Sandhoff K, Suzuki K. The GM2 gangliosidoses. In Scriver CR, Beaudet Sly WS, editors, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited disease. 7th ed, edition. New York; McGraw-Hill, 1995, pp. 2839-79. 2. Neufeld EF. 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Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 80 Distintas mutaciones de la subunidad α han sido descritas para la variante B1 de gangliosidosis GM2, aunque la más frecuente es R178H (G533→A, Arg178→His) designada como “DN-alelo” (1, 16). Esta mutación tiene una amplia distribución geográfica y étnica (16, 17) aunque es particularmente alta su incidencia en el norte de Portugal, (18-20), habiéndose incluso sugerido que pudo tener su origen en esta región (16, 18). En la población portuguesa la prevalencia de la variante B1 ha sido estimada en 0.84 por cada 100.000 nacimientos, aunque esta proporción se duplicaría para la parte norte del país (21). En Galicia una comunidad estrechamente vinculada histórica y culturalmente con el norte de Portugal, se han descrito previamente dos casos de niñas no consanguíneas que padecían gangliosidosis GM2 variante B1 (22). Una de ellas tenía la forma juvenil de la enfermedad con el genotipo R178H/R178H (paciente 1 en nuestro estudio) mientras que la otra paciente presentaba una forma infantil tardía con el genotipo R178H/?? (22). Por otra parte uno de los primeros pacientes homocigotos para la variante B1 descritos en la literatura era originario de la provincia de Orense, cuyos padres habían nacido a escasa distancia de la frontera portuguesa (Sá Miranda MC comunicación personal) Los resultados obtenidos utilizando el método termodinámico para la determinación de la heterogeneidad enzimática de Hex plasmática permitió la identificación de pacientes homocigotos con gangliosidosis GM2 variante B1 (Tabla 1). Sin embargo para los portadores heterocigotos, las proporciones relativas de Hex A estaban dentro del rango de referencia, a pesar de que la actividad enzimática de Hex A era generalmente menor que la encontrada en los individuos control. Se ha señalado que heterocigotos para el alelo de la B1 pueden presentar niveles normales para la actividad sérica de Hex A o Hex B (6), y en el screening de portadores para la variante B de Tay-Sachs, los métodos enzimáticos en suero o plasma pueden no resultar concluyentes en algunos casos (1, 6). En leucocitos MN y PMN los resultados obtenidos para la actividad específica de la Hex A, presentó un alto valor discriminatorio tanto para los pacientes homocigotos con variante B1 como para los portadores heterocigotos (Tabla 1). La proporción relativa de la isoenzima Hex A en leucocitos MN y PMN también presentó un alto valor discriminatorio (Figura 2), aunque de acuerdo con los resultados indicados en el apartado anterior, la determinación de las isoenzimas de la Hex en lisados de leucocitos totales también podría ser utilizada. Resultados y discusión 81 Figura 2. Porcentaje de Hex A en leucocitos PMN vs. MN en pacientes (Δ), portadores heterocigotos B (Ж) y B1 (●) y controles (○). Los resultados obtenidos para la Hex A por el método termodinámico son altamente concordantes con los obtenidos usando 4-metilumbeliferil-N-acetil-β-D-glucosaminido sulfatado (específico para la subunidad α) (8, 10). En la gangliosidosis GM2 se ha determinado una correlación entre la actividad residual de la Hex A y la severidad de la enfermedad, (1, 2), por lo que el fenotipo menos severo de la variante B1 podría ser explicado por la presencia de un alelo defectuoso que mantuviese una actividad residual “in vivo” de la Hex A frente el gangliósido GM2 (1, 21). En el caso de un paciente portugués homocigoto variante B1 (mutación R178H), nosotros obtuvimos una energía de activación para la Hex A plasmática (aislada por cromatografía en gel de DEAE-celulosa) de 71.5 kJ/mol (13), ligeramente inferior a la de la isoenzima Hex B (75.1 kJ/mol), siendo esta diferencia determinada de forma segura mediante el procedimiento utilizado. En el paciente 1 se encontró una actividad específica de 0.7 U/g proteína en leucocitos MN (10% de la actividad total) y de 1.5 U/L en plasma (37% de la actividad total), actividades significativamente mayores que las obtenidas en Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 82 los otros dos pacientes estudiados. Estas actividades son en cierto modo sorprendentes, pues representan respectivamente un 18% y un 39% del correspondiente límite inferior del rango de referencia, y se ha sugerido que con una proporción de 5 a 15% de actividad normal de Hex A podría ser suficiente para mantener el catabolismo normal del gangliósido GM2 (1, 2). En cualquier caso, los resultados obtenidos para este paciente son claramente discriminatorios con respecto al grupo de portadores heterocigotos y al grupo control (Figura 1 y 2). En conclusión la determinación termodinámica para la determinación de las isoenzimas de la Hex en plasma posibilitó la identificación de los pacientes homocigotos con variante B1 de gangliosidosis GM2, aunque en el caso de portadores heterocigotos pueden obtenerse falsos resultados negativos. Sin embargo, la determinación de las isoenzimas de la Hex en lisados de leucocitos permitió distinguir claramente los pacientes homocigotos con variante B1, portadores heterocigotos y sujetos control. Resultados y discusión 83 Bibliografía 1. Gravel RA, Kaback MM, Proia RL, et al. The GM2 gangliosidoses. In “The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease” (Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D eds) Eight edition. McGraw-Hill, New York 2001: 3827-76. 2. Mahuran DJ. Bichemical consequences of mutations causing GM2 gangliosidoses. Biochim Biophys Acta 1999; 1455: 105-38. 3. Kytzia HJ, Sandhof K. Evidence for two different active sites on human β-hexosaminidase A. 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Relación entre los distintos marcadores de activación monocito / macrófago en la enfermedad de Gaucher tipo 1*1 La enfermedad de Gaucher es debida a una deficiencia hereditaria de la enzima lisosómica β-glucosidasa (EC 3.2.1.45), con la consecuente acumulación de glicosilceramida en los lisosomas de los macrófagos (1, 2). Clínicamente, se han descrito tres formas de la enfermedad: tipo 1 no neuropática (la más común), tipo 2 neuropática aguda y tipo 3 neuropática subaguda. En los pacientes con enfermedad de Gaucher tipo 1 las manifestaciones clínicas son resultado de una acumulación de macrófagos que causan aumento de tamaño y disfunción de hígado y bazo, y el acumulo de células de almacenamiento causa alteraciones en médula ósea y daño óseo (1). La terapia de remplazamiento enzimático es el tratamiento de elección para la enfermedad de Gauncher tipo 1, y el seguimiento bioquímico de la respuesta al tratamiento es clínicamente importante. En cultivos celulares, el mRNA de la quitotriosidasa (ChT) solamente es expresado en un avanzado estado de diferenciación de los monocitos a macrófagos activados, indicando una intensa regulación de la expresión enzimática (3). La actividad de ChT en suero/plasma en pacientes no tratados con enfermedad de Gaucher tipo 1 está significativamente elevada y disminuye gradualmente durante la terapia de remplazamiento enzimático (4-8), siendo las denominadas “células de Gaucher” la principal fuente de ChT sérica (4). La enzima convertina-angiotensina (ECA) presente en suero es principalmente producida en el endotelio vascular, aunque en algunas situaciones patológicas los macrófagos tisulares y los monocitos circulantes pueden producir importantes cantidades de esta enzima, convirtiéndose en la principal fuente de su actividad sérica (9, 10), lo que podría explicar los aumentos de actividad sérica de ECA descritos en la enfermedad de Gaucher (11, 12). La adenosina deaminasa (ADA) puede ser un indicador de activación macrofágica y la isoenzima ADA 2 sérica parece tener su origen exclusivamente en la línea celular monocito/macrófago (13). La neopterina sería producida específicamente por los monocitos/macrófagos activados en respuesta al interferón γ producido por linfocitos T activados (14, 15). Asimismo, se ha sugerido que la Hex podría aumentar en *Casal JA, Lacerda L, Pérez LF, Pinto RA, Clara Sá Miranda M, Carlos Tutor J. Relationships between serum markers of monocyte/macrophage activation in type 1 Gaucher's disease. Clin Chem Lab Med 2002; 40: 52-5. Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 86 algunos casos por activación macrofágica (16, 17), habiéndose descrito previamente aumentos de su actividad enzimática en suero/plasma de pacientes con enfermedad de Gaucher (18-20) que podrían ser de utilidad para el diagnóstico de pacientes homocigotos y la detección de portadores heterocigotos (18). El objetivo fue mostrar las relaciones encontradas entre estos marcadores de activación monocito/macrófago en pacientes con enfermedad de Gaucher tipo 1. Material y métodos Se estudiaron 44 pacientes (27 mujeres y 17 hombres) con enfermedad de Gaucher tipo 1. Presentando una edad media (± SEM) de 33.2 ± 2.2 años (rango 9 - 63 años). Todos los pacientes procedían del norte de Portugal, y la caracterización bioquímica y molecular de la enfermedad lisosómica se realizó en la unidad de enzimología del Instituto de Genética Médica “Jacinto Magalhaes” de Oporto. Para cada paciente la severidad clínica de la enfermedad fue calculada en base al índice de Zimran (21). En 16 pacientes el estudio se hizo en el momento del diagnóstico de la enfermedad y antes de que se comenzase el tratamiento, y en los 28 casos restantes se administraba la terapia de remplazamiento enzimático con Imiglucerasa (Cerezyme®, Genzyme, Cambridge, USA) siendo el tiempo medio de tratamiento 18.8 meses (rango 1-50 meses) antes. La actividad sérica de la ChT se determinó usando el método fluorimétrico de Hollak y cols. (4) con ligeras modificaciones. La enzima angiotensina-convertina (ECA, EC 3.4.15.1) se determinó usando el ACE Kinetic Test de Bühlmann Laboratorios (Allschwill, Suiza). Para la adenosina deaminasa (ADA, EC 3.5.4.4) se utilizó el ADA Boehringer Test Combination (Roche Diagnostics, Basilea, Suiza), que cuantifica la actividad de la isoenzima ADA 2. La concentración sérica de neopterina se determinó por ELISA con reactivos de IBL Gesellschaft für Immunochemie und Immunobiologie GMBH (Hamburgo, Alemania). La β-Hexosaminidasa (Hex, EC 3.2.1.52) y sus isoenzimas Hex A y Hex B fueron determinadas como se describió previamente (22). Resultados y discusión Se identificaron tres pacientes con deficiencia de ChT; uno del grupo de pacientes no tratados y dos del grupo de pacientes tratados. Todos los pacientes no tratados presentaban niveles de ChT (excepto el caso con deficiencia de ChT), neopterina, ECA y ADA mayores que los correspondientes limites superiores de referencia; sin embargo, en Resultados y discusión 87 dos de los pacientes no tratados las actividades séricas de la Hex total y sus isoenzimas estaban dentro del intervalo de referencia. En el grupo de los pacientes tratados se encontró un descenso significativo para todas las variables bioquímicas estudiadas en comparación con el grupo de pacientes no tratados (p< 0.001). No se encontró una correlación significativa en ninguno de los grupos de pacientes estudiados entre los marcadores de activación macrofágica y el índice de severidad clínica de Zimran, o entre estos marcadores séricos y el tiempo de tratamiento en el grupo total de pacientes. La Tabla 1 muestra el incremento de los diferentes marcadores en los grupos de pacientes tratados y no tratados expresados como múltiplos del límite superior de referencia. En el grupo de pacientes no tratados el mayor incremento corresponde a la ChT, seguido de neopterina, ECA, ADA y Hex. Aunque se encontró un incremento significativo en este grupo tanto para la Hex A como la Hex B séricas en relación a un grupo control formado por 84 personas clínicamente sanas (p< 0.001), la actividad total correlacionó significativamente con la proporción en porcentaje de isoenzima Hex B (r= 0.584, p< 0.05), lo que indica que el incremento de actividad se produce principalmente a expensas de la isoenzima Hex B. Sin embargo, en el grupo tratado no se encontró una correlación significativa entre la Hex total y la Hex B (r= 0.013). No se encontró una diferencia significativa entre la proporción de isoenzima Hex B (media ± SEM) en el grupo de los 16 pacientes no tratados (37.6 ± 1.96 %), los 28 pacientes tratados (33.2 ± 1.55 %) y los 84 sujetos control (30.3 ± 0.55 %). Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 88 La Tabla 2 muestra coeficientes de correlación obtenidos entre los diferentes marcadores de activación de monocitos/macrófagos en los 44 pacientes estudiados, existiendo una alta significación estadística en todos los casos. Sin embargo, los coeficientes de correlación parcial entre la ChT y la neopterina (manteniendo las otras variables constantes) no alcanzó la significación estadística (r= 0.104). El coeficiente de correlación entre la isoenzima Hex B y los diferentes marcadores de activación macrofágica fueron más bajos que los encontrados para la Hex A. Asimismo, no se alcanzó la significación estadística en la correlación parcial entre la Hex B sérica (manteniendo la Hex A constante) y ChT (r= 0.044), neopterina (r= 0.051), ADA (r= 0.143), ECA (r= 0.018). En los grupos de pacientes no tratados y tratados, los coeficientes de correlación entre los diferentes marcadores de activación macrofágica fueron más bajos que en el grupo total, aunque alcanzando la significación estadística excepto entre ChT y neopterina. Se ha descrito que una duplicación 24 bp en el gen de la ChT tiene como resultado la síntesis de una proteína inactiva, siendo la prevalencia de portadores heterocigotos aproximadamente del 35 % (23) y para la deficiencia enzimática de aproximadamente el 6 % (4, 6), aunque algunos autores sugieren que sería menor del 2 % (8). En nuestro estudio de los 44 pacientes con enfermedad de Gaucher y de 103 individuos control, encontramos 3 y 6 casos con deficiencia de ChT respectivamente. En los 44 pacientes estudiados, tres eran homocigotos para la deficiencia de ChT, 19 portadores Resultados y discusión 89 heterocigotos y 22 presentaban un genotipo ChT normal. Los coeficientes de correlación entre los niveles séricos de ChT y neopterina fueron análogos en los grupos de portadores heterocigotos para la deficiencia de ChT (r= 0.542, p< 0.001) y con genotipo ChT normal (r= 0.609, p< 0.001). Análogos resultados se obtuvieron para las correlaciones entre la ChT y ECA, ADA y Hex para los dos grupos de pacientes. En los pacientes no tratados el incremento en suero de los niveles ChT, fue mucho mayor que el de los otros marcadores de activación macrofágica, con un mayor descenso después del comienzo de la terapia de remplazamiento enzimático (Tabla 1). Todos los pacientes no tratados, presentaron niveles en suero de ChT (excepto para el paciente deficiente en ChT), neopterina, ECA y ADA más altos que el límite superior del rango de referencia. Con respecto a la Hex total y sus isoenzimas Hex A y Hex B, dos de los pacientes presentaron actividades séricas comprendidas en los intervalos de referencia, lo que supone una sensibilidad del 88%. Nakagawa y cols (18) y Moffit y cols (19) observaron un aumento en la actividad de la Hex en suero/plasma de pacientes con enfermedad de Gaucher, principalmente a expensas de la Hex B. Se ha sugerido que el estudio rutinario de la Hex sérica podría ser utilizado para el diagnóstico y detección de portadores de Tay-sachs podría ser útil asimismo para el diagnóstico y screening de la enfermedad de Gaucher (18). Sin embargo, los datos de Natowicz y cols (20) no apoyan esta recomendación, ya que no todos los pacientes con enfermedad de Gaucher presentan elevaciones de la actividad sérica de Hex y de la proporción relativa de Hex B. La marcada heterogeneidad de la actividad total de la Hex y de la proporción relativa de sus isoenzimas, en pacientes con enfermedad de Gaucher (20), podría ser debida a la inclusión de pacientes no tratados y tratados con corticosteroides, y que estos autores carecían de información clínica de la mayoría de sus pacientes. Tanto la terapia de remplazamiento enzimático (Tabla 1) como la medicación con corticosteroides (19) pueden disminuir la actividad sérica de la Hex en estos pacientes. Debido a la liberación de enzima de origen plaquetario durante la formación del coágulo, la actividad sérica de la Hex es significativamente mayor que la actividad en plasma (24, 25), existiendo una correlación significativa entre la diferencia de actividades y el número de plaquetas (25). Como la trombocitopenia es la alteración más comúnmente observada en sangre periférica de pacientes con enfermedad de Gaucher (1, 2), debe esperarse un aumento de la sensibilidad diagnóstica de la Hex en relación a Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 96 la capacidad funcional se hizo de acuerdo con la versión española modificada del Health Assessment Questionnaire (mHAQ) (9), y la evaluación radiológica se hizo mediante el método de Sharp´s modificado, que evalúa separadamente la erosión y la reducción del espacio articular con un máximo de puntuación de 160 para las erosiones en las manos y 120 en los pies como se ha descrito previamente (10, 11). El grupo control estaba formado por 58 individuos clínicamente sanos (31 hombres y 27 mujeres) con una edad de 46.0 ± 1.2 años (rango 31 - 68 años). Las mujeres embarazadas y las que tomaban anticonceptivos orales fueron excluidas. Las muestras de sangre utilizadas para la separación del plasma y leucocitos se recogieron en tubos Vacutainer® con EDTAK3 y para la obtención de suero se utilizaron tubos Vacutainer® sin aditivo. Los leucocitos fueron aislados de las muestras de sangre utilizando Polymorphoprep® solution (Axis-Xield Poc As, Oslo, Noruega), y la separación de los leucocitos mononucleares (MN) y polimorfonucleares (PMN) se hizo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La determinación de la heterogeneidad enzimática de la Hex se hizo termodinámicamente como se ha descrito previamente (12, 13). Para el estudio de liberación de la Hex plaquetaria se realizó una activación de las plaquetas con trombina en un plasma enriquecido de acuerdo con el procedimiento descrito por Emiliani y cols (7) ligeramente modificado, y la actividad enzimática se determinó en el sobrenadante obtenido por centrifugación. La enzima angiotensina-convertina (ECA, EC 3.4.15.1) se determinó utilizando el ACE Kinetic Test de los Bühlmann Laboratories (Allschwill, Suiza). Para la adenosin deaminasa (ADA, EC 3.5.4.4) se utilizó ADA Boehringer Test Combination (Roche Diagnostics, Basilea, Suiza), que cuantifica principalmente la actividad de la isoenzima ADA 2. La actividad sérica de la quitotriosidasa (ChT) se determinó utilizando el método fluorimétrico de Hollak y cols (14) ligeramente modificado. La concentración sérica de neopterina se determinó por ELISA con reactivos de IBL Gesellschaft für Immunochemie und Immunobiologie GMBH (Hamburgo, Alemania). La concentración sérica de proteína C reactiva fue determinada por nefelometría en un Immage Immunochemical system (Beckman). El ácido siálico se determinó enzimáticamente en un analizador Hitachi 717 usando reactivos de Boehringer Mannheim (Roche Diagnostics). Las actividades séricas de la aspartáto aminotransferasa (AST, EC 2.6.1.1.), alanina aminotransferasa (ALT, EC 2.6.1.2), lactato deidrogenasa (LDH, EC 1.1.1.27), glutamato deidrogenasa (GLDH, EC 1.4.1.3), 5’- nucleotidasa (5’NU, EC 3.1.3.5), fosfatasa alcalina (ALP, EC 3.1.3.1), γ - Resultados y discusión 97 glutamiltransferasa (GGT, EC 2.3.2.2) y colinesterasa (ChE, EC 3.1.1.8) se determinaron en un analizador Hitachi 717, utilizando reactivos de Boehringer Mannheim (Roche Diagnostic ) y Biomérieux SA (MarcyL’Etoile, Francia). Resultados y discusión En la Tabla 1 se muestran los resultados obtenidos para la actividad enzimática y energía de activación aparente de la Hex, en tres plasmas enriquecidos en plaquetas antes y después de la estimulación plaquetaria con trombina. Como puede observarse, se produjo un aumento significativo de la actividad enzimática plasmática después de la estimulación plaquetaria (p< 0.001); sin embargo, la energía de activación aparente de la Hex no se modificó significativamente, lo cual sugiere que la composición isoenzimática no se vería alterada. Por otra parte, el estudio en paralelo de la actividad enzimática de la Hex en suero y plasma de 81 pacientes no seleccionados mostró que los valores medios en suero fue significativamente mayor que en plasma (22.18 ± 1.74 U/L vs. 19.14 ± 1.77 U/L, p< 0.001), existiendo entre las actividades enzimáticas en suero y plasma una correlación altamente significativa (r= 0.953, p< 0.001). Se encontró una correlación significativa entre la diferencia de actividades enzimáticas suero/plasma y el número de plaquetas en sangre (Figura 1). Tabla 1. Actividad enzimática y energía de activación aparente de la Hex en plasmas ricos en plaquetas antes y después de la estimulación plaquetaria con trombina. Antes de estimulación Después de estimulación Plasmas Actividad (U/L) Ea (kJ/mol) Actividad (U/L) Ea (kJ/mol) 1 10.7 55.7 20.3 55.8 2 18.4 57.7 33.2 58.9 3 6.8 54.0 13.2 54.0 Media 12.0 55.8 22.3 56.2 Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 98 Figura 1. Correlación entre la diferencia de actividades suero/plasma de la β-Nacetilhexosaminidasa y el número de plaquetas en sangre. Las energías de activación de la Hex en suero y plasma presentaron un alto coeficiente de correlación (r= 0.986, p< 0.001), no encontrando diferencias significativas entre las medias (55.85 ± 0.47 kJ/mol vs. 55.96 ± 0.50 kJ/mol). Estos resultados, demuestran que si bien la actividad de la Hex en suero es significativamente mayor que en plasma, su composición isoenzimática es similar en ambos medios biológicos. Debe señalarse que el anticoagulante utilizado no interfiere en la determinación de la actividad enzimática, por lo que teniendo en cuenta estos resultados, la determinación de la Hex en el grupo de pacientes con artritis reumatoide estudiados, se hizo en plasma y no en suero, que es el medio biológico utilizado por otros autores (4, 5). No se encontraron diferencias significativas para la actividad de la Hex en plasma o leucocitos cuando se hizo una dicotomía por sexos, consecuentemente tanto en el grupo control como en el grupo de pacientes ambos sexos fueron considerados conjuntamente. Resultados y discusión 99 La Tabla 2 muestra los resultados obtenidos para la actividad total de Hex, así como para sus isoenzimas Hex A y Hex B, en plasma y en leucocitos MN y PMN. En el grupo de pacientes con artritis reumatoide las actividades de Hex total y Hex B plasmáticas presentaron valores significativamente mayores que los encontrados en el grupo control. Del mismo modo, la proporción relativa de isoenzima Hex B expresada en porcentaje fue también significativamente mayor en el grupo de pacientes, aunque no se alcanzó la correlación significativa entre actividad total de Hex y la proporción de Hex B (r= 0.226). Tabla 2. Resultados obtenidos para la actividad de la Hex y su composición isoenzimática en plasma y leucocitos de sujetos control y pacientes con artritis reumatoide. Por lo que se refiere a leucocitos PMN, las actividades específicas encontradas para la Hex total, Hex A y Hex B, fueron significativamente mayores en el grupo de pacientes que en el grupo control; pero no se encontraron diferencias significativas entre ambos grupos para los leucocitos MN. Asimismo, no se encontraron correlaciones significativas entre las actividades de Hex en plasma y las actividades específicas en leucocitos MN y PMN. En el grupo de pacientes estudiado, sólo dos casos presentaron actividades Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 100 plasmáticas más altas que el límite superior del intervalo de referencia, y en 5 casos las actividades específicas para la Hex total, Hex A y Hex B en PMN superaron el límite superior de los correspondientes intervalos de referencia. En la Tabla 3 se muestran los coeficientes de correlación obtenidos en el grupo de pacientes entre las actividades plasmáticas y leucocitarias de Hex con el mHAQ, índice de Sharp, número de articulaciones inflamadas y tiempo de evolución de la enfermedad. Sólo se encontró una correlación significativa entre la actividad plasmática de la isoenzima Hex B y el número de articulaciones inflamadas. El factor reumatoide presentó una correlación significativa con el mHAQ (r= 0.286, p< 0.05) y el número de articulaciones inflamadas (r= 0.372, p< 0.01), pero no con la actividad plasmática total de la Hex, Hex A ó Hex B. El mHAQ correlacionó significativamente con el índice de Sharp (r= 0.676, p< 0.001), el número de articulaciones inflamadas (r= 0.508, p< 0.001) y el tiempo de evolución de la enfermedad (r= 0.457, p< 0.001). El índice de Sharp presentó una correlación significativa con el número de articulaciones inflamadas (r= 0.358, p< 0.001) y tiempo de evolución de la enfermedad (r= 0.680, p<0.001). Tabla 3. Coeficientes de correlación de la Hex en plasma, leucocitos y sus isoenzimas con la actividad o severidad de la enfermedad en pacientes con AR. Resultados y discusión 101 No se encontraron correlaciones significativas para la actividad plasmática o leucocitaria de la Hex con la proteína C reactiva (PCR), ácido siálico y velocidad de sedimentación (VSG), que presentaron correlaciones significativas entre si (r≥ 0.609, p< 0.001). El mHAQ presentó una correlación significativa con VSG (r= 0.371, p< 0.01), por su parte el índice de Sharp correlacionó con la PCR (r= 0.336, p< 0.01), el ácido siálico (r= 0.364, p< 0.005) y VSG (r= 0.302, p< 0.05). El número de articulaciones inflamadas mostró una correlación significativa con la PCR (r= 0.397, p< 0.005), ácido siálico (r= 0.404, p< 0.005) y VSG (r= 0.466, p< 0.001). Por lo que se refiere a la actividades plasmáticas de Hex total, Hex A y Hex B no presentaron correlaciones significativas con los marcadores de activación macrofágica neopterina, quitotriosidasa (ChT), ADA y ECA. La neopterina correlacionó significativamente con el índice de Sharp (r= 0.343, p< 0.01) y las actividades de ADA (r= 0.407, p< 0.001) y ECA (r= 0.348, p< 0.01). La Tabla 4 muestra los coeficientes de correlación de Hex total, Hex A y Hex B plasmáticas con otras enzimas séricos, encontrando sólo significación estadística con ChE y AST. La ALP presentó correlaciones significativas con el mHAQ (r= 0.331, p< 0.05), índice de Sharp (r= 0.397, p< 0.01), tiempo de evolución de la enfermedad (r= 0.438, p< 0.001), la PCR (r= 0.331, p< 0.05), ácido siálico (r= 0.337, p< 0.05) y VSG (r= 0.363, p< 0.05). Tabla 4. Coeficientes de correlación de la Hex y sus isoenzimas en plasma con diferentes enzimas séricas en pacientes con artritis reumatoide. (n= 51). Hex Hex A Hex B AST 0.373* 0.374* 0.262 ALT 0.219 0.223 0.122 LDH 0.188 0.207 0.145 GLDH 0.098 0.116 0.069 5´NU 0.128 0.108 0.156 ALP 0.148 0.147 0.109 GGT 0.265 0.275 0.229 ChE 0.461* 0.508* 0.381* Significación: * p < 0.01 Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 102 De acuerdo con los resultados obtenidos por Emiliani y cols la activación con trombina de las plaquetas provoca una liberación de actividad de Hex (7). Debido a esta liberación de enzima plaquetaria durante la formación del coagulo, la Hex en suero es significativamente mayor que en plasma, existiendo una correlación significativa entre esta diferencia de actividades y el número de plaquetas en sangre (Figura 1). La artritis reumatoide cursa frecuentemente con trombocitosis, y en el grupo de pacientes estudiado se encontró una correlación significativa entre el número de plaquetas en sangre y el número de articulaciones inflamadas (r= 0.333, p< 0.05), la PCR (r= 0.313, p< 0.05) y ácido siálico (r= 0.459, p< 0.01). Consecuentemente la determinación de Hex sérica en pacientes con artritis reumatoide realizada en estudios previos por otros autores (4, 5), podrían conducir a resultados engañosos, siendo el plasma la muestra biológica de elección. Recientemente Shikman y cols demostraron que la Hex es la glicosidasa dominante en la degradación de glicosaminoglicanos, y que dicha enzima puede ser liberada por los condrocitos articulares humanos al compartimento extracelular (6). Por tanto una inhibición química de la actividad de Hex podría representar una nueva estrategia para prevenir, o incluso revertir, el proceso de degradación del cartílago en pacientes con osteoartritis (15). En pacientes con artritis reumatoide una actividad elevada de enzimas lisosómicas en líquido sinovial está asociada con una más severa destrucción de la articulación y observable por examen radiológico (16). De acuerdo con Berenbaum y cols (4) la Hex sérica en pacientes con artritis reumatoide tendría su origen en los condrocitos del cartílago, por lo que esta enzima podría ser utilizada como marcador de degradación del mismo. Sin embargo, los aumentos observados en nuestro estudio tanto para la Hex total en plasma como para la isoenzima Hex B, aunque estadísticamente significativos, son bastante modestos (Tabla 2). El efecto que el tratamiento farmacológico puede tener sobre la actividad enzimática en estos pacientes es bien conocido, aunque verdaderamente no se encontró una correlación significativa entre la Hex plasmática y la destrucción articular evaluada radiológicamente mediante el índice de Sharp modificado. Tampoco se alcanzaron correlaciones significativas de la Hex plasmática con la actividad o severidad de la enfermedad estimada mediante el mHAQ, número de articulaciones inflamadas o tiempo de evolución de la enfermedad, ni con los marcadores de laboratorio de inflamación. Se podría decir de forma similar a lo señalado por Berembaum y cols (4), que la actividad de Resultados y discusión 103 la Hex en suero es independiente del estatus inflamatorio en pacientes con artritis reumatoide. La aumentada liberación de Hex por los condrocitos activados en medios de cultivo sugiere que el cartílago es una fuente de Hex en las articulaciones de pacientes artríticos (4). Sin embargo, teniendo en cuenta el elevado número de leucocitos presentes en líquido sinovial en la artritis reumatoide, podría también sugerirse que estas células fuesen otra fuente de actividad Hex (4). Veys y cols (17) observaron que los leucocitos del líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide contienen más Hex que los leucocitos de sangre periférica, y la actividad enzimática en líquido sinovial de estos pacientes es marcadamente mayor que la actividad sérica (4, 17). En nuestro estudio, no se encontraron correlaciones significativas de la actividad plasmática de la Hex total y sus isoenzimas con la LDH sérica, que se ha propuesto como una medida integrada de la lisis de PMN en todas las articulaciones de pacientes con artritis reumatoide (18, 19). Aunque la actividad de las enzimas lisosómicas en suero o plasma pueden reflejar un aumento de actividad macrofágica total en el organismo, Falkenbach y cols sugieren la posibilidad de que la β-glucuronidasa en suero pueda ser un marcador de actividad macrofágica intra-articular (20-22), y podría ser usada como indicador precoz de la eficacia del tratamiento farmacológico en pacientes con artritis reumatoide (20). En enfermedades autoinmunes tiene lugar una activación de la inmunidad celular y el efecto de las diversas citocinas sobre las poblaciónes monocito/macrofágo podría ser estimado por la determinación de la neopterina sérica (23). Las enzimas ChT (24), isoenzima 2 de ADA (25) y ECA (26) son otros posibles marcadores de activación monocito / macrófago. En el grupo de pacientes estudiados ninguna de estas variables bioquímicas presentó una correlación significativa con la Hex y sus isoenzimas Hex A y Hex B, lo que podría indicar que su actividad plasmática en la artritis reumatoide no sea modulada por la activación macrofágica. Estudios previos han mostrado que la proporción de leucocitos neutrófilos activados en sangre periférica, es significativamente más alta en pacientes con artritis reumatoide que en controles (27). No obstante, los niveles intracelulares de las enzimas lisosómicas β-glucuronidasa y lisozima de neutrófilos aislados de sangre periférica de pacientes con artritis reumatoide no están alterados en comparación con los de sujetos normales (28, 29). Asimismo, los neutrófilos aislados de pacientes con artritis reumatoide presentan una menor liberación espontánea de las enzimas lisosómicas contenidas en los gránulos específicos (29). En nuestro grupo de pacientes se encontró un incremento significativo Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 104 en la actividad específica de Hex total, Hex A y Hex B en leucocitos PMN periféricos (p< 0.001) pero no se encontró una correlación significativa con la actividad enzimática en plasma. La aumentada excreción urinaria de ácido D-glucárico en pacientes con artritis reumatoide sometidos a tratamiento con fármacos antirreumáticos probablemente refleja un aumento del metabolismo hepático (30). Un aumento de la actividad de Hex total, así como de la proporción en porcentaje de isoenzima Hex B en suero/plasma, se observa frecuentemente en enfermedades hepáticas (31, 32). Sin embargo las enzimas lisosómicas podrían ser secretadas al plasma por células intactas contrariamente a las enzimas mitocondriales y citoplasmáticas liberadas por daño celular (33). La correlación significativa en el grupo de pacientes entre la actividad plasmática total de Hex y sus correspondientes isoenzimas, con la CHE sérica, podría sugerir un origen hepático para los moderados incrementos encontrados, posiblemente debido a un aumento de secreción de precursores de alta masa molecular recientemente sintetizados. La ausencia de una correlación significativa entre la Hex plasmática y las actividades séricas de GGT, ALP y 5´Nu puede ser debido al hecho que estas enzimas podrían comportarse como marcadores de inflamación en la artritis reumatoide (34-36). En conclusión, aunque la Hex participa en la degradación de la matriz extracelular del cartílago humano (4, 6, 15), nuestros resultados muestran que la actividad plasmática de la Hex, o incluso sus isoenzimas Hex A y Hex B, no puede utilizarse como una prueba adecuada para evaluar la actividad o severidad de la artritis reumatoide. La función hepática parece ser el principal determinante de la actividad de las isoenzimas de Hex en plasma. Resultados y discusión 105 Bibliografía 1. López FJ, Gónzalez CM, Monteagudo I, Carreño L. Laboratorio y líquido sinovial en la artritis reumatoide. Rev Clin Esp 2000; 200 (monograf.1): 69-75. 2. Pinheiro RC, Pinheiro MFM, Andrade CAF et al. Correlation of acute phase proteins and disease activity in rheumatoid arthritis. Clin Chem 2000; 46 (Suppl.): A 471. 3. Ismail AA, Snowden N. Autoantibodies and specific serum proteins in the diagnosis of rheumatological disorders. Ann Clin Biochem 1999; 36: 565-78. 4. Berenbaum F, Le Gars L, Toussirot E et al. 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Correlación de la actividad en plasma de la β-N-acetilhexosaminidasa (Hex) y sus isoenzimas con diferentes marcadores bioquímicos de daño hepático en el grupo de pacientes cirróticos (n= 35). Amonio Hex Hex A Hex B Hex B (%) Amonio — 0.490** 0.265 0.709*** 0.779*** AST 0.545*** 0.585*** 0.695*** 0.663*** 0.476** ALT 0.417** 0.490** 0.483** 0.420** 0.436** GGT 0.424** 0.585*** 0.572*** 0.548*** 0.237 GLDH 0.399** 0.572*** 0.475** 0.641*** 0.577*** CHE -0.405* -0.394* -0.374* -0.455** -0.264 Albúmina -0.551** -0.533*** -0.422** -0.620*** -0.426** Bilirrubina 0.604*** 0.289 0.201 0.456** 0.452** Ácidos biliares# 0.570** 0.712*** 0.687*** 0.775*** 0.540** Significación: *p< 0.05, **p< 0.01, ***p< 0.001; # n= 28 Figura 1. Correlación entre la concentración plasmática de amonio y la proporción en porcentaje de isoenzima Hex B (n= 35, r= 0.779, p< 0.001). Resultados y discusión 113 La adición de NH4Cl (1.0 mmol/L) o bilirrubina (513 μmol/L) a un pool de plasmas no afectó significativamente a la energía de activación aparente ni a la actividad enzimática de la Hex (datos no presentados). La incubación a 37ºC durante 48 horas de un pool de plasmas ajustado a un pH≈ 7.3 con ClH 1 mol/L en viales Eppendorff (Hamburgo, Alemania) cerrados y sin aire entre la muestra y la tapa para evitar pérdidas de CO2 y un aumento del pH (16), reveló una gradual inactivación de la Hex (Figura 2). Aunque la variación de la energía de activación aparente fue despreciable durante las 7 primeras horas de incubación (CV= 0.27%), después se observó un significativo incremento para esta variable termodinámica (Figura 2); sin embargo la actividad residual de las isoenzimas Hex A y Hex B nunca se diferenció más de un 20% durante el tiempo de incubación (Figura 3). Los resultados obtenidos para la composición isoenzimática de la Hex (porcentaje de isoenzima Hex B) en un pool de plasmas con pH ajustado, mediante la determinación de la energía de activación aparente enzimática y utilizando un método de inactivación térmica a 52 ºC (17) de la isoenzima Hex A, proporcionan resultados concordantes tanto antes (31.8% vs. 32.8%) como después de 24 horas de incubación a 37 ºC (40.0% vs. 40.1%). Figura 2. Efecto de la incubación a 37 ºC sobre la actividad enzimática (●) y la energía de activación aparente (○) de β-N-acetilhexosaminidasa total (Hex) en un pool de plasmas ajustado a pH≈ 7.3 Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 114 Figura 3. Efecto de la incubación a 37 ºC sobre la actividad enzimática de las isoenzimas Hex A (○) y Hex B (●) en un pool de plasmas ajustado a pH≈ 7.3. Las causas más frecuentemente asociadas a un aumento de actividad plasmática de Hex son enfermedad hepática, alcoholismo y embarazo (2, 3, 5). Este incremento de actividad enzimática es debido fundamentalmente a un incremento de la Hex P (3, 5), que básicamente sólo se diferencia de la isoenzima Hex B por presentar un mayor contenido en ácido siálico (18), con energías de activación aparente análogas para ambas formas enzimáticas (12). En el grupo de pacientes estudiados, se encontró un aumento significativo para la actividad en plasma de las isoenzimas Hex A y Hex B (Tabla 1), sin embargo, el porcentaje de Hex B no mostró diferencias significativas con respecto al grupo control. Esto podría ser debido a la rápida desaparición que se produce en suero de la Hex B durante la abstinencia alcohólica (19, 20) y a la existencia de cirrosis en nuestros pacientes, donde la proporción de Hex A en plasma tiende a ser mayor que en otras enfermedades hepáticas (2, 3, 21). Los resultados obtenidos por otros autores en la correlación de la actividad de la Hex en suero/plasma con los marcadores bioquímicos clásicos de daño hepatocelular o Resultados y discusión 115 colestasis en pacientes con enfermedad hepática o en animales de experimentación, no son del todo concordantes (4, 5, 8, 22). En el grupo de pacientes estudiado por nosotros se encontró una correlación positiva y estadísticamente significativa para Hex y sus isoenzimas Hex A y Hex B con los marcadores bioquímicos de daño hepatocelular (AST, ALT y GLDH) y colestasis (GGT, bilirrubina y ácidos biliares), y una correlación negativa con los marcadores de insuficiencia hepatocelular (albúmina y CHE) tal y como se muestra en la Tabla 2. Los cationes NH4+ causan una inhibición en la maduración de los precursores de alta masa molecular de Hex, interfiriendo en su transporte hacia los lisosomas mediante receptores específicos de manosa-6-fosfato (9-11). Esto conduce a un incremento en la secreción de formas enzimáticas recientemente sintetizadas al medio extracelular. Aunque las concentraciones plasmáticas de amonio en las enfermedades hepáticas son mucho menores que las utilizadas por Hultberg y cols en sus modelos experimentales, estos autores sugieren que después de un largo período podría ser posible lograr concentraciones intracelulares de amonio lo suficientemente elevadas para favorecer una secreción aumentada de Hex hepática al plasma (9-11). Nuestros resultados parecen estar en la línea con esta hipótesis, pues en el grupo de pacientes cirróticos estudiados se encontró una relación significativa entre las concentraciones de amonio y las actividades de Hex B en plasma. La determinación de Hex en plasma evitaría un posible enmascaramiento de los resultados, como consecuencia de la liberación que se produce de enzima procedente de las plaquetas al suero durante el proceso de coagulación (17). Los estudios realizados por Hultberg y cols en cultivos de fibroblastos (9) y células Hep G2 (10) revelaron que la adición de NH4Cl al medio se tradujo en una aumentada liberación de Hex total. Paralelamente, la proporción de Hex B extracelular aumentó con el tiempo, debido a la rápida inactivación que se produce de la Hex A a 37 ºC, y esto podría explicar el incremento de las isoformas de Hex B (particularmente Hex P) en el suero de pacientes con enfermedad hepática (9, 10). Sin embargo, se ha sugerido que la inactivación en el plasma no es aparentemente un mecanismo importante para la eliminación enzimática en el torrente circulatorio (23). La inactivación térmica de enzimas está fuertemente influenciada por la concentración proteica del medio (24), y es importante considerar que esta concentración es mucho mayor en plasma humano que la utilizada en cultivos celulares. La estabilidad de Hex a 37 ºC en muestras de suero está directamente relacionada con el pH, así a pH≈ 6.0 no se producen cambios significativos de la actividad enzimática en las primeras 24 Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 116 horas, mientras que a pH≈ 8.0 existe una importante inactivación durante las 6 primeras horas de incubación (17). Como se ha visto en los resultados antes presentados, en un pool de plasmas ajustado a pH≈ 7.3 e incubado a 37 ºC se observó una inactivación gradual de la Hex (Figura 2). El incremento de la energía de activación aparente durante el envejecimiento de la Hex plasmática en estas condiciones de pH y temperatura, es debido a la mayor inactivación de la Hex A con el consecuente aumento de la proporción relativa de Hex B, como se muestra por los resultados obtenidos para la composición isoenzimática utilizando el método de inactivación térmica. El descenso de actividad enzimática no puede ser explicado por la aparición de más o menos moléculas inactivas en el plasma, con mayor energía de activación y menor actividad catalítica específica. Nuestros resultados sugieren que la inactivación de Hex en plasma sucede de acuerdo con el principio de todo o nada, y normalmente las moléculas activas están presentes junto con moléculas completamente inactivas. Dado que estas moléculas inactivas no pueden contribuir a la hidrólisis del substrato y al incremento temperatura-dependiente de la velocidad de reacción, las energías de activación de las isoenzimas Hex A y Hex B activas permanecen constantes. Así, en condiciones fisiológicas de pH y temperatura tras las primeras 7 horas de incubación, la isoenzima Hex A en las muestras de plasma se inactiva en mayor medida que la Hex B, aunque parece que la diferencia de estabilidad es menor que la descrita para las isoenzimas secretadas en cultivos celulares (9, 10). Aunque los resultados encontrados no pueden ser totalmente extrapolados a pacientes humanos, la vida media de las formas plasmáticas de Hex humana tras ser infundidas en la circulación de ratones es de aproximadamente 2-4 horas (25). Por los resultados mostrados en la Figura 3 para la estabilidad de las isoenzimas de Hex en plasma, no parece que el incremento en proporción de Hex B en enfermedades hepáticas se deba únicamente a la inactivación de Hex A a nivel circulatorio. En cultivos celulares las subunidades α y β son sintetizadas aproximadamente en cantidades similares, aunque, estas dimerizan a diferente velocidad, posiblemente debido a paso velocidad limitante en la asociación de las subunidades α (26). En los pacientes con enfermedad hepática, las subunidades β recientemente sintetizadas podrían dimerizarse más rápidamente para formar Hex B, cuya secreción al plasma podría verse incrementada por la acción del amonio. La correlación encontrada entre la concentración plasmática de amonio y la proporción de Hex B apunta en esta dirección. Resultados y discusión 117 En cualquier caso, el mecanismo por el cual se producen incrementos de las isoenzimas de Hex en plasma en las enfermedades hepaticas es multifactorial. De hecho, se encontró una correlación parcial significativa entre la proporción de Hex B y la concentración de ácidos biliares, que según Hultberg y cols no afectarían a la secreción de Hex al medio extracelular (10). En la enfermedad hepática el deterioro de la síntesis de urea conduce a un aumento en la concentración plasmática de amonio, especialmente en la cirrosis, con una derivación de este hacia la sangre venosa portal y una pérdida de masa funcional hepática (27). Sin embargo, en pacientes cirróticos la proporción de Hex A en hígado (21) y suero (2, 3, 21) puede ser mayor que en pacientes no cirróticos, posiblemente debido a una reacción mesenquimatosa (21, 27). Estos aspectos deben ser estudiados en un amplio grupo de pacientes cuya enfermedad hepática sea caracterizada por criterios clínicos, bioquímicos y anatomopatológicos. Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 118 Bibliografía 1. Elsafi ME; Hultberg B, Isaksson A, Hägerstrand I, Prytz H, Stenram U. Lysosomes and human liver disease: a biochemical and immunohistochemical study of βhexosaminidase. Eur J Clin Chem Invest 1994; 32: 669-73. 2. Isaksson A, Hultberg B. Immunoassay of β-hexosaminidase isoenzymes in serum in patients with raised total activities. Clin Chim Acta 1989; 183: 155-62. 3. Hultberg B, Isaksson A, Jansson L. β-Hexosaminidase in serum from patients with cirrosis and cholestasis. Enzyme 1981; 26: 296-300. 4. Hultberg B, Palsson B, Isaksson A, Masson P. β-Hexosaminidase in bile and plasma from patients with cholestasis. Liver 1995; 15: 153-58. 5. Hultberg B, Isaksson A. 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En el presente apartado, se presentan los resultados del estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la Hex utilizando la energía de activación aparente de la enzima en plasmas seminales de individuos normozoospérmicos, oligozoospérmicos, azoospérmicos y vasectomizados. Material y métodos Las muestras de semen se obtuvieron por masturbación, después de un período de 4 días de abstinencia sexual, de 86 hombres con una media (± SEM) de edad de 34.86 ± 0.68 años (rango de 20.0-50.0 años). El recuento de espermatozoides, así como el estudio de su motilidad y vitalidad, se hizo tras la licuefacción del semen y dentro de la primera hora después de la eyaculación, de acuerdo con los métodos estandarizados propuestos por la O.M.S. (6). Una alícuota de los eyaculados se centrifugó a 800g durante 10 minutos y el sobrenadante obtenido libre de espermatozoides se congeló a –37 ºC hasta el momento de ser procesada para determinar la actividad de la Hex. De acuerdo con los criterios de la O.M.S. se consideraron normozoospérmicos los eyaculados que presentaron más de 20 millones de espermatozoides/mL de eyaculado y oligozoospérmicos los eyaculados presentando menos 20 millones de espermatozoides/ mL. La determinación de la Hex y el cálculo de su energía de activación aparente en las muestras de plasma seminal se hicieron como se ha descrito previamente (7). El posible efecto inhibidor de la albúmina sobre la actividad enzimática de la Hex (8) no fue considerado teniendo en cuenta la baja concentración de albúmina que *Casal JA, Vizcaíno L, Garcia-Devesa J, Tutor JC. Thermodynamic study of β-Nacetylhexosaminidase enzyme heterogeneity in human seminal plasma. Clin Chim Acta 2005; 355: 55-60. Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 128 La energía de activación calculada para la Hex A (41.5 kJ/mol) es similar a la previamente descrita para esta isoenzima en muestras de plasma (41.8 kJ/mol) (7). Por su parte la isoenzima Hex B en plasma seminal presentó una energía de activación (72.3 kJ/mol) ligeramente menor que la encontrada en plasma (75.1 kJ/mol). En cualquier caso, la significativa diferencia entre las energías de activación de ambas isoenzimas, permite la determinación simple y precisa de la heterogeneidad enzimática de las Hex en muestras de plasma seminal. De acuerdo con resultados previos obtenidos para la Hex total (4), el grupo de azoospérmicos presentó actividades de Hex total, Hex A y Hex B significativamente mayores que el grupo de vasectomizados (p< 0.05). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas entre las actividades de la Hex total y Hex B en los grupos de normozoospérmicos y azoospérmicos (Tabla 1). Por tanto no se ha podido confirmar la sugerencia de Dandekar y Harkumar (4) de que la Hex total podría ser utilizada como un marcador bioquímico de azoospermia, siendo nuestros resultados más concordantes con los de otros autores (3). La actividad de Hex A es significativamente mayor en el grupo de normozoospérmicos que en el de azoospérmicos (p< 0.05), pero como se indica en la Figura 3 existe un amplio solapamiento entre las actividades enzimáticas de ambos grupos. El estudio de Ben Ayed y cols (3) sugiere que la Hex en plasma seminal tiene un origen principalmente prostático y epididimal. Desgraciadamente, en los casos de azoospermia estudiados, no se pudo conocer el diagnóstico diferencial de obstrucción epididimal o insuficiencia espermatogénica, condiciones clínicas en las cuales un estudio comparativo de la actividad enzimática de la Hex podría ser interesante. Parece evidente que la Hex, no solamente es transportada en forma soluble en el interior del acrosoma del espermatozoide, sino que podría estar formando parte como una proteína integral de la membrana del mismo (10) y aunque quizás alguna actividad enzimática débilmente unida puede ser liberada durante la centrifugación (10). Los resultados de Kawakawi y cols (11) no demostraron la liberación de actividad de Hex de acrosomas intactos de espermatozoides de perro. Sin embargo, nosotros encontramos una correlación parcial significativa de las actividades de la Hex total, Hex A y Hex B con el recuento de espermatozoides inmóviles (p< 0.01) y de la Hex total y de la Hex B con el recuento de espermatozoides muertos (p< 0.05). Aunque la actividad de Hex de origen acrosomal en el plasma seminal parece cuantitativamente poco importante, los resultados antes señalados son llamativos Resultados y discusión 129 teniendo en cuenta que en el esperma de ratón solo se ha podido caracterizar el isoenzima Hex B (12). A modo de conclusión puede señalarse que la actividad de la Hex total o incluso de sus isoenzimas Hex A y Hex B, no parece ser un marcador bioquímico adecuado de azoospermia. Se ha señalado que algunas enzimas de origen espermático son particularmente termolábiles (12, 13), lo cual podría estar relacionado con las bajas temperaturas requeridas para la espermatogénesis (12). Este hecho podría dificultar la utilización de métodos de inactivación térmica en la determinación de las isoenzimas de las Hex en espermatozoides y el procedimiento termodinámico descrito constituye una alternativa válida para el estudio de la heterogeneidad enzimática de la Hex en espermatozoides, a la que aun no se le ha dedicado suficiente atención. Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 130 Bibliografía 1. Kapur DK, Gupta GS. Purification, biochemical properties and active sites of Nacetyl-β-D-hexosaminidases from human seminal plasma. Biochem J 1986; 15: 13339. 2. Ben Ayed S, Gonzales J, Foglietti MJ, Percheron F, Bernard M. On some glycosidases (β-D-mannosidase, α-L-fucosidase, N-acetyl-β-D-glucosaminidase) of human seminal plasma. 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Assay of serum/plasma β-N-acetylhexosaminidase isoenzymes by heat inactivation using a continuous spectrophotometric method adapted to a centrifugal analyzer. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1997; 35: 445-52. 9. Demetriou JA, Drewes PA, Gin JB. Enzymes In: Henry JB, Winkelman JW, editors, Clinical Chemistry. Principles and Techniques. 2nd Edition. Hagerstown: Harper and Row Publishers, 1974, pp. 815-1001. 10. Hutchinson T, Dwivedi K, Rastogi A, Prasad R, Pereira BMJ. N-acetyl-β-Dglucosaminidase is not attached to human sperm membranes through the glycosylphosphatidyl inositol (GPI)-anchor. Asian J Androl 2002; 4: 27-33. 11. Kawakami E, Arai T, Oishi I. Changes in hyaluronidase, acrosin, and Nacetylhexosaminidase activities of dog sperm after incubation. J Vet Med Sci 1999; 61: 183-84. Resultados y discusión 131 12. Miller DJ, Gong X, Shur BD. Sperm require β-N-acetylglucosaminidase to penetrate through the egg zone pellucida. Development 1993; 118: 1279-89. 13. Shur BD, Neely CA. 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Los factores pronósticos negativos de insuficiencia renal grave son, sexo masculino, comienzo de hipertensión en estadíos tempranos, aumento del tamaño renal, así como un incremento en la excreción urinaria de albúmina (3). En los primeros estudios electroforéticos realizados en muestras de orina de pacientes con poliquistosis renal (PR), se indicó que en la fase inicial de la enfermedad, con filtración glomerular (FG) conservada, la proteinuria sería cuanti y cualitativamente normal, o de tipo glomerular altamente selectivo (5). Una vez que el deterioro de la función renal ha comenzado, la proteinuria podría ser glomerular, y sólo en fases más avanzadas de insuficiencia renal sería de tipo mixto, glomerular y tubular (5). El incremento de albúmina en orina, sin aumento de proteínas de bajo peso molecular, se considerará un marcador precoz de daño glomerular (6), y en los pacientes con PRAD la microalbuminuria es más frecuente que la proteinuria (3). La microalbuminuria en estos pacientes puede estar asociada con aumento de la tensión arterial (7-9), progresión a insuficiencia renal (8), así como una mayor formación de quistes (7); sin embargo, en pacientes con PRAD normotensos, la microalbuminuria presentaría asimismo una aumentada prevalencia (10). La excreción urinaria aumentada de Hex, indica una liberación directa de material procedente del túbulo proximal (6, 11). Swedenborg y cols (12), encontraron un aumento de la actividad urinaria de la Hex en pacientes con PR, que estaría relacionada con los cambios de creatinina sérica producidos durante el período de un año. Este es un dato *Casal JA, Hermida J, Lens XM, Tutor JC. A comparative study of three kidney biomarker tests in autosomal-dominant polycystic kidney disease. Kidney Int 2005; 68: 948-54. Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 134 interesante ya que, teniendo en cuenta las alteraciones renales, tanto estructurales como funcionales, encontradas en ratas con PR inducida por difeniltiazol, se ha sugerido que el deterioro de la función renal en las formas clínicas de PR podría ser debido primariamente a alteraciones en el túbulo en lugar de alteraciones glomerulares o vasculares (13). El objetivo fue hacer un estudio comparativo en pacientes con PRAD de tres marcadores bioquímicos precoces de daño renal como la albúmina, y la actividad total de la Hex y sus isoenzimas en orina, así como la glutatión peroxidasa sérica (GPx EC 1.11.1.9) que ha sido considerada un marcador de la función del túbulo proximal (14). Asimismo, la GPx es un importante enzima antioxidante y distintas observaciones sugieren que la severidad de la PR puede estar modulada por el stres-oxidativo (15). Paralelamente también fueron determinados otros marcadores de disfunción renal como la cistatina C, creatinina y urea en suero. Material y métodos Se estudiaron un total de 92 pacientes con PRAD (42 hombres y 50 mujeres) con una edad media (±DEM) de 42.3 ± 1.5 años (rango 14 - 83 años), cuyo diagnóstico se realizó en base a su historia familiar, hallazgos ecográficos típicos, y test genéticos. Treinta y cinco pacientes eran normotensos y 57 con hipertensión arterial, siendo tratados con fármacos antihipertensivos, preferentemente inhibidores de la enzima angiotensinaconvertina (ECA) y antagonistas del receptor II de la angiotensina. De acuerdo con la excreción urinaria de albúmina y concentración sérica de cistatina C, los pacientes se clasificaron en los siguientes grupos: I) normoalbuminuria; II) microalbuminuria; III) macroalbuminuria; IV) insuficiencia renal (cistatina C >1.3mg/L). Asimismo, en función de los hallazgos ecográficos se clasificaron en tres grupos: I) con menos de 10 quistes en cada riñón (índice ecográfico 1); II) con ligero aumento del tamaño de los riñones y más de 10 quistes en cada uno (índice ecográfico 2); III) con marcado aumento del tamaño de los riñones y elevado número de quistes (índice ecográfico 3). En 42 de estos pacientes (7 de ellos con insuficiencia renal y 35 sin ella), con una edad media de 37.0 ± 2.5 años (rango 22-49 años) y que acudieron a revisión clínica, se realizó una segunda determinación al cabo de un año de la excreción urinaria de Hex y albúmina, así como las concentraciones séricas de cistatina C, creatinina y urea. Las variaciones relativas producidas para estos parámetros bioquímicos durante este período de tiempo se calcularon mediante la expresión: Cambio relativo (%)= 100 (V2-V1)/V1; donde V1 es el primer valor y V2 el Resultados y discusión 135 segundo. Como grupo control se estudiaron 54 individuos clínicamente sanos, con análoga distribución por edad y sexo a la de los pacientes. Las muestras de sangre se tomaron por la mañana en ayunas y las muestras de orina utilizadas correspondieron a la segunda micción del día, recogidas de acuerdo con las recomendaciones de Itoh y cols (16) para evitar falsos resultados para la Hex como consecuencia de la contaminación con enzima de origen genital. En todos los casos las orinas presentaron un pH< 8. El método termodinámico empleado para determinar la actividad enzimática de la Hex así como la evaluación de sus correspondientes isoenzimas (Hex A y Hex B) se ha descrito previamente (17) y los resultados se expresaron en U/g creatinina. La albúmina urinaria se determinó por nefelometría utilizando reactivos comercializados por Dade Behring (Liederbach, Alemania). Los resultados se expresaron como cociente entre las concentraciones de albúmina y creatinina en orina (RAC) y las unidades empleadas fueron mg/g creatinina. De acuerdo con las recomendaciones de la American Diabetes Association (18), la normoalbuminuria se definió como un valor menor de 30 mg/g creatinina, microalbuminuria de 30–300 mg/g creatinina y macroalbuminuria mayor de 300 mg/g creatinina. La GPx (masa) sérica se determinó utilizando un anticuerpo policlonal específico para la forma enzimática plasmática extracelular humana (GPx3), usando el inmunoanálisis Bioxytech pl.GPx-EIA commercializado por Oxis International Inc. (Portland, USA). La cistatina C sérica fue determinada por inmunoturbidimetría (Dako Cytomation, Glostrup, Dinamarca). La determinación de creatinina y urea se realizó con procedimientos estándarizados en un Advia 1650 analyzer (Bayer Corp., Tarrytown, USA). Resultados y discusión Los resultados obtenidos para las diferentes variables estudiadas en el grupo de pacientes con PRAD y en el grupo control se muestran en la Tabla 1. La dicotomía de los pacientes en función del sexo no ofreció información de interés adicional. En el caso de la GPx sérica, no se encontró una diferencia estadísticamente significativa entre los distintos grupos. Los rangos de referencia calculados para la excreción urinaria de Hex en el grupo control fueron: 1.0 - 4.4 U/g creatinina para Hex total (distribución log-normal), 0.9 – 3.4 U/g creatinina para Hex A (distribución log-normal), 0.0-1.3 U/g creatinina para Hex B (distribución no gausiana) y 0 – 33% para la proporción relativa de Hex B (distribución no gausiana). El grupo de pacientes con normoalbuminuria presentó valores significativamente mayores para la excreción de Hex B (p< 0.05) y la proporción relativa en Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la ß–N-acetilhexosaminidasa 136 porcentaje de esta isoenzima (p< 0.01) que el grupo control. En 5 casos (12%) la excreción urinaria de la Hex B y en 18 casos (43%) la proporción relativa de Hex B fue mayor que el correspondiente límite superior de referencia. Resultados y discusión 137