Catálisis de Rutenio en Química Bioortogonal: Viabilidad de nuevos métodos basados en intermedios vinilidénicos

Catálisis de Rutenio en Química Bioortogonal: Viabilidad de nuevos métodos basados en intermedios vinilidénicos Laura Parada Pérez José Luis Mascareñas Cid, titor e docente do Departamento de Química Orgánica, e Fernando López García, cotitor e docente do Departamento de Química Orgánica, autorizan a presentación do Traballo de Fin de Grao da alumna Laura Parada Pérez na convocatoria de xullo do 2023-2024, o cal foi realizado baixo a súa dirección no Centro de Investigación en Química Biolóxica e Materiais Moleculares da Universidade de Santiago de Compostela (CiQUS). E para que así conste asinamos o presente informe en Santiago de Compostela o 28 de xuño de 2024. Firmado por LOPEZ GARCIA FERNANDO JOSE - ***6333** el día 28/06/2024 con un certificado emitido por AC FNMT Usuarios MASCAREÑAS CID JOSE LUIS - 34934771W Firmado digitalmente por MASCAREÑAS CID JOSE LUIS - 34934771W Fecha: 2024.06.28 14:00:58 +02'00' ÍNDICE ABREVIATURAS .................................................................................................................... 1 RESUMEN ................................................................................................................................ 2 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 4 1.1. Química bioortogonal ....................................................................................................... 4 1.2. Catálisis con complejos de rutenio en medios de relevancia biológica ......................... 5 1.2.1. Reacciones de rotura de enlaces ............................................................................... 6 1.2.2. Reacciones de formación de enlaces ........................................................................ 7 1.2.3. Reacciones redox ...................................................................................................... 9 1.2.4. Fotocatálisis bioortogonal ...................................................................................... 10 1.3. Vinilidenos metálicos: especies reactivas inexploradas en química bioortogonal ..... 10 2. OBJETIVOS Y PLANIFICACIÓN .................................................................................. 13 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................................... 14 3.1. Optimización de la síntesis de indoles a través de vinilidenos de rutenio .................. 14 3.1.1. Análisis por GC-MS ................................................................................................ 14 3.1.2. Análisis por 1H-RMN .............................................................................................. 16 3.2. Ligandos azaryphos para la síntesis de indol a través de vinilidenos de rutenio ...... 25 3.3. Alenilidenos de rutenio para la síntesis de furanos ...................................................... 27 3.4. Procedimientos experimentales ...................................................................................... 29 4. CONCLUSIONES .............................................................................................................. 37 BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................... 39 ANEXOS ................................................................................................................................. 44 Anexo I: Espectros de RMN .................................................................................................. 44 1 ABREVIATURAS ABTS 2,2’-azinobis(3etilbenzotiazolina-6-sulfonato de diamonio) IEDDA Diels-Alder de demanda electrónica inversa bis-CF3-bpy 5,5’-bis(trifluorometil)-2,2’- bipiridina m multiplete bpy bipiridina Me metilo c cuadruplete NAD + nicotinamida adenina dinucleótido (forma oxidada) COD 1,5-ciclooctadieno OAc acetato Cp ciclopentadieno PBS tampón fosfato salino (phosphate buffer saline) Cp* pentametilciclopentadieno Ph fenilo CuAAC cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre ppm partes por millón d doblete r.t. temperatura ambiente dd doble doblete RMN resonancia magnética nuclear DMF N,N-dimetilformamida RuAAC cicloadición de azida-alquino catalizada por rutenio DMSO dimetilsulfóxido RuAtAC cicloadición de azida-tioalquino catalizada por rutenio dppf 1,1’-bis (difenilfosfino) ferroceno SPAAC cicloadición de azida-alquino promovida por tensión dt doble triplete TBAF fluoruro de tetrabutilamonio Et etilo THF tetrahidrofurano E. coli Escherichia coli TLC cromatografía de capa fina (thin layer chromatography) equiv. equivalente TMB 1,3,5-trimetoxibenceno GC-MS cromatografía de gasesespectrometría de masas UV ultravioleta HeLa Henrietta Lacks 2 RESUMEN El desarrollo de nuevas reacciones bioortogonales y biocompatibles ha supuesto una revolución en la química sintética y la química biológica, dado el potencial que éstas ofrecen en ámbitos como la biomedicina. En este sentido, el uso de complejos de metales de transición (como Ru, Cu y Au) como catalizadores de estas reacciones puede representar una poderosa herramienta, debido a la versatilidad mecanística que permiten. En concreto, la introducción de especies reactivas como los vinilidenos metálicos en química bioortogonal es de gran interés para los avances en este campo. En este Trabajo de Fin de Grado, se presenta la optimización de la isomerización de ortoalquinil anilinas a indoles para su traslado a medios biológicos. Esta reacción transcurre a través de vinilidenos de rutenio, y permite la formación de moléculas de alto interés biológico. Además, se ha sintetizado un complejo de rutenio con un ligando azaryphos, altamente eficiente en reacciones cuyo mecanismo involucra vinilidenos de rutenio. Este se ha utilizado para catalizar la reacción de formación de indoles estudiada, y ha permitido adaptarla a medios acuosos. Por último, se ha preparado un complejo de rutenio que permite la formación de furanos a través de vinilidenos y alenilidenos de rutenio. Se ha conseguido llevar a cabo esta reacción en medios acuosos y a bajas temperaturas (40 ºC), lo que abre la puerta a futuras investigaciones para su traslado a medios biológicos. RESUMO O desenvolvemento de novas reaccións bioortogonais e biocompatibles supuxo unha revolución na química sintética e na química biolóxica, dado o potencial que estas ofrecen en ámbitos como a biomedicina. Neste sentido, o uso de complexos de metais de transición (como Ru, Cu e Au) como catalizadores destas reaccións pode representar unha poderosa ferramenta, debido á versatilidade mecanística que permiten. En concreto, a introdución de especies reactivas como os vinilidenos metálicos na química bioortogonal é de gran interese para os avances neste campo. Neste Traballo de Fin de Grao, preséntase a optimización da isomerización de orto-alquinil anilinas a indois para o seu traslado a medios biolóxicos. Esta reacción transcorre a través de vinilidenos de rutenio, e permite a formación de moléculas de alto interese biolóxico. Ademais, sintetizouse un complexo de rutenio cun ligando azaryphos, altamente eficiente en reaccións cuxo mecanismo involucra vinilidenos de rutenio. Este foi utilizado para catalizar a reacción de formación de indois estudada, e permitiu adaptala a medios acuosos. Por último, preparouse un complexo de rutenio que permite a formación de furanos a través de vinilidenos e alenilidenos de rutenio. Conseguiuse levar a cabo esta reacción en medios acuosos 3 e a baixas temperaturas (40 ºC), o que abre a porta a futuras investigacións para o seu traslado a medios biolóxicos. ABSTRACT The development of new bioorthogonal and biocompatible reactions has meant a revolution in Synthetic Chemistry and Biological Chemistry, due to the potential they offer in areas such as biomedicine. In this sense, the use of transition metal complexes (such as Ru, Cu and Au) as catalysts in these reactions can constitute a powerful tool, given the mechanistic versatility they offer. Specifically, the introduction of reactive species such as metallic vinylidenes in Bioorthogonal Chemistry is of great interest for advances in this field. In this Degree Final Project, we present the optimization of the isomerization of orthoalkynyl anilines to indoles for its transfer to biological media. This reaction takes place through ruthenium vinylidenes, and it allows the formation of highly biologically interesting molecules. Moreover, we have synthesized a ruthenium complex containing an azaryphos ligand, which is highly efficient in reactions whose mechanism involves ruthenium vinylidenes. This complex has been used to catalyse the formation of indoles, and it has allowed us to adapt it to aqueous media. Lastly, we have prepared a ruthenium complex which catalyses the formation of furans through ruthenium vinylidenes and allenylidenes. It has been possible to perform this reaction in aqueous media and at low temperatures (40 ºC), which opens a door for future investigations for its transfer to biological media. 4 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Química bioortogonal El concepto de química bioortogonal fue introducido por Carolyn R. Bertozzi en 2003,1 y abarca el conjunto de reacciones químicas que pueden ser llevadas a cabo en el interior de un organismo vivo sin interferir en su funcionamiento. Estas reacciones se caracterizan por sus altos rendimientos y cinética rápida, su elevada selectividad y su especificidad, así como por la estabilidad y biocompatibilidad de los reactivos y productos en el medio celular.2,3 Estas características suponen un reto, dada la alta complejidad que supone el interior de una célula: es necesario el uso de agua como disolvente (aunque se introduzcan pequeñas cantidades de disolventes orgánicos), un pH neutro, temperatura ambiente (hasta 40 ºC), bajas concentraciones de reactivos y una mínima toxicidad de estos.4 Entre los primeros ejemplos de reacciones en este campo se encuentran la formación de oximas por condensación de cetonas y aldehídos con aminas nucleofílicas5 de Rideout y la ligación de Staudinger entre azidas y triarilfosfinas.6 Aunque en un principio la química bioortogonal se orientó principalmente hacia la modificación de proteínas, pronto las reacciones de formación de enlaces llamaron la atención y evolucionaron hacia objetivos más diversos. Así, la química click -concepto introducido por Sharpless en 2001-7 empezó a combinarse con la química bioortogonal gracias a la reacción de cicloadición [3+2] entre azidas y alquinos catalizada por cobre (CuAAC, Figura 1), publicada independientemente por Sharpless8 y Meldal.9 Ésta mejoraba algunas características de la cicloadición original 1,3-dipolar de Huisgen como su regioselectividad, velocidad y temperatura de reacción, entre otras; permitiendo unas condiciones de trabajo más suaves. Esta reacción supuso una revolución en este ámbito, y ha tenido numerosas aplicaciones en química biológica, entre otros campos. Figura 1: Cicloadición [3+2] entre azidas y alquinos catalizada por Cu (CuAAC). Sin embargo, aunque el uso de metales como catalizadores resulta atractivo, se ha investigado la posibilidad de evitar su uso en las reacciones bioortogonales. Un ejemplo de esto es la cicloadición entre azidas y alquinos promovida por tensión anular (SPAAC, Figura 2),10 desarrollada por el grupo de Bertozzi, inspirándose en el trabajo de Wittig y Krebs sobre cicloalquinos tensionados.11 Pese a sus atractivas características, esta reacción presenta desventajas frente a la CuAAC, tales como su menor velocidad, la dificultad de preparación de los reactivos, su inestabilidad y las posibles reacciones inespecíficas con nucleófilos del medio. 5 Figura 2: Cicloadición entre azidas y ciclooctinos promovida por la tensión anular de éstos (SPAAC). Dados estos problemas, los esfuerzos por descubrir nuevas reacciones impulsadas por tensión estructural se han incrementado. De esta forma, la reacción de Diels-Alder de demanda electrónica inversa (IEDDA) se ha convertido en una de las reacciones bioortogonales más conocidas. El grupo de Fox la dio a conocer en 2008,12 demostrando su biocompatibilidad y eficiencia en medios biológicos; lo que impulsó publicaciones profundizando en el posible alcance de este tipo de cicloadiciones.13 Pese a su gran éxito, esta reacción presenta también problemas de reactividad no específica y de dificultad en la preparación de los sustratos. Por otra parte, un área de creciente interés en química biológica es la fotoquímica bioortogonal, dados los altos rendimientos que este tipo de reacciones ofrecen y el hecho de no necesitar metales como catalizadores. De nuevo, esta área está estrechamente relacionada con la química click, como se ve en ejemplos como la cicloadición 1,3-dipolar inducida por luz, cuya bioortogonalidad fue demostrada por el grupo de Lin.14 Este equipo ha conseguido trasladar la reacción a distintos medios biológicos, como bacterias E. coli15 y células de mamíferos.16 Como es de esperar, este tipo de reacciones tienen un altísimo potencial, pero también presentan limitaciones como la menor velocidad con respecto a la CuAAC, problemas de selectividad y la necesidad de luz UV para su funcionamiento.17 Pese a ello, su relevancia es innegable, con aplicaciones en reacciones como la SPAAC18 y la IEDDA.19 1.2. Catálisis con complejos de rutenio en medios de relevancia biológica El rutenio (Ru) es un metal de transición situado en el grupo 8 de la tabla periódica. Los complejos de este metal han sido ampliamente usados como catalizadores en química sintética, ya que suelen presentar muy buen balance entre reactividad y estabilidad, pueden modularse utilizando distintos ligandos y participan en las etapas típicas de los mecanismos organometálicos. La mayoría de las reacciones en las que está involucrado implican intermedios organometálicos, con cambios de oxidación cíclicos en sus mecanismos (las valencias más comunes de este metal en catálisis varían entre +2 y +4). Además, el rutenio ofrece un gran abanico de posibilidades a nivel mecanístico, pudiendo utilizarse en reacciones de formación de enlaces, de desprotección, de cicloadición o isomerización, entre otras. Así, se conocen numerosos intermedios organometálicos con Ru, como carbenos, vinilidenos, alenilidenos, π-alilos, etc. 6 Atendiendo a su papel en catálisis, el rutenio no ha tenido un desarrollo tan visible como otros metales de transición como el Pd o el Rh, que poseen aplicaciones a nivel industrial como el proceso Wacker y la hidroformilación de alquenos.20 Esto tiene su raíz en problemas de disponibilidad o de inactivación de especies de Ru0 y RuII. Sin embargo, poco a poco se ha descubierto el potencial de este metal como catalizador en síntesis orgánica, con características que no ofrecen metales como Pd o Rh. En términos de química bioortogonal, los complejos metálicos más estudiados involucran metales como Pd21 y Cu,22 entre otros. Sin embargo, en muchas ocasiones estos compuestos no ofrecen buenos resultados a nivel de eficiencia, y se enfrentan a problemas de biocompatibilidad y desactivación en medios acuosos. En este sentido, el rutenio es una gran alternativa, gracias a sus altos niveles de biocompatibilidad y la variedad de reacciones que permite estudiar.23 De esta forma, la estrategia tradicional para las reacciones catalizadas por complejos de Ru (uso de disolventes orgánicos y ausencia de agua y oxígeno) se ha visto desplazada gracias al descubrimiento de la tolerancia de este metal a medios acuosos. Esto ha llevado a una investigación más profunda sobre este elemento, lo cual ha permitido encontrar aplicaciones incluso en el ámbito de la biomedicina, con agentes anticancerígenos de rutenio como potenciales herramientas.24 En este apartado, se discutirán algunas de las reacciones catalizadas por Ru más relevantes para la química bioortogonal. 1.2.1. Reacciones de rotura de enlaces Un hito en el campo de la catálisis organometálica en química bioortogonal fue el descubrimiento por parte del grupo de Meggers, en 2006,25 de una desprotección de aminas catalizada por un complejo de RuII (Figura 3), con la correspondiente rotura de los carbamatos de alilo presentes. La reacción, catalizada por el complejo [Cp*Ru(COD)Cl], transcurre en presencia de agua y aire, e incluso puede tener lugar en el interior de células de mamíferos. Así, se demostró la posibilidad de utilizar metales de transición para llevar a cabo reacciones dentro de células. Figura 3: Desprotección de aminas catalizada por RuII publicada por el grupo de Meggers.25 El mecanismo de la reacción es similar al propuesto por Tsuji-Trost para procesos de sustitución alílica catalizada por metales, involucrando una coordinación del alilo al complejo 13 2. OBJETIVOS Y PLANIFICACIÓN En base a estos precedentes, en este Trabajo de Fin de Grado se estudiará la optimización de la formación de indoles a partir de orto-alquinil anilinas, mediante el uso de complejos de rutenio que permitan la formación de intermedios vinilidénicos estables en medio acuoso. Todo ello se desarrolla en el marco de un objetivo más amplio, que pretende el desarrollo de nuevas reacciones bioortogonales y biocompatibles catalizadas por complejos de rutenio, a través de especies vinilidénicas intermedias. En concreto, los objetivos específicos son: 1) Estudio en profundidad de la reacción de formación de indol para determinar el origen de la disparidad entre conversión y rendimiento y 2) síntesis de distintos complejos de rutenio para optimizar dicha reacción, incluyendo el análisis de las condiciones de reacción óptimas. Todo el trabajo se ha llevado a cabo con la ayuda del doctorando Leonard G. Cool. El plan seguido es el mostrado en la Tabla 1. Tabla 1: Cronograma de actividades Noviembre Diciembre Enero Febrero Marzo Abril Mayo Junio Revisión bibliográfica X X Optimización de la reacción X X X X Síntesis de catalizadores X X X Nuevas reacciones X X X Seminarios de grupo X X X X X Escritura del trabajo X X 14 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. Optimización de la síntesis de indoles a través de vinilidenos de rutenio 3.1.1. Análisis por GC-MS El primer objetivo de este trabajo fue tratar reproducir los resultados preliminares obtenidos previamente por este grupo, con el fin de familiarizarse con la reacción de interés (Figura 9) y analizar en profundidad la disparidad entre los datos de conversión y rendimiento. Para ello, se partió de las condiciones ensayadas, usando como catalizador el complejo [(η3:η3C10H16)RuCl(OAc)] (Ru1, 5 mol%), y la reacción se llevó a cabo a 37 ºC, en una mezcla DMSO:H2O (1:9) durante 16 horas. Según los resultados anteriores, la conversión del reactivo inicial observada por GC-MS oscilaba entre el 47 y el 99% y el rendimiento del indol variaba entre el 9 y el 27%. Sin embargo, al analizar nuevamente la reacción, se observó una conversión completa del sustrato, mientras que no se encontró producto. Para dar con el problema, se decidió repetir la optimización de las condiciones de la reacción utilizando diferentes disolventes y analizando los resultados mediante GC-MS. Para mejorar la precisión de los valores de conversión y rendimiento, se elaboraron dos rectas de calibrado para 1 (Figura 10a) y 2 (Figura 10b), utilizando como patrón interno: escatol (5-75 mM) y como disolvente: CH2Cl2. Figura 10: a) (izq.) Recta de calibrado de GC-MS de 1 en CH2Cl2 utilizando escatol como patrón interno. b) (dcha.) Recta de calibrado de GC-MS de 2 en CH2Cl2 utilizando escatol como patrón interno. En estos experimentos (Figura 11), solamente se detectaron trazas de indol (2) por GC-MS, no pudiendo determinar el rendimiento de las reacciones en la recta de calibrado, ya que las cantidades obtenidas eran menores que el límite inferior de la recta, 5 mM. 15 Figura 11: Reacción de 1 a 2 en diferentes disolventes. Condiciones: 1 (1 equiv., 70 mM), disolvente (1 mL), 37ºC, 16 h, atmósfera de N2. Rendimientos y conversiones calculados mediante rectas de calibrado en GC-MS. Elaboración: dilución con H2O (4 mL), extracción con CH2Cl2 (3x2 mL), evaporación en rotavapor y secado a vacío. En este punto, consideramos que la diferencia entre las altas conversiones de 1 y los bajos rendimientos de 2 podría deberse al proceso de elaboración de la reacción, que implicaba el uso de CH2Cl2 para extraer producto y reactivo de la fase acuosa. Decidimos cambiar este disolvente por EtOAc y, así, observamos por primera vez la formación de 2, lo que podría indicar que el EtOAc lo extrae de manera más eficiente de la fase acuosa. No obstante, al llevar a cabo la misma reacción en las mismas condiciones varias veces (Tabla 2, entradas 1-4), los rendimientos observados no fueron repetibles, oscilando entre el 4 y el 22% (Tabla 3, entradas 2 y 3). Por tanto, la causa de esta disparidad seguía sin conocerse. Tabla 2: Resultados de la reacción de 1 a 2 extrayendo con EtOAc durante la elaboración. Entrada Rendimiento (%) Conversión (%) 1 7 72 2 4 79 3 22 95 4 9 72 (a) Condiciones de reacción: 1 (1 equiv., 75 mM, Ru1 (5 mol%), H2O:DMSO (9:1, 1 mL), 37 ºC, 16 h, atmósfera de N2. Rendimientos y conversiones calculados mediante rectas de calibrado en GC-MS. Elaboración: dilución con H2O (4 mL), extracción con EtOAc (3x2 mL), evaporación en rotavapor y secado a vacío. Para evitar el proceso de extracción, se hizo una prueba liofilizando las fases acuosas, y analizándose por GC-MS las muestras resultantes de las reacciones, redisueltas en MeCN:H2O (1:1). Curiosamente, no se pudieron observar los compuestos 1 o 2. Este resultado parecía indicar que la variabilidad en los rendimientos podría deberse a la volatilidad de los productos, que se podrían perder en las evaporaciones en el rotavapor o en la fase de secado en la línea de alto vacío, previas al análisis por GC-MS. 16 Para comprobar si 1 y 2 se estaban perdiendo en el proceso de evaporación del disolvente en el rotavapor, se prepararon muestras de ambos compuestos en CH2Cl2 a una concentración conocida. A continuación, se evaporaron en el rotavapor durante 10 min y se secaron en la línea de alto vacío durante otros 10 min. Por último, se analizaron las muestras (redisueltas en CH2Cl2) por GC-MS, interpolando los resultados en las rectas de calibrado correspondientes (Tabla 3). Tabla 3: Resultados de las pruebas de evaporación de 1 y 2. Entrada [1] inicial (mM) [2] inicial (mM) [1] final (mM) [2] final (mM) 1 70 - 4 - 2 - 70 - 53 3 35 35 11 31 (a) Condiciones: Disoluciones de 1 y 2 en CH2Cl2. Evaporación con ayuda de un rotavapor durante 10 min y secado posterior en línea de vacío durante 10 min. Resultados analizados mediante GC-MS. De esta forma, se descubrió que ambos compuestos se perdían durante la evaporación en la línea de alto vacío (entradas 1 a 3), lo cual explicaba las altas conversiones y bajos rendimientos, así como la variabilidad de los resultados, que dependían de la cantidad de tiempo que la muestra estuviese a vacío. Además, se realizaron experimentos de control en los que se disolvió una cantidad conocida de 1 o 2 en CH2Cl2 y se inyectó la muestra en GC-MS. Sorprendentemente, la cantidad medida por el equipo no coincidió con la teórica. Este resultado nos indicaba que, por algún motivo desconocido (por ejemplo, la falta de reproducibilidad en el volumen inyectado por el equipo o la calibración errónea de las micropipetas), el análisis de las muestras por GC-MS no era adecuado. Por ello, se decidió cambiar el método, y se optó por el análisis mediante 1H-RMN. 3.1.2. Análisis por 1H-RMN El nuevo análisis consistió en añadir 1,3,5-trimetoxibenceno (TMB) como patrón interno a las muestras (tras la extracción y evaporación) y diluir estas en CDCl3 para determinar rendimientos y conversiones mediante 1H-RMN. Así, se repitió la reacción en las condiciones optimizadas [DMSO:H2O (1:9), 37 ºC, 16 h], evitándose la línea de vacío y reduciendo el tiempo en el rotavapor a 5 min. De esta manera, el rendimiento de indol (2) fue del 16% y la conversión de 1 del 76%. En este punto, se realizó una nueva optimización de disolventes, con el fin de comprobar si la mezcla previamente usada (DMSO:H2O 1:9) era la más adecuada (Tabla 4). Los mejores resultados se observaron con mezclas de H2O:DMSO 6:4 y 9:1 (entradas 3 y 5), así como con H2O (entrada 15), pero no diferían mucho y, dada la baja solubilidad de 1 y Ru1 en agua, se decidió continuar utilizando la mezcla H2O:DMSO (9:1). Aunque la disparidad entre rendimiento y conversión disminuía al usar MeCN como co-disolvente (entradas 6 a 10), los 17 rendimientos de indol eran también menores a los que ofrecía la reacción en DMSO. Dado que en ningún caso se observó la formación de subproductos significativos en los espectros de 1H-RMN de los crudos de reacción, se siguió intentando encontrar la causa de las discordancias entre rendimiento y conversión, hecho que consideramos fundamental para poder optimizar el proceso. Tabla 4: Resultados de la optimización de disolventes para la reacción de 1 a 2. Entrada Disolvente Rendimiento (%) Conversión (%) 1 DMSO 6 84 2 H2O:DMSO (1:1) 15 81 3 H2O:DMSO (6:4) 23 84 4 H2O:DMSO (8:2) 14 55 5 H2O:DMSO (9:1) 16 72 6 MeCN 13 55 7 H2O:MeCN (1:1) 4 25 8 H2O:MeCN (6:4) 10 27 9 H2O:MeCN (8:2) 5 39 10 H2O:MeCN (9:1) 5 22 11 DMF 4 64 12 THF 7 75 13 H2O 15 61 14 Acetona 5 36 (a) Condiciones: 1 (1 equiv., 75 mM), Ru1 (5 mol%), disolvente (1 mL), 37 ºC, 16 h, atmósfera de N2. Elaboración: dilución con H2O (4 mL), extracción con EtOAc (3x2 mL) y evaporación del disolvente 5 min en un rotavapor (40 ºC, 200 mbar). Rendimientos y conversiones determinados mediante patrón interno de TMB en 1H-RMN (CDCl3). Siguiendo con la optimización, se llevó a cabo la reacción con diferentes complejos de rutenio previamente utilizados en reacciones que transcurren a través de especies vinilidénicas, pero siempre en disolventes orgánicos y a altas temperaturas, como [CpRu(MeCN)3]PF6,49 [RuCl2(PPh3)(p-cimeno)],55 [CpRuCl(PPh3)2],54 [Cp*RuCl(COD)]56 y [(η3:η3C10H16)RuCl(OAc)].43 Los resultados obtenidos (Tabla 5) siguieron la línea de lo que se había observado hasta el momento: altas conversiones de 1 y bajos rendimientos de 2. Aun así, el complejo más eficiente -con rendimientos del 16 y 17%- fue el que previamente veníamos 18 utilizando (Ru1, entradas 11 y 12), tanto usándolo por sí solo como añadiendo un ligando de tipo bipiridina (L1) que incorpora grupos “-CF3” (entrada 12). Entre los complejos utilizados, también destacó el [CpRuCl(PPh3)2] (Ru2), que permitió obtener 2 con un rendimiento del 10% y una conversión de 1 más cercana a éste (42%, entrada 9). Tabla 5: Resultados de la optimización de catalizadores para la reacción de 1 a 2. Entrada Complejo Rendimiento (%) Conversión (%) 1 RuCl3·H2O 2 97 2 [CpRu(MeCN)3]PF6 3 24 3 [CpRu(MeCN)3]PF6 + L1 3 51 4 [CpRu(MeCN)3]PF6 + L2 0 45 5 [Cp*Ru(MeCN)3]PF6 0 42 6 [Cp*Ru(MeCN)3]PF6 + L1 0 63 7 [RuCl2(PPh3)(p-cimeno)] 2 62 8 [RuCl2(PPh3)2(p-cimeno)] + NH4PF6 1 67 9 [CpRuCl(PPh3)2] (Ru2) 10 42 10 [Cp*RuCl(COD)] 1 32 11 Ru1 16 72 12 Ru1 + L1 17 78 (a) Condiciones: 1 (1 equiv., 75 mM), [Ru] (5 mol%), ligando (5 mol%), H2O:DMSO (9:1, 1 mL), 37 ºC, 16 h, atmósfera de N2. Elaboración: dilución con H2O (4 mL), extracción con EtOAc (3x2 mL) y evaporación durante 5 min en rotavapor (40 ºC, 200 mbar) Rendimientos y conversiones determinados mediante patrón interno de TMB en 1H-RMN (CDCl3). 19 También se consideró la posibilidad de preformar el catalizador resultante de mezclar Ru1 con el ligando L1, durante 10 min, antes de llevar a cabo la reacción (Tabla 6). De esta forma, pudimos comprobar que al preformar el catalizador durante 10 min a 60 ºC, se podía incrementar el rendimiento de 2 desde un 14% (sin preformación, entrada 1) hasta un 22% (entrada 3). No obstante, la diferencia entre la conversión y el rendimiento de 2 seguía siendo demasiado alta (la conversión observada es de un 75%). Tabla 6: Influencia de la preformación del catalizador en la reacción de 1 a 2. Entrada Catalizador Ru1/L1 preformado T (ºC) de preformación Rendimiento (%) Conversión (%) 1 NO - 14 76 2 SÍ 37 13 68 3 SÍ 60 22 75 (a) Condiciones: 1 (1 equiv., 75 mM), Ru1 (5 mol%), H2O:DMSO (9:1, 1 mL), 37 ºC, 16 h, atmósfera de N2, agitación previa: 10 min. Elaboración: dilución con H2O (4 mL), extracción con EtOAc (3x2 mL) y evaporación del disolvente 5 min en rotavapor (40 ºC, 200 mbar). Rendimientos y conversiones determinados mediante patrón interno de TMB en 1H-RMN. Por otra parte, también se probó el complejo [CpRuCl(PPh3)2] (Ru2), que había llamado la atención durante la optimización de catalizadores (Tabla 6, entrada 9). Así, tomando como referencia el trabajo de Saá y Varela,54 se utilizó piridina como disolvente y una temperatura de 90 ºC (Figura 12) para llevar a cabo la reacción estudiada. Figura 12: Reacción de 1 a 2 en las condiciones descritas por el grupo de Saá.54 Al reproducir estas condiciones, se obtuvo un rendimiento de 2 del 89% y una conversión del 100% de 1 tras 25 minutos de reacción (Tabla 7, entrada 1). Además, con el fin de comprobar la influencia del tiempo sobre los resultados, se llevó a cabo la reacción durante 16 h, lo que llevó a un aumento del rendimiento hasta el 99% (entrada 2). 20 A continuación, se comprobó la influencia de la disminución de la temperatura hasta 37 ºC en piridina, el disolvente óptimo para este complejo. El rendimiento descendió hasta un 4% (entrada 3), lo que muestra la necesidad de temperaturas altas para que la reacción tenga lugar en estas condiciones y con este complejo. Asimismo, se intentó disminuir la concentración de Ru2, lo que conllevó un brusco descenso del rendimiento (entrada 4). También tuvo un efecto considerable la disminución de la concentración de 1, obteniéndose un rendimiento del 32% (entrada 5). Se consiguió un resultado similar disminuyendo a la vez la concentración de 1 y Ru2 (entrada 6). Una vez más, al disminuir la temperatura hasta 37 ºC, el rendimiento descendió drásticamente (entradas 7 y 8). Tabla 7: Resultados de diferentes condiciones en la reacción de 1 a 2. Entrada [1] (mM) [Ru2] (mol %) Temperatura (ºC) Rendimiento (%) Conversión (%) 1 150 10 90 89 100 2 b 150 10 90 99 100 3 150 10 37 4 43 4 150 5 90 21 71 5 75 10 90 32 75 6 75 5 90 29 72 7 75 5 37 3 76 8 75 10 37 6 32 (a) Condiciones: 1 (1 equiv.), piridina (3 mL), 25 min, atmósfera de N2. Elaboración: dilución con H2O (4 mL), extracción con EtOAc (3x2 mL) y evaporación del disolvente durante 5 min en un rotavapor (40 ºC, 200 mbar). Rendimientos y conversiones determinados mediante patrón interno de TMB en 1H-RMN (CDCl3). (b) Tiempo de reacción: 16 h. A continuación, también evaluamos la influencia de la temperatura en las reacciones promovidas por otros complejos de rutenio. Se realizaron los experimentos a 37 y 60 ºC. Aunque los rendimientos son, en general, bajos (Tabla 8), se observa que no existe una diferencia importante entre ambas temperaturas, excepto en el caso del complejo formado a partir de Ru1 y L1, con el que se observó un aumento del rendimiento del 14 al 21% (entradas 9 y 10). Por otra parte, se ensayó si, añadiendo una base al medio, se podrían mejorar los rendimientos. Sin embargo, el uso de KOAc (2.5 equiv., entrada 11) dio lugar al mismo resultado (17% de indol y 81% de conversión de 1). 21 Tabla 8: Influencia de la temperatura para diferentes catalizadores en la reacción de 1 a 2. . Entrada Complejo Temperatura (ºC) Rendimiento (%) Conversión (%) 1 [CpRu(MeCN)3]PF6 + L1 37 3 46 2 [CpRu(MeCN)3]PF6 + L1 60 2 72 3 [Cp*Ru(MeCN)3]PF6 + L1 37 0 52 4 [Cp*Ru(MeCN)3]PF6 + L1 60 0 62 5 [RuCl2(PPh3)(p-cimeno)] + NH4PF6 37 1 67 6 [RuCl2(PPh3)(p-cimeno)] + NH4PF6 60 2 87 7 Ru1 37 14 72 8 Ru1 60 12 78 9 Ru1 + L1 37 14 90 10 Ru1 + L1 60 21 94 11 b Ru1 37 17 81 (a) Condiciones: 1 (1 equiv., 75 mM), [Ru] (5 mol%), H2O:DMSO (9:1, 1 mL), 16 h, atmósfera de N2. Elaboración: dilución con H2O (4 mL), extracción con EtOAc (3x2 mL) y evaporación del disolvente durante 5 min en un rotavapor (40 ºC, 200 mbar). Rendimientos y conversiones determinados mediante patrón interno de TMB en 1HRMN (CDCl3). (b) KOAc (2.5 equiv.) añadido al medio de reacción. También con el fin de favorecer el ataque nucleófilo de la amina al vinilideno, se preparó la alquinil anilina 3, que incorpora un grupo metoxi en para al amino. Además, el mayor peso molecular debería disminuir la volatilidad del producto, favoreciendo la reproducibilidad del método. Una vez sintetizada la 4-metoxi-2-etinilanilina, se llevó a cabo la reacción en las condiciones iniciales [DMSO:H2O (1:9), 37 ºC, 16 h, Figura 13], pero el rendimiento no aumentó, obteniéndose un 14% de indol, y una conversión del 72% (de nuevo, persistía la incoherencia entre conversión y rendimiento). Figura 13: Reacción de formación del 5-metoxi-1H-indol a través de un vinilideno de Ru. 22 Asimismo, se realizaron experimentos añadiendo el total del catalizador en diferentes porciones a lo largo de 6 horas, con la finalidad de comprobar si el complejo estaba sufriendo algún proceso de desactivación en el medio antes de que tuviese lugar la reacción de interés. En concreto, se añadió un 5 mol% de Ru1 al inicio de la reacción y un 2 mol% más al cabo de 2, 4 y 6 horas. Lamentablemente, el resultado no mejoró, con un rendimiento del 12% y una conversión del 84%. Experimento en DMSO deuterado Para tratar de obtener información sobre las causas de las altas conversiones, se realizó una reacción en DMSO deuterado, para visualizar mediante 1H-RMN todas las especies presentes antes durante y al final de la reacción (Figura 14). De esta forma, se evita la elaboración de la reacción con la posible pérdida de reactivo y/o producto. El análisis de los datos obtenidos (Tabla 9) muestra que el rendimiento aumenta lentamente hasta alcanzar el 15% tras 20 h, mientras que la conversión llega al 45% en el mismo tiempo, un valor significativamente inferior al obtenido cuando la reacción se extraía con disolvente orgánico. Este dato indica que, de alguna manera, la anilina (1) se pierde durante los procesos de elaboración y evaporación. Por otra parte, aunque el espectro no muestra una aparición importante de ningún producto secundario que permitiese justificar ese valor de conversión (45%) ni, por tanto, la diferencia con el valor del rendimiento de 2 (15%), sí es importante indicar que se observan algunas señales en la zona aromática (Figura 15) no correspondientes a 1 ni a 2, además de una señal a 11.5 ppm (Figura 16). Por tanto, podría tratarse de varios subproductos de diferente naturaleza, pero en cantidades pequeñas, lo que dificultaría su cuantificación e identificación. Además, es posible que alguno sea insoluble, lo que impide su observación por RMN de forma clara. Tabla 9: Resultados de la reacción de 1 a 2 en DMSO-d6. Entrada Tiempo (h) Rendimiento (%) Conversión (%) 1 0 0 0 2 2 5 26 3 3 8 36 4 4 9 38 5 5 10 39 6 20 15 45 (a) Condiciones: 1 (1 equiv., 75 mM), Ru1 (5 mol%), DMSO-d6 (1 mL), 37 ºC, 20 h, atmósfera de N2. Rendimientos y conversiones determinados mediante patrón interno de TMB en 1H-RMN (DMSO-d6). 29 Teniendo en cuenta que este proceso permite el uso de temperaturas suaves y medios acuosos, en un futuro se continuará estudiando su posible adaptación a condiciones biocompatibles. Además, se intentará utilizar este complejo Ru4 como catalizador para la isomerización de 1 a 2, dados los prometedores resultados en medios acuosos observados. 3.4. Procedimientos experimentales Información general Condiciones de trabajo, disolventes y reactivos La preparación de los compuestos se llevó a cabo bajo atmósfera inerte de nitrógeno excepto que se especifique lo contrario, empleando una línea de vacío y técnicas estándar. Las reacciones se realizaron en disolventes anhidros de la casa comercial Sigma Aldrich o Fisher y se usaron sin previa purificación. En caso de utilizarse agua como disolvente, se obtuvo a partir de un sistema de purificación de agua MilliQ integral de Millipore MilliQ. Además, los disolventes empleados en extracciones y en cromatografía de columna se emplearon con el grado de pureza necesario y sin purificación previa. Las adiciones de disolventes y disoluciones se llevaron a cabo vía jeringa de plástico y agujas de la casa comercial Braun. Para la cromatografía en capa fina, se usó gel de sílice F-254 Merck, con revelado mediante exposición a luz ultravioleta (λ = 254 nm, λ = 365 nm). Los factores de retención (Rf) se han obtenido sobre gel de sílice. Para la cromatografía en columna, se utilizó gel de sílice Silicagel 60A de Acros Organics. Los productos se concentraron eliminando los disolventes a presión reducida en un rotavapor Buchi y un posterior tratamiento en línea de alto vacío. Los reactivos químicos empleados proceden de las casas comerciales Sigma Aldrich, Alfa Aesar, Merck o Fisher y se usaron sin previa purificación. Técnicas analíticas e instrumentales Los espectros de RMN se registraron en el espectrómetro AMX-300 (300.13 MHz para 1H y 75.37 MHz para 13C) y se procesaron con la ayuda del programa MestreNova®. Los valores de los desplazamientos químicos (δ) están expresados en partes por millón (ppm) y están referidos a la señal residual del disolvente utilizado (en 1H-RMN, CDCl3 δ = 7.260 ppm, DMSO-d6 δ = 2.500 ppm, CD2Cl2 δ = 5.320 ppm). Las abreviaturas utilizadas para indicar la multiplicidad de las señales en 1H-RMN son: (s) = singlete, (d) = doblete, (dd) = doble doblete, (dt) = doble triplete, (t) = triplete, (c) = cuadruplete y (m) = multiplete o señal sin resolver. La HPLC analítica se realizó en un HPLC Thermo Ultimate 3000 acoplado a un espectrómetro de masas Bruker AmaZon SL, usando ionización por electrospray (ESI) a temperatura ambiente. 30 Procedimientos experimentales Procedimiento general para la reacción de 1 a 2 En un tubo Schlenk, se añade [Ru] (5 mol%) y se realizan ciclos de vacío-N2. Se adiciona 1 mL del disolvente o mezcla de disolventes previamente desoxigenados (mediante burbujeo de N2 durante 20 minutos) bajo atmósfera inerte de N2. A continuación, se añade 1 equiv. de 1 bajo N2 vía jeringa Hamilton. Se agita la mezcla durante el tiempo necesario a la temperatura adecuada. Finalizada la reacción, se diluye la mezcla en 4 mL de agua y extrae con EtOAc (3x2 mL). La fase orgánica se filtra sobre Florisil y se eliminan los disolventes a presión reducida (200 mbar) para obtener un aceite marrón. Para el análisis mediante GC-MS, se diluye el crudo en 1 mL de mezcla H2O:MeCN (1:1), se añade escatol como patrón interno (1 equiv.) y la muestra se filtra antes de trasladarla a un vial de HPLC. Para el análisis mediante 1H-RMN, se añade TMB como patrón interno (0.333 equiv.) y se diluye la mezcla en 0.7 mL de CDCl3 para trasvasarla a un tubo de RMN. Para cuantificar los rendimientos de 2 y conversiones de 1, se calculó una media de las integrales de los picos de la zona aromática de ambos y se comparó con la señal del TMB a 6.080 ppm (s, 3H); mientras que la señal correspondiente al H del alquino de 1 se comparó con la señal del TMB a 3.754 ppm (s, 9H). Síntesis de Ru1 Síntesis de Ru1.1 Procedimiento adaptado de: Toerien, J. G., van Rooyen, P. H., J Chem Soc Dalton Trans. 1991, 1563.58 En un tubo sellado, se disuelve RuCl3·H2O (500.0 mg, 2.218 mmol, 1.0 equiv.) en 2metoxietanol (6.5 mL) y se añade isopreno (7.0 mL, 69.982 mmol, 31.554 equiv.). Se agita la mezcla durante 3 días a 60 ºC. Por último, se evapora el disolvente y se filtra la solución para obtener 234.6 mg de un sólido rosa oscuro. Rendimiento: 34% 31 1H-RMN (300 MHz, CDCl3): δ 6.11 (s, 1H), 5.74 (s, 1H), 5.39 (s, 1H), 5.24 (s, 1H), 5.09 (s, 1H), 4.89 (s, 1H), 4.75 (s, 1H), 4.73 (s, 1H), 4.67 (s, 1H), 4.54 (s, 1H), 4.51 (s, 1H), 4.47 (s, 1H), 2.63-2.57 (m, 2H), 2.49 (s, 3H), 2.40 (s, 3H), 2.30 (s, 3H), 2.26 (s, 3H). Datos de acuerdo con la literatura.58 Síntesis de [(η3:η3-C10H16)RuCl(OAc)] (Ru1): Procedimiento adaptado de: Kavanagh, B., Steed, J. W., Tocher, D. A., J Chem Soc Dalton Trans. 1993, 327.59 En un matraz de fondo redondo de 100 mL, se suspende Ru1.1 (234.6 mg, 0.381 mmol, 1.0 equiv.) en acetona desoxigenada (25.4 mL). Se añade AgOAc (127.1 mg, 0.761 mmol, 2.0 equiv.) y se agita la mezcla, protegida de la luz, durante 1 h. Transcurrido este tiempo, la solución se filtra sobre Celita para separar el precipitado de AgCl y se evapora el disolvente. El aceite naranja obtenido se recristaliza con dietiléter para dar Ru1 como sólido granate (103.7 mg). Rendimiento: 37% 1H-RMN (300 MHz, CDCl3): δ 5.53 (s, 1H), 4.67 (s, 1H), 4.65 (s, 1H), 4.23 (s, 1H), 3.59 (s, 1H), 3.51 (s, 1H), 2.59 (m, 4H), 2.32 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 1.87 (s, 3H). Datos de acuerdo con la literatura.59 Síntesis de 3 Síntesis de 3.1 Procedimiento adaptado de: Varela-Fernández, A., Varela, J. A., Saá, C., Synthesis, 2012, 44.54 En un tubo Schlenk, se añaden, bajo atmósfera de N2, 2-yodo-4-metoxianilina (500.0 mg, 2.008 mmol, 1.0 equiv.), CuI (11.0 mg, 0.060 mmol, 3 mol%) y Et3N (1.1 mL, 8.030 mmol, 4.0 equiv.) y se disuelven en THF (8.0 mL). Se añade Pd(PPh3)2Cl2 (14.0 mg, 0.020 mmol, 1 mol%) y se agita la mezcla a r.t. durante 16 h. A continuación, se filtra la solución sobre Florisil y se evapora 32 el disolvente. Se diluye la mezcla con EtOAc (10 mL) y se lava con NaCl saturado (3x10 mL). La fase orgánica se seca con MgSO4 anhidro y se evapora el disolvente para obtener un aceite rojo. El crudo se purifica mediante una cromatografía de columna sobre carga seca de sílica gel usando hexano:EtOAc (de 99:1 a 70:30), monitorizada por TLC en hexano:EtOAc (99:1). Se aísla el producto 3.1 como aceite rojo (200.2 mg). Rendimiento: 46% 1H-RMN (300 MHz, CDCl3): δ 6.84 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 8.8, 2.9 Hz, 1H), 6.65 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 3.73 (s, 3H), 0.26 (s, 9H). Datos de acuerdo con la literatura.54 Síntesis de 3 Procedimiento adaptado de: Varela-Fernández, A., Varela, J. A., Saá, C., Synthesis, 2012, 44.54 En un vial seco, se disuelve Ru1.1 (200.0 mg, 0.912 mmol, 1.0 equiv.) en THF (1.8 mL). Se adiciona, gota a gota, TBAF (1.1 mL, 1.140 mmol, 1.3 equiv.), que causa un color naranja en la solución. Tras agitar a r.t. durante 1 h, se evapora el disolvente, se diluye la mezcla con agua (5 mL), se extrae con dietiléter (5 mL), se lava con NaCl saturado (5 mL) y la fase orgánica se seca con MgSO4 anhidro. Se evapora el disolvente para obtener un aceite naranja. El crudo se purifica mediante una cromatografía de columna sobre carga seca de sílica gel usando hexano:EtOAc (de 90:10 a 80:20), monitorizada por TLC en hexano:EtOAc (70:30). Se aísla el producto 3 como aceite naranja (70.1 mg). Rendimiento: 52% 1H-RMN (300 MHz, CDCl3): δ 6.87 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 6.79 (dd, J = 8.8, 2.9 Hz, 1H), 6.65 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.13 – 3.78 (br s, 1H), 3.73 (s, 3H), 3.38 (s, 1H). Datos de acuerdo con la literatura.60 33 Síntesis de Ru3 Síntesis de P1 Procedimiento adaptado de: Zajkirova, G. G., Mladentsev, D. Y., Borisova, N. E., Synthesis, 2019, 51.61 En un tubo Schlenk, se añaden, bajo Ar, 2-bromo-6-(tert-butil)piridina (416.8 mg, 1.947 mmol, 1.0 equiv.), óxido de difenilfosfina (472.3 mg, 2.336 mmol, 1.2 equiv.) y K2CO3 (403.6 mg, 2.920 mmol, 1.5 equiv.). Se adicionan de forma conjunta el complejo de Pd (4.4 mg, 0.019 mmol, 1 mol%) y el ligando dppf (21.6 mg, 0.039 mmol, 2 mol%) y se disuelve todo en DMF (10.0 mL). La mezcla se agita a 120 ºC durante 7 h. A continuación, la solución se diluye con NaCl saturado (40 mL) y se extrae con CH2Cl2 (3x80 mL). La fase orgánica se lava con NaCl saturado (40 mL) y se seca con Na2SO4 anhidro para proceder a secar el disolvente. El crudo se purifica mediante una cromatografía de columna sobre carga seca de sílica gel usando CH2Cl2:MeOH:Et3N (de 98:1:1 a 94:5:1) monitorizada por TLC en CH2Cl2:MeOH:Et3N (98:1:1). Se aíslan 358.7 mg de sólido P1. Rendimiento: 55% 1H-RMN (500 MHz, CDCl3): δ 8.14-8.10 (m, 1H), 7.99-7.92 (m, 4H), 7.77 (td, J = 7.8, 4.1 Hz, 1H), 7.49 (td, J = 7.3, 1.5 Hz, 2H), 7.42 (ddt, J = 7.0, 5.4, 2.2 Hz, 5H), 1.32 (s, 9H). 31P-RMN (202 MHz, CDCl3): δ 19.26. Datos de acuerdo con la literatura.61 Síntesis de P2 Procedimiento adaptado de: Iwasaki, T., Tsuge, K., Naito, N., et al. Nat Commun, 2023, 14.62 En un matraz de fondo redondo de 100 mL, se disuelve P1 (214.6 mg, 0.640 mmol, 1.0 equiv.) en tolueno (6.5 mL) y se añaden triclorosilano (566.8 mg, 4.185 mmol, 6.5 equiv.) y trietilamina (479.9 mg, 4.743 mmol, 7.4 equiv.) a 0 ºC bajo nitrógeno. La mezcla se agita a reflujo durante 17 h. Tras evaporar el disolvente, se añade NaHCO3 desoxigenado (10 mL) y la solución 34 se extrae con dietiléter desoxigenado (3x8 mL) bajo Ar. La solución se concentra bajo presión reducida y el sólido se lava con hexano (5 mL) para obtener P2 como sólido blanco (163.5 mg). La purificación del compuesto P2 no fue posible debido a su sensibilidad al oxígeno, por lo que el siguiente paso (síntesis de Ru3) se llevó a cabo en el mismo recipiente, sin purificación previa. Rendimiento: 80%. Síntesis de Ru3 Procedimiento adaptado de: Grotjahn, D. B., Lev, D. A., J Am Chem Soc. 2004, 126.50 En el matraz redondo de 100 mL en el que se sintetizó P2 (163.5 mg, 0.512 mmol, 1.0 equiv.) se añade CH2Cl2 (2.0 mL) desoxigenado. A continuación, se adiciona, bajo Ar, [CpRu(MeCN)3]PF6 (117.18 mg, 0.256 mmol, 0.5 equiv.) se agita la mezcla a r.t. durante 4 h. A continuación, se lava el sólido obtenido con pentano desoxigenado (2x5 mL) y se seca a vacío, para obtener un sólido amarillo. El crudo se purifica mediante una cromatografía de columna sobre carga seca de sílica gel usando CH2Cl2:IPA (de 99:1 a 97.5:2.5), monitorizada por TLC en CH2Cl2:IPA (97.5:2.5). Se aíslan 200.2 mg de Ru3 como sólido amarillo. Rendimiento: 79% 1H-RMN (500 MHz, CD2Cl2): δ 7.38 – 7.29 (m, 12H), 7.23 – 7.19 (m, 4H), 7.13 – 7.06 (m, 8H), 6.57 – 6.53 (m, 2H), 4.36 (s, 5H), 2.09 (t, J = 1.5 Hz, 3H), 1.32 (s, 18H). 31P-RMN (202 MHz, CD2Cl2): δ 43.73. Datos de acuerdo con la literatura.50 Síntesis de Ru4 Síntesis de Ru4.1 En un matraz de fondo redondo de 100 mL, se disuelven RuCl3·H2O (1260.5 mg, 4.281 mmol, 1.0 equiv.) y Cp* (1.7 mL, 10.606 mmol, 2.2 equiv.) en MeOH (15 mL) y la mezcla se agita a reflujo durante 3 h. La solución marrón oscura se enfría en el congelador y el precipitado violeta 35 oscuro se filtra, se lava con MeOH frío (15 mL) y se seca bajo presión reducida. Se obtienen 1359.7 mg de Ru4.1 como sólido cristalino violeta oscuro. Rendimiento: 92% Síntesis de Ru4 Procedimiento adaptado de: Nishibayashi, Y., Wakiji, I., Hidai, M., J Am Chem Soc. 2000, 122.63 En un matraz de fondo redondo de 100 mL, a una suspensión de Ru4.1 (1359.7 mg, 2.213 mmol, 1.0 equiv.) en THF (28 mL) se añade trimetil(metiltio)silano (0.78 mL, 5.533 mmol, 2.5 equiv.) y se agita a r.t. durante 24 h. El precipitado marrón se filtra, se lava con hexano (20 mL) y se recristaliza con CH2Cl2:hexano 1:1, para dar Ru4 como sólido violeta oscuro (548.3 mg). Rendimiento: 50% 1H-RMN (300 MHz, CDCl3): δ 2.53 (s, 6H), 1.53 (s, 30H). Datos de acuerdo con la literatura.63 HRMS-ESI: Calculado para C22H36Cl2Ru2S2 [M-Cl]+: 603.23; encontrado: 603.23. Síntesis de 5 Síntesis de 5.1 Procedimiento adaptado de: Bew, S.P., El-Taeb, G.M.M., Jones, S., Knight, D.W. and Tan, W.-F., 2007, Eur J Org Chem, 2007.60 En un tubo Schlenk, se disuelve etiniltrimetilsilano (1.3 mL, 9.423 mmol, 2.0 equiv.) en THF (19 mL). Se enfría la mezcla hasta -78 ºC y se agita 15 min. Se añade n-butil-litio (4.1 mL, 10.365 mmol, 2.2 equiv.) y se agita durante 1 h a la misma temperatura. A continuación, se adiciona benzoína (1.000 g, 4.711 mmol, 1.0 equiv.). Se deja calentar hasta r.t. y se agita durante 16 h. 36 Se diluye la solución con NH4Cl (30 mL), se extrae con EtOAc (3x30 mL) y se seca con MgSO4 anhidro. Tras evaporar el disolvente a vacío, se obtiene un precipitado blanco. El crudo se purifica mediante una cromatografía de columna sobre carga seca de sílica gel usando hexano:EtOAc (80:20) monitorizada por TLC en hexano:EtOAc (80:20). Se aíslan 747.9 mg de 5.1 como sólido blanco. Rendimiento: 51% 1H-RMN (300 MHz, CDCl3): δ 7.48–7.41 (m, 2H), 7.33 – 7.15 (m, 8H), 4.89 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 3.02 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 2.86 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 0.26 (s, 9H). Datos de acuerdo con la literatura.60 Síntesis de 5 Procedimiento adaptado de: Bew, S.P., El-Taeb, G.M.M., Jones, S., Knight, D.W. and Tan, W.-F., 2007, Eur J Org Chem, 2007.60 En un tubo Schlenk, se disuelve 5.1 (500.0 mg, 1.610 mmol, 1.0 equiv.) en THF (8.1 mL). Se enfría la solución a 0 ºC y se agita durante 10 min. A continuación, se añade el TBAF (1.6 mL, 1.610 mmol, 1.0 equiv.) gota a gota, lo que conlleva un cambio de color de amarillo a naranja. Una vez transcurrido el tiempo, se diluye la mezcla con agua (10 mL) y se extrae con dietiléter (3x10 mL). Se vuelve a lavar con agua (10 mL) para eliminar los restos de THF y se seca la fase orgánica con MgSO4 anhidro. Tras evaporar el disolvente, se redisuelve el aceite en EtOAc (2 mL) y se diluye con hexano (8 mL). Se enfría en el congelador durante 2 h y se obtiene 5 (252.0 mg) como sólido cristalino blanco tras decantar el disolvente y secar el precipitado bajo presión reducida. Rendimiento: 66% 1H-RMN (300 MHz, CDCl3): δ 7.44 (m, 2H), 7.31–7.27 (m, 3H), 7.24–7.12 (m, 5H), 4.90 (s, 1H), 2.90 (br s, 1H, OH), 2.75 (br s, 1H, OH), 2.69 (s, 1H). Datos de acuerdo con la literatura.60 37 4. CONCLUSIONES En este proyecto, se ha estudiado la optimización de la isomerización de orto-alquinil anilinas a indoles para su traslado a medios biológicos. Esta reacción transcurre a través de vinilidenos de rutenio, que habitualmente participan en procesos que requieren altas temperaturas para ser eficientes. En concreto, se ha intentado adaptar a condiciones biocompatibles la formación de indol a partir de 2-etinilanilina catalizada por complejos de rutenio que han sido utilizados en reacciones que involucran vinilidenos metálicos, pero siempre en disolventes orgánicos y a altas temperaturas. Gratamente, se ha conseguido llevar a cabo la reacción en medios acuosos, y en un futuro se intentará mejorar el método para conseguir realizarla a temperaturas biocompatibles. Además, se ha sintetizado un complejo de rutenio con un ligando azaryphos, previamente estudiado por su eficiencia en hidrataciones de alquinos anti-Markovnikov y síntesis de indoles a través de vinilidenos. Se ha demostrado que la formación de indol a partir de 2-etinilanilina catalizada por este complejo puede tener lugar en medios acuosos con buenos resultados. En un futuro, se pretende mejorar el procedimiento para conseguir disminuir la temperatura hasta 37 ºC. Por último, se ha preparado un complejo de rutenio capaz de catalizar la formación de furanos a través de vinilidenos y alenilidenos de rutenio. Esta reacción había sido descrita en etanol, pero se ha conseguido llevar a cabo en medios acuosos a 40 ºC con resultados muy prometedores, lo cual favorece su traslado a medios biológicos. Estas reacciones abren la puerta a futuras investigaciones acerca de la introducción de los vinilidenos metálicos en Química Bioortogonal, permitiendo una mayor versatilidad mecanística en las reacciones realizadas en el interior celular y la formación de moléculas de alto interés biológico como los indoles y los furanos. CONCLUSIÓNS Neste proxecto, estudouse a optimización da isomerización de orto-alquinil anilinas a indois para o seu traslado a medios biolóxicos. Esta reacción transcorre a través de vinilidenos de rutenio, que habitualmente participan en procesos que requiren altas temperaturas para ser eficientes. En concreto, intentouse adaptar a condicións biocompatibles a formación de indol a partir de 2etinilanilina catalizada por complexos de rutenio utilizados en reaccións que involucran vinilidenos metálicos, pero sempre en disolventes orgánicos e a altas temperaturas. Gratamente, conseguiuse levar a cabo a reacción en medios acuosos, e nun futuro intentarase mellorar o método para conseguir realizala a temperaturas biocompatibles. Ademais, sintetizouse un complexo de rutenio cun ligando azaryphos, previamente estudado pola súa eficiencia en hidratacións de alquinos anti-Markovnikov e síntese de indois a 38 través de vinilidenos. Demostrouse que a formación de indol a partir de 2-etinilanilina catalizada por este complexo pode ter lugar en medios acuosos con bos resultados. Nun futuro, preténdese mellorar o procedemento para conseguir diminuír a temperatura ata 37 ºC. Por último, preparouse un complexo de rutenio capaz de catalizar a formación de furanos a través de vinilidenos e alenilidenos de rutenio. Esta reacción fora descrita en etanol, pero conseguiuse levar a cabo en medios acuosos a 40 ºC, con resultados moi prometedores, o cal favorece o seu traslado a medios biolóxicos. Estas reaccións abren a porta a futuras investigacións sobre a introdución dos vinilidenos metálicos en Química Bioortogonal, permitindo unha maior versatilidade mecanística nas reaccións realizadas no interior celular e a formación de moléculas de alto interese biolóxico como os indois e os furanos. CONCLUSIONS In this project, we have studied the optimization of the isomerization of ortho-alkynyl anilines to indoles for its transfer to biological media. This reaction takes place through ruthenium vinylidenes, which usually participate in processes that require high temperatures for them to be efficient. Specifically, we have tried to adapt to biocompatible conditions the formation of indole from 2-ethynylaniline catalysed by ruthenium complexes which have been used in reactions that involve metallic vinylidenes, but always in organic solvents and at high temperatures. Gratifyingly, we have achieved to perform the reaction in aqueous media, and, in the future, we will try to improve the method to be able to perform it at biocompatible temperatures. Furthermore, we have synthesized a ruthenium complex containing an azaryphos ligand, which has been previously studied because of its efficiency in anti-Markovnikov alkyne hydrations and indole synthesis through vinylidenes. We have demonstrated that the formation of indole from 2-ethynylaniline catalysed by this complex can take place in aqueous media with good results. In the future, we will try to improve the procedure to be able to lower the temperature down to 37 ºC. Finally, we have prepared a ruthenium complex capable of catalysing the formation of furans through ruthenium vinylidenes and allenylidenes. This reaction had been described in ethanol, but we managed to perform it in aqueous media at 40 ºC with very promising results, which favours its transfer to biological media. These reactions open the door to future investigations on the introduction of metallic vinylidenes into Bioorthogonal Chemistry, allowing a greater mechanistic versatility in the reactions we perform in cells, as well as the formation of highly biologically interesting molecules such as indoles and furans. 45 Ru3: 1H-RMN (500 MHz, CD2Cl2) Ru3: 31P-RMN (202 MHz, CD2Cl2) 46 Ru4: 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) 5: 1H-RMN (300 MHz, CDCl3)