Regulación central del balance energético por hormonas tiroideas

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA Regulación central del balance energético por hormonas tiroideas TESIS DOCTORAL Noelia Martínez Sánchez Santiago de Compostela, 2015 UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA Dr. Miguel A. López Pérez, Profesor Titular del Departamento de Fisiología de la Universidad de Santiago de Compostela Prof. Dr. Carlos Diéguez González, Catedrático del Departamento de Fisiología de la Universidad de Santiago de Compostela Certifican que: la presente Tesis Doctoral titulada, “Regulación central del balance energético por hormonas tiroideas” elaborada por Noelia Martínez Sánchez, ha sido realizada bajo su dirección en los Laboratorios de Neurociencia “Ramón Domínguez” del Departamento de Fisiología de la Universidad de Santiago de Compostela y en el Centro de Investigaciones en Medicina Molecular y Enfermedades Crónicas (CIMUS) de la Universidad de Santiago de Compostela, estimando que se encuentra concluida y en condiciones de ser presentada para optar al grado de Doctor. Y para que así conste, firmamos la presente autorización en Santiago de Compostela, 2015 Fdo.: Dr. Miguel A. López Pérez Fdo.: Dr. Carlos Diéguez González Santiago de Compostela, Noviembre 2015 INDICE RESUMEN ...................................................................................................................................... 1 Datos y cifras ......................................................................................................................... 3 INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 5 HOMEOSTASIS ENERGÉTICA: las señales periféricas ................................................................ 7 Señales de saciedad .............................................................................................................. 8 EL HIPOTÁLAMO ........................................................................................................................ 9 El núcleo arcuato ................................................................................................................. 10 El núcleo ventromedial del hipotálamo .............................................................................. 13 El núcleo paraventricular .................................................................................................... 15 El núcleo dorsomedial ......................................................................................................... 16 El área hipotalámica lateral ................................................................................................. 17 METABOLISMO LIPÍDICO ......................................................................................................... 18 LIPOTOXICIDAD Y ER ESTRÉS ................................................................................................... 23 SENSORES ENERGÉTICOS ........................................................................................................ 29 AMPK ................................................................................................................................... 29 KINASAS C-JUN AMINO TERMINALES ( JUN amino-terminal kinases, JNKs) ...................... 34 TERMOGÉNESIS: el tejido adiposo pardo ................................................................................ 37 LAS HORMONAS TIROIDEAS .................................................................................................... 43 Las hormonas tiroideas y el metabolismo .......................................................................... 47 Las hormonas tiroideas: termogénesis y gasto energético ................................................. 47 Las hormonas tiroideas y la ingesta .................................................................................... 49 Hormonas tiroideas y metabolismo de la glucosa en el hígado ......................................... 50 OBJETIVOS ................................................................................................................................... 53 MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................................... 57 MODELOS ANIMALES Y CUIDADOS ......................................................................................... 59 ANESTESIA Y ANALGESIA ......................................................................................................... 60 VÍAS DE ADMINISTRACIÓN DE SUSTANCIAS ........................................................................... 61 1) Vía intraperitoneal (IP) ................................................................................................ 61 2) Vía subcutánea (SC) ..................................................................................................... 61 3) Vía intracerebroventricular (ICV) ................................................................................ 62 4) Vía núcleo-específica ................................................................................................... 62 PROCEDIMIENTOS NO QUIRÚRGICOS ..................................................................................... 63 Monitorización de la ingesta y de la masa corporal ............................................................ 63 Determinación de la composición corporal ........................................................................ 63 Preparación de mini bombas osmóticas ............................................................................. 63 PROCEDIMIENTOS QUIRÚRGICOS ........................................................................................... 64 Canulación ICV ..................................................................................................................... 64 Estereotáxia núcleo-específica ............................................................................................ 65 Registro de la actividad simpática ....................................................................................... 67 Vagotomía ........................................................................................................................... 67 Perfusion intracardíaca ....................................................................................................... 68 Infusión de oleato-C14 ......................................................................................................... 69 Disección y extracción de tejidos ........................................................................................ 69 DISEÑOS EXPERIMENTALES ..................................................................................................... 69 Alteración del estado tiroideo ............................................................................................. 69 Tratamiento ICV crónico y agudo con T3 ............................................................................ 70 Tratamiento ICV crónico con T3 en ratas vagotomizadas ................................................... 70 Tratamiento ICV crónico con T3 y antagonista β3-AR (SR59230A) subcutáneo ................. 71 Tratamiento IP crónico con T3 ............................................................................................ 72 Tratamiento núcleo-específico crónico de T3 mediante bombas ....................................... 72 Tratamiento de T3 en regiones cercanas al VMH ............................................................... 73 Inoculación estereotáxica de Ad-TR-DN, Ad-AMPK-CA y Ad-AMPK-DN en el VMH ........... 73 Inoculación estereotáxica de Ad-AMPK-CA en ratas hipertiroideas ................................... 74 Inoculación estereotáxica de Ad-AMPK-CA en ratas tratadas con T3 ICV .......................... 74 Tratamiento ICV de ceramidas en ratas hipertiroideas. ..................................................... 75 Inoculación estereotáxica de Ad-GRP78-DN en ratas hipertiroideas ................................. 76 Tratamiento ICV de Rottlerin (inhibidor de PKC) en ratas hipertiroideas ........................... 76 Tratamiento ICV de SP600125 (inhibidor de JNK) o de Rottlerin (inhibidor de PKC) en ratas tratadas con T3 ICV ............................................................................................................. 77 Tratamiento ICV con T3 en ratones WT y JNK1KO .............................................................. 77 Inoculación de Ad-Cre en ratones JNK2KO-jnk1 floxed y posterior administración de T3 ICV. ...................................................................................................................................... 78 TÉCNICAS ANALÍTICAS ............................................................................................................. 79 Extracción de proteína ........................................................................................................ 79 Cuantificación de proteína .................................................................................................. 80 Western Blot ....................................................................................................................... 80 RT-PCR ................................................................................................................................. 85 Ensayos enzimáticos ............................................................................................................ 90 Inmunohistoquímica ........................................................................................................... 92 Inmunofluorescencia ........................................................................................................... 92 Bioquímica ........................................................................................................................... 93 Análisis de lípidos ................................................................................................................ 93 Lipidómica ........................................................................................................................... 94 Cuantificación de ceramidas ............................................................................................... 95 Tinción Oil-Red O ................................................................................................................. 96 Estadística ............................................................................................................................ 96 RESULTADOS ............................................................................................................................... 97 Las ratas hipertiroideas muestran una marcada alteración en la ruta de la lipogénesis de novo en tejidos periféricos. ..................................................................................................... 99 La T3 a nivel central regula la ruta de la lipogénesis de novo en hígado y BAT. ................... 100 El PSNS media las acciones centrales de T3 en la lipogénesis de novo en el hígado. ........... 104 El SNS media las acciones centrales de T3 en la lipogénesis de novo en el BAT. ................ 105 T3 a nivel central regula la captación de lípidos en BAT ....................................................... 107 T3 en el VMH regula la ruta de la lipogénesis de novo en hígado y BAT. ............................. 108 Los efectos centrales de la T3 en la lipogénesis de novo en hígado y BAT dependen de AMPK en el VMH. ............................................................................................................................. 113 Las hormonas tiroideas alteran la composición lipídica en el hipotálamo de rata, reduciendo los niveles de ceramidas. ...................................................................................................... 119 Las hormonas tiroideas reducen la lipotoxicidad hipotalámica inducida por ceramidas y el ER estrés. .................................................................................................................................... 121 Las ceramidas y la inducción de ER estrés revierten el efecto de la hormona tiroidea en la lipogenesis de novo y la termogénesis en BAT ..................................................................... 124 La inhibición farmacológica de JNK revierte las acciones centrales de T3 en la lipogénesis de novo del hígado ..................................................................................................................... 128 JNK1 en el VMH media las acciones centrales de T3 en la lipogénesis de novo en el hígado. ............................................................................................................................................... 132 DISCUSIÓN ................................................................................................................................. 139 Resumen gráfico .................................................................................................................... 148 CONCLUSIONES ......................................................................................................................... 149 ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS ................................................................................................. 153 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................ 159 RESUMEN Resumen 3 La obesidad y el sobrepeso se definen como un incremento de la masa corporal debido sobre todo a una acumulación anormal o excesiva de grasa que puede ser perjudicial para la salud. Ambos se han convertido en una epidemia mundial llegando a ser un problema importante de salud pública, convirtiéndose en el sexto factor principal de riesgo de defunción en el mundo (Cuadro 1). El aumento de la prevalencia de sobrepeso y obesidad está asociado con muchas enfermedades crónicas como la diabetes mellitus, las enfermedades cardiovasculares, accidentes cerebrovasculares, hipertensión y ciertos tipos de cáncer; esto conduce a una mayor tasa de mortalidad y morbilidad, reduciéndose así la calidad y la esperanza de vida de quién lo padece (Novelle et al., 2013; Medina-Gomez and Vidal-Puig, 2005; Fruhbeck, 2008; Calle and Kaaks, 2004; Farooqi, 2005). La Organización Mundial de la Salud (OMS) clasifica el estado nutricional de un individuo basándose en el Índice de Masa Corporal (Body Mass Index, BMI), una medida de asociación entre masa y la talla de un individuo (masa en kilogramos dividido por la altura en metros elevada al cuadrado) que es usada comúnmente para clasificar el bajo peso, sobrepeso y obesidad en adultos. Una persona con un IMC igual o superior a 25 es considerada con sobrepeso y con un IMC igual o superior a 30 es considerada obesa. Cuadro 1Datos de la OMS sobre la obesidad y sobrepeso (Nota descriptiva N°311 Mayo de 2014). El peso, la composición corporal y el almacenamiento de energía en forma de triglicéridos en el tejido adiposo son determinados por la interacción entre factores genéticos, ambientales y sociales; todo esto afecta al balance energético, balance entre la ingesta de calorías y el gasto de las mismas. Estudios fisiológicos han sugerido previamente que la masa corporal y las reservas de energía son reguladas homeostáticamente, mediante la pérdida o ganancia de masa produciendo cambios en la ingesta o el gasto energético. Asumiendo que un individuo no tiene problemas con la absorción de nutrientes, el almacenamiento de energía en forma de grasa solo se incrementará si la energía ingerida excede el total del gasto energético Datos y cifras  Desde 1980, la prevalencia de la obesidad se ha duplicado en todo el mundo.  En 2008, 1400 millones de adultos (mayores de 20 años) presentaban sobrepeso. Dentro de este grupo, más de 200 millones de hombres y cerca de 300 millones de mujeres eran obesos.  En 2008, el 35% de las personas adultas mayores de 20 años presentaban sobrepeso, y el 11% eran obesas.  El 65% de la población mundial vive en países donde el sobrepeso y la obesidad se cobran más vidas de personas que la insuficiencia ponderal.  En 2012, más de 40 millones de niños menores de cinco años presentaban sobrepeso.  La obesidad puede prevenirse. Resumen 4 (actividad física, metabolismo basal y termogénesis adaptativa) (Spiegelman and Flier, 2001; Barsh et al., 2000; Schwartz et al., 2000; Schwartz and Porte, Jr., 2005). Durante los últimos años muchas de las investigaciones se han centrado en identificar los mecanismos moleculares de la homeostasis energética (Fruhbeck, 2008; Medina-Gomez and Vidal-Puig, 2005; Medina-Gomez et al., 2005). El sistema nervioso central (CNS) influye en el balance energético y la masa corporal a través de tres mecanismos: (1) efecto del ambiente, incluyendo alimentación y actividad física; (2) efectos en la actividad del sistema nervioso autónomo, que regula el gasto energético y otros aspectos del metabolismo; y (3) efectos en el sistema neuroendocrino, incluyendo secreción de hormonas como hormona de crecimiento (GH), hormonas tiroideas (THs), insulina, cortisol y hormonas sexuales. La coordinación de este sistema complejo ha sido sujeto de intensos estudios y ha aportado muchos avances en el estudio de la obesidad (Spiegelman and Flier, 2001; Rossner, 2002). La prevención debería ser el primer mecanismo de acción contra la obesidad, pero también es muy importante el desarrollo de estrategias para el tratamiento. Nuevas señales y factores involucrados en la modulación del balance energético y del metabolismo están siendo continuamente descubiertos, proporcionando nuevas dianas terapéuticas para fármacos potenciales contra la enfermedad metabólica. Una estrategia complementaria es el mejor conocimiento de cómo las señales hormonales actúan y como la manipulación de las rutas en las que están implicadas puede conducir a una mejora del la disfunción metabólica (Spiegelman and Flier, 2001; Lopez et al., 2013). El potencial de las hormonas tiroideas en el tratamiento de la obesidad ha sido conocido desde hace décadas pero su uso terapéutico ha sido obstaculizado por sus efectos secundarios. Conocer sus mecanismos de acción e implicación en el balance energético puede ser de gran relevancia para el tratamiento de la obesidad o el síndrome metabólico. Introducción 12 al., 1999). POMC también actúa como precursor de la adrenocorticotropina (ACTH) y de la βendorfina. Las melanocortinas, incluida α-MSH, liberadas desde las neuronas POMC del ARC se unen a receptores MC4-R para inhibir la ingesta. La delección de MC4-R en ratón resulta en hiperfagia, reducción del gasto energético y obesidad, resaltando la importancia de este receptor en la regulación del apetito (Huszar et al., 1997; Simpson et al., 2009). Estudios recientes han demostrado la importancia del sistema de melanocortinas en la regulación de la homeostasis energética en humanos; así mutaciones en MC4R provocan el 6% de la obesidad severa temprana en humanos y más de 90 mutaciones han sido asociadas con la obesidad (Vaisse et al., 1998; Farooqi et al., 2003; Simpson et al., 2009). La estimulación de las neuronas POMC en el ARC tiene como resultado una reducción de la ingesta (Aponte et al., 2011) mientras que su ablación genera fenotipos hiperfágicos y obesos (Yaswen et al., 1999; Challis et al., 2004; Zhan et al., 2013). La mayoría de neuronas POMC en el ARC también co-expresan mRNA de CART. Estudios en animales han mostrado que la administración ICV de CART inhibe la ingesta de comida mientras que la inyección ICV de antisuero de CART incrementa la ingesta (Kristensen et al., 1998; Thim et al., 1998; Lambert et al., 1998), sugiriendo así un importante papel en la regulación de la ingesta y de la homeostasis energética. Los niveles de este neuropéptido en el ARC son regulados por la leptina circulante (Kristensen et al., 1998; Schwartz et al., 2000) siendo incrementado tras la administración de leptina periférica (Elias et al., 1998; Kristensen et al., 1998; Wang et al., 2000) indicando su papel en la regulación del balance energético. Además, recientes estudios involucran activamente a este neuropéptido en el ciclo de sueño (Lee et al., 2014a) (Ilustración 1). Introducción 13 Ilustración 1. Representación de los dos grupos neuronales en el ARC (AgRP/NPY y Pomc/Cart) regulados por los niveles de hormonas circulantes. Insulina y leptina inhiben las neuronas AgRP/NPY, mientras que estimulan las neuronas POMC/CART. Ghrelin activa las neuronas AgRP/NPY estimulando la ingesta.(Barsh and Schwartz, 2002). El núcleo ventromedial del hipotálamo El núcleo ventromedial del hipotálamo (VMH) es un núcleo altamente conservado en todas las especies, formado por un grupo de células bilaterales que se sitúan cerca de la base del diencéfalo, adyacentes al tercer ventrículo lateralmente al ARC. En la década de los 40, surgieron las primeras evidencias de que el VMH podría estar involucrado en la regulación de la ingesta y del metabolismo energético mediante estudios realizados con animales que presentaban lesiones en esta región ya que desarrollaban rápidamente un fenotipo obeso (Hetherington and Ranson, 1940, 1942). Además se ha implicado en un gran número de funciones homeostáticas y comportamentales tales como la regulación del comportamiento sexual femenino, alimentación, balance energético y función cardiovascular (McClellan et al., 2006; Shimogawa et al., 2014). Introducción 14 Estudios con microarrays muestran que existen genes marcadores específicos del VMH como el factor esteroidogénico 1 (steroidogenic factor-1, SF-1) (Segal et al., 2005), un factor de transcripción implicado en el desarrollo de las funciones fisiológicas del VMH. Su expresión está restringida a neuronas de este área (sobre todo la zona central y ventromedial) y está implicado en su correcto desarrollo (Budefeld et al., 2012) además de ser un componente esencial en el balance energético (King, 2006) (Jo, 2012). Las neuronas que expresan SF-1 están implicadas en la homeostasis energética (Zhang et al., 2008) y contribuyen en la detección de importantes reguladores energéticos como por ejemplo la leptina (Dhillon et al., 2006). Ratones knockout en SF-1, carentes de un VMH normal, llegan a ser obesos y pueden alcanzar el doble de su masa normal (Majdic et al., 2002); esto se atribuye principalmente a un descenso en la actividad (King, 2006) y en su capacidad termogénica (Kim et al., 2011). Existe también otro factor llamado factor neurotrófico derivado del cerebro (Brainderived neurotrophic factor, BDNF) que es altamente expresado en el VMH e implicado en la regulación de la ingesta y la masa corporal en roedores y humanos (Lyons et al., 1999; Rios et al., 2001; Xu et al., 2003; Jo, 2012). Su expresión en el VMH está regulada por nutrientes y señales asociadas a ellos, como son la glucosa, la leptina (que aumenta sus niveles de expresión) (Komori et al., 2006) y el ayuno (produce su reducción en el VMH) (Rios et al., 2001). Algunas neuronas SF-1 expresan este factor de tal forma que SF-1 modula su expresión (Jo, 2012). Se piensa que las neuronas POMC del ARC tienen un papel en la activación de las neuronas del BDNF para que ocurra ese descenso en la ingesta y de la masa corporal (Simpson et al., 2009; Pelleymounter et al., 1995; King, 2006). El VMH tiene numerosas conexiones neuronales con otras áreas del cerebro implicadas en el comportamiento alimenticio. Estudios previos han demostrado que las conexiones neuronales entre el VMH y diferentes regiones del cerebro como son el área preóptica medial (POA), la estría terminal (la mayor vía eferente de la amígdala terminal), la amígdala (AMG) (implicada en aspectos emocionales del comportamiento alimenticio), el núcleo anterior (AH), la sustancia gris central del mesencéfalo (Midbrain Central Gray, MCG) y la eminencia media son importantes para las funciones neuroendocrinas en roedores (Renaud and Martin, 1975; Millhouse, 1978; Shimogawa et al., 2014; Noble et al., 2014). A su vez, el VMH recibe numerosas proyecciones neuronales de NPY, AgRP y POMC desde el ARC (Palkovits, 2003; Simpson et al., 2009) y en él se expresan los receptores de NPY Y1 y Y5 así como MC4-R (Lopez-Valpuesta et al., 1996; Harrold et al., 1999; Li and Davidowa, 2004). Posee una amplia población de neuronas sensibles a la glucosa que responden a la hipoglucemia además de numerosos receptores que responden a dopamina, serotonina, GABA, histamina y estrógenos (Shimogawa et al., 2014). Un gran número de receptores de la leptina también se expresan en este núcleo (Elmquist et al., 1998). Introducción 15 En los últimos años, el núcelo ventromedial (VMH) comenzó a ser considerado como el principal núcleo encargado del control del gasto energético mediante la modulación de la termogénesis en el BAT (Morton et al., 2006; Xue and Kahn, 2006). Primero, se demostró que la estimulación eléctrica de este núcleo incrementaba la temperatura escapular del BAT y que este efecto se inhibía al bloquear los receptores beta-adrenérgicos (Perkins et al., 1981). Luego se postuló que este núcleo formaba parte de un eje entre VMH-Sistema Nervioso simpático (SNS)-BAT a través del cual se modula la termogénesis en el BAT (Lopez et al., 2010b; Whittle et al., 2012; Martinez de Morentin et al., 2012a; Martinez de Morentin et al., 2014a). Lo desarrollaremos más adelante. El núcleo paraventricular El núcleo paraventricular (PVH) está localizado en el hipotálamo anterior encima del tercer ventrículo y ocupa una posición central en la regulación de la ingesta y el gasto energético. Recibe un gran número de señales entrantes desde otras regiones hipotalámicas, también del tronco cerebral, así como señales peptídicas y parámetros fisiológicos conocidos por su acción en la modulación de la ingesta. Por ejemplo las neuronas sensibles a leptina presentes en el ARC proyectan sus axones a este núcleo (Cowley et al., 1999a; Sutton et al., 2014). La ruta de las melanocortinas está muy estrechamente ligada a la función de este núcleo y en el existe una densa expresión de receptores de melanocortinas (Kishi et al., 2003; Sutton et al., 2014). Las fibras de NPY/AgRP y α-MSH convergen en este núcleo también (Cowley et al., 1999b; Li et al., 2000). Lesiones en el PVH son seguidas de un incremento en la ingesta y obesidad (Aravich and Sclafani, 1983; Tokunaga et al., 1986). Además de su vinculación con la regulación de la ingesta también existen datos que apoyan su participación en el control del gasto energético, de tal forma que la infusión en el PVH de un agonista de uno de los receptores de melanocortinas produce un incremento en el gasto energético (Cowley et al., 1999a; Sutton et al., 2014). Una gran variedad de neuropéptidos son sintetizados en este núcleo, algunos de ellos muy vinculados a la regulación de la ingesta. En el PVH se encuentran las neuronas liberadoras de la hormona liberadora de corticotropinas (Corticotropin-releasing hormone, CRH), implicadas en la regulación de la ingesta y del balance energético, reguladas conjuntamente por NPY y las melanocortinas, de tal forma que CRH desciende la ingesta e incrementa la actividad del sistema nervioso central a través de fibras que viajan desde el PVH a la médula espinal (Cowley et al., 1999a; Palkovits, 2003). La leptina estimula la expresión de RNA mensajero de CRH (Kalra et al., 1999; Sahu et al., 1995; Palkovits, 2003). Se ha observado en ratas obesas que la Introducción 16 administración central de CRH tiene un efecto inhibitorio sobre la ingesta (Rohner-Jeanrenaud et al., 1989). Por otra parte, la hormona liberadora de tirotropina (Thyrotropin-releasing hormone, TRH) es sintetizada en las neuronas parvicelulares del PVH y algunas de estas células coexpresan también el péptido CART. Estas neuronas reciben inervaciones de otras neuronas como AgRP y POMC del ARC (Fekete et al., 2001; Ghamari-Langroudi et al., 2010). La TRH suprime la ingesta y juega un papel crucial en la regulación del balance energético (Kow and Pfaff, 1991). La TRH estimula la liberación de tirotropina u hormona estimulante de la tiroides (TSH) por parte de la hipófisis. Veremos esto más adelante. Por último, en neuronas locales del PVH es sintetizada la galanina, un marcador neuroquímico de la ingesta de grasa que contribuye al apetito natural por las grasas y es inhibido por la insulina (Akabayashi et al., 1994; Sahu et al., 1995; Wang and Leibowitz, 1997; Palkovits, 2003). El núcleo dorsomedial El núcleo dorsomedial (DMH) está formado por tres subdivisiones y está implicado en un amplio número de procesos fisiológicos tales como apetito, termorregulación o estrés (Schneeberger et al., 2014). Aunque este núcleo contienen receptores de leptina e insulina (Marks et al., 1990; Mercer et al., 1996b) así como terminaciones axonales de neuronas NPY/AgRP del ARC (Schwartz et al., 2000), solo unos pocos péptidos orexigénicos y anorexigénicos son expresados en este núcleo (Palkovits, 2003). Las neuronas que expresan el péptido similar a la galanina (Galanin galanin-like peptide, GALP) están presentes en la región más caudal de este núcleo (Jureus et al., 2000; Palkovits, 2003). Lesiones en el DMH inhiben la ingesta (Bernardis and Bellinger, 1987). Este papel en el comportamiento de la ingesta puede estar relacionado con el hecho de que las neuronas de este núcleo emiten sus proyecciones al VMH y PVH (Thompson et al., 1996) y son activadas por leptina (Elmquist et al., 1998). Como ocurre en otras regiones hipotalámicas, la microinyección de varias de las señales orexigénicas en el DMH provocan un incremento en la ingesta (Kalra et al., 1999). El aumento de los niveles de NPY en este núcleo por manipulación farmacológica o genética estimula la ingesta y el aumento de la masa corporal (Yang et al., 2009b; Bi et al., 2012). Introducción 17 El área hipotalámica lateral El área lateral hipotalámica (LHA) ha sido considerada esencial en la regulación de la ingesta y de la masa corporal. Lesiones en esta área resultan en una ingesta deficiente e incluso a veces en afagia (ausencia de ingesta) (ANAND and BROBECK, 1951; Palkovits, 2003). Recibe e integra muchas señales incluyendo estímulos metabólicos para modular la ingesta, la actividad y la atención o alerta según las condiciones ambientales y nutricionales (MORRISON et al., 1958; Goforth et al., 2014). Para contribuir a este proceso, el LHA recibe numerosas proyecciones desde el ARC y dos tipos de neuropéptidos orexigénicos han sido localizados en su superficie: MCH y OXs. Terminales inmunorreactivas de NPY, AgRP y α-MSH están presentes en este núcleo y mantienen contacto con células que expresan MCH y OXs (Broberger et al., 1998; Goforth et al., 2014). Se ha demostrado que lesiones en esta región conducen a marcadas alteraciones metabólicas y endocrinas, tales como problemas de crecimiento, problemas en el eje tiroideo y en la homeostasis de la glucosa (Bernardis et al., 1992; Lopez et al., 2010a). En humanos se han identificado dos receptores de MCH, Mchr1 y Mchr2, mientras en roedores solo ha sido identificado el primero de ellos, Mchr1. Ratones knockout para Mchr1 presentan un incremento en el gasto energético, actividad locomotora y son resistentes a la obesidad inducida por dieta (Chen et al., 2002; Simpson et al., 2009), mientras que la inyección en ratas en este núcleo de MCH provoca un incremento en la ingesta de alimento (Qu et al., 1996; Chen et al., 2002; Imbernon et al., 2013) y su sobreexpresión en ratones conduce a obesidad y resistencia a insulina (Chen et al., 2002). Otro neuropéptido expresado en el LHA es la orexina, también llamada hipocretina. Existen dos tipos que derivan del mismo precursor: orexina A y orexina B, y actúan a través de dos receptores OX1R y OX2R. Su administración ICV incrementa la ingesta (Sakurai et al., 1998; Lopez et al., 2010a; Alvarez-Crespo et al., 2013) y la leptina representa un modulador crucial de este neuropéptido, inhibiendo la activación de sus neuronas (Lopez et al., 2000; Yamanaka et al., 2010; Goforth et al., 2014). Sin embargo, se vio también el importante papel de este neuropéptido en los ciclos de sueño de tal forma que su ausencia en modelos animales o bien en humanos provoca narcolepsia; por lo tanto se ha postulado que sus efectos en la ingesta, nada claros aun, están ligados a la excitación y sueño reducido asociados (Hagan et al., 1999; Hara et al., 2001; Simpson et al., 2009). Introducción 18 Ilustración 2. Regulación hipotalámica del balance energético.(Lopez et al., 2013) METABOLISMO LIPÍDICO El tejido adiposo blanco (‘white adipose tissue’, WAT) almacena triacilglicéridos durante períodos de exceso de energía y los hidroliza (lipólisis) para la obtención de ácidos grasos que serán usados por otros tejidos durante períodos de déficit energético. Este tejido representa el órgano más eficiente para almacenar el exceso de ácidos grasos circulantes durante el periodo postprandial (Zimmermann et al., 2009). Mientras la síntesis de triacilglicéridos ocurre también en otros órganos como por ejemplo el hígado (producción de VLDL: lipoproteína de muy baja densidad), la lipólisis para la provisión de ácidos grasos para otros órganos parece ser exclusivo de los adipocitos (Ahmadian et al., 2009). En períodos de demanda, los ácidos grasos son liberados desde la célula (donde se encuentran almacenados en forma de gotas de grasa) por la acción de lipasas. Inicialmente, la limitada cantidad de lípidos presentes en los tejidos va a ser hidrolizada. Pero durante periodos de ayuno prolongado, estos almacenes son insuficientes para los requerimientos de ácidos grasos para la producción de energía y las reservas de grasa son movilizadas mediante la inducción de la lipólisis en los adipocitos. Fisiológicamente, los triglicéridos representan el mayor almacenamiento de energía del cuerpo. El hígado es uno de los órganos centrales en el metabolismo de los ácidos grasos y de los triglicéridos ya que recibe ácidos grasos de dos fuentes: la primera fuente proviene de la hidrólisis de los triglicéridos derivados del intestino que viajan en los quilomicrones durante el Introducción 19 período postprandial, y la otra fuente proviene de los ácidos grasos no esterificados (nonesterified fatty acids, NEFA) derivados de la lipolisis del tejido adiposo durante las condiciones de ayuno. Junto a estas dos fuentes exógenas de lípidos el hígado es también capaz de sintetizar ácidos grasos (lipogénesis de novo) a partir del exceso de glucosa. Estos ácidos grasos provenientes de diferentes fuentes pueden ser utilizados para la oxidación en el hígado, o bien ser ensamblados en triglicéridos para el almacenamiento o la secreción desde el hígado al plasma en su mayoría en partículas conocidas como lipoproteínas, principalmente en forma de lipoproteínas de muy baja densidad (‘very low-density lipoproteins, VLDL) (VLDL-TG) (Gibbons et al., 2000; Bruinstroop et al., 2014). La regulación de las VLDL-TG y su secreción es muy compleja; la disponibilidad de ácidos grasos, las hormonas (como la insulina) y la formación o degradación de ApoB (la mayor proteína estructural de VLDL) han sido implicadas en la regulación de la secreción de estas partículas (Gibbons, 1990; Mason, 1998). Las VLDLTG secretadas por el hígado pueden ser almacenadas en el tejido adiposo o ser usadas como fuente de energía predominantemente por los músculos (Bruinstroop et al., 2014). Tanto factores hormonales como el sistema nervioso autónomo pueden regular el metabolismo lipídico hepático (Bruinstroop et al., 2014). Dentro del hígado es muy importante la lipina 1 (LIPIN1) ya que controla la producción de TAG y la secreción de VLDL, así como los procesos de regeneración. Esta enzima existe en muchos otros tejidos: participa en el desarrollo y mantenimiento del tejido adiposo, en el músculo controla el gasto energético y los procesos de autofagia, y en el sistema nervioso periférico controla los procesos de mielinización (Csaki and Reue, 2010). Su importancia es clave en el organismo ya que ratones deficientes en ella poseen dificultades en el metabolismo de los lípidos en el hígado y en el tejido adiposo así como resistencia a insulina (Mlinar et al., 2008; Peterfy et al., 2001). Deficiencias en esta proteína dan lugar a la patología conocida como lipodistrofia (Miranda et al., 2007). Los niveles de esta proteína pueden ser regulados por glucocorticoides, esteroles, ayuno, etc. El paso limitante de la lipólisis está controlado por la lipasa sensible a hormonas (HSL). Esta enzima cataliza la hidrólisis de triglicéridos hasta monoglicéridos, finalmente, éstos son degradados por la monoacilglicerol lipasa (monoacylglycerol lipase, MAGL). La HSL está sujeta a una intensa regulación; esta enzima se activa por fosforilación controlada por la proteína kinasa A (PKA), la cual está asimismo activada por la vía del AMP cíclico (AMPc). La lipólisis se verá estimulada por todas aquellas hormonas que al unirse a su receptor provoquen la activación de proteínas G estimulantes y, por tanto la estimulación de la adenilatociclasa y la formación de AMPc (catecolaminas unidos a receptores β3 adrenérgicos o glucagón). Por el contrario, la lipólisis va a ser inhibida por aquellas hormonas cuyo receptor se encuentra asociado a la adenilato ciclasa a través de proteínas G inhibitorias (catecolaminas unidas a receptores β2 adrenérgicos o insulina). Introducción 20 Los ácidos grasos incorporados a las células deben entrar en la mitocondria para su βoxidación. Este proceso va a estar controlado a nivel de la carnitin palmitoil transferasa I (‘carnitine palmitoyltransferase I’, CPT1) un enzima mitocondrial que media el transporte de ácidos grasos de cadena larga a través de la membrana uniéndolos a las carnitina y regulada por los niveles plasmáticos de malonil-CoA (sustrato de la síntesis de ácidos grasos y regulador de su oxidación) (Lage et al., 2008; Wakil and Abu-Elheiga, 2009). La estearoil CoA desaturasa (‘Stearoyl-Coenzyme A desaturase-1’; SCD1) representa uno de los pasos claves en el mantenimiento de los lípidos intracelulares pues está implicada en la regulación de la síntesis, oxidación y almacenamiento de ácidos grasos. Es una desaturasa que convierte los ácidos grasos saturados en ácidos grasos moninsaturados. Estos ácidos grasos monoinsaturados son los sustratos para formar triglicéridos, ésteres de colesterol y diacilglicéridos (Flowers and Ntambi, 2009). Los ácidos grasos extracelulares también pueden entrar en la célula para ser esterificados en el retículo endoplasmático a través de una vía en la que participa la enzima dicailglicerol aciltransferasa (diacylglycerol acyltransferase, DGAT) generando también TG a partir de acetil CoA y diacilglicerol (DG) que pueden ser posteriormente secretados. Existen dos isoformas, DGAT1 y DGAT2, ambas se encuentran principalmente en el ER y se expresan ampliamente en numerosos tejidos pero sobre todo en aquellos con gran producción de TG como el WAT y el hígado (Yen et al., 2008). DGAT2 parece poseer más afinidad por los sustratos y su ausencia en ratones knock out no es compatible con la vida (Stone et al., 2004). Los lípidos de la dieta (principalmente triglicéridos, fosfolípidos y esteres de colesterol), una vez que llegan al intestino delgado son emulsionados por las sales biliares y las enzimas pancreáticas los transforman en productos primarios (monoacilglicéridos, ácidos grasos libres, colesterol, fragmentos de fosfolípios, etc.). Estos productos primarios son usados por los enterocitos para formar quilomicrones que salen vía linfática hacia la sangre. Estos quilomicrones y las VLDL son la principal fuente de triglicéridos para los adipocitos; estos son hidrolizados hasta ácidos grasos libres y monoglicerol por la lipoproteína lipasa (LPL) (Wang and Eckel, 2009). Esta enzima se expresa en numerosos tejidos como el músculo esquelético, tejido adiposo blanco y marrón (BAT) y en menor medida en tejidos como el hígado y el pulmón; su actividad es útil para determinar los niveles de triacilglicéridos en el adipocito (Fried et al., 1993) y en su regulación interviene el estado nutricional y hormonal. (Wang and Eckel, 2009). Los ácidos grasos libres hidrolizados son captados por los adipocitos a través de procesos de transporte activo mediado por proteínas transportadoras específicas de ácidos grasos, como la proteína de unión a ácidos grasos 3 (‘fatty acid-binding proteins’, FABP3). Estas proteínas están relacionadas con el transporte intracelular de ácidos grasos, con la captación celular de ácidos grasos (liberados por la albúmina), su almacenamiento intracelular, y con la entrega de los ácidos grasos a los sitios de su utilización. A mayores modulan la concentración intracelular de ácidos grasos y por lo tanto intervienen en la regulación del Introducción 21 metabolismo lipídico (Chmurzynska, 2006). Una vez en el interior de la célula, los ácidos grasos libres son re-esterificados para formar triglicéridos. Algunos factores de transcripción que intervienen en el metabolismo lipídico son PGC1α y PGC1β (receptor activado por proliferadores peroxisomales alfa y beta). Estos son coactivadores transcripcionales que mejoran la actividad de muchos receptores nucleares y coordinan los programas de transcripción importantes para el metabolismo energético (incluidas la biogénesis y oxidación mitocondriales) y la homeostasis energética. PGC1α se expresa selectivamente en tejidos con sistemas mitocondriales muy desarrollados como el corazón, músculo esquelético, grasa parda e hígado, donde regula respectivamente algunos tipos de fibras oxidativas, la contracción, termogénesis, gluconeogénesis y β-oxidación (Alaynick, 2008). Este factor de transcripción coactiva por un lado a PPARγ (‘peroxisome-proliferator activated receptors’), receptor nuclear altamente expresado en grasa considerado como el ‘director regulador’ de la adipogénesis y sin él las células precursoras son incapaces de expresar cualquier aspecto fenotípico de los adipocitos (Farmer, 2006). Por otro lado, también activa al factor respiratorio nuclear 1 (‘nuclear respiratory factor 1’, NRF1 ) que parece estar implicado en la expresión de distintas subunidades nucleares respiratorias, así como en la expresión de elementos que componen la maquinaria de replicación y transcripción; juega un papel importante en la biogénesis mitocondrial y el estrés oxidativo (Chen et al., 2003). Como mencionamos antes, los ácidos grasos pueden derivar de la dieta o de la síntesis de novo. La lipogénesis de novo, es el proceso por el cual el exceso de glucosa es incorporado por el hígado o el tejido adiposo y mediante una serie de reacciones se convierte en ácidos grasos que posteriormente serán esterificados a glicerol para formar los triacilglicéridos. La ruta de biosíntesis de novo de los ácidos grasos comprende tres enzimas principales; la acetil-CoA carboxilasa (acetyl-CoA carboxylase, ACC) que cataliza la síntesis de malonil-CoA (donador de carbonos en la síntesis de novo); la ácido graso sintasa (fatty acid synthase, FAS) es un complejo enzimático que convierte posteriormente ese malonil-CoA en ácidos grasos de cadena larga, como el palmitato; y la malonil-CoA decarboxilasa (MCD) incrementa la descarboxilación del malonil-CoA, reduciendo los niveles de malonil-CoA celular y generando acetil-CoA (Lopez et al., 2007a) (Menendez et al., 2009). ACC cataliza la carboxilación de acetil-CoA hacia malonil –CoA en un proceso dependiente de ATP; esta síntesis de malonilCoA es regulado reversiblemente por la MCD que convierte otra vez el malonil hacia acetilCoA. Ambos, son usados como substratos para la producción de palmitato, el principal producto de FAS. El resultado final es una molécula de acido graso saturada producida por FAS que puede ser metabolizado dependiendo de los requerimientos: por un lado puede ser desaturado para la formación de ácidos grasos insaturados, derivado a moléculas de triglicéridos para el Introducción 28 esfingomielinas son el esfingolipido más abundante en mamíferos por lo que son una enorme sustrato para la síntesis de ceramidas. Existen algunos estudios sobre el papel de este enzima en la función metabólica y en la obesidad. Los niveles de SMase ácida están elevados en el tejido adiposo de ratones obesos (Samad et al., 2006). Interesantemente, aquellos humanos que poseen el síndrome de Niemann que se caracteriza por la ausencia de la actividad de SMase ácida, tienen problemas para ganar y mantener el peso corporal, lo mismo ocurre en los modelos animales (CROCKER and FARBER, 1958; Garver et al., 2007). 3). La vía de rescate o recuperación: las ceramidas pueden ser producidas a través del catabolismo de otros complejos de esfingolipidos. La degradación de esfingolípidos se produce en los endosomas y lisosomas. Mediante una serie de eventos los esfingolipidos de orden superior se degradan dentro de los compartimentos celulares con naturaleza ácida gracias a las enzimas residentes (SMasa ácida y ácido ß-glucosidasa 1) para formar ceramidas (40-42), que es degradada a esfingosina y ácidos grasos libres para ser capaz de entrar al citosol. Una vez en el citosol, la esfingosina se convierte de nuevo a través de la ceramidasa (Bikman and Summers, 2011) (Ver Ilustración 6). Un incremento en la producción de ceramidas puede dar lugar a ER estrés (Kahn et al., 2006; Holland and Summers, 2008; Bikman and Summers, 2011). En relación con esto, la inhibición farmacológica o la ablación genética global de la síntesis de novo de ceramidas provoca una mejora en la sensibilidad a insulina y en la homeostasis de la glucosa (Summers et al., 1998; Yang et al., 2009a). Otras evidencias indican que los niveles de ceramidas en el cerebro están incrementados en obesidad inducida por dieta alta en grasa (Borg et al., 2012) y que los niveles hipotalámicos regulados por CPT1c (isoforma específica localizada en el ER) median los efectos orexigénicos de ghrelin (Ramirez et al., 2013). Recientemente, nuestro grupo demostró que la lipotoxicidad hipotalámica inducida por ceramidas y el ER estrés provocan un descenso en el tono simpático hacia el BAT, lo que produce un descenso en la termogénesis y una ganancia de masa corporal independiente de la ingesta (Contreras et al., 2014b). Sin embargo, no existen muchos datos que vinculen la lipotoxicidad o el ER estrés con las hormonas tiroideas. Introducción 29 Lysoglycerophospholipids DAG PCPSPE PI LIPIN1 CDIPT PISD PTDSS1 PLA2g4a PLA2g4a PLA2g4a Phosphocholine PCYT1a SMPD2SGMS1 SPTlc1 Sphinganine Ceramide Sphingomyelin TAG DGAT1PNPLA2 Palmitoyl -CoA Malonyl-CoA Acetyl-CoA FAS ACC MCD - Malonyl- -CoA LASS1 Sphingosine ACER1 Ilustración 6. Esquema de la ruta de síntesis de ceramidas. SENSORES ENERGÉTICOS AMPK AMPK (AMP activated protein kinase) es una proteína muy bien conservada en eucariotas. Es el componente downstream de una cascada de kinasas que actúa en un amplio rango de niveles celulares, además de considerarse un sensor celular de los niveles de energía. En los últimos años, se ha demostrado que AMPK está también involucrada en la regulación del balance energético a nivel de todo el cuerpo respondiendo a señales hormonales y señales nutricionales que conducen a cambios en la homeostasis energética. La relevancia fisiológica de AMPK fue demostrada por el hecho de que el deterioro en las funciones de AMPK está asociado con alteraciones metabólicas, resistencia a insulina, obesidad, desordenes hormonales y enfermedad cardiovascular (Carling et al., 1987; Andersson et al., 2004; Kahn et al., 2005; Carling et al., 2008; Lage et al., 2008; Blanco Martinez de et al., 2011). A nivel molecular, AMPK es un complejo heterotrimérico formado por una subunidad α catalítica con un dominio protein kinasa serina/treonina convencional, y dos subunidades reguladoras, β y γ. En mamíferos, cada subunidad es codificada por múltiples genes (α1, α2, β1, β2, γ1, γ2, γ3) que resulta en 12 posibles combinaciones de complejos AMPK. La subunidad α Introducción 30 contiene un dominio kinasa N-terminal y un dominio C-terminal involucrado en la formación del complejo con las subunidades β y γ; la subunidad β contiene un dominio C-terminal muy combinado que son capaces por si mismos de forma un complejo con la subunidad γ (Lage et al., 2008). La regulación de la actividad de AMPK involucra por un lado una estimulación alostérica por un incremento en el ratio intracelular AMP/ATP así como por su fosforilación; la activación requiere la fosforilación de la treonina 172 (Thr-172) en la subunidad catalítica α por una kinasa upstream sensible a AMP (Ponticos et al., 1998; Hawley et al., 1996). Se han identificado dos kinasas AMPK upstream: el supresor de tumores LKB1 (Liver Kinase B1) y la proteína kinasa de la kinasa dependiente de calcio y calmodulina (Ca2+ ⁄calmodulin-dependent protein kinase kinase, CaMKK 1 y 2; CaMKK1 o CaMKK2, también llamadas CaMKKα y CaMKKβ, respectivamente) (Woods et al., 2005; Carling et al., 2008; Hawley et al., 2005). Aunque in vivo, la isoforma 2 parece ser más importante. Algunas publicaciones señalan también a la proteína fosfatasa 2C α (protein phosphatase 2C alpha, PP2Cα) como un inhibidor de AMPK mediante una desfosforilación (Hurley et al., 2005; Steinberg et al., 2006b; Hardie, 2007) y otras publicaciones, muestran que la proteína TAK1 (Transforming growth factor-betaactivated kinase) activa AMPK (Woods et al., 2003; Hawley et al., 2005; Xie et al., 2006) y la kinasa supresora de Ras (kinase suppressor of Ras, KSR2) interactúa con la subunidad α1 de AMPK, modulando su actividad (Costanzo-Garvey et al., 2009) (Ilustración 7). Un primer mecanismo de activación de AMPK definido postula que AMPK es activado alostéricamente por AMP, que también inhibe PP2Cα incrementando la fosforilación en Thr172 y por tanto activando AMPK; este se conoce como mecanismo de regulación dependiente de AMP (Sanders et al., 2007; Lage et al., 2008); sin embargo estudios recientes postulan otro mecanismo independiente de AMP llamado modelo de activación dependiente de Ca2+: el incremento de Ca2+ conduce a la activación de CaMKKβ, que incrementa la fosforilación en Thr172 y se activa AMPK; este mecanismo ocurre sin necesidad del incremento de AMP (Sanders et al., 2007). Finalmente, se reveló otro mecanismo que modula la actividad de AMPK; este implica la formación de un complejo entre la subunidad β de AMPK y CIDEA (Cell-death-inducing likeeffector A) que provoca la degradación de AMPK mediada por ubiquitinación reduciendo así su actividad (Qi et al., 2008). La visión clásica de AMPK, es como un sensor de energía intracelular que modula el balance energético dentro de la célula. En muchos tejidos, la activación de AMPK (su fosforilación) provoca la inactivación de todos aquellos procesos consumidores de ATP mientras se promueven los procesos catabólicos para la producción de ATP y restaurar así el ratio AMP:ATP (Kahn et al., 2005; Carling et al., 2008; Lage et al., 2008). La reducción de la Introducción 31 actividad de AMPK en tejidos periféricos como el músculo, el hígado y el tejido adiposo, provoca una reducción de la capacidad de ejercicio, de la tolerancia a la glucosa y una predisposición a la obesidad y la diabetes (Steinberg et al., 2006a) (Stark et al., 2013). Además de en la periferia, AMPK actúa como un sensor clave en el balance energético mediante la integración de señales nutricionales y hormonales en el hipotálamo. AMPK actúa en neuronas hipotalámicas, vinculando el estado metabólico de neuropéptidos clásico, con el sistema de neurotransmisores que regulan la alimentación. Se ha observado que AMPK es expresado en varios núcleos hipotalámicos como el ARC, PVH, VMH y LHA (Minokoshi et al., 2004a; Lopez et al., 2008; Lage et al., 2008; Lopez et al., 2006). El ayuno incrementa la actividad de AMPK en múltiples regiones del hipotálamo y la realimentación la inhibe (Andersson et al., 2004; Minokoshi et al., 2004a; Lopez et al., 2008). Por otro lado la activación de AMPK en el hipotálamo incrementa la ingesta y la ganancia de masa corporal, mientras que su inhibición promueve la hipofagia y la pérdida de masa (Minokoshi et al., 2004b)(Andersson et al., 2004; Lopez et al., 2007a). Ilustración 7. Estructura y regulación de AMPK. (Blanco Martinez de et al., 2011) Como hemos mencionado antes, AMPK es un modulador clave de la ruta metabólica hipotalámica de los ácidos grasos. La activación de AMPK provoca la fosforilación e inhibición de ACC, y una disminución de la expresión del mRNA de FAS a través de la proteína SREBP1; como resultado se produce una disminución marcada en los niveles de malonil-CoA, lo que estimula la actividad de CPT1, y esto lleva a un incremento en la ingesta (Lopez et al., Introducción 32 2008; Kola et al., 2005; Minokoshi et al., 2004a; Minokoshi et al., 2008). Se establece así un eje crucial para el control de la homeostasis energética formado por AMPK-malonil CoA-CPT1 que media no solo efectos en la periferia sino también a nivel central. Señales anorexigénicas como la leptina, la insulina o GLP-1 inhiben AMPK a nivel hipotalámico, provocando un incremento en la actividad de ACC (Minokoshi et al., 2004a; Andersson et al., 2004; Seo et al., 2008; Gao et al., 2007; Wolfgang et al., 2007). Por el contrario, señales orexigénicas como los canabinoides, los glucocorticoides, ghrelin, hormonas tiroideas o AgRP, activan AMPK a nivel hipotalámico (Kola et al., 2005; Lopez et al., 2008; Lopez et al., 2010b; Ishii et al., 2008). Sin embargo, hay excepciones, la resistina (RSTN) a pesar de poseer un efecto anorexigénico provoca la activación de AMPK (Vazquez et al., 2008). Claret y colaboradores, hipotetizaron que AMPK regulaba el balance energético y el apetito por media de sus acciones en neuronas AgRP y POMC en el ARC. La delección de la subunidad α2 en neuronas AgRP causa un fenotipo delgado con un incremento en la sensibilidad hacia el antagonista de las melanocortinas, pero sin cambios en la ingesta. Por otra parte la delección en la en la subunidad α2 en neuronas POMC reduce el gasto energético e incrementa la ganancia de masa corporal (Claret et al., 2007a). Varios modelos animales con delecciones selectivas en las subunidades de AMPK han sido generados para el estudio de su papel en el metabolismo energético y la obesidad. Ratones deficientes en AMPKα2 a nivel global alimentados con dieta alta en grasa (Viollet et al., 2003) y ratones deficientes en AMPKα2 pero en neuronas POMC alimentados con dieta estándar y dieta alta en grasa muestran una elevada masa corporal y masa grasa (Claret et al., 2007b; Long and Zierath, 2006). Por el contrario ratones con ablación selectiva de AMPKα2 en neuronas AgRP muestran un fenotipo delgado dependiente de la edad (Claret et al., 2007a). Estos datos parecen indicar el importante papel que AMPK desarrolla en el ARC en el control de la ingesta. Otros ratones como los ratones deficientes en AMPKβ1 en condiciones de dieta alta en grasa o dieta normal tienen reducida su ingesta, su adiposidad y su masa corporal total pero sin cambios en el ratio metabólico, la actividad física, la lipolisis del tejido adiposo y la lipogénesis (Dzamko et al., 2010). La ausencia de alteraciones en el peso corporal o en la ingesta en algunos de estos modelos animales se relaciona posiblemente con la compensación que existe entre las restantes subunidades catalíticas; por ejemplo en el caso del ratón deficiente en AMPKα2 los niveles de expresión de AMPKα1 están incrementados (Viollet et al., 2003). Sin embargo, el fenotipo obeso de los ratones POMCα2 KO no se debe a la compensación por la sobreexpresión de AMPKα1 (Claret et al., 2007a). Por tanto, el desarrollo de otros modelos de animales focalizados en subunidades específicas de AMPK en núcleos hipotalámicos concretos o en poblaciones neuronales, ayudarán a aclarar el papel de AMPK en la fisiología de la obesidad y en la respuesta a metabolitos periféricos. Introducción 33 Muchas de las acciones de AMPK como modulador de la ingesta las ubican en el núcleo ARC, pero AMPK en el VMH se ha demostrado que posee un papel más integrador. Últimas investigaciones colocan al AMPK hipotalámico como un regulador central de la termogénesis a través del sistema nervioso autónomo (autonomic nervous system, ANS) y a través del VMH. Nuestro grupo, examinó los efectos de las hormonas tiroideas sobre AMPK a nivel central y sobre el metabolismo energético. El hipertiroidismo o la inyección central de T3 en el hipotálamo provocan una reducción de la masa corporal sin verse afectada la ingesta. Como consecuencia, se produce un incremento en la termogénesis (incremento de la expresión de UCP1 y PGC1α) por estimulación del SNS a través de los receptores β3 adrenérgicos. Al inyectar T3 directamente en el VMH (alta coexpresión de AMPK y de TR) se observaba una disminución en la actividad de AMPK y un aumento en la actividad nerviosos simpática en el BAT. Por otro lado, la inyección central de AICAR o de un adenovirus AMPK constitutivamente activado, revertía los efectos en la pérdida de peso, reducía los niveles de malonil-CoA y la expresión de marcadores termogénicos en BAT. La inyección en el VMH de un adenovirus dominante negativo para AMPK, inducía pérdida de peso, incrementaba los niveles de malonil-CoA y provocaba un aumento en el programa termogénico en BAT (Lopez et al., 2010b). Este estudio, muestra que las hormonas tiroideas inactivan AMPK en el VMH y provocan el aumento de la activación de la termogénesis, lo que conduce a una pérdida de masa sin afectar a la ingesta. De manera similar la administración central de nicotina, estrógenos o liraglutide (un análogo de GLP-1 de uso clínico) inhiben también la actividad de AMPK en el hipotálamo, lo que conduce a la activación del SNS y de la expresión de los marcadores termogénicos UCP1 y UCP3 en el BAT. Además la inhibición de la ruta lipogénica en el VMH impide la activación del BAT mediada a nivel central por nicotina o estrógenos, revirtiendo la pérdida de peso asociada a la administración central de estas sustancias (Cannon and Nedergaard, 2010; Martinez de Morentin et al., 2012a; Martinez de Morentin et al., 2014a; Seoane-Collazo et al., 2014; Beiroa et al., 2014). Así, el AMPK hipotalámico no sólo regula el apetito, sino que también regula el gasto energético. Introducción 34 Ilustración 8. Esquema de las acciones de AMPK en tejidos periféricos. (Hardie, 2004) KINASAS C-JUN AMINO TERMINALES ( JUN amino-terminal kinases, JNKs) Kinasas c-JUN amino terminales (JNKs), también conocidas como kinasas activadas por estrés (SAPKs, stress-activated protein kinases) constituyen una familia de proteínas de transducción de señales que son activadas bajo diversas circunstancias. JNKs son componentes de una cascada de señalización clásica de proteínas kinasas activadas por mitógenos (MAPK, mitogen-activated protein kinase) que sirven para amplificar la señal filtrando y permiten así la diversidad de la señalización. JNKs regula la expresión de genes a través de la fosforilación y activación de factores de transcripción como cJUN o ATF2 (Gupta et al., 1995), o bien por la regulación de la estabilidad de mRNA (Chen et al., 1998). Tres genes codifican los miembros de la familia JNK (Jnk1, Jnk2 y Jnk3); mientras Jnk1 y Jnk2 son ampliamente expresados, Jnk3 se expresa específicamente en el cerebro, los testículos y el corazón (Davis, 2000; Chang and Karin, 2001; Manieri and Sabio, 2015). Pero se ha observado que la actividad de JNK es mayor en el cerebro que en cualquier otro tejido dentro de los mamíferos (Coffey and Courtney, 1997; Coffey, 2014; Hu et al., 1997; Kuan et al., 2003) lo que sugiere que los miembros de esta familia de kinasas son reguladores clave dentro del CNS. Cada miembro de JNKs puede ser expresado en varias variantes que pueden ser separadas en dos grupos en función de su tamaño: las formas cortas sobre 46 kDa (JNK1α1, JNK1β1, JNK2α1, JNK2β1, JNK3α1) y las formas largas sobre 54 kDa (JNK1α2, JNK1β2, JNK2α2 JNK2β2, JNK3α2) (Sabio and Davis, 2014; Manieri and Sabio, 2015). Introducción 35 JNK es activado en respuesta a un amplio rango de estímulos: citoquinas (IL6, TNFα), ambientes estresantes (hipoxia, radiación ionizante), toxinas, drogas y cambios metabólicos incluyendo la obesidad y la hiperlipidemia. La obesidad causa una respuesta inflamatoria crónica de bajo grado que conduce a la activación de rutas de estrés, incluyendo la de JNK1; esta es la principal isoforma que ha sido implicada en el desarrollo de la obesidad y resistencia a insulina (Hirosumi et al., 2002), aunque JNK2 podía tener también un papel en esto (Tuncman et al., 2006) (Imagen 9). La ablación del gen Jnk1 en ratones (shRNA) o bien su inhibición farmacológica protege contra la resistencia a insulina inducida por obesidad (Hirosumi et al., 2002; Kaneto et al., 2004; Bennett et al., 2003; Nakatani et al., 2004; Sabio and Davis, 2010). Por otra parte, los estudios en ratones deficientes en JNK1 a nivel global en todo el cuerpo han mostrado que esta kinasa controla la acumulación de lípidos y la absorción de lípidos en hígado (Imbernon et al., 2013). Los adipocitos durante la obesidad son objeto de estímulos de estrés, de tal forma que la obesidad debida a alteraciones genéticas o inducidas por dieta, activa JNK1 en el tejido adiposo (Hirosumi et al., 2002). Sin embargo, los ratones condicionales para JNK1 generados sobre tejidos periféricos sensibles a la insulina (Sabio et al., 2008; Sabio et al., 2009; Sabio and Davis, 2010; Sabio et al., 2010b), no englobaban el fenotipo que se generaba con ratones JNK1 knock out totales, lo que sugería la posibilidad de que la activación de JNK1 pero a nivel del CNS podía contribuir al mantenimiento del balance energético y del metabolismo de la glucosa. La activación de JNK en el hipotálamo durante la obesidad se ha relacionado con el ER estrés, la inflamación y la hiperlipidemia (Ozcan et al., 2004; Prada et al., 2005a; Prada et al., 2005b). En 2010, dos grupos independientes generaron dos modelos JNK1 knock out condicionales en áreas específicas del cerebro (Sabio et al., 2010a; Belgardt et al., 2010b) usando un sistema de Nestin-cre (permite abolir el gen de interés en neuronas y astrocitos del CNS (Tronche et al., 1999)); ambos estudios mostraron que estos ratones estaban protegidos contra la obesidad inducida por dieta alta en grasa, resistencia a insulina e intolerante a la glucosa a nivel central y periférico (Belgardt et al., 2010b; Sabio et al., 2010a). Por otro lado, tenían reducida la acumulación de lípidos en el BAT mientras los niveles plasmáticos de T3 y T4 estaban elevados, lo que se correlacionaba con los altos niveles de TRH en el hipotálamo. Estos datos parecían indicar que JNK1 en el CNS controlaba la homeostasis corporal mediante la regulación del eje hipotálamo-hipófisis-tiroides (Sabio et al., 2010a). Ratones carentes de JNK1 en todas las neuronas, presentaban un fenotipo metabólico con el gasto energético elevado (esto se correlacionaba con los niveles altos de T3), una ligera pérdida de masa pero ningún cambio en la masa grasa con respecto a los controles, por lo que no quedaba claro si estaban protegidos contra la obesidad (Belgardt et al., 2010b). Otros modelos de ratones surgieron para intentar aclarar el papel de JNK en el CNS; ratones que sobrexpresaban JNK1 en neuronas AgRP, desarrollaban obesidad cuando eran alimentados con dieta alta en grasa, además de convertirse en resistentes a la leptina a nivel neuronal y sistémico (Tsaousidou et al., Introducción 36 2014). Estos resultados indicaban que JNK y en particular JNK1 desempeñaba un papel fundamental en el control de la obesidad a nivel del CNS. Además, se ha demostrado que la ablación selectiva de JNK1 en el hipotálamo y en la hipófisis mediante un sistema de NestinCre conduce a la activación del eje tiroideo, mostrando un incremento de TRH-R y TSHβ en la hipófisis así como niveles circulantes de T3 elevados (Belgardt et al., 2010b). Por tanto, JNK1 es un regulador negativo de la sensibilidad a insulina, del eje tiroideo y del crecimiento, aunque las poblaciones neuronales implicadas en estos efectos no han sido definidas (Belgardt et al., 2010a). Podríamos decir que JNK1 ha sido implicado en la regulación de la ingesta y en el metabolismo periférico de la glucosa (Unger et al., 2010; Belgardt et al., 2010a; Belgardt et al., 2010b; Tsaousidou et al., 2014), pero sin embargo su implicación en el metabolismo lipídico no ha sido muy estudiado. Ilustración 9. Acciones de las isoformas de JNK sobre órganos específicos en el metabolismo. JNK juegan un papel crucial en el metabolismo; las funciones de JNK1 y JNK2 son específicas de algunos órganos y han sido extensamente estudiados modelos animales. (Manieri and Sabio, 2015). Introducción 37 TERMOGÉNESIS: el tejido adiposo pardo El balance energético es la diferencia entre la energía que obtiene un individuo a través de la ingesta y la energía que gasta este individuo (gasto energético, GE). Dentro del GE, podemos diferenciar entre la termogénesis obligatoria (energía consumida por un individuo en reposo, ayunas y en condiciones de termoneutralidad; asociada a reacciones metabólicas esenciales) y la termogénesis facultativa o adaptativa (el calor producido por el músculo (tiritando) y el tejido adiposo pardo como respuesta a la exposición al frío o a una dieta hipercalórica). El tejido adiposo pardo a pesar de estar compuesto por células grasas es totalmente diferente al tejido adiposo blanco. Sus adipocitos muestran una forma poligonal con una gran cantidad de gotas lipídicas citoplasmáticas pequeñas (multiloculares), un núcleo central y un gran número de mitocondrias en los adipocitos; los lípidos son su fuente primaria de combustible para la fosforilación oxidativa y la producción de calor (Cannon and Nedergaard, 2004; Contreras et al., 2014a). La gran cantidad de mitocondrias existentes en las células del BAT es fundamental para que se produzcan la fosforilación oxidativa y la termogénesis (Ricquier, 2005). La membrana interior de las mitocondrias posee unos transportadores específicos para el intercambio de ADP-ATP, fosfato, citrato, glutamato y malato. Además mantienen un gradiente electroquímico muy grande generado por la cadena de transporte electrónico necesaria para la conservación de la energía y para la síntesis de ATP en la mitocondria así como para su uso (Brand et al., 1999) (Ricquier, 2005). El BAT puede considerarse un órgano altamente activo siendo considerado el principal sitio donde ocurre la termogénesis sin temblor, que es facilitada a través del desacoplamiento de la respiración mitocondrial para la producción de ATP, y mediada por la proteína desacoplante 1 (UCP1, uncoupling protein 1) también conocida con el nombre de termogenina y que está localizada en la membrana mitocondrial interna y es un excelente marcador de este tejido (Contreras et al., 2014a; Cannon and Nedergaard, 2004; Whittle et al., 2011). Esta proteína disocia la cadena de transporte electrónico para la producción de calor, permitiendo el libre movimiento de protones a través de la membrana mitocondrial (Whittle et al., 2011). La función termogénica del BAT y UCP-1 ha sido extensamente estudiada. Ratones con el BAT reducido genéticamente son propensos a desarrollar obesidad sin embargo ratones deficientes en UCP-1 no son propensos a ganar masa corporal (Lowell and Flier, 1997). Por otra parte los ratones carentes de UCP-1 son extremadamente sensibles al frío (Enerback et al., 1997; Feldmann et al., 2009). Estos datos sugieren que podían existir mecanismos adicionales que pueden controlar el gasto energético además de UCP-1. Posteriormente se identificaron otros dos miembros de la familia de las proteínas desacoplantes: UCP-2 ampliamente expresada en muchos tejidos, y UCP-3 expresada principalmente en el BAT y en el músculo esquelético. Se ha demostrado que ratones deficientes en UCP-2 y UCP-3 tampoco presentaban una significante predisposición a hipotermia, reducido gasto energético u obesidad (Arsenijevic et al., 2000; Introducción 44 producidas por células foliculares a través de la yodación de los residuos de tirosina en la glucoproteína llamada tiroglobulina, aunque la mayoría de la T3 circulante es generada de forma periférica por la conversión de T4 a T3 gracias a las deyodinasas intracelulares (Mebis and Van den Berghe, 2009a; Mebis and Van den Berghe, 2011; Brent, 2012). La glándula tiroides también produce la calcitonina (secretada por las células parafoliculares e involucrada en la regulación de los niveles de calcio y fósforo en suero y la remodelación esquelética, junto con la hormona paratiroidea y la vitamina D)(Little, 2006a). En el suero, las hormonas tiroideas se unen a proteínas de transporte de hormonas tiroideas como son la globulina fijadora de tiroxina (TBG, T4-binding globulin), transtiretina (TTR, transthyretin) y la albumina (Mebis and Van den Berghe, 2009b). El eje hipotálamo-hipófisis-tiroides controla los niveles de T4 y T3, a través de un control de feedback negativo, principalmente, mediante el incremento o descenso de la demanda metabólica, aunque existen otros factores que pueden afectar al control de este balance como son algunas enfermedades, las drogas, las enfermedades tiroideas, los desórdenes en la hipófisis e incluso la edad (Little, 2006b; Mebis and Van den Berghe, 2009a; Mebis and Van den Berghe, 2011). Bajo condiciones normales, el hipotálamo (en el PVH) se produce la hormona liberadora de tirotropina (TRH) en respuesta a estímulos externos como son enfermedad, estrés, demanda metabólica y bajos niveles de T3. La TRH estimula la hipófisis para liberar la hormona estimulante de tiroides (TSH, thyroid-stimulating hormone), que actúa directamente en el receptor de TSH expresado en las células foliculares de la tiroides, causando la secreción de la pro-hormona T4 y en menor medida de T3. Esto, altos niveles de T4 y T3 cesan la liberación de TSH y bajos niveles la incrementan (Little, 2006a; Mebis and Van den Berghe, 2009a; Brent, 2012). La ruta de activación de la tiroxina es mediada por un grupo de enzimas llamadas yodotironina deyodasas que elimina el yodo de la molécula de T4 y sus derivados; existen tres tipos: tipo 1 (D1), tipo 2 (D2), y una deyodasa inactivante, la tipo 3 (D3). Estas tres enzimas constituyen un grupo de proteínas (dimeric integral membrane thioredoxin fold-containing proteins) que pueden activar o inactivar las hormonas tiroideas (Bianco and Kim, 2006; Mebis and Van den Berghe, 2009b; de Jesus et al., 2001). Las deyodinasas son determinantes para mantener el pool de T3 citoplasmático, la concentración nuclear de T3 y la saturación de TR (Ilustración 13). D1 está localizada en la membrana plasmática, con un dominio transmembrana anclado en la membrana y con un dominio globular catalítico hacia el citosol; el gen Dio1 es altamente sensible a T3. Este tipo de deyodasa es expresada en la glándula tiroides, el hígado, el riñón y la glándula pituitaria; provoca la bioactivación de T4 a T3 por deyodinización (Bianco and Kim, 2006; Mebis and Van den Berghe, 2009a) y su actividad está regulada por T3 a nivel transcripcional, con un incremento en la actividad de D1 durante el hipertiroidismo y un Introducción 45 descenso en el hipotiroidismo (Mebis and Van den Berghe, 2009b). D1 es una enzima cinéticamente ineficiente cuyo papel en la fisiología del cuerpo no está muy clara (Bianco and Kim, 2006). D2 es la principal enzima activadora de la T4 y tiene una elevada afinidad por el sustrato; está localizada en el retículo endoplasmático, de este modo la producción mediada por D2 ocurre intracelularmente. Esta enzima se expresa en el cerebro, la glándula tiroides, el músculo esquelético y la glándula pituitaria anterior; su función es convertir T4 a su forma activa T3 y la rT3 convertirla en 3,5-diyodo-L-tironina (T2). Es esencial para la producción local de T3 (Mebis and Van den Berghe, 2009b; Mebis and Van den Berghe, 2011; Arrojo E Drigo and Bianco, 2011). D3 abunda en muchos tejidos durante las etapas tempranas del desarrollo; cuando el embrión está maduro, la expresión de D3 disminuye mientras la de D2 se incrementa, provocando un aumento en la señalización de las hormonas tiroideas hasta después del nacimiento y hasta la edad adulta. Es localizada en la membrana plasmática, y está presente en la piel, cerebro, varios tejidos fetales, el útero gestante y la placenta. Esta deyodinasa media la degradación de la hormona tiroidea: cataliza la conversión de T4 hacia 3,3’-5’-triyodotironina (T3 o reverse T3) y la de T3 hacia T2 (Arrojo E Drigo and Bianco, 2011; Arrojo E Drigo et al., 2013; Herwig et al., 2008). Tanto las deyodasas como los receptores de hormonas tiroideas (TRs, thyroid hormone receptors) están situados intracelularmente. Las THs necesitan transportadores de membrana para entrar al citoplasma debido a su carácter no lipídico. Han sido identificados varios transportadores de dichas hormonas: NTCP (Na+/taurocholate cotransporting polypeptide), translocador de ácidos grasos (fatty acid translocase), transportadores de aminoácidos y miembros de la familia de polipéptidos transportadores de aniones orgánicos (OATPs, organic anion-transporting polypeptide) y la familia de proteínas de transporte monocarboxiladas (MCT, monocarboxylate transporter) (Visser et al., 2008). Dentro de la familia MCT, probablemente una de los transportadores más importantes es el MCT8. Este transportador está localizado en diferentes tejidos como el hígado y el cerebro (incluyendo el hipotálamo, el mayor sitio de integración de la regulación génica y feedback de las THs) y es altamente selectivo para las THs (Friesema et al., 2010; Friesema et al., 2012; Martagon et al., 2013; Brent, 2012). MCT8 es muy importante para la captación y el flujo de las THs a través de la barrera hematoencefálica y las neuronas (Martagon et al., 2013). La mayor ruta de entrada de la T4 en el cerebro es a través de dicha barrera hematoencefálica; una vez dentro del cerebro, dos de los principales transportadores específicos que existen aquí son el polipéptido transportador de aniones orgánicos 1c1 (OATP1C1, organic anion-transporting polypeptide 1c1) y MCT8; se podría decir que el principal transportador de T4 en el cerebro es OATP1C1 y para la T3 es el MCT8 (Lazar, 1993; Herwig et al., 2008) (Ilustración 13). Introducción 46 La bioactividad de las THs puede ser modulada a nivel de sus receptores nucleares que actúan como factores transcripcionales ligando dependientes; existen tres receptores funcionales con similar afinidad por la unión a T3 y codificados por dos genes: TRα y TRβ (Mebis and Van den Berghe, 2009a). Una vez dentro de la célula, T3 puede interactuar con receptores TH y activar o inactivar la respuesta de genes. Dos genes, TRα y TRβ, codifican siete receptores identificados que mediante un proceso de splicing alternativo o por el sitio de iniciación de la transcripción, producen las diferentes isoformas (Herwig et al., 2008). Los transcritos del gen TRβ producen tres proteínas de unión a ligando (TRβ1-3) con una región C-terminal conservada, incluyendo dominios DNA y de unión a ligando pero con diferentes porciones N-terminal. La situación es más compleja con el gen TRα; uno de los dos mayores productos de este gen, TRα1, da lugar a un receptor-ligando, mientras el otro genera tres principales isoformas llamadas TRα2, TRα3 y TRα4, que no se unen al ligando pero tienen capacidades de unión a DNA, aunque su función in vivo no está clara (Warner and Mittag, 2012; Brent, 2012; Lopez et al., 2010b). TRα1 y TRβ1 tienen una distribución muy extensa, mientras TRβ2 está mucho menos distribuido y su expresión está localizada en algunos tipos de células incluyendo neuronas TRH en el PVH y células tirotropas en la pituitaria (Costa-e-Sousa RH and Hollenberg, 2012; Lechan et al., 1993). Los humanos con mutaciones en el desarrollo de TRβ desarrollan resistencia central a TH, indicando la importancia de esta isoforma en humanos (Costa-e-Sousa RH and Hollenberg, 2012). Los TRs están ampliamente distribuidos en todo el cerebro incluyendo la expresión de la mayoría de isoformas, en el ARC en el VMH y en el PVH, en donde se colocalizan con neuronas TRH (Herwig et al., 2008). Ilustración 13. Síntesis y transporte de hormonas tiroideas (Wiersinga, 2014). Introducción 47 Las hormonas tiroideas y el metabolismo Se sabe desde hace mucho tiempo que las THs incrementan la tasa metabólica basal. El papel de las THs en la regulación de la homeostasis energética es evidente en aquellos pacientes que padecen algún desorden tiroideo. El hipertiroidismo es un síndrome clínico caracterizado por la sobreactivación de la glándula tiroidea de forma que se produce una sobreproducción de T3 y T4, conduciendo a un exceso de hormonas tiroideas circulantes. Esto lleva a un aumento en el consumo de oxígeno y la producción de calor, resultando en un incremento en la tasa metabólica, pérdida de peso, incremento de la ingesta calórica y taquicardias (Lopez et al., 2010b; Warner and Mittag, 2012; Yehuda-Shnaidman et al., 2013). El 85% de los pacientes con tirotoxicosis muestran una pérdida de peso, a pesar de que muchos de ellos tiene un elevado consumo de comida (Brent, 2012; Silva, 2006; Bianco, 2011). En el otro extremo, el hipotiroidismo, con niveles de T3 reducidos, poseen elevada sensibilidad al frío, descenso del gasto energético, ganancia de masa a pesar de un descenso en la ingesta y bradicardia (Alkemade et al., 2005; Alkemade, 2010; Warner and Mittag, 2012; Yehuda-Shnaidman et al., 2013; Kim, 2008). Recientes estudios epidemiológicos han mostrado una incidencia de hasta un 20% de hipotiroidismo en pacientes obesos, sugiriendo el importante papel de las THs en el desarrollo de la obesidad (Pearce, 2012; Kaptein et al., 2009). Muchos de estos efectos han sido conectados a acciones directas de las THs en los tejidos metabólicamente activos, como son el hígado, el WAT, el BAT, el músculo esquelético y el corazón (Warner and Mittag, 2012; Lopez et al., 2010b; Silva, 2003; Silva, 2006; Klein and Ojamaa, 2001). Las hormonas tiroideas: termogénesis y gasto energético Las THs son cruciales para la ‘termogénesis obligatoria’, la producción de calor debido a la tasa metabólica; junto a la termogénesis obligatoria, las THs también modulan la ‘termogénesis facultativa’, es decir, la producción de calor bajo demanda, cuando la temperatura ambiental desciende por debajo de la termoneutralidad (Silva, 2006; Cannon and Nedergaard, 2004; Whittle et al., 2011). Los sitios y mecanismos de acción para la termogénesis facultativa divergen entre las dos clases de animales homeotermos; en pájaros el principal sitio de termogénesis facultativa es el músculo esquelético (Silva, 2006) mientras en mamíferos incluyendo los humanos, ocurre principalmente en el BAT (Cannon and Nedergaard, 2004; Cannon and Nedergaard, 2010; Nedergaard et al., 2007). El BAT es una diana de las THs y tiene un largo número de TRs α1 y β1 (Hernandez and Obregon, 1996; Silva, 1995). TRα1 es necesario para mantener la capacidad de respuesta normal de los adipocitos marrones, mientras TRβ media la expresión génica de UCP1 inducida por T3 (Ribeiro et al., 2001; Ribeiro et al., 2010). Los ratones deficientes en TRα son Introducción 48 intolerantes al frío y muestran una marcada incapacidad en la termogénesis en el BAT (Marrif et al., 2005). La deficiencia global de TRα1 y TR-α1/β, así como la delección de todas las isoformas de TRα (Thra-0/0), conduce a hipotermia y intolerancia al frío asociada a termogénesis reducida en el BAT, pero no en la termogénesis obligatoria, debido a la respuesta inducida por NE, a pesar de que la morfología del BAT, desarrollo y reclutamiento son normales (Marrif et al., 2005; Wikstrom et al., 1998; Johansson et al., 1999). Los modelos de animales knockout en deyodinasas aportan también una interesante información sobre el papel de las THs en la función del BAT. D2 es esencial para mediar la respuesta termogénica del BAT a la estimulación adrenérgica debido al incremento de la conversión de T4 a T3 dentro del tejido; ratones con una alteración en el gen Dio2 (D2KO) tienen dañado las vías de la lipolisis y la lipogénesis conduciendo a un disfunción en el BAT (de Jesus et al., 2001; Christoffolete et al., 2004; Castillo et al., 2011). En estos modelos, al igual que ocurre en animales hipotiroideos, se observa una disfunción en el BAT que conduce a una forma de termogénesis adaptativa más demandante energéticamente, induciendo resistencia a la obesidad. (Sjogren et al., 2007; Liu et al., 2003; Marsili et al., 2011). Recientes evidencias han cambiado el dogma periférico, demostrando que la acción de las THs en la termogénesis del BAT es también mediada centralmente y que los efectos metabólicos a nivel de todo el cuerpo que se observan en el hipertiroidismo pueden ser relacionados con una acción central, en lugar de un efectos directo de dichas hormonas sobre los adipocitos del BAT (Sjogren et al., 2007; Lopez et al., 2010b). La primera evidencia que demostró que los efectos metabólicos de las THs están centralmente mediados fue abarcado en un estudio de Vennström et al. (Sjogren et al., 2007) usando un ratón heterocigoto para un mutante de TRalpha1 con baja afinidad por T3; este ratón era hipermetabólico, con incremento en el consumo de oxígeno, menor cantidad de masa grasa, incremento en la ingesta y resistencia a obesidad inducida por dieta. El hipermetabolismo de este ratón fue explicado por la elevada actividad del BAT, es decir, incremento en la termogénesis y el gasto energético; a pesar de esto, no presentaba incremento en la temperatura corporal debido a la alteración de la función vascular en la cola, conduciendo a una inapropiada disipación de calor (Warner et al., 2013). Estas alteraciones metabólicas fueron neutralizadas tras la denervación funcional de la señal simpática hacia el BAT, indicando que el CNS controlaba el metabolismo de estos ratones actuando a través de del sistema nervioso autónomo (Sjogren et al., 2007). Evidencias mostradas por nuestro grupo han unido la actividad de AMPK con la termogénesis inducida por THs a través de la modulación del SNS (Lopez et al., 2010b). Introducción 49 Las hormonas tiroideas y la ingesta Alteraciones en el estado tiroideo están asociadas con cambios en los patrones de alimentación tanto en humanos como en roedores (Pijl et al., 2001; Lopez et al., 2010b; Gonzalez et al., 2012). El efecto orexigénico de las THs es mediado por la regulación del conjunto de neuropéptidos hipotalámicos, con una up-regulation de AgRP y NPY, y downregulation de POMC en el ARC de ratas hipertioideas (Pijl et al., 2001) (Ishii et al., 2003; Lopez et al., 2010b; Gonzalez et al., 2012; Varela et al., 2012). La acción de TH ha sido vinculada también a otras dianas en el mismo núcleo como son D2, UCP2 y mTOR (Varela et al., 2012; Martinez de Morentin et al., 2014b). mTOR es una serina-treonina kinasa que modula la progresión del ciclo celular así como el crecimiento celular mediante la detección de cambios que se producen en el balance energético, factores de crecimiento, nutrientes o oxígeno (Martinez de Morentin et al., 2014b; Catania et al., 2011). La ruta de mTOR es altamente expresada en núcleos hipotalámicos específicos como el ARC, donde se colocaliza con NPY,AgRP y POMC (Cota et al., 2006; Martinez de Morentin et al., 2014b). A este nivel, la señalización de mTOR juega un papel crucial en las redes hipotalámicas que responden a la disponibilidad de nutrientes (como la concentración de leucina) y el entorno hormonal (Martinez de Morentin et al., 2014b; Catania et al., 2011). Nuestro grupo ha demostrado que la hiperfagia inducida por la administración aguda de T3 o el hipertiroidismo crónico es mediado por la activación específica de la ruta de mTOR en el núcleo ARC, donde mTOR colocaliza con TRα (Varela et al., 2012). En consecuencia, el tratamiento central con rapamicina (inhibidor de mTOR), revierte totalmente la hiperfagia inducida por el hipertiroidismo como resultado de una normalización de la expresión de AgRP y NPY en el ARC (Varela et al., 2012). Estas evidencias indican que las acciones de T3 en varios de los sensores metabólicos hipotalámicos son diferentes: la regulación de la ingesta es mediada a través de mTOR en el ARC (Varela et al., 2012), mientras la modulación del balance energético ocurre vía AMPK en el VMH (Lopez et al., 2010b) (Ilustración 14). Introducción 50 Ilustración 14. Dianas identificadas de las hormonas tiroideas en el hipotálamo adulto (Warner and Mittag, 2012). Hormonas tiroideas y metabolismo de la glucosa en el hígado Kalsbeek y Fliers han demostrado que las THs modulan la producción de glucosa hepática y la sensibilidad a insulina a través de una vía simpatética desde le PVH hacia el hígado, independientemente de las hormonas circulantes que regulan la glucosa (Fliers et al., 2010a; Klieverik et al., 2008; Klieverik et al., 2009b). La tirotoxicosis incrementa la producción de glucosa por parte del hígado. La simpatectomía atenúa este incremento en la producción de glucosa hepática durante la tirotoxicosis, mientras la parasimpatectomía no afecta a la producción de glucosa hepática pero desciende la sensibilidad a insulina (Klieverik et al., 2008). Tras la administración central de T3 en el PVH (núcleo con abundante expresión de TRs) se estimula la producción hepática de glucosa, pero la eliminación de las conexiones simpatéticas hacía el hígado elimina este efecto (Klieverik et al., 2009b). Este estudio concluye que la administración central de las THs requiere un SNS intacto para actuar a través del eje PVHhígado para controlar la producción de glucosa. Dado que el ARC también tiene su función en la modulación de la producción de glucosa hepática (Obici et al., 2002; Konner et al., 2007; Konner et al., 2009) y expresa un gran número de TRs podría tener un potencial relevante para futuras investigaciones sobre la señalización de TH y el metabolismo de la glucosa. Introducción 51 Ilustración 15. Modelo representativo de las acciones centrales de las hormonas tiroideas en el metabolismo periférico (Martinez-Sanchez et al., 2014). OBJETIVOS Material y métodos 60 responsable es Miguel A.López Pérez y realizados bajo los números de procedimientos: ID 15005AE/10/FUN/FISIO2/MLP2 (bajo el cumplimiento del RD 1201/2005 del 10 de octubre, sobre la protección de los animales utilizados para la experimentación y otros fines cientifícos) y el ID 15010/14/006 (bajo el cumplimiento del actual y vigente RD 53/2013 del 1 de febrero, por el que se establecen las normas básicas aplicables para la protección de los animales utilizados en expermientación y otros fines científicos, incluyendo la docencia), de acuerdo a la legislación vigente: Ley 30/1992 del 26 de noviembre del régimen jurídico de las administraciones públicas y del procedimiento administrativo común, moficada por la Ley 4/1999, del 14 de enero, por la que se establece que la resolución que proponga fin al procedimiento decidirá todas las cuestiones expuestas por los interesados y aquellas otras derivadas de este; el Decreto 296/2008 del 30 de diciembre, de protección de los animales utilizados para la experimentación y otros fines científicos, incluida la docencia, y por el que se crea el ‘Rexisro de centros de cría’, de suministradores y usuarios y la ‘Comisión Galega de Benestar de los Animales de Experimentación’; orden del 15 de septiembre de 2006 por la que se crea el ‘Comité de Bioética da Consellería Rural’; Decreto 153/1998 del 2 de abril por lo que se aprueba el reglamento que desarrolla la Ley 1/1993 del 13 de abril (protección de animales domésticos y salvajes en cautividad); Ley 32/2007 del 7 de noviembre, para el cuidado de los animales en su explotación, transporte y sacrificio; siguiendo también la Directiva Europea de Experimentación Animal (2010/63/UE). ANESTESIA Y ANALGESIA Para llevar a cabo los diferentes procedimientos quirúrgicos, los animales fueron tratados con anestesia general mediante una inyección intraperitoneal (IP). La composición de la anestesia fue en el caso de rata de 42,5% de ketamina (Imalgene 1000 inyectable,Merial, Barcelona, España), 20% xilazina (Rompún 2%, Bayer Health Care, Berlin, Alemania) y 37,5% de suero salino fisiológico (Suero fisiológico isotónico, Physan, Madrid, España), y la dosis utilizada fue de 200μl/100 gramos de masa corporal; en el caso de ratón los componenetes fueron los mismos pero en distinta proporción (1 ml ketamina, 250 μl de xilazina, 6 ml de salino) y la dosis fue de 100μl/10g de masa corporal (duración de unas 2horas aproximadamente). Para comprobar el estado de anestesia de cada individuo, se comprobó el reflejo podal y palpebral, de tal forma que su ausencia es indicativo de que puede llevarse a cabo el procedimiento quirúrgico. Tras los procedimientos quirúrgicos los animales fueron tratados con ketoprofeno como medida de analgesia (ketoprofeno-Orudis 100 mg., Sanoli aventis, Barcelona, España) por vía subcutánea (SC), administrando unos 2,5 mg por Kg de masa corporal. Material y métodos 61 VÍAS DE ADMINISTRACIÓN DE SUSTANCIAS Se han utilizado diferentes vías de administración de sustancias que se describen a continuación, así como las sustancias inyectadas. 1) Vía intraperitoneal (IP) Esta vía no requiere anestesia; se realiza en la parte ventro-caudal de la rata por debajo del peritoneo. Se coge al animal por la espalda con ayuda de un trapo para poder inmovilizarlo intentando oprimirle las extremidades anteriores. Se inclina la cabeza del animal ligeramente hacia abajo para minimizar el riesgo de desgarro en vísceras y se inserta la aguja (BD Microlance, 25G 5/8” 0,5x16mm, BD Medical Surgicals Systems) (acoplada a una jeringa (1 ml BD slip-tip siringe, bulk, non-sterile, BD Medical Surgicals Systems)) prácticamente de manera perpendicular a este, preferiblemente por su costado derecho. Esta vía fue utilizada para la administración de la anestesia (dosis detallada en la sección anterior) y para la administración de T3. Sustancias IP Casa Comercial Dosis Vehículo T3 SIGMA; St. Louis, MO,USA 4 ng / día Salino:DMSO (1:50) 2) Vía subcutánea (SC) No requiere anestesia y se realiza por la zona lateral dorso-caudal del animal, por enzima de la pata posterior. Se inmoviliza el animal con la ayuda de un trapo cubriéndole la cabeza, se pellizca el lomo del animal con la misma mano; con la otra mano se introduce la aguja, paralelamente a la columna vertebral. Este procedimiento puede ser llevado a cabo durante varios días seguidos. Sustancias subcutáneas Casa Comercial Dosis Vehículo T4 SIGMA; St. Louis, MO,USA 100 μg/día Salino SR 59230A Tocris; Bioscience, Bristol, UK 3 mg/kg/día DMSO Material y métodos 62 3) Vía intracerebroventricular (ICV) Tampoco es necesaria anestesia en este procedimiento, el animal está totalmente consciente. Con ayuda de un trapo se inmoviliza de forma leve al animal presionándolo suavemente contra la base de su jaula intentando evitarle un excesivo estrés; se abre la cánula implantada con ayuda de una tijera por el extremo sellado, se introduce una jeringuilla Hamilton (Model 7001KH 25s, Hamilton) y se produce a su vaciado una vez que está correctamente insertado. Al retirar la aguja es necesario extremar el cuidado sujetando la cánula para evitar su desplazamiento del lugar de inserción. Este procedimiento se repite en el mismo individuo durante varios días consecutivos, pero nunca más de 8-10 días desde la implantación de la cánula. Estas cánulas pueden conectarse a bombas osmóticas que contengan la sustancia de interés y que se colocaron en el espacio interescapular del animal bombas osmóticas (modelo 2001, Alzet Osmotic Pumps, Cupertino, CA, USA) que nos permite un flujo constante de la sustancia inoculada a un ritmo según indica el fabricante (0,5ul/hora aproximadamente) durante 6-7días (explicado más adelante). Sustancias ICV Casa Comercial Dosis Vehículo T3 (crónico) (rata) SIGMA; St. Louis, MO,USA 4 ng /4μl / día Salino:DMSO (1:50) T3 (crónico) (ratón) SIGMA; St. Louis, MO,USA 8 ng /1μl / día Salino:DMSO (1:50) T3 (agudo) SIGMA; St. Louis, MO,USA 16 ng /1 μl Salino:DMSO (1:50) Ceramidas SIGMA; St. Louis, MO,USA 1,25 mg/ml Salino:DMSO (1:3) SP 600125 Tocris; Bioscience, Bristol, UK 0,5 μg/μl Salino;DMSO (1:50) Rottlerin Calbiochem; Billerica, USA 60 μmoles/L Salino;DMSO (1:50) 4) Vía núcleo-específica Para esta vía se requiere anestesia general. Se utiliza para poder acceder a núcleos concretos del cerebro del animal; se requieren coordenadas concretas seleccionadas previamente del Atlas Paxinos (tanto para rata como ratón). Para ello pueden usarse dos métodos: a. Mediante la utilización de un aparato de estereotaxia (KOPF, David Kopf Instruments) (ver en más detalle en Procedimientos quirúrgicos) y jeringuillas de microinyección (Hamilton, Serie 700, modelo 7001, 1μl calibre 25 para rata y Hamilton, NeuroHamilton Modelo 7001KH Neuros Syringe, en el caso de Material y métodos 63 ratón), con un flujo de inyección de 200 nl/min durante 5 minutos en el caso de ratas y 10-15 minutos en el caso de ratón. b. Mediante la utilización de cánulas bilaterales nucleoespecíficas (Plastics One, Roanake, VA USA); se insertan en el cerebro en unas coordenadas específicas con la ayuda del estereotáxico. Estas cánulas van conectadas a mini bombas osmóticas (modelo 10007D, Alzet Osmotic Pumps, Cupertino, CA, USA) que nos permite un flujo constante de la sustancia inoculada a un ritmo según indica el fabricante (0,5ul/hora aproximadamente) durante 6-7días. Sustancias estereotaxia Casa Comercial Concentración Vehículo Ad-AMPK-CA Viraquest; North Liberty, IA, USA 1x1012 pfu/ml (1:50) PBS Ad-AMPK-DN Viraquest; North Liberty, IA, USA 1,12x1012 VG/ml PBS Ad-TR-DN Viraquest; North Liberty, IA, USA 1x1012 pfu/ml PBS Ad-GRP78-DN Viraquest; North Liberty, IA, USA 1x108 pfu/ml PBS Ad-Cre SignaGen; Rockville, MD, USA 1,12x1012 VG/ml PBS PROCEDIMIENTOS NO QUIRÚRGICOS Monitorización de la ingesta y de la masa corporal: la determinación de la masa corporal y de la ingesta se realizó mediante una balanza de precisión; los animales fueron pesados diariamente así como su comida, siempre más o menos a la misma hora en cada experimento (aproximadamente cercano a la hora de inicio de la fase oscura). En el caso en que los animales fueron mantenidos en grupo en una misma caja (en el caso de las hipertiroideas y durante el período de acción del adenovirus Cre), la ingesta se promedió en función del número de individuos de cada caja. Determinación de la composición corporal: el análisis de la composición corporal se hizo a través de una técnica de resonancia magnética de imagen (Whole Body Composition Analyzer EhcoMRI 500, EchoMRI, Houston, Texas, USA); con ella se obtuvieron datos de la composición de masa grasa, masa magra y agua de cada animal. Las determinaciones se hicieron al inicio y al final del experimento. Preparación de mini bombas osmóticas: para la administración crónica de sustancias en núcleos específicos del hipotálamo se utilizaron bombas osmóticas (modelo 1007D, Alzet Osmotic Pumps, Cupertino, CA, USA). Antes de la implantación en el animal, las bombas fueron rellenadas con las sustancias a inocular o con su correspondiente vehículo; posteriormente se les colocó un catéter en la zona de expulsión (para la posterior conexión con Material y métodos 64 las cánulas nucleoespecíficas). Luego se colocaron en un baño a 37ºC durante toda la noche, o bien mínimo 6 horas, para que se activaran y comenzaran a expulsar la sustancia. PROCEDIMIENTOS QUIRÚRGICOS Canulación ICV Se llevó a cabo este procedimiento en todos aquellos experimentos que requerían la administración de sustancias a nivel central, directamente en el cerebro, en el ventrículo lateral. Las cánulas usadas para este efecto, consistían en un tubo de de polietileno (BD Intradermic® Polyethylene tubing (Non-Sterile), Becton Dickison and Company, Franklin Lakes, NJ, USA) (PE-20 en el caso de ratas; PE-50 en el caso de ratón) de 1,09 mm de diámetro exterior, 0,38 mm de diámetro interior, y de 0,965 mm de diámetro exterior, 0,58 mm de diámetro interior para ratón. Se cortó uno de los extremos en forma de bisel con un ángulo de 45º y con una longitud de 0,5 mm; a 4 mm de este bisel, en el caso de rata, y a 2,5 mm en el caso de ratón se insertó un tope. La longitud total de la cánula para rata es de 3,5mm y 2,5 mm para ratón. El otro extremo se selló hasta el momento de la administración del tratamiento. Una vez anestesiados los animales y comprobado su estado de anestesia, se les practicó un corte transversal en la piel de la cabeza (por delante de las orejas) perpendicular a la sutura Material y métodos 65 sagital de aproximadamente 1,5cm. Con ayuda de un mosquito se mantuvo la piel retirada para tener una óptima visión del plano quirúrgico. Posteriormente se separó el tejido subcutáneo del cráneo dejando al descubierto la inserción entre la sutura sagital y la sutura coronal, es decir, el bregma; si se producía sangrado se presionó el cráneo con una gasa durante unos segundos hasta el cese de dicho sangrado. Tras la correcta localización del bregma, se realizó una perforación en el cráneo (al lado derecho o izquierdo del bregma) con una broca quirúrgica a una distancia lateral de 1,5 mm de la sutura sagital y 0,9 mm posterior al bregma (en el caso de rata) y una distancia lateral de 1,2 mm de la sutura sagital y 0,6 mm posterior al bregma (en el caso de ratón). Tras reducir el eventual sangrado con una gasa, se introdujo la cánula en el orificio por el extremo biselado, de manera paralela al eje dorso-ventral del animal. Finalmente, la cánula se fijó al cráneo del animal con el adhesivo cianocrilato (SuperGlue-3, Loctite). Tras la canulación los animales se estabularon individualmente y se dejó un periodo de recuperación de entre 3-4 días antes de proceder a la inyección de las sustancias. Estereotáxia núcleo-específica Este procedimiento quirúrgico se realizó en aquellos animales donde el procedimiento experimental requería la inoculación de sustancias en núcleos específicos del hipotálamo. Tras la anestesia general de los animales se les realizó un corte transversal en la piel de la cabeza por detrás de las orejas. Se retiró la piel con ayuda de un mosquito para mantener visible el plano quirúrgico y se les separó el tejido subcutáneo del cráneo dejando al descubierto la zona circundante al bregma. Posteriormente se marcó el bregma para tomarlo como punto de referencia para la posterior localización de las coordenadas y se colocó al animal en un instrumento de estereotaxia (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA). Una vez fijada la rata en el aparato se anotaron las coordenadas de referencia correspondientes al punto bregma. A partir de ahí:  En el caso de rata: en el VMH se realizaron dos inyecciones en cada hemisferio cerebral siguiendo las siguientes coordenadas: eje antero-posterior: 2,4-3,2 mm; eje lateral: 0,6 mm; eje dorso-ventral: 10,1 mm. En el caso del ARC se realizó una inyección en cada hemisferio cerebral siguiendo las siguientes coordenadas: eje antero-posterior: 2,8 mm; eje lateral: 0,3 mm; eje dorso-ventral: 10,2 mm. Material y métodos 66  En el caso de ratón: en el VMH se realizó una inyección en cada hemisferio cerebral siguiendo las siguientes coordenadas: eje antero-posterior: 1,7 mm; eje lateral: 0,5 mm; eje dorso-ventral: 5,5 mm. Posteriormente, se perforó el cráneo en cada punto de las coordenadas con una broca quirúrgica y se procedió a la inyección de la sustancia. En cada inyección se inoculó 1μl de sustancia durante 5 minutos para el caso de ratas y 10-15 minutos para el caso de ratones (velocidad de administración: 200nl/min). Una vez terminada la inoculación se procedió a la sutura del corte en la piel mediante la ayuda de seda de sutura (Ethicon Mersilk Soie, Special 2-0, Johnson and Johnson company, Alemania) y se estabularon los animales de forma individual. Para la administración crónica de sustancias en núcleos específicos del hipotálamo se utilizaron cánulas bilaterales permanentes (Plastics One, Roanake, VA USA) de diferentes características de longitud y separación entre los inyectores de cada hemisferio, según el núcleo acorde a las coordenadas señaladas anteriormente:  Para VMH: eje antero-posterior: 2,8 mm; eje lateral: 0,6 mm; eje dorso-ventral: 10,1 mm.  Para ARC: eje antero-posterior: 2,8 mm; eje lateral: 0,3 mm; eje dorso-ventral: 10,2 mm. Material y métodos 67 Se perforó el cráneo en cada punto de coordenadas con una broca quirúrgica y se introdujo la cánula, de manera paralela al eje dorso-ventral del animal. A continuación se fijó la cánula al cráneo con adhesivo cianocrilato (SuperGlue-3, Loctite, Barcelona, España); cada inyector se conectó a una mini bomba osmótica (modelo 1007D, Alzet Osmotic Pumps, Cupertino, CA, USA) mediante un catéter. Finalmente se colocaron las mini bombas osmóticas en la zona lumbar, debajo de la piel, y se cerró el corte con seda de sutura. Al final del procedimiento los animales se estabularon individualmente. Registro de la actividad simpática El registro multi-fibras de actividad del nervio simpático (SNA) fue obtenido mediante el registro de los nervios que inervan BAT Una vez anestesiados los animales del modo previamente descrito, se les mantuvo bajo anestesia mediante el uso de α-cloralosa (dosis inicial: 25mg/kg, dosis repetidas: 50 mg/kg/h) administrada vía catéter en la vena femoral. Se les practico una traqueotomía para permitir la correcta respiración y se monitorizó y mantuvo la temperatura rectal a 37.5ºC usando una mesa quirúrgica de temperatura controlada y una lámpara. Se identificó e inervó una fibra nerviosa interescapular en el BAT usando un microscopio de disección y se colocó sobre un electrodo bipolar de platino-iridio unido a una sonda de alta impedancia (HIP-511, Grass Instruments; West Warwick, RI USA). La señal se amplificó 105 veces con la ayuda de un preamplificador (Grass P5 AC). Tras la amplificación, se filtró la señal a 100 y 1000 Hz. A continuación, la señal del nervio se acopló a un osciloscopio (54501A, Hewlettackard, Iowa, USA) para monitorizar la calidad del registro del nervio. Las medidas de actividad del SNS en el BAT se realizaron cada 15 minutos durante 6 horas tras las inyecciones ICV. Para asegurar que el ruido eléctrico era excluido durante el estudio, cada registro se corrigió por la actividad del nervio post-mortem. (Protocolo experimental realizado por el Dr. Kamal Rahmouni, Departments of Internal Medicine, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa City, Iowa, 52242, USA). Vagotomía Los animales sometidos a este procedimiento fueron puestos en ayuno la noche previa a la operación, así evitábamos que el estómago estuviera hinchado y fue más fácil el acceso a él. Las ratas fueron anestesiadas como hemos descrito previamente; se colocan sobre su espalda en posición decúbito dorsal y se hace una incisión en la línea media abdominal. Se visualizó el Material y métodos 68 estómago y el hígado es movido cuidadosamente para poder visualizar bien el esófago. Las dos ramas del nervio vago (dorsal y ventral) fueron expuestas y diseccionadas a la altura del esófago justo por encima del estómago. Cada rama del nervio fue ligado previamente con seda de sutura en ambos extremos más distales para prevenir el desangrado. Luego los músculos abdominales y la piel fueron cosidos con seda de sutura. También se hicieron ratas control o sham, a las cuales solo se les provocó una incisión abdominal igual que las anteriores, y las ramas del nervio vago fueron expuestas pero no se les realizó ninguna sutura. Luego las ratas fueron estabuladas y se estableció un tiempo de recuperación de unos 15 días antes de someterlas al siguiente procedimiento. La efectividad de la vagotomía fue confirmada al final del experimento, una vez postmorten mediante el análisis del estómago; solo las ratas que mostraban un incremento evidente en el tamaño del estómago después de la vagotomía (debido a la disminución en la movilización gástrica) fueron incluidas en el análisis. Perfusion intracardíaca El cerebro de la rata se fija mediante perfusión intracardíaca como paso previo al estudio inmunohistoquímico. Tras la anestesia general del animal con el anestésico habitual se coloca el animal en posición decúbito dorsal y se procede a la apertura de la cavidad abdominal. Tras la localización del apéndice xifoides, este se levanta ligeramente con unas pinzas procediendo a la rotura del diafragma y al corte de las parrillas costales. Tras la apertura de la caja torácica y del pericardio, se administraron en una inyección intracardíaca 200 μl de heparina (Heparina sódica Mayne 5%; Mayne Pharma) en el ventrículo izquierdo, con el fin de evitar problemas de coagulación en los vasos durante la perfusión. A continuación, se realiza una pequeña incisión en la punta del ventrículo izquierdo por la cual se introduce una cánula hasta llegar a la raíz de la aorta. Tras el clampaje de la vía se secciona la orejuela de la aurícula derecha. A través de dicha vía se bombea una solución de suero salino 0.9% NaCl, con el fin de eliminar la sangre del sistema circulatorio. La decoloración del hígado, así como la de la propia solución salina que sale por la orejuela seccionada marca el inicio del proceso de fijado. A través de la misma vía se introducen 500 ml de una solución de formalina (100mM) en tampón fosfato (PB, pH=7.4) durante aproximadamente 10 minutos. La eficacia de la perfusión puede constatarse por la rigidez plena Material y métodos 69 del animal. Los tejidos son diseccionados y mantenidos en la solución de fijado durante 12 horas a 4ºC. A continuación se realizan un par de lavados en tampón fosfato. Infusión de oleato-C14 Las ratas previamente operadas para la inserción de cánulas ICV fueron sometidas a un periodo de recuperación de 7 días antes de las infusiones. Las ratas previamente anestesiadas con una solución de alfa-cloralosa (solución 2,5%; 50 mg / kg) se colocaron sobre almohadillas de calor antes de insertar un catéter en la vena femoral. La anestesia fue infundida simultáneamente (25 mg / kg / h) junto con el trazador oleato-C14 (3.000 Bq / minuto, dosis total: 0,6 MBq en 0,3 μmol de oleato) (Duivenvoorden et al., 2005). Después de 30 min de la línea de base, se tomaron mediciones de suero y las ratas tratadas con vehículo (DMSO) o T3 (4 ng durante 3 horas (se disolvió en 5 L de DMSO; Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) a través de las cánulas ICV. Las muestras de sangre se tomaron a intervalos regulares hasta que se terminó el experimento; se sacrificaron los animales y se produjo la recolección de tejidos Para el análisis de la actividad específica del C14 los tejidos y sueros lisados o los extractos de lípidos se resuspendieron en el reactivo Beta-Flour Scintillans (National Diagnostics; Atlanta; USA) y las desintegraciones por minuto fueron medidas usando un contador de centelleo (LabLogic 300SL, LabLogic; Broomhill, UK). Disección y extracción de tejidos Al término de cada procedimiento experimental se sacrificaron los individuos por luxación cervical y decapitación posterior según las normas y leyes de experimentación animal. Se extrajeron los tejidos y se conservaron a -80ºC hasta su procesamiento y análisis. En los casos en los que se requiriera hacer microdisección, se llevó a cabo bajo una lupa óptica de 20 aumentos. DISEÑOS EXPERIMENTALES Alteración del estado tiroideo Gran parte de los diseños experimentales se realizan con ratas con el estado tiroideo alterado. Para la generación de estos modelos se somete a los animales a tratamientos de 21 días Material y métodos 76 Las ratas durante este procedimiento fueron estabuladas individualmente una vez colocada la cánula ICV. Se procedió al pesado del animal y de la ingesta todos los días. Inoculación estereotáxica de Ad-GRP78-DN en ratas hipertiroideas Previamente al tratamiento con adenovirus, se induce la alteración del estado tiroideo, inducción del hipertiroidismo. El vector adenoviral administrado GRP78-DN (Viraquest; North Liberty, IA, USA) expresa una forma inactiva de la proteína GRP78; se inocula 1 μl por inyección con una concentración de 1x108 pfu/ml. Como control del tratamiento se administró un adenovirus que únicamente expresa GFP (1 μl por inyección de un stock de 1x1012 pfu/ml) (1:50). Sobre el día 15 del tratamiento con T4, se procede a la inoculación estereotáxica del adenovirus, dejándolo unos 5-7 días que es cuando el virus tiene su pico de mayor efecto (día 20-22 del tratamiento con T4). Durante todos estos días se continúa con la administración subcutánea de T4. Las ratas durante este procedimiento fueron estabuladas individualmente una vez inoculado el adenovirus; en el mismo momento del pinchazo se procedió al pesado del animal y de la ingesta todos los días. Tratamiento ICV de Rottlerin (inhibidor de PKC) en ratas hipertiroideas. Se generan ratas hipertiroideas como se describió anteriormente; sobre el día 15 de su tratamiento SC con T4 se procedió a la inserción de cánulas ICV conectadas a una bomba osmótica que contenía Rottlerin. Se administró este tratamiento durante 7 días, al mismo tiempo se continuó con la administración SC de T4, hasta el final del experimento. Se generan 4 grupos: Tratamiento SC Operación estereotáxica Sacrificio Día 1 Día 15 Día 21-22 Peso e ingesta Material y métodos 77 -Eutiroideas-Vehículo ICV / Eutiroideas-Rottlerin ICV -Hipertiroideas-Vehículo ICV / Hipertiroideas-Rottlerin ICV Las ratas durante este procedimiento fueron estabuladas individualmente una vez colocada la cánula ICV. Se procedió al pesado del animal y de la ingesta todos los días. Tratamiento ICV de SP600125 (inhibidor de JNK) o de Rottlerin (inhibidor de PKC) en ratas tratadas con T3 ICV Para este experimento es necesario crear 4 grupos experimentales diferentes. - Vehículo ICV-Vehículo ICV / Vehículo ICV-SP600125 ICV (o Rottlerin ICV) - T3 ICV-Vehículo ICV / T3 ICV-SP600125 ICV (o Rottlerin ICV) Se procede a la operación ICV y a la conexión de una bomba osmótica a dicha cánula ICV; en esta bomba osmótica iban las dos sustancias administradas (inhibidor+T3; igual medio de dilución). En este caso el periodo de recuperación de la ICV ya va solapado al inicio de la administración de las sustancias. Las ratas durante este procedimiento fueron estabuladas individualmente; se procedió al pesado del animal y de la ingesta todos los días sobre la misma hora. Tratamiento ICV con T3 en ratones WT y JNK1KO En este caso se sigue el mismo proceso que en el caso de las ratas; se sometió a la operación para la inserción de las cánulas a los ratones, se les dejó un período de recuperación de 4 días y luego se llevo a cabo la suministración de la sustancia a través de la cánula ICV. Se establecieron 4 grupos: Tratamiento SC Tratamiento ICV Sacrificio Día 1 Día 21-22 Día 15 Peso e ingesta Material y métodos 78 -WT-Vehículo ICV / WTT3 ICV -JNK1KO-Vehiculo ICV / JNK1KOT3 ICV Los ratones durante este procedimiento fueron estabulados individualmente; se procedió al pesado del animal y de la ingesta todos los días sobre la misma hora al mismo tiempo que se realizó la administración de T3. Inoculación de Ad-Cre en ratones JNK2KO-jnk1 floxed y posterior administración de T3 ICV. Los ratones fueron sometidos a estereotaxia en el VMH con adenovirus adenoasociado Cre (SignaGen; Rockville, MD, USA); se inoculó un 1 μl por pinchazo en cada hemisferio con una concentración 1x1012 pfu/ml. Como control del tratamiento se administró un adenovirus que únicamente expresa GFP (1 μl por inyección de un stock de 1x1012 pfu/ml). Se dejó actuar este virus aproximadamente 30 días; una vez pasado este tiempo los ratones fueron sometidos a una segunda operación para la inserción de la cánulas ICV; se dejaron recuperar durante 4 días y luego se llevo a cabo la administración de T3 durante los 5 días. Se establecieron 4 grupos: -JNK2KO-jnk1 floxed-GFPVehículo ICV / JNK2KO-jnk1 floxed-GFPT3 ICV - JNK2KO-jnk1 floxed-CreVehículo ICV / JNK2KO-jnk1 floxed-CreT3 ICV Día 1 Día 30 Día 34 Día 38 Peso e ingesta Operación Estereotáxica Operación ICV Tratamiento ICV Sacrificio Operación ICV Inyección ICV (Día 1) Recuperación Tratamiento Sacrificio (Día 5) Peso e ingesta Material y métodos 79 Los ratones durante este procedimiento fueron estabulados individualmente una vez insertada la cánula ICV. Se procedió al pesado del animal y de la ingesta dos veces a la semana durante el período de espera de actuación del adeno CRE (para evitar el estrés innecesario del animal) y luego todos los días una vez comenzada la administración de T3. (Todos los animales tuvieron acceso ad libitum a pienso y agua; al final de todos los procedimientos se extrajeron los tejidos (cerebro, musculo, BAT, WAT, hígado) y suero). TÉCNICAS ANALÍTICAS Extracción de proteína En el momento inicial de la extracción se separó una porción de tejido para ser procesado y el resto de la muestra se volvió a congelar a -80ºC. Durante todo el proceso de extracción, las muestras estuvieron refrigeradas a 0ºC para evitar la degradación de las proteínas. En un tubo eppendorf de 2 ml con cierre de seguridad (Safe-Lock Tubes 2.0 ml, Eppendorf, Hamburgo, Alemania) se le añadió un volumen determinado de tampón de lisis (composición en tabla) con inhibidor de proteasas (Complete TM, Roche, Mannhein, Alemania), dependiendo del tejido del que se fuera a extraer proteína (volumen entre 200 μl y 1000 μl). Además dependiendo del tipo de análisis que se fuera a realizar con estas proteínas, el tampón variaría para análisis de actividad enzimática (se usa un tampón de lisis de sacarosa, composición en sección ‘ensayos enzimáticos’) o cuantificación de expresión proteica (tabla composición tampón de lisis). Las muestras se homogeneizaron por un proceso de disgregación y rotura celular mecánica mediante un homogeneizador (TissueLyser II, Qiagen, Germantown, MD, USA) durante 2-3 minutos con una frecuencia de unas 30 Hz. Posteriormente, se centrifugaron durante 30 minutos a 13.200 rpm y a 4º centígrados (en el caso de WAT y BAT se realizó otra centrifugación de unos 10 minutos para eliminar mejor la grasa). Se retiró el sobrenadante en varias alícuotas y se congelaron a -80ºC, hasta el momento de su análisis. Composición Tampón de lisis (ajustar pH a 7,5 y H2O destilada hasta 500 ml) Tris-HCL pH 7,5 2,5 ml EGTA 0,2 M (pH8) 2,5 ml EDTA 0,2 M (pH8) 2,5 ml Tritón X-100 5 ml Ortavanadato Sódico 0,1 M 5 ml Fluoruro Sódico 1 gramo Pirofosfato Sódico 1,1 gramo Sacarosa 46 gramos Cóctel inhibidor de proteasas (ROCHE) 1 pastilla por cada 50 ml Material y métodos 80 Cuantificación de proteína Para determinar la concentración de proteína en las alícuotas obtenidas en la extracción (tanto para medir su actividad o su expresión) se mantuvieron a 4ºC en hielo y se utilizó procedimiento realizado por el método colorimétrico de Bradford (referencia 1976), utilizando el kit Bio-Rad Protein Assay (Protein Assay Dye Reagent, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Para ello, se procedió a diluir cada muestra por un factor de 1:26 en H2O destilada tubos eppendorfs. En una placa de 96 pocillos, se cargaron por duplicado 10 μl de cada muestra, y posteriormente 250μl de reactivo de Bradford diluido en proporción 1:4 en H2O destilada y a una temperatura de 37ºC. Además en cada placa, se realizó una recta de calibrado, mediante una dilución seriada de BSA (Albumin bovine fraction V powder, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) con 7 puntos duplicados, (0,03125; 0,0625; 0,125; 0,125; 0,25; 0,5; 0,7 y 1mg/ml). Luego en un lector de placas (Multiskan Go Microplate Spectrophotometer, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) se incubó la placa durante 5 min a 37º y se midió la colorimetría en OD (optical density) en cada pocillo a una longitud de onda de λ=595nm. A través de la extrapolación de los valores de la recta de calibrado se determinó la concentración de proteína de cada muestra. Una vez determinada la cantidad de proteína de cada muestra se prepararon alícuotas a la concentración necesaria para cada análisis (10-20 μg/16 μl). Western Blot 1) Preparación de las muestras Las proteínas son separadas mediante electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE, Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electroforesis). Al tratarse de una técnica que se basa en la separación de proteínas por su masa molecular, en base a su migración en un campo eléctrico, es necesario neutralizar una serie de características de las proteínas que darían lugar a patrones de migración erróneos e identificaciones incorrectas. Por un lado, es necesario eliminar la estructura cuaternaria de la proteína para poder reproducir una migración en el gel lo más proporcional posible a su tamaño. Y por otro lado, dado que las proteínas van a estar sometidas a un campo eléctrico, es necesario eliminar la carga intrínseca de los polipéptidos, (desnaturalizarlos) y otorgarles el mismo signo de carga. Para ello, se preparó una alícuota de cada muestra, con la misma concentración de proteína total (10-20 μg) en tampón de lisis con inhibidor de proteasas. A cada muestra además se le añadió la misma proporción de solución de carga 5x. Este tampón de carga proporciona a la alícuota la eliminación de la estructura 4ria de la proteína (β-mercaptoetanol, Sigma-Aldrich, Material y métodos 81 St. Louis, USA), uniformiza su carga eléctrica de forma proporcional a su longitud (SDS, Sodium DodecylSulfate, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), una densidad mayor (Glicerol, SigmaAldrich, St. Louis, USA). Todo esto facilita su carga en el gel y además posee un colorante, para identificar el frente de migración (azul de bromofenol, MERK, Darmstadt, Alemania). Composición del tampón de carga (ajustar pH a 6,8 y H2O miliQ hasta 1L) SDS 2 g Trizma-base 8 ml β-mercaptoetanol 1 ml Azul de bromofenol 4 mg Glicerol 10 ml 2) Electroforesis. La electroforesis se realizó en un gel que consiste de una estructura tridimensional, en forma de red, formada por la polimerización de acrilamida y bis-acrilamida (N,Nmetilenobisacrilamida). El proceso de polimerización se cataliza por amonio persulfato (APS) (Ammonium persulfate, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) y TEMED (N,N,N,Ntetramethyletilenediamina, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). La concentración de acrilamida y bis-acrilamida (30% Acrylamide/Bis Solution 29:1, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) en el gel determina el tamaño de los poros de la red tridimensional y el grado de migración de las proteínas según su tamaño. El gel consiste de dos fracciones, una fracción concentradora con 4 % de acrilamida/bis-acrilamida, en la que la que se agrupan las muestras a cargar, de manera que la separación de las proteínas de las diferentes muestras ocurra de forma simultánea, y una fracción separadora con 6%, 8% y 10% en función del tamaño de la proteína de interés. Los geles se montaron en un kit de electroforesis (Mini-PROTEAN Tetra Cell, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) y se sumergieron en tampón running 1x. (Composición del tampón de running 5X: 72 g de Glicina, 15 g de Trizma base, 5 g de SDS, H2O destilada hasta 1L). Previamente a la carga de las muestras en el gel se agitaron y se calentaron a 95º C durante 10 minutos y se volvieron a agitar. En cada pocillo del gel se cargaron 16 μl de muestra. En uno de los carriles se cargaron 5 μl de un marcador de pesos moleculares (Precision Plus Protein Standars-Dual Color, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). En cada gel se cargaron siempre muestras de todos los grupos experimentales. Una vez esto, se sometieron las muestras a un campo eléctrico (voltaje constante de 140V-120V y amperaje de 180 mA), conectando el kit de electroforesis a una fuente de energía (PowerPac HC High Current Power Suppy, Bio-Rad, Hercules, CA, USA), en el que se indujo Material y métodos 82 la migración de las proteínas hacia el cátodo. Se detuvo la electroforesis cuando el frente de migración llegó a una distancia aproximada de unos 0,5 cm del final del gel. Gel separador 6 %Gel Gel separador 8 %Gel Gel separador 10 %Gel H2O destilada 5,3 ml H2O destilada 4,6 ml H2O destilada 4,0 ml Acrilamida/bisacrilamida (30%) 2,0 ml Acrilamida/bisacrilamida (30%) 2,7 ml Acrilamida/bisacrilamida (30%) 3,3 ml 1,5M Tris (pH 8,8) 2,5 ml 1,5M Tris (pH 8,8) 2,5 ml 1,5M Tris (pH 8,8) 2,5 ml SDS 10 % 0,1 ml SDS 10 % 0,1 ml SDS 10 % 0,1 ml APS 10 % 0,1 ml APS 10 % 0,1 ml APS 10 % 0,1 ml TEMED 8 μl TEMED 6 μl TEMED 4 μl Gel concentrador 4% (igual para todos): H2O destilada 3,4 ml; Acrilamida/bisacrilamida (30%) 0,83 ml; 1,5M Tris (pH 8,8) 0,63 ml; SDS 10 % 50 μl; APS 10 % 50μl; TEMED 5 μl. 3) Transferencia. Una vez finalizada la electroforesis las proteínas deben ser transferidas a una membrana para poder realizar el análisis de expresión de cada proteína; para ellos son sometidas a un campo eléctrico capaz de movilizar las proteínas hasta la membrana donde quedaran adsorbidas y donde se realizaran las incubaciones con los diferentes anticuerpos. Se realizó una transferencia de tipo semi-seca, donde la membrana y el gel se situaban una debajo del otro y separadas por papeles absorbentes estos y las placas que creaban el voltaje (Trans-Blot SemyDry Transfer Cell, Bio-Rad). Se utilizaron membranas de PVDF (Polivinylidene Fluoride Immobilion-P membrane, Millipore), cortadas con unas dimensiones de 8,5x6,5 cm, activadas previamente durante 4 min en metanol, 5 min en H2O destilada y 5 min en tampón de transferencia. Composición del tampón de transferencia 25X: 36,5 g de Glicina, 72,5 g de Trizma base, 4,5 g de SDS, H2O destilada hasta 500 ml. Composición del tampón de transferencia 1X: 40 ml de tampón de transferencia 25X, 200 ml de Metanol, H2O destilada hasta 1L. El papel transferencia (Extra Thick Blot Paper, Bio-Rad) se empapó en tampón de transferencia para que a través de él pudiera crearse el campo eléctrico necesario para la Material y métodos 83 transferencia; el gel y la membrana se colocaron entre dos piezas de papel de transferencia de manera que así se creó un campo eléctrico necesario para la correcta transferencia; se eliminaron las posibles burbujas que podían quedar entre esta, el papel y el gel con un rodillo. Se realizó la transferencia durante 1h y 40min a un amperaje constante de 250mA conectando el kit de electroforesis a una fuente de energía (PowerPac HC High Current Power Suppy, BioRad, Hercules, CA, USA). Para comprobar la correcta transferencia se tiñeron las membranas con colorante Rojo de Ponceau (Ponceau S Red, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Para eliminar la tinción fue suficiente con hacer un par de lavados con tampón de lavado. 4) Inmunodetección de proteínas. Tras la transferencia la membrana se incubo a temperatura ambiente durante 1h con tampón de bloqueo (Componentes del tampón de bloqueo: BSA 3g en 100ml de tampón de lavado). De esta manera se eliminaron las uniones inespecíficas ofrecidas por la membrana en todas aquellas áreas donde no existía proteína transferida. Posteriormente, se cortó la membrana tomando como referencia el marcador de pesos moleculares, de manera que, pudiéramos detectar en una misma membrana proteínas diferentes, de esta forma se pudieron detectar diferentes proteínas simultáneamente. Cada fragmento de membrana se incubó durante 1h a temperatura ambiente o bien toda la noche a 4ºC con el anticuerpo primario (dependiendo del anticuerpo y sus condiciones específicas; ver tabla) diluido previamente en el tampón de bloqueo. Transcurrido el tiempo de incubación con el anticuerpo primario, se retiró y se hicieron 3 lavados de 5 min con tampón de lavado a temperatura ambiente. Seguidamente se incubaron las membranas durante 1 hora a temperatura ambiente con un anticuerpo secundario conjugado con Horseradish Peroxidase capaz de reconocer y unirse específicamente al anticuerpo primario utilizado. Material y métodos 84 Anticuerpo Primario Casa comercial Dilución ACCα Millipore; Billerica, MA, USA 1:1000 pACC Cell Signaling; Danvers,MA,USA 1:1000 AMPKα1 Millipore; Billerica, MA, USA 1:1000 AMPKα2 Upstate; Temecula, CA, USA 1:1000 pAMPKα Cell Signaling; Danvers,MA,USA 1:2000 FAS BD, Franklin Lakes, NJ, USA 1:1000 CPT1c, CPT1l, CPT1m SCBT; Dallas, Texas, USA 1:1000 UCP-1 Abcam; Cambridge, UK 1:20000 GRP78 Cell Signaling; Danvers,MA,USA 1:1000 ATF6α Santa Cruz; 1:1000 PERK Cell Signaling; Danvers,MA,USA 1:1000 pPERK SCBT; Dallas, Texas, USA 1:1000 peIF2α SCBT; Dallas, Texas, USA 1:1000 CHOP SCBT; Dallas, Texas, USA 1:1000 IREα Cell Signaling; Danvers,MA,USA 1:1000 pIREα Abcam; Cambridge, UK 1:1000 p-SAPK/JNK Cell Signaling; Danvers,MA,USA 1:2000 JNK SCBT; Dallas, Texas, USA 1:2000 p-c-Jun Cell Signaling; Danvers,MA,USA 1:1000 pSTAT3 Abcam; Cambridge, UK 1:1000 PKC ε Abcam; Cambridge, UK 1:1000 PKC δ SCBT; Dallas, Texas, USA 1:1000 β-actina SIGMA; St. Louis, MO, USA 1:5000 α-tubulina SIGMA; St. Louis, MO, USA 1:5000 Tabla: Relación de anticuerpos usados y dilución de los mismos. Componentes tampón de lavado 10X: 24,2 g de Trizma base, 80 g DE NaCl, H2O destilada hasta 1L; ajustar pH a 7,6. Componentes tampón de lavado 1X: 100 ml de tampón de lavado 10X, 1 ml de Tween 20, H2O destilada hasta 1L. 5) Revelado y fijación de la señal. Se retira el anticuerpo secundario y se vuelven a hacer tres lavados; para proceder al revelado de la membrana se utilizó 1 ml de un sustrato de revelado que detecta el Horseradish Peroxidase en proporción 1:1 (Pierce ECL Western Blotting Substrate, Cultek). Se incuban las membranas durante 2 min en oscuridad con este sustrato. Una vez pasado el tiempo de incubación se colocaron las membranas en una casete de revelado (Hypercassette, Amersham Biosciences, Little Chalfont, Reino Unido) y se impermeabilizaron con la ayuda de papel transparente. Se procedió a su revelado en una sala oscura destinada a tal fin. Se introdujo una hoja de revelado (FujiMedical X-Ray Film Super RX, Fujifilm Corporation, Tokio, Japón) sobre las Material y métodos 85 membranas y se cerró el casete; se dejó exponer la señal quimioluminiscentre durante unos segundos/minutos en función de la proteína. Luego se retiro la película y se sumergió en una solución reveladora (dilución 1:10) (G150, Developer/Replenisher, Agfa-Gevaert Group, Dubendorf, Suiza) hasta que se visualiza la señal buscada y en ese momento se sumerge la película en líquido fijador (dilución 1:5) (G354, Manual Fixing Bath, Agfa-Gevaert Group, Dubendorf, Suiza) durante un par de minutos con el fin de fijar la señal. Por último se lava la película con agua correinte y se deja secar. 6) Cuantificación. La cuantificación de la señal se realizó mediante la medición de la densidad óptica de la señal de cada muestra, a partir de las imágenes escaneadas (resolución 400 ppp, CanonScan 9900F, Canon, Tokio, Japón) de las películas autorradiografiadas, con el software informático ImageJ (ImageJ 1.40g, Wayne Rasband, NIH, USA). Cada medición de densidad óptica se corrigió por la medición de la densidad óptica de una región adyacente a la señal de las muestras. RT-PCR 1) Extracción de RNA. Todo el proceso se realizó manteniendo las muestras en hielo con el fin de evitar la degradación del RNA. Un pequeño fragmento de las muestras congeladas fue homogeneizado mecánicamente junto con 1000 ml de Trizol (TRIZOL Reagent; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) durante 3 min (con el mismo sistema usado en el caso de la extracción proteica). Después de la homogeneización las muestras se dejaron reposar a Tª ambiente durante unos 5 minutos. A continuación se añadió 1 ml de cloroformo (Chloroform, Sigma-Aldrich, St Louis, USA) a cada muestra y se agitaron fuertemente durante varios segundos con un posterior tiempo de reposo de unos 5 minutos. Luego, se centrifugaron 15 minutos a 12000 rpm a 4ºC y se observó ya claramente 2 fases: una fase acuosa (donde se halla el RNA) y una fase orgánica (que contiene las proteínas y los lípidos). Entre ambas se sitúa la inter-fase (donde está el DNA).Se retira la fase acuosa con cuidado pasándola a otro tubo autoclavado y se desprecia la fase orgánica. De esa manera se separó el RNA del resto de los componentes celulares. Una vez separado el RNA, se le añadió 1 ml de isopropanol (2-propanol, Sigma-Aldrich, St Louis, USA) a cada muestra, se agitaron y se colocaron a -20ºC durante unos 10 minutos (consiguiendo así que el RNA precipite). Transcurrido este tiempo se centrifugaron las muestras Material y métodos 92 Inmunohistoquímica Para el estudio inmunohistoquímico, el cerebro de la rata se fija mediante perfusión intracardiaca tal y como se detalló anteriormente. Una vez fijados los tejidos del animal, se extrae el cerebro y se mantiene inmerso en la misma solución de fijado durante 12 horas a 4ºC. A continuación se transfieren a tampón fosfato 0,1M durante 1 hora. Se hacen secciones en un vibrotomo (Vibratome Series 1000, The Vibratome Company, St Louis, MO, USA) en secciones de 50 μm de grosor. Las secciones se recogen en PBS. Para la detección inmunohistoquímica de la expresión de c-FOS, se incubaron secciones del cerebro con anticuerpo primario c-FOS (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) en dilución 1:1000 durante toda la noche a 4ºC; al finalizar se hicieron 2 lavados de 10 minutos. A continuación se incubó con H2O2 3% en agua destilada (para inhibir la peroxidasa endógena) durante 10 min y se hicieron nuevamente 2 lavados de 10 minutos. Como sistema de detección se utilizó EnVision policlonal (polímero de dextrano conjugado con anticuerpos anti-conejo y con peroxidasa; Dako, Glostrup, Dinamarca) durante 30 min. Se hicieron 2 lavados de 10 minutos y se incubó con DAB (Dako, Glostrup, Dinamarca ) durante 10 min, preparada siguiendo el protocolo del fabricante (1 gota de DAB en 1 mL del disolvente suministrado). Al finalizar la reacción, las secciones se extienden en portas xilanizados (Histobond, Marienfield-Superior, Lauda-Konigshofen) dejándolos secar; posteriormente se deshidrataron en etanol, se aclararon en xilol y se montaron con un medio de montaje permanente. La reacción fue observada y fotografiada bajo un microscopio de fluorescencia Provis AX70 (Olympus Corp.; Tokyo, Japan). Además, se cuantificó la inmunoreactividad de c-FOS en DMH. El número de células teñidas en cada sección se usó como numero representativo de células con inmunoreactividad positiva de c-FOS. Inmunofluorescencia Los cerebros una vez perfundidos se sumergen en formalina al 10% durante 24 horas. Se cortaron secciones de 50 µm de grosor en un vibratomo (Vibratome® Series 1000). Para la immunofluorescencia, la secciones se incubaron en flotación durante toda la noche a 4ºC con anti-GFP de conejo (Abcam) diluído 1:1000 en PBS. Tras dos lavados de 5 minutos en PBS las secciones se incubaron 1 hora a temperatura ambiente con anti-fragmento F (ab´)2 AlexaFluor® 488 (Molecular Probes) en una dilución en PBS de 1:200. Las secciones se montaron en portas de polisina (VWR International, Leuven) y se cubrieron con medio de montaje fluorescente. Material y métodos 93 Bioquímica La sangre extraída durante el sacrificio fue centrifugada y separada en suero y plasma. Los niveles de T3 y T4 fueron medidos en plasma mediante la utilización de un kit de ELISA (Crystal Chem Inc; Downers Grove IL, USA). Análisis de lípidos Para la extracción de lípidos, se pesaron 100 mg de tejido o 250 μl de suero; se homogenizaron (con el mismo sistema usado en la extracción proteica) con 1 ml de reactivo de Folch (cloroformo: metanol, 2:1). Una vez homogenizadas, se mantuvieron en agitación constante durante unas 3 horas temperatura ambiente o bien toda la noche a 4ºC. Posteriormente se le añadió a cada muestra 300 μl de agua Mili-Q (en el caso de suero no se añadió agua MiliQ), se vortearon y se centrifugaron 20 minutos a 13200 rpm. La fase inorgánica fue eliminada y los extractos lipídicos contenidos en la fase orgánica y se dejaron secar toda la noche en una campana de extracción. Para el análisis de triglicéridos, una vez realizada la extracción de lípidos y una vez secos, se re suspenden en cloroformo (una cantidad conocida e igual para cada muestra) y se dejan evaporar; luego mediante la utilización de un kit enzimático colorimétrico (Trigliceridos GPOPOD Enzimático colorimétrico, SPINREACT, Girona, España). Para la separación de triglicéridos y ácidos grasos libres, el extracto total de lípidos fue resuspendido en cloroformo y detectados a través de placas de cromatografía de capa fina (TLC; Plastic Backed Silica Matrix, Merk; Hoddesdon, UK). La cromatografía se realizó usando tolueno:choroformo:metanol (85:15:5) como solvente de migración. Las bandas lipídicas fueron visualizados utilizando una solución de primulina; posteriormente fueron raspados e introducidos en viales de centelleo para la cuantificación del C14 una vez que estuvieran secas. Para el análisis de ácidos grasos, después de la extracción de de lípidos de 15 mg de tejidos como explicamos anteriormente; como estándar interno se usó Ácido tridecanoico deuterado (C13D25O2H, Cambridge Isotopes; Andover, MA, USA). Los lípidos totales fueron saponificados y convertidos en ésteres metílicos de ácidos grasos utilizando trifluoruro de boro (MORRISON and SMITH, 1964). Las muestras fueron resuspendidas en hexano y se analizaron en Thermo Finnigan Focus GC acoplado a un detector FID. Una columna Thermo Scientific TR-FAME (longitud: 30 m, diámetro: 0,25 mm, tamaño de la película: 0,25 um; Thermo Material y métodos 94 Scientific; Surrey, Reino Unido) fue usada con helio como gas transportador a una velocidad de infusión de 1,9 ml/min; la temperatura de entrada era de 230ºC y la temperatura del detector era de 250ºC. El programa usado fue el siguiente: 100 ° C durante 2 min, 25 ° C / min durante 2 min, 2,5 ° C / min durante 4,8 min, mantener durante 3,8 min, 4,5 ° C / min durante 2,4 min, mantener durante 5 minutos, 5 ° C / min durante 7,4 min, 40 ° C / min durante 0,5 min y mantener durante 0,5 min. Los cromatogramas fueron analizados y cuantificados usando el software Xcalibur 2.0 (Thermo Scientific; Surrey, Reino Unido). I La identificación de los picos FAME se hizo mediante la comparación de los tiempos de retención contra los estándares externos (Restek 35077 Food Industry FAME mix; Bellefonte, Pensilvania, USA; y Supelco 46.904 éster metílico vacénico (Vaccenic Methyl ester); Sigma, St Louis, MO, USA). Los datos se normalizaron con estándares internos y por el ajuste de la masa del tejido. Los resultados se expresan como porcentajes molares normalizados con los animales control. Lipidómica Preparación de las muestras: los hipotálamos fueron diseccionados y pesados; se les añadió a cada muestra 20 μl de una mezcla estándar interna y 100 μl de NaCl (0,9%). Los lípidos se extrajeron de las muestras con 400 μl de cloroformo: metanol (proporción 2: 1) y se homogenizaron en un homogeneizador. Después de agitación durante 2 min y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, la capa inferior (aproximadamente 100 μl) se separó por centrifugación a 10.000 rpm durante 3 min a temperatura ambiente. Luego 10 μl de la mezcla estándar marcada fue añadida al extracto de lípidos. La mezcla de patrón interno contenía los siguientes compuestos lipídicos con ácidos heptadecanoico (C17: 0) como ácido graso esterificado: ceramida (d18: 1/17: 0) (91,6 mg / ml; Avanti lípidos polares; Alabaster, AL, USA), GPCholine (17: 0/17: 0) (9,9 mg / ml; Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA), GPEthanolamine (17: 0/17: 0) (89,5 g / mL; Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL ,USA) y TG (17: 0/17: 0/17: 0) (103,6 g / ml; Larodan químicos puros; Limhamn, Suecia). La mezcla estándar marcado consistía GPCholine (16: 0/0: 0-D3) (92,8 mg / ml; Larodan Fine Chemicals, Limhamn, Suecia), GPCholine (16: 0/16: 0-D6) (116,8 mg / ml ; Larodan Fine Chemicals, Limhamn, Suecia) y TG (16: 0/16: 0/16: 0-13C3) (99,6 g / mL; Larodan Fine Chemicals, Limhamn, Suecia). Análisis de lípidos: los extractos de lípidos se analizaron utilizando un espectrómetro de masas QToF (Waters; Milford, MA, USA) combinado con un Acquity Ultra Performance Material y métodos 95 Liquid Chromatography (UPLC/MS; Chicago, IL, USA). La columna era una Acquity UPLC BEH C18 10x50 mm con 1,7 micras de tamaño de partículas; se mantuvo a 50ºC. El sistema de disolvente binario A incluyó agua (1% NH4Ac 1M, 0,1% HCOOH) y el sistema de disolvente B incluía LC/MS (Rathburn; Walkerburn, Reino Unido) de acetonitrilo / isopropanol (5:2, 1% NH4Ac 1M, 0,1% HCOOH). El gradiente comenzó a partir del 65% de A / 35% de B, alcanzando el 100% del B en 6 min y se mantuvo allí durante los próximos 7 min. El tiempo total de ejecución que incluye una etapa de re-equilibrio de 5 minutos fue de 18 min. El caudal fue de 0,2 ml/min y el volumen de inyección fue de 1 μl. La temperatura del organizador de las muestras se fijó en 10 ° C. El perfil de lípidos se llevó a cabo utilizando el modo de ión positivo. Los datos fueron recolectados en el rango de masa de m/z de 300 a 2000, con una duración de exploración de 0,2 segundos. La fuente de temperatura se fijó en 120 ° C y el nitrógeno fue usado como gas de de solvatación (800 L/h) a 250 ° C. Los voltajes del cono de muestreo y del capilar fueron 39 V y 3,2 KV, respectivamente. La reserpina (50μg / L) fue utilizada como compuesto de referencia de pulverización de bloqueo (5 l / min; 10 seg. frecuencia de exploración). Procesamiento de los datos de lipidómica y análisis. Los resultados obtenidos se convierten en formato netCDF usando Dbridge Software (MASSLYNX. Waters; Milford, MA, USA). Los datos convertidos se procesan usando el programa informático MZmine Software version 0.60 58-60 (440-442). Los lípidos se identificaron basándose en su tiempo de retención (RT) y el ratio masa/carga (MZ) a partir de una base de datos ya creada. (Realizado por el Dr. Matej Orešic. VTT Technical Research Centre of Finland, Tietotie 2, Espoo, FIN-02044, Finland). Cuantificación de ceramidas Las ceramidas se extrajeron y analizaron utilizando un el sistema ESI-MS LC / MS System (API 3000 PE Sciex; SpectraLAB Científico; Markham, Ontario, Canadá) con ionización positiva como hemos descrito previamente (Contreras et al., 2014b). Las concentraciones se midieron por monitorización de reacción múltiple (MRM) utilizando Nheptadecanoilo-D-erytro-esfingosina (C17ceramida) como estándar interno (50 ng / ml). El método fue lineal en el intervalo de 2 a 600 ng / ml utilizando como patrones N-palmitoil-Derytro-esfingosina (C16 ceramida) y N-estearoil-D-erytro-esfingosina (C18 ceramida) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA). (Realizado por la Dra. Nuria Casals. Departament de Ciències Bàsiques Facultat de Medicina i Ciències de la Salut, Universitat Internacional de Catalunya). Material y métodos 96 Tinción Oil-Red O La tinción Oil-Red O se realizó en fragmentos de hígado congelados. Se realizaron cortes en un criostato de un grosor de 10 micras. Posteriormente se fijaron las muestras toda la noche en formalina neutra tamponada al 10%. Luego fueron teñidas con Solución Oil Red durante 20 minutos (Oil red color solution, Merck) y posteriormente se lavaron con agua destilada. Se someten a otro colorante y se contratiñen con Hematoxilina de Harris durante 10 minutos. (Hematoxilina de Harris, Bio-optica). Se vuelven a lavar y se montan en un media de montaje acuoso. Luego se realizan fotos en un microscopio óptico conectado a una cámara Olympus a aumentos 20x y 40x. Para finalizar las fotos fueron medidas mediante el programa Image J (ImageJ 1.40g, Wayne Rasband, NIH, USA). Estadística Los datos obtenidos en todos los experimentos se analizaron mediante el software estadístico GraphPad Instad (GraphPad Instad Software, v5, La Jolla, CA, USA). El grado de significación estadística se determinó, para los experimentos de 1 variable se ha realizado t-test y ANOVA, mientras que para aquellos con 2 o más variables se utilizó un análisis estadístico ANOVA seguido de un test post-hoc Bonferroni. Los resultados se representaron en porcentaje en función del control, tomándose como valor la media (M) y la desviación estándar de la media (SEM) (media±SEM). En los experimentos en los que se monotorizaron parámetros como la ingesta de alimento y masa corporal, estos datos se representaron brutos sin realizar ningún tipo de relación porcentual de comparación. Se consideraron significativos todos los resultados con una P<0,05; muy significativos con una P<0,01 y extremadamente significativos con P<0,001. RESULTADOS Resultados 99 Las ratas hipertiroideas muestran una marcada alteración en la ruta de la lipogénesis de novo en tejidos periféricos. Las ratas tratadas con T4 muestran un descenso en la ganancia de masa a pesar de una marcada hiperfagia; además presentan unos niveles circulantes de T4 y T3 elevados, confirmando su estado hipertiroideo (Figura 1). 0 10 20 30 40 Eutiroid Hipertiroid Ingesta (g) *** Hipertiroid T4 (nmol/l) 0 50 100 150 200 Eutiroid *** Eutiroid Hipertiroid T3 (nmol/l) 0 1 2 3 4*** 100 120 140 Eutiroid Hipertiroid Cambios peso corporal (g) 0 20 40 60 80 *** Figura 1. Efecto de la administración periférica de hormonas tiroideas. Cambios en la masa corporal (n=16-18 por grupo), la ingesta (n=16-18 por grupo) y los niveles circulantes de T4 y T3 (n=9-10 por grupo) en ratas hipertiroideas y sus controles (ratas eutiroideas). ***P<0.001 vs. eutiroideas. Nos centramos en los efectos del hipertiroidismo en la lipogénesis de novo en tejidos periféricos. Nuestros datos mostraron que las ratas hipertiroideas poseen una marcada desregulación en las enzimas lipogénicas en tejidos periféricos. Mientras en el hígado el efecto global de hipertiroidismo fue promover la lipogénesis de novo (con un descenso en los niveles de pAMPK/pACC y un incremento de FAS), en músculo, WAT y BAT el efecto global fue el efecto opuesto, con un pronunciado descenso en los marcadores lipogénicos (Figura 2). Resultados 100 AMPKα2 ACCα/β FAS AMPKα1 pACCα/β pAMPKα Control de carga Higado HipertirEutir Músculo ND HipertirEutir BAT HipertirEutir WAT HipertirEutir 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 pAMPKα AMPKα1 AMPKα2 pACCα/β ACCα/β FAS Niveles de proteina/Control de carga (% Eutiroid) *** **** ND *** *** *** *** ** *** **** *** **** ** *** ** ** *** Higado WAT Músculo BAT Figura 2. Efecto de la administración subcutánea de T4 sobre la ruta de AMPK en tejidos periféricos. Cuantificación de los niveles de proteína e imágenes autorradiográficas representativas (panel superior) de western blot de diferentes enzimas implicadas en la ruta de AMPK en hígado, WAT, BAT y músculo (n=8-22 animales por grupo) de ratas hipertiroideas y sus respectivos controles. Para simplificar las gráficas, las barras de los controles (ratas eutiroideas) se han sustituido por una línea discontinua que representa el 100%. En las muestras de músculo, la expresión de FAS no fue detectada (ND). Los valores están normalizados con β-actina en el caso de hígado y WAT, y con α-tubulina en el caso de músculo y BAT. **P<0.01, ***P<0.001 vs. Eutiroideas. La T3 a nivel central regula la ruta de la lipogénesis de novo en hígado y BAT. Investigamos si el efecto del hipertiroidismo en el metabolismo periférico de los lípidos era central o periférico. Para ello, las ratas fueron tratadas crónicamente ICV con T3 durante 5 días. Como en el caso de las ratas hipertiroideas inducido por la administración de T4 periférica, el tratamiento crónico ICV con T3 induce una marcada pérdida de masa corporal (Lopez et al., 2010b), pero no se observaron cambios en la ingesta ni en los niveles circulantes de T3 y T4 (Figura 3). Resultados 101 Veh ICV T3 ICV Ingesta de alimento (g) 0 10 20 30 40 -10 Veh ICV Cambios peso corporal (g) -5 0 5 10 15 20 T3 ICV *** Veh ICV T3 ICV T4 (nmol/l) 0 40 100 140 60 120 80 20 0 1 2 3 Veh ICV T3 ICV T3 ICV (nmol/l) Figura 3. Efecto de la administración central de hormonas tiroideas. Cambios en la masa corporal (n=9-10 animales por grupo), la ingesta (n=9-10 animales por grupo) y los niveles circulantes de T4 y T3 (n=8-10 animales por grupo) en ratas tratadas ICV con T3 y sus controles, vehículo ICV. ***P<0.001 vs. Vehículo ICV. Para caracterizar los efectos de la administración central de T3, examinamos las enzimas de la lipogénesis de novo en los tejidos periféricos y observamos que la administración central de T3 provoca exactamente el mismo patrón de expresión proteica observado en ratas hipertiroideas en el hígado y el BAT; sin embargo no se observaron cambios en WAT y músculo (Figura 4). T3 ICVVeh ICV BAT T3 ICVVeh ICV WAT ND T3 ICVVeh ICV Músculo AMPKα2 FAS AMPKα1 pAMPKα Control de carga pACCα/β ACCα/β T3 ICVVeh ICV Higado 0 50 100 150 200 250 Niveles de proteina/Control de carga(% Vehiculo ICV) pAMPKα AMPKα1 AMPKα2 pACCα ACCα/β FAS Higado WAT Músculo BAT *** *** *** *** ** * ND *** * Figura 4. Efecto de la administración central de T3 sobre la ruta de AMPK en tejidos periféricos. Cuantificación de los niveles de proteína e imágenes autorradiográficas representativas (panel superior) de western blot de diferentes enzimas implicadas en la ruta de Resultados 108 En general estos datos apoyan el efecto central de la T3 en el metabolismo lipídico hepático que conducen a un incremento en la síntesis de TG. En contraste, la reducción del programa lipogénico en BAT (incremento en pAMPK y pACC, ningún cambio en LIPIN1 y DGAT1) y la falta de un incremento en la incorporación de TG marcados con C14, junto con el aumento de la expresión de genes termogénicos (Figura 12A) (Lopez et al., 2010b) sugieren que los lípidos absorbidos por el BAT están actuando como combustible para la termogénesis. Sin embargo, no se observó acumulación de C14 en WAT después de la administración central de T3 en ratas infundidas con oleato-C14, indicando que este tratamiento no tuvo efecto en el almacenamiento de energía (Figura 11C-D). Vehículo ICV T3 ICV Vehic ICV T3 ICV 0 20 40 60 80 100 120 140 160 ** UCP1/-tubulina (% vehiculo) Niveles mRNA/HPRT (% Vehículo) 0 50 100 150 200 250 PGC1α PGC1βUCP1 UCP3 BAT ** ** P=0.06 A Figura 12. Efecto de la T3 central en el metabolismo lipídico periférico. (A) Cuantificación de los niveles de mRNA de marcadores termogénicos (n=8-10 animales por grupo) y niveles proteicos de UCP1 (n=7 animales por grupo) en BAT de ratas tratadas ICV con T3 y sus controles (Vehículo ICV). **P<0.01 vs. Vehículo ICV. T3 en el VMH regula la ruta de la lipogénesis de novo en hígado y BAT. El siguiente objetivo de nuestro estudio fue identificar el núcleo hipotalámico donde las hormonas tiroideas ejercen su acción en el metabolismo lipídico periférico. Así, administramos estereotáxicamente T3 dentro del VMH y del ARC con la ayuda de cánulas nucleoespecíficas. La correcta posición de la cánula fue verificada mediante examinación histológica de secciones coronales del cerebro (Figura 13). VMH A 3V ARC VMH 3V ARC B Figura 13. Imágenes histológicas de secciones coronales del cerebro de ratas mostrando la localización de las cánulas nucleoespecíficas en el VMH (A) y el ARC (B). Resultados 109 Tras la administración en el VMH, observamos que la T3 promueve una pérdida de masa (Figura 14A) independiente de la ingesta (Figura 14B) y se observa una reducción en la adiposidad sin cambios en la masa magra (Figura 14C) en asociación con un incremento de los niveles proteicos de UCP1 en el BAT (Figura 14D). 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Vehículo VMH T3 VMH Ingesta diaria (g) Vehículo VMH T3 VMH -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 Tiempo (días) Ganancia peso corporal (g) 1 2 3 4 5 6 7 Vehículo VMH T3 VMH A Cirugía + Administración T3 ***** B DVeh VMH α-tubulina UCP1 T3 VMH BAT 0 50 100 150 200 Vehículo VMH T3 VMH ** UCP1 /α-tubulina (% Vehículo VMH) ** Cambios masa (% Vehículo VMH) 120 0 20 40 60 80 100 Masa grasaMasa magra C Figura 14. Efecto de la administración crónica de T3 en el VMH. (A) Ganancia de masa corporal (n= 16-17 animales por grupo), (B) ingesta (n= 16-17 animales por grupo), (C) cambios en la masa corporal (n=6-7 animales por grupo) y (D) imágenes representativas autorradiográficas (panel superior) y cuantificación de los niveles de UCP1 (panel inferior) (n=14 animales por grupo) en BAT, en ratas que recibieron T3 en el VMH y sus controles (Vehículo VMH). *P<0.05, **P<0.01 vs vehículo VMH. Resultados 110 En relación a la ruta de señalización de AMPK en hígado y BAT, nuestros datos muestran que la administración de T3 en el VMH induce un descenso de pACC y pAMPK en el hígado mientras en el BAT el efecto es el contrario (Figura 15A-B) AVeh VMH FAS AMPKα1 pAMPKα β-actina T3 VMH AMPKα2 ACCα pACCα Hígado pAMPKαAMPKα1 AMPKα2 pACCαACCαFAS 0 20 40 60 80 100 120 140 Niveles de proteína/-actina (% Vehículo VMH) * *** ** BAT pAMPKαAMPKα1 AMPKα2 pACCαACCαFAS Niveles de proteína/α-tubulina (% Vehículo VMH) Vehículo VHM T3 VMH 0 50 100 150 200 BVeh VMH pAMPKα T3 VMH ACCα AMPKα1 AMPKα2 FAS α-tubulina pACCα *** Figura 15. Efecto de la administración crónica de T3 en el VMH en el metabolismo periférico. (A-B) Imágenes representativas autorradiográficas de western blot (panel izquierdo) y cuantificación de niveles de proteína de la ruta de AMPK (panel derecho) en hígado (A) (n=14 animales por grupo) y BAT (B) (n=14 animales por grupo), de ratas tratadas crónicamente con T3 en el VMH y sus controles (Vehículo VMH). *P<0.05, **P<0.01 vs vehículo VMH. Sin embargo, cuando administramos T3 en el ARC observamos una leve tendencia a incrementar la masa corporal al final del tratamiento en asociación con un incremento en la ingesta (Figura 16A-B) y sin cambios en la adiposidad (Figura16C), la masa magra o los niveles de UCP1 (Figura 16D). Tampoco se observaron cambios en el programa lipogénico del BAT y el hígado (Figura 16E-F). Esto indica que las acciones centrales de la T3 en el metabolismo lipídico son núcleo-específicas y originadas en el VMH. Resultados 111 T3 ARCT3 ARCT3 ARC 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 2 4 6 8 10 14 16 ** Ingesta diaria (g) Vehículo ARC A -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 1 2 3 4 5 6 7 Ganancia peso corporal (g) Tiempo (días) Vehículo ARC T3 ARC Vehículo ARC T3 ARC Cirugía + Administración T3 P=0.06 B 0 20 40 60 80 Vehículo ARC T3 ARC UCP1 /α-tubulina (% Vehículo ARC) 100 120 Veh ARC α-tubulina UCP1 T3 ARC BAT Masa grasa Masa magra 0 20 40 60 80 100 120 Cambios masa (% Vehículo ARC) C D BAT 0 20 40 60 80 100 120 140 pAMPKα AMPKα1 AMPKα2 pACCα ACCα FAS Vehículo ARC T3 ARC Hígado 0 20 40 60 80 100 120 140 Niveles proteína/-actina (% Veh ARC) pAMPKα AMPKα1 AMPKα2 pACCα ACCα FAS Niveles proteína/α-tubulina (% Veh ARC) F E Figura 16. Efecto de la administración crónica en el ARC de T3. (A) Ganancia de masa corporal (n= 16-17 animales por grupo), (B) ingesta (n= 16-17 animales por grupo), (C) cambios en la masa corporal (n=6-7 animales por grupo), (D) imágenes representativas autorradiográficas (panel superior) y cuantificación de los niveles de UCP1 (panel inferior) (n=14 animales por grupo) en BAT, y (E-F) cuantificación de niveles de proteína de la ruta de AMPK en hígado (E) (n=14 animales por grupo) y BAT (F) (n=14 animales por grupo), en ratas que recibieron crónicamente T3 en el VMH y sus controles (Vehículo ARC). **P<0.01 vs Vehículo ARC. Resultados 112 Para marcar mejor la especificidad de la inyección en el VMH, administramos T3 en áreas próximas y circundantes al VMH; bajo estas condiciones no observamos cambios en la ruta de AMPK en hígado y BAT (Figura 17). 0 20 40 60 80 100 120 140 pAMPKα AMPKα1 AMPKα2 pACCα ACCα FAS Niveles proteína/α-tubulina (% Vehículo) Vehículo ‘inyección perdida’ (no VMH) T3 'inyección perdida' (no VMH) BAT A 0 20 40 60 80 100 120 140 pAMPKα AMPKα1 AMPKα2 pACCα ACCα FAS Niveles proteína /β-actin (% Vehículo) Hígado B Figura 17. Efecto de la administración de T3 en áreas próximas al VMH. (A) Cuantificación de niveles de proteína de la ruta de AMPK en hígado (n=7 animales por grupo) y (B) cuantificación de niveles de proteína de la ruta de AMPK en BAT (n=7 animales por grupo), en ratas que recibieron T3 en regiones próximas al VMH y sus controles (Vehículo). Cuando el receptor de hormonas tiroideas es abolido en el VMH de ratas eutiroideas mediante la inserción estereotáxica de una isoforma dominante negativa del receptor de hormonas tiroideas (TR-DN), observamos que se ejerce un efecto contrario en la lipogénesis en hígado y BAT de lo detectado tras la administración de T3 en este núcleo (incremento de la ruta de AMPK en hígado y descenso en BAT) (Figura 18B-C). Estos adenovirus fueron previamente validados (Lopez et al., 2010b) y la eficiencia de la infección fue demostrada mediante la expresión de GFP en el VMH (Figura 18A). A 3V VMH ARC ME VMH Resultados 113 B 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 pAMPKαAMPKα2 pACCαACCαFASAMPKα1 ** P=0.08 ** Niveles proteína/β-actina (% GFP) Hígado CGFP VMH TR-DN VMH ** *** pAMPKαAMPKα2 pACCαACCαFASAMPKα1 Niveles proteína/α-tubulina (% GFP) 120 0 20 40 60 80 100 BAT Figura 18. (A) Imágenes de inmunofluorescencia representativas (izquierda: 4X, derecha: 20X) con anticuerpo anti-GFP mostrando la expresión de GFP en el VMH de ratas tratadas con adenovirus dentro del VMH. (3V: tercer ventrículo). (B-C) Cuantificación de niveles de proteína de la ruta de AMPK en hígado (B) (n=7 animales por grupo) y en BAT (C) (n=7 animales por grupo), en ratas que recibieron estereotáxicamente en el VMH un adenovirus TR-DN o GFP durante 5 días. **P<0.01, ***P<0.001 vs. GFP VMH. Estos datos refuerzan el concepto de que la acción de la T3 en el metabolismo lipidico periférico es núcleo específica del VMH, y que sus acciones son opuestas a nivel hepático y del BAT a través de los TRs. Los efectos centrales de la T3 en la lipogénesis de novo en hígado y BAT dependen de AMPK en el VMH. Luego investigamos los mecanismos centrales concretos que conducen a la modulación de la lipogénesis en estos tejidos tras la administración central de T3. El hipertiroidismo, la administración central de T3 y la administración de T3 en el VMH producen la activación hipotalámica de la lipogénesis de novo (Lopez et al., 2010b; Varela et al., 2012) asociado con un incremento en el programa termogénico en BAT a través del SNS. Nuestros datos confirman que es específico del hipotálamo y no extensible a otras áreas del cerebro como el cortex (Figura 19A). De acuerdo con estos resultados, la concentración de malonil-CoA fue incrementada en el hipotálamo, pero no en el cortex, de ratas hipertiroideas (Figura 19B), mientras que la actividad de CPT1 muestra un patrón opuesto (Figura 19C). No se encontraron cambios en la expresión de otros genes de la oxidación lipídica entre hipotálamo y cortex (Figura 19D). Resultados 114 Hipotálamo Cortex A 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 pAMPKα AMPKα1 AMPKα2 pACCα ACCα FAS CPT1c CPT1l CPT1m ** *** ** *** *** *** Niveles proteína/-actina (% Eutiroidea) C CPT1 actividad (% Eutiroidea) 0 20 40 60 80 100 120 Hipotálamo Cortex *** Malonyl-CoA (nmol/g) 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Hipotálamo Cortex *** BEutiroideas Hiperrtiroidas Cortex 0 20 40 60 80 100 120 140 160 ACADM ACOX-1 EHHADH PGC1α PPARα UCP-2 Niveles mRNA/HPRT (% Eutiroidea) Hipotálamo 0 20 40 60 80 100 120 140 ACADM ACOX-1 EHHADH PGC1α PPARα UCP-2 Niveles mRNA/HPRT (% Eutiroidea) DEutiroideas Hiperrtiroidas Figura 19. Efecto de la administración central de T3 sobre diferentes áreas del cerebro. (A) Cuantificación de los niveles de proteínas de la ruta de AMPK y de CPT1 (n=6-8 animales por grupo), (B) concentración malonil-CoA (n=8-10 animales por grupo), (C) actividad de CPT1 (n= 6-10 animales por grupo) y (D) niveles de mRNA de genes implicados en la oxidación lipídica (n=7-8 animales por grupo) en el hipotálamo y el cortex de ratas hipertiroideas y eutiroideas. **P<0.01, ***P<0.001 vs. Eutiroideas. Para poder aclarar el papel de la actividad de AMPK en el hipotálamo en el programa lipogénico en hígado y BAT, administramos los adenovirus AMPKα-DN o GFP estereotáxicamente en el VMH de ratas eutiroideas, como previamente validamos (Lopez et al., Resultados 115 2010b; Whittle et al., 2012; Martinez de Morentin et al., 2014a). La eficiencia de la infección fue demostrada por la expresión de GFP en el VMH (Figura 18A). Observamos que el tratamiento con adenovirus AMPKα-DN induce una pérdida de masa independiente de la ingesta y un incremento de los niveles de UCP1 en BAT (Figura 20A-B). La inhibición genética de AMPKα provoca los mismos efectos que la inyección de T3 en el VMH, inhibición de la señalización de AMPK en el hígado (Figura 20C) e incremento en el BAT (Figura 20D). 0 5 10 15 20 25 GFP AMPKα-DN Ingesta (g) -15 -10 -5 0 5 GFP AMPKα-DN Ganancia peso corporal (g) AGFP AMPK-DN B 0 50 100 150 200 250 GFP AMPKα-DN α-tubulina UCP1 GFP AMPKα-DN *** UCP1 /α-tubulina (% GFP) *** GFP β-actina AMPKα-DN FAS AMPKα1 pAMPKα AMPKα2 ACCα pACCα C Niveles proteina/-actina (% Eutiroid GFP) 0 20 40 60 80 100 120 140 pAMPKα AMPKα1 AMPKα2 pACCα ACCα FAS Hígado ** *** * DGFP α-tubulina AMPKα-DN FAS AMPKα1 pAMPKα AMPKα2 ACCα pACCα 0 50 100 150 200 pAMPKα AMPKα1 AMPKα2 pACCα ACCα FAS Niveles proteina/-tubulina (% Eutiroid GFP) BAT *** ** Resultados 116 Figura 20. Efecto de la inactivación de AMPK en el VMH sobre el metabolismo del hígado y del BAT. (A) Ganancia de masa corporal (n= 23-25 animales por grupo) y ingesta (n= 23-25 animales por grupo), (B) imágenes representativas de western blot (panel superior) y cuantificación de los niveles de UCP1 en BAT (n=8 animales por grupo), (C-D) imágenes representativas autorradiográficas (panel izquierdo) y cuantificación de los niveles de proteína de la ruta de AMPK en hígado (C) ( n=12-13 animales por grupo) y BAT (D) (n=12-13 animales por grupo) de ratas eutiroideas tratadas estereotáxicamente con AMPKα-DN en el VMH por 6 días y sus controles (GFP VMH). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs. GFP VMH. Siguiendo con esta hipótesis, quisimos ver si el efecto central de T3 en el metabolismo lipídico hepático y del BAT estaba mediado por la inhibición específica de AMPK en el VMH; para ello, inyectamos AMPKα-CA o GFP en el VMH de ratas hipertiroideas. Este adenovirus está previamente validado por nuestro grupo (Lopez et al., 2010b; Martinez de Morentin et al., 2014a; Whittle et al., 2012). La sobrexpresión de AMPK-CA en el VMH fue acompañada por una ganancia de masa en las ratas hipertiroideas pero no en las eutiroideas ni hubo alteraciones en la alimentación (Figura 21). Esto estaba asociado con una reversión de los efectos inducidos por el hipertiroidismo en la ruta de la lipogénesis de novo en hígado (Figura 21B) y BAT (Figura 21C). A Ganancia peso corporal (g) -25 -20 -15 -10 -5 0 5 10 ** ## 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Ingesta (g) ****** Eutiroideas GFP Eutiroideas AMPK-CA Hipertiroideas GFP Hipertiroideas AMPK-CA pAMPKαAMPKα1 AMPKα2 pACCαACCFAS ## Hígado 0 50 100 150 200 Niveles de proteina/-actina (% Eutiroid GFP) ACCα -actina pAMPKα AMPKα1 FAS pACCα AMPKα2 GFP AMPKα-CAGFPAMPKα-CA Eutiroid GFP Eutiroid AMPK-CA Hipertiroid Hipertiroid AMPK-CA B ** *** ***** ** * *** # ### # P=0.09 *** ## *** Eutiroid Hipertiroid Resultados 117 Eutiroid Hipertiroid ACCα α-tubulina pAMPKα AMPKα1 FAS pACCα AMPKα2 0 50 100 150 200 * BAT Niveles de proteina/-tubulina (% Eutiroid GFP) pAMPKαAMPKα1 AMPKα2 pACCαACCFAS C * ## ## * GFP AMPKα-CAGFPAMPKα-CA Figura 21. Efecto de la activación de AMPK en el VMH de ratas hipertiroideas sobre el metabolismo del hígado y del BAT. (A) Ganancia de masa corporal (n= 17-24 animales por grupo) y ingesta (n= 17-24 animales por grupo), (B-C) imágenes representativas autorradiográficas (panel izquierdo) y cuantificación de los niveles de proteína de la ruta de AMPK en hígado (B) ( n=7 animales por grupo) y BAT (C) (n=7 animales por grupo) de ratas eutiroideas e hipertiroideas tratadas estereotáxicamente con AMPKα-CA en el VMH por 6 días y sus controles (eutiroideas GFP VMH). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs. Eutiroideas GFP VMH. #P<0.05, ## P<0.01, ### P<0.001 Hipertiroideas GFP vs Hipertiroideas AMPK  -CA Estos datos indican que el descenso en la actividad de AMPK provocado por el hipertiroidismo en el VMH modula la lipogenesis de novo en hígado y BAT. Siguiendo con esta hipótesis, los virus de AMPKα-CA fueron administrados en el VMH de ratas centralmente tratadas con T3. Los datos mostraron que la activación constitutiva de AMPK en el VMH revierte los efectos centrales de la T3 en la masa corporal independientemente de la ingesta (Figura 22A) y va asociado a un descenso en los niveles de UCP1 en BAT (Figura 22B). De igual modo que ocurría en el modelo hipertiroideo, se revierten los efectos centrales de T3 en la ruta de AMPK en el hígado (Figura 22C) y en el BAT (Figura 22D). Estos datos son coherentes con la hipótesis de que la reducción en la función de AMPK en el VMH, media los efectos de la TH a nivel central en el metabolismo lipídico del hígado y BAT. Resultados 124 Niveles de proteína/-actina (% Hipertiroid GFP) Hipertir GFP Hipertir AMPKαCA ** * * Hipotálamo 0 50 100 150 200 250 BIP ATF6 pIRE IRE pPERK PERK peiF2α CHOP Hipertir GFP Hipertir AMPKα-CA GRP78 pIRE pPERK peIF2α ATF6 IRE PERK CHOP Β-actina Hipertir GFP Hipertir AMPKα-CA C GRP78 Figura 26. Efecto de AMPK sobre los niveles de ceramidas hipotalámicas y el ER estrés. (AC) Imágenes autorradiográficas representativas (panel izquierdo) y niveles de proteínas (panel derecho) de diferentes proteínas implicadas en la ruta de señalización del ER estrés en el VMH de ratas tratadas con AMPKα-DN (A) (n=7 animales por grupo) y en el hipotálamo de ratas tratadas con AMPKα-CA (C) (n=7 animales por grupo), durante 6 días. (B) Niveles totales de ceramidas en el MBH de ratas estereotáxicamente tratadas AMPKα-DN (n=9 animales por grupo). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs. GFP o Hipertiroideas GFP vs Hipertiroideas AMPKα-CA. Las ceramidas y la inducción de ER estrés revierten el efecto de la hormona tiroidea en la lipogenesis de novo y la termogénesis en BAT Lo obtenido hasta ahora muestra que el descenso de la actividad de AMPK en el VMH provoca un descenso en los niveles de ceramidas así como un descenso de ER estrés. En base a esto, para investigar si los mecanismos que median las acciones centrales de las hormonas tiroideas en el metabolismo del hígado y BAT, tratamos ratas hipertiroideas ICV con C6 ceramida (ceramida penetrante en la célula que es convertida a ceramidas de cadena larga dentro de la célula (Contreras et al., 2014b)). La administración central de ceramida inducía una marcada ganancia de masa (Figura 27A), asociada a un incremento de ER estrés en el MBH (Figura 27E) y un descenso en los niveles de UCP1 y ruta de señalización en AMPK en el BAT (Figura 27 B-C). Estos datos demuestran que la administración central de ceramidas revierte el efecto central de T3 en el metabolismo de BAT. Sin embargo no hemos encontrado cambios en la ruta de AMPK en el hígado (Figura 27D), indicando que el efecto es específico del BAT. Resultados 125 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Ingesta diaria (g) BAT -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 Ganancia peso corporal (g) ** ** *** *** *** 1 2 3 4 5 6 Cirugía + Administración Ceramidas Tiempo (días) A B D C pAMPKα AMPKα1 AMPKα2 pACCα ACCα FAS 20 40 60 80 100 120 140 160 0 Niveles proteína/-actina (% Vehículo ICV) Hígado Hipertiroideas Ceramida ICV Hipertiroideas Vehículo ICV 0 20 40 60 80 UCP1 /α-tubulina (% Vehículo ICV) 100 120 * α-tubulina UCP1 Vehículo Ceramida Vehículo FAS AMPKα1 pAMPKα Ceramida AMPKα2 ACCα pACCα α-tubulina 20 40 60 80 100 120 140 160 pAMPKα AMPKα1 AMPKα2 pACCα ACCα FAS 0 Niveles proteína/α-tubulina (% Vehículo ICV) *** * * ** E 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 pPERK PERK peiF2α CHOP MBH ** P=0.07 * Niveles proteína/β-actina (% vehículo ICV) Figura 27. Efecto de las ceramidas sobre las acciones centrales de la T3 en el metabolismo periférico. (A) Ganancia de masa corporal e ingesta (n=9-10 animales por grupo), (B-E) Resultados 126 imágenes autorradiográficas representativas de western blot (panel superior e izquierdo) y niveles proteicos (panel inferior o derecho) de UCP1 en BAT (B) (n= 7 animales por grupo), de la ruta de AMPK en BAT (C) (n= 7 animales por grupo), de la ruta de AMPK en hígado (D) (n=7 animales por grupo) y de la ruta de ER estrés en el MBH (E) (n=7 animales por grupo), de ratas hipertiroideas tratadas con vehículo ICV o ceramida ICV durante 6 días. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 Hipertiroideas Vehículo ICV vs Hipertiroideas Ceramidas ICV. Para evaluar el papel del ER estrés en los datos observados, inyectamos estereotáxicamente GRP78-DN en el VMH (Contreras et al., 2014b). Como en otros experimentos de adenovirus, la eficiencia de las inyecciones fue medida por la expresión de GFP en el VMH. Encontramos que tras la administración de GRP78-DN en el VMH de ratas hipertiroideas provocaba una ganancia de masa (Figura 28A), asociado con un incremento en el ER estrés en el VMH (Figura 28E), reducción en los niveles de UCP1 y en la ruta de AMPK en BAT (Figura 28B-C). No se detectaron cambios en la ruta de AMPK a nivel hepático (Figura 28D). Resultados 127 BAT 10 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Ingesta diaria (g) -25 -20 -15 -10 -5 0 5 1 2 3 4 5 * P=0.06 Cirugía + administración adenovirus Ganancia peso corporal (g) ** Tiempo (días) Hipertiroideas GFP VMH 0 20 40 60 80 100 120 140 pAMPKα AMPKα1 AMPKα2 pACCα ACCα FAS Niveles proteína/-actina (% GFP) Niveles proteína/α-tubulina (% GFP) 0 20 40 60 80 100 120 140 pAMPKα AMPKα1 AMPKα2 pACCα ACCα FAS *** Hígado GFP GRP78-DN UCP1/α-tubulina (% GFP) α-tubulina UCP1 0 20 40 60 80 100 120 * GFP FAS AMPKα1 pAMPKα GRP78-DN AMPKα2 ACCα pACCα α-tubulina Hipertiroideas GRP78-DN VMH A B D C 0 50 100 150 200 250 300 pPERK PERK peiF2α CHOP VMH * ** * Niveles proteína/β-actina (% GFP) E Figura 28. Efecto del ER estrés sobre las acciones centrales de la T3 en el metabolismo periférico. (A) Ganancia de masa corporal e ingesta (n=22-25 animales por grupo), (B-E) imágenes autorradiográficas representativas de western blot (panel superior e izquierdo) y niveles proteicos (panel inferior o derecho) de UCP1 en BAT (B) (n= 14 animales por grupo), Resultados 128 de la ruta de AMPK en BAT (C) (n= 13-15 animales por grupo), de la ruta de AMPK en hígado (D) (n=13-14 animales por grupo) y de la ruta de ER estrés en el MBH (E) (n=7-14 animales por grupo), de ratas hipertiroideas tratadas estereotáxicamente en el VMH con GFP o GRP78-DN durante 6 días. *P<0.05, **P<0.01, Hipertiroideas GFP vs Hipertiroideas GRP78-DN. Nuestros datos muestran que los niveles de ceramidas y el ER estrés en el VMH, median las acciones de T3 y AMPK en BAT pero no en hígado. La inhibición farmacológica de JNK revierte las acciones centrales de T3 en la lipogénesis de novo del hígado Investigamos los mecanismos moleculares que median los efectos de la T3 a nivel central en la función hepática. Recientes evidencias han mostrado que la proteína PKC juega un papel importante en la regulación del metabolismo de la glucosa hepática a través del ANS (Benoit et al., 2009). Nosotros hipotetizamos la posible implicación de PKC en el efecto de la T3 sobre el metabolismo lipidico hepático. Nuestros datos mostraban, que PKCδ, pero no PKCε estaban elevados en el hipotálamo y el MBH en ratas hipertiroideas y ratas tratadas con T3 ICV, respectivamente (Figura 29A-B). Estos resultados podían ser indicativos de la implicación de PKCδ en la acción de T3. Para corroborar esta posibilidad, usamos un inhibidor de PKC, rottlerin, que al ser administrado centralmente provocaba un descenso en los niveles de proteína de PKCδ y sus proteínas diana pERK (Figura 29C). Sin embargo, nuestros datos mostraban que no había efecto del rottlerin sobre los niveles hepáticos de pAMPK y pACC en ratas hipertiroideas y tratadas con T3 ICV (Figura 29D-E), indicando que la ruta de PKC no está involucrada en las acciones centrales de TH en el hígado. Resultados 129 T3 ICV Vehículo ICV T3 ICV rottlerin ICV 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 PKCδ PKCε * AB Eutiroideas Hipertiroideas Niveles proteína/-actina (% Eutiroideas) 0 20 40 60 80 100 120 140 PKCδ PKCε Vehículo ICV T3 ICV * MBH Hipotálamo ** ** Vehículo ICV Rottlerin ICV C 0 20 40 60 80 100 120 PKCδ pERK Niveles proteína/-actina (% Vehículo) Hipotálamo Hipertiroideas Vehículo ICV Hipertiroideas rottlerin ICV Hígado D 0 20 40 60 80 100 120 140 pAMPK pACCC Hígado E Niveles proteína/-actina (% Vehículo) 0 20 40 60 80 100 120 pAMPK pACCC Niveles proteína/-actina (% Hipertiroideas Vehículo ICV) pAMPKαpACCα Niveles proteína/-actina (% T3 Veh ICV) pACCαpAMPKα ** ** Figura 29. Efecto de la inhibición de PKC en las acciones centrales de T3 en el metabolismo del hígado y del BAT. (A y B) Niveles hipotalámicos y del MBH de PKCδ y PKCε de ratas hipertiroidea (n=7 animales por grupo) y ratas tratadas ICV con T3 (n=7 animales por grupo), (C) niveles de PKCδ y de pERK en el hipotálamo de ratas tratadas ICV con el inhibidor de PKC (n=7 animales por grupo); (D y E) niveles proteicos de PACC y PAMPK en hígado (D) y BAT (E) (n=7 animales por grupo) de ratas hipertiroideas y ratas T3 ICV tratadas con Rottlerin ICV durante 6 días. *P<0.05, **P<0.01 vs Eutiroideas o Vehículo ICV. JNK1 juega un papel crucial en la regulación hipotalámica de la ingesta y del metabolismo de la glucosa (Unger et al., 2010; Belgardt et al., 2010a; Belgardt et al., 2010b; Tsaousidou et al., 2014). Sin embargo, la implicación de JNK1 en la regulación del metabolismo hepático a través del ANS es actualmente desconocido. Para verificar esta teoría, primero analizamos los niveles proteicos de JNK1 en el hipotálamo de ratas hipertiroideas, T3 ICV y T3 VMH. Nuestros datos mostraban que los niveles de proteína de pJNK1 estaban incrementados en el hipotálamo, el MBH y el VMH, respectivamente, de los modelos anteriormente mencionados (Figura 30A-C). Resultados 130 Además, el efecto del hipertiroidismo y la T3 en pJNK1 estaban revertidos cuando las ratas eran tratadas simultáneamente con AMPKα-CA dentro del VMH (Figura 30D-E), indicando que el efecto de las hormonas tiroideas era mediado por AMPK, que regula a su vez JNK1 (Figura 30D-E). Niveles proteína/-actina (% T3ICV GFP) pJNK1 β-actina JNK1 T3 ICVGFP T3 ICVAMPKα-CA 0 20 40 60 80 100 120 pJNK JNK *** T3 ICV GFP T3 ICV AMPKα-CA 0 50 100 150 200 250 300 pJNK JNK Niveles proteína/-actina (% Eutiroid.) *** Eutiroid. Hipertiroid. A pJNK1 β-actina JNK1 Eutiroid. Hipertiroid. Hipotálamo 0 20 40 60 80 100 120 140 160 pJNK JNK Vehículo ICV T3 ICV * B Niveles proteína/-actina (% Vehículo ICV) pJNK1 β-actina JNK1 Vehículo ICV T3 ICV MBH Vehículo VMH T3 VMH 0 20 40 60 80 100 120 140 160 pJNK JNK *** C Niveles proteína/-actina (% Vehículo VMH) pJNK1 β-actina JNK1 Vehículo VMH T3 VMH VMH pJNK1 JNK1 pJNK1 JNK1pJNK1 JNK1 E Niveles proteína/-actina (%Hipertir. GFP) Hipertir. GFP Hipertir. AMPKα-CA 0 20 40 60 80 100 120 pJNK JNK ** D pJNK1 β-actina JNK1 Hipertir. GFP Hipertir. AMPKα-CA VMHHipotálamo pJNK1 JNK1 pJNK1 JNK1 Figura 30. Efecto de las hormonas tiroideas en JNK1. (A-E) Imágenes autorradiografiadas representativas de western blot (paneles superiores) y niveles proteicos (paneles inferiores) de JNK1 y PJNK1 en el hipotálamo, MBH o VMH de ratas hipertiroideas (n=7 animales por grupo) (A), ratas tratadas ICV T3 (n=7 animales por grupo (B), ratas tratadas con T3 en el VMH (n=7 animales por grupo) (C) y ratas hipertiroideas (n=7 animales por grupo) (D) y ratas tratadas con T3 ICV (n=11 animales por grupo) (E) tratadas estereotáxicamente con Resultados 131 AMPKα-CA. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs. eutiroideas, vehículo ICV, vehículo VMH, GFP VMH. Dado esto, nosotros barajamos la posibilidad de que JNK1 podía mediar las acciones centrales de T3 en la lipogénesis del hígado. Para ello, usamos un inhibidor de JNK llamado SP600125 administrado a nivel central. Al hacer esto, observamos un descenso en los niveles de p-c-Jun y pSTAT3, indicando la inhibición funcional de JNK1 (Figura 31A). El inhibidor de JNK fue capaz de revertir los efectos centrales de la T3 en la ruta hepática de AMPK, mediante el incremento de pAMPK y pACC (Figura 31D), seguido de una disminución en el contenido de TG (Figura 31E). Sin embargo, no se observaron cambios en pAMPK a nivel del MBH (Figura 31B), confirmando que JNK1 no estaba regulando AMPK a este nivel. Además, tampoco se observaron cambios en los niveles de UCP1 (Figura 31C) ni en la ruta de AMPK (Figura 31G) en el BAT, indicando que el efecto es específico sobre el hígado. A 0 20 40 60 80 100 120 140 p-c-Jun pSTAT3 Vehículo ICV SP600125 ICV * Niveles proteína/-actina (% Veh ICV) MBH ** 0 20 40 60 80 100 120 VH ICV MBH B pAMPKα/-actina (% Vehículo ICV) MBH ** 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Veh ICV UCP1/α-tubulin (% Vehículo ICV) C T3 ICV Veh ICV T3 ICV SP600125 ICV ** ** 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 pAMPKα AMPKα1 AMPKα2 pACCα ACCα FAS Hígado Niveles proteína/-actina (% T3ICV-Veh ICV) ** * T3 ICV - Veh ICV βactina T3 ICV - SP600125 ICV FAS AMPKα1 pAMPKα AMPKα2 ACCα pACCα D 0 20 40 60 80 100 120 140 pAMPKα AMPKα1 AMPKα2 pACCα ACCα FAS Niveles proteína/α-tubulin (% T3ICV-Veh ICV) GBAT F T3 ICV Veh ICV T3 ICV SP600125 ICV TAG (mg/gr tissue) Hígado E 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 Veh ICV * Stained Area (%) 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 Hígado * T3 ICV SP600125 ICV T3 ICV Veh ICV Resultados 132 Figura 31. Efecto de la inhibición hipotalámica de JNK en las acciones centrales de T3 sobre el metabolismo del hígado y de BAT. (A) Niveles proteicos de p-c-Jun (n=7 animales por grupo) y PSTAT3 (n=7 animales por grupo) en el MBH de ratas tratadas ICV crónicamente con vehículo o el inhibidor de JNK (SP600125). (B y C) Niveles proteicos de pAMPK en el MBH (B) (n=7 animales por grupo) y UCP1 en BAT (C) (n=7 animales por grupo) en el MBH de ratas tratadas con T3 ICV y con el inhibidor de JNK (SP600125) durante 6 días (con sus respetivos controles). (D y G) Niveles proteicos de las enzimas implicadas en la ruta de AMPK en el hígado (D) (n=7 animales por grupo) y el BAT (G) (n=7 animales por grupo), (E) niveles de triglicéridos hepáticos (n=8 animales por grupo), y (F) análisis de la tinción Oil Red O (n=7-8 animales por grupo; 40X; barra de escala: 100μm) e imágenes representativas de secciones del hígado, de ratas tratadas ICV con T3 y con el inhibidor de JNK (SP600125). *P<0.05, **P<0.01 vs. Vehículo ICV o T3 ICV Vehículo ICV. JNK1 en el VMH media las acciones centrales de T3 en la lipogénesis de novo en el hígado. Para explorar la implicación de JNK1 en el efecto lipogénico de la T3 sobre el hígado, usamos ratones deficientes en jnk1 y sus controles wildtype. Cuando les administramos centralmente T3, la ruta de AMPK en el hígado de los ratones WT disminuía pero no en los JNK1 KO (Figura 32A-B). En esta línea, los niveles de TG hepáticos y la tinción de cortes de hígado con Oil Red estaban elevados en los WT pero no en los JNK1 KO (Figura 32D-E). Sin embargo, AMPK estaba disminuido en el VMH de ambos ratones, WT y JNK1 KO, sugiriendo otra vez que AMPK está a su vez regulando JNK1 en el VMH (Figura 32F). Los niveles de UCP1 en el BAT, estaban incrementados tras la administración de T3 en ambos ratones (Figura 32G), sugiriendo que JNK1 media las acciones de la T3 a nivel hepático pero no en el BAT. Resultados 133 TG (mg/gr tejido) Área teñida(%) CD 0 20 40 60 80 100 120 140 160 pAMPKα AMPKα1 AMPKα2 pACCα ACCα FAS Niveles proteína/-actina (% WT Veh ICV) ** * * 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 1 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 1 ** ** WT Veh ICV WT T3 ICV JNK1 KO Veh ICV JNK1 KO T3 ICV Hígado 0 20 40 60 80 100 120 140 160 pAMPKα AMPKα1 AMPKα2 pACCα ACCα FAS Hígado A pAMPKα AMPKα2 AMPKα1 FAS Veh ICV T3 ICV ACCα pACCα β-actina WT Veh ICV T3 ICV BJNK1 KO pAMPKα AMPKα2 AMPKα1 FAS ACCα pACCα β-actina Niveles proteína/-actina (% JNK1KO Veh CV) Vehículo ICV T3 ICVVehículo ICVT3 ICV WT JNK1KO E Discusión 141 En este estudio hemos podido comprobar que las hormonas tiroideas a nivel central ejercen efectos sobre el metabolismo lipídico periférico, descubriendo también las rutas subyacentes por las cuales actúan. Las hormonas tiroideas son esenciales para el desarrollo, pero también para la correcta regulación del metabolismo; así, las hormonas tiroideas regulan un gran número de procesos metabólicos y es extensamente comprobado que el estado de los niveles de las hormonas tiroideas correlaciona con la masa corporal y el gasto energético (Knudsen et al., 2005; Iwen et al., 2013; Fox et al., 2008; Brent, 2012). Una de las principales características de las personas con una disfunción en la tiroides es la existencia de hiperfagia, la pérdida de masa y un estado hipermetabólico cuando existe hipertiroidismo (exceso de hormonas tiroideas) (Mullur et al., 2014). Esta condición, es observada también en nuestro modelo de hipertiroidismo en roedores, los cuales presenta un claro descenso en la masa corporal y una marcada hiperfagia, junto con unos niveles circulantes elevados de T4 y T3, corroborando su estatus hipertiroideo. La visión clásica de las hormonas tiroideas asume que la mayoría de los efectos de dichas hormonas son a través de una acción periférica (Silva, 2006). Sin embargo, datos recientes indican que las acciones de las hormonas tiroideas son mediadas también a través de una acción central (Fliers et al., 2010a; Warner and Mittag, 2012; Lopez et al., 2013). En consonancia con esto, tras la administración central de T3 pudimos observar el mismo descenso de masa corporal en las ratas tratadas pero sin cambios en los niveles circulantes de T4 y T3 (lo que apoya que este efecto metabólico no es debido a un incremento de dichas hormonas a nivel periférico). Las hormonas tiroideas modulan el metabolismo lipídico en tejidos periféricos (Volpe and Kishimoto, 1972; Gnoni et al., 1983; Blennemann et al., 1992; Hagenfeldt et al., 1981; Beylot et al., 1991; Riis et al., 2002) . Específicamente, las hormonas tiroideas regulan la síntesis de lípidos en el hígado, el músculo, el WAT, el BAT y el hipotálamo por modulación de la expresión y activación de enzimas lipogénicas clave como ACC, FAS y AMPK (Lopez et al., 2010b; Varela et al., 2012; Mullur et al., 2014). Nosotros hipotetizamos que las alteraciones lipogénicas podrían estar mediadas al menos en parte por la acción de la T3 en el hipotálamo. En este estudio demostramos que tanto el hipertiroidismo como la T3 a nivel central, incrementan la lipogénesis de novo en el hígado (descienden los niveles de pACC y pAMPK, incrementan los de FAS), así como la formación de triacilglicéridos. Sin embargo en el BAT el efecto lipogénico es el contrario aunque el programa termogénico está incrementado. La especificidad de este efecto queda demostrada por el hecho de que en el músculo o el WAT la T3 a nivel central no tiene efectos en el metabolismo lipídico. Aunque clásicamente el VMH es considerado como un regulador del control de la ingesta (‘the satiey center’), recientes evidencias revelan un complejo papel fisiológico para este Discusión 142 núcleo. Otros estudios apoyan diferentes roles metabólicos para el VMH, demostrando una compleja función de este área en el control de la ingesta (Lopez et al., 2008; Dhillon et al., 2006), del gasto energético (Lopez et al., 2010b; Whittle et al., 2012; Martinez de Morentin et al., 2012b; Contreras et al., 2014b) y de la homeostasis de la glucosa (Tong et al., 2007; McCrimmon et al., 2008). En consonancia con estos conocimientos y en base a nuestros datos, observamos que la T3 administrada en el VMH regula la lipogénesis de novo en el hígado y en el BAT, produciendo también una pérdida de masa independiente de la ingesta así como un incremento de la termogénesis en el BAT. Vemos que tras la administración de T3 en el VMH, en el hígado se activa la lipogénesis de novo mientras que en el BAT está inhibida (como habíamos observado hasta ahora en el modelo hipertiroideo y el T3 central). Sin embargo la T3 en el ARC, un área cercana y también implicada en el balance energético, no ejerce efecto a nivel del metabolismo lipídico ni en BAT ni en hígado, dando especificidad al VMH. Hace unos pocos años se estableció un link entre los efectos centrales de las hormonas tiroideas, AMPK y BAT. Específicamente se demostró que la activación del programa termogénico en BAT a través del SNS dependía de la activación mediada por T3 en la lipogénesis de novo en el hipotálamo, mediante la inhibición de AMPK (Lopez et al., 2010b). Se sabe también que AMPK en el VMH está involucrado en la integración de señales periféricas, como la ghrelin y la leptina, con las redes de señalización hipotalámicas (Kola et al., 2008; Lage et al., 2010) y en la detección de hipoglicemia aguda y en mecanismos de respuesta a la glucosa (McCrimmon et al., 2008). La especificidad de AMPK quedó claramente demostrada con la administración de adenovirus para esta proteína en el VMH; con la administración de virus AMPK-DN observamos una pérdida de masa independiente de la ingesta así como un incremento en los niveles de UCP1; además, la inhibición genética de AMPK provocaba también la inhibición de la ruta de señalización de AMPK en el hígado y el incremento en el BAT. Sin embargo, tras la sobre-expresión de AMPK en el VMH en ratas hipertiroideas observamos una ganancia de peso, y los efectos en la lipogénesis de novo a nivel hepático y del BAT eran revertidos; lo mismo ocurre tras la sobre-expresión de esta proteína en ratas centralmente tratadas con T3. Todo esto apoya que las hormonas tiroideas tienen un efecto central a través de AMPK y así regulan a nivel periférico el metabolismo lipídico tanto en hígado como en BAT. La importancia del CNS en la mediación de los efectos de las hormonas tiroideas en el metabolismo lipídico periférico no está clara. Sin embargo, décadas antes del descubrimiento y el aislamiento de la T4, el aumento de la actividad del SNS ya se creía que desempeñaba un importante papel fisiopatológico en enfermedades como la enfermedad de Graves. Esto se vio apoyado en el siglo 19 por el tratamiento de la tirotoxicosis severa a través de la resección de la cadena simpática cervical (Leak, D. (1970) The Thyroid and the Autonomic Nervous System, Discusión 143 William Heinemann Medical Books). Actualmente, los bloqueadores β-adrenérgicos son utilizados rutinariamente para el manejo inicial de la tiroxicosis severa, caracterizada por nerviosismo, sudoración excesiva, intolerancia al calor y pérdida de masa (Fliers et al., 2010a). Por otro lado, las hormonas tiroideas juegan un papel clave en la termogénesis obligatoria y adaptativa (Lowell and Flier, 1997; Lowell and Spiegelman, 2000); el principal sitio de la termogénesis adaptativa en roedores es el BAT donde el SNS y las hormonas tiroideas son esenciales para el mantenimiento de la temperatura corporal (Ribeiro et al., 2000; Ribeiro et al., 2001). Además la expresión de UCP1 es requerida para la termogénesis en el BAT, y esta proteína es sinérgicamente regulada por NE y T3 (Mullur et al., 2014). La relación entre la actividad del SNS y el estado tiroideo es complejo, y señala diferentes efectos dependiendo del órgano (corazón, músculo) y tejido (tejido adiposo) estudiado. Nuestro grupo ya había demostrado que la expresión de los marcadores termogénicos tras la administración central de T3 estaba mediada por los β-3 AR (Lopez et al., 2010b). Aquí a mayores, evaluamos lo que ocurría a nivel del metabolismo lipídico observando que tras la inhibición farmacológica del SNS, se revierten los efectos de la T3 en el BAT, pero sin embargo no ocurría nada en el hígado, es decir, la T3 a nivel central actúa sobre la lipogénesis de novo en el BAT a través del SNS pero no en el hígado, donde seguíamos observando el mismo efecto. Como hemos mencionado antes, las hormonas pueden regular el metabolismo directamente por acciones en los tejidos diana a través de receptores, pero también pueden ejercer sus acciones indirectamente a través de los núcleos hipotalámicos utilizando el sistema nervioso autónomo para controlar procesos metabólicos (Kalsbeek et al., 2004; Kreier et al., 2006; Fliers et al., 2010b). Desde el DMV, proyecciones presinápticas del parasimpático viajan a través del nervio vago, haciendo posteriormente sinapsis con neuronas postsinápticas en ganglios cerca de órganos viscerales, como, por ejemplo, el hígado (Barthel and Schmoll, 2003). En relación con esto, se ha observado en varios estudios que el hipotálamo puede modular la producción endógena de glucosa mediante el uso recíproco de outputs del sistema nervioso simpático y parasimpático hacia el hígado (van den Hoek et al., 2008; Sandoval et al., 2008; Pocai et al., 2005). En nuestro estudio observamos que tras la administración central de T3 se producía un incremento en c-FOS (marcador de la actividad neuronal) en el DMV. En base a esto, tras la denervación del nervio vago hacia el hígado, el análisis de los resultados mostró que los efectos de la T3 sobre la lipogénesis de novo en el hígado se veían eliminados aunque los efectos en el BAT y la pérdida de masa no sufrían cambios. Estos resultados seguían la misma línea que estudios anteriores, apoyando que las acciones centrales de la T3 sobre la lipogénesis de novo en el hígado implicaban al PSNS, y aunque era sabido que las hormonas tiroideas modulaban el metabolismo lipídico en tejidos periféricos (Klieverik et al., 2009a; Discusión 144 Duntas and Brenta, 2012) no había evidencias claras que mostraran esta regulación a través del PSNS. Las ceramidas son importantes reguladores del balance energético y el metabolismo (Turpin et al., 2014; Holland et al., 2011; Raichur et al., 2014; Xia et al., 2015). En tejidos periféricos las especies reactivas de lípidos como las ceramidas son un mecanismo patogénico de resistencia a insulina; este proceso conocido como lipotoxicidad ocurre a través de la inflamación y el ER estrés (Unger, 2002; Fu et al., 2012; Summers, 2006). El ER está involucrado en el almacenamiento de calcio y en la biosíntesis de lípidos. Existen una serie de factores que activan estas proteínas UPR incluyendo el exceso de nutrientes, la deprivación o el estrés oxidativo (Cunard, 2015). Varios estudios han demostrado que la señalización de las UPR y el ER estrés están asociados con cambios fisiopatológicos y metabólicos, incluyendo la obesidad, la diabetes tipo 2, la aterosclerosis, la patología cardíaca y enfermedades de hígado (Park and Ozcan, 2013; Lee and Ozcan, 2014). Ozcan y colaboradores identificaron el ER estrés como un vínculo molecular entre la obesidad, el deterioro de la acción de la insulina y el desarrollo de la diabetes tipo 2 (Ozcan et al., 2004). Nuestros resultados mostraron que el hipertiroidismo reduce los niveles hipotalámicos de ceramidas y ER estrés; lo mismo ocurre con la T3 a nivel central o bien con la T3 administrada estereotaxicamente en el VMH. Esto se observa por los bajos niveles de AFT6, CHOP y pPERK. Sin embargo los niveles de GRP78, la chaperona ubicada más upstream en la UPR, están incrementados. En otras áreas como el cortex ocurre lo contrario. Al analizar los niveles de ceramidas y los marcadores de ER estrés en los animales en los que AMPK fue reducido genéticamente, observamos el mismo patrón, descenso de los niveles de ceramidas y de ER estrés; ocurre lo contrario cuando se sobre-expresa AMPK. En base a esto nosotros deducimos que el efecto central de la T3 provoca un descenso en los niveles de ceramidas y ER estrés en el hipotálamo y que este efecto está mediado por AMPK en el VMH. Recientes datos de nuestro grupo, han demostrado que la lipotoxicidad inducida por ceramidas a nivel central induce ER estrés conduciendo a una ganancia de masa y un descenso en el tono simpático y en el programa termogénico (Contreras et al., 2014b). En base a estas evidencias, hipotetizamos un posible vínculo entre T3 y ER estrés. Al evaluar los resultados tras la administración central de ceramidas en ratas tratadas con T3 comprobamos que los efectos de la T3 sobre la pérdida de masa y la termogénesis eran revertidos (descenso de UCP1) y la ruta metabólica de AMPK también estaba disminuida (contrario a los efectos de T3); sin embargo a nivel hepático no observamos estos efectos. Por otra parte, cuando inducíamos ER estrés en el VMH observábamos el mismo efecto que con las ceramidas, es decir, el programa termogénico y la ruta de señalización de AMPK en BAT disminuye, sin embargo a nivel hepático no ocurría Discusión 145 ningún cambio. En base a estos resultados, podemos decir que los niveles de ceramidas y el ER estrés en el VMH están mediando los efectos centrales de la T3 y de AMPK en BAT. El cerebro parece ser un posible sitio donde JNK1 ejerce su regulación sobre la obesidad, debido a la implicación del hipotálamo en esta patología. La función de esta proteína en el sistema nervioso parece ser compleja pero sin embargo hay indicios para pensar que el eje hipotálamo-hipofisistiroides es una de las más importantes dianas de JNK1 para ejercer sus funciones metabólicas (Sabio et al., 2010a; Belgardt et al., 2010b). Estudios a un nivel global del organismo han observado que los ratones deficientes en esta kinasa controla la acumulación y la captación de lípidos en el hígado (Imbernon et al., 2013). Después de analizar los niveles de JNK1 a nivel central en nuestros modelos, observamos que tanto las hormonas tiroideas a nivel periférico como a nivel central y núcleo-específico poseían los niveles de pJNK1 elevados; estos niveles elevados se revertían cuando sobreexpresabamos AMPK en ratas hipertiroideas o tratadas centralmente con T3, lo que nos llevó a postular que AMPK está upstream de JNK. Debido a las investigaciones previas de otros grupos con JNK1 (Bennett et al., 2003; Nakatani et al., 2004; Sabio et al., 2009; Sabio and Davis, 2010; Sabio et al., 2010a; Belgardt et al., 2010a; Imbernon et al., 2013) decidimos seguir investigando esta vía y ver que implicaciones podía tener en las acciones de las hormonas tiroideas sobre el metabolismo lipídico hepático; de este modo, al administrar un inhibidor de esta proteína a nivel central junto con la T3 pudimos observar que los efectos de la T3 en presencia del inhibidor se veían eliminados a nivel hepático, pero en el BAT no tenía efecto; a nivel de los triglicéridos hepáticos también dejaba de tener efecto la T3 en presencia del inhibidor de JNK. Esto nos indicaba que el efecto de JNK era específico del hígado. Sin embargo para explorar mejor el efecto lipogénico de JNK1 usamos ratones deficientes en JNK1 a nivel global de todo el cuerpo y al suministrarles T3, observamos que las acciones de la T3 sobre el hígado se veían revertidas, aunque en el BAT seguía ocurriendo lo mismo (incremento de UCP1 e incremento de pACC y pAMPK). Los niveles de los triglicéridos también estaban disminuidos cuando JNK1 era eliminado. En conjunto estos resultados sugerían un posible papel de JNK1 hipotalámico como mediador de las acciones centrales de T3 sobre el metabolismo lipídico hepático. No obstante, en este punto tampoco podíamos excluir la implicación de JNK2 en este proceso (Gupta et al., 1995; Liedtke and Trautwein, 2006) y nuestra idea era poder dar más especificidad a JNK1 sobretodo a nivel central. Para ello tras abolir JNK1 en el VMH de ratones carentes de JNK2 a nivel global y administrarles T3 ICV observamos que efectivamente, sólo JNK1 tenía implicaciones a nivel hepático tras la administración de T3 a nivel central; en los ratones JNK2 knock out sin eliminar JNK1 en el VMH la T3 seguía ejerciendo el mismo efecto a nivel hepático, con incremento de la lipogénesis de novo e incremento de triacilglicéridos; sin embargo en los ratones donde JNK1 fue eliminado en el VMH, estos efectos a nivel hepático no eran observados. A nivel del BAT, Discusión 146 la T3 seguía afectando a este órgano de igual forma, es decir, los niveles de UCP1 estaban incrementados. A nivel hipotalámico, en ninguno de los ratones observamos cambios en relación a la acción de T3 sobre AMPK (disminuía en ambos casos). Estos datos nos han indicado que JNK1 en el VMH media las acciones centrales en la lipogénisis hepática pero no en el BAT, pero está situado downstream de AMPK. Es importante destacar que con los resultados obtenidos, no se puede excluir una implicación de JNK3, aunque de las tres isoformas parece ser la que menos implicaciones tiene en el metabolismo hasta este momento conocidas (Coffey, 2014). El resultado neto de la administración central de T3 a nivel hepático es un incremento de la lipogénesis. En este sentido, los datos mostrados por el oleato marcado demuestran que la síntesis de novo de ácidos grasos y la captación dentro del hígado está incrementada. Nuestros estudios anteriores demostraron que la T3 a nivel central aumenta la actividad termogénica en este tejido (Lopez et al., 2010b), esto concuerda con los valores incrementados de C14 en el BAT. Es posible que este incremento del C14 encontrado en el BAT surja por un lado de la captación directa de ácidos grasos circulantes (Ouellet et al., 2012) y por otro, de los triglicéridos sintetizados por el hígado (Bartelt et al., 2011; Gibbons et al., 2000). Las lipoproteínas ricas en triglicéridos son conocidas por su contribución al contenido de lípidos en el BAT durante la termogénesis y su captación es regulada por lipasas específicas (Bartelt et al., 2011; Bruinstroop et al., 2014) cuya actividad está incrementada en el BAT después de la administración de T3 a nivel central (Lopez et al., 2010b). Sin embargo en el BAT, nuestros resultados no demuestran un incremento en los niveles de TG marcados con C14, esto puede deberse al incremento que posee este tejido en la beta-oxidación tras la administración de T3. Aunque la termogénesis está incrementada, no observamos una activación del programa lipogénico en el BAT; este hecho sumado a que los niveles del metabolito C14 está incrementado en suero, pueden apuntar a un posible suministro de energía por parte del hígado hacia el BAT. La idea global de nuestro estudio, es que el hipertiroidismo y la T3 a nivel central inducen un marcado incremento en la lipogenesis de novo específicamente en el hipotálamo lo que lleva a un incremento en la actividad del BAT a través del SNS conduciendo a una pérdida de peso; por otro lado también provoca un incremento en la lipogénesis de novo en el hígado, incrementando los niveles de TG en dicho tejido a través del sistema nervioso parasimpático. Las acciones centrales de T3 y AMPK hacia el BAT van a estar mediadas por bajos niveles de ceramidas que lleva a bajo ER estrés, mientras que hacia el hígado van a estar mediadas por JNK1. Todo esto estará mediado por AMPK en un núcleo específico que es el VMH. Nuestros datos parecen indicar que este incremento en la producción de lípidos después de la administración de T3 son redireccionados hacia el BAT, donde sirven de combustible para la maquinaria termogénica debido a que esta está incrementada también por las acciones de la T3. Discusión 147 Todo esto describe un nuevo papel sobre la acción de las hormonas tiroideas en el VMH describiendo un nuevo circuito desconocido que modula el metabolismo lipídico a nivel periférico a través de dos vías distintas. En resumen, podemos concluir que a través de este doble mecanismo hipotálamo, controlado inicialmente por AMPK, la T3 maximiza las capacidades metabólicas de cada tejido: la lipogénesis en el hígado y la termogénesis en el BAT, que a su vez usa como combustible los lípidos hepáticos. 148 Resumen gráfico ARC T3 VMH TR BAT 3-AR pAMPK pACC FAS Lipogénesis de novo Termogénesis Programa termogénico RPa IO SNS Glándula tiroides AMPK Ceramidas ER stress ARC VMH T3 TR Glándula tiroides JNK1 AMPK Nervio vago (PSNS) DMV Hígado TGs pAMPK pACC FAS Lipogénesis de novo 3V 3V T3-AMPK-ERstress-SNS-BAT T3-AMPK-JNK-PSNS-Hígado CONCLUSIONES