Nuevas estrategias proteómicas para la caracterización de proteínas de baja abundancia en muestras clínicas

NUEVAS ESTRATEGIAS PROTEÓMICAS PARA LA CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS DE BAJA ABUNDANCIA EN MUESTRAS CLÍNICAS GRADO EN QUÍMICA Ángel Camilo López Regueiro Santiago de Compostela, Julio 2017 Dr. Don ANTONIO MOREDA PIÑEIRO, Profesor Titular de Química Analítica, y Dra. Doña MARÍA DEL PILAR BERMEJO BARRERA, Catedrática de Universidad, ambos en el Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Universidad de Santiago de Compostela, INFORMAN, Que la memoria adjunta titulada “Nuevas estrategias proteómicas para la caracterización de proteínas de baja abundancia en muestras clínicas” para optar al Grado en Química ha sido realizada por Don Ángel Camilo López Regueiro bajo su dirección en los laboratorios GETEE del Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología. Considerando que constituye un Trabajo de Fin de Grado, autorizan su presentación en la Facultad de Química de la Universidad de Santiago de Compostela. Santiago de Compostela, 11 de julio de 2017 Fdo. D. Antonio Moreda Piñeiro Fdo. Dña. Mª del Pilar Bermejo Barrera Índice I. RESUMEN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 II. INTRODUCCIÓN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3 1. Enfermedad de Alzheimer. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1.1. Patogenia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2. Proteómica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 2.1. Biomarcadores. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6 2.2. Fosfoproteómica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6 2.3. Metalómica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 2.4. Muestras en el estudio proteómico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7 3. Estudio del proteoma: fases y técnicas analíticas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 3.1. Depleción y fraccionamiento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 3.1.1. Cromatografía de afinidad. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11 3.2. Separación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 3.2.1. Electroforesis bidimensional (2D-PAGE) . . . . . . . . . . . . . . . . . .12 III. OBJETIVOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16 IV. REACTIVOS Y EQUIPOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17 V. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19 1. Obtención de suero. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19 2. Cromatografía líquida. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 3. Precipitación de las proteínas y resuspensión. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 4. Isoelectroenfoque y Electroforesis en Gel de 2 Dimensiones. . . . . . . . . . . . . .20 5. Adquisición y análisis de las imágenes obtenidas de los geles en 2 dimensiones (2-DE). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 1. Dilución 1:10 frente a dilución 1:5. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22 2. Elección del pH de las tiras IPG. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24 3. Tamaño del gel. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24 4. Porcentaje de polimerización del gel. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25 5. Condiciones nativas y desnaturalizantes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 6. Tinciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27 7. Secado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27 VII. CONCLUSIONES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36 VIII. BIBLIOGRAFÍA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 I. RESUMEN RESUMEN 1 Castellano La enfermedad de Alzheimer es un proceso neurodegenerativo del sistema nervioso central caracterizada por la muerte neuronal progresiva en ciertas áreas del cerebro. Esta enfermedad es el tipo más habitual de demencia, que en 2013 contaba con 44 millones de afectados y se estima que aumente a 65 millones en 2030. Actualmente, la muestra clínica más estudiada es el líquido cefalorraquídeo, por lo que el hallazgo de biomarcadores indicadores de la enfermedad en muestras cuya obtención sea más sencilla se presenta como una interesante alternativa a estudiar. En este trabajo se han desarrollado y estandarizado diferentes técnicas para el estudio de muestras de suero, centrándose en el campo de la proteómica, realizando la separación de las proteínas de alta abundancia de las de baja abundancia por cromatografía de afinidad, para la subsiguiente separación de éstas por electroforesis bidimensional 2D-PAGE. Se han estudiado las diferentes condiciones de electroforesis (nativas o desnaturalizantes), el pH de las tiras o la dilución de la muestra; y con respecto a los geles de poliacrilamida su tinción, el grado de polimeración, el tamaño y el secado. Las metodologías se aplicaron a muestras de personas sanas, pacientes con deterioro cognitivo que evolucionaría a Alzheimer y pacientes con Alzheimer, realizando un análisis de imagen comparativo de estas situaciones. Gallego A enfermidade de Alzheimer é un proceso neurodexenerativo do sistema nervioso central caracterizada pola morte neuronal progresiva en certas áreas do cerebro. Esta enfermidade é o tipo máis habitual de demencia, que en 2013 contaba con 44 millóns de afectados e estímase que aumente a 65 millóns en 2030. Actualmente, a mostra clínica máis estudada é o líquido cefalorraquídeo, polo que o achado de biomarcadores indicadores da enfermidade en mostras cuxa obtención sexa máis sinxela preséntase como una interesante alternativa a estudar. Neste traballo desenvolvéronse e estandarizáronse diferentes técnicas para o estudo de mostras de soro, centrándose no campo da proteómica, realizando a separación das proteínas de alta abundancia das de baixa abundancia por cromatografía de afinidade, para a subseguinte separación destas por electroforese bidimensional 2D-PAGE. Estudáronse diferentes condicións de electroforese (nativas ou desnaturalizantes), o pH da tira ou a dilución da mostra; e con respecto aos xeles de poliacrilamida a tinción, o grado de polimerización, o tamaño e o secado. As metodoloxías foron aplicadas a mostras de persoas sas, pacientes con deterioro cognitivo que evolucionaría a Alzheimer e pacientes con Alzheimer, realizando unha análise de imaxe comparativa destas situacións. RESUMEN 2 Inglés Alzheimer´s disease is a neurodegenerative process of the central nervous system characterized by progressive neuronal death in certain areas of the brain. This disease is the most common type of dementia, which affected 44 million people in 2013. This number is estimated to increase to 65 million in 2030. Currently, the most studied clinical sample is cerebrospinal fluid, so the finding of biomarkers of this disease in samples whose extraction is simpler is presented as an interesting alternative to study. For this purpose, different techniques for the study of serum samples have been developed and standardized, focusing on the field of proteomics. The separation of high abundance proteins from low abundance ones is carried out by affinity chromatography, for the subsequent separation by 2D-PAGE two-dimensional electrophoresis. Different electrophoresis conditions have been tested (native or denaturing), as well as the pH of the strips and the dilution of the sample; and with respect to the polyacrylamide gels their staining, degree of polymerization, size and drying. The methodologies were applied to samples of healthy individuals, patients with cognitive impairment that would evolve to Alzheimer's and Alzheimer's patients, performing a comparative image analysis of these situations. II. INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 3 1. Enfermedad de Alzheimer La demencia es un síndrome causado por una enfermedad del cerebro, usualmente de naturaleza crónica o progresiva, en la cual hay una alteración de múltiples funciones corticales superiores, incluyendo la memoria, el pensamiento, la orientación, la comprensión, el lenguaje, la capacidad de aprender y de realizar cálculos y la toma de decisiones. Las deficiencias de las habilidades cognitivas están comúnmente acompañadas, y ocasionalmente precedidas, por un deterioro del control emocional, del comportamiento social o de la motivación [1]. La demencia afecta a cada persona de manera diferente dependiendo del impacto de la enfermedad, así como de la personalidad premórbida del individuo, estableciéndose tres etapas: la fase temprana, que se desarrolla entre el primer y segundo año; la fase media que tiene lugar entre el segundo año y el cuarto o quinto; y la fase avanzada, a partir del quinto año (Tabla 1). La enfermedad de Alzheimer (Alzheimer Disease, AD) es la forma más común de la demencia y se caracteriza por ser un tipo de demencia que comienza con un fallo sutil y poco reconocible de la memoria y que, lentamente, se vuelve más grave hasta incluso poder ser incapacitante. Otros síntomas comunes incluyen confusión, mal juicio, alteración del lenguaje, agitación, abstinencia y alucinaciones; mientras que también se pudieron observar convulsiones, incontinencia o mutismo. La muerte suele provenir de la inanición general, la desnutrición y la neumonía [2]. Actualmente, la demencia senil afecta a más de 44 millones de personas en todo el mundo (Figura 1), siendo la AD la afección atribuible a un 50-75% de los casos[3,4]. La importancia socio-familiar, así como el coste económico, que conlleva esta afección conduce a desarrollar nuevas técnicas de diagnóstico precoz, con el fin de minimizar o eliminar el avance de la enfermedad. Figura 1. Aumento del número de personas con demencia en el mundo (2010-2050), comparando estimaciones actualizadas [3]. INTRODUCCIÓN 4 Tabla 1. Fases del desarrollo de la demencia y síntomas asociados [1]. Descripción Síntomas Fase temprana La persona tiende a ser ignorada ya que se confunde como un componente normal en el proceso de envejecimiento. Es difícil establecer su inicio debido a su carácter gradual. -La persona se torna olvidadiza. -Dificultad de comunicación. -Pérdida de orientación espacial. -Pérdida de la noción del tiempo (hora, día, mes, año, estaciones). -Dificultad en la toma de decisiones y en la realización de tareas. -Cambios en el ánimo (menor actividad, menor motivación, pérdida de interés). Fase media Los problemas se vuelven más obvios y limitantes. - La persona se torna muy olvidadiza (eventos recientes, nombres de personas). -Dificultad para comprender el tiempo, fechas, lugares y eventos. -Dificultad en el habla y la comprensión. -Necesidad de ayuda en el cuidado personal. -Incapacidad de vivir sólo de manera segura. -Cambios del comportamiento: deambular, gritar, perturbación del sueño, alucinaciones. -Comportamiento inapropiado para la comunidad (agresividad, desinhibición). Fase avanzada Casi total dependencia e inactividad. Las alteraciones de la memoria son más serias y el lado físico de la enfermedad se vuelve más obvio. -Desconocimiento de la fecha y el lugar en el que se encuentra. -Alta dificultad de compresión. -No reconoce a familiares, amigos u objetos conocidos. -Incontinencia renal e intestinal. -Alta incapacidad móvil. -Cambios de comportamiento: agresiones y agitación no verbal. 1.1 Patogenia El estudio de la AD apoya un modelo en el que un péptido denominado amiloideβ, o Aβ, se acumula en el cerebro a lo largo del tiempo e inicia una cadena de acontecimientos que desemboca en la AD. El Aβ se crea cuando la proteína transmembranosa precursora de la proteína amiloide (APP) es escindida secuencialmente por las enzimas conversoras del Aβ (BACE) y la γ-secretasa. Las mutaciones en APP o en los componentes de la γ-secretasa provocan AD al aumentar INTRODUCCIÓN 11 3.1.1 Cromatografía de afinidad La cromatografía de afinidad es una poderosa herramienta en el análisis de compuestos bioquímicos, ya que se emplean interacciones específicas entre un componente inmovilizado sobre un soporte (ligando de afinidad) y el compuesto complementario al mismo [18]. Hay tres etapas para el proceso de separación por cromatografía de afinidad (Figura 5). La primera etapa es la inyección de la muestra, la cual es bombeada a través de la columna, y todas las especies no retenidas pasan a través de la misma, salvo el analito complementario, que es retenido por su ligando afín [18]. Después de que todos los componentes no retenidos pasen por la columna, se inicia la segunda etapa del proceso cromatográfico, produciéndose un cambio en la fase móvil aplicada, lo que provoca la disrupción de las fuerzas de unión entre el analito y el ligando de afinidad, por lo que el analito es eluido de la columna [18]. Existen dos categorías de tampones de elución: Tampones bioespecíficos de elución [18]: contienen una especie que interactúa específicamente con el ligando de afinidad o analito para efectuar la elución. El uso de este tipo de tampón añade una segunda etapa de especificidad, ya que no solo es específica la retención, sino también la elución. Este tipo de elución bioespecífica es la que se lleva a cabo en columnas con lectina que retienen proteínas glicosiladas [18]. Tampones generales [18]: afectan a la elución por medios no específicos, a través de la interrupción de los enlaces producidos o las fuerzas intermoleculares débiles entre el analito y el ligando de afinidad. Este tipo de elución utiliza cambios de pH, de fase móvil, la inclusión de modificadores orgánicos o el uso de condiciones desnaturalizantes (como puede ser la adición de urea). La desventaja de este esquema de elución es que las especies que se adsorben inespecíficamente al soporte pueden eluir con el analito [18]. La tercera etapa del proceso de cromatografía de afinidad es el reequilibrado de la columna con la primera fase móvil, antes de la inyección de la siguiente muestra[18]. INTRODUCCIÓN 12 Figura 5. Esquema representativo de la cromatografía de afinidad, en la que se ven la fase de carga, elución de los compuestos no retenidos y la elución del analito [19]. 3.2 Separación Una vez que se ha deplecionado y fraccionado la muestra, todavía se sigue teniendo un mezcla compleja de proteínas, por lo que surge la necesidad de técnicas analíticas que permitan la separación de proteínas valiéndose de sus propiedades físicas y químicas. De esta forma, se desarrolla una técnica denominada electroforesis bidimensional, inicialmente puesta en marcha por O’Farrel en 1975 [20]. 3.2.1 Electroforesis bidimensional (2D-PAGE) Se define electroforesis como el movimiento de partículas cargadas a causa de un campo eléctrico externo [18], por lo tanto es deducible que esta técnica utilizará un campo eléctrico para, aprovechándose de la naturaleza anfótera de las proteínas, separar las proteínas formando una matriz de dos dimensiones. Para la primera dimensión se realiza un isoelectroenfoque (IEF), en el cual las proteínas se separan en un gradiente continuo de pH en función de su punto isoeléctrico (pI, que es eI pH al cual la proteína tiene carga neta igual a cero); en la segunda dimensión, o SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis), las proteínas se separan en función de su peso molecular, y la dirección del movimiento en esta segunda etapa es perpendicular a la primera. Como resultado, se obtiene una serie de puntos o spots, cada uno de los cuales pertenece a una proteína [21]. ISOELECTROENFOQUE El IEF proporciona una resolución alta, ya que posibilita la separación de proteínas que difieren en su carga, además de una alta reproducibilidad, debido a que actualmente se utilizan tiras que contienen geles con un gradiente de pH inmovilizado, las tiras IPG (immobilized pH gradients), que generan este gradiente al contener sustancias no anfóteras denominadas inmovilinas, que están covalentemente ligadas a INTRODUCCIÓN 13 una matriz copolimerizada de gel de acrilamida [21]. Las inmovilinas comprenden diversidad valores de pKa y son capaces de soportar la corriente eléctrica indefinidamente sin ser alteradas, conduciendo a capacidades de amortiguación específicas sobre el intervalo de pH de la tira (siendo las más habituales las tiras que comprenden pH entre 3-10 y entre 4-7), obteniendo el gradiente inmovilizado[21]. Por lo tanto, cuando la proteína tiene carga positiva (la proteína está en una región de pH por debajo de su pI) migrará hacia el ánodo (negativo), mientras que si la proteína tiene carga negativa (la proteína está en una región de pH por encima de su pI) migrará hacia el cátodo (positivo) [21]. Cuando la proteína alcanza la región de pH que corresponde a su pI la migración cesa, puesto que en este punto no tiene carga neta, habiéndose completado el “enfoque” de la proteína y pudiendo permanecer en este punto durante largos períodos de tiempo [21]. Para que el IEF se produzca con mayor facilidad, se utilizan anfolitos, que son compuestos de bajo peso molecular que poseen carga eléctrica y colaboran en la migración de las proteínas hasta su pI, favoreciendo además la solubilización de la muestra en el tampón requerido [22]. Por ello, es conveniente añadir un pequeño porcentaje de anfolitos de un rango de pH mucho más amplio que el utilizado en la tira [22]. De esta forma, el IEF inmoviliza a las proteínas en el gel de las tiras IPG, pero también es posible que esta inmovilización se produzca en fase líquida, como es el caso del OFFGEL, en el que la muestra es fraccionada en diversas porciones líquidas que contienen proteínas con un rango de pI estrecho. Sus ventajas e inconvenientes se encuentran resumidas en la Tabla 2, en las que destacan la recuperación de proteínas en fase líquida, lo que permite un análisis directo de las fracciones de proteína aisladas mediante técnicas avanzadas de separación tales como MS/MS; así como la alta resolución en los pI, porque cada una de las fracciones líquidas (suelen ser 12 o 24 fracciones) se encuentra contenida en un “pocillo” en los que la variación en el pI se encuentra entre ±0,26 a ±0,27 unidades de pI [21]. Tabla 2. Ventajas y desventajas de la tecnología OFFGEL [21]. Tecnología OFFGEL Ventajas Inconvenientes Recuperación de las proteínas en fase líquida Largo tiempo de separación (de unas horas hasta 2-4 días) Alta resolución en los pI (tiras IPG) Número moderado de proteínas identificadas Poca influencia de los reactivos de OFFGEL sobre el rendimiento de otras técnicas de separación Posible precipitación de proteínas de carga neutra INTRODUCCIÓN 14 Tanto en el caso del isoelectroenfoque en el gel de la IPG como en el caso del OFFGEL (Figura 6), el hecho de que las proteínas migran desde cualquier punto de la tira a la posición de su pI permite que la muestra pueda ser cargada a lo largo de todo el sistema de separación. Figura 6.Fraccionamiento basado en el pI siguiendo la tecnología OFFGEL [23]. SDS-PAGE Esta dimensión cuenta con dos variables indispensables para su realización. La primera de ellas es la utilización de dodecilsulfato de sodio (SDS), que es un detergente y desnaturalizante de proteínas especialmente eficaz; mientras que la segunda variable es el uso de un soporte en el que separar las proteínas en función de su masa molecular [18]. De forma habitual, se utilizan geles de agarosa o de poliacrilamida, ya INTRODUCCIÓN 15 que en su preparación se puede controlar el tamaño de poro, lo que determinará el movimiento de las proteínas en relación a la masa [18]. Las proteínas cuyo tamaño electroforético sea más pequeño avanzarán más lejos [18] (Figura 7). Figura 7. Electroforesis bidimensional, realizada mediante el IEF en una tira IPG y el SDS-PAGE sobre un gel [24]. La alternativa al SDS-PAGE para la variante OFFGEL se realiza mediante unos chips (LOC, Lab-on-chip) en los que se cargan las fracciones en el mismo, junto con los agentes reactivos, y son analizados por un bioanalizador, obteniendo una segunda dimensión virtual en un ordenador, teniendo como ventaja que este bioanalizador es capaz de realizar una cuantificación de la cantidad de proteína que hay en una fracción. III. OBJETIVOS OBJETIVOS 16 El objetivo principal del presente Trabajo Fin de Grado es la aplicación de técnicas proteómicas basadas en la electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional (2D-PAGE) para la caracterización de proteínas y metaloproteínas de suero sanguíneo. Para ello, se llevará a cabo: 1. La optimización de las condiciones de la depleción de las proteínas de alta abundancia. 2. La estandarización de las condiciones de separación electroforética para proteínas y metaloproteínas. 3. La identificación de spots significativos cuya caracterización pueda resultar en la determinación de un posible biomarcador de la AD. IV. REACTIVOS Y EQUIPOS REACTIVOS Y EQUIPOS 17 REACTIVOS - Buffer A y Buffer B empleados en la depleción de proteínas de alta y baja abundancia (Agilent Technologies, EEUU). - Metanol 100% (Merck, Alemania). - Cloroformo (Merck, Alemania). - Agua Milli-Q (Millipore, Bedford, Estados Unidos) - Tampón de rehidratación con urea/tiourea 2-DE: 7M urea (Sigma-Aldrich, EEUU), 2M tiourea (Sigma-Aldrich, EEUU), 2% (w/v) CHAPS (Sigma-Aldrich, EEUU), 0.5% (v/v) anfolitos (Serva, Alemania), 0.002% azul bromofenol (SigmaAldrich, EEUU), 50nM DTT (Serva, Alemania). - Anfolitos 0.5% (v/v): 0.1% (pH 3-10) y 0.05% (pH 2-4 y 9-11) (Serva, Alemania). - SDS equilibration solution buffer I: 6M urea (Sigma-Aldrich, EEUU), 75nM TrisHCl pH 8.8 (Sigma-Aldrich, EEUU), 20 % glicerol (w/w) (Sigma-Aldrich, EEUU), 2% SDS (Sigma-Aldrich, EEUU), 0.002% azul de bromofenol (Sigma-Aldrich, EEUU), 1% (w/v) DTT (Serva, Alemania). - SDS equilibration buffer solution II: 6M urea (Sigma-Aldrich, EEUU), 75nM TrisHCl pH 8.8 (Sigma-Aldrich, EEUU), 20% glicerol (w/w) (Sigma-Aldrich, EEUU), 2% SDS (Sigma-Aldrich, EEUU), 0.002% azul de bromofenol (Sigma-Aldrich, EEUU), 4 % (w/v) iodoacetamida (Sigma-Aldrich, EEUU). - Tampón de electroforesis: 14.4 g/L de glicina (Sigma-Aldrich, EEUU), 3.03 g/L de Tris Base (Sigma-Aldrich, EEUU) y 5 ml de SDS al 10% (Sigma-Aldrich, EEUU). - Disolución acuosa metanol/acético (10%/7%) (Merck, Alemania). - Sypro Ruby (Lonza, Suiza). EQUIPOS - Agilent 1260 Infinity Quaternary LC VL (Agilent Technologies, EEUU). o Multiple Affinity Removal System (MARS) Human 6 (4.6 mm id × 100 mm) (Agilent Technologies, EEUU) - Sigma 2K15 centrífuga refrigerada (SIGMA Laborzentrifugen GmbH, Alemania). o Agilent Spin Concentrators for Proteins (Agilent Technologies, EEUU). o Microtubos MCT-150-C 1,5 mL Clear (Axygen, EEUU). o Tubos Eppendorf (Eppendorf, Alemania). - Protean IEF Cell (BioRad, EEUU). o Tiras IPG 4-7 de 7 cm y 17 cm (Biorad, EEUU) - Proteome Plus Dodeca (BioRad, EEUU). - Typhoon FLA 7000 (GE Healthcare, Reino Unido). o ProgenesisSameSpots versión 4.5 (Nonlinear Dynamics, EEUU). - Secador de gel de electrophoresis (BioRad, EEUU). - Centrífuga de mesa (Beckman Coulter, EEUU). - Micropipetas de 500 µL ,100 µL, 10 µL y 2 µL (Eppendorf, Alemania). REACTIVOS Y EQUIPOS 18 MUESTRAS Las muestras de suero sanguíneo de pacientes control, pacientes con deterioro cognitivo leve, y pacientes con Alzheimer fueron suministradas por el Laboratorio Clínico de Investigaciones en Neurociencias (Clinical Neurosciences Research Laboratory, LINC) del Instituto de Investigaciones Sanitarias del Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela (IDIS-CHUS). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 23 Figura 9. Cromatograma de una muestra de suero diluida 1:10 con Buffer A. Al encontrar un mejor ajuste en la dilución 1:5 respecto a la dilución 1:10, se optó por realizar ésta en las muestras de suero del posterior estudio, es decir, las muestras de pacientes con AD, de pacientes con deterioro cognitivo y de pacientes control. Además, de esta forma se disminuye el consumo de reactivos. La interpretación del cromatograma es simple, el primer pico del cromatograma (cuyo máximo se encuentra en torno al minuto 3) corresponde con la elución de las proteínas de baja abundancia, ya que son las proteínas de alta abundancia las que quedan retenidas en la columna por interacciones antígenoanticuerpo, mientras que al producirse un cambio en la fase móvil al Buffer B (también disolución comercial de composición desconocida) en el minuto 10 (Tabla 3, página 19), se provoca la elución de las proteínas de alta abundancia, viéndose reflejado en el pico que se observa en torno al minuto 12. Los siguientes cambios de fase móvil tienen como objetivo el reequilibrado de la columna, de esta forma se produce una limpieza de la columna por si queda algún compuesto en ella para poder efectuar una siguiente inyección con la columna limpia. El programa completo tiene una duración total de 28 minutos. Por lo tanto, en las distintas muestras de suero, se deben recoger dos fracciones. La primera fracción corresponde a la de las proteínas de baja abundancia, y comprenden el eluato desde el minuto 2 (en el que empiezan a eluir estas proteínas) hasta el minuto 12, esto se justifica ya que aunque en apariencia el pico regresa a la línea base en torno al minuto 5, en realidad no es así, ya que se sigue obteniendo señal hasta aproximadamente el minuto 12, es decir, en este tiempo continúan eluyendo proteínas de baja abundancia que son necesarias para el estudio, ya que entre ellas podría encontrarse un candidato a biomarcador de la AD cuando se realice el RESULTADOS Y DISCUSIÓN 24 fraccionamiento de las muestras clínicas del estudio. La segunda fracción corresponde a las proteínas de alta abundancia, y comprende el eluato entre el minuto 12 al minuto 13,5. 2. Elección del pH de las tiras IPG De manera comercial se encuentran disponibles tiras IPG con un rango de pH comprendido entre 4-7 y entre 3-10. Se escogieron las tiras de pH 4-7, ya que al comprender un rango más corto de pH (hay 3 unidades de diferencia entre el pH más alto y más bajo, frente a las 7 que existen en la otra tira y refiriéndose a tiras de la misma longitud), la separación a partir del pI de la proteína tiene una mayor resolución, es decir, la separación discrimina entre proteínas con pI muy similares. Este factor es de alta importancia a la hora de localizar modificaciones post-traduccionales como pueden ser las fosforilaciones, ya que provocan pequeñas diferencias en los pI de la proteína (en el caso de las fosforilaciones, al aumentar el número de las mismas el pI se torna más ácido), manifestándose en forma de spots de idéntica masa molecular pero distinto pI, dando lugar a manchas consecutivas en el eje horizontal a la misma altura en el eje vertical. Una vez optimizados estos dos parámetros (referidos a la fase de fraccionamiento de la muestra y al isoelectroenfoque), se procedió a realizar experimentos que optimizasen los parámetros referidos a los geles, es decir, a la segunda dimensión (SDS-PAGE). Para ello, se trabajó en los siguientes aspectos: el tamaño del gel, el porcentaje de polimeración del gel, las condiciones de electroforésis de las proteínas, la tinción del gel y el secado del gel. 3. Tamaño del gel Partiendo de una muestra de suero de un paciente control, se realizaron geles de distinto tamaño: geles con una longitud de 7cm y geles con una longitud de 17 cm (Figura 10). Para su comparación, fueron realizados en las mismas condiciones: dilución 1:5, 12 % poliacrilamida y tinción Sypro Ruby. Figura 10. Geles correspondientes a la fracción de proteínas de alta abundancia. El rango de pH es de 4-7 y su longitud es de 7cm en el gel de la izquierda y 17 cm en el de la derecha.Tinción Sypro Ruby. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 25 Obsérvese que en el gel de 17 cm (a la derecha en la Figura 10) le falta un fragmento, esto es debido a la facilidad que tiene para romperse en la manipulación del mismo, pero de todas formas, sirve para afirmar que los geles son comparables independientemente del tamaño. Es por ello, que para la futura identificación de proteínas se utilizarán los geles de 17 cm, ya que al ser de mayor tamaño, son más fáciles de aislar los spots. Por otro lado, se realizarán geles de 7 cm para el futuro estudio del perfil metálico de las proteínas, ya que su conservación y transporte es más sencillo, disminuyendo además el área de ablación, ya que este estudio se llevará a cabo con un equipo de LA-ICP-MS. Estos dos geles (Figura 10) sirven también como ejemplo para poner de manifiesto la utilización de un indicador para la segunda dimensión, y es que se impregna un papel adsorbente, que se posiciona en un extremo de la parte superior del gel, con una disolución que contiene proteínas de 25 kDa y 75 kDa, por lo que al aplicar el voltaje necesario para la migración de las proteínas según su masa molecular, estas también migran, visibilizándose por tanto unos spots que son indicativos del posicionamiento de las proteínas según su masa, y por lo tanto son de ayuda a la hora de establecer un eje con los valores numéricos correspondientes a la masa molecular. Estos dos spots indicadores se observan como dos manchas en el extremo izquierdo de los geles, coincidente con 25 kDa y 75 kDa. 4. Porcentaje de polimerización del gel Con la finalidad de optimizar el porcentaje de polimerización del gel, y por lo tanto el tamaño de poro, se realizaron, utilizando suero de un paciente control, geles con un porcentaje de polimerización del 12% de poliacrilamida y del 20 % de policrilamida (Tabla 5). Como resultado, se obtuvieron geles con una mayor resolución al utilizar un porcentaje de polimerización del 12% de poliacrilamida, o lo que es lo mismo, con un mayor tamaño de poro, ya que se observó que había una mayor separación entre los spots, al permitir un mayor avance de las proteínas con menor masa molecular. Tabla 5. Reactivos utilizados para en la polimerización de geles al 12% y al 20% de poliacrilamida. Reactivos Polimerización del 12% Polimerización del 20% H2O 3,3 mL 1 mL 30% acrylmide mix 4,0 mL 10,67 mL 1,5 M Tris (pH 8,8) 2,5 mL 4 mL 10% SDS 0,1 mL 160 µL 10% ammonium persulfate 0,1 mL 160 µL TEMED 0,004 mL 16 µL RESULTADOS Y DISCUSIÓN 26 5. Condiciones nativas y condiciones desnaturalizantes Estudios previos muestran que el enlace metal-proteína se conserva en la mayoría de las proteínas después de una separación por 2D-PAGE [13], siendo uno de los desafíos más importantes cuando se trabaja con especies metálicas el mantener la integridad del enlace metal-proteína [14]. Es por ello que se realizó un experimento para comparar una separación que utilice condiciones nativas (no desnaturalizantes) con las habituales condiciones desnaturalizantes. El factor determinante entre trabajar en condiciones nativas o desnaturalizantes es el uso de dodecilsulfato de sodio (SDS), que es un detergente y desnaturalizante de proteínas, cuya adición interrumpe prácticamente todas las interacciones no covalentes de la molécula, provocando que si un metal está débilmente unido al complejo proteico, este se desvincularía de la proteína, provocando una determinación incorrecta de las metaloproteínas. Para ello, a la hora de realizar este experimento en condiciones nativas (Figura 11) es necesario eliminar el SDS, así como todos los agentes desnaturalizantes, en las fases de resuspensión de proteínas y en el equilibrado de la tira. Además, tampoco se añade SDS cuando se polimerizan los geles (Tabla 5). Figura 11. Geles correspondientes a la fracción de proteínas de baja abundancia (etiquetados como 2/3) y proteínas de alta abundancia (etiquetados como 4). El rango de pH es de 4-7 y su longitud es de 7m. El porcentaje de poliacrilamida es del 12% para los geles de arriba y del 20% para los geles de abajo. Se realizó la tinción de plata. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 27 Como resultado, se comprobó que es más difícil interpretar un gel que haya sido realizado en condiciones nativas, dado que en lugar de obtener spots diferenciados, se obtienen bandas de proteínas, cuyo análisis de imagen es más dificultoso, provocando por tanto que tienda a imposibilitarse la identificación de proteínas por técnicas de análisis de masas. Es por ello, que se optó por realizar los experimentos sucesivos en condiciones desnaturalizantes. 6. Tinciones Se realizaron dos tipos de tinciones en los geles: la tinción Sypro Ruby (Figura 10) y la tinción con nitrato de plata (Figura 11). Dada la compatibilidad de la tinción con nitrato de plata con el LA-ICP-MS que se usará para el estudio del perfil metálico, esta será la tinción que se utilice para el estudio de las metaloproteínas. Por otra parte, la tinción Sypro Ruby es compatible con el uso del equipo MALDI-TOF, por ello, esta será la tinción que se utilice para la identificación de proteínas. 7. Secado Para el futuro estudio de las metaloproteínas séricas, se ablacionarán los geles de 7cm teñidos con nitrato de plata. Estos geles deben de estar perfectamente secos para no causar interferencias en el equipo de ablación láser que será utilizado. Para este propósito, se realizaron pruebas en el secado de los geles, estudiando dos métodos: el secado a temperatura ambiente y el uso de un desecador al vacío a 80ºC. Los mejores resultados se obtuvieron con el uso del desecador, por lo que será el método utilizado cuando se realicen estos geles, que una vez listos podrán ser secados y conservados a baja temperatura hasta su análisis. En el caso de la identificación de proteínas por espectrometría de masas no es necesario el secado de los geles, ya que en este caso se someterá a una digestión tríptica de los spots que, según el análisis de imagen, se consideren significativos. Recapitulando, se estandarizaron las condiciones de separación de proteínas, para su caracterización, llegando a las conclusiones resumidas en la Tabla 6. Tabla 6. Resumen de las condiciones estudiadas de la 2D-PAGE. MALDI-TOF LA-ICP-MS pH de las tiras IPG 4-7 4-7 Tamaño del gel 17 cm 7 cm Porcentaje de poliacrilamida 12% 12% Tipo de electroforesis Desnaturalizante Desnaturalizante Tinción Sypro Ruby Nitrato de plata Secado - Desecador a 80ºC RESULTADOS Y DISCUSIÓN 28 Además, otro aspecto que se estudió fue la resuspensión de las proteínas, en vista a la realización de réplicas, para responder a la pregunta de, si después de congelar la muestra (refiriéndose en este caso como muestra a las proteínas disueltas en el tampón de rehidratación), sería necesario volver a precipitar y resuspender las proteínas, o si se podría realizar la electroforesis tras descongelar la muestra (proteínas + tampón de rehidratación). Tras la realización de los geles, el resultado fue idéntico para ambas condiciones (Figura 12), por lo tanto se podría realizar la separación electroforética tras descongelar la muestra sin la necesidad de volver a precipitar y resuspender las proteínas. Figura 12. Geles correspondientes a la fracción de proteínas de baja abundancia del paciente C66. El rango de pH es de 4-7 y su longitud es de 7cm. Tinción Sypro Ruby. El gel de la izquierda corresponde a las proteínas precipitadas y resuspendidas tras la congelación, mientras que el de la derecha a las proteínas separadas tras la descongelación de la muestra. Una vez tenidas en cuenta las consideraciones anteriores, se procedió a realizar el estudio con las muestras clínicas. Para ello, se realizaron los geles para seis muestras de suero de pacientes control, que no padecen ninguna enfermedad neurodegenerativa, los cuales fueron seleccionados aleatoriamente de un grupo de 66 muestras de pacientes, etiquetando a las muestras como C1, C20, C30, C40, C60 y C66. A continuación, se realizaron los geles para seis muestras de suero de pacientes, proporcionados por el servicio de neurología del CHUS, entre los que se incluyen tres muestras de suero de paciente con deterioro cognitivo que evolucionaría a Alzheimer y tres muestras de suero con pacientes con Alzheimer, etiquetando a las muestras como E1, E2, E3, E4, E5 Y E6. Esta primera fase del estudio pretende que, mediante la separación electroforética, el análisis de imagen y la identificación de proteínas; se pueda distinguir entre los pacientes con deterioro cognitivo que evolucionaría a Alzheimer y los pacientes con Alzheimer, por ello, de manera inicial no existe una correlación entre la muestra y la patología que padece el paciente. Respecto a las muestras de pacientes control, se realizaron con diferentes volúmenes de tampón de rehidratación: RESULTADOS Y DISCUSIÓN 29 C1: 435 µL (300 µL + 125 µL + 10 µL) C20: 735 µL (300 µL + 300 µL + 125 µL + 10 µL) C30: 435 µL (300 µL + 125 µL + 10 µL) C40: 560 µL (300 µL + 125 µL + 125 µL + 10 µL) C60: 435 µL (300 µL + 125 µL + 10 µL) C66: 860 µL (300 µL + 300 µL + 125 µL + 125 µL + 10 µL) Estas diluciones corresponden a diferentes situaciones. En el caso de C1, C30 y C60 el volumen sería el necesario para elaboración de un gel de 17 cm (300 µL) y un gel de 7 cm (125 µL) (Figura 13). Figura 13. Geles correspondientes a la fracción de proteínas de baja abundancia (izquierda) y alta abundancia (derecha) de las muestras C1, C30 y C60. El rango de pH es de 4-7 y su longitud es de 17cm.Tinción Sypro Ruby. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 30 En C40 se ensayó con un volumen que proporcionaría un gel de 17 cm y dos geles de 7 cm (Figura 14). Figura 14. Geles correspondientes a la fracción de proteínas de baja abundancia (izquierda) y alta abundancia (derecha) de la muestra C40. El rango de pH es de 4-7 y su longitud es de 17cm.Tinción Sypro Ruby. Por otro lado, para C20 resultarían en dos geles de 17 cm y un gel de 7 cm (Figura 15), mientras que para C66 resultarían dos geles de 17 cm y dos geles de 7 cm (Figura 16). Figura 15. Geles correspondientes a la fracción de proteínas de baja abundancia (izquierda) y alta abundancia (derecha) de la muestra C20. El rango de pH es de 4-7 y su longitud es de 17cm.Tinción Sypro Ruby. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 31 Figura 16. Geles correspondientes a la fracción de proteínas de baja abundancia (izquierda) y alta abundancia (derecha) de la muestra C66. El rango de pH es de 4-7 y su longitud es de 17cm.Tinción Sypro Ruby. En todos los casos se añadieron 10 µL de tampón de rehidratación extra para la futura realización de la cuantificación de proteínas en la muestra sérica. Como conclusión, se decidió que las sucesivas muestras (muestras de pacientes enfermos) se realizarían utilizando 860 µL de tampón de rehidratación, ya que una mayor dilución conlleva una mayor resolución. Por ejemplo, en las proteínas de baja abundancia disminuye la cantidad de albúmina (que no es deplecionada al 100%). Además se podrían realizar réplicas, en caso de realizar un estudio posterior o si ocurre algún problema en la realización de los geles. Siguiendo estas consideraciones, se realizó la separación de las proteínas de las muestras de pacientes enfermos (Figuras 17 y 18). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 32 Figura 17. Geles correspondientes a la fracción de proteínas de baja abundancia (izquierda) y alta abundancia (derecha) de las muestras E1, E2 y E3. El rango de pH es de 4-7 y su longitud es de 17cm.Tinción Sypro Ruby. BIBLIOGRAFÍA 37 [1] DEMENCIA, O.P.A.S. Una prioridad de salud pública. Washington, DC: Organización Panamericana de la Salud, World Health Organization 112 (2013). [2] Bird TD. Alzheimer disease overview (2015). [3] The Global Impact of Dementia 2013–2050 (Alzheimer’s Disease International, Londres, 2013). [4] Wortmann M. World Alzheimer report 2014: Dementia and risk reduction. Alzheimer's & Dementia: The Journal of the Alzheimer's Association. 11.7 (2015) 837. [5] Kumar V, Cotran RS, Robbins SL. Patología humana. Elsevier Health Sciences. (2008). [6] Tuneu-Valls L, Rojas-Cano M, Sardans-Marquillas M, Paredes-Pérez E, Gaona-Franco A. Guía de seguimiento farmacoterapéutico de los pacientes con Alhzeimer. (2005). [7] Pedrouso-López MD. 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