Desarrollo del análisis de peligros y puntos de control crítico en explotaciones de vacuno lechero en Galicia, estudio epidemiológico de patógenos zoonóticos

UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTADE DE VETERINARIA DE LUGO INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN E ANÁLISES ALIMENTARIAS DESARROLLO DEL ANÁLISIS DE PELIGROS Y PUNTOS DE CONTROL CRÍTICO EN EXPLOTACIONES DE VACUNO LECHERO EN GALICIA: ESTUDIO EPIDEMIOLÓGICO DE PATÓGENOS ZOONÓTICOS María José Vilar Ares UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTADE DE VETERINARIA DE LUGO INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN E ANÁLISES ALIMENTARIAS DESARROLLO DEL ANÁLISIS DE PELIGROS Y PUNTOS DE CONTROL CRÍTICO EN EXPLOTACIONES DE VACUNO LECHERO EN GALICIA: ESTUDIO EPIDEMIOLÓGICO DE PATÓGENOS ZOONÓTICOS Memoria presentada por: María José Vilar Ares Para optar al grado de Doctor en Veterinaria Lugo, Julio de 2007 Eduardo Yus Respaldiza, Profesor Titular del Área de Sanidad Animal de la Facultad de Veterinaria de Lugo, Universidad de Santiago de Compostela. José Luis Rodríguez Otero, Profesor Titular del Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Facultad de Veterinaria de Lugo, Universidad de Santiago de Compostela. INFORMAN: Que la Licenciada en Veterinaria Dña. María José Vilar Ares realizó en el Instituto de Investigación e Análises Alimentarias, Facultad de Veterinaria de la Universidad de Santiago de Compostela, bajo nuestra dirección, el trabajo “Desarrollo del análisis de peligros y puntos de control crítico en explotaciones de vacuno lechero en Galicia: estudio epidemiológico de patógenos zoonóticos”, que presenta para optar al grado de Doctor. Y para que así conste, firmamos el presente informe en Lugo a 2 de Mayo de 2007 Fdo. Eduardo Yus Respaldiza Fdo. José Luis Rodríguez Otero Fdo. María José Vilar Ares AGRADECIMIENTOS Gracias a mis directores de Tesis, al Dr. José Luis Rodríguez Otero y Dr. Eduardo Yus Respaldiza, por su visión crítica de todo el trabajo y sin cuya ayuda, apoyo y esfuerzo no habría logrado realizar este largo proyecto. A Marisa Sanjuán, que en todo momento me animó a seguir adelante y a no abandonar esta segunda carrera. A Javier que también sabe lo que es hacer una Tesis. A Tania, del Aula de Productos Lácteos, y todas las chicas que estuvieron allí, que tanta paciencia demostraron con la llegada, a veces sin previo aviso, de muestras para su análisis. A los veterinarios del Laboratorio de Sanidad y Producción Animal por las numerosas muestras analizadas, y en especial a Carmen Calvo y Santi, por enseñarme lo que es un laboratorio y por explicarme el “increíble y maravilloso mundo de la PCR”. A Fco. Javier Ga Peña, por analizar tantas y tantas muestras como le envíe, así como por ayudarme con la explicación de los temas de laboratorio. A la empresa Puleva Food, S.L. por colaborar con nosotros en la elaboración de todo el trabajo y en particular a Gonzalo Fuentes, pues con él todas las visitas a granjas fueron más interesantes, formativas y amenas. A Jose A. Glez da Silva, Amparo Seijas y Elena Soto y en general a la empresa Lactalis, por ayudarnos a dar los primeros pasos en el tema del APPCC. A todos los ganaderos que durante la realización de los estudios hicieron un hueco en su agenda para atenderme, e invitarme a algún que otro café. A Gonzalo Fernández y Azucena Mora que siempre estuvieron cuando necesite su ayuda. A los compañeros que pasaron por la Unidad, Paloma, Miguel, Mari y Carolina, que hicieron las mañanas mucho más amenas. A Mª Eugenia que me ayudó con los temas en inglés y a Nacho por preparar el ordenador para la realización de los trabajos elaborados durante todo este tiempo. A mis amigos que aún siguen ahí, a pesar de estar casi ilocalizable durante estos últimos años. Y como no, a mi familia, padres y hermanas, por todo el cariño y apoyo recibido desde que decidí venir a Lugo. Los trabajos de esta Tesis han podido realizarse gracias al proyecto con Código PGIDIT03RAG26103PR de la Xunta de Galicia. INDICE Capítulo 1 Introducción general ………………………………………………………………… 1 1. Sistema de análisis de peligros y puntos de control crítico . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2. ATP bioluminiscencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 3. Infecciones por Listeria spp. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 4. Infecciones por Campylobacter spp. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 5. Infecciones por Arcobacter spp. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 6. Región geográfica donde se realizaron los trabajos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 7. Perfil de la Tesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 8. Referencias bibliográficas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 Capítulo 2 Desarrollo de un sistema de análisis de peligros y puntos de control crítico en explotaciones de ganado vacuno lechero ………………………………………..…… 49 Capítulo 3 Aplicación del ATP bioluminiscencia para determinar la limpieza del equipo de ordeño en explotaciones de ganado vacuno ………………………………….………………..… 81 Capítulo 4 Prevalencia y factores de riesgo asociados a Listeria spp. en granjas de vacuno lechero en Galicia …………………...……………………………………............................…… 95 Capítulo 5 Distribución de Arcobacter spp. en heces de ganado vacuno lechero clínicamente sano en Galicia ……………………………………………………………………...……..…. 113 Capítulo 6 Prevalencia de Campylobacter spp. en explotaciones de ganado vacuno lechero en Galicia ……………….……………………………………………...…………………..……. 127 Capítulo 7 Discusión general …………….…………………………………………..………..… 137 Capítulo 8 Conclusiones ……………………………………………………………………….... 147 Capítulo 9 Resumen ………………………………………………………………………....…... 151 Capítulo 10 Summary …………………………………………………………………………….. 155 __________________________________________________________________Introducción general 5 1. Creación de un equipo de trabajo Será multidisciplinar e incluirá al personal representativo de las distintas áreas implicadas en el proceso de producción, aunque puede ser necesario el consejo de expertos externos en determinados aspectos. El número adecuado de personas oscila entre 4 y 6 (Noordhuizen y Welpelo, 1996; Mortimore y Wallace, 2001). Es fundamental que todo el personal conozca el sistema, los beneficios que aporta y los recursos necesarios (Mortimore y Wallace, 2001). Las funciones de cada uno de los miembros estarán bien definidas (FAO, 1998) y las primeras tareas del equipo serán limitar la extensión del estudio para que sea manejable e identificar los peligros a controlar en cada fase de la cadena de producción (Van Schothorst, 2004). 2. Descripción del producto Se realiza una descripción completa del producto: ingredientes y materias primas, propiedades químicas y físicas y características del procesado (FAO, 1998). Una vez el producto esté terminado, la etiqueta debe indicar la información de su elaboración, envasado y almacenamiento, con las instrucciones y requisitos legislativos (Pierson y Corlett, 1992; Cullor, 1995b). 3. Identificación de la intención de uso Se describe el uso esperado que le dará el consumidor al producto y se tendrá en cuenta a la población a la que va destinado, es decir, se indica el mercado al que va dirigido el producto (Noordhuizen y Welpelo, 1996). 4. Construcción de un diagrama de flujo Es la descripción o imagen esquemática del proceso de producción que sirve como guía (Van Schothorst, 2004). Se desarrollará a nivel sectorial y de manera individual, incluyendo toda la información complementaria que sea relevante, pero procurando no sobrecargarlo (Ropkins y Beck, 2002; Escriche y Doménech, 2004). La realización de este diagrama simplifica la gestión y comprensión del procedimiento del APPCC (Ropkins y Beck, 2002). Se elabora tras las entrevistas con el personal y la Capítulo 1 ___________________________________________________________________________ 6 observación de las distintas operaciones para obtener el producto, pudiendo apoyarse en los planos de las instalaciones. Se puede utilizar en su elaboración un modelo como guía del diagrama (FAO, 1998). 5. Verificación “in situ” del diagrama de flujo Esta verificación es una primera revisión de los peligros. El equipo de trabajo debe comprobar el diagrama mediante la observación de todas las etapas de producción para realizar modificaciones cuando sea necesario (Pierson y Corlett, 1992). 6. Principio 1: Analizar los peligros Se establecen los peligros en cada fase del proceso, clasificándose en cuanto a la gravedad de los efectos adversos producidos y la probabilidad de aparición. Con la ayuda del diagrama de flujo se pueden identificar todos los peligros potenciales en cada una de las etapas cuya prevención, eliminación o reducción a niveles aceptables sea esencial para la producción de alimentos seguros (Noordhuizen y col., 1997). Se considera peligro cualquier agente presente en un alimento capaz de provocar un efecto adverso en la salud del consumidor como consecuencia de su ingestión (Mortimore y Wallace, 2001). La FAO define el peligro como “cualquier agente biológico, físico o químico que puede hacer que un alimento no sea seguro para el consumo” (FAO, 1998). Específicamente se definen los peligros físicos como partículas o materiales extraños, como restos del material de envasado, que pueden estar presentes de manera anormal en el alimento y ser portadores de peligros microbiológicos (Escriche y Doménech, 2004). Los peligros químicos son sustancias potencialmente tóxicas que pueden provocar la muerte, intoxicaciones crónicas de tipo acumulativo o cancerígeno o reacciones alérgicas. Se clasifican en (Mortimore y Wallace, 2001): - productos químicos naturales como las micotoxinas y los alérgenos - productos químicos añadidos como los plaguicidas, los productos de limpieza y los residuos de medicamentos - productos químicos provenientes del material de envasado como el plomo __________________________________________________________________Introducción general 7 Los peligros biológicos pueden provocar dos consecuencias graves como son la transmisión de enfermedades y la alteración de la calidad del producto terminado mediante la modificación de las características organolépticas (Escriche y Doménech, 2004). Se distinguen peligros macrobiológicos (moscas o insectos) y peligros microbiológicos (bacterias, virus, parásitos y mohos productores de micotoxinas) (Mortimore y Wallace, 2001; Escriche y Doménech, 2004). Hacen referencia, sobre todo, a las enfermedades de origen alimentario asociadas a productos crudos contaminados, ya que la mayoría de los microorganismos se destruyen o inactivan tras un tratamiento térmico o se minimizan mediante un manejo y almacenamiento adecuado del alimento (FAO, 1998). El riesgo es una estimación de la probabilidad de aparición y gravedad de un peligro (Pierson y Corlett, 1992). El análisis de riesgos o peligros consiste en tres pasos: a) Evaluación de riesgos o peligros Se refiere a la identificación y cuantificación de los riesgos y se divide en tres pasos interrelacionados entre sí: i) identificación de todos los peligros que puedan estar asociados al producto, ii) caracterización del peligro mediante una evaluación cuantitativa y/o cualitativa de la gravedad de los efectos adversos relacionados, iii) evaluación cuantitativa y/o cualitativa de la probabilidad de aparición del peligro (FAO, 1998; Hulebak y Schlosser, 2002). Tanto la gravedad como la probabilidad de un peligro pueden ser categorizadas como alto, medio y bajo o nulo. En muchos casos no hay datos suficientes para realizar una evaluación cuantitativa de los riesgos asociados a peligros biológicos, por lo que la única alternativa es la evaluación cualitativa (FAO, 1998). b) Gestión de riesgos o peligros Uno de los puntos más importantes del sistema APPCC es establecer las medidas preventivas o de control, una vez identificados los peligros (Noordhuizen y Welpelo, 1996; Mortimore y Wallace, 2001). Las medidas de control son factores o actividades que se utilizan para prevenir, eliminar o reducir un peligro hasta un nivel aceptable (FAO, 1998). Cuando no existen mecanismos por los que un peligro pueda ser controlado en todo el proceso y el riesgo asociado a él sea inaceptable, el método de producción debería modificarse (Ropkins y Beck, 2002). Capítulo 1 ___________________________________________________________________________ 8 c) Comunicación de riesgos o peligros Es un proceso interactivo de intercambio de información entre el personal implicado en el análisis y terceras partes interesadas (FAO, 1998). El análisis de peligros implica realizar un estudio de las condiciones de producción, manejo, almacenamiento, envasado, distribución y consumo de un alimento y permite identificar aquellas áreas que pueden contribuir a la aparición de un peligro, determinándose así los puntos de control crítico (PCCs) (Pierson y Corlett, 1992). La identificación de los peligros varía en función del tipo de industria y del producto final; por ejemplo, en una fábrica de conservas se considera peligro biológico la presencia de toxina botulínica, mientras que en una industria cárnica un peligro es la contaminación con microorganismos saprofitos intestinales (Mouwen y Prieto, 1998). 7. Principio 2: Determinar los puntos de control crítico Un PCC es cualquier punto, etapa o proceso en la cadena alimentaria donde mediante la aplicación de una serie de medidas el peligro puede ser evitado, eliminado o reducido a un nivel aceptable. La pérdida de control de un PCC podría conducir a un riesgo inaceptable de seguridad alimentaria (Noordhuizen y col., 1997; Cullor, 1997b; Hulebak y Schlosser, 2002). Las características idóneas de un PCC son (Pierson y Corlett, 1992): - estar relacionados con el peligro - ser específicos, cuantificables o su valoración debe ser si/no - los criterios para establecerlos se basan en la literatura científica - estar disponible la tecnología para controlarlos y a coste bajo - la monitorización es continua - al controlarlos se eliminan o reducen los peligros potenciales Los PCCs se eligen en función de los factores de riesgo o peligros identificados (Noordhuizen y col., 1997), pudiendo haber más de un PCC para un peligro. Todos los PCCs deben estar interconectados a través del sistema de monitorización y vigilancia (Noordhuizen y Frankena, 1999). __________________________________________________________________Introducción general 9 Una operación controlada con un número excesivo de PCCs puede hacer que la aplicación del sistema sea difícil de implementar, monitorizar y documentar (Panisello y col., 2000). Por ello, se utiliza un árbol de decisiones que consiste en una serie lógica de preguntas que se responden para cada peligro identificado en cada etapa en la que pueda aparecer. El objetivo es seleccionar los PCCs imprescindibles para hacer el sistema compatible con los recursos humanos y económicos disponibles (Pierson y Corlett, 1992; Escriche y Doménech, 2004). Si el sistema APPCC sugiere que en cierta etapa no es posible controlar el peligro y éste no se elimina o reduce a un nivel aceptable en un paso posterior, el proceso debería modificarse eliminando esta etapa o incluyendo una medida de control anterior o posterior (Van Schothorst, 2004). 8. Principio 3: Establecer los límites críticos Representan el límite de seguridad, es decir, son el criterio que debe cumplir cada PCC para obtener alimentos seguros. Puede haber más de un parámetro de evaluación por cada PCC identificado (FAO, 1998). Estos límites críticos son los niveles de tolerancia y objetivo. El nivel objetivo es más estricto y se utiliza para reducir el riesgo de desviación cuando existe una tendencia hacia la pérdida de control en el PCC, asegurando que nunca suceda una alteración con respecto al límite crítico de tolerancia (Noordhuizen y Welpelo, 1996; Hulebak y Schlosser, 2002). Los límites críticos se basan en los textos o normas legales y/o en el conocimiento científico relacionado con el tipo de peligro a controlar. Pueden ser químicos (niveles de micotoxinas, pH), físicos (temperatura del tanque refrigeración) o microbiológicos (ausencia de Listeria monocytogenes) (Mortimore y Wallace, 2001; Escriche y Doménech, 2004). 9. Principio 4: Establecer un sistema de monitorización para controlar los PCCs Consiste en programar una serie de medidas, pruebas y observaciones en un PCC que demuestren que está bajo control, es decir, dentro de los límites críticos. El sistema debe proporcionar un aviso de alarma precoz que ayude a prevenir o minimizar la alteración del Capítulo 1 ___________________________________________________________________________ 10 producto cuando hay desviaciones e indique la causa del problema (Hogue y col., 1998; Van Schothorst, 2004). Las acciones de monitorización deben ser rápidas y específicas de cada PCC, depender de los límites críticos y su objetivo será garantizar que cada PCC esté siempre bajo control (Pierson y Corlett, 1992). La monitorización puede realizarse de manera continua o discontinua, con periodicidad suficiente para garantizar el control del PCC (Mortimore y Wallace, 2001). 10. Principio 5: Establecer las acciones correctoras Estas acciones deben eliminar el peligro potencial creado por una desviación del límite crítico en un PCC determinado (Hogue y col., 1998; Ropkins y Beck, 2002) para garantizar la seguridad del producto final y prevenir otra posible desviación (Van Schothorst, 2004). La diversidad de posibles desviaciones en cada PCC puede hacer necesario la existencia de más de una medida correctora (FAO, 1998). 11. Principio 6: Establecer la documentación y los registros de los principios y su aplicación La documentación supone una prueba escrita del desarrollo de todas las actividades que permite un seguimiento retrospectivo y posibilita la verificación del sistema. Los registros son la única referencia disponible que asegura la trazabilidad del producto. La documentación contendrá las actas de las reuniones del equipo, el diagrama de flujo y los registros de la identificación de peligros, las medidas preventivas, la vigilancia de los PCCs, etc. (Pierson y Corlett, 1992; Cullor, 1995b; Escriche y Doménech, 2004). 12. Principio 7: Establecer verificaciones para confirmar que el sistema funciona correctamente La verificación proporciona información adicional para garantizar que la aplicación del sistema APPCC conlleva la producción de alimentos seguros (Van Schothorst, 2004). La realización de verificaciones periódicas mejora el plan establecido al trabajar sobre los puntos débiles y eliminar las medidas innecesarias (FAO, 1998). Se pueden identificar varios pasos en el proceso de verificación: i) revisar que los límites críticos de los PCCs son adecuados y suficientes, ii) verificar los registros para garantizar que el plan APPCC __________________________________________________________________Introducción general 11 funciona correctamente, iii) realizar una inspección de todo el proceso y un informe por escrito (Mortimore y Wallace, 2001; Hulebak y Schlosser, 2002). Generalmente la verificación de un sistema se realiza mediante una auditoria interna o externa. La auditoria es un examen sistemático e independiente para determinar si las actividades y los resultados obtenidos cumplen con los procedimientos establecidos, son adecuados para alcanzar los objetivos fijados y si se implementan correctamente (Couto y Factor, 2000). La certificación es una forma específica de verificación, normalmente realizada por una tercera parte independiente, cuyo objetivo es comprobar si el sistema APPCC se realiza según el estándar. No está entre sus funciones emitir un juicio sobre la seguridad del producto (Van Schothorst, 2004). Debe revisarse la aplicación del sistema APPCC y hacer los cambios necesarios cuando se producen modificaciones en el producto o en el proceso (FAO, 1998). 2. ATP BIOLUMINISCENCIA Fundamento La quimioluminiscencia se produce cuando una molécula emite un fotón como resultado de una reacción química exogénica en la que uno de los productos intermedios o finales queda en un estado electrónico excitado. Cuando el producto excitado transfiere su energía a otra sustancia con características adecuadas de fluorescencia se produce la luminiscencia (Gorus y Schram, 1979). La bioluminiscencia es un caso especial de quimioluminiscencia, propuesta en 1960 como una técnica para estimar la actividad microbiana en los procesos biológicos (Chu y col., 2000). Por otra parte, todos los microorganismos vivos se pueden detectar midiendo su energía celular que se encuentra en forma de adenosin trifosfato (ATP). El ATP no está asociado a células muertas, ni es absorbido por superficies o coloides, por lo que existe una Capítulo 1 ___________________________________________________________________________ 12 proporción constante entre la concentración de ATP y el número de células o bacterias viables. Por lo tanto, la determinación de la cantidad de ATP es una estimación fiable de los microorganismos metabólicamente activos presentes, ya que la concentración de ATP de una célula viva permanece relativamente constante, pudiendo variar ligeramente según las condiciones ambientales y la fase de crecimiento (Lai-King y col., 1985; Griffiths, 1993; Corbitt y col., 2000; Venkateswaran y col., 2003). La cantidad de ATP se mide mediante la bioluminiscencia generada en una reacción estequiométrica: Esta reacción se produce cuando una forma reducida de luciferina (fenol heterocíclico termoestable) junto con una molécula de ATP en presencia de luciferasa (enzima termoestable) se libera como oxiluciferina, es decir, se produce una descarboxilación oxidativa de la luciferina y la liberación de fotones. Por cada molécula de ATP consumida se produce un fotón (Green y col., 1999; Puig-Durán, 2002; Delahaye y col., 2003). El complejo enzimático luciferina-luciferasa que es específico para la medición de ATP se detectó por primera vez de manera natural en la cola de la luciérnaga Photinus pyralis (Aycicek y col., 2006). Cuando la reacción de la bioluminiscencia se realiza en condiciones óptimas, la señal lumínica resultado del balance entre reducción y oxidación es estable durante horas; no obstante, en condiciones de campo la emisión de luz será menor porque depende de la demanda de oxígeno activo (Champiat y col., 2001). La luz producida en la bioluminiscencia se mide en un tubo detector multiplicador y se expresa en unidades relativas de luz (URL) cuantificadas mediante un fotómetro o luminímetro (Gorus y Schram, 1979; Murphy y col., 1998; Champiat y col., 2001). ATP + luciferina luciferina + AMP + PPi (luciferasa / Mg2+) oxiluciferina + AMP + luz CO2O2 __________________________________________________________________Introducción general 13 Con la ATP bioluminiscencia se han logrado límites de detección de 10-5 µg/l ó µg/kg de ATP en la muestra (Puig-Durán, 2002). Usando tests con soluciones estándar de ATP, 1 µg/l de ATP debería producir una intensidad de luz de 1036 URLs (Chu y col., 2000). Utilidades En la implementación de programas de APPCC, la ATP bioluminiscencia ha sido utilizada en la rápida detección de microorganismos vivos y su monitorización y, en general, en la valoración de la contaminación (Champiat y col., 2001). Monitorización de la higiene La higiene de las superficies, instrumentos y equipos en la industria alimentaria afecta a la calidad de los productos procesados, siendo las biopelículas uno de los principales problemas en la higienización de los equipos como consecuencia de la liberación de las bacterias que pueden contener (Oulahal-Lagsir y col., 2000). La ATP bioluminiscencia es un sistema rápido de monitorización de la higiene. Se ha demostrado su utilidad en superficies y equipos de la industria alimentaria, al detectar contaminación de origen microbiano y de origen orgánico. La monitorización de la higiene es probablemente el uso de esta técnica más frecuente en la industria alimentaria; así, las superficies de plantas de procesado, de vehículos para el transporte y de equipos de ordeño en las granjas lecheras han sido evaluadas (Murphy y col., 1998; Oulahal-Lagsir y col., 2000). Las superficies que presentan lecturas bajas de ATP implican ausencia de contaminación, pero si son altas sólo indicaran presencia de ATP, que puede proceder de microorganismos vivos o de otras fuentes orgánicas (Poulis y col., 1993). Una superficie de contacto con alimentos limpia estará libre de ATP (Nieuwenhof, 1996), ya que la mayoría de los productos desinfectantes inhiben la actividad metabólica y alteran la membrana celular, disminuyendo la emisión de luz (Puig-Durán, 2002). Los resultados de las lecturas pueden verse influenciados por factores ambientales tales como el pH, la temperatura, la concentración iónica, los restos de detergentes y Capítulo 1 ___________________________________________________________________________ 14 desinfectantes que alteran a los componentes implicados en la reacción, provocando una disminución de la cantidad de luz emitida (Nieuwenhof, 1996; Green y col., 1999; Venkateswaran y col., 2003). Los valores obtenidos con la medición del ATP y el uso de los cultivos microbiológicos son compatibles; sin embargo, es difícil establecer una relación entre la microbiología tradicional y la medición del ATP, puesto que las técnicas miden poblaciones microbianas diferentes. Cuando el ATP total es bajo, la microbiología tradicional es más sensible; por ejemplo, si hay esporas el contenido de ATP será menor que si hay formas vegetativas. A pesar de esto, la bioluminiscencia es capaz de detectar bajos niveles de microorganismos. La medición de valores altos de ATP no implica necesariamente presencia de bacterias (Poulis y col., 1993; Davidson, y col., 1999; Chu y col., 2000). En función del ratio ATP/ufc se pueden establecer hipótesis sobre el tipo y actividad de los microorganismos que están presentes. Si la relación es baja, puede deberse a la presencia de bacterias Gram negativas o formas de resistencia bacteriana (esporas). Si la relación es alta podría tratarse de levaduras o bacterias Gram positivas, con una actividad metabólica elevada (Venkateswaran y col., 2003). Por lo tanto, la utilización de la ATP bioluminiscencia como método de evaluar los equipos de la industria alimentaria no sustituye la cuantificación de la carga microbiana por los métodos tradicionales (Aycicek y col., 2006). Otras utilidades 1. Evaluación de la calidad microbiológica de la leche cruda y pasteurizada. Se han desarrollado diferentes métodos basados en la ATP bioluminiscencia para estimar la carga bacteriana en la leche; sin embargo, muchos carecen de la sensibilidad suficiente como consecuencia de las altas concentraciones de ATP no bacteriano presente (asociado a las micelas de caseína o en las células somáticas) (Brovko y col., 1991; Samkutty y col., 2001). La concentración bacteriana mínima capaz de detectarse es 106 unidades formadoras de colonia por mililitro (ufc/ml) (Griffiths, 1993). Diversas investigaciones han estudiado el modo de mejorar la sensibilidad, incorporando un paso de filtración u otros procedimientos para concentrar las bacterias, junto con una lisis selectiva de las __________________________________________________________________Introducción general 21 Una de las causas para sufrir listeriosis es la proliferación ilimitada de L. monocytogenes en individuos inmunocomprometidos. La exposición reiterada frente a L. innocua puede también estimular una inmunidad frente a diferentes especies patógenas de listeria (Instituto de Salud Carlos III, 1998; Vázquez-Boland y col., 2001). L. monocytogenes es un patógeno que puede afectar a un gran número de tejidos y órganos; sin embargo, las principales formas clínicas de listeriosis tienen como órganos diana el sistema nervioso central y el útero grávido, a los que llegan vía sanguínea (Vázquez-Boland y col., 2001; McLauchlin y col., 2004). L. monocytogenes sintetiza una β-hemolisina, la listeriolisina O como principal factor de virulencia y mediador de la supervivencia intracelular que está presente en todas las formas patógenas (Bunning y col., 1992; Bourry y Poutrel, 1996). Formas clínicas Además de los síntomas generales como depresión, fiebre, debilidad e incluso mamitis en vacuno, clínica o subclínica, las tres principales formas clínicas asociadas a L. monocytogenes tanto en personas como en animales son (Blenden y col., 1987; Contreras y col., 1997; Low y Donachie, 1997): - forma nerviosa, también llamada “enfermedad del círculo” que afecta sobre todo a rumiantes y aparece con relativa frecuencia en rebaños de ovino y caprino - forma reproductiva, detectada principalmente en rumiantes, pero también en muchas otras especies de animales domésticos, provocando abortos, partos prematuros, etc. - forma visceral o septicémica que es poco común y si aparece afecta a los neonatos como consecuencia de una infección intrauterina Diagnóstico La confirmación del diagnóstico se realiza mediante el aislamiento y posterior identificación de Listeria spp. a partir de los órganos afectados (Blenden y col., 1987). Capítulo 1 ___________________________________________________________________________ 22 Según la norma de la International Dairy Federation (IDF) 143A:1995 para la detección de Listeria spp. se deben seguir al menos tres pasos: i) enriquecimiento en un medio líquido selectivo, ii) aislamiento e identificación presuntiva, iii) confirmación de la identidad (IDF, 1995). En el método clásico de identificación se utilizan galerías API junto con el test CAMP para distinguir entre las especies de listeria (Amaro, 2002). Existen numerosos métodos para identificar Listeria spp. (Bourry y Poutrel, 1996; Low y Donachie, 1997) basados en: - inmunoensayos: ensayo inmunoenzimático (ELISA) aplicable en alimentos y en detección de mamitis bovinas, técnicas de serodiagnóstico como el “dot-blot” y la fijación de complemento - pruebas de ADN: la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la electroforesis en gel de campo pulsante en productos lácteos - métodos bioquímicos y otros Tratamiento L. monocytogenes es susceptible a la mayoría de los agentes antibacterianos, aunque puede presentar problemas por su localización intracelular. En muchos casos el antibiótico de elección es la ampicilina (Ryser y Marth, 1991). Puede ocurrir una recuperación espontánea de la enfermedad en ganado vacuno; sin embargo, en ovejas y cabras después de la aparición de los primeros síntomas el tratamiento suele ser ineficaz (Ryser y Marth, 1991; Cooper y Walker, 1998). En vacas con mamitis, la terapia de secado podría eliminar la listeria o reducir la posibilidad de que colonice de forma generalizada la ubre. Los animales que puedan ser portadores crónicos es mejor eliminarlos (Sharp, 1989). En personas es posible una recuperación espontánea, aunque es mejor aplicar una terapia antibiótica de manera precoz (Low y Donachie, 1997). __________________________________________________________________Introducción general 23 Prevención y control Un método para disminuir la incidencia de la listeriosis, en humanos y en animales, es reducir el número de microorganismos presentes en los alimentos; no obstante, la eliminación total de L. monocytogenes de todos los alimentos puede resultar imposible (Bell y Kyriakides, 2000). Se deben aplicar las medidas higiénicas y sanitarias adecuadas para evitar que Listeria spp. entre en la cadena alimentaria. Para ello hay que reducir la incidencia de listerias en las unidades de producción animal, con unas buenas prácticas de manejo, realizando un ordeño higiénico y limpiando adecuadamente la sala y el equipo de ordeño, usando piensos y ensilados de buena calidad, etc. El control de la calidad del ensilado es uno de los puntos más importantes, debiéndose realizar un buen corte, prensado y sellado y evitar la humedad. Se usará materia prima libre de Listeria spp. y cuando se abran los silos, se medirá el pH y chequeará la presencia de mohos. Tampoco se debe usar el ensilado de los bordes, ni de la parte superior, porque en estos puntos la fermentación es menor (Low y Donachie, 1997; Bastien y Brouillet, 2000). Otra recomendación sería aislar y tratar a los animales enfermos que sufren listeriosis de forma crónica. Después de un brote se deben destruir los cadáveres, el ensilado y el material en contacto con los enfermos y los alojamientos se limpiaran y desinfectaran (Contreras y col., 1997). Las vacunas con listerias muertas no son eficaces y las elaboradas con listerias vivas o atenuadas, basadas en los serovares 1/2a y 4b de L. monocytogenes, no presentan un modelo experimental para probar su eficacia. La vacunación sólo se debe utilizar en aquellos casos donde se presente una alta incidencia de listeriosis clínica para intentar disminuir la prevalencia de la infección y también en rebaños que hayan manifestado la infección de manera recurrente (Ryser y Marth, 1991). Capítulo 1 ___________________________________________________________________________ 24 Aspectos zoonóticos En la década de los 80, se reconoció a la listeriosis como una enfermedad de origen alimentario según la Organización Mundial de la Salud (OMS, 2002). L. monocytogenes es responsable del 99% de las listeriosis en personas, siendo los serogrupos 1/2a, 1/2b o 4b los que aparecen en la mayoría de los brotes, aunque no son los que con más frecuencia se encuentran en los alimentos (Hahn, 1996; Wiedmann, 2003). En los países desarrollados entre 2 y 15 personas por cada millón sufren listeriosis clínica, así se considera que la incidencia de listeriosis es relativamente baja (Pak y col., 2002). Ello es debido a que L. monocytogenes tiene un potencial patógeno más bajo que otras bacterias zoonóticas, considerando su amplia distribución y la alta frecuencia de contaminación de los alimentos. La incidencia de listeriosis en humanos es baja, salvo la aparición ocasional de brotes. Otros estudios indican que es una bacteria no adaptada al hombre que actúa como patógeno oportunista (Vázquez-Boland y col., 2001; McLauchlin y col., 2004). Las principales formas de contagio son la vía oral, la vía respiratoria y la vía cutánea que causa pústulas o pápulas en brazos de veterinarios, ganaderos y trabajadores de laboratorio. Las personas pueden entrar en contacto con el microorganismo a través del consumo de diversos tipos de alimentos contaminados y mediante el contacto con plantas, insectos, aire, arena u otros hombres (infecciones nosocomiales) (Vázquez-Boland y col., 1996; Low y Donachie, 1997). L. monocytogenes se ha aislado en numerosos tipos de alimentos crudos o cocinados, contaminados posteriormente al tratamiento térmico: leche cruda y pasterizada, quesos, helados, verduras, embutidos crudos o fermentados, pollo, pescado, etc. (McLauchlin y col., 2004). Los brotes más importantes de listeriosis en humanos estuvieron relacionados con el consumo de: 1. Vegetales: en 1981 en Canadá hubo 18 muertos por consumo de ensalada de coles (Blenden y col., 1987; Wesley y Ashton, 1991). __________________________________________________________________Introducción general 25 2. Productos lácteos: en 1983, 14 muertos por consumo de leche pasteurizada en Massachusetts. En 1985, en California, 42 personas por consumo de queso fresco estilo mejicano (Blenden y col., 1987; Wesley y Ashton, 1991). Durante 1989, en USA se declararon 49 casos por consumo de leche pasteurizada. Entre 1983 y 1987 en Suiza, hubo 32 muertos por consumo del queso Vacherin (Hahn, 1996; Amaro, 2002). 3. Productos cárnicos: en Francia, en 1992, hubo 63 muertos, por consumir lengua de cerdo con gelatina. En el Reino Unido, entre 1987 y 1989, el consumo de paté belga causó más 90 muertos (Amaro, 2002). La incidencia de listeriosis en humanos en Europa fue máxima en los años 80 (Amaro, 2002) debido, entre otras causas al aumento del consumo de productos preparados y conservados en refrigeración, al aumento de la población susceptible y al aumento en la vigilancia y mejora del diagnóstico (Brisabois y col., 1997). En España existe una Red de Vigilancia Epidemiológica que registra los casos declarados por el Sistema de Información Microbiológico. Este sistema notificó 208 casos de listeriosis entre los años 1988 y 1998 (Instituto de Salud Carlos III, 1998). En general la listeriosis en humanos se produce de forma esporádica, siendo considerados como grupos de riesgo los recién nacidos, las mujeres embarazadas, las personas mayores y las inmunodeprimidas. En estos grupos de riesgo, la listeriosis puede causar una mortalidad entre un 30% y un 40% (Donelly, 1990; Vázquez-Boland y col., 1996). 4. INFECCIONES POR CAMPYLOBACTER SPP. Aspectos históricos En 1909 a partir de abortos de ovejas, se aisló una bacteria parecida a los vibrios. En 1919, Smith aisló el microorganismo de fetos de abortos bovinos y lo asignó al género Vibrio por su apariencia espiral. En 1946, Levy relacionó algunas infecciones gastrointestinales humanas con estas especies, sin embargo, el primer caso de campilobacteriosis en personas se describió en 1938. En 1963, Sebald y Veron designaron un nuevo género Capítulo 1 ___________________________________________________________________________ 26 denominado Campylobacter (significa “bacilo curvado”) ya que demostraron que V. fetus, V. jejuni y V. coli se distinguen de los vibrios por la composición de bases de ADN (Alonso, 2002; Quinn y col., 2004; Moore y col., 2005). Etiología En la familia Campylobacteraceae se incluyen 16 especies y 8 subespecies del género Campylobacter. Entre las especies de Campylobacter se encuentran: C. fetus (C. fetus subespecie fetus y C. fetus subespecie venerealis), C. coli, C. hyointestinalis (C. hyointestinalis subespecie hyointestinalis y C. hyointestinalis subespecie lawsonii), C. jejuni (C. jejuni subespecie jejuni y C. jejuni subespecie doylei), C. lari, C. sputorum (C. sputorum subespecie bubulus y C. sputorum subespecie fecalis) y C. upsaliensis (Quinn y col., 2004; Glenn y Post, 2005). Hay especies no patógenas, saprofitas en el ambiente (Quinn y col., 2004). Las especies termófilas se denominan así por su capacidad para crecer a altas temperaturas y su incapacidad para hacerlo a temperaturas inferiores a 30ºC y entre ellas se encuentran C. jejuni subespecie jejuni, C. coli y C. lari entre otras (Altekruse y col., 1998; Quinn y col., 2004). Campylobacter spp. son bacilos Gram negativos que miden 0,2 a 0,9 µm × 0,5 a 5 µm y que cuando se dividen permanecen unidos, con forma de gaviota, de S y a veces largas espirales. No forman esporas. Los movimientos en sacacorchos son típicos, debido a los flagelos polares. Son bioquímicamente casi inertes, no fermentadores, oxidasa positivos y de reacciones variables a la catalasa (Nachamkin, 1995; Quinn y col., 2004). Son bacterias microaerofilas, aunque algunas especies pueden crecer en condiciones de aerobiosis o anaerobiosis (Alonso, 2002; Quinn y col., 2004). Las colonias de Campylobacter normalmente son grises, redondas, ligeramente elevadas, lisas y traslúcidas (Nachamkin, 1995). Crecen mejor en medios nutritivos suplementados con sangre, aunque la mayoría de las especies crecen en agar MacConkey (Quinn y col., 2004). __________________________________________________________________Introducción general 27 No utilizan carbohidratos y la energía se produce por el metabolismo de los animoácidos o de los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Alonso, 2002). Epidemiología Campylobacter spp. tiene distribución mundial. Algunos datos al respecto se indican en el capítulo 6 de esta Tesis. La mayoría de las especies de este género, especialmente las especies termófilas, son hospedadores naturales de aves, al ser su temperatura corporal de 42ºC, óptima para el crecimiento de C. jejuni. Tanto las personas como los animales domésticos y silvestres pueden actuar como portadores asintomáticos de esta bacteria, ya que las condiciones de microaerofilia y las altas temperaturas de su tracto intestinal constituyen un hábitat idóneo para su crecimiento (Stanley y col., 1998b; Alonso, 2002), de este modo, Campylobacter spp. se ha aislado de las heces de vacas, ovejas, cerdos, pollos, patos y aves silvestres (Rosef y col., 1983). La excreción de Campylobacter spp. en ganado bovino es intermitente, con picos de eliminación en primavera y otoño. Este hecho puede deberse a factores ambientales como la temperatura que influye sobre la presencia de aves migratorias, roedores e insectos, en los cambios de alimentación o agua de bebida. También pueden influir los cambios hormonales durante el parto y el ordeño o los factores que provocan estrés (Stanley y col., 1998b; Louis y col., 2005). La resistencia de las especies de Campylobacter termófilas y microaerofilas a los factores físicos es relativamente baja, siendo sensibles al oxígeno atmosférico, al pH ≤ 5, a la radiación gamma, a la salinidad, a los desinfectantes como los amonios cuaternarios, formaldehídos, etc. y a la sequía (Altekruse y col., 1998). Pueden permanecer viables durante más de 3, 4 y 5 semanas en heces, agua y en orina, respectivamente, a 4ºC (Busato y col., 1999; Stanley y Jones, 2003). Las botas de los ganaderos son un vehículo de transmisión y mantenimiento de Campylobacter spp. en las granjas. Los purines de los animales en los pasillos, patios de Capítulo 1 ___________________________________________________________________________ 28 recreo y pastos pueden ser fuente de contagio para posibles vectores de este patógeno como las aves silvestres y las moscas (Moore y col., 2005). La contaminación del agua por heces juega un papel importante en el ciclo biológico de Campylobacter spp. en explotaciones ganaderas; así, los animales con acceso a aguas no cloradas excretan más microorganismos que los que beben aguas cloradas. A pesar de esto, su aislamiento de fuentes acuáticas es poco frecuente (Altekruse y col., 1998; Stanley y col., 1998a). La presencia de Campylobacter spp. en ganado vacuno está relacionada con la contaminación de la leche en la explotación y las canales en el matadero, así como con la contaminación ambiental tras la eliminación de efluentes de mataderos y de granjas (Stanley y col., 1998a). Se ha aislado Campylobacter spp. en alimentos de origen animal como la leche y los productos avícolas y pueden permanecer viables en refrigeración y congelación (Zanetti y col., 1996). Las bacterias del género Campylobacter alcanzan la leche a través de la contaminación fecal durante el ordeño, aunque también ocasionalmente a partir de vacas con mamitis asintomática en ganado vacuno (Cullor, 1995a; Hahn, 1996). La prevalencia de C. jejuni y C. coli en ganado vacuno lechero depende del tipo de muestra analizada (las heces recogidas del recto presentan más frecuentemente estas bacterias que las tomadas del suelo), del medio de aislamiento usado, de la edad del animal (la prevalencia en terneros es entre 10 y 100 veces más alta que en adultos), de la estación del año y de la localización geográfica; así, la prevalencia varía en el ganado vacuno entre 0,8% y 100% (Busato y col., 1999; Wesley y col., 2000; Stanley y Jones, 2003). Patogenia Se sabe poco de los mecanismos de patogenicidad de Campylobacter spp. La dosis infectiva no es muy elevada, incluso entre 500 y 1000 microorganismos son capaces de __________________________________________________________________Introducción general 29 causar la enfermedad. La principal vía de transmisión de la mayoría de las especies es la ruta oro-fecal (Alonso, 2002; Quinn y col., 2004). Los signos y síntomas de la infección sugieren un mecanismo invasivo; estudios tanto “in vivo” como “in vitro” sugieren que la bacteria, tras sobrevivir al pH ácido del estómago coloniza la capa mucosa intestinal según indica el Eastern Regional Health Authority (ERHA, 1999). Entre los factores de virulencia de C. jejuni se encuentran una adhesina, una citotoxina y una toxina termolábil. A su vez, utiliza sideróforos exógenos para la obtención de hierro (Nachamkin, 1995; Quinn y col., 2004). Formas clínicas Muchas de las infecciones entéricas causadas por Campylobacter spp. en animales domésticos son subclínicas (ERHA, 1999). No obstante, C. fetus provoca abortos esporádicos en vacuno y ovino (Busato y col., 1999), C. jejuni se ha aislado en casos de mamitis bovina (Atabay y Corrry, 1998) y vacas con elevados RCS (Neill y col., 1982), y en enteritis de perros, gatos y terneros con diarrea (Harvey y col., 2004), y C. coli aparece con mayor frecuencia en cerdos, causando cuadros diarreicos o sin síntomas de enfermedad (Altekruse y col., 1998). Algunas especies de Campylobacter no termófilas son capaces de provocar enfermedad en animales domésticos (ERHA, 1999). Diagnóstico No existe ningún protocolo estándar de aislamiento para la detección de estos microorganismos (Mateo y col., 2005). Se pueden recoger muestras de contenido abomasal fetal en casos de abortos, moco genital en anestro de casos de infertilidad y bilis en la hepatitis vibriónica aviar (Alonso, 2002). Capítulo 1 ___________________________________________________________________________ 30 Debido a su morfología característica, las especies de Campylobacter pueden detectarse mediante una tinción directa de Gram a partir de deposiciones de pacientes con enteritis aguda (Nachamkin, 1995). El aislamiento puede realizarse mediante la filtración de membrana y posterior pase a medio sólido o líquido en condiciones microaerófilas y/o mediante medios de aislamiento selectivos (Allos, 2001). Los métodos de elección para la identificación son las técnicas moleculares basadas en la PCR por su rapidez, especificidad y sensibilidad (Mateo y col., 2005): PCR-ELISA se utiliza en cultivos negativos de muestras fecales procedentes de animales sospechosos, PCR a tiempo real en muestras de alimentos, PCR retro-transcriptasa que distingue entre células viables y muertas de C. jejuni (Moore y col., 2005). Aspectos zoonóticos A pesar de que un amplio número de especies de Campylobacter están implicadas en los brotes de enteritis humanas, las más comunes son las termófilas, de las cuales C. jejuni es el responsable de más del 90% de los casos (Hahn, 1996; López y col., 2003); sin embargo, si se aplican técnicas de diagnóstico más precisas se identifican otras bacterias implicadas, entre las que se encuentra Arcobacter butzleri (Butzler, 2004). La transmisión entre personas es raro que ocurra, con contagio más frecuente por contacto con animales de compañía infectados (Allos, 2001). C. jejuni es uno de los microorganismos más comunes en los casos esporádicos de enteritis bacteriana en los países desarrollados, siendo una de las principales causas de toxiinfecciones alimentarias a nivel mundial, con mayor tasa de incidencia en niños y adultos jóvenes (Warner y col., 1986; Butzler, 2004; Louis y col., 2005). Se ha comprobado que puede ser suficiente una dosis infectiva de 500 bacterias para provocar la enfermedad. Normalmente, la vía de contagio es el consumo de alimentos contaminados, principalmente productos avícolas, aunque también a través de agua de bebida y leche (Rodríguez López, 1988; Altekruse y col., 1998; ERHA, 1999), carnes de cerdo, cordero y ternera mal cocinadas o a la brasa y champiñones frescos (Cullor, 1995a). __________________________________________________________________Introducción general 37 7. PERFIL DE LA TESIS Para la elaboración de la presente Tesis Doctoral se realizaron una serie de estudios como parte integral del planteamiento del APPCC con una finalidad eminentemente práctica basados en la aportación de datos sobre la influencia que las distintas prácticas de manejo tienen en la producción de leche segura, sana e inocua en las explotaciones de ganado vacuno. En el capítulo 2 se describe el proceso de adaptación e implementación de un sistema de APPCC en las granjas bovinas, con el objeto de evitar alteraciones de la calidad higiosanitaria de la leche del tanque de refrigeración. El sistema se basó en la aplicación de las buenas prácticas ganaderas como parte del programa de APPCC utilizadas como medidas preventivas para la aparición de los peligros: presencia de patógenos mamarios, saprofitos o zoonóticos (Listeria spp., Campylobacter spp. y Arcobacter spp.) y presencia de residuos de medicamentos o inhibidores como detergentes, desinfectantes, etc. El capítulo 3 hace referencia a la utilidad de la ATP bioluminiscencia como método de monitorización de la higiene de las superficies de los equipos de ordeño y su relación con la calidad bacteriana de la leche del tanque de refrigeración. Finalmente, en los tres últimos capítulos se estudian las prevalencias de los agentes patógenos potencialmente zoonóticos como Listeria spp. en muestras de leche del tanque, ensilado y heces de vacas en lactación recogidas en las granjas y Campylobacter spp. y Arcobacter spp. en heces de vacas en lactación. Así mismo, se analiza la influencia que ejercen algunas de las prácticas de manejo realizadas por los ganaderos sobre la aparición de estas bacterias en las granjas. 8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abu-Halaweh, M.; Bates J.; Patel, B. K. C. 2005. Rapid detection and differentiation of pathogenic Campylobacter jejuni and Campylobacter coli by real time PCR. Res Microbiol, 156: 107-114. Capítulo 1 ___________________________________________________________________________ 38 Allos, B. M. 2001. Campylobacter jejuni infections: update on emerging issues and trends. Clin Infect Dis, 32: 1201-1206. Alonso, J. M. 2002. Géneros Campylobacter y Helicobacter. 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Producción de leche de vaca en explotaciones 2005b. Citado: 22/01/2007. Disponible en: http://www.mapa.es/estadistica /pags/Lactea/lactea:anual.htm Capítulo 1 ___________________________________________________________________________ 44 Moore, J. E.; Corcoran, D.; Dooley, J. S. G.; Fanning, S.; Lucey, B.; Matsuda, M.; McDowell, D. A.; Mègraud, F.; Millar, B. C.; O´Mahony, R.; O´Riordan, L.; O´Rourke, M.; Rao, J. R.; Rooney, P. J.; Sails, A.; Whyte, P. 2005. Campylobacter. Vet Res, 36: 351382. Moreno, Y.; Alonso, J. L.; Botella, S.; Ferrús, M. A.; Hernández, J. 2004. Survival and injury of Arcobacter after artificial inoculation into drinking water. Res Microbiol, 155: 726-730. Mortimore, S.; Wallace, C. 2001. HACCP. Enfoque práctico. Ed. Acribia, Zaragoza. Mouwen, J.; Prieto, M. 1998. Aplicación del sistema ARICPC-HACCP a la industria cárnica. Cienc Tecnol Aliment, 2: 42-46. Murphy, S. C.; Kozlowski, S. M.; Bandler, D. K.; Boor, K. J. 1998. 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Posteriormente, se celebró una reunión con todo el personal implicado en la producción de leche, en donde se distribuyeron las funciones que debía cumplir cada grupo. Como resultado, el equipo de trabajo estaba integrado por personal de todas las áreas implicadas en la producción de la leche de vaca: - Los ganaderos titulares de las explotaciones o empleados, si existen, realizan los autocontroles, aplican las medidas preventivas y guardan registro de la documentación necesaria para garantizar la trazabilidad de la producción de leche segura y de calidad. - Los veterinarios asesoran en calidad de la leche y control de mamitis, pero también en problemas de tipo sanitario. - Los técnicos de mantenimiento del equipo de ordeño y del tanque de refrigeración de la leche realizan las revisiones y reparaciones cuando sea necesario. - Los auditores internos o inspectores de la empresa lechera comprueban la aplicación del sistema APPCC, es decir, determinan si las actividades realizadas en las explotaciones se llevan a cabo correctamente. - Los auditores externos comprueban si el protocolo de actuación en las explotaciones se realiza según el sistema APPCC. - El equipo del Instituto de Investigación e Análises Alimentarias de la Universidad de Santiago de Compostela realiza los estudios y ensayos para el diseño, el desarrollo y la mejora continuada del sistema APPCC, en colaboración con las industrias lecheras. Cada cierto periodo de tiempo se realizaron reuniones entre los miembros del equipo para evaluar el funcionamiento del sistema del APPCC, en donde se intercambiaron ideas, actualizaron datos, etc. Capítulo 2 ___________________________________________________________________________ 54 2. Descripción del producto Según la Directiva 92/46/CEE es “leche producida por la secreción de las glándulas mamarias de una o más vacas, que no haya sido calentada por encima de 40ºC, ni haya sido sometida a un tratamiento con un efecto equivalente”. A su vez, el Reglamento (CE) 853/2004 establece “la leche cruda de vaca destinada al consumo directo o la elaboración de productos lácteos debe contener un RB (media geométrica móvil observada durante un período de 2 meses, con un mínimo de dos muestras al mes) inferior a 100×103 ufc/ml y RCS (media geométrica móvil observada durante un período de 3 meses, con un mínimo de una muestra al mes) inferior a 400×103 cel/ml”. La descripción del producto final que se quiere obtener con este planteamiento de trabajo es la leche de tanque de refrigeración de las granjas de vacuno lechero con unos valores medios mensuales de RB menores de 20×103 ufc/ml, de RCS menores de 200×103 cel/ml y ausencia de microorganismos patógenos zoonóticos e inhibidores. 3. Identificación de la intención de uso Leche cruda para su consumo directo tras los tratamientos térmicos aplicados en las fábricas de las empresas lecheras o como materia prima de la industria transformadora para la elaboración de derivados lácteos. 4. Construcción de un diagrama de flujo Se realizó una descripción del proceso de producción de la leche en forma de diagrama de flujo que sirvió como guía del estudio. El diagrama se completó tras haber efectuado las visitas, las entrevistas y la observación de las distintas operaciones y con la ayuda de los planos de las instalaciones. En él se indican los movimientos habituales del ganado y del personal, la entrada de las materias primas, así como todos los procesos implicados en la obtención de la leche. _________________________________ Sistema de análisis de peligros y puntos de control crítico 55 En la figura 2.1 se presenta el diagrama de flujo del proceso de producción de leche estandarizado para las explotaciones de ganado vacuno de leche visitadas. 5. Verificación “in situ” del diagrama de flujo Se debe confirmar que todas las actividades importantes conducentes a la producción de leche han sido identificadas; para ello, tras la elaboración del diagrama, se comprobó si se ajustaba a cada explotación y se completó o modificó cuando fue necesario. Capítulo 2 ___________________________________________________________________________ 56 Figura 2.1: Diagrama de flujo con los movimientos del ganado y los procesos implicados en la producción de leche. Vacas Lactación Vacas Secas Ordeño Com p ra de animales Cuarentena Alimentación Instalaciones Cubículos/Camas Lechería Tanque Equipo Rutina Sala partos Tratamientos Recría Controles de leche Patios de recreo _________________________________ Sistema de análisis de peligros y puntos de control crítico 57 6. Principio 1: Analizar los peligros Se deben listar todos los peligros potenciales en cada fase (evaluación de peligros), realizar un análisis de peligros y considerar las medidas de control para estos peligros identificados (gestión de peligros) e informar al equipo de trabajo (comunicación de peligros). a) Evaluación de peligros Con la ayuda del diagrama de flujo se identificaron todos los peligros potenciales asociados a la producción de la leche en todas las áreas de la granja. Los peligros se clasificaron en: - biológicos: patógenos mamarios, saprofitos ó microorganismos zoonóticos como Arcobacter spp., Campylobacter spp. y Listeria spp. - químicos: residuos de detergentes, desinfectantes, fitosanitarios o medicamentos. En muchos casos no hay datos suficientes para realizar una evaluación cuantitativa de los peligros asociados a agentes patógenos, por lo que la única alternativa es la evaluación cualitativa. b) Gestión de peligros Una vez identificados los peligros y valorado su riesgo, se establecieron las medidas necesarias para prevenir, eliminar o reducir un peligro determinado dentro de la propia explotación ganadera, ya que se demuestra que, por lo general, la pasteurización de la leche en la industria láctea es una medida de control específica para obtener leche segura e inocua. c) Comunicación de peligros Periódicamente se informaba a todo el personal implicado en la producción de leche en cada granja de los peligros presentes en la misma, así como de las medidas preventivas a aplicar para su control. Capítulo 2 ___________________________________________________________________________ 58 En la tabla 2.2, se describen los diferentes aspectos que influyen en la producción de la leche en una explotación bovina, los peligros identificados en cada etapa y las medidas preventivas a aplicar para cada peligro. 7. Principio 2: Determinar los puntos de control crítico Los PCC son puntos o etapas del proceso donde un peligro puede ser evitado, eliminado o reducido a un nivel aceptable y no existe una medida de control en una etapa posterior para eliminar o reducir ese peligro. Para identificar los PCC en las granjas se utilizó un árbol de decisiones (figura 2.2) para cada peligro identificado en el principio 1 en cada una de las etapas de producción de la leche, siendo el equipo de trabajo quién decidió finalmente cuales fueron los PCCs. Figura 2.2: Árbol de decisiones para identificar los puntos de control crítico 1. ¿Existen medidas preventivas para el peligro? ¿Es necesario para la seguridad un control en esta fase? 3. ¿Podría haber contaminación si aparece el peligro identificado en exceso del nivel aceptable o podría aumentar hasta un nivel inaceptable? 2. ¿Está esta fase específicamente diseñada para eliminar o reducir la probabilidad de presentación del peligro hasta un nivel aceptable? 4. ¿Una fase posterior del proceso eliminará el riesgo o reducirá la probabilidad de su presentación hasta un nivel aceptable? NO ES UN PCC Modificar la fase, el proceso o el producto NO ES UN PCC ES UN PCC NO ES UN PCC NO S I NO S I SI NO S I NO NO S I _________________________________ Sistema de análisis de peligros y puntos de control crítico 59 Tabla 2.2: Etapas de producción de la leche, los peligros identificados, las medidas preventivas a aplicar y la determinación de los puntos de control crítico COMPRA DE ANIMALES ETAPA DEL PROCESO PELIGRO MEDIDAS PREVENTIVAS PCC Presencia de residuos de medicamentos Suponer que están bajo tratamiento, realizar prueba de detección de antibióticos en leche. Ordeño separado Si están secas, analizar la leche 5 días postparto PCC-1 Cuarentena Aumento del recuento de células somáticas (RCS), introducción de patógenos mamarios y zoonóticos Comprobar historial RCS individual y del tanque de explotación de origen Análisis de leche de mezcla de cuarterones PCC-2 ALIMENTACIÓN ETAPA DEL PROCESO PELIGRO MEDIDAS PREVENTIVAS PCC Introducción de patógenos zoonóticos en animales Compra a industrias certificadas Elaboración correcta del ensilado y realización de análisis físico-químicos y microbiológicos del ensilado PCC-3 Origen de alimentos Presencia de fitosanitarios y abonos Uso correcto de fitosanitarios y abonos, respetar períodos de supresión, análisis en ensilado NO Conservación y almacén de alimentos Multiplicación de patógenos mamarios, zoonóticos y saprofitos Residuos de fitosanitarios No compartir equipos para limpieza Almacén de alimentos de uso exclusivo y separado de fuentes de contaminación No utilizar ensilado de bordes, ni parte superior de silo Limpieza y desinfección del silo de concentrados, anotar fechas PCC-4 Limpieza de bebederos y comederos Introducción y multiplicación de patógenos zoonóticos Situados alejados de fuentes contaminación Limpieza diaria para eliminar restos de comida PCC-5 Agua (de bebida y/o limpieza) Introducción y transmisión de patógenos mamarios, saprofitos y zoonóticos Aumento del recuento bacteriano (RB) en tanque Realizar analíticas periódicas del agua. Potabilización Proteger pozos, situados alejados de fosa purines, etc. PCC-6 Capítulo 2 ___________________________________________________________________________ 60 Tabla 2.2: Etapas de producción de la leche, los peligros identificados, las medidas preventivas a aplicar y la determinación de los puntos de control crítico (continuación) INSTALACIONES ETAPA DEL PROCESO PELIGRO MEDIDAS PREVENTIVAS PCC Condiciones del Establo Ventilación / Iluminación Multiplicación de patógenos mamarios, zoonóticos y saprofitos Diseño adecuado de instalaciones Dotación suficiente de iluminación, fundamental en pasillo de alimentación NO Multiplicación de patógenos mamarios, zoonóticos y saprofitos Limpieza de pasillos diaria Colocación de mosquiteras, sellado de agujeros, grietas, etc. Desinfección mínima semestral del establo NO Limpieza / Programa de desinfección, desinsectación y desratización Intoxicaciones por fitosanitarios Respetar periodo de espera antes de entrada de animales tras desinfección NO Cubículos y camas Diseño y número Multiplicación de patógenos mamarios, zoonóticos y saprofitos Un cubículo por vaca en lactación Tamaño suficiente para evitar que defequen en interior Pendiente adecuada para favorecer drenaje NO Arreglo / Renovación Multiplicación de patógenos mamarios, zoonóticos y saprofitos Mantener cubículos secos, limpios y drenados Reposición periódica del material Retirada de heces y allanado de cama diario PCC-7 Agentes secantes Multiplicación de patógenos mamarios, zoonóticos y saprofitos Aplicación mínima semanal PCC-8 Patios Salida a pastos / patios recreo Residuos de fitosanitarios Introducción de patógenos mamarios y zoonóticos Períodos de supresión tras uso de fitosanitarios o aplicación de purines Evitar salida de animales a pastos en mal estado y acceso de animales silvestres Limpieza diaria de patios PCC-9 Vacas secas Sala de partos Multiplicación de patógenos mamarios, zoonóticos y saprofitos Uso exclusivo Limpieza/reposición de cama tras cada uso, desinfección mínima semestral NO Alojamiento Multiplicación de patógenos mamarios, zoonóticos y saprofitos Separado de vacas lactación Alojamiento limpio y seco NO _________________________________ Sistema de análisis de peligros y puntos de control crítico 61 Tabla 2.2: Etapas de producción de la leche, los peligros identificados, las medidas preventivas a aplicar y la determinación de los puntos de control crítico (continuación) TRATAMIENTOS ETAPA DEL PROCESO PELIGRO MEDIDAS PREVENTIVAS PCC Tratamiento en lactación Aplicación Introducción de patógenos mamarios y saprofitos en ubre Usar guantes desechables Limpiar y desinfectar el pezón Introducción parcial de cánulas Aplicar baño de pezones NO Identificación de animales Identificar a los animales y/o tener información visible en sala, marcar puesto si se trata de estabulación fija PCC-10 Período de supresión Pauta correcta según receta/prospecto (dosis, vía, duración, etc.) Registro de tratamientos (fecha de tratamiento y periodo de espera), archivo de recetas PCC-11 Retirada de la leche Presencia de residuos de medicamentos Ordeño separado o en punto aparte, si no desinfectar unidad Eliminar la leche de los 4 cuarterones PCC-12 Tratamientos de secado Aplicación Introducción de patógenos mamarios y saprofitos a ubre Secado brusco. Tratar todos los cuarterones a secar: una cánula por cuarterón Limpiar y desinfectar el pezón, introducción parcial de cánula, etc. NO Introducción de patógenos mamarios a ubre Vigilar si las vacas presentan signos de inflamación NO Duración / Período de supresión Presencia de residuos de medicamentos Registro de fecha de secado, parto y período de espera Duración del secado entre 6-8 semanas. Si es menor de 30 días, tirar leche 7 días PCC-13 Otros tratamientos (antiparasitarios, etc.) Presencia de residuos de medicamentos Aplicación en etapa de secado de la vaca Respetar el período de espera si tratamiento es en lactación NO Otros Almacén y uso de medicamentos Presencia de residuos de medicamentos Almacenamiento correcto, separar tratamientos de lactación y de secado, proteger de contaminación Mantener correcto etiquetado, desechar caducados, etc. Disponer de servicio veterinario responsable del uso de medicamentos en granja NO Eliminación de animales Introducción y multiplicación de patógenos mamarios Eliminar vacas con mamitis crónicas (infecciones crónicas con elevados RCS varios meses seguidos, infecciones persistentes en lactaciones sucesivas, infección en 3 ó 4 cuarterones, vacas tratadas de mamitis 3 ó más veces) PCC-14 Capítulo 2 ___________________________________________________________________________ 62 Tabla 2.2: Etapas de producción de la leche, los peligros identificados, las medidas preventivas a aplicar y la determinación de los puntos de control crítico (continuación) ORDEÑO ETAPA DEL PROCESO PELIGRO MEDIDAS PREVENTIVAS PCC Condiciones del ordeñador Transmisión de patógenos mamarios, saprofitos y zoonóticos. Presencia de inhibidores en tanque Formación específica del personal que ordeña Seguir normas básicas de higiene: usar ropa limpia y de uso exclusivo para el ordeño, utilizar y limpiar guantes, no fumar ni comer durante el ordeño, etc. NO Rutina Orden de ordeño Transmisión de patógenos mamarios y zoonóticos Establecer orden de ordeño según Californian mastitis test (CMT) o control lechero PCC-15 Despuntado e higienización Eliminar primeros chorros en recipiente o limpiar entre tandas Limpieza correcta de ubres y pezones con paños individuales, productos adecuados Secar bien pezones antes de colocar pezoneras. Evitar mojar ubre PCC-16 Manejo preordeño Colocación de pezoneras Introducción y transmisión de patógenos mamarios, saprofitos y zoonóticos Aumento del RB Presencia de inhibidores Tiempo entre estimulación y colocación pezoneras 60-90 segundos Colocación de pezoneras evitando entrada de aire NO Fase de ordeño Introducción de patógenos mamarios, saprofitos y zoonóticos a la ubre Controlar el nivel de vacío durante ordeño y funcionamiento de pulsadores NO Retirada de pezoneras Retirada inmediata de pezoneras tras finalizar ordeño, cortando el vacío No realizar apurado manual, apurado con máquina ≤ 5 segundos Baño pezones Baño de pezones cubre mínimo 75% superficie Manejo postordeño Control de vacas Introducción de patógenos mamarios, zoonóticos y saprofitos en ubre Evitar que los animales se tumben PCC-17 Equipo de ordeño Local de ordeño Multiplicación de patógenos mamarios, zoonóticos y saprofitos Limpiar tras el ordeño, paredes y suelos lavables, drenaje correcto Iluminación y ventilación suficiente Diseño adecuado, fácil acceso y salida, no comunicación directa con fuentes de contaminación NO Limpieza y desinfección interior correcta tras ordeño con dosis de detergentes, temperatura del agua y aclarado adecuados PCC-18 Limpieza del equipo de ordeño Aumento del RB, patógenos mamarios y zoonóticos Presencia de residuos de detergentes Limpieza exterior del equipo de ordeño NO Revisiones y cambios Pulsadores Funcionamiento Nivel de vacío Introducción de patógenos mamarios, zoonóticos y saprofitos en ubre Diseño adecuado según producción de leche Evitar fluctuaciones de vacío durante ordeño, comprobar reserva tras ordeño Revisión y mantenimiento periódicos del equipo (pulsadores, nivel vacío, conducciones, unidades, regulador, etc.) Cambio de elementos según recomendaciones del fabricante PCC-19 _________________________________ Sistema de análisis de peligros y puntos de control crítico 69 Tabla 2.3: Actuaciones a realizar una vez identificados los puntos de control crítico (continuación) PCC LIMITE CRÍTICO MONITORIZACIÓN ACCIONES CORRECTORAS REGISTRO 11 No reajustar el período de supresión tras prescripción excepcional (combinación productos, dosis o frecuencia distinta a la indicada en el prospecto, etc.) Revisión de las instrucciones indicadas en la receta veterinaria Desechar la leche de vacas sospechosas Libro de registro de tratamientos y archivo de recetas 12 No ordeño de las vacas en tratamiento al final o en punto aparte Eliminar la leche sólo del cuarterón tratado Comprobar ordeño de animales en tratamiento al final, desvío del equipo, o existencia de cántara Desechar la leche de vacas sospechosas Libro registro tratamientos, marcado de animales en tratamiento 13 Desconocer el período de supresión por prescripciones excepcionales, partos prematuros y en general, secados con duración menor 6-8 semanas Revisar registros de fechas de secado, parto esperado y período de espera Realizar analíticas periódicas de inhibidores Desechar la leche de vacas sospechosas Libro registro de tratamientos, registro fecha secado, parto y período de espera Resultados pruebas de antibióticos 14 Mantener en rebaño vacas con mamitis crónica Comprobar historial de RCS, de tratamientos y curaciones Aplicar las medidas preventivas Libro registro de tratamientos, boletines del LIGAL 15 Desconocer si las vacas sufren mamitis y no separarlas cuando están en la sala de espera Comprobación en cada ordeño que el orden es correcto Aplicar las medidas preventivas Comprobación visual durante el ordeño 16 No realizar despuntado Compartir paños entre vacas o no limpiar las ubres No secar la ubre antes de colocar las pezoneras No enjuagar suficientemente las pezoneras si las desinfecta entre vacas durante el ordeño Observación de la leche despuntada Comprobación de la limpieza del extremo del pezón con un algodón Observar si los pezones están secos Aplicar las medidas preventivas Comprobación visual durante el ordeño 17 Pezoneras permanecen puestas tras detenerse flujo de leche No utilización de baño de pezones postordeño Se tumban un gran número de vacas tras el ordeño Vigilar en cada ordeño Medición leche residual Seguir las medidas preventivas Ajustar retiradores automáticos Observación durante y tras finalizar el ordeño Comprobar ajustes retiradores automáticos No lavar el equipo tras el ordeño o hacerlo en condiciones deficientes: temperatura agua menor a 60-65ºC, detergentes a dosis inadecuadas, aclarado con agua no potable, etc. 18 No drenar completamente las conducciones del equipo antes del siguiente ordeño Observación de la limpieza alcanzada (en gomas, juntas, etc.). Mediciones de ATP bioluminiscencia Revisión del sistema de lavado y funcionamiento del calentador de agua Boletines del LIGAL 19 Existencia de fallos en los pulsadores (“cojeo” > 5%, fase succión inferior al 30% y relajación inferior al 15%) y fluctuaciones de vacío > 10Kpa en tubo corto de leche Observación durante ordeño del vacuómetro, frecuencia de pulsación y si las pezoneras caen Reparar y/o cambiar los pulsadores Corregir el nivel de vacío Testajes estático y dinámico del equipo de ordeño Observaciones durante el ordeño 20 El tanque no está a 3-4ºC como máximo en la media hora posterior al final del ordeño Comprobación diaria del tiempo y temperatura de enfriamiento Reparar o sustituir el tanque Testajes anuales Boletines del LIGAL No se lava a diario con solución alcalino clorada y agua a 5060ºC y semanalmente con solución ácido desincrustante 21 No se realiza aclarado tras el lavado o el drenaje es incorrecto Observación diaria de la limpieza alcanzada Revisión del sistema de lavado Boletines del LIGAL Capítulo 2 ___________________________________________________________________________ 70 11. Principio 6: Establecer la documentación y los registros de los principios El registro de los datos y la documentación constituyen una prueba escrita del desarrollo de todas las actividades implicadas en la producción de la leche que facilita el seguimiento retrospectivo y permite la verificación del sistema. Además supone la única referencia disponible que asegura la trazabilidad del producto. En los registros se incluyen: - el esquema de trabajo seguido: descripción del equipo, elaboración de los diagramas de flujo, establecimiento de los límites críticos, etc. - los registros generados en su aplicación: datos de la monitorización, de las acciones correctoras, etc. La tabla 2.3 contiene el sistema de registro de datos y documentación necesarios en cada PCC. 12. Principio 7: Establecer verificaciones para confirmar que el sistema funciona Las verificaciones realizadas en las 187 granjas de vacuno lechero, incluidas en este programa fueron diferentes en función de la empresa que le recogiese la leche. El personal del departamento de calidad de leche de Lactalis realiza auditorías periódicas a las granjas para comprobar el cumplimiento del sistema de APPCC y verificar los resultados de los controles analíticos de la leche, el agua, etc. En cada inspección emiten un informe por escrito con las inconformidades y las posibilidades de mejora que es enviado a la explotación ganadera auditada. Una entidad certificadora, externa a la empresa, programa las auditorías a las explotaciones y a la industria, verifica la conformidad con los requisitos del APPCC y emite un informe de cada auditoría. El personal de Puleva Food, S.L. también realiza auditorías de manera periódica en las granjas. La finalidad de estas auditorías es comprobar que la implementación del sistema de APPCC se realiza de manera correcta y hacer las recomendaciones necesarias para _________________________________ Sistema de análisis de peligros y puntos de control crítico 71 mantener el buen funcionamiento del mismo, con el objetivo de garantizar la producción de leche higiénica. DISCUSIÓN En este trabajo se ha desarrollado un sistema APPCC, adaptándolo e implementándolo en explotaciones de ganado vacuno lechero de Galicia en todas las etapas de producción para la mejora de la calidad higio-sanitaria de la leche. El sistema APPCC se está utilizando desde hace años en los procesos industriales de elaboración de alimentos, tanto en la industria cárnica (Mouwen y Prieto, 1998) como en la láctea (Morgan, 2004), con el objetivo de prevenir los peligros en salud pública, evitando las alteraciones de la calidad en los alimentos a través de la aplicación de prácticas adecuadas en los PCCs identificados. Por el momento a la producción primaria no se le exige la aplicación de los principios del APPCC, sin embargo, a medio plazo esta metodología aplicada a la producción de productos de origen animal en granjas o a la gestión de la sanidad animal podría ser desarrollada dentro de un sistema de control de la calidad (Noordhuizen y Welpelo, 1996). Por otra parte, la utilización del APPCC en el sector primario se ha visto dificultada por la ausencia de parámetros de evaluación objetivos y medibles. En consecuencia, ciertos investigadores consideran que la aplicación del sistema APPCC en el sector primario no resulta viable, con lo que abogan por la implementación de guías de BP (Gonzalo y col., 2004). El fundamento de las BP es realizar cambios cualitativos en el proceso de producción para mejorar la calidad del producto, pero no es un método demostrable ni certificable como es el APPCC (Noordhuizen y Welpelo, 1996). A pesar de esto, la aplicación de unas BP es necesaria para la correcta implementación del APPCC. Un ejemplo es el Programa de Aseguramiento de la Calidad de la Leche en Canadá, en el cual las BP se utilizan como medidas de control para prevenir los problemas de calidad y seguridad alimentaria en las granjas como fundamento de un sistema APPCC (Agriculture and Agri-Food Canadá, 2001), con unos planteamientos similares a los realizados en nuestro estudio. En dicho trabajo se identifican como PCCs esenciales la Capítulo 2 ___________________________________________________________________________ 72 administración de medicamentos en la granja, el enfriamiento y conservación de la leche, la limpieza del equipo de ordeño y el uso del agua para la limpieza de superficies de contacto con la leche, que corresponden en nuestro caso con los PCCs indicados en las etapas de tratamiento en lactación y en secado (PCC-10, PCC-11, PCC-12 y PCC-13), del tanque de almacenamiento (PCC-20 y PCC-21) y del agua de bebida y/o limpieza (PCC6). Desde hace años se están llevando a cabo actividades para certificar a grandes productores de ganado en la gestión de la calidad ambiental, en la gestión de la producción o en el cuidado de la sanidad animal en países europeos como Alemania, Dinamarca y Holanda. También en Australia están aplicando programas de gestión de la calidad en rebaños lecheros basados en el sistema APPCC (Noordhuizen y Frankena, 1999). En España la adaptación e implementación de la metodología del APPCC en granjas de vacuno lechero no se ha instaurado, por lo que con este trabajo se pretendió ayudar a los ganaderos en la obtención de una leche segura y de calidad, facilitando la certificación del proceso de producción. Otros trabajos en los que se utilizó la metodología del APPCC en granjas de vacuno lechero, lo aplicaron para el control de determinados peligros o ciertas etapas de la producción de leche como fueron el control de mamitis, la gestión de la sanidad animal, la presencia de residuos de medicamentos en la leche del tanque y el ordeño (Cullor, 1995; Noordhuizen y Welpelo, 1996; Sischo y col., 1997; Zorraquino, 1998; Alves, 2003). En nuestro estudio el APPCC se amplió a todas las etapas en las que estaban implicados los animales productores de leche, desde la entrada de materias primas para su alimentación hasta la eliminación de aguas residuales después de la limpieza de las instalaciones, así como a los diferentes aspectos que pueden influir sobre la calidad de la leche. El último trabajo mencionado se trató también de una Tesis (Alves, 2003) y el sistema APPCC se implementó únicamente en dos granjas lecheras de Brasil, centrándose sólo en las actividades relacionadas con la rutina de ordeño. De manera similar a nuestro estudio, se evaluó la eficacia del APPCC frente a la utilización de las BP como único método de control de la calidad de la leche, obteniéndose resultados similares a los del presente _________________________________ Sistema de análisis de peligros y puntos de control crítico 73 trabajo en lo que respecta a la mejora del RCS y del RB, así como en reducir el número de cuarterones afectados y en la gravedad de las mamitis presentes. Asimismo, pudimos comprobar, al igual que lo indicado por otros investigadores (Noordhuizen y Frankena, 1999; Alves, 2003) que el éxito de la aplicación del sistema de APPCC en las explotaciones de ganado vacuno lechero se centra en gran parte en el personal de la granja, específicamente en su participación activa y su compromiso, más que en la calidad higio-sanitaria de la leche o del nivel tecnológico de la explotación al inicio de la implementación del APPCC. Como consecuencia del presente estudio, se comprobó que con únicamente unas pocas adaptaciones y modificaciones, el sistema APPCC puede ser desarrollado y puesto en práctica de manera individual en las granjas de ganado vacuno lechero para obtener un producto final de calidad. No obstante, nuevos estudios epidemiológicos de campo basados en análisis de peligros son necesarios para identificar los PCCs y diseñar procedimientos de APPCC para este tipo de explotaciones ganaderas. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Agriculture and Agri-Food Canada. 2001. Canadian Quality Milk-Quality Assurance Program. Reference Manual, Canada. Alves, A. 2003. Aplicaçao do sistema de análise de perigos e pontos críticos de controle (APPCC) em propriedades leiteiras. Tesis. Pirassununga, Brasil. Cullor, J. S. 1995. Implementing the HACCP program on your clients’ dairies. Vet Med, 90: 290-295. Cullor, J. S. 1997. HACCP (Hazard Analysis Critical Control Points): Is it coming to the dairy? J Dairy Sci, 80: 3449-3452. Diéguez, J.; Soto, E.; Seijas, A. 2004. Guía de manejo para explotaciones de vacuno lechero: Análisis de peligros y puntos de control críticos (APPCC). Ed. Lactalis, Lugo. Capítulo 2 ___________________________________________________________________________ 74 Diario Oficial de la Unión Europea. 1992. Directiva 92/46/CEE del Consejo, de 16 de junio de 1992, por la que se establecen las normas sanitarias aplicables a la producción y comercialización de leche cruda, leche tratada térmicamente y productos lácteos. DOCE nº L268 de 14/09/1992. Diario Oficial de la Unión Europea. 2004. Reglamento 853/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 29 de abril de 2004, por el que se establecen normas específicas de higiene de los alimentos de origen animal. DOCE nº L139/55 de 25/06/1004. Escriche, I.; Doménech, E. 2004. El APPCC, elemento clave para garantizar la seguridad alimentaria. Instituto de Ingeniería de Alimentos para el Desarrollo. Universidad Politécnica de Valencia. Ed. 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Vet Q, 18: 121-126. _________________________________ Sistema de análisis de peligros y puntos de control crítico 75 Noordhuizen, J. P. T. M.; Frankena, K. 1999. Epidemiology and quality assurance: applications at farm level. Prev Vet Med, 39: 93-110. Sischo, W. M.; Kiernan, N. E.; Burns, C. M.; Byler, L. I. 1997. Implementing a quality assurance program using a risk assessment tool on dairy operations. J Dairy Sci, 80: 777787. Zorraquino, M. A. 1998. Aplicación de un sistema de análisis de riesgos y puntos críticos para asegurar una leche libre de residuos de medicamentos veterinarios. Curso de medicina de la producción en vacuno lechero, Lugo. Capítulo 2 ___________________________________________________________________________ 76 Anexo 1: Cuestionario utilizado para la recogida de datos en las explotaciones 1. DATOS GENERALES 1.- Fecha realización cuestionario: ___ / ___ / ___ 2.- Ganadero: ______________________________ 3.- Dirección: ______________________________ Tlf.: _____________ 4.- Tipo de estabulación: Libre Fija 5.- Tipo de ordeño: Sala Circuito 6.- Explotación: Abierta Cerrada 7.- Nº vacas: ____ menores 12 meses: ____ mayores 12 meses: ____ 2. ANALÍTICA Y TRAZABILIDAD DE LA LECHE 1.- Está en control lechero SI NO 2.- Granja y tanques dados de alta en la base de datos Letra Q SI NO 3.- Observación historial calidad de la leche (ver último recibo). Hay algún problema en: RCS RB Inhibidores Punto crioscópico Proteína Grasa 4.- Tiene servicios veterinarios para control de mamitis y calidad de leche NO SI: cuál?: ________ 5.- Hay otros veterinarios que traten las mamitis NO SI: cuál?: ________ Observaciones: 3. ALIMENTACIÓN Y AGUA PARA LOS ANIMALES 1.- Analiza el forraje / ensilado NO SI: - realiza análisis nutricional/ físico/ químico NO SI: dónde?: ________ - tiene un nutrólogo que realice la ración: NO SI: cooperativa fábrica otros: __________ - a quién compra la mezcla/ ración: __________ 2.- Productos fitosanitarios (fertilizantes, cal, etc.): - Respeta periodo de supresión de recogida de hierba/pastoreo SI NO - Almacén separado para éstos SI NO 3.- Frecuencia limpieza silos de concentrados: ________ 4.- Comederos limpios NO SI: Frecuencia: __________ 5.- Bebederos limpios NO SI: Frecuencia: __________ _________________________________ Sistema de análisis de peligros y puntos de control crítico 77 6.- Agua: - origen: pozo traída otros: ________ - potable SI NO - tiene clorador SI NO - analíticas periódicas NO SI: parámetros: E. coli coliformes enterococos otros Observaciones: 4. ESTADO SANITARIO DE LOS ANIMALES 1.- Explotación libre de enfermedades de Campaña de Saneamiento Ganadera: SI NO 2.- Está en Asociación Defensa Sanitaria Ganadera: SI: cuál?: __________ NO: Está en otras agrupaciones de servicios veterinarios? NO SI: alimentación serv. reproducción serv. podología 3.- Existe un lugar apartado para animales enfermos o en cuarentena SI NO 4.- Compra de animales: - recría SI NO - a quién: tratante otra explotación importa otros: ________ - chequea: estado explotación de origen (RCS) SI NO CMT SI NO analiza mezcla de los 4 cuarterones NO SI: que analiza?: __________ Observaciones: 5. GESTIÓN DE MEDICAMENTOS Y TRATAMIENTOS DE ANIMALES 1.- Existe botiquín: - Está en un lugar adecuado SI NO - Está ordenado SI NO 2.- Tratamientos mamitis: - si es intramuscular e intracisternal, como es el período de supresión: prospecto veterinario más días otros: ________ - identificación individual de vacas tratadas SI NO - ordeño aparte con recipiente separado las vacas tratadas SI NO - ordeña al final las vacas tratadas SI NO - retirada de la leche: 4 cuarterones cuarterón tratado - se avisan entre ordeñadores SI NO - si sospecha el paso de leche a tanque: avisa empresa tira leche tanque otros: _____ - todos los tratamientos son con receta SI NO - lleva libro tratamientos al día SI NO Observaciones: Capítulo 2 ___________________________________________________________________________ 78 6. BIENESTAR ANIMAL 1.- Ventilación adecuada SI NO 2.- Iluminación adecuada SI NO 3.- Frecuencia de limpieza y desinfección del establo: trimestral semestral anual menor 4.- Sistema eliminación purines: _________ 5.- Programas adecuados de desinfección, desinsectación y desratización SI NO 6.- Tienen: cubículos de cemento cubículos con cama - diseño correcto de cubículos SI NO - tipo de cama (material): _________ - nivel de llenado: correcto deficiente inexistente - frecuencia de arreglo: diario varios/sem menor - frecuencia de renovación: __________ - empleo de agentes secantes: NO SI: frecuencia: varios/semana semanal quincenal menor tipo: fosfato cálcico carbonato cálcico otros 7.- Densidad correcta (nº cubículos: ____ ) SI NO 8Tienen sala de partos: NO SI: cambia entre partos SI NO desinfección SI NO 9.- Salida a pastos: NO SI: diario estacional duermen fuera 10Pasillos y patio de ejercicio limpios SI NO 11Hay problemas podales SI NO 12.- Condición corporal Buena Mala Observaciones: 7. ORDEÑO, ALMACENAMIENTO Y CALIDAD DE LECHE A. Protocolo de ordeño 1.- Marca equipo ordeño: __________ Existe máquina aparte SI NO Nº puntos ordeño: ______ 2.- Ordeñador: nº personas que ordeñan: ____ empleo de guantes SI NO 3.- Orden de ordeño SI NO 4.- Preparación de ubre: - despuntado NO SI: recoge/limpia no recoge/limpia - uso de toallita/paño: húmeda seca de uso individual: SI NO - limpieza en extremo de pezón SI NO - prediping NO SI: secado post sin secado post 5.- Tiempo de estimulación-colocación correcto SI NO 6.- Retirada de la unidad de ordeño (sobreordeño) SI NO ________________________________________________________________ ATP bioluminiscencia 85 Tabla 3.1: Valores de las unidades relativas de luz en las superficies analizadas N Media Mínimo Máximo Pezonera 106 363,6 8 Sobrecarga* Colector 84 2197,1 0 Sobrecarga* Unidad final 52 2929,7 0 Sobrecarga* Puntos circuito 23 8536,7 2 77000 *Sobrecarga: valores >105 URL, no usados en el cálculo de las medias En un total de 3 mediciones, una por cada superficie medida, los resultados del luminímetro reflejaron sobrecarga (valores superiores a 105 URL), lo que podría relacionarse con fallos importantes en el sistema de limpieza, utilización de agua fría, lavado sin detergente, etc. Estos valores no fueron utilizados para los cálculos estadísticos. La obtención de valores muy bajos (0) en colectores y unidad final indican ausencia de contaminación, es decir, el sistema de limpieza funciona correctamente. Slaghuis and Wiegersma (1996) tras medir las URL en diversas superficies de equipos de ordeño en 3 granjas, obtuvieron también valores muy diversos con un mínimo de 9 y un máximo de 38570. Asociación entre las variables del sistema de ordeño y frecuencia de limpieza de ordeño y los valores de los logaritmos de las unidades relativas de luz En la tabla 3.2 se presentan los resultados observados y la significación obtenida tras aplicar el ANOVA para las variables origen del agua, sistema de ordeño y frecuencia de uso del detergente ácido. La calidad microbiológica del agua es importante por el posible aporte al RB total de la leche, por lo que es aconsejable contar con aguas potables (Marco, 1998). En este estudio, en la mayoría de las granjas (68,9%) el agua era de pozo sin ningún tipo de tratamiento potabilizador. Cuando el agua no era potable, los valores de las LURL fueron mayores para las pezoneras y la unidad final de manera significativa (P = 0,04 y P = 0,02), sin embargo, en el colector y los puntos de conexión al circuito, a pesar de que las LURL también fueron elevadas, no se estableció una relación significativa. Las LURL encontradas en las pezoneras se ven influenciadas por el sistema de ordeño empleado aunque solo se puede explicar el 19,3% de la variabilidad encontrada. En las Capítulo 3 ___________________________________________________________________________ 86 pezoneras de las cántaras las LURL son mayores (P = 0,00), esta diferencia se puede explicar debido a que la limpieza aplicada en este tipo de equipos es manual y normalmente la temperatura del agua utilizada no suele ser la adecuada (Marco, 1998). Con respecto a los colectores, los circuitos presentan valores de LURL mayores que en las salas, ya que el recorrido de la solución de lavado hasta el tanque es menor en este último tipo de ordeño, y por lo tanto el riesgo de contaminación de la leche también disminuye (Marco, 1998). En las unidades finales, las LURL observadas en los circuitos son mayores que las observadas en las salas de ordeño (P = 0,06). La frecuencia de utilización de detergente ácido para limpiar las superficies internas de las conducciones del equipo de ordeño por donde circula la leche no presenta diferencias significativas en la medición del ATP en ninguna de las distintas superficies evaluadas, excepto en la unidad final (P = 0,04); sin embargo, en las pezoneras y colectores, las LURL alcanzan valores máximos cuando no se utiliza nunca este tipo de detergente y menores cuando su uso es semanal. Sin embargo, en las unidades finales, el valor más alto coincide con el uso diario del detergente, al igual que para los puntos de conexión al circuito, y el mínimo con la no utilización o su uso varias veces por semana. Esta variabilidad observada en los resultados puede ser explicada por el efecto de arrastre hacia las unidades finales o los puntos de conexión al circuito cuando se realiza el lavado diario con detergente ácido. Otra posible explicación puede estar en las diferentes actividades de manejo realizadas por el ganadero, las cuales no pudieron ser determinadas. Tabla 3.2: Asociación entre las variables sistema de ordeño y frecuencia de limpieza frente a los LURL de cada superficie Agua potable Sistema ordeño Detergente ácido Si No Sala Circuito Cántara No Semanal Varios semana Diario Pezoneras media (SD) Sig 1,91 2,21 (0,66) (0,65) 0,04 1,98 1,76 2,74 (0,61) (0,58) (0,64) 0,00 2,38 1,94 2,09 1,99 (0,47) (0,68) (0,69) (0,66) 0,35 Colectores media (SD) Sig 2,19 2,23 (0,90) (1,01) 0,85 2,22 2,26 2,02 (0,90) (1,05) (0,81) 0,77 2,43 2,18 2,23 2,32 (0,74) (0,92) (0,63) (1,15) 0,89 Unidad final media (SD) Sig 1,86 2,66 (0,97) (1,12) 0,02 1,76 2,33 (1,03) (1,02) 0,06 0,78 1,82 2,55 2,67 (0,82) (1,21) (1,20) 0,04 Puntos circuito media (SD) Sig 2,75 3,07 (1,14) (1,37) 0,55 2,89 (1,23) 0,06 2,39 2,81 3,15 (1,37) (1,03) (1,13) 0,87 ________________________________________________________________ ATP bioluminiscencia 87 Influencia de los logaritmos de las unidades relativas de luz en las distintas superficies del equipo de ordeño sobre el recuento bacteriano en el tanque En las figuras 3.1, 3.2, 3.3 y 3.4 se representan la asociación entre los LURL en las superficies analizadas y los LRB del tanque de leche según las tres categorías de granjas. Con objeto de poder considerar una limpieza adecuada, los valores de referencia de ATP para cada superficie del equipo de ordeño se establecieron en base a la media de los LURL obtenidos en cada superficie en las granjas pertenecientes a la clase A, obteniéndose 2,18, 2,38, 2,45 y 3,26 para las pezoneras, colectores, unidades finales y puntos de conexión al circuito, respectivamente, los cuales al transformarlos en URL correspondieron a 152, 242, 282 y 1821 en las superficies mencionadas. Estos valores suponen un límite alcanzable por todos los ganaderos cuyo objetivo sea la mejora de la higiene de los equipos de ordeño, así a partir de dichos valores podemos indicar que el 63,2%, 62,7%, 67,3% y el 60,9% de las superficies de pezoneras, colectores, unidades finales y puntos de conexión al circuito presentaban una limpieza adecuada. Capítulo 3 ___________________________________________________________________________ 88 Figura 3.1: Gráfico de dispersión del LRB total en tanque frente al LURL de la superficie de las pezoneras, con el punto de corte para la limpieza establecido en 2,18 LURL (152 URL) ● Clase A (20×103 ufc/ml), ■ Clase B (20-100×103 ufc/ml), ▲Clase C (<100×103 ufc/ml) Figura 3.2: Gráfico de dispersión del LRB total en tanque frente al LURL de la superficie de los colectores, con el punto de corte para la limpieza fijado en 2,38 LURL (242 URL) ● Clase A (20×103 ufc/ml), ■ Clase B (20-100×103 ufc/ml), ▲Clase C (<100×103 ufc/ml) 4,003,002,001,00 LURL Pezonera 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 LRB 5,004,003,002,001,00 0,00 LURL Colector 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 LRB ________________________________________________________________ ATP bioluminiscencia 89 Figura 3.3: Gráfico de dispersión del LRB total en tanque frente al LURL de la superficie de las unidades finales, con el punto de corte para la limpieza establecido en 2,45 LURL (282 URL) ● Clase A (20×103 ufc/ml), ■ Clase B (20-100×103 ufc/ml), ▲Clase C (<100×103 ufc/ml) Figura 3.4: Gráfico de dispersión del LRB total en tanque frente al LURL de la superficie de los puntos de conexión al circuito, con el punto de corte para la limpieza fijado en 3,26 LURL (1821 URL) ● Clase A (20×103 ufc/ml), ■ Clase B (20-100×103 ufc/ml), ▲Clase C (<100×103 ufc/ml) 5,004,003,002,001,00 0,00 LURL Unidad final 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 LRB 5,004,003,002,001,00 0,00 LURL Puntos Circuito 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 LRB Capítulo 3 ___________________________________________________________________________ 90 En la tabla 3.3 se presentan los resultados obtenidos mediante el análisis de regresión lineal múltiple, estimados para el valor del RB con las variables independientes LURL de las pezoneras (LURLpz), de los colectores (LURLcol), de las unidades finales (LURLuf) y de los puntos de conexión al circuito (LURLpc): Tabla 3.3: Análisis de regresión regresión lineal múltiple para el RB con los logaritmos de cada superficie Coeficientesa Coeficientes no estandarizados Coeficientes estandarizados IC para β al 95% Modelo β Error típico β t Sig. Límite inferior Límite superior Constante 1,93 1,15 1,68 0,12 -0,57 4,43 LURLpz 0,30 0,33 0,26 0,91 0,38 -0,42 1,02 LURLcol -0,09 0,21 -0,12 -0,40 0,69 -0,55 0,38 LURLuf -0,08 0,16 -0,14 -0,48 0,64 -0,43 0,27 LURLpc -0,05 0,14 -0,09 -0,34 0,74 -0,36 0,26 a. Variable dependiente: LRB Con los resultados conseguidos mediante la regresión lineal múltiple se obtuvo la siguiente ecuación de regresión: LRB = 1,93 + 0,30×LURLpz – 0,09×LURLcol – 0,08×LURLuf – 0,05×LURLpc con un coeficiente de determinación r2 = 0,12 (P = 0,78), es decir, la higiene del equipo de ordeño sólo explicaría el 12% del RB total de la leche, ya que al RB contribuyen otras fuentes de contaminación como son el estado sanitario de la vaca o las condiciones del tanque de refrigeración. Además la mayoría de las superficies evaluadas pertenecían a granjas con medias de RB inferiores a 20×103 ufc/ml. A pesar de que otros estudios de bioluminiscencia sobre superficies obtienen valores superiores en coeficiente de determinación, no son comparables al establecido en este trabajo, puesto que no analizaron superficies de equipos de ordeño (Siragusa y col., 1995; Finger y Sischo, 2001; Samkutty y col., 2001). Existen investigaciones que indican que, en condiciones normales, la higiene de la superficie interna en los conductos y recipientes por los que discurre la leche supone entre el 50-80% del RB final en la leche del tanque de refrigeración (Marco, 1998); sin embargo, con nuestros resultados no se puede establecer una relación aceptable entre los LURL en las superficies del equipo de ordeño y el LRB en leche del tanque de refrigeración. Pero no contradice la relación existente entre las ufc determinadas en cultivos puros y las URL producidas en un entorno estable de ATP, cuando ambos valores ________________________________________________________________ ATP bioluminiscencia 91 son medidos en la misma superficie. A pesar de estos resultados, es fundamental una buena higienización tanto del equipo de ordeño como del tanque de refrigeración (Poulis y col., 1993). La presencia de bacterias, principalmente psicótrofas Gram negativas y de otros restos orgánicos, en los sistemas de conducción o almacenamiento de la leche se debe generalmente a un inadecuado programa de limpieza y desinfección y/o mantenimiento del equipo (Marco, 1998; Murphy y col., 1998). Por lo tanto, se considera el RB como un indicador de la higiene con la que se manipula la leche, por lo que se ha utilizado tradicionalmente como un método indirecto y no muy sensible de la limpieza del equipo de ordeño, ya que intervienen más factores en la calidad higiénica de la leche como la preparación correcta de las ubres (limpieza del pezón y realización de despuntado), la calidad del agua utilizada y principalmente el funcionamiento del tanque de refrigeración que supone uno de los factores más importantes, así como el tiempo que permanece la leche en su interior (Nieuwenhof, 1996; Marco, 1998). Por todo ello, la utilización de la ATP bioluminiscencia es útil para evaluar la higiene de las superficies de contacto con la leche y la repercusión sobre el RB en explotaciones ganaderas (Nieuwenhof, 1996), especialmente dentro de un programa de APPCC, al ser una técnica de fácil aplicación con obtención rápida de resultados que incluso podría utilizarse como un método objetivo para demostrar a los ganaderos la eficacia de la limpieza (Seeger y Griffiths, 1994; Aycicek y col., 2006). Con excepción de alguna comunicación en congresos (Slaghuis y Wiegersma, 1996; De Celis, 2006), este es el primer trabajo científico que utiliza la ATP bioluminiscencia en superficies de equipo de ordeño, por lo que son necesarios nuevos estudios para evaluar la higiene del mismo mediante esta técnica y su relación con la calidad microbiológica de la leche del tanque de refrigeración. Capítulo 3 ___________________________________________________________________________ 92 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Aycicek, H.; Oguz, U.; Karci, K. 2006. Comparison of results of ATP bioluminescence and traditional hygiene swabbing methods for the determination of surface cleanliness at a hospital kitchen. Int J Hyg Environ Health, 209: 203-206. Brovko, L. Y.; Froundjian, V. G.; Babunova, V. S.; Ugarova, N. N. 1991. Quantitative assessment of bacterial contamination of raw milk using bioluminescence. J Dairy Res, 66: 627-631. Champiat, D.; Matas, N.; Monfort, B.; Frass, H. 2001. Applications of biochemiluminescence to HACCP. Luminescence, 16: 193-198. Corbitt, A. J.; Bennion, N.; Forsythe, S. J. 2000. Adenylate kinase amplification of ATP bioluminescence for hygiene monitoring in the food and beverage industry. Lett Appl Microbiol, 30: 443-447. Davidson, C. A.; Griffith, C. J.; Peters, A. C.; Fielding, L. M. 1999. 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En el 7,2% de las muestras de ensilado analizadas se encontró más de una especie del género Listeria, mientras que en las muestras de heces se aislaron de forma conjunta varias especies en el 3,1% de los casos. Normalmente el porcentaje de aislamientos de Listeria spp. en heces de animales sanos varía ampliamente debido, aparentemente, a los diferentes métodos de muestreo y aislamiento (Husu, 1990). Así, de las 97 muestras de heces analizadas, se detectó Listeria spp. en el 41,2%, valor situado entre el 8% de Suecia (Unnerstad y col., 2000) y 9,6% de Finlandia (Husu, 1990), y el 81% de Francia (Sanaa y col., 1996). La eliminación de Listeria spp. en las heces de animales clínicamente sanos demuestra que las heces de estos animales pueden ser una fuente de contaminación de la leche (Unnerstad y col., 2000). L. innocua se identificó en el 22,7% de las muestras, prevalencia muy superior a los valores encontrados por otros autores, 2% (Unnerstad y col., 2000) y 4,6% (Husu, 1990); mientras que L. monocytogenes se encontró en el 9,3% de las heces estudiadas, porcentaje similar a los encontrados por Unnerstad y col. (2000) 6% y Husu (1990) 6,7%, pero bastante inferior al 39% encontrado por Sanaa y col. (1996). En cuanto a otras especies del género, el 4,1% de las muestras de heces presentaron L. welshimeri, valor superior al 0,2% encontrado por Husu (1990), que es el único de los autores citados que hace referencia a esta especie. Además en el 4,1% de las heces se detectó L. grayi, mientras que L. ivanovii solo se detectó en el 1,0%. Estas dos últimas especies no fueron mencionadas en ningún otro estudio realizado previamente. L. seeligeri no fue detectada en este estudio como tampoco por otros autores (Sanaa y col., 1996; Unnerstad y col., 2000), aunque sí por Husu (1990), pero únicamente en el 0,1% de las muestras analizadas. En el 33,7% de los ensilados se aisló Listeria spp., valor comprendido entre el 22,7% encontrado en Finlandia (Husu, 1990) y el 62% en Francia (Sanaa y col., 1996). Si se comparan los resultados de nuestro trabajo con los que se llevaron a cabo en otros países, en general se observa un menor porcentaje de muestras positivas a L. monocytogenes Capítulo 4 ___________________________________________________________________________ 102 (6,0%), siendo esta prevalencia sólo superior al 3% encontrado por Rea y col. (1992) en Irlanda, pero muy inferior al 16% detectado en Finlandia (Husu, 1990) y el 39% en Francia (Sanaa y col., 1996). En un 19,3% de las muestras se aisló L. innocua, valor superior al 6% encontrado por Rea y col. (1992). Otras especies de listerias se encontraron en menos ocasiones, así el 4,8% de las muestras presentaban L. welshimeri, el 2,4% L. grayi y el 1,2% L. seeligeri. Listeria spp. fue aislada en muestras de ensilado cuyos valores de pH oscilaban entre 4,47 y 6,97, intervalo diferente al observado en otros trabajos, 3,8 – 5,2 de Rea y col. (1992) ó el 5,78 – 5,89 de Ryser y col. (1997). Nuestro valor se ajustaría más al límite crítico de pH del 4,5 para la multiplicación de la listeria. Tabla 4.2: Asociación entre factores de riesgo y presencia de Listeria spp. en el ensilado Variables Nº granjas positivas (%) P OR IC pH ≥ 4.5 No 1/16 (6,2%) Si 18/61 (29,5%) 0,05 6,28 0,77 – 51,16 Conservación Trinchera 9/35 (25,7%) 1,00 Bolsas 3/12 (25,0%) 0,97 Zanjas 8/28 (28,6%) 0,96 1,11 Asociaciones analizadas para un nivel de probabilidad de 95% (P ≤ 0,05) En la Tabla 4.2 se puede observar que la presencia de Listeria spp. en el ensilado está relacionada con el pH del mismo (P = 0,05). Cuando el pH es igual o superior a 4,5 el riesgo de presentar bacterias de este género aumenta (OR = 6,28). Una insuficiente acidificación del ensilado puede favorecer el crecimiento de Listeria spp., sobre todo, cuando el pH es superior a 4,5 (Sanaa y col., 1993), aunque otros autores consideran un ensilado mal fermentado cuando el pH es superior a 4,0 (Sanaa y Ménard, 1994; Ryser y col., 1997). El modo de conservación del ensilado también influye en la presencia de este patógeno (Tabla 4.2). El riesgo de presencia de Listeria spp. en los ensilados según el modo de conservación fue similar, aunque cuando se conservaba en zanjas sobre tierra era ligeramente mayor y cuando estaba en bolsas era menor en comparación al almacenamiento en trincheras, probablemente debido a las diferencias higiénicas entre los tres procedimientos de ensilado. ___________________________________Prevalencia y factores de riesgo asociados a Listeria spp. 103 Relación entre el aislamiento Listeria en ensilado y/o heces y leche La Tabla 4.3 muestra las asociaciones entre los aislamientos de Listeria spp. en ensilados, heces y leche. En el 4,1% de las explotaciones visitadas se aisló Listeria spp. de manera simultánea en los tres tipos de muestras, en el 9,2% se detectó en heces y leche, en el 8,2% en ensilado y heces y en el 6,1% en ensilado y leche, mientras que en otros estudios el porcentaje de granjas positivas a las tres muestras se incrementa hasta el 50% (Rea y col., 1992). La presencia de Listeria spp. en ensilados y heces es un factor de riesgo para que también se encuentre en la leche del tanque de refrigeración. Según Sanaa y Ménard (1994) la presencia de L. monocytogenes en ensilados y/o en heces multiplica por 20 el riesgo de contaminación de la leche. Nuestro estudio confirma el aumento de ese riesgo, aunque los factores por los que se multiplica, son sensiblemente menores, y están comprendidos entre 2 y 3. Tabla 4.3: Asociación entre los aislamientos de Listeria spp. en ensilado, heces y leche Nº Listeria spp. positivas leche (%) P OR IC Listeria spp. ensilado No 8/62 (12,9%) Si 6/21 (28,6%) 0,10 2,70 0,81 – 8,99 Nº Listeria spp. positivas leche (%) Listeria spp. heces No 7/60 (11,7%) Si 9/37 (24,3%) 0,10 2,43 0,82 – 7,23 Nº Listeria spp. positivas heces (%) Listeria spp. ensilado No 24/61 (39,3%) Si 8/21 (38,1%) 0,92 0,95 0,34 – 2,63 Asociaciones analizadas para un nivel de probabilidad de 95% (P ≤ 0,05) En el 28,6% de las explotaciones que presentaron Listeria spp. en ensilado también se aisló en leche. Al igual que lo afirmado por Sanaa y col. (1993), el riesgo de contaminación de la leche aumentó en aquellas explotaciones con un ensilado de mala calidad y que además realizaban el ordeño de manera higiénicamente deficiente. El 24,3% de las granjas en las que se encontró Listeria spp. en heces también la presentaron en leche, porcentaje muy similar al 24,4% encontrado por Husu (1990). Otros trabajos también consideran el material fecal como una potencial fuente de contaminación exógena de la leche, principalmente durante el ordeño y debido a un mal manejo higiénico (Sanaa y col., 1996). El 38,1% de las explotaciones que presentaron Listeria spp. en ensilado también la presentaron en heces, valor inferior al 61,5% encontrado por Husu (1990). Sin Capítulo 4 ___________________________________________________________________________ 104 embargo, la presencia de Listeria spp. en heces cuando también está presente en el ensilado es similar a cuando no se aísla del ensilado. En este trabajo, lo mismo que en el de Husu (1990) no se encontraron diferencias (P = 0,92) entre la contaminación de heces de animales clínicamente sanos y el consumo de ensilado, aunque en otros estudios sí se encontraron (Ryser y col., 1997). La excreción por heces puede tener su origen en la contaminación del alimento ingerido (Husu, 1990; Sanaa y col., 1993), pero también en la contaminación ambiental de la granja (Van Kessel y col., 2004). Factores de riesgo para la presencia de Listeria spp. en la leche La interpretación del efecto de una práctica de manejo sobre la presencia de Listeria spp. debe hacerse en base a la biología de este microorganismo (Hassan y col., 2001), aunque no siempre exista una relación estadísticamente significativa. La Tabla 4.4 recoge la asociación estadística entre los factores de riesgo y la presencia de Listeria spp. en la leche. Dentro de las condiciones generales del establo se estudió la influencia de la ventilación y la limpieza sobre la presencia del microorganismo en la leche. De acuerdo con otros autores (Hassan y col., 2001), en este estudio se comprobó que la ventilación está relacionada con la presencia de esta bacteria en la leche; observándose que cuando la ventilación del establo es la adecuada disminuye el riesgo de aparición de Listeria spp. (OR = 0,63). Esto se debe a que con una buena ventilación disminuye la concentración de gases, polvo y microorganismos patógenos, como Listeria spp. en el ambiente, con lo que el riesgo de exposición de los animales es menor. La probabilidad de encontrar leche contaminada por Listeria spp. fue menor cuando el establo se encontraba en buenas condiciones higiénicas (OR = 0,86). La higiene insuficiente en el establo, principalmente en las camas, aumenta la exposición a los microorganismos patógenos, entre ellos Listeria spp., lo que constituye un importante factor ambiental para la contaminación de la leche. ___________________________________Prevalencia y factores de riesgo asociados a Listeria spp. 105 Tabla 4.4: Asociación entre los factores de riesgo, condiciones del establo y manejo del ordeño, y la presencia de Listeria spp. en leche de tanque Variables Nº granjas positivas (%) P OR IC Condiciones del establo Ventilación Pobre 5/23 (21,7%) Buena 11/74 (11,9%) 0,44 0,63 0,19 – 2,05 Limpieza Pobre 6/36 (16,7%) Buena 9/61 (14,7%) 0,80 0,86 0,28 – 2,67 Manejo durante el ordeño Sist. Ordeño Sala 4/40 (10,0%) 1,00 Circuito 12/42 (28,6%) 2,87 Otros 0/15 (0,0%) 0,01 0 ¿Identifica mamitis? No 12/58 (20,7%) Si 4/39 (10,3%) 0,17 0,44 0,13 – 1,47 ¿Orden ordeño? No 8/25 (32%) Si 7/65 (10,7%) 0,01 0,26 0,08 – 0,81 ¿Despuntado? No 2/20 (10,0%) Si 14/76 (18,4%) 0,37 2,03 0,42 – 9,79 ¿Vacas se tumban postordeño? No 8/64 (12,5%) Si 7/30 (23,3%) 0,18 2,13 0,69 – 6,56 Asociaciones a nivel de explotación analizadas para un nivel de probabilidad de 95% (P ≤ 0,05) Por otra parte, el manejo inadecuado durante la rutina de ordeño favorece la contaminación de la leche por bacterias patógenas como Listeria spp. que puede llegar a la leche a partir de la suciedad de las ubres y pezones de los animales o de las pezoneras del equipo de ordeño. Es importante, por lo tanto, realizar una correcta higienización de los pezones y, en general, de todo el proceso de ordeño para eliminar los microorganismos que se encuentran sobre las ubres antes de proceder al ordeño y disminuir de esta forma la incidencia de infecciones (Rohrbach y col., 1992; Sanaa y col., 1993; Hassan y col., 2001). Sin embargo, en el 96,8% de las explotaciones incluidas en este trabajo se llevaba a cabo una limpieza de pezones antes de la colocación de las pezoneras y, a pesar de ello, en el 16,5% se detectó Listeria spp. en la leche. Esto quizá fue debido a que esta práctica no se hacía de forma adecuada o a la influencia de alguno de los otros factores de riesgo mencionados en este trabajo. Capítulo 4 ___________________________________________________________________________ 106 En el ordeño en plaza proteger la leche de la contaminación ambiental es más difícil que cuando se hace en sala, por lo que el RB suele ser más elevado (Hassan y col., 2001) como se pudo comprobar en este estudio (χ2 = 11,26, P = 0,02); del mismo modo, la contaminación de la leche por Listeria spp. también es más probable. El 41,2% de las ganaderías disponían de sala de ordeño y el 43,3% ordeñaban en circuito, siendo en estos últimos la probabilidad de encontrar Listeria spp. en la leche casi 3 veces mayor (OR = 2,87) que en los que ordeñaban en sala. Al contrario que en otros trabajos (Rohrbach y col., 1992), en nuestro estudio pudimos observar una relación significativa entre el sistema de ordeño y la presencia de esta bacteria en leche (P = 0,01). Únicamente el 40,2% de los ganaderos identificaban correctamente las vacas con mamitis y, en éstos, la probabilidad de contaminación de la leche con Listeria spp. fue menor (OR = 0,44). Aunque estos microorganismos se aíslan con baja prevalencia de las glándulas mamarias, es decir, su asociación con mamitis es infrecuente (Rea y col., 1992; Rohrbach y col., 1992; Sanaa y col., 1996) existe riesgo de contaminación de la leche, por lo que es imprescindible la detección de animales que sufran mamitis por Listeria spp. (Sanaa y col., 1996). Además, el seguir un apropiado orden de ordeño dificulta la transmisión de bacterias entre los animales y la contaminación del equipo de ordeño, con lo que se reduce la probabilidad de aparición de Listeria spp. en la leche del tanque. En este trabajo se comprobó que la contaminación de la leche por este patógeno era mayor cuando no se seguía un orden correcto (P = 0,01, OR = 0,26). Con menor frecuencia, Listeria spp. puede alcanzar la leche del tanque cuando está asociada a mamitis clínica o subclínica; en ese caso, al eliminar los primeros chorros se elimina la leche de baja calidad que presenta altas concentraciones de bacterias. Por eso es importante realizar el despuntado, práctica que realizaban en la mayoría las explotaciones (79,2%), aunque no se encontró relación (P = 0,37) con la presencia de Listeria spp. en leche. Asociación con los resultados de calidad higiénica de la leche La mayoría de las explotaciones presentaron RCS menores a 400×103 cel/ml (83,9%), siendo el 34,5% inferior a 200×103 cel/ml. En el 96,5% de las granjas el RB fue inferior a 100×103 ufc/ml, siendo el 42,4% inferior a 20×103 ufc/ml. Al evaluar la distribución de las variables RCS y RB se comprueba que no siguen una distribución normal (P = 0,00 para ___________________________________Prevalencia y factores de riesgo asociados a Listeria spp. 107 los grupos que no presentan Listeria spp.). Al aplicar la prueba no paramétrica U de Mann-Whitney para el RCS y el RB, en ambos casos no hubo diferencias (P = 0,64 y P = 0,89, respectivamente), aunque se detectara Listeria spp. en la leche; sin embargo, ambos recuentos fueron ligeramente superiores, 252×103 cel/ml y 29×103 ufc/ml, frente a 250×103 cel/ml y 26×103 ufc/ml (rango promedio = 46,8 y 43,8, respectivamente) (Tabla 4.5). Si el RCS se considera un indicador de la presencia de infecciones mamarias, podría utilizarse también relacionado con la prevalencia de patógenos zoonóticos. Considerando el RCS como una variable con tres categorías: < 200×103 cel/ml, 200-400×103 cel/ml y > 400×103 cel/ml, su relación con el aislamiento de Listeria spp. no manifestó diferencias entre las tres categorías (P = 0,32), al igual que en los trabajos de Hassan y col. (2000), Rorhbach y col. (1992) y Van Kessel y col. (2004). No obstante, la probabilidad de encontrar Listeria spp. es mayor cuando las muestras proceden de leche de las categorías con mayores recuentos (OR = 2,33 y OR = 1,43). Al evaluar el RB en la leche del tanque como variable con tres categorías < 20×103 ufc/ml, 20-100×103 ufc/ml y >100×103 ufc/ml frente la presencia de Listeria spp., no se encontró una relación significativa. Sin embargo, el riesgo de aislar esta bacteria fue mayor cuando la leche procedía de la categoría intermedia (OR = 1,56), aunque debe tenerse en cuenta que cuando este valor está incrementado puede disminuir la probabilidad de aislar bacterias del género Listeria, ya que podría estar enmascarada su presencia por el crecimiento de otras bacterias, dando falsos negativos (Fernández-Garayzabal y col., 1987). Tabla 4.5: Medias geométricas del RCS (×103 cel/ml) y el RB (×103 ufc/ml) en muestras de leche con y sin Listeria spp. Media RCS P Media RB P Sin Listeria 250 26 Con Listeria 252 0,64 29 0,89 Asociaciones analizadas para un nivel de probabilidad de 95% (P ≤ 0,05) Unas prácticas de manejo correctas, tanto en la elaboración del ensilado, como en el mantenimiento de las condiciones higiénicas del establo y por supuesto en la rutina del ordeño son básicas para evitar la introducción de la bacteria en el rebaño, su dispersión en el mismo y su llegada a la leche durante el ordeño como consecuencia de una contaminación ambiental. El riesgo de contaminación de la leche por Listeria spp. aumenta cuando se alimenta a los animales con un ensilado de mala calidad, Capítulo 4 ___________________________________________________________________________ 108 principalmente cuando su pH es igual o superior a 4,5. La prevalencia de Listeria spp. y L. monocytogenes, en particular, en leche de tanque fue similar a la de otros estudios realizados previamente. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Bastien, J.; Brouillet, P. 2000. Mieux gérer au quotidien les pathologies dans les élevages en tenant compte du risque sanitaire pour le lait: un impératif pour les vétérinaires de demain. SNGTV. Commission Qualité du Lait. Paris. Bell, C.; Kyriakides, A. 2000. Listeria: una aproximación práctica al microorganismo y su control en los alimentos. Ed. Acribia, Zaragoza, España. Cooper, J.; Walker, R. D. 1998. Listeriosis. Microbial foodborne pathogens. Vet Clin N Am-Food Anim Pract, 14: 113-125. Farber, J. M.; Sanders, G. W.; Malcolm, S. A. 1988. The presence of Listeria spp in raw milk in Ontario. Can J Microbiol, 34: 95-100. Fenlon, D. R.; Wilson, J. 1989. The incidence of L. monocytogenes in raw milk from farm bulk tanks in North-East Scotland. J Appl Bacteriol, 66:191-196. Fernández-Garayzabal, J. 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Una colonia de cada uno de los diferentes tipos de colonias sospechosas sobre los distintos tipos de medio fue seleccionada y se examinó en microscopio de campo oscuro. Las colonias con morfología y movimiento compatibles con Arcobacter spp. se purificaron por siembra en placas de agar base para anaerobios con 5% de sangre de caballo lacada. La identificación se realizó utilizando una técnica de PCR múltiple previamente descrita (Houf y col., 2000). Análisis de datos Los datos obtenidos fueron analizados usando los programas Microsoft Excel y el estadístico SPSS 13.0. Las explotaciones que tenían como mínimo un animal positivo para Arcobacter spp. fueron consideradas positivas para la correspondiente especie bacteriana. Para evaluar la asociación entre las variables consideradas como potenciales factores de riesgo y el aislamiento de las bacterias en heces, se realizó la prueba de χ2 para variables categóricas, considerándose una significación del 95% de probabilidad con una significación estadística P ≤ 0,05 y 1 grado de libertad. RESULTADOS Los porcentajes de positividad de las diferentes especies de Arcobacter en heces procedentes de explotaciones de ganado vacuno lechero se reflejan en la Tabla 5.1. Del total de las 89 granjas visitadas durante el estudio, 61 (68,5%) fueron positivas a Arcobacter spp. Capítulo 5 ___________________________________________________________________________ 118 Tabla 5.1: Distribución de Arcobacter spp. aislados de heces de vacas lecheras Distribución Arcobacter spp.(%) Nº muestras M.Positivos1 (%) Ac2 As2 Ab2 Ni3 Heces 254 106 (41,7%) 71 (27,9%) 51 (20,1%) 19 (7,5%) 7 (2,8%) 1M. positivos= animales positivos a Arcobacter spp. 2Ac= Arcobacter cryaerophilus, As= Arcobacter skirrowii, Ab= Arcobacter butzleri 3Ni= aislamientos no identificados En relación a los animales individuales, 106 (41,7%) de las 254 muestras de heces analizadas fueron positivas a Arcobacter spp. Mediante la aplicación de una PCR múltiple, se comprobó que la prevalencia de las especies pertenecientes al género Arcobacter fue la siguiente: A. cryaerophilus 27,9% (71/254), A. skirrowii 20,1% (51/254) y A. butzleri 7,5% (19/254). Las infecciones mixtas no fueron frecuentes y únicamente un 15,3% de las vacas presentaron heces contaminadas por varias especies de Arcobacter simultáneamente en 30 explotaciones analizadas. La distribución de las especies identificadas fue del 48,0%, 34,5% y 12,8% para A. cryaerophilus, A. skirrowii y A. butzleri, respectivamente, obteniéndose 7 aislados que no pudieron ser identificados. Tabla 5.2: Prácticas de manejo y su relación con al aislamiento de Arcobacter spp. en heces de ganado vacuno lechero Arcobacter spp. Variables Nº granjas positivas (%) P OR IC del OR Compra animales No 27/42 (64,3%) Si 27/34 (79,4%) 0,14 2,14 0,75-6,08 Agua de bebida clorada No 44/65 (67,7%) Si 17/24 (70,8%) 0,78 1,16 0,42-3,22 Bebederos de uso individual No 43/58 (74,1%) Si 18/31 (58,1%) 0,12 0,48 0,19-1,22 Limpieza diaria bebederos No 47/65 (72,3%) Si 14/22 (63,6%) 0,44 0,67 0,24-1,87 Análisis ensilado No 11/15 (73,3%) Si 49/73 (67,1%) 0,63 0,74 0,21-2,58 Salida a pastos No 37/51 (72,6%) Si 23/37 (62,2%) 0,30 0,62 0,25-1,54 Limpieza pasillos No 18/23 (78,3%) Si 42/65 (64,6%) 0,22 0,51 0,17-1,54 ________________________________ Distribución de Arcobacter spp. en heces de vacuno lechero 119 Los diversos aspectos relacionados con el manejo en las explotaciones estudiadas y los resultados obtenidos al aplicar los tratamientos estadísticos mencionados anteriormente están reflejados en la Tabla 5.2. No se establecieron relaciones significativas entre el aislamiento de Arcobacter spp. en heces de vacas y los factores evaluados. DISCUSIÓN De las 89 explotaciones visitadas, el 68,5% presentaron como mínimo un animal positivo a Arcobacter spp. Este valor se encuentra por debajo del descrito por Wesley y col. (2000) que en 31 granjas de vacuno lechero localizadas en diferentes regiones de EE.UU., observaron que el 71% de las mismas eran positivas. Por tanto, el porcentaje de explotaciones con infecciones por Arcobacter spp. puede reflejar grandes variaciones según el país o área geográfica estudiada, y de manera más significativa la metodología analítica empleada (Van Driessche y col., 2003). El porcentaje de Arcobacter spp. en las muestras fecales de los animales analizados en nuestro estudio fue del 41,7%, valor claramente superior a los indicados en los estudios realizados en vacas lecheras clínicamente sanas hasta la actualidad: 12% en 31 explotaciones de EE.UU. (Wesley y col., 2000), 11% en tres rebaños belgas (Van Driessche y col., 2005), 10% y 9,5% en muestras fecales recogidas en mataderos en Bélgica y Turquía, respectivamente (Van Driessche y col., 2003; Öngor y col., 2004) y 3,6% en 18 granjas japonesas (Kabeya y col., 2003). La comparación de estos datos debe realizarse con cautela, ya que existen diferencias evidentes en cuanto al diseño del estudio, el tamaño de muestra y los métodos de aislamiento e identificación utilizados (Wesley y col., 2000; Kabeya y col., 2003; On y col., 2003; Van Driessche y col., 2005). Así, la prevalencia detectada en heces de ganado vacuno en matadero se incrementó del 10%, aplicando el aislamiento directo, al 39% después de un método de enriquecimiento (Van Driessche y col., 2003). Por otra parte, podría influir que la transmisión de las especies de Arcobacter se produce más frecuentemente en climas cálidos (Golla y col., 2002; Van Driessche y col., 2005) como el de España, o también variaciones de prevalencia debido a las diversas prácticas de limpieza utilizadas, ya que el uso de agua a presión para eliminar el estiércol, la utilización de bebederos individuales y el tipo de alimentación Capítulo 5 ___________________________________________________________________________ 120 proporcionada a los animales pueden incrementar la presencia de Arcobacter spp. (Golla y col., 2002; Öngor y col., 2004; Van Driessche y col., 2005). En cuanto al porcentaje de las diferentes especies de Arcobacter, indicar que A. cryaerophilus fue la especie predominante con un 27,9%, seguida por A. skirrowii con 20,1%, al contrario de lo observado en otros trabajos, en los cuales la especie más frecuentemente aislada fue A. butzleri con 3%, 7% y 25,5%, respectivamente (Kabeya y col., 2003; Öngor y col., 2004; Van Driessche y col., 2003). En general, las diferencias en cuanto a las prevalencias encontradas para las distintas especies de Arcobacter pueden deberse a que en los diferentes trabajos se estudiaron distintos animales (terneros, animales adultos, toros, vacas de aptitud láctea y cárnica), fueron analizadas diversas muestras (heces, canales en matadero, hisopos vaginales y rectales, etc.) y los estudios se desarrollaron en diferentes localizaciones geográficas y en distintas estaciones del año (Wesley y col., 2000; Kabeya y col., 2003; Van Driessche y col., 2003; Öngor y col., 2004; Van Driessche y col., 2005). A. cryaerophilus fue la especie más frecuentemente identificada, representando el 48,0% de todos los aislados obtenidos, valor muy superior a los observados en otros estudios (Kabeya y col., 2003; Van Driessche y col., 2003; Öngor y col., 2004). A. skirrowii y A. butzleri representaron el 34,5% y 12,8%, respectivamente, valores que difieren a los encontrados por otros autores que detectaron A. skirrowii en un 46% (Van Driessche y col., 2005) y A. butzleri en un 51,5% (Wesley y col., 2000). En la valoración de estos resultados deberá tenerse en cuenta la influencia que ejerce el método de aislamiento utilizado sobre las especies de Arcobacter detectadas, ya que la mayoría de las técnicas utilizadas no son óptimas para Arcobacter spp. (Kabeya y col., 2003; Van Driessche y col., 2005). En nuestro estudio, las infecciones simultáneas por más de una especie de Arcobacter se observaron en 30 granjas y en el 36,8% de las granjas positivas, valor similar al obtenido por Van Driessche y col. (2005) y muy superior al 10% comprobado en un estudio realizado en matadero (Van Driessche y col., 2003). Se necesitan realizar más estudios epidemiológicos para determinar el origen de cada especie de Arcobacter y el significado de las infecciones mixtas. Otro de los objetivos del estudio fue intentar identificar si algunas prácticas de manejo del ganado podían estar relacionadas con la presencia de Arcobacter spp. en el tracto intestinal de las vacas. Ninguno de los potenciales factores de riesgo estudiados presentó una ________________________________ Distribución de Arcobacter spp. en heces de vacuno lechero 121 relación significativa con la aparición de estos microorganismos en heces de las vacas en lactación. Al igual que lo descrito por Wesley y col. (2000), la utilización de agua de bebida clorada no fue un factor de protección frente a la presencia de Arcobacter spp.; sin embargo, la aplicación de unas buenas prácticas de cloración del agua de bebida son necesarias para inactivar estos microorganismos (Rice y col., 1999; Moreno y col., 2004; Öngor y col., 2004), ya que tanto el agua de bebida y de limpieza como el material utilizado en la granja puede ser un vector para la dispersión de estas bacterias y también una fuente de contagio importante para los animales (Van Driessche y col., 2005). El uso o no de bebederos individuales tampoco presentó una relación significativa (P = 0,12) con la presencia de Arcobacter spp., comprobándose que la proporción de aislamientos de Arcobacter spp. fue mayor cuando los bebederos eran de uso colectivo (OR = 0,48). Resultados similares fueron observados por Wesley y col. (2000), en cuyo estudio los bebederos individuales fueron un factor de protección frente a la presencia de Arcobacter spp. En aquellas ganaderías que compraban animales de reposición, la presencia de Arcobacter spp. era mayor (OR = 2,14). Este resultado es similar al encontrado por Wesley y col. (2000), aunque nosotros lo valoramos con un grado de significación más estricto. La compra de animales sin chequeos sanitarios es un factor de riesgo importante para la introducción de diversos microorganismos en las explotaciones ganaderas. En algunos estudios se han evaluado otros parámetros como posibles variables de influencia en la aparición de las especies de Arcobacter en explotaciones bovinas como son el modo de retirada del estiércol y su uso como abono, el tipo de alimentación de los animales y la presencia o no de roedores y/o aves con acceso al alimento, obteniéndose resultados muy diferentes (Wesley y col., 2000; Van Driessche y col., 2005). Todo esto indica que son necesarios más estudios sobre factores de riesgo para evaluar que condiciones de manejo o características ambientales de las explotaciones actúan como factores predisponentes o protectores para este tipo de infecciones. Este trabajo es el primer reportaje sobre la prevalencia de diversas especies de Arcobacter entre explotaciones de bovino lechero en España y sugiere determinados factores de riesgo Capítulo 5 ___________________________________________________________________________ 122 en explotaciones para futuras investigaciones. Las prevalencias de Arcobacter spp. en heces a partir de ganado vacuno lechero obtenidas con este protocolo fueron más elevadas que las reflejadas en otros estudios. La eliminación de Arcobacter spp. en las heces de los animales es importante por el papel que desempeña en la entrada de la cadena alimentaria. Por lo tanto, es necesario realizar nuevos estudios para una mejor compresión de la epidemiología de las especies de Arcobacter en el ganado vacuno lechero, prestándoles mayor atención como patógenos zoonóticos de origen alimentario. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Atabay, H. I.; Corry, J. E. L. 1998. Evaluation of a new arcobacter enrichment mediun and comparison with two media developed for enrichment of Campylobacter spp. Int J Food Microbiol, 41: 53-58. Donachie S. P.; Bowman, J. P.; On, S. L. W.; Alam, M. 2005. Arcobacter halophilus sp. nov., the first obligate halophile in the genus Arcobacter. Int J Syst Evol Microbiol, 55: 1271-1277. Golla, S.C.; Murano, E. A.; Johnson, L. G.; Tipton, N. C.; Cureington, E. A.; Savell J. W. 2002. Determination of the ocurrence of Arcobacter butzleri in beef and dairy cattle from Texas by various isolation methods. J Food Prot, 65: 1849-1853. Harmon, K. M.; Wesley I. V. 1997. 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Differentation of Arcobacter species by numerical analysis of AFLP profiles and description of a novel Arcobacter from pig abortion and turkey faeces. J Appl Microbiol, 95: 1096-1105. Capítulo 5 ___________________________________________________________________________ 124 Öngor, H.; Çetinkaya, B.; Açik, M. N.; Atabay, H. I. 2004. Investigation of Arcobacters in meat and faecal samples of clinically healthy cattle in Turkey. Lett Appl Microbiol, 38: 339-344. Rice, E.W.; Rodgers, M. R.; Wesley, I. W.; Johnson, C. H.; Tanner, S. A. 1999. Isolation of Arcobacter butzleri from ground water. Lett Appl Microbiol, 28: 31-35. Scullion, R.; Harrington, C. S.; Madden, R. H. 2004. A comparison of three methods for the isolation of Arcobacter spp. from retail raw poultry in Northern Ireland. J Food Prot, 67: 799-804. Vandamme, P.; Pugina, P.; Benzi, G.; Van Etterijck, R.; Vlaes, L.; Kersters, K.; Butzler, J. P.; Lior, H.; Lauwers, S. 1992. 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Algo similar comprobamos con el uso de bebederos individuales, que parece ser un factor de protección (OR = 0,62), mientras que, en cuanto a la limpieza de los mismos, la proporción de aislamientos de Campylobacter spp. fue menor cuando se limpiaban los bebederos a diario (OR = 0,85), lo que parece lógico puesto que el agua de bebida es una posible fuente de infección para el ganado bovino (Humphrey y Beckett, 1987). A pesar de que los resultados observados en este estudio no fueron significativos (P = 0,09), mantener en buenas condiciones de limpieza el establo se considera un factor de protección, así esta práctica resultó ser significativa en un estudio realizado por Wesley y col. (2000), aunque utilizando un nivel de significación menor. La falta de limpieza del establo junto con que los animales no salgan a pastos favorece la re-infección de los animales, al aumentar la frecuencia de exposición cuando las vacas permanecen en el establo, ya que están constantemente expuestas a la infección y la posible recontaminación tanto del agua como del alimento (Rosef y col., 1983; Stanley y col., 1998). En otros trabajos se han estudiado otros aspectos con posible influencia en la aparición de Campylobacter spp. en granjas de vacuno lechero, observándose una relación significativa principalmente en la composición de la alimentación o la presencia de roedores con acceso al alimento (Wesley y col., 2000). Todo ello indica que es necesario realizar más estudios para identificar determinadas prácticas de manejo como posibles factores de riesgo para la introducción, diseminación y excreción de estos microorganismos en el ganado vacuno lechero. Capítulo 6 ___________________________________________________________________________ 134 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Altekruse, F.; Swerdlow, D. L.; Stern, N. J. 1998. Campylobacter jejuni. Microbial food borne pathogens. Vet Clin N Am-Food Anim Pract, 14: 31-40. Atabay, H. I.; Corry J. E. L. 1998. The isolation and prevalence of Campylobacters from dairy cattle using a variety of methods. J Appl Microbiol, 84: 733-740. Busato, A.; Hofer, D.; Lentze, T.; Gaillard, C.; Burnens, A. 1999. Prevalence and infection risks of zoonotic enteropathogenic bacteria in Swiss cow calf farms. Vet Microbiol, 69: 251-263. Glenn Songer, J.; K. W. Post. 2005. The genera Campylobacter, Helicobacter, and Arcobacter. En: Veterinary Microbiology, Bacterial and fungal agents of animal diseases. Elsevier Saunders. Missouri. Pp: 223-231. Harvey R. B.; Droleskey, R. E.; Sheffield, C. L.; Edrington, T. E.; Callaway, T. R.; Anderson, R. C.; Drinnon, D. L. J.; Ziprin, R. L.; Scott, H. M.; Nisbet, D. J. 2004. 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Capítulo 6 ___________________________________________________________________________ 136 CAPÍTULO 7 DISCUSIÓN GENERAL Capítulo 7 ___________________________________________________________________________ 138 El principal objetivo de esta Tesis Doctoral fue la adaptación e implementación de un sistema APPCC en explotaciones de ganado vacuno lechero, con objeto de mejorar la calidad microbiológica e higiénica de la leche producida en las granjas incluidas en el estudio. Así, en cada una de las granjas se desarrollaron las 12 etapas y se aplicaron los 7 principios que integran el APPCC. En los últimos años el sistema APPCC ha sido utilizado en industrias alimentarias (Mouwen y Prieto, 1998; Morgan, 2004) e incluso en granjas de vacuno lechero, pero en este último caso siempre enfocado a prevenir un peligro concreto, como la presencia de medicamentos en leche (Zorraquino, 1998) o la gestión de mamitis (Alves, 2003; Cullor, 1995). Sin embargo, hasta la fecha no se había planteado su aplicación de manera integral y en combinación con la utilización de las BP en las granjas de vacuno lechero en España, como se ha realizado anteriormente en otros países (Agriculture and Agri-Food Canada, 2001). Actualmente existen pocos trabajos de campo en los que se aplicara este protocolo en explotaciones bovinas de aptitud láctea. De forma similar al presente estudio, en esos trabajos algunos de los PCCs identificados, en los que se aplicaron medidas correctoras, fueron el uso de medicamentos, el almacenamiento de la leche, la limpieza de los equipos de ordeño y la rutina de ordeño (Sischo y col., 1997; Agriculture and Agri-Food Canada, 2001; Alves, 2003) Con la implementación de esta metodología se posibilita el control de los factores de riesgo asociados al proceso de producción de la leche, desde la entrada de materias primas hasta la recogida de la leche por la industria láctea, abarcando todas las actividades que tienen lugar en las explotaciones ganaderas. Comprobamos que su aplicación resulta sencilla para los ganaderos, los cuales, en su mayoría, participaron activamente en el desarrollo del APPCC, además de ser un mecanismo que facilita la certificación tanto de la granja como de la leche. Por todo ello, entendemos que el sistema APPCC podría en un futuro cercano implementarse en las explotaciones ganaderas como un sistema integral de gestión de la calidad (Noordhuizen y Welpelo, 1996). ____________________________________________________________________ Discusión general 139 Uno de los parámetros monitorizados del APPCC fue la evaluación de la higiene de superficies del equipo de ordeño mediante la ATP-bioluminiscencia. Las mediciones obtenidas fueron muy diversas, desde un mínimo (0) hasta valores superiores a 105 URL, similar a lo observado por otros autores (Slaghuis y Wiegersman, 1996). Se obtuvieron los valores medios de URL más bajos en las gomas de las pezoneras y los más elevados en los puntos de conexión al circuito situados en el establo, donde la contaminación ambiental y la dificultad para realizar una limpieza adecuada del circuito son mayores. Se comprobó que la utilización de agua no potable, conllevaba un aumento de URL en las superficies evaluadas, por lo que es importante disponer de agua de calidad microbiológica, pues en caso contrario el ATP de las superficies y el RB total del tanque se verán incrementados. También el ordeño en cántara conlleva URL más elevadas, ya que la limpieza de estos sistemas es manual y por lo tanto la temperatura del agua no suele ser la adecuada (Marco, 1998). No pudimos relacionar los LURL medidos en las superficies del equipo y el LRB de tanque, probablemente debido a los bajos recuentos encontrados en las granjas estudiadas y a la influencia de otros factores; sin embargo, es fundamental realizar una buena limpieza del equipo de ordeño, ya que algunos autores consideran que entre el 50 y 80% del RB total de tanque depende de la higiene de las superficies (Marco, 1998). A excepción de alguna comunicación en congresos (Slaghuis y Wiegersma, 1996; De Celis, 2006) no se había utilizado esta técnica para monitorizar la higiene de equipos de ordeño, por lo tanto no existen valores de URL de referencia para considerar una superficie limpia. En este trabajo se proponen los valores 152, 242, 282 y 1821 de URL en pezoneras, colectores, unidades finales y puntos de conexión al circuito, respectivamente, como un límite fácilmente alcanzable por los ganaderos cuyo objetivo sea la mejora de la higiene del equipo de ordeño. La ATP-bioluminiscencia puede usarse como un método práctico para valorar de forma objetiva por el ganadero la limpieza de las diferentes superficies de contacto con la leche en su explotación. Capítulo 7 ___________________________________________________________________________ 140 Dentro del sistema APPCC se identificó como peligro biológico la presencia de patógenos zoonóticos, específicamente Listeria spp., Campylobacter spp. y Arcobacter spp., en leche de tanque de refrigeración. Así, Listeria spp. fue aislada en el 16,3% de las muestras de leche analizadas, valor superior al encontrado en otros trabajos (Farber y col., 1988; Husu, 1990; Rea y col., 1992; Van Kessel y col., 2004). L. innocua fue la especie más identificada (7,1%), seguida de L. monocytogenes (6,1%) y con menores prevalencias L. grayi y L. welshimeri (2,0% y 1,0%, respectivamente). Las diferencias encontradas en las prevalencias entre los diferentes trabajos pueden deberse a diversas razones, sin excluir las distintas regiones geográficas estudiadas, el tipo de muestra analizada o a la metodología analítica empleada (Van Kessel y col., 2004). La presencia de listeria en ensilados y heces aumenta el riesgo de que aparezca en leche; de este modo, en nuestro estudio se observó que ese riesgo se multiplica por 2 ó 3, mientras que Sanaa y Ménard (1994) comprobaron que ese riesgo se multiplica por 20, probablemente debido a unas mejores condiciones higiénicas generales en las explotaciones de nuestro estudio. El crecimiento de listerias en ensilados es favorecido por una acidificación insuficiente; así, la relación entre el valor de pH del ensilado y el asilamiento de esta bacteria fue significativa, lo que ratifica que la excreción por heces puede tener su origen en el consumo de ensilado contaminado (Sanaa y col., 1993) o en la contaminación ambiental (Van Kessel y col., 2004). A su vez, disponer de una buena ventilación y adecuadas condiciones higiénicas en el establo disminuye la probabilidad de contaminación de la leche por Listeria spp., ya que la suciedad y la concentración de gases y microorganismos será menor. Es, así mismo, importante seguir una correcta rutina de ordeño para reducir la incidencia de infecciones (Rohrbach y col., 1992; Sanaa y col., 1993; Hassan y col., 2001) y aplicar un orden de ordeño adecuado para reducir la probabilidad de contaminación de la leche. En el ordeño en plaza, proteger la leche de la contaminación ambiental es más complicado y el RB es más elevado (Hassan y col., 2001); sin embargo, en las muestras con RB más altos no se aisló Listeria spp. con mayor frecuencia que cuando los RB eran menores. Esto puede ser debido a que su crecimiento esté enmascarado por el de otras bacterias (Fernández- ____________________________________________________________________ Discusión general 141 Garayzabal y col. 1987). No obstante, cuando se aisló Listeria spp., tanto el RCS como el RB de la leche del tanque de refrigeración se vieron ligeramente incrementados. Otros microorganismos potencialmente zoonóticos estudiados fueron Campylobacter spp. y Arcobacter spp. Campylobacter spp. se aisló en el 36,0% de las explotaciones visitadas, prevalencia muy superior al 5,6% encontrado por Rosef y col. (1983) e inferior a la descrita en otros estudios realizados con un número menor de explotaciones (Atabay y Corry, 1998; Wesley y col., 2000; Nielsen, 2002). El porcentaje de muestras de heces positivas fue del 20,5%, similar a los indicados en otros trabajos, en los que analizaron menor número de muestras (Nielsen, 2002; Harvey y col., 2004; Sato y col., 2004). Con respecto a Arcobacter spp., el 68,5% de las granjas visitadas presentaron como mínimo un animal positivo, valor próximo al observado por Wesley y col. (2000) en un estudio en el que sólo se analizaron muestras fecales de 31 explotaciones. A nivel individual, aislamos Arcobacter spp. en 41,7% de los animales muestreados, porcentaje claramente superior al indicado en otros estudios (Kabeya y col., 2003; Öngor y col., 2004; Van Driessche y col., 2005). La especie más prevalente fue A. cryaerophilus (27,9%) seguida de A. skirrowii (20,1%), al contrario que lo descrito en otros trabajos (Kabeya y col., 2003; Van Driessche y col., 2003; Öngor y col., 2004). Para ambos géneros bacterianos las diferencias en las prevalencias pueden ser debidas a la localización geográfica y las variaciones estacionales de cada estudio, al tamaño y tipo de muestra recogida (heces o hisopos rectales, etc.), a los animales analizados (terneros, adultos, vacas lecheras o de aptitud cárnica) y, de manera más significativa, a los métodos de laboratorio utilizados para su aislamiento e identificación (Kabeya y col., 2003; Sato y col., 2004; Van Driessche y col., 2005). Por último, las características y aspectos de manejo en las granjas que pueden tener influencia sobre la aparición de estos microorganismos en las heces, no presentaron una relación estadísticamente significativa, resultados similares a los observados por Wesley y col. (2000). Sin embargo, para interpretar los efectos de estos potenciales factores de riesgo se debe tener en cuenta la epidemiología de las bacterias; así, el uso de agua potable, el chequeo sanitario de animales incorporados y la limpieza de las instalaciones Capítulo 7 ___________________________________________________________________________ 142 son aspectos a tener en cuenta en cualquier explotación ganadera (Harvey y col., 2004; Moreno y col., 2004; Van Driessche y col., 2005) Es necesario realizar nuevos estudios para determinar las prevalencias reales de los diversos agentes patógenos zoonóticos incluidos en esta Tesis, así mismo se necesitan llevar a cabo más trabajos para evaluar qué condiciones de manejo o características del entorno de los animales actúan como factores de riesgo para estos microorganismos. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Agriculture and Agri-Food Canada. 2001. Canadian Quality Milk-Quality Assurance Program. Reference Manual, Canada. Alves, A. 2003. Aplicaçao do sistema de análise de perigos e pontos críticos de controle (APPCC) em propriedades leiteiras. Tesis Doctoral. Pirassununga, Brasil Atabay, H. I.; Corry J. E. L. 1998. The isolation and prevalence of Campylobacters from dairy cattle using a variety of methods. J Appl Microbiol, 84: 733-740. Cullor, J. S. 1995. Implementing the HACCP program on your clients’ dairies. Vet Med, 90: 290-295. De Celis, P. 2006. Control de la limpieza de los equipos mediante bioluminiscencia. XI Congreso Anembe de Medicina Bovina, Zaragoza. Farber, J. M.; Sanders, G. W.; Malcolm, S. A. 1988. The presence of Listeria spp in raw milk in Ontario. Can J Microbiol, 34: 95-100. Fernández-Garayzabal, J. F.; Domínguez, L.; Vazquez, J. A.; Gómez-Lucia, E.; Rodríguez-Ferri, E. R.; Suárez, G. 1987. Ocurrence of Listeria monocytogenes in raw milk. Vet Rec, 120: 258-259.