Evaluación de la motilidad y viabilidad del semen bovino mediante el uso de sistemas CASA y citometría de flujo, identificación de subpoblaciones espermáticas

UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTADE DE VETERINARIA Departamento de Patoloxía Animal EVALUACIÓN DE LA MOTILIDAD Y VIALIDAD DEL SEMEN BOVINO MEDIANTE EL USO DE SISTEMAS CASA Y CITOMETRÍA DE FLUJO: IDENTIFICACIÓN DE SUBPOBLACIONES ESPERMÁTICAS Tesis presentada para la obtención del grado de doctor por: RODRIGO MUIÑO OTERO : 1 ÍNDICE Indice 2 I. INTRODUCCIÓN ...........................................................................................................4 II. REVISION BIBLIOGRÁFICA......................................................................................7 1. Obtención y Evaluación del semen bovino.....................................................................8 1.1. Recogida del semen......................................................................................................8 1.2. Volumen del eyaculado y concentración espermática..................................................9 1.3. Evaluación de la calidad del semen............................................................................10 1.3.1. Motilidad Espermática.......................................................................................11 1.3.1.1. Aspectos fisiológicos de la motilidad espermática................................11 1.3.1.1.1. Estructura de la cola ...............................................................11 1.3.1.1.2. Mecanismo que permite la motilidad espermática.................13 1.3.1.1.3. Metabolismo espermático.......................................................13 1.3.1.1.4. Adquisición del movimiento espermático..............................14 1.3.1.2. Evaluación subjetiva de la motilidad espermática.................................15 1.3.1.3. Evaluación de la motilidad mediante el uso de sistemas CASA...........16 1.3.1.3.1. Definición de los parámetros medidos por el CASA .............17 1.3.1.3.2. Identificación de subpoblaciones espermáticas......................19 1.3.1.3.3. Algunos inconvenientes de los sistemas CASA.....................20 1.3.2. Morfología Espermática....................................................................................21 1.3.3. Citometría de flujo: métodos aplicados al análisis de los espermatozoides bovinos ..............................................................................................................................23 1.3.3.1. Análisis de la viabilidad espermática....................................................24 1.3.3.2. Análisis de la funcionalidad mitocondrial.............................................26 1.3.3.3. Análisis de la integridad acrosomal.......................................................26 2. Criopreservación del semen bovino ..............................................................................28 2.1. Diluyentes utilizados para la congelación del semen bovino.....................................29 2.1.1. pH y capacidad tampón ....................................................................................30 2.1.2. Sustancias orgánicas protectoras de los espermatozoides frente al shock por frío ...........................................................................................................................................31 Indice 3 2.1.3. Agentes crioprotectores y efectos de la congelación sobre las células espermáticas ......................................................................................................................33 2.1.3.1. Eventos que ocurren durante la congelación y descongelación .........33 2.1.3.2. Causas de muerte celular por congelación .........................................34 2.1.3.3. Agentes crioprotectores......................................................................35 2.1.3.3.1. Cómo actúa el glicerol en las células...................................36 2.1.3.3.2. Efectos nocivos del glicerol.................................................37 2.1.3.3.3. Concentración óptima de glicerol........................................37 2.2. Periodo de equilibrado................................................................................................38 2.3. Formato de envasado..................................................................................................40 2.4. Congelación................................................................................................................40 2.5. Descongelación...........................................................................................................42 III. OBJETIVOS................................................................................................................44 IV. MATERIAL Y MÉTODOS........................................................................................46 V. RESULTADOS............................................................................................................58 VI. DISCUSIÓN................................................................................................................67 VII. CONCLUSIONES.....................................................................................................76 VIII. RESUMEN...............................................................................................................79 IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................82 X. ARTÍCULOS..............................................................................................................105 4 I. INTRODUCCIÓN Introducción 5 Desde el descubrimiento de la acción crioprotectora del glicerol sobre los espermatozoides (Polge y col., 1949), la inseminación artificial (IA) con semen congelado comenzó a practicarse de forma generalizada en la especie bovina. La evolución tan favorable de esta técnica se ha debido a las pocas desventajas y muchas ventajas que presenta, siendo la mas relevante desde el punto de vista zootécnico, la de permitir de una forma más rápida que la monta natural la difusión de aquellos caracteres genéticos mejorantes de las producciones animales. El auge experimentado por la IA se debe a los continuos avances conseguidos en la metodología empleada en cada una de las fases que constituyen dicha técnica, lo que ha mejorado los resultados de fertilidad obtenidos. Las investigaciones desarrolladas en este campo han estudiado los sistemas de recolección seminal, los métodos empleados en la dilución y la conservación del semen, la determinación del número óptimo de espermatozoides por dosis y el momento más adecuado para realizar la inseminación. De todas estas investigaciones se han obtenido los distintos procedimientos empleados de forma rutinaria para la IA en la especie bovina. Un tema que siempre ha preocupado a los investigadores ha sido el desarrollo de pruebas de laboratorio que permitan predecir de forma precisa la capacidad fecundante del semen que posteriormente se va a emplear en la inseminación, o determinar si un protocolo de congelación espermático funciona bien o no. Obviamente, el método más fiable para determinar la capacidad fecundante de un eyaculado es la inseminación de un gran número de vacas (Amann, 1989), sin embargo, la información recibida mediante este sistema es muy tardía, resulta muy costosa, y además puede estar influenciada por multitud de factores dependientes de la hembra y, por tanto, modificar los resultados obtenidos. Por otra parte, no hay muchas dudas de que el análisis objetivo, riguroso y simultáneo, de varios parámetros relativos a las características funcionales y morfológicas de los espermatozoides, permite estimar razonablemente el potencial fecundante de una muestra de semen (Amann, 1989). Por tanto, no es sorprendente que no se hayan escatimado esfuerzos para el desarrollo de nuevas tecnologías in vitro, como la citometría de flujo o los sistemas CASA (Computer Assisted Sperm Análisis), que permiten el Introducción 6 estudio de múltiples características funcionales y morfológicas de los espermatozoides, para intentar predecir la capacidad fecundante del semen de la forma más objetiva posible. Además, la aplicación de estas nuevas técnicas permite la re-evaluación de muchos aspectos de los protocolos de criopreservación, que hasta ahora se habían evaluado de forma más o menos subjetiva, tales como la elección del mejor diluyente para obtener una mayor supervivencia espermática postdescongelación o la temperatura ideal de descongelación de las dosis seminales. El uso de los sistemas CASA proporciona toda una serie de datos relativos a la velocidad y trayectoria de cada espermatozoide individual y ello permite identificar la existencia de subpoblaciones espermáticas con distintos patrones de movimiento que coexisten en la misma muestra de semen (Davis y col. 1995; Holt, 1996; Abaigar et al., 1999), lo cual es una visión más real que la motilidad media de la muestra, puesto que, un eyaculado está constituido por una población heterogénea de espermatozoides. Existen numerosas evidencias de la existencia de subpoblaciones espermáticas con patrones de movimiento específicos en eyaculados de varias especies de mamíferos (Holt, 1996; Abaigar y col, 1999; 2001; Rigau y col., 2001; Quintero-Moreno y col., 2003; 2004). La presencia de estas subpoblaciones podría sugerir la existencia de alguna relación entre cambios en la estructura subpoblacional de una muestra de semen y su capacidad fecundante, pero esto todavía no se ha demostrado. En la especie bovina, de momento no se ha investigado la existencia subpoblaciones espermáticas, definidas por sus características cinéticas, en muestras de semen fresco o congelado. 7 II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Revisión Bibliográfica 8 1. OBTENCIÓN Y EVALUACIÓN DEL SEMEN BOVINO 1.1. Recogida del Semen La recogida del semen bovino normalmente se realiza utilizando dos métodos: la vagina artificial o el electroeyaculador. En los centros de inseminación artificial se emplea de forma rutinaria la vagina artificial. Excepcionalmente en casos muy concretos, como pueden ser toros con problemas físicos que no puedan realizar la monta, animales jóvenes o machos mal entrenados que se niegan a saltar, se puede utilizar el electroeyaculador. La vagina artificial está constituida por un cilindro rígido de dimensiones diferentes en función de la edad del semental. En ambos extremos del cilindro se fija la camisa de caucho que delimita una cámara interior. El espacio interior se rellena de agua a 45ºC a través de una válvula, pudiendo insuflarse también aire con el objeto de incrementar la presión y facilitar la eyaculación del semental. En uno de los extremos del cilindro se acopla un embudo de caucho unido a un tubo de vidrio graduado, protegido de la luz y del frío por una funda protectora. El pene en erección se introduce en el interior de la vagina artificial y, gracias a las condiciones de temperatura y presión, se desencadena la eyaculación del macho. Es un método muy eficaz que, realizado apropiadamente, puede utilizarse a lo largo de la vida reproductiva del semental. Si la temperatura o la presión interior de la vagina no son las adecuadas o la recogida la realiza personal no entrenado, se pueden originar lesiones en el pene que pueden llegar a suprimir la libido del toro y el rechazo de la monta. En la recogida del semen se facilitará la extracción si se utiliza un animal entrenado para realizar las funciones de maniquí; suele emplearse un semental que ha terminado su etapa reproductiva y que se encuentra en buena condición corporal. La recogida de semen en toros adultos suele realizarse dos veces a la semana, con un intervalo de 4 días entre los dos días de la monta. En los días de extracción normalmente se realizan dos falsas montas sobre el semental que permanece como maniquí, con el fin de estimular al toro donante y obtener un semen con buena concentración espermática; en la tercera monta, se introduce el pene en la vagina artificial con el fin de provocar la eyaculación. En cada día de recogida se recolectan dos eyaculados con un intervalo de 20 Revisión Bibliográfica 15 glucoproteína de elevado peso molecular que se denomina “inmovilina”, la cual determina un incremento de la viscosidad del medio que impide la motilidad espermática (Turner y Giles, 1982). Si se analizan diferentes regiones anatómicas del epidídimo se observa que, en contacto con una solución tamponada con activadores de la motilidad, los espermatozoides de la cabeza, en la mayoría de los mamíferos, presentan un batido vibratorio que origina movimientos circulares (Blandau y Rumery, 1964; Gaddum 1968; Fray y col., 1972; Burgos y Tovar, 1974). En contraste, los espermatozoides de la cola del epidídimo tienen un movimiento vigoroso que determina una progresión rápida, presentando el flagelo una mayor rigidez y un menor arco de curvatura del batido (Bedford, 1975). La adquisición de la motilidad progresiva depende de un incremento en el contenido intracelular de cAMP, inducido por la exposición a las secreciones epididimales. En espermatozoides maduros procedentes de la cola del epidídimo, la concentración intracelular de cAMP es un 40% superior a la de espermatozoides de la cabeza (Hoskins y col., 1974; Amman y col., 1982). El principal sitio de almacenamiento de los espermatozoides dentro del aparato reproductor del toro es precisamente la cola del epidídimo, que contiene el 70% de la cantidad total de gametos presentes en los conductos excretores, mientras que el conducto deferente contiene sólo un 2% (Curtis, 1981). La mayor parte de los espermatozoides almacenados y no eyaculados se eliminan gradualmente por excreción en la orina. Aquellos que no se eliminan en la orina experimentan un envejecimiento gradual, primero pierden su capacidad fecundante, luego su motilidad, y por último, degeneran y mueren. 1.3.1.2. Evaluación Subjetiva de la Motilidad Espermática La motilidad espermática normalmente se valora de forma subjetiva, mediante la observación visual de una muestra de semen con un microscopio de contraste de fases y platina a 37ºC. En el eyaculado de los rumiantes, dada su elevada concentración espermática, se puede valorar la motilidad masal, definida como el movimiento en remolinos del total de espermatozoides de la muestra. Normalmente la motilidad masal se valora de forma subjetiva en una escala de 0 a 5, con una puntuación de 5 cuando se observan oleadas o remolinos con movimiento rápido y vigoroso, y de 0 cuando no se Revisión Bibliográfica 16 observa movimiento en ondas. Tras la dilución del eyaculado fresco, o tras la descongelación de dosis de semen congelado, se estima el porcentaje de espermatozoides individuales que están en movimiento y el tipo de movimiento que realizan (progresivos o no progresivos). Las dosis descongeladas con una motilidad progresiva inferior al 40% normalmente se descartan para su uso en IA (NAAB, 1986). La valoración visual de la motilidad espermática es el método más simple, rápido y barato. Sin embargo, es altamente subjetivo, puesto que los resultados obtenidos dependen en gran parte de la habilidad y experiencia del técnico que evalúa la muestra (RodríguezMartínez, 2000; Phillips y col., 2004), y además, si se trabaja con muestras muy concentradas se tiende a sobrestimar el porcentaje de espermatozoides móviles. Por tanto, no es un método que, de forma fiable y repetible, permita predecir la capacidad fecundante de una muestra de semen (Saacke y White, 1972; Linford y col., 1976). La valoración de la motilidad como único parámetro de calidad seminal no es suficiente para predecir la capacidad fecundante del semen (Liu y Foote, 1998), es sólo uno de los requisitos que ha de cumplirse, de ahí que la correlación existente entre la motilidad de una muestra de semen y su fertilidad real, aunque significativa, sea baja (Kjaestad y col., 1993). 1.3.1.3. Evaluación de la Motilidad Espermática mediante el uso de Sistemas CASA Desde hace varias décadas numerosos investigadores (Glover, 1968; Katz y Dott, 1975; Amann y Hammerstedt, 1980; Katz y Overstreet, 1981; O´Connor y col., 1981) han dedicado mucho trabajo y recursos para intentar eliminar la subjetividad inherente a la evaluación microscópica de la calidad del semen. Fruto de estas investigaciones fue el desarrollo de los sistemas computerizados para el análisis de la motilidad espermática. Desde que se introdujeron en el mercado a principios de los años 80, originalmente para la evaluación de semen humano, los sistemas CASA (Computer Assisted Sperm Analysis) se han ido perfeccionando y modernizando, a la vez que su precio se fue haciendo más asequible. En consecuencia, comenzaron a utilizarse cada vez con más frecuencia en veterinaria, especialmente en la especie bovina, tanto en el ámbito de la investigación como en el de la industria, en los centros de IA. Revisión Bibliográfica 17 Un sistema CASA consta de varias unidades interdependientes: un microscopio de contraste de fases conectado a una cámara de vídeo, que envía la imagen desde el microscopio a un monitor de TV. Posteriormente, la imagen es enviada desde el monitor a un ordenador, donde un analizador digital de imagen captura varias fotografías seriadas de cada campo microscópico seleccionado, normalmente en menos de 1 segundo. El software discrimina a los espermatozoides de otras partículas que puedan aparecer en la imagen por su tamaño, y analiza la trayectoria recorrida por cada espermatozoide individual durante esa fracción de segundo. Aunque los principios básicos utilizados para el análisis de las imágenes digitalizadas son similares en los diferentes sistemas CASA que existen en el mercado, hay diferencias apreciables en sus sistemas ópticos, técnicas de captura de imagen y reconocimiento espermático, algoritmos utilizados para la reconstrucción de trayectorias y determinación de las medidas cinéticas, y también en el manejo y análisis de los datos, y consecuentemente, en los resultados finales. (Davis y Katz, 1993; Davis y Siemers, 1995; Irving, 1995; Krause, 1995; Mortimer, 2000; Verstegen y col., 2002). 1.3.1.3.1. Definición de los parámetros cinéticos medidos por el CASA Los programas diseñados para estos equipos incluyen una serie de parámetros descriptores del movimiento espermático que son comunes a todos los sistemas CASA (Boyers y col., 1989; Farell y col., 1995). Algunos de los parámetros más utilizados por los diversos autores son los siguientes: -Porcentajes de motilidad total o de motilidad progresiva: en función de su velocidad curvilínea (VCL) o de su velocidad media (VAP), los espermatozoides son clasificados en estáticos, móviles progresivos o móviles no progresivos; y dentro de los móviles, en rápidos, medios y lentos. -Parámetros que definen la velocidad de los espermatozoides (Mortimer, 1997): Revisión Bibliográfica 18 -VCL (Velocidad Curvilínea): distancia recorrida por el espermatozoide a lo largo de su trayectoria real por unidad de tiempo. -VSL (Velocidad rectilínea): distancia recorrida por el espermatozoide entre el primer y el último punto de su trayectoria por unidad de tiempo. -VAP (Velocidad Media): distancia recorrida por el espermatozoide a lo largo de la trayectoria media. -LIN (Indice de Linealidad): es la relación porcentual entre la Velocidad Rectilínea y la Velocidad Curvilínea. LIN: (VSL / VCL) x 100 -STR (Indice de Rectitud): es la relación porcentual entre la Velocidad Rectilínea y la Velocidad Lineal. STR: (VSL / VAP) x 100 -WOB (Indice de Oscilación): es la relación porcentual entre la Velocidad Lineal y la Velocidad Rectilínea. WOB: (VAP / VCL) x 100 Parámetros de angularidad y oscilación de la cabeza: -ALH (Amplitud media del desplazamiento lateral de la cabeza): es el desplazamiento que efectúa la cabeza espermática en su trayectoria curvilínea de un lado a otro de la trayectoria media o lineal. -BCF (Frecuencia de batido): es la frecuencia con la que la trayectoria curvilínea atraviesa la trayectoria lineal o media en función del tiempo. Al final del proceso, el CASA proporciona toda una serie de datos relativos a la velocidad y trayectoria de cada espermatozoide individual, con lo que permite obtener Revisión Bibliográfica 19 información precisa, objetiva y repetible, sobre el porcentaje de células móviles presentes en la muestra y la calidad media de ese movimiento (Amann, 1989; Anzar y col., 1991). 1.3.1.3.2. Identificación de subpoblaciones espermáticas El CASA permite identificar la existencia de subpoblaciones de espermatozoides con distintos patrones de movimiento que coexisten en la misma muestra de semen (Davis y col., 1995; Holt, 1996; Abaigar y col., 1999). En los últimos años se ha demostrado la existencia de subpoblaciones espermáticas con distintos patrones de movimiento en los eyaculados de todas las especies estudiadas hasta la fecha, como por ejemplo, el cerdo, el mono tití, la gacela, el caballo o el perro (Holt, 1996; Abaigar y col., 1999; 2001; Quintero-Moreno y col., 2003; Nuñez-Martínez y col., 2006). Además, se ha observado que espermatozoides pertenecientes a distintas subpoblaciones responden de forma diferente ante procesos como la criopreservación o la exposición al efecto de agentes capacitantes (Holt, 1996; Abaigar y col., 1999). En semen bovino fresco o congelado, de momento, no se ha publicado ningún estudio relativo a la identificación de subpoblaciones espermáticas con distintos tipos de movimiento. Los espermatozoides que forman parte de un eyaculado no son uniformes en cuanto a sus características de motilidad, es decir, en el mismo eyaculado existe un porcentaje de espermatozoides que se mueven de forma rápida y progresiva, otro porcentaje de espermatozoides que se mueven más lentamente, y por último, aparece un número de espermatozoides sin apenas movimiento. Por lo tanto, si no consideramos la existencia de estas subpoblaciones en un eyaculado, tal y como se hacía hasta hace pocos años, y partimos de la base de que el eyaculado es una población homogénea, se estará perdiendo información relevante. Probablemente, la capacidad fecundante de un eyaculado o de una dosis de semen descongelado resida únicamente en la subpoblación que contiene a los espermatozoides más competentes. Si esta subpoblación representa un porcentaje muy pequeño, sus características se verán enmascaradas por el resto de la población. Esto explicaría, al menos en parte, que no se haya observado correlación significativa entre parámetros cinéticos medios (por ejemplo VCL, VSL, LIN o ALH) y la fertilidad in vivo de una dosis seminal (Holt y Van Look, 2004). Revisión Bibliográfica 20 Además de un estudio minucioso de la motilidad, los sistemas computerizados, también permiten realizar medidas de las dimensiones de la cabeza espermática. Se conocen como sistemas ASMA (Assisted Sperm Morphology Analisys), y están diseñados para realizar medidas del área, perímetro, longitud y anchura de las cabezas espermáticas presentes en una extensión de semen fijada y teñida. Es interesante disponer de los datos morfométricos de las dosis seminales, puesto que se ha comprobado que la morfometría anormal de las cabezas espermáticas influye negativamente en la fertilidad de los sementales bovinos (Gravance y col., 1996). 1.3.1.3.3. Algunos inconvenientes de los sistemas CASA El uso de sistemas CASA para la contrastación rutinaria de las dosis seminales ofrece notables ventajas pero también posee algunos inconvenientes. Uno de los principales es que no existe una estandarización y optimización de los equipos y de los procedimientos empleados en los análisis (Verstegen y col., 2002). Los diferentes laboratorios trabajan con distintos equipos, y las características técnicas difieren de unos a otros, lo cual provoca que los resultados facilitados por los distintos centros para los mismos parámetros sean muy dispares. Existen una serie de consideraciones prácticas y biológicas que afectan a los resultados obtenidos con el CASA. Según Verstegen y col. (2002) entre los principales factores de los que depende el resultado final están: -La temperatura de análisis del semen. -El volumen analizado. -El tipo de cámara utilizada. -El tiempo que transcurre entre la recogida y el análisis. -La concentración espermática de la muestra. -El diluyente utilizado. -El objetivo del microscopio utilizado en el análisis, así como la iluminación, etc. Esto significa que cada laboratorio debe estandarizar su propio equipo y establecer su propio protocolo de trabajo, teniendo en cuenta que dichos resultados serán únicamente aplicables a las muestras evaluadas con ese equipo en cuestión. Revisión Bibliográfica 21 Los sistemas CASA permiten determinar la concentración espermática de la muestra a analizar. Sin embargo, Verstegen y col. (2002) comprobaron, utilizando muestras de semen de distintas especies animales, que los CASA tienden a sobreestimar la concentración de espermatozoides de la muestra. Dichos autores atribuyen el error a que, debido a las colisiones espermáticas, el mismo espermatozoide puede ser contabilizado varias veces. Cuanto mayor es la tasa de dilución del semen, los problemas de sobreestimación de la concentración tienden a disminuir puesto que la posibilidad de colisión disminuye. 1.3.2. Morfología Espermática Para una interacción normal del espermatozoide con el microambiente del tracto genital femenino y con las envolturas del ovocito, además de tener motilidad progresiva, los espermatozoides han de ser morfológicamente normales. Cualquier anomalía que afecte a algún atributo del espermatozoide puede dificultar su migración en el tracto genital de la hembra, impidiendo la unión con el ovocito (Rodríguez-Martínez, 1999). A medida que aumenta la proporción de espermatozoides anormales en el eyaculado, desciende la capacidad fecundante del mismo (Howard y Pace, 1998). Por tanto, se ha de tener muy presente que las muestras de semen con un porcentaje de espermatozoides morfológicamente normales inferior al 70% (Barth y Oko, 1989) han de descartarse para la congelación. Se han establecido distintas clasificaciones de las anomalías espermáticas atendiendo a distintos criterios: a) dependiendo de si se originan en el testículo (anomalías mayores) o a lo largo del tránsito epididimal o tras la eyaculación (anomalías menores) (Bloom, 1977; Barth y Oko, 1989); b) de si están asociadas a infertilidad o no (primarias o secundarias, respectivamente) (Milovanov, 1938; Bloom, 1977); o c) de la región espermática implicada (anomalías de la cabeza, de la pieza intermedia o de la pieza principal). Cualquier anomalía, primaria o secundaria, si afecta a un número elevado de espermatozoides, puede llegar a comprometer la fertilidad del semen. Por ejemplo, si una Revisión Bibliográfica 22 dosis seminal tiene una motilidad espermática entorno al 50%, y contiene un 30% de espermatozoides con gotas citoplamáticas proximales, la alta incidencia de esta morfoanomalía repercutirá negativamente en la fertilidad de esa muestra pese a la buena motilidad del eyaculado. Este defecto es muy común en sementales jóvenes y normalmente su incidencia va disminuyendo a medida que el toro crece y maduran sus órganos sexuales (Amann y col., 2000). Otra anomalía relativamente frecuente son los espermatozoides con la cabeza de forma piriforme. Los espermatozoides con este defecto se observó que presentaban menor capacidad de unión y de penetración de la zona pelúcida, y si conseguían fecundar a algún ovocito, los zigotos resultantes tenían menor capacidad para iniciar su desarrollo y degeneraban a las pocas horas (Thundathil y col., 1999). Un grupo de anomalías de especial importancia son las que afectan al acrosoma, y entre las más frecuentes se han descrito el acrosoma nudoso y la membrana acrosomal aplanada. Los espermatozoides con acrosoma nudoso se encontraron en el eyaculado de sementales frisones cuya espermatogénesis estaba alterada y se cree que es un defecto de origen congénito y hereditario (Barth y Oko, 1989). Los eyaculados que contienen espermatozoides con el acrosoma nudoso suelen presentar también otras anomalías espermáticas, lo que compromete aun más la fertilidad del semental (Gran y Dott, 1976). Si el porcentaje de espermatozoides con acrosoma nudoso es elevado, se podría decir que el semental es virtualmente estéril, puesto que los espermatozoides con esta alteración se comprobó que no eran capaces de atravesar la zona pelúcida (Thundathil y col., 2000; 2002). Además, se cree que es un defecto no compensable, es decir, los espermatozoides normales presentes en el mismo eyaculado también tenían menor capacidad fecundante. Otra anomalía acrosómica es la membrana acrosomal aplanada, que se describió por primera vez en eyaculados de toros frisones. Se observó que los espermatozoides procedentes de eyaculados bovinos con alta incidencia de esta anomalía podían unirse normalmente a la zona pelúcida del ovocito, y su matriz acrosomal permanecía funcional (Thundathil y col., 2001; Meyer y Barth, 2001). No obstante, no se investigó si los embriones eran viables o por el contrario degeneraban a los pocos días. Las anomalías que afectan al núcleo espermático, como las vacuolas nucleares, suelen tener una menor incidencia. Thundathil y col. (1998) demostraron que los Revisión Bibliográfica 23 espermatozoides que presentaban este defecto nuclear se unían con dificultad a la zona pelúcida pero eran capaces de penetrar el citoplasma del ovocito y fertilizarlo, y el embrión formado continuaba su desarrollo hasta la fase de blastocisto. Otras anomalías más frecuentes en semen bovino, como las colas enrolladas o los plegamientos de la pieza intermedia, si son abundantes en el eyaculado, pueden comprometer la fertilidad del toro, ya que los espermatozoides defectuosos no poseen una motilidad normal y por tanto no van poder alcanzar las proximidades del ovocito (Nothling y Arndt, 1995). Siempre que aparezcan anomalías en un eyaculado la fertilidad del semental puede verse comprometida, pero realmente no se sabe cuál es el porcentaje máximo de morfoanomalías espermáticas que puede ser compatible con una fertilidad normal. Lo que está demostrado es que existe una correlación negativa entre el número de formas anormales y la fertilidad del semental (Barth y Oko, 1989; Januskauskas y Žilinskas, 2002). 1.3.3. Citometría de Flujo: Métodos Aplicados al Análisis de Espermatozoides Bovinos La citometría de flujo es una técnica que permite identificar, cuantificar y separar las distintas subpoblaciones celulares presentes en una muestra de células en suspensión, en función de los distintos patrones de tinción adquiridos tras el marcaje con diferentes colorantes fluorescentes, que se unen a estructuras celulares específicas o se acumulan selectivamente en compartimentos intracelulares. A lo largo de las dos últimas décadas, la citometría de flujo se ha convertido en una herramienta de gran utilidad para la investigación de poblaciones espermáticas. Se han desarrollado muchos métodos de tinción y combinaciones de fluorocromos, se han comercializado muchos fluorógenos nuevos, que permiten analizar una gran variedad de funciones espermáticas, y como resultado, hoy en día, el uso de esta técnica ofrece la posibilidad de analizar múltiples características espermáticas, simultáneamente en la misma muestra de semen, de una forma rápida, precisa y objetiva. Debido al creciente Revisión Bibliográfica 24 número de parámetros analizables y al desarrollo de citómetros a un coste accesible, se ha extendido su uso tanto en laboratorios de investigación como en centros de IA. Entre las características espermáticas más frecuentemente analizadas para el control de calidad del semen bovino se incluyen el estudio de la viabilidad espermática, de la integridad acrosomal y de la funcionalidad mitocondrial, así como la investigación del estado de capacitación de los espermatozoides. Además, la citometría de flujo también permite obtener muestras de espermatozoides sexados, bien para su uso en IA o en fecundación in vitro (Garner y col., 1983; Pinkel y col., 1985; Johnson y col., 1989). 1.3.3.1. Análisis de la viabilidad espermática El estudio de la viabilidad espermática normalmente se basa en el análisis de la integridad de la membrana plasmática de los espermatozoides, mediante el uso de dos fluorocromos combinados: uno de ellos sólo es capaz de atravesar las membranas plasmáticas dañadas o degeneradas, y por tanto permite identificar a las células muertas o en proceso de degeneración, mientras que el otro es capaz de atravesar membranas celulares intactas y por tanto permite identificar la población de células viables (Garner y col., 1997). Uno de los fluorocromos más utilizados para identificar células muertas es el Ioduro de propidio (PI). Este compuesto entra en espermatozoides con la membrana plasmática dañada, se une al núcleo y, al ser excitado por la longitud de onda apropiada (510-560 nm), emite fluorescencia roja. Además del PI, existen otros marcadores fluorescentes específicos para células muertas cuyo mecanismo de acción es similar, como por ejemplo, el Hoechst 33258 (Keeler y col., 1983; Pintado y col., 2000), el bromuro de etidio (Evenson y col., 1982) o la hidroetidina (HED) (Ericsson y col., 1989), entre otros. Entre los fluorocromos más utilizados para identificar la población de células vivas se encuentra el grupo de las carboxifluoresceínas: CFDA: diacetato de carboxifluoresceína, (Garner y col., 1988; Harrison y Vickers, 1990), CMFDA: diacetato de carboximetilfluoresceína, (Garner y col., 1986) o CDMFDA: diacetato de carboxidimetilfluoresceína (Ericsson y col., 1990), que son compuestos no fluorescentes capaces de atravesar membranas celulares intactas. En el interior de las células, debido a la Revisión Bibliográfica 31 sulfónico)], BES [N,N BIS (2 hidroxietil)-2 aminoetano ácido sulfónico], pero los estudios realizados en semen de toro son escasos (Pace y Graham., 1970; Foote, 1972; Graham, Crabo y Brown, 1972). Hoy en día, la mayor parte de los diluyentes utilizados para la congelación del semen bovino incluyen Tris y ácido cítrico como principales sustancias tampón. 2.1.2 Sustancias Orgánicas Protectoras de los Espermatozoides frente al Shock por Frío Desde que Phillips (1939) descubrió que la yema de huevo era un valioso aditivo para el mantenimiento de la capacidad fecundante de los espermatozoides, esta sustancia se incluyó como constituyente de muchos diluyentes. La yema de huevo se demostró que ejercía un efecto protector sobre las membranas plasmáticas, acrosomal y mitocondrial de los espermatozoides expuestos a bajas temperaturas (Jones y Martín, 1973) además de preservar la motilidad espermática durante la refrigeración del semen (Lardy y Phillips, 1939). También se han desarrollado diluyentes en base al uso de leche desnatada en polvo o leche entera homogeneizada, pudiendo ser el constituyente básico del diluyente (Thacker y Alquimist, 1951), o bien ser incorporadas en pequeñas cantidades a un diluyente sintético (Jones, 1968, 1969 b). En el caso de la leche, se sabe que el agente responsable del efecto protector de las membranas espermáticas reside en la caseína, cuya concentración óptima oscila entre el 1 y el 8%. Sin embargo, a un nivel molecular, todavía no está clara la naturaleza de este efecto protector (Salibury y col., 1978). En cuanto a los componentes de la yema de huevo con actividad crioprotectora, se han propuesto los fosfolípidos y las proteínas (Kampschmidt y col, 1953; Bialy y col., 1957; Martin, 1963; Lanz y col., 1965; Gebauer y col., 1970), y se ha llegado a la conclusión de que la fracción de lipoproteínas de baja densidad (LDF) es la principal responsable del efecto crioprotector (Pace y Gram., 1974; Watson y Martin, 1973, 1975; Watson, 1976; Foulkes, 1977). Todavía no se han aclarado los mecanismos por los cuales las LDF protegen a los espermatozoides de los daños ocasionados por la congelación (Voglmayr y col., 1983). Foulkes (1977) sugirió que la yema de huevo preserva la Revisión Bibliográfica 32 integridad de la membrana plasmática previniendo la pérdida de hialuronidasa soluble. Watson (1975 b) propuso que los espermatozoides son protegidos por un recubrimiento reversible y sugirió que las proteínas de la fracción lipoproteica se unen a la superficie de la membrana evitando la pérdida de fosfolípidos de membrana durante la criopreservación. Recientemente, se ha propuesto un nuevo mecanismo de acción de las LDF sobre las membranas espermáticas. Manjunath y col., (2002) demostraron que las LDF de la yema de huevo tienen una elevada afinidad para unirse a las proteínas del plasma seminal bovino; esta unión se produce de forma rápida, específica, saturable y estable, y se mantiene después de la congelación. Las proteínas del plasma seminal bovino, durante la eyaculación, se unen a las membranas espermáticas recubriéndolas superficialmente (Manjunath y col., 1994) e inducen la salida de fosfolípidos y colesterol de membrana provocando su destabilización, y este efecto es tiempoy concentración-dependiente (Thérien y col. 1998, 1999). Cuanto más prolongada sea la exposión a las proteínas del plasma seminal, mayor cantidad de colesterol y de fosfolípidos serán eliminados de la membrana plasmática. La pérdida de lípidos, especialmente de colesterol, induce la desestabilización de las membranas y causa una reducción de su resistencia al shock por frío y a la congelación (Darin-Bennet and White 1977; White 1993). Se ha sugerido (Manjunath y col., 2002) que las lipoproteínas de la yema de huevo protegen a los espermatozoides durante el enfriamiento y la congelación, debido a que se unen a las proteínas del plasma seminal presentes en el semen, secuestrándolas en su mayoría y por tanto, impidiendo su efecto negativo sobre las membranas espermáticas. Tanto la yema de huevo como las proteínas de la leche representan un riesgo higiénico por tratarse de productos de origen animal, y por tanto, su uso podría asociarse a la introducción de contaminación microbiana en las muestras de semen, con la consiguiente producción de endotoxinas capaces de dañar la capacidad fecundante de los espermatozoides (Bousseau y col., 1998). Además, la presencia de hormonas esteroides en la yema de huevo, se ha sugerido que puede reducir la capacidad fecundante de los espermatozoides. Por otra parte, la yema de huevo y la leche contienen partículas groseras que interfieren en la valoración de la calidad espermática. Revisión Bibliográfica 33 Por todas estas razones, a lo largo de la última década se han ido desarrollando nuevos diluyentes basados en el uso de lipoproteínas y lipopolisacáridos de origen vegetal, principalmente a partir de extractos de soja. La eficacia de estos nuevos diluyentes para la congelación del semen bovino ha sido evaluada por diferentes grupos, en comparación con el uso de diluyentes convencionales elaborados con yema de huevo (Bousseau and Brillard 1994; Hinsch y col., 1997a; Müller-Schlösser y col., 2001), pero los resultados obtenidos por los diferentes autores fueron muy dispares, no pudiéndose extraer una conclusión clara. Por ejemplo, Hinsch y col., (1997 a,b) y Gil y col., (2000) no encontraron diferencias significativas en la motilidad espermática o en la integridad acrosómica postdescongelación al comparar diluyentes elaborados a partir de yema de huevo y de soja. Sin embargo, otros autores observaron un descenso en la tasa de no retorno a los 56 dias (Van Wagtendonk-de Leeuw y col., 2000), una reducción en la motilidad, viabilidad y resistencia osmótica de los espermatozoides (Thun y col., 2005) o una caída brusca en la supervivencia espermática post-descongelación (Christensen y col., 2005), cuando los espermatozoides bovinos se congelaron en diluyentes elaborados a partir de extractos soja frente a los que contenían yema de huevo. 2.1.3. Agentes Crioprotectores y Efectos de la Congelación sobre las Células Espermáticas 2.1.3.1. Eventos que ocurren durante la Congelación y Descongelación En el proceso de criopreservación espermática, cuando la temperatura desciende por debajo del punto de congelación del medio extracelular, comienza la formación de hielo. El agua pura cristaliza dejando a los solutos en mayor concentración en el agua que permanece en estado líquido. Las membranas celulares impiden la extensión de los cristales de hielo hacia el interior de la célula y por lo tanto el contenido intracelular se encuentra superenfriado, permaneciendo líquido por debajo del punto de congelación, con lo cuál se establece una diferencia en el potencial químico del agua intra y extracelular, creándose una tendencia a que el agua salga de la célula a favor del gradiente osmótico. Revisión Bibliográfica 34 A partir de este momento pueden ocurrir dos cosas: si la velocidad de enfriamiento es lo suficientemente lenta, el agua sale de la célula y ésta se deshidrata progresivamente. Pero si la velocidad de enfriamiento es demasiado alta, el agua no puede moverse de la célula lo suficientemente rápido y hay un incremento en el grado de superenfriamiento hasta que ocurre la congelación intracelular para restaurar el equilibrio. Mazur y col. (1970) demostraron que para todos los tipos celulares estudiados, las curvas de supervivencia versus tasa de enfriamiento tienen forma de U o V invertida. La velocidad de enfriamiento óptima varía considerablemente entre tipos celulares desde menos de 1ºC/min para embriones, hasta 2000-3000ºC/min para glóbulos rojos. El óptimo puede ser alterado por la presencia de agentes crioprotectores, y además, la mayoría de los tipos celulares no sobreviven a la congelación en ausencia de algún crioprotector. Para las células espermáticas, la tasa óptima de enfriamiento oscila entre 10100ºC/min. Velocidades más rápidas o más lentas resultarán en menor supervivencia (Bruemmer y col., 1963; Salamon, 1970; Colas, 1975; Rodríguez y col., 1975; Robbins y col., 1976; Fiser y Fairfull, 1984). 2.1.3.2. Causas de Muerte Celular por Congelación A velocidades de enfriamiento superiores a la óptima, la formación de cristales de hielo intracelulares es el factor letal (Mazur, 1977), mientras que a velocidades más bajas que la óptima, los “efectos solución” son los responsables de la pérdida de viabilidad. No hay discusión en cuanto a la idea de que la muerte celular está asociada con la presencia de gran cantidad de cristales de hielo intracelulares, pero algunos estudios han demostrado que pequeñas cantidades de hielo intracelular, no necesariamente son incompatibles con la supervivencia (Sherman, 1962). Además Farrant y col. (1977) demostraron que la cantidad de hielo intracelular y el tamaño de los cristales son lo que determina la supervivencia. Las células congeladas rápidamente (conteniendo cristales de hielo intracelulares), sobrevivirán sólo si son descongeladas rápidamente. El recalentamiento lento da tiempo para la recristalización, proceso de crecimiento de los cristales durante la descongelación, que es perjudicial. Revisión Bibliográfica 35 El término "efectos solución" incluye una serie de hechos interrelacionados: creciente concentración de solutos intracelulares, disminución del contenido de agua intracelular, precipitación de solutos a medida que sus solubilidades son sobrepasadas, resultando en alteraciones del pH (Van Den Berg y Rose, 1959; Van Den Berg y Soliman, 1969), y precipitación de todos los solutos por debajo del punto eutéctico del sistema. Si alguno de estos factores tiene un efecto especialmente perjudicial, es un tema todavía en discusión. 2.1.3.3. Agentes Crioprotectores En presencia de un crioprotector, la cantidad de agua que permanece en estado líquido a medida que desciende la temperatura es mayor, y por lo tanto, la concentración de electrolitos aumenta menos. El efecto está relacionado con la concentración molar del crioprotector. Mazur y Rigopoulos (1983), y Mazur y Cole (1985), propusieron que la fracción de agua no congelada es más importante que la concentración de electrolitos, ya que la constricción de los canales líquidos causa un estres físico sobre las células ya contraídas, e incrementa el contacto célula-célula que se considera perjudicial. Existen numerosos compuestos que ejercen efecto crioprotector sobre las células (Doebbler, 1966; Meryman, 1971), y tradicionalmente se han clasificado en agentes penetrantes o no penetrantes en función de que su acción sea intra o extracelular. Desde que Polge, Smith y Parkes (1949) demostraron la eficacia del glicerol, se ha considerado como el crioprotector celular universal, y ha sido el más extensamente utilizado para los espermatozoides de la mayoría de las especies de mamíferos, puesto que ningún otro crioprotector ha dado mejores resultados que el glicerol. Entre los agentes penetrantes, además del glicerol, podemos citar el dimetilsulfóxido (DMSO), el metanol y algunos polialcoholes (Polge y Soltys, 1960; Jones, 1965; Nagase, 1968; Nagase y Tomizuka, 1968; Salamon, 1968; Wilmut y Polge, 1977). El mecanismo de crioprotección de los agentes penetrantes, aunque no totalmente dilucidado, parece ser que es en virtud de sus propiedades coligativas y ligantes de agua (Mazur y col., 1970; Meryman, 1971), disminuyendo el punto crioscópico intracelular, y por lo tanto disminuyendo la concentración de solutos intracelular a una temperatura dada, ya que la Revisión Bibliográfica 36 cantidad de agua que permanece en estado líquido será mayor que en ausencia del crioprotector. Los agentes no penetrantes -proteínas, azúcares de elevado peso molecular, polivinilpirrolidonaactúan osmóticamente promoviendo la deshidratación celular durante la congelación, e impidiendo la formación de grandes cristales de hielo en el interior de las células (Watson, 1990). Estos agentes no atenúan el efecto de la alta concentración intracelular de solutos (“efecto solución”), y por tanto son más efectivos en congelaciones rápidas (Nagase y col., 1968). 2.1.3.3.1. Cómo actúa el glicerol en las células Durante el procesado ocurren dramáticos movimientos de agua y crioprotector en una célula espermática; respuestas similares, aunque únicas, es posible que ocurran en cada subcompartimento celular (Hammerstedt y col., 1990). En respuesta a la adición del glicerol al medio isotónico en el que están las células espermáticas en suspensión, tiene lugar un primer ajuste del volumen celular debido a una rápida salida de agua intracelular (arrugamiento de la célula), seguida por un lento retorno al volumen original a medida que penetra el crioprotector. Cuando el agua extracelular se congela ocurre un segundo ajuste de volumen, motivado por la salida de agua del interior de la célula, en respuesta a las altas concentraciones de sales extracelulares. La descongelación induce cambios de volúmenes análogos pero opuestos. Como los componentes de membrana pueden cambiar a lo largo del ciclo de congelación-descongelación, la cinética del transporte de agua puede no ser equivalente (Hammerstedt y col., 1990). Los ajustes de volumen de mayor magnitud se producirán cuando las células son expuestas a condiciones hipertónicas durante la congelación. Ello se revierte durante la descongelación y el espermatozoide recupera su volumen isotónico. Otro gran cambio ocurrirá cuando el espermatozoide equilibrado con glicerol, es transferido de un diluyente glicerolado (1300 mOsm.) al tracto genital de la hembra (300 mOsm). A medida que el agua osmóticamente activa entra en la célula, más rápidamente de lo que el glicerol puede Revisión Bibliográfica 37 salir, ocurrirá una expansión de 3,4 veces. ¿Cómo pueden las membranas acomodarse a esta gran reducción y expansión de volumen? (Hammerstedt y col. 1990) la respuesta a condiciones moderadamente hipertónicas podría ser a través una íntima aproximación de los sistemas de membrana (Jones, 1971), pero como el mayor espacio lo ocupa el núcleo (núcleoproteínas altamente condensadas y cromatina unidas por puentes disulfuro) (Bedford y Calvin, 1974), el acrosoma y los espacios intramembrana pueden reducir su volumen, pero las reducciones sustanciales del volumen total podrían ser a expensas del tracto intermedio y la cola (Hammerstedt y col., 1990). 2.1.3.3.2. Efectos nocivos del glicerol Además de los efectos osmóticos, el glicerol actúa directamente sobre las membranas espermáticas (Parks y Graham, 1992). La naturaleza de esta acción no se conoce con exactitud, pero puede relacionarse con: -alteración directa de las capas de la membrana (Hempling y White, 1984; Anchordoguy y col., 1987; Goodrich y col., 1988; Crowe y col., 1987) -interacción con los enlaces de proteínas y glucoproteínas (Armitage, 1986) -inducción de un incremento de la demanda bioenergética (Hammerstedt y col., 1990) En virtud de su efecto directo sobre las membranas espermáticas y sobre el metabolismo celular, el glicerol tiene una acción perjudicial sobre la fertilidad espermática y esta acción es más acusada a mayor temperatura. En semen ovino el efecto negativo sobre la fertilidad se ha atribuído a la inducción anticipada de la reacción acrosómica, que sería la responsable de las bajas tasas de concepción del semen congelado (Slavik, 1987). En espermatozoides humanos, la hiperosmolaridad posee un efecto estimulador de la reacción acrosómica (Aitken y col., 1983), y también se ha planteado si la presión osmótica del medio, que se incrementa al añadir el glicerol, podría estimular la reacción acrosómica (Slavik, 1987). 2.1.3.3.3. Concentración óptima de glicerol Revisión Bibliográfica 38 Teniendo en cuenta los efectos tóxicos del glicerol y el hecho indiscutible de que su uso es necesario para la supervivencia espermática postdescongelación, es necesario establecer una concentración óptima que represente un compromiso entre el efecto tóxico y el efecto protector (Watson, 1979). La concentración de glicerol requerida para una supervivencia óptima depende de numerosas consideraciones (constituyentes del diluyente, velocidad de congelación y descongelación, formato de envasado), pero el factor determinante de esta concentración es la especie (Watson, 1979). Los espermatozoides de toro se ven adversamente afectados por niveles superiores al 10% (Polge, 1953; Robbins y col., 1976), siendo la concentración óptima entre el 6 y 9% para espermatozoides congelados en pajuelas (Pickett y Berdston, 1974; Rodríguez y col., 1975; Mortimer y col., 1976; Becker y col., 1977; Unal y col., 1978). 2.2. Periodo de Equilibrado Algunos autores observaron que la motilidad postdescongelación y la fertilidad de los espermatozoides bovinos se incrementaban si se prolongaba el periodo comprendido entre la adición del glicerol y el comienzo de la congelación. Este intervalo, que normalmente transcurría a 5ºC, se denominó “periodo de equilibrado del glicerol” porque se creía que era necesario para que el glicerol penetrase en el interior de los espermatozoides y se equilibrase su concentración a ambos lados de la membrana plasmática. Algunos estudios diseñados para determinar la influencia de este periodo sobre la fertilidad, claramente establecieron que un periodo de equilibrado de varias horas era beneficioso (Salisbury y col., 1978). Posteriormente se demostró que el glicerol penetra en los espermatozoides de toro, a 25ºC ó a 5ºC, en 3-5 min (Berndstone y Foote, 1972), sin embargo, la máxima supervivencia postdescongelación se consigue con un tiempo de exposición al glicerol de sólo 10 seg (Berndstone y Foote, 1972), siendo peor con exposiciones de 2 min. o más. Otros autores encontraron que los resultados de motilidad y fertilidad eran prácticamente idénticos, tanto con exposiciones cortas (<1min.) como largas (varias horas). Estos hallazgos cambiaron el concepto del "tiempo de equilibrado", indicando que este periodo Revisión Bibliográfica 39 de almacenaje a 5ºC probablemente era más necesario para que las membranas espermáticas se adaptasen a las bajas temperaturas, que para la penetración del glicerol. Se realizaron varios experimentos con distintos tiempos de equilibrado a 5ºC, en presencia y ausencia de glicerol, para determinar si se trataba de una interacción entre las células y el glicerol, o era más bien un proceso de adaptación celular a las bajas temperaturas. Varios estudios demostraron que el glicerol puede ser adicionado en cualquier momento de este periodo sin afectar a la fertilidad (Martin, 1965; Jones, 1965, 1969). Los efectos perjudiciales de la exposición al glicerol a elevadas temperaturas, son al menos parcialmente reversibles durante el subsecuente enfriamiento a 5ºC. Es posible que la supervivencia se encuentre más severamente afectada si el periodo de enfriamiento pre-congelación se reduce (Salisbury y col., 1978). No obstante, este periodo de almacenaje parece ser menos importante si el descenso de temperatura a 5ºC se hace lentamente (Jones, 1969a y b; Ennen y col., 1976; Gilbert y Almquist, 1978). No es muy apropiado, por tanto, referirse a este periodo de enfriamiento como tiempo de equilibrado por su connotación de penetración del glicerol, siendo más apropiado el término de periodo de enfriamiento (Watson, 1979). Otro aspecto a evaluar fue la conveniencia de añadir al semen el diluyente glicerolado desde la primera dilución, en un único paso, o bien de forma gradual a lo largo de varios pasos. Se comparó la fertilidad de espermatozoides bovinos congelados, glicerolados a 5ºC en 1 ó 4 pasos inmediatamente después de que el semen alcanzó esta temperatura, con la de espermatozoides glicerolados a 5ºC después de 5 h de enfriamiento (una hora antes de congelar), observándose que la fertilidad no estaba significativamente influenciada por el método de adición del glicerol (revisado Pickett y Berndtson, 1978); y también fue similar cuando las muestras fueron gliceroladas lentamente a lo largo de 2 h, o de forma rápida (Berndtson y Foote 1969, 1972). Bajo ciertas condiciones, la adición del glicerol por pasos, puede incrementar la motilidad postdescongelación; la diferencia generalmente es pequeña, y puede que no se refleje en un incremento de la fertilidad in vivo (Salisbury y col., 1978). Revisión Bibliográfica 40 2.3. Formato de Envasado El semen de toro, al igual que el de otras especies, normalmente se envasa en pajuelas de PVC (Cassou, 1965) de 0,25 ó de 0,5 ml, ya que constituyen un formato adecuado para la manipulación, identificación, almacenaje y descongelación. Cuando se desarrolló la tecnología para la congelación del semen bovino, se utilizaban casi exclusivamente ampollas de cristal. Las ampollas proporcionaban un envase estéril que podía etiquetarse, llenarse y sellarse automáticamente, lo cual previene la contaminación cruzada. Entorno a 1965, Cassou desarrolló las pajuelas de PVC, y a partir de este momento su uso fue generalizado para el envasado del semen bovino, y también del de otras especies. Las pajuelas requieren menos espacio de almacenamiento que las ampollas, y por lo tanto la congelación de las mismas es más rápida y eficaz que las ampollas, y además el esperma de la pajuela puede depositarse en el tracto genital de la hembra con una pérdida mínima de células espermáticas. Otro formato que permitió obtener buenos resultados de fertilidad fueron los pellets (revisado en Watson, 1979). Este método consiste en la deposición de pequeñas alícuotas de semen diluído en unas depresiones hemisféricas hechas en un bloque de hielo seco, con lo cuál el semen se congela instantáneamente adquiriendo la forma de píldoras o pellets. Los pellets ocupan poco espacio de almacenamiento y pueden considerarse como el formato más barato, sin embargo, tienen algunas desventajas con respecto al uso de pajuelas: es difícil de identificar el toro en cada pellet y la contaminación cruzada con otros espermatozoides o con microorganismos es posible. Material y Métodos 47 Animales Para la realización de este trabajo se utilizaron toros pertenecientes a dos centros de inseminación artificial. En los estudios 1, 2 y 4 se trabajó con sementales que permanecían estabulados en el Centro de Selección y Reproducción Animal de Galicia XENÉTICA FONTAO, S.A. (Fontao, Esperante, Lugo), mientras que para el tercer trabajo, se utilizaron toros alojados en el Centro de Inseminación Artificial de Somió (SERIDA), Gijón (Asturias). En todos los estudios se utilizaron toros de raza Holstein, y en el segundo trabajo se utilizaron también toros de raza Rubia Gallega. Todos los sementales comenzaron su etapa como reproductores a los 15 meses de edad, estaban clasificados como `aptos para la reproducción’ y libres de toda enfermedad infectocontagiosa. Obtención y evaluación de los eyaculados En todos los casos la extracción del semen se realizó mediante el uso de vagina artificial (a una temperatura interna de 45ºC). De cada toro se obtuvieron dos eyaculados, con un intervalo de 20 min entre los dos saltos, excepto en el tercer estudio en el que únicamente se recogió un eyaculado por toro. Tras la obtención del semen se realizó una primera valoración de la calidad de los eyaculados atendiendo a los siguientes parámetros: -volumen, determinado por lectura directa en un tubo graduado de 10 ml -motilidad en masa, determinada mediante examen microscópico subjetivo; los eyaculados se puntuaron en una escala de 0 (ausencia de movimiento) a 5 (ondas con movimiento muy rápido y vigoroso), y aquellos con una puntuación inferior a 3 se descartaron. -concentración espermática, determinada mediante el uso de fotómetros calibrados; en los trabajos 1, 2 y 4 se utilizó el modelo Photometer SDM 4 (Minitüb, Tiefenbach, Germany), y en el trabajo 3, se utilizó un fotómetro modelo Accucel (IMV, L’Agle, France). Material y Métodos 48 Dilución seminal Una vez determinado el volumen y la concentración, se mezcló el semen procedente de uno o dos saltos con el diluyente utilizado en cada ensayo. Los diluyentes elaborados a partir de extractos de soja (Biociphos Plus®, Andromed® y Bioxcell®), utilizados en los estudios 1 y 3, se adicionaron directamente al eyaculado, a temperatura ambiente, hasta alcanzar una concentración de 80 x 106 espermatozoides (esp)/ml (trabajo 1) ó 92 x 106 esp/ml (trabajo 3). El diluyente elaborado con yema de huevo (Biladyl®), utilizado en los estudios 1 y 4, se adicionó en 2 pasos: la solución A (libre de glicerol) se añadió en una primera fase, a temperatura ambiente, hasta alcanzar una concentración de 160x106 esp/ml. Una vez diluido con la solución A, el semen se dejó equilibrar a 4ºC durante 18 horas, y aproximadamente 1 hora antes de la congelación, se adicionó el mismo volumen de Biladyl® solución B (que contenía un 14% de glicerol) a 4ºC en 3 etapas, a intervalos de 20 min, para obtener una concentración espermática final de 80 x 106 esp/ml. Tras la dilución seminal con los respectivos diluyentes, se evaluó subjetivamente la motilidad espermática individual y aquellas muestras con motilidad inferior al 60% se desecharon. Las muestras con un porcentaje de espermatozoides móviles entre el 60 y el 85% se consideraron de calidad `buena´ y si el porcentaje de motilidad era superior al 85% se consideraron de ‘calidad muy buena’. Procesado del semen Tras la adición del diluyente al semen, que se realizó siempre a temperatura ambiente (20ºC), se procedió a bajar gradualmente la temperatura de la suspensión espermática hasta alcanzar los 4ºC. El periodo de equilibrado del semen a 4ºC fue de 18 horas en todos los ensayos, excepto en el tercer estudio, en el que se redujo a 4 horas. A continuación se procedió a la identificación (fecha de envasado, nombre del toro, etc.) de pajuelas de 0,25 ml, que se mantuvieron a 4ºC hasta el momento de su uso. Material y Métodos 49 Las operaciones de envasado del semen y sellado de las pajuelas se llevaron a cabo a una temperatura constante de 4ºC, siendo realizadas en el interior de una cámara frigorífica. La congelación se realizó en todos los casos en un congelador programable, IMV Digit-cool (IMV, L’Aigle, France), siguiendo la curva estándar para congelación de semen bovino (-5ºC/ min de + 4ºC a -10ºC; -40ºC/min de -10ºC a -100ºC y -20ºC/min de - 100ºC hasta -140ºC). Diseño experimental Experimento 1. Estudio comparativo de tres diluyentes: Andromed®, Biociphos Plus® y Biladyl®. Evaluación de la supervivencia y longevidad espermáticas post-descongelación. En este experimento se realizó un estudio comparativo de tres diluyentes comerciales previamente utilizados por otros autores para la crioconservación del semen bovino. El objetivo fue establecer cuál de ellos ofrecía mejores condiciones para la supervivencia espermática postdescongelación en las condiciones de trabajo de nuestro laboratorio. Dos de los diluyentes comerciales utilizados en el experimento 1, Biociphos Plus® (IMV, L’Aigle, France), y Andromed® (Minitüb, Tiefembach, Germany), están elaborados a partir de extractos de soja. Los fosfolípidos vegetales extraídos de la soja actúan como sustancias protectoras de las membranas celulares frente al efecto de las bajas temperaturas. Difieren entre ellos en el tipo de azúcares, en la naturaleza de las sustancias que actúan como tampón, y en los antibióticos que contienen, pero dado que son diluyentes comerciales, su composición exacta es desconocida. Ambos diluyentes se compararon frente al uso de Biladyl® (Minitüb, Tiefembach, Germany), en el que los fosfolípidos y lipoproteínas de la yema de huevo actúan como principales protectores de las membranas espermáticas frente al shock por frío. Los tres diluyentes contienen glicerol como crioprotector. Material y Métodos 50 Se utilizaron 60 eyaculados procedentes de 10 toros Holstein (6 eyaculados por toro). Cada eyaculado fue dividido en 3 volúmenes iguales, que se depositaron en 3 tubos de centrífuga, y a los que posteriormente se añadió el volumen apropiado de los respectivos diluyentes para alcanzar una concentración final de 80 x 106 esp/ml. El Biladyl® fue añadido en 2 pasos, como se ha descrito en el apartado anterior, mientras que el Biociphos Plus® y el Andromed® fueron adicionados en un solo paso, a temperatura ambiente. Las tres suspensiones espermáticas se mantuvieron a 4ºC durante 18 h. El procesado para la congelación fue realizado siguiendo la metodología descrita en el apartado anterior. La descongelación del semen se realizó en un baño de agua a 37ºC durante 20 segundos. De cada diluyente se descongelaron 3 pajuelas simultáneamente, su contenido se vació en un tubo falcon de 5 ml, y el semen se mantuvo en incubación postdescongelación a 37ºC durante un periodo de 9 h. Al cabo de 0, 3, 6 y 9 h de incubación, una alicuota de 100 μl se utilizó para evaluar la viabilidad espermática mediante citometría de flujo, utilizando la triple tinción fluorescente descrita por Nagy y col (2003). Experimento 2. Determinación de parámetros cinéticos medios en eyaculados de toros de raza frisona y rubia gallega. Influencia de la raza y la edad. En este trabajo se utilizaron 53 toros, 31 de raza Frisona y 22 de raza Rubia Gallega. Se recogieron un total de 119 eyaculados (entre 1 y 5 eyaculados por toro), de los cuales 58 eyaculados procedían de toros frisones y 61 de toros rubios. De los 58 eyaculados procedentes de toros frisones, 29 procedían de animales menores de 3 años de edad y otros 29 de animales mayores de 3 años. De los 61 eyaculados procedentes de toros rubios, 30 procedían de animales menores y 31 de animales mayores de 3 años. La calidad del semen inicialmente se valoró en base a su volumen, motilidad masal, motilidad individual y concentración espermática. Tras esta primera evaluación, los Material y Métodos 51 eyaculados seleccionados para la congelación fueron analizados con el sistema CASA Sperm Class Analyzer (Microptic S.L., Barcelona, España). Se tomó una alícuota de 5 µl de semen fresco y se diluyó con Biociphos Plus® para obtener una concentración espermática de aproximadamente 20 x 106 esp/ml. De esta dilución se tomó una alícuota de 5 μl y se depositó entre un porta y un cubre a 37ºC. Se evaluaron 3 campos de microscopio, con contraste de fases, analizándose aproximadamente 600 espermatozoides por muestra. Una vez hechas las 3 capturas, las imágenes analógicas de los espermatozoides fueron digitalizadas y analizadas con el software SCA® 2002 Movilidad (Microptic S.L., Barcelona). Los parámetros cinéticos medios, obtenidos para el total de los espermatozoides de cada muestra de semen, fueron los siguientes: 1) Parámetros de velocidad: - Velocidad curvilínea (VCL, µm/s): distancia recorrida por el espermatozoide a lo largo de su trayectoria por unidad de tiempo. - Velocidad rectilínea (VSL, µm/s): distancia recorrida por el espermatozoide entre el primer y último punto de su trayectoria por unidad de tiempo. - Velocidad media (VAP, µm/s): distancia recorrida por el espermatozoide a lo largo de su trayectoria media por unidad de tiempo. - Índice de linealidad (LIN, %): es la relación porcentual entre VSL y VCL. - Índice de rectitud (STR, %): es la relación porcentual entre VSL y VAP. - Índice de oscilación (WOB, %): es la relación porcentual entre VAP y VCL. 2) Parámetros de angularidad y oscilación de la cabeza: - Amplitud media del desplazamiento lateral de la cabeza (ALH, µm): es el desplazamiento que efectúa la cabeza espermática en su trayectoria curvilínea de un lado a otro de la trayectoria media o lineal. - Frecuencia de batido (BCF, Hz): es la frecuencia con la que la trayectoria curvilínea atraviesa la trayectoria lineal o media en función del tiempo. Material y Métodos 52 Experimento 3. Identificación de subpoblaciones espermáticas con patrones de movimiento específicos en eyaculados de toros Holstein. Influencia de la criopreservación y de la variabilidad individual. Para este estudio se utilizaron 54 eyaculados procedentes de 9 toros Holstein (6 eyaculados por toro). A los 9 toros se les recogió el semen en los mismos días experimentales, realizándose dos recogidas semanales en 3 semanas consecutivas. Tras una valoración inicial de los eyaculados, se tomó una alícuota para la evaluación de la motilidad espermática mediante el sistema CASA, y el resto del eyaculado se procesó para su congelación. La calidad del semen inicialmente se valoró en base a sus características macroscópicas, volumen, motilidad masal, motilidad individual y concentración espermática. Tras esta valoración inicial, una alícuota de semen fresco se diluyó con Bioxcell® (IMV, L’Aigle, Francia) para obtener una concentración aproximada de 40 x 106 esp/ml, y esta dilución fue utilizada para analizar la motilidad mediante el sistema CASA. El análisis de la motilidad se realizó de la forma descrita para el experimento anterior, pero en este caso se obtuvieron los parámetros cinéticos individuales que describían el movimiento de cada espermatozoide en particular, en lugar de los parámetros medios que describían el movimiento global del total de los espermatozoides de la muestra. El procesado para la congelación fue realizado siguiendo la metodología descrita en el experimento 1, con la salvedad de que en este estudio el diluyente utilizado fue Bioxcell®, y el equilibrado del semen se realizó a 5ºC durante 4 h, en lugar de a 4ºC durante 18 h. La descongelación del semen se realizó en baño de agua a 37ºC durante 40 segundos. De cada eyaculado se descongelaron 3 pajuelas simultáneamente, se mezcló su contenido en un tubo de 5 ml, y se mantuvo en incubación a 37ºC durante 4 h. Al cabo de 0, 2 y 4 h de incubación, se tomó una alícuota y se analizó de nuevo la motilidad espermática mediante el sistema CASA, obteniéndose los parámetros cinéticos para cada espermatozoide móvil. Material y Métodos 53 Experimento 4. Evaluación de diferentes temperaturas de descongelación del semen bovino: efecto sobre la viabilidad espermática post-descongelación y la distribución de los espermatozoides en subpoblaciones con diferentes patrones de movimiento. Para este estudio se utilizó semen congelado procedente de 10 toros Holstein (un único eyaculado de cada toro). El semen se congeló siguiendo el protocolo descrito en el experimento 1, utilizando el diluyente Bidadyl® y un tiempo de equilibrado de 18 h a 4ºC. De cada toro se descongelaron 3 pajuelas, de forma respectiva, a las 3 temperaturas indicadas anteriomente. La descongelación se realizó en un baño de agua a la temperatura apropiada, y el contenido de cada pajuela se vació en un tubo falcon que contenía 250 μl de medio PBS (Gibco Laboratories, Grand Island, NY, USA) a 37ºC. Las tres suspensiones se mantuvieron a 37ºC en incubación post-descongelación. En un primer ensayo, se evaluó el efecto de las diferentes temperaturas de descongelación sobre la motilidad espermática total, determinada subjetivamente, y sobre la integridad de las membranas plasmática y acrosomal de los espermatozoides, evaluada mediante citometría de flujo utilizando la triple tinción fluorescente descrita por Peña y col. (1999), tras 0 y 5 h de incubación post-descongelación. En un segundo ensayo, se investigó la existencia de subpoblaciones espermáticas definidas por los parámetros cinéticos individuales, y el efecto de las diferentes temperaturas de descongelación sobre la estructura de tales subpoblaciones. Para ello, se utilizó el sistema CASA, de la forma descrita en el experimento 3, obteniéndose los parámetros cinéticos individuales de cada espermatozoide móvil. El análisis de la motilidad se repitió al cabo de 2 h post-descongelación, con el objeto de estudiar la distribución de los espermatozoides en las distintas subpoblaciones espermáticas en función del tiempo de incubación. Material y Métodos 54 Evaluación de la integridad de las membranas plasmática y acrosomal de los espermatozoides mediante citometría de flujo. El citómetro de flujo utilizado en los experimentos 1 y 4 fue un modelo Epics XL (Coulter Corporation, Miami, FL, USA), que poseía un láser de argon de 15 mW con una longitud de onda de 488 nm. En todas las muestras se analizaron un mínimo de 100.000 eventos, cuantificándose simultánemente la fluorescencia verde, naranja y roja. Los parámetros de dispersión frontal (FS) y lateral (SS) de la luz del láser se utilizaron para separar a los espermatozoides de otros eventos en suspensión presentes en las muestras de semen, de forma que sólo fuese cuantificada la fluorescencia emitida por los espermatozoides. La fluorescencia verde se recogió en el sensor FL1, a través de un filtro dicroico de paso largo de 550 nm y de un filtro de paso de banda de 525 nm. La fluorescencia roja se recogió en el sensor FL3, a través de un filtro dicroico de paso largo de 645 nm y de un filtro de paso de banda de 620 nm. Los datos se analizaron utilizando el software System II (Coulter Corporation). En el experimento 1, las muestras de semen fueron teñidas con la triple tinción fluorescente descrita por Nagy y col (2003), que incluye la combinación de los siguientes fluorocromos: -SYBR-14, es un compuesto liposoluble capaz de atravesar las membranas celulares intactas de los espermatozoides y unirse al ADN nuclear. Cuando este compuesto es excitado por una longitud de onda de 488 nm emite fluorescencia verde. -Propidium Iodado (PI), es un compuesto capaz de entrar en los espermatozoides y unirse al ADN nuclear, pero sólo cuando las membranas celulares se encuentran alteradas. Al ser excitado a 488 nm emite fluorescencia roja. La combinación de ambos fluorocromos permite identificar y cuantificar poblaciones de espermatozoides con la membrana plasmática intacta (emiten fluorescencia verde) o con la membrana dañada (emiten fluorescencia roja). Material y Métodos 55 -Lectina de cacahuete (Arachis hypogaea) marcada con ficoeritrina (PE-PNA), esta lectina tiene gran afinidad por la membrana acrosomal interna y el contenido acrosomal de los espermatozoides de mamíferos. Cuando las membranas plasmática y acrosomal externa de los espermatozoides se encuentran alteradas, permiten la entrada y unión de la lectina al compartimento acrosomal, que al estar marcada con ficoeritrina va a emitir fluorescencia naranja cuando es excitada por un láser de 488 nm. La triple tinción fluorescente, por tanto, permite identificar y cuantificar cuatro subpoblaciones espermáticas: 1) una subpoblación de espermatozoides teñidos sólo con SYBR-14, cuyas membranas plasmática y acrosomal están intactas; 2) otra subpoblación de espermatozoides teñidos con SYBR-14 y con PE-PNA pero no con PI, cuya membrana plasmática está intacta, y por tanto impide la entrada del PI, pero con las membranas acrosomales dañadas, danto paso a la lectina; 3) una tercera subpoblación de espermatozoides teñidos con PI y PE-PNA, cuyas membranas plasmática y acrosomal ambas están dañadas; y 4) una cuarta subpoblación de espermatozoides sólo teñidos con PI, cuya membrana plasmática está alterada pero la acrosomal permanece intacta. En el experimento 4, se utilizó la triple tinción fluorescente descrita por Peña y col (1999), análoga a la anterior, en la que, en lugar de SYBR-14, el fluorocromo CarboxySNARF-1, en su forma acetoximetil éster, (SNARF) se combina con PI y FITC-PNA (lectina de cacahuete marcada con isotiocianato de fluoresceína). El SNARF es un compuesto liposoluble capaz de atravesar la membrana celular y penetrar en el interior de espermatozoides vivos y muertos. Es un indicador de pH intracelular, y en condiciones próximas a la neutralidad (7.0-7.2) emite fluorescencia naranja, mientras que a pH más alcalino la fluorescencia va cambiando hacia el rojo. Esta triple tinción, como la anterior, permite identificar cuatro subpoblaciones espermáticas: 1) espermatozoides teñidos sólo con SNARF, que se corresponden con células cuyas membranas plasmática y acrosomal se encuentran íntegras; 2) otra subpoblación de espermatozoides teñidos con SNARF y con FITC-PNA pero no con PI, cuya membrana plasmática está intacta pero la acrosomal se encuentra dañada; 3) una tercera subpoblación de espermatozoides teñidos con PI y FITC-PNA, con ambas Material y Métodos 56 membranas alteradas; y 4) una cuarta subpoblación de espermatozoides sólo teñidos con PI, con la membrana plasmática alterada pero el acrosoma intacto. Descripción del sistema CASA utilizado El sistema CASA utilizado en los estudios 2, 3 y 4, fue un Sperm Class Analyzer de Microptic S.L. (Barcelona). El análisis se basó en la captura de 16 imágenes fotográficas consecutivas, tomadas a intervalos de 40 ms, de cada campo microscópico seleccionado. Las imágenes se digitalizaron mediante el software SCA 2002® Movilidad, que incluía los siguientes parámetros predeterminados: número de imágenes capturadas por segundo, 25; VCL mínima para espermatozoides lentos, 20 μm/s; VCL máxima para espermatozoides lentos, 60 μm/s; VCL máxima para espermatozoides medios 110 μm/s; conectividad (distancia máxima entre dos objetos de dos imágenes sucesivas para que sea considerado el mismo objeto), 15 μm; número mínimo de imágenes para calcular ALH, 5. En todos los estudios se utilizó un microscopio de contraste de fases con platina a 37ºC y objetivos de 100 (trabajos 2 y 3) o de 200 (trabajo 4) aumentos. Análisis estadístico En todos los experimentos, los datos relativos a porcentajes de espermatozoides móviles, de integridad de las membranas plasmática y acrosomal, o a valores medios de los parámetros cinéticos descriptores del movimiento espermático (variables dependientes), se analizaron utilizando el procedimiento GLM (Modelo Lineal General), considerando los efectos del tratamiento, toro, replicado y las interacciones entre ellos (variables independientes) y las diferencias entre diferentes tratamientos se determinaron mediante tests HDS de Tukey. En los estudios en los que la variable dependiente se analizó a diferentes intervalos de tiempo (experimentos 1 y 4) se utilizó la modalidad GLM para medidas repetidas. El estudio de subpoblaciones espermáticas con patrones de movimiento específico (experimentos 3 y 4) se realizó mediante un análisis de clusters multivariante, utilizando el Resultados 63 descongelación, esta subpoblación sólo estuvo representada por un 15,2% y un 7,3% del total de espermatozoides. Por el contrario, la subpoblación 3, que en eyaculados frescos representaba al 10,7% del total de los espermatozoides, tras la criopreservación, se incrementó hasta un 27,2%. El porcentaje de espermatozoides asignado a la subpoblación 1, sin embargo, no varió de forma significativa con la congelación o durante la incubación post-descongelación. En semen fresco, el porcentaje de espermatozoides incluído en la subpoblación 4 varió de forma significativa (P<0,05) entre toros, sin embargo, los porcentajes de espermatozoides asignados a las otras tres subpoblaciones no mostraron diferencias entre toros. Tras la descongelación del semen, y durante la mayor parte de la incubación postdescongelación, la subpoblación 4 fue la que estableció las diferencias significativas entre toros. Tras 4 h de incubación, esta subpoblación había descendido considerablemente en todos los toros, y fue entonces la subpoblación 1 la que estableció diferencias significativas. Las subpoblaciones 2 y 3, prácticamente no mostraron diferencias entre los distintos toros. Se encontró una correlación significativa (p<0.01) entre la proporción de espermatozoides asignada a la subpoblación 4 en los eyaculados frescos y esa subpoblación en semen congelado a las 0 (r=0.473), 2 (r=0.513) y 4 h postdescongelación (r=0.450). Como se ha descrito, el toro tuvo un efecto significativo sobre la distribución de los espermatozoides en subpoblaciones, tanto en muestras de semen fresco como congelado. Sin embargo, el replicado (o día experimental) o la interacción entre toro y replicado no tuvieron efecto significativo sobre la estructura de las subpoblaciones. Hubo diferencias significativas entre las muestras de semen fresco y congelado en los parámetros que definían a las cuatro subpoblaciones. En general, tales diferencias indicaron que, en las cuatro subpoblaciones, la velocidad de los espermatozoides disminuyó tras la descongelación y también durante la incubación post-descongelación. Resultados 64 Experimento 4. Evaluación de diferentes temperaturas de descongelación del semen bovino: efecto sobre la viabilidad espermática post-descongelación y la distribución de los espermatozoides en subpoblaciones con diferentes patrones de movimiento. El método de descongelación (35ºC / 40 s; 50ºC/ 15 s; ó 70ºC / 8 s) no tuvo efecto significativo ni sobre la motilidad espermática, determinada subjetivamente o con un sistema CASA, ni sobre el porcentaje de espermatozoides vivos con el acrosoma intacto, en ninguna las evaluaciones post-descongelación (Tabla 2). Independientemente del método de descongelación, el tiempo de incubación causó una reducción significativa (P<0,001) tanto de la motilidad (subjetiva o determinada con CASA) como de la viabilidad espermática. Tabla 2. Porcentajes (medias ±DE) de motilidad (determinada subjetivamente y mediante un sistema CASA) y de viabilidad espermática (determinada por citometría de flujo) en muestras de semen bovino descongelado a diferentes tasas (n=10). Temperatura /tiempo de descongelación Evaluaciones post-descongelación 35ºC / 40 s 50ºC/ 15 s 70ºC / 8 s Mot. Subj. 0 h 64,0±14,5 59,0±11,0 61,0±13,3 Mot. Subj. 5 h 7,4±9,1 17,4±11,7 6,3±8,8 Mot. CASA 0h 82,7±7,5 80,9±10,3 86,1±6,7 Mot. CASA 2h 66,7±17,1 67,4±17,7 78,6±13,8 Viabilidad 0 h 73,4±15,0 73,3±13,3 74,4±7,7 Viabilidad 5 h 55,5±19,9 62,1±9,7 66,7±11,0 Tras un análisis de clusters multivante sobre un total de 6115 espermatozoides móviles, se identificaron cuatro subpoblaciones espermáticas con patrones de movimiento específicos, que eran análogas a las descritas en el experimento anterior: - La subpoblación 1 estaba representaba por espermatozoides de velocidad moderada (VCL=79,4±17,7 μm/s; VSL=49,9±13,3 μm/s; VAP=57,4±13,5 μm/s) pero de trayectoria progresiva (LIN=63,4±12,7%; STR=86,9±9,3%; ALH=2,98±0,89 μm). El porcentaje de espermatozoides que constituían esta subpoblación fue del 27%. - La subpoblación 2 estaba integrada por espermatozoides con movimiento rápido pero no progresivo (VCL=104,4±24,4 μm/s; VSL=31,8±12,3 μm/s; VAP=61,9±18,0 μm/s; Resultados 65 LIN=30,5±9,7%; STR=52,3±16,7%; ALH=4,56±1,21 μm), considerado como algo similar a la hipercinesis. El 15% del total de los espermatozoides formaba parte de esta subpoblación. - La subpoblación 3, constituída por el 34% del total de espermatozoides, eran células con muy baja velocidad (VCL=28,8±15,6 μm/s; VSL=9,0±6,0 μm/s; VAP=15,9±8,8 μm/s) y movimiento no progresivo (LIN=32,8±16,7%; STR=56,5±19,7%; ALH=1,49±0,77 μm). - La subpoblación 4, representada por el 23% del total de espermatozoides móviles, incluía espermatozoides con un movimiento muy rápido (VCL=132,4±23,6 μm/s; VSL=89,2±20,4 μm/s; VAP=102,5±19,5 μm/s) y muy progresivo (LIN=68,3±14,1%; STR=87,2±11,3%; ALH=4,28±1,39 μm). El método de descongelación per se no tuvo influencia significativa sobre la distribución de los espermatozoides en las distintas subpoblaciones, sin embargo, la interacción entre método de descongelación y tiempo de incubación tuvo un efecto significativo sobre el porcentaje de espermatozoides asignado a la subpoblación 4. En las muestras de semen descongeladas a 35ºC, la subpoblación 4 se redujo de forma importante (p=0.017) tras 2 h de incubación post-descongelación (24,1% a las 0 h vs 8,3% a las 2 h); en cambio, esta subpoblación no varió de forma significativa cuando el semen fue descongelado a 50ºC (16,7% a las 0 h vs 18,1% a las 2 h) o a 70ºC (24,1% a las 0 h vs 16,5% a las 2 h). Las otras 3 subpoblaciones no se vieron influídas por la interacción entre el método de descongelación y el tiempo de incubación. El método de descongelación tuvo efecto significativo (P<0,05) sobre alguno de los parámetros cinéticos que definían a las 4 subpoblaciones. Por ejemplo, los espermatozoides asignados a la subpoblación 4 tenían un movimiento más rápido (mayor VCL, VSL, VAP, ALH y BCF) cuando la descongelación fue a 35ºC que cuando fue a 50ºC o a 70ºC. Resultados 66 Para los tres métodos de descongelación, algunos de los parámetros cinéticos que definían a cada subpoblación, variaron de forma significativa durante las 2 h de incubación postdescongelación. El cambio más interesante se observó en muestras descongeladas a 50ºC: los espermatozoides asignados a la subpoblación 4 mostraron un movimiento aún más rápido y progresivo tras 2 h de incubación que justo tras la descongelación. 67 VI. DISCUSIÓN Discusión 68 Los resultados del presente estudio (experimento 1) indicaron claramente que, si el semen se va a mantener a 4ºC durante un periodo de 18 h antes de su congelación, es más recomendable utilizar un diluyente elaborado en base a yema de huevo, como es el Biladyl®, que diluyentes elaborados en base a extractos de soja, como son Andromed® o Biociphos Plus®. El uso de Biladyl® no sólo implica la utilización de yema de huevo como principal sustancia protectora de las membranas espermáticas frente al shock por frío, si no que también implica la adición del glicerol en tres pasos, al final del periodo de refrigeración. Por el contrario, cuando el semen se diluye en Andromed® o Biociphos Plus®, el glicerol ya va incluído en el diluyente y por tanto se añade al semen desde la primera dilución. Varios estudios diseñados para evaluar el efecto de añadir el glicerol al semen bovino antes, durante, o al final de un periodo de refrigeración de entre 4 y 18 h a 5ºC en uno o en varios pasos, llevaron a la conclusión de que el glicerol podía ser adicionado al semen en cualquier momento de este periodo sin que la calidad espermática o la fertilidad del semen se viesen afectadas (revisado por Pickett y Berndtson, 1978). Por lo tanto, en el presente estudio, el efecto beneficioso del Biladyl® parece más probable que fuese debido a un mayor efecto protector de las membranas espermáticas por parte de la yema de huevo que de los lípidos de la soja. Varios estudios en los que se evaluó la eficacia de Andromed® o de Biociphos Plus® para la criopreservación del semen bovino, en comparación con el uso de diluyentes clásicos elaborado en base a Tris-yema de huevo, mostraron resultados contradictorios: por ejemplo, Hinsch y col. (1997 a, b) y Gil y col. (2000) no observaron diferencias significativas en la motilidad post-descongelación, la integridad de las membranas plasmática y acrosomal, el estado de capacitación de los espermatozoides o la fertilidad del semen bovino congelado con Biociphos Plus® o con Triladyl®. Sin embargo, otros autores observaron que el uso de Biociphos Plus® estaba asociado a menor tasa de no retorno a los 56 días (Van Wagtendonk-de Leeuw y col., 2000), menor motilidad, Discusión 69 viabilidad o resistencia osmótica de los espermatozoides tras su descongelación (Thun y col., 2002), o a una menor longevidad espermática durante la incubación postdescongelación (Christensen y col., 2005). En relación al uso de Andromed®, los resultados obtenidos por los distintos autores tampoco son concluyentes: Müller-Schlösser y col. (2001) no encontraron diferencias significativas en la motilidad post-descongelación, en el porcentaje de reacción acrosómica en respuesta a proteínas de la zona pelúcida o a progesterona, o en la fertilidad in vivo del semen congelado con Andromed® o con un diluyente Tris-yema. Aires y col. (2003), en cambio, no observaron diferencias significativas en la calidad postdescongelación del semen evaluada in vitro, pero obtuvieron mayor fertilidad in vivo cuando el semen había sido congelado con Andromed®. Sin embargo, Nehring y Rothe (2003) obtuvieron tasas de no retorno similares utilizando Andromed® o Triladyl® con dosis de inseminación de 15 millones de espermatozoides, pero cuando redujeron la dosis de inseminación a 5 millones de espermatozoides, el descenso de la tasa de no retorno fue casi del doble para Andromed® que para Triladyl®. Estos resultados tan dispares probablemente indican que la diferencia entre ambos tipos de diluyentes en lo que se refiere a su capacidad de criopreservación del semen bovino, es pequeña; pero también podrían estar relacionados con diferencias entre las distintas razas de toros utilizadas por los distintos autores. No obstante, es necesario remarcar que, en todos los trabajos anteriormente mencionados, los diferentes autores han utilizado periodos de equilibrado del semen, a una temperatura de 4-5ºC, comprendidos entre 2 y 5 h. Recientemente se ha propuesto un nuevo mecanismo de crioprotección de las membranas espermáticas por parte de la fracción de lipoproteínas de baja densidad de la yema de huevo. Manjunath y col. (2002) demostraron que las lipoproteínas de la yema de huevo tienen una gran afinidad por las proteínas del plasma seminal bovino (BSP: bovine seminal plasma proteins); esta unión se produce de forma rápida, específica, saturable y estable, y se mantiene durante la congelación y la descongelación. Las BSP se sabe que durante la eyaculación, se unen a la membrana plasmática de los espermatozoides Discusión 70 recubriéndola superficialmente (Manjunath y cols., 1994), e inducen la salida de fosfolípidos y colesterol de la membrana provocando su desestabilización, y este efecto depende de la concentración y del tiempo de exposición a las BSP (Thérien y cols. 1998, 1999). La pérdida de fosfolípidos y de colesterol, inducida por la exposición a las proteínas del plasma seminal, hace que se desestabilice la membrana y se reduzca su resistencia a la congelación (Darin-Bennet y White, 1977; White, 1993). Las lipoproteínas de baja densidad de la yema de huevo, al unirse a las proteínas del plasma seminal presentes en el semen, neutralizarían su efecto perjudicial sobre las membranas espermáticas protegiéndolas durante el enfriamiento y la congelación (Manjunath y col., 2002). En el presente estudio, las lipoproteínas de la yema de huevo pueden haber contrarestado o atenuado los efectos nocivos de las BSP sobre las membranas espermáticas, mientras que los fosfolípidos de la soja puede que no hayan tenido esa capacidad. En este estudio, las membranas de espermatozoides diluídos en Andromed® o Biociphos Plus® habrían estado expuestas al efecto de las BSP durante un periodo de 18 h, mientras que en los trabajos anteriormente reseñados este periodo fue tan sólo de 2-5 h. Es probable, por tanto, que el prolongado periodo de equilibrado utilizado en este estudio haya determinado las contundentes diferencias observadas entre ambos tipos de diluyentes. Al estudiar el efecto de la raza y de la edad sobre la producción de semen (experimento 2), se observó que los toros frisones mayores de 3 años produjeron eyaculados de mayor volumen que los toros rubios de ambos grupos de edad (mayores y menores de 3 años de edad). En general, los toros de razas lecheras se sabe que producen eyaculados de mayor volumen que los de razas de aptitud cárnica (Cole y Cupps, 1984), y nuestros resultados confirmaron este hecho. La concentración espermática, en cambio, fue mayor en eyaculados de toros rubios que en los de toros frisones, y por tanto, el número total de espermatozoides del eyaculado resultó ser similar para ambas razas. Esto probablemente indica que la diferencia entre las dos razas en el volumen de eyaculado se debe más a una diferencia en la cantidad de plasma seminal, emitido por las glándulas sexuales accesorias durante la eyaculación, que a una diferencia en la producción testicular. De hecho, el número total de espermatozoides presentes en el eyaculado no se Discusión 71 vio influido por la raza, pero sí por la edad del toro, siendo mayor en toros de más de 3 años. El tamaño y el peso del parénquima testicular son parámetros altamente correlacionados con el número total de células de Sertoli (Berndtson et al., 1987), con la producción de espermatozoides (Coulter et al., 1976; Madrid et al., 1988) y con la calidad espermática (Bailey et al., 1996) y fertilidad in vivo del semental (Elmore et al., 1976; Coulter and Foote, 1979). Era de esperar, por tanto, que los toros de mayor edad produjesen mayor cantidad de espermatozoides que los más jóvenes, muchos de los cuales no habrían completado su crecimiento corporal ni la maduración de sus órganos genitales. Cuando se utiliza un sistema CASA se debe tener en cuenta que los resultados que proporciona únicamente son aplicables y repetibles en otro laboratorio de análisis seminal, siempre y cuando se utilice el mismo equipo. Los resultados obtenidos tras el análisis de las mismas muestras de semen en distintos laboratorios y con diferentes equipos pueden ser muy dispares. Estas diferencias pueden ser debidas a que diferentes sistemas pueden incorporar distintas especificaciones técnicas (nº de imágenes por segundo, límites de tamaño, límites de velocidad para espermatozoides inmóviles, lentos, etc.), pero fundamentalmente se deben a que los distintos equipos a veces utilizan algoritmos muy diferentes para calcular el mismo parámetro cinético, con lo cuál es muy probable que en realidad se estén calculando parámetros distintos (Holt et al., 1994). Por otra parte, el usuario es una fuente de variabilidad tan o incluso más importante que la impuesta por las diferencias técnicas existentes entre los distintos equipos (Holt et al., 1994). Entre los valores medios de los parámetros descriptores de la motilidad espermática obtenidos mediante el sistema CASA (experimento 2), quizás el dato más relevante fue la diferencia observada entre toros frisones y rubios en lo que se refiere al porcentaje de espermatozoides clasificados como rápidos. En toros frisones, el grupo de espermatozoides rápidos describían una movimiento de mayor velocidad y de trayectoria más rectilínea (mayor VSL, VAP, LIN, WOB y menor ALH) que dicho porcentaje en eyaculados de toros rubios. Este hecho podría indicar la existencia de diferencias genéticas en la calidad del semen entre ambas razas. En un estudio reciente (Hoflack y col., 2007), se ha demostrado la existencia de diferencias significativas entre eyaculados de toros Azul Discusión 72 Belga y Holstein. Los porcentajes medios de espermatozoides móviles y progresivos, así como la velocidad y linearidad de las trayectorias espermáticas fueron superiores en eyaculados de toros Holstein. Los autores del estudio sugieren que un componente genético podría ser la base de dichas diferencias, probablemente como consecuencia de una mayor presión de selección sobre la raza Holstein. A lo largo de los años, y a nivel mundial, se han ido seleccionando los sementales Holstein de mayor fertilidad para su uso en IA, pero la presión de selección ha sido mucho menor para la raza Azul Belga o la Rubia Gallega. Los resultados de este estudio (experimentos 3 y 4) demostraron que en eyaculados bovinos, al igual que en los de otras especies de mamíferos, se pueden diferenciar varias subpoblaciones espermáticas con distintos tipos de movimiento. Tanto en semen fresco como en congelado se identificaron 4 subpoblaciones espermáticas determinadas en base a 8 parámetros cinéticos. Es de destacar que ambos experimentos se realizaron utilizando semen procedente de 2 centros de IA diferentes, con toros y protocolos de criopreservación diferentes y en distintas condiciones de manejo y alimentación. No obstante, los resultados obtenidos con eyaculados de toros Holstein, no necesariamente tienen que ser aplicables a todas las razas bovinas. De hecho, en semen porcino (QuinteroMoreno y col., 2004; Rivera y cols., 2005; 2006), de conejo (Quintero-Moreno y col., 2007) y de perro (Nuñez-Martínez y col., 2006 a,b) se han observado diferencias en el número y estructura de las subpoblaciones espermáticas identificadas en eyaculados de individuos de la misma especie pero de distintas razas. Por tanto al usar otras razas de toros, es posible que cambie el número de subpoblaciones y la frecuencia de distribución de los espermatozoides en las distintas subpoblaciones; aunque también es probable que dichos cambios se produzcan únicamente a nivel de la subpoblación 4, como hemos podido constatar en el experimento 2, al establecer las diferencias entre toros rubios y frisones en los parámetros cinéticos que definen el movimiento de los espermatozoides rápidos. El proceso de criopreservación (experimento 3) indujo cambios significativos en la frecuencia de distribución de los espermatozoides en las distintas subpoblaciones, y 79 VIII. RESUMEN Resumen 80 El objetivo de esta tesis fue la aplicación de nuevas tecnologías (sistemas CASA y citometría de flujo) para valorar de forma objetiva el éxito de nuevos métodos de congelación y descongelación del semen, la utilidad de nuevos diluyentes o la presencia de subpoblaciones espermáticas con características de movimiento específicas, que reflejan la existencia de espermatozoides con diferentes patrones cinéticos en un mismo eyaculado o dosis seminal. Para la realización de dicho trabajo se han efectuado 4 experimentos sobre distintos aspectos del protocolo de criopreservación de semen bovino de acuerdo al siguiente diseño experimental. Inicialmente se realizó un estudio comparativo de los tres diluyentes más frecuentemente utilizados por los diferentes centros de inseminación artificial (Andromed®, Biociphos Plus® y Biladyl®), obteniendo los resultados más satisfactorios con el medio dilutor elaborado a base de yema de huevo. Este medio se utilizó como base de las siguientes experimentaciones. A continuación se establecieron valores medios para una serie de parámetros cinéticos descriptores del movimiento espermático, obtenidos mediante un sistema CASA (Computer Assisted Sperm Analyzer), en eyaculados de toros Holstein y de raza Rubia Gallega, y clasificados con calidad adecuada para la criopreservación. Los resultados obtenidos después del análisis cinético revelaron que en general los toros Holstein tenían un porcentaje de espermatozoides rápidos con mayor velocidad y de trayectoria más rectilínea que dicho porcentaje en toros rubios. El tercer experimento consistió en determinar la existencia de diferentes subpoblaciones espermáticas con patrones de movimiento específicos en eyaculados de toros Holstein. Además, se determinó la frecuencia de distribución de los espermatozoides en las distintas subpoblaciones, y se evaluaó el efecto de la criopreservación e incubación postdescongelación sobre la distribución de los espermatozoides dentro de las diferentes subpoblaciones. Los resultados mostraron que los eyaculados con la subpoblación de espermatozoides más rápidos y progresivos presentaban mayor resistencia a la criopreservación y manifestaban mayor supervivencia espermática después de cuatro horas de incubación a 37ºC. Resumen 81 Por último, se evaluó el efecto de diferentes temperaturas de descongelación del semen bovino (37ºC durante 40 s, 50ºC durante 15 s, y 70ºC durante 8 s) sobre la integridad de las membranas plasmática y acrosomal de los espermatozoides, y sobre la distribución espermática en distintas subpoblaciones con patrones de movimiento específicos. Los resultados han puesto de manifiesto que las tres temperaturas de descongelación evaluadas (35ºC / 40s; 50ºC / 15s; 70ºC / 8s) produjeron resultados similares sobre la motilidad total y la viabilidad espermática postdescongelación. Sin embargo, el estudio de las diferentes subpoblaciones espermáticas durante el stress térmico postdescongelación, reveló diferencias entre las tres temperaturas, obteniéndose una mayor subpoblación de espermatozoides rápidos y progresivos cuando el semen se descongeló a las temperaturas más elevadas. 82 IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Referencias Bibliográficas 83 Aamdal, J., Andersen, K., 1968. Fast thawing of semen frozen in straws. Zuchthygiene 3, 22-24. Abaigar, T., Holt W.V., Harrison, R.A.P., Del Barrio G., 1999. Sperm subpopulations in boar (Sus scrofa) and gazelle (Gazella dama mhorr) semen as revealed by pattern analysis of computer-assisted motility assessments. Biol. Reprod. 60, 3241. Abaigar, T., Cano, M., Pickard, A.R., Holt, W.V., 2001. 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E-mail: [email protected] Delayed Freezing of Bull Sperm using Egg Yolk-based or Egg Yolk-free Extenders 311 2007 The Authors. Journal compilation 2007 Blackwell Verlag Please cite this article in press as: Mui˜ no, R., et al., Identification of sperm subpopulations with defined motility characteristics in ejaculates from Holstein bulls: Effects of cryopreservation and between-bull variation, Anim. Reprod. Sci. (2007), doi:10.1016/j.anireprosci.2007.10.007 ARTICLE IN PRESS +Model ANIREP-3464; No. of Pages13 R. Mui˜no et al. / Animal Reproduction Science xxx (2007) xxx–xxx 3 spermatozoa (Watson, 2000). Individual variation in semen freezability is recognized to exist in most domestic species, including the bovine (Parkinson and Whitfield, 1987), and such variation has been related to the incidence of motile (Davis et al., 1995; Nu˜ nez-Mart´ ınez et al., 2006a,b) and morphologically (Thurston et al., 2001; Esteso et al., 2006;Nu˜ nez-Mart´ ınez et al., 2007; Rubio-Guill´ en et al., 2007) distinct sperm subpopulations present in the fresh ejaculates. The purpose of this study was to (1) determine the existence of distinct motile sperm subpopulations, as well as their incidence, in fresh bull ejaculates, (2) evaluate the effects of cryopreservation on the frequency distribution of spermatozoa within the different subpopulations, and (3) evaluate between-bull variations in the sperm subpopulations structure of fresh and frozen-thawed semen. 2. Materials and methods 2.1. Animals A total of 54 ejaculates were collected from 9 Holstein bulls (six ejaculates per bull), with ages between 14 and 24 months. The bulls were in regular AI service housed at the Centro de Inseminaci´ on Artificial de Somi´ o (SERIDA), Gij´ on, Asturias. The overall 90 day non-return rates of the bulls, as obtained from previous records including all the inseminations (not only first but also second, third and subsequent inseminations), were in the range 45–51%. 2.2. Experimental design The 9 bulls were collected on the same experimental days, twice a week for 3 successive weeks. After collection and initial evaluation of each ejaculate (to determine its volume, sperm concentration and motility by subjective assessment) an aliquot was removed for computer-assisted evaluation of sperm motility, and the rest of the ejaculate was frozen. The overall sperm motility as well as the kinematic parameters of individual spermatozoa were determined by using a CASA system (Sperm Class Analyzer, Microptic; Barcelona, Spain) to investigate the existence of separate motile subpopulations in fresh bull semen samples. After 2 weeks of storage, the frozen semen was thawed and the CASA-derived motility characteristics were analysed after 0, 2 and 4 h of post-thaw incubation at 37 ◦C, to evaluate the effect of cryopreservation and post-thaw thermal stress on the distribution of spermatozoa into the different subpopulations. 2.3. Semen collection and freezing Ejaculates were collected by using an artificial vagina (initial temperature of the water: 45 ◦C) and evaluated for volume, sperm concentration by using a photometer (Accucell, IMV, L’Aigle, France), and the proportion of total motile spermatozoa by subjective visual assessment. The sperm motility was evaluated after dilution of a semen aliquot with Bioxcell®(IMV, L’Aigle, France) to reach a sperm concentration of approximately 40 ×106spz/ml. All the ejaculates collected had at least 80% of total motile spermatozoa, as determined subjectively. The same aliquot of diluted semen was then used to determine the sperm motility and the kinematic parameters of individual spermatozoa by means of a CASA system. Mean (±S.D.) values for volume of ejaculates, sperm concentration and total sperm motility (determined subjectively) were: 5.11 ±1.86 ml, 1183 ±343 ×106spz/ml and 87 ±6%, respectively. Please cite this article in press as: Mui˜ no, R., et al., Identification of sperm subpopulations with defined motility characteristics in ejaculates from Holstein bulls: Effects of cryopreservation and between-bull variation, Anim. Reprod. Sci. (2007), doi:10.1016/j.anireprosci.2007.10.007 ARTICLE IN PRESS +Model ANIREP-3464; No. of Pages13 4R. Mui˜no et al. / Animal Reproduction Science xxx (2007) xxx–xxx The rest of the ejaculate was diluted with Bioxcell®at room temperature (22 ◦C), at a final sperm concentration of 92 ×106spz/ml. Extended semen was left to equilibrate in a cooler at 5◦C for 4 h, then it was packaged in 0.25 ml French-straws (23 ×106spz/straw), and frozen in liquid nitrogen vapours in a programmable freezer following the IMV Digit-cool standard curve for bovine semen (−5◦C/min from +4 ◦Cto−10 ◦C; −40 ◦C/min from −10 ◦Cto−100 ◦C and −20 ◦C/min from −100 ◦Cto−140 ◦C). Thawing was done in a waterbath at 37 ◦C for 40 s. Three straws per ejaculate were simultaneously thawed, their content was pooled in a 5 ml falcon tube and the thawed semen was incubated at 37 ◦C in the dark for 4 h. 2.4. Sperm motility evaluation by using a CASA system The CASA system used was based on the analysis of 16 consecutive, digitalized photographic images which were taken in a time lapse of 0.64 s, which implied a velocity of image-capturing of 1 photograph every 40 ms. Images were taken from 5-␮l semen aliquots, which were placed on slides and covered with 20 ×20 mm coverslips. Three microscopic fields were analysed in each sample using a phase-contrast microscope supplied with a prewarmed stage at 37 ◦C and at 200×magnification. The number of spermatozoa analysed per sample ranged between 100 and 200, including the inmotile sperm. Objects incorrectly identified as spermatozoa were minimized on the monitor by using the playback function. Total motility was defined as the percentage of spermatozoa with mean velocity (VAP) above 10 ␮m/s. The kinematic parameters recorded for each spermatozoon, as described by Mortimer (1997, 2000) were: curvilinear velocity (VCL, ␮m/s): the average path velocity of the sperm head along its actual trajectory; straight-line velocity (VSL, ␮m/s): the average path velocity of the sperm head along a straight line from its first to its last position; average path velocity (VAP, ␮m/s): the average velocity of the sperm head along its average trajectory; percentage of linearity (LIN, %): the ratio between VSL and VCL; percentage of straightness (STR, %): the ratio between VSL and VAP; wobble coefficient (WOB, %): the ratio between VAP and VCL; mean amplitude of lateral head displacement (ALH, ␮m): the average value of the extreme side-to-side movement of the sperm head in each beat cycle; and beat cross frequency (BCF, Hz): the frequency with which the actual sperm trajectory crosses the average path trajectory. 2.5. Statistical analysis Data from all the motile spermatozoa obtained in evaluations of 54 fresh (9 bulls ×6 ejaculates) and 162 thawed (9 bulls ×6 ejaculates ×3 evaluation times) semen samples were imported into a single data set that represented 16,740 spermatozoa, each one defined by the 8 motility descriptors specified above. A multivariate k-means cluster analysis was carried out to classify the 16,740 spermatozoa into a reduced number of subpopulations according to their patterns of movement, so that every spermatozoon belonged to one and only one cluster. Spermatozoa that were very close to each other were assigned to the same cluster, whereas spermatozoa that were far apart were put into different clusters. The k-means clustering model used euclidean distances computed from the 8 quantitative variables, after standardisation of the data (arcsin transformation), so that the cluster centers were the means of the observations assigned to each cluster. The specified number of clusters was based on the previous analysis of hierarchical dendograms (Holt, 1996) constructed on individual ejaculates using the Ward method. For each ejaculate from each bull, contingency tables were used to determine the percentages of spermatozoa assigned to the different clusters at Please cite this article in press as: Mui˜ no, R., et al., Identification of sperm subpopulations with defined motility characteristics in ejaculates from Holstein bulls: Effects of cryopreservation and between-bull variation, Anim. Reprod. Sci. (2007), doi:10.1016/j.anireprosci.2007.10.007 ARTICLE IN PRESS +Model ANIREP-3464; No. of Pages13 R. Mui˜no et al. / Animal Reproduction Science xxx (2007) xxx–xxx 5 the different time points (pre-freezing, 0, 2 and 4 h post-thaw). The effects of cryopreservation, post-thaw incubation time, bull and ejaculate, on the relative distribution frequency of spermatozoa within subpopulations were analyzed using a GLM procedure. The GLM procedure was also used to evaluate the influence of the independent variables on the mean kinematic parameters defining the different sperm subpopulations (i.e. the cluster centers). Differences between means were analysed by Tukey’s test. All the statistical analyses were performed using the SPSS 14.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA), and differences were considered significant at P< 0.05 level. 3. Results 3.1. Overall sperm motility determined by CASA in fresh and frozen-thawed bull spermatozoa The mean (±S.D.) total sperm motility in the fresh semen samples collected from the 9 bulls (6 ejaculates per bull) was 82.3 ±9.8%, and after semen cryopreservation, it decreased to 75.8 ±12.8%, 69.8 ±16.3% and 59.4 ±20.9%, respectively, at evaluations done after 0, 2 and 4 h of incubation post-thaw at 37 ◦C. Post-thaw sperm motility after 2 h of incubation was lower (P< 0.05) than that recorded pre-freezing, but it was not different from that obtained immediately after thawing (Fig. 1). After 4 h of incubation post-thaw, total sperm motility was lower (P< 0.05) than that in fresh and frozen-thawed semen at 0 and 2 h post-thaw. There were significant differences (P< 0.01) between bulls in total sperm motility. In fresh semen (Fig. 2a), bulls 3 and 7 had higher sperm motility than bull 4. However, just after thawing (Fig. 2b), bulls 1, 2 and 9 had significantly higher sperm motilities than bull 7; and after 4 h of incubation post-thaw (Fig. 2d), bull 1 had a significantly higher sperm motility than bulls 3, 6, 7 and 8. There were no differences in total sperm motility between the different experimental days (when including pooled data across bulls) neither in fresh semen nor immediately after thawing or after 2 or 4 h of post-thaw incubation. Fig. 1. Relative frequency distribution of motile spermatozoa (mean percentages; n= 54) within subpopulations (1: black columns, 2: white columns, 3: grey columns, 4: dotted columns) in fresh and frozen-thawed bull semen samples. Different letters (a–c) inside columns indicate significant differences within subpopulations between evaluation time points (fresh, 0, 2 or 4 h post-thaw). Letters over the columns (a–c) indicate significant differences in total sperm motility between different evaluation time points. Please cite this article in press as: Mui˜ no, R., et al., Identification of sperm subpopulations with defined motility characteristics in ejaculates from Holstein bulls: Effects of cryopreservation and between-bull variation, Anim. Reprod. Sci. (2007), doi:10.1016/j.anireprosci.2007.10.007 ARTICLE IN PRESS +Model ANIREP-3464; No. of Pages13 6R. Mui˜no et al. / Animal Reproduction Science xxx (2007) xxx–xxx Fig. 2. (a–d) Relative frequency distribution of motile spermatozoa (mean percentages; n= 6) within subpopulations (1: black columns, 2: white columns, 3: grey columns, 4: dotted columns) between bulls in fresh (a) and frozen-thawed semen after 0 (b), 2 (c) and 4 h (d) of post-thaw incubation at 37 ◦C. Different letters (a, b and c) inside or by side columns indicate significant differences within subpopulations between bulls. Different letters (a and b) over the columns indicate significant differences in total motility between bulls. Please cite this article in press as: Mui˜ no, R., et al., Identification of sperm subpopulations with defined motility characteristics in ejaculates from Holstein bulls: Effects of cryopreservation and between-bull variation, Anim. Reprod. Sci. (2007), doi:10.1016/j.anireprosci.2007.10.007 ARTICLE IN PRESS +Model ANIREP-3464; No. of Pages13 R. Mui˜no et al. / Animal Reproduction Science xxx (2007) xxx–xxx 7 3.2. Motile sperm subpopulations Four sperm subpopulations were defined after multivariate cluster analysis of the 16,740 individual motile spermatozoa. The motility characteristics of those subpopulations are shown in Table 1, and their pattern of movement can be described as follows. Subpopulation 1 represented those spermatozoa with relatively low velocity (medium VCL, VSL and VAP) but with high progressiveness (high LIN, STR, WOB, BCF and low ALH). This population included about 23% of the total motile spermatozoa. Subpopulation 2 contained highly active but non-progressive spermatozoa, as indicated by the high values of VCL and ALH together with low values of LIN and STR, and moderate BCF. This population might be considered as having an “hyperactivated-like” movement, and about 16% of the total motile spermatozoa were assigned to this subpopulation. Subpopulation 3 included about 35% of the total spermatozoa, and those were poorly motile and non-progressive, as indicated by the lowest values of VCL, VSL, VAP, ALH and BCF together with the lowest LIN, STR and WOB. Subpopulation 4, containing about 25% of the total population, represented those spermatozoa which moved most rapidly and progressively, as indicated by the highest values of VCL, VSL, VAP and BCF together with the highest LIN, STR, WOB and moderate ALH. 3.3. Frequency distribution of spermatozoa within subpopulations before and after semen cryopreservation The proportions of spermatozoa assigned to the 4 subpopulations significantly changed (P< 0.01) during cryopreservation (Fig. 1). In fresh semen samples, 34.1% of the total spermatozoa moved very rapidly and progressively (subpopulation 4), but immediately after thawing, only 20.6% of the total spermatozoa showed this type of movement, and after 2 and 4 h of incubation, this subpopulation further decreased to 15.2% and 7.3%, respectively. In contrast, the poorly motile non-progressive sperm (subpopulation 3), that represented 10.7% of all the fresh spermatozoa, increased to 27.2% immediately after thawing, and then it did not significantly vary during post-thaw incubation. In fresh semen samples, 21.1% of the spermatozoa showed a Table 1 Mean values (and ranges) of the kinematic parameters defining the four subpopulations identified in fresh and frozenthawed bull semen samples Kinematic parameters Sperm subpobpulations 1234 No. spz (%) 3880(23.2) 2688(16.0) 5937 (35.5) 4235(25.3) VCL (␮m/s) 70.1a (10.1–109.3) 118.4 b (66.0–227.2) 29.5 c (10.0–93.0) 131.0d (86.1–254.0) VSL (␮m/s) 48.3a (9.9–82.3) 44.6b (8.5–72.1) 8.9c (1.2–26.7) 95.6d (60.1–201.0) VAP ( ␮m/s) 54.3a (10.3–89.9) 76.8b (27.6–168.0) 15.0c (1.9–57.9) 107.5d (73.3–205.2) LIN (%) 69.8a (32.9–100.0) 38.1b (10.0–65.7) 31.4c (10.0–93.4) 73.9d (30.7–99.5) STR (%) 88.9a (43.7–100.0) 59.4b (11.7–97.7) 59.2b (13.4–100.0) 89.1a (42.6–99.9) WOB (%) 78.2a (42.2–100.0) 65.4b (21.1–98.1) 51.5c (10.6–100.0) 82.8d (44.8–99.8) ALH (␮m) 2.3a (0.3–6.3) 4.6b (1.0–11.8) 1.5c (0.3–5.1) 3.7d (0.6–12.0) BCF (Hz) 9.0a (0.4–22.0) 7.6b (0.8–20.3) 5.0c (0.0–15.4) 9.5d (1.0–21.7) Different letters (a–d) indicate significant differences between subpopulations (P< 0.05). Please cite this article in press as: Mui˜ no, R., et al., Identification of sperm subpopulations with defined motility characteristics in ejaculates from Holstein bulls: Effects of cryopreservation and between-bull variation, Anim. Reprod. Sci. (2007), doi:10.1016/j.anireprosci.2007.10.007 ARTICLE IN PRESS +Model ANIREP-3464; No. of Pages13 8R. Mui˜no et al. / Animal Reproduction Science xxx (2007) xxx–xxx “hyperactivated-like” pattern of movement (subpopulation 2), and after thawing, this proportion decreased to 18.1% to further decrease to 8.7% and 5.9%, respectively, after 2 and 4 h of incubation post-thaw. Finally, the proportion of spermatozoa assigned to subpopulation 1 (moderately slow but progressive sperm) did not significantly change during cryopreservation or incubation post-thaw (16.5%, 15.9%, 18.3% and 15.5%, respectively, for fresh, 0, 2 and 4 h post-thaw). 3.4. Effect of individual variability on the frequency distribution of spermatozoa within subpopulations In fresh semen samples, the proportion of spermatozoa assigned to subpopulation 4 was the only one that significantly varied among bulls (P< 0.05), whereas subpopulations 1, 2 and 3 were not different for the 9 bulls (Fig. 2a). Immediately after thawing (Fig. 2b), subpopulations 2 and 4 had decreased in the 9 bulls in relation to prefreezing values, but such decrease was different (P< 0.05) for the different bulls. Subpopulations 1 and 3, however, did not differ among the 9 bulls. After 2 h of incubation post-thaw (Fig. 2c), differences among bulls in the sperm subpopulations distribution were only due to the proportion of spermatozoa assigned to subpopulation 4. At the end of the incubation period (Fig. 2d), however, subpopulation 4 had decreased considerably in all bulls, and individual differences were mainly due to differences in subpopulation 1. As described, the bull had a significant effect on the subpopulations distribution of spermatozoa in fresh and frozen–thawed semen samples, however, when data were pooled across bulls, there was no difference between replicates nor significant interaction between bull and replicate. There was no significant correlation between the total sperm motility in fresh samples and that in frozen–thawed semen either immediately after thawing or after post-thaw incubation. However, significant correlations (P< 0.01) were found between the proportions of spermatozoa assigned to subpopulation 4 in the fresh ejaculates and those in frozen–thawed semen after 0 (r= 0.473), 2 (r= 0.513) and 4 h post-thaw (r= 0.450). This subpopulation in fresh semen, was the only one significantly correlated with itself in frozen–thawed semen. Moreover, the percentage of spermatozoa assigned to subpopulation 4 in the fresh ejaculates was significantly correlated (P< 0.01) with the total motility (r= 0.477) and with the proportion of spermatozoa included in subpopulation 1 (r= 0.423) after 4 h of incubation post-thaw. 3.5. Kinematic parameters of spermatozoa within the different subpopulations before and after semen cryopreservation There were significant differences between fresh and frozen-thawed semen samples in the kinematic parameters defining the four sperm subpopulations (data not shown). In general, such differences indicated that, in the four subpopulations, the sperm velocity parameters (VCL, VSL and VAP) decreased after cryopreservation and also during post-thaw incubation. However, the trajectory of the sperm movement changed in a different way depending on the sperm subpopulation. In subpopulations 2 and 4, the sperm trajectories were more progressive after thawing and during post-thaw incubation than before freezing (higher LIN, STR and BCF), whereas in subpopulations 1 and 3, the sperm trajectories were less progressive immediately after thawing than before freezing, and became even more oscillatory during post-thaw incubation. The magnitude of the changes in the sperm kinematic parameters was quite similar for the four sperm subpopulations. For example, for spermatozoa assigned to subpopulation 4, mean values (and ranges) of VCL, VSL and VAP changed from 134.6 (86.1–254.0), 97.2 (60.1–201.0) and Please cite this article in press as: Mui˜ no, R., et al., Identification of sperm subpopulations with defined motility characteristics in ejaculates from Holstein bulls: Effects of cryopreservation and between-bull variation, Anim. Reprod. Sci. (2007), doi:10.1016/j.anireprosci.2007.10.007 ARTICLE IN PRESS +Model ANIREP-3464; No. of Pages13 R. Mui˜no et al. / Animal Reproduction Science xxx (2007) xxx–xxx 9 111.8 (74.1–205.2) ␮m/s, respectively, before freezing to 118.6 (86.4–196.2), 90.2 (65.0–147.0) and 96.9 (75.2–148.7) ␮m/s, respectively, after 4 h of post-thaw incubation. And mean values (and ranges) of LIN, STR, ALH and BCF changed from 73.3 (30.7–99.5)%, 87.1 (42.6–99.9)%, 3.8 (0.6–11.1) ␮m and 7.2 (2.0–17.5) Hz, respectively, before freezing to 76.9 (37.0–97.6)%, 93.1 (51.5–99.6)%, 3.3 (0.7–8.3) ␮m and 12.6 (2.1–21.0) Hz, respectively, after 4 h of post-thaw incubation. Changes of a similar magnitude were observed in the kinematic parameters defining the other three subpopulations. 3.6. Effect of individual variability on the sperm kinematic parameters defining the four sperm subpopulations There were significant differences among bulls (P< 0.05) on the sperm kinematic parameters defining the four subpopulations. For example, for spermatozoa assigned to subpopulation 4, bulls 3 and 9 showed the highest differences. Bull 3 had significantly (P< 0.05) higher VCL, VSL, VAP, LIN, WOB and significantly (P< 0.05) lower values of ALH and BCF than bull 9 [mean values (and ranges) were VCL: 133.9 (89.7–228.2) versus 127.1 (88.5–206.1) ␮m/s; VSL: 101.5 (63.0–201.0) versus 87.8 (64.0–181.0) ␮m/s; VAP: 113.9 (75.6–202.6) versus 98.2 (73.7–190.8) ␮m/s, LIN: 76.6 (36.3–99.5) versus 70.5 (35.5–95.6)%; WOB: 85.5 (46.5–99.6) versus 78.5 (44.9–99.2)%; ALH: 3.4 (0.9–10.4) versus 3.9 (0.9–9.6) and BCF: 9.2 (1.8–21.0) versus 11.0 (1.7–21.3) Hz]. Differences were also observed among the other bulls in some, but not all, of the kinematic parameters defining the sperm velocity or the trajectory of subpopulation 4. Similar individual variability was observed in the kinematic parameters defining the other 3 subpopulations. 4. Discussion The results of the present study indicated that four sperm subpopulations were distinguishable in fresh and frozen-thawed bull semen samples, as determined by the 8 kinematic parameters studied. The most interesting finding in this study was that the four sperm subpopulations were quite similarly distributed in the nine bulls, either in fresh or frozen-thawed semen, and differences among bulls were almost exclusively established by the proportion of spermatozoa assigned to the subpopulation of most active and progressive sperm. From studies in several species, it seems that the presence of three or four well-defined sperm populations is a common finding among mammalian ejaculates (Quintero-Moreno et al., 2003). To our knowledge, the existence of separate motile subpopulations in fresh or frozen-thawed bovine semen has not been previously investigated. In semen from boars (Quintero-Moreno et al., 2004; Rivera et al., 2005, 2006), rabbits (Quintero-Moreno et al., 2007) and dogs (Nu˜ nez-Mart´ ınez et al., 2006a,b), significant differences in the sperm subpopulations structure have been described between-breeds within species. And in a recent study, objective differences in the percentages of total and progressive motility, as well as in the velocity and straightness of spermatozoa, were found in semen from Belgian Blue and Holstein bulls (Hoflack et al., 2007). The authors suggested that a genetic component could be the basis for the breed differences in sperm motility, probably as a result of the world-wide long-term selection of highly fertile Holstein AI bulls (S¨ oderquist et al., 1991). Although in the present study the frequency distribution of spermatozoa within subpopulations was very consistent among bulls and ejaculates, it is likely that different subpopulations could be defined when using bulls of different breeds. Please cite this article in press as: Mui˜ no, R., et al., Identification of sperm subpopulations with defined motility characteristics in ejaculates from Holstein bulls: Effects of cryopreservation and between-bull variation, Anim. Reprod. Sci. (2007), doi:10.1016/j.anireprosci.2007.10.007 ARTICLE IN PRESS +Model ANIREP-3464; No. of Pages13 10 R. Mui˜no et al. / Animal Reproduction Science xxx (2007) xxx–xxx The cryopreservation process had significant effects on the frequency distribution of spermatozoa within subpopulations (Fig. 1). Although different mortality rates in the four sperm subpopulations may account for a change in their frequency distribution, it was obvious that the cryopreservation process modified the motility patterns of the surviving spermatozoa, some spermatozoa being assigned to a different subpopulation. A possible sequence for the progression of spermatozoa through the four subpopulations, similarly to that proposed for gazelle sperm (Abaigar et al., 2001), can be hypothesized. Spermatozoa in subpopulation 4 represent the most rapid and progressive sperm, probably the pattern movement most suitable for being part of the fertilizing population, and this was the majoritary population in fresh ejaculates. After cryopreservation and during post-thaw incubation, some of those spermatozoa might reduce their flagellar activity, probably as a consequence of sublethal cryoinjury, and they would be included into subpopulation 1. Some of the spermatozoa from subpopulation 1, constituted by relatively slow but progressive spermatozoa, might lose the ability to control the semipermeability of their membranes and thereby experience a sort of false hyperactivation (Yanagimachi, 1994), being assigned then to subpopulation 2. Finally, subpopulation 3, constituted by poorly motile non-progressive spermatozoa, could represent a late stage of cell deterioration, probably contributed to by spermatozoa from the other three subpopulations, but most importantly by those from subpopulation 2. The changes in the sperm subpopulations structure induced by cryopreservation were quite similar for the nine bulls, and differences between bulls were mainly due to subpopulation 4, either in fresh semen, just after thawing or after 2 h post-thaw. Only at the end of the incubation period, it was the subpopulation 1 which established differences among bulls. It is interesting to note that the proportion of spermatozoa included in subpopulation 4 in the fresh ejaculates was significantly correlated with that in thawed semen (at 0 and 2 h post-thaw) and with subpopulation 1 after 4 h of incubation post-thaw. However, the overall motility of the fresh ejaculates showed no correlation at all with total post-thaw motility or with any of the sperm subpopulations obtained after thawing. This indicated that the ejaculates with the highest subpopulations of rapid and progressive sperm were also the most resistant to cryopreservation and showed the best post-thaw sperm longevity. Similar results were also found in human (Davis et al., 1995) and dog ejaculates (Nu˜ nez-Mart´ ınez et al., 2006a) and it has been proposed that sperm belonging to clusters with high velocities and more progressive movement can be considered the sperm with the highest fertilizing potential (Quintero-Moreno et al., 2003; Cremades et al., 2005; Nu˜ nez-Mart´ ınez et al., 2006a). As differences among bulls were mainly evidenced by the proportion of spermatozoa included into subpopulation 4, perhaps this subpopulation could also determine differences in their in vivo fertility. However, to provide valid measurements of fertility in which a bull accounts for a substantial proportion of the total variance, insemination doses of 0.8–1.5 ×106sperm should be used, to place the results on the dose–responsive rather than on the asymptotic part of the curve (Amann, 1989; Christensen et al., 2005). Insemination doses of about 23 ×106sperm would largely compensate differences among bulls in the proportions of spermatozoa assigned to subpopulation 4. In such a situation, bull and ejaculate effects would account for less than 1% of the random variation in NRR (St˚ alhammar et al., 1994; Amann and Hammerstedt, 2002; Christensen et al., 2005). To evaluate the importance of identifying concrete motile subpopulations in the ejaculates of different bulls, perhaps a first approach should be an in vitro estimation of the quality of sperm at the site of fertilization. For example, by using a swim-up procedure (Zhang et al., 1998), differences in the recovered sperm populations after swim-up separation could reflect those Please cite this article in press as: Mui˜ no, R., et al., Identification of sperm subpopulations with defined motility characteristics in ejaculates from Holstein bulls: Effects of cryopreservation and between-bull variation, Anim. Reprod. Sci. (2007), doi:10.1016/j.anireprosci.2007.10.007 ARTICLE IN PRESS +Model ANIREP-3464; No. of Pages13 R. Mui˜no et al. / Animal Reproduction Science xxx (2007) xxx–xxx 11 among the ‘competent’ motile subpopulations. In addition, the use of IVF tests could demonstrate differences in the fertilizing capacity of bulls with different proportions of the most interesting subpopulation. Then, if the initial results were positive, a low-dose insemination trial could be carried out to try to establish a threshold number of spermatozoa in subpopulation 4 above which an optimal fertility should be expected. This information could be used to adjust the insemination doses to the minimum threshold required, especially from highly demanded bulls. In conclusion, the results of the present study indicated that four well-defined motile sperm subpopulations were present in fresh and frozen-thawed semen from Holstein bulls. The cryopreservation process significantly modified the distribution of spermatozoa within subpopulations, and these changes were consistent among bulls and ejaculates. Differences among bulls were almost exclusively established by the subpopulation of spermatozoa with the highest velocity and progressiveness; the magnitude of this subpopulation in fresh ejaculates was positively correlated with their resistance to cryopreservation. Further studies should be conducted to determine the relative importance of the different subpopulations of motile spermatozoa coexisting in a bull semen sample when it comes to predict its in vivo fertility. Acknowledgement The authors wish to thank the staff of SERIDA for valuable collaboration in this study. References Abaigar, T., Cano, M., Pickard, A.R., Holt, W.V., 2001. Use of computer-assisted sperm motility assessment and multivariate pattern analysis to characterize ejaculate quality in Mohor gazelles (Gazella dama mhorr): effects of body weight, electroejaculation technique and short-term semen storage. Reproduction 122, 265–273. Abaigar, T., Holt, W., Harrison, R., Del Barrio, G., 1999. Sperm subpopulations in boar (Sus scrofa) and gazelle (Gazella dama mhorr) semen as revealed by pattern analysis of computer-assisted motility assessments. Biol. Reprod. 60, 32–41. Amann, R.P., 1989. Can the fertility potential of a seminal sample be predicted accurately? J. 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A χ2-test procedure was applied to evaluate statistical differences in the percentages of spermatozoa assigned to the different subpopulations, and then a GLM procedure was used to determine the effects of the thawing rate and incubation time, as well as their interaction, on the relative distribution frequency of spermatozoa within subpopulations. The GLM procedure was also used to evaluate the influence of the two independent variables on the mean kinematic parameters defining the different sperm subpopulations (i.e. the cluster centers). Differences between means were analysed by Tukey’s test. All the statistical analyses were performed using the SPSS 14.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA), and differences were considered significant at P< 0.05 level. 3. Results 3.1. Experiment 1 The thawing rate had no significant effect on sperm motility as determined subjectively. At the onset of incubation, proportions of motile spermatozoa thawed at 35 ◦C for 40 s, at 50 ◦C for 15sorat70◦C for 5 s, were 64.0 ±14.5%, 59.0 ±11.0% and 61.0 ±13.3%, respectively. After 5 h of incubation, sperm motility decreased (P< 0.001) for the three treatments (7.4 ±9.1%, 17.4 ±11.7% and 6.3 ±8.8% for samples thawed at 35 ◦C for 40 s, at 50 ◦C for 15 s and at 70 ◦C for 5 s, respectively) but there was no interaction between thawing rate and incubation time. The proportions of spermatozoa with intact plasma and acrosomal membranes, for samples thawed at 35 ◦C, 50 ◦Cor70◦C, were 73.4 ±15.0%, 73.3 ±13.3% and 74.4 ±7.7%, respectively. There was no significant effect of the thawing rate on the sperm plasma and acrosomal membrane integrity. After 5 h of incubation, sperm membrane integrity declined significantly for the three thawing rates (55.5 ±19.9%, 62.1 ±9.7% and 66.7 ±11.0%, respectively, for samples thawed at 35 ◦C, 50 ◦C and 70 ◦C), but there was no significant interaction between thawing rate and incubation time. Immediately after thawing, the proportion of live spermatozoa with damaged acrosomes was lower than 1% for the three thawing rates (0.08 ±0.13%, 0.41 ±0.26% and 0.81 ±0.34%, for samples thawed at 35 ◦C, 50 ◦C and 70 ◦C, respectively), and after 5 h of incubation, it was lower than 2.5% (1.19 ±1.03%, 0.67 ±0.45% and 1.40 ±0.48%, respectively, for samples thawed at 35 ◦C, 50 ◦Cor70 ◦C). The thawing rate as well as the interaction between thawing rate and incubation time had significant (P< 0.01) effects, being 70 ◦C for 5 s the rate showing higher proportion of live spermatozoa with damaged acrosomes. 3.2. Experiment 2 3.2.1. Total sperm motility In agreement with results of experiment 1, the thawing rate had no significant effect on the total sperm motility objectively determined with a CASA system (P= 0.099). Immediately after thawing, percentages of total motile spermatozoa were 82.7 ±7.5%, 80.9 ±10.3% and 86.1 ±6.7%, for samples thawed at 35 ◦C, 50 ◦C and 70 ◦C, respectively. After 2 h of incubation at 37 ◦C, sperm motility decreased significantly (P= 0.001) for the three thawing rates (66.7 ±17.1%, 67.4 ±17.7% and 78.6 ±13.8% for samples thawed at 35 ◦C, 50 ◦C and 70 ◦C, respectively), but there was no significant interaction between thawing rate and incubation time. Please cite this article in press as: Mui˜ no, R., et al., Effect of different thawing rates on post-thaw sperm viability, kinematic parameters and motile sperm subpopulations structure of bull semen, Anim. Reprod. Sci. (2008), doi:10.1016/j.anireprosci.2007.11.028 ARTICLE IN PRESS +Model ANIREP-3497; No. of Pages15 R. Mui˜no et al. / Animal Reproduction Science xxx (2008) xxx–xxx 7 Table 1 Motility characteristics (mean ±S.D.) for the four sperm subpopulations identified in thawed bull semen samples (n= 6115) Sperm motility descriptors Sperm subpopulations 12 34 Number of spz (%) 1650 (27.0) 943 (15.4) 2098 (34.3) 1424 (23.3) VCL (␮m/s) 79.4 ±17.7 a 104.4 ±24.4 b 28.8 ±15.6 c 132.4 ±23.6 d VSL (␮m/s) 49.9 ±13.3 a 31.8 ±12.3 b 9.0 ±6.0 c 89.2 ±20.4 d VAP ( ␮m/s) 57.4 ±13.5 a 61.9 ±18.0 b 15.9 ±8.8 c 102.5 ±19.5 d LIN (%) 63.4 ±12.7 a 30.5 ±9.7 b 32.8 ±16.7 c 68.3 ±14.1 d STR (%) 86.9 ±9.3 a 52.3 ±16.7 b 56.5 ±19.7 c 87.2 ±11.3 a WOB (%) 72.8 ±11.0 a 59.7 ±12.2 b 56.5 ±14.5 c 78.0 ±10.4 d ALH (␮m) 2.98 ±0.89 a 4.56 ±1.21 b 1.49 ±0.77 c 4.28 ±1.39 d BCF (Hz) 9.15 ±3.45 a 7.28 ±2.92 b 5.07 ±2.52 c 10.33 ±3.10 d Including data from three thawing treatments and two incubation times a, b, c and d: different letters indicate significant differences between subpopulations (P< 0.05). 3.2.2. Motile sperm subpopulations Four sperm subpopulations were defined after multivariate cluster analysis of the 6115 individual motile spermatozoa. The motility characteristics of those subpopulations are shown in Table 1, and their pattern of movement can be described as follows. Subpopulation 1 represented those spermatozoa with a relatively low velocity (medium VCL and VAP) but with a high progressiveness (high LIN, STR, WOB and low ALH). This population included 27% of the total motile spermatozoa. Subpopulation 2 contained highly active but non-progressive spermatozoa, as indicated by the high values of VCL and ALH together with low values of LIN and STR, and moderate BCF. They could be considered as having “hyperactivated-like” movement. About 15% of the total motile spermatozoa were assigned to this subpopulation. Subpopulation 3 included about 34% of the total spermatozoa, and those were poorly motile and non-progressive. Those spermatozoa showed the lowest values of VCL, ALH and BCF together with low LIN and STR. Subpopulation 4, containing about 23% of the total population, represented those spermatozoa which moved most rapidly and progressively, as indicated by the highest values of VCL, VAP, LIN, STR and also the highest BCF. 3.2.3. Frequency distribution of spermatozoa within subpopulations according to the thawing method used The thawing method per se had no significant influence on the frequency distribution of spermatozoa within subpopulations, but the interaction between thawing rate and incubation time had a significant effect (P< 0.05) on the proportion of spermatozoa assigned to subpopulation 4. Immediately after thawing (Fig. 1a), semen samples thawed at 35 ◦C showed the lowest proportion of spermatozoa with “hyperactive-like” movement (subpopulation 2), and the difference with the same subpopulation in samples thawed at 50 ◦C almost achieved statistical significance (P= 0.063). After 2 h of incubation (Fig. 1b), the semen samples that were thawed at 35 ◦C showed a significant reduction (P= 0.017) of subpopulation 4, but this subpopulation did not significantly change during the incubation when the thawing was at higher rates. Please cite this article in press as: Mui˜ no, R., et al., Effect of different thawing rates on post-thaw sperm viability, kinematic parameters and motile sperm subpopulations structure of bull semen, Anim. Reprod. Sci. (2008), doi:10.1016/j.anireprosci.2007.11.028 ARTICLE IN PRESS +Model ANIREP-3497; No. of Pages15 8R. Mui˜no et al. / Animal Reproduction Science xxx (2008) xxx–xxx Fig. 1. Relative frequency distribution of motile spermatozoa within subpopulations (1: grey columns, 2: black columns, 3: white columns, 4: striped columns) in bull semen samples thawed at different rates, after 0 h (a) and 2 h (b) of incubation at 37 ◦C. Subpopulations 1–3 were not significantly influenced by the interaction between thawing rate and incubation time. 3.2.4. Influence of the thawing method and incubation time on the kinematic parameters defining the four sperm subpopulations The thawing rate had a significant effect (P< 0.05) on some of the kinematic parameters defining the four sperm subpopulations. Spermatozoa from subpopulations 1 and 2 had more straighten pathways (STR and BCF were significantly higher and WOB significantly lower) when the thawing was at 35 ◦C for 40 s than at 70 ◦C for 5 s (Tables 2 and 4). Spermatozoa from subpopulation 3 were even less active (VCL, VSL, VAP and ALH were significantly lower) when the thawing was at 35 ◦C for 40 s than when itwasat70 ◦C for 5 s (Tables 2 and 4). And spermatozoa from subpopulation 4 moved faster (VCL, VSL, VAP, ALH and BCF were significantly higher), when the thawing was at 35 ◦C than when it was at 50 ◦Cor70◦C(Tables 2–4). For each of the three thawing rates, the mean values of some kinematic parameters changed significantly (P< 0.05) during the 2 h of incubation. In semen samples thawed at 35 ◦C(Table 2), there were significant changes in the motility descriptors of the four sperm subpopulations: spermatozoa from subpopulation 1 were a little bit Please cite this article in press as: Mui˜ no, R., et al., Effect of different thawing rates on post-thaw sperm viability, kinematic parameters and motile sperm subpopulations structure of bull semen, Anim. Reprod. Sci. (2008), doi:10.1016/j.anireprosci.2007.11.028 ARTICLE IN PRESS +Model ANIREP-3497; No. of Pages15 R. Mui˜no et al. / Animal Reproduction Science xxx (2008) xxx–xxx 9 Table 2 Mean (±S.D.) motility characteristics for the four sperm subpopulations identified in bull semen samples thawed at 35 ◦C for 40 s, after 0 and 2 h of incubation at 37 ◦C Sperm subpopulations 12 34 Incubation time (h) 0 2 0 2 0 2 0 2 Number of spz (%) 271 (23.4) 351 (40.5) 155 (13.4) 92 (10.6) 394 (34.0) 315 (36.4) 339 (29.2) 108 (12.5) VCL (␮m/s) 81.8 ±17.3 76.5 ±17.8*111.3 ±25.2 93.2 ±18.3*26.8 ±14.6 28.7 ±16.1 139.9 ±25.5 126.2 ±20.8* VSL (␮m/s) 49.5 ±12.8 50.1 ±13.5 34.5 ±13.0 26.6 ±10.4*8.1 ±5.5 9.0 ±5.5 91.8 ±23.6 90.9 ±17.6 VAP ( ␮m/s) 57.2 ±13.6 55.8 ±13.5 64.1 ±19.7 53.3 ±14.6*14.3 ±7.7 16.4 ±9.5*106.9 ±22.4 100.0 ±18.1* LIN (%) 61.2 ±13.2 65.8 ±11.7*31.3 ±10.5 28.5 ±9.3 31.3 ±15.9 34.2 ±17.2*66.3 ±14.5 73.0 ±13.6* STR (%) 86.5 ±9.4 89.5 ±8.3*55.1 ±17.5 50.2 ±14.9 55.3 ±18.8 57.3 ±20.2 85.8 ±11.5 91.1 ±8.8* WOB (%) 70.7 ±12.1 73.4 ±9.7*58.0 ±13.8 57.4 ±11.4 55.2 ±14.5 58.3 ±14.9*76.9 ±11.3 79.9 ±11.4* ALH (␮m) 3.1 ±0.9 2.8 ±0.7*4.7 ±1.3 4.6 ±1.1 1.4 ±0.7 1.4 ±0.8 4.5 ±1.5 3.9 ±1.4* BCF (Hz) 9.7 ±3.4 10.1 ±3.2 8.0 ±3.0 6.8 ±2.7*5.4 ±2.5 5.2 ±2.6 10.8 ±3.1 10.8 ±2.4 *P< 0.05: significant differences within subpopulation between incubation time. Please cite this article in press as: Mui˜ no, R., et al., Effect of different thawing rates on post-thaw sperm viability, kinematic parameters and motile sperm subpopulations structure of bull semen, Anim. Reprod. Sci. (2008), doi:10.1016/j.anireprosci.2007.11.028 ARTICLE IN PRESS +Model ANIREP-3497; No. of Pages15 10 R. Mui˜no et al. / Animal Reproduction Science xxx (2008) xxx–xxx Table 3 Motility characteristics (mean ±S.D.) for the four sperm subpopulations identified in bull semen samples thawed at 50 ◦C for 15 s, after 0 and 2 h of incubation at 37 ◦C Sperm subpopulations 12 34 Incubation time (h) 0 2 0 2 0 2 0 2 Number of spz (%) 265 (22.5) 213 (27.0) 254 (21.5) 79 (10.0) 417 (35.3) 284 (36.0) 244 (20.7) 212 26.9) VCL (␮m/s) 81.2 ±18.5 77.1 ±17.2*105.1 ±24.9 102.7 ±24.2 29.3 ±15.5 27.0 ±14.2*128.2 ±19.6 130.9 ±24.9* VSL (␮m/s) 48.7 ±12.9 51.1 ±13.7 32.1 ±12.6 32.7 ±11.8 9.0 ±5.9 9.4 ±6.5 82.7 ±16.6 95.0 ±20.2* VAP ( ␮m/s) 56.9 ±13.3 57.8 ±14.0 60.3 ±16.7 64.3 ±18.1 16.1 ±8.7 15.0 ±8.6 95.4 ±15.2 105.9 ±19.1* LIN (%) 60.6 ±11.8 66.7 ±12.7*30.5 ±9.5 32.3 ±10.2 31.5 ±15.6 35.4 ±18.2*65.4 ±13.3 73.6 ±13.3* STR (%) 85.6 ±9.3 88.2 ±8.8*53.9 ±17.1 52.5 ±17.5 55.0 ±19.2 61.1 ±20.1*86.8 ±10.6 90.0 ±10.8* WOB (%) 70.8 ±11.0 75.4 ±10.1*58.2 ±12.7 63.1 ±11.9*56.2 ±14.0 56.2 ±15.0 75.1 ±10.5 81.6 ±8.9* ALH (␮m) 3.1 ±0.9 2.8 ±0.8*4.6 ±1.2 4.4 ±1.4 1.5 ±0.8 1.4 ±0.7*4.4 ±1.3 3.9 ±1.3* BCF (Hz) 8.7 ±3.2 8.8 ±3.6 7.5 ±3.1 6.9 ±3.0 5.0 ±2.4 4.7 ±2.6 10.4 ±2.9 10.6 ±3.2 *P< 0.05: significant differences within subpopulation between incubation time. Please cite this article in press as: Mui˜ no, R., et al., Effect of different thawing rates on post-thaw sperm viability, kinematic parameters and motile sperm subpopulations structure of bull semen, Anim. Reprod. Sci. (2008), doi:10.1016/j.anireprosci.2007.11.028 ARTICLE IN PRESS +Model ANIREP-3497; No. of Pages15 R. Mui˜no et al. / Animal Reproduction Science xxx (2008) xxx–xxx 11 Table 4 Motility (mean ±S.D.) characteristics for the four sperm subpopulations identified in bull semen samples thawed at 70 ◦C for 5 s, after 0 and 2 h of incubation at 37 ◦C Sperm subpopulations 12 34 Incubation time (h) 0 2 0 2 0 2 0 2 Number of spz (%) 287 (26.1) 263 (25.7) 180 (16.4) 183 (17.9) 326 (29.6) 362 (35.4) 307 (27.9) 214 (20.9) VCL (␮m/s) 80.8 ±17.9 76.9 ±16.4*104.7 ±24.3 101.4 ±23.3 30.4 ±16.4 30.5 ±16.6 134.6 ±23.4 126.0 ±21.3* VSL (␮m/s) 49.8 ±13.4 48.8 ±13.2 32.2 ±12.7 30.4 ±11.4 9.2 ±6.2 9.8 ±6.3 89.6 ±20.5 85.1 ±16.5* VAP ( ␮m/s) 58.7 ±13.6 56.4 ±13.2*63.3 ±19.8 62.2 ±16.0 16.3 ±8.7 17.2 ±9.8 105.2 ±19.7 97.6 ±15.1* LIN (%) 62.3 ±12.9 64.0 ±13.0 30.7 ±9.9 30.0 ±9.1 31.5 ±15.8 33.6 ±17.4 67.5 ±14.0 68.8 ±14.3 STR (%) 84.6 ±9.4 86.5 ±9.8*51.6 ±16.3 49.5 ±15.2 55.5 ±19.0 56.8 ±19.7 85.5 ±12.1 87.4 ±11.1 WOB (%) 73.4 ±11.4 73.8 ±10.7 60.5 ±12.2 61.7 ±10.0 55.6 ±14.5 57.2 ±14.5 78.7 ±9.8 78.2 ±9.4 ALH (␮m) 3.0 ±1.0 2.9 ±0.9*4.5 ±1.1 4.5 ±1.2 1.6 ±0.8 1.6 ±0.8 4.3 ±1.3 4.2 ±1.3 BCF (Hz) 8.4 ±3.5 9.2 ±3.5*7.0 ±2.7 6.9 ±2.7 4.9 ±2.4 5.1 ±2.6 9.7 ±3.2 9.9 ±3.1 *P< 0.05: significant differences within subpopulation between incubation time. Please cite this article in press as: Mui˜ no, R., et al., Effect of different thawing rates on post-thaw sperm viability, kinematic parameters and motile sperm subpopulations structure of bull semen, Anim. Reprod. Sci. (2008), doi:10.1016/j.anireprosci.2007.11.028 ARTICLE IN PRESS +Model ANIREP-3497; No. of Pages15 12 R. Mui˜no et al. / Animal Reproduction Science xxx (2008) xxx–xxx slower (lower VCL and ALH) but more progressive (higher LIN, STR and WOB); sperm from subpopulation 2 showed a less “hyperactive-like” movement (lower VCL, VSL, VAP and BCF); those from subpopulation 3 had higher VAP, LIN and WOB; and spermatozoa from subpopulation 4 were a little less rapid (lower VCL, VAP and ALH) but more linear (higher LIN, STR and WOB). Similar changes were observed in subpopulations 1 and 3 for semen samples thawed at 50 ◦C, however, spermatozoa from subpopulation 4 were even more rapid and more progressive after 2 h of incubation than immediately after thawing (Table 3). In semen samples thawed at 70 ◦C, spermatozoa from subpopulations 2 and 3 showed no significant changes in the characteristics of their movement; those from subpopulation 1 showed lower velocity (VCL, VAP and ALH) and higher straightness, and spermatozoa from subpopulation 4 had lower velocity (VCL, VSL and VAP) without significant changes in their trajectories (Table 4). 4. Discussion The results of the present study indicated that, in terms of total post-thaw sperm motility and integrity of plasma and acrosomal membranes, there was no difference between the three thawing rates compared. These results disagree with previous findings that thawing temperatures higher than 35 ◦C improved post-thaw sperm motility, acrosomal integrity or sperm morphology (Senger, 1980; Nur et al., 2003). In previous studies, different extenders, glycerol levels and freezing rates were used, and these factors are known to interact to influence the sperm tolerance to a thawing rate (Rodriguez et al., 1975; Robbins et al., 1976). Four sperm subpopulations were distinguishable in the frozen-thawed bull semen samples used in this experiment, as determined by the eight kinematic parameters studied. The present study confirmed our previous results (Mui˜ no et al., 2007) that described a very similar structure of four sperm subpopulations in fresh and frozen-thawed semen from Holstein bulls. It is noteworthy that the two experiments were performed in two different AI centers and not only the bulls but also the semen cryopreservation protocols were different. Studies in fresh and frozen-thawed semen of a variety of species (marmosets: Holt, 1996; gazelles: Abaigar et al., 1999, 2001; boars: Abaigar et al., 1999; Quintero-Moreno et al., 2004; Cremades et al., 2005; Rivera et al., 2005, 2006; or stallions: Quintero-Moreno et al., 2003) have identified the presence of three or four sperm subpopulations with specific patters of movement, and this has been suggested to be a widespread phenomenon among mammalian ejaculates (Quintero-Moreno et al., 2003). The four subpopulations identified in the present study are thought to represent spermatozoa in different physiological states (Abaigar et al., 1999). A possible sequence for the progression of spermatozoa through the four subpopulations, similar to that proposed for gazelle sperm (Abaigar et al., 2001), can be hypothesized. Spermatozoa in subpopulation 4 represent the most rapid and progressive sperm, probably the pattern movement most suitable for being part of the fertilizing population. During post-thaw thermal stress, some of those spermatozoa may reduce their flagellar activity, probably due to sublethal cryoinjury, although their movement is still forward, and they would be then assigned to subpopulation 1. Some spermatozoa from subpopulation 1, constituted by relatively slow but progressive spermatozoa, might lose structural integrity and the ability to control the selective permeability of their membranes, and convert to the movement pattern of subpopulation 2. Accumulation of intracellular Ca2+ above physiological concentrations is believed to cause a hyperactive-like pattern of movement in the spermatozoa (Yanagimachi, 1994). Finally, subpopulation 3, constituted by poorly motile nonprogressive spermatozoa, could represent a late stage of cell deterioration, probably contributed Please cite this article in press as: Mui˜ no, R., et al., Effect of different thawing rates on post-thaw sperm viability, kinematic parameters and motile sperm subpopulations structure of bull semen, Anim. Reprod. Sci. (2008), doi:10.1016/j.anireprosci.2007.11.028 ARTICLE IN PRESS +Model ANIREP-3497; No. of Pages15 R. Mui˜no et al. / Animal Reproduction Science xxx (2008) xxx–xxx 13 to by spermatozoa from the other three subpopulations, but most importantly by those from subpopulation 2. In the present study, when post-thaw sperm motility was determined by subjective microscopic assessment it was found to be about 25% lower than that determined by the CASA system. Such proportion fits well with the percentage of spermatozoa included into subpopulation 3, which could have been considered immotile by the subjective observer. The human eye tends to include as motile spermatozoa preferentially those that show clear movements between frames (Holt et al., 1996). Our results showed that the thawing rate had no significant effects on the mean post-thaw sperm motility or membrane integrity, but it affected to the motile sperm subpopulation structure found after post-thaw incubation. Interestingly, when the thawing was at 35 ◦C, after 2 h of incubation, the subpopulation 4 was substantially reduced, but it was not when the thawing was at 50 ◦C, or such reduction was less important when at 70 ◦C(Fig. 1). This indicated that more severe latent injury was induced to the sperm during the slow than during the rapid thawing, and that thawing at 50 ◦C was less harmful than at 70 ◦C. It seems obvious that spermatozoa from subpopulations 2 and 3 should not be expected to successfully migrate within the cow’s oviduct (Gaddum-Rosse, 1981; Olds-Clarke, 1986; Shalgi et al., 1992; Scott, 2000), however, there is not an obvious answer to whether the fertilizing ability of these samples should be expected to reside exclusively in subpopulation 4, or in both, subpopulations 1 and 4. If the fertilizing ability of the semen samples used in the present study were preferentially localized in subpopulation 4, thawing at the higher rates should be recommended. This would mean then, that only around 20% of the thawed spermatozoa present in these samples would have the capacity to progress toward the fertilization site. Alternatively, it is possible that the relatively slow but progressive spermatozoa assigned to subpopulation 1 can also be part of the ‘competent’ population selected during the sperm transport in the female genital tract. In that case, the three thawing rates would have produced similar proportions of potentially ‘competent’ spermatozoa. Clearly, the relative importance of the different subpopulations of motile spermatozoa present in a semen sample for predicting its in vivo fertility still has to be more deeply investigated. Some of the kinematic parameters defining the four subpopulations significantly varied depending on the thawing method used. Interestingly, spermatozoa included in subpopulation 4 showed a more rapid and active movement (higher VCL, VSL, VAP, ALH and BCF) when the thawing wasat35◦C than when it was at 50 ◦Corat70◦C. Such increased flagellar activity may have induced an earlier exhaustion of these cells, thereby causing the subpopulation 4 to be significantly reduced after incubation. Our results showed that after a 2-h period of in vitro incubation, the kinematic parameters defining the four sperm subpopulations significantly varied, in general to indicate that the swimming velocity of the spermatozoa had decreased. It was interesting to note one exception to this rule in samples thawed at 50 ◦C(Table 3), for which the subpopulation 4 showed a more rapid and progressive movement after incubation. This effect was probably a consequence of some individual spermatozoa switching into a different subpopulation, but it also indicated that those spermatozoa remaining in subpopulation 4 did not reduce their velocity or progressiveness during post-thaw incubation. Again, this finding suggests that thawing at 50 ◦C was less harmful than at 70 ◦Corat35◦C. In conclusion, the results of the present study confirmed that different sperm subpopulations with specific patterns of movement are present in frozen-thawed bull semen samples. As shown in fresh or frozen-thawed semen from other mammalian species, the different subpopulations Please cite this article in press as: Mui˜ no, R., et al., Effect of different thawing rates on post-thaw sperm viability, kinematic parameters and motile sperm subpopulations structure of bull semen, Anim. Reprod. Sci. (2008), doi:10.1016/j.anireprosci.2007.11.028 ARTICLE IN PRESS +Model ANIREP-3497; No. of Pages15 14 R. Mui˜no et al. / Animal Reproduction Science xxx (2008) xxx–xxx represented spermatozoa with a different functional status. The three thawing rates evaluated produced similar results in terms of total post-thaw sperm motility or plasma membrane integrity; however, the study of the different sperm subpopulations present in the thawed samples, and especially, of those subpopulation dynamics during post-thaw thermal stress, revealed discrete functional differences between the three thawing procedures. Higher proportions of spermatozoa with fast and progressive movement were observed after post-thaw incubation when thawing at the higher temperatures. Whether this subtle difference might affect to the in vivo fertility of the thawed semen is not known. Nevertheless, a detailed study of the sperm subpopulations coexisting in a semen sample might open new possibilities to help to predict its in vivo fertility as well as to improve the current cryopreservation protocols. Acknowledgements The authors wish to thank the Centro de Selecci´ on y Reproducci´ on Animal the Galicia, Xen´ etica Fontao, for generous donation of the frozen semen, and Minit¨ ub Ib´ erica for economical support. References Aamdal, J., Andersen, K., 1968. Fast thawing of semen frozen in straws. Zuchthygiene 3, 22–24. Abaigar, T., Holt, W., Harrison, R., Del Barrio, G., 1999. 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