Descubrimiento y optimización de nuevos agentes antitumorales empleando reacciones multicomponente

ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA USC Carlos Carbajales Pérez Tesis doctoral DESCUBRIMIENTO Y OPTIMIZACIÓN DE NUEVOS AGENTES ANTITUMORALES EMPLEANDO REACCIONES MULTICOMPONENTE Santiago de Compostela, 2023 Programa de doctorado en Ciencia y Tecnología Química TESIS DOCTORAL DESCUBRIMIENTO Y OPTIMIZACIÓN DE NUEVOS AGENTES ANTITUMORALES EMPLEANDO REACCIONES MULTICOMPONENTE Autor Carlos Carbajales Pérez Director: Alberto José Coelho Cotón y Eddy Sotelo Pérez Tutor/a: Alberto José Coelho Cotón PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA QUÍMICA SANTIAGO DE COMPOSTELA / LUGO RESUMEN Esta Tesis Doctoral abordó la aplicación de una estrategia multidisciplinar aplicada a la obtención de nuevos fármacos antitumorales que incluyó tres ejes fundamentales: por una parte, se estudió el diseño de nuevos fármacos de perfil antitumoral, mediante la observación y el empleo de procedimientos de diseño por ordenador basado en la estructura de la diana (Structure based Drug Design, SBDD), particularmente, el docking o bien por otras técnicas de modelado molecular (MM, o Molecular Modeling) como el modelado de receptores por homología (Homology Modeling). Por otra parte, se investigó el diseño y síntesis ad hoc de reacciones multicomponente (RMC) como herramienta de diversificación estructural para la síntesis de fármacos con perfil antitumoral. El trabajo estudió, asimismo, la evaluación farmacológica de los diversos prototipos sintetizados, el establecimiento de las relaciones estructura actividad (REA) preliminares y el análisis computacional que establece el modo de unión fármaco-diana. La Memoria se distribuyó en dos bloques bien diferenciados: 1. Bloque I: Descubrimiento de nuevos fármacos antimitóticos basado en la aplicación de una estrategia sintética basada en reacciones Ugi dirigidas, ciclaciones de los aductos intermedios y decoración final del scaffold de bencimidazol (Targeted Oriented Synthesis). 2. Bloque II: Descubrimiento de nuevos fármacos sobre el receptor A2B, empleando la reacción de Biginelli, una nueva aproximación al descubrimiento de nuevos antitumorales. En la primera parte de la Tesis (correspondiente a las publicaciones y/o capítulos 1, 2 y 3) se analizó el estado actual del descubrimiento de fármacos antimitóticos empleando reacciones multicomponente. Se investigó el diseño computacional, la síntesis y evaluación farmacológica de prototipos directamente diseñados para la inhibición de la quinesina mitótica del huso mitótico, KSP (Kinesin Spindle Protein) basados en una estructura de tipo bencimidazol, obtenidos mediante reacciones específicamente diseñadas para el sitio de unión alostérico Eg5, de la diana KSP. En la segunda parte (publicación y/o capítulo 4), se introdujo una línea de investigación basada en el diseño y síntesis de derivados antagonistas de los receptores A2B de adenosina como agentes anticancerígenos. Se identificó una nueva familia de ligandos antagonistas de A2B distintos de la xantina, estructuralmente simples, potentes y selectivos, y se confirmó su comportamiento antagónico mediante experimentos funcionales. Esto constituye el primer ejemplo de reconocimiento enantioespecífico en el receptor de adenosina A2B y abre nuevas posibilidades en el diseño de ligandos para este receptor, el cual está implicado en procesos cancerígenos, a través del papel del antagonismo de A2B en la progresión de varios tipos de cánceres. AGRADECIMIENTOS Hace ya unos años, Abel Crespo, un amiguete con el que solía quedar para tomar algo al salir de clase y que había comenzado su tesis un par de años antes, me comentó que en su grupo necesitaban gente. Él sabía de mi curiosidad y que tenía bastante tiempo libre. Era mi último año y solo me quedaban tres asignaturas para acabar la carrera de Farmacia. Así empezó mi relación con la Unidad de Química Combinatoria adscrita al Instituto de Farmacia Industrial, sólo el nombre asustaba y fascinaba al mismo tiempo. Estaba dirigido por Eddy Sotelo, acompañado de Alberto Coelho, dos investigadores del Programa Parga Pondal que habían decidido encaminar su carrera por esta parcela de la Orgánica montando su propio grupo. En aquel joven grupo, encontré el que sería mi modo de vida durante los siguientes años. El diseño, la planificación, el método y la paciencia serían mi guía para avanzar a través de los problemas que cada trabajo nos plantease. Y esto es lo más valioso que me llevo de este tiempo. Así días enteros, noches, fines de semana, de ordenador, reacciones, purificaciones, caracterización y mucho fregadero. Estas líneas van dedicadas a agradecer a todos los que me han acompañado y ayudado a llegar hasta aquí. Gracias a los incontables compañeros que han pasado por el grupo y que me sería imposible mencionar sin dejarme inmerecidamente alguno por el camino. Gracias a Abel por haberme abierto la puerta de este mundo y enseñarme a moverme entre matraces y columnas. Gracias a Aziz, a Jhonny y a Luz por ser mis auténticos maestros en la buena práctica de laboratorio, por su amistad y compañía, y sobre todo por mostrarme la belleza de la rutina, la constancia y el orden como clave de bóveda para la excelencia. Gracias a Vicente, Paula, Cris y Belén, compañeros en aquellos primeros días de laboratorios en sótanos y campanas ruidosas. Con ellos las horas de espera eran más cortas y los problemas pequeños. Gracias a los chicos que he tutelado durante la experimental, Raluka, Alessandra, Jacobo, y especialmente a Ángel, Antonio y Ana. En las horas que hemos compartido he aprendido mucho más de lo que yo haya podido enseñaros. En verdad, os tengo en mi corazón. Mi agradecimiento a todo el personal de apoyo a la investigación que colaboró en la obtención de este trabajo. Especialmente a Xosé, sobra decir que su labor es imprescindible para todo el departamento de Orgánica de Farmacia, también a Ramón Gesto, Esteban Guitián y al personal del CIQUS. Gracias a todos ellos nuestros trabajos pueden brillar. Gracias a todos los coautores que han participado en los artículos que conforman esta tesis y aquellos en los que he colaborado. Mención especial merecen Miguel Ángel, Hugo Gutiérrez de Terán, Giovanni Marzaro, Junichi Sawada y Akira Asai, por su gigante implicación y compromiso en ellos. Con ellos he vivido en primera persona que la interrelación entre áreas de conocimiento y el trabajo en equipo son el mejor camino a la buena ciencia. Finalmente, gracias a Alberto cuya energía y visión me han acompañado incesantemente, más intensamente cuando más lo necesitaba. Y a Eddy, brillante líder, que vive con pasión su trabajo y tiene como guía la cultura del esfuerzo, ad astra per aspera. A los dos os debo esta memoria y los éxitos de estos años. Infinitas gracias por vuestro apoyo constante, vuestra paciencia y empuje. Gracias por dedicarme tantas horas de trabajo. De verdad, gracias por ofrecerme esta aventura. “Las verdades que revela la ciencia superan siempre a los sueños que destruye.” Joseph E. Renan A Alba, mi mejor descubrimiento. A Bruno, nuestra mejor síntesis. ÍNDICE ______________________________________________________________________ 1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………….17 1.1. El cáncer y su tratamiento terapéutico. Breve repaso histórico y estrategias actuales……………………….……………………………..17 1.2. Fármacos antimitóticos: Introducción……………………………….22 1.2.1. Mecanismos de acción de los antimitóticos………………………..24 1.2.2 Nuevas dianas antimitóticas prometedoras: Quinasas y Quinesinas………………………………………………...25 1.2.2.1 Inhibidores de la Quinesina mitótica KSP……………………31 1.2.3. Limitaciones de los fármacos antimitóticos y de los inhibidores de KSP………………………………………………………………….31 1.3. Los receptores de adenosina y su papel en el cáncer…………………....33 1.3.1 Importancia y funciones fisiológicas de la adenosina…………...33 1.3.2 Síntesis y degradación de la adenosina…………………………..33 1.3.3 Receptores de adenosina, expresión y funciones………………...34 1.3.4 La adenosina en el cáncer y sus funciones inmunosupresoras…34 1.3.4.1 Influencia de la Adenosina en los Hallmarks del Cáncer…………………………………………………...34 1.3.4.1.1 Evasión de la supresión de señales de crecimiento…………………………………….34 1.3.4.1.2 Resistencia a la muerte celular programada.........35 1.3.4.1.3 Inducción de la angiogénesis……………………...35 1.3.4.1.4 Habilitación de la replicación ilimitada………….35 1.3.4.1.5 Capacidad para invadir tejidos circundantes y formar metástasis……...………………………......35 1.3.4.2. Roles de los receptores A2A y A2B en la inmunoterapia del cáncer………………………………………………………36 1.3.5 Antagonistas de los Receptores A2B en el Tratamiento del Cáncer…………………………………………………………37 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS…………………………………………....……39 3.METODOLOGÍA……………………………………….....................…...41 3.1. Antecedentes metodológicos y resultados previos…………..…………..41 3.1.1. Aplicación de las Reacciones Multicomponente “ad hoc”: Quimiotecas dirigidas hacia la obtención de ligandos que modulen las funciones de la diana KSP o el receptor A2B de adenosina………………………………………………….41 3.3.1.1 Síntesis orientada a la diversidad frente a síntesis orientada a la diana…………………………………………………………..41 3.1.2 Conceptos extrínsecos aplicables a las RMC: Utilización de reactivos soportados (scavengers) para eliminar exceso de isonitrilo en procesos de work up……………………..46 3.1.3 Empleo de herramientas computacionales que asistan el proceso de síntesis de fármacos inhibidores de la KSP o moduladores del receptor A2B y que aceleren la generación de quimiotecas……………………………………………………..47 3.1.4 Evaluación farmacológica de los prototipos sintetizados en los apartados anteriores…………………………………………..49 3.1.5 Evaluación farmacológica y otras metodologías para la modulación del receptor A2B………………………………......50 4.COMPENDIO DE PUBLICACIONES ………………………………….....53 4.1.Publicación 1: Multicomponent reactions in antimitotic drug discovery………………55 4.2.Publicación 2: Structure-based design of new KSP-Eg5 inhibitors assisted by a targeted multicomponent reaction……………………………………….77 4.3. Publicación 3: Multicomponent Assembly of the Kinesin Spindle Protein Inhibitor CPUYJ039 and Analogues as Antimitotic Agents…………..149 4.4.Publicación 4: Enantiospecific Recognition at the A2B Adenosine Receptor by Alkyl 2-Cyanoimino-4-substituted-6-methyl-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5carboxylates………………………………………………………………227 melanoma, el cáncer de pulmón y el cáncer renal. Por ejemplo, el trastuzumab,26 un anticuerpo monoclonal que se dirige a la proteína HER2, se utiliza ahora en combinación con otros fármacos en el tratamiento del cáncer de mama HER2-positivo. El rituximab, es también un anticuerpo monoclonal utilizado en inmunoterapia contra el cáncer. Es un anticuerpo monoclonal quimérico que se dirige al antígeno CD20, que se encuentra en la superficie de los linfocitos B. Se utiliza principalmente para el tratamiento de linfomas no Hodgkin y ha demostrado ser efectivo en combinación con otros agentes quimioterapéuticos o inmunoterapéuticos. El rituximab fue aprobado por primera vez por la FDA en 1997. Otros fármacos de inmunoterapia incluyen inhibidores de puntos de control inmunológico, como el ipilimumab27 y el pembrolizumab,28 y terapias celulares, como las células CAR-T. Estos fármacos han proporcionado nuevas opciones de tratamiento para pacientes con cánceres avanzados que antes no tenían opciones de tratamiento efectivo. Estos fármacos actúan bloqueando la interacción entre las células tumorales y las células T del sistema inmunológico, lo que permite que las células T ataquen y destruyan las células tumorales. Ambos fármacos son anticuerpos monoclonales. El ipilimumab es un anticuerpo monoclonal IgG1 y el pembrolizumab es un anticuerpo monoclonal IgG4. Los anticuerpos monoclonales son moléculas diseñadas para reconocer y unirse específicamente a proteínas diana, y se utilizan ampliamente en la terapia contra el cáncer debido a su alta selectividad y afinidad. Tanto las pequeñas moléculas como los anticuerpos monoclonales son herramientas importantes en la lucha contra el cáncer y tienen ventajas y desventajas. Las pequeñas moléculas, como los inhibidores de quinasas, tienen la capacidad de penetrar en las células y dirigirse a objetivos intracelulares específicos, lo que los hace útiles para el tratamiento de tumores con mutaciones genéticas específicas. También pueden ser más fáciles de administrar y producir en grandes cantidades que los anticuerpos monoclonales. Por otro lado, los anticuerpos monoclonales tienen una mayor especificidad y afinidad por los objetivos extracelulares, como proteínas de superficie celular, y pueden activar respuestas inmunitarias específicas contra las células tumorales. Además, los anticuerpos monoclonales se han utilizado con éxito en la inmunoterapia contra el cáncer, un enfoque terapéutico que ha dado lugar a respuestas duraderas en algunos pacientes con cáncer. En resumen, ambas herramientas tienen sus propias ventajas y limitaciones, y su elección dependerá del tipo de cáncer, el objetivo terapéutico y las características del paciente. • Radioterapia: la radioterapia consiste en la aplicación de radiación ionizante para destruir las células tumorales. Se utiliza principalmente en combinación con otros tratamientos como la cirugía y la quimioterapia. Cabe mencionar que el tratamiento del cáncer es cada vez más personalizado y depende del tipo de tumor, de las características moleculares del mismo y de la salud general del paciente. Además, se están desarrollando nuevas estrategias terapéuticas, como la terapia génica, la nanoterapia y la epigenética, que tienen el potencial de mejorar el tratamiento del cáncer en el futuro. 21 1.2 Fármacos antimitóticos: Introducción La mitosis es un proceso fundamental en el ciclo celular de los organismos eucariotas. Se trata de la división celular en la que se separan los cromosomas replicados y se distribuyen de manera equitativa en dos células hijas (Figura 1.2a). Durante la mitosis, el material genético de la célula madre se duplica y se distribuye en dos juegos idénticos en las células hijas. Este proceso es esencial para el crecimiento y la reparación de los tejidos en organismos multicelulares. En el contexto del cáncer, la mitosis juega un papel importante ya que el crecimiento celular descontrolado y la proliferación excesiva de células cancerosas es el resultado de una regulación defectuosa de la división celular. Las células cancerosas pueden adquirir mutaciones genéticas que alteran los procesos normales de la mitosis y permiten una proliferación celular descontrolada. Por ejemplo, las células cancerosas pueden dividirse más rápidamente de lo normal, lo que conduce a una rápida expansión del tumor. Además, los cambios en los genes que regulan la división celular pueden hacer que las células cancerosas se dividan incluso en condiciones en las que normalmente no deberían hacerlo, como la ausencia de estímulos de crecimiento externos. Figura 1.2a: Esquema general del ciclo celular y mitosis.29 La mitosis consta de varias etapas: profase, prometafase, metafase, anafase y telofase, seguidas de la citocinesis o división del citoplasma. En el ciclo celular normal, la mitosis es una etapa crítica que asegura que las células hijas tengan el mismo número de cromosomas que la célula madre y que la información genética se distribuya de manera uniforme. Sin embargo, en el cáncer, la regulación normal del ciclo celular se pierde y las células pueden proliferar de manera descontrolada. Las células cancerosas a menudo tienen alteraciones en los mecanismos de control del ciclo celular, lo que les permite dividirse incluso cuando no debería ocurrir. Por ejemplo, las células cancerosas pueden ignorar señales de detención del ciclo celular y seguir dividiéndose sin control. La mitosis es, por lo tanto, una etapa crítica para el crecimiento y la propagación de las células cancerosas. Muchos fármacos anticancerígenos se dirigen precisamente a las células en mitosis para prevenir la proliferación de las células cancerosas. Además, los 22 estudios de la mitosis y sus mecanismos de regulación son importantes para comprender los defectos en el ciclo celular que conducen al cáncer y para desarrollar nuevas terapias para tratar esta enfermedad. Existen dos tipos de paradas mitóticas:30-34 • Parada mitótica normal: Ocurre durante la metafase de la mitosis y es un proceso normal que se produce para garantizar que las cromátidas se unan correctamente a los microtúbulos antes de que la célula se divida. Si la célula detecta algún error en la unión de los microtúbulos a las cromátidas, se detendrá en la metafase y se activarán los mecanismos de corrección necesarios para solucionar el problema antes de continuar con la división celular. • Parada mitótica anormal: Se produce cuando la célula detecta algún tipo de estrés celular que impide que la división celular progrese. Este tipo de parada mitótica se produce, por ejemplo, cuando se introduce un fármaco que impide la formación de los microtúbulos necesarios para la correcta separación de los cromosomas durante la división celular. En este caso, la célula se detiene en la metafase de la mitosis y puede sufrir daños irreparables que lleven a la apoptosis (muerte celular programada) o a la aparición de mutaciones genéticas que puedan dar lugar a la formación de células cancerosas. En resumen, la parada mitótica normal es un mecanismo importante para asegurar la correcta segregación de los cromosomas durante la mitosis, mientras que la parada mitótica anormal puede tener consecuencias graves para la célula, pudiendo llevar a la muerte celular o a la aparición de células cancerosas. Los fármacos antimitóticos son aquellos que interfieren con la división celular y se utilizan principalmente en el tratamiento del cáncer y otras enfermedades que implican un crecimiento celular descontrolado. Estos fármacos se han utilizado con éxito durante décadas en la quimioterapia para reducir el tamaño de los tumores y prolongar la supervivencia de los pacientes. Tal y como se ha mencionado previamente, existen varios fármacos antimitóticos llamados “clásicos”, aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA, por sus siglas en inglés) de EE. UU. que se utilizan en la práctica clínica (Figura 1.2b). Algunos de ellos son: • Paclitaxel: Este fármaco se utiliza en el tratamiento del cáncer de mama, de ovario, de pulmón y otros tipos de cáncer. Actúa inhibiendo la descomposición de los microtúbulos, una estructura que ayuda a las células a dividirse, lo que resulta en la muerte de las células cancerosas. • Docetaxel: Este fármaco también se utiliza en el tratamiento del cáncer de mama, de próstata y de pulmón, entre otros. Actúa de manera similar al paclitaxel, inhibiendo la descomposición de los microtúbulos y deteniendo la división celular. • Vinblastina: Este fármaco se utiliza en el tratamiento del linfoma de Hodgkin y otros tipos de cáncer. Actúa impidiendo la formación de los microtúbulos y, por lo tanto, detiene la división celular. • Vincristina: Este fármaco se utiliza en el tratamiento del cáncer de mama, de pulmón, de ovario y otros tipos de cáncer. Actúa de manera similar a la vinblastina, inhibiendo la formación de los microtúbulos. • Eribulina: Este fármaco se utiliza en el tratamiento del cáncer de mama metastásico. Actúa inhibiendo la formación de los microtúbulos y, por lo tanto, detiene la división celular.35 23 Figura 1.2b: Principales antimitóticos clásicos en uso. Estos fármacos antimitóticos se administran típicamente por vía intravenosa en el hospital o en un centro médico especializado, bajo la supervisión de un médico y un equipo de enfermería experimentado. Es importante tener en cuenta que estos fármacos pueden tener efectos secundarios significativos y que su uso debe ser siempre supervisado cuidadosamente por un profesional de la salud capacitado. 1.2.1. Mecanismos de acción de los antimitóticos Los antimitóticos pueden clasificarse en dos grupos: los que estabilizan los microtúbulos y los que los desestabilizan. Los antimitóticos que desestabilizan los microtúbulos son los más utilizados en la clínica, ya que inducen la detención de la célula en la fase mitótica y la apoptosis. Un ejemplo de antimitótico que actúa sobre la dinámica de los microtúbulos es la vinblastina, un alcaloide de la pervinca de Madagascar que se utiliza en el tratamiento de varios tipos de cáncer, incluyendo el linfoma y el cáncer de mama. La vinblastina inhibe la formación del huso mitótico al unirse a los microtúbulos y provocar su despolimerización. Otros ejemplos de antimitóticos que actúan sobre los microtúbulos son la vincristina, la paclitaxel y la docetaxel. Por lo tanto, el taxol (paclitaxel) y los alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, entre otros) son dos tipos de fármacos antimitóticos que se utilizan en el tratamiento del cáncer, pero actúan de manera diferente sobre el proceso de división celular. El Taxol actúa estabilizando los microtúbulos durante la fase de mitosis de la célula, lo que interfiere con la capacidad de la célula para completar la división celular. El taxol se une a los microtúbulos y previene su despolimerización, lo que impide la separación de los cromosomas durante la mitosis. Esto provoca la detención del ciclo y la muerte celular. Los alcaloides de la vinca, por el contrario, actúan bloqueando la formación de los microtúbulos en la fase de mitosis. Los alcaloides de la vinca se unen a la proteína tubulina, que es un componente importante de los microtúbulos, lo que impide la formación de los microtúbulos necesarios para la segregación adecuada de los cromosomas durante la mitosis. Esto provoca la detención del ciclo y la muerte celular. En resumen, mientras que el taxol actúa estabilizando los microtúbulos y previniendo su despolimerización durante la mitosis, los alcaloides de la vinca actúan bloqueando la formación de los microtúbulos necesarios para la correcta segregación de 24 los cromosomas. Estas diferencias en el mecanismo de acción pueden tener implicaciones importantes en la selección y uso clínico de estos fármacos antimitóticos en el tratamiento del cáncer. En cuanto a las perspectivas de futuro de las terapias basadas en fármacos antimitóticos, hay varias líneas de investigación y desarrollo en curso que podrían mejorar su eficacia y reducir sus efectos secundarios. Estos incluyen: • Nuevos fármacos antimitóticos: Se están desarrollando nuevos fármacos que tienen como objetivo mejorar la especificidad y selectividad de los fármacos antimitóticos existentes, lo que significa que pueden apuntar a las células cancerosas de manera más efectiva y reducir los efectos secundarios en las células sanas. • Terapias combinadas: Se están estudiando nuevas combinaciones de fármacos antimitóticos con otros tipos de terapias, como la inmunoterapia, para mejorar la eficacia del tratamiento. • Terapias personalizadas: Con los avances en la genómica y la biología molecular, se están desarrollando terapias personalizadas que se basan en las características moleculares y genéticas de un tumor específico. Esto permitiría la selección de fármacos antimitóticos que sean más efectivos contra las células cancerosas de un paciente en particular. Por lo tanto, las terapias basadas en fármacos antimitóticos continuarán siendo una parte importante del arsenal terapéutico contra el cáncer y otras enfermedades relacionadas con el crecimiento celular descontrolado. Se están realizando avances significativos en el desarrollo de nuevos fármacos y terapias combinadas, así como en la personalización de los tratamientos para mejorar su eficacia y reducir sus efectos secundarios. 1.2.2 Nuevas dianas antimitóticas prometedoras: Quinasas y Quinesinas Las quinasas mitóticas son proteínas enzimáticas que regulan la progresión del ciclo celular y la mitosis, activando y desactivando otras proteínas a través de la fosforilación. Por otro lado, las quinesinas (también llamadas cinesinas) mitóticas son proteínas motoras que se encargan del movimiento y la distribución de los cromosomas durante la mitosis. Ambas tienen funciones importantes en la mitosis, pero su actividad y función son distintas. Las quinasas mitóticas son importantes para la regulación del ciclo celular y la entrada en mitosis, mientras que las quinesinas mitóticas son responsables del movimiento y la distribución de los cromosomas en la célula durante la mitosis. En general, las quinasas mitóticas actúan en la regulación de la actividad de proteínas motoras como las quinesinas mitóticas. En cuanto a las dianas antimitóticas más prometedoras, una de las principales dianas terapéuticas en el campo de la oncología es la proteína Aurora quinasa. Esta enzima regula la segregación de los cromosomas durante la mitosis y su sobreexpresión se ha asociado con muchos tipos de cáncer. Se han desarrollado varios fármacos que inhiben la actividad de Aurora quinasa, que han demostrado actividad antitumoral en ensayos clínicos. Además, se está investigando el uso combinado de inhibidores de Aurora quinasa con otros agentes antitumorales para mejorar la eficacia del tratamiento. Otra diana antimitótica prometedora es la proteína PLK (Polo-Like Kinase), que es una quinasa que regula varios procesos durante la mitosis, incluyendo la separación de los cromosomas. Varios inhibidores de PLK se encuentran en diferentes fases de desarrollo clínico y algunos de ellos han demostrado actividad antitumoral en ensayos clínicos. 25 Se conocen alrededor de 10 quinesinas mitóticas que participan en diferentes procesos durante la mitosis. Algunas de las quinesinas mitóticas36-38 importantes incluyen: 1. Quinesina-5 (Eg5): involucrada en la formación del huso mitótico y separación de los cromosomas. 2. Quinesina-12 (Kif15): participa en la estabilización de los microtúbulos y en la segregación de los cromosomas. 3. Quinesina-13 (MCAK): importante en la dinámica de los microtúbulos y en la separación de los cromosomas durante la mitosis. 4. Quinesina-14 (HSET): contribuye en la organización del huso mitótico y en la separación de los cromosomas. 5. Quinesina-10 (CENP-E): involucrada en la alineación de los cromosomas en la placa metafásica. 6. Kif14: también conocida como CHO1/MKLP1, participa en la citocinesis y en la regulación de la dinámica de microtúbulos durante la mitosis. 7. Kif23: también conocida como MKLP2, juega un papel importante en la citocinesis y la estabilidad del huso mitótico. 8. Kif18A: regula la dinámica de los microtúbulos y la separación de cromosomas durante la mitosis. ¿Cómo se relacionan las familas Aurora y Polo con las quinesinas mitóticas? Las quinasas Aurora y Polo, junto con las quinesinas, son proteínas esenciales que regulan la progresión de la mitosis. La Aurora B y Polo son quinasas mitóticas que regulan la segregación de los cromosomas y la citocinesis, mientras que las quinesinas, como la quinesina-5 (Eg5), son motores que se encargan del movimiento de los microtúbulos durante la mitosis. La quinasa Aurora B es una proteína central en la citocinesis y la segregación de los cromosomas. Esta quinasa es necesaria para la correcta formación del huso mitótico y para la separación de los cromosomas durante la anafase. Por su parte, la quinasa Polo se encarga de regular la actividad de la Aurora B y otros componentes del huso mitótico. La quinesina Eg5 también es importante en la coordinación de la mitosis, ya que se encarga del movimiento de los microtúbulos y su organización en el huso mitótico. La actividad de la quinesina Eg5 está regulada por las quinasas Aurora B y Polo, que controlan su localización y actividad (Figura 1.2.2a).39-42 En conjunto, estas proteínas regulan de forma coordinada la progresión de la mitosis, asegurando la correcta segregación de los cromosomas y la formación de dos células hijas viables. Figura 1.2.2a: “Venenos mitóticos” y sus dianas.42 26 Existen cinco tipos de PLK (Polo-like kinase)43-44 conocidos: PLK1, PLK2, PLK3, PLK4 y PLK5. Dentro de la familia Polo (PLK), el subtipo más importante es la proteína Polo-like kinase 1 (PLK1), ya que es la más estudiada y se ha demostrado que desempeña un papel clave en la regulación de la mitosis. Las proteínas de la familia PLK, incluyendo a PLK1, interactúan con otras proteínas de la célula para controlar la progresión de la mitosis y asegurar que las células se dividan correctamente. Por ejemplo, PLK1 interacciona con proteínas como Aurora A, Aurora B y la quinesina mitótica Eg5 para coordinar la formación y la separación de los husos mitóticos durante la mitosis. Además, PLK1 tiene múltiples funciones en la mitosis, como la regulación del ensamblaje del huso mitótico, la promoción de la entrada en anafase y la inhibición de la citocinesis prematura. Por tanto, PLK1 es esencial para la correcta progresión de la mitosis y la división celular. De entre estas isoformas de PLK, la más relevante en la mitosis es PLK1, ya que desempeña una función crucial en la regulación de la progresión de la mitosis y la citocinesis. A continuación, se podría decir que PLK2 es la siguiente en relevancia, aunque su función en la mitosis no está completamente definida. PLK3 y PLK4 parecen estar más involucradas en la regulación del ciclo celular en general y en la respuesta celular al estrés. A continuación, podemos clasificar los diferentes inhibidores publicados (Figura 1.2.2b) para cada una de estas dianas, ordenados por importancia: • Inhibidores de PLK-1:45-47 Volasertib: ha mostrado actividad antitumoral significativa en varios estudios preclínicos y clínicos, y se encuentra en ensayos clínicos avanzados para el tratamiento del cáncer. BI 2536: es uno de los inhibidores más potentes y selectivos de PLK-1 descubiertos hasta la fecha y ha demostrado una actividad antitumoral significativa en ensayos clínicos. GSK461364: también es un inhibidor altamente selectivo de PLK-1 que ha mostrado actividad antitumoral en ensayos preclínicos y clínicos. • Inhibidores de AURKA:48-49 Alisertib (MLN8237): ha mostrado actividad antitumoral en varios tipos de cáncer y actualmente se encuentra en ensayos clínicos avanzados para el tratamiento del cáncer. Danusertib (PHA-739358): también es un inhibidor potente y selectivo de AURKA que ha demostrado actividad antitumoral en ensayos clínicos. Barasertib (AZD1152): se encuentra en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer y ha mostrado una actividad antitumoral significativa en ensayos preclínicos y clínicos. • Inhibidores de AURKB: ZM447439: es uno de los inhibidores más potentes y selectivos de AURKB descubiertos hasta la fecha y ha mostrado actividad antitumoral en ensayos preclínicos y clínicos. Barasertib (AZD1152): también es un inhibidor potente y selectivo de AURKB que se encuentra en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer. GSK1070916: ha demostrado actividad antitumoral en ensayos preclínicos y clínicos y se encuentra en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer. • Inhibidores de CENP-E:50-51 GSK923295: es un inhibidor potente y selectivo de CENP-E que ha mostrado actividad antitumoral en ensayos preclínicos y clínicos. GSK923295A: es un análogo de GSK923295 que ha demostrado una mayor potencia y selectividad contra CENP-E en ensayos preclínicos. PF-2771: es otro inhibidor potente y selectivo de CENP-E que ha mostrado actividad antitumoral en ensayos preclínicos. 27 Figura 1.2.2b: Fármacos inhibidores de quinasas mitóticas que han demostrado actividad inhibidora de AUK en estudios preclínicos y ensayos clínicos, y algunos de ellos han sido evaluados en varias indicaciones de cáncer. Por otra parte, hay varios fármacos antimitóticos en fase de estudio clínico en la actualidad (Figura 1.2.2c). Algunos de ellos son: • Tanespimicina: Es un inhibidor de la proteína Hsp90, que se encuentra en varias vías de señalización celular implicadas en la división celular. Está siendo evaluado en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer de pulmón, de mama y otros tipos de cáncer. • Plinabulina: Es un análogo sintético de la halichondrina B, que se une a los microtúbulos y los estabiliza, evitando su descomposición. Se está evaluando en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer de pulmón, de mama y otros tipos de cáncer. • Ensartinib: Es un inhibidor de la proteína cinasa ALK (anaplastic lymphoma kinase), que se encuentra en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón. Además de inhibir la señalización de ALK, también se ha demostrado que ensartinib interfiere con la división celular. • Adavosertib: Es un inhibidor de molécula pequeña de la tirosina quinasa WEE1 con potencial actividad sensibilizante antineoplásica. Está siendo desarrollado por AstraZeneca. Se está investigando como tratamiento para el cáncer de páncreas con un ensayo de fase 1. Es importante tener en cuenta que estos fármacos antimitóticos en estudio aún no han sido aprobados para su uso en la práctica clínica y se encuentran en diferentes etapas de desarrollo clínico. Además, su eficacia y seguridad aún deben ser evaluadas y confirmadas a través de ensayos clínicos rigurosos antes de su aprobación por las autoridades reguladoras. 28 Figura 1.2.2c: Fármacos antimitóticos en fase de estudio clínico en la actualidad. 1.2.2.1 Inhibidores de la Quinesina mitótica KSP Los inhibidores de la quinasa mitótica del huso (KSP, por sus siglas en inglés, Kinesin Spindle Protein) son una clase de fármacos antimitóticos que actúan al interferir con la función de la proteína quinesina mitótica del huso (Figura 1.2.2.1a). Esta proteína es esencial para la correcta segregación de los cromosomas durante la mitosis y su inhibición puede provocar la muerte celular. Figura 1.2.2.1a: Representación del huso mitótico y las moléculas Eg5 tetraméricas que cruzan los microtúbulos del huso.52 Modificado de ref. 52. Los inhibidores de la KSP son conocidos por su capacidad para bloquear la división celular en la mitosis, lo que resulta en la acumulación de células en mitosis y finalmente en la muerte celular.53 El mecanismo exacto por el cual los inhibidores de la KSP inducen la muerte celular no se comprende completamente, pero se han propuesto varias hipótesis. Una de ellas sugiere que la inhibición de la KSP conduce a la activación de la proteína quinasa p38 MAPK, lo que a su vez activa la proteína quinasa c-Jun Nterminal (JNK) y la caspasa-3, una proteasa responsable de la apoptosis. Además, se ha sugerido que la inhibición de la KSP puede aumentar la actividad de la proteína quinasa B (Akt) y la proteína quinasa C (PKC), lo que también puede desencadenar la apoptosis. Otra hipótesis es que la inhibición de la KSP causa la formación anormal de husos mitóticos y la acumulación de células en mitosis prolongada, lo que finalmente desencadena la muerte celular por apoptosis o necrosis. También se ha demostrado que la inhibición de la KSP puede afectar la segregación de los cromosomas y la formación del huso mitótico, lo que contribuye a la muerte celular. En resumen, aunque no se conoce completamente el mecanismo exacto de muerte celular inducido por los inhibidores de la KSP, se han propuesto varias hipótesis que implican la activación de vías de señalización de apoptosis, la formación anormal del huso mitótico y la segregación de los cromosomas. 29 En 2022, una excelente revisión de Shanin54 recopila los principales logros de los inhibidores de KSP y su recorrido en ensayos clínicos. Algunos ejemplos de estos inhibidores de KSP (Figura 1.2.2.1b) incluyen: • Ispinesib: Ispinesib es un inhibidor selectivo de la quinesina KSP que ha sido evaluado en ensayos clínicos para el tratamiento de diferentes tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón de células no pequeñas y el cáncer de mama metastásico. SB-743921:55 Es otro inhibidor selectivo de KSP que se ha evaluado en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer de mama metastásico y otros tipos de cáncer. Dos ensayos clínicos Fase I/II completados Ambos completados. Colangiocarcinoma, tumores sólidos y linfoma. • Filanesib ARRY-520:56 El Filanesib es un inhibidor de la quinesina KSP que ha sido investigado en ensayos clínicos para el tratamiento del mieloma múltiple recurrente o refractario. Ha demostrado actividad antitumoral y se ha estudiado tanto en monoterapia como en combinación con otros agentes terapéuticos. Actualmente, 8 ensayos clínicos Fase I/II completada. 1 activo y 7 completados. Leucemia mieloide avanzada, mieloma y tumor sólido avanzado • MK-0731 (Epidasib): El Epidasib es un inhibidor oral de la quinesina KSP que ha sido estudiado en ensayos clínicos en el tratamiento de tumores sólidos avanzados, incluyendo el cáncer de mama, el cáncer de ovario y el cáncer de próstata resistente a la castración. Siete ensayos clínicos, de ellos seis completados y uno terminado. Fase I completada con respuesta estable de la enfermedad en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas, tumores sólidos, cáncer de ovario, cáncer gástrico, cáncer de próstata y leucemia aguda. • ARQ-751: Es un inhibidor selectivo de la quinesina KSP y ha mostrado actividad antitumoral en estudios preclínicos. Se ha evaluado en ensayos clínicos en pacientes con tumores sólidos avanzados, incluyendo cáncer de ovario, cáncer de mama y tumores neuroendocrinos. Un estudio clínico detenido después de la fase I. Neoplasias malignas hematológicas y tumores sólidos metastásicos • AZD4877: Es un inhibidor de KSP que ha sido estudiado en ensayos clínicos en pacientes con tumores sólidos avanzados. Ha mostrado actividad antitumoral en estudios preclínicos y se ha evaluado en combinación con otros fármacos en ensayos clínicos. • EMD534085: Es otro inhibidor de la quinesina KSP que ha sido evaluado en ensayos clínicos en pacientes con tumores sólidos avanzados. Se ha investigado tanto en monoterapia como en combinación con otros agentes terapéuticos. Un estudio clínico Tumores sólidos refractarios, linfoma de Hodgkin o linfoma no Hodgkin. Los inhibidores de KSP han pasado por diferentes etapas de desarrollo clínico y se espera que en el futuro se puedan utilizar en el tratamiento de varios tipos de cáncer. 30 emocionante avance en la búsqueda de tratamientos más efectivos y personalizados para los pacientes con cáncer. 1.3.5 Antagonistas de los Receptores A2B en el Tratamiento del Cáncer Como ya se ha comentado anteriormente, en la búsqueda constante de enfoques terapéuticos innovadores para combatir el cáncer, los antagonistas de los receptores A2B han emergido como una clase de fármacos polivalentes que ofrecen nuevas perspectivas en la lucha contra esta enfermedad. Estos compuestos representan una prometedora estrategia que no solo se enfoca en revertir la inmunosupresión en el microambiente tumoral, sino que también aborda directamente el crecimiento y la invasión de las células tumorales, lo que los convierte en candidatos excepcionales para el tratamiento oncológico del futuro. Los receptores A2B, pertenecientes a la familia de los receptores de adenosina, desempeñan un papel crítico en esta inmunosupresión. La adenosina, liberada en grandes cantidades en el microambiente tumoral, se une a estos receptores, lo que inhibe la actividad de las células inmunitarias, especialmente las células T. Esto permite que las células tumorales evadan la detección y el ataque del sistema inmunológico, lo que contribuye al crecimiento y la propagación del cáncer. Los antagonistas de los receptores A2B representan una herramienta poderosa en la lucha contra esta inmunosupresión. Al bloquear selectivamente estos receptores, se pueden revertir los efectos inhibidores de la adenosina en las células inmunitarias, restaurando así su capacidad para reconocer y destruir las células tumorales. Esta acción por sí sola podría mejorar significativamente la eficacia de la inmunoterapia, una estrategia prometedora que ha demostrado resultados impresionantes en el tratamiento de algunos tipos de cáncer. Pero la versatilidad de los antagonistas de los receptores A2B no termina ahí. Además de su impacto en la respuesta inmunitaria, se ha descubierto que estos compuestos tienen la capacidad de atacar directamente a las células cancerosas. Los receptores A2B se expresan no solo en las células inmunitarias, sino también en las propias células tumorales. La activación de estos receptores en las células cancerosas desencadena una serie de señales pro-tumorales que, como ya se ha explicado, promueven el crecimiento y la invasión del cáncer. Al bloquear los receptores A2B en las células tumorales, se puede inhibir esta cascada de eventos y frenar el desarrollo del cáncer en su raíz. En resumen, los antagonistas de los receptores A2B representan una estrategia terapéutica versátil y prometedora en la lucha contra el cáncer. Su capacidad para revertir la inmunosupresión, inhibir directamente el crecimiento tumoral y mejorar la eficacia de la inmunoterapia los convierte en candidatos excepcionales para el tratamiento del cáncer en el futuro. A medida que se avanza en la investigación y el desarrollo de nuevas terapias, la modulación de los receptores A2B se presenta como una herramienta invaluable en el arsenal contra esta enfermedad implacable. Por estos motivos, el desarrollo de antagonistas para los receptores A2B ha avanzado mucho en los últimos años. El desarrollo temprano de antagonistas A2B estuvo influenciado por derivados naturales como la cafeína. En la adenosina, agonista no selectivo, el núcleo de adenina es la parte que se une al receptor y la ribosa es el residuo que lo activa (Figura 1.3.5). Las adeninas sin ribosa generalmente son antagonistas de receptores de adenosina, y los derivados de alquilxantina son ejemplos prototípicos.97-99La cafeína y la teofilina, alcaloides naturales, actúan como antagonistas de receptores de adenosina débiles y no selectivos. Se ha investigado en profundidad la relación entre la estructura y actividad de los derivados de xantina. El CGS15943 fue el primer antagonista sintético de AR descubierto,100 37 destacando por su estructura de triazolo[1,5-c]pirimidina y su alta afinidad por los subtipos de AR. A pesar de lograr derivados con buena afinidad para A2BAR, las propiedades fisicoquímicas derivadas del esqueleto de xantina y su complicada síntesis, presentaron desafíos.99 Por ello, en investigaciones recientes se han centrado en el desarrollo de antagonistas A2B no xantínicos, en particular ligandos basados en pirimidina que combinan novedad estructural, alta afinidad, selectividad y factibilidad sintética.101-106 El grupo del Profesor Sotelo ha contribuido de forma importante al desarrollo de antagonistas selectivos del receptor A2B (Figura 1.3.5, compuestos 4,9–15). Empleando estrategias preparativas basadas en la reacción de Biginelli, el grupo descubrió un nuevo farmacóforo que ha sido refinado y optimizado los perfiles farmacodinámicos y farmacocinéticos de diferentes familias de compuestos y proponiendo varios candidatos a fármacos.101-106 Figura 1.3.5. Estructura y datos de afinidad de antagonistas A2B relevantes comparados con la Adenosina. O 2 N 3 4 5N7 8 N 9 N 1 6 O 2) Cafeína: Ki > 10000 nΜ H N N N 3 O N 1O 3) Teofilina: Ki > 10000 nΜ N N N N Cl NH2 O 4) CGS15943 Ki = 32.4 nM OH HO HO O N9 8 N 7 5 6 NH2 N 1 2N 3 4 1) Adenosina: Ki > 10000 nΜ N NN N O Pr H S N O O N X O 5) X = Br, PSB-1901: Ki = 0.083 nM 6) X = Cl, PSB-603: Ki = 0.53 nM H N NN N O Pr Pr O 7) CVT-7124 Ki = 6.00 nM N N CF3 H N NN H 8) OSIP339391 Ki = 0.50 nM N O N Ph Ph NHN H O N NN 9) Ki = 1.40 nM N Ph Cl O Ph N N N H N NN O 10) Ki = 17.00 nM N N H 11) X = N, ISAM-148 Ki = 55.6 nM 12) X = CH Ki = 85.6 nM X N O O O N N H 13) R7 = R8=H, ISAM-140 Ki = 3.49 nM 14) R7 = Cl, R8 = H Ki = 44.3 nM 15) R7 = H, R8 = Cl, ISAM-161 Ki = 5.03 nM N O O O R8 R7 38 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ______________________________________________________________________ La hipótesis inicial planteada en este trabajo partió de la idea de un diseño de procedimientos sintéticos basados en la aplicación de reacciones multicomponente dirigidas, especialmente diseñadas para la interacción con sitios de unión específicos de dianas tumorales, a partir de un conocimiento de su estructura. Esta estrategia se apoyaría en la aplicación de herramientas computacionales que utilizan la información estructural de las dianas en cuestión y que “guiarían” la síntesis de moléculas. Estas herramientas utilizarían y analizarían la información estructural disponible, bien a través de estructuras 3D cristalográficas (disponibles en la base de datos Protein Data Bank), como en el caso del docking, o bien a través de la creación de modelos de receptor elaborados a partir de la técnica computacional llamada modelado por homología (homology modeling). El ensamblaje multicomponente y, en general, el diseño de procesos sintéticos en pocos pasos de síntesis aceleraría la obtención de ligandos afines a las dianas en cuestión. Teniendo en consideración la hipótesis principal descrita en el párrafo anterior, así como la experiencia en la materia y antecedentes del grupo de investigación en el cual inicié este trabajo experimental, el objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue la obtención de nuevos agentes antitumorales, mediante la aplicación de un abordaje multidisciplinar dirigido a la interacción con sitios de unión específicos de dos dianas implicadas en procesos tumorales: - La quinesina del huso mitótico KSP (Kinesin Spindle Protein) y - El receptor de A2B de adenosina Este abordaje multidisciplinar desarrollado está basado en tres ejes: bioinformática, síntesis multicomponente dirigida y evaluación farmacológica. Se pretendió la obtención rápida y eficiente de nuevos prototipos con perfil antitumoral, adaptados a las dianas antes mencionadas, para la obtención de nuevas moléculas activas capaces de modular estas dianas específicas tumorales que sirvan de base para nuevos desarrollos. Los objetivos específicos de esta Tesis están contenidos en dos bloques claramente diferenciados (KSP y el receptor de A2B de adenosina) y cuatro capítulos, en los que se pueden distinguir los siguientes objetivos generales: 1. Realizar un repaso bibliográfico sobre el estado del arte en materia de antimitóticos obtenidos mediante reacciones multicomponente y los posibles nichos de intervención y mejora de los fármacos actualmente disponibles que actúan mediante la intervención en procesos mitóticos. Esta temática se aborda en el capítulo I de la discusión de la memoria. 2. El diseño y síntesis dirigida (Targeted Oriented Synthesis) hacia la quinesina KSP, de una quimioteca de compuestos derivados del núcleo de bencimidazol, apropiadamente decorado, a través de reacciones multicomponente y estrategias de ciclación y decoración adecuadas de los 39 aductos generados por la reacción multicomponente. La filosofía inicial del proyecto contempló el empleo de pocos pasos de síntesis para acceder a los productos finales. Esta temática se aborda en los capítulos II y III de la discusión de la memoria. 3. La evaluación farmacológica de los prototipos sintetizados como agentes antimitóticos, principalmente a través de ensayos de inhibición ATPasa de la enzima KSP, estudios de citotoxicidad en líneas tumorales, así como estudios fenotípicos de inhibición de la quinesina KSP. Establecimiento de las Relaciones estructura-actividad (REA) preliminares. Esta temática se aborda en los capítulos II y III de la discusión de la memoria. 4. La síntesis multicomponente (mediante reacciones Biginelli) de ligandos de tipo pirimidina, especialmente diseñados para su interacción con el receptor A2B de adenosina. Por último, la evaluación farmacológica de los prototipos sintetizados en el apartado anterior, mediante el estudio de unión al receptor A2B. Esta temática se aborda en el capítulo IV de la discusión de la memoria. 40 3. METODOLOGÍA ______________________________________________________________________ 3.1. Antecedentes metodológicos y resultados previos Las principales herramientas metodológicas que se han empleado en la realización de este trabajo experimental están basadas en la filosofía y la experiencia previa de las investigaciones del grupo de investigación. Particularmente las relativas a la aplicación de metodologías que permitan un acceso rápido a estructuras bioactivas, aunque también otras estrategias como la aplicación de reactivos soportados, o la colaboración con grupos de diseño computacional de fármacos y evaluación farmacológica de diversa índole. La presente Tesis supone una primera aproximación a la temática del cáncer en el seno del grupo Combiomed, empleando las estrategias metodológicas siguientes: 3.1.1 Aplicación de las Reacciones Multicomponente “ad hoc”: Quimiotecas dirigidas hacia la obtención de ligandos que modulen las funciones de la diana KSP o el receptor A2B de adenosina El descubrimiento de nuevos fármacos es un proceso complejo y fascinante que involucra la identificación y desarrollo de compuestos químicos con propiedades terapéuticas. A lo largo de la historia, se han descubierto y desarrollado numerosos fármacos que han revolucionado la medicina y han mejorado la calidad de vida de las personas. Sin embargo, a pesar de los avances logrados, el espacio químico107 que queda por explorar en busca de nuevos fármacos es vasto y desafiante. Se estima que solo una fracción muy pequeña de este espacio químico ha sido investigada hasta ahora, lo que significa que existe un enorme potencial sin explorar para descubrir compuestos con propiedades terapéuticas. El reto principal en el descubrimiento de fármacos radica en encontrar compuestos químicos que sean selectivos, seguros y efectivos en el tratamiento de enfermedades. A medida que se avanza en el conocimiento de la biología y la química de las enfermedades, se abren nuevas oportunidades para explorar enfoques innovadores y estrategias de diseño de fármacos. La problemática de futuro en el descubrimiento de fármacos radica en la complejidad de las enfermedades humanas, muchas de las cuales son multifactoriales y requieren enfoques terapéuticos más precisos y personalizados. Además, el desarrollo de fármacos puede enfrentar desafíos como la resistencia a los medicamentos, la toxicidad y los efectos secundarios indeseables. Otro aspecto importante y de creciente preocupación en la actualidad referido al descubrimiento de fármacos es el concepto de sostenibilidad. A pesar de la importancia de los fármacos en la salud, por desgracia la gran mayoría adolecen de una característica importante: la capacidad de ser producidos de manera rápida, sostenible y asequible. La química sintética sigue consistiendo en una serie de procesos químicos seguidos de tediosas etapas de purificación de compuestos. Por consiguiente, los fármacos se producen mayormente a través de procesos laboriosos, con multitud de etapas y con frecuencia utilizando materiales tóxicos. Relacionado con toda esta problemática, el doctor Barry Sharpless, Premio Nobel de Química en los años 2001 y 2022 y precursor de la llamada “click chemistry”, propuso en su día que, dado que el espacio químico explorado es infinitesimal comparado con el 41 total por explorar, el enfoque debería estar orientada al empleo de metodologías robustas y versátiles. Su filosofía se centra en la exploración del espacio químico para descubrir nuevas moléculas útiles en diferentes áreas, incluyendo la medicina. En relación con la síntesis de nuevos fármacos, el Dr. Sharpless ha propuesto la idea de la síntesis modular, que consiste en la construcción de moléculas complejas a través de la unión de fragmentos más simples. Esta estrategia permite la síntesis de compuestos de manera más eficiente y rápida, además de proporcionar una mayor flexibilidad en la construcción de estructuras moleculares. la química clic es considerada una síntesis modular debido a su capacidad para unir diferentes módulos o bloques de construcción de manera rápida y eficiente para formar moléculas complejas con una alta especificidad y selectividad. La reacción clic utiliza reactivos de bajo costo, es altamente eficiente y puede ser utilizada en una variedad de aplicaciones, incluyendo la síntesis de fármacos.108 En este contexto, del mismo modo, las reacciones multicomponente (RMC) son un tipo de síntesis modular que implica la unión simultánea de tres o más componentes para producir un producto complejo. Las RMC se contraponen a las clásicas síntesis lineales en las cuales la diversidad se va introduciendo a través de diferentes etapas de purificación (Figura 3.1.1). Son útiles en la búsqueda de nuevos fármacos, ya que permiten la síntesis de compuestos diversificados en una sola reacción, lo que puede acelerar el proceso de descubrimiento de nuevos medicamentos. En cuanto a la aplicación de las reacciones multicomponente en la búsqueda de nuevos fármacos, se han desarrollado diversas metodologías que han permitido la síntesis de compuestos con actividad biológica. Por ejemplo, se ha utilizado esta estrategia para la síntesis de moléculas con actividad anticancerígena, antiinflamatoria y antimicrobiana, entre otras.109 Figura 3.1.1: Reacciones multicompoente vs Síntesis lineales. Entre las principales características intrínsecas de este tipo de transformaciones destacamos: • Eficiencia: las reacciones multicomponente permiten la formación de múltiples enlaces en una sola etapa de reacción, lo que conduce a una alta eficiencia en la síntesis de moléculas complejas. • Versatilidad: estas reacciones pueden llevarse a cabo en condiciones suaves y con diferentes tipos de sustratos, lo que las hace versátiles y adaptables a diferentes necesidades sintéticas. • Diversidad: las reacciones multicomponente pueden generar una gran diversidad estructural, lo que las convierte en una herramienta útil para la síntesis de librerías de compuestos. • Facilidad de purificación: las reacciones multicomponente suelen producir una única molécula producto, lo que facilita su purificación y ahorra tiempo y recursos. • Economía de átomos: al generar múltiples enlaces en una sola etapa de reacción, las reacciones multicomponente presentan una alta economía de átomos, lo que las hace respetuosas con el medio ambiente y económicamente viables. Hoy en día se conocen entre 300-400 reacciones multicomponente diferentes. Entre ellas aproximadamente un 20-25% están basadas en isonitrilos como un 42 componente de partida. Una reciente revisión de nuestro colega Ángel Cores50 repasa los principios activos que han sido sintetizados con la ayuda de este tipo de reacciones. Algunas de las reacciones multicomponente más empleadas en química y que han dado lugar a importantes avances en el descubrimiento de fármacos son las siguientes: • Reacción de Passerini: es una reacción de acilación multicomponente que involucra un aldehído, un ácido carboxílico y un isonitrilo. La reacción produce una α-aciloxiamida. Esquema 3.1.1a: Síntesis de una Tubulisina mediante reacción de Passerini.109 • Reacción de Ugi: La reacción de Ugi es una reacción multicomponente ampliamente utilizada en la síntesis de compuestos orgánicos. Fue descubierta por el químico alemán Ivar Karl Ugi en 1959. Esta reacción permite la construcción eficiente de una amplia variedad de moléculas complejas mediante la combinación de una amina, un aldehído o cetona, un ácido carboxílico y un isonitrilo. La relevancia de la reacción de Ugi dentro de las reacciones multicomponente radica en su versatilidad y capacidad para generar una amplia diversidad estructural en una sola etapa de reacción. Esto la convierte en una herramienta valiosa en el campo de la síntesis de compuestos bioactivos y fármacos. La reacción de Ugi ha sido ampliamente aplicada en la síntesis de quimiotecas de compuestos, lo que permite la exploración de nuevas estructuras químicas con potencial actividad biológica. Las posibilidades mecanísticas que son posibles con estos cuatro ingredientes de partida pueden exponerse en la siguiente figura: Esquema 3.1.1b: Reacción de Ugi.109 Existen muchos ejemplos de aplicación de la reacción Ugi en la síntesis de fármacos. Es destacable la síntesis del antitumoral Ivosidenib: 43 Esquema 3.1.1c: Síntesis del antitumoral ivosidenib mediante reacción de Ugi.109 •Reacción de Biginelli: es una reacción multicomponente que involucra un aldehído, una cetona y una urea. La reacción produce una dihidropirimidina. Esquema 3.1.1d: Síntesis del antimitótico monastrol mediante reacción de Biginelli.109 •Reacción de Hantzsch: es una reacción multicomponente que involucra una cetona, un aldehído y amoníaco. La reacción produce una dihidropiridina. Destaca la síntesis de la felodipina, que actúa como un bloqueador de los canales de calcio de acción duradera usado en medicina como antihipertensivo. Esquema 3.1.1d: Síntesis de Hantzsch aplicada a la obtención de la felodipina.109 •Reacción de Strecker: es una reacción multicomponente que involucra un aldehído, cianuro de hidrógeno y amoníaco. La reacción produce un producto amina. Estas son solo algunas de las reacciones multicomponente más empleadas en química, pero existen muchas otras que se utilizan ampliamente en la síntesis de compuestos orgánicos complejos. Esquema 3.1.1f: La síntesis total de la trabectedina requiere un paso clave, la síntesis de Stecker.110 44 3.1.1.1 Síntesis orientada a la diversidad frente a síntesis orientada a la diana La síntesis orientada a la diversidad (Diversity Oriented Synthesis, DOS) y la síntesis orientada a la diana (target) (Targeted Oriented Synthesis, TOS) son dos enfoques diferentes en el diseño y desarrollo de compuestos químicos, especialmente en el campo de la química medicinal y el descubrimiento de fármacos. El enfoque de síntesis orientada a la diversidad se centra en la generación de bibliotecas de compuestos químicos que abarquen una amplia variedad de estructuras y propiedades. El objetivo principal es explorar un amplio espacio químico en busca de compuestos con actividad biológica interesante, sin tener un objetivo o blanco específico en mente. Se utilizan estrategias sintéticas flexibles y de alto rendimiento para sintetizar una diversidad de moléculas, y luego se evalúan su actividad biológica y propiedades farmacológicas para identificar compuestos prometedores. Por otro lado, el enfoque de síntesis orientada al target se centra en el diseño y síntesis de compuestos específicamente dirigidos a un objetivo terapéutico o una proteína diana particular. En este enfoque, se tienen en cuenta las características estructurales y las interacciones moleculares del objetivo deseado. Se utilizan técnicas de diseño racional y basado en la estructura para optimizar la afinidad y la selectividad de los compuestos hacia el objetivo deseado. El objetivo es desarrollar compuestos que tengan una alta actividad y especificidad hacia el blanco terapéutico seleccionado. Ambos enfoques tienen sus propias ventajas y desafíos. La síntesis orientada a la diversidad permite la exploración de un amplio espacio químico y el descubrimiento de compuestos con actividades inesperadas, lo que puede conducir a nuevas oportunidades terapéuticas. Sin embargo, puede requerir una optimización adicional para mejorar la actividad y la selectividad de los compuestos identificados. Por otro lado, la síntesis orientada al target permite un diseño más preciso y una optimización dirigida de los compuestos hacia un objetivo específico, lo que puede acelerar el proceso de descubrimiento de fármacos. Sin embargo, existe el riesgo de limitarse a un único objetivo y perder la oportunidad de descubrir nuevas actividades o blancos terapéuticos. En última instancia, la elección entre la síntesis orientada a la diversidad y la síntesis orientada al target depende del contexto y los objetivos específicos del proyecto de descubrimiento de fármacos. En muchos casos, se pueden combinar ambos enfoques para aprovechar sus fortalezas y maximizar las posibilidades de descubrir nuevos compuestos bioactivos y fármacos prometedores. En este trabajo experimental hemos “acotado” minuciosamente el espacio de diversidad que queríamos introducir. Esta manera, en función de la diana hemos empleado más o menos reactivos específicos de un tipo u otro en función de la arquitectura final deseada, con el fin de lograr una complementariedad química y topológica con la diana. Una vez obtenidos los productos de Ugi, se pueden explorar diversas estrategias de ciclación para generar nuevos heterociclos (Figura 3.1.1.1). Estas estrategias pueden incluir reacciones de anillo cerrado, reacciones de cicloadición, reacciones de ciclización intramolecular, entre otras. Estas transformaciones químicas permiten la formación de anillos heterocíclicos, que son estructuras clave presentes en muchos fármacos y compuestos bioactivos. La importancia de estas estrategias de ciclación a partir de los productos de Ugi radica en su capacidad para generar bibliotecas de compuestos con diversidad estructural y actividad biológica potencial. Los heterociclos resultantes pueden tener propiedades interesantes, como la capacidad de interactuar con sitios activos específicos de proteínas o enzimas, lo que los convierte en candidatos prometedores para el desarrollo de nuevos fármacos. 45 Figura 3.1.1.1: Estrategias de ciclación diversas a partir de los productos de U-4CR.109 Por lo tanto, en esta Tesis se han desarrollado dos grandes tipos de reacciones multicomponente para los objetivos químicos y farmacológicos planteados: Las reacciones de Ugi y las reacciones de Biginelli. En el primer caso, además se ha tenido muy en cuenta la estructura de la diana y muy específicamente el sitio de unión, tanto eligiendo los scaffolds de partida como la estrategia adecuada de ciclación que generase el tipo de estructura deseada. Todo este planteamiento se desarrollará en el apartado 4 de esta memoria. En cuanto a la caracterización estructural de los compuestos generados en la presente memoria, hemos recurrido a diferentes técnicas, que requirieron entrenamiento en el uso e interpretación de los diferentes protocolos de RMN (1H, 13C, 19F, NOESY, COSY), en espectrometría de masas tanto de baja como de alta sensibilidad, de infrarojos, dicroismo circular, etc. En este punto es destacable la utilización del programa de procesamiento de espectros de RMN perteneciente a la empresa MestreLabÒ, surgida de la Universidade de Santiago de Compostela. Otro aspecto significativo en el desarrollo de este proyecto ha sido el constante uso de las bases de datos ScifinderÒ o PubMedÒ, entre otras, que facilitaron el acceso rápido a información, en especial en los aspectos químicos y de búsqueda de condiciones de reacción apropiadas en el proceso de optimización de las reacciones de Ugi, ciclaciones, desprotecciones, oxidaciones, etc. 3.1.2 Conceptos extrínsecos aplicables a las RMC: Utilización de reactivos soportados (scavengers) para eliminar exceso de isonitrilo en procesos de work up En las reacciones de Ugi, los isonitrilos se utilizan comúnmente como componente clave para la formación de enlaces C-N. Sin embargo, a menudo pueden producir subproductos no deseados, como la formación de cianuros (nitrilos) inestables. Para evitar esto, se pueden utilizar scavengers (secuestradores) de isonitrilos para atrapar los subproductos y evitar su acumulación. Estos scavengers son reactivos soportados sobre matrices poliméricas, que generalmente se basan en sílica o poliestireno, y pueden estar funcionalizados con grupos que reaccionen selectivamente con los subproductos no deseados. Por ejemplo, se pueden utilizar scavengers con grupos de ácido carboxílico para capturar nitrilos inestables (Esquema 3.1.2). Los scavengers de isonitrilos pueden utilizarse para eliminar los olores fuertes que a menudo están asociados al uso de ellos. Los scavengers pueden capturar el isonitrilo libre y reducir su volatilidad y la intensidad del olor. Además, algunos scavengers también pueden ser utilizados para modificar las propiedades físicas y químicas de los isonitrilos, como su solubilidad en diferentes solventes, lo que puede ser beneficioso en ciertas aplicaciones sintéticas. Anteriormente, el grupo de investigación Combiomed ya había empleado este PS-TsOH en otros trabajos, facilitando la elaboración de las reacciones 46 4. COMPENDIO DE PUBLICACIONES ________________________________________________________ PUBLICACIÓN 1: Multicomponent reactions in antimitotic drug discovery Cores, A.1 Carbajales, C.1 Coelho, A.*1,2 Revista: Current Topics in Medicinal Chemistry Editorial: Bentham Science ISSN: 1873-4294. Año de publicación: 2014 Volumen: 14 Número: 20 Páginas: 2209-2230 DOI: 10.2174/1568026614666141127115130 1Center for Research in Biological Chemistry and Molecular Materials, University of Santiago de Compostela, Spain. 2Department of Organic Chemistry, University of Santiago de Compostela, Spain. Contribución específica en la publicación: Elaboración y corrección del manuscrito bibliográfico. Adquisición y análisis de datos bibliográficos. Índices de calidad: Q1 en el año de publicación de la revista (2014). Q1 (12/59) Medicinal Chemistry. Índice de impacto: 3,4. Artículo de revisión, correspondiente Capítulo 1 de esta memoria. 53 Send Orders for Reprints to [email protected] Current Topics in Medicinal Chemistry, 2014, 14, 2209-2230 2209 Multicomponent Reactions in Antimitotic Drug Discovery Angel Cores1, Carlos Carbajales1 and Alberto Coelho1,2,*,# 1Center for Research in Biological Chemistry and Molecular Materials, University of Santiago de Compostela, Spain; 2Department of Organic Chemistry, University of Santiago de Compostela, Spain Abstract: As enabling technology, the development and application of multicomponent reactions (MCRs) are now an integral part of the work of any major medical research unit. Targeted MCR approaches focused on specific antimitotic pathways afford new solutions for the medicinal chemistry of the XXI century. In this review, the contribution of these procedures to the discovery of antimitotic drugs that are currently in clinical trials or already in the market is discussed. Keywords: Antimitotic, Biginelli, Aurora kinases, KSP, Multicomponent reactions, Ugi. #Author’s Profile: Dr. Alberto Coelho is currently a associate professor at University of Santiago de Compostela (Spain) and a Researcher of the Center for Biological Research and Molecular Materials (CIQUS-USC). His research interests include structure based drug design, targeted multicomponent reactions and Medicinal Chemistry. INTRODUCTION Mitosis is an elaborate process in actively proliferating cells, resulting in the division of duplicated sets of chromosomes and two genetically identical daughter cells. Failure of cell-cycle checkpoint regulations often results in aneuploidy and genetic instability, culminating either in cell death or cancer [1]. Despite being the shortest phase of the cell-cycle, mitosis orchestrates major changes in multiple cellular components. Hence, it is considered to be the most fragile period of the cell-cycle, during which it is highly susceptible to cell death when exposed to various harmful events [2]. An ideal antimitotic drug interferes with normal mitotic propagation without seriously affecting quiescent, nondividing cells. Spurred by the success of paclitaxel and vinblastine for the treatment of various malignancies, mitotic cell death (MCD) is considered to be highly effective in treating tumor cells [3]. The strategy of clinically targeting cancerous cells at their most vulnerable state during mitosis has instigated numerous studies into the MCD pathway [4]. A repertoire of new chemical inhibitors targeting various mitosis-specific kinases, motor proteins and multiprotein complexes has been developed since the relative success of the classical microtubule poisons such as vincas or taxanes. These new drugs are naturally more mitosis-selective yet without the side effect of neurotoxicities [5, 6]. However, dramatic in vitro and in vivo results do not necessarily translate to clinic efficacy, as seen in the majority of these mitotic therapeutics. One of the main reasons for the difficulty of finding effective antimitotic are, first, the inherent slow growth of human tumors and the rapid development of drug resistance (associated to mitotic slippages both as a cause and as a consequence) limit patients response and curb the full potential of existing mitosis-selective inhibitors. Moreover, the genetic and phenotypic heterogeneity of cancer *Address correspondence to this author at the Center for Research in Biological Chemistry and Molecular Materials. University of Santiago de Compostela. Spain; Tel: ++34-881815739; Fax: ++34-881-815704; E-mail: [email protected] presents a large challenge to effective chemotherapy. Drug responses vary greatly, not only among disease types, but also among individual patients with the same disease. For certain inhibitors of kinase oncogenes, variation in drug sensitivity can be caused by mutations in the drug binding site [1-7], but for most anticancer drugs, the mechanistic basis of drug sensitivity is poorly understood. In view of all these problems based in the clinical experience with antimitotic drugs, open questions are still in discussion about the antimitotic therapies: Are these drugs still relevant as a potent chemotherapeutic strategy? How to improve the selectivity of antimitotics towards cancer cells without off-site(s) targeting? Can the balance of therapeutic benefits and reversible side effects be struck in combinatorial treatments consisting of multiple antimitotics targeting different stages of mitosis? What about multi-phasic combinatorial therapies encompassing antimitotics, DNA-damaging agents and/or antiangiogenic drugs? [4]. The answers to these questions necessarily involve clinical evaluation of different therapeutic strategies. Today, the best results of chemotherapy are based on the concept of "tailored medicine", specific treatments for each patient and type of tumor, for example combining antimitotics with drugs that appropriately modulate apoptotic pathways. These approaches will require new and novel molecular entities that would be found in new chemical spaces, many of them not accessible by traditional organic synthesis but more efficient transformations. Chemical efficiency in modern terms implies not only the traditional concept of chemical yield but it also takes into account chemo-, regio-, and stereoselectivity, atom economy, and convergence of the reaction. The compliance of these aspects has been the center of many efforts over the second half of the last century [8]. Many aspects of the modern criteria of synthetic efficiency to achieve an easy and rapid production of collections of the above target molecules are covered by the multicomponent reactions (MCRs) [9], as 1873-5294/14 $58.00+.00 © 2014 Bentham Science Publishers 55 2210 Current Topics in Medicinal Chemistry, 2014, Vo l. 14, No. 20 Cores et al. a powerful tool for the efficient generation of structurally and stereochemically diversified families of the identified biologically validated targets (focused libraries) [10]. The resurgence of the MCRs in the last decade as major supplier of big libraries, has evolved into a trend of more rational design, involving targeted libraries, preferably directed at specific targets involved in a specific disease. With the introduction of molecular biology and high-throughput biological screening, the demand on the number and the quality of compounds for drug discovery has increased enormously. Furthermore, increasing structural information [available on different antimitotic targets such as Kinesin Spindle Protein (KSP-Eg5), Aurora Kinase (AUK), PoloLike Kinases (PLK), etc.] enables rational discovery of novel potent and selective drugs with a predictable mechanism. Similarly, progress in the discovery of new targeted MCRs, will enable quick access to new drugs that improve the effectiveness of existing antimitotic and evaluate the true potential of antimitotic drugs as effective agents against cancer. This review is focused on the success, scope and future of the multicomponent reactions in the development of new antimitotic treatments. CURRENT MITOSIS-SELECTIVE STRATEGIES AGAINST CANCER Although the number of types of enzymes involved in the mitosis is imprecise, kinases have become one of the most intensively pursued classes of drug target with approximately 30 distinct kinase targets being developed to the level of a Phase I clinical trial. The vast majority of these targets are being investigated for the treatment of cancer. Despite a high degree of conservation in the ATP binding site, highly selective small molecules with favourable pharmaceutical properties can be developed [11]. The main enzymes known to date that play key roles in mitosis are presented in Fig. (1). Colectively, we can describe four major simplified antimitotic strategies for which there have been discovered various antimitotic drugs: Targeting mitotic entry and the spindle, targeting the Spindle Assembly Checkpoint (SAC) and finally targeting the mitotic exit. The major mitotic kinases are the Cyclin-Dependent Kinase 1, Cdk1 [12] the aurora kinases family (aurora A, B and C) [13] and the polo-like kinases family (Plk1 to PLK4) [14]. Other important enzymes play important roles in mitosis such as kinesines and phosphatases (PP1, PP2A, and is Cdc25 which has dual specificity) [15]. A comprehensive presentation of the molecular mechanisms of mitosis is beyond the scope of this article. Next, we present a brief description of the molecular events that ensure the progression of mitosis. Targeting Mitotic Entry One class of new targets involves kinases responsible for directing cells into mitosis. The most prominent mitotic kinase is the cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1), the founding member of the Cdk family of cell-cycle regulators. Generaly, mitotic entry is driven by the activation of a ‘mitosispromoting factor’, which comprises the cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1)/cyclin B1 heterodimer [16]. Therefore, inhibition of Cdk1 blocks mitosis and induces cell death. Nevertheless, despite the excitement generated at preclinical stages, several human trials on Cdk drugs failed to deliver significant clinical advantages, with toxicity and side effects [17]. Targeting the Spindle Assembly Classical Microtubule Poisons All mitotic drugs currently used in the clinic [taxanes (e.g., paclitaxel, taxotere), vinca alkaloids (e.g., vinblastine, vinorelbine) and epothilones (e.g., ixabepilone, epothilones A, B)] shown in Fig. (2), are microtubule poisons that perturb microtubule dynamics, impairing the formation of a proper bipolar spindle. Microtubule drugs are usually classified in two main groups: microtubule-destabilizing agents that inhibit microtubule polymerization (e.g. vinca alkaloids) and microtubule-stabilizing agents (e.g. taxanes) that enhance microtubule polymerization [18]. Despite the great success of these groups of drugs in the treatment of different types of tumors, these drugs are far from ideal prototype antimitotic drug, mainly because of its major side effects. The dose-limiting toxicities of these drugs are largely a consequence of the general disturbance of microtubule dynamics that they induce, causing serious neurotoxicity [19, 20]. In addition, acquisition of resistance is quite common in Fig. (1). New spindle targets in mitosis [15]. 56 Multicomponent Reactions in Antimitotic Drug Discovery Current Topics in Medicinal Chemistry, 2014, Vol. 14, No. 20 2211 Fig. (2). Classic antimitotic agents acting on microtubules. patients treated with anti-microtubule drugs [19]. However, this generation of classic antimitotic drugs will continue to be used in clinic in the coming years (either individually or in association with other new drugs), mainly due to their effectiveness compared to the relatively poor results obtained in clinical trials by the new antimitotic drugs that act on new mitotic targets showed in Fig. (1). By this reason, it has been speculated that the success of microtubule poisons might be given by its ability to target non-mitotic functions of microtubules [21]. The vinca alkaloids (Fig. 2) exemplified by vincristine, vinblastine, vindesine, and vinorelbine are -tubulin binding agents that interfere with proper mitotic spindle formation by preventing the normal dynamics and polymerization of spindle microtubule formation. The vinca alkaloids are important in the treatment of leukemias, lymphomas, small cell lung cancer, and other cancers [22]. These agents are also known as microtubule-destabilizing agents or microtubule polymerization inhibitors or depolymerizers. Taxanes (Fig. 2) are exemplified by paclitaxel (taxol) and docetaxel (taxotere) [18]. Paclitaxel increases microtubule polymerization and thus interferes with spindle microtubule dynamics and prevents the dividing cell from progression. These are microtubule-stabilizing agents or polymerizing agents. The taxanes are clinically useful in the treatment of breast, lung, ovarian, head and neck, and bladder carcinomas among others. Epothilones [24] and (+)-discodermolide [25] are also potent microtubule-stabilizing agents that have undergone intensive clinical evaluation. A peculiarity of the microtubule binding agents is their extreme structural diversity and, in many cases, structural complexity (Fig. 2). Vincas and taxanes are complex molecules, generally difficult to synthesize. The relative ease in accessing the taxol through semisynthesis subdued the impact of total synthesis of taxol on its supply problems. Synthesizing taxol analogues with less molecular complexity and comparable cytotoxicity to the parent molecule is an attractive aim [28]. The third class, typified by colchicine, is comprised of a diverse collection of small molecules that bind to the colchicine binding site. These compounds are microtubule polymerization inhibitors similar to the vinca alkaloids. However they bind to a different site and their depolymerization mechanism of action is also different. Combrestatins (Fig. 2) are a class of drugs that are in clinical trials as antitumor agents that bind to the colchicine binding site [29]. There are no clinically approved antitumor agents that bind to the colchicine site. New Spindle Targets Anti-Motor Proteins (Kinesin Inhibitors) One of the most important groups of key regulators of the spindle are kinesin motor proteins, which have crucial functions in spindle assembly, chromosome congression and segN H N MeOOC MeO NOR3 OR2 OH OH R1 Vinblastine Vincristine Vindesine O O OOH O HO OH NH R O O AcO Placitaxel Docetaxel O OMe NH O MeO MeO OMe MeO MeO OMe OH OMe S N X R1 OHO O O OH Colchicine Combrestatin Epothilone A Epothilone B Ixabepilone O O NH H Me Me H XR1 R1R2R3 Me OMe COMe CHO OMe COMe Me NH2H R= COPh R=COOt-Bu O OH OH O HO O OH NH2 O H (+)-Discodermolide 57 2212 Current Topics in Medicinal Chemistry, 2014, Vo l. 14, No. 20 Cores et al. regation [30]. The superfamily of kinesin ATPases consists of more than a hundred representative proteins, which can be ordered into 14 different families. There have been identified 44 kinesins in the human genome. The growing interest of the kinesins as an antitumor targets emerged from the pioneer identification of monastrol, the first small-molecule inhibitor of kinesin spindle protein (KSP-Eg5) [31]. As a consequence of these promising results, a number of KSPEg5 inhibitors have been studied, and some of them (such as ispinesib and AZD-4877) have recently entered into clinical trials. Human KSP-Eg5, a member of the kinesin superfamily, plays a key role in mitosis, as it is required for the formation of a bipolar spindle. Although side effects are moderate, the clinical efficacy of KSP-Eg5 inhibitors has been limited, with only few studies demonstrating a partial response [32]. However, it seems very likely that the effectiveness of these drugs is increased in the presence of other antitumor agents. Given the great interest shown so far about this kinesin, numerous examples of multicomponent reactions applied to obtain new inhibitors have emerged and will be addressed ahead. In addition to KSP-Eg5, several other mitotic kinesin motor proteins contribute to the proper alignment and segregation of chromosomes [33]. These include MKLP1, Kif4, Kid, MCAK and CENP-E among others, being the KSP by far the most advanced potential drug target in this family of proteins. Kinesin CENP-E has recently emerged as a potential antitumoral target [34]. This kinesin is also a plus enddirected motor protein that appears to have a pivotal role specifically in mitosis. This enzyme accumulates during late G2 and M-phases. It is localized at the kinetochores (Fig. 1) and is required for proper chromosome congression during metaphase. Moreover, it also stabilizes kinetochore– microtubule attachments and serves as a sensor of SAC by binding to and regulating the activity of BubR1 [35]. Mitotic Kinases Protein phosphorylation plays a fundamental role in many cellular events and is heavily involved in cell division. Kinases are enzymes that transfer a phosphate group from a high-energy donor molecule, such as ATP, to a target substrate [36]. Currently, the search for kinases inhibitors is one of the priorities in cancer research and, as a result, several kinase inhibitors have been developed as successful anticancer drugs [37]. Two main groups of mitotic kinase families have attracted much attention during the last couple of years, both in academia and in the pharmaceutical industry: the aurora kinases, which are essential for accurately dividing chromosomes to each daughter cell and the polo-like kinases are important during both mitosis and cytokinesis [38]. The mammalian aurora members A, B and C are serine/ threonine protein kinases that have multiple essential roles during mitosis. Often times, they are overexpressed in several tumor types, making them ideal targets for cancer therapy [39]. They fulfill important roles during mitosis to ensure proper centrosome function, chromosome alignment and segregation [40-42]. Aurora-A has been shown to be amplified in several tumors and can act as an oncogene [43]. Both aurora-A and aurora-B kinases are key regulators of mitosis with distinct functions that were considered as novel mitotic drug targets due to their frequent overexpression in human cancer [44]. The 0effective role of aurora C is unclear [45] but its known that it is a chromosomal passenger protein, and that it binds directly to INCENP and survivin in vitro [46, 47]. Frequent gene amplifications in various tumor entities were only found for aurora-A and overexpression of aurora-A, but not aurora-B is sufficient to transform rodent fibroblasts suggesting that aurora-A rather than aurora-B might represent an oncogene [48]. Targeting the Mitotic Checkpoint Imparing a functional spindle is monitored by a mitotic checkpoint, known as the spindle assembly checkpoint (SAC), that delays mitosis, providing cells with additional time to resolve errors in microtubule–kinetochore attachment [49]. The SAC involves a group of conserved checkpoint proteins including Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, and Bub3 among others, that are recruited specifically to kinetochores that are either not attached to microtubules or that do not exhibit a tension across sister kinetochores, which indicates a lack or incomplete chromosome alignment [50]. Targeting Mitotic Exit Inhibiting mitotic progression triggers the SAC and inhibits APC/C–Cdc20. During a normal mitosis the APC/C is activated by a co-factor, known as Cdc20 that targets cyclin B for its proteasome mediated degradation leading to the exit from mitosis [50]. Manchado et al. have recently shown that the ablation of Cdc20 results in efficient regression of aggressive tumors, whereas current mitotic drugs display limited effects [51]. MULTICOMPONENT REACTIONS IN THE SEARCH OF ANTIMITOTIC AGENTS Drug discovery is a long process and comprises numerous steps, some of which are severely regulated to control toxicology and target selectivity. In the complex process of the current drug development, the integration of different disciplines is necessary. The recent demands in drug discovery for more diverse small molecules and their efficient synthesis has now shifted the attention of the chemist to the as yet largely unexplored area of chemistry of multicomponent reactions (MCR). Today, with the emergence of combinatorial chemistry and high-speed parallel synthesis, the multicomponent reactions (MCR) are widely employed for the rapid assembly of arrays with high molecular diversity [52]. In a multicomponent reaction (MCR) process (as opposed to linear synthesis, where the chemical diversity is being incorporated at different stages of synthesis), three or more reactants are combined in a single chemical step to produce products that incorporate substantial portions of all the components, and naturally comply with many of the stringent requirements for ideal organic syntheses discussed previously (Fig. 3). Although the first examples of this type of reactions dates back to the 19th century (Stecker reaction and Biginelli reaction), the chemistry of the MCRs did not develop until the last century, with examples such as the synthesis of Mannich and others, until the appearance of the isocyanates based on MCR. Overall, MCRs can be subcategorized in two general 58 Multicomponent Reactions in Antimitotic Drug Discovery Current Topics in Medicinal Chemistry, 2014, Vol. 14, No. 20 2213 Fig. (3). Linear synthesis and multicomponent synthesis. classes, i.e. isocyanide-based MCRs [53, 54], and nonisocyanide-based MCRs (Scheme 1). The main isocyanidebased MCRs are the Passerini (1921) and Ugi reaction (1959). The former, the Stecker MCR, (Scheme 1), is the reaction between isocyanides, carboxylic acids, and aldehydes or ketones to afford acyl carboxamides in a single step [55]. The second and arguably the most important isocyanide-based MCR is the Ugi four component reaction (Scheme 1) holds a special ‘‘cream of the crop’’ status, because of its generality, versatility, experimental simplicity, and atom economy. This elegant four-component reaction, discovered in 1959, is a reaction between isocyanides, carboxylic acids, ketones or (usually) aldehydes and primary amines to afford dipeptide-like structures. Together, the isocyanide based multi-component reactions have experienced a resurgence of interest and appear well positioned for a stronger impact for the post-genomic era in the new millennium [56]. Scheme 1. Examples of the main MCR. The importance of multicomponent reactions not only lies in being inherently efficient transformations but it also provide new heterocycles formed by cyclization possibilities from the adducts formed (Fig. 4). Thus the initial MCR derived products can be considered as a synthetic hub to a vast diversity of novel cyclic or acyclic scaffolds by employing different secondary transformations. Typically, only 13 synthetic steps are needed to synthesize libraries of drug-like advanced compounds. In addition, MCRs are adaptable to new working methods of modern organic chemistry, such as miniaturization, parallel synthesis or use of supported reagents within the same reaction processes. Next, we will describe the main achievements in the synthesis of novel antimitotic agents obtained by MCRs. Tubulin Polimerization Inhibitors Tubulysins and Tubugis Tubulysins are among the most potent antimitotic agents known to date, with an extraordinarily high cytotoxic activity, which also extends to multi-drug-resistant cell lines. It makes the tubulysins a remarkable lead for the development of novel anticancer drugs [57]. These unusual tetrapeptides disrupt the microtubule spindle and were first isolated by Höofle’s group from myxobacteria culture broths [58]. The most potent tubulysins possess a rare tertiary amide (this part of the molecule largely determines the cytotoxic activity of the tubulysin) that makes the middle part of the molecule extremely crowded and constitutes the major challenge in their synthesis [57]. Modifications over this part of the tubulysin has led to a decreased activity, as seen in ciclotubulysin D and tubulysin U and V (Scheme 2). The use of natural product leads and multiple MCRs together can be considered also a valuable strategy for the generation of new bioactive natural products. Taking this concept into consideration, Wessjohann et al. reported the first synthesis of tubulysin natural product analogues (called tubugis) by means of a combination of three different types of isonitrile-based multicomponent reactions in a concise and convergent manner and represents the first example of a target-oriented synthesis approach using multiple MCRs (Scheme 2) [59]. The synthetic strategy employed for preparing the new analogues are shown in Scheme 3. Two different MCRs are used for preparing the key precursors 3b and tubuvaline 6, R3NH2R5NC O R2 R1 O OH R4 N R3O N H R5 O R4 R1R2 R1O O O R2 R4CHO N H O NH2 N NH R4 R3 R1O O O R3 R2 R1 H NR2H H O R5 O R4 R3 R2 N R5 O R3R4 H H R1 O H RRCN NH2 R4 NC O R2 R1 O OH R3O R3 O R2 R1 O N R4 H CNN H H H Strecker Mannich Biginelli Ugi Passerini 59 2214 Current Topics in Medicinal Chemistry, 2014, Vo l. 14, No. 20 Cores et al. Fig. (4). Construction of new cyclic structures, from intermediates generated by the MCR. Scheme 2. Natural D-tubulysin D and tubugis. and the synthetic route is complemented by a Ugi reaction (Step C). The Mep-Ile-OH fragment 3b was synthesized through an Ugi-type MCR involving 1-piperideine (1), the 4-methyl-2,6,7-trioxabicyclo[2.2.2]octyl (OBO) ester (2) of isoleucine isocyanide, and trifluoroacetic acid. In the other hand, preparation of Boc-protected tubuvaline (Tuv) ethyl ester 6 was performed by using a Passerini-type reaction as the key step and Boc-protected Tuv-Tup-OMe 4 and (E)- ethyl 2-cyano-3-(dimethylamino)acrylate 5 [60, 61]. Synthesis of Tubugis 12a, 12b and 12c from the crucial Ugi-4CR-based coupling was initially attempted using as the amino component the Tuv-Tup-OMe dipeptide, which was generated in situ from its Boc-protected derivative tubuvaline (Tuv) ethyl ester 6; Mep-Ile-OH (3b) served as the carboxylic acid component, paraformaldehyde or acetaldehyde 7 as the oxo component and isopropyl isocyanide or butyl isocyanide 8 as the condensing agent (Scheme 3). The new cytotoxic tubugis 12a, 12b and 12c (in which the rare peptoid N, O-acetal-ester functionality has been replaced by a more stable N-branched peptide backbone with retention of the cytotoxic activity) (Scheme 3) showed prominent biological activities (GI50 values in the high picomolar range), most likely acting as microtubule modifiers like their lead natural products [59]. Indolobenzazepinones In the context of a medicinal chemistry project directed towards finding new antitumor agents, Beaumont et al. prepared indolobenzazepinone derivatives of type 1 (Scheme 4), as analogues of natural products [62]. The cytotoxic activity N H NN S NN H O COOH O O O O OAc N H NN HS NN H O COOH O OOR3 S N N H O COOH N H N O O N O Tubulysin D MCR-1 MCR-2 Cyclo-tubulysin D R3= Ac. tubulysin U R3= H. tubulysin V MCR-3 Cytotoxic activity decreases two or three orders of magnitude N H NN S NN H O COOH O OOAc R1 HN O R2 Tubugis Peptoid-like amide moiety accessible by Ugi four component Acid component isonitrile component Aldehyde component Amine component 60 Multicomponent Reactions in Antimitotic Drug Discovery Current Topics in Medicinal Chemistry, 2014, Vol. 14, No. 20 2215 Scheme 3. Reagents and conditions: (STEP A) (1) MeOH, stirring, 15 h; (2) CF3COOH, stirring, 30 min; (3) NaOH, THF/H2O; no purification. (STEP B) (1) (CH2O)n, Pd(OH)2/C, H2, MeOH/H2O (3:1 v/v), stirring, 16 h, separation of the C2 diastereomers; (2) HCl, THF/H2O (1:1 v/v); 9b in 31% overall yield. (STEP C) (1) CH2Cl2/CF3COOH (4:1 v/v) at 0 _C; (2) NaHCO3; (3) (CH2O)n for 9a and 9b and CH3CHO for 9c, isopropyl isocyanide for 9b and n-butyl isocyanide for 9a and 9c, MeOH; 35-52% overall yield. (STEP D) (1) CF3COOH/THF/H2O (2:2:1 v/v/v); (2) LiOH in THF/H2O (1:1 v/v); (3) DIC, PFP, CH2Cl2; (4) Tup-OMe 10 HCl, diisopropylethylamine, DMF; 55-62% overall yield. (STEP E) (1) LiOH, THF/H2O (v/v 1:1); (2) Ac2O/Py (in the case of tubugi 12c, a catalytic amount of dimethylaminopyridine was added); 71-86% overall yield. of 13 in a variety of cancer cell lines was first determined and in some cases compared to that of colchicine and Nacetylcolchinol-NAC (Scheme 4). Thus, the cytotoxicity of 13 in all cell lines was of the same order of magnitude as in KB cells, IC50’s ranging from 0.030 μM in MDA-MB231 cells to 0.070 μM in MDA-MB435 and K562 cells, thus clearly indicating an antiproliferative activity regardless of the origin of the tumor cells. The displayed potent antimitotic properties of type 1 molecules (in the micromolar range) is a consequence of tubulin polymerization inhibition, by the interruption of cancer cell growth at the G2/M stage in the presence of 13. Finally, these in vitro observations were confirmed in vivo whereby compound 13, used in a CAM model of tumor growth at concentrations inhibiting tubulin polymerization, was significantly more effective than colchicine and NAC in causing tumor volume regression after only several days of treatment [62]. Regarding the structure-activity relationships, it was found that the presence of an alkyl side chain at the C-5 position is crucial in order to obtain cytotoxic effects in the nanomolar range (Scheme 4). Application of a Ugi multicomponent reaction to oxo acids 14 allows the formation of potentially antimitotic inN F3COH O O O O + O SH BocHN O EtO2C NC N + NH+ H N O O OH NH+ H N O O OH Cl-ClS NOEt OAc BocHN O Ugi-Nenajdenko MCR Passerini-Dömling MCR Tubuvaline S N OEt O N NHO O N OH O N H R2 R1 R2-NC R1-CHO Ugi-MCR Synthesis of building blocks by MCR Assembly of building blocks by MCR NH2 COOMe S N O N NHO O N OH O N H R2 R1 NCOOMe 10 Tubugi 12a: R1=H, R2=CH2(CH2)2CH3 Tubugi 12b: R1=H, R2=CH(CH2)2 Tubugi 12c: R1=CH3, R2=CH2(CH2)2CH3 STEP C STEP D Tubugis from multiple MCRs S N O N NHO O N OAc O N H R2 R1 NCOOH STEP E Mep-IIle-OH dipeptide 9a: R1=H, R2=CH2(CH2)2CH3 9b: R1=H, R2=CH(CH2)2 9c: R1=CH3, R2=CH2(CH2)2CH3 11a: R1=H, R2=CH2(CH2)2CH3 11b: R1=H, R2=CH(CH2)2 11c: R1=CH3, R2=CH2(CH2)2CH3 1254 STEP A, B ref X 3a 3b 6 (7) (8) 9 H H 61 2216 Current Topics in Medicinal Chemistry, 2014, Vo l. 14, No. 20 Cores et al. dolobenzazepinones of type 2 in good yields of up to 72% (Scheme 4) [63]. The reaction can be applied to a wide range of isocyanides, thereby ensuring introduction of molecular diversity at the key C-5 position. Use of cyclohexenyl isocyanide (Armstrong isocyanide) allows postcondensation modifications, while careful choice of the amine and the indole protecting groups proved to be important for providing the deprotected compounds necessary for biological tests. Scheme 4. Intramolecular Ugi-4-CRs starting from oxo acid 14. Podophyllotoxin Podophyllotoxin (15, Scheme 5) is another natural product extracted from Podophyllum Peltatum L, also known as the American Mayapple and has been investigated as an antitumor agent [64]. Although clinical results were quite disappointing due to severe gastrointestinal side effects, podophyllotoxin is a good tubulin polymerization inhibitor and extensive synthetic efforts in order to overcome these problems have been carried out by a number of researchers. The structural modification of podophylotoxin has led to the discovery of molecules such as the etopoxide 16 (Scheme 5) and other analogues, which have shown to inhibit DNA topoisomerase-II (topo-II) by stabilizing the covalent topo-II DNA cleavable complex [65] and are used against a variety of cancers. Kalivendi et al. reported an efficient access to the construction of a new novel 4-aza-2,3didehydropodophyllotoxin derivatives 17 applying a multicomponent route involving the condensation of substituted heteroaromatic amines, tetronic acid, and substituted aromatic aldehydes in ethanol. All the compounds showed improved cytotoxicity and inhibition of tubulin polymerization, being significantly cytotoxic with a concentration of the compound that produced 50% inhibition of cell growth (GI50) ranging from 0.1 to 2.9 μM. 4-Arylpyrano[3,2-c]pyridones 2-Pyridone framework occurs in many natural and synthetic molecules exhibiting diverse biological activities [66]. Somewhat surprisingly, the biology of 4H-pyrano[3,2c]pyridin-5(6H)-ones (19, Scheme 6) has not been thoroughly investigated with the exception of antibacterial properties associated with some of these compounds [67, 68]. Very similar compounds, such as chromenes 18 inhibit tubulin polymerization and induce apoptosis in cancer cells and exhibit high potency against taxol and vinblastineresistant, P-glycoprotein overexpressing cell types [69]. Furthermore, chromenes 18 disrupt tumor vasculature in a number of human solid tumor xenografts and they are currently in development as anticancer agents [70, 71]. Based on the structural similarity of these two frameworks, Magedov et al. prepared series of 4-arylpyrano[3,2-c]pyridones 22 by a one-step cyclocondensation of 4-hydroxy-1,6dimethylpyridin-2(1H)-one 20 with various substituted benzaldehydes and malononitrile (in a 1:1:1 ratio), in refluxing ethanol containing a small quantity of Et3N. They also reported on the preparation of pyrano[2,3-c]quinolones anaScheme 5. Structures of podophylotoxin 15, etoposide 16 and the MCR synthesis of a library of compounds 17. N H NH O R N H N O R1 R3 N H COOH O R3 R1NH2R2NC O HN R2 ++MeOH 50ºC Citotoxicity R=(S)Et IC50= 0.037 μM type 1 O NHAc N-Acetylcolchinol (NAC) OH H3CO H3CO H3CO NHAc H3CO H3CO H3CO O H3CO Colchicine type 2 14 13 NH2 O O O O H R3 +Et3N EtOH reflux NH2 R3 H N O R3O OH O O O O OMe OMe MeO abcd O O O 17a: R1 = 2,4 dimethoxy 5-pyrimidyl R3 = 3,4,5-trimethoxy R1 R1 R1 17b: R1 = 2-methyl-5-indyl R3 = 4-fluoro-3-trimethoxy 17c: R1 = 6-benzthiazolyll R3 = 3,4,5-trimethoxy O O O O O OMe OMe MeO O O H R1 R2 HO Podophyllotoxin Etoposide 16 15 62 Multicomponent Reactions in Antimitotic Drug Discovery Current Topics in Medicinal Chemistry, 2014, Vol. 14, No. 20 2223 Fig. (8). X-ray structures of compounds in the KSP allosteric binding site. A) 76 (yellow, PDB code 2FL6) and 75a (green, PDB code 2PG2); B) 75b (blue, PDB code 2UYI) and 75c (orange, PDB code 2UYM). Protein surface is shown for KSP/ADP/76 (A) and KSP/ADP/75b (B). Compounds are shown in thick sticks, and protein residues are shown in thin sticks [111]. Pyrazolopyridines have received much attention in the recent years. An interesting biological activity of this kind of compounds is as a potent cyclin dependent kinase 1 (CDK1) inhibitors [112]. Taking as a starting point the disubstituted indazole scaffold, emerged as promising structural core for enzyme inhibitors with excellent potency against numerous kinase targets, Huang et al. reported the discovery of the compound 82 [112] (Scheme 12). This compound was tested for its ability to inhibit CDK1 activity, which was evaluated using CDK1 in complex with cyclin B to phosphorylate a histone-H1 biotinylated peptide substrate. This compound showed high inhibition of CDK1 with an IC50 of 23 nM. Nikpassand et al. described an efficient method for the regioselective synthesis of new derivatives of pyrazolopyridines 80 or 81 through multicomponent reactions of 3-amino5methylpyrazole, azo-linked aldehydes and active methylene compounds using nano-Fe3O4 (Scheme 12) [113]. Aurora Kinase Inhibitors The combination of high-throughput screening and the multicomponent reactions was applied by Wu et al. to the discovery of new compounds active on several mitotic targets, such as aurora or CDC25B [114]. They described a novel and highly efficient route for the generation of diverse 1H-pyrazolo[5,1-a]isoquinolines 93 via a multicomponent reaction of 2-alkynylbenzaldehyde 88, sulfonohydrazide 89, alcohol 84, and ,-unsaturated aldehyde or ketone 90. Final structures 93 combine two medicinally interesting scaffolds, i.e. the isoquinoline moiety and a pyrazolo[1,5-a]pyridine skeleton (Scheme 13). The discovery of this new reaction was inspired by the isolation of an unespected byproduct 87 of a side reaction, while they were exploring the scope of a novel MCR of their own discovery (3CR, Scheme 13) [115]. The initial reaction involved a metal and N-heterocyclic carbene cocatalyzed 3CR of N-(2-alkynylbenzylidene)hydrazines 83, metanol and ,-unsaturated aldehydes 85 to obtain 2-amino-1,2-dihydroisoquinolines 87. When they treated of 2-alkynylbenzaldehyde 88 with sulfonohydrazide 89 the reaction led to N-(2-alkynylbenzylidene)hydrazide 91, which then underwent cyclization to furnish isoquinolinium intermediate 92 in the presence of suitable metal catalyst. Meanwhile, the enolate was produced in situ via nucleophilic attack of alcohol to theunsaturated aldehyde or ketone 90. Thus, after subsequent transformation (including intermolecular nucleophilic addition, intramolecular condensation, and aromatization), the desired 1H-pyrazolo[5,1a]isoquinolines 93 are afforded. The library was tested in a pannel of diverse kinases. Compound 93a showed an interesting result as an aurora A inhibitor (IC50 13.43 μM). Other assays included activity against CDC25B (IC50= 2.19 μg/mL), TC-PTP (IC50= 4.50 μg/mL), and PTP1B (IC50= 1.75 μg/mL) [114]. Aurora Kinase/ KSP Dual Inhibitors Assuming that two main reasons for the failure of many mitosis-selective strategies are the underestimated slowness of human tumor-doubling time [116] (A parameter used to determine tumour aggressiveness, which serves to prognostiS NO NH N F F N O O S S NO NH O S S NO NH O S ATPase IC50 = 1.7 μM Cytotoxicity 60 h EC50 =1.0 μM ATPase IC50 = 0.048 μMATPase IC50 = 3.1 μM Cytotoxicity 60 h EC50 =6.0 μM Cytotoxicity 60 h EC50 =2.0 μM 76 75a 75b 75c 69 2224 Current Topics in Medicinal Chemistry, 2014, Vo l. 14, No. 20 Cores et al. cate, measure therapeutic success, and quantify tumour kinetics and growth rate) and the occurrence of mitotic slippage (exit from mitotic arrest), one can envisage two possible ways to circumvent the complications: (i) antagonizing cancer-specific targets that have oncogenic roles outside mitosis (i.e., important throughout the cell-cycle), and (ii) combining targeted inhibitors to maximize mitotic arrest-cell death and minimize mitotic exit (combinatorial therapy). This line of reasoning makes the development of dual ligands one of the most interesting approaches for developing new anticancer drugs candidates, due to the possibility of selectively block key processes in the development of mitosis. The most viable approach to find new ligands with dual affinity for two different targets involves the use of a rational structure-based drug design. Scheme 12. Multicomponent synthesis of pyrazolopyrimidines. Following this working hypothesis, Xu and coworkers designed and synthesized series of dihydropyrazolo[3,4b]pyridines 94 and benzo[4,5]imidazo[1,2-a]pyrimidines 95 as dual KSP and aurora-A kinase inhibitors for anticancer agents by introducing some fragments of aurora-A kinase inhibitors into the previous KSP inhibitor CPUYL064 (94) reported by this group [117]. Taking this inhibitor as starting point and two targeted priviliged scaffolds such as 1H-pyrazol-3-amine and 1H-benzo[d]- imidazol-2-amine to afford interactions with hinge region of Aurora, they merged and aligned both pharmacophores to form an hybrid structure which keeps resulting interactions on both targets (Fig. 9). The synthesis of the dihydropyrazolo[3,4-b]pyridines (99) (Scheme 14) was performed via one-pot threecomponent condensation reaction of 1H-pyrazol-3-amine 97, N-alkyl acetylacetamides 95 and the appropriate aromatic aldehyde 96 in the presence of FeCl3 as a catalyst at ambient temperature. N-Alkyl acetylacetamides 95 were prepared by ester/amide exchange reaction. Similarly, compounds (100) were prepared using benzo[d]imidazol-2-amine 98 as amine component in the presence of ceric ammonium nitrate and absolute etanol. A total of 19 target compounds were evaluated by two related enzyme inhibition assays and a cytotoxicity assay in vitro. In the first series of dihydropyrazolo[3,4b]pyridines, it was interesting that compounds 99a, 99b with the R1 group being furyl showed better inhibition activities against aurora-A kinase with the IC50values of 9.25 and 8.10 μM, respectively, compared with the phenyl and thienyl substituted compounds. Scheme 13. 3CR towards 2-amino-1,2-dihydroisoquinolines and 4CR towards 1H-pyrazolo[5,1-]isoquinolines. Fig. (9). Design of compounds 99 and 100 as KSP /aurora dual inhibitors. Although compounds 100a and 100b were moderately potent KSP and aurora-A kinase inhibitory fused-molecules, most compounds in these series of benzo[4,5]imidazo[1,2a]pyrimidines displayed more balanced inhibitory activities NOH CHO NAr O O NN H Me NH2 + nano-Fe3O4 NH NH N O OH NMe NAr N NH N O OH NMe NAr or NN H N N HN N 77 78 79 80 82 81 NNHTs R2 R1 R3H O MeOH AgOTf IPr-HCl NNHTs R1 R3 OMeO R2 H R2 R1 R3R4 O MeOH KOH AgOTf N R1 R2 O TsNHNH2 N R4 OMe R3 DCE 4CR 3CR NN Cl + N R2 R1 H NTs [Ag] R3R4 OOMe N R1 R2 NTs R3R4 OOMe pyrazolo[1,5-a]pyridine isoquinoline H-pyrazolo[5,1-a]isoquinoline 83 84 86 85 87 88 92 89 91 90 93 84 93a: R1= 5-Cl, R2= Ph, R3= 4-Me-Ph R4= H 87a: R1=H, R2=Ph, R3=Ph N H N H OO Cl CPUYL064 HN NNH N NH NH Hinge region Hinge region Hinge region FUSED PHARMACOPHORE N N H N H O OR N N H Ar N H OR HN N + Ar= Ph, furan, thiophene 99 100 94 70 Multicomponent Reactions in Antimitotic Drug Discovery Current Topics in Medicinal Chemistry, 2014, Vol. 14, No. 20 2225 Scheme 14. Synthesis of dihydropyrazolo[3,4-b]pyridines and benzo[4,5]imidazo[1,2-a]pyrimidines. against two targets compare to dihydropyrazolo[3,4b]pyridines 99 and showed more potent anti-proliferative activities against the HCT116 cell line with IC50 ranging from 4.9 to 11.5 μM (Fig. 10). As shown in Figs. (11) and (12), compound 100b interacts with KSP through a cavity formed by Glu116, Gly117, Glu118, Trp127, Ala133, Ile136, Pro137, Tyr211, Leu214 and Glu215, and forms a hydrogen bond with the main oxygen chain of the residue Gly117. The furan group of compound 100b interacted mainly with a cooperative minor pocket surrounded by Arg221 and Ala218. Furthermore, compound 100b establishes interactions with the hinge region of aurorakinase through the benzo [4,5]imidazo[1,2-a]pyrimidine ring, forming two H-bonds with the main chain of Ala213 as well as hydrophobic interactions with the surrounding residues, including Leu139, Val147, Ala160, and Leu263. FUTURE DIRECTIONS. INTEGRATION OF MULTICOMPONENT REACTIONS AN STRUCTUREBASED-DRUG DESIGN MCRs not only can reduce the time and effort required for the synthesis of drugs already in clinical phase (shortening the number of reaction steps), but the integrated application of structure-based design (SBDD) and MCRs can produce synergistic improvements in the efficiency of drug discovery. The increasing structural information available for many of the new antimitotic targets (mainly crystallographic and NMR structures of mitotic targets (such as Polo, Aurora, KSP and others) will enable the discovery of new ligands in the coming years, even more potent and selective for each of the targets, SBDD and targeted oriented synthesis. In this regard, the methodologies based on High Throughput Synthesis (including MCRs) are tools of great value not only to accelerate the synthesis of new candidates but also for target validation. At first glance, it might be thought that MCRs and SBDD are two somewhat conflicting tools, because while the former is aimed at the synthesis of large collections of molecules (MCRs can potentially produce millions of compounds, more than are desired or useful by parallel synthesis), the later attempts to select few molecules that are active on a target in question. The limitations and strengths of structure-based design and MCRs are complementary. Structure-based drug design address the problem of which Fig. (10). Inhibitory activities and anti-proliferative activities against the HCT116 for compounds 99a, 99b, 100a and 100b. N HN NH2 HN O O R2 +R1 CHO N H HN N O N H R1 N N H N O N H R1 HN O O R2 +R1 CHO +N H N NH2 R2 R2 + dihydropyrazolo[3,4-b]pyridines benzo[4,5]imidazo[1,2-a]pyrimidines 95 96 97 95 96 98 99 100 N H N H O O HN N OCH3 N N H N H O O N OCH3 2.46 7.58 8.71 5.65 6.15 4.96 KSP IC50 (μM) Aurora-A (μM) HCT116 IC50 (μM) 0.001 9.25 >50 10.36 8.10 39.79 KSP IC50 (μM) Aurora-A (μM) HCT116 IC50 (μM) N H N H O O HN N F KSP IC50 (μM) Aurora-A (μM) HCT116 IC50 (μM) N N H N H O O N F KSP IC50 (μM) Aurora-A (μM) HCT116 IC50 (μM) 99a 100a 99b 100b 71 2226 Current Topics in Medicinal Chemistry, 2014, Vo l. 14, No. 20 Cores et al. Fig. (11). Model of compound 100b bound to the KSP. Docking simulation was performed using the program GOLD and the crystal structure of KSP (PDB code 1Q0B) [118]. Fig. (12). Model of compound 100b bound to the Aurora-A kinase. Docking simulation was performed using the program GOLD and the crystal structure of Aurora-A kinase (PDB code 2BMC) [117]. compounds should be prepared by making the search for new leads and development of SAR more directed and by scaling back the numbers of compounds that are synthesized but suffers from the inability to predict the energetic effects of even the most conservative modifications of a lead compound. As a consequence, it is necessary to synthesize many compounds to meet the objectives of a drug discovery program. MCRs addresses this limitation by providing the methodology to synthesize many compounds in parallel so that an extensive array of structure-activity relationships can be developed. The process begins with the design of a library and provides the initial synthesis of a small number of analogues. The process is an iterative one in which SAR data and structural data guide not only the iterative selection of library members for testing, but also the design of later generation library scaffolds. When sufficient SAR data has accumulated and the structures of target complexes with key templates and substituents have been determined, potent compounds with the desired “drug like” compositions are designed and synthesized using a structure-based recombination strategy (Fig. 13). It is expected that in the coming years, this strategy will lead to the discovery of promising new antimitotic drugs as seen for other anticancer targets [119, 120]. Fig. (13). The combination of structure-based design and MCRs can facilitate the generation of recombined compounds to rapidly produce potent compounds with maximum chemical and structural diversity. 72 Multicomponent Reactions in Antimitotic Drug Discovery Current Topics in Medicinal Chemistry, 2014, Vol. 14, No. 20 2227 CONCLUSION As an essential tool in the current landscape of drug discovery, the MCRs can generate high structural complexity in a single step synthesis starting from three or more reactives and can therefore accelerate the creation of libraries of smallmolecule targeted antimitotic drugs. The development of novel MCRs is an intellectually challenging task that considers not only the reactivity of the starting materials but also the reactivities of the intermediate molecules generated in situ, their compatibility, and their compartmentalization. There have been some efforts to synthesize antimitotic drugs in recent years by MCRs, but these attempts have mainly focused on the synthesis of drugs aimed to the interaction with microtubules, in many cases as analogues of natural products. However, targeted MCRs toward emerging new antimitotic targets are a powerful tool to obtain new clinically validated drugs in the coming years, and it will help to clarify the true potential of the antimitotic therapies. CONFLICT OF INTEREST The authors confirm that this article content has no conflict of interest. ACKNOWLEDGEMENTS This work was financially supported by the “Programa Sectorial de Investigacion Aplicada e i+d” of Galician Government (project: 10CSA234012PR). We also thank professors Maria del Carmen Lopez Santamaria and Xerardo García Mera by their support. REFERENCES [1] Kastan, M.B.; Bartek, J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature, 2004, 432, 316-323. [2] Rieder, C.L.; Maiato, H. 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University of Santiago de Compostela. Jenaro de la Fuente s/n, Campus Vida. Santiago de Compostela 15782 (Spain). E-mail: [email protected] b Dr. H. Gutiérrez-de-Terán. Department of Cell and Molecular Biology, Uppsala University. Biomedical Center, Box 596, 751 24 Uppsala (Sweden) c Dr. M. Prado, Harvard Medical School, Department of Cell Biology 240 Longwood Avenue, Boston, MA 02115 (USA) d Dr. B. Fernández-García, Prof. P. S nchez-Lazo, Instituto Universitario de Oncolog a del Principado de Asturias (IUOPA), Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Oviedo, Campus of “El Cristo”. Santiago Gasc n Building, 33006 Oviedo (Spain). e Dr. S. Novio, Prof. M. J. Nuñez, Prof. M. Freire-Garabal. Department of Pharmacology, University of Santiago de Compostela Lennart Levi Stress and Neuroimmunology Laboratory, School of Medicine, C/San Francisco, s/n. Santiago de Compostela, 15782 (Spain). f Prof. E. Sotelo, Prof. X. García-Mera, Prof. A. Coelho. Department of Organic Chemistry, University of Santiago de Compostela. Avda. das Ciencias, s/n. Campus sur Santiago de Compostela, 15782 (Spain). Contribución específica en la publicación: Metodología e investigación: planteamiento y desarrollo de los experimentos químicos en laboratorio para la obtención de las quimiotecas. Caracterización de los compuestos. Adquisición y análisis de datos. Índices de calidad: Q2 (15/59) en el área de Medicinal Chemistry en 2014. Índice de impacto: 3,0. Artículo de investigación, correspondiente al Capítulo 2 de esta memoria. 78 about six times more potent than its enantiomer 21, whereas 22 is about seven times more potent than its enantiomer 23. With regard to mitotic arrest, only 20 and 22 show G2/M blockage (Table 2, Entries 15 and 17), whereas 21 and 23 show no such blockage (entries 16 and 18). Further assignment of enantiomeric configurations should provide more clues for the hitto-lead process in these series. Conclusion In silico design was followed by the synthesis of a series of molecules devoted to inhibition of Eg5 KSP by mean of the multicomponent U-4CR reaction. The pharmacological results demonstrate the efficiency of such a multidisciplinary approach: with the synthesis of only 18 compounds, we obtained compounds with KSP-Eg5 inhibitory activities much higher than that of the reference compound monastrol and comparable with that of STLC. In particular, compounds 20 and 22 are promising hits for the development of a hit-to-lead program based on multicomponent reactions, currently being undertaken in our labs with the goal of obtaining highly potent KSP inhibitors that could be used to treat tumors that display resistance to current chemotherapeutic treatments. Experimental Section Computational details: Molecular dockings were performed with GOLD v5 software[28] with the following parameters, which were tested in a re-docking experiment with the inhibitor co-crystallized with KSP (PDB ID: 2GM1[21] used for docking reported here). All ligands were prepared by use of the LigPrep program in the Schrçdinger suite,[29] which allows the protonation of the compounds and generation of all possible diastereoisomers and outputs a minimized 3D structure in each case. Protein preparation was performed with Hermes (GOLD graphical interface), including hydrogen addition and accepting default charge state for titratable residues. Three water molecules close to the ligand were kept and treated by default “spinning” options, in addition to the ADP molecule and the two Mg2+ions (see Figure 1A). The search space was defined as the surface within 6  of the co-crystallized ligand, ensuring a proper search grid in the binding site of the receptor. Twenty genetic algorithm runs were performed for each ligand, with use of ChemScore-kinase as the scoring function. Solutions were clustered with a 2  RMSD tolerance, and the best scored pose within a given cluster was selected as a representative solution, provided that it was at least within the three best-ranked compounds. Chemistry General: Commercially available starting materials and reagents were purchased and used without further purification, from freshly opened containers. Polystyrene-supported p-toluenesulfonic acid (PS-p-TsOH) was purchased from Aldrich. All solvents were purified and dried by standard methods. Organic extracts were dried with anhydrous Na2SO4. The reactions were monitored by TLC with Merck silica gel strips (GF 254, 2.5 mm); purified compounds each showed a single spot. Unless stated otherwise, UV light and/or iodine vapor were used for the detection of compounds. The synthesis and purification of all compounds were accomplished with equipment routinely available in organic chemistry laboratories for parallel synthesis. Most of the preparative experiments were performed in coated Kimble vials with a PLS (64) Organic Synthesizer and orbital stirring. Purification of isolated products was carried out by column chromatography or with an ISCO Combiflash system that employs prepacked silica gel columns. Specific optical rotations for compounds 20,21,22 and 23 were determined with a Jasco P-2000 apparatus. Compounds were routinely characterized by spectroscopy and elemental analysis. Melting points were determined with a Gallenkamp melting point apparatus and are uncorrected. The NMR spectra were recorded on AM 300 MHz (1H) and XM 500 75 MHz (13C) spectrometers (Bruker). Chemical shifts are given as dvalues against tetramethylsilane as internal standard, and Jvalues are given in Hz. Mass spectra were obtained with a Varian MAT-711 instrument. High-resolution mass spectra (HRMS) were obtained with an Autospec Micromass spectrometer. General procedure to obtain compounds 6–19: The appropriate mono-Boc-protected ortho-phenylenediamine analogue 2 (0.5 mmol) in methanol (1 mL), molecular sieves (4 ) and the appropriate aldehyde 1(1 mmol) were placed in that order in a 7 mL Kimble vial. The mixture was allowed to stir at room temperature overnight. Then, the appropriate acidic component 3(0.5 mmol), methanol (1 mL) and the appropriate isocyanide 4(0.5 mmol) were added, and the mixture was left stirring at room temperature with monitoring of the reaction by thin-layer chromatography (TLC) until total consumption of the starting products (24–72 h). After the Ugi adduct formation, dichloromethane (4 mL) and PS-TsOH resin (1.5 mmol) were added to the vial, and the reaction mixture was allowed to stir for one hour at room temperature. Once that time had elapsed, the resin was filtered in a Manifold-Visiprep filtration system, with washing alternately and three times each with methanol (4 mL) and dichloromethane (8 mL). The filtrate was collected in a round-bottomed flask, and the solvent was evaporated to dryness to give the appropriate intermediate 5as a pale colorless oil or a white solid. This crude Ugi adduct (without any prior purification) was dissolved in 1,2-dichloroethane (DCE, 5 mL). DCE/trifluoroacetic acid (5:1, 12 equiv TFA) was then added, and the mixture was allowed to stir at room temperature for a minimum of 6 h to afford the cyclized product, with monitoring of reaction progress by TLC. After the reaction, the mixture was converted to basic pH by addition of a saturated solution of potassium carbonate. The product was extracted three times, the first fraction being obtained from Figure 3. Detailed binding modes of S(magenta) and R(green) enantiomers corresponding to the pair of compounds 20 and 21. Hydrogen bonds are indicated with dashed lines.  2014 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim ChemBioChem 2014,15, 1471 – 1480 1476 CHEMBIOCHEM FULL PAPERS www.chembiochem.org 85 CH2Cl2, and the next two by washing the aqueous phase with ethyl acetate (20 mL2). The organic phases were pooled, dried with sodium sulfate, filtered and concentrated to dryness. The final solid or oily residue was purified by column chromatography with hexane/ethyl acetate to give compounds 6–19. General procedure to obtain compounds 20 and 21 starting from diastereoisomers 16 and 17 (the same procedure applies to compounds 22 and 23, starting from diastereoisomers 18 and 19): The diastereoisomer pairs 16–17 and 18–19 were separated by column chromatography, thus providing four diastereoisomers as pure compounds. Each stereoisomer (compounds 16 and 17, 0.5 mmol) was dissolved in dichloromethane (8 mL), MnO2(10 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1–4 h. After the reaction, the mixture was filtered with a Visiprep filtration system and the filtrate was concentrated to dryness (rotary evaporator) to give the two final enantiomers (16 gave 20;17 gave 21). Purification by column chromatography (AcOEt/hexane 1:2) gave the final compounds. Characterization data for compounds 6–23 Methyl 2-[2-(2-benzyl-5,6-dichloro-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)butanamido]acetate (6): M.p. 180–1828C (AcOEt/hexane 1:1); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): d=7.84 (s, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.36–7.25 (m, 5H), 4.99 (brs, 1H), 4.67–4.60 (m, 1H), 4.48 (d, J=16.1 Hz, 1H), 4.17 (d, J=16.1 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.62 (brs, 2H), 2.31–2.03 (m, 2H), 0.62 ppm (t, J=7.3 Hz, 3H); 13C NMR (CDCl3, 75.5 MHz): d=169.0, 167.7, 155.5, 142.2, 135.6, 132.6, 129.4, 128.6, 127.6, 127.0, 126.9, 120.8, 113.4, 60.6, 52.3, 41.2, 35.0, 22.7, 10.3 ppm; HRMS (ESI-FIATOF): m/zcalcd for C21H22Cl2N3O3: 434.1033 [M + H]+; found: 434.1029. Ethyl 2-[2-(2-benzyl-5,6-dichloro-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)butanamido]acetate (7): M.p. 178–1808C (AcOEt/hexane 1:1); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): d=7.76 (s, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.31–7.16 (m, 5H), 5.09 (brs, 1H), 4.58 (dd, J=5.6, 4.6 Hz, 1H), 4.40 (d, J=16.1 Hz, 1H), 4.13 (d, J=16.1 Hz, 1H), 4.03 (q, J=7.2 Hz, 2H), 3.57 (t, J=6.0 Hz, 2H), 2.29–2.17 (m, 1H), 2.06–1.90 (m, 1H), 1.10 (t, J=7.3 Hz, 3H), 0.62 ppm (t, J=7.3 Hz, 3H); 13C NMR (CDCl3, 75.5 MHz): d=168.5, 167.6, 155.5, 142.2, 135.6, 132.6, 129.4, 128.6, 127.6, 127.1, 126.9, 120.8, 113.5, 61.5, 60.7, 41.3, 35.0, 22.7, 13.9, 10.3 ppm; HRMS (ESIFIA-TOF): m/zcalcd for C22H24Cl2N3O3: 448.1189 [M + H]+; found: 448.1184. Methyl 2-[2-(2-benzyl-5,6-dichloro-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)pentanamido]acetate (8): M.p. 171–1738C (AcOEt/hexane 1:1.5); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): d=7.79 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.35–7.10 (m, 5H), 5.22 (brs, 1H), 4.58 (dd, J=5.3, 4.7 Hz, 1H), 4.45 (d, J=15.6 Hz, 1H), 4.13 (d, J=15.6 Hz, 1H), 3.62 (s, 3H), 3.57 (t, J=6.0 Hz, 2H), 2.27–2.19 (m, 1H), 2.03–1.82 (m, 1H), 1.12–1.01 (m, 2H). 0.81 ppm (t, J=5.2 Hz, 3H); 13C NMR (CDCl3, 75.5 MHz): d=169.1, 167.8, 155.3, 142.1, 135.5, 132.7, 129.4, 128.5, 127.6, 127.0, 126.8, 120.7, 113.4, 59.1, 52.3, 41.2, 34.9, 31.4, 19.3, 13.5 ppm; HRMS (ESI-FIATOF): m/zcalcd for C22H24Cl2N3O3: 448.1189 [M + H]+; found: 448.1196. Ethyl 2-[2-(2-benzyl-5,6-dichloro-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)pentanamido]acetate (9): M.p. 161–1638C (AcOEt/hexane 1:1.5); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): d=7.83 (s, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.35–7.30 (m, 2H), 7.26–7.22 (m, 3H), 4.95 (brs, 1H), 4.71 (dd, J=5.6 Hz, 4.3 Hz, 1H), 4.48 (dd, J=15.8 Hz, 1H), 4.19 (d, J=15.8 Hz, 1H), 3.63 (t, J= 5.3 Hz, 2H), 4.05 (m, 2H), 2.26–2.18 (m, 1H), 2.16–2.00 (m, 1H), 1.14 (t, J=5.9 Hz, 3H), 1.10–0.86 (m, 2H), 0.82 ppm (t, J=5.3 Hz, 3H); 13C NMR (CDCl3, 75.5 MHz): d=168.6, 167.7, 155.3, 142.2, 135.6, 132.8, 129.4, 128.5, 127.6, 127.0, 126.8, 120.8, 113.4, 61.5, 59.2, 41.3, 35.0, 31.5, 19.3, 13.9, 13.5 ppm; HRMS (ESI-FIA-TOF): m/z calcd for C23H26Cl2N3O3: 462.1351 [M + H]+; found: 462.1349. Methyl 2-[2-(2-benzyl-5,6-dibromo-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)butanamido]acetate (10): M.p. 187–1888C (AcOEt/hexane 1:1.5); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): d=8.03 (s, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.36–7.25 (m, 5H), 4.99 (brs, 1H), 4.65–4.60 (m, 1H), 4.48 (d, J=16.0 Hz, 1H), 4.18 (d, J=16.0 Hz, 1H), 3.63 (s, 3H), 3.62 (t, J=5.8 Hz, 2H), 2.31–2.03 (m, 2H), 0.63 ppm (t, J=7.3 Hz, 3H); 13C NMR (CDCl3, 75.5 MHz): d= 194.5, 186.5, 169.0, 167.7, 155.4, 143.1, 135.5, 129.4, 128.6, 127.6, 124.0, 118.4, 116.5, 60.5, 41.1, 41.0, 34.9, 22.7, 10.3 ppm; HRMS (ESIFIA-TOF): m/zcalcd for C21H22Br2N3O3: 522.0022 [M + H]+; found: 522.0016. Ethyl 2-[2-(2-benzyl-5,6-dibromo-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)butanamido]acetate (11): M.p. 193–1948C (AcOEt/hexane 1:1.5); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): d=7.99 (s, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.35–7.22 (m, 5H), 5.26 (brs, 1H), 4.67–4.62 (m, 1H), 4.43 (d, J=16.4 Hz, 1H), 4.18 (d, J=16.4 Hz, 1H), 3.62 (q, J=7.3 Hz, 2H), 3.67–3.62 (m, 2H), 2.28– 2.05 (m, 2H), 1.17 (t, J=7.4 Hz, 3H), 0.59 ppm (t, J=7.3 Hz, 3H); 13C NMR (CDCl3, 75.5 MHz): d=168.6, 167.7, 155.4, 143.2, 135.5, 133.6, 129.4, 128.6, 127.6, 124.1, 118.4, 118.1, 116.5, 61.5, 60.7, 41.3, 34.9, 22.7, 14.0, 10.3 ppm; HRMS (ESI-FIA-TOF): m/zcalcd for C22H24Br2N3O3: 536.0179 [M + H]+; found: 536.0164. Ethyl 2-[2-(2-benzyl-5,6-dibromo-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)-2-cyclopropylacetamido]acetate (12): M.p. 160–1638C (AcOEt/hexane 1:1.5); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): d=8.07 (s, 1H), 7.82 (s, 1H), 7.34– 7.19 (m, 5H), 6.05 (brs, 1H), 4.31 (d, J=4.0 Hz, 1H), 4.22–4.15 (q, J=7.1 Hz, 2H), 4.03 (d, J=10.2 Hz, 1H), 3.98–3.46 (m, 3H), 1.74– 1.68 (m, 1H), 1.26 (t, J=7.1 Hz, 3H), 0.93–0.87 (m, 1H), 0.41– 0.39 ppm (m, 2H), 0.59 to 0.50 (m, 1H); 13C NMR (CDCl3, 75.5 MHz): d=168.5, 167.2, 154.8, 140.9, 135.0, 133.8, 129.3, 128.5, 127.7, 123.2, 118.9, 118.6, 116.7, 64.2, 61.7, 41.5, 34.1, 14.0, 11.9, 6.7, 3.4 ppm; HRMS (ESI-FIA-TOF): m/zcalcd for C23H24Br2N3O3: 548.0179 [M + H]+; found: 548.0174. Ethyl 2-{2-[5,6-dibromo-2-(thiophen-2-ylmethyl)-1H-benzo[d]imidazol1-yl]butanamido}acetate (13): M.p. 185–1878C (AcOEt/hexane 1:1); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): d=8.04 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.21 (t, J= 3.1 Hz, 1H), 7.21 (dd, J=3.1, 1.4 Hz, 2H), 5.40 (brs, 1H), 4.77 (q J= 16.5 Hz, 1H), 4.60 (d J=16.5 Hz, 1H), 4.43 (q, J=16.5 Hz, 1H), 4.13 (q, J=7.3 Hz, 1H), 3.76 (t, J=5.9 Hz, 2H), 2.40–2.16 (m, 1H), 2.13– 2.04 (m, 2H), 1.19 (t, J=7.3 Hz, 3H), 0.68 ppm (t, J=7.3 Hz, 3H); 13C NMR (CDCl3, 75.5 MHz): d=168.7, 167.7, 154.6, 142.8, 137.5, 133.5, 127.5, 126.7, 125.6, 124.2, 118.7, 118.4, 116.6, 61.6, 60.7, 41.5, 29.3, 22.9, 14.0, 10.3 ppm; HRMS (ESI-FIA-TOF): m/zcalcd for C20H22Br2N3O3S: 541.9743 [M + H]+; found: 541.9730. Ethyl 2-[2-(2-benzyl-5,6-dibromo-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)pentanamido]acetate (14): M.p. 182–1848C (AcOEt/hexane 1:1); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): d=8.02 (s, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.36–7.24 (m, 5H), 4.98 (brs, 1H), 4.72 (dd, J=5.5, 4.4 Hz, 1H), 4.58 (d, J=16.0 Hz, 1H), 4.16 (d, J=16.0 Hz, 1H), 4.09 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.61 (dd, J= 5.5, 4.4 Hz, 2H), 2.27–2.17 (m, 1H), 2.06–1.93 (m, 1H), 1.17 (t, J= 7.1 Hz, 3H), 1.25–1.02 (m, 1H), 0.99–0.80 (m, 1H), 0.78 ppm (t, J= 7.1 Hz, 3H); 13C NMR (CDCl3, 75.5 MHz): d=168.6, 167.7, 155.2, 143.2, 135.5, 133.7, 129.4, 128.5, 127.6, 124.1, 118.4, 118.1, 116.5, 61.5, 59.2, 41.3, 35.0, 31.5, 19.3, 14.0, 13.5 ppm; HRMS (ESI-FIATOF): m/zcalcd for C23H26Br2N3O3: 550.0335 [M + H]+; found: 550.0333. Methyl 2-[2-(2-benzyl-5,6-dibromo-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)-2-cyclopentylacetamimido]acetate (15): M.p. 172–1748C (AcOEt/hexane 1:1); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): d=8.02 (s, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.36– 7.24 (m, 5H), 5.08 (brs, 1H), 4.70 (dd, J=5.5, 4.4 Hz, 1H), 4.46 (d,  2014 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim ChemBioChem 2014,15, 1471 – 1480 1477 CHEMBIOCHEM FULL PAPERS www.chembiochem.org 86 J=15.5 Hz, 1H), 4.16 (d, J=15.5 Hz, 1H), 4.09 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.63 (s, 3H), 2.29–2.20 (m, 1H), 2.05–1.97 (m, 1H), 1.26–1.15 (m, 3H), 1.12–0.96 (m, 1H), 0.83–0.74 ppm (m, 3H); 13C NMR (CDCl3, 75.5 MHz): d=168.7, 167.9, 155.3, 143.1, 135.4, 133.6, 129.3, 128.5, 127.5, 123.9, 118.4, 118.1, 116.5, 61.5, 59.4, 41.3, 34.8, 29.2, 28.1, 22.1, 14.0, 13.7 ppm; HRMS (ESI-FIA-TOF): m/zcalcd for C24H28Br2N3O3: 564.0492 [M + H]+; found: 564.0477. Ethyl 2-(2-cyclopropyl-2-{5,6-dibromo-2-[(R)-hydroxy(phenyl)methyl]- 1H-benzo[d]imidazol-1-yl}acetamido)acetate—first diastereoisomer (16): M.p. 179–1828C (AcOEt/hexane 1:1.5); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): d=7.94 (s, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.40–7.35 (m, 5H), 6.28 (s, 1H), 6.08 (brs, 1H), 6.02 (brs, 1H), 4.32 (d, J=10.4 Hz, 1H), 4.12 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.94–3.80 (m, 2H), 1.90–1.75 (m, 1H), 1.32–1.26 (m, 1H), 1.22 (t, J=7.1 Hz, 3H), 0.90–0.80 (m, 1H), 0.78–0.60 (m, 1H), 0.45–0.25 ppm (m, 1H); 13C NMR (CDCl3, 75.5 MHz): d=169.7, 167.8, 155.9, 142.0, 139.2, 134.5, 128.8, 128.2, 126.1, 124.9, 123.8, 118.9, 118.0, 117.6, 70.0, 63.3, 61.7, 41.5, 14.0, 10.4, 6.3, 2.1 ppm; HRMS (ESI-FIA-TOF): m/zcalcd for C23H24Br2N3O4: 564.0128 [M + H]+; found: 564.0114. Ethyl 2-(2-cyclopropyl-2-{5,6-dibromo-2-[(R)-hydroxy(phenyl)methyl]- 1H-benzo[d]imidazol-1-yl}acetamido)acetate—second diastereoisomer (17): M.p. 86–888C (AcOEt/hexane 1:1.5); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): d=7.91 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.45–7.39 (m, 5H), 6.18 (s, 1H), 5.86 (brs, 1H), 5.10 (brs, 1H), 4.24 (d, J=9.9 Hz, 1H), 4.15 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.87 (dd, J=5.5 Hz, J=12.6 Hz, 1H), 3.64 (dd, J= 4.4 Hz, J=13.7 Hz, 1H), 1.78–1.72 (m, 1H), 1.34–1.28 (m, 1H), 1.22 (t, J=7.1 Hz, 3H), 0.90–0.81 (m, 1H), 0.45–0.32 ppm (m, 2H); 13C NMR (CDCl3, 75.5 MHz): d=169.4, 167.6, 156.4, 141.8, 139.4, 134.7, 129.0, 128.4, 126.3, 123.7, 118.9, 118.0, 117.3, 69.8, 63.8, 61.6, 41.3, 14.0, 12.0, 6.6, 3.2 ppm; HRMS (ESI-FIA-TOF): m/zcalcd for C23H24Br2N3O4: 564.0128 [M + H]+; found: 564.0114. Ethyl 2-(2-{5,6-dibromo-2-[(R)-hydroxy(phenyl)methyl]-1H-benzo[d]- imidazol-1-yl}pentanamido)acetate—first diastereoisomer (18): M.p. 151–1538C (AcOEt/hexane 1:1); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): d=7.94 (s, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.37–7.20 (m, 6H), 6.34 (s, 1H), 6.24 (brs, 1H), 4.94 (q, J=2.7 Hz, 1H), 4.07 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.93–3.75 (m, 2H), 2.26–2.14 (m, 1H), 1.32–1.26 (m, 1H), 1.16 (t, J=7.1 Hz, 3H), 0.87– 0.62 (m, 1H), 0.51 (t, J=6.3 Hz, 3H), 0.47–0.43 ppm (m, 1H,); 13C NMR (CDCl3, 75.5 MHz): d=169.6, 167.6, 156.2, 141.9, 138.8, 134.1, 128.8, 128.2, 126.1, 123.5, 119.0, 118.2, 117.7, 70.1, 61.6, 58.8, 41.4, 30.7, 18.9, 13.9, 13.3 ppm; HRMS (EI): m/zcalcd for C23H25Br2N3O4: 565.0012 [M]+; found: 565.0204. Ethyl 2-(2-{5,6-dibromo-2-[(R)-hydroxy(phenyl)methyl]-1H-benzo[d]- imidazol-1-yl}pentanamido)acetate—second diastereoisomer (19): Oil (AcOEt/hexane 1:1.5); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): d=7.87 (s, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.42–7.28 (m, 6H), 6.36 (s, 1H), 5.94–5.88 (brs, 1H), 5.01 (t, J=7.4 Hz, 1H), 4.07 (q, J=7.2 Hz, 2H), 3.93–3.83 (m, 1H), 3.57–3.49 (m, 2H), 2.22–2.15 (m, 1H), 1.75–1.76 (m, 1H), 1.28–1.20 (m, 1H), 1.18 (t, J=7.2 Hz, 3H), 0.73 ppm (t, J=3.9 Hz, 3H); 13C NMR (CDCl3, 75.5 MHz): d=169.5, 167.9, 156.8, 141.7, 139.3, 134.0, 128.4, 128.1, 126.4, 123.3, 119.0, 118.3, 117.4, 69.9, 61.6, 58.9, 41.2, 32.0, 19.3, 14.0, 13.5 ppm; HRMS (EI): m/zcalcd for C23H25Br2N3O4: 569.0171 [M]+; found: 565.0191. ( + )-Ethyl 2-[2-(2-benzoyl-5,6-dibromo-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)-2 cyclopropylacetamido]acetate (20):Oil (AcOEt/hexane 1:1.5); [a]25 D= 15.00 (c=0.30, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): d=8.24 (d, J= 8.8 Hz, 2H), 8.18 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.68 (t, J=7.6 Hz, 1H), 7.53 (t, J=7.6 Hz, 2H), 7.35 (brs, 1H), 4.78 (d, J=9.9 Hz, 1H), 4.18 (q, J= 7.0 Hz, 2H), 4.18 (m, 2H), 1.23 (d, J=7.0 Hz, 3H), 1.21–0.96 (m, 1H), 0.94–0.85 (m, 2H), 0.67–0.52 (m, 1H), 0.31–0.30 ppm (m, 1H); 13C NMR (CDCl3, 75.5 MHz): d=186.9, 173.8, 169.2, 167.5, 135.9, 134.6, 134.5, 131.4, 128.6, 126.2, 121.7, 119.5, 117.4, 114.7, 108.2, 65.0, 61.7, 41.7, 14.0, 12.0, 6.6, 3.6 ppm; HRMS (ESI-FIA-TOF): m/z calcd for C23H22Br2N3O4: 561.9972 [M + H]+; found: 561.9950; elemental analysis calcd (%): C 49.05, H 3.76, Br 28.37, N 7.46, O 11.36; found: C 49.04, H 3.75, Br 28.35, N 7.49, O 11.37. ()-Ethyl 2-[2-(2-benzoyl-5,6-dibromo-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)-2 cyclopropylacetamido]acetate (21): M.p. 82–848C (AcOEt/hexane 1:1); [a]25 D=22.28 (c=0.14, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): d=8.27– 8.24 (m, 2H), 8.19 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.71–7.66 (m, 1H), 7.54 (t, J=7.3 Hz, 2H), 7.34 (brs, 1H), 4.78 (d J=9.9 Hz, 1H), 4.23–4.01 (m, 4H), 1.24 (t, J=7.1 Hz, 3H), 0.99–0.85 (m, 2H), 0.67–0.55 (m, 2H), 0.32–0.29 ppm (m, 1H); 13C NMR (CDCl3, 75.5 MHz): d=186.9, 169.2, 167.5, 148.1, 142.2, 135.9, 135.0, 134.4, 131.4, 128.6, 126.2, 121.7, 119.5, 117.4, 65.0, 61.7, 41.7, 14.0, 11.99, 6.6, 3.6 ppm; HRMS (EI): m/zcalcd for C23H21Br2N3O4[M]+: 560.9899; found: 560.9908; elemental analysis calcd (%): C 49.05, H 3.76, Br 28.37, N 7.46, O 11.36; found: C 49.02, H 3.76, Br 28.34, N 7.50, O 11.40. ( + )-Ethyl 2-[2-(2-benzoyl-5,6-dibromo-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)pentanamido]acetate (22): M.p. 69–738C (AcOEt/hexane 1:1); [a]25 D= 65.19 (c=0.17, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): d=8.27–8.22 (m, 2H), 8.15 (d, J=1.1 Hz, 1H), 8.09 (d, J=2.2 Hz, 1H), 7.72–7.67 (m, 1H), 7.58–7.52 (m, 2H), 7.46–7.42 (t, J=5.5 Hz, 1H), 5.56 (dd, J= 7.0 Hz, J=1.6 Hz, 1H), 4.16 (q, J=7.1 Hz, 2H), 4.04–3.93 (m, 2H), 2.22–2.17 (m, 2H), 1.19 (t, J=7.1 Hz, 3H), 1.15–0.90 (m, 2H), 0.78 ppm (t, J=7.1 Hz, 3H); 13C NMR (CDCl3, 75.5 MHz): d=186.7, 169.0, 167.9, 148.7, 142.2, 135.6, 134.7, 134.1, 131.4, 128.6, 126.0, 121.8, 119.9, 118.2, 61.5, 59.2, 41.6, 30.6, 19.0, 14.0, 13.3 ppm; HRMS (EI): m/zcalcd for C23H23Br2N3O4: 563.0055 [M]+; found: 279.0067; elemental analysis calcd (%): C 48.87, H 4.10, Br 28.27, N 7.43, O 11.32; found: C 48.86, H 4.10, Br 28.28, N 7.41, O 11.34. ()-Ethyl 2-[2-(2-benzoyl-5,6-dibromo-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)pentanamido]acetate (23): M.p. 96–988C (AcOEt/hexane 1:1); [a]25 D= 69.65 (c=0.15, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): d=8.27 (d, J= 8.8 Hz, 2H), 8.16 (d, J=3.8 Hz, 2H), 7.74–7.68 (m, 1H), 7.59–7.54 (m, 2H), 7.41 (t, J=5.0 Hz, 1H), 5.56 (t, J=7.5 Hz, 1H), 4.14 (q, J= 7.2 Hz, 2H), 4.08–3.95 (m, 2H), 2.24 (q, J=7.1 Hz, 2H), 1.20 (t, J= 7.2 Hz, 3H), 1.10–0.95 (m, 2H), 0.80 ppm (t, J=7.2 Hz, 3H); 13C NMR (CDCl3, 75.5 MHz): d=186.8, 169.0, 167.8, 148.8, 142.3, 135.5, 134.8, 134.2, 131.4, 128.7, 126.2, 121.8, 119.9, 118.2, 61.5, 59.2, 41.6, 30.6, 19.0, 14.0, 13.3 ppm; HRMS (EI): m/zcalcd for C23H23Br2N3O4: 563.0055 [M]+; found: 279.0037; elemental analysis calcd (%): C 48.87, H 4.10, Br 28.27, N 7.43, O 11.32; found: C 48.86, H 4.12, Br 28.26, N 7.42, O 11.33. Functional evaluation Enzyme-linked inorganic phosphate assay: The in vitro KSP inhibitory activities of the compounds at 5 mmwere measured by use of a microtubule-activated ATPase end-point assay from Cytoskeleton[24] (Cat. No. BK053). The reaction was carried out in duplicate under the manufacturer’s conditions. Briefly, microtubules (2 mg), KSP (EG01, cytoskeleton, 0.4 mg), and inhibitor (5 mm) were placed in wells of 96-well half-area plates (Corning). The reactions were started with the addition of ATP (Sigma, 0.3 mm), incubated for 5 min at room temperature and terminated by the addition of CytoPhos reagent (70 mL). After 10 min of additional incubation at room temperature the plates were read at 650 nm with a Power Wave XS instrument (BioTek). All synthesized compounds, STLC (Calbiochem) and monastrol (Sigma–Aldrich) were dissolved in DMSO. All activities were measured against controls of DMSO at a final concentration of 0.06%.  2014 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim ChemBioChem 2014,15, 1471 – 1480 1478 CHEMBIOCHEM FULL PAPERS www.chembiochem.org 87 For IC50 measurements we used a microtubule-activated ATPase kinetic assay (BK060, Cytoskeleton) with wells of a one-half-area 96well plate, according to the manufacturer’s instructions. Reactions were started by the addition of ATP and were read every 30 s at 360 nm for a total of 20 min. The assay is based on an absorbance shift (330–360 nm) that occurs when 2-amino-6-mercapto-7-methylpurine ribonucleoside (MESG) is catalytically converted into 2amino-6-mercapto-7-methylpurine in the presence of inorganic phosphate (Pi) and purine nucleoside phosphorylase (PNP).[30] The Vmax rate was calculated from the eight consecutive absorbance readings with the greatest slope. Cell culture and cytotoxicity assay: HeLa cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with FBS (10%) and penicillin/streptomycin (5%) under a humidified atmosphere (5% CO2)at378C. Exponentially growing cells were seeded into 96-well microtiter plates (8000 cells per well) and precultured for 1 day. Cells were treated with different concentrations of compounds to be tested for 24 to 72 h. Medium containing DMSO (5%) was used as negative control. The cytotoxic activity was determined by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) colorimetric assay.[31] The absorbance at 570 nm was determined with a plate reader. Cytotoxicities were expressed as IC50 values (mgmL1), these being the concentration of each compound that reduced the number of viable cell by 50%. In every case the value represents the mean of three independent determinations. Flow cytometry: To measure the percentages of cells in G2M, 2 105HeLa cells were grown for 24 h and treated with 20, STLC or monastrol (dissolved in DMSO) at the concentrations indicated (0.1–150 mm) for another 17 h. All compounds were dissolved in DMSO. The final DMSO concentration was 0.06%. Cells were collected by trypsinization, washed with PBS and incubated sequentially by Vindelov’s technique in buffer A [Tris·HCl (pH 7.6, 0.5 mm), NP-40 (0.1%, v/v), trisodium citrate (3.4 mm), spermine (1.5 mm), trypsin (Sigma–Aldrich, 30 mgmL1), 300 mL] for 10 min, in buffer B [Tris·HCl (pH 7.6, 0.5 mm), NP-40 (0.1%, v/v), trisodium citrate (3.4 mm), spermine (1.5 mm), trypsin inhibitor (500 mgmL1), RNase A (Sigma–Aldrich, 100 mgmL1), 250 mL] for 10 min and in buffer C [Tris·HCl (pH 7.6, 0.5 mm), NP-40 (0.1%, v/v), trisodium citrate (3.4 mm), spermine (4.83 mm), propidium iodide (416 mgmL1), 250 mL] for 10 min. Cell cycle was analyzed with a FACscan flow cytometer (Becton Dickinson). The percentages of cells in G2M were obtained from the histograms with the aid of ModFit LT software (Verity Software House), and values were entered into GraphPad Prism (GraphPad Software) to provide EC50 values by a nonlinear regression [log(agonist) vs. response—variable slope]. Immunofluorescence staining: HeLa cells were grown in four wells of adherent chamber slides (Lab-Tek II–CC2, NUNC) for 24 h and treated with the indicated compounds (dissolved in DMSO) for another 17 h under the same concentration as used for EC50 values obtained in G2/M blockage experiments. After treatment, cells were fixed by the conventional paraformaldehyde/methanol method and fixed with Triton X-100 (0.5%), glycine (20 mm) and NH4Cl (50 mm; all in PBS) for 10 min. HeLa cells were blocked by incubation in horse serum (2.5%) and Triton X-100 (0.1%) diluted in PBS for 30 min at RT. Afterwards cells were incubated O/N at 48C with anti-a-tubulin (Cat. No. CP06, Calbiochem) diluted 1:200 in 0.5% BSA in PBS. Next day, cells were incubated for 1 h at RT in the dark with anti-mouse-Alexa 488 diluted 1:1000 in blocking buffer. Finally, nuclei were stained for 5 min with DAPI (1 mgmL1) dissolved in PBS. Images were acquired with a confocal microscope (Ultra-Espectral Leica TCS-SP2-AOBS) and processed with the software ImageJ. Acknowledgements This work was financially supported by the “Programa Sectorial de Investigacion Aplicada e i+d” of the Galician Government (project: 10CSA234012PR). J. Azuaje thanks the Diputacin de la CoruÇa (Spain) for a post-doctoral position. Work at the IUOPA laboratory was supported by the Spanish Ministry of Science and Technology (MICINN)—Grant SAF2009-07227—and by the Plan Regional de Ciencia y Tecnologa del Principado de Asturias (PCTI)—Grant IB09-066. M.A.P. received a fellowship from the PCTI, and B.F. received a fellowship from IUOPA, supported by Obra Social Cajastur. We thank Julian Iglesias for helping with MTT and FACS experiments and Ana Salas for helping with FACS experiments. Keywords: antitumor agents ·drug design ·inhibitors · kinesin spindle protein ·multicomponent reactions [1] J. R. Jackson, D. R. Patrick, M. M. Dar, P. S. Huang, Nat. 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KGaA, 69451 Weinheim, 2014 Structure-Based Design of New KSP-Eg5 Inhibitors Assisted by a Targeted Multicomponent Reaction Carlos Carbajales,[a] Miguel ngel Prado,[c] Hugo Gutirrez-de-Tern,[b] ngel Cores,[a] Jhonny Azuaje,[a] Silvia Novio,[e] Mara Jesffls NuÇez,[e] Beln Fernndez-Garca,[d] Eddy Sotelo,[a, f] Xerardo Garca-Mera,[f] Pedro Snchez-Lazo,[d] Manuel Freire-Garabal,[e] and Alberto Coelho*[a, f] cbic_201402089_sm_miscellaneous_information.pdf 91 6(&7,21 6WUXFWXUDOVWXG\RIDOO3'%HQWULHVRI.63ZLWKDQ\OLJDQG 3'% /,*$1' [ 0RQDVWRO JP $= NHQ 6-WULW\O-/-F\VWHLQH [U YHU\VLPLODUWRNHQ [DH YHU\VLPLODUWRNHQ JT K IO  NH HQDVWURO IPH TF NE WHWUDKLGUR-EHWD-FDUEROLQH IN\  T\  IO  T]  \UV ELV LHK 5-PRQ OK (0' X\P  X\L  SJ  FMR  [F 6-HQDVWURO [H 6-IOXRUDVWURO [G 6-GLPHWK\OHQDVWURO 92 SECTION 2 Antiproliferative effect of compounds 9, 12, 20,21,22,23 towards HeLa cells as determined by the MTT assay. SURVIVAL RATE CONCENTRATION (µM) 24h 48h 72h Comp. 23 25 91.3 (5.02) 86.4 (4.27) 81.54 (3.36) 50 74.72 (3.81) 51.27 (1.95) 42.63 (5.94) 60 61.29 (3.19) 41.74 (2.86) 36.3 (4.38) 75 39.51 (4.14) 20.92 (5.03) 17.29 (6.42) 100 28.65 (5.06) 10.27 (3.73) 8.02 (3.04) Comp. 21 20 71.03 (7.05) 62.21 (7.18) 59.45 (8.04) 22.5 60.44 (6.42) 55.77 (4.16) 48.24 (3.62) 25 50.91 (4.52) 44.82 (6.47) 38.2 (5.2) 40 19.97 (6.71) 11 (5.11) 9.21 (5.37) 50 9.33 (4.27) 7.83 (6.28) 7.01 (5.03) Comp. 9 5 95.05 (9.13) 92.17 (6.03) 87.26 (8.27) 10 79.19 (7.27) 73.45 (4.28) 71.2 (6.25) 12.5 67.25 (7.36) 62.23 (7.3) 60.82 (5.37) 15 51.73 (4.26) 49.64 (8.26) 45.28 (7.34) 20 18.4 (6.67) 13.91 (6.31) 11.42 (4.23) Comp. 12 2.5 90.11 (8.27) 86.18 (4.04) 78.21 (5.13) 5 73.19 (7.36) 68.63 (5.95) 59.38 (3.27) 10 64.28 (8.21) 54.8 (3) 47.22 (3.36) 15 52.25 (8.31) 46.87 (4.28) 39.77 (3.31) 20 41.81 (5.52) 34.19 (6.61) 31.03 (6.28) Comp. 22 2.5 69.98 (4.42) 61.67 (4.46) 57.16 (2.94) 5 59.32 (6.01) 51.57 (7.17) 48.01 (4.02) 10 56.4 (4.27) 48.1 (6.28) 46.93 (7.28) 15 41.04 (5.58) 36.81 (7.37) 34 (7.37) 20 30.02 (2) 24.71 (2.25) 21.42 (5.5) Comp. 20 1 79.98 (5.16) 76.49 (4.16) 70.92 (5.15) 2.5 69.44 (5.37) 65.01 (8.38) 58.72 (7.33) 5 44.09 (6.83) 37.28 (7.22) 31.3 (6.01) 10 24.47 (5.16) 18.66 (4.37) 15.01 (8.37) 20 6.82 (7.28) 4.61 (6.81) 2.91 (6.22) Monastrol 75 96.62 (4.13) 93.32 (9.15) 92.02 (7.55) 90 83.53 (9.05) 79.52 (9.27) 74.27 (8.43) 95 60.37 (7.16) 51.02 (5.26) 49.31 (4.31) 100 52.44 (7.26) 47.77 (4.57) 46.18 (4.33) 125 48.59 (6.71) 45.26 (5.67) 42.91 (5.73) STLC 0.5 11.02 (2.15) 19.83 (3.62) 31.55 (4.61) 1 23.87 (3.06) 36.48 (5.15) 46.14 (5.37) 2 42.13 (5.27) 49.49 (7.02) 53.23 (7.29) 3 50.73 (7.36) 54.61 (5.14) 61.08 (6.46) 4 63.03 (6.78) 68.11 (6.3) 72.47 (4.23) 93 Antiproliferative effect of compounds 9, 12, 20,21,22,23 towards HeLa cells as determined by the MTT assay. Cells were treated with benzimidazoles at different concentrations and times (24, 48, and 72 h). Monastrol and STLC were used as positive controls. Growth inhibition was determined by a MTT assay and shown as cytotoxicity rates (%)=[1-(OD of the test samples/OD of the negative control)]x100%. n=3. Mean ± SEM. 94 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 PUBLICACIÓN 3: Multicomponent Assembly of the Kinesin Spindle Protein Inhibitor CPUYJ039 and Analogues as Antimitotic Agents Carlos Carbajales,† Junichi Sawada,‡ Giovanni Marzaro,§ Eddy Sotelo,†,∥ Luz Escalante,†, Antonio Sánchez-Díaz Marta,† Xerardo García-Mera,∥ Akira Asai,‡ and Alberto Coelho*,†,∥ Revista: ACS Combinatorial Science Editorial: American Chemical Society ISSN: 2156-8944 Año de publicación: 2017 Volumen: 19 Número: 3 Páginas: 153-160 DOI: https://doi.org/10.1021/acscombsci.6b00166 †Center for Research in Biological Chemistry and Molecular Materials, University of Santiago de Compostela, Jenaro de la Fuente s/n, Campus Vida, Santiago de Compostela 15782, Spain ‡Graduate School of Pharmaceutical Sciences, University of Shizuoka, Suruga-ku, Shizuoka 422-8526, Japan §Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, University of Padova, Via Marzolo 5, 35131 Padova, Italy ∥Department of Organic Chemistry, Faculty of Pharmacy, University of Santiago de Compostela, Avenida das Ciencias, s/n, Campus sur, Santiago de Compostela 15782, Spain. Contribución específica en la publicación: Metodología e investigación: planteamiento y desarrollo de los experimentos químicos. Caracterización de los compuestos. Adquisición y análisis de datos. Índices de calidad: Q1 en Chemistry Applied 16/72 en ese año de publicación. Índice de impacto: 3,5. Artículo de investigación, correspondiente al Capítulo 3 de esta memoria. 149 Multicomponent Assembly of the Kinesin Spindle Protein Inhibitor CPUYJ039 and Analogues as Antimitotic Agents Carlos Carbajales, † Jun-ichi Sawada, ‡ Giovanni Marzaro, § Eddy Sotelo, †,∥ Luz Escalante, † Antonio Sa nchez-Díaz Marta, † Xerardo García-Mera, ∥ Akira Asai, ‡ and Alberto Coelho* ,†,∥ † Center for Research in Biological Chemistry and Molecular Materials, University of Santiago de Compostela, Jenaro de la Fuente s/n, Campus Vida, Santiago de Compostela 15782, Spain ‡ Graduate School of Pharmaceutical Sciences, University of Shizuoka, Suruga-ku, Shizuoka 422-8526, Japan § Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, University of Padova, Via Marzolo 5, 35131 Padova, Italy ∥ Department of Organic Chemistry, Faculty of Pharmacy, University of Santiago de Compostela, Avenida das Ciencias, s/n, Campus sur, Santiago de Compostela 15782, Spain * SSupporting Information ABSTRACT: The potent kinesin spindle protein inhibitor CPUYJ039 and a set of analogues were prepared by a targetoriented approach based on a Ugi reaction that uses 2nitrophenyl isocyanides as key building blocks. The herein documented strategy provides straightforward and atom economical access to potent benzimidazole-based antimitotic agents by exploring the versatility and exploratory power of the Ugi reaction. The results of docking studies and biological activity evaluations of the benzimidazole compounds are also reported. KEYWORDS: kinesin spindle protein inhibitor, CPUYJ039, antimitotic agent, Ugi reaction ■INTRODUCTION Mitosis is a highly regulated and orchestrated process in which various proteins are responsible for the accurate inheritance of genetic materials, cytoplasmic organelles, and cell membrane into two daughter cells. Among the proteins, kinases 1 and kinesins 2 have emerged as valuable targets for cancer therapeutics in the past decade because they play key roles in mitosis and tumor development. Kinesin Spindle Protein (KSP, also known as Eg5) 3 is a plus-end-directed motor protein of the kinesin-5 subfamily, and it is essential for the proper separation of spindle poles during mitosis. 4 The KSP-targeting agents selectively act on cells undergoing cell division, which means that they are mitosis-specific inhibitors. These proteins have attracted great interest due to a number of advantages, e.g., they have fewer side effects (such as no neurotoxicity) than tubulinbinding agents that inhibit overall microtubule-based processes. 3 S-Monastrol and S-trityl-L-cysteine (STLC), which are shown in Figure 1A, are the first small-molecule inhibitors of KSP, and they bind to an induced allosteric binding site close to the site of ATP hydrolysis, called the L5/α2/α3 pocket in the motor domain. 5 These compounds are frequently used as model ligands for the evaluation of anti-KSP activity. 3 However, the most advanced clinical trials (phase I and phase II clinical trials, either as monotherapies or in combination with other drugs) have been carried out using the prototypes that contain a central planar heterocycle attached to an exocyclic 2-(1-(N- (3-aminopropyl)benzamido)alkylic framework (Figure 1B), such as Ispinesib, 6 SB-743921, 7 pyrrolotrizine-1 (BMS-24), 8 AZD4877, 9 CK0106023, 10 and CPUYJ039, 11 all of which target the L5/α2/α3 pocket of KSP. 12 The presence of a basic amino or dimethylamino group at the end of the aminopropyl-type chain in these molecules often increases the specificity in targeting KSP. Another important element in these series is the benzoyl moiety attached to the exocyclic tertiary nitrogen, which improves the affinity for KSP through a better interaction in the so-called “cooperative pocket”. 12 This interaction causes a significant increase in the antimitotic activity, and it is not present in the other KSP inhibitors such as S-Monastrol and STLC. All of the compounds represented in Figure 1B, because of their complex chemical structures, require tedious linear synthetic routes in which the chemical diversity is introduced step by step. For instance, the linear syntheses of Ispinesib, 6c SB-743921, 7c and Pyrrolotrizine 8 require eight steps, and the preparation of AZDD4877 involves 13 transformations. 9 CPUYJ039 is a potent KSP inhibitor, and it contains benzimidazole as a central core. 11 Despite the high in vitro activity of this molecule (IC50 = 40 nM, KSP-ATPase test), 11 its cytotoxicity in HTC116 cells is low (EC50 = 2.30 μM). 11 You and co-workers proposed permeability problems as the cause of this low activity, 11 but this is unclear considering the good cellular activity shown by another series of similar benzimidazoles that target KSP. 13 The only experimental procedures described for the synthesis of CPUYJ039 and the related Received: October 30, 2016 Revised: January 16, 2017 Published: January 30, 2017 Research Article pubs.acs.org/acscombsci © 2017 American Chemical Society 153 DOI: 10.1021/acscombsci.6b00166 ACS Comb. Sci. 2017, 19, 153−160 150 amino-free benzimidazoles are linear 7or 8-step procedures, respectively, described by Boyce (Chiron Patent) 14 that uses 2nitroanilines as starting materials (Scheme 1). In an effort to facilitate the development of more potent and effective KSP inhibitors of this class, we started a research program aimed at a simple and efficient synthesis route for the preparation of CPUYJ039 and its benzimidazole derivatives. It was envisaged that this would also help to clarify some structure−activity relationships within this KSP inhibitor family. One of the key issues of the current drug development process concerns the high process cost, sustainability and viability of the synthetic routes necessary to obtain privileged structures. 15 Multicomponent reactions (MCRs) 16 offer attractive solutions for new programs based on parallel synthesis when compared to linear synthesis processes. The importance of the MCR-based transformations lies not only in the intrinsic ability to generate convergent diversity but also the possibility of different cyclization strategies to obtain new heterocycles from the adducts formed. There are several relevant examples in which antitumor drugs have been obtained through multicomponent strategies, such as the discovery of p53−MDM2 interaction inhibitors as a promising new approach for cancer treatment by an Ugi-based strategy, 17 and the application of the Biginelli-type three-component reaction to prepare a series of dihydropyrazolo[3,4-b]pyridines and benzo[4,5]imidazole[1,2-a]pyrimidines as dual KSP/ Aurora-A Kinase inhibitors. 18 Isocyanide-based multicomponent reactions (IMCRs) 16 have been widely used in drug discovery. 19 The paradigmatic Ugi four-component reaction (4CR) produces α-acylaminoamides that closely resemble dipeptides, and these can be further modified to access a rich array of skeletal diversity, in particular, rigidified scaffolds. 20 In 2004, Tron synthesized a series of quinazolinones, including the racemic Ispinesib, in four steps by exploring the reactivity of secondary amines in the Ugi reaction. 21 An alternative strategy for the construction of heterocycles by the cyclization of Ugi intermediates involves the use of suitably functionalized isocyanides as starting materials. Hulme’s group used N-Boc-ortho-phenylisocyanides (containing a masked amine group) as building blocks to perform the Ugi reaction for the synthesis of benzimidazoles. 22 However, the synthesis of CPUYJ039-free amine analogues by this strategy would require the use of two different protecting groups (for the amine and isocyanide components, respectively) and orthogonal deprotection steps because the use of 2-(N-Boc-amino)-phenylisocyanides as starting materials in conjunction with N-Bocprotected-3-aminoalkylamines for the Ugi reaction 22 leads to the generation of byproducts. Thus, we envisioned another alternative based on the use of 2-nitrophenyl isocyanides as starting materials for Ugi-4CRs, although this strategy has not been explored to any great extent. 23 The retrosynthetic pathways developed in the Chiron patent for the synthesis of CPUYJ039 and its amine-free analogues as well as our proposed methodology are highlighted in Scheme 1. In this study, we present a new synthetic route for straightforward access to the potent benzimidazole KSP inhibitor CPUYJ039 (in 2 steps) and related benzimidazole-free amine analogues (3 steps) using a Ugi-4CR/cyclization strategy with 2-nitrophenyl isocyanides (2-nitrophenyl isocyanide or 4-methoxy-2-nitrophenyl isocyanide) 23 (Scheme 2). This approach provides a considerable reduction of the synthetic pathway described in Figure 1. (A) S-Monastrol and STLC. (B) Some of the most important KSP inhibitors that contain the pharmacophoric N-(3-aminopropyl)-N-alkylbenzamide exocyclic fragment (highlighted in red). ACS Combinatorial Science Research Article DOI: 10.1021/acscombsci.6b00166 ACS Comb. Sci. 2017, 19, 153−160 154 151 the original Chiron patent (5 steps) for the preparation of such chemical structures. 14 ■RESULTS AND DISCUSSION To maximize the chances of obtaining compounds that were bioactive against the target kinesin KSP, we performed docking experiments using Surflex software on the L5/α2/α3 pocket of KSP and several crystallographic structures deposited in the Protein Data Bank: Ispinesib (PDB ID: 4AP0), SB-743921 (4AS7), and pyrrolotriazine-1 (2GM1) in complex with KSP. The binding poses (in 4AP0) were predicted for AZD4877, CK0106023, and CPUYJ039 (Figure S1) as well as for a small library including CPUYJ039 and 14 selected analogues (Figure 2) from 64 (2 ×2×4×4) possible combinations. The building blocks used for the starting Ugi reaction were selected to take into account the structural requirements of the assembled final benzimidazole structures for appropriate interaction with KSP, as suggested by docking studies. A basic aminopropyl moiety serves as a hydrogen bond donor for the carboxylate on Glu116. A cooperative binding pocket, mainly formed by Arg119, Ser120, Trp127, Asp130 and Ala133, accommodated the benzoyl moiety. Indeed, the functionalization with para-substituents (chloro, bromo and, in particular, methyl) enhanced the interaction with the target. Only small differences were predicted with respect to the alkyl side chains (ethyl, cyclopropyl, iso-propyl, tert-butyl), with a slight preference for the bulkier substituents. Finally, the pocket formed by Leu160, Leu171, Gly217, Ala218 and Arg221 (which was supposed to accommodate the benzimidazole moiety) offered a large enough space to bear the presence of substituents at position 5 or 6 (Figure 2). Further details and the predicted score for each compound are provided in the Supporting Information. The synthetic strategy employed to obtain CPUYJ039 (7a) and its analogues is represented in Scheme 2. It should be noted that the proposed method enables the synthesis of Ndimethylated compounds 7a−ias well as compounds containing a free amino group (8a−g). A sequence of two steps was used, and this comprised an Ugi-4CR reaction + NO2-reduction/cyclization and N-benzylation sequence. For the targeted benzimidazoles with a free amino group (8a−g)to be obtained, an extra deprotection step was required to remove the Boc group from the aminopropyl chain in compounds 7j− p. All of the starting materials used in this study are Scheme 1. (A) Retrosynthetic Approaches to CPUYJ039 and Free Amine Analogues by the Chiron Patent and (B) the Strategy Described Herein ACS Combinatorial Science Research Article DOI: 10.1021/acscombsci.6b00166 ACS Comb. Sci. 2017, 19, 153−160 155 152 commercially available. The use of 2-nitrophenyl isocyanides 1 as building blocks for the Ugi reaction (containing the nitro functionality as a masked internal amine group) is the key aspect of our strategy because it enables selective cyclization through the nearest carboxamido group in adducts 5. Compounds 5a−owere prepared by Ugi-4CR using equimolar amounts of the corresponding amine, aldehyde, acid, and 2-nitrophenyl isocyanide at room temperature (Scheme 2). Optimization of the process revealed that the solvent is a key factor for a successful reaction outcome. The Ugi reaction conducted in methanol did not proceed. However, the use of trifluoroethanol as a solvent allowed the reaction to proceed satisfactorily in a period of 24−48 h in most cases (Figure 3). Another important aspect is the preformation of the intermediate imine at low temperature (−20 °C) prior to addition of the remaining components (acid and isocyanide) of the reaction. The Ugi condensations proceeded well (only as a main reaction product; representative yields: 80% 5a and 78% 5b), and the standardization of the reaction conditions was successful for all of the combinations of building blocks used, although when 4-bromobenzoic acid was used as a reagent, the use of methanol as a cosolvent was needed and a longer reaction time (72 h) was required to complete the transformation. Two workup protocols were performed for Ugi adducts: A “catch and release”strategy [by using PS-TsOH as a scavenger for the Ugi intermediates (5a−i) that reacts through the basic dimethylamino group present in these compounds (catch) and subsequent treatment with DIPEA (release)] was performed to give pure Ugi compounds 5a−i(Method A). The workup of compounds containing an N-Boc-aminopropyl chain (5j−o) was carried out by combining the use of two supported reagents (PS-TsOH and PS-carbonate) to carry out the workup after the Ugi reaction, acting as scavengers for the eventual excess of amine and isocyanide (PS-TsOH) as well as acid (PScarbonate) at room temperature (Method B). Hydrogenation/ cyclization required the catalytic hydrogenation of the Ugi Scheme 2. Synthetic Route for Obtaining CPUYJ039 and Analogues with the Synthesis of Compounds 8a−g Carried out by a Final Treatment with TFA Figure 2. (A) Binding modes proposed for novel CPUYJ039 analogues in the L5/α2/α3 pocket of the KSP motor domain (see Supporting Information for further details). (B) Schematic binding mode for novel CPUYJ039 analogues. ACS Combinatorial Science Research Article DOI: 10.1021/acscombsci.6b00166 ACS Comb. Sci. 2017, 19, 153−160 156 153 adducts by using ammonium formate and Pd/C at 90 °C for 2 h to reduce the nitro group. The obtained amine was heated at 130 °C under microwave heating in a xylene/acetic acid mixture for 1 h to provide quick access to cyclic compounds 6a−oin moderate yields (30−50%). This cyclization and subsequent benzylation strategy not only provides Ndimethylated benzimidazoles 7a−iby a short and simple methodology but also gives the final free amine compounds Figure 3. A set of final synthesized compounds (yield of the first step (Ugi + cyclization)/yield of the second step (benzylation)/yield of the third step (deprotection of the Boc group)). ACS Combinatorial Science Research Article DOI: 10.1021/acscombsci.6b00166 ACS Comb. Sci. 2017, 19, 153−160 157 154 8a−gthrough smooth ring closure. Benzylation of compounds 6a−ousing NaH as base and benzyl bromide at 0 °C provided the dimethylated aminopropyl benzimidazoles 7a−ias well as the N-Boc analogues 7j−pin almost quantitative yields. In the case of the substituted 6-methoxybenzimidazole 6o,two benzylated regioisomers 7o−pwere formed in similar proportions (54% 7o/45% 7p) and unequivocally identified through NMR (see Figure S2). The final step in the synthesis of amine-free CPUYJ039 analogues was the deprotection of the BOC group on the aminopropyl chain in compounds 7j−p. This step was performed using a TFA/DCM (10%) solution at room temperature to give the benzimidazoles with a free amino group (8a−g) in almost quantitative yields. The structures of the obtained benzimidazoles and the partial yields for each of the stages of this focused chemical library synthesis of benzimidazoles are represented in Figure 3. The CPUYJ039 analogues synthesized by the new method described here were evaluated for cellular activity 24 using two human cancer cell lines, HCT116 and HeLa cells, which are summarized in Tables 1 and 2. The analogues having an Ndimethylated group, excluding CPUYJ039 (7a), exhibited no significant inhibition of cell proliferation even at 20 μM(Table 1). The N-dimethylated analogues generally produced less favorable profiles in cell proliferation inhibition than the analogues having a basic amine group. Analogues 8c−8g exhibited concentration-dependent anti-cell proliferation effects on both cell lines at concentrations above 1 μM(Figure S3). The three most potent analogues, 8d,8e, and 8g, having a tertiary butyl substituent at the R6position as well as a free amine group at the end of the aminopropyl chain in common, showed more potent anti-cell proliferation activities than those of CPUYJ039 and were also found to have higher antimitotic activity in the cell cycle analysis (Table 2). For example, treatment of HeLa cells with 8g for 20 h, corresponding to approximately one cell cycle, efficiently increased the population of mitotic cells, which began at 1 μM and reached a maximum level of 90% at 5 μM( Figure S3). Immunofluorescence microscopic observation of HeLa cells revealed that 8d,8e, and 8g induced monoastral spindles as their phenotypes, similar to the typical phenotype by KSP inhibitors such as STLC (Figure 4). The cellular activities of these compounds appear to be in agreement with their inhibitory abilities for the KSP ATPase (Table 2). Even in the initial library of CPUYJ039 analogues, 8d,8e, and 8g were found to be more potent antimitotic agents relative to CPUYJ039 and are comparable to STLC in terms of the inhibitory activities for KSP ATPase, cell proliferation, and the cell cycle. ■CONCLUSIONS A concise and efficient MCR-based approach has been optimized for the synthesis of benzimidazole-type KSP inhibitors as antimitotic agents. This procedure is based on an initial Ugi-4CR employing 2-nitrophenyl isocyanides, and it allows rapid access to the potent KSP inhibitor (CPUYJ039) and dimethylated analogues as well as its derivatives containing a free amino group as compared with the current linear synthesis procedures reported previously. The discovery of more optimized CPUYJ039 analogues indicates the power of our new MCR-based method that efficiently provides potential mitotic inhibitors targeting the KSP motor domain. ■EXPERIMENTAL PROCEDURES General Procedure for the Synthesis of Products 6a−i. Ugi Reaction. In a prerefrigerated Kimble vial (−20 °C), the corresponding aldehyde 4(1 mmol) was added to N1,N1dimethylpropane-1,3-diamine 2a (1 mmol) in trifluoroethanol (4 mL), and the mixture was stirred at room temperature for 10 min. Acid 3(1 mmol) and 2-nitrophenyl isocyanide 1a (1 mmol) were added separately. The mixture was stirred continuously at room temperature for 48 h, except those containing acid 3d as a building block (72 h). The reaction was monitored by TLC, and when the 2-nitro-phenyl-isocyanide had been consumed, the solvent was removed under reduced pressure. The residue was dissolved in 40 mL of a DCM/ MeOH (3:1) solution and treated with 3 mmol of PS-TsOH Table 1. IC50 Values (μM) of the CPUYJ039 Analogues and the References CPUYJ039 and STLC in Cell Proliferation Inhibition a HCT116 HeLa compound IC50 (μM) inhibition (%) at 20 μMIC 50 (μM) inhibition (%) at 20 μM 7b >20 <5 >20 6.7 7c >20 <5 >20 <5 7d >20 <5 >20 <5 7e >20 <5 >20 <5 71 >20 <5 >20 <5 7g >20 <5 >20 <5 7h >20 <5 >20 <5 7i >20 <5 >20 <5 8a >20 <5 >20 <5 8b 18 (0.71) 82 19 (0.79) 69 8c 3.1 (0.17) 92 5.3 (0.61) >95 8d 1.7 (0.20) 94 2.4 (0.34) >95 8e 1.9 (0.30) 94 2.4 (0.66) >95 8f 3.6 (0.54) >95 6.5 (0.52) 94 8g 1.0 (0.069) >95 1.3 (0.34) 94 CPUYJ039 b 2.3 b N.T. b , c STLC 0.49 d >95 0.91 d >95 a The values (μM) are the means of three independent experiments with standard deviations shown in parentheses. b Values previously reported by Jiang and co-workers. 11 The length of chemical treatment with cells in their experiments was 48 h, which is different from ours. c N.T.: not tested. d The values are consistent with previous studies. 25 Table 2. IC50 Values (μM) of 8d, 8e, and 8g and References CPUYJ039 and STLC in Mitotic Arrest and KSP ATPase a mitotic arrest KSP ATPase compound IC50 (μM) inhibition (%) IC50 (μM) inhibition (%) at 200 μM 8d 3.5 (0.68) 87 (8 μM) 9.4 (5.0) 82 8e 4.3 (0.20) 83 (8 μM) 10 (4.0) 86 8g 2.3 (0.11) 90 (5 μM) 1.8 (0.44) 92 CPUYJ039 b N.D. b , c 40 (16 μM) b 0.04 b STLC 1.3 d 93 (5 μM) 1.5 d 92 a The values (μM) are the means of three independent experiments with standard deviations shown in parentheses. b Values previously reported by Jiang and co-workers. 11 Their results indicate CPUYJ039 with a mitotic arrest IC50 value of >16 μM in the treatment of HCT116 cells with CPUYJ039 for 24 h. Their enzyme assay conditions were different from ours in the concentrations of KSP protein, microtubules, and ATP. c N.D.: not determined. d The values are consistent with previous studies. 25 ACS Combinatorial Science Research Article DOI: 10.1021/acscombsci.6b00166 ACS Comb. Sci. 2017, 19, 153−160 158 155 (0.8 mmol/g loading) (catch) and stirred for 1 h. The polymer was filtered offand washed with 50 mL of 5:1 DCM/MeOH and then treated with 10 mL of DIPEA (release) in 20 mL of DCM. The polymer was again filtered offand the filtrate was collected and evaporated to give adduct 5. Reduction and Cyclization. To a solution of Ugi adduct 5 (1 mmol) in dry degassed MeOH (5 mL) were added ammonium formate (5 mmol) and 100 mg of Pd/C, and the mixture was heated under reflux (90 °C) for 2 h in a sealed tube. After the starting material had been consumed (TLC control), the mixture was filtered through Celite and washed with dichloromethane, and the filtrate was evaporated under reduced pressure. The residue obtained in the previous step was placed in a microwave vial (Anton Paar) and treated with xylene/acetic acid (2,8 mL, 13:1) until the starting material had been consumed (1 h). The microwave vial was cooled to room temperature, and the mixture was diluted with EtOAc (15 mL) and washed (3×) with saturated Na2CO3(15 mL). The organic layer was dried over anhydrous Na2SO4and concentrated. The residue was purified in a Teledyne Isco CombiFlash Rf apparatus (hexane/EtOAc or EtOAc/MeOH) to afford the targeted benzimidazoles 6a−i. Biological Evaluations. The cell proliferation assays using cultured cells, the immunostaining assays for the antimitotic activity and phenotypes, and the in vitro ATPase assays using the KSP motor domain with microtubules are described in the Supporting Information. ■ASSOCIATED CONTENT * SSupporting Information The Supporting Information is available free of charge on the ACS Publications website at DOI: 10.1021/acscombsci.6b00166. NMR spectra of all compounds, supplementary data regarding the biological activities of 8d, 8e, and 8g, and experimental procedures for biological evaluations (PDF) ■AUTHOR INFORMATION Corresponding Author *Fax.: +34 881815704, Tel.: +34 88115739, e-mail: albertojose. [email protected]. ORCID Eddy Sotelo: 0000-0001-5571-2812 Alberto Coelho: 0000-0001-6514-3967 Notes The authors declare no competing financial interest. ■ACKNOWLEDGMENTS This work was financially supported by the “Programa Sectorial de Investigacion Aplicada e i+d”to A.C. (Project: 10CSA234012PR) as well as “Programa de Consolidacionde Unidades de Investigacion”(PS09/63-GPC2014/003) and Centro Singular de Investigacion de Galicia Accreditation 2016-2019 (ED431G/09) all from Conselleri a de Cultura, Educacion e Ordenacion Universitaria, and the European Regional Development Fund (ERDF). The work was also supported by the Drug Discovery Program of the Pharma Valley Center to A.A. ■REFERENCES (1) (a) Linardopoulos, S.; Blagg, J. Aurora Kinase Inhibition: A New Light in the Sky? J. Med. Chem. 2015,58, 5186. (b) Dipke, C. N.; Vyas, R. Drug design efforts toward Aurora kinase inhibitors. Int. J. Pharm. Bio. Sci. 2014,5, 714. (c) Hilton, J. F.; Shapiro, G. I. Aurora Kinase Inhibition as an Anticancer Strategy. J. Clin. Oncol. 2014,32, 57. (d) Dar, A. A.; Goff, L. W.; Majid, S.; Berlin, J.; El-Rifai, W. Aurora kinase inhibitors–rising stars in cancer therapeutics? Mol. Cancer Ther. 2010,9, 268. (e) Palmisiano, N. D.; Kasner, M. T. Polo-like kinase and its inhibitors: Ready for the match to start? Am. J. Hematol. 2015,90, 1071. (f) Craig, S. N.; Wyatt, M. D.; McInnes, C. Current assessment of polo-like kinases as antitumor drug targets. Expert Opin. Drug Discovery 2014,9, 773. (2) (a) Myers, S. M.; Collins, I. 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HeLa cells were cultured in the presence of 6 μM 8d,6μM8e,or5μM8g. The representative phenotype of each compound is presented. In addition to the normal mitotic spindle in mock-treated cells, the STLC-induced monoastral spindle is also presented. Microtubules (red) and chromosomes (cyan) were stained with anti-α-tubulin antibody and DAPI, respectively. Scale bar, 10 μm. ACS Combinatorial Science Research Article DOI: 10.1021/acscombsci.6b00166 ACS Comb. Sci. 2017, 19, 153−160 159 156 tumors and human tumor xenografts. Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 2002,43, 1335. (b) Sorbera, L. A.; Bolos, J.; Serradell, N.; Bayes, M. Ispinesib Mesilate. Drugs Future 2006,31, 778. (c) Finer, J. T.; Bergnes, G.; Smith, W. W.; Chabala, J. C.; Feng, B. Methods and compositions utilizing quinazolinones. U.S. Pat. Appl. Publ. US8470838 B2, June 25, 2013. (7) (a) Bongero, D.; Paoluzzi, L.; Marchi, E.; Zullo, K. M.; Neisa, R.; Mao, Y.; Escandon, R.; Wood, K.; O’Connor, O. A. 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Structure-Guided Design of Novel l-Cysteine Derivatives as Potent KSP Inhibitors. ACS Med. Chem. Lett. 2015,6, 1004. ACS Combinatorial Science Research Article DOI: 10.1021/acscombsci.6b00166 ACS Comb. Sci. 2017, 19, 153−160 160 157 158 Esquema 5.3.2.3b: Ruta sintética propuesta para la síntesis de CPUYJ039 y análogos. Es importante destacar, en estos trabajos en los cuales se emplea la síntesis de Ugi (en general, síntesis con isonitrilos), la necesidad de utilizar scavengers o “secuestradores” de este tipo de reactivos. Esto es debido a sus desagradables propiedades organolépticas, que harían el trabajo en el laboratorio especialmente difícil para el caso de algunos isonitrilos (especialmente los más volátiles) incluso trabajando bajo campana de extracción. Por ello, nuestro grupo de investigación ideó una interesante propuesta basada en el empleo de un reactivo soportado consistente en una resina de poliestireno que soporta un grupo de tipo ácido p-toluensulfónico (PS-TsOH).134 Al ser un reactivo de carácter ácido (tal y como se ha comentado en el apartado de metodología) puede ser empleado en procesos de extracción en fase sólida para el “rescate” de bases, como los grupos dimetilamino. Como puede observarse en el esquema 5.3.2.3b, esta estrategia facilita en gran medida la purificación. La estrategia se compone de un atrapamiento o “catch” (mediante la reacción entre la resina ácida y el grupo dimetilamino, básico) y un proceso de liberación del compuesto del seno del polímero (release) mediante un tratamiento con DIPEA, que permite la obtención de los compuestos 5a−i (Método A), de manera satisfactoria. El procesamiento de los compuestos que contienen una cadena N-Boc-aminopropilo (5j−o) se realizó combinando el uso de dos reactivos soportados (PS-TsOH y PS-carbonato) para realizar el procesamiento después de la reacción de Ugi, actuando como secuestradores, para el eventual exceso de amina e isonitrilo (PS-TsOH) así como de ácido (PS-carbonato) a temperatura ambiente (Método B). Es importante recordar que los grupos R-NHBOC carecen de suficiente basicidad para ser afectados por PS-TsOH (Método B). La purificación de los compuestos se llevó a cabo de manera similar al trabajo anterior. 5.3.2.4 Resultados de actividad antitumoral Los ensayos de actividad antitumoral de estas series de compuestos fueron realizados por los profesores Akira Asai y Junichi Sawada, en Japón. El compuesto más interesante de la serie ofreció una potente inhibición de la KSP (ensayo enzimático ATPasa, 8g: IC50= 1.8 µM), así como un interesante valor de citotoxicidad en HeLA, y HCT-116 (8g: IC50 HeLa= 1.3 µM, IC50 HCT-116= 1.0 µM), mostrando el fenotipo de inhibición KSP característico en forma de monoáster, igual que algunos otros de la serie (Figura 5.3.2.4). Otros ligandos potentes fueron 8d y 8e. 261 Figura 5.3.2.4: Curvas dosis-respuestaLas actividades biológicas de 8d, 8e y 8g. Las actividades inhibidoras de 8d, 8e y 8g para la proliferación celular HCT116 (A), la progresión del ciclo celular (B) y la KSP ATPasa (C). Los datos los puntos de 8d, 8e y 8g están representados por círculos abiertos, grises y cerrados, respectivamente. Fenotipo de inhibición KSP mostrado por 8d, 8e y 8g. Los tres análogos más potentes, 8d, 8e y 8g, tienen un sustituyente de tipo tertbutilo en la posición R6, así como un grupo amino al final de la cadena aminopropilo en común. Un sustituyente metoxilo en posición 5 mejora la actividad (8g). Estos compuestos con amino libre mostraron actividad anti-proliferativa más potente que la de CPUYJ039 y también se encontró que tenían una mayor actividad antimitótica para el análisis celular. Colectivamente estos datos nos indicaron que: a) CPUYJ039 ofrece bastantes dudas como ligando antimitótico efectivo. Si bien es cierto que nuestros ensayos se centraron en el derivado racémico, su actividad celular es muy baja y la actividad frente a KSP reportada por Jiang (IC50= 40 nm) es bajo nuestro punto de vista, bastante cuestionable. De hecho, ningún compuesto de la serie con dimetilamino mostró actividad celular significativa. A pesar de ello, la variación estructural que realizamos sobre este scaffold CPUYJ039 confirmó de alguna manera nuestras observaciones en los programas de docking, b) En la Figura 5.3.2.4 se puede observar el claro fenotipo mostrado por los 3 compuestos más potentes de la serie preparada. Todos ellos mostraron un fenotipo característico de inhibición KSP. 262 5.3.3 Conclusiones específicas de este trabajo en el contexto de la Tesis Se han sintetizado series de bencimidazoles de tipo N-(3-aminopropil)-N-(1-(1bencil-1H-indol-2-il)alquil)benzamidas, mediante una estrategia sintética corta basada en reacciones de Ugi, ciclación de los aductos intermedios y bencilación del núcleo de bencimidazol. Esta estrategia sintética acorta en varios pasos de síntesis esta clase de compuestos, descritos por primera vez en la mencionada patente Quiron. Analizando los resultados obtenidos en el apartado anterior, podemos concluir que los datos publicados (IC50 ATPasa= 40 nM, IC50in vivo: 2.3 µM de actividad celular HCT116) acerca de la molécula principal sobre la cual se fundamentaron los estudios y el diseño inicial de nuestra estrategia sintética, el CPUYJ039 (reportada por Jiang), presentan ciertas dudas. Estas dudas surgen al no obtenerse datos similares de actividad ATPasa ni actividad celular para esta molécula, en los estudios de evaluación farmacológica por parte del profesor Sawada, tras haber sido sintetizada y caracterizada inequívocamente en nuestro laboratorio. Estos resultados farmacológicos empleando una proteína expresada por el doctor Sawada, ofrecieron un perfil farmacológico diferente al reportado por Jiang (CPUYJ039 resultó inactivo en el ensayo KSP y en el ensayo celular). Por otra parte, Jiang no reporta los datos de caracterización estructural de CPUYJ039, ni tenemos conocimiento de ninguna publicación describiendo la estructura de este compuesto. Por ello, es difícil extraer una conclusión acerca de si esa variabilidad en los resultados es consecuencia de las condiciones específicas del ensayo farmacológico sobre la proteína, o bien se trata de otra molécula que por alguna circunstancia se publicó con esa estructura. Una circunstancia que apoya esta versión es la observación de la diferente actividad farmacológica entre las series de compuestos preparadas en el trabajo. A pesar de ello, algunos de los nuevos análogos sintetizados y descritos en esta memoria lograron buenos valores de inhibición ATPasa de la KSP, así como buenos valores de actividad citotóxica en líneas tumorales (HTC116 y HeLa), lo que las valida como una buena base estructural basada en el núcleo de bencimidazol para la obtención de prototipos futuros para esta diana. La conclusión más importante acerca de la REA preliminar, derivada de la evaluación farmacológica de las series de bencimidazoles análogos de CPYUJ039 es la importancia del grupo amino libre del resto aminopropilo. Este grupo funcional con mucha probabilidad interacciona con un residuo de Glutámico Glu116 presente en el sitio alostérico de la diana KSP. En contraste, las series de compuestos que contienen el resto dimetilaminopropílico fueron inactivas. Otro aspecto estructural importante es la presencia de un sustituyente metoxilo en posición 5 del anillo de bencimidazol para mejorar la actividad. Colectivamente, del análisis de los resultados obtenidos por nosotros y la bibliografía relacionada, la interacción ligando-proteína óptima parece requerir un correcto acoplamiento entre el ligando y varios bolsillos (pockets) del sitio de unión alostérico KSP. La combinación de interacciones favorables sobre la cavidad central y 3 o 4 bolsillos de la KSP conduce a ligandos potentes. 263 5.4 CAPÍTULO IV: RECONOCIMIENTO ENANTIOESPECÍFICO EN EL RECEPTOR A2B DE ADENOSINA POR ALQUIL 2‑CIANOIMINO-6-METIL-1,2,3,4 TETRAHIDROPIRIMIDINA-5-CARBOXILATOS-4SUSTITUIDOS (PUBLICACIÓN 4) ______________________________________________________________________ 5.4.1 Introducción y objetivo el trabajo El nucleósido purínico adenosina regula multitud de procesos fisiológicos,135,136 mediante su unión a receptores específicos, conocidos como receptores de adenosina y clasificados en 4 subtipos: A1, A2A, A2B y A3 (ARs). Desde su descubrimiento, los ARs han sido considerados objetivos atractivos en la investigación de fármacos. 137,138 Los ARs pertenecen a la superfamilia de los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) y, por lo tanto, ejercen sus funciones fisiológicas mediante la activación o inhibición de diferentes sistemas de segundos mensajeros.135,136 Nuestra mejor comprensión de la fisiología, farmacología, y biología estructural y molecular de las vías de señalización de la adenosina respalda el desarrollo de ligandos potentes y selectivos, lo que conduce, en última instancia, a la introducción de nuevas estrategias terapéuticas para abordar necesidades médicas urgente.139-141 El A2BAR se expresa de manera ubicua en el cuerpo y regula una amplia gama de eventos fisiopatológicos.142,145 El A2BAR se define generalmente como un receptor de baja afinidad146 que permanece inactivo en condiciones fisiológicas, pero se activa rápidamente durante condiciones crónicas de estrés oxidativo (por ejemplo, hiperglucemia, inflamación o activación de mastocitos). Evidencias recientes respaldan que el A2BAR está regulado de manera transcripcional por factores implicados en la hipoxia inflamatoria,146 participando así en procesos fisiológicos clave (por ejemplo, tono vascular, homeostasis de la glucosa, inflamación pulmonar, respuesta inflamatoria o dolor). Sin embargo, desde una perspectiva farmacológica, el A2BAR es el menos caracterizado de los cuatro subtipos de AR debido a su baja afinidad general hacia los ligandos prototípicos de AR.141,147 En consecuencia, se requieren nuevos antagonistas potentes y selectivos del A2BAR para el desarrollo de fármacos o como herramientas farmacológicas para validar nuevas aplicaciones terapéuticas (por ejemplo, asma, colitis, retinopatía diabética, inflamación o cáncer). 143-145 La búsqueda de antagonistas del A2BAR139-141,147 se ha centrado tradicionalmente en las xantinas de origen natural (Figura 5.4.1, Compuestos 1−3),148-149 que han evolucionado estructuralmente para producir ligandos de alta afinidad y selectividad (Figura 5.4.1, Compuestos 4−7),150-152 incluyendo deaza-xantinas (Figura 5.4.1, Compuesto 8).19,20 153,154 En contraste, solo se han descrito unos pocos ejemplos de antagonistas potentes y selectivos no xantínicos del A2BAR (Figura 5.4.1, Compuestos 9−15).155-156 Al igual que todos los ligandos de AR conocidos, todos los antagonistas conocidos del A2BAR contienen un andamiaje central plano (Figura 5.4.1, Compuestos 1−11), lo que evita el establecimiento de interacciones estereoespecíficas ligandoreceptor. Por lo tanto, la evaluación de nuevos quimiotipos que aporten topologías estereodiversas proporciona bases sólidas para explorar modos de unión alternativos y estereoespecíficos, conciliando así la simplicidad molecular con perfiles de afinidad y selectividad óptimos. 265 Figura 5.4.1 Estructuras de antagonistas A2BAR representativos. 148-159 Recientemente nuestro grupo documentó la primera familia de antagonistas A2BAR no planares, estructuralmente simples, selectivos y de alta afinidad, basados en la estructura de 3,4-dihidropirimidin-2(1H)-ona (Figura 5.4.1, Compuesto 12).158 La factibilidad sintética de esta estructura, que se prepara eficientemente a través de una reacción multicomponente de Biginelli, permitió la evaluación rápida de las características más destacadas de las relaciones estructura-actividad y selectividad en esta serie. Con el objetivo de explorar nuevos prototipos que exhiban una alta afinidad hacia A2BAR, posteriormente exploramos las propiedades farmacológicas de tres series de análogos: 3-deaza[piridin-2(1H)-onas] y derivados bicíclicos y tricíclicos fusionados en las posiciones 2,3 o 5,6 del esqueleto heterocíclico.159 Ese estudio reveló el potencial de diversificación estructural en la posición 2 de la estructura central de diazinona y proporcionó algunos ligandos bicíclicos (13, 14) y tricíclicos (15) prometedores (Figura 5.4.1).159 En este capítulo describimos el descubrimiento de una nueva familia de antagonistas A2BAR potentes y altamente selectivos basados en el esqueleto de 2cianoimino-6-metil-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-5-carboxilato sustituido en posición 4. Los dos enantiómeros del ligando más atractivo (16b) se separaron mediante HPLC quiral y sus configuraciones absolutas fueron establecidas mediante dicroísmo circular. La evaluación farmacológica de los dos enantiómeros demostró que la afinidad se debe exclusivamente al enantiómero (S)-16b, en línea con nuestros modelos moleculares previos158,159 y actuales. Este es el primer ejemplo de reconocimiento enantiospecífico en el A2BAR. N NN N O O H H Pr N N CF3 7 CVT-712420 N N N H 9 LAS3809622 N N NN N O O R7 R1 R3 1 R1 = R3 = R7 = Me Caffeine15 2 R1 = R3 = Me R7 = H Theophylline15 3 R1 = Pr R3 = R7 = H Enprofylline16 N NN N O O H H Pr SO3H 4 PSB-111517 N NN N O O H Pr Pr O O N H CN 5 MRS-175418 N NN N O O H H Pr N N 6 CVT-669419 NO N Cl N N N O O H Pr Pr O N O O H N N N N NN N O N NN N NH N O HN H Me O N 10 OSIP33939123 N N O H HO O Me S 12 SYAF08625 O NN 821 N N N O O Me O H 13 ISAM15226 1124 N N N O O Me O H 15 ISAM14026 N N N N O O Me O H 14 ISAM14826 H O Ki = 53.4 nM Ki = 1.9 nM Ki = 7.0 nM Ki = 6.0 nM Ki = 19.9 nM Ki = 0.5 nM Ki = 20.0 nM Ki = 23.6 nM Ki = 85.6 nM Ki = 17.0 nM Ki = 55.6 nM Ki = 3.5 nM 266 5.4.2 Diseño El diseño de los compuestos con estructura de 2-cianoimino-6-metil-1,2,3,4tetrahidropirimidina-5-carboxilatos (Figura 5.4.2) se basó en la sustitución bioisostérica del grupo carbonilo en la posición 2 de la estructura central de 3,4-dihidropirimidin2(1H)-ona (17), 158 o del grupo imino presente en el anillo azol fusionado al núcleo de pirimidina en derivados bicíclicos (18 y 19),159 por un grupo cianoimino exocíclico (Figura 5.4.2). Esta modificación estructural aparentemente sutil debería, sin embargo, afectar profundamente las características conformacionales, electrónicas, estéricas y lipofílicas de la estructura central, con un posible impacto en el perfil farmacológico de los ARs. Sobre la base de la SAR observada para la serie anterior (17-19), nuestro modelo hA2BAR previo158,159 y el estudio prospectivo de modelado realizado en este trabajo (ver más adelante), mantuvimos los mejores sustituyentes en las posiciones 4 y 5 de la estructura pirimidina. Así, una vez que se habían sintetizado y evaluado farmacológicamente la nueva serie de compuestos, realizamos un análisis comparativo entre las estructuras centrales más similares (16 y 17). Figura 5.4.2. Estrategia de diseño empleada para las moléculas objetivo (16). 5.4.3 Química Del mismo modo que las 3,4-dihidropirimidin-2(1H)-onas (17), que inspiraron este trabajo,158 los compuestos documentados aquí (16) se ensamblaron mediante una aproximación multicomponente (MCR).160 El Esquema 5.4.3 presenta la transformación, inspirada en la reacción de Biginelli, empleada como estrategia sintética. Siguiendo un procedimiento previamente descrito,161 la cianamida (20), un β-cetoéster (21a–b) y el correspondiente carbaldehído (22a–d) se calentaron (80 ºC) en etanol utilizando HCl/NaOAc como catalizador en un tubo sellado durante 4-6 h. Los alquil 2-cianoimino6-metil-1,2,3,4-tetrahidro-pirimidin-5-carboxilatos (16a–j) se aislaron en rendimientos moderados a excelentes (68-93%) después de su purificación mediante cromatografía en columna o recristalización (isopropanol). La secuencia de reacción comenzó con la autocondensación de la cianamida in situ para obtener el intermediario cianoguanidina, que luego se combinó con el aldehído o el β-cetoéster siguiendo cualquiera de las vías mecanísticas alternativas propuestas para la heterociclización de Biginelli.161 En la parte experimental del capítulo IV de esta Tesis se proporciona una descripción exhaustiva del método sintético y los datos estructurales y espectroscópicos completos de todos los compuestos. Asumiendo la superposición de las estructuras centrales discutidas anteriormente, se preparó una colección de compuestos en la que, de acuerdo con las tendencias SAR del quimiotipo151,158 mantuvimos los sustituyentes en las posiciones 4 (2-furilo, 3-furilo y 2-tienilo y 3-tienilo) y 5 (etoxicarbonilo o isopropoxicarbonilo) del heterociclo (16a–h). Además, se introdujeron grupos fenilo y ciclopentilo en la posición 4 (compuestos 16i–l) para evaluar el efecto de eliminar el núcleo heterocíclico. N N H Me O O R Y X X N N N H Me O O R Y X N H N N N H Me O O R Y X O H 17 18, 1916 267 Esquema 5.4.3. Síntesis y propiedades moleculares de los 2-cianoimino-4-sustituidos-6-metil-1,2,3,4tetrahidropirimidina-5-carboxilatos 16. Como se indicó anteriormente (Figura 5.4.2), el grupo cianoimino exocíclico en la posición 2 de 16 se concibió como un bioisóstero del grupo carbonilo de 17 de tal manera que los grupos NH restantes en las posiciones 1 y 3 desempeñarían roles equivalentes en las dos estructuras centrales. Sin embargo, como se muestra en la Figura 5.4.4, existen tres posibles formas tautoméricas para la estructura central 16, que debido a los diferentes patrones de enlace de hidrógeno podrían llevar a modos de unión distintos entre los tautoméros. Para determinar la forma tautomérica prevalente, tanto en estado sólido como en solución, se llevaron a cabo estudios de cristalografía de rayos X y espectroscopia de RMN (experimentos de diferencia NOE 1D) que proporcionaron información clave sobre la estructura de un compuesto representativo en la serie, concretamente el isopropil 2cianoimino-4-(furano-2-il)-6-metil-1,2,3,4-tetrahidropirimidin-5-carboxilato (16b). Los datos cristalográficos de un monocristal de 16b confirmaron la prevalencia del tautómero 16-I en estado sólido (Figura 5.4.4.B), proporcionando además más evidencia de la conformación pseudo-bote adoptada por el anillo heterocíclico. Este es un rasgo común asumido para la serie principal (17-19)158,159 y constituye una diferencia estructural importante con respecto a todos los antagonistas conocidos de A2B,140,141,147 que son estructuras planas. Los experimentos de diferencia NOE unidimensionales (1D) en 16b (Figura 5.4.4.C) confirmaron de manera inequívoca que el tautómero predominante es, de hecho, el inicialmente considerado (Figura 5.4.4, 16-I), al menos en solución de DMSO-d6. En consecuencia, el nuevo núcleo heterocíclico presenta una superposición óptima de grupos químicos con la estructura central modelo 17 (Figura 5.4.2). 5.4.4 Evaluación biológica Las afinidades de los nuevos ligandos (16) por los cuatro subtipos de receptores de adenosina humanos (A1, A2A, A2B y A3) se determinaron in vitro mediante ensayos de unión de radioligandos.158,159 Se emplearon receptores de adenosina humanos expresados en células CHO transfectadas (A1AR), HeLa (A2AAR y A3AR) y HEK-293 (A2BAR). Los radioligandos [3H]-1,3-dipropil-8-ciclopentilxantina ([3H]DPCPX) para A1AR y A2BAR, [3H]ZM241385 para A2AAR y [3H]NECA para A3AR se utilizaron en los ensayos de unión. Los datos obtenidos se presentan en la Tabla 5.4.4.1a. Como en estudios anteriores, 158,159 todos los compuestos se evaluaron inicialmente como mezclas racémicas. Los datos biológicos se expresan como Ki ± SEM (nM, n = 3) o como inhibición porcentual de la N N R4 N H 20 21a) R4 = 2-furilo 21b) R4 = 3-furilo 21c) R4 = 2-tienilo 21d) R4 = 3-tienilo 21e) R4 = Fenilo 21f) R4 = Ciclopentilo OR5 O Me R4 H O Me O OR5 O + + 22a) R5 = Et 22b) R5 = i-Pr NNH2N H HCl/AcONa EtOH, 80ºC Sealed Tube 16a) R4 = 2-furilo, R5 = Et, 80% 16b) R4 = 2-furilo, R5 = i-Pr, 72% 16c) R4 = 3-furilo, R5 = Et, 81% 16d) R4 = 3-furilo, R5 = i-Pr, 68% 16e) R4 = 2-tienilo, R5 = Et, 89% 16f) R4 = 2-tienilo, R5 = i-Pr, 90% 16g) R4 = 3-tienilo, R5 = Et, 82% 16h) R4 = 3-tienilo, R5 = i-Pr, 90% 16i) R4 = Fenilo, R5 = Et, 93% 16j) R4 = Fenilo, R5 = i-Pr, 91% 16k) R4 = Ciclopentilo, R5 = Et, 82% 16l) R4 = Ciclopentilo, R5 = i-Pr, 85% * 268 unión específica al 1 μM (n = 2, promedio) para aquellos compuestos que no desplazaron completamente la unión al radioligando. Figura 5.4.4. Análisis estructural de los alquil 2-cianoimino-4-(furano-2-il)-6-metil-1,2,3,4tetrahidropirimidina-5-carboxilatos (16). (A): Posibles formas tautoméricas de 16. (B): Diagrama de Ortep del 16b racémico (CCDC1475413). (C): Experimentos NOE empleando 16b: traza inferior: RMN 1H a 300 MHz de 16b (DMSO-d6). Trazo central: Espectro de diferencia NOE de 16b; irradiación del protón en la posición 4. Trazo superior: Espectro de diferencia NOE de 16b; irradiación del grupo metilo en la posición 6. Para fines de comparación, se incluyen los datos biológicos obtenidos para la serie principal de 3,4-dihidropirimidina-2(1H)-ona (17) (Tabla 5.4.4.1a). Los valores de Ki se obtuvieron ajustando los datos con regresión no lineal utilizando el software Prism 2.1 (GraphPad, San Diego, CA). Para aquellos compuestos que mostraron poca afinidad o baja solubilidad, se informa la inhibición porcentual de la unión específica. Los resultados son el promedio de tres experimentos (n = 3), cada uno realizado en duplicado. 5.4.4.1. Experimentos funcionales. Ensayos de cAMP Como parte de la caracterización farmacológica de esta nueva serie de ligandos selectivos de A2BAR, el compuesto más atractivo de la serie (16b) se sometió a ensayos funcionales (cAMP) para evaluar su capacidad para inhibir la producción de cAMP estimulada por NECA (10 µM). Estos experimentos confirmaron que 16b inhibe la acumulación de cAMP, lo que valida el comportamiento antagonista de los nuevos derivados descritos aquí frente al A2BAR. Una comparación de los valores de Ki y KB HN N Ar N H O O Me R N HN N Ar N O O Me R N H N N Ar N H O O Me R N H 16-I16-II 16-III A" B" C" 269 revela una buena correlación entre los datos obtenidos de los ensayos de unión (Ki = 24.3 nM) y los ensayos funcionales (KB = 116.0 nM). Tabla 5.4.4.1a. Datos de estructura y afinidad de unión de los 2-cianamido-4-sustituidos-1,4-dihidropirimidina-5-carboxilatos 16 en los receptores de adenosina humanos. Comp R4 R5 Ki (nM) o % a 1 µMa hA1b hA2Ac hA2Bd hA3e 16a 2-Furilo Et 27% 20% 900 ± 6 20% 16b (SY1K024) 2-Furilo i-Pr 21% 19% 24.3 ± 0.9 4% 16c 3-Furilo Et 28% 31% 102 ± 3 14% 16d (SY1K025) 3-Furilo i-Pr 34% 25% 59.4 ± 1.8 41% 16e (SY1K022) 2-Tienilo Et 26% 33% 51.0 ± 2.1 3% 16f 2-Tienilo i-Pr 31% 16% 349.1 ± 3 27% 16g 3-Tienilo Et 29% 30% 461 ± 2 23% 16h 3-Tienilo i-Pr 11% 18% 647 ± 4 13% 16i Fenilo Et 18% 13% 25% 13% 16j Fenilo i-Pr 20% 12% 32% 6% 16k Ciclopentilo Et 11% 10% 19% 4% 16l Ciclopentilo i-Pr 3% 5% 11% 3% DPCPX - - 2.2 ± 0.2 157 ± 2.9 73.2 ± 2.0 1722 ± 11 ZM241385 - - 683 ± 4.1 1.90 ± 0.1 65.7 ± 1.7 863 ± 4.0 an = 3 para los valores Ki, o n = 2 para el porcentaje de desplazamiento de la unión específica bDesplazamiento de la unión específica [3H]DPCPX en receptores de adenosina A1 expresados en células CHO humanas. cDesplazamiento de la unión específica [3H]4-(2-[7-amino-2-(2-furil)[1,2,4]triazolo[2,3-a][1,3,5]triazin-5-ilamino]etil)fenol en receptores de adenosina A2A expresados en células HeLa humanas. dDesplazamiento de la unión específica [3H]DPCPX en células humanas HEK-293. eDesplazamiento de la unión específica [3H]NECA en receptores de adenosina A3 expresados en células humanas HeLa. N N R4 N H OR5 O Me N H 270 recientemente159 y comprende una combinación de modelado de homología y acoplamiento ligando-receptor. Modelado de homología del hA2BAR: La generación de la estructura 3D inactiva de este receptor, utilizada para el acoplamiento de antagonistas, consistió en los siguientes pasos secuenciales: (i) Curación manual de la alineación de secuencia con la plantilla A2AAR (código PDB 3EML),167 (ii) Generación y selección de modelos de homología y procedimientos de refinamiento de bucles con Modeler,168 (iii) Evaluación de los rotámeros de Asn/Gln/His y estados de protonación de las cadenas laterales con el servidor web Molprobity (http://molprobity.biochem.duke.edu/) (iv) Uso de herramientas de la Suite Schrödinger para refinamientos estructurales energéticos.169 Acoplamiento de ligandos: Tanto los estereoisómeros R como S de cada ligando se construyeron y optimizaron en 3D utilizando la interfaz gráfica Maestro y la utilidad LigPrep de la Suite Schrödinger. Cada ligando se acopló 20 veces con parámetros de búsqueda de algoritmo genético (GA) por defecto (alta precisión), utilizando la función de puntuación Chemscore implementada en GOLD4170y permitiendo plena flexibilidad para el ligando, incluyendo la inversión de los enlaces amida. La esfera de búsqueda se centró en la cadena lateral (CD1) de Ile7y se expandió con un radio de 15 Å, asegurando así un espacio de búsqueda lo suficientemente generoso que abarca el sitio de unión de antagonistas determinado experimentalmente para los receptores de adenosina. Se consideraron dos moléculas de agua en la cavidad de unión, como se propuso previamente171 y se confirmó aquí mediante simulaciones de MD (Molecular Dynamics). La contribución potencial del agua para la unión solo se incluye en la posición final del acoplamiento si produce un aumento en la puntuación predicha, y la red de enlaces de hidrógeno se optimiza (opción toogle trans_spin 2 en GOLD). Además, se tuvieron en cuenta los dos rotámeros de Asn6 utilizando la opción de estructura de ensamblaje en GOLD. El criterio de selección de las posiciones de acoplamiento se basó en una combinación de la clasificación de Chemscore y la población (convergencia) de las soluciones de acuerdo con un criterio de agrupación de 1 Å. 277 5.4.7 Conclusiones específicas de este trabajo en el contexto de la Tesis Durante este trabajo hemos descubierto una novedosa familia de antagonistas A2BAR selectivos, potentes y de estructura simple basados en el quimiotipo 2cianoimino-4-sustituido-6-metil-1,2,3,4-tetrahidro-pirimidina-5-carboxilato de alquilo. Los datos farmacológicos (afinidad y funcional) y la relación estructura-actividad (SAR) obtenidos para este nuevo núcleo heterocíclico son coherentes con los obtenidos para una serie anterior, lo que valida el diseño basado en la sustitución bioisostérica del grupo carbonilo por un grupo ciano-imino. El modo de unión de ambas series también fue coherente, con una interacción estereoespecífica propuesta entre el isómero (S)-16b y análogos y el receptor. La hipótesis de una interacción estereoespecífica con el sitio de unión en el A2BAR se confirmó experimentalmente por primera vez, con el eutómero (S)-16 mostrando una notable potencia (valor Ki de 15.1 nM) y manteniendo el perfil completa selectividad respecto el resto de los receptores de adenosina. Este estudio representa el primer ejemplo de reconocimiento enantioespecífico en el A2BAR y demuestra las ventajas competitivas de la aplicación de la química multicomponente como herramienta para acelerar los proyectos de descubrimiento de fármacos y en la generación de nuevos prototipos activos. Dos de los compuestos obtenidos en el marco de este capítulo (SY1K022 y SY1K024) están siendo probados en líneas celulares de cáncer de colon, en colaboración con el Dr. Jorge Barbazán (IDIS). Esos estudios han proporcionado resultados muy satisfactorios, evidenciando una notable actividad antiproliferativa (reducciones del 60-80% a 1 y 10 mM) evidenciando el potencial de los antagonistas A2BAR en el marco de la terapia del cáncer. 278 6. CONCLUSIONES ______________________________________________________________________ Esta Memoria de Tesis Doctoral describe una investigación basada en el descubrimiento de nuevos fármacos antitumorales mediante el empleo de reacciones multicomponente como motor principal en la generación de estructuras y en definitiva como herramienta de High Throughput Syntehsis. El enfoque diferencial con respecto a otras aproximaciones sintéticas que utilizan reacciones multicomponente, radica en que en este trabajo el diseño de estas metodologías sintéticas se realizó teniendo en consideración sitios de unión específicos de dianas tumorales (KSP o receptor A2B de adenosina) y la asistencia de herramientas computacionales (docking, modelado por homología, etc). Las quimiotecas de compuestos, sintetizadas en esta Tesis, fueron obtenidas mediante reacciones multicomponente (reacciones de Ugi para el sitio de unión alostérico de la diana KSP o reacciones de Biginelli para la interacción con el receptor A2B) así como estrategias de ciclación y/o decoración, para sitios de unión específicos de proteínas que están directamente relacionadas con el desarrollo de tumores. Las metodologías empleadas en esta Tesis (RMCs, bioinformática y ensayo farmacológico) nos han permitido acceder de manera ágil a biomoléculas que interactúan con los sitios de unión de las dos dianas específicas que se han estudiado en este proyecto. Las conclusiones generales más importantes de este trabajo de Tesis Doctoral pueden resumirse en los siguientes puntos: - En el primer capítulo se describe una revisión bibliográfica realizada sobre el empleo de reacciones multicomponente en el campo del descubrimiento de fármacos antimitóticos. El desarrollo de nuevas MCR es una tarea intelectualmente desafiante que considera no solo la reactividad de los materiales iniciales, sino también la reactividad de las moléculas intermedias generadas in situ, su compatibilidad y su compartimentalización. En los últimos años ha habido algunos esfuerzos para sintetizar fármacos antimitóticos mediante MCR, pero estos intentos se han centrado principalmente en la síntesis de fármacos destinados a interactuar con los microtúbulos, en muchos casos como análogos de productos naturales. Sin embargo, las MCR dirigidas a nuevos objetivos antimitóticos emergentes son una herramienta poderosa para obtener nuevos fármacos clínicamente validados en los próximos años, y contribuirán a aclarar el verdadero potencial de las terapias antimitóticas. - En el segundo capítulo, la investigación partió de un diseño in silico sobre el sitio de unión allostérico de KSP, que fue seguido por la síntesis de una serie de moléculas destinadas a la inhibición de la quinesina Eg5-KSP mediante el empleo de una reacción multicomponente U-4CR inical y posterior ciclación y decoración de los aductos generados, para dar compuestos de tipo bencimidazol, diversamente sustituidos. Los resultados farmacológicos demostraron la eficacia de este enfoque multidisciplinar: con la síntesis de solo 18 compuestos tipo bencimidazol, obtuvimos compuestos con actividades inhibidoras de KSP-Eg5 mucho más altas que las del compuesto de referencia monastrol y comparables o similares a las de fármacos de referencia como STLC. En particular, los compuestos 20 y 22 son prometedores para el desarrollo de un programa de hitto-lead basado en reacciones multicomponente, con el objetivo de obtener 279 inhibidores de KSP altamente potentes que podrían utilizarse para tratar tumores que muestran resistencia a los tratamientos quimioterapéuticos actuales. - En el tercer capítulo, se optimizó un enfoque multicomponente similar al efectuado en el trabajo anterior, basado en reacciones de Ugi y ciclación/decoración posterior. Este nuevo procedimiento químico es conciso y eficiente para la síntesis de nuevos inhibidores de KSP tipo N-bencilbenzimidazol, estructuralemnte diferentes a los del capítulo anterior, como agentes antimitóticos. Este procedimiento se basa en una Ugi-4CR inicial que empleó isonitrilos derivados de 2-nitrofenilo y permitió un acceso rápido al inhibidor de KSP, CPUYJ039, y a análogos dimetilados, así como a sus derivados que contienen un grupo amino libre, en comparación con los procedimientos de síntesis lineal actuales informados previamente. El descubrimiento de análogos de CPUYJ039 más optimizados indica el poder de nuestro nuevo método basado en MCR, que proporciona eficazmente posibles inhibidores mitóticos dirigidos al dominio motor de KSP. - En el cuarto y último capítulo de esta Tesis, se estudió una novedosa familia de antagonistas altamente selectivos de A2BAR basados en el quimiotipo de 2cianoimino-4-sustituido-6-metil-1,2,3,4-tetrahidro-pirimidina-5-carboxilato, estructuralmente simples y potentes. Los datos biológicos y la relación estructuraactividad obtenidos para este scaffold son consistentes con los obtenidos para una serie anterior [es decir, el scaffold de 3,4-dihidropirimidin-2(1H)-ona], validando así nuestro diseño basado en la sustitución bioisostérica del grupo carbonilo por un grupo ciano. El modo de unión de ambas series también fue consistente, con una interacción estereoespecífica propuesta entre el isómero (S)-16b y análogos con el receptor. La hipótesis de una interacción estereoespecífica con el sitio de unión en A2BAR se confirmó experimentalmente por primera vez, con el eutómero [(S)-16] mostrando una potencia notable (valor Ki de 15.1 nM) y manteniendo el perfil completo de selectividad en los cuatro receptores ARs. Este estudio constituye el primer ejemplo de reconocimiento enantiospecífico en A2BAR y abre nuevas posibilidades en el diseño de ligandos para este receptor. 280 7. BIBLIOGRAFÍA ______________________________________________________________________ (1) Sociedad Española de Oncología Médica; SEOM. Las Cifras Del Cáncer En España; 2023; Vol. ISBN: 9788409481736. (2) Gilman, A.; Philips, F. S. The Biological Actions and Therapeutic Applications of the BChloroethyl Amines and Sulfides. Science (1979) 1946, 103 (2675), 409–436. https://doi.org/10.1126/science.103.2675.409. (3) Jordan, M. A.; Wilson, L. Microtubules as a Target for Anticancer Drugs. 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Año de publicación: 2014 Volumen: 14 Número: 20 Páginas: 2209-2230 Autorización de la revista: La revista perteneciente a la editorial Bentham, donde se ha publicado el Capítulo 1, permite la reutilización del artículo por parte del autor como parte de su tesis: 297 PUBLICACIÓN 2: Structure-based design of new KSP-Eg5 inhibitors assisted by a targeted multicomponent reaction Carlos Carbajales, [a] Miguel Ángel Prado,[c] Hugo Gutiérrez-de-Terán,[b] Ángel Cores,[a] Jhonny Azuaje,[a] Silvia Novio,[e] María Jesús Nuñez,[e] Belén Fernández-García,[d] Eddy Sotelo,[a, f] Xerardo García-Mera,[f] Pedro Sánchez-Lazo,[d] Manuel Freire-Garabal,[e] Alberto Coelho*[a, f] Revista: ChemBioChem DOI: 10.1002/cbic.201402089 ISSN: 1439-7633 Año de publicación: 2014 Volumen: 15 Número: 10 Páginas: 14711480. Autorización de la revista: La revista perteneciente a la editorial Wiley, donde se ha publicado el Capítulo 2, permite la reutilización del artículo por parte del autor como parte de su tesis: 298 PUBLICACIÓN 3: Multicomponent Assembly of the Kinesin Spindle Protein Inhibitor CPUYJ039 and Analogues as Antimitotic Agents Carlos Carbajales,† Junichi Sawada,‡ Giovanni Marzaro,§ Eddy Sotelo,†,∥ Luz Escalante,†, Antonio Sánchez-Díaz Marta,† Xerardo García-Mera,∥ Akira Asai,‡ and Alberto Coelho*,†,∥ Revista: ACS Combinatorial Science https://doi.org/10.1021/acscombsci.6b00166 ISSN: 2156-8944 Año de publicación: 2017 Volumen: 19 Número: 3 Páginas: 153-160 Autorización de la revista: La revista perteneciente a la editorial ACS, donde se ha publicado el Capítulo 3, permite la reutilización del artículo por parte del autor como parte de su tesis: 299 PUBLICACIÓN 4: Enantiospecific Recognition at the A2B Adenosine Receptor by Alkyl 2-Cyanoimino-4substituted-6-methyl-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylates Carbajales, C. Azuaje, J. Oliveira, A. Loza, M.I. Brea, J. Cadavid, M.I. Masaguer, C.F. García-Mera, X. Gutiérrez-De-Terán, H. Sotelo, E. Revista: Journal of Medicinal Chemistry DOI: 10.1021/acs.jmedchem.7b00138 ISSN: 1520-4804 Año de publicación: 2017 Volumen: 60 Número: 8 Páginas: 33723382. Autorización de la revista: La revista perteneciente a la editorial ACS, donde se ha publicado el Capítulo 1, permite la reutilización del artículo por parte del autor como parte de su tesis: 300 8.2 PERMISOS DE REPRODUCCIÓN DE FIGURAS RECOGIDOS EN ESTA TESIS. (22) Hanahan, D.; Weinberg, R.A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell 2011, 144, 646-674. (52) Wojcik, E. J.; Buckley, R. S.; Richard, J.; Liu, L.; Huckaba, T. M.; Kim, S. Kinesin5: Cross-bridging mechanism to targeted clinical therapy. Gene 2013, 531(2), 133-149. Permisos de revistas MDPI: No se requiere ningún permiso especial para reutilizar todo o parte del artículo publicado por MDPI, incluidas figuras y tablas. Para los artículos publicados bajo una licencia Creative Common CC BY de acceso abierto, cualquier parte del artículo puede reutilizarse sin permiso siempre que se cite claramente el artículo original. La reutilización de un artículo no implica respaldo por parte de los autores ni de MDPI. (12) Graziano, G.; Stefanachi, A.; Contino, M.; Prieto-Díaz, R.; Ligresti, A.; Kumar, P.; Scilimati, A.; Sotelo, E.; Leonetti, F. Multicomponent Reaction-Assisted Drug Discovery: A Timeand Cost-Effective Green Approach Speeding Up Identification and Optimization of Anticancer Drugs. Int. J. Mol. Sci. 2023, 24 (7), 6581. (26) Škubník, J.; Jurášek, M.; Ruml, T.; Rimpelová, S. Mitotic Poisons in Research and Medicine. Molecules 2020, 25, 4632. doi: 10.3390/molecules25204632. (50) Cores, A; Clerigué, J.; Orocio-Rodríguez, E.; Menéndez, C. Pharmaceuticals 2022, 15, 1009. 301 18/9/23, 17:29 RightsLink Printable License https://s100.copyright.com/AppDispatchServlet 1/7 ELSEVIER LICENSE TERMS AND CONDITIONS Sep 18, 2023 This Agreement between Universidade de Santiago de Compostela -- Carlos Carbajales Pérez ("You") and Elsevier ("Elsevier") consists of your license details and the terms and conditions provided by Elsevier and Copyright Clearance Center. License Number 5631981179863 License date Sep 18, 2023 Licensed Content Publisher Elsevier Licensed Content Publication Cell Licensed Content Title Hallmarks of Cancer: The Next Generation Licensed Content Author Douglas Hanahan,RobertA. Weinberg Licensed Content Date Mar 4, 2011 Licensed Content Volume 144 Licensed Content Issue 5 Licensed Content Pages 29 Start Page 646 End Page 674 Type of Use reuse in a thesis/dissertation Portion figures/tables/illustrations 302 18/9/23, 17:15 RightsLink Printable License ELSEVIER LICENSE TERMS AND CONDITIONS Sep 18, 2023 This Agreement between Universidade de Santiago de Compostela -- Carlos Carbajales Pérez ("You") and Elsevier ("Elsevier") consists of your license details and the terms and conditions provided by Elsevier and Copyright Clearance Center. License Number 5631980341382 License date Sep 18, 2023 Licensed Content Publisher Elsevier Licensed Content Publication Gene Licensed Content Title Kinesin-5: Cross-bridging mechanism to targeted clinical therapy Licensed Content Author Edward J. Wojcik,Rebecca S. Buckley,Jessica Richard,Liqiong Liu,Thomas M. Huckaba,Sunyoung Kim Licensed Content Date Dec 1, 2013 Licensed Content Volume 531 Licensed Content Issue 2 Licensed Content Pages 17 Start Page 133 End Page 149 Type of Use reuse in a thesis/dissertation Portion figures/tables/illustrations 309 https://s100.copyright.com/AppDispatchServlet 1/7 18/9/23, 17:15 RightsLink Printable License Number of figures/tables/illustrations 1 Format both print and electronic Are you the author of this Elsevier article? No Will you be translating? Yes, including English rights Number of languages 1 DESCUBRIMIENTO Y OPTIMIZACIÓN DE NUEVOS Title AGENTES ANTITUMORALES EMPLEANDO REACCIONES MULTICOMPONENTE Institution name Universidade de Santiago de Compostela Expected presentation date Dec 2023 Portions figure 2 Specific Languages Spanish, English Universidade de Santiago de Compostela Jenaro de la Fuente sn Requestor Location Santiago de Compostela, A Coruña 15705 Spain Attn: CIQUS Publisher Tax ID GB 494 6272 12 Total 0.00 EUR Terms and Conditions INTRODUCTION 310 1. The publisher for this copyrighted material is Elsevier. By clicking "accept" in connection with completing this licensing transaction, you agree that the following terms and conditions apply to this transaction (along with the Billing and Payment terms and conditions https://s100.copyright.com/AppDispatchServlet 2/7 18/9/23, 17:15 RightsLink Printable License established by Copyright Clearance Center, Inc. ("CCC"), at the time that you opened your RightsLink account and that are available at any time at https://myaccount.copyright.com). GENERAL TERMS 2. Elsevier hereby grants you permission to reproduce the aforementioned material subject to the terms and conditions indicated. 3. Acknowledgement: If any part of the material to be used (for example, figures) has appeared in our publication with credit or acknowledgement to another source, permission must also be sought from that source. If such permission is not obtained then that material may not be included in your publication/copies. Suitable acknowledgement to the source must be made, either as a footnote or in a reference list at the end of your publication, as follows: "Reprinted from Publication title, Vol /edition number, Author(s), Title of article / title of chapter, Pages No., Copyright (Year), with permission from Elsevier [OR APPLICABLE SOCIETY COPYRIGHT OWNER]." Also Lancet special credit - "Reprinted from The Lancet, Vol. number, Author(s), Title of article, Pages No., Copyright (Year), with permission from Elsevier." 4. Reproduction of this material is confined to the purpose and/or media for which permission is hereby given. The material may not be reproduced or used in any other way, including use in combination with an artificial intelligence tool (including to train an algorithm, test, process, analyse, generate output and/or develop any form of artificial intelligence tool), or to create any derivative work and/or service (including resulting from the use of artificial intelligence tools). 5. Altering/Modifying Material: Not Permitted. However figures and illustrations may be altered/adapted minimally to serve your work. Any other abbreviations, additions, deletions and/or any other alterations shall be made only with prior written authorization of Elsevier Ltd. (Please contact Elsevier’s permissions helpdesk here). 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Objection to Contrary Terms: Publisher hereby objects to any terms contained in any purchase order, acknowledgment, check endorsement or other writing prepared by you, which terms are inconsistent with these terms and conditions or CCC's Billing and Payment terms and conditions. These terms and conditions, together with CCC's Billing and Payment terms and conditions (which are incorporated herein), comprise the entire agreement between you and publisher (and CCC) concerning this licensing transaction. In the event of any conflict between your obligations established by these terms and conditions and those established by CCC's Billing and Payment terms and conditions, these terms and conditions shall control. 14. 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Preprints should not be added to or enhanced in any way in order to appear more like, or to substitute for, the final versions of articles however authors can update their preprints on arXiv or RePEc with their Accepted Author Manuscript (see below). If accepted for publication, we encourage authors to link from the preprint to their formal publication via its DOI. Millions of researchers have access to the formal publications on ScienceDirect, and so links will help users to find, access, cite and use the best available version. Please note that Cell Press, The Lancet and some society-owned have different preprint policies. Information on these policies is available on the journal homepage. Accepted Author Manuscripts: An accepted author manuscript is the manuscript of an article that has been accepted for publication and which typically includes author incorporated changes suggested during submission, peer review and editor-author communications. Authors can share their accepted author manuscript: immediately via their non-commercial person homepage or blog by updating a preprint in arXiv or RePEc with the accepted manuscript via their research institute or institutional repository for internal institutional uses or as part of an invitation-only research collaboration work-group directly by providing copies to their students or to research collaborators for their personal use for private scholarly sharing as part of an invitation-only work group on commercial sites with which Elsevier has an agreement After the embargo period via non-commercial hosting platforms such as their institutional repository via commercial sites with which Elsevier has an agreement In all cases accepted manuscripts should: link to the formal publication via its DOI bear a CC-BY-NC-ND license - this is easy to do if aggregated with other manuscripts, for example in a repository or other site, be 313 shared in alignment with our hosting policy not be added to or enhanced in any way to appear more like, or to substitute for, the published journal article. Published journal article (JPA): A published journal article (PJA) is the definitive final record of published research that appears or will appear in the journal and embodies all value-adding publishing activities including peer review co-ordination, copy-editing, formatting, (if relevant) pagination and online enrichment. Policies for sharing publishing journal articles differ for subscription and gold open access articles: Subscription Articles: If you are an author, please share a link to your article rather than the full-text. 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Gold Open Access Articles: May be shared according to the author-selected end-user license and should contain a CrossMark logo, the end user license, and a DOI link to the formal publication on ScienceDirect. Please refer to Elsevier's posting policy for further information. 18. For book authors the following clauses are applicable in addition to the above: Authors are permitted to place a brief summary of their work online only. You are not allowed to download and post the published electronic version of your chapter, nor may you scan the printed edition to create an electronic version. Posting to a repository: Authors are permitted to post a summary of their chapter only in their institution's repository. 19. Thesis/Dissertation: If your license is for use in a thesis/dissertation your thesis may be submitted to your institution in either print or electronic form. Should your thesis be published commercially, please reapply for permission. These requirements include permission for the Library and Archives of Canada to supply single copies, on demand, of the complete thesis and include permission for Proquest/UMI to supply single copies, on demand, of the complete thesis. Should your thesis be published commercially, please reapply for permission. Theses and dissertations which contain embedded PJAs as part of the formal submission can be posted publicly by the awarding institution with DOI links back to the formal publications on ScienceDirect. Elsevier Open Access Terms and Conditions You can publish open access with Elsevier in hundreds of open access journals or in nearly 2000 established subscription journals that support open access publishing. Permitted third party re-use of these open access articles is defined by the author's choice of Creative Commons user license. See our open access license policy for more information. 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En la primera parte de la Tesis, se investiga el diseño, síntesis y evaluación de prototipos directamente diseñados para la inhibición de la diana antimitótica KSP (Kinesin Spindle Protein) y que están basados en la estructura de tipo bencimidazol. En la segunda parte, se introduce una línea de investigación basada en la búsqueda de antagonistas de los receptores A2B de adenosina como agentes anticancerígenos.