Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide, polimorfismos en genes candidatos y estudios de confirmación

Universidad de Santiago de Compostela Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Medicina Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela Laboratorio de Investigación 2 Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide. Polimorfismos en genes candidatos y estudios de confirmación Tesis Doctoral Rebeca Diéguez González 2009 El Dr. Antonio González Martínez-Pedrayo, investigador principal del Laboratorio de Investigación 2 del Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela, y el Dr. Juan Jesús Gómez-Reino Carnota, Jefe del Servicio de Reumatología del Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela y Profesor Titular del Departamento de Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela, CERTIFICAN QUE: El presente trabajo que lleva por título: Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide. Polimorfismos en genes candidatos y estudios de confirmación, realizado por Rebeca Diéguez González en el Departamento de Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela bajo nuestra dirección, ha sido revisado y está en disposición de ser presentado para optar al grado de Doctora en Biología. Fdo: Dr. Antonio González Martínez-Pedrayo Fdo: Dr. Juan J. Gómez-Reino Carnota A mis padres Agradecimientos Cuando consigues algo por lo que has luchado con todas tus fuerzas y todo tu corazón, la satisfacción es tan grande que es difícil de contener. Cuando ese momento llega, miras hacia atrás y lo que recuerdas es a quien te ha acompañado en ese camino. Entonces, un millón de sentimientos se agolpan, un millón de recuerdos renacen, y sonríes feliz y agradecido a todas aquellas personas que han compartido tu esfuerzo. Porque la felicidad no es feliz si no tienes con quien compartirla. Me siento tremendamente afortunada de haber llegado hasta aquí, y se que ha sido posible gracias al apoyo incondicional de quien ha confiado en mi, y me ha ayudado a comprender que merece la pena luchar por lo que uno cree. Por eso quiero agradecer a todas esas personas, que hayan compartido este sendero conmigo. En primer lugar quiero darle las gracias al Dr. Antonio González, quien ha “sufrido” la dirección de esta tesis doctoral. Gracias por haberme dado la oportunidad de llevar a cabo un sueño. Gracias por tu entusiasmo y por seguir pensando que las cosas van a mejorar en este mundo de locos. Gracias también al Dr. Juan J. Gómez-Reino, mi codirector de tesis, por permitirme realizar mi trabajo en colaboración con el Servicio de Reumatología del Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela. Gracias a todos aquellos pacientes y controles que se han prestado de manera completamente desinteresada a colaborar en este proyecto de investigación. Nada de esto sería posible sin la participación de estas personas. Gracias también a todos los clínicos e investigadores que han participado de alguna manera en este trabajo. A mis padres, a quienes dedico este momento. Y os lo dedico con humildad porque el esfuerzo que yo haya empleado estos años, no alcanza ni de lejos, ni uno de los días de trabajo que vosotros habéis dedicado para que yo haya podido llegar hasta aquí. Me habéis dado en vida, la mejor herencia que se le puede dejar a un hijo, toneladas de amor incondicional, que habéis demostrado con cada uno de los sacrificios que tuvisteis que hacer para que yo tuviera lo que vosotros no tuvisteis. Me habéis hecho entender, con vuestro ejemplo, que en esta vida hay que tener afán de lucha y espíritu de superación, que hay que ser generosos, y que las cosas se consiguen a base de esfuerzo, pero se consiguen si uno pone ilusión y empeño. Es una auténtica fortuna teneros por padres. Os agradezco todo, porque os debo todo y más. Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide Objetivos 59 - Objetivos 61 Procedimiento experimental, resultados y discusión 63 -Procedimiento experimental, resultados y discusión 65 - Esquema general 65 - NFκB en AR 69 -TNFAIP3 y región intergénica 6q23 95 - IRF5 en AR 123 - IL-1 en AR 137 -Otros genes candidatos en AR 157 Discusión general 179 -Discusión 181 -Estudio de la variabilidad de la ruta NFκB en relación con susceptibilidad a la AR 184 -TNFAIP3 y la región intergénica 6q23 en AR 189 -Haplotipos de IRF5 en AR 194 -Análisis de polimorfismos del gen IL-1β en relación a la susceptibilidad a la AR 199 -Exploración de otros genes candidatos: CFH, CD209, Eotaxin-3 y MHC2TA 201 -Sumario 207 Conclusiones 211 - Conclusiones 213 Bibliografía 215 - Bibliografía 217 Abreviaturas 1 ABREVIATURAS ACPA Autoanticuerpos frente a péptidos/proteínas citrulinadas ACR Colegio Americano de Reumatología AR Artritis Reumatoide C5 Componente 5 del complemento CD209 Receptor de la lectina tipo C CFH Factor del complemento H CTLA4 Antígeno linfocitario citotóxico 4 FR Factor Reumatoide GWAs Estudios de asociación de genoma completo (del inglés, genome wide association studies) HLA Antígeno leucocitario humano HWE Equilibrio de Hardy-Weinberg IFN Interferón IL Interleucina IRF5 Factor regulador del interferón 5 LD Desequilibrio de ligamiento LES Lupus eritematoso sistémico MHC Complejo mayor de histocompatibilidad MHC2TA Trasactivador 2 del complejo mayor de histocompatibilidad NFκB Factor nuclear-κB nsSNP Polimorfismos no sinónimos de un solo nucleótido Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 2 OR Odds ratio PADIs Peptidilarginina deaminasa PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa PTPN22 Fosfatasa de tirosina tipo 22 no-receptor RR Riesgo relativo SCLC22A4 Transportador soluble de cationes orgánicos 4 SE Epítopo compartido (del inglés, shared epitope) SNP Polimorfismo de un sólo nucleótido (del inglés, Single nucleotid polymorphism) STAT4 Traductor de señal y activador de la transcripción 4 TNF Factor de necrosis tumoral TNFAIP3 Proteína 3 inducida por TNF alpha TRAF1 Factor 1 asociado al receptor de TNF Introducción Introducción 5 Introducción Artritis Reumatoide La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria crónica caracterizada por sinovitis y por una severa destrucción articular, que afecta fundamentalmente a las articulaciones periféricas con distribución simétrica. Algunas de sus manifestaciones clínicas son dolor, rigidez, hinchazón y pérdida de movilidad. Puede llegar a producir la destrucción de la arquitectura de la articulación causando graves deformidades (Feldmann M et al., 1996) (Bresnihan B et al., 1998). Su evolución es progresiva con remisiones y exacerbaciones y, en ocasiones, se acompaña de otros problemas en diferentes órganos como vasculitis, pleuritis, pericarditis…Esta enfermedad afecta al 1% de la población caucásica, con una prevalencia en mujeres con respecto a hombres del 2,5:1 (Lawrence RC et al., 1998). La patogenia de la AR es un proceso complejo, que implica proliferación celular y fibrosis a nivel sinovial, la formación de pannus, y la erosión del cartílago y el hueso. La respuesta inmune que se desencadena en la AR, da lugar a la inflamación de la membrana sinovial. Las células del sistema inmune, linfocitos T, linfocitos B, monocitos/macrófagos y granulocitos, invaden la membrana sinovial, al mismo tiempo que las células residentes, sinoviocitos tipo macrófago y tipo fibroblasto, se hiperplasian y proliferan (Figura 1). Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 6 Fémur Tibia Cartílago Cápsula Membrana sinovial Fémur Cartílago Tibia Cápsula Membrana sinovial Sinoviocitos ARTICULACIÓN NORMAL AR TEMPRANA AR ESTABLECIDA Membrana sinovial hiperplásica Sinoviocitos hipertróficos Formación capilares Neutrófilos Células B Células T Células plasmáticas “Villi” sinovial Angiogénesis Hueso erosionado Pannus Neutrófilos Fémur Tibia Cartílago Cápsula Membrana sinovial Fémur Cartílago Tibia Cápsula Membrana sinovial Sinoviocitos ARTICULACIÓN NORMAL AR TEMPRANA AR ESTABLECIDA Membrana sinovial hiperplásica Sinoviocitos hipertróficos Formación capilares Neutrófilos Células B Células T Células plasmáticas “Villi” sinovial Angiogénesis Hueso erosionado Pannus Neutrófilos Figura 1: Esquema de los cambios que se van observando en una articulación con artritis reumatoide (Choy EH, Panayi GS, 2001) Todo este conjunto de células producen factores que acentúan y mantienen la inflamación, como citocinas, quimiocinas, prostanoides, y enzimas degradativos tales como metaloproteasas de matriz extracelular (MMPs), proteasas de serina y agrecanasas (Tak P, Bresniham B, 2000) (Dinarello C, Moldawer L, 2002). Entre las citocinas cabe destacar la interleucina 1 (IL, 1 Interleukin-1) y el factor de necrosis tumoral (TNF, tumor necrosis factor) que son mediadores fundamentales de la inflamación en la AR (Buchan G et al., 1998) (Arend WP et al., 1990) (Koch AE et al., 1995). Los enzimas Introducción 7 degradativos son capaces de digerir la matriz extracelular, lo que facilita la infiltración celular inflamatoria, y provoca la destrucción de las estructuras articulares (Firestein GS, 2003). La alteración de la respuesta inmune favorece la aparición del denominado factor reumatoide (FR), un autoanticuerpo reactivo frente a la porción constante de la IgG. Este autoanticuerpo se emplea como uno de los criterios de clasificación de la AR establecidos por el Colegio Americano de Reumatología (ACR, American College of Rheumatology) en 1987 (Arnett FC et al., 1988) (Tabla 1). Tabla 1: Criterios de clasificación de la AR establecidos por la ACR en 1987. 1. Rigidez matinal 2. Artritis de tres o más articulaciones 3. Artritis de manos 4. Artritis simétrica 5. Nódulos reumatoides 6. Factor reumatoide sérico 7. Cambios radiográficos La asociación de la enfermedad con el FR, es la principal razón por la que la AR se clasifica dentro de las enfermedades autoinmunes. La sensibilidad y especificidad del FR en la AR son, sin embargo, bajas: 60-70 y 80-90%, respectivamente. Recientemente se han descubierto autoanticuerpos frente a péptidos/proteínas citrulinadas (ACPA, anti-citrullinated peptides antibodies), con una sensibilidad similar a la del FR pero con mucha más especificidad (∼99%) (Vossenaar ER et al., 2004). Tanto el FR como los ACPA se Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 8 desarrollan años antes del comienzo de las manifestaciones clínicas de la enfermedad (Nielen MM et al., 2004) (Rantapaa-Dahlqvist S et al., 2003), y ambos están asociados con una mayor severidad de las mismas (van Gaalen FA et al., 2003) (Kroot EJ et al., 2000). Mediadores de la degradación tisular y de la inflamación en AR Como se comentaba anteriormente, la patogenia de la artritis reumatoide se caracteriza por la acción concertada de diferentes tipos de células que desencadenan la inflamación de la membrana sinovial y en ocasiones, la erosión del cartílago. De forma resumida, el resultado global de todos estos procesos es una acumulación de células inmunes en la membrana sinovial, y un marcado incremento de la sinovia debido a la hipertrofia e hiperproliferación de los sinoviocitos tipo macrófago y los de tipo fibroblasto. Esta membrana sinovial engrosada se puede transformar en un tejido inflamatorio llamado pannus que destruye el cartílago y el hueso subcondral. Dentro de todo el conjunto de moléculas que participan en la patogenia de la AR, las citocinas inflamatorias son los principales mediadores de la infamación y de la degradación tisular. Numerosos estudios tanto in vivo como in vitro indican que la IL-1 y el TNFα son las citocinas catabólicas más importantes implicadas en la destrucción del cartílago articular en la AR (van der Berg WB, van Riel PL, 2005) (Dayer JM, 2003) (van der Berg WB, 2005). La IL-1 y el TNF-α inducen la producción de otras proteínas inflamatorias que incluyen la IL-6, el factor inhibidor de leucemia (LIF), IL-17 y la IL-18, así como quimiocinas (Goldring SR, Goldring MB, 2004) (Aida Y et al., 2006) (Figura 2) Introducción 9 Figura 2: Redes de citocinas e interacciones celulares en la destrucción del cartílago en AR. (Otero M, Goldring MB, 2007). TNFα El factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) es una potente citocina proinflamatoria. El gen TNFα se localiza en una región cercana a los genes HLA en la región 6p23-6p12, y codifica para una proteína secretada principalmente por monocitos y macrófagos, pero también por células B, células T y fibroblastos. Su producción es inducida por IFN, IL-2 e IL-18. TNF-α es un estimulador autocrino y un potente inductor paracrino de otras citocinas como IL-1, IL-6 e IL-8, así como de otras proteínas que incluyen las GM-CSF y las Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 16 pueden tener en la AR. Por este motivo, el análisis de polimorfismos de los genes implicados en la ruta resulta muy interesante ya que las rutas de señalización son potenciales dianas terapéuticas. MAP quinasas Las proteínas quinasas activadas por mitógeno (MAPK, mitogenactivated protein kinases) son también moléculas reguladoras claves en la producción de citocinas y metaloproteasas, y por tanto potencialmente importantes en la AR. Las MAPK participan en múltiples rutas de señalización que integran señales externas con la apropiada respuesta celular. Las tres familias principales de MAP quinasas, quinasas reguladas por señal extracelular (ERK, extracelular signal-regulated kinase), quinasas N-terminal c-Jun (JNK, c-Jun N-terminal kinase) y del grupo p38, se expresan en el tejido sinovial de pacientes con AR (Schett G et al., 2000). Todas ellas son expresadas de forma constitutiva por los sinoviocitos en cultivo, y se fosforilan tras la exposición a citocinas inflamatorias. Las MAPK han sido objeto de estudio como posibles dianas terapéuticas en AR. Así, estudios experimentales muestran que los inhibidores de p38 son efectivos en diferentes modelos animales de artritis (Badger AM et al., 1996). Además, un inhibidor de JNK (SP600125) proporcionó protección frente a la destrucción del hueso y cartílago en un ensayo llevado a cabo en modelos animales (Han Z et al., 2001). Por otra parte, una de las isoformas de JNK, JNK2, es particularmente importante en artritis, ya que se expresa predominantemente en sinoviocitos, y se ha visto que ratones knockout para JNK-2 sufren menos daño en el cartílago en comparación con ratones normales (Han Z et al., 2001). Introducción 17 AP-1 La proteína activadora 1, es un factor de transcripción que regula diferentes genes que participan en AR, incluyendo TNF-α y diferentes metaloproteasas. Los componentes de este factor de transcripción, c-Jun y c-Fos, están sobreexpresados en la sinovia de AR (Kinne RW, 1995). Diferentes citocinas inflamatorias activan AP-1 en los sinoviocitos, lo que provoca una expresión masiva de metaloproteasas. El bloqueo de AP-1 a través de oligonucleotidos, suprime la artritis inducida por colágeno (CIA, collageninducen arthritis) e inhibe la citocinas IL-1, IL-6 y TNF-α, así como las metaloproteasas MMP-3 y MMP-9. A pesar de que estas rutas de trasducción de la señal (NFκB y MAPK), así como el factor de transcripción AP-1 son potenciales dianas terapéutica, no hay demasiados datos publicados acerca de estudios donde se analice el papel de la variabilidad genética de las mismos. Por este motivo, sería interesante examinar la posible asociación genética entre la AR, y polimorfismos conocidos en genes claves en estas rutas de señalización celular. Genética de la AR La AR es una enfermedad compleja en la que los factores genéticos juegan un papel relevante. Se han obtenido evidencias de la influencia genética en AR a través de estudios de agregación en familias y estudios de concordancia en gemelos. En el primer caso, se ha observado que la prevalencia de la AR en los hermanos de los pacientes oscila entre el 2% y el 12%, mientras que la prevalencia en la población es solamente del 0,2-1% (Deighton CM et al., 1989). El riesgo relativo entre hermanos (λs) (que expresa el riesgo que tiene el Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 18 hermano de un enfermo de sufrir la enfermedad, comparado con el riesgo que tiene la población en general) es entre 2 y 17 veces mayor que en la población control (Silman AJ et al., 1999). Por su parte, los estudios con gemelos han mostrado que los índices de concordancia varían entre el 12% y el 30% en gemelos monocigóticos, y entre el 5% y el 10% en gemelos dicigóticos del mismo sexo (Aho K et al., 1986) (Silman AJ et al., 1993). A partir de estos datos, se ha estimado que el componente genético explica alrededor del 50% de la etiología de la AR (Harney S, Wordsworth BP, 2002). Los factores genéticos más importantes residen en el complejo mayor de histocompatibilidad o HLA (human leukocyte antigen), un complejo que se tratará más detenidamente en un apartado posterior, y al que se le atribuye un 30% del componente genético de la AR (Seldin MF et al., 1999). Para tratar de descubrir otros genes de susceptibilidad, se han llevado a cabo tanto estudios de ligamiento como estudios de asociación. Estos últimos pueden realizarse en familias, o como estudios caso-control. Actualmente, la posibilidad de realizar estudios de asociación caso-control del genoma completo (GWAs, genome wide associatios studies), ha supuesto una revolución en la identificación de factores genéticos de la AR. Estudio de ligamiento de genoma completo Los estudios de ligamiento de genoma completo se basan en el análisis de la cosegregación de loci y enfermedad, en familias con varios miembros afectados por una determinada enfermedad. Se estudian marcadores repartidos por todo el genoma. Si un marcador está en ligamiento con un locus de susceptibilidad, los miembros afectados de la familia tendrán el mismo alelo del Introducción 19 marcador. De esta manera se observan las regiones cromosómicas que segregan con la enfermedad, y se buscan posibles genes candidatos en las mismas. En AR se han realizado siete estudios de ligamiento llevados a cabo en poblaciones de Francia, Reino Unido, EEUU y Japón. Los resultados obtenidos confirman el papel del locus HLA, y aportan datos que apuntan a la existencia de muchos otros loci de susceptibilidad (MacKay K et al., 2002) (Jawaheer D et al., 2001) (Eyre S et al., 2004) (Cornelis F et al., 1998) (Shiozawa S et al., 1998) (Jawaheer D et al., 2003) (Osorio Y Fortéa J et al., 2004). Hasta cincuenta loci han mostrado evidencias de ligamiento en, al menos, un estudio. Sólo una minoría de estos loci han mostrado ligamiento en más de un estudio, y éstos son los más prometedores a la hora de localizar genes candidatos asociados con la enfermedad. Identificación de genes candidatos en loci de ligamiento. Un paso importante en la investigación genética de la AR, fue el de estudiar en detalle las amplias zonas que se habían propuesto en los estudios de ligamiento de genoma completo, en busca de genes de susceptibilidad a la AR. Lo que se denomina escaneado fino de la región. Para ello se realizaron estudios de asociación caso-control. En estos estudios de asociación se compara la frecuencia relativa de los polimorfismos entre una serie de individuos afectados y un grupo control adecuado. Con estos estudios se identifican “genes candidatos” (aquellos cuya función puede estar relacionada con la enfermedad de interés). Los marcadores más utilizados son los SNPs. Algunos de los estudios de ligamiento identificaron el locus 1p36 como una región de interés en la AR (Cornelis F et al., 1998) (Shiozawa S et al., Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 20 1998). Este locus contiene el gen TNFR2 (tumor necrosis factor receptor 2) que codifica para el receptor 2 de TNFα. La relevancia del papel de TNFα en la patofisiología de la AR, así como el hecho de que TNFR2 se localice dentro de uno de los loci de interés identificados, indica que este gen podría participar en la susceptibilidad a la AR. Se identificó un SNP que produce la sustitución de un residuo de arginina por un residuo de metionina en la posición 196 del gen (exón 6), y que altera la transmisión de señales intracelulares generadas cuando TNFα se une a TNFR2 (Morita C et al., 2001). Diferentes estudios llevados a cabo en población japonesa y holandesa no evidenciaron asociación entre dicho polimorfismo y la AR (Shibue T et al., 2000) (Bayley JP et al., 2003). Sin embargo, un estudio de asociación en población de Reino Unido con AR familiar mostró una asociación significativa con el alelo 196R, y un mayor riesgo para el genotipo 196R/R. Esta asociación restringida a AR familiar, fue confirmada por el mismo grupo de investigación en una cohorte independiente (Barton A et al., 2001). Además, la asociación entre el genotipo 196R/R se confirmó en un estudio llevado a cabo en Francia en una cohorte de pacientes, también con AR familiar. Sin embargo, los resultados obtenidos no son concluyentes, por lo que se necesitan estudios adicionales en colecciones de muestras independientes para confirmar el papel de TNFR2 en la susceptibilidad a la AR. Otro posible factor genético detectado a partir de los estudios de ligamiento es PADI4 (peptidyl arginine deiminase type IV) localizado en el mismo locus de interés que TNFR2, 1p36. Este locus contiene un cluster que incluye los genes para diferentes peptidilarginina deiminasas (PADIs). Estas enzimas catalizan la citrulinización de los residuos de arginina, que son blanco de una serie de autoanticuerpos específicos de AR como los anti-Sa, antifilaggrin y ACPA. La elevada especificidad de estos autoanticuerpos que casi Introducción 21 sólo se observan en pacientes con AR, sugiere que la citrulinización, y por tanto, las PADIs, pueden jugar un papel clave en la patofisiología de la enfermedad. Ocho SNPs del gen PADI4 se encontraron asociados con AR en un estudio japonés. La asociación más fuerte fue con el SNP denominado padi4_94*T/C. Además, un haplotipo definido por cinco SNPs exónicos (padi4_89*A/G, padi4_90*T/C, padi4_92*G/C, padi4_94*T/C, padi4_104*T/C), también se encontró asociado con la enfermedad (Suzuki A et al., 2003). Análisis posteriores revelaron que el haplotipo de susceptibilidad afectaba a la estabilidad del ARN mensajero de PADI4. La asociación genética entre PADI4 y la AR se confirmó en población japonesa (Ikari K et al, 2005) y población coreana (Kang CP et al., 2006). En otros estudios en población caucásica los resultados obtenidos no fueron concluyentes (Barton A et al., 2005) (Harney SM et al., 2005) (Martinez A et al., 2005) (Plenge RM et al., 2005) (Hoppe B et al., 2006). Recientemente, diferentes metaanálisis de los SNPs de PADI4 confirman la asociación entre PADI4 y la AR en población asiática, y apuntan a que esta asociación también se observa en población europea (Iwamoto T et al., 2006) (Lee YH et al., 2007) (Takata Y et al., 2008) El grupo japonés que identificó este haplotipo de susceptibilidad en PADI4, estudió también, la posible asociación entre el gen SLC22A4 (Solute carrier family 22 organic cation transporter, member 4), y AR (Tokuhiro S et al., 2003). Este gen está localizado en el locus 5q31 que muestra ligamiento a múltiples enfermedades con un componente inflamatorio, y que contiene potenciales genes candidatos debido a su efecto en las respuestas inmunes. El gen SLC22A4 se había visto asociado con enfermedad de Crohn y enfermedad inflamatoria crónica del tracto intestinal en poblaciones caucásicas (Costantin A et al., 2004) (Peltekova VD et al., 2004) (Fisher SA et al., 2006) (Silverberg Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 22 MS et al., 2007), enfermedades que tienen algunas similitudes con la AR. El grupo de Tokuhiro (2003) mostró la asociación de un SNP localizado en una secuencia intrónica con la AR. Este SNP está situado en una secuencia que contiene un lugar de unión para el factor de transcripción RUNX1 (runt-related transcription factor 1). La presencia del alelo de susceptibilidad resulta en una mayor afinidad por este sitio de unión, lo que provoca una menor transcripción de SLC22A4. Por lo tanto, este descenso en la producción de SLC22A4 puede estar jugando un papel en la patofisiología de la enfermedad. Con la finalidad de confirmar la asociación entre SLC22A4 y la AR, se han llevado a cabo diferentes estudios en población caucásica y japonesa (Newman B et al., 2005) (Barton A et al., 2005) (Kuwahara M et al., 2005) (Plenge RM et al., 2005) (Martínez A et al., 2006) (Orozco G et al., 2006) (Takata Y et al., 2008). En ninguno de los estudios se confirmó la asociación entre la variabilidad genética en SLC22A4 y susceptibilidad a la AR. Recientemente, un estudio en japoneses llevó a cabo un metaanálisis con los datos de todos los trabajos en los que se analizaba el polimorfismo de este gen. Además, realizó un estudio de confirmación en una colección de muestras japonesas independiente (Okada Y et al., 2008). Los resultados obtenidos confirman la asociación entre el polimorfismo de SLC22A4 y la AR en japoneses pero no en caucásicos. Probablemente la falta de asociación en caucásicos se deba a que la menor frecuencia del alelo de riesgo en esta población, disminuye el poder estadístico de estos estudios, en relación con los realizados en japoneses. Por lo tanto, estudios independientes serían necesarios para aclarar el papel que juega la variabilidad genética de SLC22A4 en la etiología de AR Estos resultados establecen el valor de los estudios de ligamiento y proporcionan una visión clara de la complejidad de la susceptibilidad genética de la AR. Sin embargo, los resultados obtenidos no son del todo sólidos por la Introducción 23 falta de confirmación de los mismos. Esto puede deberse, por una parte, a los tamaños muestrales reducidos tanto de los estudios de ligamiento que sugieren estos genes candidatos, como de alguno de los estudios de asociación casocontrol de esos genes propuestos. Por otro lado, estos factores genéticos pueden tener un efecto modesto o pequeño en la predisposición a la enfermedad, y esto explicaría que la magnitud de los efectos observados para la mayoría de los loci sean débiles (Lander Es, Schork NJ, 1994) (Wandstrat A, Wakeland E, 2001). Estudios de asociación de genes candidatos Otros genes candidatos han sido estudiados con independencia de los estudios de ligamiento. Este es el caso del gen que codifica para la proteína 4 asociada con linfocitos T citotóxicos (CTLA-4, cytotoxic T-lymphocyte antigen4 gene) y el gen que codifica para la fosfatasa de tirosina linfocitaria Lyp (PTPN22, protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 22 (lymphoid)). Estos genes habían mostrado una asociación contrastada con otras enfermedades de carácter autoinmune (enfermedad de Graves, en el caso de CTLA-4 y diabetes de tipo 1 en PTPN22), y es posible que el mismo gen participe en la patofisiología de diferentes enfermedades de este tipo (Pearce HS, Merriman T, 2006). Alguno de los genes comentados anteriormente como IL-1, IL-1RA, TNF, así como otros muchos, han suscitado interés debido a su implicación en la patogenia de la AR, y por ello, se ha estudiado si la variabilidad genética de los mismos podría afectar a la susceptibilidad a AR. Algunos se comentarán a continuación y dos de ellos, PTPN22 y STAT4, se tratarán en un apartado posterior donde se analizarán los factores genéticos confirmados. Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 24 El gen CTLA-4 está situado en la región 2q33, y codifica para un receptor de carácter inhibidor que pertenece a la familia CD28/B7. Este receptor es necesario para controlar la estimulación de los linfocitos T (Chambers CA et al., 2001). Distintos alelos localizados dentro de la región 3´UTR de CTLA-4 se vieron asociados con la enfermedad de Graves (Yanagawa T et al., 1995). El SNP que presentó una mayor asociación con esta enfermedad fue el denominado CT60*G (Ueda H et al., 2003). Además, un SNP codificante localizado en el codón 17 del gen, también se vio asociado con diabetes tipo I (Nistico L et al., 1996). La asociación de estas enfermedades con CTLA-4 se confirmó en otros estudios (Donner H et al., 1997) (Kotsa K et al., 1997) (Vaidya B et al., 1999) (Kristiansen OP et al., 2000) (Ueda H et al., 2003) (Han S et al., 2005). En el caso de la AR, se estudió la asociación del polimorfismo +49A/G de CTLA-4. Los resultados obtenidos no fueron concluyentes. Cuatro estudios (Seidl C et al., 1998) (Yanagawa T et al., 2000) (Lee CS et al., 2003) (Lei C et al., 2005) encontraron una asociación entre este polimorfismo y AR. Otros siete estudios (Barton A et al., 2000) (Matsushita M et al., 2000) (Hadj Kacem H et al., 2001) (Milicic A et al., 2001) (Vaidya B et al., 2002) (Lee YH et al., 2002) (Miterski B et al., 2004) no observaron dicha asociación. Las discrepancias podían estar justificadas debido tanto al insuficiente tamaño muestral de cada estudio, como a que el efecto de este polimorfismo en la AR fuera pequeño. Por lo tanto, el grupo de Han S (Han S et al., 2005) llevó a cabo un metaanálisis con los estudios caso-control publicados. Los resultados de dicho metaanálisis sugirieron que el alelo +49G no parece ser un factor de riesgo para AR en europeos, sin embargo, puede jugar un papel en la susceptibilidad a AR en asiáticos. El SNP CT60*G también se estudió en relación con susceptibilidad a la AR. Dos estudios diferentes no encontraron asociación con la enfermedad Introducción 25 (Orozco G et al., 2004) (Barton A et al., 2004).Por otra parte, un estudio de genes candidatos llevado a cabo por el grupo de Plenge (Plenge RM et al., 2005) observó asociación entre este polimorfismo de CTLA-4 y la AR. La falta de resultados concluyentes no permite destacar CTLA-4 como un factor genético de riesgo en susceptibilidad a la AR Otros genes que se estudiaron como candidatos en la susceptibilidad a la AR fueron la IL-1 y el IL-1RA. En el caso de la IL-1, múltiples estudios demuestran que esta citocina es un importante mediador de las enfermedades inflamatorias (Choy EH, Panayi GS, 2001) (Mrak RE, Griffin WS, 2001) (Libby P, 2002). Estudios de asociación también han sugerido una influencia genética de la región de IL-1 en una gran variedad de enfermedades con componente inflamatorio (Duff GW, 2000) (Griffin WS et al., 2000) (Francis SE, 1999) (Kormman KS et al., 1997) (El-Omar EM et al., 2000) (Jacoviello L et al., 2005). La AR es sin duda una enfermedad con un fuerte componente inflamatorio, y de forma particular, la IL-1 interviene en la patogénesis de la enfermedad (Koch AE et al., 1995). Diferentes estudios, han sugerido la asociación entre polimorfismos en el cluster de la IL-1 y severidad de AR (Cantagrel A., 1999) (Buchs N., 2001) (Trifunovic Cvetkovic J., 2002) (Genevay S, 2002). Así, Cantagrel y sus colaboradores, que estudiaron diferentes polimorfismos situados en los genes de IL-1 β e IL-1Ra, encontraron dos SNPs en IL-1 β que afectaban a la producción de la proteína. Uno de ellos estaba situado en el promotor (-511), y el otro estaba localizado en el exón 5 (+3954) (Di Giovanni FS, 1992) (Pociot F, 1992). Ninguno de los dos SNPs estaba asociado con susceptibilidad a la AR, pero sí se observó un incremento significativo en la frecuencia del alelo raro del polimorfismo +3954 en el subgrupo de pacientes con AR erosiva, y que además portaban el SE (Cantagrel A., 1999). En el estudio publicado por Busch se analizaron de nuevo estos dos Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 32 El grupo de Plenge llevó a cabo otro GWA con la finalidad de identificar nuevos alelos asociados con susceptibilidad a la AR. En este caso se genotiparon 116204 SNPs en 397 pacientes con AR ACPA positivos que compararon con 1211 individuos control (Plenge RM et al., 2007b). Identificaron un SNP en la región 6q23 (rs10499194) localizado a unas 150 kb de los genes TNFAIP3 y OLIGO3. Esta asociación se confirmó en una colección de muestras independientes constituida por un total de 2283 pacientes con AR, también ACPA positivos, y 3258 controles. Simultáneamente, el WTCCC publicó su GWA en el que se informaba de la asociación entre un SNP localizados a 3.8 kb del rs10499194 (rs6920220) y AR (Wellcome Trust Association Consortium, 2007). El grupo de Plenge demostró que ambas señales de asociación eran estadísticamente independientes. El último de los GWA publicados en AR hasta el momento se llevó a cabo en población española (Julià A et al., 2008). Este estudio analizó 317503 SNPs en 400 pacientes con AR y 400 controles. Identificaron el locus KLF12 (activador protein 2 α [AP-2 α ] represor) como un nuevo gen de susceptibilidad a la AR. Este gen es un inhibidor del factor de transcripción AP-2α (Schuierer M et al., 2001) El patrón de expresión de los genes regulados por este factor de transcripción, que incluyen el gen TNF α , ha sido implicado en respuestas a estrés y transformación celular (Kannan P et al., 1994) (Wajapeyee N, Somasundaram K, 2003). La asociación genética de KLF12 con la AR, y su implicación directa en la regulación de TNF α , podría suponer una nueva perspectiva en las interacciones ambiente-genética asociadas con susceptibilidad a la AR Tras la realización de los estudios de GWA, los grupos de investigación responsables de su desarrollo intentaron confirmar las señales, que sin llegar al Introducción 33 valor de p mínimo establecido para este tipo de estudios, alcanzaban niveles cercanos que las hacían susceptibles de confirmación. Por lo tanto, las nueve señales con valores de p entre 10-5 y 5x10-7 en el primero de los GWA, fueron de nuevo genotipadas, en una cohorte de muestras independiente (Thomson W et al., 2007). Solamente se confirmó la asociación para uno de los polimorfismos (rs6920220) localizado en la región intergénica 6q23. Esta señal (de la que se hablará detalladamente en un apartado posterior) apareció asociada en estudios posteriores, que además mostraron otros polimorfismos asociados en esta región (Plenge RM et al., 2007b). De forma similar, otras señales con valores de p menos claros entre 10-4 y 5x10-5 han sido también estudiadas en nuevas colecciones de muestras. Tres de ellas (rs4750316, rs1678542 y rs3218253) localizadas en los loci 10p15, 12q13 y 22q23 respectivamente, han sido confirmadas (Barton A et al., 2008). El gen más próximo a la señal localizada en el locus 10q15 es PKCQ. Este gen tiene un papel importante en la activación de las células T, ya que ratones deficientes en esta proteína manifiestan una marcada disminución en la producción de IL-2 (Hayashi K, Altman A, 2007). Por su parte, el SNP rs1678542, localizado en la región 12q13, se sitúa en el intrón 15 de gen KIF5A. Este gen codifica para la cadena pesada de una quinesina, algunas de cuyas mutaciones se han visto asociadas con un tipo de paraplejia (Fichera M et al., 2004). Más prometedor parece uno de los genes próximos PIP4K2C (phosphatidinositol-5-phosphate 4kinase, type II, gamma), ya que se expresa en células B y parece tener un papel importante en la activación del receptor de estas células, así como durante el desarrollo de los linfocitos B (Niiro H, Clark EA, 2003). Por último, el SNP rs3218253 se localiza en el intrón 1 del gen IL2R, que es otro buen candidato funcional en la susceptibilidad a AR. Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 34 Recientemente, se llevó a cabo un metaanálisis de los dos primeros GWA publicados (The Wellcome Trust Case Control Consortium, 2007) (Plenge RM et al., 2007a). En este estudio se analizaron 340000 SNPs en un total de 3393 casos y 12462 controles (Raychaudhuri S et al., 2008). Se obtuvieron 31 SNPs que presentaban nuevas señales de asociación y éstos se analizaron en una cohorte independiente constituida por un total de 3929 pacientes con AR, positivos para el FR o ACPA, y 5807 controles. De esta forma se confirmaron variantes asociadas en CD40 (TNF receptor superfamily member 5) y CCL21 (Chemokine (C-C motif) ligand 21). También se observaron evidencias de asociación en cuatro loci adicionales: MMEL1-TNFRSF14 (membrane metalloendopeptidase-like1tumor necrosis factor receptor superfamily, member 14), CDK6 (Cyclin-dependent_kinase_6), PRKCQ (protein linase C, theta) y KIF5A-PIP4K2C (kinesin family member 5ªphosphatidylinositol-5-phosphate 4-kinase, type II, gamma). Sin duda, la señal más importante de estas últimas fue la de CD40 (rs4810485), no solamente por ser la asociación más clara, sino también por sus implicaciones biológicas. CD40 es un receptor que se expresa en la superficie de múltiples células del sistema inmune, incluyendo las células B, monocitos y células dendríticas. Este receptor está indirectamente implicado en la ruta NFκB, ya que TRAF1 se une a CD40 y coopera con TRAF2 para activar NFκB. Además, TRAF1 también su une a TNFAIP3, regulador negativo de NFκB. Por otra parte, el estudio de la ruta de señalización a través de CD40 en modelos animales y en el desarrollo de ciertas drogas, ha demostrado que el bloqueo de esta ruta podría prevenir el desarrollo de la AR y la diabetes (Balasa B et al., 1997) (Durie FH et al., 1993). El polimorfismo asociado está fuertemente correlacionado (r2=0.95) con otro polimorfismo (rs1883832) que se había visto asociado con enfermedad tiroidea autoinmune (Jacobson EM et al., 2007). Este Introducción 35 último SNP produce una traducción incorrecta del receptor CD40 lo que podría causar la asociación con la AR. Por lo tanto, y haciendo una reflexión general de los visto hasta el momento, los GWA han permitido pasar de dos locus claramente asociados con susceptibilidad a la AR (HLA-DRB1 y PTPN22), a cuatro factores genéticos más, cuya asociación con la enfermedad ya ha sido confirmada (6q23, TRAF1C5, STAT4, TNFAIP3), así como un conjunto de nuevas señales que se están corroborando en colecciones de muestras independientes como por ejemplo, CD40. La amplia cobertura genética, así como los tamaños muestrales de los que disponen estos estudios, facilitan la búsqueda de factores de riesgo asociados a una enfermedad. Sin embargo, y aunque los GWA superen la resolución de los estudios de ligamiento y los estudios de asociación casocontrol, siguen teniendo ciertas limitaciones como son la detección de falsos positivos y falsos negativos. Un ejemplo de falsos negativos sería el hecho de que TRAF1-C5 y STAT 4 no se detectó como señal de asociación en el primero de los GWA (The Wellcome Trust Case Control Consortium, 2007), pero sí en el estudio llevado a cabo por Plenge y sus colaboradores (Plenge RM et al., 2007a). En cuanto a señales que resultan ser falsos positivos, ese primer estudio de genoma completo, detectó hasta nueve loci con valores de p situados entre 10-5 y 5x10-7, de los cuales solamente se confirmó la asociación para uno de los polimorfismos (rs6920220) localizado en la región intergénica 6q23. Por lo tanto, esto apoya la necesidad de la confirmación de las señales de asociación obtenidas, así como la continuación en la búsqueda de nuevas señales de asociación con la AR. Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 36 Factores genéticos asociados con AR Mediante el uso de las diferentes metodologías de estudio expuestas hasta ahora, los factores genéticos más claramente asociados con la susceptibilidad a la AR son HLA-DRB1, y PTPN22. Además, como también se comentaba anteriormente, otros loci de asociación han sido confirmados en estudios independientes, como TRAF1-C5, la región intergénica 6q23, el gen STAT4 e IRF5. De todos ellos se hablará detalladamente a continuación: HLA. Organización y nomenclatura El Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC, major histocompatibility complex) se localiza en el brazo corto del cromosoma 6p21.3 y se extiende sobre 3,6 Mb. Se divide en tres subregiones que se denominan Clase I, situada en posición telomérica, Clase III, y Clase II que es la más centromérica. En total contiene unos 220 genes, muchos de los cuales tienen funciones relacionadas con las respuestas inmunes. Los loci HLA-A, B y C codifican moléculas (antígenos) que se expresan en todas las células nucleadas y cuya función es la de presentar péptidos intracelulares a los linfocitos T. Estos antígenos se denominan de Clase I. Por otra parte, los loci HLA-DR, DQ y DP codifican las moléculas que presentan péptidos procedentes de la degradación de bacterias o proteínas fagocitadas. Estos péptidos son procesados por células del sistema inmune. Los antígenos HLA-DR, DQ y DP se agrupan bajo la denominación de antígenos de Clase II. Solamente se expresan en células implicadas activamente en la respuesta Introducción 37 inmunitaria como los linfocitos B, los monocitos y los linfocitos T activados. Los genes de Clase III no pertenecen al sistema HLA, y por tanto, no están implicados en la presentación de péptidos. Entre ellos se encuentran algunos genes que también están relacionados con la respuesta inmune como son algunos componentes del sistema del complemento y TNF. Tanto las moléculas de Clase I como las de Clase II, son glicoproteínas heterodiméricas. En el caso de las moléculas de Clase II, el heterodímero está formado por una cadena α y una cadena β. Una característica distintiva del HLA es su gran polimorfismo. Así, por ejemplo, hay más de 400 alelos del gen HLA-DRB1, o más aún, aproximadamente 600 alelos del gen HLA-B. Otra característica de esta región es el fuerte desequilibrio de ligamiento (LD) existente, que se traduce en una baja densidad de haplotipos. Este fuerte LD en el MHC supone un problema a la hora de diferenciar qué genes están realmente predisponiendo a una enfermedad (Undlien DE et al., 2001). El epítopo compartido Tanto los estudios de segregación en familias, como los de concordancia en gemelos y los estudios de asociación en la población, demuestran que el MHC, y en concreto el locus HLA-DR, es el factor genético más importante en la predisposición a la AR. Se estima que contribuye, al menos, en un tercio del componente genético total (Seldin MF et al., 1999). La primera evidencia de asociación entre genes pertenecientes al HLA y la predisposición a AR, fue aportada por Stastny en 1976 (Stastny P, 1976). Análisis posteriores concretaron que la asociación provenía del locus HLA-DR, en concreto de los alelos DR4 y DR1 del gen DRB1 (Stastny P, 1978) Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 38 (Woodrow JC et al., 1981). El desarrollo de técnicas de genotipado más resolutivas, llevaron a la demostración de que los diferentes alelos DR4 y DR1 no estaban igualmente asociados con AR. Además, estudios en diferentes poblaciones demostraron que otros alelos de DRB1 también estaban asociados con la enfermedad. Estos hallazgos apuntaban a que la complejidad de la asociación entre HLA-DRB1 y la AR era mayor de lo que en un principio se presuponía. Gregersen y sus colaboradores (Gregersen PK et al., 1987), fueron los primeros en unificar los diferentes alelos de HLA-DRB1 asociados con la AR, bajo la hipótesis del epítopo compartido (SE, shared epitope). Demostraron que la AR está asociada con alelos de DRB1 que codifican para una secuencia aminoacídica conservada, situada en la tercera región hipervariable de la cadena DRβ1. Esta secuencia se extiende desde la posición 70 a la 74 de la cadena aminoacídica: 70QKRAA74, 70QRRAA74 , 70RRRAA74. Estos residuos forman parte de uno de los dominios hélice α que conforma, el lugar de unión al péptido. Los alelos que codifican esta secuencia nucleotídica son DBR1*0401, *0404, *0405, *0408, *0101, *0102, *1001 y *1402. La hipótesis del SE asume que estas moléculas de Clase II están directamente implicadas en la patogenia de la AR, pero el mecanismo exacto no se conoce. Estudios recientes han postulado la hipótesis de que los alelos SE suponen un riesgo para el desarrollo de ACPA de forma directa, y que su efecto sobre la susceptibilidad a la AR sería consecuencia de esta asociación. Además parece existir una interacción entre los alelos SE y uno de los factores ambientales implicados en AR, el tabaquismo, de tal manera que esta interacción predispone también a la aparición de ACPA. La hipótesis postula que la exposición al tabaco genera la citrulinización de péptidos/proteínas que desencadenan reacciones autoinmunes específicas. Estas reacciones se mantienen a lo largo del tiempo, y eventos secundarios como traumas o infecciones, generan Introducción 39 sinovitis inespecíficas y la consecuente citrulinización en el tejido. En individuos que presentan ACPA esta sinovitis puede desencadenar una enfermedad crónica articular (van der Helm-Van Mil AH et al., 2007) (Figura 6). RF + ACPA + Comienzo de la enfermedad Tabaquismo Factores secundarios SE+ RF + ACPA + Comienzo de la enfermedad Tabaquismo Factores secundarios RF + ACPA + Comienzo de la enfermedad Tabaquismo Factores secundarios SE+ Figura 6: Perfil temporal de la interacción de SE, tabaquismo, ACPA y AR (figura modificada de Klareskog L et al., 2006) Existen diferencias regionales en cuanto a la asociación del HLA con AR. Por ejemplo, se ha descrito una mayor asociación de HLA-DRB1*0401 y *0404 con la enfermedad en americanos y poblaciones del Norte de Europa. En contraste, el alelo HLA-DRB1*1001, es más frecuente en población española que en otras poblaciones (Ollier W, Thomson W, 1992). Además, existen estudios que evidencian que los alelos SE clásicos no parecen contribuir al riesgo de AR en poblaciones afroamericanas ni hispanoamericanas (McDaniel DO et al., 1995) (Teller K et al., 1996). También se ha visto asociado a la AR el alelo *0901 en poblaciones asiáticas. Este alelo no contiene la misma secuencia aminoacídica conservada de los alelos SE clásicos, 70RRRAE74. Por otra parte, en población caucásica se ha observado una jerarquía en los alelos SE en función del riesgo relativo (RR). El alelo *0401 tiene un RR de 3 y los alelos *0101, *0404, *1001 y *0901 tienen un RR más moderado, de Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 40 aproximadamente 1.5 (Fernando MM et al., 2008). Así mismo, se ha descrito una jerarquía en el efecto de los distintos genotipos que contienen alelos SE. De este modo, para le genotipo DRB1*0401/DRX, donde X es un alelo que no codifica para SE, el riesgo relativo (RR) de desarrollar la enfermedad es de 4,7; en el caso del genotipo DRB1*0404/DRX el RR es 5. Cuando el paciente es homocigoto para DRB1*0401/*0401 el RR es de 18.8, y si es heterocigoto del tipo DRB1*0401/*0404 tienen un RR de 31 (Hall FC et al., 1996). El efecto de asociación del homocigoto *0404/*0404 todavía no se ha comparado con los heterocigotos *0401/*0404. También se ha descrito una jerarquía en la asociación de los diferentes alelos SE y severidad de la AR. Así, las manifestaciones más severas de la enfermedad se observan en pacientes homocigotos para *0404 o *0401 y heterocigotos para los alelos DRB1*0401, *0404 y *0408 (Weyand CM et al., 1992). Hipótesis alternativas La hipótesis de la asociación del SE con AR, es la más aceptada, sin embargo, existen hipótesis alternativas que sugieren que la asociación se debe, en realidad, a los alelos de HLA-DQ, en concreto DQ3 y DQ5. De todas formas, debido al fuerte desequilibrio de ligamiento de estos alelos con alguno de los alelos SE, es difícil discernir una contribución independiente. Además de los efectos de predisposición mencionados, existen determinados haplotipos de HLA-DRB1, que parecen aportar protección ante la AR. Esos haplotipos contienen, en lugar del SE, la secuencia aminoacídica conservada 70DERAA74. Los alelos del HLA-DRB1 que la contiene son Introducción 41 DRB1*0103, *0402, *1102, *1103, *1301, *1302 y *1304 (van der HorstBruinsma IE et al., 1999) (Seidl C et al., 2001). Los primeros estudios que aportaron estas evidencias carecían de potencia estadística (van der HorstBruinsma IE et al., 1999) (Vos K et al., 2001). Sin embargo, estudios recientes han confirmado que los alelos HLA-DRB1 que contienen la secuencia DERAA están asociados con protección frente a la AR tanto en individuos portadores de alelos SE, como en individuos portadores de alelos “neutros”. Por lo tanto, este efecto protector es independiente del efecto de los alelos SE (van der Helm-van Mil AH et al., 2005). Por último, diferentes investigadores han propuesto la necesidad de una reclasificación de los alelos del HLA, ya que la hipótesis del SE como tal, no puede explicar todo el riesgo genético atribuible al locus HLA-DRB1 (Gao X et al., 1991) (Zanelli E et al., 1998) (de Vries N et al., 2002) (Michou L et al., 2006). Sin embargo, no se ha establecido ninguna clasificación consensuada PTPN22 El gen PTPN22 se localiza en el cromosoma 1p13 y codifica para una fosfatasa de tirosina linfoide (Lyp), que modula la activación de quinasas implicadas en la ruta de señalización intracelular desencadenada por la unión del TCR en los linfocitos T (Hill RJ et al., 2002). Un SNP no sinónimo en PTPN22 (rs2476601, R620W), que produce un cambio de una arginina por triptófano en el codón 620 de la proteína, se ha encontrado asociado con múltiples enfermedades autoinmunes. El primer estudio que evidenció la asociación de este polimorfismo con una enfermedad de este tipo, fue un estudio de genes candidatos en diabetes tipo 1 (Bottini N et al., 2004). Esta asociación se confirmó en otros estudios (Smyth D et al., 2004) (Ladner MB et Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 48 receptor de células T, sugiriendo que TRAF1 actúa como un regulador negativo de estas rutas de señalización (Tsitsikov EN et al., 2001). TRAF1 se une a diferentes proteínas intracelulares incluyendo el inhibidor de NFκB, TNFAIP3, y el receptor CD40, cooperando con TRAF2 para activar NFκB (Bradley JR, Pober JS, 2001) C5 también se presenta como un buen candidato en susceptibilidad a la AR. La ruta del complemento es esencial en la inducción de artritis inflamatoria a través de autoanticuerpos, al menos en dos modelos de ratones (Ji H et al., 2002) (Hietala MA et al., 2002) (Wang Y et al., 1995). El papel del complemento en la AR humana ha sido difícil de establecer, pero diferentes hallazgos sugieren una contribución de esta ruta a la enfermedad. Así, en el líquido sinovial de AR, pero no en otros tipos de artritis inflamatorias, se ha visto que los componentes del complemento están disminuidos (Pekin TJ et al., 1964). Además, existe una clara evidencia de la presencia de productos de degradación del complemento en el líquido sinovial (Monlles TE et al., 1986) (Olmez U et al., 1991). En la misma línea, se ha demostrado que C3 se deposita en la superficie del cartílago y en la sinovia de pacientes con AR (Cooke TD et al., 1975) (Vetto AA et al., 1990), tal y como se había visto en varios modelos de ratones (Matsumoto I et al., 2002) (Stuart JM et al., 1983) (van den Berg EB et al., 1984). Del mismo modo, se sabe que ratones deficientes para C5 son resistentes a artritis inflamatoria en modelos con un componente humoral dominante (Wang Y et al., 2000) (Ji H et al., 2001). Estos datos apoyan el potencial papel tanto de TRAF1 como C5 en la susceptibilidad a la AR. Introducción 49 IRF5 La familia de factores reguladores del interferón (IRF, interferon regulatory factors) comprende 9 miembros desde el IRF1 al IRF9. Estos factores comparten un dominio de unión constituido por un motivo de aproximadamente 120 aminoácidos, que reconoce una secuencia consenso de ADN conocida como ISRE (INF-Stimulated Response Element) (Kyogoku C Tsuchiya N, 2007). Esta secuencia consenso se encuentra en los promotores de múltiples genes que son activados por el INF de tipo I, como son: INF α , INF β , IL-12, CXCL10 (C-X-C motif chemokine 10 presursor) e IFIT1 (Interferoninduced protein with tetratricopeptide repeats) (Taniguchi T, Takaska A, 2001). El gen que codifica para el factor regulador del interferón 5 (IRF5) se encuentra situado en el cromosoma 7q32. Este gen presenta una transcripción compleja ya que contiene 3 promotores conocidos y al menos 11 variantes de su RNA mensajero (V1-V11) debido a splicing alternativo (Mancl ME et al., 2005) (Graham. RR et al., 2006). Este factor de transcripción se expresa en linfocitos B y células dendríticas, y su expresión aumenta al activarse la vía del IFN de tipo I (Mancl ME et al., 2005) (Izaguirre A et al., 2003). Se activa en respuesta a señales de la ruta TLR-MyD88 y como consecuencia, induce la expresión de múltiples genes incluyendo citocinas por-inflamatorias. En infecciones víricas, su función reguladora de estas citocinas se produce en cooperación con NFκB. En este caso, recibe las señales de los TLR desde los endosomas. (Barnes BJ et al., 2002) (Fitzgerald-Bocarsly P et al., 2008) (Honda K et al., 2005) (Akahoshi M et al., 2006). Sin embargo, sus efectos no se limitan a las citocinas proinflamatorias, así, cuando se analizó el patrón de genes expresados en linfocitos B humanos en relación con IRF5, se encontró que 657 genes (568 aumentados y 89 disminuidos) estaban regulados (Barnes BJ et al., 2004). Estos resultados Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 50 demuestran la importancia de este factor en la regulación de la expresión de un amplio espectro de genes. IRF5 es uno de los principales factores genéticos de susceptibilidad al LES. En un primer estudio, se demostró la asociación de diferentes polimorfismos del locus IRF5 con esta enfermedad autoinmune en población de Suecia, Finlandia e Islandia (Sigurdsson S et al., 2005). Los datos obtenidos en este estudio muestran la clara asociación de 3 SNPs (rs729302, rs2004640, rs752637) de la región 5´ del gen. Esta asociación de IRF5 con LES fue confirmada en diferentes estudios en los que se analizaba población caucásica y asiática (Demirci FY et al., 2006) (Graham. RR et al., 2006), (Cunnighame Gram. DS et al., 2007) (Graham. RR et al., 2007) (Kozyrev SV et al., 2007) (Reddy MV et al., 2007) (Shin HD et al., 2007) (Ferreiro-Neira I et al., 2007). Los resultados incluyen tanto la asociación con susceptibilidad a la enfermedad, como con protección a la misma, y se conocen, al menos, tres polimorfismos potencialmente funcionales implicados. Uno es el SNP rs10954213, que afecta a la estabilidad del mensajero de IRF5, debido a que produce un cambio en la longitud de la cola de poli A del RNA (Cunnighame Gram. DS et al., 2007) (Graham. RR et al., 2007). Un segundo SNP, rs2004640, crea un donor splice site, necesario para la expresión del exón 1B de IRF5 (uno de los tres posibles primeros exones) (Graham. RR et al., 2006) (Kozyrev SV et al., 2007). Un tercer polimorfismo, es una inserción/deleción que modifica, en 10 aminoácidos, la longitud de una secuencia rica en prolina en el exón 6 (Graham. RR et al., 2007) (Kozyrev SV et al., 2007). Existen evidencias que muestran una relación entre los IFNs tipo 1 y la AR. Así, se ha visto que artritis inflamatorias pueden desencadenarse por el tratamiento con IFN tipo 1, aunque esto sucede de forma poco habitual (Borg Introducción 51 FA, Isenberg DA, 2007). También se ha visto un aumento en la expresión de IFNβ (van Holten J et al., 2005) y un incremento en el número de células dendríticas plasmocitarias, que son la fuente principal de IFNs de tipo 1, en la sinovia y el tejido sinovial de pacientes con AR (Lande R et al., 2004).Por otra parte, análisis de microarrays de la expresión génica en AR, muestran una expresión aumentada de genes regulados por el INF de tipo 1, en un subgrupo de pacientes de AR (van der Pouw Kraan TC et al., 2007). Estos hallazgos junto con la implicación en la AR de muchas citocinas y quimiocinas reguladas por IFN tipo 1 e IRF5, podrían interpretarse como que estos factores son proinflamatorios en la AR. Sin embargo, experimentos en modelos animales de artritis evidenciaron un posible papel protector de IFN β (Tak PP, 2004). Además, un ensayo clínico basado en el tratamiento con IFNβ no mostró que se produjera una mejora de la AR, ni tampoco se observaron cambios en biopsias secuenciales de la sinovia (van Holten J et al., 2005). Por lo tanto, aunque existen evidencias que sugieren que el IFN de tipo 1 puede ser importante en la AR, no está claro si el papel que juega es de tipo pro-inflamatorio o antiinflamatorio. Los estudios en los que se ha analizado la posible asociación de polimorfismos en IRF5 con AR, han mostrado resultados poco concluyentes. Por una parte, dos estudios no evidencian asociación entre la variabilidad genética en este gen y la enfermedad (Rueda B et al., 2006) (Garnier S et al., 2007) Sin embargo, en otro estudio se observa una asociación, pero únicamente en el subgrupo minoritario de pacientes que no tienen ACPA (Sigurdsson S et al., 2007). Con la finalidad de esclarecer estos resultados, es necesario estudiar el papel que juega IRF5 en AR en cohortes de muestras independientes. Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 52 Por lo tanto, mediante el uso de una gran variedad de metodologías como estudios de ligamiento, estudios de genes candidato y estudios de asociación genética a gran escala, una serie de trabajos recientes han ido identificando algunos de los factores genéticos implicados en la AR. El más robusto después del HLA-DRB1 es PTPN22, el cual se ha visto repetidamente asociado con AR en individuos de ancestro europeo (Begovich AB et al., 2004) (Plenge RM et al., 2005) (Gregersen PK, Behrens TW, 2006). Además estudios de ligamiento evidenciaron variantes de susceptibilidad en el locus 1p36 en el que se encuentra situado el cluster de PADIs que incluye a PADI4 (Suzuki A et al., 2003) (Lee YH et al., 2007). Del mismo modo, estudios de asociación con un considerable poder estadístico identificaron una serie de SNPs en STAT4 asociados con AR (Remmers EF et al., 2007), la región 6q23 (Plenge RM et al., 2007a) (Thomsom E et al., 2007) y TRAF1-C5 (Plenge RM et al., 2007b) (Kurreeman FA et al., 2007). Otros loci que se han visto asociados con la AR, aunque con resultados menos concluyentes son por ejemplo, el SNP localizado en el lugar de unión de SLC22A4 a RUNX1 (Tokuhiro S et al., 2003) (Okada Y et al., 2008). IRF5 es otro de los genes en los que se ha visto asociación entre diferentes polimorfismos y la AR, aunque en este caso, la asociación parece ser más clara en determinados subgrupos de pacientes (Sigurdsson S et al., 2007). Algunos de estos polimorfismos asociados con AR presentan diferencias en cuanto al tamaño del efecto según el grupo étnico; así por ejemplo, las variantes asociadas con la enfermedad en PADI4 parecen tener un efecto más fuerte en asiáticos del este y un menor efecto en descendientes de Europeos (Plenge RM et al., 2005). De forma similar, el alelo de riesgo W620 de PTPN22 es muy raro en asiáticos y por lo tanto, no juega un papel en la susceptibilidad a AR en esta población (Gregersen PK et al., 2006). Introducción 53 Debido a la etiología de la AR, los estudios genéticos suponen una herramienta básica en el estudio de esta enfermedad. Además, como han demostrado algunos de estos estudios genéticos, fundamentalmente estudios de tipo metaanálisis y estudios de ligamiento, algunas de las variantes implicadas en susceptibilidad a la AR muestras efectos pleiotrópicos en otras enfermedades de carácter autoinmune (Gregersen PK et al., 2006) (Remmers EF et al., 2007) (Bottini N et al., 2004) (Wellcome Tust Case Control Consortium). Por lo tanto, la identificación de nuevos factores genéticos de riesgo a la AR, permitiría elucidar los mecanismos que subyacen a la autoinmunidad en varias enfermedades de carácter autoinmune, así como mejorar los tratamientos existentes mediante el estudio de nuevas dianas terapéuticas. De ahí la necesidad de seguir descubriendo nuevos factores genéticos implicados en la AR, así como identificar las variantes funcionales de las señales asociadas conocidas. Hipótesis Hipótesis 57 Hipótesis 1. Los factores genéticos explican alrededor de un 50% de la etiología de la AR. 2. Los estudios de asociación caso-control de genes candidatos suponen una herramienta muy útil a la hora de investigar y establecer los factores genéticos implicados en la patofisiología de la AR 3. La confirmación de los resultados obtenidos en un primer estudio genético, en estudios independientes, es imprescindible para asentar conclusiones sólidas que permitan el progreso en este área de la investigación biomédica Procedimiento experimental, resultados y discusión 65 Procedimiento experimental, resultados y discusión Esquema general 1 NFκB en AR Publicación 1: • Dieguez-Gonzalez R, Akar S, Calaza M, Perez-Pampin E, Costas J, Torres M, Vicario JL, Velloso ML, Navarro F, Narváez J, Joven BE, Herrero-Beaumont G, Gonzalez-Alvaro I, Fernandez-Gutierrez B, de la Serna AR, Carreño L, Lopez-Longo J, Caliz R, Collado-Escobar MD, Blanco FJ, Fernandez-Lopez C, Balsa A, Pascual-Salcedo D, Gomez-Reino JJ, Gonzalez A. Genetic variation in the NFKB pathway in relation to susceptibility to rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. Abril 2008 [Epub ahead of print] 2 TNFAIP3 y región 6q23 Publicación 2: • Dieguez-Gonzalez R, Calaza M, Perez-Pampin E, Balsa A, Blanco FJ, Cañete JD, Caliz R, , Carreño L, de la Serna AR, Fernandez-Gutierrez B, Ortiz AM, Herrero-Beaumont G, de Pablos JL, Narváez J, Navarro F, Marenco JL, Gomez-Reino JJ, Gonzalez A. TNFAIP3, a Feedback inhibitor of NFKB, and the neighbour intergenic 6q23 region contain independent genetic factors for rheumatoid arthritis. Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 66 3 IRF5 en AR Publicación 3: • Dieguez-Gonzalez R, Calaza M, Perez-Pampin E, de la Serna AR, Fernandez-Gutierrez B, Castañeda S, Largo R, Joven B, Narvaez J, Navarro F, Marenco JL, Vicario JL, Blanco FJ, Fernandez-Lopez JC, Caliz R, Collado-Escobar MD, Carreño L, Lopez-Longo J, Cañete JD, Gomez-Reino JJ, Gonzalez A. Association of interferon regulatory factor 5 haplotypes, similar to that found in systemic lupus erythematosus, in a large subgroup of patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2008. 58 (5):1264-74 4 IL-1 en AR Publicación 4: • Johnsen AK, Plenge RM, Butty V, Campbell C, Dieguez-Gonzalez R, Gomez-Reino JJ, Shadick N, Weinblatt M, Gonzalez A, Gregersen PK, Benoist C, Mathis D. A broad analysis of IL1 polymorphism and rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2008. 58 (7):1947-57 Procedimiento experimental, resultados y discusión 67 5 Otros genes candidatos en AR Publicación 5: • Dieguez-Gonzalez R, Akar S, Calaza M, Gonzalez-Alvaro I, Fernandez-Gutierrez B, Lamas JR, de la Serna AR, Caliz R, Blanco FJ, Balsa A, Velloso ML, Perez-Pampin E, de Pablos JL, Navarro F, Narváez J, Lopez-Longo J, Herrero-Beaumont G, Gomez-Reino JJ, Gonzalez A. Lack of association to rheumatoid arthritis of tour candidates genes: CFH, DCSIGN, Eotaxin-3 and MHC2TA NF κ B en AR Procedimiento experimental, resultados y discusión 71 1 Genetic Variation in the NF B Pathway in Relation to Susceptibility to Rheumatoid Arthritis Rebeca Dieguez-Gonzalez 1 , Servet Akar 1 , Manuel Calaza 1 , Eva Perez-Pampin 1 , Javier Costas 2 , Maria Torres 2 , Jose Luis Vicario 3 , Maria Luisa Velloso 4 , Federico Navarro 5 , Javier Narvaez 6 , Beatriz Joven 7 , Gabriel Herrero-Beaumont 8 , Isidoro Gonzalez-Alvaro 9 , Benjamin Fernandez-Gutierrez 10 , Arturo R. de la Serna 11 , Luis Carreño 12 , Javier LopezLongo 12 , Rafael Caliz 13 , María Dolores Collado-Escobar 13 , Francisco J Blanco 14 , Carlos Fernandez-Lopez 14 , Alejandro Balsa 15 , Dora Pascual-Salcedo 16 , Juan J Gomez-Reino 1 , Antonio Gonzalez 1 1 Laboratorio de Investigacion 2 and Rheumatology Unit, Hospital Clinico Universitario de Santiago, Santiago de Compostela, Spain 2 National Genotyping Center. Hospital Clinico Universitario de Santiago. Santiago de Compostela, Spain 3 Regional Transfusion Center. Madrid, Spain 4 Rheumatology Unit, Hospital Universitario de Valme. Sevilla, Spain 5 Rheumatology Unit, Hospital Universitario Virgen Macarena. Sevilla, Spain 6 Rheumatology Unit, Hospital Universitario de Bellvitge. Barcelona, Spain 7 Rheumatology Unit, Hospital 12 de Octubre. Madrid, Spain 8 Rheumatology Unit, Fundacion Jimenez Diaz. Madrid, Spain 9 Rheumatology Unit, Hospital Universitario de la Princesa. Madrid, Spain 10 Rheumatology Unit, Hospital Clinico San Carlos. Madrid, Spain 11 Rheumatology Unit, Hospital Santa Creu e San Pau. Barcelona, Spain 12 Rheumatology Unit, Hospital Universitario Gregorio Marañon. Madrid, Spain 13 Rheumatology Unit, Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Granada, Spain 14 Laboratorio de Investigación Osteoarticular y del Envejecimiento. Servicio de Reumatología, Hospital Universitario Juan Canalejo. A Coruña, Spain 15 Rheumatology Unit, Hospital La Paz. Madrid, Spain 16 Immunology, Hospital La Paz. Madrid, Spain Corresponding author: Antonio Gonzalez Laboratorio de Investigacion 2 Hospital Clinico Universitario de Santiago Travesia de Choupana sn. 15706-Santiago de Compostela Spain [email protected] [email protected] Running title: NF B polymorphisms in Rheumatoid Arthritis Word count: 2933; Abstract: 218 The Corresponding Author has the right to grant on behalf of all authors and does grant on behalf of all authors, an exclusive licence (or non exclusive for government employees) on a worldwide basis to the BMJ Publishing Group Ltd to permit this article (if accepted) to be published in ARD and any other BMJPGL products and sublicences such use and exploit all subsidiary rights, as set out in our licence (http://ARD.bmjjournals.com/ifora/licence.pdf)." Copyright Article author (or their employer) 2008. Produced by BMJ Publishing Group Ltd (& EULAR) under licence. Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 72 2 ABSTRACT Objective: To examine genetic association between RA and known polymorphisms in core genes of the NF B pathway, the major intracellular pathway in RA pathogenesis. Methods: Discovery and replication sample sets of Spanish RA patients and controls were studied. A total of 181 single nucleotide polymorphisms (SNPs) uniformly spaced along the genomic sequences of 17 core genes of the NF B pathway (REL, RELA, RELB, NFKB1, NFKB2, NFKBIA, NFKBIB, NFKBIE, IKBKA, IKBKB, IKBKE, IKBKAP, KBRAS1, KBRAS2, MAP3K1, MAP3K14, TAX1BP1) were studied by mass spectrometry analysis complemented with 5’-nuclease fluorescence assays in the discovery set, 458 RA patients and 657 controls. SNPs showing nominal significant differences were further investigated in the replication set of 1189 RA patients and 1092 controls. Results: No clear reproducible association was found, although 12 SNPs in IKBKB, IKBKE and REL genes showed significant association in the discovery set. Interestingly, two of the SNPs in the IKBKE gene, weakly associated in the discovery phase, showed a trend to significant association in the replication phase. Pooling both sample sets together, the association with these two SNPs was significant. Conclusion: We did not find any major effect among the explored members of the NF B pathway in RA susceptibility. However, it is possible that variation in the IKBKE gene could have a small effect that requires replication in additional studies. Keywords: Genetic susceptibility, NF B, Rheumatoid Arthritis, Candidate genes, Signaling pathway Procedimiento experimental, resultados y discusión 73 3 INTRODUCTION The complex etiology of rheumatoid arthritis includes a genetic component that accounts for about 50 % of disease liability.[1] The main genetic factor is known to reside in specific HLA-DRB1 alleles, collectively called the shared epitope (SE). A second major genetic factor is a non-synonymous polymorphism in the lymphocyte thyrosine phosphatase coded by PTPN22.[2] Other genetic factors, in STAT4, [3] the TRAF1/C5 [4] and the OLIG3/TNFAIP3 [5, 6] loci have been discovered in recent months. NF B plays a key role in a wide range of RA related mechanisms and is downregulated by several drugs used in RA treatments.[7-9] NF B activates proinflammatory cytokines, the matrix metalloproteinases, the adhesion molecule ICAM1 that favors recruitment of lymphocytes, and cyclooxygenase 2 that is responsible for the formation of prostanoids. Surprisingly, no systematic investigation of the role of genetic variation in the NF B pathway has been done. Only a couple of polymorphisms in NFKB1 and NFKBIA have been ever explored.[10-12] Herein, we have attempted to fill this hole by studying the NF B core players. There are two major signaling pathways that activate NF B.[13-15] The canonical pathway is triggered by pro-inflammatory cytokines and pathogen-associated molecular patterns. These signals cause activation of the I B kinase (IKK, note that different symbols are used for proteins and the genes encoding them) complex, which includes the IKK and IKK catalytic subunits and the IKK regulatory subunit (encoded by the IKBKA, IKBKB and IKBKG genes, respectively). The activated complex phosphorylates the inhibitors of NF B or I Bs. These proteins, I B, I B, I B and IB (corresponding to the NFKBIA, NFKBIB, NFKBIE and a fragment of the NFKB1 genes, respectively), in their unphosphorylated form bind to NF B dimers and retain them in the cytoplasm. After phosphorylation, the I Bs are polyubiquitinated and degraded. In this way, NF B dimers become free to move to the nucleus where they bind the DNA promoters of their regulated genes. The NF B dimers are formed by any of the five NF B proteins: p50/105, p52/100, RelA, RelB and c-Rel (encoded by NFKB1, NFKB2, RELA, RELB and REL genes, respectively). Phosphorylation and degradation of the I Bs is the critical step in the regulation of this pathway. Two proteins, KBRAS1 and KBRAS2, bind to I B and I B delaying their degradation and contributing to inhibit NF B induction. The alternative pathway is activated by engagement of a specific subset of receptors from the TNF receptor superfamily. This pathway is absolutely dependent on the kinases NIK (or MAP3K14) and IKK and independent of IKK and IKK . The two kinases are assembled into an active complex trough binding to separate domains of IKBKAP. The target of phosphorylation by IKK in this pathway is p100. It is possible that other minor pathways lead to NF B activation. For example, T cell receptor signals activate NF B by a pathway dependent on IKK (encoded by IKBKE). Also there is crosstalk with other signaling pathways induced by signals in Toll-like receptors involving the kinase MAP3K1 that phosphorylates members of the IKK complex. Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 80 10 DISCUSSION We have taken in this study a variant of the candidate gene approach by exploring genetic variation in a functional unit in RA pathogenesis. The selected NF B signaling pathway has an important regulatory role in RA.[7-9] It has two clearly defined branches and many alternative players at different levels.[13, 15] Therefore, it seemed interesting to investigate if genetic association with RA susceptibility will identify any of them as critical. The 17 selected genes included the core elements and other members of the pathway related to either minor routes of activation, as IKBKE and MAP3K1, or critical regulatory steps, as KBRAS1 and KBRAS2. Density of SNP coverage was slightly larger than the available in the WGA panels but was not complete at r 2 >0.8. The study was conducted in two phases because replication of the findings is critical to differentiate between true associations and random frequency changes. However, it should be noted that alleles with modest effects could have been missed in the discovery phase. More specifically, for an OR = 1.3 and minor allele frequency of 0.2, the power of the discovery phase was 72 % and power of the replication set was > 95 %. Results of the first phase were promising with SNPs in three genes showing nominal evidence of association and some of them, in IKBKB and IKBKE, a relatively strong effect. However, the evidence for association would be lower if an adjustment was performed for multiple testing. None of these associations was replicated in the second phase of the study. Allele frequency differences between the two phases were present only among the patients with RA, but we did not find correlation with available clinical data even with the clinical characteristics that were different between the two phases of the study. Therefore, the lack of replication of the original findings remains unexplained. Only two SNPs in IKBKE showed a trend to association in the replication sample set. These two SNPs, rs2151222 and rs3748022, also showed an increased statistical significance when the two sample sets were considered together. Interestingly, they are correlated and thus the possible association would be to a single genetic factor. Another possibility is that they are related with an interleukin cluster, 270 Kb telomeric to IKBKE. This cluster includes IL10, a gene with several regulatory polymorphisms that influence RA susceptibility and severity according to some studies, [19-21] but not according to others. [22, 23] If a direct IKBKE association is confirmed it will add new perspectives into RA pathology because IKK is not a component of the IKK complex and is not involved in the best-known NF B activation pathways.[24] IKK activates the IRF-3 and IRF-7 transcription factors of the innate immune response, and the NF B pathway in T cells by directly phosphorylating RelA.[25] Also of relevance for RA pathology could be that IKK is expressed in fibroblast-like synoviocytes and in the synovial intimal lining where it participates in the induction of matrix metalloproteinases through phosphorylation of c-Jun.[26] It is also possible that the differences in IKBKB SNPs in the discovery set were related with the nearby PLAT gene, coding for the tissue type plasminogen activator, that is only 63 Kb telomeric to IKBKB and that we have previously found associated to RA susceptibility.[27] Nevertheless, we have not detected significant LD between the regulatory SNP in PLAT and the SNPs of IKBKB (not shown). Results from the first large WGA in RA susceptibility have been published very recently.[28] This study can provide important independent confirmation for our results because it is very powerful and exhaustive, including 3000 controls and 2000 RA patients of British descent genotyped at 500 000 SNPs. None of the SNPs that are highlighted in the WGA publication as different in RA patients and controls is near any of the NF B genes explored by us. However, a deeper analysis is possible as there are many other differences in the WGA study that are not significant at the genome level Procedimiento experimental, resultados y discusión 81 11 but they can be used for confirmation of independent studies. For example, the WGA includes the same number of SNPs in the IKBKB locus as our study. Only one shows some difference between cases and controls (rs5029748, p = 0.01). This SNP was also included in our discovery phase but we did not find any difference. On the contrary, two SNPs with significant differences in our discovery phase (rs12676482 and rs17875732) are represented in the WGA by highly correlated SNPs (r 2 = 1) that are not different between RA patients and controls. In the same way, there are two SNPs in the WGA study informative about the REL SNPs we have analyzed. None of them are associated to RA. Unfortunately, it is impossible to obtain this kind of information for IKBKE because the WGA panel does not include any SNPs in the 40 Kb surrounding the IKBKE gene. In addition, flanking SNPs do not show significant correlation with IKBKE SNPs. These comparisons show a way in which WGA studies will contribute to progress in the genetic investigation of RA. In conclusion, our study has not found important genetic factors for RA susceptibility in core members of the NF B signaling pathway. It should be noted, however, that SNP coverage was not complete and that power of the discovery phase did not allow excluding modest effects. Also, it is possible that a more complex or restricted involvement, because of interaction between genetic factors or association limited to a subgroup of patients, has eluded our detection. Our initial findings of RA association with IKBKB and REL SNPs were most likely due to random fluctuations in allelic frequencies that can be expected in any study where multiple SNPs are analyzed. Lack of replication in the second set of samples and of confirmatory evidence in the published WGA study support this conclusion. Nevertheless, variation in IKBKE or nearby sequences could have a role in RA susceptibility although we were unable to obtain clear confirmatory evidence. This effect may be small, in an OR range of 1.1-1.2, and this will make difficult future attempts of replication. ACKNOWLEDGMENTS We thank Cristina Fernandez-Lopez for her excellent technical assistance. This project was supported by grant PI04/1513 form the Instituto de Salud Carlos III (Spain) with participation of funds from FEDER (European Union). SA was the recipient of a Research Fellowship of the Fundation Articulum. CONFLICT OF INTEREST The authors declare they do not have any conflict of interest. Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 82 12 REFERENCES: 1. Oliver JE, Worthington J , Silman AJ. Genetic epidemiology of rheumatoid arthritis. Curr Opin Rheumatol. 2006;18:141-6 2. Begovich AB, Carlton VE, Honigberg LA, Schrodi SJ, Chokkalingam AP , Alexander HC et al. A missense single-nucleotide polymorphism in a gene encoding a protein tyrosine phosphatase (PTPN22) is associated with rheumatoid arthritis. Am J Hum Genet. 2004;75:330-7 3. Remmers EF, Plenge RM, Lee AT, Graham RR, Hom G , Behrens TW et al. STAT4 and the risk of rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus. N Engl J Med. 2007;357:977-86 4. 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Center name Study phase Town RA Controls H Clínico Universitario de Santiago Discovery Santiago 458 657 H Clínico Universitario de Santiago a Replication Santiago 95 0 H de la Santa Creu I Sant Pau Barcelona 45 48 H Príncipes de España Barcelona 94 94 H Virgen de las Nieves Granada 92 96 H Universitario de Valme Sevilla 81 95 H Virgen de La Macarena Sevilla 166 143 H Universitario de La Princesa Madrid 109 100 Fundación Jiménez Díaz Madrid 34 45 H Universitario Doce de Octubre Madrid 85 77 H Clínico San Carlos Madrid 93 102 H Universitario La Paz Madrid 156 111 Complejo H Univ Juan Canalejo a A Coruña 89 94 H Universitario Gregorio Marañón Madrid 50 87 a These two collections were considered as the same town because they are only to 60 km appart and share the same population on many criteria. Procedimiento experimental, resultados y discusión 85 Suplementary Table 2: List of 181 SNPs selected in 17 NFKB core genes. SNPs that were excluded of further analysis are signaling Gene name SNP ID Position Call rate HWEpval controls MAF Case,Control Ratios P value CHUK rs10786583 101936004 95,40 Discarded CHUK rs7909855 101957202 52,10 Discarded CHUK rs17880376 101943695 91,60 0,069 0,43 491:349, 663:509 0,400 CHUK rs17885645 101977457 98,20 0,078 0,42 508:362, 735:551 0,569 CHUK rs11591741 11966491 97,80 0,112 0,42 506:360, 734:548 0,589 CHUK rs7923726 101953289 96,60 0,185 0,48 459:429, 651:583 0,628 CHUK rs3818411 101950956 97,00 0,974 0,47 468:416, 660:586 0,990 IKBKAP rs838818 108772687 98,20 0,022 0,37 552:328, 807:453 0,532 IKBKAP rs4978372 108715838 74,50 Discarded IKBKAP rs4978753 108717026 45,40 Discarded IKBKAP rs754333 108766451 97,40 0,050 0,17 724:152, 1042:206 0,609 IKBKAP rs3204145 108731175 71,50 Discarded IKBKAP rs2275635 108768322 97,10 0,055 0,17 726:152, 1032:206 0,684 IKBKAP rs4978747 108702780 98,30 0,312 0,46 455:417, 714:558 0,071 IKBKAP rs3818875 108720079 98,30 0,330 0,17 724:148, 1049:223 0,737 IKBKAP rs4978374 108726538 96,00 0,402 0,24 657:217, 929:289 0,562 IKBKAP rs2275495 108723951 96,80 0,499 0,12 773:99, 1091:147 0,714 IKBKAP rs2275626 108738576 81,70 0,504 0,17 622:126, 858:176 0,922 IKBKAP rs838824 108750262 94,30 0,522 0,33 579:269, 798:410 0,292 IKBKAP rs2289480 108785056 98,20 0,581 0,34 588:298, 821:433 0,667 IKBKAP rs4978746 108702610 98,10 0,616 0,45 459:421, 710:548 0,050 IKBKAP rs3763643 108775162 97,10 0,626 0,27 649:223, 900:344 0,288 IKBKAP rs1538660 108721380 92,70 0,741 0,18 717:145, 948:210 0,443 IKBKAP rs3818932 108743733 98,60 0,981 0,27 654:230, 917:349 0,426 IKBKB rs3747811 42248662 79,30 0,004 0,49 376:342, 518:516 0,310 Discarded IKBKB rs2272733 42277059 98,60 0,170 0,11 814:70, 1131:161 0,001 IKBKB rs3136717 42315598 98,20 0,193 0,10 824:72, 1125:147 0,007 IKBKB rs12676482 42293234 98,90 0,368 0,05 868:24, 1218:74 0,001 IKBKB rs9694958 42275203 99,20 0,473 0,09 831:63, 1168:128 0,021 IKBKB rs5029748 42259706 99,30 0,656 0,27 641:255, 957:339 0,233 IKBKB rs17875732 42306311 93,90 0,744 0,08 766:40, 1152:116 0,000 IKBKE rs3748022 203057860 96,90 0,162 0,23 654:220, 992:264 0,025 IKBKE rs2297543 203039745 94,90 Discarded IKBKE rs1953090 203036542 94,90 0,216 0,17 716:156, 1010:204 0,517 IKBKE rs11584629 203029255 98,10 0,321 0,47 480:396, 666:614 0,207 IKBKE rs7552033 203052791 95,90 0,347 0,15 745:119, 1045:199 0,161 IKBKE rs10863389 203044687 90,70 0,365 0,37 523:337, 736:398 0,061 IKBKE rs2297546 203036432 98,40 0,375 0,42 501:371, 760:530 0,499 IKBKE rs1930437 203034822 95,90 0,400 0,47 432:420, 677:579 0,149 IKBKE rs12724769 203043133 95,90 0,412 0,50 441:411, 644:612 0,172 IKBKE rs2184030 203055836 94,60 0,470 0,47 443:367, 669:601 0,369 IKBKE rs2151222 203042663 98,10 0,522 0,29 598:278, 925:355 0,045 IKBKE rs1059704 203036773 96,10 0,553 0,33 564:296, 849:403 0,285 IKBKE rs10836 203058564 92,00 0,569 0,46 485:389, 609:539 0,275 IKBKE rs1930438 203031501 96,20 0,575 0,22 651:207, 989:267 0,121 IKBKE rs9242 203025794 96,80 0,630 0,45 452:394, 720:562 0,215 IKBKE rs3849271 203064778 87,10 0,643 0,49 345:329, 638:602 0,912 Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 86 IKBKE rs1539243 203036182 98,10 0,658 0,13 766:110, 1107:173 0,517 IKBKE rs2274902 203034706 92,40 0,766 0,49 446:426, 604:556 0,151 IKBKE rs17433930 203041134 96,40 0,808 0,06 803:51, 1187:77 0,910 IKBKE rs17433804 203029447 89,30 0,835 0,33 552:248, 770:392 0,204 IKBKE rs11117858 203034669 96,50 0,903 0,25 639:235, 953:293 0,077 IKBKE rs12728136 203048917 98,60 0,918 0,13 768:108, 1121:171 0,536 IKBKE rs17433909 203040120 96,40 1,000 0,03 860:14, 1196:48 0,002 IKBKE rs17434047 203054115 94,50 1,000 0,02 862:8, 1178:30 0,009 KBRAS1 rs2885034 23908178 98,00 Discarded KBRAS1 rs11918791 23923193 Discarded KBRAS1 rs7619870 23969981 93,90 0,272 0,34 582:286, 772:408 0,442 KBRAS1 rs1133926 23936766 96,30 0,518 0,22 681:191, 955:275 0,805 KBRAS1 rs11129128 23936625 93,90 0,722 0,08 796:70, 1094:88 0,593 KBRAS1 rs1136155 23909494 94,60 0,862 0,21 686:170, 946:262 0,314 KBRAS2 rs4796758 37423045 74,80 Discarded KBRAS2 rs7225117 37451242 98,30 0,476 0,19 713:173, 1023:233 0,571 KBRAS2 rs4796756 37409324 96,00 0,576 0,19 688:164, 1004:234 0,843 KBRAS2 rs4796763 37458592 90,90 0,689 0,18 700:168, 925:187 0,144 KBRAS2 rs2240011 37447235 99,20 0,731 0,19 706:176, 1039:239 0,467 MAP3K1 rs96844 56232361 92,40 0,051 0,25 625:211, 892:300 0,971 MAP3K1 rs1423622 56149199 95,50 0,066 0,07 799:57, 1157:83 0,975 MAP3K1 rs17661089 56141753 82,40 0,076 0,07 704:48, 978:78 0,409 MAP3K1 rs3733951 56165560 95,90 0,113 7,00 784:58, 1173:89 0,885 MAP3K1 rs252908 56156443 90,60 0,194 0,38 517:309, 708:454 0,453 MAP3K1 rs832574 56195639 97,60 0,252 0,37 549:329, 802:462 0,664 MAP3K1 rs832575 56197544 98,40 0,259 0,14 751:121, 1100:186 0,702 MAP3K1 rs3817119 56219500 94,50 0,352 0,09 795:81, 1088:110 0,960 MAP3K1 rs2067214 56169828 Discarded MAP3K1 rs33323 56211323 20,90 Discarded MAP3K1 rs33322 56210983 92,60 0,734 0,20 668:162, 950:252 0,426 MAP3K1 rs702689 56213200 95,30 0,757 0,30 570:242, 886:392 0,673 MAP3K1 rs863839 56186856 83,70 0,782 0,36 542:320, 631:343 0,580 MAP3K1 rs702688 56226743 91,40 0,851 0,37 514:300, 747:445 0,828 MAP3K1 rs7733041 56143134 97,90 0,906 0,22 682:188, 1003:275 0,960 MAP3K1 rs702691 56150283 98,10 0,924 0,38 549:323, 784:496 0,423 MAP3K1 rs252899 56224326 96,70 0,928 0,21 692:180, 987:263 0,824 MAP3K1 rs832582 56213500 98,10 0,956 0,21 686:186, 1006:274 0,966 MAP3K1 rs43184 56177534 97,50 0,969 0,12 695:183, 992:270 0,759 MAP3K14 rs2072090 40706910 93,80 0,013 0,49 428:420, 630:594 0,385 MAP3K14 rs4248280 40690761 98,00 0,034 0,49 461:415, 648:640 0,180 MAP3K14 rs708563 40696719 96,60 0,086 0,49 454:420, 633:625 0,460 MAP3K14 rs7222094 40723436 99,10 0,097 0,46 481:421, 694:592 0,768 MAP3K14 rs11079502 40706449 98,60 0,107 0,50 445:439, 646:646 0,876 MAP3K14 rs2074293 40699856 96,50 0,212 0,44 503:373, 683:571 0,177 MAP3K14 rs2074291 40717672 93,90 0,218 0,86 410:402, 657:605 0,486 MAP3K14 rs9909488 40695542 99,60 0,286 0,04 863:41, 1249:47 0,285 MAP3K14 rs721579 40726264 98,10 0,368 0,27 641:233, 939:353 0,733 MAP3K14 rs9908330 40738883 97,70 0,431 0,44 486:384, 718:570 0,957 MAP3K14 rs3785803 40716996 97,20 0,505 0,14 749:131, 1106:160 0,135 MAP3K14 rs12449740 40741132 98,60 0,509 0,44 497:391, 729:559 0,771 MAP3K14 rs2285674 40698089 48,90 Discarded MAP3K14 rs3785805 40716723 80,10 0,00 657:1, 1106:4 Discarded MAP3K14 rs11574822 40718258 Discarded MAP3K14 rs2291448 40688148 99,60 0,689 0,06 846:58, 1214:82 0,933 Procedimiento experimental, resultados y discusión 87 MAP3K14 rs17686001 40744196 99,20 0,700 0,16 759:135, 1089:207 0,581 MAP3K14 rs16939943 40709546 98,60 0,769 0,15 739:145, 1108:184 0,167 MAP3K14 rs1047841 40696414 93,70 0,780 0,05 761:47, 1203:57 0,189 MAP3K14 rs1047833 40697924 99,00 0,784 0,30 648:246, 886:406 0,050 MAP3K14 rs3744410 40697696 99,20 0,902 0,04 855:41, 1240:54 0,649 NFKB1 rs230539 103852725 93,60 0,019 0,31 573:245, 838:400 0,259 NFKB1 rs1599961 103800754 94,30 0,020 0,35 551:279, 789:451 0,198 NFKB1 rs3774937 103791438 96,00 0,082 0,31 597:249, 865:397 0,323 NFKB1 rs1020760 103871638 95,50 0,100 0,37 537:305, 782:474 0,481 NFKB1 rs230526 103816010 95,60 0,115 0,37 539:295, 788:478 0,268 NFKB1 rs230509 103835455 97,00 0,119 0,31 603:263, 860:404 0,436 NFKB1 rs230521 103820512 96,80 0,125 0,37 558:306, 791:471 0,370 NFKB1 rs3774956 103865719 91,60 0,137 0,37 500:290, 768:454 0,841 NFKB1 rs3774938 103795624 97,70 0,153 0,36 565:305, 809:467 0,465 NFKB1 rs3755867 103883867 92,40 0,319 0,29 635:239, 817:339 0,328 NFKB1 rs1609798 103894643 92,30 0,465 0,26 617:205, 888:316 0,509 NFKB1 rs3774963 103876558 96,50 0,482 0,28 624:234, 900:362 0,478 NFKB1 rs3774968 103888305 93,40 0,500 0,46 437:393, 665:555 0,408 NFKB1 rs747559 103771362 83,80 0,000 0,36 441:233, 746:420 0,531 Discarded NFKB1 rs93059 103825702 91,80 0,001 0,46 463:403, 625:525 0,694 Discarded NFKB1 rs230511 103831958 60,60 Discarded NFKB1 rs997476 103899208 96,90 0,635 0,05 815:49, 1206:58 0,262 NFKB1 rs230491 103841806 96,50 0,001 0,32 583:273, 858:406 0,912 Discarded NFKB1 rs230542 103855648 94,20 0,009 0,32 586:252, 830:400 0,239 Discarded NFKB1 rs4648072 103875893 59,70 Discarded NFKB1 rs4698863 103903051 96,50 0,666 0,28 618:240, 915:347 0,810 NFKB1 rs4648099 103886010 73,70 0,00 Discarded NFKB1 rs3774932 Discarded NFKB2 rs7897947 104147701 91,90 0,743 0,16 729:151, 986:166 0,091 NFKB2 rs7076748 104140132 97,60 0,877 0,25 669:223, 959:309 0,738 NFKB2 rs12772374 104146901 94,70 0,886 0,16 720:126, 1045:203 0,397 NFKB2 rs12769316 104142741 94,90 0,910 0,15 731:127, 1045:197 0,509 NFKBIA rs696 34940844 96,80 0,069 0,40 518:352, 759:489 0,555 NFKBIA rs3138053 34944605 96,10 0,369 0,27 628:220, 905:349 0,339 NFKBIA rs3138045 34947472 94,80 0,562 0,21 680:170, 962:262 0,438 NFKBIA rs1957106 34943521 96,80 0,580 0,26 612:230, 966:310 0,119 NFKBIA rs2233409 34944021 96,00 0,654 0,23 642:182, 975:301 0,425 NFKBIA rs1012919 34954390 88,50 Discarded NFKBIA rs3138056 Discarded NFKBIA rs2233406 34944550 96,80 0,893 0,27 648:226, 896:348 0,281 NFKBIB rs9403 44098007 97,40 0,056 0,37 562:332, 792:462 0,889 NFKBIB rs3136640 44088140 95,70 0,149 0,40 521:341, 755:495 0,985 NFKBIB rs3136641 44088489 93,70 0,256 0,23 635:197, 956:280 0,588 NFKBIB rs3136642 44090256 96,40 0,352 0,41 513:363, 735:515 0,913 NFKBIB rs3136646 44091117 97,50 0,528 0,23 658:204, 1000:288 0,480 NFKBIB rs2053071 44082771 73,90 Discarded NFKBIE rs529948 44344347 99,60 0,011 0,10 790:88, 1151:137 0,646 NFKBIE rs730775 44340052 94,50 0,085 0,47 443:405, 649:557 0,482 NFKBIE rs476632 44322303 94,30 0,177 0,39 531:331, 711:477 0,423 NFKBIE rs504697 44328054 97,70 0,520 0,28 630:236, 904:354 0,653 NFKBIE rs1044690 44353219 98,80 0,617 0,22 686:174, 990:298 0,111 NFKBIE rs2282151 44334173 12,40 Discarded NFKBIE rs2233434 44340898 49,80 Discarded REL rs842647 61031122 98,40 0,041 0,23 658:222, 1007:277 0,047 Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 88 REL rs3732179 61065976 98,50 0,055 0,23 657:225, 1004:280 0,045 REL rs13031237 61047780 94,70 0,084 0,41 484:334, 742:524 0,800 REL rs9309331 61053266 97,20 0,271 0,25 655:197, 941:345 0,054 REL rs6545835 61024203 86,30 0,670 0,25 581:165, 841:311 0,017 REL rs1429265 61064733 96,50 1,000 0,04 838:32, 1210:42 0,690 RELA rs1049728 65177693 97,40 0,061 0,06 812:44, 1213:73 0,593 RELA rs10896027 65177336 95,20 0,202 0,37 546:322, 768:458 0,903 RELA rs11227247 65179429 97,50 0,743 0,13 750:126, 1108:160 0,237 RELA rs11568300 65181743 97,50 0,791 0,36 575:307, 810:454 0,597 RELA rs1466462 65175940 97,30 0,819 0,37 541:313, 801:485 0,619 RELB rs10424046 50227876 97,60 0,022 0,45 496:394, 686:580 0,478 RELB rs1560725 50235627 94,30 0,036 0,43 511:363, 675:535 0,223 RELB rs10856 50233254 96,30 0,371 0,07 822:54, 1151:101 0,097 RELB rs909134 50184901 95,80 0,573 0,34 572:300, 819:427 0,949 RELB rs9193 50188143 97,80 0,855 0,10 798:92, 1155:117 0,378 RELB rs2288918 50220639 94,20 0,000 0,34 576:278, 794:434 0,187 Discarded TAX1BP rs2051829 27639471 97,70 0,590 0,43 489:391, 732:530 0,263 TAX1BP rs1859328 27651317 96,80 0,681 0,23 662:204, 982:274 0,345 TAX1BP rs2237337 27552125 93,30 0,707 0,38 504:306, 763:473 0,823 TAX1BP rs3779472 27596483 92,90 0,787 0,07 786:56, 1103:91 0,405 TAX1BP rs2057998 27569761 96,10 0,845 0,22 665:199, 975:267 0,404 TAX1BP rs739900 27646925 97,40 0,856 0,07 805:61, 1174:96 0,654 TAX1BP rs2074769 27561733 17,30 Discarded TAX1BP rs7809260 27570900 98,50 0,00 Discarded TAX1BP rs1029604 27565196 98,40 0,998 0,15 747:135, 1079:195 1,000 TAX1BP rs11761430 27610598 66,10 Discarded Procedimiento experimental, resultados y discusión 89 Suplementary Table 3: Condicional logistic regression analysis of RA associated IKBKB SNPs in de discovery set. SNP OR and 95% CI conditional on rs17875732 OR and 95% CI of rs17875732 conditional on the indicated SNP rs9694958 1.05 (0.7-1.6) 0.47 (0.3-0.8) rs2272733 0.98 (0.6-1.6) 0.47 (0.25-0.9) rs12676482 0.78 (0.4-1.7) 0.57 (0.3-1.0) rs3136717 1.21 (0.7-1.8) 0.44 (0.2-0.8) Procedimiento experimental, resultados y discusión 97 1 TNFAIP3, a Feedback Inhibitor of NFkappaB, and the Neighbour Intergenic 6q23 Region Contain Independent Genetic Factors for Rheumatoid Arthritis Rebeca Dieguez-Gonzalez1, Manuel Calaza1, Eva Perez-Pampin1, Alejandro Balsa2, Francisco J. Blanco3, Juan D. Cañete4, Rafael Caliz5, Luis Carreño6, Arturo R. de la Serna7, Benjamin Fernandez-Gutierrez8, Ana Maria Ortiz9, Gabriel Herrero-Beaumont10, Jose Luis Pablos11, Javier Narvaez12, Federico Navarro13, Jose Luis Marenco14, Juan J Gomez-Reino1,15, Antonio Gonzalez1 1 Laboratorio de Investigacion 2 and Rheumatology Unit. Hospital Clinico Universitario de Santiago. Santiago de Compostela. Spain 2 Rheumatology Unit. Hospital La Paz. Madrid 3 Laboratorio de Investigación Osteoarticular y del Envejecimiento. Servicio de Reumatología. Hospital Universitario Juan Canalejo. A Coruña. Spain 4 Arthritis Unit, Rheumatology Deparment. Hospital Clinic. Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer. Barcelona 5 Rheumatology Unit. Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Granada. Spain 6 Rheumatology Unit. Hospital Universitario Gregorio Marañon. Madrid 7 Rheumatology Unit. Hopital Santa Creu e San Pau. Barcelona 8 Rheumatology Unit. Hospital Clinico San Carlos. Madrid 9 Rheumatology Unit. Hospital Universitario La Princesa. Madrid 10 Rheumatology Unit. Fundación Jimenez Diaz. Madrid 11 Rheumatology Unit. Hospital 12 de Octubre. Madrid 12 Rheumatology Unit. Hospital Universitario de Bellvitge. Barcelona 13 Rheumatology Unit. Hospital Univesitario Virgen Macarena. Sevilla. Spain 14 Rheumatology Unit. Hospital Universitario de Valme. Sevilla. Spain 15 Department of Medicine. University of Santiago de Compostela, Santiago de Compostela, Spain Corresponding author: Antonio Gonzalez Laboratorio de Investigacion 2 Hospital Clinico Universitario de Santiago Travesia de Choupana sn. 15706-Santiago de Compostela Spain Tfn: 34 981 950 903 Fax: 34 981 951 068 [email protected] [email protected] Running title: TNFAIP3 and intergenic 6q23 in Rheumatoid Arthritis Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 98 2 Keywords: Genetic susceptibility, TNFAIP3, A20, Rheumatoid Arthritis, Candidate gene, Whole Genome Association Procedimiento experimental, resultados y discusión 99 3 ABSTRACT Objectives: We aimed to examine if genetic variation in the TNFAIP3 gene, which encodes an important feedback inhibitor of TNF signaling trough NFkappaB, contributes to rheumatoid arthritis (RA) susceptibility. This possibility was suggested by the report in whole genome association studies (WGAS) of reproducible association of RA to SNPs in a 6q23 intergenic region that is flanked by TNFAIP3. Methods: Samples from 1651 patients with RA and 1619 healthy controls of Spanish ancestry were analyzed. Genotypes were obtained for 12 tagSNPs in the 6q23 intergenic locus and 6 tagSNPs in the TNFAIP3 locus. Results: Evidence of association was found both in the 6q23 intergenic region and in the TNFAIP3 locus. The rs582757 SNP and a common haplotype in the TNFAIP3 locus showed association to RA. Analysis of unreported data from a previous RA WGAS confirmed association at the TNFAIP3 locus. In the intergenic region, two SNPs were associated, rs609438 and rs13207033. The later was only associated in ACPA+ patients. The previously reported rs6920220 SNP was not replicated though a trend to association with the same allele was observed (P = 0.07). Overall, statistical association was best explained by the independent contribution of SNPs from the two loci, TNFAIP3 and the 6q23 intergenic region. Conclusion: Our data indicate that, like for SLE, there are several independent RA genetic factors in the 6q chromosome including polymorphisms in the TNFAIP3 gene, which is a clear functional candidate that has been neglected in RA research. Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 100 4 INTRODUCTION RA etiology includes a genetic component that has become amenable to investigation in recent years. A major development has been the availability of large scale whole genome association studies (WGAS). They typically analyze 300 000 or more single nucleotide polymorphisms (SNPs) distributed all along the genome in each DNA sample. These studies are conducted in large collections of cases and controls. The first WGAS in RA have easily confirmed the two clearest RA genetic factors, in the HLA region and in the PTPN22 gene.[13] In addition, they have shown other areas of association. Some of them have already been confirmed in additional studies like the TRAF1-C5 locus and the intergenic region in the 6q23 chromosome.[2-5] Independently, association to STAT4 polymorphisms has been found and confirmed.[5-7] One of the clearly confirmed RA genetic factors is in a region of chromosome 6q23 that is flanked at about 185 Kb to either side by the oligodendrocyte transcription factor 3 gene (OLIG3) and the tumor necrosis factor-α-induced protein 3 gene (TNFAIP3, also known as A20), but that does not contain any known protein coding sequence and lacks any evident functional consequence.[2, 4] Two SNPs in 6q23, rs6920220 and rs13207033 (or its perfect surrogate rs10499194), have shown peak association in an independent way.[2] This has been interpreted as indicative of multiple effects.[2] Given this complex pattern of association and the absence of a better candidate, we surmised the hypothesis that genetic variation in TNFAIP3 could explain association in the intergenic region of chromosome 6q23 (See Figure 1 for the positions of these two loci). TNFAIP3 is an excellent candidate for such an effect because it is a feedback negative regulator of TNF signaling trough NfkappaB.[8-10] To test our hypothesis and to relate the TNFAIP3 locus with the intergenic 6q23 region, we have genotyped tagSNPs in both loci. Analysis in 1651 RA patients and 1619 controls showed significant associations at each locus Procedimiento experimental, resultados y discusión 101 5 that were statistically independent. These results support multiple RA genetic factors in chromosome 6q that include polymorphisms in the TNFAI3 gene. Similarly, multiple SLE genetic factors have just been reported in the same loci highlighting the importance of this region for immune-mediated diseases.[11, 12] Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 102 6 MATERIAL AND METHODS DNA Samples: Recruitment of samples included in this study has already been described.[13] Samples were obtained from Caucasian Spanish RA patients, 1651, and healthy controls, 1619. All patients were according to the 1987 American College of Rheumatology criteria,[14] and their clinical characteristics are shown in Table 1. Participants granted their informed consent and the respective ethical committees approved the study. SNP selection: Two regions were selected for analysis, one of 56 Kb centered on the TNFAIP3 gene, and a second of 65 Kb in the 6q23 intergenic region (Figure 1). Boundaries of the intergenic region were established on the recombination hot-spots at about 138.002 Mb and 138.067 Mb.[15] TagSNPs (Supplementary Table 1) were selected with the Haploview software[16] to cover with a pairwise r2 0.8 all the SNPs with minor allele frequency over 0.05 (TNFAIP3 locus) or 0.1 (intergenic locus). TagSNPs of the intergenic region included the peak SNPs in previous studies rs6920220,[1] and rs13207033, that is a perfect proxy of rs10499194.[2] SNP genotyping: PCRs were done with the Qiagen Multiplex PCR kit (Qiagen, CA) on 30 ng of genomic DNA. PCR products were purified by Exo-SAP digestion with Exonuclease I (Epicentre, Madison, WI) and Shrimp Alkaline Phosphatase (GE Healthcare, Bacelona). Single-base extension reactions with the SNaPshot Multiplex Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) were done. Oligonucleotide sequences are shown in Supplementary Table 1. Statistical analysis: Hardy-Weinberg equilibrium concordance was tested in control samples. LD was analyzed with Haploview.[16] Chi squared tests for the 2 x 2 contingency tables were used to compare allele frequencies. Likelihood ratio tests for the additive, dominant and recessive genetic models were obtained relative to the codominant model. Multivariate logistic regression analysis was used to evaluate the conditional effect of the SNPs. Step-wise logistic regression was conducted to detect best multi-SNP models. Haplotypes were Procedimiento experimental, resultados y discusión 103 7 estimated with the Phase 2.1 software.[17] Odds ratios (O.R.) for each haplotype were calculated taking as reference all chromosomes not bearing the haplotype. Combined analyses of our results with previously reported results,[1, 2, 4] and the freely available summary data from the RA WGA performed by the WTCCC (http://www.wtccc.org.uk/info/summary_stats.shtml) were done. For these analyses, we used the Mantel-Haenszel approach on allele frequencies and the Breslow-Day test for heterogeneity. If allele frequencies were unavailable, we used a fixed effect metaanalysis and the Cochran Q statistic for heterogeneity. A customized version of Statistica 7.0 (Statsoft, Tulsa OK) was used for analyses except metaanalysis that was done with R software (http//www.R-project.org <http://www.r-project.org/>) and statistical power that was estimated with the “Power and sample size calculations” software.[18] Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 104 8 RESULTS TNFAIP3 locus Six tagSNPs were enough to cover the TNFAIP3 gene and 20 Kb of flanking sequences to either side. Genotypes of these tagSNPs were obtained with a 99.1 % call rate and they were in HWE except for the rs629953 SNP, which was excluded from further analysis. Analysis of allele frequencies showed that the minor allele of the rs582757 SNP was significantly less frequent in RA patients than in controls (O.R. = 0.89; Table 2). Genotype frequency comparisons were similar (not shown). Estimation of the haplotype frequency distribution showed that only six haplotypes accounted for more than 98 % of all chromosomes in RA cases and controls (Table 3). The rs582757 minor allele was distributed in two haplotypes and none of them showed significant changes. However, the most common haplotype, which was defined by the major alleles of the five tagSNPs, was significantly more common in RA patients than in controls (haplotype #5 in Table 3). Multivariate analysis combining haplotype #5 and rs582757 SNP genotypes showed that any of them could account for the association with RA and that these two association signals were not independent (not shown). No significant change was detected by stratifying by gender (not shown) or by the presence of RF or ACPA (Supplementary Table 2). Three of the tagSNPs we have studied were also analyzed in the WTCCC WGAS,[1] and we have combined the results (Table 2). For the rs582757 SNP, WTCCC results were almost identical to ours. Combined analysis showed a more significant difference with p = 0.002 (Table 4). Data from other SNPs included in the WTCCC WGAS suggest also that genetic variation in TNFAIP3 is associated to RA (Supplementary Table 3). One of these, rs11970411, showed the strongest association, but we did not find any difference between cases and controls in our study (Table 2). This discrepancy could be due to the significant difference in allele frequencies between the UK and Spanish controls at this SNP (7.7 vs 10.1 Procedimiento experimental, resultados y discusión 105 9 %, respectively). 6q23 intergenic locus We have included 10 tagSNPs in addition to the two SNPs that have shown peak association in previous studies in the 6q23 intergenic locus.[1, 2, 4] Genotypes of these 12 SNPs were in HWE and showed a high call rate (99.0 %) in our samples. Comparison of allele frequencies showed no clear association to RA of any of these SNPs (Table 4). Association in the peak rs13207033 SNP was completely absent. The rs6920220 SNP showed a trend (P = 0.07) in the same direction that has been reported.[1, 2, 4] Only the rs609438 SNP showed a P value that was just below 0.05 (Table 4). The difference was more marked when only women were considered (44.5 vs. 48.9 % in RA patients and controls, respectively; OR = 0.84; 95 % CI = 0.7-1.0; P = 0.006). Genotypes of this SNP were best fitted by a dominant model and analysis according to this model showed a clearer difference between RA patients and controls (frequencies of CA + AA genotypes = 68.4 % in patients vs. 72.7 % in controls; OR = 0.81; 95 % CI = 0.70-0.95; P = 0.008); difference that was further accentuated in women (frequencies of CA + AA genotypes = 66.8 % in patients vs. 74.0 % in controls; OR = 0.71; 95 % CI = 0.58-0.86; P = 0.0006). Genotype analyses of all other SNPs were very similar to allele frequency comparisons, and no differences were found by gender stratification (not shown). Association of the rs6920220 SNP to RA has previously been reported to be stronger in ACPA+ or RF+ patients than in the ACPAor RFsubgroup.[4] However, we did not detect any significant difference between these patient subgroups (Table 5 and Supplementary Table 2). In contrast, we found that the rs13207033 SNP was associated to RA only in the ACPA+ patients. Other three SNPs showed significant association exclusively in ACPA+ patients (Table 5). Conditional logistic regression of these 4 SNPs, taken two by two, was unable to distinguish between them (not shown). Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 112 16 6. Lee HS, Remmers EF, Le JM, Kastner DL, Bae SC , Gregersen PK et al. Association of STAT4 with rheumatoid arthritis in the Korean population. Mol Med. 2007;13:455-60 7. Remmers EF, Plenge RM, Lee AT, Graham RR, Hom G , Behrens TW et al. STAT4 and the risk of rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus. N Engl J Med. 2007;357:977-86 8. Lee EG, Boone DL, Chai S, Libby SL, Chien M , Lodolce JP et al. Failure to regulate TNF-induced NF-kappaB and cell death responses in A20-deficient mice. Science. 2000;289:2350-4 9. Heyninck K , Beyaert R. A20 inhibits NF-kappaB activation by dual ubiquitin-editing functions. Trends Biochem Sci. 2005;30:1-4 10. Beyaert R, Heyninck K , Van Huffel S. 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Arthritis Res Ther. 2008;10:R50 Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 114 18 Table 1: Clinical characteristics of the 1651 patients with RA that were included in the study Clinical characteristics Female (%) 75 Age of disease onset (median, IQR) 48 (37-57) Morning stiffness (%) 96.0 Arthritis 3 joint areas (%) 99.7 Arthritis of hand joints (%) 99.3 Symmetric arthritis (%) 99.0 Rheumatoid nodules (%) 20.3 Rheumatoid factor (%) 72.6 Erosions (%) 70.5 S. Sicca (%) 8.8 Interstitial pneumonitis (%) 2.8 ACPA+ (%)*67.2 * Data were only available for 574 RA patients. Procedimiento experimental, resultados y discusión 115 Table 2: Comparison of the allele frequencies in the tagSNPs covering variability in the TNFAIP3 gene between patients with RA and controls. Data are presented for all valid tagSNPs in our study and for the SNPs available in the WTCCC WGAS,[1] as well as a combined analysis of our results with all previous data. SNP Current study WTCCC WGAS b Combined MAF %(n/N) a OR (95% CI) P MAF %(n/N) OR (95% CI) P OR (95% CI) P P hetero rs600144 RA 25.9 (850/3278) 0.96 (0.91.1) ns CRL 26.8 (857/3202) rs11970361 RA 5.7 (187/3300) 0.94 (0.8-1.2) ns CRL 6.0 (194/3238) rs11970411 RA 10.2 (338/3300) 1.01 (0.9-1.2) ns 10.7 (396/3702) 1.43 (1.24-1.65) 7.4x10 -7 1.23 (1.10-1.36) 0.0002 0.002 CRL 10.1 (328/3238) 7.7 (449/5806) rs582757 RA 24.8 (816/3286) 0.89 (0.8-0.99) 0.041 25.0 (929/3718) 0.90 (0.82-0.98) 0.02 0.89 (0.83-0.96) 0.002 ns CRL 27.0 (871/3220) 27.1 (1593/5876) rs17780429 RA 12.7 (418/3300) 0.91 (0.8-1.0) ns 13.8 (512/3716) 0.92 (0.82-1.03) 0.15 0.91 (0.83-1.00) 0.05 ns CRL 13.8 (446/3236) 14.8 (871/5870) a MAF = minor allele frequency, n = number of minor alleles, N = total number of alleles. b Data from the WTCCC WGAS (1.860 RA cases and 2.938 controls).[1] It was combined to our data with the Mantel-Hanszel approach. Heterogeneity assesed with the Breslow-Day test. Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 116 Table 3: Distribution of estimated haplotype frequencies in the TNFAIP3 locus for controls and patients with RA. The minor allele of each tagSNP is in bold. Haplotypes with frequency over 2% are shown, ordered by the OR comparing RA patients with controls CONTROLS RA patients OR (95% C.I.) haplo # rs600144 rs11970361 rs11970411 rs582757 rs17780429 n % n % 1 T C G C A427 13.2 399 12.1 0.92 (0.79-1.06) 2 T T C T G 185 5.7 175 5.3 0.93 (0.76-1.16) 3 T C G C G 443 13.7 420 12.7 0.93 (0.81-1.07) 4CC G TG 849 26.2 843 25.5 0.98 (0.88-1.09) 5 T C G C G 1159 35.8 1271 38.5 1.14 (1.03-1.26) 6 T C CC G 141 4.4 162 4.9 1.15 (0.91-1.44) Procedimiento experimental, resultados y discusión 117 Table 4: Comparison of the allele frequencies in the 12 tagSNPs covering variability in the intergenic 6q23 region between patients with RA and controls. Data are presented for all tagSNPs in our study and for the SNPs available in previous studies, as well as a combined analysis of our results with all previous data. Current study Previous reports Combined SNP MAF % (n/N) a OR (95% CI) P OR (95% CI) P P hetero. OR (95% CI) P P hetero. rs566097 RA 11.4 (364/3198) 0.99 (0.8-1.1) ns 1.12 b (1.0-1.3) ns NA 1.06 (1.0-1.2) ns ns CRL 11.5 (367/3182) rs13207033 RA 29.3 (897/3062) 0.98 (0.9-1.1) ns 0.78 c (0.7-0.9) 0.0003 0.005 0.81 (0.7-0.9) 0.002 0.0002 CRL 29.7 (914/3082) rs489738 RA 17.7 (559/3164) 0.94 (0.8-1.1) ns CRL 18.6 (586/3158) rs12194935 RA 23.0 (726/3160) 1.00 (0.9-1.1) ns CRL 23.0 (726/3154) rs536331 RA 42.1 (1345/3194) 0.99 (0.9-1.1) ns CRL 42.5 (1351/3182) rs675520 RA 48.6 (1507/3104) 0.96 (0.9-1.1) ns CRL 49.5 (1520/3070) rs6920220 RA 22.0 (703/3200) 1.12 (1.0-1.3) 0.07 1.23 d (1.2-1.3) 9.4x10 -13 ns 1.21 (1.1-1.3) 5.7x10 -13 ns CRL 20.1 (639/3178) rs694069 RA 39.0 (1244/3188) 0.96 (0.9-1.1) ns CRL 40.0 (1273/3180) rs6917441 RA 24.9 (790/3178) 0.95 (0.9-1.1) ns CRL 25.8 (816/3164) rs647108 RA 39.7 (1265/3188) 0.95 (0.9-1.0) ns CRL 40.9 (1301/3178) rs9321627 RA 22.7 (728/3202) 0.96 (0.9-1.1) ns CRL 23.5 (749/3186) rs609438 RA 45.1 (1436/3182) 0.91 (0.8-1.0) 0.047 CRL 47.6 (1513/3178) a MAF = minor allele frequency, n = number of minor alleles, N = total number of alleles. b Data from the WTCCC WGAS (1.860 RA cases and 2.938 controls).[1] It was combined to our data with the Mantel-Hanszel approach. Heterogeneity assesed with the Breslow-Day test. Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 118 c Data from the WTCCC WGAS and the 4 sample collections in Plenge et al. combined with fixed effect metaanalysis (4540 RA patients and 7407 controls).[2] Heterogeneity assesed with the Cochran Q test. d Data from the WTCCC WGAS,[1] and from Thomson et al. [4] combined with the MantelHanszel approach (6923 RA cases and 6787 controls). Heterogeneity assesed with the Breslow-Day test. Procedimiento experimental, resultados y discusión 119 2 Table 5: Allele frequency differences in tagSNP of the intergenic 6q23 region between RA ACPA+ patients and controls SNP MAF % (n/N) a OR (95%CI) P rs566097 RA ACPA+ 10.9 (84/772) 0.94 (0.7-1.2) ns CRL 11.5 (367/3190) rs13207033 RA ACPA+ 25.1 (185/736) 0.80 (0.66-0.96) 0.015 CRL 29.7 (914/3082) rs489738 RA ACPA+ 18.2 (138/760) 0,97 (0.8-1.2) ns CRL 18.6 (586/3158) rs12194935 RA ACPA+ 26.1 (198/758) 1.18 (1.0-1.4) ns CRL 23.0 (726/3154) rs536331 RA ACPA+ 37.9 (292/770) 0.83 (0.71-0.97) 0.023 CRL 42.4 (1351/3184) rs675520 RA ACPA+ 44.5 (334/750) 0.82 (0.70-0.96) 0.014 CRL 49.5 (1520/3070) rs6920220 RA ACPA+ 22.3 (172/770) 1.15 (0.95-1.39) ns CRL 20.1 (639/3184) rs694069 RA ACPA+ 35.5 (273/770) 0.82 (0.70-0.97) 0.019 CRL 40.1 (1276/3186) rs6917441 RA ACPA+ 27.9 (212/760) 1.11 (0.9-1.3) ns CRL 25.8 (816/3166) rs647108 RA ACPA+ 41.9 (321/766) 1.04 (0.9-1.2) ns CRL 41.0 (1306/3184) a MAF = minor allele frequency, n = number of minor alleles, N = total number of alleles. Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 120 2 Figure 1: Map of the studied region in chromosome 6q. Recombination hot-spots from the HapMap CEU data are represented as black squares below the rule with physical distances along the chromosome in Kb. The positions of the two RA associated peak SNPs from previous studies (rs13207033 and rs6920220) are marked by arrow-heads. Position of the TNFAIP3 gene and its structure are shown. Procedimiento experimental, resultados y discusión 121 138000k 138100k 138200k 138300k TNFAIP3 rs6920220rs13207033 Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 128 A Chromo4 real-time PCR system (MJ Research, Waltham, MA) was used to run these assays. Statistical analysis. Analysis of the results was carried out in Haploview (33), Statistica 7.0 (StatSoft, Tulsa, OK), and the Phase 2.0 program (34). Hardy-Weinberg equilibrium was tested in control samples, using a threshold of 0.05 without correction for multiple testing. Chi-square tests on 2 ⫻2 contingency tables were used to compare allele frequencies. Conditional logistic regression was used to ascertain the effect of the different SNPs on RA susceptibility, following a simplified additive model without interaction parameters, implemented using the Statistica program. Effects on clinical subgroups of patients were explored by sample stratification. Meta-analysis by pooling available data was performed with the Mantel-Haenszel method on 2 ⫻2 frequency tables, stratified by sample collection. Homogeneity of effect size across sample collections was assessed with the Breslow-Day test. RESULTS IRF5 genetic variation in RA susceptibility. Nine SNPs covering genetic variation in the IRF5 locus (Figure 1) were genotyped with a 99.7% success rate, both in the exploratory phase and in the replication phase. Genotypes were in Hardy-Weinberg equilibrium. Analysis of the linkage disequilibrium pattern showed high D⬘values between the 9 SNPs, indicating that they were in a single linkage disequilibrium block. At the same time, they were not providing redundant information, since most r 2 values were below 0.8, as expected for tagSNPs. Therefore, it is likely that a large fraction of genetic variation in the IRF5 locus has been adequately covered and has been determined with a minimum of redundancy. The first exploratory analysis was conducted using the collection of samples from the Hospital Clinico Universitario de Santiago, which included 516 RA patients and 503 controls. There was evidence of a significant association (P⬍0.05) for 6 of the 9 IRF5 SNPs (Table 2). The strength of association was more marked for the rs2004640, rs10954213, and rs10488631 SNPs. Table 2. Frequencies of alleles of the IRF5 SNPs in RA patients and controls from the 2 phases of the study* SNP, group Exploratory Replication Combined analysis MAF, %† OR (95% CI) Pversus controls MAF, %‡ OR (95% CI) Pversus controls MAF, %§ OR (95% CI) Pversus controls rs729302 RA 32.3 0.83 (0.7–1.0) 0.047 30.1 0.97 (0.8–1.1) NS 31.0 0.93 (0.8–1.0) NS Control 36.5 30.8 32.6 rs2004640 RA 41.3 0.75 (0.6–0.9) 0.001 41.8 0.99 (0.9–1.1) NS 41.6 0.91 (0.8–1.0) 0.07 Control 48.3 42.1 44.0 rs752637 RA 32.0 0.83 (0.7–1.0) 0.040 33.9 0.94 (0.8–1.1) NS 33.1 0.92 (0.8–1.0) NS Control 36.3 35.2 35.1 rs10954213 RA 30.1 0.77 (0.6–0.9) 0.006 34.9 0.94 (0.8–1.1) NS 33.0 0.87 (0.8–1.0) 0.016¶ Control 35.9 36.4 36.2 rs13242262 RA 31.1 0.80 (0.7–1.0) 0.016 35.2 0.96 (0.8–1.1) NS 33.6 0.92 (0.8–1.0) NS Control 36.2 36.2 35.5 rs10488630 RA 40.2 1.18 (1.0–1.4) 0.069 40.1 1.01 (0.9–1.2) NS 40.2 1.03 (0.9–1.1) NS Control 36.3 39.8 39.4 rs10488631 RA 15.0 1.36 (1.1–1.8) 0.020 11.0 1.08 (0.9–1.4) NS 12.6 1.23 (1.0–1.4) 0.013 Control 11.5 10.3 10.5 rs2280714 RA 29.6 0.88 (0.7–1.1) NS 32.1 1.00 (0.9–1.2) NS 31.1 0.99 (0.9–1.1) NS Control 32.4 32.1 31.2 rs4731535 RA 46.6 0.93 (0.8–1.1) NS 47.4 1.01 (0.9–1.2) NS 47.1 1.02 (0.9–1.1) NS Control 48.5 47.1 46.7 * SNPs ⫽single-nucleotide polymorphisms; MAF ⫽minor allele frequency; OR ⫽odds ratio; 95% CI ⫽95% confidence interval; NS ⫽not significant. † Total of 1,032 chromosomes of rheumatoid arthritis (RA) patients and 1,006 chromosomes of control subjects. ‡ Total of 1,612 chromosomes of RA patients and 1,608 chromosomes of control subjects. § Total of 2,644 chromosomes of RA patients and 3,236 chromosomes of control subjects. ¶ No data from Spanish controls in the previous study (31) were included for this SNP. IRF5 POLYMORPHISMS IN RHEUMATOID ARTHRITIS 1267 Procedimiento experimental, resultados y discusión 129 Table 3. Allele frequencies of the IRF5 SNPs in the subgroups of RA patients defined either by the presence or absence of ACPAs or for being a carrier or noncarrier of the SE* SNP, group† MAF, % Pversus ACPA⫺or SE⫺ OR (95% CI) Pversus controls rs729302 RA ACPA⫹31.9 NS 0.97 (0.8–1.2) NS RA ACPA⫺30.5 0.91 (0.7–1.2) NS RA SE⫹32.5 NS 0.99 (0.8–1.2) NS RA SE⫺33.0 1.02 (0.8–1.3) NS Control 32.6 Referent rs2004640 RA ACPA⫹41.8 NS 0.91 (0.8–1.1) NS RA ACPA⫺37.0 0.75 (0.6–1.0) 0.018 RA SE⫹40.9 NS 0.88 (0.7–1.1) NS RA SE⫺42.5 0.94 (0.8–1.2) NS Control 44.0 Referent rs752637 RA ACPA⫹34.1 0.007 0.95 (0.8–1.1) NS RA ACPA⫺25.3 0.63 (0.5–0.8) 5.4 ⫻10 ⫺4 RA SE⫹31.7 NS 0.86 (0.7–1.1) NS RA SE⫺34.0 0.95 (0.8–1.2) NS Control 35.1 Referent rs10954213 RA ACPA⫹31.3 0.059 0.80 (0.7–1.0) 0.019 RA ACPA⫺25.3 0.60 (0.5–0.8) 1.6 ⫻10 ⫺4 RA SE⫹30.7 NS 0.78 (0.6–1.1) 0.019 RA SE⫺30.7 0.78 (0.6–1.0) 0.027 Control 36.2 Referent rs13242262 RA ACPA⫹32.2 0.050 0.86 (0.7–1.0) NS RA ACPA⫺26.0 0.64 (0.5–0.8) 7.7 ⫻10 ⫺4 RA SE⫹31.7 NS 0.84 (0.7–1.0) NS RA SE⫺31.8 0.85 (0.7–1.1) NS Control 35.5 Referent rs10488630 RA ACPA⫹39.2 NS 0.99 (0.8–1.2) NS RA ACPA⫺44.1 1.22 (1.0–1.5) NS RA SE⫹36.0 0.039 0.86 (0.7–1.1) NS RA SE⫺42.7 1.14 (0.9–1.4) NS Control 39.4 Referent rs10488631 RA ACPA⫹14.9 NS 1.49 (1.2–1.9) 0.0014 RA ACPA⫺16.9 1.73 (1.3–2.4) 6.6 ⫻10 ⫺4 RA SE⫹18.1 0.015 1.88 (1.5–2.4) 9.4 ⫻10 ⫺7 RA SE⫺12.3 1.19 (0.9–1.6) NS Control 10.5 Referent rs2280714 RA ACPA⫹31.0 0.035 0.99 (0.8–1.2) NS RA ACPA⫺24.4 0.71 (0.5–0.9) 0.012 RA SE⫹29.5 NS 0.92 (0.7–1.1) NS RA SE⫺30.7 0.97 (0.8–1.2) NS Control 31.2 Referent rs4731535 RA ACPA⫹47.7 NS 1.04 (0.9–1.2) NS RA ACPA⫺43.2 0.87 (0.7–1.1) NS RA SE⫹50.4 0.067 1.16 (1.0–1.4) NS RA SE⫺44.3 0.91 (0.7–1.1) NS Control 46.7 Referent *SE⫽shared epitope (see Table 2 for other definitions). † Groups included the following number of chromosomes: RA ACPA⫹646, RA ACPA⫺308, RA SE⫹ 492, RA SE⫺424, and controls 3,236. 1268 DIEGUEZ-GONZALEZ ET AL Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 130 Frequencies of the rare alleles of rs2004640 and rs10954213 were decreased in RA samples compared with control samples (OR 0.75, 95% CI 0.6–0.9 and OR 0.77, 95% CI 0.6–0.9, respectively). In addition, the rare alleles of 3 other SNPs were also less common in RA patients than in controls (Table 2). Conversely, the rs10488631 SNP rare allele was more frequent in RA patients than in controls (OR 1.36, 95% CI 1.05–1.8). Replication of the study in a second collection of samples from multiple centers, which included 822 RA patients and 839 controls, showed a similar trend but did not confirm the association (Table 2). For completeness, we performed a combined analysis that also included samples from 313 Spanish controls from our previous study (31). In this analysis, involving 1,655 controls and 1,338 RA patients, the frequencies of the rs10954213 and rs10488631 SNPs remained significantly different between RA patients and controls, similar to the findings in the exploratory phase (Table 2). Preferential IRF5 association in RA patients without ACPAs. Data on ACPA status were only available for samples from the exploratory collection. Six SNPs showed significant differences in allele frequencies between the ACPA⫺patients and the controls, of which 4 were significantly different at P⬍0.001 (Table 3). In contrast, all of the allele frequencies in the ACPA⫹ patients were at an intermediate level, between those observed in the ACPA⫺patients and those observed in the controls. Moreover, only 2 IRF5 SNPs were significantly more frequent in the ACPA⫹patients than in the controls, in spite of the larger size of the ACPA⫹ subgroup (Table 3). The rs2004640 SNP showed a significant association with RA in the ACPA⫺patients only (Table 3), which is consistent with the preferential association reported by Sigurdsson et al (22). Meta-analysis of available studies. All studies of IRF5 genetic variation in RA have included the investigation of one of the functional SNPs, rs2004640. Therefore, results for this SNP were pooled and analyzed. Eight collections of samples, comprising a total of 4,620 RA patients and 3,741 controls, were included. All subjects were of European Caucasian descent (1 collection was from Argentina). Results from the different collections did not show significant heterogeneity (P⫽ 0.19), thus allowing inclusion in a pooled data set. Most single collections showed a trend toward lower frequency of the rs2004640 minor allele in RA patients compared with controls (Figure 2A). In 2 collections, 1 from Sweden and 1 from the present study, the difference in frequency of this minor allele was significant. In another 2 collections, the Argentinean and the Dutch, the decreased frequency of rs2004640 was not significantly different from controls, which is likely attributable to insufficient sample size. The other Figure 2. Meta-analysis of all available studies of the association of the rs2004640 IRF5 single-nucleotide polymorphism with susceptibility to rheumatoid arthritis (RA). Data were obtained on RA patients as a whole (A) and stratified according to anti–citrullinated protein antibody (ACPA) status (B). Each collection of samples is identified by country and corresponding study reference number. Samples in the present study were from either the exploratory collection or the replication collection. The collections in Binclude the Swedish and Dutch samples described in ref. 22 and the samples in our exploratory (Explora.) collection. Results are the odds ratio (OR) with 95% confidence interval. The size of each square represents the size of the collection, but the size of the diamonds (for summary ORs) is arbitrary. IRF5 POLYMORPHISMS IN RHEUMATOID ARTHRITIS 1269 Procedimiento experimental, resultados y discusión 131 4 collections, 2 from Spain, 1 from Sweden, and 1 from France, showed an rs2004640 minor allele frequency that approached a neutral level of association (OR 1.0). Mantel-Haenszel analysis showed that the frequency of this minor allele was significantly reduced in the RA patients as a whole (Figure 2A), with a pooled OR of 0.88 (95% CI 0.83–0.94; P⫽6.5 ⫻10 ⫺5 versus controls). Therefore, our findings indicate that an association of the rs2004640 SNP was present in this RA patient population as a whole. In addition, the data on the rs2004640 SNP from 3 collections were stratified by ACPA status. These analyses included 895 ACPA⫺RA patients, 1,478 ACPA⫹RA patients, and 1,545 controls. Results on the frequency of rs2004640 by ACPA status were not heterogeneous among the 3 different collections (for ACPA⫺ patients, P⫽0.70, and for ACPA⫹patients, P⫽0.96). Mantel-Haenszel analysis showed that the pooled effect of the rs2004640 minor allele was larger in the ACPA⫺ patients than in the ACPA⫹patients (Figure 2B), although it was significantly different from controls in both subgroups of RA patients (for ACPA⫺patients, OR 0.77, 95% CI 0.69–0.87, and for ACPA⫹patients, OR 0.90, 95% CI 0.81–0.99; P⫽1.8 ⫻10 ⫺5 and P⫽ 0.026 versus controls, respectively). This was unexpected, because ACPA⫹patients did not show a significant association of this allele with RA in any of the 3 sample collections separately (Figure 2B). Therefore, ACPA status by itself does not fully explain the effect of IRF5 genetic variation on RA susceptibility. IRF5 association in other RA subgroups. We also tested allele frequencies in 5 clinically relevant subclassifications of RA patients, according to sex and according to the presence or absence of erosions, RF, the SE, and the 620W PTPN22 allele. These analyses yielded unremarkable results except in the patients grouped by SE carrier status (Table 3) and except for a minor effect of erosive arthritis. (Detailed results for all of these subgroups are available online on the author’s Web site.) Two IRF5 SNPs were significantly different between the SE⫹and SE⫺RA patients (Table 3). The frequency of one of these SNPs, rs10488631, was highly significantly different from that in controls in the SE⫹ subgroup only (18.1% in SE⫹patients versus 10.5% in controls), with an OR of 1.88 (95% CI 1.5–2.4; P⫽9.4 ⫻ 10 ⫺7 versus controls). The association of the SE was dose dependent, since the frequency of this minor allele was higher in patients homozygous for the SE (24.0%) than in patients who were SE heterozygotes (16.6%). Thus, a significant correlation was observed between the SE dose and minor allele frequency of this SNP (P⫽ 0.037). This was a remarkable finding, because the rs10488631 minor allele has also been shown to tag the haplotype associated with SLE susceptibility (31), and because its frequency was increased in ACPA⫺patients (Table 3) and in RA patients with erosive disease (data available online on the author’s Web site). Similar to the results stratified by SE status, a significant difference in frequency of alleles of the rs10488631 SNP was also found in the group of RA patients with erosive disease compared with those without erosions (data available online on the author’s Web site). This finding was obtained when all of the RA Table 4. Allele frequencies of the IRF5 SNPs in the subgroups of RA patients defined jointly by the presence or absence of ACPAs and for being a carrier or noncarrier of the SE* SNP, group† MAF, % OR (95% CI) Pversus controls rs729302 ACPA⫹and SE⫺31.6 0.95 (0.7–1.3) NS ACPA⫺or SE⫹32.0 0.97 (0.8–1.2) NS Control 32.6 Referent rs2004640 ACPA⫹and SE⫺42.5 0.94 (0.7–1.2) NS ACPA⫺or SE⫹39.6 0.84 (0.7–1.0) 0.045 Control 44.0 Referent rs752637 ACPA⫹and SE⫺36.8 1.08 (0.8–1.4) NS ACPA⫺or SE⫹29.9 0.79 (0.7–1.0) 0.013 Control 35.1 Referent rs10954213 ACPA⫹and SE⫺32.0 0.83 (0.6–1.1) NS ACPA⫺or SE⫹29.0 0.72 (0.6–0.9) 0.0007 Control 36.2 Referent rs13242262 ACPA⫹and SE⫺33.3 0.91 (0.7–1.2) NS ACPA⫺or SE⫹29.8 0.77 (0.6–0.9) 0.0059 Control 35.5 Referent rs10488630 ACPA⫹and SE⫺41.2 1.08 (0.8–1.4) NS ACPA⫺or SE⫹39.1 0.99 (0.8–1.2) NS Control 39.4 Referent rs10488631 ACPA⫹and SE⫺11.8 1.14 (0.8–1.7) NS ACPA⫺or SE⫹17.5 1.80 (1.4–2.3) 7.54 ⫻10 ⫺7 Control 10.5 Referent rs2280714 ACPA⫹and SE⫺32.0 1.04 (0.8–1.4) NS ACPA⫺or SE⫹28.0 0.86 (0.7–1.0) NS Control 31.2 Referent rs4731535 ACPA⫹and SE⫺45.2 0.94 (0.7–1.2) NS ACPA⫺or SE⫹47.9 1.05 (0.9–1.2) NS Control 46.7 Referent * ACPAs ⫽anti–citrullinated protein antibodies; SE ⫽shared epitope (see Table 2 for other definitions). † Groups included the following number of chromosomes: ACPA⫹ and SE⫺RA patients n ⫽228, ACPA⫺or SE⫹RA patients n ⫽618, and control subjects n ⫽3,236. 1270 DIEGUEZ-GONZALEZ ET AL Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 132 patients from the exploratory set and the replication set were studied together. Association of IRF5 genetic variation according to both ACPA status and SE status. The preceding analyses led us to test whether simultaneous classification according to ACPA status and SE status could be useful in separating IRF5-associated patients from IRF5-independent patients. RA patients were classified into 1 of 2 groups: one that lacked the 2 associated characteristics, designated the ACPA⫹and SE⫺group, and one that included either of them, designated the ACPA⫺or SE⫹group; extensive classification would actually produce 4 subgroups, but the 3 included in the ACPA⫺or SE⫹definition were associated with IRF5 SNPs. The ACPA⫹and SE⫺group (27.0% of RA patients) showed no association with IRF5 genetic variation (Table 4). The second group, ACPA⫺or SE⫹, which included all of the remaining RA patients, showed significant changes in allele frequencies for 5 of the IRF5 SNPs. The most notable was the difference in frequency of the rs10488631 SNP (OR 1.80, 95% CI 1.4–2.3; P⫽7.54 ⫻10 ⫺7 versus controls). Therefore, classification of RA patients by both ACPA status and SE status allowed a clear separation of patients who showed an association with IRF5 variants from those who lacked any association. These results allowed us to further investigate the nature of the associated polymorphisms in the ACPA⫺ or SE⫹subgroup. Conditional logistic regression analysis of rs10488631 along with each of the other IRF5associated SNPs was conducted to determine whether the association with IRF5 variants was attributable to linkage disequilibrium or to an independent effect. Only the rs10954213 SNP remained associated with RA after conditioning (adjusted OR 0.79, 95% CI 0.64–0.97; P⫽ 0.02 versus controls), indicating that 2 IRF5independent effects could be present in the subgroup of ACPA⫺or SE⫹RA patients. (Detailed results of the conditional logistic regression analysis are available online on the author’s Web site.) We also performed an analysis of haplotypes in this subgroup of patients. Only 6 haplotypes had frequencies higher than 5%. Two of these haplotypes had frequencies that were significantly different from those in controls (Figure 3 and results online on the author’s Web site). One was a susceptibility haplotype, which was identified by the increased frequency of the minor allele of the rs10488631 SNP (allele 6 in Figure 3). This haplotype was almost twice as common in the RA patients as in the controls, and had a unique combination of the 3 known IRF5 functional polymorphisms. The other was a protective haplotype (allele 1 in Figure 3), which was less common in this subgroup of RA patients than in the controls. In contrast, the ACPA⫹ and SE⫺group did not show any significant difference from controls in the frequency of any of these haplotypes (results available online on the author’s Web site). DISCUSSION In the present study, we have expanded the knowledge of the role of IRF5 genetic variation in RA Figure 3. Haplotype analysis of the 9 IRF5 single-nucleotide polymorphisms (SNPs) in the rheumatoid arthritis patients who were either anti–citrullinated protein antibody negative or shared epitope positive. Results are the odds ratio (OR) with 95% confidence interval (95% CI) for those haplotypes with a frequency higher than 5%. Alleles in each haplotype are shown in the order of the SNPs in the IRF5 sequence (rs729302, rs2004640, rs752637, rs10954213, rs13242262, rs10488630, rs10488631, rs2280714, and rs4731535). Haplotype 6 or 1.8 (95% CI 1.4–2.3; P⫽1.2 ⫻10 ⫺6 versus controls) and haplotype 1 OR 0.76 (95% CI 0.6–0.98; P⫽0.046 versus controls). IRF5 POLYMORPHISMS IN RHEUMATOID ARTHRITIS 1271 Procedimiento experimental, resultados y discusión 133 susceptibility. Our meta-analysis of all of the available studies that have analyzed the rs2004640 IRF5 SNP showed, convincingly, that this SNP is associated with RA susceptibility. This association in nonstratified RA patients was unexpected, since most previous reports have described a lack of association of this SNP with RA (20–22). Only our exploratory sample collection and the samples in a previous study from Sweden (22) were found to show an association of this IRF5 SNP with RA in nonstratified patients. The associated SNP, rs2004640, is 1 of the 3 functional SNPs that have been identified in IRF5, and its association suggests that other functional variants will also have a role in RA susceptibility. This contention was supported by our results, which showed a wide association of IRF5 SNPs in our exploratory sample collection. Additional independent evidence comes from the WGAS performed by the Wellcome Trust Case–Control Consortium (WTCCC) (8). In the WTCCC study, up to one-half million SNPs have been genotyped in 2,000 RA patients and 3,000 control subjects from the UK as part of a larger project that includes 6 other diseases. In that study, 2 SNPs in the IRF5 locus were found to be associated with RA. One of these, rs12531711, showed a perfect correlation with rs10488631 and had an increased minor allele frequency in RA patients (OR 1.16, 95% CI 1.02–1.3; P⫽0.027 versus controls). The other, rs3807306, was correlated with rs13242262, at an r 2 of 0.75, and had a decreased minor allele frequency in RA patients (OR 0.84, 95% CI 0.8–0.9; P⫽4.2 ⫻10 ⫺5 versus controls). These results are very similar to those observed for the rs10488631 and rs13242262 SNPs in our exploratory sample collection. Therefore, in independent sample collections, particularly in those from largescale RA studies such as meta-analyses or the WTCCC study, the association of IRF5 genetic variation with RA as a whole has been demonstrated. However, the IRF5 association is not homogeneous across RA patients. The particular association that we observed in ACPA⫺patients has been found previously in patients from Sweden and in those from The Netherlands (22). We confirmed this finding in our study, showing that the changes in frequency of alleles of the IRF5 SNPs were more marked in the ACPA⫺ subgroup of patients than in the ACPA⫹patients. Accordingly, our meta-analysis of 3 of the sample collections showed a more marked effect of the rs2004640 SNP in ACPA⫺patients than in ACPA⫹patients. However, the meta-analysis also showed that, unexpectedly, rs2004640 was associated with RA in ACPA⫹ patients; this was not the case in any of the 3 sample collections studied separately. This result indicates that IRF5 variation could affect the susceptibility to RA in patients who are not included in the minor ACPA⫺ subgroup. Stratification of RA patients according to other characteristics allowed identification of strong IRF5 associations in the SE carrier subgroup, whereas patients in the SE noncarrier subgroup showed weak IRF5 associations. Because the patients in the SE⫹subgroup were not always the same patients as in the APCA⫺ subgroup, the SE carrier status could potentially explain the IRF5 association among the ACPA⫹patients. This preferential association in SE⫹patients should be considered with prudence until it is replicated in other studies. Nevertheless, it seems to be useful, since it allows a more precise separation of IRF5-associated RA patients from IRF5-independent RA patients, when the groupings are combined with ACPA status. The IRF5-associated group included most RA patients (⬃73%). These patients were ACPA⫺or SE⫹ and showed a strong association with several of the IRF5 SNPs. The IRF5-independent group, a minority of the RA patients, comprised those RA patients who were ACPA⫹and SE⫺. This latter classification is puzzling, because we do not know specifically what distinguishes the 2 groups of patients, and because the defining characteristics of the IRF5-independent subgroup, ACPA⫹and SE⫺, are discordant. As already mentioned, the SE predisposes RA patients to develop ACPA⫹, and not ACPA⫺, disease (4). At present, it is unclear whether there are any particular defining characteristics in RA patients who develop ACPAs in the absence of the SE. Further investigation of this subgroup may help identify the clinical or laboratory features that would distinguish these patients and ultimately point out the dissimilar pathogenic mechanisms involved in RA. Possible clues could be obtained from the interferon signature found in some RA patients (17). In contrast, the IRF5-associated group included most RA patients, and because of their heterogeneity, the data from this group are likely to be not very informative in this regard. Results of the haplotype analysis in the ACPA⫺ or SE⫹subgroup were reminiscent of the findings in patients with SLE (26,27,31). Most notably, RA patients and SLE patients appear to share the same susceptibility haplotype, with an OR that is almost double the likelihood in controls (31). This haplotype combines the rs2004640 allele, which introduces the donor splice site for exon 1B, and the rs10954213 allele, which determines elevated mRNA stability, as well as the longer, prolinerich region in exon 6. The specific consequences of this 1272 DIEGUEZ-GONZALEZ ET AL Factores genéticos implicados en la susceptibilidad a la artritis reumatoide 134 particular combination of alleles are unknown, but it constitutes an intriguing example of epistasis. The protective haplotype in the ACPA⫺or SE⫹ RA subgroup was 1 of the 2 protective haplotypes found in our SLE study; the other protective haplotype from the SLE study (31) (haplotype 5 in Figure 3) was not protective in RA patients. We do not have a clear picture as to what could be behind protective IRF5 haplotypes. In SLE, we have speculated that the protection could be linked to an unknown polymorphism tagged by the rs729302 SNP, but this SNP was irrelevant in RA. Others have proposed that protective haplotypes lack the exon 1B splicing site and include only 1 of the 2 other functional alleles (27), but this hypothesis also did not match our findings in RA. The similarity in the associated haplotypes between the ACPA⫺or SE⫹RA subgroup and patients with SLE suggests that the impact of these haplotypes on the etiologic processes of each disease will be similar. This is intriguing, because SLE and RA are clearly differentiated diseases and their presence in the same subject is less frequent than what would be expected at random (35). Also, RA patients in the IRF5-associated group did not show an increase in the presence of antinuclear antibodies (14.1%) as compared with that in RA patients in the IRF5-independent group (20.7%). It is likely that RA and SLE share some genetic factors related to the breaking of immune tolerance to autoantigens, but the role of IRF5 in this context is unclear, and results from the WGAS did not disclose an IRF5 association in patients with type 1 diabetes or in those with Crohn’s disease. In fact, our knowledge of IRF5 or type 1 IFNs in RA is insufficient to allow for robust prediction of the role of IRF5 variants in the disease. IRF5 has not yet been investigated at the molecular or cellular level in the context of autoimmune disease. Experiments have been restricted to antiviral responses and to the role of IRF5 in cancerous cells (11,36). The fact that a combination of polymorphisms is required to increase susceptibility and that both susceptibility and protective haplotypes are present, as well as the finding of a preferential association in a subset of RA patients, complicate further interpretation. It is possible that IRF5 genetic variation will impinge on synovial inflammation via its contribution to the induction of proinflammatory cytokines and chemokines (37). However, there are too many unsolved questions to propose any sound hypothesis. In conclusion, the association of IRF5 genetic variants with RA susceptibility has been confirmed. This association was preferential in patients with ACPA⫺ RA or in patients with SE⫹RA. Combining both criteria allowed us to separate a minor subgroup of IRF5-independent RA patients, characterized as ACPA⫹and SE⫺, from the remaining majority of patients with RA, who show strong IRF5 associations. It is expected that investigation of this classification may help us to better understand the different mechanisms involved in RA expression. In addition, we found that the expression pattern of IRF5 polymorphisms associated with RA was similar to that described in patients with SLE (31), suggesting that the involved molecular mechanisms might be similar. Note added in proof. A new functional polymorphism in the promoter region of IRF5 has been identified and has been shown to be associated with SLE susceptibility (Sigurdsson S, Go¨ring HH, Kristjansdottir G, Milani L, Nordmark G, Sandling JK, et al. Comprehensive evaluation of the genetic variants of interferon regulatory factor 5 (IRF5) reveals a novel 5 bp length polymorphism as strong risk factor for systemic lupus erythematosus. Hum Mol Genet 2008;17:872– 81). This polymorphism is not directly related to any of the haplotypes showing an association with RA in our study (unpublished observations). Further studies will be required to examine whether this polymorphism is associated with RA susceptibility. ACKNOWLEDGMENT We thank Cristina Fernandez-Lopez for excellent technical assistance. AUTHOR CONTRIBUTIONS Dr. Gonzalez had full access to all of the data in the study and takes responsibility for the integrity of the data and the accuracy of the data analysis. Study design. Dieguez-Gonzalez, Gonzalez. Acquisition of data. Dieguez-Gonzalez, Perez-Pampin, Rodriguez de la Serna, Fernandez-Gutierrez, Castan˜eda, Largo, Joven, Navarro, Marenco, Vicario, Blanco, Fernandez-Lopez, Caliz, Collado-Escobar, Carren˜o, Lopez-Longo, Can˜ete, Gomez-Reino. Analysis and interpretation of data. Dieguez-Gonzalez, PerezPampin, Rodriguez de la Serna, Fernandez-Gutierrez, Castan˜eda, Largo, Joven, Narvaez, Navarro, Marenco, Vicario, Blanco, Fernandez-Lopez, Caliz, Collado-Escobar, Can˜ete, Gomez-Reino, Gonzalez. Manuscript preparation. Dieguez-Gonzalez, Gonzalez. Statistical analysis. Calaza, Gonzalez. REFERENCES 1. Oliver JE, Worthington J, Silman AJ. Genetic epidemiology of rheumatoid arthritis. Curr Opin Rheumatol 2006;18:141–6. 2. Gorman JD, Lum RF, Chen JJ, Suarez-Almazor ME, Thomson G, Criswell LA. Impact of shared epitope genotype and ethnicity on erosive disease: a meta-analysis of 3,240 rheumatoid arthritis patients. Arthritis Rheum 2004;50:400–12. 3. 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