Neurotoxicidade do Metilmercurio

CURSO ACADÉMICO 2022-2023 NEUROTOXICIDADE DO METILMERCURIO METHYLMERCURY NEUROTOXICITY ELOI CAAMAÑO LOURIDO Autor deseño da portada, Solpor no laboratorio: Samuel Rey Viña. 3 Resumo O mercurio (Hg) é un metal tóxico empregado historicamente para diferentes propósitos como a minería de metais preciosos, constituíndo un contaminante ambiental a nivel mundial. As súas características fisicoquímicas permítenlle experimentar unha serie de procesos bioxeoquímicos a partir dos cales, mediante a participación da microbiota acuática, prodúcense diferentes especies derivadas, entre as cales destaca o metilmercurio (MeHg+). Trátase dun potente neurotóxico que pode supoñer un risco para aquela poboación que se vexa exposta a el mediante o consumo de especies marítimas contaminadas. O metilmercurio pode exercer a súa toxicidade en diferentes partes do organismo, sen embargo, o sistema nervioso central é particularmente sensible ós seus efectos. A exposición neurolóxica a este tóxico conleva unha ampla colección de alteracións moleculares e celulares entre as que se inclúen estrés oxidativo, disfunción mitocondrial, dishomeostase de glutamato e Ca2+, alteracións epixenéticas ou apoptose celular. Neste traballo de fin de grao realizarase unha análise dos aspectos relativos ó ciclo bioxeoquímico deste elemento, ademais do estudo dos efectos a nivel celular e molecular do MeHg+, indicando os tipos celulares e os mecanismos polos que se ven afectados. Palabras clave: ciclo do mercurio, metilmercurio, neurotoxicidade, estrés oxidativo, epixenética. 4 Abstract Mercury (Hg) is a toxic heavy-metal element widely known for its different historical applications such as the mining of precious metals, which also constitutes an environmental pollutant worldwide. Its physicochemical properties allow it to experience a series of biogeochemical processes from which, through the participation of aquatic microbiota, different derived species are produced, among which methylmercury (MeHg+) stands out. It is a potent neurotoxicant that can pose a risk to those who expose themselves to it through the consumption of contaminated marine species. Methylmercury can exert its toxicity in distinct parts of the human being; however, the central nervous system is particularly susceptible to its effects. A wide collection of molecular and cellular alterations such as oxidative stress, mitochondrial dysfunction, glutamate and Ca2+ dishomeostase, epigenetic alterations or cell apoptosis are included among the main effects after neurological exposure to methylmercury. In this thesis, both an analysis of the aspects related to the biogeochemical cycle of Hg and a study of the cellular and molecular effects of MeHg+, indicating affected cell types and prevalent cellular toxic mechanisms will be made. Keywords: mercury cycle; methylmercury; neurotoxicity; oxidative stress; epigenetics. 5 ÍNDICE Resumo e palabras clave ................................................................................................... 3 Abstract and keywords ..................................................................................................... 4 1 Introdución ................................................................................................................... 6 2 Obxectivos .................................................................................................................. 10 3 Metodoloxía ............................................................................................................... 11 4 Ciclo Bioxeoquímico do Hg .......................................................................................... 12 5 Toxicocinética ............................................................................................................. 15 6 Análise Toxicolóxica Molecular ................................................................................... 18 6.1 Selenio e Selenoproteínas ............................................................................................... 18 6.2 Estrés Oxidativo .............................................................................................................. 19 6.2.1 Sistema Glutatión .......................................................................................................................... 19 6.2.2 Sistema Tiorredoxina ..................................................................................................................... 20 6.2.3 Excitotoxicidade ............................................................................................................................ 21 6.2.4 Dismhomeostase de Calcio ........................................................................................................... 23 6.2.5 Disfunción Mitocondrial ................................................................................................................ 23 6.3 Análise Toxicolóxica Celular ............................................................................................ 24 6.3.1 Microglía ........................................................................................................................................ 24 6.3.2 Astrocitos....................................................................................................................................... 26 6.3.3 Neuronas ....................................................................................................................................... 28 6.3.4 Células Cerebelares ....................................................................................................................... 28 7 Epixenética da Intoxicación por MeHg+ ....................................................................... 30 8 Conclusións ................................................................................................................ 32 9 Referencias ................................................................................................................. 33 Agradecementos ............................................................................................................. 38 6 1 Introdución O mercurio (Hg) é un contaminante ambiental ben coñecido polo ser humano dende a antigüidade, aparecendo na maioría de cadeas tróficas do planeta, sobre todo nas acuáticas. A presencia deste elemento no medio-ambiente é debida, sobre todo, ás actividades humanas, as cales, dada á utilidade do cinabrio (mineral que contén Hg) para a minería de metais como a prata ou o ouro, liberaron mercurio ó aire, á terra e ó auga a gran escala dende o século XVI. O boom industrial posterior nos séculos XIX e XX condicionaron que as emisións de mercurio foran continuas polas actividades mineiras, polas súas novas aplicacións na tecnoloxía ou pola fabricación de produtos químicos e, dende os anos 60, pola queima de carbóns e a industria metalúrxica (1). As consecuencias tóxicas do metal tamén non so constitúen unha preocupación actual, senón que no século XIX xa se usaban expresións como “estar tolo como un sombreireiro”, debido á exposición crónica ás sales de mercurio no feltro dos sombreiros da época. Durante anos, a toxicidade mercurial representou unha problemática eminentemente industrial, que afectou a mineiros, fabricantes de barómetros e termómetros e traballadores do ámbito da odontoloxía. Por outra parte, o uso medicinal do mercurio tamén estivo presente ó longo da historia. O Hg presentaba recoñecidas propiedades antifúnxicas e antibacterianas, utilizándose como tratamento para a sífilis a finais do século XIX, baixo a cómica prescrición: “unha noite con Venus, sete anos con mercurio”. De igual xeito, as súas propiedades sobre o sistema xenitourinario condicionaron a entrada dos diuréticos mercuriais, empregados durante máis de 3 décadas ata seren substituídos a principios do século XX (1) (2). As alarmas internacionais sobre a toxicidade do Hg fixéronse efectivas tras os dramáticos incidentes de intoxicación por metilmercurio na bahía de Minamata (Xapón) e en Iran nos anos 60 e 70 respectivamente. Investigacións posteriores ós desastres cuantificaron a extensión global da contaminación polo metal, en parte debido á súa dispersión atmosférica na súa forma gasosa (Hg0) de longa vida, pero tamén á metilación microbiana xeralizada de Hg en ambientes anóxicos e a bioamplificación de Hg nas redes tróficas acuáticas. Estudos epidemiolóxicos paralelos nos anos 80 e 90 indicaron o risco de toxicidade para o neurodesenvolvemento pola exposición ó metilmercurio a partir do consumo de marisco, incluso a baixas doses. Debido á ameaza sanitaria global e os custos económicos asociados, impulsouse a acción internacional que comezou ca “Convención de Minamata” de 2013, que entrou en vigor en 2017 e que ten como principal obxectivo frear a liberación de Hg ó medio ambiente, así como a elaboración de protocolos para o rastrexo do seu éxito (1). 7 O mercurio e os seus compostos soen clasificarse en tres grupos principais: “mercurio elemental” (Hg0), “mercurio inorgánico” (Hg22+ e Hg2+) e “mercurio orgánico” (derivados monoorganometálicos e diorganometálicos de Hg2+). Inda que a intoxicación por mercurio, tanto elemental como inorgánico, pode producir síntomas neurolóxicos, a neuropatoloxía non está ben descrita. Sen embargo, as características neurotóxicas do mercurio orgánico descríbense con alta frecuencia na literatura científica. O “mercurio elemental” ou metálico é o único metal de toda a táboa periódica que, a temperatura ambiente e presión normal, se encontra en estado líquido e forma facilmente amalgamas con outros metais. Debido a estas características, utilizouse durante séculos para refinar diversos tipos de metais, ademais de que a amalgama de mercurio empregouse para o tratamento dental. O Hg0 tamén se aplicou en instrumentos de medida como termómetros, barómetros e tensiómetros, así como en aparellos eléctricos como equipos de iluminación e baterías secas, e na produción de sosa cáustica por electrólise. A toxicidade do mercurio elemental resulta principalmente da inhalación de vapores e afecta principalmente ós pulmóns. As sales de “mercurio inorgánico”, principalmente cloruros, derivan da interacción do elemento en estado metálico co medio ambiente e foron moi utilizados durante anos polo ser humano en medicamentos, cremas faciais, xermicidas e pesticidas. Un dos propósitos máis relevantes deste tipo de mercurio coincide cunha das pegadas medioambientais máis importantes a nivel histórico (antes do desastre de Minamata) e sitúan os focos sobre España, concretamente sobre Almadén, Ciudad Real. Trátase da maior explotación mineira de cinabrio e da maior anomalía xeolóxica de mercurio a nivel mundial, cuxa relevancia viña dada por ser o maior arsenal amalgamante do planeta, destinado á extracción de ouro (2) (3). O “mercurio orgánico” existe en forma de arilo (fenilmercúrico) ou con grupos alquilo curtos ou longos, destacando os de cadea curta dimetilmercurio (CH3—Hg—CH3) e catión monometilmercurio (CH3—Hg+), contaminantes ambientais extremadamente tóxicos e perigosos. O dimetilmercurio é un líquido claro cun cheiro lixeiramente doce, é unha das neurotoxinas máis potentes, cunha concentración tóxica inferior a 0,1 mL sendo capaz de causar intoxicación grave e incluso a morte. A súa natureza lipofílica permite que se absorba rapidamente cando se inhala ou se aplica á pel. O composto pode penetrar nunha variedade moi ampla de materiais, incluíndo plásticos e compostos de caucho como luvas de látex (4). A exposición de Karen Wetterhahn (5) a simplemente unhas pingas de dimetilmercurio nun accidente de traballo en 1996, provocou a aparición insidiosa de síntomas neurolóxicos e signos de intoxicación máis de tres meses despois. A pesar da terapia quelante tan agresiva 8 que recibiu, o seu estado deteriorouse rapidamente e morreu ós 48 anos de idade en xuño de 1997. Este incidente ben documentado conmocionou o mundo da investigación clínica e toxicolóxica e, na actualidade, o dimetilmercurio é usado so nun pequeno número de laboratorios químicos como material de referencia na espectroscopía de resonancia magnética nuclear (6). A ilustración 1 resume a historia, a aplicación clínica, a farmacoloxía, a toxicoloxía e a farmacocinética do mercurio e dos preparados que conteñen mercurio na medicina tradicional. O metilmercurio, principal obxecto de estudo deste traballo, é a forma de mercurio de maior preocupación tanto para a saúde humana como para a dos ecosistemas, debido principalmente á súa capacidade de biomagnificar nas cadeas alimentarias acuáticas ata niveis potencialmente tóxicos en peixes e piscívoros consumidos polos seres humanos e a vida salvaxe (4). A intoxicación denominada mercuriose pode producirse por calquera dos tres tipos de mercurio; sen embargo, o tóxico máis importante é o MeHg+. A sintomatoloxía e gravidade dos síntomas dependen en gran medida da magnitude da intoxicación e da forma que entre en contacto co organismo, podendo o ser humano intoxicarse por inhalación do tóxico en forma de vapor ou por contacto ca dermes, ou por inxestión de peixes ou mamíferos mariños Ilustración 1: Resumo das aplicacións históricas do mercurio e das súas formas, así como rasgos da súa farmacocinética e da súa toxicidade (3). 9 contaminados (7). A Axencia Española de Seguridade Alimentaria e Nutrición publicou en 2019 (8) novas recomendacións para o consumo de peixe sobre o seu contido en mercurio: - Para a poboación en xeral: recoméndase o consumo de ata 3-4 racións de peixe á semana, procurando en todos os casos variar a especie entre o peixe branco e o azul. - Para a poboación vulnerable requírense recomendacións específicas máis estritas para as 4 especies identificadas cun alto contido en mercurio: peixe espada/emperador, atún vermello, lucio e quenlla. - Os nenos de entre 10 e 14 anos deben limitar o consumo destas catro especies a 120 gramos ó mes. Unha vez incorporado ó organismo interaciona en gran medida con grupos —SH e ligandos tioles, determinando así unha distribución ampla cara os principais órganos afectados: fígado, riles e, sobre todo, cerebro (9). A capacidade de atravesar a barreira hematoencefálica (BHE) e ser tan prexudicial para o sistema nervioso central (SNC) ven determinada xustamente polas súas características fisicoquímicas, as cales lle permiten acceder facilmente ó compartimento cerebral por pura liposolubilidade ou por outros mecanismos complementarios como a formación de complexos con L-cisteína, emulando así un dos aminoácidos que poden atravesar esta barreira libremente: a L-metionina. As consecuencias por este tóxico poden oscilar entre alteracións do cortex visual e do cerebelo en adultos e parálise cerebral e desenvolvemento psicomotor deficiente en fetos ou neonatos (10), sendo estes os principais afectados pola intoxicación tal e como se expoñerá nos seguintes apartados deste Traballo de Fin de Grao. 16 sulfuro. Este feito explica moitos aspectos do comportamento do tóxico, como a forma que ten de atravesar as membranas biolóxicas ou a propia BHE (24). O metilmercurio no peixe inxerido está unido a residuos de cisteína (Cys) presentes nas proteínas musculares (25). Unha vez chegan ó estómago, o pH e péptidos coma a pepsina degradan este complexo e liberan o tóxico. Debido ás propiedades fisicoquímicas do elemento e das condicións de acidez do entorno estomacal, é moi probable que se produza a formación de MeHgCl (95% do metilmercurio cando pH = 2). A absorción realízase a través dos enterocitos do tracto gastrointestinal (TGI) (Ilustración 5) e pódese explicar se atendemos ós criterios de liposolubilidade desta especie. O paso a través da membrana tamén pode ocorrer por mecanismos de Rabbenstein, producíndose intercambios entre grupos cisteinato presentes tanto na parede interior estomacal coma no interior das células enterogástricas e nas paredes vasculares, accedendo así finalmente ó torrente sanguíneo. Tamén foron descritos mecanismos de entrada nos enterocitos por transportadores de anións orgánicos (OATPs), transportadores de aminoácidos neutros (LATs) e incluso proteínas de resistencia a medicamentos (MRPs), estando estos últimos relacionados co movemento a través da membrana basolateral. Unha vez na circulación xeral, o MeHg+ enfróntase a un ambiente cargado de abundantes grupos –SH ós que unirse: - Eritrocitos: O paso da membrana ocorre case de inmediato por transporte de Cys ou por OAT. Unha vez no interior, o MeHg+ únese a 3 principais candidatos: A hemoglobina (a máis relevante debido a que é a proteína máis abundante no compartimento sanguíneo), o GSH libre ou as proteínas do ciclo glicolítico (como a hexokinasa ou a lactato deshidroxenasa). A doses baixas so a hemoglobina (Ilustración 6) e o GSH se ven afectados, mentres que un incremento das cantidades de tóxico induce a Ilustración 5: Características ADME principais do MeHg+ (7). 17 acumulación de intermediarios de reacción do ciclo glicolítico (o que denota inhibición enzimática), podendo servir este feito como indicador de toxicidade xeral (26) (27). - Albúmina: A presencia de varios grupos cisteinato fai á albúmina (Ilustración 7) a proteína plasmática máis importante na distribución de MeHg+, sen embargo non se coñece en profundidade os mecanismos exactos de unión (28). A pesar que a albúmina é unha proteína moito máis abundante, as súas características estruturais non permiten unha tan adecuada aproximación do tóxico ós seus puntos de ancoraxe, mentres que a hemoglobina presenta estos puntos estéricamente máis accesibles. Esta soltura que presenta o tóxico de intercambiarse facilmente con grupos –SH e –SeH é a que lle confíre a capacidade de aumentar drásticamente a súa capacidade de distribución. Non só as súas características fisicoquímicas lle permiten acadar todos os recunchos do organismo, senón que esta facilidade de unión a grupos -SH tamén lle posibilita a entrada ó SNC, o órgano crítico. O complexo L-Cys-MeHg posúe unhas características estruturais practicamente iguais ás da L-metionina (un aminoácido esencial para o desenvolvemento do SNC), que presenta a capacidade de atravesar á vontade a BHE a través dos transportadores LAT1 (L-Aminoacid Transporter 1) (29). En canto á metabolización, simplemente recalcar que a maioría dos órganos son capaces de provocar a demetilación do metilmercurio, sendo o fígado o máis importante (por gran Ilustración 6: Estrutura 3D dunha molécula de hemoglobina humana. Marcados en amarelo os 6 residuos de Cys ós cales pode acceder e unirse facilmente o MeHg+. Representado con Chimera 1.16 (PDB: 5KSI) Ilustración 7: Estrutura 3D dunha molécula de seroalbúmina humana. Marcados en morado os 17 residuos de Cys ós cales o MeHg+ se pode ancorar, aínda que con impedimentos estéricos lixeiramente maiores que a hemoglobina. Representado con Chimera 1.16 (PDB: 1AO6) 18 presencia de grupos tiol antioxidantes), aínda que non son capaces de realizar este proceso á velocidade suficiente como para evitar os efectos tóxicos. A demetilación provoca a expulsión do tóxico cas sales biliares cara o TGI, onde no íleo distal se reabsorbe, entrando así na circulación enterohepática. A principal vía de excreción é por feces, aparecendo en forma de mercurio inorgánico (aínda que tamén é posible encontrar excreción urinaria) (30) (31). O mero paso a través desta membrana xa produce o seu primeiro efecto tóxico, xa que ó entrar en contacto cas células da BHE prodúcese aumento de factores coma os factores de crecemento endotelial vascular 1 e 2 (VEGF), que inducen vasodilatación e hiperpermeabilidade vascular, facilitando o paso de substancias tanto inocuas como tóxicas ó SNC. Isto ten un efecto moito máis intenso en fetos, onde a barreira hemato-encefálica aínda non está totalmente desenvolta. Unha vez dentro, son 3 os tipos celulares os que se ven afectados: a microglía, os astrocitos e as neuronas (32). Pero antes de proceder ca toxicidade celular debemos facer converxer as características fisicoquímicas cas moléculas características do SNC, de xeito que poidamos comprender en profundidade os efectos neurotóxicos ó detalle. 6 Análise Toxicolóxica Molecular A neurotoxicidade inducida polo MeHg+ depende de varias condicións, incluídas a idade de exposición (fetal, infantil ou adulta), os niveis de exposición e as diferenzas nas características dos tecidos e das células. A investigación puxo de relevo a importancia do estrés oxidativo na patoxénese da neurotoxicidade inducida por MeHg+ (10). 6.1 Selenio e Selenoproteínas O selenio é un dos elementos máis importantes para que un cerebro en pleno desenvolvemento creza adecuadamente. Intervén en varias etapas da formación neurolóxica e tamén xoga un papel crucial na defensa antioxidante do organismo, sobre todo do SNC (33), formando parte da enzima glutatión peroxidasa (GPx), da cal o Se, en forma de selenocisteína (Sec), representa o seu centro activo. A predilección do Se polo MeHg+ non so ten unha explicación fisicoquímica, senón que tamén representa unha función protectora fronte a intoxicación. Isto é debido a que a formación do complexo implica un descenso brusco da solubilidade da selenoproteína, formando agregados insolubles e irreversibles, eliminando por completo a acción tóxica do MeHg+ (34). Sen embargo, esta acción “pseudoquelante” so é efectiva cando os niveis de Se 19 son altos previamente á exposición ó tóxico, xa que se non hai unha concentración suficiente para neutralizar todos os catións MeHg+ que acceden ó organismo, este provocará bloqueo parcial dos transportadores específicos que utiliza o Se para acceder ós tecidos (probablemente debido á presencia de grupos -SH no seu dominio transmembrana) (35). Isto non so condiciona que as células reduzan significativamente a súa concentración intracelular de Se, senón que tampouco serán capaces de eliminar o metilmercurio que xa foi asimilado. Neste punto, o tratamento con Se xa é ineficaz, posto que de administralo non se conseguiría máis que bloquear por completo o transportador por saturación, negando calquera albisco de recuperar o estado funcional da célula (35). Isto supón unha problemática maior á esperable, xa que é imposible previr a cantidade de MeHg+ ca que se vai a producir a intoxicación. Se ademais temos en conta que unha administración excesiva de Se antes da exposición ó tóxico pode producir un aumento significativo de estado oxidativo do organismo (36) faise imposible a utilización deste elemento con fins profilácticos. 6.2 Estrés Oxidativo As defensas antioxidantes do SNC baséanse principalmente en 3 sistemas fundamentais: glutatión (GSH), glutatión peroxidasa (GPx) e tiorredoxin reductasa (TrxR). Ademais neste apartado tamén se estudarán os efectos sobre o sistema glutamato (Glu), cuxa alteración é responsable indirecto de estrés oxidativo. 6.2.1 Sistema Glutatión O glutatión é un péptido formado por tres aminoácidos: γ-glutamato-cisteína-glicina. É unha molécula antioxidante e constitúe un dos mecanismos de defensa antioxidante máis importantes do organismo, ademais de representar o 90% dos tioles non proteicos do ser humano. O seu principal cometido é a eliminación de especies de osíxeno reactivas (ROS), mantendo a homeostase redox celular. Esta molécula posúe dous estados: reducido (GSH) e oxidado (GSSG). Por razóns obvias, a molécula capaz de enfrontarse as ROS é o glutatión reducido, xa que ten o potencial redutor suficiente para eliminar a capacidade oxidante da maioría de ROS. Desta forma, podemos analizar a proporción GSH/GSSG para obter datos interesantes sobre o estado do maior sistema antioxidante a baixo nivel oxidativo do organismo, tendo en conta que debe estar sempre por riba da unidade (37). 20 Debido á presencia na molécula dun grupo tiol reducido (Cys-SH) é un obxectivo ideal para o MeHg+ (Ilustración 8), cuxa asociación induce a formación de agregados insolubles, descendendo así a concentración de glutatión reducido. A pesar de que este feito implica que as concentracións de metilmercurio tamén descenden, varios estudos documentan que as alteracións bioquímicas, producidas pola interacción do tóxico con compoñentes tisulares ou pola perda de potencial redutor, poden persistir indefinidamente (37). A glutatión peroxidasa (GPx) é unha enzima encargada da oxidación do GSH a GSSG utilizando o potencial redutor para producir desperoxidación, mentres que a glutatión reductasa (GR) é outra enzima capaz de catalizar o proceso contrario, mediante o uso do poder redutor do NADPH. En estudos con peixes cebra documéntase que o metilmercurio produce regulación á baixa da GPx1 nos embrións logo de 72 h de exposición, mentres que en estudos con embrións de rata encontrouse que o sistema GSH/GPX vese perturbado por completo en menos de 7 días, diminuíndo considerablemente a proporción GSH/GSSG (38). Todos estos efectos desprotexen ó tecido cerebral completamente fronte a acción das ROS, producindo principalmente acúmulos de H2O2 e peroxidación lipídica, a principal marca de estrés oxidativo. 6.2.2 Sistema Tiorredoxina O sistema tiorredoxina é outra barreira antioxidante do corpo humano, extremadamente importante a nivel do SNC e conformado pola propia tiorredoxina (Trx), a tiorredoxin redutasa (TrxR) e o NADPH. Presenta suma importancia no neurodesenvolvemento, debido a que, entre outros factores, a isoforma Trx1 actúa en mamíferos como cofactor adxuvante no crecemento cerebral, principalmente inducindo a liberación do factor de crecemento nervioso (NGF: Nerve Growth Factor). Ambas as dúas Ilustración 8: Intervención do MeHg+ sobre os estados de oxidación tanto GSH e do Trx, podendo ver como se inclina a balanza dos sistemas homeostásicos cara as formas oxidadas, as cales non son útiles na defensa contra o tóxico (7). 21 proteínas posúen Se, sendo ademais parte do centro catalítico da TrxR e posuír a importante responsabilidade de ser a única enzima capaz de devolverlle á tiorredoxina o estado reducido (de xeito que se evidencia de maneira bastante obvia a relación entre o sistema tiorredoxina e a intoxicación por metilmercurio) (39) (40). O sistema Trx e o GSH están intimamente relacionados en canto ós efectos neurotóxicos na intoxicación por MeHg+ (Ilustración 8). Cando a magnitude da intoxicación é baixa, o sistema tiorredoxina vai a ser o principal afectado, producíndose unha diminución substancial dos seus efectos protectores. Cando a concentración de tóxico no organismo se eleva, é o glutatión o que sofre unha importante oxidación. Esta inhibición particular asociada ás doses de tóxico explícanse en parte se atendemos ás características fisicoquímicas anteriormente citadas neste traballo; de xeito que, se o metilmercurio posúe unha maior afinidade polas moléculas con grupos selenol, é de esperar que o sistema tiorredoxina se vexa prexudicado antes de que o faga o sistema glutatión. A ausencia de moléculas suficientes de GSH non so prexudica a defensa antioxidante mediada por este sistema en particular, senón que a enzima glutarredoxina (unha proteína encargada de reducir a TrxR e que usa ó glutatión como cofactor) tamén se ve neutralizada, facendo caer en picado a proporción Trxr/Trxo (41). 6.2.3 Excitotoxicidade O ácido glutámico (Glu) é un aminoácido excitatorio que ten un papel importante en diversos aspectos do neurodesenvolvemento, como na aprendizaxe, na memoria e no propio crecemento cerebral. É unha molécula liberada tanto por neuronas como por células da glía, e exerce a súa acción mentres permaneza na fendedura sináptica (Ilustración 9). Sen embargo, a Glu tamén é liberada normalmente en situacións de estrés para forzar o organismo a reaccionar ó estímulo dañino, de forma que niveis altos poden actuar como unha toxina que causa danos nerviosos e incluso a morte celular (42). Por este motivo debe ser eliminada case de inmediato logo de ser liberada, papel que asume a glutamina sintetasa (GS). Esta enzima é capaz de degradar o ácido glutámico e convertelo en glutamina (Gln), molécula non excitable, permitindo así a relaxación das células próximas á fendedura sináptica. A GS so é posible encontrala no citoplasma celular, polo que o Glu debe ser importado polos transportadores específicos das células veciñas. Un equilibrio tan importante como este tamén se ve afectado pola presencia de metilmercurio, xa que a súa entrada nas células tanto induce a liberación como inhibe a 22 recaptación. Isto, provoca neurotoxicidade excitatoria entre as neuronas e células gliais próximas (42). A inhibición do metabolismo do Glu e do seu transportador produce acumulación desta substancia no entorno celular, provocando sobreactivación dos receptores de N-metil-Daspartato (NMDAr), os cales incrementan o fluxo intracelular de Na+ e Ca2+ e cuxas altas concentracións están relacionadas con mecanismos de morte e apoptose neuronal e gliar (43). Por outra parte, a formación de ROS nas inmediacións das células gliares tamén afectan á capacidade recaptativa dos transportadores de Glu, principalmente radicais superóxido, peróxido de hidróxeno e peroxinitrito. Experimentos en cachorros lactantes describen que, incluso ca lactancia, o metilmercurio reduce considerablemente a recaptación de Glu en diversas áreas cerebrais, incrementando así o estado oxidativo (44). En canto á limitada terapéutica se refire, recentemente tense observado os efectos do riluzol sobre a reducción da interferencia do estrés oxidativo ca excitotoxicidade (45). Este fármaco, tradicionalmente utilizado para o tratamento da esclerose lateral ammiotrófica, posúe un mecanismo de acción moi complexo que inclúe a activación do transportador de glutamato (GLT-1) e do transportador de glutamato/aspartato (GLAST) nos astrocitos, o que incrementa a recaptación de glutamato e reduce a activación de respostas mediadas por NMDAr (46). Isto plantexa un posible futuro onde o riluzol poida actuar coma un coadxuvante no tratamento da intoxicación co fin de reducir a toxicidade no SNC. Ilustración 9: Consecuencias da intervención do MeHg no ciclo glutamatérxico en diversos tipos celulares (7). 23 6.2.4 Dishomeostase de Calcio O Ca2+ é o mensaxeiro intracelular por excelencia na neurofisioloxía e é extremadamente importante, tanto no correcto funcionamento do sistema nervioso como nos mecanismos de toxicidade de metilmercurio. O aumento intracelular de Ca2+ é un indicador prematuro de neurotoxicidade por metilmercurio (relacionado ademais directamente ca excitotoxicidade). As neuronas inmaduras son particularmente sensibles a este mecanismo de toxicidade (47). O aumento de calcio intracelular por metilmercurio pode producirse por dous mecanismos principais: - A peroxidación lipídica altera a permeabilidade das membranas celulares, tanto da bicapa lipídica coma dos transportadores de Ca2+. Isto provoca principalmente a liberación de calcio intracelular. - As altas concentracións de Glu activan os NMDAr, aumentando a captación de calcio extracelular. A dishomeostase cálcica tamén induce a acción de caspasas, as cales son mediadoras de mecanismos de morte celular (ver máis adiante). 6.2.5 Disfunción Mitocondrial Un dos lugares onde máis metilmercurio se acumula é nas mitocondrias, véndose afectados principalmente a membrana interna e os transportadores de calcio. O tóxico provoca que as mitocondrias experimenten unha entrada masiva destos ións, alterando drásticamente o potencial de membrana que impide o transporte electrónico, o que ó mesmo tempo afecta ó proceso de fosforilación oxidativa (perturbando o aporte de ATP). Se sumamos isto co aumento das ROS (que producen peroxidación lipídica), obtemos unha apertura na membrana mitocondrial expoñéndoa a danos tales como mutacións na súa cadea de ADN (a cal é moito máis sensible que a nuclear debido á falta de histonas, entre outros factores). A ruptura da envoltura mitocondrial tamén implica unha liberación de Ca2+ ó lumen intracelular, agravando así a disfunción mitocondrial (48). O ADN mitocondrial (ADNmi) é particularmente susceptible a danos por estrés oxidativo, principalmente debido á súa forma circular e ó seu empaquetamento exento de histonas. O incremento da taxa de mutación do ADNmi é característico da toxicidade por dishomeostase de calcio. Unha variación na súa secuencia xenética pode aumentar na maioría dos casos a expresión de xenes involucrados no proceso de respiración celular, o cal 24 desencadearía un aumento da concentración de ROS derivados do proceso, provocando unha maior inestabilidade aínda no ADNmi (49). Estas condicións celulares inducen a acción dunha serie de proteínas denominadas caspasas, protein-kinasas relacionadas con diversos mecanismos de morte celular programada. A súa activación pode producirse por diversos motivos, entre os que destaca a liberación de Ca2+ ó espáceo intracelular, iniciando a formación de gránulos apoptóticos previos ó proceso de morte programada (48). En outros estudos descríbese como, aínda varios días despois do cese da exposición ó tóxico, seguíanse percibindo cantidades significativas de factores pro-apoptóticos e caspasas no hipocampo, o que levou posteriormente á morte celular (50). 6.3 Análise Toxicolóxica Celular O metilmercurio pode provocar danos citotóxicos sobre todo no SNC, tanto en doses baixas coma en altas. As áreas cerebrais maiormente afectadas son: - Lóbulo occipital, encargado do procesamento da información visual, polo que a toxicidade do metilmercurio pode producir alteracións no campo visual (51). - Lóbulo temporal, que presenta un papel importante nas tarefas visuais complexas como o recoñecemento de rostros, ademais de estar encargado da audición. Danos citotóxicos por MeHg+ provocan perda de agudeza visual e auditiva (51). - Cerebelo, bulbo olfactorio e hipocampo onde entre outras localizacións encontramos as células glutamatérxicas, células moi pequenas que interveñen directamente en procesos como a memoria e o aprendizaxe motor. Danos nestas células provocan ataxia, descordinación locomotora e convulsións tónicas ocasionais (51). Revisados os efectos tóxicos do metilmercurio a nivel molecular, abordaremos neste apartado á discusión sobre os efectos celulares que produce nos distintos tipos de células do sistema nervioso central. 6.3.1 Microglía Son as principais células de defensa e de soporte das funcións neuronais, os equivalentes ós macrófagos do SNC. Estas células encóntranse normalmente en repouso, proveendo as neuronas de sustento e mantendo a homeostase, ata que se produce unha perturbación no entorno neuronal. A microglía nese momento responde con cambios 25 morfolóxicos e procesos como a proliferación, a activación fagocítica e a secreción proinflamatoria e citoquínica. Varios estudos demostran que o efecto neurotóxico que provoca o metilmercurio neste tipo de células é principalmente debido ás funcións protectoras que exercen no SNC, sendo as primeiras células do entorno cerebral afectadas logo da exposición a metilmercurio. A súa viabilidade está relacionada co metilmercurio de forma dosee tempo-dependentes: dende aumentos moderados na concentración de ROS no interior e na periferia destas células na primeira hora de contacto co tóxico, ata a formación de clústeres e gránulos apoptóticos na periferia neuronal tras unha intoxicación crónica (52). Paradoxicamente, unha concentración baixa de metilmercurio (aproximadamente 2 ng/mL) é capaz de inducir un aumento na viabilidade e supervivencia das células microgliares, evento que cesa en canto se aumenta a dose (52). As células microgliares, en resposta á elevación da concentración de substancias tóxicas no ambiente cerebral, desenvolven cambios conformacionais nos que se incrementa o número de procesos e adquiren unha forma máis “astillada”, o que lle permite unha mellor comunicación co resto de células do entorno e unha maior capacidade de reacción ante o tóxico. Estos cambios morfolóxicos veñen dados pola sinalización ROCK (“Rho-associated protein kinase”), unha protein-kinasa esencial na regulación da forma e movemento das células pola súa actuación nas fibras de actina do citoesqueleto celular e na contractilidade celular. A activación da vía de sinalización ROCK induce a modulación do fenotipo microgliar, mediando mecanismos neuroinflamatorios e estando asociado cunha motilidade mellorada, así como co incremento da producción de ROS e da liberación de citocinas pro-inflamatorias (TNF-α, iNOS, IL-1 e sobre todo IL-6). Non so iso, senón que esta vía tamén está relacionada ca capacidade de fagocitación e invaxinación da membrana celular microgliar, desenvolvendo Ilustración 10: Avance dos cambios morfolóxicos de células gliares segundo a intensidade e duración da exposición a MeHg+. Obsérvase claramente coma o número de procesos e ramificacións se ven diminuídos e como na exposición de longa duración se perde case por completo a morfoloxía característica das células gliares, adoptando unha máis redondeada e disfuncional (54). 32 8 Conclusións - O Hg aparece de forma natural no medioambiente, sen embargo as concentracións actuais derivan da intervención humana, como a explotación das minas de cinabrio para posterior obtención de Ag e Au, ou o desastre de Minamata. - O mercurio elemental é facilmente evaporable e tende a acadar a atmosfera, onde se oxida a Hg2+ e cae ca chuvia de novo ó medio acuático. Aquí son as bacterias SRB as encargadas de metilar o mercurio e formar a especie máis tóxica, metilmercurio, mentres que as bacterias posuidoras do operon mer encárganse do proceso contrario, fechando o ciclo. - O metilmercurio presenta unha fisicoquímica particular que lle permite transportarse na sangue mediante a hemoglobina e a albúmina pola presencia de grupos –SH e acadar e atravesar facilmente a BHE, xa sexa por cuestións de liposolubilidade ou por transporte a través de LAT1, exercendo a nivel cerebral gran parte dos seus efectos tóxicos. - O MeHg+ exerce a súa toxicidade molecular principalmente a través da produción de ROS e do esgotamento da maquinaria antioxidante do SNC, intervindo nos ciclos bioquímicos do sistema GSH, do sistema Trx e no sistema Glu/Gln así como tamén provoca toxicidade mitocondrial e altera a homeostase do Ca2+. - As células afectadas polo MeHg+ son as da microglía, os astrocitos, as neuronas da cortiza cerebral e as células granulares do cerebelo, que ven mermadas as súas defensas antioxidantes ou desencadean procesos apoptóticos tras a activación da sinalización ROCK ou a dishomeostase de glutamato. - O metilmercurio tamén provoca efectos sobre a descendencia celular mediante cambios epixenéticos, tanto aumentando a metilación do DNA e das histonas como descendendo os niveis da acetilación destas últimas, así como provocando interferencias nos micro ARN mensaxeiros e descendendo a expresión de diferentes neurotrofinas. 33 9 Referencias 1. Sonke JE, Angot H, Zhang Y. Global change effects on biogeochemical mercury cycling. Ambio. 2023; 52: p. 853-876. Dispoñible en: https://link.springer.com/article/10.1007/s13280-023-01855-y 2. Oakley P. Making Mercury's Histories: Mercury in Gold Mining's Past and Present. Ambix. 2023; 70(1): p. 77-98. Dispoñible en: https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/00026980.2023.2192125 3. Zhao M, Li Y, Wang Z. Mercury and Mercury-Containing Preparations: History of Use, Clinical Applications, Pharmacology, Toxicology, and Pharmacokinetics in Traditional Chinese Medicine. Frontiers in Pharmacology. 2022; 13. Dispoñible en: https://www.frontiersin.org/ar ticles/10.3389/fphar.2022.807807/full 4. Hadidi S. A high-efficiency decomposition method for mono and dimethylmercury induced by low-energy electron attachment (<≈7 eV): A computational insight into the decomposition mechanism of extremely toxic mercury compounds. Chemosphere. 2023; 310. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/science /article/pii/S0045653522033380 5. Lemonick S. 25 Years After Karen Wetterhahn Died of Dimethylmercury Poisoning, Her Influence Persists Chemist left her mark on lab safety, the scientific method, and women in science. ACS Chemical Health & Safety. 2022; 29(4): p. 327-332. Dispoñible en: https://cen.acs.org/safety/lab-safety/25-years-KarenWetterhahn-died-dimethylmercury-poisoning/100/i21 6. Zee DZ, Singer CP, O'Halloran TV. Chemical-Shift Standards for 199Hg NMR Spectroscopy, 25 Years Later. Inorganic Chemistry. 2022; 61(35): p. 12657-13661. Dispoñible en: https://pubs.acs.org/doi/10 .1021/acs.inorgchem.2c02183 7. Pan J, Li X, Wei Y. Advances on the Influence of Methylmercury Exposure during Neurodevelopment. Chemical Research in Toxicology. 2022; 35(1): p. 43-58. Dispoñible en: https://pubs.acs.org/doi/1 0.1021/acs.chemrestox.1c00255 8. AESAN. Aesan - Mercurio. [Online].; 2019 [cited 2023 04 26. Dispoñible en: https://www.aesan.gob.es/AECOSAN/web/seguridad_alimentaria/ampliacion/mercurio.htm. 9. Ferreira L, Karpova N, Alves B. Evidence on Neurotoxicity after Intrauterine and Childhood Exposure to Organomercurials. International Journal of Environmental Research and Public Health. 2023; 20(2): p. 1121. Dispoñible en: https://www.mdpi.com/1660-4601/20/2/1070 10. Fujimura M, Usuki F. Cellular Conditions Responsible for Methylmercury-Mediated Neurotoxicity. International Journal of Molecular Sciences. 2022; 23(13). Dispoñible en: https://www.mdpi.com/14220067/23/13/7218 11. Sexauer M, Bank M, Bishop K. Mercury biogeochemical cycling: A syntesis of recent scientific advances. Science of The Total Environment. 2020; 737. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/science/ article/pii/S0048969720331399?via%3Dihub 12. Burger B, Estrada MV, Sexauer Gustin M. What caused Earth's largest mass extinction event? New evidence from the Permian-Triassic boundary in northeastern Utah. Global and Planetary Change. 2019; 177: p. 81100. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0921818118301322?via%3Dihub 13. Environment UN. UNEP - UN Environment Programme. [Online].; 2017 [cited 2023 04 14. Dispoñible en: http://www.unep.org/resources/report/global-mercury-supply-trade-and-demand. 14. Selin NE. Global Biogeochemical Cycling of Mercury: A Review. Annual Review of Environment and Resources. 2009; 34: p. 43-63. Dispoñible en: https://www.annualreviews.org/doi /abs/10.1146/annurev.environ.051308.084314 15. Gao Z, Zheng W, Li Y. Mercury transformations processes in nature: Critical knowledge gaps and perspectives for moving forward. Journal of Environmental Sciences. 2022; 119: p. 152-165. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1001074222003692?via%3Dihub 16. Cooper C, Zheng K, Rush K. Structure determination of the HgcAb complex using metagenome sequence data: insights into microbial mercury methylation. Communications biology. 2020; 3(320). Dispoñible en: https://www.nature.com/articles/s42003-020-1047-5 17. Choi SC, Chase T, Bartha R. Metabolic Pathways Leading to Mercury Methylation in Desulfovibrio desulfuricans. Applied and Environmental Microbiology. 1994; 60(11). Dispoñible en: https://journals.asm.org/doi/10.1128/aem.60.11.4072-4077.1994 34 18. Nascimento A, Chartone-Souza E. Operon mer: Bacterial resistance to mercury and potential for bioremediation of contaminated environments. Genetics and Molecular Research. 2003; 2(1): p. 92-101. Dispoñible en: https://www.funpecrp.com.br/gmr/year2003/vol1-2/sim0005_full_text.htm 19. Clarkson TW, Magos L. The Toxicology of Mercury and Its Chemical Compounds. Critical Reviewsin Toxicology. 2006; 36(8): p. 609-662. Dispoñible en: https://www.tandfonline.com /doi/abs/10.1080/10408440600845619?journalCode=itxc20 20. Renzoni A, Zino F, Franchi E. Mercury Levels along the Food Chain and Rosk for Exposed Populations. Environmental Research. 1998; 77(2): p. 68-72. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/sci ence/article/pii/S0013935198938324?via%3Dihub 21. Madabeni A, Nogara P, Bortoli M. Effect of Methylmercury Binding on the Peroxide-Reducing Potential of Cysteine and Selenocysteine. Inorganic Chemistry. 2021; 60(7): p. 4646-4656. Dispoñible en: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.inorgchem.0c03619 22. Chen B, Dong S. Mercury Contamination in Fish and its Effects on the Health of Pregnant Women and Their Fetuses, and Guidance for Fish Consuption—A Narrative Review. International Journal of Environmental Research and Public Health. 2022; 19(23). Dispoñible en: https://www.mdpi.com/1660-4601/19/23/15929 23. Ajsuvakova O, Tinkov A, Aschner M. Sulfhydryl groups as targets of mercury toxicity. Coordination Chemistry Reviews. 2020; 417. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/science/ar ticle/pii/S0010854520300837?via%3Dihub 24. Khan M, Wang F. Mercury-selenium compounds and their toxicological significance: Toward a molecular understanding of the mercury-selenium antagonism. Environmental Toxicology and Chemistry. 2010; 28(8): p. 1567-1577. Dispoñible en: https://setac.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1897/08-375.1 25. Bojian C, Shiyuan D. Mercury Contamination in Fish and Its Effects on the Health of Pregnant Women and Their Fetuses, and Guidance for Fish Consumption—A Narrative Review. International Journal of Environmental Research and Public Health. 2022; 19(23). Dispoñible en: https://www.mdpi.com/16604601/19/23/15929 26. Fang SC, Fallin E. The binding of various mercurial compounds to serum proteins. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 1976; 15: p. 110-117. Dispoñible en: https://link.springer.com/ article/10.1007/BF01686202 27. Bank RPD. RCSB PDB - 5KSI: Crystal structure of deoxygenated hemoglobin in complex with sphingosine phosphate and 2,3-Bisphosphoglycerate. [Online].; 2015 [cited 2023 March 13. Dispoñible en: https://www.rcsb.org/structure/5ksi. 28. Bank RPD. RCSB PDB - 1AO6: CRYSTAL STRUCTURE OF HUMAN SERUM ALBUMIN. [Online].; 2015 [cited 2023 March 13. Dispoñible en: https://www.rcsb.org/structure/1ao6. 29. Farina M, Rocha JBT, Aschner M. Mechanisms of methylmercury-induced neurotoxicity: Evidence from experimental studies. Life Sciences. 2011; 89(15-16): p. 555-563. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0024320511002657?via%3Dihub 30. Vázquez M, Vélez D, Devesa V. In vitro evaluation of inorganic mercury and methylmercury effects on the intestinal epithelium permeability. Food and Chemical Toxicology. 2014; 74: p. 349-359. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0278691514004505?via%3Dihub 31. Friberg L, Karle Mottet K. Accumulation of methylmercury and inorganic mercury in the brain. Biological Trace Elements Research. 1989; 21: p. 201-206. Dispoñible en: https://link.springer.com /article/10.1007/BF02917253 32. Novo J, Martins B, Raposo R. Cellular and Molecular Mechanisms Mediating Methylmercury Neurotoxicity and Neuroinflammation. International Journal of Molecular Sciences. 2021; 22(6). Dispoñible en: https://www.mdpi.com/1422-0067/22/6/3101 33. Wang F, Khan MMA. Mercury-selenium compounds and their toxicological significance: Toward a molecular understanding of the mercury-selenium antagonism. Environmental Toxicology and Chemistry. 2010 Xaneiro; 28(8): p. 1567-1577. Dispoñible en: https://setac.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1897/08-375.1 34. Reed M, Banna K, Heath J. Dietary selenium protects against selected signs of aging and methylmercury exposure. NeuroToxicology. 2010 Marzo; 31(2): p. 169-179. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0161813X10000069?via%3Dihub 35 35. Ye X, Fisher N. Minor effects of dietary methylmercury on growth and reproduction of the sheepshead minnow Cyprinodon variegatus and toxicity to their offspring. Environmental Pollution. 2020 Novembro; 266(1). Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/sc ience/article/pii/S0269749120308770?via%3Dihub 36. Kieliszek M, Blazejak S. Current Knowledge on the Importance of Selenium in Food for Living Organisms: A Review. Molecules. 2016; 21(5): p. 11-21. Dispoñible en: https://www.mdpi.com/1420-3049/21/5/609 37. Stringari J, Nunes A, Jeferson FL. Prenatal methylmercury exposure hampers glutathione antioxidant system ontogenesis and causes long-lasting oxidative stress in the mouse brain. Toxicology and Applied Pharmacology. 2008 Febreiro; 227(1): p. 147-154. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0041008X07004620?via%3Dihub 38. Cambier S, Gonzalez P, Mesmer-Dudons N. Effects of dietary methylmercury on the zebrafish brain: histological, mitochondrial, and gene transcription analyses. BioMetals. 2012; 25: p. 165-180. Dispoñible en: https://link.springer.com/article/10.1007/s10534-011-9494-6 39. Nordberg J, Arnér E. Reactive oxygen species, antioxidants, and the mammalian thioredoxin system. Free Radical Biology and Medicine. 2001; 31(11): p. 1287-1312. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0891584901007249?via%3Dihub 40. Bank RPD. RCSB PDB - 1H6V: Mammalian thioredoxin reductase. [Online].; 2015 [cited 2023 feb 23. Dispoñible en: https://www.rcsb.org/structure/1h6v. 41. Branco V, Coppo L, Solá S. Impaired cross-talk between the thioredoxin and glutathione systems is related to ASK-1 mediated apoptosis in neuronal cells exposed to mercury. Redox Biology. 2017; 13: p. 278-287. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2213231717303099?via%3Dihub 42. Petronia D, Tsai J, Mondal D. Attenuation of low dose methylmercury and glutamate induced-cytotoxicity and tau phosphorylation by an N-methyl-D-aspartate antagonist in human neuroblastoma (SHSY5Y) cells. Environmental Toxicology. 2011; 28: p. 700-706. Dispoñible en: https://onlinelibrary.wiley .com/doi/10.1002/tox.20765 43. Liu W, Xu Z, Deng Y. Excitotoxicity and oxidative damages induced by methylmercury in rat cerebral cortex and the protective effects of tea polyphenols. Environmental Toxicology. 2012; 29(3): p. 269-283. Dispoñible en: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/tox.21755 44. Chung YT, Lim KT, Park ST. Methylmercury-induced neurotoxicity in cerebral neuron culture is blocked by antioxidants and NMDA receptor antagonists. Neurotoxicology. 1996; 17(1): p. 37-45. Dispoñible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8784817/ 45. Deng Y, Xu Z, Liu W, . Exploring cross-talk between oxidative damage and excitotoxicity and the effects of riluzole in the rat cortex after exposure to methylmercury. Neurotoxicity Research. 2014; 26(1). Dispoñible en: https://link.springer.com/article/10.1007/s12640-013-9448-6 46. Fumagalli E, Funicello M, Rauen T. Riluzole enhances the activity of glutamate transporters GLAST, GLT1 and EAAC1. European journal of pharmacology. 2008; 578(2-3): p. 171-176. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014299907011818?via%3Dihub 47. Mundy WR, Freudenrich TM. Sensitivity of immature neurons in culture to metal-induced changes in reactive oxygen species and intracellular free calcium. Neurotoxicology. 2000; 21(6): p. 1135-1134. Dispoñible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11233760/ 48. Patel E, Reynolds M. Methylmercury impairs motor function in early development and induces oxidative stress in cerebellar granule cells. Toxicology Letters. 2013; 222(3): p. 265-272. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378427413012733?via%3Dihub 49. Wang X, Yan M, Zhao L. Low-Dose Methylmercury-Induced Apoptosis and Mitochondrial DNA Mutation in Human Embryonic Neural Progenitor Cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016. Dispoñible en: https://www.hindawi.com/journals/omcl/2016/5137042/ 50. Sokolowski K, Falluel-Morel A, Zhou X. Methylmercury (MeHg) elicits mitochondrial-dependent apoptosis in developing hippocampus and acts at low exposures. NeuroToxicology. 2011; 32(5): p. 535-544. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161813X11001070?via%3Dihub 51. Korbas M, Lai B. Methylmercury Targets Photoreceptor Outer Segments. ACS Chemical Biology. 2013; 8(10): p. 2256-2263. Dispoñible en: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/cb4004805 52. Tan Q, Zhang M, Geng L. Hormesis of methylmercury-human serum albumin conjugate on N9 microglia via ERK/MAPKs and STAT3 signaling pathways. Toxicology and Applied Pharmacology. 2019; 362: p. 59-66. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041008X18304812?via%3Dihub 36 53. Giovanna C, Philipe C. Function of Rho family proteins in actin dynamics during phagocytosis and engulfment. Nature Cell Biology. 2000; 2(10): p. E191-E196. Dispoñible en: https://www.nature.co m/articles/ncb1000_E191 54. Shinozaki Y, Danjo Y, Koizumi S. Microglial ROCK is essential for chronic methylmercury-induced neurodegeneration. Journal of Neurochemistry. 2019; 151(1): p. 64-78. Dispoñible en: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1111/jnc.14817 55. Fujimura M, Usuki F, Sawada M. Methylmercury exposure downregulates the expression of Racl and leads to neuritic degeneration and ultimately apoptosis in cerebrocortical neurons. NeuroToxiclogy. 2009; 30(1): p. 16-22. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161813X08001897?via%3Dihub 56. Hou S, Zhang X, Ning X. Methylmercury induced apoptosis of human neuroblastoma cells through the reactive oxygen species mediated caspase and poly ADP-ribose polymerase/apoptosis-inducing factor dependent pathways. Environmental Toxicology. 2022; 37(8): p. 1891-1901. Dispoñible en: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/tox.23535 57. Fujimura M. Fasudil, a ROCK inhibitor, prevents neuropathic pain in Minamata disease model rats. Toxicology Letters. 2022; 371: p. 38-45. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/science /article/abs/pii/S0378427422017623?via%3Dihub 58. Bélanger M, Magistretti PJ. The role of astroglia in neuroprotection. Dialogues Clinical Neuroscience. 2009; 11(3): p. 281-295. Dispoñible en: https://www.tandfonline.com/doi/f ull/10.31887/DCNS.2009.11.3/mbelanger 59. Liedtke W, Edelmann W, Bieri P. GFAP is necessary for the integrity of CNS white matter architecture and long-term maitenance of myelination. Neuron. 1996; 17(4): p. 607-615. Dispoñible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8893019/ 60. Middledorp J, Hol EM. GFAP in health and disease. Progress in Neurobiology. 2011; 93: p. 421-443. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0301008211000062?via%3Dihub 61. Milos P, Nilsson M. Astrocyte activation and reactive gliosis. Glia. 2005; 50(4): p. 427-434. Dispoñible en: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/glia.20207 62. Pajarillo E, Rizor A, Lee J. The role of astrocytic glutamate transporters GLT-1 and GLAST in neurological disorders: Potential targets for neurotherapeutics. Neuropharmacology. 2019; 161. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0028390819300802?via%3Dihub 63. Pierozan P, Biasibetti H, Schmitz F. Neurotoxicity of Methylmercury in Isolated Astrocytes and Neurons: the Cytoskeleton as a Main Target. Molecular Neurobiology. 2017; 54: p. 5752-5767. Dispoñible en: https://link.springer.com/article/10.1007/s12035-016-0101-2 64. Tian J, Luo Y, Chen W. MeHg Suppressed Neuronal Potency of Hippocampal NSCs Contributing to the Puberal Spatial Memory Deficits. Biological Trace Element Research. 2016; 172: p. 424-436. Dispoñible en: https://link.springer.com/article/10.1007/s12011-015-0609-8 65. Bose R, Onishchenko N, Edoff K. Inherited Effects of Low-Dose Exposure to Methylmercury in Neural Stem Cells. Toxicological Sciences. 2012; 130(2): p. 383-390. Dispoñible en: https://academic.oup.com/toxsci/article/130/2/383/1726168?login=false 66. Ke T, Tsatsakis A, Santamaría A. Chronic exposure to methylmercury induces puncta formation in cephalic dopaminaergic neurons in Caenorhabditis elegans. NeuroToxicology. 2020; 77: p. 105-113. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161813X20300115?via%3Dihub 67. Tucker E, Nowak R. Methylmercury alters proliferation, migration, and antioxidant capacity in humans HTR8/SV-neo trophoblast cells. Reproductive Toxicology. 2018; 78. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S089062381730607X?via%3Dihub 68. Yuan Y, Atchinson W. Multiple Sources of Ca2+ Contribute to Methylmercury-Induced Increased Frequency of Spontaneous Inhibitory Synaptic Responses in Cerebellar Slices of Rat. Toxicological Sciences. 2016; 150(1): p. 117-130. Dispoñible en: https://academic.oup.com/toxsci/article/150/1/117/2461549?login=false 69. NCI. Definition of epigenetics - NCI Dictionary of Cancer Terms - NCI. [Online].; 2011 [cited 2023 06 20. Dispoñible en: https://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms/def/epigenetics. 70. Ke T, Tinkov AA, Skalny AV. Epigenetics and Methylmercury-Induced Neurotoxicity, Evidence from Experimental Studies. Toxics. 2023; 11(1). Dispoñible en: https://www.mdpi.com/2305-6304/11/1/72 71. Gruenwedel DW, Glaser JF, Cruikshank MK. Binding of methylmercury(II) by HeLa S3 suspension-culture cells: Intracellular methylmercury levels and their effect on DNA replication and protein synthesis. Chemo- 37 Biological Interactions. 1981; 36(3): p. 259-274. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/science/ article/abs/pii/0009279781900703?via%3Dihub 72. Cediel-Ulloa A, Lindner S, Rüeg J. Epigenetics of methylmercury. Neurotoxicology. 2023; 97: p. 24-46. Dispoñible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161813X23000645?via%3Dihub 73. Ceccatelli S, Bose R, Edoff K. Long-lasting neurotoxic effects of exposure to methylmercury during development. Journal of Internal Medicine. 2013; 273(5): p. 490-497. Dispoñible en: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/joim.12045 74. Kuzumaki N, Ikegami D, Tamuro R. Hippocampal epigenetic modification at the brain-derived neurotrophic factor gene induced by an enriched environment. Hippocampus. 2011; 21(2): p. 127-132. Dispoñible en: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/hipo.20775 38 Agradecementos Agradezo a valiosa colaboración e tutela da miña titora Mª Ángeles Sánchez González, cuxo amparo, dirección e consellos foron imprescindibles para a realización deste traballo. Tamén agradecer á miña familia e parella o apoio e respaldo ofrecido, facendo obviables as preocupacións derivadas do longo proceso de redación deste traballo. Agradecementos tamén @/s lectores deste traballo, grazas polo seu tempo e atención.