Paneles Génicos como Herramienta para el Diagnóstico de Enfermedades Raras en Pediatría

TESIS DE DOCTORADO Paneles Génicos como Herramienta para el Diagnóstico de Enfermedades Raras en Pediatría Sofia Isabel Barbosa Sousa Gouveia ESCOLA DE DOUTORAMENTO INTERNACIONAL PROGRAMA DE DOUTORAMENTO EN INVESTIGACIÓN CLÍNICA EN MEDICINA SANTIAGO DE COMPOSTELA 2020 DECLARACIÓN DEL AUTOR DE LA TESIS Paneles Génicos como Herramienta para el Diagnóstico de Enfermedades Raras en Pediatría Dña. Sofia Isabel Barbosa Sousa Gouveia Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento, y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) En su caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide con la versión enviada en formato electrónico. 4) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. En Santiago de Compostela, 13 de Julio de 2020 Fdo: Sofia Isabel Barbosa Sousa Gouveia AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR / TUTOR DE LA TESIS Paneles Génicos como Herramienta para el Diagnóstico de Enfermedades Raras en Pediatría Dña. María Luz Couce Pico Dña. María Rosaura Leis Trabazo INFORMAN: Que la presente tesis, corresponde con el trabajo realizado por Dña. SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA, bajo nuestra dirección, y a utorizamos su presentación , considerando que reúne l os r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como directores de ésta no incurre en las causas de abstención establecidas en Ley 40/2015. En Santiago de Compostela, 13 de Julio de 2020 Fdo. María Luz Couce Pico Fdo. María Rosaura Leis Trabazo El autor declara no tener ningún conflicto de interés en relación con la tesis doctoral. i RESUMO Estímase que as enfermidades raras no seu conxunto afectan a entre un 3,5% e un 5,9% da poboación mundial, o que se traduce en preto de 30 millóns de persoas afectadas en Europa, e 300 millóns a nivel mundial. Ata a data identificáronse ao redor de 6000 enfermidades raras, das cales o 70% son pediátricas. O diagnóstico destas patoloxías é un dos desafíos máis complexos aos que se enfrontan os especialistas en pediatría, dado que se caracterizan por unha ampla diversidade de síntomas e signos pouco específicos que varían non só dunha enfermidade a outra, senón tamén dun paciente a outro padecendo a mesma enfermidade. Desafíos que poden ocultar enfermidades subxacentes e que inevitablemente conducen ao atraso no diagnóstico e tratamento destes pacientes. As tecnoloxías de secuenciación de próxima xeración (NGS), están a cambiar o panorama das probas xenéticas en enfermidades raras e como consecuencia, o paradigma do diagnóstico destas patoloxías. O avance destas tecnoloxías permitiu a análise simultánea de centos / miles de xenes en moi pouco tempo e a baixo custo, ofrecendo varias estratexias para apoiar o diagnóstico destes trastornos. Unha destas estratexias é o deseño de paneis xénicos específicos de enfermidade. Neste proxecto de tese deseñáronse 10 paneis xénicos individuais que inclúen xenes asociados a Erros Conxénitos do Metabolismo (ECM) e a enfermidades neurolóxicas. Posteriormente, todos os xenes incluídos nos paneis individuais foron agrupados nun panel único, o NeuroExoma. En total estudáronse 825 pacientes <18 anos, por sospeita de enfermidade metabólica e/ou neurolóxica, e o estudo xenético realizouse por: análise exclusiva do panel individual, análise exclusiva do NeuroExoma e análise do panel individual complementada por NeuroExoma cando o resultado do primeiro é negativo. As taxas de ii diagnóstico entre os diferentes paneis individuais variaron entre o 4,8% (no panel de discapacidade intelectual) e o 58,3% (no panel de defectos do metabolismo intermediario). Con relación ás tres estratexias implementadas, as taxas de diagnóstico globais dos paneis individuais e do NeuroExoma foron similares, ao redor do 24%. A partir da análise dos datos xenéticos obtidos, foi posible describir a arquitectura molecular asociada aos ECM e enfermidades neurolóxicas, onde as variantes de novo, o mosaicismo e as CNVs gañaron relevancia nos últimos anos, así como a detección de variantes patoxénicas recorrentes na nosa poboación e posibles casos de herdanza dixénica. Como parte deste traballo de tese foi levada a cabo unha estancia internacional no Radboud University Medical Center. Durante este período, realizáronse estudos funcionais para confirmar a patoxenicidade de variantes identificadas en pacientes con sospeita de enfermidade mitocondrial. Os resultados obtidos corroboran a sospeita xenética inicial, destacando a importancia destas probas como complementación na interpretación da análise xenética. En resumo, as tecnoloxías NGS teñen un potencial enorme como test de primeira liña nas probas xenéticas para o diagnóstico de enfermidades raras, aínda que quedan limitacións por solucionar. A implementación clínica destas probas permite non só un asesoramento xenético adecuado para o paciente e familia, senon tamén o desenvolvemento doutras potenciais aplicacións clínicas como o diagnóstico prenatal, ou o cribado xenético neonatal. Palabras chave: NGS, Paneis Xenéticos, Enfermidades Raras, ECM, Neurolóxica iii RESUMEN Se estima que las enfermedades raras en su conjunto afectan a entre un 3,5% y un 5,9% de la población mundial, lo que se traduce en cerca de 30 millones de personas afectadas en Europa, y 300 millones a nivel mundial. Hasta la fecha se han identificado alrededor de 6000 enfermedades raras, de las cuales el 70% son pediátricas. El diagnóstico de estas patologías es uno de los desafíos más complejos a los que se enfrentan los especialistas en pediatría, dado que se caracterizan por una amplia diversidad de síntomas y signos poco específicos que varían no solo de una enfermedad a otra, sino también de un paciente a otro padeciendo la misma enfermedad. Desafíos que pueden ocultar enfermedades subyacentes y que inevitablemente conducen al retraso en el diagnóstico y tratamiento de estos pacientes. Las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS), están cambiando el panorama de las pruebas genéticas en enfermedades raras y como consecuencia, el paradigma del diagnóstico de estas patologías. El avance de estas tecnologías ha permitido el análisis simultáneo de cientos / miles de genes en muy poco tiempo y a bajo coste, ofreciendo varias estrategias para apoyar el diagnóstico de estos trastornos. Una de estas estrategias es el diseño de paneles génicos específicos de enfermedad. En este proyecto de tesis se han diseñado 10 paneles génicos individuales que incluyen genes asociados a Errores Congénitos del Metabolismo (ECM) y a enfermedades neurológicas. Posteriormente, todos los genes incluidos en los paneles individuales fueron agrupados en un panel único, el NeuroExoma. En total se han estudiado a 825 pacientes <18 años, por sospecha de enfermedad metabólica y/o neurológica, y el estudio genético se ha realizado por: análisis exclusivo del panel individual, análisis exclusivo del NeuroExoma y análisis del panel individual complementada por NeuroExoma cuando el resultado del primero es negativo. Las tasas de diagnóstico entre los diferentes paneles individuales variaron entre el iv 4,8% (en el panel de discapacidad intelectual) y 58,3% (en el panel de defectos del metabolismo intermediario). Con relación a las tres estrategias implementadas, las tasas de diagnóstico globales de los paneles individuales y del NeuroExoma fueron similares, alrededor del 24%. A partir del análisis de los datos genéticos obtenidos, fue posible describir la arquitectura molecular asociada a los ECM y enfermedades neurológicas, donde las variantes de novo, el mosaicismo y las CNVs han ganado relevancia en los últimos años, así como la detección de variantes patogénicas recurrentes en nuestra población y posibles casos de herencia digenica. Como parte de este trabajo de tesis fue llevada a cabo una estancia internacional en Radboud University Medical Center. Durante este periodo, se han realizado estudios funcionales para confirmar la patogenicidad de variantes identificadas en pacientes con sospecha de enfermedad mitocondrial. Los resultados obtenidos corroboran la sospecha genética inicial, relevando la importancia de estas pruebas como complementación en la interpretación del análisis genético. En resumen, las tecnologías NGS tienen un potencial enorme como test de primera línea en las pruebas genéticas para el diagnóstico de enfermedades raras, aunque quedan limitaciones por solucionar. La implementación clínica de estas pruebas permite no sólo un asesoramiento genético adecuado para el paciente y familia, como también el desarrollo de otras potenciales aplicaciones clínicas como el diagnóstico prenatal, o el cribado genético neonatal. Palabras clave: NGS, Paneles Genéticos, Enfermedades Raras, ECM, Neurológicas v ABSTRACT It is estimated that rare diseases affect between 3.5% and 5.9% of the world's population, which means about 30 million people are affected in Europe, and 300 million worldwide. So far, about 6,000 rare diseases have been identified, of which 70% are pediatric. The diagnosis of these disorders is one of the most complex challenges faced by pediatric specialists, as they are characterized by a wide variety of unspecific symptoms and clinical signs that vary not only from one disease to another, but also from one patient to another suffering from the same disorder. These challenges can hide underlying diseases and inevitably will lead to delays in the diagnosis and treatment of these patients. Next-generation sequencing technologies (NGS) are changing the landscape of genetic testing in rare diseases and, as a result, their diagnostic paradigm. The development of these technologies has allowed the simultaneous analysis of hundreds / thousands of genes in a very short time and at low cost, offering several strategies to support their diagnosis. One of these strategies is the design of disease-specific gene panels. In this thesis project, 10 individual gene panels have been designed that include genes associated with Inborn Errors of Metabolism (IEM) and neurological diseases. Subsequently, all genes included in the individual panels were grouped into a single panel, called NeuroExoma. Genetic studies were performed on a total of 825 patients, <18 years of age, with suspicion of metabolic and / or neurological disease, as followed: exclusive analysis of the individual panel, exclusive analysis of NeuroExoma and analysis of the individual panel supplemented by NeuroExoma when the result of the first approach was negative. Diagnosis rates between the different individual panels ranged from 4.8% (in the intellectual disability panel) to 58.3% (in the intermediate metabolism defects panel). Regarding the three implemented strategies, the overall diagnostic rates of the individual vi panels and NeuroExoma were similar, around 24%. From the analysis of the genetic data obtained, it was possible to describe the molecular architecture associated with IEM and neurological diseases, where de novo variants, mosaicism and CNVs have been highlighted in recent years, as well as the detection of recurrent pathogenic variants in our population and possible cases of digenic inheritance. As part of this thesis work an international stay was conducted at Radboud University Medical Center. During this period, functional studies were performed to confirm the pathogenicity of variants identified in patients with suspected mitochondrial disease. The results obtained corroborate the initial genetic suspicion, highlighting the importance of these tests as a complement to the interpretation of genetic analysis. In summary, NGS technologies have enormous potential as a firstline genetic testing for the diagnosis of rare diseases, although limitations remain to be addressed. The clinical implementation of these tests allows not only adequate genetic counseling for the patient and family, but also the development of other potential clinical applications such as prenatal diagnosis, or newborn genetic screening. Keywords: NGS, Genetic Panels, Rare Diseases, IEM, Neurologic vii ABREVIATURAS ACMG American College of Medical Genetics AD Autosómico Dominante ADN Ácido desoxirribonucleico ADNmt ADN mitocondrial APS Persulfato de amonio AR Autosómico Recessivo ARN Ácido ribonucleico ATP Adenosina trifosfato B Benigna BAM Binary Alignment Map bp base pairs BWA Burrows-Wheeler Aligners C Conflicto de interpretaciones CNV Copy Number Variation ddNTP Didesoxinucleótidos DE Desviación Estándar DEL Delección DISC INT Discapacidad Intelectual DMD Distrofia Muscular de Duchenne DN de novo dNTP Desoxinucleótidos DUP Duplicación ECAR Tasa de Acidificación Extracelular ECM Errores Congénitos del Metabolismo EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EEG Electroncefalograma EIEE Encefalopatía Epiléptica Infantil de Inicio Temprano ENCODE Enciclopedia de Elementos de ADN EPI Epilepsia ESE Exonic Splicing Enhancer ESP Exome Sequencing Project viii ESS Exonic Splicing Silencer ETC Cadena de transporte de electrones ExAC Consorcio de Agregación de Exomas FCS Suero fetal de ternera FS Frameshift GATK Genoma Analysis Toolkit GC Contenido en guanina y citosina GERP Genomic Evolutionary Rate Profiling GFP Green Fluorescent Protein GTP Guanosín trifosfato GTR Genetic Testing Registry GWAS Genome Wide Association Studies H Herencia HE Hemicigoto HGMD Human Gene Mutation Database HGVS Human Genome Variation Society HIPO/HIPER Hipo/Hiperglucemia HO Homocigoto HNO/A Hermano/a HPA Hiperfenilalalinemia HPO Human Phenotype Ontology HT Heterozigoto HT C Heterocigoto compuesto ID Discapacidad Intelectual LB Probablemente benigna LCR Líquido cefalorraquídeo LGMD Distrofia Muscular de la Cintura Escapular lncARN Ácido ribonucleico no codificante largo LP Probablemente Patogénica LSDB Locus Specific Databse List LTBL Leucoencefalopatía con afectación del tálamo y tronco encefálico con acidosis láctica MAF Frecuencia del Alelo Menor MAT Materna ix MET INT Metabolismo Intermediario MISS Missense MITO Mitocondrial MODY Maturity Onset Diabetes of the Young MOL COMP Moleculas Complejas MORF CER Morfogenesis Cerebral MOS Mosaicismo MOV Trastornos del Movimiento MRI Resonancia Magnetica MUS Neuromuscular ncARN Ácido ribonucleico no codifcante NCBI Centro Nacional para la Información Biotecnológica ND No disponible NGS Next-Generation Sequencing NHGRI Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano (NHGRI) NON Nonsense OCR Tasa de Consumo de Oxígeno OMIM Online Mendelian Inheritance in Man OXPHOS Mitochondrial Oxidative Phosphorylation System P Patogénica PAT Paterna PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa PGH Proyecto del Genoma Humano piARN microARN asociado a piwi PKU Fenilcetonuria RTA Real Time Analysis SAM Sequence Alignment Map siARN microARN de interferencia corto SMRT Single Molecule Real Time SNP Single Nucleotide Polymorphism SNV Single Nucleotide Variant SPL Splicing STR Repeticones en tandem cortas x SV Variación Estructural SYN Sinónima TMAP Programa de alineación de mapeo de torrents UCSC University of California Santa Cruz Genome Browser UTR Región no codificada VCF Variant Calling Format VUS Variante de significado incierto WES Whole Exome Sequencing WGS Whole Genome Sequencing XL Herencia ligada al cromosoma X xvii 5.1.1. Tasa de diagnóstico en los Paneles Genéticos Individuales …………………………………………………………………...191 5.1.1.1. Errores Congénitos del Metabolismo (ECM)...... 191 5.1.1.2. Enfermedades Neurológicas ................................ 193 5.1.2. Tasa de diagnóstico: Paneles, NeuroExoma y Paneles+NeuroExoma ............................................................... 195 5.2. LIMITACIONES ............................................................... 197 5.2.1. Demostración de causalidad de una variante .............. 197 5.2.2. Expansión de trinucleótidos ....................................... 198 5.2.3. No detección de variantes en regiones codificantes ... 199 5.2.3.1. Exones ricos en GC ............................................. 199 5.2.3.2. Regiones altamente homólogas ........................... 199 5.2.4. Limitaciones bioinformáticas ..................................... 199 5.2.5. Variantes perdidas en regiones no codificantes .......... 200 5.2.6. Variantes perdidas en el mosaicismo somático .......... 201 5.2.7. Variantes epigenéticas perdidas.................................. 202 5.2.8. Influencia de otros mecanismos desconocidos ........... 202 5.3. PERSPECTIVAS FUTURAS ............................................ 204 5.3.1. Farmacogenómica ....................................................... 204 5.3.2. Translación del WGS a la clínica ............................... 205 5.3.3. Genética en el cribado neonatal .................................. 206 CONCLUSIONS ....................................................................... 210 ARTÍCULOS PUBLICADOS .................................................. 213 REFERENCIAS ........................................................................ 255 9. ANEXO ..................................................................................... 300 INTRODUCCIÓN 1.1. SECUENCIACIÓN DEL GENOMA HUMANO It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material. Watson and Crick, 1953 1.1.1. El inicio de la era genómica En mayo de 1952, Rosalind Franklin y Raymond Gosling, hallaron una de las primeras evidencias de la estructura del ácido desoxirribonucleíco (ADN) mediante difracción de rayos X, la famosa fotografía 51 (Figura 1a) 1. El 25 de abril de 1953, John Watson y Francis Crick publicaban un artículo en Nature, donde, basándose en el patrón de densidades electrónicas de la fotografía 51, proponían un modelo para la estructura química de la molécula de ADN (Figura 1b) 2. El artículo finalizaba con la frase preliminar de esta introducción, que contiene una de las ideas más importantes de la historia de la ciencia. FIGURA 1 - a) FOTO 51. Imagen de difracción de rayos X de la forma B, hidratada, de la molécula de ADN. Tomada por Raymond Gosling y Rosalind Franklin en mayo de 1952 (archivo del Kings College London). b) MODELO DE LA MOLÉCULA DE ADN propuesto por Watson y Crick en su artículo en Nature de abril de 1953. El modelo propuesto por John Watson y Francis Crick, una doble hélice formada por dos cadenas complementarias antiparalelas, en las INTRODUCCIÓN 3 que las bases nitrogenadas se apareaban adenina con timina y citosina con guanina, implicaba un posible mecanismo de replicación, al poder actuar cada cadena como molde de su complementaria 3. La demostración del mecanismo de replicación semiconservativa por Matthew Meselson y Franklin W. Stahl en 1958 4, cambió para siempre la manera de entender la herencia genética. Al mismo tiempo el conocimiento de las propiedades derivadas de la complementariedad del ADN y de su mecanismo de replicación proporcionaron la base para el desarrollo tecnológico de la mayor parte de las técnicas empleadas para el estudio y secuenciación del ADN y, por lo tanto, están en el origen de la genómica, definida de una manera amplia como el estudio de la secuencia, estructura, función y evolución del material genético de un organismo. Los primeros métodos de secuenciación del ADN, definida como la determinación del orden de las bases nucleotídicas en un fragmento de ADN, no se describieron hasta 1977 de manera independiente por los grupos de Maxam y Gilbert, en la Universidad de Harvard, y el grupo de Sanger, en la Universidad de Cambridge. En Febrero de 1977, Walter Gilbert y Allan Maxam publicaron un método de secuenciación no-enzimático basado en la degradación química específica de las bases nitrogenadas del ADN 5. El proceso era complejo y las lecturas de ADN eran cortas, de alrededor de 100pb máximo. Poco después, en diciembre del mismo año, Frederick Sanger describió la metodología de la secuenciación por síntesis del ADN 6. El método de Sanger determinaba la secuencia de bases de ADN, utilizando un método enzimático que sustituyó rápidamente al método de Maxam-Gilbert 7. El método inicial de Sanger utilizaba didesoxinucleótidos (ddNTP), nucleótidos en los que el grupo hidroxilo de la posición 3´de la desoxirribosa ha sido sustituido por un hidrógeno. Esta modificación impide la formación del enlace fosfodiéster durante la reacción de síntesis de ADN, terminando la misma cada vez que se incorpora un ddNTP. La secuencia se produce en una serie de 4 reacciones separadas (A, C, G y T), donde se añade una cantidad de ddNTP a las reacciones (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP, respectivamente), junto con los respectivos desoxinucleótidos de trifosfato convencionales (dNTP), uno de ellos marcado con 32P (Mardis, 2013). Por lo tanto, el ddNTP competirá con su respectivo SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 4 dNTP en la reacción de polimerización mediada por una ADN polimerasa en presencia de un ADN molde y un oligonucleótido que actúe como cebador. La incorporación del ddNTP producirá un conjunto de cadenas de oligonucleótidos de longitud variable, reflejando la distribución de cada dNTP en la secuencia de ADN. Después de la electroforesis y la autorradiografía posterior, es posible deducir, a partir del tamaño de los fragmentos, la secuencia de bases que forman el fragmento de ADN analizado 6. El siguiente avance se produjo gracias al descubrimiento de la ADN polimerasa termoestable, que condujo al desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 9. La incorporación de la amplificación previa a la reacción de secuenciación supuso una mejora notable de la técnica al permitir que se partiera de cantidades significativamente menores de ADN. Los avances en la bioquímica de nucleótidos también fueron importantes, con la introducción de ddNTP marcados con fluorocromos, en lugar de radioisótopos. Como resultado de todos estos avances, surgió el método de secuenciación automática de ADN basado en el método de Sanger, en el que los productos de la reacción de secuenciación son separados mediante electroforesis capilar, y los nucleótidos son identificados por la emisión de fluorescencia específica inducida por la acción de un láser 10. Estos avances contribuyeron en gran medida al aumento significativo de rendimiento de cada reacción con la automatización, permitiendo que en cada ejecución se cargaran hasta 96 muestras 8. El uso de un software específico permite la traducción del electroferograma obtenido en secuencias de ADN, además de generar el cálculo de la probabilidad de error para cada base identificada 11. 1.1.2. Evolución en la secuenciación de nueva generación – Next-Generation Sequencing (NGS) Aunque el método de Sanger, el cual se podría considerar como la “primera generación” de secuenciación de ADN, fue fundamental en el origen de la medicina molecular y muy útil para el diagnóstico de enfermedades raras o complejas, y cuyo diagnóstico genético implicaba INTRODUCCIÓN 5 la secuenciación de una cantidad pequeña de ADN, del orden de Kb, pronto se mostró claramente insuficiente, cuando el objetivo implicaba secuenciar algo más que genes individuales. El método había alcanzado su límite y no quedaban opciones que permitiesen optimizarlo y reducir el coste y el tiempo necesario para abordar la secuenciación genómica 12. Fue necesario un desarrollo integrado en varios campos como la bioquímica, ingeniería de hardware y software hasta llevar a la aparición de la segunda generación de tecnología de secuenciación – secuenciación de nueva generación, o Next-Generation Sequencing (NGS). Las nuevas plataformas de secuenciación, que surgieron a partir del 2004, utilizan una estrategia metodológica similar, donde tienen en común la amplificación de los fragmentos de ADN de interés espacialmente separados, pero presentan diferentes enfoques dependiendo de las características de la plataforma y de lo que se pretende estudiar (Mardis, 2017, 2008). Generalmente, en la tecnología NGS, se parte de la construcción de una biblioteca de fragmentos de ADN genómico con un determinado tamaño. Esta fragmentación puede ser llevada a cabo por métodos mecánicos como la sonicación o enzimáticos. Hay diferentes tipos de bibliotecas de fragmentos de ADN, dependiendo si el objetivo del estudio es secuenciación dirigida de regiones específicas: biblioteca de fragmentos de ADN con tamaño variable y adaptadores universales en los extremos (Figura 2a); biblioteca con código de barras, en la cual se añade al fragmento una secuencia de ADN determinada que sería el “código de barras” (Figura 2b); o si es para secuenciación de regiones complejas y repetitivas, y la más adecuada sería una biblioteca mate-pair, donde dos fragmentos de ADN separados por un adaptador interno están también rodeados por adaptadores universales (Figura 2c). SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 6 FIGURA 2 – Ejemplos de bibliotecas de ADN usadas en NGS a) biblioteca de fragmentos de ADN de tamaño variable (150 – 1000bp) con adaptadores universales b) biblioteca de código de barras, una secuencia especifica de indexación de la muestra c) biblioteca mate-pair donde dos fragmentos de ADN están unidos por un adaptador interno. Ad1 – adaptador universal 1; Ad2 – adaptador universal 2; Ad Int – Adaptador Interno Después de finalizadas las librerías estas son preparadas para la secuenciación mediante amplificación clonal. Este proceso genera varias copias de cada uno de los fragmentos de DNA que constituyen la librería manteniéndolos separados lo que por un lado amplifica la señal que se genera permitiendo la detección de los nucleótidos durante la secuenciación y permite que esta señal se produzca de manera inequívoca. En el caso de la secuenciación dirigida las reacciones de secuenciación se realizan a partir de los fragmentos amplificados y para que esto suceda, se agrega un adaptador a cada extremo de los fragmentos presentes en la biblioteca mediante la acción de una ADN ligasa. Estos adaptadores son secuencias de bases universales y específicas de la plataforma, lo que permite amplificar los fragmentos de la biblioteca por PCR, así como su posterior unión a la celda donde se produce la reacción de secuenciación, mediante el uso de secuencias complementarias fijadas a dichas celdas y que constituyen la flowcell INTRODUCCIÓN 7 14. De hecho, para minimizar los sesgos generados por esta técnica y mantener la uniformidad de la cobertura, la PCR se realiza con el menor número de ciclos posible 15. Otra variante sería la adición de colas poliA a un extremo de los fragmentos, aunque esto se usa principalmente en tecnologías de secuenciación de moléculas individuales 16. Como resultado de la amplificación se obtienen grupos, clusters, de fragmentos, y cada grupo se origina a partir de un solo fragmento en la biblioteca. Esto proporcionará suficiente señal de cada fragmento en la reacción de secuenciación. Debido a este proceso de amplificación combinada con la secuenciación posterior, estas plataformas utilizan una metodología de secuenciación masiva en paralelo. Esto es uno de los avances clave de estas tecnologías, ya que estas plataformas permiten secuenciar, simultáneamente, cientos de miles a millones de fragmentos de ADN, durante una única carrera, lo que se traduce en una potencia enorme de secuenciación y en la generación de un gran número de datos. Esta maximización del rendimiento por carrera se traduce en costes de secuenciación considerablemente más bajos que los asociados a la secuenciación tipo Sanger 17. Otra de las grandes ventajas de estas tecnologías es la posibilidad de realizar un enriquecimiento dirigido mediante el uso de sondas específicas, mediante el cual podemos seleccionar aquellas regiones de interés a estudiar, permitiendo la aplicación de la NGS en la secuenciación de determinados genes que podrían estar implicados en enfermedades humanas y, contribuyendo al desarrollo de técnicas de diagnóstico como el diseño de paneles génicos específicos para patologías 18. El análisis de los datos generados mediante tecnología NGS presenta una dificultad asociada al tamaño de ADN de las secuencias obtenidas. A diferencia de lo que sucede en la secuenciación tipo Sanger, en la que la limitación del tamaño del fragmento viene dada por la capacidad de resolución del capilar en el que se realiza la electroforesis, y el resultado es la suma de miles de secuencias idénticas, en NGS el tamaño se determina en función de la relación señal-ruido y, en general se obtienen millones de fragmentos diferentes de pocos cientos de bases 19. La dificultad estriba en el alineamiento de estas secuencias frente al genoma de referencia, sobre todo en regiones con un alto contenido repetitivo y ricas en los nucleótidos GC. Esto, SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 8 llevó al desarrollo de algoritmos bioinformáticos específicos para el ensamblaje de este tipo de lecturas 20,21. Surgen así dos aproximaciones diferentes para la secuenciación: secuenciación de un solo extremo (single-end sequencing) y secuenciación de extremo emparejado (paired-end sequencing). Mientras que en la secuenciación de extremo único los fragmentos se secuencian partiendo únicamente de uno de los extremos, en la secuenciación de extremo emparejado los fragmentos se secuencian partiendo de ambos extremos. Esta última proporciona datos de mayor calidad, facilita el alineamiento de las secuencias y permite la detección de variantes tipo deleción/inserción que no es posible detectar mediante la secuenciación de extremo único 17. 1.1.2.1. Secuenciadores de segunda generación A pesar de las similitudes descritas anteriormente, las plataformas de segunda generación son bastante diversas con relación a la longitud de lectura y la química empleada en la secuenciación. La pirosecuenciación (454 Life Sciences / Roche) fue inicialmente desarrollada en 1996 por el Instituto de Tecnología Stockolm Royal y fue la primera tecnología NGS disponible en 2005 22. Esta técnica se basa principalmente en la hibridación de oligonucleótidos y detección y cuantificación de la actividad de la enzima ADN polimerasa, a través de la enzima luciferasa. El paso inicial de esta tecnología era la generación de una biblioteca de fragmentos de ADN, que posteriormente se sometían a amplificación mediante PCR de emulsión en la superficie de cientos de miles de beads de agarosa. La formación de micelas acuosas permite generar micro reactores, donde cada bead se incorpora individualmente, junto con los reactivos de PCR. La amplificación de un solo fragmento de la biblioteca genómica unida a cada bead, permite formar al menos 1,000.000 de copias de ese fragmento por bead, lo que permitía obtener una señal detectable en la reacción de secuenciación 23. Después de romper las micelas, cada bead se incorpora en un pocillo de 44µm de una placa junto con los reactivos de secuenciación. Las bases se agregan secuencialmente, reacción catalizada por la ADN polimerasa, y cada vez que se agrega un INTRODUCCIÓN 15 1.2. EL PROYECTO DEL GENOMA HUMANO Los objetivos principales del Proyecto del Genoma Humano (PGH), determinar la secuencia del ADN, e identificar y mapear los genes del genoma humano, fueron descritos por primera vez en 1988 por un comité especial de la Academia Nacional de Ciencias de EEUU y fueron coordinados y planificados en etapas de 5 años por los Institutos Nacionales de Salud y el Departamento de Energía 34. Enfrentándose a un enorme desafío, el PGH empleó un enfoque de dos fases para abordar la secuencia del genoma humano. En la primera fase, fue usada la metodología shotgun 35. Esta técnica consiste en la fragmentación aleatoria del ADN genómico seguido de la clonación de los fragmentos generados en vectores antes de la secuenciación, lo que se traduce en una mejora en el tiempo de respuesta a expensas de simplificar el procesamiento computacional. En la segunda fase del proyecto, llamada fase de finalización se centró en cubrir los huecos no resueltos en la fase inicial y en resolver la secuencia de ADN en áreas ambiguas, como regiones repetitivas, que no se obtuvieron durante la fase de shotgun por limitación de la metodología 36,37. El aumento exponencial de la información de la secuencia de ADN llevó a que la misma fuese almacenada en la unidad de Secuencias Genómicas de Alto Rendimiento (High-Trhoughput Genomic Sequences – HTGS) de GenBank al final de la fase de shotgun 38. En 2001, se publicó el primer borrador del genoma humano, cubriendo aproximadamente el 90% del genoma 36. En 2003, se concluyó el PGH publicándose la secuencia completa del ADN humano al año siguiente 37. Esta secuencia final cubría aproximadamente el 99% de las regiones que contienen genes del genoma humano, con una precisión del 99,99%. Como resultado, el mapeado de la localización cromosómica de los genes ha permitido tener acceso a información detallada sobre la estructura, organización y función del conjunto completo de genes humanos, información considerada como las instrucciones básicas heredables para el desarrollo y la función de un ser humano. SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 16 FIGURA 3 – PRINCIPALES HITOS EN LA HISTORIA DEL ESTUDIO DEL GENOMA HUMANO. Podemos considerarlo un viaje que empezó en 1953 y que culminó en 2003 con la publicación del genoma humano (Figura 3). Inicialmente, la estimación del número de genes humanos oscilaba entre 40.000 y 100.000 39. El análisis de la información generada por el PGH permitió realizar una estimación más realista, situando el número de genes codificantes de proteínas entre los 19.000 y los 24.000 37,40. Sin embargo, el incremento en el conocimiento sobre el papel de los genes que expresan ARN no codificantes (ncARN), implicados en la regulación de la expresión génica, incluyendo los ARN no codificantes largos (lncRNA) y cortos, entre los que se incluyen los microARNs, los ARN de interferencia cortos (siRNAs) y los ARN asociados a piwi (piRNAs) ha incrementado este número de manera significativa, no habiéndose alcanzado aún un número oficial definitivo (Tina Hesman Saey, 2018; Alles et al., 2019). La última versión (v. 33) de GENCODE (base de datos del Instituto INTRODUCCIÓN 17 Europeo de Bioinformática), contabiliza un total de 60.662 genes, de los cuales 19.957 son codificantes de proteínas y 25.528 de ARN no codificante (“GENCODE - Human Release Statistics,” v.33). El PGH fue sin duda un punto de inflexión en el campo de la genética humana y abrió la puerta a la era genómica. Los resultados finales proporcionaron información sobre la biología básica y evolución de la variación genética humana. Además, tanto la información generada, con el aumento de nuestro conocimiento de la estructura y regulación del genoma humano, así como el impulso al desarrollo tecnológico que acompañó al proyecto, supuso una revolución en el campo de la genética clínica, al dotarnos de unas herramientas que nos han permitido avanzar en la comprensión de las bases moleculares de la enfermedad humana. 1.3. EL GENOMA HUMANO El desarrollo de las tecnologías NGS y la conclusión del PGH han revolucionado el conocimiento sobre la genómica humana. El genoma humano consta de aproximadamente 3.000 millones de pb de ADN, distribuido en 46 cromosomas nucleares (44 autosomas y 2 sexuales) y 1 cromosoma mitocondrial, considerablemente más pequeño (16 569 pb). La variación genética, que existe a lo largo de todo el genoma, denota una enorme importancia funcional y, como tal, ha sido el objetivo del análisis del genoma en varios niveles. Se estima que dos individuos elegidos al azar comparten el 99.9% de su genoma. Aproximadamente el 0.1% de la variabilidad en el genoma humano representa ≈3 millones de cambios por individuo 44. De hecho, ya en 1902 se estableció el concepto de "individualidad química" 45, sin embargo, solo con la disponibilidad de la secuencia humana completa, fue posible la caracterización de los diferentes tipos de variantes genéticas. Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), variantes de una única base y los INDEL, pequeñas inserciones / deleciones (<50bp) en la secuencia de ADN, representan la forma más abundante de variación en el genoma, habiéndose descrito entre ~3- SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 18 4 millones de SNP y ~0,4-0,5 millones de INDEL en el genoma humano en relación a la secuencia de referencia 46. Un subtipo de INDEL, que se caracterizan por presentar un número variable de repeticiones en tándem, son las repeticiones en tándem cortas (STR). Esta forma de variación consiste en una pequeña secuencia de longitud variable que se repite varias veces también de manera variable (microsatélites y minisatélites). A pesar de que la mayoría de los SNP no tienen impacto funcional a nivel molecular, algunos pueden afectar a la estructura de las proteínas, como es el caso de las variantes sin sentido (nonsense), o de terminación, las variantes de cambio de sentido (missense) y las variantes que afectan al splicing. quelas variantes sin sentido implican la introducción de un codón de terminación prematuro en la secuencia de ADN y potencialmente su impacto sería deletéreo. Se estima que cada genoma porta >100 variantes de terminación en genes codificantes, de las cuales >20 son raras en la población humana 47. Las variantes de cambio de sentido o los indels que producen cambios en la secuencia pueden generar modificaciones en los aminoácidos afectando la expresión del gen y por consiguiente la correcta transcripción de la proteína. Los cambios estructurales (SV – Structural Variation) incluyen CNV (Copy Number Variation - duplicaciones y deleciones de más de 50bp), inversiones y translocaciones. Están asociados a cambios importantes en la secuencia genética debido a su tamaño, y generalmente representan un desequilibrio en la diploidía en un locus dado, estando asociados frecuentemente a enfermedades raras graves 48. Los SV extremamente grandes que delecionan o duplican determinadas regiones cromosómicas suelen tener un pronóstico grave, estando asociados a muertes prematuras y por lo tanto no se suele observar a menudo en la población 46. Sin embargo, estudios recientes en Whole Genome Sequencing (WGS) estiman que los individuos de una población pueden ser portadores en media de 2,9 SV raros que podrían alterar las regiones codificadoras del genoma. El 54.5% de estos SVs corresponden a delecciones y el 42.2 a duplicaciones. Además, se estima que el 23.4% afectan a alrededor de 4,2 genes de media 49. INTRODUCCIÓN 19 En los estudios de la enfermedad mendeliana, así como en el diagnóstico genético de las mismas, es necesaria la priorización de variantes mediante la predicción del impacto y su patogenicidad. En estudios de asociación de variantes raras de enfermedades comunes u otros rasgos complejos, las frecuencias de las variantes alélicas y las predicciones de impacto son usadas para priorizar las causales del defecto molecular y agruparlas por gen que se analizarán para determinar la asociación de fenotipos. Este enfoque ha sido crucial para estudiar enfermedades comunes que están frecuentemente asociadas a variantes raras y de novo, como la epilepsia. 1.3.1. Principales iniciativas desarrolladas tras el conocimiento del Genoma Humano Desde el inicio de la era genómica y, sobre todo, a partir del desarrollo de la secuenciación de nueva generación, se hizo patente que el conocimiento sobre la variación genética, tanto en la población general, como aquella asociada a enfermedad era de vital importancia a la hora de ser capaces de interpretar la información derivada de la secuenciación del ADN. Por ello, se han desarrollado diversas iniciativas para caracterizar dicha variación, tanto en la población sana como en la población enferma 50–52. Una de las primeras iniciativas fue el proyecto HapMap (Haplotype Map), planteado como un proyecto internacional con el objetivo de comprender la relación entre el genoma y la salud en la población creando un mapa de haplotipos del genoma humano y describiendo los patrones comunes de la variación genética humana 53. Desarrollado entre los años 2003 y 2006, se ha caracterizado diferentes poblaciones con ascendencia africana, asiática y europea, en relación con variantes comunes, su frecuencia y sus patrones de expresión, es decir, la caracterización de los haplotipos del genoma humano. El impacto de HapMap ha sido enorme y decisivo en la investigación en varios campos, desde el estudio de enfermedades complejas, hasta la genética de poblaciones y la genética evolutiva 52. A raíz de los datos generados por el proyecto, la realización de SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 20 los estudios de asociación de genoma completo (GWAS – Genome Wide Association Studies) sufrió un gran impulso. Los GWAS buscan establecer una relación estadística entre una o más variantes de una región genómica dada, con la presencia o ausencia de una condición clínica determinada 54. A pesar del valor de estos estudios, estos no son capaces de explicar por completo la heredabilidad asociada a estas condiciones clínicas, ya que las variantes comunes (frecuencia del alelo menor - MAF> 5%) que se asocian con un rasgo particular, solo contribuyen a una pequeña fracción de la herencia (< 10%). Por lo tanto, se hizo patente la necesidad de catalogar variantes de baja frecuencia o raras, que son la causa más frecuente de enfermedad genética (MAF <5%) 55. En 2007, se puso en marcha el proyecto internacional 1000 Genomas 56. Su objetivo era encontrar variantes genéticas con una frecuencia de al menos 1% en la población estudiada (MAF > 1%), secuenciando ≈2.500 individuos de más de 20 grupos étnicos. Dentro del alcance de los 1000 genomas, en 2012 se publicó el resultado de la secuenciación de todo el genoma con baja cobertura (2 - 6x) y la secuenciación de todo el exoma (50 - 100x) de 1.092 individuos de 14 poblaciones diferentes en el continente europeo y asiático, africanos y americanos. Desarrollado entre los años 2008 y 2015 el proyecto describió más de 40 millones de variantes genéticas, de las cuales 38 millones son SNP (54% de ellas son nuevos SNP), 1.4 millones de INDEL y 14.000 CNV / SV 50. Aunque el estudio de las variantes descritas anteriormente es de gran importancia en la caracterización funcional de la secuencia de ADN, hay otro conjunto de elementos decisivos para la evaluación en términos funcionales. Esta funcionalidad está determinada por el proceso de splicing para la transcripción del ARN, trasporte hacia el compartimiento celular apropiado y traducido a proteínas; todos estos procesos son regulados a varios niveles que incluyen la metilación de las islas CpG del ADN, modificación de la cromatina, la unión de factores de transcripción al ADN y unión de factores de splicing al ARN 57. Conscientes de esta complejidad más allá de la propia secuencia de ADN, en 2003 se fundó un consorcio INTRODUCCIÓN 21 internacional llamado Enciclopedia de Elementos de ADN (ENCODE), fundado por el Instituto Nacional de Investigación del Genoma (NHGRI-NIH) 58. ENCODE tiene como objetivo descubrir elementos funcionales no codificantes en el genoma humano, utilizando información de la cromatina; cambios en histonas; posicionamiento de los nucleosomas; metilación del ADN; transcripción e información sobre sitios de unión de factores específicos, con el fin de catalogar identificar elementos reguladores en el ADN 59. 1.3.2. Bases de datos Las bases de datos poblacionales incluyen datos de miles de individuos de varias poblaciones y representan una fuente de información sobre los patrones globales de variación genética humana. Ayuda no solo a identificar los alelos asociados a una enfermedad, sino también a comprender los orígenes de las poblaciones, las migraciones, las relaciones, las mezclas y los cambios en el tamaño de la población, lo que podría ser útil para comprender algunos patrones de enfermedades 60. La base de datos Single Nucleotide Polymorphism (dbSNP) es de acceso público y almacena una colección de polimorfismos genéticos que incluyen SNPs, INDEL e inserciones de elementos retroposibles y variaciones de repetición de microsatélites. dbSNP fue desarrollado en 1999 en colaboración con el Centro Nacional de Información (NCBI) y el Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano (NHGRI), para complementar la base de datos de GenBank (que almacena secuencias de nucleótidos de más de 100.000 organismos). Los registros anotados incluyen muestras de población para identificar variantes y para medir la frecuencia alélica específica de una populación ya que estas pueden variar. Un alelo muy común en una población puede ser bastante raro en otra. Además, las variantes alélicas pueden surgir como polimorfismos individuales cuando poblaciones particulares han sido aisladas SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 22 reproductivamente de grupos vecinos, como es el caso de las poblaciones en islas 61. El Consorcio de Agregación de Exomas (ExAC), ha generado una de las bases de datos públicas más completas hasta la actualidad que reúne variantes en las regiones codificadoras de proteínas humanas de cerca de 60.706 individuos. Cada variante, su anotación funcional y su frecuencia en las poblaciones globales (africanos, estadounidenses, europeos no finlandeses, europeos finlandeses, asiáticos orientales, asiáticos del sur) están disponibles para la para su uso tanto en el campo de la genética clínica, facilitando la clasificación de variantes de interés en pacientes, como en investigación, para explorar la variación en genes específicos 62. De hecho, diferentes estudios han demostrado la utilidad de esta base de datos en el filtrado e identificación de variantes causales de enfermedades raras 63,64. Este recurso proporciona una resolución mucho mayor para filtrar variantes en cohortes clínicas y poblacionales, y limita aún más la capacidad para identificar variantes de codificación funcional relevantes para la enfermedad. Después del éxito del ExAC, el mismo equipo de investigación dirigido por Daniel MacArthur de Broad Institute, ha desarrollado una base de datos que contiene la información sobre 126.216 exomas y 15.136 secuencias de genoma completo, llamado de GnomAD (“GnomAD Resource Introduced at ASHG Meeting, Doubles ExAC Dataset,” 2016). Como complemento al proyecto de 1000Genomas descrito anteriormente, en la actualidad la iniciativa más desarrollada para la identificación y filtración de variantes en una población es el proyecto GnomAD que en su tercera fase, reúne la secuencia del genoma completo de 71702 individuos. 66. La base de datos ESP (Exome Sequencing Project) se centra en comprender la contribución de la variación genética rara a los trastornos cardíacos, pulmonares y hematológicos a través de la secuenciación de poblaciones bien fenotipadas y actualmente contiene datos de secuencia de exomas en 6503 individuos, y las frecuencias alélicas son relativas a populaciones afroamericanas y europeoamericanos. Como ESP es un proyecto de secuenciación del INTRODUCCIÓN 23 exoma, la base de datos no es útil para evaluar la frecuencia de la mayoría de las variantes identificadas. Las variantes ESP se mapean contra el genoma de referencia (GRCh37) y junto con la nomenclatura propuesta de la Sociedad de Variación del Genoma Humano (HGVS) se proporciona números de referencia correspondientes. Una diferencia importante es la inclusión en esta base de datos muestras de individuos con enfermedades raras donde por ejemplo, 418 individuos con fibrosis quística constituyen el 6% en ESP, o se estima la frecuencia de la población de esta enfermedad en individuos de ascendencia del norte de Europa que sería 125 veces más frecuente 67. Los millones de variantes identificadas requieren un filtrado adicional para limitar aquellas que son altamente penetrantes. Este es un proceso lento que requiere el uso de múltiples bases de datos adicionales y búsqueda de literatura para evaluar variantes individuales. Las bases de datos disponibles, además de las bases de datos centradas en la variación descritas anteriormente, incluyen bases de datos depuradas basadas en información más específica de la variante, como es el caso del HGMD (Human Gene Mutation Database), bases de datos específicas de locus, LSDB (Locus Specific Database List), bases de datos desarrolladas por profesionales centradas en información clínica con algunos datos de variantes como es el caso de GeneReviews, bases de datos seleccionadas que proporcionan información sobre fenotipos heredados y genes con información de variantes seleccionadas como en el OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) y bases de datos de con descripción detallada de variantes identificadas y estudiadas en varios laboratorios, ClinVar (National Center for Biotechnology Information). 1.4. ANÁLISIS DEL GENOMA HUMANO 1.4.1. Herramientas de análisis bioinformático SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 24 Como ha sido discutido anteriormente la evolución tecnológica de la secuenciación del genoma por NGS permitió una reducción en el coste de secuenciación mayor de lo que se esperaría de acuerdo con la ley de Moore (inicialmente aplicada a la evolución del hardware computacional y expandida a tecnologías como la secuenciación) (“DNA Sequencing Costs,” 2019). Esto ha permitido que cada vez sea más económico obtener grandes cantidades de datos genómicos de una persona. El alto rendimiento de las tecnologías NGS proporciona un volumen considerable de datos, que necesitan de un posterior procesado bioinformático que permitan su interpretación. De hecho, en la actualidad el verdadero reto se sitúa cada vez más en la capacidad de gestión y análisis de dichos datos, convirtiendo a la bioinformática en un área de vital importancia en la secuenciación genómica 46. La bioinformática es, por lo tanto, la disciplina que nos permite comprender los datos producidos por la secuenciación 69. El análisis de una secuencia genómica comienza con la creación de un pipeline analítico, a fin de combinar métodos de análisis para obtener resultados biológicamente relevantes. Varias herramientas bioinformáticas están disponibles para realizar cada uno de los pasos del análisis, por lo que es necesario establecer a priori el tipo de datos del genoma que se obtendrán, para una correcta elección de las herramientas que se utilizarán. Una vez que se establece un pipeline, presenta un orden predefinido de pasos de análisis y algoritmos internos. El conjunto de pasos que constituyen un pipeline comienza con asegurar la calidad de las lecturas obtenidas en la secuenciación y el ensamblaje de la secuencia obtenido a través del alineamiento de las lecturas frente a un genoma de referencia. Posteriormente se realizará el proceso de identificación y anotación de variantes, que nos permite identificar aquellas posiciones en las que nuestra secuencia varía con respecto a la de referencia, así como su consecuencia biológica. Finalmente, dichas variantes se filtrarán y priorizarán 70. INTRODUCCIÓN 31 no es identificada en un número significativo de lecturas debería ser descartada, lo que puede llevar a que se excluyan algunos positivos verdaderos. Además, estas herramientas pueden ofrecer información adicional integrando varios algoritmos permiten calcular las puntuaciones de las consecuencias para cada variante en función de varios parámetros diferentes, como el grado de homología de secuencia, conservación evolutiva, estructura de proteínas o predicción estadística basada en mutaciones conocidas. Las herramientas más usadas para este objetivo son SIFT 91, PolyPhen-2 92, CADD 93 y Condel 94. Uno de los programas más ampliamente utilizado en la anotación de variantes es ANNOVAR que puede identificar SNP, INDEL y CNV 95. Este algoritmo utiliza bases de datos de anotaciones de UCSC, Ensembl o cualquier dato de anotación que se convierta al formato Genérico de Características 3 (GFF3), el formato de texto que representa las anotaciones utilizadas por ANNOVAR 71, anota los efectos funcionales de las variantes con respecto a los genes y otros elementos genómicos y compara las variantes con las bases de datos de variaciones existentes, y subconjuntos de variantes que no se informan en bases de datos públicas, lo cual es importante especialmente cuando se trata de variantes raras que causan enfermedades mendelianas 96. El acceso a toda la información adicional puede ser un recurso para las bases de datos de variantes de enfermedades como ClinVar y HGMD, donde se recupera información sobre la asociación clínica a la variante. 1.4.1.3.2. Filtrado y Priorización de variantes Después de la anotación de un archivo VCF el número total de variantes es enorme variando su número dependiendo de si se trata de secuenciación de regiones específicas del exoma, el exoma o el genoma completos. Así, para identificar las variantes que causan la enfermedad, se requieren algunas estrategias de filtrado. SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 32 Se ha realizado un control de calidad en pasos anteriores para la correcta llamada de variante, pero todavía hay podrían existir variantes positivas falsas debido a artefactos o errores de lectura. Para un nuevo filtrado de calidad de las variantes identificadas se debe tener en cuenta otros factores como el número total de lecturas independientes y el porcentaje de lecturas que muestra cada variante. El umbral de los dados observados es definido por el genetista siendo que las variantes con menos de 10 lecturas independientes son descartadas ya que es probable que se deba a un sesgo de secuencia o una baja cobertura 72. Otro filtro frecuentemente empleado es la de la frecuencia de determinada variante en la población. La frecuencia alélica menor (MAF), una de las variables utilizadas para filtrar en función de la frecuencia alélica, y permite clasificar las variantes en tres grupos: variantes raras (MAF <0.5, generalmente asociadas a enfermedades mendelianas), variantes frecuentes bajas (MAF entre 0.5% y 5%) y variantes comunes (MAF> 5%) 53. Las bases de datos de población, tales como el proyecto de 1000 genomas 97, el Consorcio de agregación de exomas (ExAC) 62 y la Base de datos de agregación de genomas (“GnomAD Resource Introduced at ASHG Meeting, Doubles ExAC Dataset,” accedido en 2020) son las bases de datos más utilizadas para determinar la frecuencia alélica. Aunque de bstante utilidad, la aplicación de este método para análisis de las frecuencias en la población tiene sus limitaciones y podría causar una exclusión errónea. Por ejemplo, en el caso de portadores de variantes en genes de trastornos recesivos que no muestran signos de la enfermedad, y la frecuencia de los alelos dañinos en las bases de datos de variantes poblacionales puede ser mayor que el umbral establecido para dicha enfermedad recesiva. Para la priorización e interpretación de las variantes filtradas, se emplean los criterios estandarizados para la evaluación de variaciones genómicas obtenidas a través de NGS, como las guías aprobadas del Colegio Americano de Genética y Genómica Médica (ACMG) y la Sociedad Europea de Genética Humana 98,99. INTRODUCCIÓN 33 1.5. APLICACIÓN DE LA NGS EN LA CLÍNICA Con las tecnologías NGS todo el panorama de las pruebas genéticas en el entorno clínico ha cambiado. Se ha convertido la secuenciación genómica a gran escala en una herramienta de diagnóstico genético de rutina en la clínica, particularmente para enfermedades heterogéneas desde el punto de vista del diagnóstico genético, como algunos errores congénitos del metabolismo o enfermedades del neurodesarrollo 100 y su implementación en laboratorios de investigación en todo el mundo ha llevado a un aumento sustancial en la identificación de nuevos genes asociados a enfermedad 101. Actualmente se discute sobre el potencial del estudio del genoma, exoma o paneles genéticos en un contexto clínico y cual es el enfoque más apropiado mediante una sospecha de enfermedad 102. Los principales factores que contribuyen a la decisión de la implementación de una prueba basada en NGS son el conocimiento que se tiene sobre la enfermedad, el tiempo de respuesta y el coste de la prueba. La decisión y aceptación de las pruebas genéticas basadas en NGS va a depender de una demostración clara de los beneficios para el paciente. Además, de que es necesario tener claro que los resultados son precisos suficientemente para respaldar el diagnóstico de la enfermedad 103. Otro factor importante que debe tenerse en cuenta al analizar las opciones de implementación de NGS en el diagnóstico es la rentabilidad. En la asistencia sanitaria, la elección de una tecnología particular debe justificarse mostrando un beneficio adicional significativo. Aunque una tecnología dada puede tener un rendimiento mayor en comparación con las alternativas, las diferencias en los costes pueden limitar la implementación del enfoque "superior". Sin embargo, a medida que la tecnología de secuenciación mejora rápidamente y los costes se abaratan, una tecnología que actualmente se podría considerar insuficientemente rentable puede llegar a serlo en el futuro cercano. Cada vez es más abundante el conocimiento sobre la relación entre variantes genéticas y enfermedad, lo que hace que sea más fácil la clasificación de las variantes en función de su potencial SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 34 implicación en el fenotipo de un paciente. Aun así, en muchos casos, no es posible alcanzar una clasificación definitiva de las variantes que nos lleven a un diagnóstico genético definitivo. La búsqueda del diagnóstico se ha descrito como una odisea para las familias donde los padres de los niños con trastornos genéticos raros buscan respuestas que les ayuden en la aceptación de su situación, el apoyo social, el tratamiento y el pronóstico 104. Existen tres enfoques de la NGS para mejorar el diagnóstico de enfermedades humanas: enriquecimiento dirigido de un conjunto de genes (panel de genes), secuenciación del exoma completo (WES) y secuenciación del genoma completo (WGS). 1.5.1. Paneles genéticos Una de las estrategias empleadas es el diseño de paneles genéticos específicos para una determinada patología que reúne ciertos genes candidatos para estudio. La decisión del tipo de panel es basada en una sospecha diagnóstica, como, por ejemplo, en el caso de las enfermedades neurometabólicas, las cuales son patologías heterogéneas genéticamente y con una presentación clínica variada, incluyendo muchas veces fenotipos poco comunes en los estadios tempranos de la enfermedad 105. La decisión sobre el panel de genes a estudiar se basa en el fenotipo clínico y en las demás pruebas analizadas previamente, como estudios bioquímicos y de neuroimagen El tiempo de respuesta en patologías con pronóstico severo es crucial, principalmente en aquellas donde están disponibles tratamientos para manejar la enfermedad y cambiar su curso. En este método se enriquecen las regiones codificantes y las regiones de splicing de interés para un determinado grupo de enfermedades y son útiles para diagnosticar trastornos monogenéticos hereditarios bien definidos. Son varias las ventajas de este método: el coste reducido del método cuando comparado con WES o WGS, el enriquecimiento dirigido y su posterior INTRODUCCIÓN 35 secuenciación proporcionan una calidad superior y una profundidad de lectura mayor que WES o WGS 18 y el análisis de los datos al ser más restringida disminuye la complejidad de su análisis e interpretación, contribuyendo a tiempos de respuesta reducidos 106. Otra ventaja es la minimización del problema de hallazgos incidentales, aumentado la disposición de los pacientes y sus familias a participar activamente en las pruebas diagnósticas 107. Sin embargo, una de las dificultades asociadas a este método es la selección especifica de genes que deben estar incluidos en un determinado panel, de hecho, paneles diseñados por distintos laboratorios para el mismo grupo de patologías muestran diferencias cuanto al contenido de genes incluidos. Debido a esto, el ACMG ha aprobado recientemente guías estandarizadas que dirigen los aspectos técnicos para el diseño de paneles 108. Además, la rápida velocidad de descubrimiento de nuevos genes asociados a enfermedad implica que estos paneles sean rediseñados y reevaluados frecuentemente. Varios paneles genéticos han sido empleados con éxito en el diagnóstico de enfermedades raras con heterogeneidad genética, incluyendo heterogeneidad alélica 109, de locus 110, fenotipos sobrepuestos 111 y en genes asociados a vías comunes de determinadas enfermedades 112. Específicamente para los errores congénitos de metabolismo, varios estudios defienden el uso de los paneles genéticos para la identificación del defecto molecular de este tipo de enfermedades presentado tasas de diagnóstico muy alentadores y con tiempos de respuesta reducidos. En 2015, el Grupo Saudi Mendeliome ha presentado los resultados de análisis de un grupo de pacientes con sospecha de enfermedad mendeliana estudiados por panel de genes donde han obtenido una sensibilidad clínica diagnóstica en 43% de los casos 113. En otro estudio para el diagnóstico de enfermedades neurometabólicas complejas se ha descrito una tasa de diagnóstico en 53% de los casos mediante uso de paneles genéticos dirigidos según la presentación clínica del paciente 105. SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 36 El estudio por panel de genes ha ganado popularidad y son utilizados por muchos laboratorios clínicos en la investigación de una amplia gama de condiciones genéticamente heterogéneas. Su rendimiento diagnóstico se basa esencialmente en el conocimiento que se tiene sobre determinada enfermedad, sin embargo, con la disminución de los costes de las tecnologías NGS, el WES y WGS probablemente reemplazarán el uso de paneles genéticos en el entorno de diagnóstico clínico en el futuro. No obstante, quedan muchos desafíos antes de esta implementación, incluidas las dificultades para interpretar cantidades enormes de datos generados e incertidumbres sobre los hallazgos clínicamente reportables. 1.5.2. Secuenciación Completa del Exoma (WES) versus Secuenciación Completa del Genoma (WGS) La secuenciación completa del exoma (WES) / genoma (WGS) suelen ser aplicados en los casos en que no fue posible obtener un diagnóstico concluyente en pruebas convencionales y en test genéticos basados en paneles. Se podría justificar también en respuesta al diagnóstico de aquellas enfermedades en que el papel genético no es claro todavía ya que el conocimiento de las bases moleculares adyacentes es aún limitado. El WES se ha descrito de gran utilidad para inferir sobre regiones codificantes del genoma humano que corresponden a alrededor de 1% de todo el genoma (“ENCODE,” accedido en 2020), permitiendo el análisis a un mayor número de genes que no estarían incluidos en el diseño de los paneles genéticos, sin embargo, es probable que su representación sea incompleta ya que puede ocurrir que determinados exones no son incluidos en el diseño de captura, y la baja cobertura de las lecturas de nucleótidos en exones específicos puede ser influida muchas veces por el alto contenido en GC 115. El WES puede incluso alcanzar profundidades de lectura considerablemente más altas y a un coste más bajo comparado con WGS (revisión publicada resultado de la tesis, Fernandez- INTRODUCCIÓN 37 Marmiesse et al., 2018).; además, hay que tener en cuenta que alrededor del 10% de las bases leídas por WES no llegan a una profundidad de lectura de 20x, requisito mínimo para validación de las mismas 117. Estos factores pueden llevar a la no detección de variaciones genómicas que podrían estar relacionadas con la enfermedad como INDEL, SV y CNVs. El WGS se usa para determinar la secuencia completa de ADN de un paciente, incluyendo regiones codificantes y no codificantes, y regiones reguladoras e intergénicas del genoma pero se necesitan grandes cantidades de número de lecturas de secuenciación para conseguir obtener una cobertura de lectura fiable, y esto puede ser un factor limitante en el número de muestras a analizar durante la técnica. En ambos métodos se puede inferir sobre la implicación de nuevos genes en la enfermedad, revelando la posibilidad de identificar diversos tipos de variantes genéticas que podrían llevar a una identificación más precisa de las patogénicas para dirigir el diagnóstico y el tratamiento. Así lo demostraron un grupo de la Universidad de Washington del Centro Genómico Mendeliano, en que estudiaron a cuatro pacientes, con la misma presentación clínica y no relacionados entre sí, y por análisis de WES identificaron un nuevo gen candidato al síndrome de Miller, el DHODH 118. Por otra parte, el estudio por WES ha incrementado el rendimiento diagnóstico en pacientes con sospecha de enfermedad genética 119, en pacientes con fenotipos de enfermedades superpuestas 120 e incluso se propone como test de primera línea en el ámbito clínico 121. Estudios recientes describen las tasas de diagnóstico del WES alrededor de 36% en pacientes con enfermedades del neurodesarrollo, 43% en pacientes con sospecha de enfermedad neurometabólica y 25% en pacientes con distonías 122. El uso del WES/WGS permiten además la identificación de variantes de novo en análisis en trio de padres-pacientes para enfermedades heterogéneas, como en las enfermedades de neurodesarrollo 123. Estudios con WGS han reportado incluso una tasa de diagnóstico mayor que el WES 124. En un estudio reciente de una cohorte de pacientes el análisis por WGS ha detectado las mismas variantes que en WES, pero en 9 de los 35 participantes han detectado variantes SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 38 que podrían justificar el diagnóstico y que no estaban incluidas en los datos del WES. Estas incluían SNP intrónicos, pequeños CNVs, variantes en ARN no codificante, ADN mitocondrial y SNP en regiones codificantes que presentaban poca cobertura en el WES. Una de las mayores ventajas y limitaciones del WES/WGS es el acceso y almacenamiento de una gran cantidad de información genómica, incluso completa, la cual queda disponible para posteriores análisis rápidos e intensivos de un paciente. Por un lado, la disponibilidad de esta información permite la reanálisis de los datos de secuenciación de un paciente, dinámica cada vez más necesaria para acompañar la velocidad a que avanza el conocimiento genómico 125. Esto permite una evaluación sistemática de las variantes inicialmente identificadas y su categorización cuanto a la patogenicidad cambiar en resultado de estudios que van siendo publicados. Hay también varios estudios clínicos publicados apoyando la utilidad diagnóstica rápida del WGS en neonatos con patologías severas y en estado crítico, ingresados en las Unidades de Cuidados Intensivos, con una tasa de diagnóstico considerablemente alta que varía entre el 42 a 57%, y en 30 a 72% de los casos los resultados genéticos llevaron a cambios en el tratamiento médico 126– 130. Hay que tener en cuenta que, aunque es secuenciado todo el genoma de los pacientes, el análisis y priorización de las variantes se suele restringir, al fenotipo presentado por el paciente, a través del cual y mediante uso de plataformas como el Human Phenotype Ontology (HPO) o Genetic Testing Registry (GTR – NCBI) el análisis se restringe a un conjunto de genes candidatos y bien caracterizados, lo cual sería como analizar las regiones codificantes de un panel de genes diseñado virtualmente. Esto sucede porque hay que garantizar que la información extrapolada del análisis por WGS es interpretada correctamente para el diagnóstico del neonato en estado crítico, y esto solo es posible si está bien caracterizada en la literatura y bases de datos científicas. Sin embargo, la enorme cantidad de información obtenida exige una gran disponibilidad de herramientas bioinformáticas potentes y de una gran capacidad de análisis para filtrar los datos según sean INTRODUCCIÓN 39 variantes posiblemente causadoras de enfermedad. Se pueden obtener una gran cantidad de hallazgos incidentales por la detección, por ejemplo, de una variante conocida/ no conocida en un gen asociado a una enfermedad que no coincide con el fenotipo clínico del paciente y/o detección de una variante no conocida en un gen no asociado previamente a ninguna enfermedad 131. Por ejemplo, el proyecto BaySeq fue el primer ensayo clínico aleatorizado diseñado para examinar la mejor forma de utilizar el WES como herramienta en la detección de posibles patologías en neonatos 132. El estudio ha incluido a 325 familias, de las cuales 257 tenían bebés sanos en y 68 en la Unidad de Cuidados Intensivos Neonatales. Sin embargo, durante el análisis de variantes fueron detectados hallazgos incidentales como variantes posiblemente patogénicas en genes asociados con patologías en adulto como cáncer de mama y ovario o el síndrome de Lynch (BRAC1, BRAC2, MLH1, MSH2, MSH6). Estos hallazgos al entrar dentro de la lista de genes considerados con impacto clínico severo aprobada por la ACMG, fueron reportados en el informe y la familia informada, si así lo ha aceptado mediante consentimiento informado antes del estudio. Los aspectos éticos de los hallazgos incidentales están en debate en la comunidad científica y clínica donde se han desarrollado prácticas éticamente aceptables para el manejo de esta información 133. 1.6. ENFERMEDADES GENÉTICAS Las enfermedades mendelianas son raras tomadas de forma individual, pero en su conjunto tienen una tasa de 40 a 82 por cada 1.000 nacimientos, con una estimación anual de 7.9 millones de niños diagnosticados de un trastorno genético 134. Hasta el 24 de febrero de 2020 se han incluido 5740 enfermedades de base genética conocida en la base de datos OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man, https://omim.org/). Estas patologías tienden a aparecer en familias, aunque también pueden ser causadas por eventos de novo 135. Dependiendo del mecanismo patológico, el fenotipo clínico de un paciente se podrá manifestar de manera dominante o recesivo 134. SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 40 Los estudios de enfermedades monogénicas, tanto de herencia autosómica recesiva como la fenilcetonuria, o enfermedades dominantes como la paraparesia espástica 136, revelan variantes en genes específicos para la aparición y transmisión de la enfermedad. Sin embargo, muchos de los fenotipos de la enfermedad Mendeliana pueden ser genéticamente heterogéneos. Las enfermedades como la retinitis pigmentosa tienen más de 40 genes con variantes causales identificadas. Además, las variantes específicas pueden llevar a un determinado fenotipo según sean en homocigosis, en heterocigosis o en heterocigosis compuesta 137. Por lo tanto, incluso cuando existen patrones simples de herencia en enfermedades con un curso patológico bien caracterizado, los eventos mutacionales subyacentes deben identificarse para obtener un diagnóstico molecular preciso. De hecho, la tecnología NGS ha permitido el estudio de muchos cambios monogénicos ya descritos. Aunque las enfermedades mendelianas son típicamente raras y tienen patrones de herencia predecibles, las enfermedades complejas son comunes en la población general y resultan de la interacción de varios loci de susceptibilidad y factores ambientales. Sin embargo, la heterogeneidad y la penetrancia incompleta que se percibe hacen sugerir que la distinción tradicional entre enfermedades mendelianas y complejas no siempre es absoluta 138. Con esto ha surgido un interés creciente en el estudio de enfermedades complejas. Se han propuesto dos modelos distintos que dirigen el análisis de variantes en enfermedades complejas 139. El modelo, inicialmente seguido, reside en la hipótesis "Variación común - Enfermedad común", en la que los fenotipos complejos son el resultado de los efectos acumulativos de una gran cantidad de variantes comunes. Según este modelo, el conjunto de 10 a 15 millones de SNP, CNV y otras variantes, que son comunes en la población, están modulados por la presencia de factores ambientales en términos de herencia. La aplicación del GWAS permitió identificar una serie de asociaciones entre variantes comunes y fenotipos complejos que apoyan este modelo 140. Sin embargo, la pérdida de heredabilidad verificada por las variantes encontradas INTRODUCCIÓN 47 constantemente y las funciones ejecutivas son especialmente vulnerables. Por lo tanto, y a pesar de un control metabólico adecuado, la mayoría de estos pacientes muestran dificultades de aprendizaje, conductuales y emocionales 163. 2. Enfermedades de moléculas pequeñas vinculadas a una deficiencia. Este grupo incluye todos los defectos de moléculas esenciales que deben transportarse a través de las membranas celulares, como los errores innatos del transporte de aminoácidos y la síntesis de ácidos grasos. Uno de los ECM más paradigmático relacionado es la deficiencia de SLC7A5 que resulta en el transporte defectuoso de los ácidos ramificados 164 y la deficiencia de MFSD2A que resulta del transporte defectuoso de los ácidos grasos esenciales, como el ácido docosahexanoico 165. Curiosamente, la rara deficiencia de deshidrogenasa quinasa de cadena ramificada, que sobreactiva la oxidación irreversible de BCAA, causando niveles muy bajos de BCAA como en las variantes SLC7A5, presenta un síndrome neurológico igualmente devastador con alteración del desarrollo neurológico 166. Los síntomas resultan principalmente de la síntesis defectuosa de compuestos que están distales del bloqueo o del transporte defectuoso de una molécula esencial a través del epitelio intestinal, la barrera hematoencefálica y las membranas citoplasmáticas u orgánicas. Los signos clínicos son, al menos en teoría, tratables al proporcionar el compuesto faltante. La mayoría de estos defectos causan una alteración del desarrollo neurológico, tienen una presentación congénita y pueden presentarse como defectos de nacimiento. 1.6.1.1.3. ECM Mitocondriales Generalmente se trata de enfermedades con presentaciones clínicas muy graves y con mal pronóstico. Los genes asociados hasta SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 48 ahora como causantes de la enfermedad mitocondrial se pueden dividir en aquellos que tienen un papel principal específico de la biogénesis del sistema OXPHOS (Sistema de Fosforilación Oxidativa Mitocondrial), y aquellos cuyo impacto en OXPHOS es indirecto o involucra otras funciones celulares 167. Según su función, los genes implicados en enfermedad mitocondrial codifican proteínas que se pueden agrupar en 6 grupos: 1) Subunidades y factores de ensamblaje y de los complejos del sistema OXPHOS 2) mantenimiento de ADNmt 3) expresión de ADNmt 4) cofactores enzimáticos 5) homeostasis mitocondrial y control de calidad 6) metabolismo general. Las manifestaciones cerebrales de las enfermedades mitocondriales son muy frecuentes y cubren una gran variedad de características clínicas postnatales tempranas o de inicio tardío en adultos, incluyendo convulsiones, encefalopatía, ataxia, espasticidad, distonía, trastornos del movimiento, parkinsonismo, episodios similares a accidentes cerebrovasculares, retraso del desarrollo y / o regresión. y deterioro cognitivo 168. Los defectos del metabolismo oxidativo pueden mostrar manifestaciones prenatales como la disgenesia cerebral, atrofia del cuerpo calloso, heterotopía cerebral y cerebelosa, microcefalia, (sistema de piruvato deshidrogenasa, transportador de piruvato, piruvato carboxilasa, fumarasa y otros defectos del ciclo de Krebs) 169. 1.6.1.1.4. Moléculas Complejas y Leucodistrofias INTRODUCCIÓN 49 En este grupo se incluye las enfermedades de moléculas complejas que abarcan esfingolípidos, fosfolípidos, colesterol y ácidos biliares, glucosaminoglucanos, oligosacáridos, glucolípidos y ácidos nucleicos. Se dividen en dos subgrupos. 1. Enfermedades de moléculas complejas asociadas a una acumulación. Los defectos del catabolismo pueden llevar al almacenamiento de un compuesto acumulado visible como los defectos lisosomales clásicos. Son el grupo más típico (como las esfingolipidosis o mucopolisacaridosis) en el que los signos y síntomas resultan principalmente de la acumulación anormal de compuestos y son potencialmente revertidos si se normaliza el acúmulo. Se pueden acompañar frecuentemente de manifestaciones neurológicas con trastornos progresivos de neurodegeneración con o sin signos obvios de "almacenamiento"170,171. 2. Enfermedades de moléculas complejas asociadas a una deficiencia. Un ejemplo es defectos que afectan a las Pins 3 quinasas (PIK3), una familia de enzimas de señalización que regulan varios procesos que incluyen el crecimiento celular, la proliferación, la migración, el metabolismo, y desarrollo del cerebro. Varios trastornos en este sistema enzimático conducen a los síndromes de megalencefalia-polimicrogiria-polidactilia-hidrocefalia 172. En general, no hay un marcador metabólico y el diagnóstico se basa principalmente en técnicas de genética molecular como la secuenciación dirigida de segunda generación o secuenciación del exoma completo). La mayoría de los trastornos de síntesis de colesterol pueden presentarse con varias anomalías congénitas y morfogénicas múltiples que incluyen anomalías cerebrales, de órganos internos, esqueléticas o de la piel, y un déficit en el desarrollo psicomotor. La acumulación de sustrato y la consiguiente toxicidad, con o sin deficiencia de colesterol, también explican la diversidad de fenotipos observados. Alternativamente, las anomalías pueden ser atribuibles, SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 50 al menos en parte, a una señalización deficiente como se ha sugerido en el síndrome de CK y en el síndrome de Smith Lemli Opitz 173. Varios defectos de síntesis de ácidos biliares se presentan como trastornos neurodegenerativos de inicio tardío después de un período sin síntomas seguido de un episodio transitorio de ictericia colestásica neonatal 174. Los trastornos peroxisomales son déficits que pueden afectar una enzima matriz específica o una peroxina implicada en la biogénesis de la membrana de peroxisomas. Muchos de los trastornos de la biogénesis del peroxisoma interfieren con el desarrollo neurológico en la vida fetal con un amplio espectro de fenotipos que van desde la severidad del síndrome de Zellweger, con defectos en la migración cortical hasta la una discapacidad intelectual moderada 175. Los trastornos congénitos de la glicosilación deben considerarse en cualquier condición clínica sin explicación, particularmente en la enfermedad multiorgánica con afectación neurológica, pero también en situaciones de una discapacidad del desarrollo inespecífica 176. Más recientemente se han descubierto muchos defectos que afectan a los sistemas involucrados en el tráfico intracelular, la vesiculación, el procesamiento y el control de calidad de moléculas complejas, como el plegamiento de proteínas y la autofagia, utilizando la secuenciación de segunda generación 177. 1.6.1.2. Enfermedades Neurológicas Los trastornos neurológicos son discapacidades asociadas principalmente con el funcionamiento del sistema nervioso central. Trastornos del neurodesarrollo en niños pueden incluir epilepsia, defectos en la morfogénesis cerebral, discapacidad intelectual, defectos neuromusculares, trastornos del movimiento y ciliopatias. Los niños con trastornos del neurodesarrollo pueden experimentar dificultades con el lenguaje y el habla, habilidades motoras, comportamiento, memoria, aprendizaje u otras funciones INTRODUCCIÓN 51 neurológicas. Si bien los síntomas y comportamientos de las discapacidades del desarrollo neurológico a menudo cambian o evolucionan a medida que el niño crece, algunas discapacidades son permanentes. El diagnóstico y el tratamiento de estos trastornos pueden ser difíciles y el tratamiento a menudo implica una combinación de terapia profesional, productos farmacéuticos y programas de apoyo en el hogar y en la escuela. 1.6.1.2.1. Epilepsia La epilepsia es un trastorno neurológico común con una prevalencia de 5 a 8 por 1000 individuos 178. Las causas subyacentes a la epilepsia son heterogéneas y pueden ser debidas a una infección, accidente cerebrovascular, trauma, neoplasias y autoinmunidad. Sin embargo, desde hace mucho tiempo que se ha reconocido una base genética para la epilepsia 179. Las estimaciones de heredabilidad basadas en estudios gemelos respaldan aún más una contribución de la variación genética, aunque las estimaciones de heredabilidad varían considerablemente de 8% a 69% 180,181. El aumento del riesgo familiar se ha explicado tradicionalmente por la herencia multifactorial y la presencia de factores que segregan dentro de una familia determinada 182. Sin embargo, dentro de estas familias "multifactoriales", existen aquellas familias que segregan la epilepsia como una enfermedad autosómica dominante con penetrancia alta 183(p303),184. Se han identificado varios genes asociados a la epilepsia, entre los más comunes son SCN1A (epilepsia genética con convulsiones febriles más [GEFS +]) 185, CHRNA4 (epilepsia del lóbulo frontal nocturno) 186, KCNQ2 y KCNQ3 (convulsiones neonatales) 187,188 y SCN2A (convulsiones infantiles familiares benignas) 189. Las encefalopatías epilépticas infantiles de inicio temprano (EIEE) son un grupo heterogéneo caracterizado por un inicio temprano de la enfermedad, y típicamente refractarios a las convulsiones de tratamiento con una mayor tasa de mortalidad 190. Existe un grado significativo de comorbilidad asociada a las EIEE SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 52 que incluye retraso global del desarrollo, trastornos del movimiento, autismo y problemas de conducta 191. La causa de la encefalopatía en EIEE es a menudo genética, la mayoría son causadas por variantes dominantes de novo, aunque las formas recesivas autosómicas y ligadas al cromosoma X también pueden ser identificadas (por ejemplo, ARX y CDKL5) 192,193. 1.6.1.2.2. Morfogénesis cerebral Las malformaciones en la morfogénesis cerebral representan una causa importante de discapacidades del desarrollo. Los genes que se han asociado a estas patologías suelen estar involucrados principalmente en la proliferación y especificación celular, la migración neuronal y la organización cortical tardía 194,195. La heterotopia severa implica trastornos de migración neuronal difusos que causan un deterioro neurológico global grave. Las anomalías en los genes LIS1 196, DCX 197, ARX 198, RELN 199, ACTB, ACTG1 200, y CDK5 201 se han asociado con estas malformaciones. Estudios más recientes también han establecido una relación entre la lisencefalia, con o sin microcefalia asociada, disgenesia del cuerpo calloso y la hipoplasia cerebelosa, y en ocasiones, un patrón morfológico consistente con polimicrogiria con variantes patogénicas en varios genes (TUBA1A, TUBA8, TUBB, TUBB2B, TUBB3 y DYNC1H1), que regulan la síntesis y la función de componentes de los microtúbulos y centrosomas y, por lo tanto, se definen como tubulinopatías 202,203. Los defectos que afectan solamente a un conjunto de neuronas, como la heterotopia leve de la banda subcortical y la heterotopia periventricular, se han asociado con defectos en los genes DCX, FLN1A y ARFGEF2 y causa un deterioro neurológico y cognitivo que varía de déficits leves a graves. La polimicrogiria es el resultado de una organización cortical tardía anormal y está asociada de manera inconstante con una migración neuronal anormal 202. INTRODUCCIÓN 53 1.6.1.2.3. Discapacidad Intelectual La discapacidad intelectual (ID) es uno de los trastornos neurológicos más comunes y presenta una prevalencia variable según la edad: prevalencia de 3.3 / 1000 si el rango de edad es de 20 a 50 años, pero de 14.3 / 1000 si el rango de edad es de los 6 a los 15 años 204–206. La Organización Mundial de la Salud define actualmente la discapacidad intelectual como "una capacidad significativamente reducida para comprender información nueva o compleja, para aprender y aplicar nuevas habilidades (inteligencia deteriorada)” 207. Otra definición, proporcionada por la Asociación Americana de Discapacidad Intelectual y del Desarrollo, la define como “una discapacidad caracterizada por limitaciones significativas tanto en el funcionamiento intelectual como en el comportamiento adaptativo, que incluye muchas habilidades sociales y prácticas cotidianas 208. Aunque la etiología de estas patologías puede ser muy heterogénea, las huellas genéticas subyacentes han sido desveladas en los últimos años. Los pacientes con ID, sindrómicos o no sindrómicos, suelen presentar defectos en genes asociados al cromosoma X, como el CLCN4, CNKSR2, FRMPD4, KLHL15, LAS1L, RLIM y USP27X) 209. Estos genes fueron identificados de manera sencilla debido a que su patrón de herencia permite la transmisión directa a través mujeres/madres portadoras no afectadas, y pueden explicar el fenotipo clínico de pacientes masculinos con ID 210. Por otra parte, se estima que variantes de novo son responsables de cerca de 50% de los casos severos de ID y que en poblaciones donde la consanguinidad es frecuente, la mayoría de los casos con ID son de herencia recesiva 211. Aun así, se estima que alrededor del 30-70% de los casos de discapacidad intelectual no tienen una etiología conocida 212. El rápido avance de las tecnologías NGS, prometen aumentar la comprensión de la etiología de estas patologías mediante la identificación de genes y mecanismos que contribuyen a su desarrollo. SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 54 1.6.1.2.4. Trastornos Neuromusculares Los trastornos neuromusculares afectan al sistema nervioso periférico y a los músculos y pueden ser un grupo heterogéneo de afecciones genéticas, con herencia autosómica dominante, recesiva o ligada al cromosoma X. También pueden resultar de variantes patogénicas en el ADN mitocondrial o de novo. La alta incidencia de las variantes de novo ha sido descrita con el aumento de información sobre la genética de los trastornos neuromusculares. Se caracterizan por una degeneración muscular progresiva y debilidad debido a defectos en genes que la función del músculo esquelético. El inicio puede ocurrir en la infancia y tener una progresión severa o puede aparecer más tarde con una progresión más lenta 213. Como ejemplo de este tipo de patologías tenemos la enfermedad de Duchenne, una distrofia muscular asociada a defectos en el gen DMD, asociado al cromosoma X 214. Las distrofias musculares de la cintura escapular (LGMD), son un grupo de trastornos que afectan principalmente a las cintura pélvicas y escapulares. Estas patologias pueden presentar una herencia autosómica recesiva y, con menos frecuencia, autosómica dominante. Actualmente hay 19 genes recesivos (LGMD2A-2T) y ocho genes dominates (LGMD1A-1H) identificados. Los pacientes afectados pueden tener una progresión leve de la enfermedad leve o tener un fenotipo grave, clínicamente muy similar a la distrofia muscular de Duchenne 215. La paraparesia espástica hereditaria se define como un grupo de trastornos hereditarios raros que causan debilidad y rigidez en los músculos de los miembros. Los síntomas suelen empeorar gradualmente con el tiempo. Se han identificado genes de herencia dominante, responsables por el 75%-80% de las personas afectadas (SPAST, ATL1, REEP1). La paraparesia espática autosómica recesiva se estima que esté presente en 25%-30% de los pacientes INTRODUCCIÓN 55 con variantes patogénicas identificadas en varios genes como CYP7B1, SPG7, SPG11 216. Las enfermedades de neuronas motoras son un grupo de trastornos neurodegenerativos donde están afectadas las neuronas motoras superiores y/o inferiores, como la esclerosis lateral amiotrófica, la atrofia muscular espinal, la parálisis bulbar progresiva y la esclerosis lateral primaria 215. 1.6.1.2.5. Trastornos del Movimiento Los trastornos genéticos del sistema nervioso central pueden causar trastornos del movimiento o ataxia, como parte del fenotipo clínico. Los trastornos del movimiento en niños están asociados a defectos en el desarrollo neurológico y con retraso global del desarrollo, disfunción cognitiva, trastornos del comportamiento y / o epilepsia. Se pueden clasificar en 2 categorías 217. 1. Los movimientos hipercinéticos, definidos como movimientos no voluntarios y excesivos, incluyen distonía, corea, atetosis, mioclonia, temblor, y estereotipias 218. 2. Los movimientos hipocinéticos, descritos como una disminución en el número de movimientos, que se denominan como síndrome hipocinético rígido o parkinsonismo 219. La distonía es una característica de muchos trastornos hereditarios neurodegenerativos y metabólicos y puede estar asociada a otros signos tales como afectación cognitiva, signos piramidales o anomalías oculares. Variantes en el gen DYT1, que codifica la proteína torsina A, son responsables de la forma más común de distonía primaria, heredada como un rasgo autosómico dominante 220 Las discinesias paroxísticas causan un trastorno de movimiento mixto con elementos de distonía, corea y balismo. La discinesia paroxística cinesigénica, asociada a defectos en el gen PRRT2, se SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 56 caracteriza por ataques de corta duración, que generalmente duran solo unos segundos, pero ocurren hasta 100 veces por día. Los ataques generalmente son precipitados por movimientos repentinos o la anticipación del movimiento 221. Frecuentemente las ataxias de inicio temprano tienden a ser autosómicas recesivas, pero las de inicio tardío suelen ser autosómicas dominantes y la herencia ligada al cromosoma X es muy rara. Las ataxias dominantes son un grupo clínico y genéticamente complejo de trastornos neurodegenerativos que se caracterizan por una ataxia cerebelosa progresiva y se asocia de manera variable con otras características neurológicas extracerebelosas como la oftalmoplejía, la atrofia óptica, la neuropatía periférica y los signos piramidales y extrapiramidales 222. 1.6.1.2.6. Cíliopatias Las ciliopatias son un grupo de trastornos hereditarios causados por defectos en el funcionamiento de los cilios. Los cilios son orgánulos celulares que sobresalen de la membrana plasmática apical y tienen un papel importante en la transducción de señales, facilitando las comunicaciones entre las células y su entorno. La alteración ciliar puede dar lugar a una amplia variedad de trastornos clínicos y genéticamente heterogéneos con fenotipos superpuestos, como por ejemplo, el síndrome de Joubert y el síndrome de MeckelGruber que son trastornos del desarrollo neurológico raros que se superponen genética y fenotípicamente 223. Las características comunes son enfermedad quística renal, ceguera, defectos del tubo neural, discapacidad intelectual, anomalías esqueléticas que van desde polidactilia a costillas y extremidades anormalmente cortas, defectos ectodérmicos, obesidad, situs inversus, infertilidad y anomalías respiratorias 223. MATERIAL AND METHODS 3.1. STUDY DESIGN Prospective study over a 4-year period of patients from Spain and Portugal with suspected hereditary neurological and / or metabolic genetic disease. 3.2. PATIENTS Over a period of 4 years (September 2015 – November 2019), 825 paediatric patients were included in the study. All the 825 cases were from clinical centers from Spain and Portugal and they all had a diagnosis suspicion of metabolic or neurologic genetic disorders. In all cases, prior to the genetic analysis, informed consent was obtained from the patient's legal guardians to carry out the genetic study. The relevant clinical information from the medical record was collected for the interpretation of the genetic results. For its execution, this project was submitted for approval by the Autonomous Committee of Ethics of Clinical Research of Galicia (code 2015/410). This study respects the fundamental principles established in the Declaration of Helsinki of the World Medical Association, in the Convention of the Council of Europe related to human rights and biomedicine and fulfills the requirements established in Spanish legislation in the field of biomedical research, the protection of personal data and bioethics. 3.3. GENE PANELS DESIGN The gene panels were designed using the OMIM databases (https://omim.org/) as the main source of information, as well as periodic reviews of the scientific literature. In this way, the relevant genes previously associated with 10 groups of diseases were selected, and clustered together generating 10 disease-panels (Table SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 64 3). The review and update of the gene panels were carried out periodically throughout this work. The 10 individual panels were then grouped into a clinical directed exome, called NeuroExome. Gene Panel Number of genes Hypoglycemia and Hyperglycemia 72 Intermediate metabolism defects 156 Mitochondrial diseases 268 Complex Molecule Metabolism and Leukodystrophy 176 Epilepsy 259 Cerebral Morphogenesis defects 195 Intellectual disability 180 Neuromuscular disorders 323 Movement disorders defects 313 Ciliopathies 81 NeuroExome 1929 TABLE 3 – TOTAL NUMBER OF GENES INCLUDED IN EACH OF THE DESIGNED GENE PANELS. 3.3.1. Genetic panels technical features All the gene panels had an average coverage achieved between 200-300X. The mean percentage of bases with coverage <10X per sample analyzed is 0.28% (28 out of 10,000 bp are found with coverage <10X or insufficient). These coverage defects are caused by intrinsic problems to the enrichment method used. However, this calculation is made for readings of quality greater than 20 (Q20 - Qscore, estimates the probability of an error in the identification of a nucleotide base based on a quality model, Phred quality score). For a Q20, the probability of base error factor is 1 in 100, which implies greater reliability of bases with insufficient coverage. MATERIAL AND METHODS 65 3.4. NGS SEQUENCING The genetic study is carried out with the creation of a working pipeline that combines sequencing and bioinformatic analysis methods for the identification and annotation of variants with relevant biological significance (Figure 4). In this section it is described the process of sequencing different regions of the human genome for DNA samples, using Illumina's sequencing technology (www.illumina.com). The regions to be sequenced were defined and designed in-house and provided by Agilent. SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 66 FIGURE 4 - AN OVERVIEW OF THE NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS) BIOINFORMATICS WORKFLOW. MATERIAL AND METHODS 67 Illumina's sequencing technology is based on the clonal amplification of individual DNA molecules. In this Synthesis Sequencing process, fluorescently labeled nucleotides with reversible termination are used. The reliability of nucleotide incorporation is very high, since in each sequencing cycle there is a competition between the 4 bases. For each library (sequencing line), several million sequenced fragments (reads) are obtained, which can guarantee a high coverage in each region and strengthening the quality of the consensus sequences generated. Each sequencing run allows the analysis of one flow cell (physical support of the samples in the sequencing process). For sequence capture it was used the Agilent Technologies SureSelect Solution Hybridization System (compatible with Illumina sequencing protocols). The probes of the sequence regions of interest were designed for each gene panel. These probes included exons and intron-exon boundaries of a pre-selected group of genes, including all the transcripts for each on of them. The Sure Design web-based probe design tool was the one used for this purpose (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/). To guarantee an optimal representation of all regions of interest, different subgroups of probes were designed according to the percentage content of GC and the presence of repetitive sequences. The sequencing protocol was performed following the approved protocols and using the equipment and reagents officially recommended by Illumina. 3.4.1. Samples reception and DNA extraction Patient’s blood sample were received in an anticoagulated tube with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), at Unit of Diagnosis and Treatment of Congenital Metabolic Diseases, Hospital Clínico de Santiago de Compostela along with a requisition form specifying the gene panel requested and a brief summary of patient’s clinical history, including family background. Genomic DNA was then extracted using the commercial Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega), following the manufacturer's instructions. The concentration of the DNA obtained was quantified using the NanoDrop 1000 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 68 Spectrophotometer (Nanodrop Technologies) and the Qubit® fluorimeter. Furthermore, DNA integrity was checked by 0.8% agarose gel electrophoresis. In all cases, at least 3μg of complete DNA was obtained, free of impurities (Abs260 / 280> 1.8 and Abs260 / 230> 1.5). 3.4.2. DNA Libraries with Sequence Capture Once the genomic DNA samples from the patients have been checked, the libraries to be sequenced were prepared. The SureSelect (Agilent) kits used were: SureSelectXT Reagent kit, HSQ and SureSelect Capture Library Custom 0.5-2.9 Mb (16 reactions). The kit TrueSeq DNA Sample Preparation (Illumina) was used for the NeuroExome panel analysis. It is called library to the pool of samples that were sequenced together. An excel document was prepared which specifies the samples that were included in each of the libraries, as well as the capture library used for each sample. For the preparation of the libraries, the protocol indicated by Agilent, SureSelectXT Target Enrichment System for Illumina Paired-End Sequencing Library (Version 1.5, November 2012), was followed, using the additional recommended material. The genomic DNA was fragmented by sonication, using an isothermal mechanical process by Covaris (Covaris, Inc) for fragments enrichment of 150-200 bp range. For quality control samples were checked using the Agilent 2100 Bioanalyzer system, an established automated electrophoresis solution for the sample quality control of biomolecules. Samples showing insufficient fragmentation were sonicated again under the same conditions but for shorter times (between 10 and 25 minutes depending on the electropherogram obtained by the Bioanalyzer). The quality control of the fragmented sample was performed by Agencourt AMPure XP beads, a process based on magnetic sphere technology, it is an automated PCR purification system that offers quality DNA assessment. MATERIAL AND METHODS 69 The quality control of the samples was performed again by the Agilent 2100 Bioanalyzer, and next the ends of the generated fragments were repaired by a T4 DNA polymerase, Klenow, T4 PNK. Purification of the repaired DNA was checked again by Agencourt AMPure XP beads. The purification step was repeated between several protocol steps to guarantee DNA quality throughout the sequencing process. After the DNA fragment’s ends being repaired and the purification process completed, it was added dATP to the 3’ ends of the DNA fragments. It was then performed the ligation of the specific adapters to the fragments of the Illumina sequencing platform and afterwards, hybridization of the libraries with a capture solution (to capture oligonucleotides) was performed, according to the Agilent SureSelect protocol. From each sample was used 750 ng in 3,4ul, but since the samples were more diluted in this step it was needed to measure the proper volume for the amount of 750ng, evaporation of the sample was performed on a Speedvac to subsequently bring the samples to 34ul. The hybridization time was around 20-23 hours and the recovery of the captured regions was performed by using the Dynal MyOne Streptavidin T1 magnetic beads. A PCR of 14 cycles was applied to the captured library with Herculase II Fusion DNA Polymerase. The indexes that will identify each sample within the pool were included in this amplification step. 3.4.3. Sample dilution, pool, and preparation of libraries for sequencing The samples were diluted to 10 nM and pools were prepared including 5μl of each sample. These sample pools are the libraries and each one was sequenced in a MiSeq flow cell. The libraries were denatured with NaOH and then diluted for subsequent incorporation into the flow cell. SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 70 3.4.4. Sequencing in MiSeq platform (Illumina) In the MiSeq platform, the sequencing process is performed and completed. It was first generated millions of clusters of DNA sequences (representative of the DNA fragments that make up each library) on the surface of the flow cell. Then the DNA clusters worked as sequencing amplicons and in each cycle, there was the incorporation of one nucleotide and the incorporated base is then registered. The reagents corresponding to the Illumina MiSeq® Reagent Kit v2 (300 cycles) were used. A sequencing run of 75 cycles of “paired end” was performed, with 6 cycles for the sequencing of each index. 3.5. BIOINFORMATIC ANALYSIS The massive sequencing results obtained from the samples processed with the MiSeq are analyzed. The main goal of this analysis is to read the 75 base fragments of the readings generated by the sequencer and align them against the reference human genome sequence, version 'hg19'. Subsequently, the data will be processed to detect possible genetic variants in the defined capture regions. To achieve this, computational analysis followed these steps. a) Image analysis and transformation of fluorescence intensities in sequences (“Base calling”); Elimination of Illumina sequencing adapters, demultiplexing of samples, generation of .FASTQ files using Illumina algorithms. This step is carried out by the Real Time Analysis (RTA) software, incorporated in the MiSeq platform. b) Quality control of the data obtained with the FastQC program. c) Alignment of the sequenced fragments against the reference sequence with the BWA software. MATERIAL AND METHODS 71 d) Detection of gene variants and annotation, using Samtools and Annovar, as well as Progenika's own annotation programs. 3.5.1. Primary analysis 3.5.1.1. Image analysis and Base Calling The Real Time Analysis (RTA) v.1.8.70 (Illumina) program performs the first steps of sequencing analysis, which is commonly called primary analysis. In each sequencing cycle, the sequencer produces a photo for each of the tiles or areas that make up the flow cell, and in each of these areas, photos were taken with the 4 specific fluorophore filters for each nucleotide. From these files, RTA locates the generated clusters and extracts their intensities, their coordinates, and an estimation of the background noise for each cluster. The result of the image analysis is the input data for the allocation of the bases. RTA allows to transform the intensity signals into DNA sequence. Depending on the efficiency of the reagent flows and sequencing reactions, a small number of molecules can be incorporated to fast (advanced) or delayed in their incorporation cycle, which is known as prephasing and phasing steps. This effect can be corrected during the base allocation step. As the statistical estimation for the correction step is based on the standardization of numerous clusters to evaluate the correlation of the signal in different cycles, this is more reliable for tiles with a large number of clusters and a mixture of different sequences. Samples with only a "small" number of different sequences do not produce such reliable estimates. When sequencing a 0.5-1.5 Mb region (depending on the capture library used), the number of different sequences may be less than a whole genome sequencing experiment, so this correction is important. The result is a text file in “FASTQ” format which contains the sequence of each of the sequenced fragments and information about their quality. SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 72 3.5.1.2. Quality control To confirm the quality of the generated data, the FastQC v0.10.1 program (http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc) was used. This program allows to check about the composition and quality of sequencing. The quality of the sequencing data is measured using the Phred Score measure, routinely employed in the Sanger sequencing methodology, and indicates the reliability of the assigned base in the sequencing process. Quality data is generally encoded in ASCII format and is found in the original Illumina files in .FASTQ format. 3.5.2. Secondary analysis 3.5.2.1. Genome assembly The alignment was performed with the BWA 0.7.5a program 83 with the default parameters. In order to detect possible contamination problems and alignment with similar sequence regions in other sections of the genome (segmental duplications, etc.), the generated fragments are aligned against the entire human genome (version hg19). In this way we can select those fragments that align in a single genomic position and in the area of interest. The areas of interest comprise the captured regions specified by previously. From the alignment data and the capture genomic coordinates (data included in the target.bed file of the experimental design), the NGSrich program (http://ngsrich.sourceforge.net) was used to evaluate the capture efficiency. Since no filtering was performed based on the coverage obtained, there is a risk of false positives and / or false negatives in regions covered with less than 20X. For each sample, a file was generated, called “GRXXX_lowCoveragePositions.txt” (where XXX corresponds to the specific number of each sample), which MATERIAL AND METHODS 79 d) When a variant (P or LP) is identified in a recessive gene whose associated phenotype matches with that of the patient, but a second variant was not detected. 3.6. CARRIER STUDY – SANGER SEQUENCING If one or more variants identified by NGS could be involved in the clinical phenotype of the case under study, a family study of this variant was recommended to determine its segregation. This family study consisted of analyzing by classical sequencing the presence or absence of the variants in the patient's immediate relatives. In general, the family study was focused on parents and siblings. 3.6.1. Primer design for amplification Primers needed to amplify the DNA fragment containing the variant to be studied were designed using the Primer3 Input program (version 0.4.0). Once designed and validated under the appropriate conditions, these were ordered and synthesized by Sigma-Aldrich. 3.6.2. Polymerase Chain Reaction - PCR Genomic DNA from the patients and their relatives were amplified through PCR for classical sequencing. Both samples were sequenced at the same time by ABI PRISM capillary sequencer. DNA sequences were read through CHROMAS v2.6.5 software, an editor for chromatograms (traces) from automated Sanger sequencers 230. 3.7. FUNCTIONAL STUDIES During the doctoral period, an international stay of three months was carried out at the Radboud Center for Mitochondrial Medicine belonging to the Department of Pediatrics Radboud University Medical Center, (Netherlands). Functional studies, described below, have been SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 80 performed to confirm the pathogenicity of genetic variants identified in three cases (43, 163, 362) with suspected mitochondrial disease. 3.7.1. Cell culture Fibroblasts from all patients and control samples were grown in M199 culture medium (Gibco) supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) and 1% penicillin / streptomycin, with a final concentration of 100U 100ugr/ml (Gibco) in T25 culture plates. (25cm2), T80 (80cm2) and T175 (175cm2). Cell cultures were maintained at 37ºC in an atmosphere with 5% CO2. 3.7.2. Mitochondrial isolation A total of 5,5 x 106 fibroblasts from both patients and controls were resuspended in 1250 µl of 10 mM Tris-HCl, pH=7,6 and lysed in a Potter-Elvejhem homogenizer at 1800 rpm. Afterwards, 250µl 1,5 M Sucrose was added in oder to balance the osmolarity. Cell lysates were centrifuged for 10 minutes at 600 x g. The supernatant was recovered and centrifuged for 10 minutes at 14000 x g obtaining the mitochondrial pellet. 3.7.3. Measurement of mitocondrial respiration and OXPHOS complexes activity Mitochondrial respiration and glycolytic flux were determined in fibroblasts from both patients and controls. The oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) were recorded in a SeaHorse FX-96 analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) following the protocol of the Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress test kit. On the day prior to measurement of mitochondrial respiration, patients and control fibroblasts were collected from the cell cultures and MATERIAL AND METHODS 81 a cell suspension was prepared in 20% FCS medium. Then, the cells were transferred into a 96 wells plate (XF Cell Culture Microplate) at a final concentration of 10,000 cells/well and incubated overnight, at 37 ° C in a 5% CO2 atmosphere. On the day of the assay, the were washed and incubated in assay medium (Seahorse XP, cat. No. 102353-100). Afterwards, the basal fluxes were recorded followed by the addition of: 1 µM of Oligomycin which inhibits ATP synthase (complex V), 2.0 µM + 4.0 µM carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone FCCP which uncouples oxygen consumption from ATP production, and 0.5 µM rotenone + 0.5 µM antimycin A to inhibit complexes I and III, respectively. Both OCR and ECAR baseline rates were measured repeatedly before adding the previously described compounds. The OCR are reported in pmol / min and the ECAR in mpH / min. All data were normalized to citrate synthase (CS) activity. The enzymatic activities of complexes I-IV, and citrate synthase were analyzed spectrophotometrically in the fibroblasts of the patients and controls. The results of the activities of the respiratory chain complexes were normalized using the activity of citrate synthase which represents an assessment of mitochondrial amount and integrity for each sample 231. All analyzes were performed in duplicate using the Konelab 20XT spectrophotometer (Thermo Fischer Scientific). 3.7.4. SDS-PAGE and BN-PAGE immunoblot analysis Mitochondrial fractions from the control and patient cell lines were used for the detection of FOXRED1 and EARS2 proteins, either using SDS-PAGE or for analysis of native mitochondrial complexes (in the case of FOXRED1), by BN-PAGE followed by immunoblotting. For SDS-PAGE, mitochondria were heat-denatured at 70 ° C in the presence of β-Mercaptoethanol and separated on a polycrylamide gel with 10% sodium dodecyl sulfate. For BN-PAGE, the native mitochondrial complexes were solubilized with 2% n-dodecyl β-Dmaltoside and separated in a gradient polyacrylamide gel. Subsequently, the proteins were transferred to a PVDF membrane (0.20 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 82 Immobilon-P, Millipore IPVH00010) and immunodetection was performed with the following antibodies to FOXRED1: polyclonal rabbit (Proteintech: 24595-1-AP); CI-NDUFa9 (ab14713, Abcam); CII-SDHA (Ab14715; Abcam); and for EARS2 polyclonal rabbit (Proteintech: 17539-1-AP). The secondary antibodies used were goat anti-mouse (P0047; DAKO) and goat anti-rabbit (A00160, Genscript). The chemiluminescence signal was visualized using the Enhanced Chemiluminescence Kit (ECL, Thermo Fischer Scientific) and the Chemidoc XRS + System (Biorad, Hercules, CA). 3.7.5. Viral transfection and transduction: pLenti6.2 V5 For the three patients with suspected FOXRED1 or EARS2associated mitochondrial disease, viral transduction was performed with a lentivirus in order to rescue the expression of the gene that contains the molecular defect, and, consequently, to recover the function of the affected protein. The specific vectors for FOXRED1 and EARS2 were designed and requested from Harvard plasmid. The plasmids have been designed in an "open" version in order to clone the cDNA in pLenti-V5, which creates an expression vector with the corresponding cDNA and the respective V5 marker. Initially, a molecular biology method known as the Gateway cloning system was used (figure 5), which allows the transfer of DNA fragments between plasmids by recognition of specific sequences called "att", a reaction in which the enzyme "LR clonase" participates and which is so-called "LR reaction". The LR reaction is a recombination reaction between the Entry Clone and the Target Vector, mediated by a prepared solution of recombinant proteins and the enzyme LR clonase. In this reaction, the DNA fragments of the Entry Clone are transferred into the Target Vector to create an Expression Clone. The regions marked L, R, B and P correspond respectively to the specific sequences explained above: attL, attR, attB and attP. They are recombination regions for the MATERIAL AND METHODS 83 bacteriophage lambda present in Escherichia coli that are specifically recognized by the recombinant proteins. In the cloning reaction, the recombinant proteins cut the Entry Clone gene from the left to the right and link it into the Target Vector, creating an Expression Clone. The gene located in the Expression Clone is surrounded by the attB1 and attB2 regions, and its orientation remains the same throughout the subcloning process once attL1 reacts only with attR1, and attL2 reacts only with attR2. Once the aliquot from the recombination reaction is ready, it is introduced into the E.coli. The E.coli was kept in culture plates where the colonies selection was carried out by using the antibiotic ampicillin. The Target Vector that has not correctly processed the recombination reaction does not generate ampicillin resistant colonies, although it contains a lethal gene and antibiotic resistant, called ccdB. Although the selection process for ampicillin resistant E.coli cells corresponds to> 99% of the colonies. SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 84 FIGURE 5 - GATEWAY CLONING REACTIONS: The LR Reaction is represented in this figure. An Entry Clone, containing the gene of interest, FOXRED1 or EARS2, surrounded by the recombination regions, will recombine with the Destination Vector to produce an Expression Clone and a derived plasmid. As result of this reaction, the gene sequence of the Entry Clone is transferred to the Expression Vector donated by the Target Vector. The generated plasmid contains the ccdB gene, resistant to ampicillin. MATERIAL AND METHODS 85 3.7.5.1. Lentivirus transduction in primary fibroblasts for functional complementation In this process, the fibroblasts of the study patients were transfected with pLentiFOXRED1 and pLentiEARS2. The production of the lentivirus replication was initiated by cotransfecting a previously prepared DNA packaging solution and the expression plasmid Lenti into HEK293 cells. This packaging mixture consists of three packaging plasmids: PLP1, PLP2 and PLP / VSG. These provide the structural and replication proteins necessary for the production of the lentivirus. The viruses generated grew in the culture medium, 2% FCS / DMEM, and were collected 5 days after transfection. Once the virus was internalized into the cells, the viral RNA was reverse transcribed, actively imported into the nucleus, and then stably integrated into the host genome. The expression plasmid contains the DNA sequence of interest, which would be the gene that we intend to study, and also contains a specific gene that provides resistance to the blasticidin antibiotic, so that a subsequent selection is performed and a transduced cell line is created. Once the transduced cells were selected, they were stored at -80C for future research. To confirm the presence of the virus in patients and control cell lines, the Lenti-X GoStix test was performed, where, if positive, it is expected to get more than 5 x 105 IUF / ml of lentivirus. To guarantee a stable cell line from patient and control, and to make sure they are in good conditions, the number of passages is limited, and the fibroblasts were prepared in T25 cm2 culture plates so that the confluence of the cell lines on the day of transduction was 7080%. On day 1 of transduction, 1ml of virus was added to each culture plates with the corresponding cell line. Some cell lines were incubated with the pLenti and GFP, which is a green fluorescent protein, a specific marker for the lentivirus detection in patient’s and control fibroblasts. SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 86 Culture medium was changed on the following days and on day 3, 2ug/ml of blasticin was added to the culture plates to start the selection process of the cells with pLenti. Further progress in breeding the cell lines was achieved at the end of 6-8 weeks. During this period, cultures were refreshed every two days with fresh blasticin and medium culture and were transferred to a T80 cm2 culture plates for functional tests. 88 RESULTADOS Se estudiaron durante un período de 4 años a 825 pacientes <18 años, por sospecha de enfermedad metabólica y/o neurológica, provenientes de Hospitales de los Sistemas de Salud de España y Portugal. En total 346 (42%) mujeres y 479 (58%) varones, con edad media de 6,71 años (desviación estándar [DE] =5,73) y 7,18 (DE=5,55), respectivamente, analizados por distintos paneles genéticos (Tabla 4). Panel Mujer Varón Edad DE Varón DE Hipo e Hiperglucemia 6,04 7,51 8,60 5,29 Metabolismo Intermediario 2,00 1,32 2,40 3,02 Enfermedades Mitocondriales 6,68 5,57 6,19 5,40 Defectos Moléculas Complejas y Leucodistrofias 5,38 4,99 7,22 5,49 Epilepsia 6,94 5,52 6,98 5,78 Defectos Morfogénesis Cerebral 5,39 4,56 4,54 3,81 Discapacidad Intelectual 11,45 7,00 11,03 4,86 Neuromuscular 10,54 6,31 7,13 6,14 Trastornos del Movimiento 7,67 5,31 10,49 5,45 Ciliopatías 8,83 4,56 9,98 4,78 NeuroExoma 3,59 6,27 4,77 3,94 Global 6,71 5,73 7,18 5,55 TABLA 4 - EDAD MEDIA EN AÑOS Y DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE LOS PACIENTES INCLUIDOS EN EL ESTUDIO GENÉTICO DISTRIBUIDOS POR PANELES. RESULTADOS 95 En el paciente 662 fue identificada una variante hemicigota en el gen HPRT1 asociado al síndrome de Lesch-Nyhan. Tabla 9_Panel Defectos del Metabolismo Intermediario - Pacientes con Diagnóstico positivo Paciente Sexo Gen H Variante Proteína 22 V AMT AR c.[2T>C]; [8781G>A] p.[Met1Thr]; [Val905Gly] 59 V GLDC AR c.[2714T>G]; [2714T>G] p.[Val905Gly]; [Val905Gly] 68 M MOCS2 AR c.[244A>T]; [244A>T] p.[Ile82Phe]; [Ile82Phe] 254 M TCN2 AR g.(?_31018929)_ (31019095_?)del - 633 M PAH AR c.[842C>T](;) [490A>G] p.[Pro281Leu]; [Ile164Val] 634 V PAH AR c.[782G>A]; [136G>A] p.[Arg261Gln]; [Gly46Ser] 657 V MCCC2 AR c.[1015G>A]; [1423G>A] p.[Val339Met]; [Gly475Arg] 662 V HPRT1 XLR c.[424A>G]; [1601C>T] p.[Thr142Ala]; [Pro534Leu] 692 V ETFDH AR c.[c.1601C>T]; [c.1601C>T] p.[Pro534Leu]; [Pro534Leu] 711 V MOCOS AR c.[2356del]; [512C>T] p.[(Ala786Leufs*28)]; [Pro171Leu] 760 V PAH AR c.[782G>A]; [1066-11G>A] p.[Arg261Gln]; [-] 852 V PAH AR c.[1162G>A]; [728G>A] p.[Val388Met]; [Arg243Gln] 1083 V PAH AR c.[1169A>G]; [116_118delTCT ] p.[Glu390Gly]; [Phe39del] 1096 V PAH AR c.[261C>A]; [1315+1G>A] p.[Ser87Arg]; [-] En 3 casos no fue posible obtener un diagnóstico molecular concluyente. En el caso 96, por no disponer de muestras de los progenitores, no fue posible concluir los estudios familiares para determinar la segregación de la variante identificada en IDH2. En 2 casos, fueron identificadas variantes heterocigotas en genes están asociados a patologías de herencia recesiva, pero con clínica SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 96 compatible: en el paciente 286 en el gen UMPS, y en el paciente 920 en el gen PRODH. Tabla 10_Panel Defectos del Metabolismo Intermediario - Pacientes con Diagnóstico NO concluyente o Por falta de estudio familiar Paciente Sexo Gen H Variante Proteína 96 M IDH2 AD c.419G>A p.Arg140Gln o Variante heterocigota en gen recesivo con clínica compatible Paciente Sexo Gen H Variante Proteína 286 V UMPS AR c.1213C>T p.Arg405* 920 V PRODH AR c.1397C>T p.Thr466Met 4.1.3. Enfermedades Mitocondriales Se estudiaron 142 casos a través del panel de enfermedades mitocondriales. Estos pacientes presentaban sintomatología compatible con: defectos en los complejos OXPHOS (I, II, III y IV), deficiencias combinadas de OXPHOS, deficiencias primarias de CoQ, piruvato deshidrogenasa, depleción de ADN mitocondrial y genes que están asociados con otros defectos metabólicos pero cuya presentación clínica se podría confundir con una enfermedad mitocondrial. Se obtuvo una tasa diagnóstica del 14,79%, detectando en 21 pacientes la causa molecular de su patología (tabla 11). En 17 casos (11,97%) el diagnóstico no fue concluyente (tabla 12) y en 104 de los 142 (73,24%) no se identificó la causa genética. En 4 pacientes fueron identificadas variantes heterocigotas compuestas patogénicas en genes asociados a la deficiencia aislada de algún complejo del sistema OXPHOS mitocondrial: en los pacientes 43, 235 y 389 la patología estaba asociada a la deficiencia del Complejo I (ACAD9 y FOXRED1) y en el paciente 825 fue identificada una RESULTADOS 97 variante homocigota en el gen PET100 asociado a la deficiencia del Complejo IV. En 10 pacientes fueron identificadas variantes heterocigotas compuestas y homocigotas en genes asociados a la deficiencia combinada afectando a varios complejos del sistema OXPHOS: paciente 403, en el gen C12ORF65, pacientes 163, 172, 362 y 889 en el gen EARS2, paciente 215 en el gen FARS2, pacientes 12 y 252 en el gen GFM1, paciente 250 en el gen MTO1 y el paciente 65 en el gen TSFM. En 3 pacientes se identificaron variantes patogénicas en genes asociados al síndrome de depleción de DNA mitocondrial: paciente 205 con variantes heterocigotas compuestas en el gen FBXL4; paciente 179 con una variante heterocigota de novo en el gen OPA1; y el paciente 1060 con una variante homocigota en el gen SUCLA2. En 4 pacientes se identificaron variantes patogénicas en genes asociados con distintos defectos mitocondriales. Variantes heterocigotas de novo en los pacientes 142,en el gene DNM1L, asociado a la encefalopatía letal debido a defectos en la fisión peroxisomal mitocondrial; 192, en el gen PDHA1, asociado a la deficiencia del piruvato deshidrogenasa, respectivamente; en el paciente 292 fue identificada una variante homocigota en el gen COX15, asociado al síndrome de Leigh debido a la deficiencia de citocromo c oxidasa; y en el paciente 919, variantes heterocigotas compuestas fueron identificadas en el gen COQ4, asociado a la deficiencia primaria de la coenzima Q10. En los pacientes 43, 163 y 362, se realizaron estudios funcionales para determinar la patogenicidad de las variantes identificadas cuyos resultados se describen en el apartado X. Tabla 11_Panel Enfermedades Mitocondriales - Pacientes con Diagnóstico positivo Paciente Sexo Gen H Variante Proteína 12 M GFM1 AR c.[2011C>T]; [1401delA] p.[Arg671Cys]; [Ser467fs] SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 98 43 V FOXRED1 AR c.[920G>A]; [733+1G>A] p.[Gly307Glu]; [Cys240Ser] 65 V TSFM AR c.[719G>C]; [719G>C] p. [Cys240Ser]; [Cys240Ser] 142 M DNM1L AD, AR c.1337G>T p.Cys446Phe 163 V AGK EARS2 AR AR c.[518+1G>]; [518+1G>A] c.[1045G>A]; [494A>G] - p.[Glu349Lys]; [Asn165Ser] 172 V EARS2 AR c.[319C>T]; [322C>T] p.[Arg107Cys]; [Arg108Trp] 179 M OPA1 AD c.1710T>G p.Phe570Leu 192 V PDHA1 XLR c.787C>G p.Arg263Gly 205 M FBXL4 AR c.[858+5G>]; [1510T>C] p.[-]; [Cys504Arg] 215 V FARS2 AR c.1256G>A g.(?_5404749)_ (5404959_?)del p.Arg419His - 235 V ACAD9 AR c.[358delT]; [809-2A>G] p.[Phe120Fs*7]; [-] 250 V MTO1 AR c.[1450C>T]; [170G>T] p.[Arg57Leu]; [Arg484Trp] 252 V GFM1 AR c.[640A>T]; [1199G>C] p.[Ile214Phe]; [Arg400Pro] 292 V COX15 AR c.[649C>T]; [649C>T] p.Arg217Trp 362 M EARS2 AR c.[670G>A]; [376C>T] p.[Gly224Ser]; [Gln126*] 389 V ACAD9 AR c.[737T>C]; [860G>A] p.[Ile246Thr]; [Gly287Glu] 403 V C12orf65 AR c.207_220del p.(Pro70Asnfs*28) 825 M PET100 AR c.[1A>G]; [1A>G] p.[Met1Val]; [Met1Val] 889 M EARS2 AR c.[184A>T]; [920T>C] p.[Ile62Phe]; [Leu307Ser] 919 V COQ4 AR c.[202G>C]; [718C>T] p.[Asp68His]; [Arg240Cys] 1060 V SUCLA2 AR c.[850C>T]; [850C>T] p.[Arg284Cys]; [Arg284Cys] En 17 casos no fue posible obtener un diagnóstico molecular concluyente. En los casos 242, 536, 599 y 1095, por no disponer de muestras de los progenitores, no fue posible concluir los estudios RESULTADOS 99 familiares para determinar la segregación las variantes identificadas. En los casos 566, 592, 661 y 787, fueron identificadas variantes heterocigotas heredadas de uno de los progenitores asintomáticos . En 8 casos fueron identificadas variantes heterocigotas en genes asociados a patologías de herencia recesiva con clínica compatible. Tabla 12_Panel Enfermedades Mitocondriales - Pacientes con Diagnóstico NO concluyente o Por falta de estudio familiar Paciente Sexo Gen H Variante Proteína 242 M DNM1L AD, AR c.1921G>A p.Val641Met 536 V SLC6A8 XLR c.928G>A p.Gly310Arg 599 M PNPT1 AR c.[1177-2A>C(;) 1519G>T] p.[-(;) Ala507Ser] 1095 M SPG7 AD, AR c.1529C>T p.Ala510Val o Variante heredada de uno de los progenitores Paciente Sexo Gen H Variante Proteína 566 M NDUFB11 XL c.152C>A p.Pro51Gln 592 V POLG2 AD c.799G>A p.Ala267Thr 661 M LETM1 AD c.709C>T p.Pro237Ser 787 V RRM2B AD c.139A>G p.Ile47Val o Variante heterocigota en gen recesivo con clínica compatible Paciente Sexo Gen H Variante Proteína 11 M UPB1 AR c.[422C>G; 423A>T] p.[Ser141Ter; Ser141Ser] 88 V BCS1L AR c.166C>T p.Arg56* 129 V ADCK4 AR c.103G>A p.Gly35Arg 130 M ADCK4 AR c.418G>A p.Glu140Lys 372 M NDUFAF2 AR c.490delG p.Gly164fs 544 V PNPT1 AR c.493C>T p.Pro165Ser SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 100 903 V FLAD1 AR c.[1033C>T; 1589G>A] p.[Arg345Cys; Arg530His] 943 V DARS2 AR c.396+2T>G - o Otras variantes con patogenicidad indeterminada Paciente Sexo Gen H Variante Proteína 847 M POLRMT - c.[3596T>C]; [3596T>C] p.[Leu1199Ser];[ Leu1199Ser] 4.1.4. Defectos en el Metabolismo de Moléculas Complejas y Leucodistrofias Se estudiaron 62 casos a través del panel de defectos en el metabolismo de moléculas complejas y Leucodistrofias. Estos pacientes presentaban sintomatología compatible con: trastornos de depósito lisosomal, biogénesis del peroxisoma, metabolismo del colesterol, síntesis de ácidos biliares y desórdenes que cursan con leucodistrofia. Se obtuvo una tasa diagnóstica del 35,48%, detectando en 22 pacientes la causa molecular de su patología (tabla 13). En 3 casos (4,84%) el diagnóstico no fue concluyente (tabla 14) y en 37 de los 63 (59,68%) no se identificó la causa genética. En el 43% de los casos con diagnóstico positivo, fueron identificadas variantes patogénicas en genes asociados a trastornos lisosomales. De los 10 pacientes, en 8 fueron identificadas variantes heterocigotas compuestas: paciente 60, en el gen HEXA asociado a la enfermedad de Tay-Sachs; pacientes 234 y 848, en el gen GBA asociado a la enfermedad de Gaucher; paciente 1165, en el gen GAA asociado al trastorno del almacenamiento de glucógeno tipo II; pacientes 228 y 922, en el gen NAGLU asociado a la mucopolisacaridosis tipo IIIB y los pacientes 667 y 715, en el gen SGSH asociado a la mucopolisacaridosis tipo IIIA. En los otros 2 pacientes fueron identificadas variantes homocigotas: paciente 513 en el gen CTSA asociado a la galactosialidosis, y paciente 116 en el gen GNPTAB asociado a la mucolipidosis. RESULTADOS 101 En el 26% de los casos con diagnóstico positivo fueron identificadas variantes patogénicas en genes asociados a trastornos que cursan con leucodistrofia. Se identificaron variantes heterocigotas compuestas en 4 pacientes: paciente 14, en el gen TREX1 asociado al síndrome de Aicardi-Goutières; pacientes 98 y 231, en los genes POLR3B y POLR3A, respectivamente, asociados a la leucodistrofia hipomielinizante, y paciente 56, en el gen TPP1, asociado a la lipofuscinosis neuronal ceroidea., sin embargo, variantes homocigotas para el mismo trastorno fueron identificadas en los pacientes 114 y 483, en los genes PPT1 y CLN6, respectivamente. En 2 pacientes fueron identificadas variantes en genes asociados a trastornos del ácido siálico: una variante de novo en el paciente 670 en el gen GNE, asociado a la sialuria; y variantes heterocigotas compuestas en el paciente 137 en el gen SLC17A5. En 2 pacientes fueron identificadas variantes en genes asociados a trastornos peroxisomales: variantes heterocigotas compuestas en el paciente 117, en el gen HSD17B4 asociado al síndrome de Perrault (HSD17B4) y variante homocigota en el paciente 368, en el gen PEX12 asociado a trastornos de la biogénesis del peroxisoma. En el paciente 221 fue detectada una delección de 2 bp en homocigosis en el gen PLA2G6 asociada la distrofia neuronal axonal; y en el paciente 746, fue identificada una variante en hemicigosis en el gen SLC16A2 asociado al síndrome de Allan-Herndon-Dudley. Tabla 13_Panel Defectos en el Metabolismo de Moléculas Complejas y Leucodistrofias - Pacientes con Diagnóstico positivo Paciente Sexo Gen H Variante Proteína 14 M TREX1 AR c.[533G>A]; [ 380T>G] p.[Pro73Leu]; [Gln135Pro] 56 V TPP1 AR c.[1325G>A]; [1273T>C] p.[Arg208*];[-] 60 M HEXA AR c.[1528G>A]; [531+5G>A] p.[Arg178His]; [Leu127Arg] 98 V POLR3B AR c.[1045_104 7del]; [1226A>G] p.[Met415Thr]; [Glu914Lys] SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 102 114 M PPT1 AR c.[930T>A]; [930T>A] p.[Val181Leu]; [Val181Leu] 116 V GNPTAB AR c.[888_889d el]; [888_889del] p.[Cys442Tyr]; [Cys442Tyr] 117 M HSD17B4 AR c.[1252G>T]; [355+1G>A] p.[Cys425Arg]; [Asp510Asn] 137 M SLC17A5 AR c.[1080delC; [797G>A] p.[Tyr306Ter]; [Asn413Lys] 221 V PLA2G6 AR c.[1127T>C]; [1127T>C] p.[Gly487del]; [Gly487del] 228 V NAGLU AR c.[197C>G];[ 1193G>A] p.[-];[Leu349del] 231 V POLR3A AR c.[155C>T]; [1562C>T] p.[Ser793fs*3]; [Arg694His] 234 M GBA AR c.[1693C>T]; [343C>T] p.[Asn409Ser]; [Ser310Arg] 368 M PEX12 AR c.[-3213T>G]; [3213T>G] p.[296_297del]; [296_297del] 483 M CLN6 AR c.[829_836d elinsCCT]; [829_836deli nsCCT] p.[Val277Profs*5];[Val27 7Profs*5] 513 V CTSA AR c.[533G>A]; [533G>A] p.[Asp418Tyr]; [Asp418Tyr] 667 M SGSH AR c.[380T>G]; [1325G>A] p.[-]; [Val361Serfs*52] 670 M GNE AD, AR c.[1273T>C]; [1273T>C] p.[Arg266Gln]; [Arg266Gln] 715 V SGSH AR c.[1528G>A]; [531+5G>A] p.[Met376Thr]; [Ser66Trp] 746 V SLC16A2 XLR c.1045_1047 del p.(Gln16Argfs*68) 848 V GBA AR c.[1226A>G]; [930T>A] p.[Arg398Gln]; [Ser52Leu] 922 M NAGLU AR c.[888_889d el]; [1252G>T] p.[Pro521Leu]; [Arg565Trp] 1165 V GAA AR c.[355+1G>A ]; [-3213T>G] p.[Gln115*];[-] En 3 casos no fue posible obtener un diagnóstico molecular concluyente. En los casos 31, 34 y 851, fueron identificadas variantes RESULTADOS 103 heterocigotas en genes asociados a patologías de herencia recesiva con clínica compatible (Tabla 11). Tabla 14_Panel Defectos en el Metabolismo de Moléculas Complejas y Leucodistrofias - Pacientes con Diagnóstico NO concluyente o Variante heterocigota en gen recesivo con clínica compatible Paciente Sexo Ge H Variante Proteína 31 M PPT1 AR c.2T>C p.Met1Thr 34 M CLN6 AR c.314C>T p.Pro105Leu 851 M RNASEH2B AR c.655T>C p.Tyr219His 4.2. ENFERMEDADES NEUROLÓGICAS En total se estudiaron 517 pacientes con sospecha de enfermedad neurológica. En la tabla 15 se muestran el número (N) y porcentaje de casos diagnosticados según el panel analizado. Panel Diagnosticados No Concluyentes Negativos N % N % N % Epilepsia 52 23,01% 68 30,09% 106 46,90% Defectos Morfogénesis Cerebral 18 25,35% 11 15,49% 42 59,15% Discapacidad Intelectual 2 4,76% 10 23,81% 30 71,43% Neuromuscular 31 36,90% 27 32,14% 26 30,95% Desordenes del Movimiento 7 10,29% 14 20,59% 47 69,12% Ciliopatías 10 38,46% 3 11,54% 13 50,00% TABLA 15 - NÚMERO (N) Y PORCENTAJE DE CASOS ESTUDIADOS CON DIAGNÓSTICO POSITIVO, NO CONCLUYENTE O NEGATIVO POR CADA PANEL GENÉTICO. SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 104 4.2.1. Epilepsia Se estudiaron 226 casos a través del panel de epilepsias. Estos pacientes presentaban sintomatología compatible con: encefalopatía epiléptica, espectro de crisis febril plus, epilepsia neonatal, epilepsia mioclónica, síndrome de Dravet, síndrome de Rett, síndrome de West o genes que están asociados con otros defectos metabólicos pero cuya presentación clínica, principalmente convulsiones, se podría confundir con una enfermedad epiléptica. Se obtuvo una tasa diagnóstica del 23,01%, detectando en 52 pacientes la causa molecular de su patología (tabla 16). En 68 casos (30,09%) el diagnóstico no fue concluyente (tabla 17) y en 106 de los 226 (46,90%) no se identificó la causa genética. En 74% de los pacientes con diagnóstico positivo fueron identificadas variantes patogénicas en genes asociados a encefalopatía epiléptica como: ARHGEF9 (1/52), ARX (1/52), CDKL5 (6/52), DNM1 (1/52), GNAO1 (1/52), HCN1 (1/52), HNRNPU (1/52), KCNA2 (1/52), KCNQ2 (7/52), RHOBTB2 (1/52), SCN1A (14/52), SCN2A (2/52), SCN8A (1/52), SLC12A5 (1/52), STXBP1 (1/52) y TBC1D24 (1/52). En el 72% de los pacientes con diagnóstico positivo fueron identificadas variantes heterocigotas de novo. En 7 pacientes en el gen KCNQ2, 9 pacientes en el gen SCN1A, 6 pacientes en el gen CDKL5 y en 3 pacientes en el gen FOXG1, asociado al síndrome de Rett congénito. En los demás pacientes fueron identificados 1 o 2 casos con variantes de novo en un único gen como SCN8A, ARHGEF9, GRIN2A, HNRNPU, ARX, STXBP1, HCN1, RHOBTB2, KCNA2, DHDDS y GNAO1. Fueron también identificadas dos CNVs de novo en 2 pacientes: en el paciente 71 fue identificada una macrodelección que incluye genes asociados al funcionamiento de los canales de sodio, SCN1A, SCN2A y SCN9A. Y en el paciente 1058 fue identificada una delección que incluye los exones 2 al 8, en el gen IL1RAPL1, asociado a la discapacidad intelectual con convulsiones. En 4 pacientes fueron identificadas variantes en genes asociados a trastornos epilépticos de herencia recesiva. En 3 pacientes fueron RESULTADOS 111 holoprosencefalia, esquisencefalia, lisencefalia tipo I y II, heterotopías neuronales, agenesia de cuerpo calloso, hipoplasia pontocerebelar, disgenesias cerebrales, displasia cortical. Se obtuvo una tasa diagnóstica del 23,94%, detectando en 18 pacientes la causa molecular de su patología (tabla 18). En 11 casos (16,90%) el diagnóstico no fue concluyente (tabla 19) y en 42 de los 71 (59,15%) no se identificó la causa genética. En 4 pacientes fueron identificadas variantes heterocigotas compuestas: en genes asociados a la lisencefalia, como los pacientes 112 en el gen RELN y paciente 118, en el gen KNL1; y genes asociados a la hipoplasia pontocerebelosa como los pacientes paciente 223 en el gen TSEN54 y paciente 503, en el gen TSEN2. En 2 pacientes fueron identificadas variantes homocigotas: paciente 467, en el gen TUBGCP6 asociado a la microcefalia; y el paciente 927, en el gen ADGRG1 asociado a la polimicrogiria frontoparietal bilateral. En 12 pacientes fueron identificadas variantes heterocigotas en genes asociados a patologías de herencia dominante, de estos, en 9 de ellos las variantes identificadas eran de novo: pacientes 48 y 121, en el gen PAFAH1B1 asociado a la lisenecefalia; pacientes 86 y 422, en el gen PIK3R2 asociado al Síndrome de megalencefaliapolimicrogiriapolidactiliahidrocefalia; paciente 430, en el gen SHH asociado a la holoprosencefalia; paciente 517, en el gen KIF11 asociado a la microcefalia; paciente 581, en el gen TUBB2A asociado a la displasia cortical compleja; y pacientes 581 y 995, en el gen EFTUD2 asociado a la disostosis mandibulofacial. Además, variantes patogénicas heterocigotas fueron identificadas en genes en el cromosoma X: en el gen DCX asociado a la lisencefalia: paciente 69, mujer con variante heredada de la madre sintomática; y el paciente 480, varón con variante patogénica hemicigota en el mismo gen; el paciente 331, fue identificada una variante posiblemente patogénica en el gen SRPX2, asociado a la epilepsia rolándica con discapacidad intelectual. SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 112 Tabla 18_Panel Defectos de la Morfogénesis Cerebral - Pacientes con Diagnóstico positivo Paciente Sexo Ge H Variante ACMG 48 V PAFAH1B1 AD g.(?_2583433)_( 2585146_?)del - 69 M DCX XLD c.191C>T p.Pro64Leu 86 M PIK3R2 AD c.1117G>A p.Gly373Arg 112 V RELN AR c.[10112G>T]; [8809G>A] p.[Trp3371Leu]; [Ala2937Thr] 118 M KNL1 AR c.[1599A>G]; [6427G>T] p.[Gln533Gln]; [Asp2143Tyr] 121 V PAFAH1B1 AD g.(?_2541532)_( 2541639_?)del - 223 M TSEN54 AR c.[371G>T]; [919G>T; 277T>C] p.[Gly124Val]; [Ala307Ser; Ser93Pro] 331 V SRPX2 XL c.559C>T p.Pro187Ser 422 M PIK3R2 AD c.1117G>A p.Gly373Arg 430 V SHH AD c.143delT p.Ile48Thrfs*9 467 V TUBGCP6 AR c.[4315+2_4315 +3delTG]; [4315+2_4315+3 delTG] - 480 V DCX XLD c.266T>C p.Phe89Ser 503 V TSEN2 AR c.[1037A>G]; [353_354del] p.[Tyr346Cys]; [Gln118Argfs*4] 517 V KIF11 AD c.2971_2972insT p.(Ser992Lysfs*24) 581 V TUBB2A AD c.743C>T p.Ala248Val 723 M EFTUD2 AD c.259C>T p.Gln87* 927 V ADGRG1 AR c.[1504C>T]; [1504C>T] p.[Arg502*]; [Arg502*] 995 M EFTUD2 AD c.2562-2_25621delAG - En 11 casos no fue posible obtener un diagnóstico molecular concluyente. En 5 casos, por no disponer de muestras de los progenitores, no fue posible concluir los estudios familiares para determinar la segregación las variantes identificadas. En 3 casos fueron identificadas variantes heterocigotas heredadas de uno de los RESULTADOS 113 progenitores asintomáticos, los casos 119 y 439, las variantes fueron heredadas de la madre y en el caso 678, heredada del padre. En 3 casos fueron identificadas variantes heterocigotas en genes asociados a patologías de herencia recesiva con clínica compatible. Tabla 19_Panel Defectos de la Morfogénesis Cerebral - Pacientes con Diagnóstico NO concluyente o Por falta de estudio familiar Paciente Sexo Gen H Variante Proteína 216 M ZIC2 AD c.1392_1403del p.464_468del 323 M CASC5 AR c.75+6A>G(;)5142 G>C p.-(;)[Pro1714Pro 607 M TUBB2B AD c.728C>T p.Pro243Leu 710 M DCX XLD, XLR c.829C>T p.Arg277Cys 982 M FLNA XLD, XLR c.5959G>C p.Glu1987Gln o Variante heredada de uno de los progenitores Paciente Sexo Gen H Variante Proteína 119 M CASK XL g.(?_41524505)_(4 1519839_?)dup - 439 V PIK3CA - c.2530T>C p.Cys844Arg 678 M CCND2 AD c.553A>T p.Ile185Phe o Variante heterocigota en gen recesivo con clínica compatible Paciente Sexo Gen H Variante Proteína 111 V ARFGEF2 AR c.625G>A p.Glu209Lys 122 M MED17 AR c.602A>G p.Asp201Gly 718 V SNAP29 AR g.(?_21213348)_(2 1242174_?)del - SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 114 4.2.3. Discapacidad Intelectual Se estudiaron 42 casos a través del panel de Discapacidad Intelectual. Por sospecha clínica los pacientes se agrupaban en aquellos que presentaban sintomatología compatible con discapacidad intelectual asociada con otras presentaciones clínicas como retraso psicomotor, defectos de la morfogénesis cerebral o autismo. Se obtuvo una tasa diagnóstica del 4,76%, detectando en 2 pacientes la causa molecular de su patología (tabla 20). En 10 casos (23,81%) el diagnóstico no fue concluyente (tabla 21) y en 30 de los 42 (71,43%) no se identificó la causa genética. En 2 pacientes fueron identificadas variantes heterocigotas patogénicas. En el paciente 1102, fue identificada una variante de novo en el gen ADNP asociado al síndrome de Helsmoortel-van der Aa; y en el paciente 1128, fue identificada una variante en hemicigosis en el gen L1CAM, asociado a la agenesia parcial de cuerpo calloso Tabla 20_Panel Discapacidad Intelectual - Pacientes con Diagnóstico positivo Paciente Sexo Gen H Variante Variante 1102 V ADNP AD c.56_57delTG p.(Val19Glufs*5) 1128 V L1CAM XLD, XLR c.2750-2A>G - En 10 casos no fue posible obtener un diagnóstico molecular concluyente. En 7 casos, por no disponer de muestras de los progenitores, no fue posible concluir los estudios familiares para determinar la segregación las variantes identificadas. En 3 casos fueron identificadas variantes heterocigotas heredadas de uno de los progenitores asintomáticos, los casos 1100 y 1152, las variantes fueron heredadas del padre y en el caso 789, heredada de la madre. RESULTADOS 115 Tabla 21_Panel Discapacidad Intelectual - Pacientes con Diagnóstico NO concluyente o Por falta de estudio familiar Paciente Sexo Gen H Variante Proteína 615 V AUTS2 AD c.1603_1626del p.(His535_Thr542de l) 646 V GRIN2B AD c.3076G>A(;)3004 G>C p.Gly1026Ser(;)Gly1 002Arg 772 V GRIK2 AR g.(?_102483191)_( 102483466_?)del g.(?_102483466)_( 102250338_?)del - 840 V HIVEP2 AD c.6036C>A p.Asp2012Glu 1045 M GNB1 AD c.217G>A p.Ala73Thr 1180 M DDX3X XLD c.1474delA p.(Ser492Alafs*4) 1194 M AHDC1 AD c.4660_4668delG ACTCGCTG p.Asp1554_Leu1556 del o Variante heredada de uno de los progenitores Paciente Sexo Gen H Variante Proteína 789 V ZMYM3 XL c.2074G>A p.Glu692Lys 1100 V SETD5 AD c.3668C>T p.Ser1223Leu 1152 V SYNGAP1 AD c.1330A>C p.Lys444Gln 4.2.4. Enfermedades Neuromusculares Se estudiaron 84 casos a través del panel de enfermedades neuromusculares. Por sospecha clínica los pacientes se agrupaban en aquellos que presentaban sintomatología compatible con distrofias musculares (cintura escapular, congénita de Ullrich, de Duchenne, Emery-Dreifuss), miopatías congénitas, miopatías distales, miopatías metabólicas, enfermedades de la unión neuromuscular, amiotrofias espinales, y neuropatías hereditarias. Se obtuvo una tasa diagnóstica del 36,90%, detectando en 31 pacientes la causa molecular de su patología SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 116 (tabla 22). En 27 casos (32,14%) el diagnóstico no fue concluyente (tabla 23) y en 26 de los 84 (30,95%) no se identificó la causa genética. En 11 pacientes fueron identificadas variantes patogénicas en genes asociados a la distrofia muscular de varios tipos. En 5 pacientes las variantes estaban localizadas en genes asociados a la distrofia muscular de cinturas: variantes heterocigotas compuestas fueron detectadas en los pacientes 211, en el gen CAPN3, y en la paciente 358, en el gen SGCA; variantes homocigotas fueron detectadas en los pacientes 144, en el gen TCAP, y en los pacientes 543 y 988 en el gen SGCG. En la paciente 565, fue identificada una variante heterocigota en el gen COL6A3, asociado a la distrofia muscular de Ullrich. En 4 pacientes fueron identificadas variantes en el gen DMD, asociado a la distrofia muscular de Duchenne: en los pacientes 798, 850 y 1203 fueron detectadas variantes en hemicigosis, y en la paciente 880, una variante heterocigota de novo fue identificada en el mismo gen. En la paciente 325, fue identificada una variante homocigota en el gen SYNE1, asociado a la distrofia muscular de Emery-Dreifuss. En 7 pacientes fueron identificadas variantes patogénicas en genes asociados a neuropatías como la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth: variantes heterocigotas compuestas en los pacientes 373, en el gen IGHMBP2, y en el paciente 635, en el gen SH3TC2; variantes heterocigotas de novo en los pacientes 529, en el gen MPZ, en el paciente 766 en el gen MFN2, y en el paciente 908, en el gen DNM2; una variante homocigota fue identificada en la paciente 361, en el gen SH3TC2, y una variante hemicigota en el paciente 800, en el gen GJB1. En la paciente 282 fue identificada una variante homocigota en el gen HINT1 asociado a la neuromiotonia y neuropatía axonal. En 3 pacientes fueron identificadas variantes heterocigotas compuestas en el gen TTN asociado a miopatía congénita: pacientes 72, 299 y 343. En el paciente 146, fue detectada una isodisomia materna en el gen TTN (resultados descritos en el apartado 4.7). RESULTADOS 117 En 4 pacientes fueron identificadas variantes de novo: en genes asociados a la miopatía congénita relacionada con cardiomiopatía, como el paciente 195, con una variante hemicigota en el gen TAZ, y el paciente 255, con una variante heterocigota en el gen MYH7; y en el gen KBTBD13, asociado a la miopatía nemalínica, como los pacientes 197 y 876. En 2 pacientes fueron identificadas variantes en genes asociados al síndrome congénito miasténico: una variante en homocigosis, en el paciente 81, en el gen CHRNE, y variantes heterocigotas compuestas en la paciente 431 en el gen DPAGT1. En 2 pacientes fueron identificadas variantes homocigotas: en el paciente 101 fue identificada una variante patogénica en el gen GYG1, asociado a miopatía metabólica por trastorno de almacenamiento de glucógeno; y en la paciente 282, fue detectada una CNV en el gen SIGMAR1, asociado a la atrofia muscular espinal. Tabla 22_Panel de Enfermedades Neuromusculares - Pacientes con Diagnóstico positivo Paciente Sexo Gen H Proteína ACMG 72 V TTN AD, AR c.[12411delT]; [105110_105111d elCC] p.[Ser4137ArgfsTe r31]; [Thr35037AsnfsTe r9] 81 V CHRNE AD, AR c.[583G>C]; [583G>C] p.[Asp195His]; [Asp195His] 101 M GYG1 AR c.[46G>C]; [46G>C] p.[Ala16Pro]; [Ala16Pro] 144 V TCAP AR c.[255C>A]; [255C>A] p.[Tyr85*]; [Tyr85*] 146 V TTN AR c.38661_38665del p.12885_12887del 195 V TAZ XLR c.527A>G p.His176Arg 197 V KBTBD13 AD c.290T>C p.Leu97Pro 211 V CAPN3 AR c.[1962delC]; [ 2120A>G] p.[Phe654fSeArg*7 ]; [ Asp707Gly] 255 V MYH7 AD c.1606G>A p.Glu536Lys SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 118 282 M SIGMAR1 AR g.(?_34635615)_(3 4635855_?)del - 299 V TTN AD, AR c.[3034C>T]; [106531+1G>A] p.[Arg1012*];[-] 325 M SYNE1 AR c.[26095-1G>T]; [26095-1G>T] - 343 M TTN AD, AR c.[33064C>T]; [102941G>A] p.[Arg11022*]; [Gly34314Asp] 358 M SGCA AR c.[724G>T]; [739G>A] p.[Val242Phe]; [Val247Met] 361 M SH3TC2 AR c.[3325C>T]; [3325C>T] p.[Arg1109*]; [Arg1109*] 373 M IGHMBP2 AR c.[181G>A]; [1327C>T] p.[Gly61Arg]; [Arg443Cys] 431 M DPAGT1 AR c.[1150C>G]; [574G>C] p.[Leu384Val]; [Gly192Arg] 529 M MPZ AD c.369C>T p.Gly123Gly 543 M SGCG AR c.[848G>A]; [848G>A] p.[Cys283Tyr]; [Cys283Tyr] 565 M COL6A3 AD, AR c.6210+5G>A - 635 V SH3TC2 AR c.[2640delC]; [2860C>T] p.[ Ala880fSer]; [Arg954*] 637 V HINT1 AR c.[110G>C]; [110G>C] p.[Arg37Pro]; [Arg37Pro] 766 M MFN2 AD, AR c.326A>G p.Lys109Arg 798 V DMD XL c.9622A>G p.Lys3208Glu 800 V GJB1 XL c.547C>T p.Arg183Cys 850 V DMD XL c.9563+1G>A - 876 V KBTBD13 AD c.244G>A p.Val82Met 880 M DMD XL c.5697dupA p.(Leu1900Ilefs*6) 908 M DNM2 AD, AR c.1856C>T p.Ser619Leu 988 M SGCG AR c.[525delT]; [525delT] p.[Phe175Leufs*2 0]; [Phe175Leufs*20] 1203 V DMD XL g.(?_32404402)_(3 2503241_?)del - En 27 casos no fue posible obtener un diagnóstico molecular concluyente. En 17 casos, por no disponer de muestras de los progenitores, no fue posible concluir los estudios familiares para RESULTADOS 119 determinar la segregación las variantes identificadas. En 9 casos fueron identificadas variantes heterocigotas heredadas de uno de los progenitores asintomáticos. En 1 caso fue identificada una variante heterocigota en genes asociados a patologías de herencia recesiva con clínica compatible. Tabla 23_Panel Enfermedades Neuromusculares - Pacientes con Diagnóstico NO concluyente o Por falta de estudio familiar Paciente Sexo Gen H Variante Proteína 35 V SCN4A AD c.4774A>G p.Met1592Val 133 M COL6A1 AD c.868G>A p.Gly290Arg 280 M REEP1 AD c.349G>C p.Ala117Pro 283 M RYR1 AD, AR c.10347+1G>A - 303 V CAPN3 AD c.2361_2362in sTCAT p.Val787fSer 326 V REEP1 AD c.164C>T p.Thr55Ile 338 M CHRNB1 AD c.309C>G p.Ile103Met 387 V CLCN1 AD, AR c.2234A>G p.Asp745Ser 507 V RYR1 AD, AR c.4837C>T(;) 13672C>T(;) 7027G>A p.Gln1613*(;) Arg4558Trp(;)Gly2 343Ser 509 M ACTA1 AR c.529A>G(;) 809-2A>T p.Ile177Val(;) - 596 V COL12A1 AD, AR c.8215T>C(;) 6995G>A p.Cys2739Arg(;)Tr p2332* 620 V STIM1 AD c.247G>T p.Val83Leu 630 M TTN AR c.38737G>T(;) 87019_87022d el p.Glu12913*(;) 29007_29008del 749 V DST AR c.822A>G(;) 4777A>C p.Glu274Glu(;) Ile1593Leu 790 M COL6A2 AD, AR c.875G>A p.Gly292Asp 1155 M DMD XL c.3125delA p.(Lys1042Serfs*2) 1216 M FKRP AR c.545A>G(;) 898G>A(;) 822C>G p.Tyr182Cys(;)Val 300Met(;)Ile274M et SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 120 o Variante heredada de uno de los progenitores Paciente Sexo Gen H Variante Proteína 10 V MYH7 AD c.4421C>A p.Ala1474Asp 50 M COL6A1 AD, AR c.2166_2167in sC p.Ile723Hisfs*7 185 V RYR1 AR c.2709C>G p.His903Gln 209 V COL6A2 AD, AR c.1806C>A p.Cys602* 249 V MYH2 AD, AR c.4205G>A p.Arg1402Gln 349 M GDAP1 AR c.487C>T p.Gln163* 375 V INF2 AD c.1580_1581in sC p.Val530fs*49 793 V TRAPPC11 AR c.[15681G>A(;) 2147C>G] p.-(;) Ala716Gly 900 M SLC52A2 AR c.595delG p.(Ala199Hisfs*2) o Variante heterocigota en gen recesivo con clínica compatible Paciente Sexo Gen H Variante Proteína 465 V LAMA2 AR c.149C>T p.Ala50Val 4.2.5. Ataxias y Trastornos del Movimiento Se estudiaron 68 casos a través del panel de ataxias y trastornos del movimiento. Por sospecha clínica los pacientes se agrupaban en aquellos que presentaban sintomatología compatible con distonía, ataxia, corea, paraparesia espástica, hiperlaxitud y osteogénesis. Se obtuvo una tasa diagnóstica del 10,29%, detectando en 7 pacientes la causa molecular de su patología (tabla 24). En 14 casos (20,59%) el diagnóstico no fue concluyente (tabla 25) y en 47 de los 68 (69,12%) no se identificó la causa genética. En 4 pacientes fueron identificadas variantes heterocigotas: 2 de novo en los pacientes 288 y 376, en los genes KCND3 y ITPR1, asociados a la ataxia espinocerebelosa; y en el paciente 154, fue ARTÍCULOS PUBLICADOS 223 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 224 ARTÍCULOS PUBLICADOS 225 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 226 ARTÍCULOS PUBLICADOS 227 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 228 ARTÍCULOS PUBLICADOS 229 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 230 ARTÍCULOS PUBLICADOS 231 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 232 ARTÍCULOS PUBLICADOS 239 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 240 ARTÍCULOS PUBLICADOS 241 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 242 ARTÍCULOS PUBLICADOS 243 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 244 ARTÍCULOS PUBLICADOS 245 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 246 ARTÍCULOS PUBLICADOS 247 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 248 REFERENCIAS SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 256 1. Klug A. Rosalind Franklin and the discovery of the structure of DNA. 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ERRORES CONGÉNITOS DEL METABOLISMO Panel Hipoglucemia e Hiperglucemia - Pacientes con Diagnóstico positivo Paciente Estudio familiar Gen H Alelo Tipo Variante ACMG ClinVar dbSNP GnomAD DANN GERP 4 TRANS SLC22A5 AR HT C MISS c.34G>A LP VUS rs139203363 0.000711 0.9987 4,99 4 TRANS SLC22A5 AR HT C MISS c.1463G>A LP P rs28383481 0.00325 0.9993 5,77 66 MAT PHKA2 XLR HE SPL c.1245+1G>T P - - - 0.9957 5,28 277 TRANS AGL AR HO FS c.100delC LP - - - - 4,97 645 ND PHKA2 XLR HE FS c.3547_3548insGG TGCCATGGACACC CTGGAGA LP - - - - 3,60 697 TRANS GALT AR HO MISS c.443G>A LP P/LP rs111033694 0.000024 0.9988 5,30 763 ND PHKA2 XLR HE MISS c.3614C>T LP P rs137852288 - 0.9986 5,88 764 ND PHKA2 XLR HE MISS c.2746C>T LP P - - 0.9991 4,38 1210 TRANS ALDOB AR HO MISS c.448G>C LP P rs1800546 - 0.9978 6,17 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 304 Panel Hipoglucemia e Hiperglucemia - Pacientes con Diagnóstico NO concluyente Paciente Estudio familiar Gen H Alelo Tipo Variante ACMG ClinVar dbSNP GnomAD DANN GERP 251 ND CEL AD HT MISS c.1810G>C VUS - - - 0.8027 -1,89 251 ND CEL AD HT MISS c.1975G>C VUS - - - 0.8186 1,19 468 ND ABCC8 AD, AR HT CNV _DEL g.(?_17464699)_(1 7464884_?)del - - - - - - 468 ND ABCC8 AD, AR HT CNV _DEL g.(?_17464241)_(1 7464454_?)del - - - - - - 586 MAT GLUD1 AD HT MISS c.272C>T VUS - - - 0.9753 3,09 663 MAT PHKA2 XLR HT MISS c.2870A>G VUS - rs755911581 0.000076 0.9982 4,88 734 ND ETFDH AR HT NON c.1274C>G P - - - 0.9959 5,42 758 ND CPS1 AR HT MISS c.1201G>C P VUS rs760895692 0.00002 0.9982 5,88 758 ND CPS1 AR HT MISS c.2810T>A VUS VUS rs760714614 0.00002 0.9902 5,47 1138 PAT PDX1 AD, AR HT MISS c.779G>A VUS - rs116405576 3 - 0.9967 3,28 1167 ND ABCC8 AD, AR HT MISS c.3004G>A VUS - rs144329652 0.000028 0.8568 4,30 1167 ND SLC37A4 AR HT MISS c.1225A>G VUS - rs782480303 0.000080 0.9466 5,27 1167 ND SLC37A4 AR HT MISS c.1022C>T VUS - rs191545031 0.00288 0.5537 5,03 1196 ND PHKA2 XLD HT MISS c.2911C>T VUS - rs768601102 - 0.9987 6,06 ANEXOS 305 Panel Defectos del Metabolismo Intermediario - Pacientes con Diagnóstico positivo Paciente Estudio familiar Gen H Alelo Tipo Variante ACMG ClinVar dbSNP GnomAD DANN GERP 22 PAT AMT AR HT C MISS c.2T>C P - rs126625963 4 0.000004 0.9627 4,87 22 MAT Y HNO AMT AR HT C SPL c.878-1G>A P P rs181134220 0.000017 0.9936 4,77 59 TRANS GLDC AR HO MISS c.2714T>G LP - rs188269735 0.000048 0.9966 5,33 68 ND MOCS2 AR HO MISS c.244A>T LP - rs776441627 0.000024 0.9711 5,88 254 TRANS TCN2 AR HO CNV_ DEL g.(?_3101892 9)_(3101909 5_?)del - - - - - - 633 TRANS PAH AR HT MISS c.842C>T LP LP rs5030851 0.000103 0.9988 5,73 633 TRANS PAH AR HT MISS c.490A>G LP LP rs199475647 0.000016 0.9973 6,08 634 PAT PAH AR HT C MISS c.782G>A LP LP rs5030849 0.000223 0.9996 5,72 634 MAT PAH AR HT C MISS c.136G>A P P rs74603784 0.000077 0.9989 5,46 657 TRANS MCCC2 AR HT C MISS c.1015G>A LP LP rs150591260 0.000784 0.9986 5,65 657 TRANS MCCC2 AR HT C MISS c.1423G>A p P/LP rs148773718 0.000096 0.9994 5,83 662 MAT HPRT1 XLR HE MISS c.424A>G LP - - - 0.9978 5,56 692 TRANS Y HNO ETFDH AR HO MISS c.1601C>T LP P rs200920510 - 0.9989 5,60 711 PAT MOCOS AR HT C FS c.2356del LP - - - - 1,93 711 MAT MOCOS AR HT C MISS c.512C>T VUS - rs150556770 0.00114 0.9253 5,32 760 TRANS PAH AR HT C MISS c.782G>A LP P rs5030849 0.000223 0.9996 5,72 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 306 760 TRANS PAH AR HT C SPL c.106611G>A LP P rs5030855 0.000247 0.3767 3,73 852 TRANS PAH AR HT C MISS c.1162G>A LP P rs62516101 0.000084 0.9989 5,34 852 TRANS PAH AR HT C MISS c.728G>A LP P rs62508588 0.000076 0.9996 5,92 1083 PAT PAH AR HT C MISS c.1169A>G LP P rs5030856 0.00099 0.9984 5,34 1083 MAT PAH AR HT C DEL c.116_118de lTCT LP P rs199475565 /rs11682393 23 0.000016 - 5,46 1096 TRANS PAH AR HT C MISS c.261C>A P P/LP rs62516151 0.000076 0.9735 1,30 1096 TRANS PAH AR HT C SPL c.1315+1G>A P P rs5030861 0.000398 0.9953 5,33 Panel Defectos del Metabolismo Intermediario - Pacientes con Diagnóstico NO concluyente Paciente Estudio familiar Gen H Alel o Tipo Variante ACMG ClinVar dbSNP GnomAD DANN GERP 96 ND IDH2 AD HT MISS c.419G>A VUS P rs121913502 0.000032 0.9991 4,75 286 ND UMPS AR HT NON c.1213C>T P - rs199644027 0.000004 0.9975 4,75 920 MAT PRODH AR HT MISS c.1397C>T VUS P/LP/B rs2870984 0.00463 0.9989 3,10 ANEXOS 307 Panel Enfermedades Mitocondriales - Pacientes con Diagnóstico positivo Paciente Estudio familiar Gen H Alelo Tipo Variante ACMG ClinVar dbSNP GnomAD DANN GERP 12 PAT GFM1 AR HT C MISS c.2011C>T LP P/LP rs201408725 0.000064 0.9992 5.8 12 MAT GFM1 AR HT C FS c.1401delA P - rs779877297 0.000016 - 6.17 43 PAT Y HNO FOXRED1 AR HT C MISS c.920G>A LP LP rs145888229 0.000174 0.9958 5,63 43 MAT Y HNO FOXRED1 AR HT C SPL c.733+1G>A P - rs754952690 0.00004 0.9926 3,83 65 TRANS TSFM AR HO MISS c.719G>C LP - rs750799705 0.000004 0.8667 5,10 142 DN DNM1L AD, AR HT MISS c.1337G>T LP LP rs879253874 - 0.9917 5,14 163 TRANS AGK AR HO SPL c.518+1G>A P - - - 0.9955 5,20 163 PAT EARS2 AR HT C MISS c.1045G>A VUS VUS rs187662524 0.00138 0.9974 3,54 163 MAT EARS2 AR HT C MISS c.494A>G LP - rs376918203 0.000017 0.9984 4,45 172 PAT EARS2 AR HT C MISS c.319C>T VUS - rs135568545 3 0.000009 0.9986 3,59 172 MAT EARS2 AR HT C MISS c.322C>T LP VUS/P/L P rs376103091 0.000151 0.9991 4,69 179 DN OPA1 AD HT MISS c.1710T>G P - - - 0.9986 3,29 192 DN PDHA1 XLR HE MISS c.787C>G LP P rs137853259 - 0.9983 4,77 205 PAT Y HNO FBXL4 AR HT C SPL c.858+5G>C LP LP rs125776568 2 - 0.9748 4,91 205 MAT Y HNO FBXL4 AR HT C MISS c.1510T>C LP - - - 0.9977 5,82 215 PAT Y HNA FARS2 AR HT C MISS c.1256G>A LP LP rs202183509 0.00002 0.9995 5,81 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 308 215 MAT FARS2 AR HT C CNV _DEL g.(?_5404749)_(54 04959_?)del - - - - - - 235 TRANS ACAD9 AR HT C FS c.358delT P LP rs863224844 /rs13679811 02 0.000101 - 3,46 235 TRANS ACAD9 AR HT C SPL c.809-2A>G P - - - 0.9954 5,27 250 PAT MTO1 AR HT C MISS c.170G>T LP - - - 0.9981 5,76 250 MAT MTO1 AR HT C MISS c.1450C>T LP VUS/P rs748152539 0.00002 0.9989 2,07 252 MAT GFM1 AR HT C MISS c.640A>T LP - rs376046377 - 0.9809 -3,77 252 PAT GFM1 AR HT C MISS c.1199G>C LP - rs139692119 0.00008 0.9973 4,01 292 TRANS COX15 AR HO MISS c.649C>T LP P rs28939711 0.000032 0.9991 4,61 362 PAT EARS2 AR HT C MISS c.670G>A LB B rs141129877 0.000869 0.9986 5,56 362 MAT EARS2 AR HT C NON c.376C>T P - - - 0.9961 4,69 389 PAT Y HNO ACAD9 AR HT C MISS c.737T>C LP - - - 0.9985 4,31 389 MAT Y HNO ACAD9 AR HT C MISS c.860G>A LP - rs762883679 0.000016 0.9936 4,89 403 TRANS C12orf65 AR HO FS c.207_220del LP - rs138051395 0 - - -6,62 825 TRANS PET100 AR HO MISS c.1A>G LP - rs977392512 0.000007 0.9866 5,09 889 MAT EARS2 AR HT C MISS c.184A>T VUS - rs119654172 9 - 0.9642 2,05 889 PAT EARS2 AR HT C MISS c.920T>C LP - rs770916034 0.000013 0.9973 5,46 919 PAT Y TIO COQ4 AR HT C MISS c.202G>C LP LP/VUS rs758522459 0.000043 0.9952 5,49 919 MAT Y HNO COQ4 AR HT C MISS c.718C>T LP P/LP rs143441644 0.000198 0.9994 5,52 ANEXOS 309 1060 TRANS SUCLA2 AR HO MISS c.850C>T LP P rs121908538 0.000032 0.9991 5,67 Panel Enfermedades Mitocondriales - Pacientes con Diagnóstico NO concluyente Paciente Estudio familiar Gen H Alel o Tipo Variante ACMG ClinVar dbSNP GnomAD DANN GERP 11 PAT UPB1 AR HT NON c.422C>G P - - - 0.9962 5.72 11 PAT UPB1 AR HT SYN c.423A>T VUS - - - 0.7957 5.72 88 PAT BCS1L AR HT NON c.166C>T P P/LP rs121908576 0.000167 0.9961 2,23 129 MAT ADCK4 AR HT MISS c.103G>A VUS - - - 0.8354 1,16 130 DN ADCK4 AR HT MISS c.418G>A LP - rs135082291 9 0.000004 0.9993 4,72 242 ND DNM1L AD, AR HT MISS c.1921G>A VUS VUS rs863223952 - 0.9988 5,52 372 MAT NDUFAF2 AR HT FS c.490delG VUS VUS rs106479321 4 0.000347 - 5,64 536 ND SLC6A8 XLR HE MISS c.928G>A VUS - - - 0.9989 5,07 544 MAT PNPT1 AR HT MISS c.493C>T VUS LP rs151166046 0.000155 0.999 5,24 566 MAT NDUFB11 XL HT MISS c.152C>A VUS LB rs150506634 0.000433 0.9775 4,10 592 MAT POLG2 AD HT MISS c.799G>A VUS - - - 0.9992 5,43 599 ND PNPT1 AR HT SPL c.1177-2A>C P - - - 0.9952 5,51 599 ND PNPT1 AR HT MISS c.1519G>T VUS VUS rs143712760 0.000207 0.9969 5,52 661 MAT LETM1 AD HT MISS c.709C>T VUS - - - 0.9991 4,14 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 310 787 PAT RRM2B AD HT MISS c.139A>G VUS - rs129623726 1 0.000004 0.999 5,61 847 TRANS POLRMT - HO MISS c.3596T>C VUS - rs151287767 0.00616 0.3191 -5,27 903 PAT FLAD1 AR HT MISS c.1033C>T VUS - rs61740252 - 0.9965 5,51 903 PAT FLAD1 AR HT MISS c.1589G>A VUS - rs146007674 0.000167 0.9994 4,64 943 ND DARS2 AR HT SPL c.396+2T>G P P rs759123043 0.000028 0.992 6,07 1095 ND SPG7 AD, AR HT MISS c.1529C>T VUS P/LP rs61755320 0.00292 0.9992 5,42 Panel Defectos en el Metabolismo de Moléculas Complejas y Leucodistrofias - Pacientes con Diagnóstico positivo Paciente Estudio familiar Gen H Alelo Tipo Variante ACMG ClinVar dbSNP GnomAD DANN GERP 14 MAT Y HNA TREX1 AR HT C MISS c.218C>T LP VUS/P rs755919767 0.000024 0.9986 4,99 14 PAT Y HNA TREX1 AR HT C MISS c.404A>C LP - - - 0.9898 4,99 56 MAT TPP1 AR HT C NON c.622C>T P P rs119455955 0.000223 0.9966 4,10 56 PAT TPP1 AR HT C SPL c.887-10T>C VUS VUS/P rs755445790 0.00147 0.479 1,33 60 PAT HEXA AR HT C MISS c.533G>A LP P rs28941770 0.000048 0.9994 5,44 60 MAT HEXA AR HT C MISS c.380T>G LP P rs121907975 - 0.9975 5,30 98 MAT Y HNO POLR3B AR HT C MISS c.1244T>C LP P rs199504211 0.000554 0.9932 5,75 98 PAT Y HNO POLR3B AR HT C MISS c.2740G>A LP - rs138133989 1 - 0.9993 5,54 114 TRANS PPT1 AR HO MISS c.541G>T P LP rs148412181 0.000012 0.9923 4,85 ANEXOS 311 116 TRANS GNPTAB AR HO MISS c.1325G>A LP P rs281864975 - 0.9981 5,71 117 MAT HSD17B4 AR HT C MISS c.1273T>C LP - - - 0.9771 1,42 117 PAT HSD17B4 AR HT C MISS c.1528G>A LP LP rs191468413 0.000016 0.9988 5,61 137 MAT SLC17A5 AR HT C NON c.918T>G P P rs201284672 0.000084 0.997 2,28 137 PAT SLC17A5 AR HT C MISS c.1239C>G LP - - - 0.9985 5,40 221 TRANS PLA2G6 AR HO FS c.1460_1462del LP - - - - 5,61 228 PAT NAGLU AR HT C SPL c.531+5G>A VUS - - - 0.9584 3,33 228 MAT NAGLU AR HT C NON FS c.1045_1047del LP - - - - 4,70 231 TRANS POLR3A AR HT C FS c.2376_2377delAT LP - - - - 6,03 231 TRANS POLR3A AR HT C MISS c.2081G>A LP - rs376405070 0.000016 0.9992 4,89 234 TRANS GBA AR HT C MISS c.1226A>G LP P rs76763715 0.00231 0.9971 3,53 234 TRANS GBA AR HT C MISS c.930T>A VUS - - - 0.9799 -0,21 368 TRANS PEX12 AR HO FS c.888_889del LP P rs398123301 0.000127 - 4,92 483 TRANS CLN6 AR HO FS c.829_836delinsCC T LP - - - - 3,19 513 TRANS CTSA AR HO MISS c.1252G>T LP - - - 0.9953 5,56 667 MAT SGSH AR HT C SPL c.355+1G>A P - - - 0.9938 3,65 667 PAT SGSH AR HT C FS c.1080delC P P rs770947426 0.000072 - 4,45 670 DN GNE AD, AR HT MISS c.797G>A LP P rs121908622 - 0.9996 4,86 715 MAT SGSH AR HT C MISS c.1127T>C LP - rs775729169 0.000004 0.9757 4,45 715 PAT SGSH AR HT C MISS c.197C>G LP - rs104894637 0.000093 0.9919 3,89 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 312 746 MAT SLC16A2 XLR HE FS c.46delC LP - - - - 3,13 848 PAT GBA AR HT C MISS c.1193G>A LP - rs74979486 - 0.9995 3,67 848 MAT GBA AR HT C MISS c.155C>T LP - rs127572418 8 0.000004 0.9939 1,52 922 MAT NAGLU AR HT C MISS c.1562C>T LP CONFLIC T rs104894595 0.000020 0.9991 4,69 922 PAT NAGLU AR HT C MISS c.1693C>T LP P rs104894597 0.000032 0.9992 3,65 1165 TRANS GAA AR HT NON c.343C>T P LP rs786204614 - 0.9961 1,46 1165 TRANS GAA AR HT SPL c.-32-13T>G LP P rs386834236 0.00344 0.6248 -1,68 Panel Defectos en el Metabolismo de Moléculas Complejas y Leucodistrofias - Pacientes con Diagnóstico NO concluyente Paciente Estudio familiar Gen H Alel o Tipo Proteína ACMG ClinVar dbSNP GnomAD DANN GERP 31 MAT PPT1 AR HT MISS c.2T>C P P/LP rs796052927 - 0.9541 4.44 34 ND CLN6 AR HT MISS c.314C>T VUS - rs769747737 0.000004 0.9987 51,39 851 ND RNASEH2B AR HT MISS c.655T>C VUS P/LP rs75184679 0.0014 0.9967 5,78 ANEXOS 319 937 ND SCN1A AD HT MISS c.376T>A LP P rs121917971 - 0.9994 5,18 938 MAT GABRB1 AD HT MISS c.1588G>A VUS - - - 0.9988 5,43 940 PAT GRIN2A AD HT SYN c.157C>T VUS - rs55885632 0.000004 0.5891 4,25 951 ND DEPDC5 AD HT CNV_ DEL c.1604G>A - - - - - - 957 ND KCNT1 AD HT MISS g.(?_67243157)_(6 7647704_?)del VUS LP - - 0.9995 4,87 965 ND MECP2 XL HT NON c.1016T>A P - - - 0.9971 5,80 975 ND PRRT2 AD HT FS c.803C>T VUS P rs587778771/r s772994486 - - 3,90 981 ND HCN1 AD HT MISS c.824G>A VUS - - - 0.9944 5,37 996 PAT NPRL2 AD HT MISS c.775A>G VUS - - - 0.999 5,17 1008 MAT KCNT1 AD HT INDEL c.837C>T VUS - - - - 4,46 1030 ND FGF12 AD HT MISS c.949G>A VUS P rs886039903 - 0.998 5,51 1038 ND SCN8A AD HT MISS c.2912_2913delins AT VUS - - - 0.9896 4,96 1049 ND CNTNAP2 AR HT MISS c.900C>A VUS - rs1340170810 - 0.9992 5,95 1068 ND KCNC1 AD HT MISS c.718G>A VUS - - - 0.9987 4,41 1073 ND EFHC1 AD HT MISS c.1228C>G VUS - rs762271322 0.000044 0.9956 4,02 1078 ND CASR AD HT MISS c.53A>T VUS - - - 0.9919 4,98 1099 PAT HECW2 AD HT MISS c.469T>C VUS - - - 0.9983 5,01 1119 PAT SYN1 XL HT MISS c.3924A>T VUS - - - 0.9993 4,88 1126 ND SLC6A1 AD HT MISS c.1421G>T VUS - - - 0.9985 4,21 1127 ND CDKL5 XL HT MISS c.2526G>C LP - - - 0.974 5,98 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 320 1129 ND PRRT2 AD HT FS c.3274T>C VUS P/LP rs587778771/r s772994486 - - 3,90 1173 ND SCN10A AD HT FS g.(?_6366971)_(63 67083_?)del VUS VUS rs747321219 0.000076 - 3,41 1173 ND SCN10A AD HT MISS g.(?_6704579)_(67 04676_?)del VUS - rs774337248 0.000012 0.9869 4,14 1191 ND KCNQ5 AD HT MISS g.(?_67291192)_(6 7291284_?)del VUS - rs748704876 - 0.9996 5,84 Panel Defectos de la Morfogénesis Cerebral - Pacientes con Diagnóstico positivo Paciente Estudio familiar Gen H Alelo Tipo Variante ACMG ClinVar dbSNP GnomAD DANN GERP 48 DN PAFAH1B1 AD HT CNV_ DEL g.(?_2583433)_(25 85146_?)del - - - - - - 69 MAT DCX XLD HT MISS c.191C>T LP LP rs761786389 0.000033 0.8931 -1,84 86 DN PIK3R2 AD HT MISS c.1117G>A LP P rs587776934 - 0.9989 3,69 112 PAT RELN AR HT C MISS c.10112G>T LP - - - 0.9861 4,98 112 MAT RELN AR HT C MISS c.8809G>A VUS - rs750491016 0.000004 0.9973 5,89 118 MAT KNL1 AR HT C SYN c.1599A>G VUS LP rs979186313 0.000016 0.209 -2,41 118 DN KNL1 AR HT C MISS c.6427G>T LP LP - - 0.995 3,08 121 DN PAFAH1B1 AD HT CNV_ DEL g.(?_2541532)_(25 41639_?)del - - - - - - 223 PAT TSEN54 AR HT C MISS c.371G>T LP LP rs774157225 0.000012 0.9595 5,30 ANEXOS 321 223 MAT TSEN54 AR HT C MISS c.919G>T LP P/LP rs113994152 0.000903 0.9749 5,14 223 MAT TSEN54 AR HT C MISS c.277T>C LP P rs113994151 - 0.9526 1,79 331 ND SRPX2 - HE MISS c.559C>T LP - - - 0.9993 5,61 422 DN PIK3R2 AD HT MISS c.1117G>A LP P rs587776934 - 0.9989 3,69 430 DN SHH AD HT FS c.143delT P LP - - - 4,78 467 TRANS TUBGCP6 AR HO SPL c.4315+2_4315+3d elTG P LP - - - 4,12 480 ND DCX XLD HE MISS c.266T>C LP - - - 0.9983 4,21 503 MAT TSEN2 AR HT C MISS c.1037A>G LP LP rs147734769 0 - 0.9984 5,39 503 PAT TSEN2 AR HT C FS c.353_354del P LP rs755246924 0.000024 - 4,92 517 DN KIF11 AD HT FS c.2971_2972insT P LP - - - -3,05 581 DN TUBB2A AD HT MISS c.743C>T LP P/LP rs2808001 0.000034 0.9771 4,97 723 DN EFTUD2 AD HT NON c.259C>T P - - - 0.9983 6,00 927 TRANS ADGRG1 AR HO NON c.1504C>T P - rs746634404 0.000012 0.9983 4,90 995 DN EFTUD2 AD HT DEL c.2562-2_25621delAG LP - - - - 6,06 Panel Defectos de la Morfogénesis Cerebral - Pacientes con Diagnóstico NO concluyente Paciente Estudio familiar Gen H Alel o Tipo Variante ACMG ClinVar dbSNP GnomAD DANN GERP SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 322 111 ND ARFGEF2 AR HT MISS c.625G>A VUS VUS rs28937880 0.00178 0.9992 6,06 119 MAT CASK XL HT CNV_ DUP g.(?_41524505)_(41 524730_?)dup - - - - - - 119 MAT CASK XL HT CNV_ DUP g.(?_41530656)_(41 530808_?)dup - - - - - - 119 MAT CASK XL HT CNV_ DUP g.(?_41519667)_(41 519839_?)dup - - - - - - 122 ND MED17 AR HT MISS c.602A>G VUS - rs770618400 0.000008 0.9979 5,51 216 ND ZIC2 AD HT NONFS c.1392_1403del VUS - rs124150271 8 - - -2,77 323 ND CASC5 AR HT SPL c.75+6A>G VUS VUS rs201311057 0.000876 0.8046 323 ND CASC5 AR HT SYN c.5142G>C VUS - - 0.000437 0.3756 -5,43 439 MAT PIK3CA - HT MISS c.2530T>C VUS - rs756890248 0.000008 0.8934 5,38 607 ND TUBB2B AD HT MISS c.728C>T VUS VUS - - 0.9734 4,20 678 PAT CCND2 AD HT MISS c.553A>T VUS - - - 0.9869 4,79 710 ND DCX XL, XLR HT MISS c.829C>T LP LP rs587783568 - 0.9993 4,74 718 DN SNAP29 AR HT CNV_ DEL g.(?_21213348)_(21 242174_?)del - - - - - - 982 ND FLNA XL, XLR HT MISS c.5959G>C VUS - - - 0.9979 5,42 ANEXOS 323 Panel Discapacidad Intelectual - Pacientes con Diagnóstico positivo Paciente Estudio familiar Gen H Alel o Tipo Variante ACMG ClinVar dbSNP GnomAD DANN GERP 1102 DN ADNP AD HT FS c.56_57delTG LP - - - - 6,17 1128 MAT L1CAM XL, XLR HE SPL c.2750-2A>G P - - - 0.9937 5,17 Panel Discapacidad Intelectual - Pacientes con Diagnóstico NO concluyente Paciente Estudio familiar Gen H Alel o Tipo Proteína ACMG ClinVar dbSNP GnomAD DANN GERP 615 MADRE NO PORTADOR A FALTA PADRE AUTS2 AD HT DEL p.(His535_Thr542del) VUS - - - - 5,73 646 ND GRIN2B AD HT MISS p.Gly1026Ser VUS VUS rs201963596 0.000227 0.9664 5,49 646 ND GRIN2B AD HT MISS p.Gly1002Arg VUS - rs761281000 0.000019 0.999 5,50 772 ND GRIK2 AR HT C CNV _DEL - - - - - - - 772 ND GRIK2 AR HT C CNV _DEL - - - - - - - 789 MAT ZMYM3 XL HE MISS p.Glu692Lys VUS - - - 0.9643 4,70 840 ND HIVEP2 AD HT MISS p.Asp2012Glu VUS - - - 0.9824 5,21 1045 ND GNB1 AD HT MISS p.Ala73Thr VUS - - - 0.9826 5,66 1100 PAT SETD5 AD HT MISS p.Ser1223Leu VUS - rs373191662 - 0.9976 5,75 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 324 1152 PAT SYNGAP1 AD HT MISS p.Lys444Gln VUS - - - - 1180 ND DDX3X XLD HT FS p.(Ser492Alafs*4) P - - - - 5,22 1194 ND AHDC1 AD HT DEL p.Asp1554_Leu1556de l VUS - - - - 5,33 Panel de Enfermedades Neuromusculares - Pacientes con Diagnóstico positivo Paciente Estudio familiar Gen H Alelo Tipo Variante ACMG ClinVar dbSNP GnomAD DANN GERP 72 MAT Y HNA TTN AD, AR HT C FS c.12411delT LP - - - - -3.24 72 PAT Y HNA TTN AD, AR HT C FS c.105110_105111d elCC LP - - - - 2,99 81 TRANS CHRNE AD, AR HO MISS c.583G>C LP - rs774425374 - 0.9889 4,62 101 TRANS GYG1 AR HO MISS c.46G>C LP - rs200947378 0.000004 0.9962 5,29 144 TRANS TCAP AR HO NON c.255C>A P - - - 0.9945 4,55 146 ISODISO MIA MAT TTN AR HE FS c.38661_38665del LP LP - - - 3,67 195 DN TAZ XLR HE MISS c.527A>G LP - - - 0.9973 5,54 197 DN KBTBD13 AD HT MISS c.290T>C LP VUS/LP rs767384093 0.000074 0.9945 4,36 211 TRANS CAPN3 AR HT C FS c.1962delC P LP - - - 5,05 211 TRANS CAPN3 AR HT C MISS c.2120A>G LP P/LP rs200379491 0.000151 0.9986 5,01 255 DN MYH7 AD HT MISS c.1606G>A LP - - - 0.9994 4,86 ANEXOS 325 282 TRANS SIGMAR1 AR HO CNV _DE L g.(?_34635615)_(3 4635855_?)del - - - - - - 299 PAT TTN AD, AR HT C NON c.3034C>T P LP rs397517547 0.000004 0.9973 3,03 299 MAT TTN AD, AR HT C SPL c.106531+1G>A P LP rs760915007 0.000005 0.9916 5,61 325 TRANS SYNE1 AR HO SPL c.26095-1G>T P - - - 0.9945 4,54 343 MAT TTN AD, AR HT C NON c.33064C>T P - rs747806875 0.000004 0.9939 4,29 343 PAT TTN AD, AR HT C MISS c.102941G>A LP - - - 0.9483 5,60 358 MAT SGCA AR HT C MISS c.724G>T LP LP rs200166783 0.000004 0.9835 -0,28 358 PAT SGCA AR HT C MISS c.739G>A LP P/LP rs143570936 0.000112 0.9987 3,85 361 TRANS SH3TC2 AR HO NON c.3325C>T P P rs80338934 0.000039 0.9696 1,66 373 TRANS IGHMBP2 AR HT C MISS c.181G>A LP LP/VUS rs105751894 3 - 0.9993 3,63 373 TRANS IGHMBP2 AR HT C MISS c.1327C>T LP LP rs751549678 0.000012 0.9994 4,92 431 PAT DPAGT1 AR HT C MISS c.1150C>G LP - - - 0.9759 1,45 431 MAT DPAGT1 AR HT C MISS c.574G>C LP - rs768464558 0.000004 0.9994 5,63 529 DN MPZ AD HT SPL c.369C>T LP - - - 0.99 4,76 543 TRANS SGCG AR HO MISS c.848G>A LP LP rs104894422 0.000004 0.995 5,41 565 DN COL6A3 AD, AR HT SPL c.6210+5G>A LP - - - 0.9417 4,70 635 MAT SH3TC2 AR HT C NON c.2860C>T P P rs80338933 0.000748 0.9964 4,13 635 PAT SH3TC2 AR HT C FS c.2640delC P LP - - - 6,16 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 326 637 TRANS Y HNO PORTAD OR HINT1 AR HO MISS c.110G>C LP P rs149782619 0.00026 0.9914 -0,94 766 DN MFN2 AD, AR HT MISS c.326A>G LP VUS - - 0.999 5,63 798 ND DMD XL HE MISS c.9622A>G LP - - - 0.9991 5,21 800 ND GJB1 XL HE MISS c.547C>T LP LP rs863224471 - 0.9992 4,99 850 ND DMD XL HE SPL c.9563+1G>A P P rs886043989 - 0.9948 4,91 876 DN KBTBD13 AD HT MISS c.244G>A LP P rs130341120 9 0.000009 0.9982 3,66 880 DN DMD XL HT FS c.5697dupA P P - - - 6,06 908 DN DNM2 AD, AR HT MISS c.1856C>T LP P/LP rs121909095 - 0.9992 4,92 988 TRANS Y HNO PORTAD OR SGCG AR HO FS c.525delT P P rs786204786 /rs11942837 47 0.000056 - 4,60 1203 ND DMD XL HE CNV _DE L g.(?_32404402)_(3 2503241_?)del - - - - - - Panel de Enfermedades Neuromusculares - Pacientes con Diagnóstico NO concluyente Paciente Estudio familiar Gen H Alel o Tipo Proteína ACMG ClinVar dbSNP GnomAD DANN GERP ANEXOS 327 10 PAT MYH7 AD HT MISS c.4421C>A VUS - - - 0.9985 5.27 35 ND SCN4A AD HT MISS c.4774A>G LP P rs80338962 - 0.9953 3,91 50 PAT Y HNO COL6A1 AD, AR HT FS c.2166_2167in sC P - - - - 4,97 133 ND COL6A1 AD HT MISS c.868G>A P P rs121912939 - 0.9992 4,58 185 PAT RYR1 AR HT MISS c.2709C>G LP - rs100763740 5 0.000008 0.9812 2,97 209 PAT COL6A2 AD, AR HT NON c.1806C>A P LP rs751987553 - 0.9844 4,51 249 MAT MYH2 AD, AR HT MISS c.4205G>A VUS - rs781252325 0.000016 0.9995 5,03 280 ND REEP1 AD HT MISS c.349G>C VUS - - - 0.9975 5,93 283 ND RYR1 AD, AR HT SPL c.10347+1G>A P LP rs111436401 0.000004 0.9918 2,94 303 ND CAPN3 AD HT FS c.2361_2362in sTCAT P - - - - 326 MAT NO, FALTA PAT REEP1 AD HT MISS c.164C>T VUS - - - 0.9959 5,42 338 MAT NO, FALTA PAT, HNOS NO PORTAD OES DN?¿ CHRNB1 AD HT MISS c.309C>G VUS - rs370657868 0.000004 0.9891 -2,02 349 MAT GDAP1 AR HT NON c.487C>T P P rs104894077 0.000076 0.9984 5,23 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 328 375 PAT INF2 AD HT FS c.1580_1581in sC LP - - 0.000021 - 3,71 387 ND CLCN1 AD, AR HT MISS c.2234A>G VUS VUS rs144612641 0.000426 0.9967 4,34 465 ND LAMA2 AR HT MISS c.149C>T LP LP rs191899712 0.00004 0.9991 5,44 465 ND LAMA2 AR HT SPL C.8075+1G>A P LP rs105540785 7 - 0.9955 5,42 507 ND RYR1 AD, AR HT NON c.4837C>T P LP rs133237189 1 - 0.9983 3,89 507 ND RYR1 AD, AR HT MISS c.13672C>T LP LP rs771741606 0.000004 0.978 1,49 507 ND RYR1 AD, AR HT MISS c.7027G>A LP LP rs536596969 0.000024 0.9937 3,69 509 ND ACTA1 AR HT MISS c.529A>G LP LP - - 0.9495 4,58 509 ND ACTA1 AR HT SPL C.809-2A>T P P rs130190245 0.000004 0.9929 4,33 596 ND COL12A 1 AD, AR HT MISS c.8215T>C VUS - rs376478905 0.000008 0.9888 5,62 596 ND COL12A 1 AD, AR HT NON c.6995G>A P - rs971696892 - 0.9964 5,76 620 ND STIM1 AD HT MISS c.247G>T VUS - rs134460816 2 0.000004 0.9979 5,76 630 ND TTN AR HT NON c.38737G>T P LP rs767120669 0.000008 0.5786 3,74 630 ND TTN AR HT FS c.87019_87022 del P LP - - - 4,61 749 ND DST AR HT SYN c.822A>G VUS - - - 0.8517 4,99 749 ND DST AR HT MISS c.4777A>C VUS - rs202229877 0.000008 0.8349 2,91 790 ND COL6A2 AD, AR HT MISS c.875G>A LP - - - 0.9966 4,26 793 MAT TRAPPC 11 AR HT SPL C.1568-1G>A P LP - - 0.995 5,89 ANEXOS 335 Panel Individual vs NeuroExoma - Pacientes con Diagnóstico positivo Paciente Estudio familiar Gen H Alelo Tipo Proteína ACMG ClinVar dbSNP GnomAD DANN GERP 38 TRANS PCCA AR HT C SPL - VUS - - - 0.8494 5.03 38 TRANS PCCA AR HT C MISS p.Ala310Gly VUS - rs146927771 0.000705 0.9915 5.55 41 PAT KCNT1 AD HT C MISS p.Arg262Gln LP LP - - 0.9995 4,87 41 DN KCNT1 AD HT C SPL - P - - - 0.9908 5,24 67 TRANS SLC13A5 AR HT C MISS p.Pro505Leu VUS - rs936922976 - 0.9988 5,15 67 TRANS SLC13A5 AR HT C FS p.Leu504fs P LP rs121177337 2 - - 5,15 76 DN SYNGAP 1 AD HT NON p.Glu422* LP - - - - 4,80 109 DN KCNB1 AD HT MISS p.Trp369Cys LP - - - 0.9906 6,02 164 DN SLC9A6 XLD HT NON p.Ser534* P - - - 0.9949 5,36 165 DN TCF4 AD HT MISS p.Arg671Trp LP P - - 0.9992 3,92 201 DN DNM1 AD HT MISS p.Gly38Ser LP LP rs113169202 5 - 0.9986 1,83 289 DN CSNK2B AD HT NON p.Gln42* LP - - - - 315 DN SLC16A2 XLD HE FS p.(Glu34*) LP - - - - 317 DN GNAO1 AD HT MISS p.Gly203Arg VUS P rs587777057 - 0.9992 5,28 351 ND SBF2 AR HO SPL p.Ala794Ser VUS - - - 0.9897 5,63 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 336 363 PAT Y HNA TSC2 AD HT MISS p.Glu1213Lys VUS - - - 0.9991 3,74 392 DN 11/NE GNAO1 AD HT SPL - P - - - 0.9946 5,29 393 MAT LIPT1 AR HT C MISS p.Ser71Phe LP P rs767568897 0.000088 0.998 4,91 393 PAT LIPT1 AR HT C MISS p.Arg98Trp LP - rs137973334 0.000004 0.9989 4,00 499 PAT ALMS1 AR HT C NON p.Ser2529* P - - - 0.9961 4,47 499 MAT ALMS1 AR HT C NON p.Gln3673* P - - - 0.9929 5,09 571 DN KCNQ2 AD HT MISS p.Arg210His LP P rs886041262 - 0.9995 4,05 684 DN GNAO1 AD HT MISS p.Glu237Lys LP LP rs106479453 3 - 0.9993 5,29 704 DN KCNQ2 AD HT MISS p.Ile278Thr LP LP rs105752372 8 - 0.9971 4,00 774 TRANS FLVCR1 AR HO MISS p.Ala241Thr LP P rs267606819 - 0.9989 5,21 906 MAT POLR3A AR HT C SPL - P - - - 0.9938 5,49 906 PAT POLR3A AR HT C SPL - LP VUS/LP rs201314157 0.000107 0.6128 2,87 912 DN STAG1 AD HT NON p.Leu762* P - - - 0.993 6,01 990 PAT PRKRA AR HT C MISS p.Pro222Leu LP P rs121434410 0.000099 0.965 3,93 990 MAT PRKRA AR HT C MISS p.Pro153Ser LP - - - 0.9989 4,77 991 TRANS ATPAF2 AR HO SPL - P LP rs147941728 0.000028 0.9884 4,63 991 TRANS NAGS AR HO MISS p.Val239Ile LP - rs143427275 0.000044 0.9888 3,85 1024 TRANS HEXA AR HO MISS p.Arg178His LP P rs28941770 0.000048 0.9994 5,44 1082 MAT LRPPRC AR HT C SYN p.Ile560Leu VUS VUS rs144826521 0.000685 0.9776 5,88 1082 PAT LRPPRC AR HT C SPL - VUS - rs568212653 0.000048 0.9076 5,41 ANEXOS 337 1156 DN SLC6A1 AD HT MISS p.Phe385Leu LP - - - 0,9972 5,57 Panel Individual vs NeuroExoma - Pacientes con Diagnóstico NO concluyente Paciente Estudio familiar Gen H Alel o Tipo Proteína ACMG ClinVar dbSNP GnomAD DANN GERP 42 ND MTO1 AR HT MISS p.Arg464Cys VUS - rs145925279 6 0.000004 0.9995 5.48 126 ND GFM2 AR HT MISS p.Glu642Ala VUS - - - 0.8395 4.53 126 ND GFM2 AR HT MISS p.Phe641Tyr VUS - rs76339998 - 0.6827 3,31 150 MAT Y HNO KCNQ2 AD HT MISS p.Ala747Val VUS - rs124483819 8 0.000008 0.9822 3,14 150 PAT Y HNO SCN3A AD HT MISS p.Leu1938Se r VUS - rs130408205 5 0.000004 0.8581 6,03 151 ND ZEB2 AD HT NONF S p.Gly1068_S er 1069del LP VUS - - - 5,51 203 ND PDHA1 XL HT FS p.Leu193fs LP - - - - 5,28 204 MAT HCN1 AD HT MISS p.Gly44Arg VUS - rs142197526 9 - 0.9973 3,23 253 ND ZNF41 XL HEM Y MISS p.Phe686Ser VUS - - - 0.9986 3,69 278 ND ARID1B AD HT SPL P - - - 0.9949 5,56 374 ND COL4A1 AD HT MISS p.Gly969Glu LP - - - 0.9982 391 ND ATAD3C - HT CNV_ DEL - - - - - - - 391 ND ATAD3C - HT CNV_ DEL - - - - - - - 464 ND WAC AD HT MISS p.Pro528Leu VUS - rs772980873 - 0.9988 5,51 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 338 535 ND ATP13A2 AR HT MISS p.Val105Ile VUS - rs119066730 1 0.000008 0.9669 3,45 535 ND ATP13A2 AR HT MISS p.Ala249Val VUS VUS rs145515028 0.000738 0.9017 -8,40 705 MADRE NO PORTAD ORA FALTA PADRE SLC6A1 AD HT MISS p.Thr349Ala VUS - - - 0.9977 5,25 1041 ND ALG1 AR HT MISS p.Arg276Trp VUS LP rs151173406 0.000008 0.9989 4,36 1081 PAT BSCL2 AD HT MISS p.Gln14Lys VUS - - - 0.9931 5,05 1084 PAT, TIO, ABUELA MTOR AD HT MISS p.Lys42Asn VUS - - - 0.9973 4,78 ANEXOS 339 9.38.5. TABLA DE GENES CON REFSEQ CORRESPONDIENTE GENE REFSEQ GENE REFSEQ GENE REFSEQ GENE REFSEQ ABCC8 NC_000011.9 DCX NM_000555.3 KCNT1 NM_020822.3 SCN1A NM_001165963.1 ABCC8 NM_001287174.1 DDX3X NM_001356.4 KIF11 NM_004523.4 SCN1A NC_000002.11 ACAD9 NM_014049.5 DEPDC5 NM_014662.5 KIF1A NM_004321.7 SCN1B NM_199037.5 ACTA1 NM_001100.3 DEPDC5 NC_000022.11 KNL1 NM_170589.4 SCN2A NC_000002.11 ADCK4 NM_024876.4 DHDDS NM_024887.3 L1CAM NM_000425.4 SCN2A NM_021007.2 ADGRG1 NM_001145771.2 DMD NM_004006.2 LAMA2 NM_000426.3 SCN3A NM_006922.4 ADNP NM_001282531.1 DMD NC_000023.10 LETM1 NM_012318.2 SCN4A NM_000334.4 ADSL NM_000026.3 DNM1 NM_004408.3 LIPT1 NM_001204830.1 SCN8A NM_014191.3 AGK NM_018238.3 DNM1L NM_005690.4 LMNB1 NM_005573.3 SCN9A NM_002977.3 AGL NM_000642.2 DNM2 NM_001005360.2 LRPPRC NM_133259.3 SCN9A NC_000002.11 AHDC1 NM_001029882.3 DPAGT1 NM_001382.4 LZTR1 NM_006767.3 SERPINI1 NM_005025.4 AKT2 NM_001626.6 DST NM_001723.5 MCCC2 NM_022132.5 SETBP1 NM_015559.3 ALDOB NM_000035.3 DYNC1H1 NM_001376.4 MECP2 NM_004992.3 SETD5 NM_001080517.2 ALG1 NM_019109.4 EARS2 NM_001083614.1 MED17 NM_004268.5 SGCA NM_000023.4 ALMS1 NM_015120.4 EFHC1 NM_018100.3 MEF2C NM_001193347.1 SGCE NM_003919.3 AMT NM_000481.3 EFTUD2 NM_004247.3 MFN2 NM_014874.3 SGCG NM_000231.2 ANO10 NM_018075.3 EPB41L1 NC_000020.10 MOCOS NM_017947.3 SGSH NM_000199.3 ANO3 NM_031418.2 ETFDH NM_004453.4 MOCS2 NM_176806.3 SH3TC2 NM_024577.3 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 340 ARFGEF2 NM_006420.3 FARS2 NM_006567.3 MPZ NM_000530.8 SHH NM_000193.3 ARHGEF15 NM_025014.1 FARS2 NC_000006.11 MTO1 NM_012123.3 SIGMAR1 NC_000009.11 ARHGEF9 NM_015185.2 FBN1 NM_000138.4 MTOR NM_004958.3 SLC12A5 NM_020708.4 ARID1B NM_020732.3 FBXL4 NM_012160.3 MYH2 NM_017534.6 SLC13A5 NM_177550.4 ARX NM_139058.3 FGF12 NM_021032.4 MYH7 NM_000257.4 SLC16A2 NM_006517.4 ASPM NM_018136.5 FKRP NM_001039885.2 NAGLU NM_000263.3 SLC17A5 NM_012434.4 ATM NM_000051.3 FLAD1 NM_025207.4 NAGS NM_153006.2 SLC22A5 NM_003060.4 ATP13A2 NM_022089.3 FLNA NM_001456.3 NALCN NM_052867.2 SLC2A1 NM_006516.2 ATPAF2 NM_145691.3 FLVCR1 NM_014053.3 NDUFAF2 NM_174889.5 SLC35A2 NM_001282651.1 AUTS2 NM_015570.3 FMO3 NM_001002294.2 NDUFB11 NM_019056.6 SLC37A4 NM_001164278.1 BBS1 NM_024649.4 FOXG1 NM_005249.5 NDUFS2 NM_004550.4 SLC52A2 NM_001253815.1 BBS10 NM_024685.4 FOXRED1 NM_017547.3 NEDD4L NM_015277.5 SLC6A1 NM_003042.3 BBS12 NM_152618.3 FREM1 NM_144966.5 NPRL2 NM_006545.4 SLC6A8 NM_005629.4 BBS7 NM_176824.2 GAA NM_000152.4 NPRL3 NM_001077350.2 SLC9A6 NM_001042537.1 BCS1L NM_004328.4 GABBR2 NM_005458.7 OFD1 NM_003611.2 SMARCA1 NM_001282874.1 BRAT1 NM_152743.3 GABRB1 NM_000812.3 OPA1 NM_130834.2 SNAP29 NC_000022.11 BSCL2 NM_032667.6 GABRG2 NM_198903.2 PACS1 NM_018026.3 SPG7 NM_003119.3 C12orf65 NM_152269.4 GALT NM_000155.4 PAFAH1B1 NC_000017.10 SPTAN1 NM_001130438.2 CACNA1A NM_023035.2 GBA NM_000157.3 PAH NM_000277.1 SRGAP2 NC_000001.10 CACNA1D NM_000720.3 GDAP1 NM_018972.3 PCCA NM_000282.4 SRPX2 NM_014467.3 ANEXOS 341 CACNA1H NM_021098.3 GFM1 NM_024996.5 PCDH19 NM_020766.2 STAG1 NM_005862.2 CACNA2D1 NM_000722.3 GFM2 NM_001281302.1 PDHA1 NM_000284.3 STIM1 NM_003156.3 CAMTA1 NM_015215.3 GJB1 NM_000166.6 PDX1 NM_000209.3 STXBP1 NM_003165.3 CAPN3 NM_000070.2 GLDC NM_000170.2 PET100 NM_001171155.1 SUCLA2 NM_003850.2 CASC5 NM_170589.4 GLUD1 NM_005271.5 PEX12 NM_000286.2 SYN1 NM_006950.3 CASK NC_000023.10 GNAO1 NM_138736.2 PHKA2 NM_000292.2 SYNE1 NM_182961.3 CASR NM_001178065.1 GNAO1 NM_020988.2 PHKB NM_000293.2 SYNGAP1 NM_006772.2 CCND2 NM_001759.4 GNB1 NM_001282539.1 PIK3CA NM_006218.4 SYNJ1 NM_003895.3 CDH15 NM_004933.2 GNE NM_005476.3 PIK3R2 NM_005027.4 TALDO1 NM_006755.1 CDK5RAP2 NM_018249.5 GNPTAB NM_024312.5 PLA2G6 NM_003560.2 TAZ NM_000116.5 CDKL5 NM_003159.2 GPHN NC_000014.8 PLOD1 NM_000302.4 TBC1D24 NM_020705.2 CEL NM_001807.5 GPHN NM_020806.4 PNKP NM_007254.2 TCAP NM_003673.3 CEP290 NM_025114.3 GRIA4 NM_001077243.2 PNPT1 NM_033109.5 TCF4 NM_001243226.2 CHD1 NM_001270.2 GRIK2 NC_000006.11 POLG2 NM_007215.4 TCN2 NC_000022.10 CHRNA4 NM_000744.6 GRIN2A NM_000833.3 POLR3A NM_007055.3 TMEM70 NM_017866.5 CHRNB1 NM_000747.2 GRIN2B NM_000834.3 POLR3B NM_018082.6 TNXB NM_019105.6 CHRNE NM_000080.3 GYG1 NM_004130.2 POLRMT NM_005035.3 TPM2 NM_213674.1 CLCN1 NM_000083.2 HCN1 NM_021072.3 PPP2R1A NM_014225.5 TPP1 NM_000391.4 CLCN2 NM_004366.6 HECW2 NM_020760.2 PPT1 NM_000310.3 TRAPPC11 NM_021942.5 CLCN4 NM_001830.3 HEXA NM_000520.6 PRKRA NM_003690.4 TREX1 NM_033629.6 SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 342 CLN6 NM_017882.3 HINT1 NM_005340.6 PRODH NM_016335.4 TSC2 NM_000548.4 CNTNAP2 NM_014141.5 HIVEP2 NM_006734.3 PROSC NM_007198.3 TSEN2 NM_025265.3 COL12A1 NM_004370.6 HNRNPU NM_004501.3 PRRT2 NC_000016.10 TSEN54 NM_207346.2 COL1A2 NM_000089.3 HPCA NM_002143.2 PRRT2 NM_145239.3 TSFM NM_005726.6 COL4A1 NM_001845.6 HPRT1 NM_000194.3 PTPN11 NM_002834.3 TTC8 NC_000014.9 COL6A1 NM_001848.2 HSD17B4 NM_000414.4 PURA NM_005859.4 TTN NM_001267550.2 COL6A2 NM_001849.3 IDH2 NM_002168.3 PYGL NM_002863.4 TUBB2A NM_001069.2 COL6A3 NM_004369.3 IGHMBP2 NM_002180.2 RBFOX1 NC_000016.9 TUBB2B NM_178012.5 COQ4 NM_016035.4 IL1RAPL1 NC_000023.10 RBFOX1 NM_145891.2 TUBGCP6 NM_020461.3 COX15 NM_004376.5 INF2 NM_001031714.3 REEP1 NM_022912.2 UMPS NM_000373.4 CPA6 NM_020361.4 ITPR1 NM_002222.5 RELN NM_005045.3 UPB1 NM_016327.2 CPLANE1 NM_023073.3 JRK NM_003724.3 RFT1 NM_052859.3 WAC NM_016628.4 CPS1 NM_001875.4 KBTBD13 NM_001101362.2 RHOBTB2 NM_001160036.1 WDR19 NM_025132.3 CSNK2B NM_001320.6 KCNA2 NM_004974.3 RNASEH2B NM_024570.3 YARS NM_003680.3 CSPP1 NM_024790.6 KCNB1 NM_004975.3 RRM2B NM_015713.4 ZEB2 NM_014795.3 CTBP1 NM_001328.2 KCNC1 NM_001112741.1 RYR1 NM_000540.2 ZIC2 NM_007129.3 CTSA NM_000308.3 KCND3 NM_004980.4 RYR3 NM_001036.5 ZMYM3 NM_005096.3 CUL4B NM_003588.3 KCNQ2 NM_172107.3 SACS NC_000013.10 ZMYND11 NM_006624.5 CYC1 NM_001916.4 KCNQ3 NM_004519.4 SBF2 NM_030962.3 ZNF41 NM_001324155.1 DARS2 NM_018122.4 KCNQ5 NM_001160133.1 SCN10A NM_006514.3 ANEXOS 343 9.38.6. DISEÑO PANELES GENÉTICOS Panel de Hipo/Hiperglucemia ABCC8 AKT2 ALMS1 APPL1 ASXL2 BLK BSCL2 CAPN10 CDKAL1 CEL DIS3L2 ENPP1 GCGR GCK GLIS3 GLUD1 GPD2 HADH HMGA1 HNF1A HNF1B HNF4A IGF2BP2 IL6 INS INSR IRS1 IRS2 KCNJ11 KLF11 LEP LEPR LIPC LMNA MAFA MAPK8IP1 MC4R MEN1 MPI MTNR1B NEUROD1 NSD1 PAX4 PCSK1 PDX1 PGM1 PLAGL1 PLIN1 POMC PPARG PPP1R3A PTPN1 PYGL RETN SH2B1 SIM1 SLC16A1 SLC2A1 SLC2A2 SLC30A8 SLC5A1 TCF7L2 UBE3B UCP2 UMOD WFS1 ZFP57 Panel de Defectos en el Metabolismo Intermediario ABCD4 ACADM ACADS ACADSB ACADVL ACAT1 ACAT2 ACSF3 ADA ADK ADSL AGL AGXT AGXT2 AHCY ALDH4A1 ALDH5A1 ALDH6A1 ALDOB AMT APRT ARG1 ASL ASS1 AUH BCKDHA BCKDHB BTD C2ORF25 C7ORF10 CBS CD320 CLPB CLPX CPS1 CPT1A CPT2 CTH D2HGDH DBT DHTKD1 DLD DNAJC12 DNAJC19 DPYD DPYS ETFA ETFB ETFDH ETHE1 FAH FBP1 FH FMO3 FTCD G6PC GALE GALK1 GALT GBE1 GCDH GCH1 GCSH GGT1 GLDC GLUL GLYCTK GNMT GPHN GRHPR GSTZ1 GYS2 HADHA HADHB HAL HCFC1 HGD HLCS HMGCL HMGCS2 HOGA1 HPD HPRT1 HSD17B10 HTRA2 IDH2 IVD L2HGDH LMBRD1 MAT1A MCCC1 MCCC2 MCEE MDH1 MLYCD MMAA MMAB MMACHC MMADHC MOCOS MOCS1 MOCS2 MTHFR MTR MTRR MUT NAGS NT5C3A OAT OGDH OPA3 OTC OXCT1 PAH PC PCBD1 PCCA PCCB PCK1 PCK2 PEPD PGM1 PHKA2 PHKB PHKG2 PKLR PMM2 PNP PRODH PRPS1 PTS PYGL QDPR SERAC1 SLC1A1 SLC22A5 SLC25A1 SLC25A13 SLC25A15 SLC25A20 SLC2A2 SLC37A4 SLC46A1 SLC52A1 SLC6A19 SLC6A9 SUCLA2 SUCLG1 SUOX TAT TAZ TCN2 TIMM50 UMPS UPB1 XDH SOFIA ISABEL BARBOSA SOUSA GOUVEIA 344 Panel de Enfermedades Mitocondriales AARS2 ABCB11 ACAD8 ACAD9 ACO2 ADCK1 ADCK2 ADCK3 ADCK4 ADCK5 ADSL AFG3L2 AGK AIFM1 AKR1B15 APOPT1 APTX ATAD1 ATAD3A ATP5A1 ATP5B ATP5C1 ATP5D ATP5E ATP5F1 ATP5F1D ATP5G1 ATP5G2 ATP5G3 ATP5O ATPAF1 ATPAF2 BCS1L BOLA3 C10ORF2 C12ORF65 C19ORF12 C1QBP CA5A CARS2 CCDC88A CEP89 CHCHD10 CLPB CLPP COA5 COA6 COA7 COQ10A COQ10B COQ2 COQ3 COQ4 COQ5 COQ6 COQ7 COQ9 COX10 COX11 COX14 COX15 COX16 COX17 COX18 COX19 COX4I1 COX4I2 COX6A1 COX6A2 COX6B1 COX6B2 COX7B COX8A CPS1 CYC1 CYCS DARS2 DEAF1 DGUOK DLAT DLD DNA2 DNAJC19 DNM1L E4F1 EARS2 ECHS1 ELAC2 ETHE1 FAM36A FARS2 FARSB FASTKD2 FBXL4 FDX1L FH FLAD1 FOXRED1 GARS GFER GFM1 GFM2 GLRX5 GOT2 GPT2 GTPBP3 GYG2 HARS2 HCCS HIBCH HSD17B10 HSD17B4 HSPD1 HSPE1 HTRA2 IARS IARS2 IBA57 ISCA1 ISCA2 ISCU ITPA KARS LARS2 LETM1 LGI1 LIAS LIPT1 LIPT2 LONP1 LRP4 LRPPRC LYRM4 LYRM7 MARS2 MDH2 MECP2 MFF MFN1 MFN2 MGME1 MICU1 MIPEP UQCC2 MPV17 MRPL12 MRPL3 MRPL44 MRPS16 MRPS22 MRPS23 MRPS34 MRPS7 MTCH1 MTERF1 MTFMT MTHFD1L MTO1 MTPAP NADK2 NARS2 NAT8L NAXE NDUFA1 NDUFA10 NDUFA11 NDUFA12 NDUFA13 NDUFA2 NDUFA3 NDUFA4 NDUFA4L2 NDUFA5 NDUFA9 NDUFAF1 NDUFAF2 NDUFAF3 NDUFAF4 NDUFAF5 NDUFAF6 NDUFB1 NDUFB10 NDUFB11 NDUFB2 NDUFB3 NDUFB4 NDUFB5 NDUFB6 NDUFB7 NDUFB8 NDUFB9 NDUFS1 NDUFS2 NDUFS3 NDUFS4 NDUFS5 NDUFS6 NDUFS7 NDUFS8 NDUFV1 NDUFV2 NDUFV3 NFS1 NFU1 NUBPL OPA1 OPA3 PARS2 PC PCK2 PDHA1 PDHA2 PDHB PDHX PDK3 PDP1 PDP2 PDSS1 PDSS2 PET100 PET117 PGAP2 PIGN PMPCB PNPLA4 PNPLA8 PNPT1 POLG POLG2 POLRMT PTCD1 PUS1 QRSL1 RANBP2 RARS2 RERE RMND1 RNASEH1 RPIA RRM2B RTN4IP1 SARS SARS2 SCO1 SCO2 SDHA SDHAF1 SDHAF2 SDHB SDHC SDHD SERAC1 SFXN4 SLC19A3 SLC25A12 SLC25A19 SLC25A26 SLC25A3 SLC25A4 SLC25A42 SLC25A46 SLC52A2 SLC6A8 SLC6A9 SPG20 SPG7 SUCLA2 SUCLG1 SURF1 TACO1 TANGO2 TARS2 TAZ TAZ TBCD TBCE TFAM TIMM8A TK2 TKT TMEM126A TMEM126B TMEM70 TOP3A TPK1 TRAK1 TRIT1 TRMT10C TRMT5 TRMU TRNT1 TSFM TTC19 TUBB TUBB6 TUFM TXN2 TYMP UPB1 UQCC3 UQCR10 UQCR11 UQCRB UQCRC1 UQCRC2 UQCRFS1 UQCRH UQCRHL UQCRQ VAC14 VARS2 VDAC1 VDAC2 WARS2 YARS2 YME1L1 ANEXOS 351