Estudio de la microbiota asociada a almeja fina (Ruditapes decussatus) y almeja japonesa (Ruditapes philippinarum) mediante técnicas de secuenciación masiva

TESIS DE DOCTORADO Estudio de la microbiota asociada a almeja fina (Ruditapes decussatus) y almeja japonesa (Ruditapes philippinarum) mediante técnicas de secuenciación masiva Diego Gerpe Pazos ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL PROGRAMA DE DOCTORADO EN AVANCES EN BIOLOGI A MICROBIANA Y PARASITARIA SANTIAGO DE COMPOSTELA 2019 DECLARACIÓN DEL AUTOR DE LA TESIS Estudio de la microbiota asociada a almeja fina (Ruditapes decussatus) y almeja japonesa (Ruditapes philippinarum) mediante técnicas de secuenciación masiva. D. Diego Gerpe Pazos, Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo 2) En su caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide con la versión enviada en formato electrónico. 4) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de autores ni trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos En Santiago de Compostela, 7 de noviembre de 2019 Fdo. Diego Gerpe Pazos AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR / TUTOR DE LA TESIS Estudio de la microbiota asociada a almeja fina (Ruditapes decussatus) y almeja japonesa (Ruditapes philippinarum) mediante técnicas de secuenciación masiva. D. Jesús López Romalde INFORMA: Que la presente tesis, corresponde con el trabajo realizado por D. Diego Gerpe Pazos, bajo mi dirección, y autorizo su presentación, considerando que reúne los requisitos exigidos en el Reglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director de ésta no incurre en las causas de abstención establecidas en Ley 40/2015. En Santiago de Compostela, 7 de noviembre de 2019 Fdo. Jesús López Romalde DECLARACIÓN DE CONFLICTOS DE INTERESES Estudio de la microbiota asociada a almeja fina (Ruditapes decussatus) y almeja japonesa (Ruditapes philippinarum) mediante técnicas de secuenciación masiva. D. Diego Gerpe Pazos, Declara: 1) No tener ningún conflicto de intereses relevante en lo que concierne al contenido presentado en la tesis doctoral. 2) Que parte de los estudio aquí presentados se basan en información ya existentes, que no contiene datos de carácter personal, y por tanto el estudio no necesita la evaluación e informe previo del comité de ética de la investigación En Santiago de Compostela, 7 de noviembre de 2019. Fdo. Diego Gerpe Pazos A mis abuelas 16 RLO: Organismos tipo Rickettsia (Rickettsia like organisms). ROD: enfermedad de la ostra por Roseovarius (Roseovarius oyster disease). SMRT: moléculas individuales a tiempo real (Single-molecule real-time). TAE: tampon Tris-Acetato-EDTA. TCBS: Tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa. ÍNDICE 17 ÍNDICE RESUMEN .............................................................................................................................. 21 RESUMO ................................................................................................................................. 23 SUMMARY ............................................................................................................................. 25 1 INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 29 1.1 LA ACUICULTURA. ................................................................................................. 29 1.1.1 Producción de moluscos ...................................................................................... 29 1.1.2 Cultivo de almejas ............................................................................................... 31 1.2 LA ALMEJA ............................................................................................................... 32 1.2.1 Anatomía. ............................................................................................................ 32 1.2.2 Ciclo biológico .................................................................................................... 34 1.2.3 Características diferenciales entre la almeja fina y la almeja japonesa ............... 36 1.3 LA MICROBIOTA ASOCIADA A ALMEJA ......................................................... 37 1.3.1 Microbiota general .............................................................................................. 37 1.3.2 Microorganismos patógenos ............................................................................... 40 1.3.2.1 Parásitos ..................................................................................................... 40 1.3.2.2 Virus ........................................................................................................... 42 1.3.2.3 Bacterias ..................................................................................................... 43 1.3.2 Microorganismos probióticos .............................................................................. 50 1.4 NUEVAS TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN ....................................................... 52 1.4.1 Secuenciación masiva del gen ARNr 16S ........................................................... 52 1.4.1 Secuenciación del genoma bacteriano ................................................................. 57 1.4.1.1 Análisis comparativo de genomas ............................................................. 57 2 OBJETIVOS ....................................................................................................................... 63 3 ESTUDIO DE LA MICROBIOTA ASOCIADA A ALMEJA FINA Y JAPONESA MEDIANTE SECUENCIACIÓN MASIVA DEL GEN ARNr 16S........ 67 3.1 MATERIAL Y MÉTODOS ....................................................................................... 67 3.1.1 Muestreo y procesado de las muestras ................................................................ 67 3.1.2 Amplificación y secuenciación ........................................................................... 68 3.1.3 Análisis bioinformático ....................................................................................... 69 3.1.3.1 Análisis de las secuencias .......................................................................... 69 3.1.3.2 Análisis taxonómico .................................................................................. 71 3.1.3.3 Análisis de diversidad. ............................................................................... 71 3.2 RESULTADOS ........................................................................................................... 73 3.2.1 Resultados de la secuenciación ........................................................................... 73 3.2.2 Microbiota asociada a Ruditapes philippinarum y Ruditapes decussatus .......... 74 3.2.2.1 Microbiota de almeja japonesa (R. philippinarum) ................................... 75 DIEGO GERPE PAZOS 18 3.2.2.2 Microbiota de almeja fina (R. decussatus) ................................................ 78 3.2.2.3 Análisis de la diversidad ........................................................................... 82 3.2.3 Estudio de la microbiota asociada a los diferentes órganos de Ruditapes philippinarum y Ruditapes decussatus ............................................................... 83 3.2.3.1 Microbiota asociada a los órganos de almeja japonesa (R. philippinarum). .......................................................................................... 86 3.2.3.2 Microbiota asociada a los órganos de almeja fina (R. decussatus). .......... 92 3.2.3.3 Comparativa entre la microbiota asociada a los diferente órganos de almeja fina y japonesa ............................................................................... 97 3.2.3.4 Análisis de diversidad entre órganos. ........................................................ 98 3.3 DISCUSIÓN .............................................................................................................. 102 4 ESTUDIO DE LA MICROBIOTA CULTIVABLE ASOCIADA A ALMEJA FINA Y JAPONESA MEDIANTE LA TÉCNICA DE DILUCIÓN A EXTINCIÓN .................................................................................................................... 111 4.1 MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................................... 112 4.1.1 Muestreo ........................................................................................................... 112 4.1.2 Procesado de las muestras ................................................................................ 112 4.1.2.1 Técnica de dilución a extinción. .............................................................. 112 4.1.2.2 Metodología clásica. ................................................................................ 113 4.1.3 Extracción de ADN cromosómico .................................................................... 113 4.1.4 Amplificación y secuenciación del gen 16S ARNr. ......................................... 114 4.1.5 Análisis filogenético ......................................................................................... 115 4.2 RESULTADOS ......................................................................................................... 115 4.2.1 Dilución a extinción .......................................................................................... 115 4.2.2 Metodología clásica .......................................................................................... 118 4.2.3 Géneros comunes .............................................................................................. 119 4.3 DISCUSIÓN .............................................................................................................. 120 5 DESCRIPCIÓN DE NUEVOS TAXONES BACTERIANOS DEL GÉNERO RAHNELLA A PARTIR DE ALMEJA FINA Y JAPONESA .................................... 127 5.1 MATERIAL Y MÉTODOS. ................................................................................... 128 5.1.1 Origen aislados y condiciones de cultivo ......................................................... 128 5.1.2 Caracterización bioquímica. ............................................................................. 128 5.1.2.1 Metodología clásica. ................................................................................ 128 5.1.2.2 Sistemas miniaturizados .......................................................................... 133 5.2.1 Análisis del gen 16S ARNr ............................................................................... 134 5.2.1.1 Extracción y amplificación y secuenciación ........................................... 134 5.2.1.2 Análisis Filogenético. .............................................................................. 134 5.2.2 Secuenciación del genoma completo. ............................................................... 135 5.2.2.1 Extracción del ADN. ............................................................................... 135 5.2.2.2 Ensamblaje y análisis de los genomas ..................................................... 135 5.3 RESULTADOS. ........................................................................................................ 137 5.3.1 Caracterización bioquímica. ............................................................................. 137 5.3.2 Análisis del gen ARNr 16S. .............................................................................. 143 5.3.3 Análisis de genomas completos ........................................................................ 144 5.3.3.1 MLSA a partir de los genomas ................................................................ 144 ÍNDICE 19 5.3.3.2 Comparación con especies del género Rahnella ...................................... 146 5.3.4 Descripción de especies del género Rahnella ................................................... 149 5.3.4.1 Descripción de Rahnella conchicola sp nov. ........................................... 149 5.3.4.2 Description of Rahnella gallaica sp. nov. ................................................ 150 5.4 DISCUSIÓN .............................................................................................................. 151 6 DISCUSIÓN GENERAL ................................................................................................ 155 7 CONCLUSIONES/CONCLUSIONS ............................................................................. 159 8 EXTENDED SUMMARY ............................................................................................... 167 9 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................. 175 10 ANEXO I .......................................................................................................................... 223 RESUMEN 21 Estudio de la microbiota asociada a almeja fina (Ruditapes decussatus) y almeja japonesa (Ruditapes philippinarum) mediante técnicas de secuenciación masiva. RESUMEN El cultivo de almejas supone un recurso de alto valor gastronómico y comercial en Galicia. La importación de semilla alóctona en las rías gallegas como consecuencia de la sobreexplotación de los bancos naturales de almeja introdujo nuevos patógenos en el ambiente, provocando una reducción drástica de la producción de las principales especies de almeja en las últimas décadas. El estudio de la microbiota asociada a la almeja cultivada permite ampliar el conocimiento sobre la composición de la comunidades bacterianas, conocer su estado sanitario y describir nuevos taxones que nos ayuden a diseñar nuevas estrategias de control ante la aparición de enfermedades o frente a episodios de mortalidades. En esta memoria se ha realizado un estudio de la microbiota asociada a almeja fina y japonesa (Ruditapes decussatus y R. philippinarum) mediante la secuenciación masiva del gen ARNr 16S, comparando la microbiota presente en diferentes órganos y localizaciones en dos príodos del año (finales de invierno-principios de primavera y finales de verano-principios de otoño). Los resultados obtenidos muestran la gran diversidad de géneros presentes en ambas especies de almeja, observándose un mayor número OTUs en las muestras de primavera. Por lo general, los grupos de bacterias predominantes en la mayoría de las muestras se asignaron a bacterias no cultivables pertenecientes a diferentes familias como Propionibacteriaceae, Spirochaetaceae, Francisellaceae y Chlamidiaceae y a los géneros Mycoplasma, Methylobacterium, Psychrobacter, Endozoicomonas y Vibrio. La mayoría de estos grupos de bacterias mostraron una clara estacionalidad y especificidad de especies y/o tejido como es el caso de Methylobacterium que aparece con una abundancia relativa elevada en las gónadas de ambas especies en otoño, o el género Endozoicomonas que se detecta en las branquias de almeja fina con abundancias relativas superiores al 1%. Por otro lado, se realizó un estudio de la microbiota de almeja fina y japonesa mediante la técnica dependiente de cultivo denominada “dilución a extinción”, reduciendo la concentración de nutrientes de los medios y aumentando los tiempos de incubación. De esta forma se detectaron géneros hasta el momento no identificados mediante técnicas DIEGO GERPE PAZOS 22 convencionales de cultivo en estudios anteriores, como Rahnella, Brachybacterium, Janthinobacterium o Brevudimonas. Además, en esta memoria se llevó a cabo a la descripción de dos nuevas especies pertenecientes al género Rahnella, mediante el análisis comparativo de los genomas de cinco aislados de almeja y las cepas tipo de las especies del género Rahnella. RESUMO 23 Estudo da microbiota asociada a ameixa fina (Ruditapes decussatus) e ameixa xaponesa (Ruditapes philippinarum) mediante técnicas de secuenciación masiva. RESUMO O cultivo de ameixas supón un recurso de alto valor gastronómico e comercial en Galicia. A importación de semente alóctona nas rías galegas como consecuencia da sobreexplotación dos bancos naturais de ameixa introduciu novos patóxenos no ambiente, provocando unha redución drástica da produción das principais especies de ameixa nas últimas décadas. O estudo da microbiota asociada á ameixa cultivada permite ampliar o coñecemento sobre a composición da comunidades bacterianas, coñecer o seu estado sanitario e describir novos taxons que nos axuden a deseñar novas estratexias de control ante a aparición de enfermidades ou fronte a episodios de mortalidades. Nesta tese realizouse un estudo da microbiota asociada a ameixa fina e xaponesa (Ruditapes decussatus e R. philippinarum) mediante a secuenciación masiva do xene ARNr 16S, comparando a microbiota presentes en diferentes órganos e localizacións durante dous períodos do ano (fináis de inverno-principios de primavera e fináis de verán-principios de outono). Os resultados obtidos mostran a gran diversidade de xéneros presentes en ambas as especies de ameixa, observándose un maior número OTUs nas mostras de primavera. Polo xeral, os grupos de bacterias predominantes na maioría das mostras asignáronse a bacterias non cultivables pertencentes a diferentes familias como Propionibacteriaceae, Spirochaetaceae, Francisellaceae e Chlamidiaceae e aos xéneros Mycoplasma, Methylobacterium, Psychrobacter, Endozoicomonas e Vibrio. A maioría destes grupos de bacterias mostraron unha clara estacionalidade e especificidade de especies e/ou tecido como é o caso de Methylobacterium que aparece cunha abundancia relativa elevada nas gónadas de ambas as especies en outono, ou o xénero Endozoicomonas que se detecta nas branquias de ameixa fina con abundancias relativas superiores ao 1%. Doutra banda, realizouse un estudo da microbiota de ameixa fina e xaponesa mediante a técnica dependente de cultivo denominada “ dilución a extinción”, reducindo a concentración de nutrientes dos medios e aumentando os tempos de incubación. Desta forma detectáronse xéneros ata o momento non identificados mediante técnicas convencionais de cultivo en estudos anteriores, como Rahnella, Brachybacterium, Janthinobacterium ou Brevudimonas. DIEGO GERPE PAZOS 24 Ademais, nesta memoria levouse a cabo á descrición de dúas novas especies pertencentes ao xénero Rahnella, mediante a análise comparativa dos xenomas de cinco illados de ameixa e as cepas tipo das especies do xénero Rahnella. . SUMMARY 25 Study of grooved carpet shell (Ruditapes decussatus) and manila clam (Ruditapes philippinarum) microbiota by means of high throughput sequencing. SUMMARY The culture of clams is a resource of high gastronomic and commercial value in Galicia. The overexploitation of natural clam beds has resulted in the importation of allochthonous seed into the Galician estuaries. This practice has led to the introduction of new pathogens into the environment, reducing drastically the production of the main clam species in recent decades. The study of the microbiota associated to reared clam allows us to expand the knowledge about the composition of the bacterial communities, to know their health status, and to describe new taxa that might help us to design new control strategies to prevent diseases or mortality events. A study of the microbiota associated to grooved carpet shell and Manila clams (Ruditapes decussatus and R. philippinarum) has been carried out in this thesis using high-throughput sequencing of the 16S rRNA gene, comparing the microbiota present in different organs and locations in two sampling periods (late winter-early spring and late summer-early autum). The obtained results showed the great diversity of genera present in both species of clams, being spring the period in which higher number of genera has been observed. Uncultured bacteria that belong to different families Propionibacteriaceae, Spirochaetaceae, Francisellaceae and Chlamidiaceae and OTUs belonging to Mycoplasma, Methylobacterium, Psychrobacter, Endozoicomones and Vibrio genera were the predominant bacterial groups in most samples. Most of these bacterial groups showed a clear seasonality as well as species and/or tissue specificity such as the case of Methylobacterium which was detected with relative high abundance in the gonads of both species in autum, or the genus Endozoicomonas detected in grooved carpet shells gills with relative abundance higher than 1%. On the other hand, a study of the grooved carpet shell and Manila clam microbiota was carried out using the culture-dependent technique known as 'dilution to extinction', reducing the nutrient concentration of media and increasing incubation times. Thus, genera hitherto unidentified using standard culture techniques in previous studies were detected here associated to clam microbiota, such as Rahnella, Brachybacterium, Janthinobacterium or Brevudimonas. DIEGO GERPE PAZOS 32 furtivismo, condiciones adversas del clima debido al cambio climático o a enfermedades. Además, la sobreexplotación de los bancos naturales dio lugar a la importación de semillas de otros países, introduciendo de esta forma nuevos patógenos en el ecosistema. 1.2 LA ALMEJA 1.2.1 Anatomía Las almejas se encuentran dentro del Filo Mollusca, y pertenecen a la clase Bivalvia. Una de las características principales de los moluscos bivalvos es que presentan una valva izquierda y otra derecha articuladas dorsalmente por una charnela y carecen de esqueleto interno. El color, tamaño y forma de las valvas es variable según la especie de almeja y su exterior se encuentra formado por estrías lineales y concéntricas más o menos profundas dependiendo de la especie. La valvas están compuestas principalmente por carbonato cálcico y se diferencian 3 capas; una capa exterior conocida como periostraco, una capa intermedia que supone la mayoría del cuerpo de la concha y una capa interior formada por nácar (FAO, 2004). Las valvas se pueden abrir y cerrar por acción de la musculatura. Las almejas son organismos dimiarios, presentan dos músculos; el aductor anterior y el aductor posterior que son los encargados de cerrar las valvas. Las dos valvas están unidas por el ligamento, que se estira cuando las valvas se cierran por acción de los músculos aductores y se contrae al abrirse. En la cara interna de las conchas se encuentra la línea paleal (impresiones del manto) y el seno paleal (generado por la presencia de sifones) y la impresión de los de los dos músculos aductores. Las conchas protegen el cuerpo de la almeja constituido principalmente por el manto, las branquias, la masa visceral y el pie. En la cara interna de las conchas se encuentra el manto, que se une a la concha por la zona de la charnela. El manto presenta unas prolongaciones tubulares en la zona posterior denominadas sifones; uno superior, exhalante y otro inferior, inhalante. Ambos son retráctiles y presentan pequeños tentáculos en el extremo (Fig. 1.3). El manto tiene como funciones la segregación de la concha, así como una función sensorial, pudiendo iniciar el cierre de las valvas como respuesta a condiciones desfavorables INTRODUCCIÓN 33 del entorno. Además, controla la entrada de agua en la cavidad corporal y dirige las partículas hacia las branquias (Ojea, 2013). En la zona posterior se encuentra un músculo desarrollado denominado pie y que el animal usa para enterrarse y desplazarse. A cada lado del manto están las branquias, dos a cada lado. Las branquias son estructuras formadas por multitud de cilios que van a permitir el intercambio de oxígeno y la captura del alimento. Son las responsables de seleccionar el alimento que entra por el sifón inhalante y transferirlo a la boca. La masa visceral se encuentra formada por el aparato circulatorio, excretor, digestivo y reproductor. Las almejas presentan un par de riñones y glándulas pericárdicas que conforman el sistema excretor, si bien, la superficie del cuerpo y las branquias también emiten productos de excreción (Bayne y col., 1976). El sistema circulatorio es un sistema simple y muy difícil de localizar. El corazón se encuentra localizado dorsalmente en el interior de la cavidad pericárdica. Está formado por dos aurículas y un ventrículo. La hemolinfa se distribuye por todo el animal por un sistema de arterias que terminan en senos o lagunas sanguíneas. La sangre pasa a través de las arterias del manto cerca de la superficie, donde se oxigena y vuelve al corazón. Figura 1.3. Anatomía interna de la almeja. Figura original. DIEGO GERPE PAZOS 34 En cuanto al sistema digestivo, el alimento recogido por las branquias entra por la boca y pasa a través de un esófago corto al estómago. El estómago está formado por una parte anterior donde se encuentran las glándulas digestivas que digieren partículas intracelularmente; y una zona posterior denominada saco del estilo, donde se encuentra un estilete cristalino formado por partículas proteicas y enzimas digestivas que van a triturar el alimento qué posteriormente pasará a las glándulas digestivas. El estómago se abre a un intestino que desemboca en el ano, situado al lado del sifón exhalante. El sistema nervioso de las almejas es muy simple y presenta simetría bilateral. Está formado por tres pares de ganglios (cerebropleurales, pedios y viscerales) unidos por dos pares de conectivos longitudinales. Los ganglios cerebropleurales se encuentran en la zona anterior, cerca de la boca; los ganglios pedios inervan el pie y la parte posterior del manto y los viscerales controlan los órganos de la masa visceral y las branquias (Cerviño, 2011). Tanto la almeja fina como la japonesa son organismos dioicos, sin dimorfismo sexual y que se reproducen sexualmente de forma externa. Los órganos reproductores están formados por un par de gónadas conectadas cada una por un gonoducto simple que desemboca en la cavidad paleal. 1.2.2 Ciclo biológico Como ya se ha mencionado, las almejas tienen fecundación externa, de forma que los gametos son expulsados al agua mediante los sifones exhalantes. La liberación de ovocitos y espermatozoides es estacional, dependiendo de la especie (Ojea y col., 2004; RodríguezMoscoso y col., 1992). La fecundación se realiza en el medio marino y tiene lugar al azar (Grassé, 1976). Los ovocitos fecundados quedan flotando en la columna de agua, donde se produce un desarrollo indirecto de la larva. El tiempo para que se produzca el desarrollo embrionario y larvario varía según la especie, siendo de unos 35-40 días tras el desove en el caso de la almeja fina y de 30-35 días en el caso de la almeja japonesa (Fig 1.4). INTRODUCCIÓN 35 Figura 1.4. Ciclo biológico de la almeja. Figura original. La división del ovocito fecundado dará lugar a la formación de la fase multicelular de blástula, que se divide y forma la gástrula en las primeras 24 h. Pasadas 12 h se convertirá en larva trocófora. Esta larva se encuentra rodeada de cilios, presenta un flagelo en la zona apical que le permite el movimiento y tiene un tamaño de entre 60-80 m. Será esta larva trocófora la que secrete 2 estructuras simétricas (prodisoconcha I) que la envuelvan y se forma la larva D o velíger. El tamaño de la larva velíger varía entre 90-100 m tanto en almeja fina como japonesa. Durante este periodo la larva se desplaza y alimenta mediante el velo, aumentado de tamaño hasta formar la prodisoconcha II. La charnela entonces se curva y forma el umbo, dando lugar a la larva umbonada con un tamaño entre 130-160 m. Esta larva, aún con el velo, empieza a formar el pie dando lugar a la larva pedivelíger, la cual se fijará al sustrato pasando de una vida planctónica a bentónica. Una vez fijada al sustrato el velo va a ser reabsorbido, se forman las branquias y empieza la metamorfosis. Pasados 30-40 días tras el desove, la almeja alcanza el estadio de DIEGO GERPE PAZOS 36 postlarva o semilla, alcanzando tallas de entre 260-350 m. Estas adquieren nutrientes del agua y crece hasta tener la forma adulta. El crecimiento de las almejas va a depender no solo de la especie, sino también de diversos factores como el clima, la zona geográfica o la zona de cultivo (submareal o intermareal). En las zonas de clima templado hay una clara estacionalidad en el crecimiento, siendo este más rápido en primavera-verano debido a la temperatura del agua y a la mayor disponibilidad de alimento en el medio durante este periodo. 1.2.3 Características diferenciales entre la almeja fina y la almeja japonesa La almeja fina (Ruditapes decussatus) y la almeja japonesa (Ruditapes philippinarum) van a presentar características morfológicas diferenciales tanto en la anatomía externa como en la interna. La almeja fina posee unas estrías concéntricas y radiales marcadas que se entrecruzan formando una cuadrícula característica, el área de inserción del ligamento es asimétrica y no es visible en la valva derecha. La concha tiene forma cuadrangular y tiene una lúnula incolora poco diferenciada. La concha presenta una coloración igual en ambas valvas que varía entre blanco y marrón claro. La coloración interna de las valvas es blanquecina o amarillo claro (Gofas, 2011). Presenta unos sifones largos separados desde la base hasta el final y el sifón inhalante tiene 2 filas de tentáculos en el extremo. Se encuentran tanto en bancos intermareales como submareales y, debido a longitud de sus sifones, las almejas van a poder estar enterradas a 15-30 cm de profundidad en el sedimento, lo que le permite soportar mejor la desecación y las bajadas de salinidad. La almeja japonesa presenta unas estrías radiales más marcadas y el área de inserción del ligamento es asimétrica y visible en las dos valvas. Tiene una concha totalmente ovalada y una lúnula de color oscuro bien pronunciada. La concha puede tener diferente color en cada valva variando entre marrón, gris y negro, incluso presentando manchas oscuras irregulares. En el margen ventral de la concha, las impresiones de los músculos y del seno paleal presentan unas manchas púrpuras características (Quero y Vayne, 1998). El seno paleal se encuentra menos marcado que el de almeja fina, ya que este se forma en función de la longitud de los sifones (Gosling, 2003). Los sifones están soldados en la mayor parte de su longitud y se separan al final. El sifón inhalante tiene 3 filas de tentáculos. Al igual que la INTRODUCCIÓN 37 almeja fina, se encuentra en zonas mareales e intermareales, pero enterradas a menor profundidad. Tiene un crecimiento mayor que la almeja fina, alcanzando la talla mínima comercial en 2 años (JACUMAR, 2014) En cuanto a la distribución geográfica, R. decussatus se extiende por toda la costa europea del océano Atlántico y por la cuenca del Mediterráneo. En África se encuentra desde la costa de Marruecos hasta Senegal (FAO, 2019; Breber, 1985; Fischer-Piette, 1971). Los mayores productores de esta especie de almeja son España, Portugal, e Italia (FAO, 2019). En el caso de R. philippinarum, posee una gran distribución por todo el océano Índico y Pacífico. Se introdujo accidentalmente en Norteamérica y posteriormente fue importada a Europa. Aunque países como España, Italia o Francia son los mayores productores en Europa, la producción mundial de almeja japonesa se concentra principalmente en China (FAO, 2019). 1.3 LA MICROBIOTA ASOCIADA A ALMEJA 1.3.1 Microbiota general Al ser organismos filtradores, las almejas presentan una microbiota abundante y diversa microbiota con efectos directos o indirectos tanto beneficiosos como perjudiciales en estos animales (Mchenery y Birkbeck, 1985; Prieur y col., 1990; Seguineau y col., 1996; Romalde y col., 2013, 2014). Por lo tanto, el estudio de la microbiota asociada a la almeja, no solo va a ayudar a tener una idea de cómo se encuentran las poblaciones desde un punto de vista sanitario, sino que también ayudará a aumentar el conocimiento sobre eventos de patogenicidad y a diseñar nuevas estrategias de control. El primer estudio sobre la microbiota asociada a moluscos bivalvos fue elaborado en los años 60 por Colwell y Liston (1960). El estudio se centró en la microbiota de la ostra del pacífico (Crassostrea gigas) y concluyó que la mayoría de la microbiota asociada estaba formada por bacterias Gram negativas, pertenecientes a los géneros Pseudomonas y Vibrio, seguidos de Achromobacter y Flavobacterium. Otro estudio realizado en C. gigas y C. virginica obtuvo resultados muy parecidos, donde los géneros más abundantes también fueron Pseudomonas y Vibrio (Lovelace y col., 1968). En los años 80, Sugita y col., (1981) elaboraron un estudio más completo de la microbiota de diferentes especies de moluscos bivalvos (R. philippinarum, Mactra DIEGO GERPE PAZOS 38 veneriformis, Mytilus coruscus, C. gigas, Phacosoma japonicum y Scapharca broughtonii). Analizaron la microbiota en diferentes etapas de su ciclo vital, en diferentes órganos, además de la microbiota presente en los sedimentos y el agua. Los resultados que obtuvieron pusieron de manifiesto que la microbiota de moluscos bivalvos se encuentra influenciada por el medio, ya que los géneros mayoritarios encontrados en los moluscos (Vibrio, Aeromonas, Pseudomonas, Moraxella y Micrococcus), se encontraron en porcentajes semejantes en agua y sedimentos. En otro estudio sobre las variaciones a lo largo de un año de la microbiota asociada a Ostrea edulis y agua del Mediterráneo, Pujalte y col. (1999), determinaron que las bacterias halófilas anaerobias fermentativas fueron dominantes desde Marzo a Octubre, destacando el género Vibrio en el agua y en la ostra. Por otro lado, observaron que en los meses fríos predominó un grupo de bacterias oxidativas no identificadas pertenecientes a las - proteobacterias. Montilla y col. (1995) elaboraron un comparativa entre la microbiota de almeja fina y japonesa y ostras (C. gigas y O. edulis), observando una mayor incidencia de bacterias del género Vibrio en almejas que en ostras. Existen pocos estudios recientes sobre la composición y distribución de la microbiota asociada a moluscos bivalvos y generalmente están centrados en la identificación de nuevas especies con potencial patógeno (Paillard y col., 2004; Romanenko y col., 2008). En cuanto a la microbiota asociada a almejas, el estudio más completo hasta la fecha fue elaborado por nuestro grupo de investigación (Romalde y col., 2014) en el cual se estudió la microbiota presente en almeja fina y almeja japonesa en 4 localizaciones diferentes haciendo muestreos cada 2 meses durante 5 años. La diversidad microbiana encontrada fue semejante en todas las localizaciones y, al igual que en un estudio realizado por Arias y col. (1999), se observó un aumento en la abundancia de algunos taxones bacterianos durante los meses más cálidos. Vibrio fue el género más abundante en todas las muestras, constituyendo el 60% de la microbiota total. Por otro lado, se identificaron un total de 800 aislados de bacterias oxidativas, de las cuales un 52,7% pertenecían al género Pseudoalteromonas seguido del género Shewanella (16%) y otros géneros con porcentajes menores del 5% como Tenacibaculum, Psychrobater, Polaribacer, Marinomonas o Alteromonas. Además, durante este estudio se encontraron organismos tipo Rickettsia (RLO, del inglés Rickettsia-like INTRODUCCIÓN 39 organisms), que se observaron en inclusiones en branquias, palpos labiales y glándulas digestivas. La mayoría de los estudios realizados sobre la microbiota de moluscos se centran en bacterias cultivables. Esta aproximación es insuficiente ya que se calcula que las bacterias identificadas dependientes de cultivo solo explicarían alrededor de un 0,01-1% de la microbiota total presente en una muestra (Green y Keller, 2006). Recientemente, se han desarrollado nuevas técnicas de secuenciación masiva que permiten el estudio de la microbiota, cultivable y no cultivable, presente en una muestra. Los resultados obtenidos de la microbiota asociada a moluscos bivalvos mediante el uso de estas técnicas, difieren bastante de los obtenidos con anterioridad donde las -proteobacterias eran la clase más abundante, y Vibrio y Pseudomonas los géneros predominantes. Trabal y col. (2014) realizaron un estudio sobre la microbiota asociada a tres especies de ostra (Crassostrea corteziensis, C. gigas y C. sikamea) durante su fase adulta y sus estadios postlarvarios. Utilizaron la técnica de la pirosecuenciación, amplificando las regiones V3 y V4 del gen 16S ARNr. Identificaron 243 géneros y 13 filos diferentes. El filo mayoritario fue Proteobacteria seguido de Bacteroidetes, Actinobacteria y Firmicutes. La diversidad bacteriana en los estadios postlarvarios fue mucho mayor a la encontrada en los ejemplares adultos. Mientras en las postlarvas se encontraba formada por varios géneros, siendo Neptuniibacter, Marinicella, Rhodovulum y Oceanicola los géneros más abundantes, en ostras adultas la microbiota estaba compuesta principalmente por los géneros Burkholderia y Escherichia/Shigella. Además, al contrario que estudios anteriores sobre la microbiota de esta y otras especies de ostras (Harris, 1993; Pujalte y col., 1999; Najiah y col., 2008; Green y Barnes, 2010; Zurel y col., 2011; Fernández-Piquer y col., 2012), los géneros Vibrio y Pseudomonas fueron minoritarios en las etapas postlarvares y prácticamente inexistentes en ostras adultas. En un estudio centrado en las gónadas de Pecten maximus, Lasa y col. (2016) tuvieron resultados semejantes identificando 13 filos diferentes, donde Proteobacteria fue el mayoritario. Se identificaron un total de 110 géneros, siendo los más abundantes Delftia, Acinetobacter, Hydrotalea, Aquabacterium, Bacillus, Sediminibacterium, Sphingomonas y Pseudomonas. Cabe destacar que en este estudio no encontraron secuencias del género Vibrio y las secuencias del género Pseudoalteromonas fueron poco abundantes. DIEGO GERPE PAZOS 40 Vezzulli y col. (2017) estudiaron la microbiota de la hemolinfa y de la glándula digestiva de Mytilus galloprovincialis y C. gigas. El filo Proteobacteria volvió a ser el mayoritario con los géneros Vibrio y Pseudoalteromonas como predominantes, al contrario de lo que sucedió en los estudios citados anteriormente. 1.3.2 Microorganismos patógenos Uno de los mayores problemas que se encuentran los acuicultores y mariscadores son las mortalidades repentinas de los moluscos tanto en sus fases larvarias en el criadero como en sus fases juveniles y adultas en el medio natural. En Galicia, inicialmente las semillas utilizadas para el cultivo procedían de la recolección en el medio natural, pero debido a la sobreexplotación de los bancos naturales, a mediados del siglo XX se empezaron a importar masivamente juveniles de otros países. Todo esto propició la entrada de nuevos agentes causales de enfermedades. La mayoría de las mortalidades se producen en los criaderos durante las fases larvarias y postlarvarias, causando muchas veces la pérdida total de la producción. La mayor parte de estas mortalidades están asociadas con bacterias patógenas del género Vibrio (Beaz-Hidalgo y col., 2010a; Paillard y col., 2004). Muchas de estas bacterias forman parte de la microbiota de los propios moluscos y, bajo condiciones de estrés como la variaciones de salinidad y pH o temperatura, la susceptibilidad del hospedador aumenta pudiendo desarrollar enfermedades. Por lo tanto, mantener unas condiciones idóneas durante el cultivo larvario va a ser esencial para controlar la aparición de agentes patógenos y evitar altas mortalidades durante este periodo (Tubiash y Otto, 1986; DiSalvo y col., 1978). 1.3.2.1 Parásitos Los parásitos afectan a diferentes especies de moluscos bivalvos. La mayoría de los parásitos que afectan a moluscos bivalvos se encuentran dentro de los géneros Perkinsus, Haplosporidium, Martelia y Bonamia. Además, el calentamiento global y la exportación e importación de bivalvos han favorecido la expansión de enfermedades parasitarias en diferentes países (Short y col., 2017). INTRODUCCIÓN 41 El género Perkinsus se encuentra asociado con mortalidades tanto en almeja fina como almeja japonesa (Figueras y col., 1992, 1996). Las especies P. marinus y P. olseni tienen un gran impacto en moluscos bivalvos y están incluidas en la lista de enfermedades de declaración obligatoria de animales acuáticos por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE; http://www.oie.int). Hay diversos estudios que analizan las elevadas mortalidades de R. philippinarum causadas por Perkinsus spp en Japón (Hamaguchi y col., 1998; Maeno y col., 1999), Corea (Choi y Park, 1997; Park y Choi, 2001) así como en la costa atlántica y mediterránea de la Península Ibérica (Rodríguez y Navas, 1995; Sagristá y col.,1996; Figueras y col., 1992). Además, estudios recientes están asociando mortalidades de almeja japonesa a la acción conjunta de P. olseni y el aumento de la temperatura del mar (Nam y col., 2018). Existen estudios sobre cómo la almeja fina cultivada en España y Portugal también se ve afectada por esta especie del género Perkinsus (de la Herrán y col., 2000; Montes y col., 2001; Casas y col. 2002; Villalba y col., 2005). Perkinsus chesapeaki es otra de las especies de Perkinsus que afecta a almeja en Europa, donde en los últimos años se han descrito co-infecciones de esta especie y P. olseni en almeja fina y japonesa en Francia (Arzul y col., 2012) y Galicia (Ramilo y col., 2015). Cuando una población de almejas se encuentra infectada por organismos del tipo Perkinsus aumenta el número de individuos con las valvas abiertas y no muy enterrados en el sustrato. Una de las lesiones que se pueden observar en los hospedares son unos granulomas blancos de gran tamaño incrustados en las laminillas branquiales, manto y pie (Park y Choi, 2001). Estos granulomas son las lesiones que más afectan al hospedador ya que pueden cubrir más de la mitad de la superficie comprometiendo la funcionalidad respiratoria de las branquias (Ruano, 1989). Además, Montes y col. (2001) y Figueras y col. (1996) observaron que el parásito utiliza las reservas energéticas del hospedador haciéndolo más susceptible a otros patógenos oportunistas y a cambios ambientales bruscos. La haplosporidiosis es otra de las enfermedades que afectan a moluscos bivalvos y está causada sobre todo por las especies Haplosporidium nelsoni y H. costales. Estas especies han provocado grande mortalidades en C. viriginica desde la década de los 50 en Norteamérica (Andrews, 1996), pero también en otras especies de ostras como C. gigas en Norteamérica, Francia, Japón o Corea (Bower y col, 1994; Friedman y col., 1991a; Burreson y col., 2000; Renault y col., 2000) o en O. edulis en Galicia (Azevedo y col., 1999). Este DIEGO GERPE PAZOS 48 C) Enfermedad de la ostra juvenil o Enfermedad de la ostra causada por Roseovarius. Como su propio nombre indica, es una enfermedad que también afecta a ostra juvenil. En 1980 se detectaron mortalidades en juveniles de C. virginica. Las ostras presentaban una reducción del crecimiento, retracción del manto y depósitos de conquiolina, observándose mortalidades de hasta el 90% en ejemplares con un tamaño por debajo de los 25 mm (Bricelj y col., 1992; Davis y Barber, 1994; Lee y col., 1996; Lewis y col., 1996; Ford y col., 1996). El depósito de materia orgánica que se produce en el interior de las valvas se asemeja bastante a los que se encuentran en la enfermedad del anillo marrón. En 2005 se identificó Roseovarius crassostreae como posible agente causal de la enfermedad (Boettcher y col., 2005). Será en 2007 cuando Maloy y col, demuestren que esta especie es la causante de la misma, y la denominen como enfermedad de la ostra causada por Roseovarius (ROD, Roseovarius oyster disease). Recientemente, esta especie se reclasificó como Aliiroseovarius crassostreae (Park y col., 2015). Hasta el momento, esta enfermedad solo se ha detectado en C. virginica, afectando sobre todo a ostras juveniles cuando la temperatura del agua se encuentra por encima de los 20ºC (Bricelj y col., 1992, Davis y Barber, 1994; Ford y Borrero, 2001). D) Nocardiosis Al contrario que las anteriormente descritas en este capítulo, la nocardiosis está causada por bacterias Gram positivas pertenecientes al género Nocardia. Este género se encuentra asociado con mortalidades de ostra del pacífico, C. gigas en Japón, Estados Unidos, Canadá y Europa (Fujita y col., 1953, 1955; Koganezawa, 1975; Katkansky y col., 1974; Elston, 1993; Friedman y col., 1998; Engelsma y col., 2008). Además, también se han descrito mortalidades en ostra plana (O. edulis)(Engelsma y col., 2008, Bower et al., 2005, Lauckner, 1983) y recientemente, se ha detectado la presencia de N. crassostreae en mejillón (M. galloprovincialis) en el Golfo de Nápoles (Carella y col., 2013). N. crassostreae es el causante de la nocardiosis, suele provocar la enfermedad a temperaturas por encima de los 20ºC, por lo tanto, suele estar asociados con mortalidades de verano (Friedman y col., 1991, 1998). Durante la enfermedad se pueden observar abscesos de color amarillo-verdoso en manto y branquia, aunque estos signos no se pueden considerar específicos de la nocardiosis (Bower y col., 2005; Carella y col 2013). INTRODUCCIÓN 49 E) Patógenos intracelulares Los patógenos intracelulares suelen encontrarse formando colonias incrustados principalmente en las branquias. Muchos estudios han asociado estos organismos con eventos de patogenicidad y mortalidades en moluscos a lo largo del planeta. Debido a que no suelen ser cultivables, este tipo de microorganismos está poco estudiado, pero la llegada de las nuevas técnicas de secuenciación hace posible aumentar el conocimiento sobre estas bacterias y conocer su abundancia en la microbiota general de moluscos bivalvos. Las primeras bacterias intracelulares que se describieron fueron los RLO, detectados a finales de los años 70 (Harshbarger y col., 1977). Posteriormente se han observado infecciones y mortalidades en diferentes moluscos, incluyendo ostras y almejas (Zhu y col., 2012). Son bacilos Gram negativos intracelulares obligados, capaces de dividirse únicamente en las células del hospedador y que se transmiten a través del agua (Fournier y col., 2009). Este tipo de microorganismos producen la muerte del hospedador mediante la destrucción celular y sin producir ningún tipo de toxina (Romero y col., 2000). Villalba y col. (1999) vieron como Rickettsia causaba hipertrofia y la lisis de las células epiteliales de Venerupis rhomboides, originando finalmente la muerte. No siempre se producen mortalidades, sino que muchas veces causan infecciones asintomáticas (Carballal y col., 2001; Jones, 2007; Sabry y col., 2011). Los RLOs se han asociado con mortalidades de Crassostrea ariankensis desde 1992 en China, que solían producirse desde febrero a mayo y desde noviembre a diciembre cada año (Wu y Pan, 2000; Sun y Wu, 2004). También se han asociado con la pérdida de toda la producción de Tegillarca granosa en este mismo país durante los meses de marzo y septiembre (Zhu y col., 2012). En Pinctada máxima se han descrito mortalidades asociadas a Ricketssia en ejemplares de 4-6 meses (Wu y col., 2003). En otros moluscos bivalvos como abalones (Haliotis cracherodii, H. rufescens y H. diversicolor)(Gardner y col 1995; Moore y col 2000; Wu, 2003a) y almeja gigante (Tridacna gigas) (Norton y col., 1993a, 1993b) también se han descrito mortalidades asociadas a RLOs. En Galicia, se detectaron mortalidades en almeja (V. rhomboides) en la ría de Arousa (Villaba y col., 1999). En otro estudio realizado en Galicia de la microbiota de almeja fina (R. decussatus) y almeja japonesa (R. philippinarum) también se encontró una alta prevalencia de este tipo de microorganismos aunque no se asoció a mortalidades (Romalde y col., 2013). DIEGO GERPE PAZOS 50 El género Rickttessia ha sido descrito junto otros géneros como Chlamydia (CLO , del inglés Chlamydia-like organism) en vieiras (Morrison y Shum, 1982; Hine y Diggles, 2002) y mejillones (Cajaraville y Angulo, 1991; Svrd, 1999). Este tipo de infecciones, debido al parecido morfológico de los RLOs y CLOs, en la mayoría de los casos se han descrito como co-infecciones de ambos géneros. Cano y col (2018) detectaron infecciones intracelulares de bacterias del género Endozoicomonas en vieiras. Los autores proponen la hipótesis de que ELOs (del inglés, Endozoicomonas-like organisms) se encuentren como simbionte cuando está en bajas proporciones pero que al aumentar la temperatura del agua se produzca un incremento de la población bacteriana afectando a las vieiras y pudiéndole causar la muerte. 1.3.2 Microorganismos probióticos El cultivo de moluscos bivalvos está sujeto a muchos factores y uno de los más importante es el control de enfermedades y la aplicación de tratamientos contra patógenos. Al tratarse de organismos filtradores, la dispersión de patógenos a través del agua, así como la proliferación de bacterias oportunistas en el interior de los bivalvos, se produce con bastante rapidez. El uso de antibióticos no siempre es válido para el control de bacterias patógenas ya que su uso se considera un riesgo debido a la dispersión de antibióticos en el ambiente y a la aparición de cepas con resistencias que puedan ser transmitidas a patógenos humanos (Verschuere et al., 2000). Por lo tanto, la alternativa para el control se puede realizar mediante dos vías: (I) Limitar en la medida de lo posible la entrada de microorganismos en el sistema de cultivo mediante diferentes métodos como por ejemplo el uso de biofiltros y ultravioleta, y (II) el uso de probióticos que ayuden a controlar los diferentes microorganismos patógenos. Los probióticos son la alternativa más prometedora al uso de antibióticos y quimioterápicos. La definición más reciente de probiótico referente a la acuicultura fue definida por Lazado y Caipang (2014a, b) como “un microorganismo vivo o muerto o incluso un componente de un microorganismo, que a través de diferentes modos de acción confiere efectos beneficiosos al hospedador o a su entorno”. Anteriormente, Verschuere y col. (2000) lo había definido como “un aditivo microbiano vivo con efectos beneficiosos en el hospedador, que modifica la microbiota asociada al hospedador o el medio ambiente, INTRODUCCIÓN 51 asegurando el uso óptimo de la alimentación o mejorando su valor nutricional, mejorando la repuesta del hospedador contra una enfermedad, o mejorando la calidad de su medio ambiente”. Existen pocos estudios sobre probióticos de moluscos bivalvos ya que la mayoría se centran en probióticos de peces y crustáceos. Lodeiros y col realizaron en 1989 el primer estudio de probióticos en moluscos bivalvos en el cual probaron en Pecten ziczac la eficacia de una cepa de Flavobacterium contra V. anguillarum. Douillet y Langdon (1993) comprobaron el beneficio de una cepa de Alteromonas sp. en el cultivo larvario de C. gigas. Riquelme y col. (1996, 1997) ensayaron el efecto de Pseudoalteromonas haloplanktis y Pseudomonas sp en larvas de Argopecten pupuratus y demostraron la actividad antimicrobiana frente a diferentes especies del género Vibrio. Posteriormente, lograron mejorar el cultivo larvario de A. pupuratus mezclando especies del género Vibrio, Pseudomonas y Bacillus, sin necesidad de usar antibióticos (Riquelme, 2001). Hoy en día muchos probióticos han demostrado ser eficaces contra infecciones de diferentes bacterias patógenas o favorecer la supervivencia de diferentes moluscos bivalvos en estados larvarios. Géneros como Aeromonas se han probado con éxito en el cultivo de C. gigas contra infecciones de V. tubiashii (Gibson y col., 1998) y Pseudoalteromonas sp. se testó con éxito en el cultivo larvario de P. maximus. (Longeon y col., 2004). Estudios con bacterias lácticas y bacterias del género Bacillus demostraron el efecto beneficioso de estas en el cultivo larvario de C. corteziensis (Campa-Córdoba y col., 2011). Phaeobacter gallaeciensis es una de las especies con la que se han realizado diversos experimentos, demostrado su gran eficacia inhibiendo diferentes patógenos presentes en acuicultura (Prado y col., 2009) y en patógenos que afectan a P. maximus (Ruiz-Ponte y col., 1999) y O. edulis (Prado y col., 2006). Kesarcodi-Watson y col. (2012) observaron cómo cepas del clado Roseobacter proporcionaron protección a larvas de ostras y vieiras expuestas a patógenos. Hay pocos estudios en los que se hayan ensayado probióticos contra patógenos de almejas o que afectan a la supervivencia de las almejas. Castro y col. (2002) aislaron diferentes especies de Vibrio y testaron su efecto inhibitorio. Encontraron 5 aislados pertenecientes a V. tubiashi que causaba efectos inhibitorios sobre V. tapetis, V. anguillarum, V. fischeri y V. splendidus II. Longeon y col (2004) realizaron un ensayo con Pseudoalteromonas para ver su actividad antimicrobiana en cultivos de larvas de R. philippinarum y P. maximus, sin tener resultados muy prometedores en la almeja japonesa. DIEGO GERPE PAZOS 52 Bourouni y col. (2007) aislaron de un muestreo de almeja fina (R. decussatus) diferentes cepas pertenecientes a los géneros Aeromonas, Pseudomonas, Vibrio, Serratia y Lactobacillus, en los que encontraron efectos antagónicos contra especies del género Aeromonas (A. hydrophila y A. salmonicida) y Vibrio (V. alginolíticus y V. anguillarum), los cuales son patógenos comunes de peces y moluscos en acuicultura. Sonh y col. (2016) realizaron ensayos con cepas de Phaeobacter inhibens y Bacillus pumilus contra vibriosis en ostra (C. virginica), vieira (Argopecten irradians), almeja americana (M. mercenaria), mejillón (Mytilus edulis) y navaja (Ensis directus). Solo obtuvieron resultados positivos contra la vibriosis en larvas de ostra y vieira. 1.4 NUEVAS TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN Las nuevas técnicas de secuenciación han supuesto un avance muy importante en el mundo de la biología, y en especial en la microbiología, al universalizar una tecnología que permite obtener una gran cantidad de información de forma rápida y a bajo coste. Estas nuevas tecnologías han permitido ampliar el conocimiento de las comunidades microbianas presentes en diferentes ambientes, pudiendo estudiar las bacterias cultivable y acceder a la fracción no cultivable. Por otro lado, mediante la metabolómica, metatranscriptómica y otras técnicas “ómicas” podemos analizar la expresión proteica y génica de las comunidades microbioanas y como interactúan entre ellas, como afectan a diferentes hospedadores y sus funciones metabólicas. 1.4.1 Secuenciación masiva del gen ARNr 16S El gen de la subunidad ribosomal pequeña 16S fue seleccionado por Carl Woese en 1977 como un buen marcador genético para la identificación, clasificación filogenética y evolutiva de los organismos procariotas. Uno de los principales obstáculos al estudio de la comunidad bacteriana de un ambiente era la limitación de las técnicas de secuenciación (técnicas de primera generación), como el método de Sanger, que solo permitía el estudio de aquellos microorganismos cultivables y aislados. Esta tecnología fue desarrollada por Fred Sanger y su equipo y por la cual recibieron el premio Nobel en el año 1980. Posteriormente, INTRODUCCIÓN 53 este método se automatizó y mejoró, permitiendo secuenciar diferentes fragmentos de nucleótidos, haciendo posible secuenciar el genoma humano entre 1990 y 2003. Además, esta tecnología fue la que sentó las bases para poder desarrollar las nuevas técnicas de secuenciación o técnicas de segunda generación, NGS (del inglés, Next Generation Sequencing). La ventaja principal de estas técnicas de segunda generación, es que pueden realizar millones de reacciones de secuenciación de alto rendimiento de forma paralela y secuenciar todo el ADN de un conjunto de muestras en un solo esfuerzo de secuenciación. Cabe destacar que hasta el momento ninguna de las técnicas desarrolladas (2ª y 3ª generación) presenta una tasa de error igual o menor que la obtenida por el método de Sanger. Sin embargo, la cantidad de información obtenida es mucho mayor con respeto a las tecnologías anteriores. El primer secuenciador de segunda generación se desarrolló en 2004, empleando la ténica de la pirosecuenciación y fue rápidamente relevado por su sucesor 454 Life Science en 2005. Estos primeros secuenciadores ofrecían lecturas de 100 a 150 pares de bases y ofrecían 20 mb por esfuerzo de secuenciación. La plataforma 454 (Roche) ha ido mejorando durante años hasta que en 2009 obtuvo un resutlado alrededor de 600 mb con lecturas de hasta 1000 pares de bases con el 454 GS FLX+. Por otro lado, Solexa en 2006 desarrollo otra plataforma basada en la tecnología Sanger con la que lograba obtener 1 Gb en un solo esfuerzo de secuenciación, pero con fragmentos muy cortos de unos 35 pares de bases. Posteriormente Illumina, usando el método desarrollado por Solexa, mejorando la técnica, desarrolló diferentes tipos de secuenciadores a lo largo de los años, siendo la plataforma más utilizada hasta momento, capaces de obtener lecturas de 2 × 150 y 2 × 300 pb (utilizando diferencias estrategias de secuenciación, “paired end” o “singled end”), rindiendo múltiples Gb de información en pocas horas. El secuenciador más potente que tiene Illumina en la actualidad es NovaSeq, en menos de 2 días obtiene con un solo esfuerzo de secuenciación 1000 Gb de información a partir de lecturas de 2 x 150 pb (www.illumina.com) El gen ARNr 16S tiene una longitud de 1542 nucleótidos y está compuesto por 9 regiones hipervariables intercaladas por regiones más conservadas (Baker y col., 2003). Estas regiones hipervariables, proporcionan mucha información, desde un punto de vista taxonómico y filogenético, permitiendo diferenciar mejor los taxones bacterianos entre ellos. A la hora de realizar un estudio de la microbiota a partir del la secuenciación masiva del gen 16S ARNr es necesario realizar la amplificación de 1 o 2 de estas regiones hipervariables, ya DIEGO GERPE PAZOS 54 que una de las limitaciones de la NGS es que genera lecturas muy cortas de forma que tras los ensamblajes obtendremos amplicones de entre 250 y 500 pb (www.illumina.com). Por este motivo, la elección de la región a amplificar es uno de los factores clave para realizar un estudio y así poder analizar la variabilidad presente en una muestra. El origen de la muestras, así cómo el objetivo del estudio, también es importante a la hora de seleccionar unas regiones u otras. Klindworth y col. (2013) determinaron en sus estudios que las regiones V3-V4 proporcionan más información y por lo tanto el uso de una pareja de cebadores degenerados ayudaría a obtener mejores resultados. Chakravorty y col. (2007), vieron que la región V1 era útil para diferenciar entre bacterias patógenas del género Streptoccocus y entre especies de Staphylococcus. Por otro lado, Liu y col. (2007, 2008) observaron que las regiones V4/V5 eran las que aportaban más información para estudiar la microbiota presente en el intestino. Huse y col (2008) compararon muestras del intestino y de las fumarolas marinas y observaron que la región hipervariable V3 aportaba mucha más información que la región V6. Figura 1.5. Esquema elaboración de librerías para la secuenciación masiva del gen ARNr 16S. Figura adaptada de www.illumina.com. Una vez que se selecciona la región de amplificación y los cebadores correspondientes, se realiza una amplificación para así obtener amplicones de la región o ADN Genómico Amplificación región V3/V4 mediante PCR Adaptadores Índices (Barcodes) Amplicones PCR ligación Librería INTRODUCCIÓN 55 regiones hipervariables seleccionadas. A estos amplicones se les inserta a cada lado los adaptadores, que son secuencias oligonucleotídicas iguales para todas las muestras, que serán los que hibriden luego en una matriz de oligos específica para cada plataforma de secuenciación. Posteriormente se insertan los índices o “barcodes”, oligonucleótidos con secuencias diferentes para cada muestra, permitiendo diferenciar de que muestra proviene cada secuencia. Este último paso permite reducir el tiempo y la cantidad de reactivos al poder realizar la secuenciación de varias muestras en un solo esfuerzo de secuenciación, y por tanto abaratar costes. De esta forma ya tenemos preparada nuestra librería, que consiste en el conjunto de fragmentos de ADN que ya están preparados para ser secuenciados. Una vez creada la librería, dependiendo de la plataforma que utilicemos, va ser necesario realizar un paso previo a la secuenciación que consiste en una amplificación de las diferentes secuencias, de forma que se obtienen varios clones de cada secuencia de las librerías . La secuenciación correspondiente puede realizarse mediante diferentes plataformas (Morey y col., 2013) aunque hoy en día la más utilizada es Illumina. En el caso de Illumina, se introducen las secuencias desnaturalizadas en una superficie que contiene oligos a los que se van a unir los adaptadores. Una vez unido se realizan copias de cada una de las secuencias mediante una PCR puente (del inglés, bridge-PCR). Se agregan dNTP y la polimerasa, se alargan las secuencias y se vuelven a desnaturalizar, repitiendo el ciclo hasta generar clusters formados por millones de copias de cada secuencia. El segundo paso es la secuenciación, que consiste en unas secuenciación por síntesis a la cual se van añadiendo nucleótidos marcados con fluróforos. Cuando que un nucleótido se une, se para la reacción y se obtiene una señal del color emitido por el nucleótidos más el fluoróforo correspondiente y así sucesivamente de forma que solo se añade una base de cada vez. Una vez realizada la secuenciación de toda la secuencia, esta se elimina y se vuelve a empezar el proceso. Hoy en día existen ya “Tecnologías de secuenciación de tercera y cuarta generación” en las que se obtiene grandes cantidades de información, pero donde el error de secuenciación es mucho mayor. Una de las mayores ventajas que ofrece con respecto a las plataformas anteriores es que no es necesario una amplificación previa de las secuencias ya que su tecnología se basa en la secuenciación de una única molécula, SMRT (del inglés, Singlemolecule real-time). Las plataformas de Pacific Biosciences (Pac-Bio) (3ª generación) y de Oxford Nanopore (4ª generación) serían dos ejemplos. La plataforma Pac-Bio consiste en DIEGO GERPE PAZOS 56 chips formados por multitud de pocillos en el cual se encuentran enzimas polimerasas modificadas, donde se van incorporar nucleótidos con fluoróforos unidos al grupo fosfato (Liu y col., 2012). La secuenciación se basa en la detección óptica de la señal al incorporarse los nucleótidos marcados formando imágenes de la secuenciación a tiempo real (Timp y col., 2010). En el caso de Oxford Nanopore, la secuenciación se basa en la detección del cambio en la corriente iónica como consecuencia del paso de los nucleótidos de la molécula de ADN a través de un poro. Esta porina se encuentra embebida en una membrana a través de la cual pasa una corriente iónica Figura 1.6. Esquema amplificación de las secuencias de las librerías generadas y secuenciación mediante la tecnología illumina. Figura adaptada de www.illumina.com El número de publicaciones en las que se han utilizado tecnología NGS ha ido en aumento desde su aparición, apareciendo múltiples aplicaciones de estas técnicas en diferentes campos de investigación. Hoy en día existen otros métodos a parte del análisis del gen ARNr 16S que nos ayudan a obtener gran información sobre la microbiota presente en un ambiente, como son el análisis del metagenoma y del metatranscriptoma La metagenómica consiste en el estudio de todos los genomas con sus correspondientes genes presentes en una muestra que nos permite identificar los microorganismos presentes en un ambiente sin necesidad de obtener un cultivo puro. Se puede realizar una aproximación estructural, en la cual se estudia la composición de una comunidad microbiológica, pudiendo estudiar las rutas metabólicas de un microbioma para así intentar entender las funciones biológicas y ecológicas que pueden cumplir los miembros Adaptador Fragmento de ADN Adaptador Clusters Amplificación por PCR puenteDesnaturalización Clusters con millones de copias de cada secuencia Incorporación de dNTPs y polimerasa INTRODUCCIÓN 57 de la comunidad. Por otro lado, se puede realizar una aproximación funcional mediante el análisis de las secuencias codificante para proteínas, CDS (del inglés, protein coding sequences). En este caso se trata de estudiar la funcionalidad de los genes presentes en un metagenoma, pudiendo detectar en el metagenoma genes que estén involucrados en alguna función específica de interés para el estudio. La metatranscriptómica consiste en el estudio de la expresión de los genes y su función dentro de la comunidad microbiana. Permite un análisis funcionarial de la microbiota presente en un estudio mediante el estudio del ARN de la muestra, de forma que se analicen qué genes se expresan o cuales se expresan más dentro de un una comunidad o la expresión diferencial bajo diferentes condiciones. Todas estas nuevas herramientas están permitiendo un estudio más profundo de las comunidades microbianas en diferentes ambientes, el descubrimiento de nuevos genes, enzimas, productos naturales, compuestos bioactivos y bioprocesos con grandes aplicaciones industriales, biotecnológicas, biomédicas, etc. (Chaugan, 2019). 1.4.1 Secuenciación del genoma bacteriano El desarrollo de las nuevas plataformas de secuenciación ha hecho posible la reducción de los costes y el tiempo de secuenciación de genomas y metagenomas, haciendo posible que actualmente tengamos a nuestro alcance un gran volumen de datos e información. El número de genomas depositados en bases de datos públicas ha aumentado de manera exponencial en los últimos años desde 4.434 genomas bacterianos secuenciados en el 2009 hasta más de 150.000 en la actualidad (GOLD, 2019). Debido a la gran cantidad y complejidad de datos generada por estas nuevas tecnologías, a lo largo de estos últimos años también se han ido han desarrollando nuevas plataformas y herramientas que ayudan a manejar y analizar todos los datos generados. 1.4.1.1 Análisis comparativo de genomas En el campo de la taxonomía, sistemática y filogenia, la secuenciación del gen ARNr 16S junto a otros genes conservados se sigue usando como una aproximación preliminar para la definición de nuevos taxones y establecer su relación evolutiva, aunque en muchas 3. ESTUDIO DE LA MICROBIOTA ASOCIADA A ALMEJA FINA Y JAPONESA MEDIANTE SECUENCIACIÓN MASIVA DEL GEN ARNr 16S. MICROBIOTA ASOCIADA A ALMEJA 67 3 ESTUDIO DE LA MICROBIOTA ASOCIADA A ALMEJA FINA Y JAPONESA MEDIANTE SECUENCIACIÓN MASIVA DEL GEN ARNr 16S. El desarrollo de las técnicas de secuenciación de segunda generación (NGS) ha supuesto una revolución en el estudios de la comunidad microbiana en diferentes organismos y ambientes. Algunos de los estudios de la microbiota de moluscos bivalvos realizados empleando estas técnicas se han centrado en el estudio de la microbiota total presente en el hospedador o un órgano en concreto (Trabal y col., 2014; Lokmer y col., 2015; Roterma y col., 2015; Lasa y col., 2016), mientras que otros han estudiado la variación de la microbiota entre diferentes órganos y tejidos (Lokmer y col., 2016, Vezzulli y col., 2017). En todos ellos se ha puesto de manifiesto la gran diversidad bacteriana presente en los moluscos bivalvos. Todos los estudios realizados hasta el momento de la microbiota asociada a la almeja fina (Ruditapes decussatus) y japonesa (Ruditapes philippinarum) se han centrado en las bacterias cultivables, donde los géneros predominante eran Vibrio y Psuedoalteromonas (Romalde y col., 2013; Balboa y col., 2016; Leite y col., 2017). La aplicación de las nuevas técnicas de secuenciación puede ayudar a tener un visión más profunda y real sobre la microbiota asociada a las almejas. En el presente capitulo hemos realizado un estudio de la microbiota asociada a almeja fina y almeja japonesa, durante los meses de abril y octubre, en dos localizaciones de la costa gallega (Redondela y Carril) mediante la secuenciación masiva de las regiones hipervariables V3 y V4 del gen ARNr 16S. 3.1 MATERIAL Y MÉTODOS 3.1.1 Muestreo y procesado de las muestras Los muestreos de almeja fina (Ruditapes decussatus) y almeja japonesa (Ruditapes philippinarum) se realizaron en las localizaciones de Redondela (42°17'40.4" N 8°36'57.2" W) y Carril (42°36'50.4" N 8°46'39.1" W) en dos períodos del año 2015 (finales de inviernoprincipios de primavera y finales de verano-principios de otoños). Durante los muestreos, la temperatura registrada del agua en abril fue alrededor de 14ºC en Carril y de 13 ºC en DIEGO GERPE PAZOS 68 Redondela, mientras que en el mes de octubre se registraron temperatura más elevadas tanto en Carril (16.5ºC) como en Redondela (15ºC). Se muestrearon un total de 25 ejemplares de cada especie en cada localización y en cada tiempo. A cada uno de los ejemplares se les extrajo asépticamente el manto, hepatopáncreas, gónada y branquia. Cada órgano de los 25 ejemplares de cada muestreo se homogenizó conjuntamente en PBS. Las muestras se conservaron a -20ºC hasta la extracción del ADN. Antes de la extracción de ADN, se realizó una concentración de las células bacterianas presentes en cada muestra con el fin de separar las células eucariotas de las procariotas. Se realizó mediante la creación de un gradiente usando OptiPrep (Sigma), un medio de densidad de gradiente compuesto por una solución de iodixanol al 60%. Para la creación del gradiente se diluyó el optiprep en una solución de: 0,25 M sacarosa, 6 mM EDTA, 60 mM Tris-HCl a pH 7,4. De esta forma se obtuvieron soluciones con iodixanol al 14%, 25% y 55% (v/w). Se inocularon 4 ml de cada solución en un tubo de ultracentrífuga, inoculando primero la solución de 55% de iodixanol, la de mayor densidad, seguido del iodixanol al 25% y al 14%. Por ultimo, se inocularon 10 ml de cada muestra y se centrifugó a 3800 rpm durante 60 min a 4-10ºC. Una vez realizada esta centrifugación, se recolectó la capa superior y se centrifugó otros 60 min a 5300 rpm a 4ºC. Se eliminó el sobrenadante y se realizó un lavado del pellet con 2 ml de PBS mediante una centrifugación a 13000g durante 30 min. Por último, el pellet resultante se resuspendió en 1 ml de PBS. Para la extracción del ADN genómico se utilizó el kit Masterpure Complete DNA and RNA purification (Epicentre Biotechnology) siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración y calidad del ADN se determinó mediante electroforesis en un gel de agarosa (agarosa al 1% p/v en un buffer de Trisacetato-EDTA [TAE]). El ADN extraído se conservó a -20ºC hasta su amplificación. 3.1.2 Amplificación y secuenciación Para la amplificación de las regiones hipervariables V3 y V4, se utilizaron los cebadores diseñados por Lee y col. (2012), 338F (5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’) y 806R (5’GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’) . Las condiciones de la PCR utilizadas para la amplificación se muestran en la Tabla 3.1. MICROBIOTA ASOCIADA A ALMEJA 69 Tabla 3.1. Condiciones de la PCR para la amplificación de las regiones V3 y V4 del gen ARNr 16S con los cebadores 338F y 806R Ciclos Temperatura Tiempo Desnaturalización inicial 94ºC 2 minutos Desnaturalización 30 ciclos 94ºC 20 segundos Hibridación 52ºC 30 segundos Elongación 72ºC 30 segundos Elongación final 72ºC 7 minutos Mediante un gel de agarosa al 2% (p/v) en TAE y usando el marcador GreenSafe DirecLoad (NZytech) se verificó la producción de los amplicones. La cuantificación de la concentración del ADN se realizó con el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher). Una vez obtenidos los amplicones, la creación de librerías y secuenciación de la muestra se realizó en el servicio de secuenciación de Sistemas Genómicos (Valencia, España) usando la plataforma Miseq de Illumina, generando lecturas de secuencias paired end 250 pp x 2, obteniéndose tras el ensamblado secuencias de unas 450 pares de bases. 3.1.3 Análisis bioinformático 3.1.3.1 Análisis de las secuencias La calidad de las lecturas obtenidas en la secuenciación se analizó con el programa FASTQC (Brabaham Bioinformatics), que genera un informe sobre el número, calidad y longitud de las secuencias, la presencia de adaptadores y cebadores. La eliminación de los adaptadores, cebadores y bases de baja calidad se realizó con el programa informático Trimmomatic 0.32 (Bolger y col., 2014). Para ello hizo falta configurar diferentes parámetros dentro del programa: ILLUMINACLIP: Elimina de las lecturas los adaptadores y secuencias especificas de Illumina. DIEGO GERPE PAZOS 70 SLIDINGWINDOW: realiza una limpieza mediante el método “ventana deslizante”. Se seleccionó el parámetro 4:15, de forma que si el promedio de calidad de los primeros 4 nucleotidos del extremo 5´ tiene una calidad por debajo del umbral 15, esta secuencia será eliminada. LEADING: Corta las bases del inicio de las lecturas que se encuentren por debajo del umbral de calidad seleccionado. Fue seleccionado el umbral de calidad 3 TRAILING: Corta las bases del final de la lectura que se encuentre por debajo del umbral de calidad. Se seleccionó el umbral de calidad 3. MINLEN: Elimina las secuencias que sean menores a la longitud seleccionada. Se seleccionó eliminar aquellas secuencias menores de 200 pb En nuestro caso, al tratarse de lecturas “paired-end”, el programa Trimmomatic realiza un análisis en el cual verifica que cada par de lectura este presente tanto en la lectura en sentido 5´ 3´ como en sentido 3´ 5´. Se generan 2 archivos paired (forward y reverse) en los cuales están presente los dos pares de lecturas y 2 archivos unpaired en las que no están presente un par de una de las lecturas. El siguiente paso consistió en unir (en inglés, Merging) mediante el programa Fastqjoin las lecturas que se encuentran en los archivos paired, de forma que se obtuvo un único archivo con todas las lecturas ensambladas. Los parámetros utilizados en el Fastq-join fueron: p: indica el porcentaje máximo de diferencia que tienen que tener los nucleótidos para que se unan las dos lecturas. El valor de p en los análisis fue 2. m: que indica el número mínimo de nucleótidos que tienen que superponerse para realizar la unión de las dos lecturas. El valor de m en los análisis fue 33. Posteriormente se procedió a la localizar y eliminar aquellas secuencias quiméricas originadas en las muestras. Estas secuencias son fallos producidos durante la amplificación, de forma que se obtiene una secuencia formada con dos secuencias de orígenes diferentes. Para ello se utilizó el programa vsearch (Rognes, 2016) Fig 3.1. Esquema formación de quimeras. Figura original. MICROBIOTA ASOCIADA A ALMEJA 71 3.1.3.2 Análisis taxonómico Una vez ensambladas y limpias las secuencias se procedió a su análisis mediante la herramienta online Silva (Quast y col., 2013). Mediante esta herramienta se realizó un control de calidad en el que se eliminaron todas aquellas lecturas con más del 2% de ambigüedad o homopolímeros y aquellas lecturas con menos de 50 nucleótidos alineados. También se excluyeron aquellas lecturas con una baja calidad de alineamiento, eliminando de esta forma cualquier artefacto o contaminación en el análisis. Para realizar el agrupamiento de las secuencias se seleccionó un umbral de similitud del 98%, de forma que todas aquellas lecturas que fueron similares en un 98% conformaron una Unidad Taxonómica Operacional, OTU (del ingles, Operational Taxonomic Unit). Además, la herramienta Silvangs, mediante cd-hit-est (version 3.1.2; http://www. bioinformatics.org/cd-hit) (Li and Godzik, 2006), identifica las lecturas idénticas (dereplication) y agrupa las lecturas únicas (OTUs). Para la clasificación de las OTUs se empleó la base de datos Silva (versión 132; http://www.arb-silva.de). Una vez obtenida la asignación taxonómica de las muestras, se eliminaron aquellas lecturas asignadas a mitocondrias, cloroplastos, así como las no asignadas a ningún grupo taxonómico. Todos aquellos grupos taxonómicos que presentaron menos del 1% de abundancia relativa sobre el total de la muestra, no se tuvieron en cuenta para el análisis de los resultados. 3.1.3.3 Análisis de diversidad Existen diferentes índices que nos permiten analizar la diversidad presente en una muestra e incluso comparar la diversidad entre varias muestras o ambientes. Por lo general, microbiología, la diversidad se describe en términos de la diversidad en una muestra (diversidad Alfa) y la diversidad entre muestras (diversidad Beta). Diversidad Alfa: se define como la riqueza de especies (número de taxones) que se encuentran dentro de un hábitat determinado o ambiente (Whittaker, 1960). La diversidad alfa puede asociarse con las curvas de rarefacción, que en nuestro caso se obtuvieron a partir de la herramienta online Silvangs (https://ngs.arb-silva.de/silvangs). El análisis de rarefacción consiste en una normalización de los datos que nos permite visualizar la diversidad presente entre diferentes comunidades cuando el tamaño de la muestra no es igual, midiendo el número DIEGO GERPE PAZOS 72 de OTUs que se encuentra en cada muestra. En las curvas de rarefacción se representa el número de lecturas frente el número de OTUs esperado. E(S) = numero esperado de especies u OTUs. N= número total de individuos en la muestra o lecturas. Ni= número de individuos de la iésima especie o OTU. n= tamaño de la muestra estandarizado. Además, la curva de rarefacción nos da una estimación del éxito de la secuenciación, de forma que si la curva no llega a la fase estacionaria, significa que no se ha alcanzado el número máximo de OTUs presente en la muestra y aumentando el esfuerzo de secuenciación obtendríamos más información de la diversidad presente en la muestra. Por otro lado, si la curva llega hasta la fase estacionaria, no haría falta realizar una secuenciación más profunda puesto que ya hemos alcanzado el número máximo de OTUs que están presentes en la muestra. Otro índice generado a través de la herramienta Silvangs fue el índice Chao-1, que es otra forma de calcular la diversidad alfa de una muestra. Mediante Chao-1, se estima el número de taxones en una comunidad en base al número de especies raras (Taxones que aparecen 1 o 2 veces) en las muestras (Chao, 1984; Chao y lee, 1992; Smith y Van Belle 1984). Diversidad Beta: se define como la diversidad a lo largo de un gradiente o entre distintos hábitats (Whittaker, 1960). Consiste en la comparación de la diversidad de las comunidades microbianas entre diferentes ambientes, o dicho de otra forma, las diferencias entre los perfiles de abundancia taxonómicos de diferentes ambientes o muestras. Para calcular la diversidad beta utilizó la herramienta CLC Genomics Workbench 10.1.1 (CLC Bio, QUIAGEN Company, Aarhus, Dinamarca). En primer lugar se obtuvo una matriz de S= número de especies en una muestra. a= número de especies en la muestra que están representadas solamente por un único individuo. b= número de especies en la muestra representa por 2 individuos. MICROBIOTA ASOCIADA A ALMEJA 73 distancias entre las muestras usando la distancia de Bray-Curtis, analizando de esta forma las diferencias en la composición (OTUs) entre las muestras. El segundo paso consistió en calcular la diversidad beta y generar el análisis de las coordenadas principales, PCoA (del inglés, Principal Coordinates Analysis). Utilizando el Paquete R VEGAN (Clarke, 1993; Oksanen 2017) se realizaron análisis con otros parámetros para determinar si las muestras se agrupaban de la misma forma que lo observado con el PCoA y así definir mejor las diferencias entre las comunidades microbianas. Por un lado, se elaboró una matriz de similitud aplicando las distancia de Bray-Curtis a partir de la cual se realizó el escalamiento multidimensional no métrico, NMDS (del inglés, Nonmetric Multidimensional Scaling). Por otro lado, se realizó el análisis de similitudes ANOSIM (del inglés, Analysis of similarities), con el cual comprobamos estadísticamente si existen diferencias significativas entre dos o más grupos de unidades de muestreo. Para ello se comparan los rangos de distancias entre los grupos con los rangos de distancia dentro de los mismos. Posteriormente se comparan las medias de ambos tipos de rangos, el valor resultante del test estadístico (R) mide si existe una separación entre ellos, de forma que un valor cercano a 0 indica que las comunidades microbianas son semejantes, mientras que un valor cercano a 1 indica que esa comunidad es diferente. Por otro parte, un valor p<0,05 indica que los resultados obtenidos mediante este análisis son significativos Finalmente, se elaboró un diagrama de VENN utilizando la aplicación Venny (http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html), para determinar el número de OTUs compartidos entre las muestras, a nivel de género. 3.2 RESULTADOS 3.2.1 Resultados de la secuenciación Una vez limpiadas las secuencias crudas de adaptadores, cebadores, quimeras y secuencias repetitivas a través de los programas Trimmomatic y Vsearch y tras el ensamblaje con el programa fastq-join, se obtuvieron un total de 441.672 lecturas de las muestras de almeja fina (R. decussatus) y almeja japonesa (R. philippinarum) con una longitud entre 453 y 460 pares de bases. DIEGO GERPE PAZOS 80 Tabla 3.5. Porcentajes de abundancia relativa de los géneros más abundantes en las muestras de almeja fina. C= Carril, R= Redondela, F= almeja fina, 1= Abril y 2= Octubre. CF1 RF1 CF2 RF2 Borrelia 3,7 6,8 1,3 2,0 Caedibacter 0,3 0,7 0,0 7,6 Endozoicomonas 8,8 0,6 1,6 1,4 Formosa 0,0 5,1 0,0 0,0 LWSR-14 (Rickettsiales) 0,0 4,8 0,1 15,1 Methylobacterium 0,3 0,2 11,5 13,2 Mycoplasma 3,9 17,9 10,7 0,3 Propionibacterium 7,8 2,9 3,9 3,8 Pseudoalteromonas 0,1 0,1 4,7 0,1 Psychrilyobacter 0,0 0,0 6,0 0,0 Psychrobacter 0,1 0,0 26,8 0,3 Staphylococcus 4,7 0,8 1,5 1,3 TM6 (Dependentiae) 1,9 6,3 0,6 0,9 Uncult. Propionibacteriaceae 22,0 2,8 0,7 22,5 Vibrio 3,4 2,8 7,3 1,5 Como se puede observar en el diagrama de Venn (Fig. 3.5), el porcentaje de OTUs compartidos entre las diferentes muestras de almeja fina supone un 23% del total de la comunidad. Además, se observa que las muestras de cada localización comparten un 2,6% de OTUs entre ellas (CF1º vs CF2º y RF1º vs RF2º). Al analizar la variación mensual entre la muestras se observó que el número de OTUs que comparten las muestras del mes Abril fue del 6,1%, mientras que las muestras de octubre solo comparten un 1.6% del total de los OTUs (Figura 3.5). MICROBIOTA ASOCIADA A ALMEJA 81 Figura 3.5. Diagrama de Venn representado el porcentaje de OTUs a nivel de género compartidos por las diferentes especies de almejas en las diferentes localizaciones y meses. R= Redondela, C= Carril, F= almeja fina, J= almeja japonesa, 1= Abril y 2= Octubre. Tabla 3.6. Resumen de las características de todas las muestras de almeja fina y japonesa: análisis de las secuencias, índices de diversidada/riqueza C= Carril, F= almeja fina, J= al japonesa, 1= Abril y 2= Octubre Muestra Nº secuencias Longitud promedio Nº OTUs % Clasificados Nº secuencias observadas una vez Nº secuencias observadas dos veces. Chao-1 CF1 46036 457 3908 99.02 1817 685 6313.01 CF2 71785 461 2196 92.94 615 254 2936.41 CJ1 69785 460 3765 94.95 856 467 4546.92 CJ2 76376 458 2313 99.41 618 266 3027.06 RF1 28904 460 3403 97.09 1336 623 4832.13 RF2 55553 453 2219 99.45 642 288 2930.98 RJ1 35823 460 2595 94.16 863 413 3493.44 RJ2 57410 455 1645 93.21 456 169 2255.24 DIEGO GERPE PAZOS 82 3.2.2.3 Análisis de la diversidad Todas las muestras mostraron una gran riqueza de OTUs, observándose un mayor número de OTUs en las muestras de almeja fina y almeja japonesa del período primaveral. El índice Chao-1 también indica una mayor diversidad en las muestras de abril, es decir, las muestras de Redondela y Carril de primavera tienen una mayor diversidad alfa que las muestras de Redondela y Carril en octubre (Tabla 3.6). Al realizar el análisis de coordenadas principales (PCoA) de las muestras de almeja fina y japonesa, se observó cómo las muestras del mes de octubre, sin importar la especie o la localización, se agrupan juntas, mientras que las muestras de abril se encuentran mucho más alejadas las unas de las otras. Algo muy parecido se observa en análisis NMDS, donde las muestras de octubre se agrupan más cerca entre ellas, lo que muestra una mayor divergencia existente entre las comunidades de abril que entre las muestras de octubre. (Figura 3.6). Figura 3.6. Representación del escalamiento multidimensional no métrico(NMDS) aplicando la matriz de distancia Bray-Curtis (A) y representación 3D del análisis de las coordenadas principales aplicando la matriz de distancias Bray-Curtis (B). CJ2 RF2 CF2 RJ2 CF1 CJ1 RF1 RJ1 A B MICROBIOTA ASOCIADA A ALMEJA 83 EL análisis de los gráficos y valores obtenidos a partir de análisis de similitudes (ANOSIM), muestra diferencias significativas entre los perfiles de la comunidad bacteriana de los muestras de almeja fina. Por otro lado, las diferencias en la composición de la comunidad de las muestras de almeja japonesa no fueron significativas (Fig. 3.7). Los valores obtenidos al comparar las muestras por localizaciones no indicaron diferencias significativas entre las comunidades bacterianas de la localización de Carril ni de Redondela. Figura 3.7. Diagramas de caja del análisis de similaridad (ANOSIM) entre las muestras de almeja fina (A) y japonesa (C) y entre las muestras de Redondela (B) y Carril (D). 3.2.3 Estudio de la microbiota asociada a los diferentes órganos de Ruditapes philippinarum y Ruditapes decussatus El número total de secuencias fue de 411.411 (93,15%) y se obtuvieron un total de 26.868 OTUs entre todas las muestras de los órganos de las dos especies. Las secuencias que pertenecen a los órganos de almeja fina fue de un total 202.278 y con una longitud entre 451 y 466 pares de bases. Aunque el número de secuencias obtenidas fue mayor en las muestras de hepatopáncreas y gónada, el número de OTUs observadas fue mucho en general en las muestras de gónada (ver Tabla 3.14). Entre el 94,04 y el 99,9% de las secuencias pudieron DIEGO GERPE PAZOS 84 asignarse taxonómicamente, excepto en la muestra de hepatopáncreas de Carril del mes de octubre (CFHP2) donde solo un 72% de las secuencias fueron asignadas taxonómicamente. La mayoría de las curvas de rarefacción de las muestras llegó a la fase de saturación. Las muestras RFM1 (manto de almeja fina de Redondela del mes abril), RFM2 (manto de almeja fina de Redondela del mes de octubre), RFG1 (gónada de almeja fina de Redondela del mes de abril) y CFM1 (Manto de almeja fina de Carril del mes de abril) no llegaron a la fase de saturación, por lo que el esfuerzo de secuenciación no fue suficiente para obtener todos los OTUs presentes en las muestras. (Fig. 3.8) Figura 3.8 Curva de rarefacción de los órganos de almeja fina representando el número de OTUs frente al número de secuencias analizadas. R= Redondela, C= Carril, F= almeja fina, M= manto, B= branquia, G= gónada, Hp= hepatopáncreas, 1= Abril y 2= Octubre. Por otro lado, el número de secuencias obtenidas en los órganos de almeja japonesa fue de 239.394 y con una longitud entre 453 y 460 pares de base. Se obtuvieron un total de 12.670 OTUs y en la mayoría de las muestras el porcentaje de secuencias taxonómicamente asignadas osciló entre 88,04 y 99,88%. Las muestras de branquias fueron en general las que rindieron un menor número de secuancias asignadas (44,01-99,63%)(ver Tabla 3.14). Las MICROBIOTA ASOCIADA A ALMEJA 85 muestras de gónada y hepatopáncreas se encuentran en la fase asintótica de la curva de rarefacción (CJHp1, RJHp1, CJGo1, RJHp2, CJGo2, RJGo2 y CJHp2), mientras que en los demás órganos las curva de rarefacción todavía se encuentra en la fase logarítmica, por lo que probablemente al aumentar el esfuerzo de secuenciación se podría estudiar la diversidad presente en la muestra (Fig. 3.9). Figura 3.9. Curva de rarefacción de los órganos de almeja japonesa representando el número de OTUs frente al número de secuencias analizadas. R= Redondela, C= Carril, J= almeja japonesa, M= manto, B= branquia, G= gónada, Hp= hepatopáncreas, 1= Abril y 2= Octubre. La asignación taxonómica de las secuencias, muestra un gran número de filos y géneros en todos los órganos. La mayoría de la microbiota encontrada en los órganos de almeja fina puede explicarse a partir de los filos Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroides, Tenericutes, Firmicutes, Fusobacteria y Spirochaetae. En el caso de almeja japonesa el 90% de la diversidad puede ser explicado mediante estos mismo filos, además del filo Chlamydiae. El número de géneros encontrados en los órganos de ambas almejas fue elevado, ya que, aún centrándonos en aquellos taxones que se encontraban con una abundancia mayor del 1%, la microbiota se encuentra formada por más de 60 géneros. DIEGO GERPE PAZOS 86 3.2.3.1 Microbiota asociada a los órganos de almeja japonesa (R. philippinarum) Existen diferencias en la abundancia relativa de los filos entre las localizaciones de Carril y Redondela. En la mayoría de lo órganos de Carril, el filo más abundante fue Proteobacteria, siendo más abundante en manto, branquia y gónada correspondientes al muestreo de otoño. En las muestras de Redondela, el filo Proteobacteria solo fue el más abundante en gónada durante el muestreo de otoño, mientas que otros filos como Bacteroidetes, Chlamydiae o Actinobacteria fueron los taxones más abundantes las muestras de lo demás órganos (Fig. 3.10). Figura 3.10. Abundancia relativa de los filos bacterianos presentes en los órganos de almeja japonesa. El gráfico muestra los porcentajes de aquellos filos (>1%) asignados a partir de las secuencias del gen ARNr 16S obtenidas a partir de Illumina. R= Redondela, C= Carril, F= almeja fina, J= al japonesa, M= manto, B= branquia, G= gónada, Hp= hepatopáncreas, 1= Abril y 2= Octubre.  Carril Analizando más profundamente la microbiota asociada a los órganos en Carril, se observó que existe un mayor diversidad en las muestras del mes abril que de octubre. Los filos más abundantes en el manto en primavera fueron Proteobacteria (43,5%), Actinobacteria (12,5%), Chlamydiae (12,7%) y Firmicutes (10,6%), mientras que en el mes de octubre la mayoría de la microbiota se encuentra representada por el filo Proteobacteria (86,3%). Lo mismo observamos en branquias, donde el filo Proteobacteria se encuentra con abundancias relativas 0% 20% 40% 60% 80% 100% CJM1 CJB1 CJG1 CJHp1 CJM2 CJB2 CJG2 CJHp2 RJM1 RJB1 RJG1 RJHp1 RJM2 RJB2 RJG2 RJHp2 Actinobacteria Bacteroidetes Candidatus Berkelbacteria Chlamydiae Cyanobacteria CPR2 Firmicutes Fusobacteria Planctomycetes Proteobacteria Saccharibacteria Spirochaetae Tenericutes TM6 (Dependentiae) WS6 Verrucomicrobia Otros MICROBIOTA ASOCIADA A ALMEJA 87 del 70,9% en el mes de octubre, mientras que en el mes de abril los filos principales fueron Proteobacteria (35,7) , Firmicutes (24,9%), Actinobacteria (16,6%) y Chlamydiae (10%). En la gónada del mes de abril, el 71,9% de la microbiota se encuentra representada por los filos Proteobacteria (36,3%) y Actinobacteria (35,6%), mientras que durante el mes de octubre el filo Proteobacteria constituye el 82% del total de la microbiota. El filo Tenericutes, aparece en el hepatopáncreas con abundancias relativas elevadas en el mes de abril (27%) y octubre (32,4%) y con porcentajes menores al 1% en los demás órganos en ambos meses. Al igual que en los otros órganos, el filo Proteobacteria fue el más abundante en el hepatopáncreas, tanto en abril (29,7%) como en octubre (36,6%)(Tabla 3.7). Tabla 3.7. Porcentajes de abundancia relativa de los filos más abundantes en los órganos de almeja japonesa de Carril. C= Carril, J= al japonesa, M= manto, B= branquia, G= gónada, Hp= hepatopáncreas, 1= Abril y 2= Octubre. CJM1 CJM2 CJB1 CJB2 CJG1 CJG2 CJHp1 CJHp2 Actinobacteria 12,5 2,0 16,6 10,1 35,6 7,6 9,2 14,7 Bacteroidetes 6,7 5,0 6,3 3,2 2,4 1,5 13,3 2,0 Chlamydiae 12,7 1,5 10,0 1,2 6,1 1,0 2,6 0,2 Firmicutes 10,6 0,9 24,9 3,9 11,1 4,7 4,5 9,5 Proteobacteria 45,3 86,3 35,7 70,9 36,3 82,0 29,7 36,6 Fusobacteria 0,3 0,9 0,9 7,6 0,1 0,3 0,2 1,5 Spirochaetae 8,2 2,2 2,4 0,3 0,6 0,2 0,2 0,9 Tenericutes 0,0 0,8 0,1 0,2 0,5 0,0 27,0 32,5 Saccharibacteria 0,2 0,1 0,3 0,5 1,3 0,3 1,1 0,3 TM6 2,0 0,1 1,6 1,1 2,0 0,4 7,6 0,4 En un nivel taxonómico más profundo (Tabla 3.8; Fig. 3.11), se observó que el género mayoritario en el hepatopáncreas fue Mycoplasma tanto en el mes de abril (28,9%) como en octubre (45,4%). El género Formosa aparecen con abundancias relativas del 10% en el hepatopáncreas del mes de abril. En el manto, el género Psychrobacter representa el 75,5% de la microbiota total durante el otoño, mientras que en primavera, los taxones mayoritarios fueron el género Vibrio (26%) y bacterias de la familia Chlamydiaceae (11,4%). En las DIEGO GERPE PAZOS 88 branquias, durante el mes de octubre, los géneros mayoritarios fueron Psychrobacter (20,7%), Vibrio (16,6%) y Pseudoalteromonas (12,3%). En el mes de abril, el género mayoritario fue Streptococcus con un 16,2%, seguido de bacterias de la familia Chlamydiaceae (9,1%) y los géneros Vibrio (8,8%) y Cutibacterium (8,8%). El género Methylobacterium fue el más abundante en gónada en el muestreo de otoño (39,1%), seguido del género Vibrio con un 23,9%. Por otro lado, en gónada del muestreo de primavera, los taxones predominantes fueron dos grupos de bacterias no cultivables pertenecientes a las familias Propionibacteriaceae (10,1%) y Legionellaceae (5,6%) (Fig. 3.11). Tabla 3.8. Porcentajes de abundancia relativa de los géneros más abundantes en los órganos de almeja japonesa de Carril. C= Carril, J= almeja japonesa, M= manto, B= branquia, G= gónada, Hp= hepatopáncreas, 1= Abril y 2= Octubre. CJM1 CJM2 CJB CJB2 CJHp CJHp2 CJG CJG2 Chlamydiaceae 11,4 1,3 9,1 0,5 0,1 0,0 3,5 0,6 Cutibacterium 6,1 1,0 8,8 4,0 1,9 12,1 11,0 3,2 Formosa 0,0 0,2 0,0 0,0 10,1 0,1 0,0 0,0 Ilumatobacter 0,8 0,2 0,0 0,5 0,8 0,1 5,6 0,3 Methylobacterium 0,6 0,0 0,3 0,3 0,3 0,4 0,6 39,1 Mycoplasma 0,0 0,7 0,1 0,1 28,9 45,5 0,0 0,0 Pelagicola 0,0 0,0 5,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Pseudoalteromonas 0,5 1,4 0,1 12,3 0,1 0,2 0,1 0,3 Psychrilyobacter 0,0 0,7 0,0 6,4 0,1 1,5 0,0 0,2 Psychrobacter 1,2 75,6 0,1 20,7 0,1 0,0 0,1 1,3 Staphylococcus 2,0 0,2 3,2 1,0 0,4 3,6 2,3 1,3 Streptococcus 2,5 0,2 16,2 0,7 0,9 1,9 2,5 1,3 Sphingomonas 0,8 0,1 0,4 1,0 0,6 0,3 2,0 6,9 Spirochaeta 2 7,9 1,0 2,3 0,1 0,0 0,1 0,6 0,0 Vibrio 26,0 1,6 8,9 16,6 0,9 1,7 3,7 24,0 Uncult. Legionellaceae 1,2 0,2 0,4 0,2 1,9 0,1 5,7 0,7 Uncult. Propionibacteriaceae 0,2 0,1 0,6 2,5 3,2 1,1 10,2 0,5 Se observó una mayor diversidad de géneros bacterianos en todos los órganos correspondientes al muestreo de primavera con respecto al de otoño. Mientras que en los órganos analizados en el mes octubre, 1 o 2 géneros conforman el 50% de la microbiota total MICROBIOTA ASOCIADA A ALMEJA 89 (o incluso, en el caso del manto, un único género conforma el 75% de la microbiota total), en órganos correspondientes al muestreo de primavera se observa una microbiota mucho más heterogénea. Figura 3.11. Abundancia relativa de los géneros bacterianos presentes en los órganos de almeja japonesa. El gráfico muestra los porcentajes de aquellos géneros (>1%) asignados a partir de las secuencias del gen ARNr 16S obtenidas a partir de Illumina. R= Redondela, C= Carril, F= almeja fina, J= al japonesa, M= manto, B= branquia, G= gónada, Hp= hepatopáncreas, 1= Abril y 2= Octubre. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% CJM CJB CJHp CJG CJM2 CJB2 CJHp2 CJG2 RJM RJB RJHp RJG RJM2 RJB2 RJHp2 RJG2 uncultured (Actinomarinales) Ilumatobacter Corynebacterium 1 Lawsonella Dermacoccus Janibacter Micrococcus Rothia Cutibacterium uncultured (Propionibacteriaceae) uncultured (Marinifilaceae) Alloprevotella uncultured (Microscillaceae) uncultured (Blattabacteriaceae) Formosa Polaribacter 3 Polaribacter 4 Chryseobacterium ML602M-17 (Bacteroidia) Chlamydiaceae Babeliales Vermiphilaceae Sulfurovum Gemella Staphylococcus Lactobacillus Leuconostoc Streptococcus Clostridiales vadinBB60 group Anaerococcus Finegoldia Romboutsia Fusobacterium Psychrilyobacter Berkelbacteria CPR2 (Patescibacteria) Saccharimonadales WS6 (Dojkabacteria) Caulobacter Phenylobacterium Reyranella Methylobacterium Pseudahrensia Thermopetrobacter Afipia Bradyrhizobium Aliiroseovarius Pelagicola Sulfitobacter AB1 (Rickettsiales) uncultured (Anaplasmataceae) SM2D12 (Rickettsiales) uncultured (Rickettsiales) Novosphingobium Sphingomonas Pseudoalteromonas Psychromonas Coxiella Yersinia uncultured (Francisellaceae) Gammaproteobacteria Incertae Sedis Candidatus Berkiella Legionella uncultured (Legionellaceae) Marine Methylotrophic Group 3 Neptunomonas Psychrobacter Vibrio Spirochaeta 2 uncultured (Spirochaetaceae) Mycoplasma <1% DIEGO GERPE PAZOS 96 más abundante también fue el orden Rickettsiales (23,3%). El género Endozoicomonas aparece con porcentajes cercanos al 6% en las branquias de ambos meses.(Figura 3.13). Fig. 3.13. Abundancia relativa de los géneros bacterianos presentes en los órganos de almeja fina. El gráfico muestra los porcentajes de aquellos géneros (>1%) asignados a partir de las secuencias del gen ARNr 16S obtenidas a partir de Illumina. R= Redondela, C= Carril, F= almeja fina, J= al japonesa, M= manto, B= branquia, G= gónada, Hp= hepatopáncreas, 1= abril y 2= octubre. En la gónada del mes de abril, el porcentaje de bacterias no cultivables de la familia Spirochaetaceae fue mayor (18,3%). que en el mes de octubre (2,9%). Al igual que pasaba en Carril, el género Methylobacterium fue más abundantes en las gónadas del mes de octubre (32,1%), mientras que en el mes de abril, su abundancia relativa fue menor del 1%. El orden 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% CFM CFB CFHp CFG CFM2 CFB2 CFHp2 CFG2 RFM RFB RFHp RFG RFM2 RFB2 RFHp2 RFG2 Ilumatobacter Corynebacterium 1 Lawsonella Dietzia Mycobacterium Micrococcus Rothia PeM15 (Actinobacteria) Cutibacterium uncultured (Propionibacteriaceae) Bacteroides uncultured (Marinifilaceae) Alloprevotella uncultured (Microscillaceae) Formosa NS4 marine group (Flavobacteriaceae) Polaribacter 4 uncultured (Flavobacteriaceae) Babeliales UBA12409 (Babeliales) Vermiphilaceae Sulfurovum Staphylococcus Streptococcus Clostridium sensu stricto 1 Anaerococcus Fusobacterium Psychrilyobacter CPR2 (Patescibacteria) Saccharimonadales WS6 (Dojkabacteria) Methylobacterium Aliiroseovarius Sedimentitalea AB1 (Rickettsiales) MD3-55 (Midichloriaceae) Candidatus Megaira Novosphingobium Sphingomonas uncultured (Sphingomonadaceae) Aeromonas Pseudoalteromonas Psychromonas Aquabacterium Coxiella Escherichia-Shigella Yersinia uncultured (Francisellaceae) Candidatus Berkiella Legionella uncultured (Legionellaceae) Endozoicomonas Neptunomonas Psychrobacter Pseudomonas Photobacterium Vibrio uncultured (Gammaproteobacteria) Sphaerochaeta Spirochaeta 2 uncultured (Spirochaetaceae) Mycoplasma Rubritalea <1% MICROBIOTA ASOCIADA A ALMEJA 97 Rickettsiales, aparece con porcentajes elevados en las gónadas del mes octubre (17,9%) y abril (12,3%). Tabla 3.14. Porcentajes de abundancia relativa de los géneros más abundantes en los órganos de almeja fina de Redondela.R= Redondela, J= al japonesa, M= manto, B= branquia, G= gónada, Hp= hepatopáncreas, 1= Abril y 2= Octubre. RFM1 RFM2 RFB RFB2 RFHp RFHp2 RFG RFG2 AB1 (Rickettsiales) 7,5 17,4 23,6 33,3 0,0 0,0 12,3 17,9 Methylobacterium 0,1 0,1 0,5 0,5 0,2 2,4 0,3 32,1 Mycoplasma 1,6 0,7 2,2 0,8 26,7 0,1 1,0 0,2 Uncult. Propionibacteriaceae 0,8 0,1 0,0 0,4 4,1 65,2 0,2 0,3 Uncult. Spirochaetaceae 36,0 18,5 4,9 1,1 0,2 0,0 18,4 2,9 Uncult. Francisellaceae 2,4 20,4 2,7 22,4 0,0 0,0 2,4 4,0 Uncult. Microscillaceae 11,3 0,3 0,2 0,1 0,0 0,4 0,9 0,1 Formosa 0,1 0,1 0,1 0,0 7,8 0,0 0,0 0,0 Sphingomonas 0,4 0,7 0,3 0,5 0,5 0,8 1,1 9,2 Uncult. Flavobacteriaceae 7,3 0,6 2,5 0,4 0,0 0,0 0,2 0,0 Cutibacterium 2,0 1,7 5,9 1,8 1,4 7,0 7,3 2,5 Endozoicomonas 0,2 0,1 5,9 5,7 0,1 0,0 0,5 0,4 Vibrio 4,9 1,0 9,4 1,0 0,9 0,5 5,4 2,8 En el hepatopáncreas los géneros más abundantes en abril fueron Mycoplasma (24,6%), Formosa (7,8%) y bacterias no cultivables de la familia Propionibacteriaceae (4,1), mientras que en octubre la mayoría de la microbiota estaba compuesta principalmente por bacterias no cultivables de la familia Propionibacteriaceae (65,2%). 3.2.3.3 Comparativa entre la microbiota asociada a los diferente órganos de almeja fina y japonesa Al analizar las muestras a nivel de género, se observa como ciertos géneros o grupos de bacterias presentaron cierta especificidad en algunos órganos. El género Methylobacterium fue uno de los géneros predominantes en las gónadas del mes de octubre de ambas especies de almeja, mientras en el mes de abril no aparece con DIEGO GERPE PAZOS 98 abundancias relativas superiores al 3%. El género Mycoplasma aparece asociado a los hepatopáncreas de todas las muestras, en Redondela su abundancia se reduce en octubre, mientras que en Carril ocurre lo contrario. El género Psychrobacter se encuentra en porcentaje muy elevados en el manto de ambas especies de almeja durante el mes de octubre en la localización de Carril (CFM2 y CJM2), mientras que en el resto de muestras de manto aparece con porcentajes inferiores al 1%. Otros grupos de bacterias no cultivables de la familia Propionibacteriaceae fueron los microorganismos más abundantes en las muestras de hepatopáncreas de Redondela durante el mes de octubre en ambas especies de almeja (RJHP2, RFHP2). Estas bacterias no cultivables, también se encuentran como el taxón más abundante en las muestras de gónada de ambas especies de almejas en Carril (CJG, CFG) durante primavera. El género Formosa aparece en hepatopáncreas durante el mes de abril en Carril y Redondela en ambas especies, con abundancias relativas en las muestras CJHP, RJHP y RFHP del 8-10%. Este género no aparece en ninguna otra muestra de este estudio con valores mayores al 1%. El género Endozoicomonas aparece asociado a las branquias de almeja fina de ambas localizaciones, siendo el género mayoritario en branquias en el muestreo de abril en Carril. En almeja japonesa este género no se encuentra con abundancias relativas superiores del 1%. La familia Chlamydiaceae se encuentra en las muestras de manto, branquia y gónada de almeja japonesa en Carril y Redondela, descendiendo su abundancia en todas las muestras durante el mes de octubre. (Fig. 3.14). 3.2.3.4 Análisis de diversidad entre órganos La microbiota de los órganos de almeja fina está compuesta por un gran número de OTUs, siendo las muestras de hepatopáncreas y gónada las que presentan mayor diversidad al analizar tanto el número de OTUs como el índice Chao-1. En las muestras de almeja japonesa también se obtuvieron valores elevados del índice Chao-1, observándose una mayor riqueza en las muestras de abril que en las muestras de octubre, con excepción del hepatopáncreas (Tabla 3.14). MICROBIOTA ASOCIADA A ALMEJA 99 Figura 3.14. Abundancia relativa de los géneros bacterianos presentes en los órganos de almeja fina y japonesa ordenados por órganos. El gráfico muestra los porcentajes de aquellos géneros (>1%) asignados a partir de las secuencias del gen ARNr 16S obtenidas a partir de Illumina. R= Redondela, C= Carril, F= almeja fina, J= al japonesa, M= manto, B= branquia, G= gónada, Hp= hepatopáncreas, 1= Abril y 2= Octubre. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% CFM CFM2 RFM RFM2 CJM CJM2 RJM RJM2 CFB CFB2 RFB RFB2 CJB CJB2 RJB RJB2 CJHp CJHp2 RJHp RJHp2 CFHp CFHp2 RFHp RFHp2 CJG CJG2 RJG RJG2 CFG CFG2 RFG RFG2 <1% AB1 (Rickettsiales) Aeromonas Afipia Aliiroseovarius Alloprevotella Anaerococcus Aquabacterium Babeliales Berkelbacteria Bacteroides Candidatus Berkiella Candidatus Megaira Caulobacter Clostridium sensu stricto 1 Chlamydiaceae Corynebacterium 1 Coxiella Chryseobacterium Clostridiales vadinBB60 group CPR2 (Patescibacteria) Corynebacterium 1 Coxiella CPR2 (Patescibacteria) Cutibacterium Dermacoccus Dietzia Endozoicomonas Escherichia-Shigella Finegoldia Formosa Fusobacterium Ilumatobacter Gammaproteobacteria Incertae Sedis Gemella Janibacter Lactobacillus Lawsonella Legionella MD3-55 (Midichloriaceae) Leuconostoc Marine Methylotrophic Group 3 Methylobacterium Micrococcus Mycobacterium Mycoplasma Neptunomonas Novosphingobium ML602M-17 (Bacteroidia) NS4 marine group (Flavobacteriaceae) PeM15 (Actinobacteria) Photobacterium Polaribacter 3 Polaribacter 4 Pelagicola Phenylobacterium Pseudoalteromonas Pseudomonas Pseudahrensia Psychrilyobacter Psychrobacter Psychromonas Reyranella Romboutsia Rothia Rubritalea Saccharimonadales Staphylococcus Streptococcus Sedimentitalea Sphaerochaeta Sphingomonas Spirochaeta 2 Vibrio SM2D12 (Rickettsiales) Sulfitobacter Sulfurovum WS6 (Dojkabacteria) Yersinia Vermiphilaceae Thermopetrobacter uncultured (Actinomarinales) uncultured (Anaplasmataceae) uncultured (Blattabacteriaceae) UBA12409 (Babeliales) uncultured (Flavobacteriaceae) uncultured (Francisellaceae) uncultured (Legionellaceae) uncultured (Gammaproteobacteria) uncultured (Marinifilaceae) uncultured (Microscillaceae) uncultured (Propionibacteriaceae) uncultured (Spirochaetaceae) uncultured (Rickettsiales) uncultured (Sphingomonadaceae) DIEGO GERPE PAZOS 100 Tabla 3.14. Resumen de las características de todas las muestras de los órganos de almeja fina y japonesa, análiisi de las secuencias, índices de diversidad/riqueza C= Carril, F= almeja fina, J= al japonesa, M= manto, B= branquia, G= gónada, Hp= hepatopáncreas, 1= Abril y 2= Octubre . Muestra Nº secuencias Longitud promedio Nº OTUs % Clasificados Nº secuencias observadas una vez Nº secuencias observadas dos veces. Chao-1 CFM 1 6024 463 844 97.44 409 159 1365.48 CFB 1 8583 465 829 99.11 393 143 1363.92 CFG 1 17903 454 2549 98.91 1324 504 4283.31 CFHp 1 13526 454 437 99.65 114 38 602.15 CFM 2 9929 466 429 99.68 164 59 651.77 CFB 2 14102 457 559 99.26 139 83 673.18 CfG 2 29734 460 1092 99.90 356 169 1463.71 CFHp2 18020 464 654 72.79 127 70 766.69 RFM 1 2532 462 381 94.08 227 51 874.29 RFB 1 2231 458 417 94.04 251 60 931.34 RfG 1 5105 458 861 97.90 378 190 1234.05 RFHp 1 19036 460 2455 97.53 902 469 3319.58 RFM 2 3251 459 379 99.14 178 67 610.66 RFB 2 12018 457 639 99.60 179 91 812.16 RfG 2 21290 451 1108 99.50 284 159 1359.16 RFHp 2 18994 451 565 99.58 151 53 774.72 CJM 1 7340 462 599 98.83 178 93 766.59 CJB 1 5462 462 522 72.28 245 103 809.40 CJG 1 26402 457 1434 93.41 252 133 1670.01 CJHp1 30581 461 2042 99.36 441 284 2382.42 CJM 2 3887 466 285 98.56 153 35 608.00 CJB 2 22202 462 982 99.63 272 108 1320.13 CJG 2 27372 454 774 99.88 150 87 900.99 CJHp 2 22915 456 918 98.66 241 125 1147.52 RJM 1 1899 463 171 88.94 103 19 433.65 RJB 1 3912 465 350 68.71 178 49 665.06 RJG 1 6003 456 706 98.23 246 129 937.81 RJHp 1 24009 460 1879 97.62 578 307 2420.41 RJM2 5153 462 395 88.03 206 57 759.05 RJB 2 1738 464 240 47.01 147 36 530.03 RJG 2 25621 454 874 94.02 155 106 985.54 RJHp 2 24898 454 499 96.61 94 39 608.28 MICROBIOTA ASOCIADA A ALMEJA 101 El análisis de PCoA de los órganos de las dos especies de almejas, resaltó una mayor similitud entre la diversidad bacteriana de las diferentes muestras de hepatopáncreas. Las muestras del manto se agrupan de manera diferente según la localización, en Redondela las muestras del manto de misma especie se agrupan juntos (RFM con RFM2 y RJM con RJM2), lo cual indica que tienen una diversidad bacteriana similar. En Carril, las muestras del manto se agrupan juntos en el mes de octubre (CJM2 con CFM2) pero no en abril. (Figura 3.15). Figura 3.15. Representación 3D del análisis de las coordenadas principales aplicando la matriz de distancias Bray-Curtis (B). C= carril, R= Redondela, M= manto, G= branquia, Go= gónada, Hp= hepatopáncreas, 1= abril y 2= octubre. Las muestras de gónadas de ambas especies de almejas en otoño se encuentran agrupadas, lo cual indica que presentan un alto nivel de similitud en su diversidad bacteriana. Por el contrario, las gónadas del muestreo de abril son más diferentes entre ellas, ya que se observan bastante alejadas unas muestras de las otras. En el análisis NMDS se visualiza mejor como las muestras del hepatopáncreas se encuentran alejadas una de las otras y de las demás muestras, lo cual indica la gran diferencia en diversidad encontrada en este órgano en ambas especies. (Figura 3.16). DIEGO GERPE PAZOS 102 Figura 3.16. Representación del escalamiento multidimensional no métrico(MDS) aplicando la matriz de distancia Bray-Curtis. C= carril, R= Redondela, M= manto, G= branquia, Go= gónada, Hp= hepatopáncreas, 1= abril y 2= octubre. 3.3 DISCUSIÓN El gran número de lecturas obtenidas después de la limpieza de las lecturas crudas y el ensamblado, así como el gran número de OTUs observados por muestra, indican la alta diversidad presente en la microbiota de almeja fina y japonesa en ambas localizaciones y meses. Además, el número de OTUs y los índices Chao-1 observados en abril, indican una mayor riqueza de especies durante este mes. Los análisis del PCoA y NMDS mostraron una microbiota más similar entre las muestras de otoño que entre las de primavera, ya que estas se encuentran agrupadas más cerca las unas de las otras. Además, al analizar la microbiota de las muestras en cada estación, observamos diferencias entre los taxones presentes en las muestras del mes de abril y las del mes de octubre. Estas diferencias probablemente puedan ser explicadas y relacionadas con la temperatura del agua, que fue 2ºC mayor en el mes de octubre, y el estado fisiológico de las almejas las cuales se encontraban sexualmente maduras en este período. Por otro lado el análisis de similitud (ANOSIM) mostró una mayor diferencia en las comunidades microbianas entre las muestras de almeja fina que entre las muestras de almeja japonesa, por lo que la almeja fina muestra una microbiota mucho más heterogénea MICROBIOTA ASOCIADA A ALMEJA 103 que la almeja japonesa. Al observar las muestras por órganos, las muestras de hepatopáncreas y gónada fueron las que presentaron un mayor número de OTUs y valores más altos del índice Chao-1. Los análisis del PCoA y NMDS muestran una distribución diferente de las muestras según el órgano, aunque las muestras tienen una composición microbiana bastante similar ya que se encuentran agrupadas muy cerca entre ellas. Las muestras del hepatopáncreas presentan una microbiota diferente al resto de los órganos ya que se encuentra más alejadas del resto de las muestras. El filo más abundante en la mayoría de las muestras fue Proteobacteria. Esto ya se había observado en otros estudios acerca de la microbiota de moluscos bivalvos mediante las nuevas herramientas de secuenciación (Trabal y col., 2014; Lasa y col., 2016, Vezulli y col., 2017). Existe un incremento de este filo durante el mes de octubre que podría ser explicado por el aumento de la temperatura, ya que algunos géneros de este filo como puede ser el género Vibrio, se ven favorecidos por el aumento de la temperatura del agua. En todos los órganos se produce un aumento de este filo durante el mes de octubre excepto en las muestras de hepatopáncreas. La posible función del filo Proteobacteria ya ha sido estudiada en otros invertebrados marinos. Las especies de este filo son capaces de degradar la celulosa y el agar, que son los compuestos mayoritarios que se encuentran en la alimentación de moluscos bivalvos. Además, algunos grupos de bacterias del filo Proteobacteria son capaces de fijar el nitrógeno en el tracto gastrointestinal de moluscos bivalvos (Prieur y col., 1990; Harria, 1993; Zehr y col., 2003 y Newell, 2004). El filo Actinobacteria mostró una dinámica diferente dependiendo de la localización. Se observó un incremento en octubre en los ejemplares de Redondela y un descenso durante este mismo mes en las muestras de Carril. Este filo aparece con abundancias relativas elevadas en la muestras de hepatopáncreas, siendo el filo más abundante en el hepatopáncreas de Redondela. Se ha detectado en ambiente acuáticos contaminados con metales pesados y en procesos de biorremediación (Chen y col., 2015). Las Actinobacterias intervienen en el medio marino ayudando a descomponer materia orgánica y existen estudios en los que han asociado el aumento de diatomeas y dinoflagelados en el medio con un aumento de bacterias de este filo (Eckert y col., 2012; Bunse y col., 2016). Por lo tanto, la elevada presencia de este filo en el hepatopáncreas tendría sentido al ser el órgano que se encarga de la digestión en las almejas. Además, el aumento de este filo en el medio acuático ha sido asociado en las etapas finales de un afloramiento de diatomeas (Zhou y col., 2018), por lo tanto, el aumento de Actinobacteria en el hepatopáncreas de ambas especies de DIEGO GERPE PAZOS 104 almejas en Redondela en el mes de octubre, también podría explicadarse por la existencia de mareas rojas en la zona del muestreo días previos al muestreo. Otro filo que se encuentra con bastante abundancia en hepatopáncreas es Tenericutes. Diferentes estudios asocian este filo con la microbiota el sistema digestivo de ostras (C. virginica y Saccostrea glomerata), abalones (Haliotis discus subspecies hannai) mejillones (Villosa nebulosa y Mytilus spp) gasterópodos (Benedictia baicalensis) (Tanaka y col., 2004; Green y Barnes., 2010; King y col., 2012; Aceves y col., 2018; Rubiolo y col., 2018; Shtykova y col., 2018). La gran mayoría de las OTUs detectadas y que pertenecen a este filo, se corresponden con el género Mycoplasma (más del 90%), que también ha sido descrito en moluscos bivalvos anteriormente (Harshbarger y Chang, 1977; Paillard y col. 2004; Loggans y col., 2006; Winters y col., 2011; King y col., 2012; Arfken y col., 2017; Milan y col., 2018). La mayoría de los estudios que existen acerca de este género se centran en su patogenicidad (Bower y col., 1991, 1992, 1994; Azevedo, 1993) pero lo cierto es que su posible papel en el sistema digestivo o su función ecológica están poco estudiados, siendo probablemente comensales no perjudiciales en la mayoría de los casos. El filo Bacteroidetes aparece con mayor abundancia relativa en abril que en octubre, siendo esta diferencia mayor en las muestras de Redondela. La abundancia de este filo en moluscos bivalvos ya había sido descrita en otros estudios (Trabal y col., 2014; Lasa y col., 2016). El filo Bacteroidetes se puede encontrar en diferentes ambientes, desde suelos y océanos hasta en el tracto gastrointestinal de animales. Algunos estudios hablan de la importancia de este filo en la degradación de materia orgánica polimérica como la celulosa y pectinas (Thomas y col., 2011) o de su papel clave limitando la colonización de bacterias potencialmente patógenas (Troy y Kasper, 2010). Es posible que las bacterias de este filo se encuentren realizando alguna de estas funciones beneficiosas para las almejas. En las muestras del manto de Redondela, más del 90% de las OTUs detectadas del filo Bacteroidetes, fueron identificados como bacterias no cultivables de la familia Microscillaceae, sin embargo existe poca información sobre esta familia. En un estudio sobre el intestino de gusanos de tierra se observó un incremento de la representación de esta familia al exponer los gusanos metales pesados como el cromo (Tang y col., 2019) y también se ha encontrado en biopelículas de tanques de cultivo de Dentex dentex (Turgay y col., 2019). El filo Spirochaetae se encuentra con una abundancia relativa elevada en el manto de almeja fina procedentes de ambas localizaciones geográficas. Gran parte de las OTUs MICROBIOTA ASOCIADA A ALMEJA 105 asignadas a este filo en estas muestras (más del 70%), se corresponde con un grupo de bacterias no cultivables de la familia Spirochaetaceae. La abundancia de esta familia ha sido asociada en otras especies de moluscos bivalvos como indicador de un buen estado sanitario (Lasa y col., 2019, King y col., 2019). Firmicutes aparece presente en todas la muestras con porcentajes muy semejantes. Este filo es bastante común en moluscos bivalvos y ambiente acuáticos (King y col., 2012; Trabal y col., 2014; Roterman y col., 2015; Lokmer y col ., 2015; Lasa y col 2016). El género Formosa se encuentra con abundancia relativa elevada en el hepatopáncreas de las almejas durante el mes de abril. La mayoría de las especies de este género han sido aisladas a partir de algas (Nedashkovskaya y col. 2006; Ivanova y col.. 2004; Park y col. 2013), pero también se han aislado de abalones y espongas (Tanaka y col., 2015; Yoon y Oh 2011). Una de las funciones que se han descrito sobre especies de este género es la capacidad que tienen para degradar polisacáridos de algas (Man y col., 2013), por lo que su función en el hepatopáncreas podría ser semejante. El género Methylobacterium fue más abundante durante el mes de octubre en la dos localizaciones geográficas y especies de almejas. Este género no aparece en otros estudios de moluscos bivalvos con estas abundancias. Algunas especies dentro de este género tiene la capacidad de sintetizar carotenoides y mevalonato (Van Dien y col., 2003; Liang y col., 2017). También pueden absorber la radiación UV-A, pudiendo actuar como protector para las almejas (Yoshida y col., 2017). Methylobacterium se encuentra en octubre como uno de los géneros mayoritarios en gónada, las cuales se encontraban muy desarrolladas durante este período. Este género posiblemente cumpla alguna función protectora o de síntesis de compuestos necesarios durante la maduración sexual de la gónada. El género Sphingomonas también aparece con una abundancia relativa elevada en gónadas del mes de octubre. Este género ya se había descrito asociado a gónada en otros bivalvos como Pecten maximus (Lasa y col., 2016). Romanenko y col. (2007) demostraron que diferentes especies del género Sphinogmonas, aisladas a partir de moluscos bivalvos, poseían actividad antimicrobiana frente a diferentes bacterias patógenas. Sería interesante un estudio más profundo de la función de estos géneros en gónada de almeja. En el caso de almeja fina, el género Endozoicomonas se encuentra con abundancia en primavera, asociado a las branquias de almeja fina. Este género se ha descrito como simbionte en multitud de organismos marinos, como esponjas, cnidarios, moluscos, tunicados y peces DIEGO GERPE PAZOS 112 4.1 MATERIAL Y MÉTODOS 4.1.1 Muestreo Para la realización de este estudio se seleccionaron 20 ejemplares de almejas del muestreo realizado en el capitulo 3 de la presente tesis. Se analizaron 5 ejemplares de almeja fina (Ruditapes decussatus) y 5 ejemplares de almeja japonesa (Ruditapes philippinarum) del mes de octubre de cada una de las localizaciones. Los ejemplares se diseccionaron en condiciones asépticas, separando con la ayuda de unas pinzas y un bisturí estéril cuatro órganos: manto, branquia, hepatopáncreas y gónada. Posteriormente, se homogenizaron las muestras de cada órgano con solución salina al 0,85% en relación 1:1 (p/v). 4.1.2 Procesado de las muestras 4.1.2.1 Técnica de dilución a extinción A partir de los homogenados obtenidos, se determinó el número de células viables en cada una de las muestras usando el kit Live/Dead BacLight bacterial viability (Invitrogen). En primer lugar, se centrifugó 1 ml de cada muestra a 4000 g durante 2 min y se recogieron 500 µ l del sobrenadante. A estos 500 µ l se le añadieron 1,5 µ l de propidio iodado y 1,5 µ l de SYTO9 (reactivos del kit). La mezcla se incubó a temperatura ambiente y en oscuridad durante 15 min. Transcurrido este tiempo se realizó una centrifugación a 5000 g durante 4 min y se resuspendió el pellet en 100 µ l de PBS. El número de células viables se determinó en un microscopio de fluorescencia, de forma que las células viables se visualizarían en verde y las células no viables en rojo. A continuación, se ajustó cada una de las muestras para inocular 1-5 células en cada uno de los 96 pocillos de una placa con Caldo Marino (Difco) diluido 10 y 100 veces. Una vez inoculadas todas las muestras se incubaron durante 60 días en oscuridad a 24±1ºC. Transcurridos los dos meses, se sembraron cada uno de los pocillos en AM (MA, Difco) diluido 10 (AM1/10) o 100 veces (AM1/100), se incubaron 5 días a 24±1ºC y se aislaron las colonias diferentes morfológicamente. Los cultivos puros obtenidos se conservaron a -80ºC en Caldo Marino diluido 10 o 100 veces suplementado con un 15% de glicerol (v/v). (Fig.1) DILUCIÓN A EXTINCIÓN 113 Figura 4.1. Esquema de metodología utilizada en dilución a extinción y siembra directa. 4.1.2.2 Metodología clásica A partir de los homogenados obtenidos, se realizaron diluciones seriadas y se sembraron 100 µ l de cada una de las diluciones en placas de Agar Marino (AM, Difco) y de Tiosulfato-Citrato-Bilis-Sacarasa (TCBS, Oxoid). Las placas se incubaron durante 24/48 h a 24± 1ºC. Una vez incubadas, se aislaron las colonias morfológicamente diferentes en AM y se incubaron 24±1ºC durante 24 h. Los cultivos puros obtenidos se conservaron a -80ºC en Caldo Marino (Difco) suplementado con un 15% de glicerol (v/v). 4.1.3 Extracción de ADN cromosómico El ADN cromosómico de las células bacterianas se extrajo a partir de los cultivos puros obtenidos utilizando el kit comercial InstaGene matrix (Bio-Rad). Las células bacterianas de los cultivos puros, obtenidos en AM, AM1/10 o AM/100, se resuspendieron en 1 ml de agua destilada esterilizada 3 veces y se centrifugaron a 12000 rpm durante 1 min, desechando el sobrenadante. El pellet se resuspedió en 200 µ l de la matriz InstaGene y se incubó a 56ºC durante 30 min. A continuación, las muestras se agitaron en un vórtex durante 10 segundos, se incubaron a 100ºC durante 8 minutos, y se agitaron otros 10 segundos. Por Homogenados de almejas 24/48 h 24±1ºC -Amplificación y secuenciación del gen 16SARNr 27F (5′ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 1510R (5′ - GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) Microscopio de fluorecencia Live/Dead Baclight bacterial viability Kit (Invitrogen) CM 1/10 CM1/100 25ºC/60días 5 días 24±1ºC AM 1/10 AM 1/100 TCBS Y AM 1-5 células DIEGO GERPE PAZOS 114 último, las muestras se centrifugaron a 12000 rpm durante 2 min. La concentración de ADN de cada muestra se calculó utilizando el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher), ajustando el ADN a 1000 ng/µ l. Este ADN extraído de cada muestra se conservó a - 20ºC hasta su uso. 4.1.4 Amplificación y secuenciación del gen 16S ARNr Para la amplificación del gen ARNr 16S se utilizó el kit comercial DreamTaq PCR MasterMix (Thermo Scientific) que contiene: la enzima polimerasa DreamTaq, Buffer DreamTaq, MgCl2 y dNTPs). Los cebadores utilizados para amplificar el gen ARNr 16S fueron el cebador directo 27F (5’–AGAGTTTGATCCTGGCTCAG–3’) y el cebador reverso 1510R (5’–GGTTACCTTGTTACGACTT–3’) que flanquean un fragmento de unos 1540 pares de base (Hutson y col., 1993). Para la realización de la PCR se añadieron: 12.5 µ l de la Dreamtaq MasterMix, 9.5 µ l de agua triestéril y 1 µ l del cebador 27F y 1 µ l del cebador 1510R y 1 µ l de ADN de la muestra ajustada a una concentración de 1000 ng/µ l. Las condiciones de PCR utilizadas para amplificación son la que se muestras en la Tabla 4.1. Tabla 4.1. Condiciones de la PCR para la amplificación del gen ARNr16S. Ciclos Temperatura Tiempo Desnaturalización inicial 94ºC 2 minutos Desnaturalización 35 ciclos 94ºC 1 minuto Hibridación 56ºC 1 minuto Elongación 72ºC 1 minuto Elongación final 72ºC 5 minutos Los productos de la amplificación se analizaron mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa a una concentración del 1% (p/v) en tampón Tris–Acetato–EDTA (TAE) 1X (Sambrook et al. 1989), a los que se adicionó una dilución 1:10000 del reactivo GelRed Nucle Acid Gel Stain 10000X (Biotium) diluyendo el reactivo en la solución de agarosa. Las condiciones de electroforesis fueron de 120 V durante 20 min y los geles se visualizaron en DILUCIÓN A EXTINCIÓN 115 un transiluminador de ultravioleta (GelDoc 100, Bio–Rad). El marcador de referencia utilizado fue FastRuler Low Range DNA (Thermo Scientific) que permite determinar peso molecular de fragmentos entre los entre los 50 pb y 1500 pb. Las muestras amplificadas se enviaron al laboratorio STAB VIDA, Investigaçao e Serviços en Cincias Biológicas, donde fueron secuenciadas mediante el método Sanger. 4.1.5 Análisis filogenético El análisis de las secuencias obtenidas se llevó a cabo usando el paquete de programas DNASTAR Lasergene. Las secuencias se corrigieron manualmente mediante el programa SeqMan (Lasergene, USA). La identificación de cada una de las secuencias se realizó a través de la base de datos EZBiocloud (https://www.ezbiocloud.net)(Yoon y col., 2017) Para los estudios filogenéticos de las secuencias se utilizó el programa Mega versión 7 (Kumar y col., 2016) mediante el cual se alinearon las secuencias usando la herramienta CLUSTAL W (Larkin y col., 2007) y se construyeron los árboles filogenéticos utilizando el algoritmo de Neighbour–joining (NJ) (Saitou y Nei, 1987), aplicando el modelo evolutivo Kimura-2-parametros (Kimura, 1980). 4.2 RESULTADOS 4.2.1 Dilución a extinción Se obtuvieron un total de 132 aislados mediante la técnica de dilución. De ellos, 41 se corresponden con las muestras de R. philippinarum de Carril, de las cuales 13 se asilaron a partir de AM 1/10 (CJ1/10) y 28 de AM1/100 (CJA1/100). A partir de R. decussatus se obtuvieron 34 aislados, 13 de AM1/10 (CF1/10) y 21 de AM 1/100 (CF1/100). En Redondela, se identificaron 30 aislados de R. philippinarum, 17 de AM1/10 (RJ1/10) y 13 de AM1/100 (RJ1/100). A partir de las muestras de R. decussatus se obtuvieron un total 28 aislados, 16 a partir de AM1/10 (RF1/10) y 12 de AM1/100 (RF1/100)(Tabla 4.2). DIEGO GERPE PAZOS 116 Tabla 4.2. Número de aislados obtenidos en cada muestreo mediante las técnicas clásica y de dilución a extinción.. Carril Redondela AM AM1/10 AM1/100 AM AM1/10 AM1/100 R. decussatus 21 13 21 35 16 12 R. philippinarum 26 13 28 13 17 13 Tras la identificación mediante la base de datos Ezbiocloud, analizando las secuecnias a nivel de filo, se observó que el filo Gammaproteobacteria fue el más abundante en todas las muestras. Además, el filo Actinobacteria aparece con mayor abundancia en las muestras de AM1/100 de almeja japonesa y fina de Carril, CJA1/100 (29,6%) y CFA1/100 (42,9%). El filo Betaproteobacteria solo aparece representado en las muestras de Carril de almeja japonesa con porcentajes del 7,7% (CJ1/10) y 3,7% (CJ 1/100) (Fig. 2). A nivel de género, se observó una alta prevalencia del género Pseudomonas en todas las muestras de AM1/100, siendo más abundante en las almejas de Redondela. En las muestras de AM1/10 los géneros predominantes fueron Pseudomonas y Shewanella, con porcentajes muy semejantes entre ambos, constituyendo más del 50% de los aislados. Por otro lado, al analizar los géneros presentes en las muestras, se observó una mayor diversidad de géneros en las muestras de Carril que en las muestras de Redondela. Además, en Carril el número de géneros diferentes encontrado en las muestras de AM1/100 fue más elevado que en AM1/10. (Fig. 4.2). En la localización de Carril, en las muestras de almeja japonesa de AM1/10 (CJA1/10) los géneros predominantes fueron Pseudomonas (30%), Shewanella (23%) y Aeromonas (23%). Otros géneros como Janthinobacterium, Citrobacter y Rahnella, fueron menos abundantes con alrededor de un 7% cada uno. En el caso de los aislados de almeja fina obtenidos de AM1/10 (CFA1/10), los géneros más abundantes fueron Shewanella, Pseudomonas, Aeromonas y Brachybacterium (30%, 23%, 15% y 15%, respectivamente). Otros géneros como Micrococcus y Rahnella aparecieron con abundancias alrededor del 7%. Como ya hemos mencionado previamente, el número de géneros encontrados en las muestras de AM1/100 fue mayor que en las muestras de AM1/10. En las muestras de CJA1/100, los géneros Pseudomonas y Micrococcus consituyen el 40% del total de los aislados, el otro 60% DILUCIÓN A EXTINCIÓN 117 se encuentra formado por varios géneros: Shewanella, Aeromonas, Rahnella, Janthinobacterium, Lelliottia, Microbacterium, Brachybacterium, Brevudimonas, Acinetobacter, Vibrio, Stenotrophomonas, Sphingobacterium y Serratia (con porcentajes entre el 3 y 7%). El 50 % de los aislados de almeja fina de AM1/100 (CFA1/100) se identificaron como especies de los géneros Pseudomonas, Acinetobacter y Gordonia. Los géneros Micrococcus y Microbacterium se encuentra los dos con porcentajes cercanos al 10%, mientras que el otro 28% de los aislados se encuentra formado por especies de los géneros Shewanella, Lelliotia, Brevundimonas, Sphingomonas y Janibacter. Figura 4.2. Abundancias relativas a nivel de filo obtenidas de Ruditapes decussatus y Ruditapes philippinarum. El gráfico muestra los porcentajes de aislados asociados a cada filo mediante la identificación en la base de datos EzBiocloud de los fragmentos amplificados del gen ARNrv16S. RF= R. decussatus de Redondela, RJ= R. philippinarum de Redondela, CF= R. decussatus de Carril y CJ= R. philippinarum de Carril. 2= Siembra directa, 1/10= Agar Marino diluido 10 veces y 1/100= Agar Marino diluido 100 veces. En Redondela, los aislados recuperados mediante dilución a extinción están representados por menor número de géneros que en las muestras de almejas de Carril. En las muestras de almeja fina y japonesa de Redondela obtenidas a partir de AM1/10 (RJA1/10 y RFA1/10), los géneros más abundantes fueron Pseudomonas y Shewanella, representando el 60% de los aislados de RJ1/10 y el 80% de RF1/10. En las muestras de AM1/100 el género 7,4 9,5 8,3 5,9 7,7 3,7 92,3 59,3 76,9 47,6 87,5 92,3 100,0 91,7 92,3 95,2 75,0 88,2 29,6 23,1 42,9 12,5 7,7 8,3 7,7 4,8 5,9 16,7 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Alphaproteobacteria Betaproteobacteria Gammaproteobacteria Actinobacteria Bacteroidetes DIEGO GERPE PAZOS 118 Pseudomonas fue el más abundante tanto en almeja japonesa (77%) como en almeja fina (42%). El género Serratia se encuentra con porcentajes del 15-16% en ambas especies de almejas y el género Rahnella aparece representando el 25% de los aislados en las muestras de almeja fina de AM1/100. Este género solo se encontró en las muestras de dilución a extinción y la mayoría de los aislados fueron identificados como Rahnella victoriana y Rahnella aquatilis (Anexo 1). 4.2.2 Metodología clásica A partir de las muestras de siembra directa en AM y TCBS se obtuvieron un total de 95 aislados. De los 48 que se obtuvieron a partir de las almejas procedentes de Redondela, 35 de fueron de las muestras de R. decussatus y 13 de R. philippinarum. De las muestras de Carril se aislaron un total de 47 aislados, de los cuales 21 se obtuvieron a partir de R. decussatus y 26 de R. philippinarum. El filo mayoritario fue Gammaproteobacteria, con porcentajes superiores al 88% en la mayoría de las muestras, excepto en la muestra de almeja japonesa de Redondela (RJ2), donde constituye un 75% de los aislados. El filo Bacteroidetes representa casi un 17% y Alphaproteobacteria un 8,3% (Fig. 4.3). El género mayoritario en todas las muestras fue Vibrio, con porcentajes entre el 42% y 57% del total de la microbiota. En Carril, el género Pseudomonas fue el segundo género mas abundante tanto la almeja fina (24%) como en almeja japonesa (27%). El género Shewanella se encontró en las muestras de almeja japonesa de Carril y de almeja fina de Redondela, con porcentajes del 19% y 20%, respectivamente. Otros géneros detectados con menor proporción fueron Bacillus, Tenacibaculum, Photobacterium, Aliiroseovarius, Agarovorans, Cellulophaga, Endozoicomonas, Pseudomonas, Kiloniella, Acinetobacter y Aliivibrio. Las muestras procedentes de Redondela presentaron una mayor diversidad bacteriana que las de Carril. DILUCIÓN A EXTINCIÓN 119 Figura 4.3. Abundancias relativas a nivel de género obtenidas de Ruditapes decussatus y Ruditapes philippinarum. El gráfico muestra los porcentajes de aislados asociados a cada género mediante la identificación en la base de datos EztBioCloud de los fragmentos amplificados del gen ARNr 16S. RF= R. decussatus de Redondela, RJ= R. philippinarum de Redondela, CF= R. decussatus de Carril y CJ= R. philippinarum de Carril. 2= Siembra directa, A1/10= Agar Marino diluido 10 veces y A1/100= Agar Marino diluido 100 veces. 4.2.3 Géneros comunes Las muestras procedentes de siembra directa y de dilución a extinción comparten solamente 3 géneros: Vibrio, Pseudomonas y Shewanella. El género Vibrio se encuentran representado por un único aislado en las muestras de dilución a extinción. Por el contrario, en siembra directa solo se detectó un aislado identificado como Pseudomonas. Aunque el número de aislados del género Shewanella en las muestras fue elevado, al comparar los aislados a nivel de especie, en dilución a extinción la gran mayoría fueron identificados como Shewanella hafniensis, mientras que ninguno de los aislados obtenidos en siembra directa se 3,70 14,29 23,08 3,70 15,38 6,25 2,94 8,33 2,94 5,88 7,69 4,76 5,88 3,70 15,38 7,41 4,76 8,33 7,69 4,76 2,94 14,29 4,76 7,69 3,70 2,94 3,70 4,76 7,41 9,52 18,52 7,69 9,52 12,50 7,69 8,33 3,85 4,76 2,94 26,92 23,81 8,33 5,88 30,77 22,22 23,08 23,81 31,25 76,92 37,50 41,67 8,33 7,69 7,41 7,69 12,50 25,00 3,70 6,25 15,38 12,50 16,67 23,08 3,70 30,77 4,76 31,25 43,75 19,23 9,52 8,33 20,59 3,70 4,76 7,41 8,33 8,33 42,31 57,14 50,00 47,06 6,25 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% CJA 1/10 CJA 1/100 CFA 1/10 CFA 1/100 RJA 1/10 RJA 1/100 RFA 1/10 RFA 1/100 CJ2 CF2 RJ2 RF2 Acinetobacter Aeromonas Agarivorans Aliiroseovarius Aliivibrio Bacillus Brachybacterium Brevundimonas Cellulophaga Citrobacter Dietzia Endozoicomonas Gordonia Janibacter Janthinobacterium Kiloniella Lelliottia Microbacterium Micrococcus Photobacterium Pseudoalteromonas Pseudomonas Rahnella Serratia Shewanella Sphingobacterium Sphingomonas Stenotrophomonas Tenacibaculum Vibrio Yersinia DIEGO GERPE PAZOS 120 identificaron próximos a esta especie. Las especies detectadas mediante siembra directa en AM y TCBS (S. electrodiphila, S. sairae, S. aestuarii, S. pneumatophori, S. colwelliana, S. echelgeliana y S. algidipiscicola) no fueron detectados a partir de los aislados de las muestras de dilución a extinción. Al realizar un análisis filogenético del género Shewanella, los aislados de dilución a extinción se encontraban agrupados, cercanos a la especie S. hafniensis, mientras que los aislados de siembra directa, se encontraban distribuidos en diferentes linajes dentro del género Shewanella, alejados de los aislados de dilución a extinción (Fig. 4.4). 4.3 DISCUSIÓN Los géneros identificados mediante siembra directa en AM y TCBS, son muy semejantes a los obtenidos en un estudio anterior realizado por nuestro grupo (Romalde y col., 2013), donde los géneros Vibrio y Pseudoalteromonas fueron los géneros mayoritarios asociados a la microbiota de la almeja fina (R. decussatus) y japonesa (R. philippinarum). Sin embargo, los géneros identificados en las muestras de dilución a extinción difirieron bastante de los de siembra directa. El género Vibrio, solo estaba representado por un aislado en la muestra diluida de almeja fina de Carril (CFA1/100), mientras que el género Pseudoalteromonas no apareció en ninguna de las muestras de dilución a extinción. Muchos de los géneros descritos mediante la técnica de dilución a extinción no habían sido detectados con anterioridad formando parte de la microbiota de almeja fina y japonesa (Balboa y col., 2016). Además, en este estudio, fueron muy pocos los géneros comunes aislados con ambas técnicas simultáneamente. Uno de estos géneros es el género Shewanella que se asocia habitualmente a la microbiota de bivalvos (Romalde y col., 2013), aunque la especie detectada en este trabajo con mayor frecuencia, S. hafniensis, nunca se había aislado a partir de moluscos. DILUCIÓN A EXTINCIÓN 121 Figura 4.4. Árbol filogenético obtenido medialte el método NJ basado en las secuencias del gen ARNr 16S de, los aislados pertenecientes al género Shewanella obtenidos mediante la siembra directa (en AM y TCBS) y dilución a extinción, y las especies del género Shewanella más próximas a nuestros aislados. Barra, el número se corresponde con el número de sustituciones nucleotídicas por sitio. En los nodos se muestran los valores de boostrap iguales o mayores del 50% como porcentaje de 1000 peudoréplicas. CJA13(1/10) CJA1(1/10) CJA3(1/10) CFA4(1/100) RFA6(1/10) CJA15(1/100) RFA8(1/10) RFA9(1/10) RFA14(1/10) RFA12(1/10) RJA6(1/10) RJA16(1/10) RJA12(1/10) CFA8(1/10) CFA3(1/10) RFA1(1/10) Shewanella hafniensis P010T (AB2055661) CFA6(1/10) Shewanella seohaensis S7-3T (GU944672) Shewanella decolorationis S12T (AXZL01000039) Shewanella putrefaciens JCM20190T (BALN01000043) Shewanella profunda DSM15900T (FR733713) RJA13(1/10) RFA13(1/10) Shewanella glacialipiscicola T147T (AB205571.1) Shewanella baltica NCTC10735T (AJ000214.1) Shewanella oneidensis MR-1T (AE014299) Shewanella xiamenesis S4T (FJ589031) Shewanella morhuae U1417T (AB205576.1) Shewanella psychromarinicola M2T (CP034073) Shewanella vesiculosa M7T (AM980877.1) Shewanella livingstonis LMG19866T (AJ300834.1) Shewanella vesiculosa LMG24424T (RKKD01000007) Shewanella inventionis KX27T (KT781407) Shewanella litoralis MMS16-UL482T (KX621128) Shewanella ulleungensis MMS16-UL253T (KY047616) Shewanella basaltis J83T (EU143361.1) Shewanella saliphila MMS16-UL250T (MF996862) Shewanella algicola ST-6T (FJ903681) Shewanella frigidimarina ACAM 591T (SFU85903) Shewanella olleyana ACEM-9T (AF295592.1) Shewanella electrodiphila MAR441T (FR744784) Shewanella donghaensis LT17T (AY326275.1) Shewanella japonica KCTC22435T (CP020472) RF19 RF11 CF11 Shewanella gaetbuli TF-27T (AY190533.1) Shewanella denitrificans OS217T (CP000302) Shewanella aestuarii SC18T (JF751044) RF8 Shewanella intestini XMDDZSB0408T (KU663649) Shewanella spongiae HJ039T (DQ167234.1) Shewanella irciniae UST040317-058T (DQ180743.1) Shewanella marina C4T (EU290154.1) Shewanella gelidii RZB5-4T (KR080702) Shewanella sediminis HAW-EB3T (CP000821) Shewanella canadensis HAW-EB2T (AY579749) Shewanella atlantica HAW-EB5T (AY579752.1) Shewanella violacea DSS12T (AP011177) Shewanella marinisediminis DH39T (GQ869534) Shewanella woodyi ATCC 51908T (CP000961) Shewanella hanedai CIP 103207T (X82132.1) Shewanella piezotolerans WP3T (AJ551090.1) Shewanella benthica ATCC43992T (X82131) Shewanella surugensis c959T (AB094597) Shewanella gelidimarina ACAM456 (SGU85907) Shewanella fidelis KMM3582T (AF420312.1) Shewanella loihica PV-4T (CP000606) Shewanella glacialipiscicola T147T (AB2055711) Shewanella aquimarina SW-117T (AY485225.1) Shewanella waksmanii KMM 3823T (AY170366) Shewanella psychrophila WP2T (AJ551089.1) Shewanella kaireitica c931T (AB094598) Shewanella pneumatophori SCRC-2738T (AB204519) RF13 RJ3 RJ2 Shewanella schlegeliana HRKA1T (AB081760.1) RF7 Shewanella sairae SM2-1T (AB081762) Shewanella marinintestina IK-1T (AB081757) Shewanella marisflavi SW-117T (AY485224.1) Shewanella abyssi c941T (AB201475) Shewanella pealeana ATCC 700345T (CP000851) Shewanella halifaxensis HAW-EB4T (CP000931) Shewanella algidipiscicola S13T (AB205570.1) CJ14 Shewanella colwelliana ATCC39565T (AY653177) RF24 CJ13 CJ12 Shewanella litorisediminis SMK1-12T (JQ824139) Shewanella amazonensis SB2BT (CP000507) Shewanella carassii 08MAS2251T (MF164482) Shewanella indica KJW27T (HM016084) Shewanella algae JCM 21037T (BALO01000089) Shewanella corallii fav-2-10-05T (FJ041083) Shewanella submarina NIO-S14T (KX645967) Shewanella mangrovi YQH10T (KJ751544) Shewanella haliotis DW01T (EF178282.1) Shewanella chilikensis JC5T (FM210033) Shewanella fodinae JC15T (FM203122) Shewanella dokdonensis UDC329T (GQ245918) E. Coli LN831047 91 100 97 99 99 75 73 94 99 90 97 76 66 75 58 82 50 54 96 50 98 52 95 58 73 90 90 97 66 72 63 71 67 65 68 50 67 54 56 76 69 86 88 72 74 66 68 0.01 DIEGO GERPE PAZOS 128 5.1 MATERIAL Y MÉTODOS. 5.1.1 Origen aislados y condiciones de cultivo Para la realización de este estudio se seleccionaron un total de 5 aislados obtenidos mediante la técnica de dilución a extinción (ver capítulo 4), a partir de muestras de almeja fina (R. decussatus) y almeja japonesa (R. philippinarum) procedentes de Redondela (42°17'40.4" N 8°36'57.2" W) y Carril (42°36'50.4" N 8°46'39.1" W). Las cepas utilizadas se muestran en la Tabla 5.1, especificando cuales se aislaron a partir de AM diluido 10 veces y de AM dilucido 100 veces. Tabla 5.1. Aislados seleccionados para el estudio. 1/10= aislados obtenidos de AM diluido 10 veces y 1/100= aislados obtenidos de AM diluido 100 veces. Origen Especie de almeja Código aislado Carril Almeja fina CFA14(1/10) Carril Almeja japonesa CJA9(A1/10), CJA17(1/100) Redondela Almeja fina RFA10(1/100), RFA1(1/10) Todos los aislados se cultivaron a 241ºC durante 24/48 h en AM y se conservaron congeladas a -80ºC en caldo marino con 15% (v/v) de glicerol. 5.1.2 Caracterización bioquímica 5.1.2.1 Metodología clásica Para el estudio fisiológico y bioquímico de los diferentes aislados, se realizó una caracterización fenotípica siguiendo los protocolos descritos por Mac Faddin (1993) y Romalde y col. (1990) descritos a continuación:  Morfología y movilidad. Se determinó a partir de una suspensión en solución salina de una colonia de un cultivo puro y su visualización directa a 40X en un microscopio óptico (Leica DM750) GÉNERO RAHNELLA 129  Carácter Gram. Para la determinación del carácter Gram de los aislados se utilizó el método desarrollado por Buck (1989) con KOH. Con la ayuda de un palillo se coge una colonia de un cultivo puro y se dispersa sobre una gota de KOH al 3% sobre un portaobjetos limpio y se observa si se produce viscosidad o no. El KOH reacciona con la membrana fosfolipídica externa de las bacterias Gram negativa produciendo viscosidad en la gota, en caso contrario no se observa ningún cambio en la textura  Oxidasa Esta prueba consiste en la detección de la enzima citocromo-oxidasa mediante el método de Kovacs (1956). Para ello se preparó una solución acuosa de tetrametil– parafenil–diamina-dihidrocloridio al 1% y se impregnó un papel de filtro Whatman Nº1. Con la ayuda de un palillo estéril se extendió sobre el filtro una porción de cultivo fresco. Las bacterias que contengan la enzima oxidasa producen un color violáceo al entrar en contacto con el reactivo. Las bacterias oxidasa negativas no producen cambio alguno.  Catalasa Para la detección de la enzima catalasa se puso sobre un portaobjetos una gota de peróxido de hidrógeno y con la ayuda de un asa de siembra o un palillo estéril se extiendió un poco de cultivo fresco. La formación de burbujas indica la presencia de la enzima catalasa que está convirtiendo el peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua.  Oxidación-Fermentación de la glucosa Para la determinación de metabolismo oxidativo o fermentativo de los aislados se utilizó el medio basal O/F de Hugh y Leifson (1953) y ZOFT (Lemos y col., 1985) suplementados con un 1% de glucosa. A partir de un cultivo líquido en Caldo Marino, se inocularon dos tubos de cada medio, uno de ellos se cubrió con parafina líquida para así mantener condiciones de anaerobiosis y el otro se dejó en condiciones de aerobiosis. Se incubaron a 24±1ºC durante una semana. Si se produce un cambio de color del medio a amarillo solo en los tubos en aerobiosis, indica que la bacteria tiene un metabolismo oxidativo. Si cambia de color tanto en aerobiosis como en anaerobiosis, tendrán un metabolismo fermentativo.  Crecimiento en TCBS El medio TCBS (tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa) es un medio selectivo-diferencial para vibrios. Se inoculó la bacteria en la placa de TCBS (Oxoid) y se incubó a 24±1ºC DIEGO GERPE PAZOS 130 durante 24/48h horas. Si la bacteria crece y fermenta sacarosa el color de las colonias será amarillo, mientras que sí crece y no fermenta sacarosa, el color será de color verde.  Sensibilidad al agente vibriostático 0/129 Para ver la resistencia o sensibilidad a la pteridina (agente vibriostático 0/129) se empleó medio Agar Mller–Hinton (Oxoid) con NaCl al 1% (MHA–1) y los discos comerciales de 150 g de 0/129 (Oxoid). A partir de una suspensión de bacteria en caldo marino y con la ayuda de un hisopo estéril se sembró en una placa de MHA-1, se colocó un disco comercial y se dejó incubando 24/48h a 24±1ºC. Transcurrido el tiempo de incubación se determinó la resistencia o sensibilidad según los halos de inhibición formados.   Decarboxilación/dihidrólisis de aminoácidos. Con esta prueba testamos la capacidad de las bacterias para la decarboxilación o dihidrólisis enzimática de arginina, lisina y ornitina, produciendo aminas y alcalinizando el medio. Esta reacción se produce en anaerobiosis. El medio utilizado fue Moëller (Difco) suplementado con L-arginina, L-lisina o L-ornitina con una concentración final del 1% (p/v). A partir de un cultivo líquido, se inoculó la bacteria y se cubrieron los tubos con parafina líquida. Se dejó incubar a 24±1ºC durante 1 o 2 semanas. Si se produce la alcalinización del medio, los tubos se vuelven de color violeta, debido al indicador de pH púrpura de bromocresol.  Reacción del indol Este método consiste en determinar la producción del metabolito indol debido a la degradación del aminoácido triptófano por acción de la enzima triptofanasa. Para determinar la liberación del indol se utilizaron tubos de Caldo triptona (Difco) suplementado con 1% de Nacl. Se inoculó unas gotas de bacteria resuspendida en Caldo Marino y se incubó durante 24/48 h a 24±1ºC. Transcurrido el tiempo de incubación se añadieron unas gotas del reactivo de Kovacs (Kovacs, 1956). La aparición de un anillo color rosa en la parte superior del tubo indica la liberación de indol.  Prueba Voges Proskauer Mediante esta prueba se determinó la capacidad de los microorganismos de fermentar la glucosa por medio de la ruta butanodiólica, que tiene como producto intermedio la acetoína. Se inocularon las bacterias en caldo rojo de metilo-Voges Proskauer (MR-VP, Difco). Tras 48h de incubación, se le añadieron los reactivos alfa–naftol (5%) y KOH GÉNERO RAHNELLA 131 (40%). La aparición de una coloración marrón–rojiza en la parte superior del tubo indica la producción de acetoína por parte del microorganismo.  Reducción de Nitratos Esta prueba consiste en determinar la capacidad de ciertos microorganismos de reducir los nitratos a nitritos. Para ello se inoculó la bacteria en un tubo con medio líquido con extracto de carne 0,3%, peptona 0,5%, nitrato potásico 0,1% y NaCl 1%. Después de incubarlo 24/48 h a 24±1ºC, los tubos se revelaron añadiendo a partes igual los reactivos 5 g de α–naftilamina en 1000 ml de ácido acético 5N (30%) y 8 g de ácido acético sulfanílico en 1000 ml de ác. acético 5N (30%). La aparición de un color granate indica que el microrganismo es capaz de reducir nitratos a nitritos.  Utilización del citrato En esta prueba se determina la utilización del citrato como única fuente de carbono. Para ello se utilizaron tubos con medio citrato de Simmons (Difco), que contiene citrato de sodio, fostato de amonio y azul de bromotimol, suplementado con un 1% de NaCl. El azul de bromotimol es un indicador de pH, de forma que se vuelve azul a pH básico. Las bacterias capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono, también usan las sales de amonio como única fuente de nitrógeno, basificando medio, de forma que se vuelve azul.  Hidrólisis del almidón Para realizar este ensayo se sembró la bacteria en una placa con medio AM suplementado con un 0,4% de almidón y se incubó a 24±1ºC durante 24/48 h. Se añadieron unas gotas de lugol a la placa que reacciona con el almidón tiñéndolo de color azul. La aparición de un halo transparente alrededor de la colonia, indica que el microorganismo está hidrolizando el almidón mediante la enzima α -amilasa.  Hidrólisis de esculina Los microorganismos a ensayar se hicieron crecer en una placa de AM con un 1% de esculina y 0,05% de citrato férrico y se incubaron 24/48 h a 24±1ºC. Las bacterias capaces de hidrolizar la esculina van a producir esculetina, que reacciona con el citrato férrico formando sales insolubles de hierro que producen una coloración negra alrededor de la colonia. DIEGO GERPE PAZOS 132  Producción de lipasas Para determinar la presencia de esta enzima se sembró la bacteria en una placa de AM con una concentración de Tween 20 al 1%. La aparición de un halo opaco alrededor de la colonia indica la producción de la enzima lipasa.  Urea Mediante esta prueba se determina la capacidad de la bacteria para romper la urea en dos moléculas de amonio por acción de la enzima ureasa. Las bacterias se inocularon en un medio con glucosa-peptona, urea al 2% y el rojo fenol como indicador de pH. Si el resultado es positivo el medio vira de color amarillo a rojo/rosa debido a la alcalinización del medio provocada por el amonio.  Producción de ácido y gas a partir de glucosa. Se empleó un medio Peptona 10 g/l, rojo fenol 0,0018 g/l, con un 1% de glucosa y 1% de NaCL. Además, en cada tubo se introdujo una campana de Durham para determinar la producción de gas. Los tubos se incubaron 24/48 h a 24±1ºC. Si el del medio cambia a color amarillo indica que la bacteria produce ácido y si se forma una burbuja dentro de la campana indica la producción de gas por parte de la bacteria.  Crecimiento a diferentes temperaturas Para establecer un rango de temperatura de crecimiento, los aislados se hicieron crecer en placas de AM a 4ºC, 25ºC, 37ºC y 44ºC. El tiempo de incubación fue de 24/48h. Las placas de 4ºC se incubaron 10 días debido a que el crecimiento de la bacterias a bajas temperaturas suele ser más lento.  Crecimiento a diferentes salinidades. El estudio del rango de crecimiento a diferentes salinidades se realizó en placas con un medio basal de agar (1 g/l de extracto de levadura [Oxoid]; 4 g/l neopeptona [Difco]; 15 g/l agar [Pronadisa]) suplementado con sesalts (Sigma), del 0,5% al 10% (p/v). Por otro lado, también se determinó el rango de crecimiento a diferentes concentración de Nacl. Se realizó en placas con medio basal de agar suplementado con diferentes concentraciones de Nacl, del 0,5% al 10% (p/v). Las placas se incubaron a 24±1ºC durante una semana. GÉNERO RAHNELLA 133  Crecimiento a diferentes pH. El rango de crecimiento a diferentes pH se determinó sembrando los aislados en placas de AM con pH del 0,5 a 11. Las placas se incubaron a una temperatura de 24±1ºC durante 7 días.  Utilización de diferentes azúcares. Se utilizaron tubos con el medio ZOFT (Lemos y col., 1985) suplementado con diferentes azúcares al 1%. Los azúcares a ensayar fueron arabinosa, sacarosa, maltosa, manosa, manitol y sorbitol. Se incubaron a 24±1ºC durante 24/48h. El cambio de color del medio a amarillo indica que la bacteria es capaz de utilizar el azúcar de estudio.  Utilización de diferentes fuentes de carbono Para determinar el uso de diferentes compuestos como única fuente de carbono se siguieron las indicaciones de Baumann y Baumann (1981). Las placas se incubaron a 24±1ºC durante 10 días. Los compuestos utilizados fueron: ácido-γ-aminobutirico, ácidoβ-hydroxibutirico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido málico, ácido propiónico, ácido succínico, ácido trans-aconítico, ácido glucónico, acetato de sodio, ácido aspártico, ácido láctico, ácido glutámico, mio-inositol, arabinosa, D-galactosa, glicerol, D-glucosa, celobiosa, D-fructosa, lactosa, maltosa, D-manitol, D-manosa, melibiosa, pyruvato, Dribosa, L-ramnosa, sacarosa, D-sorbitol, D-trealosa, D-xilosa, amigdalina, L-citrulina, Dalanina, glicina, L-treonina, L-leucina L-arginina, L-serina, L-lisina, L-histidina, tirosina, ornitina, putrescina y salicina. 5.1.2.2 Sistemas miniaturizados Además de la metodología clásica en tubo y placa se realizó una caracterización mediante los sistemas miniaturizados API20E y API50CH (bioMerieux). Las bacterias se resuspendieron en un medio liquído y se ajustaron a una densidad óptica de 1,0 a 580 nm.  API 20E Consiste en un sistema miniaturizado y estandarizado que se suele usar par la identificación de enterobacterias de origen clínico. Está compuesto por un total de 20 pocillos con diferentes compuestos. Se utilizó siguiendo las instrucciones del fabricante, exceptuando el uso de solución salina (Nacl, 0,85%) para la preparación de los inóculos y la temperatura de incubación a 24±1ºC. La lectura de los resultados se realizó a las 24 h. DIEGO GERPE PAZOS 134  API50CH Se trata de una prueba mediante la cual se estudió el metabolismo de hidratos de carbono y otros derivados como polialcoholes y ácidos urónicos. Para la inoculación de los 50 pocillos se resuspendieron las bacterias en un medio liquido ZOFT modificado (Lemos y col., 1985; Prado, 2006) en vez del medio comercial API50CHB/E recomendado por el fabricante. Los pocillos se inocularon siguiendo las instrucciones del fabricante y se dejaron incubar a 24±1ºC. Se realizaron lecturas diarias haciendo lecturas diarias durante toda una semana. 5.2.1 Análisis del gen 16S ARNr Como ya hemos mencionado con anterioridad (ver introducción), el gen ARNr 16S es uno de los genes más utilizados en taxonomía, filogenia y evolución, debido a que posee regiones muy conservadas y regiones hipervariables que permite una identificación taxonómica bastante precisa, discriminando a nivel de género y en la mayoría de los casos a nivel de especie. 5.2.1.1 Extracción y amplificación y secuenciación La extracción del ADN cromosómico, la amplificación y la secuenciación del gen ARNr 16S de nuestros aislados se realizó de la misma forma descrita en el capitulo 4 de esta tesis. 5.2.1.2 Análisis Filogenético Para la realización del análisis filogenético se descargaron de la base de datos EzBioCloud todas las secuencias del gen ARNr 16S de las cepas tipo de las especies del género Rahnella (Rahnella aquatilis, R. victoriana, R. inusitata, R. wooldbengensis, R. bruchi) y cepas tipo las especies de diferentes géneros próximos al género Rahnella. Los análisis se realizaron tal y como se describen en el capítulo 4. GÉNERO RAHNELLA 135 5.2.2 Secuenciación del genoma completo Para realizar estudio taxonómicos a partir del genoma completo, se seleccionaron 3 de cepas representativas de nuestros aislados: CFA10(1/100), RJA17(1/100) y CFA14(1/10). 5.2.2.1 Extracción del ADN El ADN genómico se extrajo utilizando el kit comercial DNeasy Blood & Tissue (Quiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante con algunas modificaciones en el momento de la elución de la muestra para obtener una mayor concentración de ADN. La muestra se eluyó utilizando agua estéril a una temperatura de 60ºC en vez del tampón AE suministrado por el fabricante. Se inocularon entre 40-50 µ l en vez de los 100-200 µ l recomendados por el fabricante. Una vez inoculado el agua, se dejó incubando a temperatura ambiente 10 min antes de la elución. El ADN se cuantificó mediante el NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher) y Qubit 3 Fluoremeter (Invitrogen), obteniéndose las concentraciones exigidas por los servicios de secuenciación utilizados. 5.2.2.2 Ensamblaje y análisis de los genomas La secuenciación del ADN cromosómico se realizó en el servicio de secuenciación de FISABIO (Valencia, España) mediante la plataforma Hiseq de Illumina a partir de la cual se obtienen lecturas pareadas. La limpieza de adaptadores, cebadores y secuencias de baja calidad fue llevada a cabo por FISABIO. El ensamblaje de las lecturas obtenidas se realizó utilizando el programa SPAdes 3.6.1 (Nurk, 2013) y posteriormente se observó la calidad del ensamblado usando el programa Quast (Gurevich y col., 2013). Para los análisis comparativos y filogenéticos de nuestros aislados con las demás especies del género Rahnella se descargaron de las bases de datos EzBiocloud y GenBank, los genomas de las cepas tipo de las especies del género Rahnella: R. aquatilis CIP 78.65T (GCA_000241955.1), R. bruchi DSM 27398T(GCA_003614975.1), R. inusitata DSM 30078T(GCA_003602055.1), R. variigena CIP 105588T(GCA_003610915.1) y R. woolbedingensis DSM 27399T(GCA_003602095.1).  eDDH, ANIm, ANIb y orthoANI. Se realizó una comparativa ADN-ADN in silico a través del programa Genome-toGenome Distance Calculator (GCDC 2.1) (Auch y col 2010a, b; Meier-Kolthoff y col. 2013). DIEGO GERPE PAZOS 136 Además, se realizó un análisis de la similitud entre los genomas usando los algoritmos OrthoANI (Lee y col., 2015), ANIb (Goris y col., 2007) y ANIm (Richter y Roselló, 2009), previamente descritos en la introducción de esta tesis. (Tabla 5.2) Tabla 5.2. Herramientas bioinformáticas utilizadas para la comparación entre genomas Método Umbral delimitación especie Herramienta GBDP 70% Genome-to-Genome Distance Calculator ANI 95-96% JSpecies. OrthoANI 95-96% OAT, EzBiocloud.  Análisis de Secuencias Multigénicas (MLSA). Esta técnica consiste en la concatenación de las secuencias parciales de varios genes esenciales (housekeeping). Este análisis es útil para los estudios filogenéticos, ya que debido a su alto poder resolutivo, permite una mejor clasificación y/o identificación de los microorganismos,. Los genes esenciales seleccionados para realizar este análisis fueron gyrB (subunidad β de la girasa), ftsZ (proteína de la división celular ftsZ), atpD (subunidad β de la ATPasa) y rpoB (subunidad unidad β de la ARN polimerasa). Las secuencias de los genes se descargaron a partir de los genomas depositados de las cepa tipo de las especies del género Rahnella depositadas en las bases de datos pública EzBiocloud y Genbank. Cada gen se alineó de manera individual, y posteriormente se realizó el concatenando de las secuencias. El alineamiento múltiple de las secuencias se realizó mediante el programa MEGA7 (Kumar y col., 2016) utilizando la herramienta CLUSTAL W (Larkin y col., 2007). Para la elaboración del árbol filogenético se utilizó el algoritmo Neighbour–joining (NJ) (Saitou y Nei, 1987), aplicando el modelo evolutivo Kimura-2-parametros (Kimura, 1980).  Pangenoma Por otro lado, se realizó un análisis filogenético con el genoma completo de nuestros aislados y las cepas tipos de todas las especies del género Rahnella mediante la elaboración de un árbol pangenómico. El pangenoma fue descrito por Tettelin y col. (2005) para bacterias como el conjunto de todos genes presentes en todas las cepas o especies, el cual se divide en: genoma esencial (contiene los genes presentes en todas las especies o cepas) y genoma GÉNERO RAHNELLA 137 prescindible (compuesto por genes compartidos por algunas cepas o especies y genes que son únicos de cada especie o cepa) Para la realización del pangenoma se utilizó la herramienta Get_homologues (Contreras y Vinuesa, 2013) para agrupar los genes homólogos de los genomas. Para ello se utilizaron diferentes algoritmos que permitieron agrupar los genes de los diferentes genomas previamente anotados con el programa PROKKA (V1.13.3). El siguiente paso consintió en identificar y agrupar aquellas secuencias de genes ortólogos que compartían nuestros genomas anotados. Para ello se utilizaron los algoritmos BBDH (del inglés, Bi-Directional Best Hits) (Overbeek y col., 1999), COGtriangle (del inglés, Cluster of Orthologous Genes) (Kristensen y col., 2010) y OrthoMCL (del inglés, Orthologous Markov Cluster) (Li y col., 2003). Con estos tres algoritmos se pudo estimar el número de familias génicas compartidas por todos los genomas (genoma esencial), así como el número de familias diferentes acumuladas entre todos los genomas de interés (pangenoma). El número de familia de genes compartidos se clasificaron en 4 agrupaciones: genoma esencial o “Core genome” (genes presentes en todos los genomas), “Soft-genome” esencial o genoma esencial laxo (genes presentes en  del 95 % de los genomas), “Shell” (presentes en varios genomas, pero por debajo del 95 %) y “Cloud” (presente en solo unos pocos genomas) (Kaas y col., 2012). A partir del consenso (intersección) entre los algortimos COG y OrthoMCL se halló el número de familias génicas diferentes que conforman el pangenoma. Por último, para la obtención del árbol representativo del pangenoma se elaboró a partir de una matriz de presencia/ausencia de genes en un determinado genoma. Para la realización del árbol pangenómico bajo el criterio de parsimonia se utilizó el programa PARS del Paquete PHYLIP (Felsenstein, 2005) 5.3 RESULTADOS 5.3.1 Caracterización bioquímica A) Metodología clásica. Los aislados CJA17(1/100), RFA10(1/100), RFA1(1/10), CFA14(1/10) y CJA9(1/10) son todos Gram negativos móviles, anaerobios facultativos, catalasa positivos y resistentes al DIEGO GERPE PAZOS 144 Al realizar el árbol filogenético de las secuencias del gen ARNr 16S de los aislados y las cepas tipo de las especies del género Rahnella mediante el método Neighbour-Joining, se observa como nuestros aislados se encuentran agrupados en una rama diferenciada junto a R. aquatilis (Fig. 5.1). Se observa como los aislados CFA14 (1/10), CJA9(1/10), RFA1(1/100) y RFA10(1/100) forman un grupo definido con valores de “bootstrap” del 99%, mientras que la cepa CJA17(1/100) se encuentra en una rama independiente con Rahnella aquatilisT (CIP 78.65). A partir de los resultados obtenidos en el árbol filogenético, los aislados CJ17(1/100), RF10(1/100) y CF14(1/10) se seleccionaron para secuenciar su genoma completo y realizar un análisis filogenético y comparativo en profundidad. 5.3.3 Análisis de genomas completos Para realizar estudios con el genoma completo además de las secuencias de nuestros aislados se utilizaron todos los genomas de las cepas tipo de las especies del género Rahnella depositadas en las bases de datos EzBiocloud y GenBank. El contenido G+C de los aislados CFA14 (1/10), RFA10 (1/100) y CJA17(1/100) fue de 51,6 mol% G+C, 51.6mol% G+C y 52 mol% G+C respectivamente, encontrándose dentro del rango del género (51 al 56 mol% G+C). 5.3.3.1 MLSA a partir de los genomas Para la realización del análisis de secuencias multigénicas, se seleccionaron los genes gyrB, ftsZ, atpD y rpoB que se obtuvieron a partir de los genomas del género Rahnella de las cepas tipo depositadas. Los árboles filogenéticos obtenidos a partir de las secuencias concatenadas de los 4 genes y utilizando el método Neigbour-Joining, muestran resultados muy semejantes a los de los análisis del gen ARNr 16S. Nuestros aislados se encuentran agrupados con R. aquatilis en una rama independiente a las demás especies del género Rahnella. Los aislados CFA14 (1/10) y RF10 (1/100) aparecen agrupados en una rama bien diferencia del resto de las especies respaldada por un bootstrap del 100%. Por otro lado, la cepa CJA17 (1/100) permanece agrupada junto a la cepa tipo de R. aquatilis (Fig. 5.2) GÉNERO RAHNELLA 145 Figura 5.1. Árbol filogenético construido a partir del gen ARNr 16S de los 5 aislados de almeja fina y japonesa, todas las especies del género Rahnella y especies de diferentes géneros próximos a nuestros aislados. Barra, el número de sustitución nucleotídicas por sitio. En los nodos se muestran los valores de boostrap iguales o mayores del 50% como porcentaje de 1000 peudoréplicas. DIEGO GERPE PAZOS 146 Figura 5.2. Árbol filogenético construido a partir de la concatenación de las secuencias parciales de los genes de 3 de los aislados de almeja fina y japonesa, todas las cepas tipo del género Rahnella. Barra, número de sustitución nucleotídicas por sitio. En los nodos se muestran los valores de boostrap iguales o mayores del 70% como porcentaje de 1000 peudoréplicas. 5.3.3.2 Comparación con especies del género Rahnella Los análisis comparativos ANIm, ANIb, OrthoANI y eDDH con las especies del género Rahnella mostraron que nuestras 3 cepas, se encuentran por debajo del umbral para delimitación de especie (95-96% ANI y 70% eDDH). La especie más próxima fue R. aquatilis, que aparece con porcentajes de similitud con nuestros aislados entre el 90% y 92.78% en ANI y porcentajes entre el 44.3% y 48.9% en los análisis de eDDH (Tabla 5.8). Los análisis comparativos de los genomas también muestran que las cepas RFA10(1/100) y CF14(1/10) formarían una única especie, ya que los valores de ANI y de eDDH obtenidos entre ambos aislados (99% y 95,5%, respectivamente) se encuentran con valores encima del umbral del definición de nueva especie (96% y 70%, respectivamente). Además, el aislado CJA17(1/100) presentó valores en ANI entre el 90,12% y 90,89% con los otros dos aislados de almeja y del 41,7% para la hibridación DNA-DNA in silico. Ambos valores se encuentra por debajo del umbral para la definición de una nueva especie. GÉNERO RAHNELLA 147 Tabla 5.8. Comparación de los resultados obtenidos mediante ANI y eDDH entre 3 de nuestros aislados y las cepas tipo de todas las especies del género Rahnella. Índices RFA10(1/100) CFA14(1/10) CJA17(1/100) ANIb/ANIm R. bruchiT 85.49/87.39 85.54 /87.43 86.42 /88.28 R. insusitataT 82.68/85.62 82.69 /85.64 83.32/86.09 R. woodlendengensisT 85.64/87.44 85.64 /87.47 86.64/88.41 R. victorianaT 87.37/88.48 87.35/88.54 88.60/89.47 R. variigenaT 86.43/87.90 86.40/87.93 87.80/89.04 R. aquatilisT 90.90/91.65 91.04/91.75 92.22/92.78 RFA10(1/100) * 99.31/99.48 90.22/90.89 CFA14 (1/10) 99.27/99.48 * 90.12 /90.92 CJA17(1/100) 90.06/90.89 90.10/90.91 * eDDH R. bruchiT 31 31.1 33 R. insusitataT 26.5 26.5 27.5 R. woodlendengensisT 31.2 31.2 33.3 R. victorianaT 34.3 34.3 37 R. variigenaT 32.3 32.3 35.2 R. aquatilisT 44.3 44.6 48.9 RFA10(1/100) - 95.5 41.7 CFA14(1/10) 95.5 - 41.7 CJA17(1/100) 41.7 41.7 - En la imagen generada con los valores obtenidos del OrthoANI de las secuencias de los genomas, se visualiza claramente como los aislados CFA14(1/10) y RFA10(1/100), con un porcentaje de similitud del 99,4%, constituirían una única especie. La cepa CJA17(1/100) obtuvo un 90% de similitud con los otros dos aislados y un 92,6% con R. aquatilis, estando ambos valores por debajo del 96% exigido para la definición de una nueva especie. Los 3 aislados presentaron valores por debajo del 93% con todas las cepas tipo de las especies del género Rahnella (Fig. 5.3) En el árbol del pangenoma obtenido, al igual que pasaba con el MLSA, R. aquatilis se encuentra agrupada con nuestros aislados consituyendo dos grupos, uno formado únicamente por el aislado CJA17(1/100) y otro por los aislados CFA14 y RFA10 (Fig. 5.4). DIEGO GERPE PAZOS 148 Figura 5.3. Resultados del orthoANI de los 3 aislados de almeja fina y japonesa y las cepas tipos de todas las especies del género Rahnella. Figura 5.4. Árbol de parsimonia de nuestros 3 aislados y las cepas tipos de todas las especies del género Rahnella basado en la matriz consenso (OMCL and COGtriangles) de presencia y ausencias de genes. CJA17 (1/100) R. aquatilis CIP 78.65 T R. variigena CIP 105588 T R. inusitata DSM 30078 T R. w oodlengensis DSM 27399 T R. bruchii D SM 27398 T R. Victoriana BRK18a RJA10 (1/100) CFA14 (1/10) R. victoriana FRB 225T R. variigena CIP 105588T R. inusitata DSM 30078T R. woodlengensisDSM 27399T R. bruchiiDSM 27398T R. aquatilis CIP 78.65T RJA10 (1/100) CFA14 (1/10)T CJA17 (1/10)T GÉNERO RAHNELLA 149 Todos los resultados obtenidos ponen de manifiesto que nuestros aislados formarían 2 nuevas especies dentro del género Rahnella, una especie estaría formada únicamente por la cepa CJA17(100). La otra especie estaría constituida por los otros 4 aislados de almeja, RFA10(1/100), RFA1(1/10), CFA14(1/10) y CJA9(1/10), escogiendo como cepa tipo CFA14 (10)T(Fig. 5.4). 5.3.4 Descripción de especies del género Rahnella 5.3.4.1 Descripción de Rahnella conchicola sp nov. Rahnella conchicola (con.chi.co’la.; L. fem. n. conchula, pequeño molusco; L. suff – cola, habitante; N.L.n. conchicola, habitante de pequeños moluscos). Las células son Gram negativas, bacilos móviles, catalasa positivas y anaerobios facultativas. Las colonias son blancas, circulares con bordes regulares y no producen de pigmentos en Agar Marino. Reducen nitrato a nitrito y son positivas para la hidrólisis de la esculina y la lipasa. Fermentan la glucosa y producen gas. Crecen en un rango de temperatura de 4-37ºC (óptimo a 25ºC), pH 3-9 (óptimo a 3-6). Crecen en concentraciones de NaCl y de Seasalts entre el 0,5-7% (óptimo entre 0,5%-4%). No son capaces de realizar la dihidrólisis de la arginina, la descarboxilación de la lisina y de la ortinitina ni la hidrólisis de gelatina y almidón. No utilizan el citrato ni producen de indol y son negativas para la prueba de la oxidasa y Voges-Proscauer. Son positivas en las reacciones del API20E de la ß -galcatosidasa (ONPG), producción de acetoína, gelatinasa, dihidroliss de la arginina, fermentación de la glucosa, manitol, sorbitol, sacarosa, ramnosa, melobiosa, amigdalina y arabinosa. Producen ácido a partir de de glicerol, L-arabinosa, D-ribosa, D-xilosa, D-galactosa, D-glucosa, D-fructosa, D-manosa, L-rhamnosa, D-manitol, N-acetilglucosamina, arbutina, esculina, salicina, D-celobiosa, D-maltosa, Dlactosa, D-melibiosa, D-sacarosa, D-trehalosa, D-melezitosa, D-rafinosa, gentiobiosa, Dturanosa, L-fucosa, y 5-cetogluconato-potásico (API 50CHB/E). Utilizan como única fuente de carbono el ácido fumárico, D-glucosa, D-ribosa, acetato sódico, ácido. málico, D-trealosa, ácido succínico, celobiosa, D-manitol, salicina, glicerol, ácido sacárico,, melibiosa, lactosa, maltosa, D-galactosa, D-xilosa, fructosa, ácido glucurónico, ácido galactónico, D-gluconato, DIEGO GERPE PAZOS 150 ácido pirúvico, ácido láctico, L-ramnosa, D-sorbitol, L-aspártico, L-serina y sacarosa. El contenido G+C de la cepa tipo es del 52 mol%. La cepa tipo CJA17(1/100)T (=LMG 31370, =CECT 9855) fue aislada de Ruditapes philippinarum en Redondela (42°17'40.4" N 8°36'57.2" W), Galicia. 5.3.4.2 Description of Rahnella gallaica sp. nov. Rahnella gallaica [gal.la´i.ca L. fem. adj. Gallaica, perteneciente a Gallaecia (Galicia), la región noroeste de la Península Ibérica]. Son bacterias Gram negativas, bacilos móviles, catalasa positivas y anaerobias facultativos. Las colonias en AM son blancas, circulares con bordes regulares. No realizan la dihidrólisis de la arginina, la descarboxilación de la lisina y de la ortinitina y no son capaceas de hidrolizar la gelatina ni el almidón. No producen indol y son oxidasa y ureasa negativas. Reducen nitratos a nitritos y son positivas para las pruebas de la esculina y lipasa. Fermentan la glucosa y producen gas. Crecen en un rango de temperatura del 4-37ºC (óptimo a 25ºC), pH 3-9 (óptimo a 3-6). Todas las cepas crece unas concentraciones del 0,5-7% Nacl (óptimo de 0,5-4%) y 0,5%-8% (óptimo entre 0,5%-4%) de SeaSalts. Todos los aislados son positivos para la ß -galactosidasa (ONPG), utilización del citrato, fermentación de glucosa, manitol, sorbitol, sacarosa, rahmnosa, melibiosa, amygdalina y arabinosa (API20E). Producen ácido a partir de: glicerol, L-arabinosa, D-ribosa, D-xilosa, D-galactosa, D-glucosa, D-fructosa, D-manosa, L-rhamnosa, dulcitol, D-sorbitol, metil-α-D-glucopiranosida, Dmanitol, N-acetilglucosamina, arbutina, esculin, salicina, D-celobiosa, D-maltosa, D-lactosa, D-melibiosa, D-sacarosa, D-trehalosa, D-rafinosa, gentibiosa, Lfucosa, gluconato potásico y 5-cetogluconato potásico (API 50CHB/E). Los compuestos que usaron como única fuente de carbono en BMA fueron los siguientes: ácido fumárico, D-glucosa, D-ribosa, acetato sódico, ácido málico, D-trehalosa, ácido succínico, celobiosa, D-manitol, salicina, glicerol, ácido sacárico, melibiosa, lactosa, maltosa, D-galactosa, D-xilosa, fructosa, ácido glucurónico, ácido galactónico, D-gluconato, ácido pirúvico, ácido láctico, L-Ramnosa, D-sorbitol, L-aspártico, L-serina y sacarosa.. El contenido G+C de la cepa tipo es del 51,6 mol%. GÉNERO RAHNELLA 151 La cepa tipo CFA14(1/10)T (=LMG 31368, =CECT 9856) fue aislada de Ruditapes decussatus en Carril (42°36'50.4" N 8°46'39.1" W), Galicia. 5.4 DISCUSIÓN El estudio bioquímico de nuestros 5 aislados muestra la presencia de características semejantes a las otras especies del género Rahnella, como su morfología bacilar, su carácter Gram negativo, son oxidasa positivos y facultativos anaerobios. Si bien existe diferencias entre nuestros aislados, sobre todo entre CJA17(100), como su limitación de crecimiento a concentraciones de SeaSalts por encima del 7%, los resultado de la pruebas bioquímicas no ofrecen la consistencia necesaria para diferenciar nuestros aislados entre ellos y establecer una identificación correcta de nuestras cepas. El sistema miniaturizado API20E muestra diferencias con los resultados obtenidos mediante las técnicas convencionales de tubo y placa en las pruebas del citrato, VogesProskauer y arginina dihidrolasa. Los resultados de estos sistemas no son muy fiables debido a la existencia de falsos negativos y positivos en bacterias marinas (Kent, 1982; Santos y col., 1993). Al realizar una primera aproximación con la secuenciación del gen ARNr 16S, se identificó a nuestros 5 aislados como pertenecientes al género Rahnella, con porcentajes de similitud entre el 99,5% y el 99% con la especie Rahnella aquatilis. Al elaborar el árbol filogenético con las secuencias del gen ARNr 16S, todos los aislados de almeja se encontraron agrupados con la especie R. aquatilis en una rama diferenciada de las otras cinco especies del género. Tras secuenciar el genoma completo y realizar análisis comparativos de los genomas de nuestros aislados con los demás genomas depositados de las especies del género, se comprobó como las cepas de almeja se encontraban por debajo del umbral para definición de nueva especie tanto en los análisis en ANI (95-96%) como en los análisis de eDDH (70%). Además, los valores obtenidos entre las cepas CFA14(1/100) y RFA10(1/100) confirman que formarían parte de la misma especie y que el aislado CJA17(100) constituiría otra nueva especie. Los árboles realizados a partir de las secuencias concatenadas de los 4 genes seleccionados (gyrB, atpD, ftsZ y rpoB) y del pangenoma, mostraron como nuestros aislados DIEGO GERPE PAZOS 152 se encontraban formando dos grupos bien diferenciados, por un lado, CJA17(1/100) y por el otro lado CFA14 (1/100) y RFA10(100). Todos los resultados taxonómicos, moleculares y bioquímicos sostienen la propuesta de que nuestros aislados constituirían dos nuevas especies dentro del género Rahnella para las que proponemos los nombre Rahnella conchicola sp nov. y Rahnella gallaica sp. nov. siendo las cepas CJA17(1/100) T y CFA14(1/100) T las cepas tipo de cada especie, respectivamente. Por otro lado, en los análisis del gen ARNr 16S, nuestros aislados y la especie tipo del género (R. aquatilis) se encuentran separadas de las demás especies del género. La especie R. inusitata aparece en un rama alejada independiente, agrupada con especies del género Rouxiella. Al analizar las secuencias del gen ARNr 16S en la base de datos EzBiocloud se observa como esta cepa presenta porcentajes de similitud más elevados con especies del género Rouxiella (99,3%-98,8%), que con las especies del género Rahnella (98,4%-97,5%) (Tabla 5.8). Los análisis comparativos mediante los índices ANI, eDDH y el análisis MLSA también muestran una clara diferenciación de esta especie con el resto del género. Todos estos resultados plantean la necesidad de realizar un estudio taxonómico más profundo del género Rahnella y una posible reclasificación de la especie R. inusitata. 6. DISCUSIÓN GENERAL