Estructuras cristalográficas de proteínas de virus animales implicadas en la interacción virus-hospedador

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR ESTRUCTURAS CRISTALOGRÁFICAS DE PROTEÍNAS DE VIRUS ANIMALES IMPLICADAS EN LA INTERACCIÓN VIRUSHOSPEDADOR TESIS DOCTORAL PABLO GUARDADO CALVO 2010 Mark Johan van Raaij, Científico titular del Instituto de Biología Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC). José Manuel Martínez Costas, Profesor titular del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela. INFORMAN: Que la presente Tesis Doctoral titulada "Estructuras cristalográficas de proteínas de virus animales implicadas en la interacción virus-hospedador", que presenta Pablo Guardado Calvo para optar al grado de Doctor en Biología, ha sido realizada en este Departamento bajo la dirección del Doctor Mark Johan van Raaij y el Doctor José Manuel Martínez Costas y, considerando que se haya concluída, autorizan su presentación para que sea evaluada por el Tribunal correspondiente. Y para que así conste, firmo el presente informe: Fdo: Mark Johan van Raaij Fdo: José Manuel Martínez Costas Fdo: Pablo Guardado Calvo Santiago de Compostela, 22 de Enero de 2010 El trabajo recogido en la presente memoria ha sido realizado en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela, bajo la dirección de los doctores Mark Johan van Raaij y José Manuel Martínez Costas. AGRADECIMIENTOS En primer lugar me gustaría agradecer a Ana y a Yaguito todo su amor y su apoyo y a mis padres y hermanas su apoyo constante a lo largo de los años. Sin todos ellos este trabajo hubiese sido mucho más difícil. Un agradecimiento especial al Dr. Mark van Raaij, por haberme aceptado en su grupo y haberme dirigido la tesis. También me gustaría agradecer al Dr. Jose Manuel Martínez Costas por haber sido mi codirector de tesis, al Dr. Javier Benavente Martínez por haberme dejado usar su laboratorio durante tanto tiempo y a Lois Hermo Parrado que me ha enseñado mucho de lo que se del trabajo de laboratorio. También me gustaría agradecer a la gente con la que he compartido tanto tiempo en el departamento. A Rubén que me ha invitado a tantos cafés durante todos estos años. A Félix e Iria. A la gente con la que he compartido espacio en el laboratorio de Javier durante todos estos años: Javi, Alberto, Irene, Rebeca, Leticia, Iria, Salvador, Marcelo, Patricia, Lorena y Lisa. A la gente del laboratorio de Mark: Jose, Sergio, Patricia F, Carmela y Antonio. A la gente del CACTUS que tanto me ha ayudado en la recogida de datos: Antonio, Bruno, Oscar, Inés y Guillermo. A la gente que trabaja en la facultad como Rosa, Carmela, Noya y un largo etcétera. ÍNDICE Capítulo 1 - INTRODUCCIÓN....................................................................................................................1 1.1 - Los reovirus............................................................................................................................................3 1.1.1 - La familia Reoviridae. El género Orthoreovirus. El reovirus aviar ................................................3 1.1.2 - El genoma de los reovirus aviares.....................................................................................................4 1.1.3 - Las proteínas de los reovirus aviares................................................................................................5 1.1.3.1 - La proteína A...................................................................................................................................6 1.1.3.2 - La proteína B ...................................................................................................................................6 1.1.3.3 - La proteína C ...................................................................................................................................6 1.1.3.4 - La proteína μA...................................................................................................................................7 1.1.3.5 - La proteína μB...................................................................................................................................7 1.1.3.6 - La proteína μNS ................................................................................................................................7 1.1.3.7 - La proteína A...................................................................................................................................7 1.1.3.8 - La proteína B...................................................................................................................................8 1.1.3.9 - La proteína C...................................................................................................................................8 1.1.3.10 - La proteína p10................................................................................................................................9 1.1.3.11 - La proteína p17..............................................................................................................................10 1.1.3.12 - La proteína NS ............................................................................................................................ 10 1.1.4 - La partícula reoviral ........................................................................................................................10 1.1.5 - El ciclo replicativo de los reovirus...................................................................................................13 1.1.5.1 - Penetración y pérdida de la cápside externa....................................................................................14 1.1.5.2 - Expresión de los genes virales.........................................................................................................15 1.1.5.3 - Morfogénesis y salida.....................................................................................................................16 1.1.6 - Interacciones virus-célula hospedadora ......................................................................................... 17 1.1.6.1 - Fusión celular ..................................................................................................................................17 1.1.6.2 - Resistencia al interferón ..................................................................................................................17 1.2 - Los adenovirus.....................................................................................................................................18 1.2.1 - La familia Adenoviridae....................................................................................................................18 1.2.2 - Clasificación de la familia Adenoviridae ......................................................................................... 19 1.2.3 - Estructura del virión ........................................................................................................................20 1.2.4 - El genoma de los adenovirus ...........................................................................................................23 1.2.5 - La entrada de los adenovirus en la célula hospedadora ...............................................................24 1.2.6 - El uso de los adenovirus en terapia génica.....................................................................................26 1.2.6.1 - Coxsackievirus-adenovirus receptor (CAR)....................................................................................27 1.2.6.2 - CD46................................................................................................................................................28 1.2.6.3 - Ácido siálico....................................................................................................................................29 1.2.6.4 - Otros receptores primarios...............................................................................................................29 1.2.6.5 - Integrinas .........................................................................................................................................29 1.2.7 - El adenovirus aviar de tipo 1...........................................................................................................30 1.2.8 - El adenovirus porcino de tipo 4 (cepa NADC-1) ...........................................................................32 1.2.9 - Objetivos............................................................................................................................................35 Capítulo 2 - MATERIALES Y MÉTODOS..............................................................................................37 2.1 - Materiales.............................................................................................................................................39 2.1.1 - Materiales biológicos........................................................................................................................39 2.1.1.1 - Bacterias ..........................................................................................................................................39 2.1.1.2 - Plásmidos......................................................................................................................................... 39 2.1.2 - Materiales no biológicos...................................................................................................................39 2.1.2.1 - Disoluciones y tampones.................................................................................................................39 2.1.2.2 - Medios de cultivo ............................................................................................................................40 2.1.2.3 - Cebadores ........................................................................................................................................40 2.2 - Métodos................................................................................................................................................. 41 2.2.1 - Manipulación de células bacterianas..............................................................................................41 2.2.1.1 - Obtención de bacterias competentes y transformación ...................................................................41 2.2.2 - Manipulación ácidos nucleicos ........................................................................................................42 2.2.2.1 - Purificación de DNA de plásmidos .................................................................................................42 2.2.2.2 - Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)...................................................................................42 2.2.2.3 - Aislamiento de fragmentos de DNA y su purificación....................................................................42  Capítulo 1. Introducción  variabilidad antigénica que presentan los reovirus aviares ha impedido desarrollar una clasificación basada en serotipos. Figura 1.1 Fotos de microscopia de reovirus de mamífero. Obtenida de ICTVdB (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/) 1.1.2 - El genoma de los reovirus aviares Los reovirus aviares poseen un genoma compuesto por 10 segmentos de dsRNA, los cuales están divididos en tres clases de acuerdo a su movilidad electroforética; tres segmentos de la clase L (large), tres de la clase M (medium) y cuatro de la clase S (small) (Spandidos & Graham, 1976a). A excepción del segmento S1, que codifica para tres proteínas, todos los demás segmentos codifican para una única proteína. El mRNA viral está codificado por la cadena positiva de los segmentos genómicos. Esta cadena contiene un cap de tipo 1 en su extremo 5’, mientras que la cadena negativa contiene un grupo pirofosfato en la misma posición. (MartínezCostas et al., 1995). Todos los miembros de la familia Reoviridae poseen en los extremos de todos sus genes unas pequeñas secuencias muy conservadas (Patton & Capítulo 1. Introducción    Spencer, 2000), que podrían actuar como señales de transcripción, replicación y/o encapsidación de los transcritos virales. La coinfección de células aviares con dos cepas reovirales distintas, produce una progenie viral que puede contener segmentos genómicos de ambos virus parentales. Este fenómeno, denominado reassorting, ha sido muy utilizado para caracterizar las propiedades fenotípicas de los segmentos genómicos virales. Tabla I. Los genes del reovirus aviar y las proteínas que codifican dsRNA Proteína Equivalente en reovirus de mamífero Localización Función L1 A 1 Core Proteína principal del core L2 B 3 Core RNA polimerasa L3 C 2 Core Guaniltransferasa M1 μA μ2 Core Cofactor de la RNA polimerasa M2 μB μ1 Cápside externa M3 μNS μNS No estructural Formación de las factorías virales S1 C p17 p10 1 1s (1) (2) Cápside externa No estructural No estructural Unión al receptor Unión a dsDNA Fusógeno S2 A 2 Core Unión a dsRNA S3 B 3 Cápside externa S4 NS NS No estructural Unión a ssRNA (1) La proteína 1s no es la equivalente de p17 del reovirus aviar (2) La proteína p10 no tiene ningún equivalente en los reovirus de mamífero 1.1.3 - Las proteínas de los reovirus aviares El genoma del reovirus aviar codifica para 12 proteínas, 8 proteínas estructurales y 4 no estructurales. Las proteínas no estructurales no se incorporan al virión pero se expresan en las células infectadas (Martínez-Costas et al., 1997; Varela y Benavente, 1994). Las proteínas codificadas por los genes de la clase L se denominan lambda (), las codificadas por los de la clase M, mu (μ) y las codificadas por los de la clase S, sigma () (Tabla I). A cada proteína se le asigna un sufijo alfabético en orden inverso a su movilidad electroforética. El virión contiene al menos 10 proteínas estructurales diferentes, 8 de las cuales (A, B, C, μA, μB, A, B y C) son productos primarios de traducción de los mRNAs, mientras que las otras dos, μBN y μBC, se originan por procesamiento proteolítico del precursor μB (Varela et al., 1996). Los genes M3 y S4 codifican para dos proteínas no estructurales mayoritarias, denominadas μNS y NS respectivamente (Schnitzer et al., 1982; Varela & Benavente, 1994). El gen S1, que es tricistrónico, codifica en sus dos primeras pautas  Capítulo 1. Introducción  de lectura (ORF) para otras dos proteínas no estructurales, denominadas p10 y p17 (Bodelon et al., 2001; Shmulevitz et al., 2002). Aunque serían necesarios estudios en profundidad sobre los mecanismos que utilizan los ribosomas para traducir cada uno de los tres cistrones del gen S1, es posible inferir algunos detalles de este mecanismo a partir de un análisis detallado de la secuencia del mRNA s1 y del conocimiento del mecanismo de traducción de otros transcritos policistrónicos. Cuando se examinan las secuencias de nucleótidos que rodean a los codones de iniciación de cada uno de los tres cistrones se observa que el codón de iniciación del primer cistrón esta situado en un contexto muy débil, mientras que los contextos de los codones de iniciación del segundo y tercer cistrón son fuertes (Kozak, 2002). De esta forma y teniendo en cuenta que el mRNA s1 tiene un cap en su extremo 5’ es posible especular que los dos primeros cistrones son traducidos mediante un mecanismo de leaky scanning (Kozak, 1991) lo que explicaría su baja eficiencia de traducción, el primer cistrón debido a su contexto débil y el segundo debido a la lejanía del extremo 5’. Por otro lado el codón de iniciación del tercer cistrón está demasiado alejado del cap por lo que la probabilidad de que el ribosoma lo alcance mediante leaking scanning es baja, para la traducción de este cistrón se ha propuesto que el ribosoma pueda anclarse en una secuencia interna sin necesidad de un cap (Jackson & Kaminski, 1995). 1.1.3.1 - La proteína  A La proteína A es la proteína viral de mayor tamaño. Es la encargada de formar la cápside interna del reovirión. 1.1.3.2 - La proteína  B Por su tamaño, número de copias en la partícula viral y localización en el interior del core, probablemente pudiera tratarse de la RNA polimerasa viral (Martínez-Costas et al., 1997), aunque hasta la fecha no existe evidencia experimental que soporte esta hipótesis. 1.1.3.3 - La proteína  C Aunque estructuralmente forma parte de la cápside interna se extiende hasta la cápside externa (Martínez-Costas et al., 1997; Zhang et al., 2005). En el contexto del Capítulo 1. Introducción    reovirión es un pentámero localizado en los ejes de simetría 5 de la cápside. Es la proteína responsable de la adición de la caperuza 5' del RNA gracias a su actividad guanililtransferasa que reside en un fragmento amino terminal de 42 kDa. 1.1.3.4 - La proteína μ A Es una proteína estructural minoritaria de la cápside interna (Martínez-Costas et al., 1997). No existen estudios sobre sus propiedades o su función. Su homóloga en reovirus de mamífero (μ2) interacciona con microtúbulos y con la proteína no estructural μNS, y se cree que es la proteína que media la interacción entre las factorías virales y los microtúbulos (Parker et al., 2002). Sin embargo, en el reovirus aviar las factorías virales no aparecen asociadas a microtúbulos por lo que probablemente μA no sea capaz de interaccionar con ellos. 1.1.3.5 - La proteína μ B La proteína μB es una proteína miristoilada (Varela et al., 1996) que sufre un proceso proteolítico mediado por un factor viral (Varela & Benavente, 1994) que la escinde en dos fragmentos μBC y μBN. Ambos fragmentos son componentes estructurales de la cápside externa del reovirión (Martínez-Costas et al., 1997). El fragmento μBC parece desempeñar algún papel en la internalización del virus. 1.1.3.6 - La proteína μ NS La proteína μNS es el mínimo factor viral necesario para la formación de las factorías virales en células infectadas, por lo que juega un papel importante en las primeras etapas de la morfogénesis viral (Tourís-Otero et al., 2004). La proteína μNS sufre un proceso proteolítico durante la infección, que genera dos fragmentos denominados μNSN (15 kDa) y μNSC (55 kDa). Hasta la fecha el significado biólogico de este procesamiento es desconocido. 1.1.3.7 - La proteína  A La proteína A es un componente estructural de la cápside interna (MartínezCostas et al., 1997) que desempeña un papel estructural importante en la morfogénesis del reovirus aviar, ya que actúa estabilizando la cápside interna y promoviendo la formación de la cápside externa. Se ha demostrado que es capaz de  Capítulo 1. Introducción  unir dsRNA in vitro independientemente de su secuencia con alta afinidad (TourísOtero et al., 2005). Algunos estudios han mostrado que su capacidad para interaccionar con el dsRNA depende de su conformación nativa puesto que pierde esta capacidad cuando se desnaturaliza. Además de su papel estructural, existen evidencias que apuntan a que esta proteína es la responsable de la resistencia del reovirus aviar al interferón, y que de alguna manera esta actividad anti-interferón está relacionada con la inhibición de la activación de la proteína PKR. Dado que el sustrato natural de la PKR es el dsRNA, probablemente la función anti-interferón de A esté relacionada con su capacidad de interaccionar con dsRNA (Martínez-Costas et al., 2000; González-López et al., 2003). Su homóloga en reovirus de mamífero (2) desempeña un papel estructural similar (Reinisch et al., 2000) aunque es incapaz de interaccionar con dsRNA. Además, la resistencia que el reovirus de mamífero presenta a la acción antiviral del interferón parece estar relacionada con la proteína de la cápside externa 3 (Yue & Shatkin, 1997). De esta forma la proteína A parece ser homóloga estructuralmente de 2 pero análoga funcionalmente de la proteína 3. 1.1.3.8 - La proteína  B La proteína B es un componente estructural de la cápside externa del reovirión (Martínez-Costas et al., 1995; Varela et al., 1996). Al contrario que su homóloga de mamífero (3) la proteína B no une dsRNA en solución, lo que sugiere que no tiene actividad anti-interferón (Tourís-Otero et al., 2005). Se asocia rápidamente en el citoplasma con μB y μBC formando un complejo ternario con cantidades estequiométricamente iguales de las tres proteínas. Este complejo preformado es el que se incorpora al reovirión (Tourís-Otero et al., 2004a,b). 1.1.3.9 - La proteína  C La proteína C está codificada por la tercera pauta de lectura del gen S1 y es la proteína responsable de reconocer el receptor celular (todavía desconocido). La proteína C parece ser la única proteína viral presente en extractos solubles que es capaz de adherirse a monocapas de células aviares (Martínez-Costas et al., 1997). Además, es capaz de competir con el reoviriones aviares purificados bloqueando su entrada en células permisivas (Grande et al., 2000). La proteína C es un Capítulo 1. Introducción    homotrímero en su estado nativo, y su capacidad para unirse al receptor esta asociada a esta forma oligomérica (Grande et al., 2002). Mediante experimentos de saturación de la unión, realizados utilizando C expresada en bacterias, se ha estimado que cada célula CEF contiene 2.2 x 105 moléculas receptoras para la proteína C (Grande et al., 2000). Tiene un 20% de identidad de secuencia con su homóloga de mamífero 1, la cual se une a JAM-A (Junction Adhesión Molecule A). Ambas proteínas no se unen al mismo receptor ya que los reovirus de mamífero no son capaces de unirse a células aviares (Barton et al., 2001). Figura 1.2 Diagrama en donde se muestran las regiones de C fácilmente distinguibles en su secuencia. La pequeña región N-terminal responsable de la interacción con C (cola) se muestra en naranja, las dos regiones probablemente plegadas formando un triple coiled coil se muestran en verde, las dos probables repeticiones en triple  espiral en rojo y el dominio globular de cabeza en azul. La proteína C está compuesta fundamentalmente por un dominio fibroso y un dominio de cabeza globular. En el dominio fibroso se pueden distinguir a su vez dos regiones, una región más C-terminal probablemente plegada en repeticiones en triple  espiral y una larga región central cuya secuencia sugiere la existencia de dos regiones plegadas formando un triple coiled coil (Figura 1.2), por último el extremo más N-terminal de la fibra que es el encargado de anclar C a su base, un pentámero de la proteína C. 1.1.3.10 - La proteína p10 La proteína p10 está codificada por la primera pauta de lectura del gen S1. Es una proteína de membrana con un dominio transmembrana central que separa un dominio citoplasmático y un dominio extracelular de tamaños similares (Shmulevitz & Duncan, 2000). La expresión de esta proteína en células transfectadas induce una  Capítulo 1. Introducción  fusión célula-célula lo que sugiere que p10 juega un papel importante en el fenotipo fusogénico que muestran los reovirus aviares (Bodelon et al., 2001). 1.1.3.11 - La proteína p17 La proteína p17 está codificada por la segunda pauta de lectura del gen S1 y no tiene ninguna homología de secuencia con proteínas virales o celulares conocidas. Tiene capacidad de unir DNA y se acumula en el núcleo de células infectadas y transfectadas (Costas et al., 2005). 1.1.3.12 - La proteína  NS La proteína NS se acumula en las factorías virales gracias a su asociación con μNS, lo que la convierte en candidata a jugar un papel importante en el empaquetamiento del RNA y su replicación, aunque sería necesario un estudio más detallado para confirmar esta hipótesis. Tiene la capacidad de unir ssRNA de una manera independiente de secuencia in vitro (Tourís-Otero et al., 2005; Yin & Lee, 1998). Además, se encuentra formando parte de complejos ribonucleoproteicos en el citoplasma de las células infectadas, lo que sugiere que existe una asociación con ssRNA in vivo (Tourís-Otero et al., 2005). 1.1.4 - La partícula reoviral Los reoviriones aviares son partículas icosahédricas no envueltas de unos 85 nm de diámetro externo (Spandidos & Graham, 1976; Zhang et al., 2005). Contienen un genoma formado por 10 segmentos de dsRNA encapsidados dentro de dos cápsides icosahédricas concéntricas. La cápside interna está formada por los polipéptidos A, B, μA y A y la cápside externa por μB, B y C. La proteína C forma parte de ambas cápsides (Figura 1.3). La estructura de las partículas del reovirus aviar ha sido estudiada por microscopía electrónica y reconstrucción de imágenes a una resolución efectiva de 14.6 Å (Zhang et al., 2005) utilizando la cepa 138 (Figura 1.4). Los datos derivados de este trabajo así como los estudios de difracción de rayos X llevados a cabo con partículas del reovirus de mamífero (Reinisch et al., 2000) han permitido tener una información detallada sobre la organización de las proteínas estructurales en la Capítulo 1. Introducción    partícula viral. Tanto la estructura como la organización de las proteínas en el reovirión aviar es muy similar a la observada en el reovirus de mamífero (Zhang et al., 2003). De esta manera el diámetro del reovirión es de 85.7 nm, mientras que el diámetro de la cápside interna es de 53.6 nm. Dentro de la cápside interna se aprecian anillos concéntricos que probablemente representen los segmentos de dsRNA empaquetados, también dentro de esta cápside y localizados alrededor de los ejes pentaméricos se encuentran los complejos de transcripción, formados por la RNA polimerasa B y su cofactor μA. La cápside interna per se está formada por 120 copias de la proteína A, y sobre su superficie se sitúan 150 copias de la proteína A repartidas en tres posiciones distintas, 60 alrededor de los ejes pentaméricos, 60 alrededor de los ejes ternarios y las restantes 30 alrededor de los ejes binarios del icosahedro. Además, en los mapas de densidad electrónica se aprecia la presencia de 12 torres pentaméricas, cada una de ellas organizadas alrededor de uno de los ejes pentaméricos y compuestas por 5 copias de la proteína C (Martínez-Costas et al., 1997). Figura 1.3 Estructura del reovirión aviar. Modificado de Benavente & Martínez-Costas, 2007  Capítulo 1. Introducción  Figura 1.4 Estructuras de criomicroscopía electrónica del reovirus aviar 138 (AVR) y el reovirus de mamífero de tipo 3 (MRV). En (A) y (B) se muestran las superficies del reovirus aviar 138 y del reovirus de mamífero de tipo 3, respectivamente. Los colores representan distancias radiales medidas desde el centro de cada partícula en Å. Se muestra la localización de un canal P2 y de un canal P3. En (C) y (D) se muestran secciones del reovirus aviar 138 y el reovirus de mamífero 3, respectivamente. Se muestran las posiciones de los ejes de simetría binarios (2f), ternarios (3f) y de orden 5 (5f). La posición de cada una de las proteínas estructurales aparece etiquetada. Con respecto a la cápside externa, su base está formada por trímeros de la proteína μBC que están localizados sobre las moléculas de A y establecen contactos con la torres formadas por C. Situadas sobre μB se encuentran 600 copias de la proteína B, que a su vez están organizadas en grupos de cuatro o seis moléculas. Capítulo 1. Introducción    Estas agrupaciones se sitúan alrededor de dos tipos de canales que discurren a lo largo de la cápside externa, de tal forma que sobre la superficie de la cápside externa nos encontramos con 60 canales P3 rodeado cada uno de ellos por seis monómeros de B y 60 canales P2 rodeados por cuatro monómeros de B. La principal diferencia estructural entre los reovirus aviares y de mamífero es que el interior de estos canales en los reovirus de mamífero alberga un dominio C-terminal de la proteína μ1 mientras que en los reovirus aviares los canales parecen estar vacíos. Existe una característica importante observada en los reoviriones aviares pero no en los de mamífero que consiste en que los reoviriones aviares pierden la cápside externa cuando se incuban a 40 ºC (Grande & Benavente, 2000). Si tenemos en cuenta que la temperatura corporal de las gallinas es de 39.5 ºC, la liberación de los polipéptidos de la cápside externa en respuesta a la temperatura del hospedador nativo puede tener un efecto positivo en las primeras etapas de la replicación viral en el hospedador aviar, facilitando la penetración del virus a nivel intestinal y/o promoviendo la descapsidación de los reoviriones dentro de los endosomas. Las partículas reovirales se pueden transformar in vitro en dos tipos de subpartículas virales, las partículas subvirales intermedias (ISVPs) y los cores. En las ISVPs faltan las proteínas de la cápside externa B y μB pero conservan la proteína C, al contrario que los cores que sólo contienen las proteínas A, B, C, μA y A. Las ISVPs son infecciosas y transcripcionalmente activas mientras que los cores, aunque son transcripcionalmente activos, no son infecciosos probablemente porque han perdido la proteína que reconoce el receptor celular, C. 1.1.5 - El ciclo replicativo de los reovirus El ciclo replicativo de los reovirus se puede dividir en tres fases diferenciadas: 1) Penetración y pérdida de la cápside externa, 2) Expresión de sus genes y 3) Morfogénesis y salida. En la figura 3 se muestra un diagrama en donde se muestra el ciclo replicativo propuesto para los reovirus aviares.  Capítulo 1. Introducción  que infectan aves. Mastadenovirus incluye adenovirus que infectan mamíferos, por lo que incluye a todos los serotipos humanos. Atadenovirus está caracterizado por el inusual alto contenido A+T e infectan marsupiales, aves y mamíferos. Por último, el género Siadenovirus incluye virus que han sido aislado de reptiles y aves. Aunque existe reactividad antigénica cruzada entre los miembros dentro de cada género, debido fundamentalmente a la presencia de epítopos conservados localizados en la proteína que forma el capsómero hexamérico (hexon) de la cápside (Nevins, 2001; Figura 1.7), no existe un antígeno conocido común para todos los adenovirus. Hasta la fecha se han catalogado 51 serotipos distintos de adenovirus humanos basándose en su resistencia a ser neutralizados por antisueros de otros serotipos conocidos de adenovirus. Los epítopos reconocidos están localizados principalmente en el hexón y en la porción globular C-terminal de la fibra (Norrby, 1959). Los distintos serotipos pueden ser clasificados en seis subgrupos diferentes (Rosen, 1960 y Tabla II). Tabla II. Clasificación de los Adenovirus humanos (subgrupos del Género Mastadenovirus) Potencial oncogénico Especie Serotipos Tumores en animales Transformación de células en cultivo A 12, 18, 31 Alto + B 3,7,11,14,16,21,34,35,50 Moderado + C 1,2,5,6 Bajo + D 8,9,10,13,15,17,19,20 Bajo + E 4 Bajo + F 40,41 Desconocido + 1.2.3 - Estructura del virión Los adenovirus son partículas icosahédricas de 70-100 nm de diámetro con una o dos fibras proyectándose desde los vértices de la partícula (Figura 1.7). Estas partículas contienen DNA (13% de la masa), proteínas (87% de la masa), no tienen lípidos y solo cantidades traza de azúcares debido a que la fibra está O-glicosilada por una N-acetil-glucosamina (Rux et al., 2004). La mayoría de los estudios estructurales en adenovirus han sido realizados en los serotipos humanos 2 y 5 (hAd2 y hAd5). Se Capítulo 1. Introducción    han caracterizado 11 proteínas. Los principales componentes de la cápside son 240 copias del capsómero hexamérico que componen la mayoría de la superficie de la cápside y 12 copias del capsómero pentamérico situadas en los vértices de la misma. Se ha resuelto la estructura del capsómero hexamérico, que es un trímero del polipéptido II, de hAd2 y hAd5 (Rux et al., 2003). Doce hexones forman cada una de las 20 caras del icosahedro. El tamaño de cada uno de estos hexones varía entre los distintos serotipos, siendo el mayor de los descritos hasta el momento el del hAd2 con 967 aminoácidos. Comparando las secuencias de los hexones de distintos serotipos se han descrito hasta nueve regiones hipervariables en cada molécula del hexón. Se sabe que estas regiones hipervariables están localizadas en la parte superior de la estructura y seis de ellas se han podido situar con precisión en regiones con estructura  helicoidal (Saban et al., 2006). Se sabe que al menos una de estas regiones es responsable de la mayor parte de la actividad neutralizante sobre el virus (CrawfordMiksza & Schnurr, 1996). Los capsómeros pentaméricos, también denominados pentones, son un complejo covalente formado por dos proteínas, una proteína homopentamérica situada en la base del capsómero y una fibra trimérica que se proyecta hacia fuera (Figura 1.8). El monómero de la proteína que forma la base pentamérica del penton (del adenovirus humano 5) consiste en dos dominios diferenciados (Zubieta et al., 2005). En uno de estos dominios (el superior) se encuentra un motivo RGD importante para la internalización del virus. La mayoría de los adenovirus humanos contienen una única fibra a excepción de los Ad40 y Ad41 (Kidd et al., 1993) que contiene dos fibras en cada pentón. Esta característica inusual también está presente en el adenovirus aviar CELO (Chiocca et al., 1996). Debido a que la fibra es la encargada de interaccionar con el receptor celular, la incorporación de dos fibras presumiblemente aumentará el rango de tipos celulares que estos virus podrán unir. La estructura cristalina de la proteína de la base de hAd2 (un pentámero del polipéptido III), en complejo con péptidos del extremo N-terminal de la fibra, muestra como los motivos FNPVYPY de la fibra se unen en la interfaz entre monómeros del pentámero (Zubieta et al., 2005). Dichos motivos están altamente conservados entre distintos adenovirus. Del análisis de esta estructura se concluye que la proteína pentamérica de la base del pentón puede albergar hasta cinco sitios distintos de interacción con el extremo amino terminal de la fibra trimérica. De este modo hay dos  Capítulo 1. Introducción  posibles modos de interacción, o bien los tres extremos de la fibra ocupan posiciones adyacentes relacionadas entre sí por 72º, o bien dos extremos ocupan posiciones adyacentes y el otro extremo ocuparía una posición alterna girada 144º. Esta última organización parece más probable ya que se aproxima más a la simetría ternaria de la fibra. Figura 1.7 Descripción esquemática de la estructura de los adenovirus basada en estudios de criomicroscopía electrónica. La disposición de las proteínas del núcleo así como del DNA es puramente conjetural. Modificado de Russell (2009). La fibra de los adenovirus está compuesta por tres dominios claramente diferenciados: un dominio N-terminal que es el responsable de la unión a la proteína pentamérica de la base del pentón, una región fibrosa central flexible, que es importante en el proceso infectivo, y un dominio globular C-terminal que es el responsable de la interacción con el receptor celular primario (Wu et al., 2003). El conocimiento generado a partir de las estructuras cristalinas del dominio globular de hAd5, hAd2 y hAd12 (Xia et al., 1994; van Raaij et al., 1999; Bewley et al., 1999) y de la región fibrosa del hAd2 (van Raaij et al., 1999) ha producido el modelo estructural en uso actualmente para las fibras adenovirales. La región fibrosa esta compuesta por repeticiones de un motivo de unos 15 residuos que forma un Capítulo 1. Introducción    plegamiento único denominado triple--espiral (van Raaij et al., 1999). La longitud de esta región fibrosa varía entre los distintos serotipos humanos, desde 5 repeticiones en hAd3 hasta 21 repeticiones en hAd2 y hAd5 (Rux et al., 2004; San Martín et al., 2003). Existen otras proteínas minoritarias de la cápside que actúan estabilizando las interacciones entre los hexones en la partícula viral (proteína VIII) o que juegan papeles importantes en el ciclo viral (proteína I). La localización de estas proteínas minoritarias ha sido inferida de estudios de criomicroscopía electrónica (Saban et al., 2005; San Martín et al., 2008) y se representan en la figura 1.7. El núcleo del virión está constituído por cinco proteínas y el genoma viral. Los polipéptidos V, VII y XX son proteínas básicas que interaccionan con el DNA (Anderson et al.,1989; Hosokawa et al., 1976, Russell et al., 1968) y probablemente actúen condensándolo dentro del núcleo. La cuarta proteína del núcleo es la denominada proteína terminal (671 aminoácidos) que está covalentemente unida a los extremos 5’ del DNA (Rekosh et al., 1977). Por último se encuentran 10 copias de la cisteína-proteasa viral p23, importante en el procesamiento de varios precursores de proteínas del virión durante el ensamblaje, desensamblaje y la salida del endosoma durante el proceso de infección (Rusell, 2009) 1.2.4 - El genoma de los adenovirus El primer genoma secuenciado de un adenovirus fue el del hAd2 (Roberts et al., 1984). En la actualidad se conocen las secuencias de los genomas de 8 adenovirus humanos y 15 no humanos (Davison et al., 2003). Analizando estas secuencias se descubrió que los genomas de los distintos adenovirus tienen repeticiones terminales invertidas que varían en tamaño desde 36 pares de bases hasta 200 pares de bases y que funcionan como orígenes de replicación (Davison et al., 2003). Las secuencias de DNA que codifican para la mayoría de las proteínas estructurales del virión, las proteínas relacionadas con la replicación del DNA viral y aquellas que intervienen en el ensamblaje viral están mayoritariamente conservadas en todos los genomas de adenovirus. Por el contrario, las secuencias de DNA de las regiones de expresión temprana 1, 2 y 4 así como la región que codifica el VA RNA, (small virus-associated RNA) se encuentran en todos los adenovirus aislados en mamíferos, pero no están conservados en los otros géneros de Adenoviridae (Davison et al., 2003). Las  Capítulo 1. Introducción  proteínas codificadas por estas regiones tempranas así como el VA RNA regulan diversos procesos virales entre los que se incluyen la transcripción del genoma viral, el procesamiento de mRNA y su posterior exportación del núcleo. Figura 1.8 Estructura del capsómero pentamérico. (A) Estructura de la proteína pentamérica que forma la base del capsómero. Se indica la localización del bucle que contiene la secuencia RGD. (B) Estructura del dominio globular de cabeza de la fibra adenoviral de hAd35 (C) Los sitios de unión al receptor de las fibras adenovirales. Modificada de Russel (2009) 1.2.5 - La entrada de los adenovirus en la célula hospedadora El ciclo replicativo de los adenovirus comienza con la adsorción o unión extracelular del virus a los receptores celulares. Este evento esta mediado por las interacciones de gran afinidad que se establecen entre el dominio globular de la fibra (el dominio de cabeza) y su receptor celular primario. La subsiguiente internalización de la partícula viral por endocitosis mediada por clatrina se produce tras la interacción secundaria entre un motivo RGD (Arg-Gly-Asp) de la proteína pentamérica de la base de los pentones con integrinas v (Wickham et al., 1993). Este motivo RGD está muy Capítulo 1. Introducción    Figura 1.9 La ruta de entrada de los adenovirus comprende cuatro etapas claramente diferenciadas (1) la unión de la partícula viral a su receptor primario, (2) la internalización en endosomas recubiertos por clatrina, (3) formación de la subpartícula viral y su liberación en el endosoma tardío (4), (5) transporte de esta subpartícula por motores de dineína y por último la liberación del DNA en el núcleo de la célula (6). Figura obtenida de Nemerow et al. (2009). conservado en los adenovirus aunque recientemente se ha descrito un adenovirus (el adenovirus de ratón de tipo 1) en el que no aparece en la secuencia de la proteína de la base del pentón sino en el dominio de cabeza de la fibra (Raman et al., 2009). Aún así, parece jugar un papel crucial en la internalización a través de interacciones con integrinas v. Durante la etapa de internalización se produce un desensamblaje parcial de la partícula viral en el que las proteínas de los vértices del icosahedro son liberadas en el ambiente ácido del interior del endosoma. La liberación de la proteína VI produce la lisis de la membrana endosomal (Wiethoff et al., 2005), un proceso en el cual la subpartícula viral formada en el endosoma alcanza el citoplasma de la célula. Tras esta etapa, la subpartícula se asocia con motores de dineína y es transportada al núcleo a lo largo de los microtúbulos (Suomalainen et al., 1999). El proceso de entrada dentro de la célula culmina con la liberación del ácido nucleico viral y su tránsito a través del complejo del poro nuclear hasta alcanzar el núcleo celular (Figura 1.9)  Capítulo 1. Introducción  1.2.6 - El uso de los adenovirus en terapia génica. Los adenovirus han generado un gran interés como vectores de terapia génica. El adenovirus humano 5 ha sido extensamente estudiado y es el serotipo humano más usado en aplicaciones de terapia génica junto con el hAd2. Ambos han mostrado ser vehículos eficientes en células in vitro aunque, desafortunadamente, el uso de estos vectores in vivo ha sufrido serios reveses. En primer lugar, las mayoría de los humanos han desarrollado anticuerpos contra adenovirus de la especie C (hAd5 y hAd2) en edades tempranas, por lo que en muchos pacientes los vectores basados en estos serotipos son rápidamente neutralizados (Smith et al., 1993). En segundo lugar, la mayoría de los vectores adenovirales administrados por el riego circulatorio terminan retenidos en el hígado y no alcanzan las células o tejidos diana (Smith et al., 1993). En tercer lugar, los intentos de solventar estos problemas incrementando la dosis de vector ha resultado ser inadecuado y algunas veces tóxico, incluso letal (Raper et al., 2003). A pesar de todo esto, los adenovirus siguen siendo los vectores más usados en ensayos de terapia génica en humanos y en terapia contra el cáncer (http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical/) y una prueba de ello es que a fecha de septiembre de 2008, casi el 25% de los 1472 ensayos clínicos de terapia génica aprobados en el mundo utilizan vectores adenovirales, la mayoría de ellos encuadrados en terapia génica contra el cáncer (http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical/). Las estrategias que se han desarrollado para evitar los problemas previamente mencionados están basadas en el uso de adenovirus humanos de especies diferentes a la C (Abrahamsen et al., 1997), usar adenovirus humanos quiméricos (Mastrangeli et al., 1996) o usar adenovirus no humanos (Nguyen et al., 1999) para evitar la respuesta inmune. Por otro lado se han desarrollado vectores adenovirales que no quedan retenidos en el hígado y vectores que han sido diseñados para redirigirlos contra células o tejidos de interés. Para alcanzar este último objetivo se han realizado grandes esfuerzos para identificar las moléculas y los mecanismos que median la unión de los adenovirus a las células de interés. El receptor celular primario de los adenovirus humanos de las especies A, C, D E y F es CAR (coxsackie and adenovirus receptor), el de las especies B es CD46 mientras que el receptor de algunos adenovirus de la especie D es el ácido siálico (Arnberg, 2009; Tabla III). Capítulo 1. Introducción    Tabla III. Receptores de adenovirus humanos y su tropismo Especie Serotipos Tropismo natural Receptores principales A 12, 18, 31 Grastointestinal CAR 3, 7, 16, 21, 50 Respiratorio CD46 B 11, 14, 34, 35 Renal CD46 C 1, 2, 5, 6 Respiratorio CAR, Integrinas D 8,9,10,13,15,17,19 Ocular CAR, Ácido siálico E 4 Respiratorio, Ocular CAR F 40, 41 Gastrointestinal CAR 1.2.6.1 - Coxsackievirus-adenovirus receptor (CAR) El receptor CAR es una glicoproteína transmembrana de unos 46 kDa que fue inicialmente identificada porque se unía con gran afinidad a las fibras del coxsackievirus B y los serotipos 2 y 5 de los adenovirus humanos (Bergelson et al., 1997; Tomko et al., 1997). Tiene dos dominios extracelulares (distal-D1 y proximalD2) que pertenecen a la superfamilia de la inmunoglobulinas, una región hidrofóbica transmembrana y un dominio citoplasmático (Chretien et al., 1998). El dominio D1 por sí mismo es suficiente para la interacción con el dominio globular de la fibra adenoviral (Freimuth et al., 1999). Además de los serotipos 2 y 5 de adenovirus humanos, varios serotipos de las especies A, D, E y F reconocen CAR (Roelvink et al., 1998). Algunos adenovirus no humanos, como los adenovirus caninos parecen ser capaces de interaccionar con CAR, mientras que adenovirus bovinos, porcinos y ovinos parecen entrar de una manera independiente de CAR (Bangari & Mittal, 2005; Glasgow et al., 2004). Se han descrito proteínas homólogas a CAR humano en varias especies, incluyendo ratones, ratas, perros, cerdos y en el pez cebra; en todos estos casos con una gran nivel de homología (Bergelson et al., 1998; Fechner et al., 1999; Tomko et al., 1997). A pesar de la gran variación que existe entre las secuencias de los dominios de cabeza de las distintas fibras de los adenovirus que unen CAR (29-66%), los residuos implicados en la interacción con éste están bien conservados. Por otro lado, en aquellos adenovirus que no unen CAR (serotipos 3, 7, 19, 30 y 35) estos residuos o bien no están conservados o bien la conformación de algunos bucles clave impiden la interacción con el receptor (Law & Davison, 2002). Muchas líneas cancerosas son refractarias a ser transducidas por vectores adenovirales que interaccionan con CAR (Kim et al., 2002). Los niveles de expresión  Capítulo 1. Introducción  de CAR en tejidos cancerosos están inversamente correlacionados con la agresividad del tumor, y la inducción de la expresión de CAR en células cancerosas altamente tumorigénicas tiene un efecto supresor del tumor. Esta observación pone de manifiesto la necesidad de desarrollar vectores adenovirales que entren de una manera independiente de CAR para ser aptos en terapia génica de tumores. 1.2.6.2 - CD46 El receptor CD46 es una glicoproteína transmembrana cuya función biológica principal es evitar la activación del complemento en el tejido autólogo (Liszewski et al., 2005). CD46 está compuesto por: i) un dominio extracelular N-terminal que a su vez está formando por cuatro módulos diferenciados (SCR I, SCR II, SCR III, SCR IV) y por 1-3 dominios ricos en motivos STP (Ser-Thr-Pro), ii) una pequeña región de función desconocida, iii) un dominio transmembrana, y iv) un dominio citoplasmático C-terminal (Russell, 2004). CD46 funciona como un "imán de patógenos" ya que no sólo es el receptor de los adenovirus de la especie B sino que también funciona como receptor de otros patógenos humanos como el herpesvirus 6, el virus de la diarrea bovina, Streptococcus pyogenes, Neisseria gonorrhoeae, N. meningitides y Helicobactor pylori. Cada uno de ellos reconoce una parte diferente del ectodominio de CD46. CD46 es el receptor de la mayoría de los serotipos humanos de los adenovirus de la especie B (3, 7, 16, 21, 50, 11, 14, 34 y 35). Se ha demostrado que el dominio globular de estos serotipos interaccionan con el dominio SCRII, aunque el dominio SCR I también juega un papel importante en la interacción al mantener al dominio SCR II en una conformación favorable a la unión. Estudios cristalográficos con los dominios globulares de hAd11 y hAd35 han revelado que ambos dominios usan las mismas regiones para interaccionar con CD46, los bucles HI, DG e IJ (Persson et al., 2007; Pache et al., 2008). Vectores de terapia génica derivados de adenovirus de la especie B o vectores adenovirales quiméricos con fibras de la especie B pueden transducir eficientemente tipos celulares que son refractarios a los vectores tradicionales derivados de hAd5 incluyendo células cancerosas malignas, células madre hematopoyéticas y linfocitos. Capítulo 1. Introducción    1.2.6.3 - Ácido siálico El ácido siálico es un derivado del ácido neuroamínico que generalmente se encuentra presente en gangliósidos y glicoproteínas. El virus de la influenza, los rotavirus, coronavirus y poliomavirus lo utilizan como receptor celular, aunque difieren profundamente en su modo de interacción (Dormitzer et al., 2002; Stehle & Harrison, 1997; Weis et al., 1988). Algunos miembros de la especie D (8, 19a, 37) han sido frecuentemente asociados con queratoconjuntivitis epidémica (Rekhter et al., 1998) y se ha demostrado que estos serotipos utilizan el ácido siálico como receptor celular (Arnberg et al., 2000a,b; 2002). Estudios cristalográficos en adenovirus humanos de la especie D (Ad19 y Ad37) han mostrado que el sitio de unión al ácido siálico se encuentra localizado en la parte superior del trímero y que no está superpuesto con el sitio de unión a CAR (Burmeister et al., 2004). Se han desarrollado vectores basados en adenovirus que unen ácido siálico y vectores quimera con fibras de estos adenovirus que han demostrado un tropismo mayor e infectan células hematopoyéticas que generalmente son refractarias a la transducción por vectores que utilizan CAR como receptor. 1.2.6.4 - Otros receptores primarios Han sido descritos otros receptores primarios. CD80 y CD86 que son proteínas de membrana que pertenecen a la superfamilia de la inmunoglobulinas, o los proteoglicanos (PGs) que son glicoproteínas con una o más cadenas de glucosaminoglicanos. 1.2.6.5 - Integrinas Las integrinas son heterodímeros asociados no covalentemente y que funcionan como moléculas de adhesión celular. Están formados por dos subunidades ( y ß) que juegan un papel crítico en muchas funciones celulares como la adhesión, migración, crecimiento y diferenciación celular (Luo et al., 2007; Stewart & Nemerow, 2007). Existen 18 subunidades  diferentes y 8 subunidades ß, que pueden formar más de 20 complejos /ß distintos (Stewart & Nemerow, 2007). Múltiples tipos de integrinas (vß3, vß5, vß1, 3ß1, 5ß1) son capaces de actuar como receptores secundarios de adenovirus, a través de motivos RGD y LDV situados en los bucles expuestos de la proteína pentamérica de la base del pentón. En general esta     Capítulo 2 MATERIALES Y MÉTODOS  Capítulo 2. Materiales y Métodos    Capítulo 2 Materiales y métodos 2.1 - Materiales 2.1.1 - Materiales biológicos 2.1.1.1 - Bacterias XL1-blue: Es una cepa de Escherichia coli: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac(F’proAB lacIqZDM15 Tn10, Tetr). Obtenida de Stratagene. BL21(DE3): Es una cepa de E. coli B: Fdcm ompT hsdS(rBmB-) gal  (DE3). Obtenida de Promega JM109(DE3): Es una cepa de E. coli: endA1, recA1, gyrA96, thi, hsdR17 (rk–, mk+), relA1, supE44, –, (lac-proAB), [F’, traD36, proAB, lacIqZM15], lDE3. Obtenida de Promega 2.1.1.2 - Plásmidos pET23d(+) (Invitrogen): vector de expresión en bacterias. Expresa la proteína de interés con una cola de purificación N terminal compuesta por seis histidinas y una secuencia T7 (MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQRI; Novagen; el tag T7 es un péptido de 11 aminoácidos para el cual existen anticuerpos monoclonales disponibles que se pueden unir a resinas) para facilitar su purificación mediante cromatografía de afinidad. pET28c(+) (Invitrogen): vector de expresión en bacterias. Expresa la proteína de interés con una cola de purificación N terminal compuesta por seis histidinas y una secuencia T7, para facilitar su purificación mediante cromatografía de afinidad. pMAL-c2x (New England Biolabs): vector de expresión en bacterias. Expresa la proteína de interés con una proteína de fusión (MBP) en su extremo N-terminal para facilitar su purificación mediante cromatografía de afinidad. 2.1.2 - Materiales no biológicos 2.1.2.1 - Disoluciones y tampones Medio LB (Luria-Bertani): 10 g/l triptona, 5 g/l extracto de levadura, 10 g/l NaCl, pH 7.5  Capítulo 2. Materiales y Métodos   PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2PO4 y 1.5 mM KH2PO4. Tampón de electroforesis para SDS-PAGE (Tris-glicina SDS): 25 mM TrisHCl, pH 8.3, 192 mM glicina y 0.1 % SDS. Tampón MBP: 20 mM TrisHCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA Tampón ME: 10 mM MES-NaOH pH 6.5, 1 mM EDTA Tampón TAE 1X: 40mM TrisHCl, 1.1% ácido acético y 0.001% EDTA, pH 8.3 Tampón TE: 10 mM TrisHCl 8.5, 1 mM EDTA 8.0 Tampón de muestra para DNA (6X): 0.25% azul de bromofenol, 0.25% xilenocianol y 30% glicerol. Tampón de muestra de Laemmli 1X: 50 mM TrisHCl, pH 6.8, 2% SDS, 2.5% - mercaptoetanol, 90 mM DTT, 10% glicerol y 0.024% azul de bromofenol. TFB I: 30 mM acetato potásico, 100 mM RbCl, 10 mM CaCl2, 50 mM MgCl2 y 15% glicerol, pH 5.5. TFB II: 10 mM MOPS, pH 6.5, 75 mM CaCl2, 10 mM RbCl y 15% glicerol 2.1.2.2 - Medios de cultivo Las bacterias se crecieron en medio de LB. Para el crecimiento de bacterias transformadas con plásmidos, el medio se suplementó con los antibióticos ampicilina (100 μg/ml) (Sigma), tetraciclina (10 μg/ml) (Sigma) o kanamicina (50 μg/ml) (Sigma), según el método de selección para cada plásmido. Los cultivos de colonias en medio sólido se realizaron en el mismo medio con 1.5% bacto-agar (Difco) y antibióticos a las concentraciones indicadas anteriormente. 2.1.2.3 - Cebadores La secuencia de los cebadores usados, así como su finalidad, se resumen a continuación: Secuencia Enzima Observaciones Cebadores usados en el clonaje de los fragmentos de la proteína  C 5’-GATCCCAAGCTTTTAGGTGTCGATGCCGGT-3’ HindIII C(326)-REV 5’-CGCGGATCCGCTCCATTTCCGATATATCC-3’ BamH1 C(49)-FOR 5’-CGCGGATCCATGGCGATTTGACGCCGATC-3’ BamH1 C(27)-FOR 5' -CGCGGATCCATGCAGACTTCCGTGCAGGAA-3’ BamH1 C(117)-FOR Capítulo 2. Materiales y Métodos    Secuencia Enzima Observaciones Cebadores usados en el clonaje de los fragmentos de la fibra larga del adenovirus aviar de tipo 1 5’-CCGGAATTCGAGGAAGTTCCACACCCGAGGTG-3’ EcoR1 AShaft(579)-FOR 5’-CATGCCATGGCAGGCGGCAGTGGAACCTCTCTC-3’ NcoI AShaft(61)-FOR 5’-CGCGGATCCGCTGTTCGCTAACGCGAGCGCACC-3’ BamH1 AShaft(576)-REV 5’-CATGCCATGGCACTCTGCCTCAACCTGGACGAG-3’ NcoI AShaft(195)-FOR 5’-CATGCCATGGCACTCGAGCTCAACACGGACCCG-3’ NcoI AShaft(398)-FOR 5’-CGCGGATCCGACTCGAGGTCAACACGGACCCG-3’ BamH1 AShaft(398)-FOR 5’-GATCCCAAGCTTCATTGATAGTACCCCAGATAAG-3’ HindIII AShaft(792)-REV 5’-CCGGAATTCCTCGAGGTCAACACGGACCCG-3’ EcoR1 AShaft(398)-FOR 5’-CGCGGATCCTCCACACCCGAGCTGGCCACC-3’ BamH1 AShaft(576)-FOR 5’-CCGGAATTCTGGTCACCCTGAACTATCAGTC-3’ EcoR1 AShaft(430)-FOR 5’-CCGGAATTCTGTTGACGGTAAACACGATGGA-3’ EcoR1 AShaft(460)-FOR 5’-CCGGAATTCTGCTGCAGCTGCTCACTAATCCC-3’ EcoR1 AShaft(490)-FOR 5’-CCGGAATTCTGTTGGGGTTGAATGTAGACGGC-3’ EcoR1 AShaft(520)-FOR 5’-CCGGAATTCTGCTACAGATCCGTAAGGAAGCC-3’ EcoR1 AShaft(537)-FOR 5’-CCGGAATTCCTCGAGGTCAACACGGACCCG-3’ EcoR1 AShaft(398)MBP-FOR Cebadores usados en el clonaje de los dominios de la fibra del adenovirus porcino de tipo 4 5’-CGCGGATCCTAAGCTTGAACATTGCAAACCCT-3’ BamH1 pAd4(40)-FOR 5’-CGCGGATCCTAGTCTATCCCACCCTGTGGACG-3’ BamH1 pAd4(116)-FOR 5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTATTACAGTATCTG-3’ NotI pAd4(703)-REV 5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGTCTGGCAAGGTTGT-3’ NotI pAd4(392)-REV 5’-CGCGGATCCCCTTTGTCCCCCCCTACCCGAC-3’ BamH1 pAd4(393)-FOR 5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAATCCTGACCCAGGTAGCC-3’ NotI pAd4(291)-REV 5’-CGCGGATCCCCAGCTCCCCCTCCTTCCTGAGA-3’ BamH1 pAd4(292)-FOR 5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTATGCCAGTTTGCCAAAGTA-3’ NotI pAd4(313)-REV 5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAGACCCTATTGTATAGGGC-3’ NotI pAd4(371)-REV 2.2 - Métodos 2.2.1 - Manipulación de células bacterianas 2.2.1.1 - Obtención de bacterias competentes y transformación Para la obtención de células competentes, se creció la cepa bacteriana en medio LB a 37ºC durante toda la noche y el cultivo se diluyó cien veces en el mismo medio precalentado. Las bacterias se crecieron hasta alcanzar un valor de absorbancia a 600 nm de 0.3, se incubaron 5 minutos en hielo y se recogieron por centrifugación a 2500 g durante 10 min a 4º C. Seguidamente se resuspendieron en un medio de su volumen original en tampón TFB I previamente enfriado, se incubaron en hielo 5 minutos y se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 min a 4º C. Este segundo pellet de células se resuspendió en 1/25 de su volumen original en TFB II previamente enfriado. Las células se congelaron utilizando hielo seco y se guardaron a –70º C hasta su utilización. Para su transformación, las bacterias competentes se descongelaron en hielo y  Capítulo 2. Materiales y Métodos   una alícuota de 100 μl se mezcló con el DNA transformante (1-10 ng). Después de incubar en hielo durante 30 minutos, se realizó un choque térmico a 42º C durante 45 segundos. Tras mantenerlas de nuevo en hielo durante 2 minutos, se añadió 1 ml de medio LB y se incubaron a 37º C durante 1-6 h con agitación. Por último, se recogieron por centrifugación y se esparcieron sobre una placa de LB-agar suplementada con el antibiótico correspondiente. 2.2.2 - Manipulación ácidos nucleicos 2.2.2.1 - Purificación de DNA de plásmidos La purificación de DNA a pequeña escala para el análisis de transformantes, se realizó usando el sistema DNA WizardTM minipreps (Promega) a partir de 5 ml de cultivo bacteriano. Para la obtención de DNA a mayor escala se utilizaron 100 ml de cultivo bacteriano, a partir de los cuales se aisló el plásmido usando el sistema PureYield™ Plasmid Midiprep System (Promega), siguiendo las instrucciones de la casa comercial. 2.2.2.2 - Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Todas las reacciones se realizaron con el kit Platinum® Pfx DNA Polymerase (Invitrogen), el cual incluye 50 mM MgSO4, tampón de amplificación 10X y solución Enhancer 10X, que aumenta la especificidad de los cebadores. Las reacciones se llevaron a cabo manteniendo constantes las concentraciones de los reactivos y los ciclos de amplificación, a excepción de la temperatura de hibridación que varió dependiendo del oligonucleótido empleado para iniciar cada reacción. En todos los casos la reacción de amplificación se realizó con 2.5 unidades de Platinum® Pfx DNA Polymerase (Invitrogen), 1X de tampón de amplificación, 1X de solución Enhancer e incluyó 1 mM MgSO4, 0,4 mM dNTPs, 0,2 μM de cada cebador y 1 ng de plásmido. 2.2.2.3 - Aislamiento de fragmentos de DNA y su purificación Para aislar y purificar fragmentos de DNA procedentes de reacciones de amplificación por PCR o de digestiones con enzimas de restricción, primero se sometieron las muestras a electroforesis en geles de 0.8% de agarosa en 1X TAE en presencia de 0.5 μg/ml de bromuro de etidio (Sambrook et al., 1989). Posteriormente se cortó la banda correspondiente al ácido nucleico de interés con una cuchilla, y se Capítulo 2. Materiales y Métodos    transfirió a un tubo eppendorf. El DNA se purificó mediante el kit comercial GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences), siguiendo las instrucciones del proveedor. 2.2.2.4 - Tratamiento de DNA con endonucleasas Las digestiones de DNA con enzimas de restricción (Promega) se llevaron a cabo según las instrucciones del proveedor, en los tampones suministrados y a la temperatura óptima para cada caso. Las reacciones de ligación se realizaron a temperatura ambiente durante 12 h con la DNA ligasa del fago T4 (Promega). 2.2.3 - Manipulación de proteínas 2.2.3.1 - Análisis por electroforesis SDS-PAGE La electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) se llevó a cabo tal y como describe Laemmli (1970). Las concentraciones de poliacrilamida empleadas para el gel separador fueron entre 10-15% dependiendo del tamaño de la proteína y para el gel concentrador del 4%. Después de la electroforesis las proteínas se fijaron y tiñeron con azul de Coomassie al 0.25% en 33% metanol y 10% ácido acético y se destiñeron en la misma disolución sin colorante. 2.2.3.2 - Cromatografía de afinidad La cromatografía de afinidad separa proteínas basándose en la afinidad de una proteína a un determinado ligando. El método de basa en que las proteínas que no presentan ninguna afinidad por el ligando inmovilizado en la resina no interaccionan y son eliminadas en el lavado. Las proteínas retenidas son eluídas mediante cambios de pH o el uso de un tampón con un compuesto que compita con la interacción entre la proteína y el ligando de la resina. Las proteínas que fueron clonadas en el vector de expresión pET28c(+) fueron purificadas en su estado nativo utilizando una resina de Ni-NTA (Qiagen) que tiene una elevada afinidad por la cola de seis histidinas que presentaban las proteínas en su extremo N-terminal. Las proteínas se eluyeron utilizando concentraciones crecientes de imidazol según el protocolo del fabricante. Las proteínas que fueron clonadas en el vector de expresión pMAL-c2x fueron purificadas en su estado nativo utilizando una resina de amilosa (New England Biolabs) gracias a que la proteína de fusión MBP (Maltose-Binding Protein)  Capítulo 2. Materiales y Métodos   interaccionaba con la resina con gran afinidad. Las proteínas se eluyeron utilizando un tampón con maltosa. 2.2.3.3 - Cromatografía de intercambio iónico La cromatografía de intercambio iónico separa proteínas basándose en diferencias en la carga de su superficie. El método se basa en la formación de interacciones iónicas entre los grupos polares cargados de la superficie de las proteínas y el gel de intercambio iónico. De esta forma las proteínas neutras al pH utilizado no interaccionan con la columna y son eliminadas en el lavado. Las proteínas que interaccionan con la columna son eluidas con un tampón que o bien tenga una mayor fuerza iónica o un pH diferente. Las proteínas descritas en esta tesis fueron purificadas mediante cromatografía de intercambio aniónico utilizando columnas UnoQ y UnoS (Biorad, Madrid, España). La muestras se dializaron en tampón de cromatografía (TE o ME) y se eluyeron en un gradiente lineal 0-1 M NaCl en este mismo tampón. 2.2.3.4 – Cromatografía de exclusión molecular La cromatografía de exclusión molecular separa proteínas basándose en diferencias en su tamaño. El método se basa en la utilización de una resina compuesta por partículas esféricas con poros de un tamaño adecuado a través de las cuales las proteínas difunden a una velocidad proporcional a su tamaño. Algunas de las proteínas descritas en esta tesis fueron purificadas mediante cromatografía de exclusión molecular utilizando columnas Sephacryl S-100 y S-200 (GE Healthcare) usando como tampón para la cromatografía 10 mM TrisHCl 8.5, 1 mM EDTA 8.0, 150 mM NaCl. 2.2.4 - Métodos cristalográficos 2.2.4.1 - Crecimiento de cristales El objetivo de la cristalización de proteínas es obtener cristales bien ordenados y de un tamaño adecuado (>0.05 mm; idealmente de unos 0.3 mm). Estos cristales se producen a partir de una disolución sobresaturada de proteína mediante la adición ordenada de moléculas de soluto a un núcleo inicial de cristalización. De esta forma cuando realizamos un experimento de cristalización lo que pretendemos es ir incrementando lentamente la concentración de la proteína hasta obtener una solución Capítulo 2. Materiales y Métodos    sobresaturada que genere unos pocos núcleos de cristalización sobre los que crezcan unos pocos cristales. Si se supera en exceso el punto de saturación o si se hace demasiado rápido la proteína precipita como un agregado amorfo que no es apto para estudios de difracción. La proteína ha de cumplir cinco requisitos esenciales para ser considerada apta para cristalizar: Debemos disponer de ella en una elevada concentración (5-20 mg/ml), tiene que estar pura (>95%), tiene que ser homogénea, estable y debemos disponer de una cantidad suficiente (>5 mg). Una vez se ha obtenido la proteína existen varias estrategias de cristalización. La más común se basa en alcanzar la sobresaturación mediante difusión de vapor. Una pequeña gota compuesta por partes iguales de solución de proteína y de cristalización se mantiene dentro de cámara hermética formada por un reservorio que contiene un volumen mucho mayor de solución de cristalización. En estas condiciones la gota pierde agua poco a poco hasta que las concentraciones en la gota y el reservorio son iguales. Existen dos modalidades de esta técnica, en gota colgante y en gota sentada. Otra estrategia es la basada en la diálisis, la solución de proteína se introduce en un pequeño botón de diálisis que a su vez se sumerge en la solución de cristalización lo que permite que la proteína alcance gradualmente la condición de sobresaturación. Todas las proteínas descritas en este trabajo han sido cristalizadas utilizando el método de difusión de vapor en gota sentada. En esta técnica la gota, una mezcla de la solución de cristalización y la solución de proteína, se asienta sobre una elevación cóncava situada por encima del nivel de la solución de cristalización. Todos estos ensayos de cristalización se realizaron en placas de 96 pocillos CompactClover (Jena Biosciences, Jena, Alemania). Para localizar las condiciones iniciales de cristalización se utilizaron condiciones comerciales como el "Crystal Screen 1" (Hampton Research), "Crystal Screen 2" (Hampton Research), "Crystallization basic kit for proteins" (Sigma), "PEG/Ion Screen 1" (Jena Biosciences) y "PEG/Ion Screen 2" (Jena Biosciences). Una vez localizadas unas condiciones iniciales prometedoras se optimizaron variando la temperatura, el pH, el tampón usado, las concentraciones de precipitante y de sal y buscando nuevos aditivos que finalmente mejorasen el tamaño y/o el límite máximo de difracción de los cristales. Los cristales obtenidos en el proceso de optimización se probaron a temperatura ambiente utilizando un difractómetro BrukerNonius con un detector Kappa-CCD para determinar sus parámetros de celdilla, grupo  Capítulo 2. Materiales y Métodos   través de una columna Uno-Q6. La proteína eluía justo al comienzo del gradiente lineal de cloruro sódico 0-1 M en tampón TE. A continuación se concentró utilizando concentradores Centricon y se realizaron tres lavados con tampón TE para eliminar impurezas de bajo peso molecular. La expresión y la purificación de los dominios C(27-326) y C(49-326) se llevó a cabo de la misma manera que hemos descrito para C(117-326) con la excepción de que se digerían con 1 mg ml-1 de tripsina. 2.3.1.3 - Cristalización de  C(117-326) y  C(151-326). Los ensayos de cristalización de las cuatro muestras se llevaron a cabo utilizando la técnica de difusión de vapor en gota sentada con 0.1-0.15 ml de solución en el reservorio y 2-5 μl de solución de proteína mezcladas con 2-5 μl de solución de reservorio. La proteína C(151-326) cristalizó en varias condiciones: 1.5 M sulfato de amonio, 0.1 M Tris-HCl 8.5, 12% glicerol (cristales de tipo I), su posterior optimización dio como resultado cristales crecidos en presencia de 10 mM cloruro de zinc (cristales de tipo IIz) y 10 mM cloruro de cadmio (cristales de tipo IIc). Gracias a la presencia de glicerol en la condición de cristalización, los cristales fueron crioprotegidos sin necesidad de diseñar ninguna condición crioprotectora. La proteína C(117-326) cristalizó en 0.6-0.75 mM sulfato de amonio, 0.1 M Tris-HCl 8.4, 25% glicerol, 50 mM sulfato de zinc, donde tras un día aparecieron cristales con forma de barra y sección hexagonal (cristales de tipo P). Durante la recogida de datos la condición se abrió para poder coger uno de estos cristales con sección hexagonal. Tras unos días aparecieron unos nuevos cristales en esta misma condición con forma de prisma regular oblicuo (cristales de tipo C). Los cristales de C(27-326) aparecieron utilizando 27% PEG 4000, 0.1M Tris-HCl 8.5, 0.2M LiSO4. 2.3.2 - La proteína  A 2.3.2.1 - Expresión y purificación de la proteína  A La proteína A del reovirus aviar S1133 fue expresada utilizando el vector de expresión pMALCS2 fusionada a MBP como había sido descrito previamente (Gonzalez-Lopez et al,. 2003). La secuencia del inserto fue confirmada mediante secuenciación (Sistemas Genómicos, Valencia, España). Para su expresión en gran escala, la cepa XL1-Blue de Escherichia coli fue transformada con el vector pMALCS2-A. Cuatro cultivos de 0.7 litros se dejaron Capítulo 2. Materiales y Métodos    crecer a 37 ºC hasta que se alcanzó una densidad óptica de 0.6 medida a 600 nm en medio LB. En ese momento se indujo la expresión añadiendo 1 mM IPTG y se dejo a 37 ºC durante 3 horas. Las células se centrifugaron y se resuspendieron en 40 ml de tampón de lisis (20 mM Tris-HCl pH 7.3, 200 mM NaCl, 1 mM DTT), al que se le añadió una mezcla de inhibidores de proteasas específico para extractos de bacterias (Sigma-Aldrich, Madrid, España). y se congelaron a -20 ºC. El precipitado celular fue lisado con un emulsificador (Avestin Emulsifier C5, Avestin Europe GMBH, Mannheim, Alemania). Después de eliminar el material insoluble mediante centrifugación (20000 x g, 1 hora, 4 ºC) se añadió cloruro sódico y PEI (polietilenimina) hasta unas concentraciones finales de 1 M y 0.1% (w/v) respectivamente y se incubó a 4 ºC durante 1 h para precipitar los ácidos nucleicos. Después de un segundo paso de centrifugación (20000 g, 1 hora, 277 K), se le añadió ribonucleasa A de origen bovino (Sigma-Aldrich, Madrid, España) hasta una concentración final de unos 30 μg ml-1 y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente para degradar el RNA. Posteriormente se le añadieron 3 ml de resina de amilosa (New England Biolabs, Ipswich MA, USA), se mezcló suavemente y se incubó 10 minutos a temperatura ambiente y se decantó en una columna. La resina fue lavada tres veces con 30 ml de tampón MBP y se eluyó dos veces con 10 ml de tampón MBP suplementado con 10 mM de maltosa. Para eliminar la proteína de fusión, se le añadió cloruro de calcio hasta una concentración final 1 mM y factor Xa hasta una concentración final de 1 μg ml-1 y se incubó la solución durante 20 horas a temperatura ambiente. Tras dializar la mezcla toda la noche a temperatura ambiente en tampón TE, se sometió a cromatografía de interacción iónica con una columna UnoQ6. La proteína A eluía en la fracción no retenida, mientras que la proteína MBP y otras impurezas quedaban retenidas en la columna. La proteína fue concentrada con concentradores Centricon haciendo tres lavados con tampón TE para eliminar impurezas de bajo peso molecular. Desde la etapa en la que A fue separada de MBP (digestión con el factor Xa), todo el proceso se llevó a cabo a temperatura ambiente, ya que A tiene la tendencia a precipitar en frío en ausencia de sal (aunque de manera reversible).  Capítulo 2. Materiales y Métodos   2.3.2.2 - Cristalización de la proteína  A La cristalización fue llevada a cabo mediante experimentos de difusión de vapor en gota sentada a 278 K usando un volumen de 0.1-0.15 ml en el reservorio y gotas que consistían en 2-5 μl de solución de proteína (14-30 mg ml-1 en tampón TE) más 2-5 μl de solución de reservorio, siempre se mezclaron volúmenes iguales de ambos. Se obtuvieron cristales después de 6-12 meses en pH 5.5-6.5, 278 K usando como tampón 100 mM citrato sódico, fosfato sódico o MES y como precipitante entre 0.1 y 0.6 M sulfato amónico. Los cristales fueron crioprotegidos en la solución de cristalización a la que se le suplementó 25% glicerol. 2.3.2.3 - Experimentos de ultracentrifugación analítica Los análisis de velocidad de sedimentación fueron llevados a cabo utilizando una ultracentrífuga Beckman Optima XL-A (Centro de Investigaciones Biológicas, Madrid) equipada con un sistema óptico de detección UV-VIS y un rotor An-50Ti. La proteína A fue preparada como ha sido descrito previamente; un RNA autocomplementario de secuencia 5'- ACACUGUGAUCAGCAGGCGCCAGCUGAUCACAGUGU-3' fue obtenido de Nedken (Barcelona, España). El RNA de doble cadena fue preparado utilizando este oligonucleótido calentándolo primero y dejándolo enfriar lentamente. En todos los experimentos se utilizó un tampón PBS suplementado con 2 mM de cloruro de magnesio. Se centrifugaron muestras de 0.4 ml de A y dsRNA a diferentes ratios a 40000 rpm y 20 ºC. La concentración de A en todas las muestras con exceso de proteína fue de 4.9 μM, mientras que el dsRNA fue añadido a concentraciones 0.0, 1.0, 2.0 y 3.0 μM lo que dio lugar a unos ratios A-dsRNA de 1:0.0, 1:0.21, 1:0.41 y 1:0.62 respectivamente. La concentración de dsRNA en todas las muestras con exceso de dsRNA fue de 1.77 μM mientras que la proteína A fue añadida a concentraciones 0.0, 1.71, 0.58, 0.18 y 0.058 μM lo que llevo a unos ratios A-dsRNA de 0:1.0, 1:1.0, 1:3.1, 1:9.3 y 1:31 respectivamente. Para el cálculo de las concentraciones, se utilizó el coeficiente de extinción molar de A y el dsRNA calculado a partir de su secuencia (95590 M-1cm-1 a 280 nm en el caso de la proteína A y 347100 M-1cm-1 a 260 nm para el dsRNA). Los experimentos fueron monitorizados a 280 nm (experimento 1) y 243 nm (experimento 2), y los datos fueron analizados utilizando la distribución Capítulo 2. Materiales y Métodos    continua c(s) de las soluciones de la ecuación de Lamm con el programa SEDFIT (Schuck, 2000). Los valores teóricos del coeficiente de sedimentación s20,w para los distintos complejos fueron estimados utilizando el programa HYDROPRO (García de la Torre et al., 2000). Los complejos fueron construidos utilizando una, dos o tres copias de la cadena G de la estructura de A y un modelo de la forma A canónica del dsRNA con la secuencia que utilizamos. Las moléculas de A fueron colocadas en el centro del dsRNA. El volumen específico parcial de A (0.728 ml/g) fue calculado a partir de su secuencia de aminoácidos directamente por el programa HYDROPRO. Para el dsRNA se utilizó un valor de 0.55 ml/g. El volumen específico parcial de los distintos complejos se calculó promediando los valores antes citados, lo que llevo a volumenes específicos parciales de 0.669, 0.692 y 0.712 ml/g para los complejos A-dsRNA 1:1, 2:1 y 3:1 respectivamente. Como se recomendaba en el manual de HYDROPRO, los valores de los radios atómicos efectivos para la proteína, el dsRNA y los complejos proteína-dsRNA fueron 3.2, 2.8 y 3.0 respectivamente. 2.3.2.4 - Experimentos de microscopía electrónica Para el experimento con proteína sólo se utilizó a una concentración de 0.05 mg/ml y para los experimentos con dsRNA se mezcló A a 0.05 mg/ml con dsRNA de 36 pares de bases a 1.8 μM (ratio A-dsRNA de 15:1). Todos los experimentos se realizaron en tampón PBS suplementado con 2 mM de cloruro de magnesio. Las muestras fueron colocadas sobre una superficie de carbono/mica y se realizó una tinción negativa utilizando 1% (w/v) de silicotungstato de sodio (pH 7.0). Las fotografías de microscopía electrónica fueron tomadas utilizando un microscopio JEOL 120 EX II a 100 kV y utilizando una magnificación nominal de 40000. 2.3.3 - El dominio de cabeza de la fibra larga del adenovirus aviar de tipo 1 2.3.3.1 - Construcción de los vectores de expresión Un fragmento de ADN que codificaba para los residuos 579-793 (el dominio de cabeza) de la fibra larga del adenovirus aviar (UniProt Q64787) fue producida por PCR y clonada en el vector de expresión pET28c(+) (Novagen, Darmstadt, Alemania) entre los sitios BamHI-HindIII. El plásmido resultante pCELOlongfib579-793 codifica para el mencionado fragmento fusionado con una cola de purificación N-  Capítulo 2. Materiales y Métodos   terminal compuesto por seis histidinas y una secuencia T7. La secuencia fue confirmada por secuenciación de ADN (Sistemas Genómicos, Valencia, España). 2.3.3.2 - Expresión y purificación del dominio de cabeza (aminoácidos 579-793) El plásmido pCELOlongfib579-793 fue transformado en cepas de Escherichia coli JM109 (DE3) (Promega, Madrid, España). Se crecieron cuatro cultivos de 0.7 litros aeróbicamente a 37 ºC hasta que se alcanzó una densidad óptica de 0.6-0.8 medida a 600 nm. Se indujo la expresión añadiendo 1 mM IPTG durante 3 horas. Tras ese tiempo se centrifugaron las células y se resuspendieron en 40 ml de tampón PBS frío y se congelaron a -20 ºC. Las bacterias fueron lisadas en un emulsificador (emulsificador C5 Avestin, Avestin Europe GmbH, Mannheim, Alemania). Después de eliminar el material insoluble por centrifugación, se añadieron 3 ml de resina de Ni-NTA (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.). La suspensión se incubó durante 1 hora a 4 ºC y se vertió en una columna vacía. La resina se lavó con tampón PBS y elución se realizó con un gradiente de imidazol pH 7 en tampón PBS (se eluyó en 0.01, 0.05, 0.125, 0.25, 0.5 y 1.0 M imidazol). La proteína eluyó en concentraciones de imidazol de entre 0.125 y 0.5 M. Las fracciones entre 0.25 y 0.5 M de imidazol contenían la proteína prácticamente pura, la fracción no retenida así como las fracciones hasta 0.125 M imidazol se combinaron y el procedimiento se repitió de nuevo hasta que ya no eluía más proteína. Para su posterior purificación, las fracciones que contenían la proteína fueron dializadas contra tampón ME y se pasaron a través de una columna Uno-S6 de intercambio catiónico (Bio-Rad, Madrid, España) equilibrada con el mismo tampón. La proteína eluía en varios picos entre 0.2 y 0.4 M de cloruro sódico cuando se usaba un gradiente lineal de 0.0-1.0 M NaCl en tampón ME. Se agruparon todas las fracciones que contenían la proteína pura a juzgar por electroforesis desnaturalizante. La proteína se concentró a 23 mg ml-1 utilizando concentradores Centricon (Millipore, Madrid, España), se lavadron tres veces con el tampón TE para eliminar las impurezas provenientes de moléculas pequeñas. 2.3.3.3 - Cristalización del dominio de cabeza La cristalización se llevó a cabo utilizando la técnica de difusión de vapor en gota sentada con 0.2 ml de solución en el reservorio y 2 μl de solución de proteína Capítulo 2. Materiales y Métodos    mezcladas con 2 μl de solución de reservorio. La proteína cristalizó usando 10-12% (w/v) PEG 10000, 0.1 M HEPES-NaOH pH 4.7-6.1 y 0-10% (v/v) de glicerol incubando las placas de cristalización a 5 ºC. Para la recogida de datos, los cristales se crioprotegieron en una solución de cristalización que contenía un 25% (v/v) de glicerol, y se congelaron en una corriente de nitrógeno. 2.3.4 - Los dominios de la fibra del adenovirus porcino de tipo 4 2.3.4.1 - Construcción de los vectores de expresión Nuestros colaboradores en Birminghan (EEUU) obtuvieron la cepa NADC-1 de adenovirus porcino (catálogo número 030-PDV) de los laboratorios del servicio nacional de veterinaria del USDA Animal and Plant Health Inspection Service (Ames, Iowa). El gen de la fibra de NADC-1 fue amplificado directamente desde el stock viral usando la técnica de PCR y clonado en el plásmido pKan-NMOvPAd4, que fue el material de partida con el que se empezó el trabajo. Se clonaron los fragmentos 40703, 116-703, 40-291, 40-317, 40-392, 116-291, 291-392, 317-703, 371-703, 393-703 en el vector pET28c(+) (Novagen/Merck, Nottingham, England) entre los sitios BamHI-NotI. En todas las construcciones se usó el codón de iniciación del vector de expresión y se insertó un codón de terminación después del residuos 291, 317 o 392 según corresponda. Los plásmidos resultantes codifican para los dominios de la fibra correspondientes, además de una cola de purificación N-terminal que consiste en seis residuos consecutivos de histidinas y una secuencia T7. Las secuencias de estos insertos han sido confirmadas por secuenciación de DNA (Sistemas Genómicos, Valencia, España). Finalmente se lograron cristalizar los dominios 40-291, 116-291 y 393-703 y se resolvieron las estructuras del dominio de cabeza (116-291) y galectina (393-703). 2.3.4.2 - Expresión y purificación del dominio de cabeza (116-291) Para expresar el dominio de cabeza se transformó la cepa BL21(DE3) de Escherichia coli con el plásmido pET28c-Fib116-291. Se crecieron cuatro cultivos de 0.7 litros cada uno a 37 ºC hasta que alcanzaron una densidad óptica de 0.6-0.8 medida a 600 nm, y se indujo la expresión de la proteína con1 mM IPTG. Tras 3 horas a 37 ºC los cultivos se centrifugaron y los precipitados se resuspendieron en 40 ml de tampón de resuspensión (50 mM TrisHCl pH 8.5, 1 M cloruro sódico) y se congelaron a -20 ºC. Las bacterias se lisaron utilizando un emulsificador (Avestin  Capítulo 2. Materiales y Métodos   EmulsiFlex C5, Avestin Europe GMBH, Mannheim, Alemania). Después de eliminar el material insoluble por centrifugación (20 minutos a 20000 g), se añadieron 4 ml de resina de Ni-NTA (Qiagen, Valencia, California, USA). La suspensión fue incubada durante 1 hora a 4 ºC tras lo que se decantó en una columna vacía, se lavó con tampón de resuspensión y la proteína se eluyó con un gradiente de imidazol pH 7.0 (10, 20, 50, 100, 200, 400, 600, 800 y 1000 mM imidazol). La proteína eluía a partir de 600 mM imidazol. 2.3.4.3 - Expresión y purificación de los dominios de shaft y cabeza (40-291) Para expresar los dominios de shaft y cabeza se transformó la cepa BL21 (DE3) de Escherichia coli con el plásmido pET28c-Fib40-291. Se crecieron cuatro cultivos de 0.7 litros cada uno a 37 ºC hasta que alcanzaron una densidad óptica de 0.6-0.8 medida a 600 nm, y se indujo la expresión de la proteína con 1 mM IPTG. La proteína se purificó con el mismo protocolo que ha sido descrito para el dominio de cabeza. 2.3.4.4 - Expresión y purificación del dominio de galectina (393-703) Para expresar el dominio de galectina se transformó la cepa BL21 (DE3) de Escherichia coli con el plásmido pET28c-Fib393-703. Se crecieron cuatro cultivos de 0.7 litros cada uno a 37 ºC hasta que alcanzaron una densidad óptica de 0.6-0.8 medida a 600 nm, y se indujo la expresión de la proteína con 1 mM IPTG. Tras 16 horas a 25 ºC los cultivos se centrifugaron y los precipitados se resuspendieron en 40 ml de tampón de resuspensión (50 mM TrisHCl pH 8.5, 1 M cloruro sódico) y se congelaron a -20 ºC. Las bacterias se lisaron utilizando un emulsificador. Después de eliminar el material insoluble por centrifugación (20 minutos a 20000 g), se añadieron 4 ml de resina de Ni-NTA. La suspensión fue incubada durante 1 hora a 4 ºC, se lavó con tampón de resuspensión y la proteína se eluyó con un gradiente de imidazol pH 7.0 (10, 20, 50, 100, 200, 400, 600, 800 y 1000 mM imidazol). El dominio de galectina eluía entre las fracciones de 50 y 500 mM. La proteína eluída se dializó en 10 mM Tris-HCl pH 8.5, 1 mM EDTA y se cargó en una columna Uno-Q6 (Biorad, Madrid, España). La proteína no se unía a la columna y eluía en las fracciones no retenidas. El contenido de estas fracciones se concentró hasta 1.0 ml utilizando concentradores Centricon (Millipore, Madrid, España) y se cargó en una columna de Capítulo 2. Materiales y Métodos    exclusión molecular Sephacryl S100 (GE Healthcare, Alcobendas, España) previamente equilibrada con tampón TE conteniendo 150 mM cloruro sódico. 2.3.4.5 - Cristalización del dominio de cabeza Los experimentos de cristalización se han llevado a cabo utilizando la técnica de gota sentada. Se usaron 150 μl de solución de cristalización en el reservorio y 4-5 μl de solución con proteína mezclados con 4-5 μl de solución de cristalización a partes iguales. La proteína pAd4(116-291) se concentró hasta 40-60 mg ml-1 utilizando concentradores Centricon y se lavó con tampón TE hasta 3 veces para eliminar impurezas. La solución de cristalización consistió en 1 M sulfato de litio suplementado con polietilenglicol, se obtuvieron cristales equivalentes utilizando un rango 1-10% (w/v) de PEG 8000. 2.3.4.6 - Cristalización del dominio de shaft y cabeza Los experimentos de cristalización se han llevado a cabo utilizando la técnica de gota sentada. Se usaron 150 μl de solución de cristalización en el reservorio y 4-5 μl de solución con proteína mezclados con 4-5 μl de solución de cristalización a partes iguales. La proteína pAd4(40-291) se concentró hasta 40-60 mg ml-1 y se lavó con tampón TE hasta 3 veces para eliminar impurezas. La solución de cristalización consistió en 15% (w/v) PEG 4000, 0.1M citrato sódico pH 6.0 y 0.1M sulfato de amonio. Para la recogida de datos los cristales de este dominio fueron trasferidos a una solución con la misma composición que la solución de cristalización más un 20% (v/v) de glicerol. Los cristales difractaron hasta 3.1 Å de resolución en la línea X11 del DESY, desafortunadamente aunque ha sido posible resolver su estructura no ha sido posible trazar el dominio shaft. 2.3.4.7 - Cristalización del dominio de galectina y de los complejos galectina-azúcar Del mismo modo que el dominio de cabeza, todos los experimentos de cristalización del dominio de galectina fueron llevados a cabo utilizando la técnica de gota sentada. Se usaron 150 μl de solución de cristalización en el reservorio y 4 μl de solución con proteína mezclados con 4 μl de solución de cristalización a partes iguales. La proteína pAd4(393-703) se concentró hasta 10-20 mg ml-1 utilizando concentradores Centricon, lavando tres veces con tampón TE 8.0. Los cristales del  Capítulo 2. Materiales y Métodos   dominio de galectina se obtuvieron utilizando como solución de cristalización 25% (w/v) PEG 3350, 500 mM nitrato de sodio, 2 mM ácido siálico (este último fue utilizado como un aditivo aunque sepamos a priori que no es un ligando de la galectina). Para la recogida de datos, los cristales del dominio de galectina se transfirieron a una solución con la misma composición que la solución de cristalización más un 20% (v/v) de glicerol. Para resolver las estructuras del dominio de galectina con cuatro azúcares diferentes (lactosa, N-acetillactosamina, lacto-Nneotetraosa y tri(N-acetillactosamina)), en primer lugar se intentó incubar cristales nativos con soluciones que contenían estos azúcares, pero esta aproximación no tuvo el éxito esperado, por lo que procedimos a buscar condiciones de cristalización en presencia de los azúcares. La lactosa utilizada en los experimentos de cristalización se obtuvo de Sigma-Aldrich Química, S.A. (Madrid, España), la N-acetil-lactosamina y la lacto-N-neotetraosa se obtuvieron de Dextra Laboratories (Reading, UK) y la 2aminoethyl-tri(N-acetillactosamina) se obtuvo del Glycan Array Synthesis core D of the Consortium for Funcional Glycomics (The Scripps Research Institute, Department of Molecular Biology, La Jolla, CA). Los cristales del complejo con lactosa se obtuvieron usando 28% (w/v) PEG 3350, 100 mM nitrato de sodio y 5 mM DTT. Como solución de cristalización, se añadió 70 mM de lactosa en la solución de proteína. Los cristales aparecieron en 1-2 semanas y fueron crioprotegidos en 35% (w/v) PEG 3350, 100 mM nitrato de sodio, 1 mM DTT, 70 mM lactosa. Los cristales del complejo con N-acetillactosamina se obtuvieron usando 35% (w/v) PEG 3350, 500 mM nitrato de sodio y 5 mM DTT. Como solución de cristalización, se añadió 40 mM de N-acetillactosamina en la solución de proteína. Los cristales aparecieron en 12 semanas y fueron congelados directamente. Los cristales del complejo con lacto-Nneotetraosa fueron obtenidos usando 27% (w/v) PEG 3350, 200 mM nitrato de litio y 5 mM DTT. Como solución de cristalización, se añadió 5 mM de lacto-N-neotetraosa en la solución de proteína. Los cristales aparecieron en 1-2 semanas y fueron congelados directamente. Los cristales del complejo con tri-(N-acetillactosamina) se obtuvieron usando 28% (w/v) PEG 3350, 300 mM nitrato de litio y 5 mM DTT. Como solución de cristalización se añadió 5 mM de tri-(N-acetillactosamina) en la solución de proteína. Los cristales aparecieron en 1-2 semanas y fueron crioprotegidos en 35% (w/v) PEG 3350, 300 mM nitrato de litio, 1 mM DTT, 5 mM tri-(N-acetillactosamina).   Capítulo 3 LA PROTEÍNA  C  Capítulo 3. La proteína  C  3.4 - La estructura de los dominios C-terminales de  C La estructura del fragmento C-terminal de C puede ser dividido en cuatro partes claramente diferenciadas (Figura 3.3): un barril  globular que compone el dominio de cabeza (residuos 196-326), y una región fibrosa que puede ser subdividida en otros tres subdominios. El primer subdominio (residuos 160-195) contiene dos repeticiones en triple--espiral (Mitraki et al., 2002), el segundo subdominio está compuesto por una región bisagra (residuos 155-159) que conecta el primer subdominio con un tercero que está plegado formando un triple coiled coil (residuos 117-154). Figura 3.2. Estructuras cristalinas del cristal IIz de C(151-326) (A) y el cristal C de C(117-326) (B). Capítulo 3. La proteína  C  Figura 3.3. Estructura de la proteína C(117-326) en donde se muestran los cuatro dominios diferenciados. El átomo de zinc en la región bisagra se muestra en naranja, los átomos de cloro en el centro del triple coiled coil están indicados como esferas verdes. 3.4.1 - El dominio de cabeza El dominio globular de cabeza de cada cadena forma un barril ß con la misma topología que el dominio globular de 1 (Chappell et al., 2002). El barril ß esta compuesto por ocho cadenas ß que conforman una lámina ß continua en la que la cadena G interacciona con la cadena D (Figura 3.4). A su vez esta lámina ß puede ser subdividida en dos motivos Greek key compuestos por las láminas ß DABC y HEFG (Chappell et al., 2002). Al igual que en la estructura de 1, las cadenas ß C y H contienen discontinuidades, aunque estas no son debidas a residuos de prolina como ocurre en 1. La mayoría de los bucles entre cadenas ß son cortos, a excepción del bucle DE que contiene 22 aminoácidos y esta compuesto por una pequeña cadena (D') que interacciona con la cadena A y dos hélices . En 1 la región de unión al receptor esta localizada principalmente en el bucle DE (Chappell et al., 2002). Un alineamiento llevado a cabo con todas las secuencias conocidas de la proteína C de reovirus aviares revela que la región más N-terminal (aminoácidos 150) muestra un grado elevado de conservación (19 residuos idénticos de 50), la región de triple coiled coil tiene un grado de conservación menor (3 residuos idénticos de 155; aunque las posiciones hidrofóbicas se conservan y probablemente su capacidad para formar un triple coiled coil. La región C-terminal (aminoácidos 156-326)  Capítulo 3. La proteína  C  también muestra un grado elevado de conservación (60 residuos idénticos de 171). Este patrón de conservación es consistente con un modelo en el que la región más Nterminal estaría implicada en la unión a C, mientras que la región plegada en triple coiled coil jugaría un papel estructural alejando a la región globular del virus y facilitando de esta manera la interacción con el receptor. Es interesante recalcar que la región que comprende los residuos 140-160 esta relativamente conservada, incluso cuando tenemos en cuenta las fibras de los reovirus Nelson Bay (Shmulevitz et al., 2002), muscovy duck (Kuntz-Simon et al., 2002) y el reovirus de reptil (Duncan et al., 2004), por lo tanto esta región podría jugar un importante papel estructural como se discutirá posteriormente. Figura 3.4. Estructura de C(151-326). (A) Vista estereoscópica de los carbonos  conectados por líneas. Los tres monómeros se han coloreado en rojo, azul y verde. Los residuos se han numerado cada diez. (B) Diagrama en donde se etiquetan los elementos de estructura secundaria. 3.4.2 - El dominio fibroso El primer subdominio de la región fibrosa (residuos 156-195) contiene dos repeticiones en triple--espiral. La primera (residuos 160-176) es del tipo prolina (van Raaij et al., 1999; Chappell et al., 2002) y contiene un giro  de tipo II, con la Pro165 en conformación cis. La segunda (residuos 177-191) es bastante irregular, en ella los Capítulo 3. La proteína  C  residuos 179-182 forman un giro  de tipo VIb (Hutchinson et al., 1994). Las posiciones de los residuos hidrofóbicos no están estrictamente conservadas en esta repetición, la cadena  situada inmediatamente después del giro  solo tiene un residuo hidrofóbico (Cys182) contribuyendo al núcleo hidrofóbico. Algo similar ocurre con la cadena  que esta inmediatamente después del bucle compuesto por los residuos 184-187, en este caso el residuo hidrofóbico es la Leu189. La pérdida de residuos hidrofóbicos en estas cadenas  es compensada por la Phe181 situada en el giro  cuya cadena lateral se proyecta hacia el centro de la fibra, contribuyendo de esta manera al núcleo hidrofóbico. Conectando este primer subdominio y la región plegada en un triple coiled coil encontramos una región (residuos 155-159) en la que los residuos presentan unos factores térmicos elevados, lo que sugiere que presentan una elevada movilidad y que esta región podría actuar de bisagra. En ella las tres His158 están coordinando un catión divalente de zinc a través de sus átomos NE2 (Figura 3.5). La coordinación tetragonal del zinc se completa con la interacción con una molécula de agua. Por último, hacia el extremo N-terminal encontramos una región plegada formando un triple coiled coil (residuos 117-154). Esta región está formada por 5.5 repeticiones heptapeptídicas, con un "pitch length" de 166 Å. El radio del coiled coil es de 6.2 Å y el número promedio de residuos por vuelta es de 3.6 (Strelkov & Burkhard, 2002), valores comparables con los ya descritos para coiled coils triméricos (Fraser & MacRae, 1973; Tao et al., 1997). Un análisis de los residuos en las posiciones a y d del coiled coil (Leu152, Val149, Leu145, Ile142, Asn138, Ile135, Leu131, Ile128, Asn124, Val121 y Leu117) muestra que los cinco residuos que ocupan la posición a son ß ramificados (dos valinas y tres isoleucinas) mientras que los seis residuos que ocupan la posición d no lo son (cuatro leucinas y dos asparaginas). Se ha propuesto que las estructuras plegadas en coiled coil con residuos ß ramificados en la posición a y leucinas en la posición d son más estables como dímeros que como trímeros (Harbury et al., 1993), aunque otros coiled coils paralelos triples, como el de la fibritina (Tao et al., 1997) o la proteína de unión a manosa humana (Sheriff et al., 1994), contienen residuos ß ramificados en posición a y leucinas en posición d. En la región no cristalizada del triple coiled coil (residuos 53106), de los siete residuos en posición a cuatro son valinas y tres son leucinas, mientras que de los ocho residuos en posición d hay cuatro leucinas, dos isoleucinas,  Capítulo 3. La proteína  C  una valina y una metionina, es decir hay tanto residuos ß ramificados como leucinas tanto en posición a como en posición d, una configuración más favorable con la formación de trímeros. Figura 3.5. Elementos estructurales del dominio fibroso de C. (A) Motivo de trimerización que consiste en la Arg148, el Glu153 y una molécula de agua. Sólo se muestra uno de los tres puentes salinos. (B) El dominio bisagra contiene un átomo de zinc (gris) coordinado por tres histidinas (His158) con una distancia de coordinación de 2.0-2.1 Å (C y D) Vista sagital y lateral de los átomos de cloro (verde) que se encuentran en el interior del triple coiled coil coordinados por asparraginas (Asn138 y Asn124). La estructura de esta región también revela la existencia de un motivo de trimerización (Meier et al., 2002; Kammerer et al., 2005) compuesto por una red de puentes salinos intercatenarios formados por contactos entre la Arg148 en la posición g de una cadena y el Glu153 en la posición e de la cadena adyacente (Figura 3.5 A). El potencial de este dominio de trimerización sobre el efecto de los residuos hidrofóbicos de las posiciones a y d ha sido demostrado en coiled coils triples pequeños (Burkhard et al., 2000; Kammerer et al., 2005). Es interesante recalcar que el análisis de la secuencia revela otro posible motivo de trimerización en el que participarían la Arg36 y el Glu41, lo que sugeriría que el triple coiled coil se extendería mas allá del residuo 53. La estructura revela que a mayores de las interacciones hidrofóbicas existentes en el núcleo hidrofóbico del coiled coil y de las interacciones polares en su superficie, las asparaginas situadas en la posición d Capítulo 3. La proteína  C  (Asn124 y Asn138) están coordinando un ión cloro central (Figura 3.5 C y D). Los iones cloro fueron identificados como tales basándose en evidencias cristalográficas, tales como sus factores térmicos (similares a los de los residuos que lo rodean), las distancias de coordinación y la similitud con otros coiled coils triples virales. Se ha propuesto que interacciones de esta clase puede favorecer que el coiled coil se pliegue con el registro adecuado (Oakley & Kim, 1998), así como que las asparaginas en la posición d favorecen el estado trimérico (Tripet et al., 2000). Un ión cloro central coordinado por residuos de asparaginas parece ser una característica común en coiled coils paralelos triples de proteínas virales de fusión, fibras y adhesinas bacterianas (Fass et al., 1996; Tao et al., 1997; Malashkevich et al., 1999; Renard et al., 2005; Conners et al., 2008) y ha sido usado en el diseño de novo de coiled coils triméricos (Lumb & Kim, 1995). 3.5 - Comparación estructural y funcional con la proteína  1 y otras fibras virales Un alineamiento de las secuencias de la proteína C y 1 (Chappell et al., 2002), revela una identidad de secuencia baja. La identidad de secuencia es mayor para los primeros 21 residuos del extremo N-terminal, que probablemente estén implicados en la interacción con la proteína C de la cápside interna del reovirus. La proteína C comparte un 27% de identidad de secuencia con su homóloga en reovirus de mamífero, 2, y probablemente adopten una conformación similar. De este modo C y C interaccionarían del mismo modo en el que lo hacen 2 y 1. Tanto la región fibrosa que esta plegada con repeticiones en triple  espiral como el dominio globular de cabeza tienen una baja similitud de secuencia pero sus estructuras cristalinas han resultado ser idénticas tanto en sus dimensiones como en su topología. Cabe destacar que en la región fibrosa de C sólo existen dos repeticiones en triple  espiral, mientras que en la de 1 existen ocho de estas repeticiones, lo que hace de 1 una fibra más larga. Las regiones plegadas formando un triple coiled coil tienen una longitud similar. Cuando superponemos los residuos estructuralmente equivalentes de los dominios globulares de los monómeros de C y 1 obtenemos unas desviaciones cuadráticas medias de 2.5 Å para los 127 carbonos  alineados (los dominios globulares de C y 1 contienen 133 y 142 residuos, respectivamente). Por lo que ambos dominios globulares comparten no sólo la misma topología sino que los bucles  Capítulo 3. La proteína  C  que conectan las cadenas  son muy similares, la mayoría de ellos cortos y un bucle DE largo. Cuando lo que superponemos son los trímeros, tras el alineamiento de 3 x 127 carbonos  obtenemos una desviación cuadrática media de 5.3 Å. Es evidente que el trímero no se superpone tan bien como lo hacen los monómeros independientemente, y esto es debido a la diferente orientación de los monómeros en el trímero. Aunque esta diferente orientación podría ser debida a los diferentes contactos cristalinos, merece la pena recordar que no hemos detectado ninguna diferencia en la orientación de los monómeros dentro del trímero entre nuestras cinco formas cristalinas de C. La superposición muestra que los monómeros de C se disponen de una manera más abierta que los monómeros de 1. En ambos casos, el interior del trímero contiene una cavidad con moléculas de agua, pero en el caso de C esta cavidad tiene una forma cónica, siendo más ancha en la parte superior que en la inferior, mientras que en el caso de 1 esta cavidad tiene una forma más o menos cilíndrica. Esta diferente orientación produce que los contactos entre monómeros de la proteína C se produzcan principalmente en la región fibrosa y en la parte inferior del dominio globular, en contraposición a 1 cuyos contactos se producen a lo largo de todo el dominio de cabeza. Sin embargo, cuando calculamos el área de la superficie de cada monómero que esta participando en los contactos entre monómeros vemos que ésta es mayor en C de lo que lo es en 1 (700 versus 450 Å2). La gran complementariedad de superficie que existe entre los monómeros y el alto grado de conservación que se observa en la interacciones monómero-monómero en las diferentes formas cristalinas resueltas, nos hace suponer que esta disposición abierta que adquiere el trímero de C no es debida a los contactos cristalinos, sino que existe en solución, y que por lo tanto podría ser importante para la interacción de C con su receptor celular. En el dominio globular de cabeza de 1, existe una agrupación de contactos Asp-Asp que podrían ser potencialmente inestables. Estos contactos no existen en C y en cambio existen dos anillos de puentes salinos en el centro del dominio globular de cabeza. La pequeña superficie de interacción entre los monómeros en el dominio de cabeza así como la agrupación de aspartatos que se forma entre los monómeros de 1 ha llevado a pensar que la naturaleza trimérica de esta proteína podría ser temporal, aunque sólo esta sea capaz de unirse a su receptor (Schelling et al., 2007). Capítulo 3. La proteína  C  En este sentido la agrupación de aspartatos funcionaría como un interruptor mediado por pH que regularía el estado de oligomerización del dominio globular de 1 (Schelling et al., 2007). En el caso de C, la superficie que mantiene el trímero parece ser más estable ya que tiene una superficie de interacción monómero-monómero. Por otro lado, no podemos predecir el resultado que tendría un cambio de pH sobre los puentes salinos que mantienen estable el trímero, y por lo tanto el efecto que este cambio tendría sobre la estabilidad de la forma trimérica. En este sentido vale la pena recordar que la proteína ha sido cristalizada a pH 8.5, un valor no demasiado alejado del pH fisiológico. Además de presentar similitud con la proteína 1, la proteína C también muestra similitud con las fibras de adenovirus (van Raaij et al., 1999) y con el spike del bacteriofago PRD1 (Merckel et al., 2005). Ambas proteínas son triméricas y tienen repeticiones en triple  espiral en su dominio fibroso: 21 en el caso del adenovirus de tipo 2 y 2 en el caso de la fibra de PRD1. En ambos casos sus dominios globulares de cabeza están plegados formando barriles , que sin embargo tienen una topología diferente. Se ha propuesto (Stehle & Dermody, 2003) que tanto los reovirus aviares como de mamífero comparten un virus ancestro común con un genoma de dsRNA, el cual estaría a su vez evolutivamente relacionado con virus de dsDNA como los adenovirus y el bacteriofago PRD1 (Chappell et al., 2002; Merckel et al., 2005), aunque la baja similitud que existen entre estas secuencias lleva a pensar que se puede trator de un proceso de convergencia evolutiva. Una característica que todas estas fibras comparten es la existencia de regiones bisagra, que probablemente jueguen un papel importante en el proceso de infección. Los adenovirus tienen regiones bisagra en la parte más N-terminal del dominio fibroso así como entre el dominio fibroso y el dominio globular (van Raaij et al., 1999), la proteína P5 de PRD1 también tiene un región bisagra entre el dominio fibroso y el globular (Merckel et al., 2005) y la proteína 1 del reovirus de mamífero tiene una región bisagra en la parte C-terminal del dominio fibroso (Chappell et al., 2002). La proteína C, como se ha discutido previamente, tiene una región bisagra justo en el extremo C-terminal de la región plegada en triple coiled coil y quizás otra alrededor de la His110 (ver Discusión).  Capítulo 3. La proteína  C  Figura 3.6 Comparación de las estructuras de las fibras del reovirus de mamífero (1-en negro) y aviar (C-en gris). (A) Superposición de los monómeros y (B) Superposición de los trímeros. Las superposiciones fueron realizadas utilizando el programa LSQKAB (Collaborative Computational Project Number 4, 1994) utilizando únicamente los dominios globulares de cabeza de ambos dominios. (C) Estructura del trímero de 1 (1KKE) y (D) Estructura del trímero de C (2BSF) La única otra fibra viral de estructura conocida con un plegamiento  estructurado es la fibra corta del bacteriofago T4 (van Raaij et al., 2001), aunque en este plegamiento no aparecen repeticiones en triple  espiral como en el caso de la fibra C y el dominio de cabeza está compuesto por tres monómeros entrelazados (Thomassen et al., 2003), mas que por tres monómeros plegados independientemente como en el caso de las fibras antes descritas. Una característica común para todas estas fibras virales es que el extremo C-terminal de la fibra esta plegada hacia el interior de la estructura, de tal modo que no es accesible al solvente, lo que podría tener importancia al otorgarle a estas fibras resistencia a exo-proteasas que eliminen residuos comenzando por el extremo C-terminal. 3.6 - Estabilidad y plegamiento de  C Si miramos los monómeros por separado, cada uno de ellos tiene una superficie de 13 x 103 A2, de la cual un 15 % es parte de la superficie de interacción entre monómeros. Esta gran cantidad de superficie de interacción explica, al menos en Capítulo 3. La proteína  C  parte, la gran estabilidad del trímero de C, algo que queda patente por el hecho de que la proteína no se disocia en sus monómeros en un gel desnaturalizante de poliacrilamida con SDS a no ser que sea previamente hervida en un buffer que contenga SDS (Grande et al., 2000; Grande et al., 2002; van Raaij et al., 2005). La estructura confirma que no existen puentes disulfuro en la proteína, como previamente se había descrito (Grande et al., 2002). El tipo de interacciones que estabilizan el trímero son de naturaleza mixta, el núcleo central de las repeticiones en triple  espiral sólo contiene interacciones hidrofóbicas, y la región de triple coiled coil esta estabilizada tanto por interacciones hidrofóbicas como por puentes salinos intercatenarios. En el dominio globular encontramos tanto interacciones hidrofóbicas como polares incluyendo dos probables puentes salinos (His223-Asp325 y Asp277Arg321). Las evidencias bioquímicas (Grande et al., 2002) sugieren que la contribución de las interacciones hidrofóbicas es mayor que la de las polares ya que se ha visto que los detergentes son capaces de desestabilizar el trímero de C mientras que las sales lo estabilizan. En 1 y las fibras de adenovirus las interacciones que estabilizan el trímero son muy similares, generalmente interacciones hidrofóbicas en la región fibrosa e interacciones de tipo mixto en la globular. El plegamiento de C podría suceder de dos maneras. Podría empezar con la interacción entre los barriles  del extremo C-terminal, lo que conllevaría a la formación de un trímero en el dominio de cabeza, tras lo cual la región fibrosa se plegaría empezando por la región con repeticiones en triple  espiral. De este modo el dominio de cabeza y/o el dominio fibroso asegurarían que los tres monómeros estén en pauta. Esta ruta de plegamiento sería similar a la propuesta para la fibras virales de adenovirus (Mitraki et al., 1999). En la fibra 1 el dominio globular de cabeza es incapaz de trimerizar por sí mismo sin la ayuda de al menos una repetición en triple  espiral (Schelling et al., 2007), aunque como hemos visto previamente, el dominio de cabeza de C es más estable que el de 1. Una ruta alternativa sería aquella en la cual el dominio plegado en triple coiled coil sería el primero en plegarse, de tal forma que los residuos en posición d en el núcleo del triple coiled coil asegurarían que este plegamiento se produjese con el registro adecuado, y a partir de ahí se plegaría el resto de la proteína.  Capítulo 4. La proteína  A   Tabla 4.I - Estadísticas cristalográficas  A Parámetros Valores Fuente de radiación ID23-1 (ESRF) Temperatura 100 K Longitud de onda (Å) 0.954 Detector MAR Mosaic Distancia detector-cristal (mm) 251 Mosaicidad (°) 0.6 Grupo espacial P1 Parámetros de celdilla a, b, c (Å) 103.2, 129.9, 144.0 Parámetros de celdilla  ,  ,  (º) 93.8, 105.1, 98.2 Reflexiones observadasa 282973 (32868) Rango de resolución (Å) 30-2.34 (2.47-2.34) Multiplicidad 2.0 (1.9) Completitud (%) 94.3 (74.8) <I/  (I)> 7.7 (2.2) Rsymm (%)b 10.5 (30.0) Estadísticas de refinamientoc Rango de resolución 30.0-2.34 (2.47-2.34) Moléculas de proteína / ASU 12 Numero de reflexiones usadas 281587 (32494) Numero de reflexiones de Rfree 1385 (119) R-factord 21.0 (26.0) R-freee 27.1 (34.0) Modelo final Número de átomos proteína 38161 sulfato 60 agua 3003 Factores térmicos promedio (Å2) proteína 37.2 iones (Cl-/Zn+2/SO4 -1) 60.4 glicerol/agua 37.2 Geometría (desviaciones cuadráticas medias) Longitud de enlace (Å) 0.014 Angulos de enlace (º) 1.4 Estadísticas de Ramachandranf 99.5 / 99.9 Código en el PDB 2VAK aNo se descartó ninguna reflexión. bRsymm = hi|Ihi-<Ih>|/hi|Ihi| cResultados de REFMAC (Murshudov et al., 1997). dR-factor = ||Fobs(hkl)| - |Fcalc(hkl)|| / |Fobs(hkl)|. eDe acuerdo con Brunger (1997). fDe acuerdo con el programa RAMPAGE (Lovell et al., 2003). Los porcentajes indican residuos en las regiones favorables, permitidas y desfavorable, respectivamente. Capítulo 4. La proteína  A  Figura 4.2 Funciones de autorotación calculadas con el programa MOLREP (Vagin & Teplyakov, 2000) a partir de un set de datos completos de los cristales de la proteína A. (a) Sección  = 180º (b) Sección  = 50º. Se puede apreciar la presencia de múltiples ejes de simetría no cristalográfica binarios y un único eje de simetría no cristalográfica de orden mayor. 4.3 - La estructura y topología de  A Cada monómero de A tiene una forma piramidal (Figura 4.3A) con una base aproximadamente rectangular de unos 65-70 Å de longitud y 45-50 Å de ancho, en donde se localiza el posible sitio de unión a la proteína mayoritaria de la cápside interna, A. Su altura es de aproximadamente 45 Å y en su vértice estaría localizado el sitio de unión a la proteína μB en la partícula reoviral madura. Las doce copias, aún siendo cristalográficamente independientes, son prácticamente idénticas, con unas desviaciones cuadráticas medias entre sus carbonos  en el rango 0.2-0.7 Å (Figura 4.3B). Cada monómero contiene doce hélices , una lámina  mixta formada por tres cadenas , y tres láminas  antiparalelas formada por dos cadenas  cada una de ellas (Figura 4.4). En las doce moléculas presentes en la unidad asimétrica, la región situada entre los residuos 38 y 50 no presenta una densidad electrónica interpretable que se haya podido modelizar. En la proteína 2 la región equivalente estaría entre los aminoácidos 39 y 52 y estaría plegada formando una hélice  en una de las copias de 2 (residuos 39-46) y como una región desestructurada en las otras dos copias  Capítulo 4. La proteína  A   (Reinisch et al., 2000). Esta hélice  forma parte del sitio de unión a 1 en la cápside interna del reovirus de mamífero, lo que nos hace pensar que esta región de la proteína A se estructuraría tras la interacción con A formando una hélice . El hecho de que este bucle sea flexible y pueda adoptar varias conformaciones sugiere que puede ser usado por la proteína para adaptarse a los distintos entornos de unión de la cápside interna. Tanto el extremo amino como el carboxilo están orientados hacia el vértice de la pirámide y son accesibles al solvente (aunque en el virión estarían tapados por μB). Sin embargo, la cadena- A, que es el primer elemento de estructura secundaria de la estructura, está escondida en el interior de la estructura. Tanto la Phe8 como Phe9 de esta cadena  están interaccionando tanto con aminoácidos hidrofóbicos como aromáticos. Se pueden distinguir tres dominios en la estructura: un dominio más Nterminal que estaría formado por las hélices- 1, 3, 4, la posible hélice- 2 y las láminas- BC y AD. Este primer dominio estaría empaquetado al lado de un segundo dominio central con la misma topología y que estaría formado por las hélices- 5, 6, 7 y 8, y las láminas- GF y HE. Por último, ambos dominios estarían empaquetados con un tercer dominio C-terminal topológicamente distinto y que estaría formado por las hélices- 9, 10 y 11 y la cadena- I (que forma parte de la lámina- HEI). El ápice de la pirámide estaría formado por el bucle entre la hélice- 8 y la cadena- I. Las regiones de A que están en contacto con A y μB se pueden predecir a partir de la estructura cristalina del core del reovirus de mamífero [PDB 1EJ6 ((Reinisch et al., 2000)], el modelo de la partícula viral del reovirus de mamífero construido a partir de datos de criomicroscopía electrónica [PDB 2CSE (Zhang et al., 2005b)] y los estudios de criomicroscopía electrónica del reovirus aviar (Zhang et al., 2005a). El lugar de interacción con μB comprende principalmente residuos del tercer dominio mientras que los sitios de interacción con A estarían casi exclusivamente en los dominios 1 y 2. Los dominios 1 y 2 presentan los mismos elementos de estructura secundaria en la superficie de interacción con A, lo que podría implicar que ha existido una duplicación de dominios a partir de la cual cada uno habría evolucionado de manera independiente para interaccionar con distintas regiones de A. Capítulo 4. La proteína  A  Figura 4.3 Estructura de la proteína A del reovirus aviar. (a) Vista estereoscópica de la parte superior de la proteína. Para realizar la figura se usó el monómero con el factor térmico promedio menor, el monómero G. Los extremos N y C-terminales están marcados en la figura. (b) Vista estereoscópica en donde se muestra la superposición de las 12 moléculas presentes en la celdilla unidad. Se indican la metionina amino terminal, la alanina C-terminal, y un residuo de cada 50, así como los residuos que están justo antes y después de la región desordenada (Gln37 y Ile61).  Capítulo 4. La proteína  A   Figura 4.4 Diagrama topológico de la estructura de A. Las hélices- se muestran como rectángulos etiquetados con números, las cadenas- se muestran como flechas etiquetadas con letras. Los dos dominios estructuralmente homólogos son mostrados en naranja y azul, mientras que el dominio carboxi-terminal se muestra en verde. La hélice- 2 (en blanco) no aparece en la estructura pero su estructura se ha inferido tanto por la estructura de la proteína homóloga 2 de reovirus de mamífero como de la homología con el dominio central. Se ha etiquetado cada elemento de estructura secundaria con el residuo inicial y el final. 4.4 - Comparación estructural y funcional con otras proteínas Usando el servidor DALI y el servicio SSM del EBI se realizó una búsqueda de estructuras con similitud estructural tanto con A entera como por cada uno de sus dominios por separado. Dicha búsqueda reveló que la única proteína de estructura conocida con una homología estructural destacable fue la proteína 2 de reovirus de mamífero con que comparte un 29% de identidad de secuencia. La topología general de ambas proteínas es idéntica y sólo se detectan pequeñas diferencias en determinadas regiones que podrían ser atribuidas a su flexibilidad inherente, puesto que la mayoría de estas regiones también varían entre las doce copias de A en la celdilla unidad. La única diferencia notable entre A y 2 se encuentra el la región Cterminal de la hélice 10 (aminoácidos 374-388 en la estructura de A) que está claramente distorsionada en A. Capítulo 4. La proteína  A  Figura 4.5 Vista estereoscópica en donde se muestra la superposición de las cadenas principales de las proteínas A sobre 2. La cadena G de la proteína A ha sido superpuesta sobre las cadenas D y E de la proteína 2 [PDB 1EJ6 (Reinisch et al., 2000)]. La desviación cuadrática media de sus carbonos  es de 1.6 Å (Krissinel et al., 2004). 4.5 - Estudio de la interacción de la proteína  A con dsRNA Con respecto a su capacidad de interaccionar con dsRNA, A es funcionalmente, aunque no estructuralmente, análoga a la proteína 3 del reovirus de mamífero. Ambas proteínas unen dsRNA y han sido implicadas en la inhibición de la PKR (Gonzalez-Lopez et al., 2003; Imani et al., 1988). De la misma manera que A, la capacidad de 3 de unir dsRNA está relacionada con su capacidad para inhibir la activación de la PKR compitiendo por su sustrato, el dsRNA. Ha sido propuesto que la proteína 3 se una al dsRNA en forma dimérica y que múltiples dímeros se alinearían a lo largo de la molécula de dsRNA (Olland et al., 2001). En un mapa de potencial electrostático de la proteína A, se pueden apreciar varias regiones cargadas positivamente en la superficie de la proteína. Una de estas regiones contiene, entre otros residuos, la Arg155 y la Arg273 (Figura 4.6a). Cuando se mutan independientemente cualquiera de estos dos residuos por alanina y se analiza la capacidad de la proteína mutada de unir dsRNA mediante un ensayo de gel shift, se ve que ambos mutantes carecen de la capacidad de unir dsRNA (Figura 4.6b), mientras que si las mutaciones se realizan en otros regiones cargadas electropositivamente (Arg134, Arg135, Arg389 y Arg390) la capacidad de unión a  Capítulo 4. La proteína  A   dsRNA no se ve alterada. (Estos experimentos de mutagénesis dirigida así como los ensayos de unión fueron realizados por Lorena Vázquez-Iglesias). Las proteínas mutadas son solubles y no hay indicaciones de que ninguna de las mutaciones afecten a la estabilidad de la proteína o que tengan algún impacto en su estructura. Otra indicación a favor de que esta región puede jugar un importante papel en la unión a dsRNA es la presencia de un ión sulfato cerca de la Gln305, en la misma región que las Arg155 y Arg273. Este sulfato está presente en las doce copias de la proteína en la celdilla unidad y puede estar mimetizando la interacción con un fosfato de la cadena de dsRNA. En los ensayos de gel shift usando la proteína A nativa, se observan complejos con un alto peso molecular que apenas son capaces de entrar en el gel separador (Figura 4.6b, panel central). Esto puede sugerir que o bien los complejos A-dsRNA son de un gran tamaño o que los complejos resultantes pueden estar sin carga al pH utilizado en el ensayo (8.0). Esto último encajaría con un modelo en el cual, varias moléculas de A (punto isoeléctrico teórico 8.6) cubrirían la mayoría de la superficie de dsRNA, enmascarando las cargas negativas de los fosfatos y produciendo un complejo A-dsRNA sin carga. Los experimentos de unión a dsRNA indican que la proteína A es capaz de unir un dsRNA de al menos 21 bp (Figura 4.6b, panel de la izquierda). También se aprecia que, conforme aumenta la longitud de las moléculas de dsRNA se necesita una concentración menor de A para unirlas, lo que indica la existencia de una interacción cooperativa. 4.6 - Estudio de las interacciones entre las moléculas de  A en el cristal Se ha estudiado el estado oligomérico de la proteína A en solución mediante microscopía electrónica (Figura 4.8) y ultracentrifugación analítica (Tabla 4.II). Todos los resultados apuntan a que A es monomérica en solución. Sin embargo, a 4 ºC y en ausencia de sal, la proteína tiende a precipitar reversiblemente, lo que indicaría que tiene tendencia a formar agregados de orden superior. En la estructura las doce moléculas independientes se empaquetan en lo que a primera vista parece ser una doble hélice (Figura 4.7a). Cuando las interacciones son analizadas usando el servidor PISA (Krissinel et al., 2007) se observan tres tipos de interacciones con potencial relevancia biológica, que denominamos “cola-cola”, “cabeza-cola” y “cabeza-cabeza” según qué superficies están participando en la Capítulo 4. La proteína  A  interacción. La cola esta compuesta por residuos del bucle N-terminal, las cadenas- A y D, el bucle que conecta a esta última con la hélice- 4, el bucle entre las cadenas-  G y H y el bucle entre la hélice- 8 y la cadena- I. La cabeza esta compuesta por los aminoácidos del bucle entre la posible hélice- 2 y la hélice- 3, por la hélice- 10 y el bucle entre las hélices- 10 y 11. La interacción “cola-cola” tiene una superficie de interacción de 690 Å2, una ganancia de energía de solvatación de 12.4 kcal mol-1, tres puentes de hidrógeno y un P-value de 0.033. La interacción “cabezacola” tiene una superficie de interacción de 467 Å2, una ganancia de energía de solvatación de 7.4 kcal mol-1, dos puentes de hidrógeno y un P-value de 0.054, mientras que la interacción “cabeza-cabeza” tiene una superficie de interacción de 373 Å2, una ganancia de energía de solvatación de 4.7 kcal mol-1, dos puentes de hidrógeno y un P-value de 0.26. Ninguna de las interacciones observadas entre moléculas de A en el cristal son similares a las observadas entre moléculas 2 en la estructura del core del reovirus de mamífero. La interacción “cabeza-cola” es la única interacción que relaciona a las doce moléculas de A de la celdilla unidad. Esta interacción divide las doce moléculas en cuatro trímeros, de tal forma que en cada uno de estos trímeros se producirían dos interacciones “cabeza-cola”. Cada trímero esta relacionado con su opuesto en la doble hélice por una rotación de aproximadamente 180º. Si superponemos ambos trímeros vemos un ajuste muy bueno (desviaciones cuadráticas medias de sus carbonos  de 0.4 Å) lo que sugiere que los trímeros se comportan como un cuerpo rígido. Los monómeros de cada trímero están relacionados entre sí por una rotación de aproximadamente 50º alrededor de un eje que pasaría por el centro de la doble hélice, lo que explicaría el pico que se registra en la sección  = 50º de función de auto rotación. Es interesante resaltar que la forma A del dsRNA tiene una rotación helicoidal de alrededor de 50º. Cada uno de los hexámeros así formado se relaciona con el otro hexámero de la unidad asimétrica por una rotación de aproximadamente 180º. En este caso el ajuste entre ambos hexámeros no es demasiado bueno (desviación cuadrática media de 1.6 Å).  Capítulo 4. La proteína  A   Figura 4.6 Unión de la proteína A a dsRNA. (a) Mapa de potencial electrostático de la proteína A. En la figura de la izquierda la orientación es la misma que en la figura 4.3a; la orientación de la figura de la derecha ha sido rotada 180º alrededor de un eje vertical centrado en el ápice de la pirámide. Los residuos cargados positivamente de la superficie han sido etiquetados. También se muestra la localización de la Gln305, la Arg38 se muestra entre paréntesis ya que solo esta parcialmente expuesta. (b) Experimentos de gel shift. Los ensayos fueron realizados usando la proteína A a una concentración de 0.6 mg/ml en buffer TE (10 mM TrisHCl pH 8.5, 1 mM EDTA) y un marcador de peso molecular de dsRNA que consiste en siete tipos distintos de dsRNA de diferentes longitudes (500, 300, 150, 80, 50, 30 y 21 pares de bases) a 0.5 mg/ml. Se incubaron cantidades crecientes de A (0, 0.6, 1.2, 3.0 y 6 μg) con 0.5 μg de marcador de dsRNA en buffer TE suplementado con 150 mM de NaCl durante 10 minutos en hielo. Posteriormente las muestras fueron analizadas en un gel no desnaturalizante. (Izquierda) Se usó un gel al 10% de poliacrilamida en buffer TBE. (Centro y derecha) Fueron usado geles discontinuos como describió Laemmli (Laemmli, 1970) con un gel separador de acrilamida al 10% y la omisión de SDS de la muestra, el gel y el buffer. En los paneles de la izquierda y el centro se utilizó A nativa, mientras que el panel de la derecha muestra un ensayo de gel shift realizado con el mutante R155A. Se obtuvieron resultados idénticos con el mutante R273A. La flecha en el panel central indica los complejos de alto peso molecular que se observan. (Experimentos realizados por Lorena Vazquez-Iglesias) (c) La interacción de la proteína A con fragmentos más pequeños de dsRNA se estudió mediante experimentos de gel shift. En los tres primeros carriles se utilizó un dsRNA de 18 pares de bases, en los tres siguientes uno de 14 pares de bases y en los carriles 7 a 9 un dsRNA de 10 pares de bases. En el último carril se cargo la proteína A sola. Los ratios A/dsRNA usados se muestran sobre cada carril. Capítulo 4. La proteína  A  Tomando todo en su conjunto, se podría proponer un modelo en el que el trímero actuaría como una unidad biológica, o al menos la interacción “cabeza-cola” sería la interacción biológica con la que las moléculas de A se dispondrían alrededor del dsRNA, bien formando una hélice simple o bien una hélice doble. Estos modelos podrían explicar la interacción cooperativa entre la proteína A y el dsRNA así como los grandes complejos observados en los experimentos de gel shift. Las regiones cargadas electropositivamente que se han discutido anteriormente en donde se localizan las argininas responsables de la interacción con el dsRNA están situadas en el interior de la hélice. El ancho de la cavidad en el interior de la doble hélice que forman las moléculas de A en el interior del cristal varía entre 11 y 35 Å, siendo siempre mayor de 20 Å en una de las dimensiones. La sección de la forma A del dsRNA tiene unas dimensiones de 10 x 20 Å. Por lo tanto, las dimensiones de la forma A del dsRNA podrían hacer posible que éste encajase dentro de la doble hélice, aunque serían necesarios algunos ajustes menores en el dsRNA o en la doble hélice que forman las moléculas de A. La distancia entre las argininas 155 y 273 de la misma molécula es de 8.5 Å, mientras que la distancia entre argininas equivalentes de moléculas contiguas es de 39-40 Å. En un modelo (Figura 4.7b) construido a partir del los trímeros observados en la estructura cristalina y la forma A canónica del RNA bicatenario, la cadena lateral de una de las argininas podría interaccionar con un grupo fosfato a un lado del surco menor mientras la cadena lateral de la otra arginina interaccionaría con un grupo fosfato del otro lado del surco (la distancia entre grupos fosfatos a ambos lados del surco menor es de 10 Å). La siguiente molécula podría hacer la misma interacción con grupos fosfato a ambos lados del surco menor 13 pares de bases mas allá (la distancia entre fosfatos separados 13 pares de bases es de 38 Å). Para confirmar este modelo serían necesarios estudios estructurales del complejo A-dsRNA. También se podría intentar mutar residuos en la superficie de interacción entre los monómeros, aunque una inspección de esta superficie no muestra ninguna mutación obvia que pueda afectar seriamente a la superficie sin comprometer la integridad estructural de la proteína.  Capítulo 5. La fibra larga del adenovirus aviar 1 101 Capítulo 5 Estructura del dominio C-terminal de cabeza de la fibra larga del adenovirus aviar de tipo 1 El adenovirus aviar CELO (Chicken Embryo Letal Orphan), también conocido como adenovirus aviar de tipo 1 o de tipo A, es un adenovirus relativamente benigno que ha despertado interés para su uso en terapia génica (Kelleher & Vos, 1994; Stevenson et al., 2006). Una de sus características más destacadas es que cada uno de los vértices de su cápside contiene dos proteínas fibrosas triméricas insertadas en la proteína pentamérica de la base del pentón, una fibra corta (fibra 2) y una larga (fibra 1) (Hess et al., 1995). Se ha mostrado que mientras la fibra corta juega un papel clave en el proceso de infección en las células de pollo (Tan et al., 2001), la fibra larga no es esencial, lo que la convierte en un diana atractiva para su modificación. Un análisis de la secuencia de la fibra larga revela que entre sus 793 residuos existen dos regiones ricas en glicinas (Hess et al., 1995) que probablemente funcionen como regiones bisagra, una cerca del extremo N-terminal (residuos 51-62) y la otra situada entre el dominio fibroso y el dominio globular (residuos 577-579). El dominio de cabeza está compuesto por los residuos 579-793 y es comparable en tamaño a los dominios de cabeza de algunos adenovirus humanos cuyas estructuras han sido resueltas, aunque su homología de secuencia es limitada (14-17%). 5.1 - Purificación y cristalización 5.1.1 - Construcción de los vectores de expresión Se clonó un fragmento de ADN que codificaba los residuos 579-793 (el dominio de cabeza) de la fibra larga del adenovirus aviar en un vector de expresión como ha sido descrito en Materiales y Métodos. Además del dominio de cabeza se clonaron los fragmentos 62-793 y 398-793, que resultaron insolubles cuando se intentaron purificar. También se clonaron los fragmentos 398-793, 430-793, 460-793, 490-793, 520-793 y 537-793, todos ellos sin la región bisagra de 3 glicinas (residuos 577-579). Todos resultaron insolubles cuando se intentaron purificar. El fragmento 398-793 sin las tres glicinas también se clonó en pMALcX2: expresaba una proteína soluble pero cuando se cortaba la proteína de fusión MBP la proteína adenoviral  Capítulo 5. La fibra larga del adenovirus aviar 1 102 precipitaba. Finalmente se clonaron los fragmentos 61-576, 195-576 y 398-576 fusionados a un dominio de trimerización (foldon) en su extremo C-terminal. Las construcciones (61-576)foldon y (195-576)foldon fueron insolubles, mientras que la construcción (398-576)foldon era soluble y trimérica. Aunque se purificó, no fue posible cristalizarla. 5.1.2 - Expresión, purificación y cristalización del dominio de cabeza Para expresar el dominio de cabeza (aminoácidos 579-793) de la fibra larga del adenovirus aviar, se transformaron bacterias con el plásmido pCELOlongfib579793, estas se crecieron y usaron para expresar la proteína como ha sido descrito en Materiales y Métodos. Tras la lisis de las bacterias, la proteína se purificó de la fracción soluble por cromatografía de afinidad por níquel e intercambio catiónico. La proteína se concentró a 23 mg ml-1 utilizando concentradores Centricon (Millipore, Madrid, España). La cristalización se llevó utilizando la técnica de difusión de vapor en gota sentada. La proteína cristalizó usando PEG 10000 como precipitante a pH 4.76.1 a 5 ºC. Figura 5.1. Cristales de el dominio de cabeza. La barra mide aproximadamente 0.25 mm 5.2 - Determinación estructural de dominio de cabeza de la fibra larga del adenovirus CELO Los cristales se incubaron en presencia de distintas concentraciones de cloruro de metilmercurio. Debido a la falta de isomorfismo entre los cristales derivados con mercurio y los cristales nativos no fue posible resolver la estructura utilizando los datos nativos. Para resolver este problema los cristales derivados con bajas Capítulo 5. La fibra larga del adenovirus aviar 1 103 concentraciones de cloruro de metilmercurio fueron tratados como pseudo-nativos, mientras que los cristales derivados en presencia de una alta concentración de cloruro de metilmercurio fueron usados como derivados. De esta forma se localizaron ocho átomos pesados utilizando el programa SHELXD (Schneider & Sheldrick, 2002) de los cuales seis estaban relacionados por un eje de simetría ternario. Este operador de simetría fue utilizado para mejorar las fases, tras lo cual se obtuvo un mapa de fácil interpretación. Usando este mapa, se modelaron automáticamente 613 residuos y el modelo resultante se utilizó para resolver la estructura a alta resolución mediante reemplazamiento molecular. El modelo final contiene los residuos 583-793 de cada uno de los tres monómeros del trímero y no se observa ninguna incoherencia entre la densidad electrónica y la secuencia de aminoácidos. En el mapa no se observa densidad electrónica para los tres residuos del extremo N-terminal (579-582) y la cola de purificación. Presumiblemente esta región es flexible, lo que permite a estos aminoácidos adoptar conformaciones diferentes en el cristal. Las estructuras refinadas se ajustan bien a los datos, con una buena geometría y pocos residuos en las regiones desfavorables del diagrama de Ramachandran (Tabla 5.I). Sólo dos residuos se encuentran en regiones generosamente permitidas, la Asn694 del monómero B y el Asp705 del monómero C. El primero tiene una densidad electrónica clara que inequívocamente apoya la conformación del modelo y el segundo es parte de un bucle relativamente desordenado con una densidad electrónica mal definida (para un resumen de las estadísticas de los datos, véase la Tabla 5.I) 5.3 - La estructura del dominio de cabeza Cada monómero del dominio de cabeza está plegado formando un sándwich ß con una topología similar a la de otros dominios de cabeza de adenovirus humanos previamente descritos (Figura 5.2). Cada monómero está compuesto por ocho cadenas ß, que a su vez se subdividen en dos láminas ß (ABCJ y GHID) utilizando la nomenclatura descrita en Xia et al. (1994). La mayoría de los bucles entre las distintas cadenas ß son cortos, con la excepción del bucle DG (residuos 659-715) en el que está presente una pequeña cadena ß E (residuos 672-677), que interacciona con la cadena ß A. Tanto la cadena ß A como la G son discontinuas. La cadena ß J contiene una discontinuidad causada por dos prolinas sucesivas (Pro782 y Pro783). Cuando se superponen, los tres monómeros exhiben una desviación cuadrática media entre sus  Capítulo 5. La fibra larga del adenovirus aviar 1 104 Figura 5.2. Estructura del dominio de cabeza de la fibra larga del adenovirus aviar de tipo 1. (a) Vista estereoscópica del monómero visto de lado. Los carbonos  están conectados por líneas y han sido etiquetados cada 10 residuos. (b) Estructura del monómero, las cadenas  están representadas en amarillo y los bucles en verde. Las cadenas  han sido nombradas de acuerdo con Xia et al. (1994). (c) Vista desde arriba del trímero. Los monómeros han sido representados en rojo, verde y amarillo. carbonos  de tan sólo 0.2-0.3 Å. Las principales diferencias entre los monómeros se localizan en los residuos 641-642 y 771. Estos residuos, que son parte de los bucles CD e IJ, están situados en la parte superior del trímero y están involucrados en los contactos cristalinos entre los monómeros A y C, pero no en el caso del monómero B, lo que explica las diferencias de conformación. Los contactos que se producen entre los monómeros están principalmente localizados en las regiones N-terminales de las Capítulo 5. La fibra larga del adenovirus aviar 1 105 cadenas ß A y C, así como las regiones C-terminales de las cadenas ß B y J y los bucles entre las cadenas A y A’ (particularmente los residuos Asn593 y Leu594), así como una pequeña región del bucle DG (Pro689-Thr695). Tabla 5.I - Estadísticas cristalográficas aNo se descartó ninguna reflexión. bRsymm = hi|Ihi-<Ih>|/hi|Ihi| cResultados de REFMAC (Murshudov et al., 1997). dR-factor = ||Fobs(hkl)| - |Fcalc(hkl)|| / |Fobs(hkl)|. eDe acuerdo con Brunger (1997). fDe acuerdo con el programa RAMPAGE (Lovell et al., 2003). Los porcentajes indican residuos en las regiones favorables, permitidas y desfavorable, respectivamente. Cristal nativo Cristales derivados Baja concentración Alta concentración Fuente de radiación BM16 (ESRF) Cu-K (BrukerN onius FR591) Cu-K (BrukerN onius FR591) Temperatura 100 K 100 K 100 K Longitud de onda (Å) 0.9799 1.5418 1.5418 Detector 165 mm MAR-CCD KappaCCD-2000 KappaCCD-2000 Grupo espacial C 1 2 1 C 1 2 1 C 1 2 1 Parámetros de celdilla a, b, c (Å) 216.8, 58.7, 57.6 216.5, 59.2, 57.5 216.8, 59.1, 57.6 Parámetros de celdilla  ,  ,  (º) 90.0, 101.5, 90.0 90.0, 101.3, 90.0 90.0, 101.3, 90.0 Reflexiones observadasa 88294 (6836) 35555 (4586) 36315 (3624) Rango de resolución (Å) 25.0-1.6 (1.66-1.60) 43.0-2.2 (2.3-2.2) 43.0-2.2 (2.28-2.19) Multiplicidad 3.1 (2.5) 12.2 (5.2) 4.5 (2.3) Completitud (%) 93.8 (73.0) 99.6 (96.8) 97.9 (85.7) <I/(I)> 20.9 (2.3) 27.0 (8.2) 10.4 (2.8) Rsymm (%)b 4.9 (37.8) 7.3 (20.0) 18.1 (42.3) Estadísticas de phasing Rango de resolución (Å) 43.0-2.3 (2.39-2.30) Numero de reflexiones usadas 31459 (2900) Número de átomos pesados 8 Phasing power (reflexiones céntricas/acéntricas) 1.08 / 0.90 R-cullis (reflexiones céntricas/acéntricas) 0.82 / 0.71 Estadísticas de refinamientoc Rango de resolución 16.0-1.6 (1.69-1.60) Moléculas de proteína / ASU 3 Numero de reflexiones usadas 85836 (9941) Numero de reflexiones de Rfree 2034 (230) R-factord 18.0 (31.0) R-freee 21.3 (31.0) Modelo final Número de átomos proteína 4797 agua 857 Factores térmicos promedio (Å2) proteina 23.44 aguas 39.74 Geometría (desviaciones cuadráticas medias) Longitud de enlace (Å) 0.015 Angulos de enlace (º) 1.618 Estadísticas de Ramachandranf 99.6 / 100.0 Código en el PDB 2IUM  Capítulo 5. La fibra larga del adenovirus aviar 1 106 5.4 - Estabilidad y plegamiento del dominio de cabeza La superficie de cada monómero tiene un área de unos 9.6 x103 A2, de la cual un 23% forma parte de la superficie de interacción entre monómeros (2.2x103 A2). Cuando se comparan las energías de solvatación teórica del trímero con las del monómero, se prevé que en la formación de trímero se produzca una ganancia de energía de solvatación de unos 150-200 kJ mol-1 (Henrick & Thornton, 1998). La gran superficie de interacción entre monómeros (Jones y Thornton, 1996) así como esta gran ganancia de energía de solvatación que se produce en la formación del trímero, explican al menos en parte la extraordinaria estabilidad del dominio de cabeza de esta fibra, como queda de manifiesto por el hecho de que ésta no se disocie en sus monómeros en un gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes con SDS, a menos que previamente se haya hervido en un tampón en presencia de SDS (Guardado-Calvo et al., 2006). La superficie de interacción es de carácter mixto, puesto que en ella intervienen tanto contactos polares como hidrofóbicos. En las superficies de trimerización de los dominios de cabeza de adenovirus humanos (van Raaij et al., 1999a), 1 (Chappell et al., 2002), C (Capítulo 3; Guardado-Calvo et al., 2005) y la proteína p5 de PRD1 (Merckel et al., 2005), también se observa una superficie de interacción de naturaleza mixta. Por otra parte, el área de estas superficies en los dominios de cabeza de la fibras previamente citadas es aproximadamente la misma (en los adenovirus humanos esta área es de unos 2 x 103 A2 o el 20% de la superficie disponible). 5.5 - Comparación con otras proteínas de estructura conocida La superposición de los residuos estructuralmente equivalentes de los monómeros del dominio de cabeza de la fibra larga del adenovirus aviar con los monómeros de los dominios de cabeza de distintos adenovirus humanos nos ha permitido observar (Figura 5.3A) que no sólo todos los dominios de cabeza de todos estos adenovirus tienen la misma topología, sino que los bucles que conectan las cadenas ß son muy similares, siendo todos cortos a excepción del bucle DG. La discontinuidad en la cadena ß A también está conservada en el adenovirus humano de tipo 2. Cuando se superpusieron los trímeros del dominio de cabeza de la fibra larga del adenovirus aviar y el del adenovirus humano de tipo 2 (3 x 153 carbonos  Capítulo 5. La fibra larga del adenovirus aviar 1 107 estructuralmente equivalentes, Figura 5.3B), se pudo observar que la orientación relativa de los monómeros en ambos trímeros resultó ser muy similar. En comparación con el dominio de cabeza del adenovirus humano de tipo 2, el dominio de cabeza de la fibra aviar contiene 16 residuos extra, que se encuentran localizados en el bucle AB, la cadena ß G, y los bucles GH e IJ (Figura 5.3C). Además, los bucles CD y HI situados en la parte superior del trímero se orientan de manera diferente, y el bucle DG tiene una conformación distinta. Estas variaciones dan lugar a lo que probablemente sean diferencias funcionalmente significativas en la superficie externa del trímero, mientras que su estructura interna mantiene un alto grado de similitud. Otra diferencia significativa se encuentra en la conformación del bucle DG, que en la cabeza del adenovirus humano de tipo 2 tiene más residuos en la superficie de interacción monómero-monómero (a la izquierda en la Figura 5.3A y marcado con una ' I ' en la Figura 5.3B), mientras que en el dominio de cabeza de la fibra del adenovirus aviar este bucle interacciona más con la lámina ß GHIDA' (a la derecha en la Figura 5.3A e indicado con una 'S' en la Figura 5.3B). Por último, un análisis de las superficies electrostáticas (Figura 5.4) de los dominios de cabeza de los adenovirus humanos 5 y 12 nos muestra que estas guardan más parecido entre sí que con el dominio de cabeza de la fibra larga del adenovirus aviar de tipo 1, una diferencia que también puede tener connotaciones funcionales. Una búsqueda de estructuras similares al dominio de cabeza de la fibra larga del adenovirus aviar muestra que esta guarda similitud estructural con fibras de reovirus (Chappell et al., 2002; Guardado-Calvo et al., 2005) y fibras del fago Lactobacillus (Spinelli et al., 2006a,b). Del mismo modo que los dominios de cabeza de adenovirus, los dominios de cabeza de estas fibras están compuestos principalmente de láminas ß, aunque a diferencia de los adenovirus estas forman barriles ß circulares en vez de sándwiches ß. Los dominios de cabeza de las fibras de reovirus tienen la misma topología que el dominio de cabeza del adenovirus aviar.  Capítulo 5. La fibra larga del adenovirus aviar 1 108 Figura 5.3. Comparación de los dominios de cabeza de las fibras del adenovirus aviar de tipo 1 y el adenovirus humano de tipo 2. (A) Monómeros superpuestos. Se muestran las cadenas principales de los dominios de cabeza de las fibras del adenovirus aviar de tipo 1 (negro) y el adenovirus humano de tipo 2 (gris). Se indican los extremos N y C-terminales del dominio de cabeza de la fibra larga del adenovirus aviar de tipo 1. (B) Comparación de la estructura de los trímeros de ambos adenovirus, los colores se corresponden con los indicados en (A). Se indica la superficie de interacción entre dos monómeros (I) así como la posición de la lámina externa (S). (C) Alineamiento basado en la estructura de los dominios de cabeza de la fibra larga del adenovirus aviar de tipo 1 (fAd1) y el adenovirus humano de tipo 2 (hAd2). Se indican los residuos idénticos con una cuadro negro y las cadenas ß del dominio de cabeza de la fibra larga del adenovirus aviar de tipo 1. En la línea inferior, se destacan los residuos implicados en la unión a CAR, los absolutamente conservados en mayúsculas y los mayoritariamente conservados en minúsculas (de acuerdo con Law & Davidson, 2005) Capítulo 5. La fibra larga del adenovirus aviar 1 109 5.6 - La capacidad de unión al receptor El adenovirus aviar de tipo 1 es capaz de infectar diferencialmente células CHO (Chinese Hamster Ovary) deficientes en CAR y células CHO expresando CAR humano, lo que sugiere que este adenovirus tiene la capacidad de unirse a CAR humano y, por extensión también al aviar. Estudios basados en delecciones de la fibra larga del adenovirus aviar han relacionado a esta fibra larga con la unión a CAR, mientras que el receptor para la fibra corta todavía no ha sido identificado (Tan et al., 2001). En el transcurso de nuestro estudio, tratamos de medir la interacción del dominio de cabeza de la fibra larga del adenovirus aviar con el dominio 1 de CAR; dominio que se ha demostrado necesario y suficiente para la unión de gran afinidad de los dominios de cabeza de algunos adenovirus humanos (Freimuth et al., 1999; Lortat-Jacob et al., 2001). Para determinar si existía interacción entre el dominio de cabeza de la fibra larga del adenovirus aviar con el dominio 1 de CAR se realizaron experimentos de exclusión molecular y de SPR (surface plasmon resonance). Los experimentos de exclusión molecular muestran que tanto el dominio de cabeza de la fibra larga del adenovirus aviar como el dominio 1 de CAR migran de manera independiente en una columna de exclusión molecular, lo que indica que no interaccionan en solución. Para confirmar este resultado se realizó un experimento de SPR, para ello se colaboró con Hugues Lortat-Jacob (IBS, Grenoble). El dominio D1 de CAR se inmovilizó en un chip y el dominio de cabeza de la fibra larga del adenovirus 1 se usó como analito. No fue posible detectar ninguna interacción, lo que estaba en concordancia con la falta de interacción del experimento de exclusión molecular. Esta falta de interacción sugiere que, o bien que necesite del dominio 2 para establecer una interacción eficiente a CAR, o bien que el dominio fibroso de la fibra larga contenga elementos necesarios para la interacción con CAR. La otra alternativa es que CAR no sea el receptor del adenovirus aviar. Cabe señalar que estos experimentos se llevaron a cabo con el dominio 1 de CAR humano, no de pollo (NCBI RefSeq nº XW-416681, Pruitt et al., 2005), debido al interés en el uso del adenovirus aviar como una terapia génica en humanos o como vector antitumoral. Sin embargo, cabe resaltar que el dominio homólogo en pollos es un 61% idéntico al dominio 1 de CAR humano, y que los residuos de CAR humano que se sabe interaccionan con el dominio de cabeza de adenovirus humanos (Bewley et al., 1999, Law & Davidson, 2005 están totalmente  Capítulo 6. La fibra del adenovirus porcino 4  371-703, 393-703 (Figura 6.1) en un vector de expresión como se describe en Materiales y Métodos. Todos ellos resultaron solubles aunque los fragmentos 40-703 y 116-703 no se expresaban en cantidades suficientes como para poder realizar con ellos experimentos de cristalización. Finalmente sólo se lograron cristalizar los dominios 40-291, 116-291 y 393-703 y se resolvieron las estructuras del dominio de cabeza (116-291) y galectina (393-703). Aunque se logró resolver la estructura del dominio 40-291 no se apreciaba densidad electrónica para el dominio fibroso, probablemente porque es flexible. Figura 6.1 Diagrama mostrando los distintos dominios de la fibra del adenovirus porcino de tipo 4 en donde se muestran los dominios que han sido clonados y purificados. En rojo aparecen señalados aquellos dominios que se han logrado cristalizar. 6.1.2 - Expresión y purificación del dominio de cabeza (116-291) y el dominio fibroso y cabeza (40-291) Para expresar el dominio de cabeza (residuos 116-291) y los dominios de fibroso y cabeza (40-291) los plásmidos pET28c-Fib116-291 y pET28c-Fib40-291 se usaron para transformar bacterias, y se expresaron como se describe en Materiales y Métodos. Tras la recogida de bacterias por centrifugación y lisis, ambas proteínas fueron purificadas de la fracción soluble por cromatografía de afinidad por níquel. Capítulo 6. La fibra del adenovirus porcino 4  Ambas eluían a altas concentraciones de imidazol (200-800 mM), lo que es consistente con una proteína trimérica con tres colas de histidinas. La purificación se completó mediante cromatografía de intercambio catiónico en ambos casos. 6.1.3 - Expresión y purificación del dominio de galectina (393-703) Para expresar el dominio de galectina (residuos 393-703) el plásmido pET28cFib393-703 se usó para transformar bacterias y se expresó como se describe en Materiales y Métodos. Tras la recogida de bacterias por centrifugación y lisis, la proteína fue purificada de la fracción soluble por cromatografía de afinidad por níquel, intercambio catiónico y exclusión molecular. 6.1.4 - Cristalización del dominio de cabeza La proteína pAd4Fib(116-291) concentrada se cristalizó utilizando sulfato de litio y polietilenglicol 8000 como precipitante. Aunque se intentaron congelar estos cristales usando diversas soluciones crioprotectoras, finalmente resultó imposible. Sin embargo, fue posible recoger un set de datos completos a temperatura ambiente utilizando un ánodo rotante, hasta un resolución de 3.2 Å. Las estadísticas de los datos recogidos de este cristal aparecen resumidas en la Tabla 6.I 6.1.5 - Cristalización del dominio de fibroso y cabeza La proteína pAd4Fib(40-291) concentrada se cristalizó utilizando 15% PEG 4000 (w/v), 0.1M citrato sódico, 0.1M sulfato amónico. Los cristales se transfirieron a una solución con la misma composición que la solución de cristalización más un 20% (v/v) de glicerol. Los cristales difractaron hasta 3.1 Å de resolución en la línea X11 del DESY. La estructura se resolvió mediante reemplazamiento molecular utilizando la estructura del dominio de cabeza como modelo. Desafortunadamente, el dominio fibroso no era visible en el mapa de densidad electrónica. 6.1.6 - Cristalización del dominio de galectina y de los complejos galectina-azúcar La proteína pAd4Fib(393-703) concentrada se cristalizó utilizando 25% (w/v) PEG 3350, 500 mM nitrato de sodio, 2 mM ácido siálico. Los cristales fueron trasferidos a una solución crioprotectora y se midieron en la línea X11 (DESY, Hamburgo) en donde difractaron hasta 1.9 Å de resolución. Los cristales del complejo con lactosa fueron obtenidos usando 28% (w/v) PEG 3350, 100 mM nitrato de sodio y  Capítulo 6. La fibra del adenovirus porcino 4  5 mM DTT como solución de cristalización, añadiendo 70 mM de lactosa en la solución de proteína. Los cristales fueron crioprotegidos en 35% (w/v) PEG 3350, 100 mM nitrato de sodio, 1 mM DTT, 70 mM lactosa. Los cristales del complejo con N-acetillactosamina se obtuvieron usando 35% (w/v) PEG 3350, 500 mM nitrato de sodio y 5 mM DTT como solución de cristalización, añadiendo 40 mM de Nacetillactosamina en la solución de proteína. Los cristales fueron congelados directamente. Los cristales del complejo con lacto-N-neotetraosa se obtuvieron usando 27% (w/v) PEG 3350, 200 mM nitrato de litio y 5 mM DTT como solución de cristalización, añadiendo 5 mM de lacto-N-neotetraosa en la solución de proteína. Los cristales fueron congelados directamente. Los cristales del complejo con tri-(Nacetillactosamina) se obtuvieron usando 28% (w/v) PEG 3350, 300 mM nitrato de litio y 5 mM DTT como solución de cristalización, añadiendo 5 mM de tri-(Nacetillactosamina) en la solución de proteína. Los cristales fueron crioprotegidos en 35% (w/v) PEG 3350, 300 mM nitrato de litio, 1 mM DTT, 5 mM tri-(Nacetillactosamina). Las estadísticas de los datos recogidos de estos cristales aparecen resumidas en la Tabla 6.I. Figura 6.2 Cristales de el dominio de cabeza (A), el dominio fibroso y cabeza (B) y del dominio de galectina (C). 6.2 - Determinación estructural de los dominios de cabeza y de galectina 6.2.1 - Determinación estructural del dominio de cabeza La estructura del dominio de cabeza se resolvió mediante reemplazamiento molecular usando como modelo la estructura de la cabeza del adenovirus humano de tipo 5 (1KNB). La solución mostró la existencia de dos trímeros en la unidad asimétrica. Durante el refinamiento se utilizó la simetría no cristalográfica presente. A pesar de que la resolución de los datos era moderada (3.2 Å), el alto contenido de Capítulo 6. La fibra del adenovirus porcino 4  solvente así como la existencia de simetría no cristalográfica, contribuyeron a que los mapas de densidad electrónica generados fuesen de buena calidad. En la parte final del refinamiento se añadieron seis grupos de TLS (translation/libration/screw), uno por cada cadena presente en la unidad asimétrica. El modelo final consistía en los residuos 116-291 de cada una de las seis cadenas, más cuatro aguas adicionales. No se observó densidad electrónica adicional para la cola de purificación N-terminal. Las estructuras refinadas se correspondían bien con los datos, tenían una geometría aceptable y sólo un residuo en una región desfavorable del diagrama de Ramachandran. Las estadísticas de refinamiento de esta estructura aparecen resumidas en la Tabla 6.I 6.2.2 - Determinación estructural del dominio de galectina Para resolver las estructuras del dominio de galectina en complejo con los azúcares se utilizó la cadena A de la estructura previamente resuelta como modelo de reemplazamiento molecular. El modelo en complejo con lactosa consiste en una única cadena polipeptídica en donde se han podido modelar los residuos 386-684, 184 moléculas de agua, 2 iones nitrato y 2 moléculas de lactosa. Dos residuos han sido modelados con conformaciones alternativas. La molécula de lactosa unida al dominio CRD N-terminal tiene una densidad clara, mientras que la lactosa unida al dominio Cterminal tiene densidad para el anillo de galactosa y algunas nubes de densidad electrónica que se corresponden con el anillo de glucosa, esta molécula ha sido refinada finalmente con una ocupancia 0.5. El modelo en complejo con Nacetillactosamina consiste en los residuos 386-685, 163 moléculas de agua, 4 iones nitrato y 1 molécula de N-acetillactosamina unida al dominio N-terminal. Un residuo ha sido modelado con conformación alternativa. La Pro540 es el único residuo situado en una región desfavorable del diagrama de Ramachandran. El modelo en complejo con lacto-N-neotetraosa consiste en los residuos 386-684, 145 moléculas de agua, 3 iones nitrato y 1 molécula de lacto-N-neotetraosa. Finalmente, el modelo en complejo con tri-(N-acetillactosamina) consiste en dos cadenas con los residuos 386-685, 129 moléculas de agua, 6 iones nitrato y 1 molécula de tri-(N-acetillactosamina). Las estadísticas de refinamiento de estas estructuras aparecen resumidas en la Tabla 6.I  Capítulo 6. La fibra del adenovirus porcino 4  Tabla 6.I. Estadísticas de los datos, el refinamiento de la estructura y su validación. Dominio de cabeza Dominio de galectina Libre Lactosa N-acetillactosamina Lacto-Nneotetraosa tri(N-acetillactosamine) Fuente de radiación Cu-K (BrukerN onius FR591) ID14-2 (ESRF) BM30A (ESRF) EMBL X11 (DESY) BM30A (ESRF) EMBL X11 (DESY) Temperatura 298 K 100 K 100 K 100 K 100 K 100 K Longitud de onda (Å) 1.5418 0.9390 0.9797 0.8150 0.9797 0.8150 Detector KappaCCD-2000 ADSC Q4 CCD ADSC Q315r CCD MAR555 flatpanel ADSC Q315r CCD MAR555 flatpanel Distancia detector-cristal (mm) 90.0 301.1 291.9 300 292.3 300.0 Rango de oscilación (°) 0.6 0.8 1.0 1.0 1.0 1.0 Número de imágenes 166 272 176 136 180 180 Grupo espacial P212121 C2 C2 C2 C2 C2 Parámetros de celdilla a, b, c (Å) 125.7, 145.4, 147.6 167.6, 77.3, 94.1 114.6, 38.8, 70.2 108.5, 43.7, 63.9 95.4, 38.8, 84.4 176.1, 38.3, 86.5 Parámetros de celdilla  ,  ,  (º) 90.0, 90.0, 90.0 90.0, 101.5, 90.0 90.0, 93.5, 90.0 90.0, 105.8, 90.0 90.0, 102.2, 90.0 90.0, 92.1, 90.0 Mosaicidad (°) 0.36 0.68 0.80 0.90 0.68 0.87 Observaciones únicasa 45035 (4367) 89027 (12129) 21094 (3019) 22025 (3229) 23751 (3155) 20441 (2926) Rango de resolución (Å) 40.0-3.2 (3.32-3.2) 40.0-1.9 (2.0-1.9) 40.0-2.0 (2.1-2.0) 35.0-1.9 (2.0-1.9) 40.0-1.9 (2.0-1.9) 40.0-2.5 (2.6-2.5) Multiplicidad 3.8 (3.8) 4.1 (3.8) 3.5 (3.5) 2.7 (2.7) 3.4 (2.7) 3.6 (3.6) Completitud (%) 98.9 (97.5) 96.1 (90.1) 99.6 (99.3) 98.0 (98.5) 98.5 (91.7) 99.9 (99.8) <I/  (I)> 17.5 (2.9) 10.0 (3.7) 10.4 (3.3) 5.9 (2.7) 12.6 (3.2) 8.8 (3.1) Rsymm (%)b 7.2 (30.7) 7.5 (35.2) 6.9 (32.2) 9.8 (31.3) 5.8 (30.3) 9.5 (43.2) Estadísticas de refinamientoc Rango de resoluciónn 29.2-3.2 (3.37-3.20) 35-1.9 (2.00-1.90) 40-2.0 (2.11-2.00) 35-1.91 (2.01-1.91) 40-1.9 (2.00-1.90) 40-2.5 (2.63-2.50) Moléculas de proteína / ASU 6 4 1 1 1 2 Numero de reflexiones usadasa 40566 (5769) 86627 (11703) 20006 (2873) 20895 (3071) 22538 (2995) 19313 (2789) Numero de reflexiones de Rfree 2026 (218) 2124 (293) 1087 (140) 1126 (148) 1213 (153) 1123 (129) R-factord 0.173 (0.264) 0.206 (0.298) 0.183 (0.244) 0.182 (0.270) 0.187 (0.275) 0.199 (0.324) R-freee 0.201 (0.299) 0.259 (0.327) 0.228 (0.296) 0.238 (0.337) 0.223 (0.310) 0.268 (0.355) Modelo final Número de átomos proteína 7980 9556 2368 2360 2347 4708 ligandos/iones 0 84 54 42 60 176 agua 4 625 184 163 145 129 Factores térmicos promedio (Å2) proteina 65.4 38.5 33.5 33.1 40.4 31.9 nitrato /glicerol 42.1 28.3 31.2 28.5 27.8 Azúcares 32.0 22.0 34.1 33.5 aguas 58.1 44.3 38.3 37.5 41.8 28.7 Geometría. Desviaciones cuadráticas medias. Longitud de enlace (Å)c 0.009 0.010 0.009 0.012 0.011 0.009 Angulos de enlace (º)c 1.3 1.3 1.3 1.3 1.4 1.3 Estadísticas de Ramachandranf 93.9 / 6.0 / 0.1 97.0 / 2.4 / 0.6 96.6 / 3.4 / 0.0 97.7 / 2.0 / 0.3 98.0 / 2.0 / 0.0 97.5 / 2.5 / 0.0 Código en el PDB 2WST 2WSU 2WSV 2WT0 2WT1 2WT2 Se usó un cristal para resolver cada estructura; se valores entre paréntesis se refieren a la capa de mayor resolución. aNo se descartó ninguna reflexión. bRsymm = hi|Ihi-<Ih>|/hi|Ihi| cResultados de REFMAC (Murshudov et al., 1997). dR-factor = ||Fobs(hkl)| - |Fcalc(hkl)|| / |Fobs(hkl)|. eDe acuerdo con Brunger (1997). fDe acuerdo con el programa RAMPAGE (Lovell et al., 2003). Los porcentajes indican residuos en las regiones favorables, permitidas y desfavorable, respectivamente. Capítulo 6. La fibra del adenovirus porcino 4  6.3 - La estructura del dominio de cabeza y su capacidad de unirse a receptores celulares El dominio de cabeza de cada monómero es una estructura globular plegada formando un sándwich  antiparalelo con una topología similar a la descrita para los dominios de cabeza de fibras adenovirales humanas (Figura 6.3). El sándwich  esta compuesto por ocho cadenas , las cuales pueden ser divididas en dos láminas  (ABCJ y GHID usando la nomenclatura propuesta para el adenovirus humano de tipo 5; Xia et al., 1994). El bucle DG (residuos 180-231) incluye las cadenas  E (residuos 197-200) y F (residuos 203-205), que interaccionan con la cadena  A extendiendo de este modo la lámina ABCJ. Además de estas dos cadenas , el bucle DG contiene dos pequeñas hélices alfa. Una búsqueda de estructuras similares (Krissinel & Henrick, 2004) muestra que los homólogos más cercanos estructuralmente son el adenovirus humano de tipo 5 (Xia et al., 1994), de tipo 2 (van Raaij et al., 1999a), de tipo 12 (Bewley et al., 1999) y los tipos 37 y 19p (Burmeister et al., 2004). Las diferencias más notables se dan en los bucles CD e IJ, situados en la parte superior del trímero, que son notablemente más cortos en el dominio de cabeza del adenovirus porcino de tipo 4, y en el bucle HI, situado a un lado del trímero, que es más corto en el adenovirus porcino de lo que lo es en los adenovirus humanos de tipo 2 y 5. Muchos adenovirus humanos utilizan CAR (coxsackievirus and adenovirus receptor) como receptor primario (Bergelson et al., 1997; Roelvink et al., 1998; Law & Davidson, 2005). Los análisis estructurales llevados a cabo con los complejos adenovirus humano de tipo 12 – CAR (Bewley et al., 1999) y adenovirus humano de tipo 37 – CAR (Seiradake et al., 2006) han mostrado que la superficie de interacción entre estas dos moléculas estas compuesta principalmente por los residuos Asp415, Pro417, Pro418 y Leu426 del bucle AB, Val450 y Lys451 del bucle CD, Gln487, Gln494, Ser497 y Val498 del la lámina  EF y Pro517, Pro519, Asn520 y Glu523 del bucle FG (la numeración corresponde al adenovirus humano de tipo 12; Bewley et al., 1999). Estos residuos están mayoritariamente conservados en la fibras de aquellos serotipos que usan CAR como receptor primario. También se ha sugerido que las fibras que usan CAR comparten una conformación específica del bucle AB (Seiradake et al., 2005). La figura 6.4A muestra la estructura de los bucles implicados en la interacción entre el dominio de cabeza del adenovirus humano de tipo 12 (azul)  Capítulo 6. La fibra del adenovirus porcino 4  y CAR (rojo). Se han superpuesto las regiones estructuralmente equivalentes del dominio de cabeza de la fibra del adenovirus porcino de tipo 4 (amarillo). El bucle AB del adenovirus porcino tiene una conformación similar al de los adenovirus humanos que interaccionan con CAR. Sin embargo, sólo uno de los residuos implicados en esta interacción, la Pro517, está conservado en la fibra del adenovirus porcino. Además, no hemos sido capaces de detectar ninguna interacción entre el dominio de cabeza del adenovirus porcino y el dominio D1 de CAR ni por cromatografía exclusión molecular ni en experimentos de SPR. Figura 6.3 Estructura del dominio de cabeza del adenovirus porcino de tipo 4 (cepa NADC-1). (A) Monómero del dominio de cabeza en el que las cadenas  han sido coloreadas en amarillo, las hélices en rojo y los bucles en verde. Las cadenas  han sido nombradas de acuerdo con Xia et al. (1994). (B) El trímero del dominio de cabeza visto desde su parte superior. Los monómeros han sido coloreados en rojo, verde y amarillo. Otro receptor primario para adenovirus humanos es CD46, mayoritariamente usado por los adenovirus de las especies B y algunos de la D (incluyendo el tipo 37) (Segerman et al., 2003; Gaggar et al., 2003; Sirena et al., 2004; Wu et al., 2004; Marttila et al., 2005). La estructura del complejo formado por el dominio de cabeza del adenovirus humano de tipo 11 y dos repeticiones extracelulares de CD46 (Persson et al., 2007) muestra que el dominio de cabeza utiliza tres regiones separadas para interaccionar con este receptor, los bucles DGHIe IJ. Una superposición de los Capítulo 6. La fibra del adenovirus porcino 4  dominios de cabeza del adenovirus porcino de tipo 4 y el adenovirus humano de tipo 11 muestra que la conformación de los bucles DG y HI son diferentes y que el bucle IJ es mas corto en el adenovirus porcino de tipo 4 (Figura 6.4B). Además, los residuos implicados en este interacción en el adenovirus humano 11, la Asn283, Asp284, Arg280 y Gln305 no están conservados en el dominio de cabeza del adenovirus porcino 4. Experimentos llevados a cabo con un vector de adenovirus compuesto por un adenovirus humano de tipo 5 modificado con la fibra del adenovirus porcino de tipo 4, ha demostrado que es capaz de entrar en células tumorales de glioma a través de receptores independientes de CAR y CD46 (Paul et al., 2008). Finalmente, se ha demostrado que algunos glicoconjugados de la superficie celular que contienen ácido siálico unido por enlaces (2,3) o (2,6) funcionan como receptores celulares para los adenovirus humanos de tipo 37 y 19p (Burmeister et al., 2004). El dominio de cabeza de estos dos serotipos reconocen el ácido siálico en una región electropositiva situada en la parte superior del trímero (Figura 6.4C, panel de la izquierda). En el panel de la derecha mostramos un mapa de potenciales electroestáticos de la superficie del dominio de cabeza del adenovirus porcino 4 en el que podemos que ver que esta región electropositiva no existe lo que sugiere que este dominio de cabeza no puede interaccionar con ácido siálico de la misma forma que los adenovirus humanos de tipo 37 y 19p. Tomadas juntas, todas las observaciones previamente citadas sugieren que este dominio de cabeza es incapaz de interaccionar con ninguno de los receptores celulares adenovirales anteriormente mencionados. 6.4 - La estructura del dominio de galectina La estructura del dominio de galectina (Figura 6.5) muestra dos dominios CRD unidos por un péptido rico en prolinas e interaccionando entre ellos a través de una nueva superficie de interacción. Ambos CRDs están orientados de tal manera que sus sitios de unión a azúcares están enfrentados, de esta forma, al menos en potencia, ambos dominios podrían interaccionar simultáneamente con un mismo carbohidrato. Ambos CRDs están plegados  Capítulo 6. La fibra del adenovirus porcino 4  Figura 6.4. El dominio de cabeza del adenovirus porcino de tipo 4 probablemente no es capaz de interaccionar con CAR, CD46 ni ácido siálico. (A) Comparación estructural entre los dominios de cabeza de las fibras de adenovirus porcino 4 (amarillo) y el del adenovirus humano 12 (azul) en complejo con el dominio D1 de CAR (rojo). Se han señalado los bucles AB-, CD-, y FGasi como la pequeña lámina EF. (B) Comparación estructural entre los dominios de cabeza de la fibras de adenovirus porcino 4 (amarillo) y el del adenovirus humano 11 (azul) en complejo con las dos primeras repecticiones consenso de CD46. Se han señalado los bucles DG-, HI-, e IJasí como los residuos involucrados en la interacción con CD46 en la fibra del adenovirus humano de tipo 11. (C) Mapa de potenciales electroestáticos de superficie del dominio de cabeza de la fibra del adenovirus humano 37 (izquierda) en complejo con sialil-lactosa y el dominio de cabeza del adenovirus porcino 4 (derecha). formando un sándwich ß con una topología de tipo jelly-roll que es típica de lectinas vegetales y otras galectinas (Kasai et al., 1996). Cada dominio contiene dos láminas , denominadas F y S, compuestas por cinco y seis cadenas  respectivamente. El sitio de unión a carbohidratos esta localizados en la lámina  de tipo S. Se han designado las cadenas  F1-5 y S1-6 y se ha añadido el prefijo n o c para distinguir los elementos de los dominios No C-terminal respectivamente. Además de estás cadenas  existe una hélice 310 (hélice 2) situada en el bucle cF5-cS2 (Figura 6.5). Capítulo 6. La fibra del adenovirus porcino 4  El péptido que une ambos dominios cruza a lo largo de la lámina  nF. Está compuesto por 23 residuos, es rico en prolinas y tiene una pequeña hélice 310 (hélice 1). En la forma cristalina libre de ligando ha sido posible trazar una pequeña cola Cterminal en las cadenas B y C, que forma una pequeña cadena  que interacciona con la cadena  nS6 de una molécula vecina. En todas las formas cristalinas ha sido posible modelar un pequeño vestigio de la cola de purificación N-terminal que no será tenido en cuenta de aquí en adelante. Un alineamiento estructural entre ambos dominios CRD muestra una desviación cuadrática media entre sus carbonos  de 1.4 Å con una identidad de secuencia del 39%. Las principales diferencias están localizadas en el bucle S3-S4, que es más largo en el dominio C-terminal, el bucle S4-S5 y la presencia de la hélice 310 en el bucle cS2-cF5, que no está presente en el dominio N-terminal. Figura 6.5 Estructura del dominio de galectina del adenovirus porcino de tipo 4 (cepa NADC-1). Las cadenas  han sido coloreadas en amarillo, las hélices en rojo y los bucles en verde. Las cadenas  han sido nombradas de acuerdo con Lobsanov et al. (1993). Los extremos Ny C-terminal están marcados. 6.5 - El dominio de galectina es capaz de interaccionar con carbohidratos Para determinar con qué carbohidratos es capaz de interaccionar el dominio de galectinas se estableció una colaboración con el grupo de David Curiel y Joel Glasgow. Se utilizó un microarray con azúcares desarrollado por el “Consortium for Functional Glycomics” (Emory University School of Medicine, Atlante GA, U.S.A.). En este microarray se evaluaron 406 perfiles de unión a carbohidratos distintos de  Capítulo 6. La fibra del adenovirus porcino 4  producirá que la afinidad de estas partículas por los oligosacáridos previamente descritos sea mucho mayor (Lortat-Jacob et al., 2001; Lundquist & Toone, 2002). Tabla 6.II. Constantes de afinidad obtenidas por SPR Carbohidrato Kd lactosa 100 mM N -acetillactosamina 10 mM lacto-N-neotetraosa 303 μM ± 4 di(N-acetillactosamina) 309 μM ± 9 tri(N-acetillactosamina) 20 μM ± 3; 380 μM ± 40a aSe detectaron dos modos de unión con dos afinidades distintas. Figura 6.9 Superposición de los dominios N-terminal del dominio de galectina del adenovirus porcino 4 (la proteína en rojo y el azúcar en amarillo) y la galectina humana 9 (la proteína en azul y el azúcar en verde). Los átomos de oxígeno y nitrógeno del azúcar están coloreados en rojo y azul, respectivamente. Se representan los residuos que interaccionan con el azúcar usados en la superposición. Capítulo 6. La fibra del adenovirus porcino 4  6.8 - Comparación con otras galectinas repetidas en tándem Un alineamiento de múltiples secuencias de galectinas repetidas en tándem (Figura 6.11) muestra que la mayoría de los residuos implicados en la interacción con la tri-(N-acetillactosamina) en nuestra estructura están conservados tanto en la galectina 9 humana como en la porcina. Una superposición de la estructuras de los dominios N-terminales de ambas estructuras basada en estos residuos conservados muestra que ambos dominios comparten un mismo modo de interacción con la tri-(Nacetillactosamina) (Figura 6.9). Por lo tanto, la conformación extendida que el hexasacárido adopta en complejo con el dominio N-terminal de la galectin 9 humana sería compatible con un modelo de organización similar al observado en el dominio de galectina del adenovirus porcino de tipo 4. Potencialmente, todas las galectinas repetidas en tándem podrían estar organizadas de tal modo que ambos dominios estén posicionados frente a frente, como previamente se ha descrito. Este modelo de organización podría explicar que, aunque tanto la dicomo la tri-(Nacetillactosamina) hacen las mismas interacciones con el dominio N-terminal de la galectina 9 (Nagae et al., 2009), experimentos de cromatografía de afinidad indican que la tri-(N-acetillactosamina) tiene una afinidad mayor por la galectina 9 que contiene ambos dominios. Hasta donde sabemos, esta estructura representa la primera estructura de una galectina repetida en tándem intacta. Previamente se ha sugerido que esta clase de galectinas no se pueden cristalizar fácilmente debido al desorden introducido por el péptido que une ambos dominios CRD (Cummings et al., 2009). Quizás el péptido relativamente corto que presenta este dominio de galectina nos ha permitido salvar esta dificultad. Las estructuras resueltas han permitido realizar un análisis detallado de las interacciones presentes en la interfaz de interacción entre ambos dominios. Esta interfaz utiliza el 12% de la superficie de cada dominio (830-900 Å). En ella se forman puentes salinos (entre Asp514-His670 y Arg508-Glu573), tres puentes de hidrógeno e interacciones de van der Waals. Los residuos involucrados en la formación de esta interfaz son los mismos en todas las estructuras resueltas a excepción de la presencia de la Tyr585 en las estructuras que contienen Nacetillactosamina en el sitio de interacción primario.  Capítulo 6. La fibra del adenovirus porcino 4  Figura 6.10 Vista en detalle de los residuos que componen la interfaz entre los dos dominios CRD, se indican los residuos aromáticos Phe393 y Tyr548 que están conservados en otras galectinas repetidas en tándem. Los residuos implicados en esta interfaz pueden ser divididos en dos regiones. La primera región comprende los residuos situados en el bucle nS4-nS5 y el final de la cadena  nS4 que están interaccionando con residuos situados en el bucle cS3-cS4. La segunda región comprende los residuos situados al comienzo de la cadena  nS1, el bucle nF2-nS3, el final de la cadena  nS2 y el bucle nS2-nF1 que están interaccionando con los residuos estructuralmente equivalentes del dominio Cterminal. Dos residuos arómaticos situados justo al comienzo de la cadena  S1 de cada dominio forman un nucleo hidrofóbico que puede tener gran importancia para la estabilidad de la interfaz previamente descrita. Estos dos residuos aromáticos están universalmente conservados en todas las galectinas repetidas en tándem (Figura 6.11) y están ausentes en las galectinas prototípicas. Este patrón de conservación sugiere que otras galectinas repetidas en tándem podrían en potencia adoptar el mismo modo de organización al descrito aquí para el dominio de galectinas de la fibra del adenovirus porcino de tipo 4. Capítulo 6. La fibra del adenovirus porcino 4  Figura 6.11 Alineamiento entre múltiples secuencias de galectinas repetidas en tándem. El dominio de galectina del adenovirus porcino 4 (PAdV-4; UNIPROT-code Q83467), galectina humana-4 (HGal-4; P56470), galectina porcina-4 (PGal-4; Q29058), galectina humana-8 (HGal-8; O00214), galectina porcina-8 (PGal-8; NP_001136299.1), galectina humana-9 (HGal-9; O00182) y galectina porcina-9 (PGal-9; Q9XSM8). Se muestran los residuos idénticos y similares con cajas negras y blancas, respectivamente. Se indican los elementos de estructura secundaria del dominio de galectina de la fibra del adenovirus porcino 4.  Capítulo 6. La fibra del adenovirus porcino 4  6.9 - Conclusión En este trabajo hemos resuelto la estructura del dominio de cabeza y galectina de la fibra del aislado NADC-1 del adenovirus porcino de tipo 4. La estructura del dominio de cabeza sugiere que determinadas características a nivel estructural impiden que este dominio se una a ningún receptor adenoviral clásico. La estructura del dominio de galectina no sólo representa la primera estructura de una galectina viral sino la primera de una galectina repetida en tándem en la que ambos dominios están presentes. Los resultados presentados en este trabajo podrán ser usados para profundizar en la primeras etapas del ciclo replicativo de estos virus y podría llevar al desarrollo de aplicaciones terapéuticas, bien dirigidas a prevenir la interacción fibrareceptor y por lo tanto impidiendo la infección, o bien explotando las propiedades de unión a receptores únicas de esta fibra en el diseño de vectores de vacunación.   Capítulo 7 DISCUSIÓN  Capítulo 7. Discusión      Capítulo 7 Discusión Los reovirus y los adenovirus han despertado un gran interés debido a sus grandes aplicaciones biotecnológicas. Los adenovirus en el ámbito de la terapia génica y los reovirus en la terapia contra el cáncer. Hasta la fecha se han realizado numerosos estudios estructurales de proteínas de reovirus de mamífero y de adenovirus humanos. En este trabajo nos propusimos extender estos trabajos a representantes aviares (reovirus y adenovirus aviar) y porcinos (adenovirus porcino) con el objetivo de ampliar el conocimiento de la biología de estos virus en otros hospedadores y de esta manera poder ampliar y mejorar sus aplicaciones biotecnológicas. En esta tesis doctoral aparecen caracterizadas las estructuras de la proteína C (la fibra del reovirus aviar), la proteína A (la proteína responsable de la actividad anti-interferón del reovirus aviar), el dominio de cabeza de la fibra larga del adenovirus aviar 1 y dos dominios de la fibra del adenovirus porcino 4. Sus estructuras han permitido ahondar en procesos clave de la biología de los virus previamente citadas como se discutirá a continuación. 7.1Las fibras de reovirus y adenovirus son similares Aunque los reovirus y los adenovirus pertenecen a familias de virus distintas y tienen pocas propiedades en común, los estudios realizados en la fibra del reovirus de mamífero (Chappell et al., 2002) y el adenovirus humano 2 (van Raaij et al., 1999) pusieron de manifiesto unas similitudes inesperadas entre ambas. Entre estas semejanzas cabe destacar que ambas comparten una única organización de sus dominios, que son proteínas triméricas que se anclan a proteínas pentaméricas por su extremo N-terminal y que ambas interaccionan con receptores similares desde el punto de vista estructural y funcional. Estos parecidos no sólo podrían sugerir la existencia de un proceso de convergencia evolutiva, sino la existencia de un mecanismo común de adhesión y entrada celular, un proceso poco caracterizado en virus no envueltos.  Capítulo 7. Discusión     Tanto la fibra del reovirus de mamífero 1 como la fibra de adenovirus humano 2 son fibras triméricas alargadas con una región fibrosa compuesta por repeticiones en triple  espiral, aunque en el caso de los reovirus esta región fibrosa  estructurada coexiste con una región plegada formando un triple coiled coil, como se ha descrito en el Capítulo 3. La única otra fibra de estructura conocida que contiene repeticiones en triple  espiral es la fibra de fago PRD1: en este caso la región  estructurada coexiste con una región con un plegamiento de tipo colágeno. Tanto en la fibra de los reovirus como en la fibra de los adenovirus, el dominio globular de cabeza situado en el extremo C-terminal está formado por ocho cadenas  antiparalelas. Estas constituyen un barril  en el caso de la fibra de reovirus y un sándwich  en la de adenovirus, ambas con una topología única y exclusiva de estos dominios. En las fibras de ambos virus existen regiones bisagra entre el dominio de cabeza y el dominio fibroso (Fraser et al., 1990; van Raaij et al., 1999). Estas regiones han resultado tener una importancia crítica en la interacción de las fibras de adenovirus con su receptor (Chiu et al., 2001) y aunque todavía no se ha definido su relevancia biológica en reovirus, probablemente jueguen un papel importante en la interacción fibra-receptor y/o en la maduración de la partícula viral. Con respecto a sus receptores celulares, tanto el reovirus de mamífero como algunos adenovirus se unen a receptores que pertenecen a la familia de la inmunoglobulinas. En ambos casos el dominio más N-terminal del receptor es reconocido por el dominio más C-terminal de la fibra (Stehle & Dermody, 2003). 7.2Las fibras del reovirus de mamífero y aviar presentan diferencias significativas En esta tesis (Capítulo 3) se ha caracterizado estructuralmente por primera vez la fibra de un reovirus aviar. Su estructura en términos generales es similar a su homóloga de reovirus de mamífero, aunque un análisis detallado revela algunas diferencias fundamentales. 7.2.1Regulación del estado trimérico del dominio de cabeza Diversos estudios realizados con la proteína 1 del reovirus de mamífero sugieren que el estado trimérico de la estructura cristalina es transitorio y que se produce un cambio conformacional durante la pérdida de la cápside externa en el pH ácido del endosoma. Entre estas evidencias se encuentran los experimentos de Capítulo 7. Discusión      microscopía electrónica realizados con el reovirus de mamífero (Furlong et al., 1988) que muestran que 1 adopta una conformación compacta en el virión mientras que en las ISVPs adopta una conformación extendida. También, los estudios con virus PI mutantes (virus de infectividad persistente), que muestran cómo mutaciones localizadas en 1 que alteran la estabilidad del trímero (Wilson et al., 1996) mejorando su capacidad infectiva. Estas evidencias sugieren que la forma monomérica puede jugar un papel importante en el desensamblaje de la cápside externa y la replicación del virus. En el contexto de la importancia que un cambio conformacional de 1 puede tener en la biología del reovirus de mamífero, se han señalado dos regiones que pueden ser cruciales en este proceso. Una región bisagra de cuatro residuos que conecta la segunda y tercera repetición en triple  espiral y que permitiría que el dominio globular se mueva de una manera independiente del dominio fibroso (Chappell et al., 2002) y un agrupación de aspartatos localizada en la interfaz trimérica, justo en la base del dominio de cabeza (Chappell et al., 2002; Schelling et al., 2007). Se ha propuesto (Schelling et al., 2007) que el estado de protonación de uno de estos aspartatos podría jugar un papel importante en la regulación del estado trimérico de 1, al actuar como un interruptor mediado por pH. Así, en un ambiente ácido los grupos carboxilo de los aspartatos estarían protonados estableciendo dos puentes de hidrógeno y contribuyendo de esta manera a la estabilidad del trímero. En un ambiente neutro o básico, estos grupos carboxilo estarían desprotonados de tal forma que la acumulación de tres cargas negativas en esta interfaz sería altamente desfavorable y este dominio tendría tendencia a estar en forma monomérica (Schelling et al., 2007). Hasta la fecha sólo se ha encontrado una agrupación de aspartatos similar en la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Roche et al., 2006). Ambos virus utilizan la vía endosomal para entrar en la célula hospedadora.