Efecto da cutícula sobre a captación HAPs no brión Physcomitrella patens (Hedw.) Bruch & Schimp

1 Traballo Fin de Grao Efecto da cutícula sobre a captación de HAPs no brión Physcomitrella patens (Hedw.) Bruch & Schimp. Pablo Colmenero Crispín Grao en Bioloxía Curso académico: 2019/2020 Facultade de Bioloxía Universidade de Santiago de Compostela 2 ÍNDICE 1. Introdución 2. Obxectivos 3. Material e métodos 3.1. A especie 3.2. O cultivo 3.2.1. Establecemento do cultivo de P.patens en matraces Erlenmeyer 3.2.2. Subcultivos de P.patens en matraces Erlenmeyer 3.2.3. Cultivo de P.patens en biorreactores 3.3. Experimento de carga de HAPs nos clons de P. patens 3.3.1. Preparación dos clons de P.patens 3.3.2. Carga de HAPs 3.3.3. Determinacións dos HAPs 4. Resultados e discusión 4.1. Resultados de cultivo en matraces para P.patens WT 4.2. Resultados cultivo en Biorreactores 4.3. Resultados na filtración de HAPs con P.patens 4.4. Resultados de determinación dos HAPs en P.patens 5. Conclusión 6. Bibliografía 3 Resumo Os hidrocarburos policíclicos aromáticos (HAPs) son contaminantes presentes na atmosfera, cun aumento xeneralizado nas última décadas e que proveñen da queima de combustibles fósiles. A asimilación de estes compostos no corpo humano pode provocar problemas de saúde que dependendo de múltiples factores poden derivar en cancro. A súa monitorización é, polo tanto, importante para a saúde pública e para a caracterización da contaminación atmosférica. Os resultados presentados neste traballo para os dous clons do brión Physcomitrella patens (un deles silvestre e o outro con deficiencia na acumulación de ceras cuticulares) son interesantes para a optimización do cultivo en biorreactores de tamaño medio (12 L). Devanditos resultados son tamén prometedores para seguir investigando na utilidade do brión P.patens , como organismo de biomonitorización da contaminación atmosférica captando HAPs grazas as características lipófilas da súa cutícula. 1. Introdución Os hidrocarburos policíclicos aromáticos son un grupo amplo de compostos químicos formados por dous ou máis aneis fusionados de benceno. En contaminación ambiental os HAPs forman parte dos denominados compostos orgánicos persistentes (POPs nas siglas en inglés). A pirólise de materiais con carbono e hidróxeno, como madeira ou combustibles derivados do petróleo e carbón son as fontes de emisión de HAPs a atmosfera. Son fontes naturais de emisión as erupcións volcánicas e os incendios forestais e son fontes antrópicas o tráfico de vehículos, as actividades industriais ou as relacionadas coas calefaccións domésticas. As fontes antrópicas son as responsables do aumento de concentración de HAPs. (Dat and Chang, 2017; Ravindra et al ., 2008). Caracterizar as diferentes e variables propiedades físico-químicas dos HAPs é importante para coñecer o seu comportamento e interacción cando son liberados na atmosfera. Considéranse como de baixo peso molecular os HAPs con 2 ou 3 aneis de benceno con presións de vapor máis altas e, polo tanto, atópanse maioritariamente en fase volátil que lles confire unha menor 4 toxicidade. Porén, isto provoca que reaccionen con outros contaminantes na atmosfera como ozono ou óxidos de nitróxeno producindo contaminantes de maior toxicidade. Por outra banda os HAPs de elevado peso molecular de 4 ou máis aneis de benceno atópanse en fase de partícula debido ó seu baixo punto de presión de vapor (Kim et al ., 2013). Por suposto, non é tan simple e depende de multitude de factores como a zona de emisión, que inflúe na estacionalidade das partículas e a súa deposición. Tamén son factores a ter en conta o clima e a estación. Unha propiedade a destacar dos HAPs é que son lipófilos e hidrofóbicos polo tanto, isto provoca que a súa deposición na biosfera non sexa na auga senón que sexa principalmente como contaminantes no solo (Rengarajan et al ., 2015). Os riscos para a saúde derivados dos HAPs dependen da concentración e do tempo de exposición sendo a asimilación respiratoria a máis importante. Traballos como a minería, metalurxia ou refinerías de petróleo son exemplos de largas exposicións. Por outra banda o fume producido por persoas fumadoras en espazos interiores é unha das causas a ter en conta. A través da inxesta, son máis importantes os alimentos con queimaduras, exceso de tostado, grill e afumados que aqueles alimentos derivados de cultivos que poidan asimilar HAPs a través do solo (Kim et al ., 2013). Os efectos carcinoxénicos, teratoxénicos e xenotoxénicos dos HAPs dependen moito do tempo de exposición, da concentración, da toxicidade dos HAPs e da ruta de asimilación: inxestión, inhalación ou cutánea. O seu papel como axentes canceríxenos está demostrado ben por eles mesmos ou a través de metabolitos reactivos (Cohen et al ., 2013, chap. 7). É importante destacar o BaP, Benzo(a)pyrene (Grupo 1) como o principal HAP de efecto canceríxeno que constitúe, ademais, un dos principais compoñente do fume do tabaco. A capacidade do BaP para inducir cancro de pulmón está ben documentada en modelos animais. Estes tumores desenvoltos en ratas, ratos e hámsters posúen características morfolóxicas e moleculares similares ás exposicións atopadas en persoas fumadoras (Kasala et al ., 2015). A IARC (International Agency for Research on Cancer) calificou no ano 2013 a contaminación ambiental como canceríxena para os humanos (Grupo 1) así como o denominado material particulado atmosférico (PM) incluído 5 no mesmo grupo (Grupo 1). O PM defínese como unha mestura de partículas sólidas e /ou líquidas (excepto a auga pura) presentes na atmosfera cuxo tamaño pode variar entre 0,001 e 100µm3s. Os HAPs clasifícanse como partículas finas presentes no PM2,5 que designa a partículas inferiores a 2,5 µm. Aínda que poden estar adheridas a outras partículas e atoparse no PM2,5-10, superiores a 2,5 µm e inferiores a 10 µm (López Mahía, 2016). É convinte a monitorización de HAPs na atmosfera xa que presentan un problema de saúde pública importante. Tal e como se especifica no obxetivo 3 da axenda 2030 dos ODS (Obxetivos de Desenvolvemento Sostible) da ONU en reducir o número de mortes producidas pola contaminación da aire, a auga e o solo. Os métodos tradicionais de monitorización de HAPs activos bombean aire a través dun filtro, os datos obtidos nestas mostraxes resultan adecuados pero moi caros, alárganse no tempo e requiren enerxía para realizalas. Os métodos de monitorización de HAPs pasivos consisten nun substrato químico que adsorba os contaminantes pero tamén son caros e os substratos dependen da súa especificidade cos contaminantes. Os brións poden ser empregados como biomonitores de contaminación ambiental, nun principio empregáronse como biomonitores de metales pesados, pero é recente o descubrimento da súa capacidade para captar contaminantes orgánicos de xeito activo (Ares et al ., 2011; Capozzi et al ., 2016; De Nicola et al ., 2013; Foan et al ., 2015; Vingiani et al ., 2015) e pasivo (De Nicola et al ., 2013; Foan et al ., 2014; Harmens et al ., 2013; Wu et al ., 2014). Fixéronse estudos para optimizar o método máis eficaz para captar contaminación empregando brións (Ares et al ., 2012). A eficacia das “mosspheres” empregando brión desvitalizado na captación de HAPs respecto a outros métodos de monitorización como dispositivos de mostraxe PM10 e deposición total comprobouse con Sphagnum palustre L (Aboal et al ., 2020). O brión Physcomitrella patens (Hedw.) Bruch & Schimp é unha especie empregada como organismo modelo na investigación en fisioloxía vexetal, ecoloxía e evolución. Trátase do primeira planta non vascular da que foi secuenciada por completo o seu xenoma. Recentemente descubriuse en P.patens a importancia das rutas pre-lignina para a formación de biopolímeros cuticulares, estas rutas do metabolismo de compostos fenólicos consérvase en plantas vasculares 6 e posúen un rol crítico na impermeabilidade da cutícula. A matriz lípido-fenólica presente en P.patens podería constituír un representante vixente dos antepasado comúns de plantas vasculares, que diversificaron logo da colonización do medio terrestre polas algas carofíceas fai 450 Ma (Renault et al ., 2017). Neste traballo, cultiváronse in vitro dúas liñas xeneticamente diferentes do devandito brión na fase haploide do seu ciclo vital. Por un lado, Physcomitrella patens silvestre que denominaremos “wild-type” (WT). Por outro lado, un mutante de Physcomitrella patens que carece dun transportador ATP binding casette subfamilia G (ABCG). O fenotipo deste brión, presenta deficiencia na acumulación de ceras cuticulares reducindo a súa tolerancia ó estrés por desecación. A este mutante (Pp-ABCG7) xerado e descrito por (Buda et al ., 2013) denominarémolo “absence of wax” (AW). Non se coñece con exactitude porque os brións funcionan tan ben captando HAPs. Planteouse a hipótese de que os HAPs ao ser lipófilos sean adsorbidos a través da cutícula dos brións. Asumindo isto, non se coñece se esta adsorción é directa ou si existen partículas que median en dita adsorción. 2. Obxectivos Optimizar o cultivo de Physcomitrella patens WT e Physcomitrella patens AW en matraces e biorreactores. Estimar a través dunha proba de carga de HAPs en laboratorio, a adsorción de HAPs a través da cutícula de P.patens WT e a adsorción dos mesmos en P.patens AW. Os HAPs a analizar son os seguintes: N, naftaleno; Acei, acenaftileno; Ace, acenafteno; F, fluoreno; Fe, fenantreno; Ant, antraceno; Fl, fluoranteno; P: pireno; BaAnt: benzo[a]antraceno; Cr: criseno; BbjFl: benzo[b+j]fluoranteno; BkFl: benzo[k]fluoranteno; BePir:benzo[e]pireno; BaPir: benzo[a]pireno; DBahAnt: dibenzo[a,h]antraceno; Ipir: inden[1,2,3-cd]pireno; BghiPer: benzo[ghi]perlileno. 7 3. Material e métodos 3.1 A especie Cultiváronse dous clons do brión Physcomitrella .patens (Hedw.) Bruch & Schimp: un clon procedente do cultivo dun espécime silvestre (WT) e outro mutante cun “knockout” dun transportador involucrado na deposición de ceras da cutícula (AW) (Buda et al ., 2013). Ambos clones foron facilitados polo “Grupo de Ecofisioloxía Vexetal, Cambio Climático e Medio Ambiente” da Universidade de La Rioja. 3.2 O cultivo 3.2.1 Establecemento do cultivo de P.patens en matraces Erlenmeyer. En condicións de asepsia, baixo campá de fluxo laminar vertical, escolléronse ápices de gametóforo de P.patens recibidos en placas de Petri. Iniciáronse cultivos en matraces Erlenmeyer (50 ou 100 mL) cun volume de 30 mL de medio de cultivo Knop (Reski and Abel, 1985). Os gametóforos disgregáronse mecanicamente de dous xeitos: a) mediante un dispositivo Polytron (Montreal, Canada) durante 60 s a 19 000 rpm; ou b) mediante un bisturí en placas de Petri estériles (engadiuse medio Knop cunha pipeta Pasteur ata sumerxir os anacos de gametóforo, e de seguido coa mesma pipeta, inoculáronse os gametóforos disgregados a matraces Erlenmeyer de 100 mL). Posteriormente, realizáronse controis de esterilidade sobre os matraces e incubáronse en cámara de cultivo en axitación 100 rpm (Innova 2300, New Brunswick Scientific, New Jersey, USA) a 20 ºC, fotoperíodo 16 h luz/8 h escuridade e intensidade luminosa 55 µmol m-2s-1 (Phillips TLD 25) (Hohe and Reski, 2005). 3.2.2. Subcultivos de P.patens en matraces Erlenmeyer Unha vez deron medrado os brións da sección anterior, realízase o mesmo protocolo de disgregación. A continuación, vertéronse os cultivo en matraces Erlenmeyer 500 mL con 200 mL de medio Knop. Realízanse controis de esterilidade sobre os matraces e incubáronse en cámara de cultivo nas condicións descritas anteriormente. Tras 20 días, cando P.patens medra e consume o medio de cultivo repetiuse o protocolo de disgregación mecánica nas condicións descritas 8 anteriormente. A partir dos matraces Erlenmeyer 500 mL co brión disgregado, xeráronse novos cultivos a partir de diferentes volumes de inóculo en matraces Erlenmeyer 500 mL con 200 mL de medio. Realizáronse controis de esterilidade sobre os matraces e incubáronse en cámara de cultivo nas condicións descritas anteriormente. Por unha banda unha pequena parte do cultivo empregouse para subcultivar P.patens en matraces continuamente. Pola outra, a maior parte de P.patens empregouse para cebar os biorreactores de cultivo. Con este obxectivo fixéronse 12 subcultivos de P.patens WT e 12 subcultivos de P.patens AW en matraces Erlenmeyer 500 mL ó longo de 10 meses. As diferencias nos subcultivos descríbense a continuación. 3.2.3. Cultivo de P.patens en biorreactores Realizouse o autoclavado (Raypa 80L, Barcelona Spain) do biorreactor (Applikon BioBundle, Schiedam, The Netherlands) de 12 L de capacidade estando este baleiro, de seguido volveuse a autoclavar selado desta volta con 2 litros de medio Knop. Empregáronse os subcultivos de P.patens descritos na sección 2.2.2. que se someteron a disgregación mecánica mediante Polytron (Montreal, Canada) do xeito descrito na sección 2.2.1. O brión disgregado inoculouse en botellas de 1 L de volume completadas con medio de cultivo Knop. A algúns dos cultivos engadiuselle Tartrato de amonio (460 mg L-1) e nitrato de amonio (10 g L-1). A continuación inocularonse nos biorreactores. Realizáronse controis de esterilidade. As condicións do biorreactor son unha temperatura de 25ºC, 100 rpm de axitación, e fotoperíodo de 16 h luz/8 h escuridade, cunha intensidade luminosa 210 µmol m-2s-1 con tubos LED, aireación 0.3 vvm [(volume aireación)/(volume de medio)/min] e pH libre. 3.3. Experimento de carga de HAPs nos clons de P. patens 3.3.1. Preparación dos clons de P.patens Unha vez extraéronse os brións do biorreactor, procedeuse ao secado a 25ºC. A continuación realízase o homoxeneizado de P.patens mediante unha licuadora (Waring Blender Laboratory Blender, Waring comercial, New Hartford, Connecticut, USA) a 470 rpm, 5 segundos. 9 Acto seguido, procedeuse á desvitalización dos brións mediante choque térmico cunha rampa de temperaturas estando 8 h a cada unha das seguintes: 40 ºC, 80 ºC e 100 ºC, na estufa (P-Selecta Dry-big, Selecta, Barcelona, España). Unha vez desvitalizados e atemperados a 25ºC, realizouse a moenda dos brións nun muíño tanxencial de bólas (Restch MM400, Haan, Germany), empregando cápsulas de ZrO2 e acadando as partículas obtidas un diámetro de 10 µm. 3.3.2. Carga de HAPs As incubacións de cada un dos clons (WT e AW) realízanse nun control e en 5 disolucións dun patrón de HAPs (Polynuclear Aromatic Hydrocarbon 16 solution ). As concentracións de cada un dos HAPs no patrón son 10 µg/mL e as disolucións probadas móstranse na táboa 1. Nun matras Erlenmeyer de 100 mL engadiuse 1 g de brión moído e pesado nunha báscula de precisión (Mettler AJ100, Mettler-Toledo, Greifensee, Switzerland). A continuación engadiuse cada unha das disolucións da táboa 1 e homoxenizouse durante 1 h a 120 rpm estando cuberto con parafilm®. A continuación filtrouse nun funil Büchner acoplado a un kitasato e unha bomba de baleiro. Empregouse un filtro de nitrocelulosa de 0,45 μm (Milipore .45 μm 90 mm nitrocellulose, Darmstadt, Alemania), xa que o intento de emprego de filtros de nylon de 0,45 μm (Milipore .45 μm, 90 mm, nylon, Darmstadt, Alemania ) fracasou. Finalmente, empregando un portaobxectos, separase o brión húmido do filtro e déixase secar a temperatura ambiente (25ºC), moéndose posteriormente nun muíño tanxencial de bólas (Restch MM400, Haan, Germany), empregando cápsulas de ZrO2. 3.3.3. Determinacións dos HAPs As determinacións realizáronse no Instituto de Medio Ambiente (Universidade da Coruña). Os HAPs contidos nos brións analizáronse mediante extracción en matriz de dispersión en fase sólida, seguido de determinación mediante unha vaporización de temperatura programada, cromatografía de gases e espectrometría de masas en tándem (PTV-GC-MS / MS) empregando metodoloxía desenvolvida por (Concha-Graña et al ., 2015). 16 Táboa 4: Concentracións de hidrocarburos policíclicos aromáticos (HAPs) captados por Physcomitrella patens,WT e Physcomitrella patens AW expresado en µg/g nas 12 disolucións descritas na táboa 1. A determinación dos HAPs realizouse mediante PTV-GC-MS / MS. µg/g AW1 AW2 AW3 AW4 AW5 AW6 WT1 WT2 WT3 WT4 WT5 WT6 N 0,049 0,062 0,060 0,058 0,064 0,070 0,099 0,074 0,319 0,381 1,061 2,078 Acei 0,000 0,171 0,241 0,833 1,447 1,810 0,000 0,367 1,052 1,802 2,792 3,486 Ace 0,013 0,276 0,275 0,852 0,964 1,311 0,011 0,331 0,578 1,080 2,018 2,700 F 0,012 0,564 0,780 2,435 2,720 3,902 0,016 0,641 1,360 2,263 4,202 5,524 Fe 0,021 0,781 1,349 3,195 8,117 10,058 0,030 0,936 2,014 3,840 9,738 12,925 Ant 0,010 0,621 1,199 2,633 6,598 9,554 0,008 0,859 1,922 3,460 8,725 12,126 Fl 0,008 0,782 0,658 1,532 6,632 8,479 0,015 0,936 1,368 1,702 7,838 10,024 P 0,007 0,835 0,736 2,580 5,495 10,389 0,013 0,970 0,945 1,835 7,407 11,571 BaAnt 0,001 1,110 0,612 2,107 5,528 12,669 0,009 1,418 0,665 1,122 2,653 3,090 Cr 0,000 1,070 0,793 2,154 9,445 15,493 0,008 1,364 1,547 3,317 7,409 28,514 BbjFl 0,001 0,957 0,793 0,137 0,945 0,686 0,006 0,624 0,369 0,412 0,150 0,473 BkFl 0,000 0,268 0,188 0,569 3,400 1,032 0,005 0,257 0,647 1,435 1,562 5,104 BaPir 0,001 0,793 0,346 1,207 1,780 0,771 0,004 0,491 0,657 1,643 1,086 0,889 DBahAnt 0,000 1,526 0,328 0,782 0,940 6,059 0,001 2,004 0,680 1,067 1,612 3,479 Ipir 0,000 1,019 0,247 0,520 0,894 2,081 0,001 1,421 0,814 1,821 0,914 1,012 BghiPer 0,001 0,886 0,676 1,836 9,096 6,008 0,004 1,173 1,115 4,796 6,614 2,028 Abreviaturas: AW, “absence of wax” ; WT, “wild type”. N, naftaleno; Acei, acenaftileno; Ace, acenafteno; F, fluoreno; Fe, fenantreno; Ant, antraceno; Fl, fluoranteno; P: pireno; BaAnt: benzo[a]antraceno; Cr: criseno; BbjFl: benzo[b+j]fluoranteno; BkFl: benzo[k]fluoranteno; BaPir: benzo[a]pireno; DBahAnt: dibenzo[a,h]antraceno; Ipir: inden[1,2,3-cd]pireno; BghiPer: benzo[ghi]perlileno. PTV-GC-MS / MS : extracción en matriz de dispersión en fase sólida, determinación mediante vaporización de temperatura programada, cromatografía de gases e espectrometría de masas en tándem. 17 Figura 1: Concentración de hidrocarburos policíclicos aromáticos (HAPs) captados por Physcomitrella patens,WT e Physcomitrella patens AW expresado en µg/g. As concentración de P.patens AW2 e P.patens WT2 réstanselle os valores obtidos para P.patens AW1 e P.patens WT1 respectivamente. Abreviaturas: AW, “absence of wax” ; WT, “wild type”. 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 1,600 1,800 2,000 2,200 µg/g HAPs AW2-AW1 WT2-WT1 18 6. Bibliografía Aboal, J.R., Concha-Graña, E., De Nicola, F., Muniategui-Lorenzo, S., López-Mahía, P., Giordano, S., Capozzi, F., Di Palma, A., Reski, R., Zechmeister, H., Martínez-Abaigar, J., Fernández, J.A., 2020. Testing a novel biotechnological passive sampler for monitoring atmospheric PAH pollution. Journal of Hazardous Materials 381, 120949. https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2019.120949 Ares, A., Aboal, J.R., Carballeira, A., Giordano, S., Adamo, P., Fernández, J.A., 2012. Moss bag biomonitoring: A methodological review. Science of The Total Environment 432, 143– 158. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2012.05.087 Ares, Á., Ángel Fernández, J., Ramón Aboal, J., Carballeira, A., 2011. Study of the air quality in industrial areas of Santa Cruz de Tenerife (Spain) by active biomonitoring with Pseudoscleropodium purum. Ecotoxicology and Environmental Safety 74, 533–541. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2010.08.019 Buda, G.J., Barnes, W.J., Fich, E.A., Park, S., Yeats, T.H., Zhao, L., Domozych, D.S., Rose, J.K.C., 2013. An ATP Binding Cassette Transporter Is Required for Cuticular Wax Deposition and Desiccation Tolerance in the Moss Physcomitrella patens. Plant Cell 25, 4000–4013. https://doi.org/10.1105/tpc.113.117648 Capozzi, F., Giordano, S., Di Palma, A., Spagnuolo, V., De Nicola, F., Adamo, P., 2016. Biomonitoring of atmospheric pollution by moss bags: Discriminating urban-rural structure in a fragmented landscape. Chemosphere 149, 211–218. https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2016.01.065 Cohen, A.J., Samet, J.M., Straif, K., International Agency for Research on Cancer, 2013. Air pollution and cancer. International Agency for Research on Cancer, Lyon. Concha-Graña, E., Muniategui-Lorenzo, S., De Nicola, F., Aboal, J.R., Rey-Asensio, A.I., Giordano, S., Reski, R., López-Mahía, P., Prada-Rodríguez, D., 2015. Matrix solid phase dispersion method for determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in moss. Journal of Chromatography A 1406, 19–26. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2015.06.014 Dat, N.-D., Chang, M.B., 2017. Review on characteristics of PAHs in atmosphere, anthropogenic sources and control technologies. Science of The Total Environment 609, 682–693. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2017.07.204 De Nicola, Flavia, Murena, F., Costagliola, M.A., Alfani, A., Baldantoni, D., Prati, M.V., Sessa, L., Spagnuolo, V., Giordano, S., 2013. A multi-approach monitoring of particulate matter, metals and PAHs in an urban street canyon. Environ Sci Pollut Res 20, 4969– 4979. https://doi.org/10.1007/s11356-012-1456-1 De Nicola, F., Spagnuolo, V., Baldantoni, D., Sessa, L., Alfani, A., Bargagli, R., Monaci, F., Terracciano, S., Giordano, S., 2013. Improved biomonitoring of airborne contaminants by combined use of holm oak leaves and epiphytic moss. Chemosphere 92, 1224–1230. https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2013.04.050 Foan, L., Domercq, M., Bermejo, R., Santamaría, J.M., Simon, V., 2015. Mosses as an integrating tool for monitoring PAH atmospheric deposition: Comparison with total deposition and evaluation of bioconcentration factors. A year-long case-study. Chemosphere 119, 452– 458. https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2014.06.071 Foan, L., Leblond, S., Thöni, L., Raynaud, C., Santamaría, J.M., Sebilo, M., Simon, V., 2014. Spatial distribution of PAH concentrations and stable isotope signatures (δ13C, δ15N) in mosses from three European areas – Characterization by multivariate analysis. Environmental Pollution 184, 113–122. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2013.08.006 Harmens, H., Foan, L., Simon, V., Mills, G., 2013. Terrestrial mosses as biomonitors of atmospheric POPs pollution: A review. Environmental Pollution 173, 245–254. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2012.10.005 Hohe, A., Reski, R., 2005. Control of growth and differentiation of bioreactor cultures of Physcomitrella by environmental parameters, in: Hvoslef-Eide, A.K., Preil, W. (Eds.), Liquid Culture Systems for in Vitro Plant Propagation. Springer-Verlag, Berlin/Heidelberg, pp. 155–161. https://doi.org/10.1007/1-4020-3200-5_10 19 Kasala, E.R., Bodduluru, L.N., Barua, C.C., Sriram, C.S., Gogoi, R., 2015. Benzo(a)pyrene induced lung cancer: Role of dietary phytochemicals in chemoprevention. Pharmacological Reports 67, 996–1009. https://doi.org/10.1016/j.pharep.2015.03.004 Kim, K.-H., Jahan, S.A., Kabir, E., Brown, R.J.C., 2013. A review of airborne polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and their human health effects. Environment International 60, 71– 80. https://doi.org/10.1016/j.envint.2013.07.019 López Mahía, P., 2016. Material particulado atmosférico: el desafío de una mezcla compleja de contaminantes : discurso de ingreso como Académica correspondiente, Purificación López Mahía, discurso de presentación, Soledad Muriategui Lorenzo. NINO, Santiago de Compostela. Ravindra, K., Sokhi, R., Vangrieken, R., 2008. Atmospheric polycyclic aromatic hydrocarbons: Source attribution, emission factors and regulation. Atmospheric Environment 42, 2895– 2921. https://doi.org/10.1016/j.atmosenv.2007.12.010 Renault, H., Alber, A., Horst, N.A., Basilio Lopes, A., Fich, E.A., Kriegshauser, L., Wiedemann, G., Ullmann, P., Herrgott, L., Erhardt, M., Pineau, E., Ehlting, J., Schmitt, M., Rose, J.K.C., Reski, R., Werck-Reichhart, D., 2017. A phenol-enriched cuticle is ancestral to lignin evolution in land plants. Nat Commun 8, 14713. https://doi.org/10.1038/ncomms14713 Rengarajan, T., Rajendran, Peramaiyan, Nandakumar, N., Lokeshkumar, B., Rajendran, Palaniswami, Nishigaki, I., 2015. Exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons with special focus on cancer. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 5, 182–189. https://doi.org/10.1016/S2221-1691(15)30003-4 Reski, R., Abel, W.O., 1985. Induction of budding on chloronemata and caulonemata of the moss, Physcomitrella patens, using isopentenyladenine. Planta 165, 354–358. https://doi.org/10.1007/BF00392232 Vingiani, S., De Nicola, F., Purvis, W.O., Concha-Graña, E., Muniategui-Lorenzo, S., LópezMahía, P., Giordano, S., Adamo, P., 2015. Active Biomonitoring of Heavy Metals and PAHs with Mosses and Lichens: a Case Study in the Cities of Naples and London. Water Air Soil Pollut 226, 240. https://doi.org/10.1007/s11270-015-2504-5 Wu, Q., Wang, X., Zhou, Q., 2014. Biomonitoring persistent organic pollutants in the atmosphere with mosses: Performance and application. Environment International 66, 28–37. https://doi.org/10.1016/j.envint.2013.12.021