Datación de traumatismos cranoencefálicos mediante técnicas inmunohistoquímicas

Universidad de Santiago de Compostela Departamento de Ciencias Morfológicas Tesis Doctoral DATACIÓN DE TRAUMATISMOS CRANEOENCEFÁLICOS MEDIANTE TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS Mª Ángeles Romero Tirado Santiago de Compostela, 2015 Los Dres. José Blanco Pampín, Jefe de Servicio de Patología Forense del Instituto de Medicina Legal de Galicia, y Rosalía Gallego Gómez, Profesora Titular de Histología de la Universidad de Santiago de Compostela, HACEN CONSTAR: Que la tesis que lleva por título “DATACIÓN DE TRAUMATISMOS CRANEOENCEFÁLICOS MEDIANTE TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS”, fue realizada bajo su dirección por la Licenciada en Medicina Mª de los Ángeles Romero Tirado, y reúne todos los requisitos para ser presentada y defendida para optar al Grado de Doctor por la Universidad de Santiago de Compostela. Santiago de Compostela, 25 de septiembre de 2015 Dr. J. Blanco Pampín Dra. R. Gallego Gómez M. A. Romero Tirado A mi padre, el Dr. José Mª Romero Roldán, de quien heredé su espíritu inquieto y su amor por la Medicina. Y a mi hija Mª José, a quien espero transmitir este mismo legado AGRADECIMIENTOS Deseo expresar mi gratitud al Dr. José Blanco Pampín, mi Jefe, mi Mentor y mi amigo, porque sin conocerme me creyó capaz de hacer este trabajo y me ha enseñado grandes cosas sobre Patología Forense, sobre investigación y sobre la vida. Gracias por tu apoyo incondicional en todo momento y circunstancia. A la Dra. Rosalía Gallego, Profesora titular de Histología, una excelente persona de inteligencia y capacidad de trabajo extraordinarias; que me dedicó tantas horas de su tiempo fuera de las horas de trabajo para enseñarme neurohistología y neuropatología prácticamente desde cero, y que se entusiasmó tanto como yo con este trabajo. A los técnicos de Anatomía Patológica. A José Luis, por ayudarme tanto con la obtención y conservación de las muestras y a Patricia y a Roberto porque siempre estuvieron dispuestos a hacer un corte y una tinción más. Al Profesor Xosé Luis Otero Cepeda, Profesor Titular de Estadística de la Universidad de Santiago de Compostela, quien me reconcilió con el análisis estadístico, e incluso consiguió que me pareciera bonito y divertido. A Ángel Vázquez Boquete, que me ayudó con la presentación de este trabajo, consiguiendo fuera mucho mejor de lo que yo sola hubiera podido hacerla nunca. Porque de nada sirve hacer un buen trabajo si no puedes transmitirlo. A mis compañeros de la Subdirección de Pontevedra del Instituto de Medicina Legal, por acordarse de mí, siempre que caía en sus manos un caso interesante, y en especial al Dr. Juan González Fontán y la Dra. Tamara Ramos Paradelo por cubrirme tantas horas de guardia para que yo pudiera ir a investigar a la Facultad de Medicina. A mi marido, Javier, por su infinita paciencia que sólo puede ser fruto de un amor sincero e incondicional. A mis hermanas mayores Candi, Mª José y Asun, que fueron mi inspiración cuando era niña y quienes, aún desde la distancia, me apoyan y me animan en todo lo que hago. GLOSARIO ÍNDICE Índice _________________________________________________________ 17 ÍNDICE REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA……………………………..……………....27 1.- Introducción………………………………………….…………………27 1.A.- Tipos de lesiones craneales……………………………...…….…28 1.B.- Concepto de daño axonal difuso……………………………...….31 1.C.- Concepto de apoptosis y su relación con el DAI……….………...33 2.- Data microscópica de los traumatismos craneoencefálicos mediante técnicas clásicas……………………….…………………….…….…35 3.- Marcadores biológicos de neovascularización………………........….41 3.A.- Tenascina…………………………………………………….….41 3.B.- Laminina y colágeno tipo IV………………………………..……42 3.C.- Trombomodulina…………………………………………......….42 3.D.- Factor VIII………………………………………………….…...42 4.- Marcadores de gliosis…………………….……………………….……43 4.A.- Astrocitos……………………………………………….……….43 4.A.a.- PGFA……………………………...…….………………43 4.A.b.- Vimentina…………………………………….……….…45 4.A.c.- alfa-1-antiquimiotripsina………………………..………..46 4.A.d.- Proteoglicanos: condroitínsulfato, queratansulfato y dermatansulfato……………………………..………..…..47 Índice _________________________________________________________ 18 4.B.-Macrófagos y microglía……………………………….…….48 4.B.a.- Interleukina 1………………………………………...….50 4.B.b.- Interleukina 6…………………...……………………….53 4.B.c.- Factor de necrosis tumoral alfa…………………….…….54 4.B.d.- Factor asociado al receptor TNF alfa…….……..………..55 4.B.e.- Pro EMAP II…………………………………...………..56 4.B.f.- OX 6 y OX 42…………………………………………...56 4.B.g.- CD 68………………………………………….………...57 4.B.h.- CD 163…………………………………………………..58 4.C.- Marcadores leucocitarios……………………………………...….59 4.C.a.- Antígeno leucocitario común (LCA) y UHCL-1.....………59 4.C.b.- CD 3……………………………………………….…….60 4.C.c.- CD 15…………………………………………………....60 5.- Marcadores de lesión neuronal………………………………………...61 5.A.- NCAM…………………………………………………………..61 5.B.- Enolasa neuronal específica……………………………………...62 6.- Marcadores biológicos de daño axonal difuso………………………...64 6.A.- β-APP………….………………………………………………...64 6.B.- Proteína FE 65…………………………………………………..75 6.C.- Destrucción del citoesqueleto neuronal………….………………76 6.C.a.- Neurofilamentos…….…………...………………………76 Índice _________________________________________________________ 19 6.C.b.- Microtúbulos…………………………………………….78 7.- Marcadores de proliferación celular…………….……………………..79 7.A.- Nestina…………………………………………………………..79 7.B.- BrdU…………………………………………………………….80 7.C.- DNA metiltransferasa…………………………………………....82 8.- Estudio de la apoptosis…………………………………………………83 8.A.- Técnicas moleculares…………………………………………….83 8.A.a.- TUNEL (fragmentación de DN)….……………………...83 8.A.b.- Hibridación in situ………….……………………………84 8.B.- Inmunohistoquímica……………………………………………..85 8.B.a.- Caspasa 3………………………………………………...85 8.B.b.- Citocromo C……………………………………………..87 8.B.c.- Factor inductor de la apoptosis (AIF)……………………87 8.B.d.- Genes de la familia Bcl-2………………………………...88 8.B.e.- p53………………………………………………………92 8.B.f.- Fas (CD95) y Fas L (CD 95 L)…………………………...94 8.B.g.- Proteínas asociadas a Fas (Daxx, DED, FADD y FAP-1)..95 9.- Otros marcadores……………………………………………………….95 9.A.- Citoquinas……………………………………………………….95 9.B.- Metaloproteinasas………………………………………………..96 9.C.- Proteínas inductoras de las metaloproteinasas (EMMPRIN o CD147)………………………………………………………...96 Índice _________________________________________________________ 20 9.D.- Diacilglicerolquinasa………………………….………………….97 9.E.- Conjugados de proteínas autofágicas (ATG 12 y ATG 5)………..97 9.F.- Proteína asociada al crcimiento(GAP 43) y sinaptosina…………..98 9.G.- Factor neutrofílico ciliar…………………………………………98 9.H.- Progranulina……………………………………………………..98 9.I.- Proteína de choque térmico 72 (HSP 72)………………………...99 9.J.- Factor inducible por hipoxia 1 (HiF 1)………………….………100 9.K.- Caveolinas……………………………….…………………...…100 9.L.- Factor de crecimiento similar a la insulina (IGFA-1)………..…..101 9.M.- AMPc………………………………………………………..…102 9.N.- Molécula de integración estromal oligomerizada 1 (STIM 1)…....102 9.O.- Acuaporina 9 (AQP 9)………………………………………….103 9.P.- Prohibitina 2 (PHB2)…………………………………………...103 9.Q.- Ubiquitina……………………………………………………....104 10.- Casos de especial relevancia médico legal…………………..……...105 10.A.- Shaken baby syndrome (síndrome del niño sacudido)……..…...105 10.B.- Lesiones por arma de fuego………………..…………………....108 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS DEL TRABAJO……………..…..…….113 MATERIAL Y METODO…………………………………………………..99 1.- Material……………………………………………………………117 Índice _________________________________________________________ 21 1.A.- Selección de los casos……………………………...……118 2.- Métodos…………………………………………………………...120 2.A.- Autopsia encefálica y procedimiento de obtención de secciones de tejido cerebral………………………….…......120 2.B.- Preparación de los bloques tisulares…………….……….120 2.C.- Procesamiento de los bloques tisulares…….…………………..………122 2.D.- Técnicas histológicas……………………………….…...123 2.D.a.- Hematoxilina-Eosina……………………….123 2.D.b.- Técnica inmunohistoquímica……...………..124 2.E.- Estudio de las muestras…………………...…………….125 2.F.- Cuantificación de la inmunirreactividad…………………125 2.G.- Análisis estadístico……………………………...………127 RESULTADOS…………………………………………………………….131 1.- Hallazgos macroscópicos………………………………………….131 2.- Hematoxilina-Eosina…………………………….………………..138 3.- Técnicas inmunohistoquímicas……………………………………149 3.A.- Grupo control………….….…………………………….149 3.B.- Grupo 1 (supervivencia inferior a dos horas)……....…….157 3.C.- Grupo 2 (supervivencia entre 2 y 24 horas)……………...169 3.D.- Grupo 3 (supervivencia entre 24 horas y 30 días)……….180 3.E.- Grupo 4 (supervivencia superior a 30 días)………….…..196 Índice _________________________________________________________ 22 4.- Análisis estadístico………………………………...………………204 4.A.- PGFA……………………………………….…………..204 4.A.a.- Sustancia gris……………………….………204 4.A.b.- Sustancia blanca……………………………206 4.B.- CD68………………………………………………...….209 4.B.a.- Sustancia gris……………………………….209 4.B.b.- Sustancia blanca………………………....….211 DISCUSIÓN………………………………………………….…………….217 1.- Consideraciones generales…………………………………………217 2.- Utilidad de los marcadores inmunohistoquímicos…………...……..219 3.- Consideraciones técnicas…………………………………………..224 4.- Interpretación de los resultados…………………………...………225 5.- Expresión de los marcadores seleccionados…….…………………226 5.A.- Neurofilamentos………………..………………………226 5.B.- PGFA…………………………….……………………..228 5.C.- CD68……………………..……………….…………….232 5.D.- Βapp……………………………………………………235 5.E.- Genes de apoptosis: Bcl-2 y p53….……………………..239 5.F.- Vimentina……………………………………………….240 6.- Casos de especial mención……………..………………………….242 7.- Consideraciones finales………………………………...………….243 Índice _________________________________________________________ 23 CONCLUSIONES...................................................................................................247 BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………..251 Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 29 lesiones no son apreciables en la autopsia y requieren estudio histológico que, incluso en algunas ocasiones, resulta negativo.  Contusión cerebral: Se produce una pérdida de conciencia superior a 6 horas. El tejido cerebral se destruye, acompañándose de extravasaciones o pequeñas hemorragias localizadas en la zona afectada que se rodean de ligero edema perifocal. Las células afectadas liberan sustancias que licúan el tejido circundante, formando pequeñas cavidades quísticas que son invadidas por microglía, dando lugar a los cuerpos granulosos. A los 3 días la astroglía da lugar a su cicatrización.  Edema cerebral: Se produce por el aumento de la permeabilidad capilar y la disminución de la presión osmótica del plasma, lo que hace que pase agua y sodio al tejido cerebral, dando lugar a un aumento de la presión intracraneal. El diagnóstico de certeza debe ser microscópico, aunque signos macroscópicos evidentes pueden ser la turgencia y el brillo de la masa encefálica, el borrado de las circunvoluciones y surcos, herniaciones y la aparición del enarenado hemorrágico en la sustancia blanca al corte.  Hemorragias cerebrales: o Extradurales o Subdurales: aguda, con un periodo de latencia inferior a 24 h, subaguda con latencia de entre 24 h y 3 meses, y crónica con más de 3 meses de margen temporal para su aparición. o Subaracnoideas: Las hemorragias subaracnoideas son el hallazgo intracraneal más común como consecuencia de un traumatismo craneal, pudiendo ser difusas, focales o parcheadas. También pueden ser causadas por lesión de las arterias Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 30 vertebrales o la arteria basilar como consecuencia de la hiperextensión del cuello o, en el caso de la arteria vertebral, por traumas laterales en el cuello o Intraparenquimatosas: localizadas con mayor frecuencia en las regiones frontal y temporal, normalmente asociadas a fracturas craneales. Su aparición puede ser diferida horas o días tras el traumatismo  Daño axonal difuso En la actualidad se empieza a poner de manifiesto la correlación entre un traumatismo cráneo-encefálico de baja-media intensidad y la aparición de secuelas diferidas, incluso con la aparición de enfermedades neurodegenerativas tales como el Alzheimer o el Parkinson. El estudio simple de las lesiones encefálicas es complejo y la información obtenida del estudio macroscópico es pobre y por supuesto, insuficiente. Como puede deducirse, el proceso de daño y reparación tisular sufrido por el encéfalo ante cualquier agente es más complejo que un simple proceso inflamatorio. Además, en la actualidad, dichos procesos bioquímicos no son conocidos en su totalidad, si bien son similares en todas las posibles etiologías (hipoxia, epilepsia, toxinas, traumatismos…), en parte por la especialización de sus células, y en parte porque en todas las situaciones, la respuesta macroscópica es similar. Es decir, cualquier noxa produce inflamación, que a su vez produce edema, y ésta provoca problemas de espacio en la cavidad cerrada que es el cráneo (Castellano Arroyo, en Medicina legal y toxicológica. Capítulo 33 (2000)). Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 31 1.B.- CONCEPTO DE DAÑO AXONAL DIFUSO (Diffuse Axonal Injury) Las lesiones asociadas con traumatismos cráneo-encefálicos se pueden clasificar en focales o difusas. Las focales incluyen las fracturas de cráneo, hematomas y contusiones. Las lesiones difusas hacen referencia a isquemia generalizada, edema cerebral y daño axonal traumático, el cual se produce por interrupción del flujo axonal. El diagnóstico de daño axonal requiere la identificación microscópica de axones edematosos y bulbos axonales (Reichard y cols, 2005). Cuanto más severo es el traumatismo, mayor es la frecuencia de lesiones en la cápsula interna, el cerebelo y el tallo cerebral, así como en la sustancia blanca hemisférica. Por tanto podría definirse como daño axonal difuso (DAI) aquel que se detecta en hemisferios cerebrales, cuerpo calloso y tallo cerebral (Geddes y cols, 1997). Es decir, supone lesiones en lugares específicos supra e infra tentoriales, aunque la distribución e intensidad de las lesiones varía según los casos, dependiendo del tipo y la severidad del impacto. De este modo el daño axonal traumático puede ser multifocal y en otros muchos casos, difuso. Hay que señalar que el daño axonal difuso no sólo se produce por traumatismos, sino también por isquemia, hipoglucemia y otros trastornos metabólicos, inflamación, drogas y alcohol e incluso por envejecimiento. En general, todas aquellas circunstancias en las que se produce un aumento de la presión intracraneal pueden dar lugar a daño axonal (Orthobagyi y cols, 2007). No obstante, los cambios morfológicos secundarios a isquemia han sido bien definidos en distintos estudios (Tatlisumak y cols, 2009), presentando ligeras diferencias con los cambios sufridos tras un traumatismo, tanto en su expresión morfológica como temporal: Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 32 Cambios morfológicos en tejido cerebral tras trauamtismo (Tatlisumak y cols, 2009) En casos de etiología traumática la presencia de células inflamatorias como neutrófilos, mononucleares y macrófagos parece estar implicada en el daño cerebral secundario, contribuyendo a alteraciones en el flujo sanguíneo cerebral, edema, hipertensión intracraneal y en última instancia, a la muerte neuronal (Hausman y cols, 1999). El diagnóstico de este tipo de lesión neuronal se hizo clásicamente con hematoxilina-eosina y tinciones argénticas; sin embargo, la frecuencia en su diagnóstico ha aumentado (demostrando su importancia en la morbimortalidad 1,5 h 3h 6h 12h 24h 72h Edema y granulación citoplasma + + + + + Edema axonal + + Eosinofilia + + Necrosis total + Neuronas fantasmas + Edema de células gliales + + + + + Acumulación de glía junto a infarto + + Infiltrado de PMN + + + Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 33 subsecuente a un traumatismo cráneo-encefálico) debido al empleo de técnicas inmunohistoquímicas (Graham y cols, 2004), principalmente mediante el estudio de la acumulación de la proteína -Amiloide y su precursor -APP. 1.C.- CONCEPTO DE APOPTOSIS Y SU RELACIÓN CON EL DAÑO AXONAL DIFUSO Después de un traumatismo se ponen en marcha dos tipos de neurodegeneración: la excitotóxica y la apoptótica. Mientras que la primera presenta un tiempo de evolución rápido, la apoptosis se presenta de forma diferida y afecta a áreas del encéfalo distantes del lugar del impacto. La respuesta apoptótica depende de la edad. Los desencadenantes son múltiples: lesiones de ADN, deprivación de factores de crecimiento, producción de citoquinas, etc. Además, se ejecuta por distintas vías bioquímicas aunque todas confluyen en la activación de las caspasas (Felderhoff-Muesner y cols, 2002). La muerte por neurotoxicidad (necrosis) se debe a la liberación de aminoácidos excitotóxicos con la consecuente entrada de calcio a la célula, que provoca una estimulación enzimática que dará lugar a productos de metabolismo (como lactato) que constituyen factores de daño secundario, productos de degradación de fosfolípidos (ácido araquidónico), peroxidación de lípidos, proteolísis del citoesqueleto, etc. Todo ello conduce a una pérdida de integridad de las membranas con el consiguiente daño irreparable de las organelas y edema celular (Dong y cols, 2001). Una consecuencia inmediata de la elevación de la concentración del calcio intracelular es la activación de las proteasas calcio dependientes (calpaínas), que conduce a la proteolisis de proteínas intracelulares incluyendo las del citoesqueleto. El estudio de los mecanismos de muerte celular in vitro ha llevado a la conclusión de que concentraciones bajas de calcio conducirían a una muerte Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 34 por apoptosis, mientras que concentraciones altas llevarían a la necrosis (Raghupathi, 2004). La apoptosis o muerte celular programada es un proceso fisiológico que resulta crítico en el desarrollo del sistema nervioso central, su homeostasis y en la eliminación de células potencialmente peligrosas. Ocurre en ausencia de respuesta inflamatoria en los tejidos circundantes y puede ser iniciada por distintos estímulos. No sólo ha sido reconocida como un fenómeno esencial en la homeostasis del tejido nervioso sino que también juega un papel crucial en eventos neuropatológicos, tales como el traumatismo cráneo encefálico, la isquemia cerebral, y varias enfermedades neurodegenerativas (Cernak y cols, 2002). Por ello, se ha propuesto que la apoptosis neuronal tras un accidente isquémico o traumático, podría representar un mecanismo de protección para el cerebro; por ejemplo, podría constituir un mecanismo para eliminar las células dañadas o muertas sin afectar a las células sanas (Raghupathi, 2004). No obstante, su función es mucho más amplia y compleja ya que sus mecanismos bioquímicos conservan la integridad de las membranas, provocan la condensación del citoplasma y las organelas y forman vesículas (apoptosomas). El mecanismo general puede resumirse en un receptor que activa las cascada de las caspasas, que activan las proteinkinasas con la consiguiente liberación del citocromo C del espacio intramembrana de la mitocondria, el cual provocaría en última instancia la fragmentación de ADN (Gao-Xiang Dong y cols, 2001). Los mecanismos bioquímicos que conducen a la muerte celular programada aún no se conocen en su totalidad, si bien se relacionan con un grupo de genes proapoptóticos (p53,Bax, Bid, Bik, Bak, Bim y Bcl-X) y antiapoptótiocos (Bcl-2, Bcl-Xl y Mcl-1), descritos en relación con el linfoma de células B (BCL-2, B cell leukemia-2 gene product). Los desencadenantes incluyen deprivación de factor de crecimiento, daños en el ADN, producción de citokinas y activación de receptores. Todo ello converge en la activación de las caspasas: Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 35 - Vía extrínseca: La vía extrínseca o mitocondrial de la apoptosis es el resultado de la desaparición de estímulos de supervivencia, esto provoca un aumento en la permeabilidad de las membranas mitocondriales que libera al citoplasma algunas proteínas como el citocromo C que actúa como cofactor de las proteínas activadoras de la apoptosis (Apaf-1) y en último término activando la caspasa 9. - Vía intrínseca: Consiste en la activación de receptores como el FAS (que pertenece a la familia del TNF-). La unión de FAS a una proteína adaptadora y a la forma inactiva de la caspasa 8, forma un complejo inductor que a su vez transforma la pro-caspasa 8 en caspasa 8 activa iniciando la cascada hasta activar la caspasa 3 (FelderhoffMuessner y cols, 2002). 2.- DATA MICROSCÓPICA DE LOS TRAUMATISMOS CRÁNEO ENCEFÁLICOS MEDIANTE TÉCNICAS CLÁSICAS La técnica básica para el estudio de la data de los traumatismos es la observación del estado del coágulo del hematoma: la organización de membranas de fibrina y el estado de las células que lo conforman. De este modo obtendríamos los resultados que se reflejan en el siguiente cuadro (Di Maio, 2003): Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 36 Cambios evolutivos en el coágulo de una hemorragia intracraneal (Di Maio, 2003) Periodo de tiempo tras la lesión Estado del coagulo Hallazgos microscópicos Lado de la membrana en contacto con la duramadre Lado de la membrana entre coagulo y aracnoides 24 horas Eritrocitos frescos Fina capa de fibrina entre la dura y el coágulo 24-72 h Eritrocitos frescos Escasos fibroblatos (fusiformes) en la interfase Solo fibrina 4-5 días Comienzan a romperse los eritrocitos Capa de fibroblastos de 2-5 células Células fusiformes ocasionales entre fibrina 5-10 días Eritrocitos en islotes, Los fibroblastos pueden extenderse dentro del coágulo Formación capilar temprana Capa de fibroblastos de 3-14 células Pequeños capilares ocasionales Macrófagos cargados de pigmento. Capa con predominio de fibrina con algunos fibroblastos 10-20 días Quedan pocos eritrocitos La formación capilar continúa Capa de fibroblastos de 1/3 a 1/2 del espesor de la duramadre Capilares Macrófagos cargados de pigmento Membrana fibrobástica temprana evidente 3-4 semanas Casi licuado Membrana de espesor igual a la duramadre Macrófagos cargados de pigmento Membrana fibroblástica de ½ de espesor de la duramadre Ocasionales macrófagos cargados de pigmento 5 semanas Grandes capilares Membrana bien formada Membrana bien formada 1-3 meses Puede haber grandes capilares (gigantes) Puede haber hemorragia secundaria Hialinización de la membrana Hialinización de la membrana 3-6 meses Membrana hialinizada Membrana hialinizada Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 37 También puede observarse el infiltrado inflamatorio como en cualquier otra lesión. Así los PMN son observables a los 150 min, en regiones perivasculares, extendiéndose por todo el tejido pudiendo permanecer hasta un mes y medio. Los eritrocitos se hacen visibles en el tejido a las 20 horas y permanecen hasta 4 meses (Walter y cols, 2009). Desde el punto de vista morfológico las neuronas que sufren necrosis presentan una serie de cambios morfológicos: citoplasma eosinófilo, condensaciones nucleares, núcleo picnótico y por último cariorrexis (Kaya y cols, 1999). Todo ello como consecuencia de la condensación, fragmentación y destrucción del ADN. Todos estos productos de deshecho se eliminan en forma de acúmulos de lipofuscina, los cuales son fáciles de detectar mediante técnicas de tinción convencionales. Como es lógico la tinción será siempre mayor alrededor de la zona de contusión (región donde existen más células necróticas) y disminuirá conforme nos alejemos de este foco. Se hacen evidentes a las tres horas postraumatismo en la región penumbra y se hace mucho más visible a las 24 horas. La pérdida de neuronas tras un traumatismo se observa a partir de las 48 horas evidenciándose cada vez más hasta las 2 semanas. En la zona del impacto aparecen también eritrocitos y se observa un incremento del número de células gliales. La pérdida aparente de neuronas y el adelgazamiento de la capa interna del giro dentado homolateral al impacto, se hace evidente al mismo ritmo. Además, las células apoptóticas superan en número a las necróticas en el hipocampo, en especial en el cíngulo y la zona CA3, aunque no se conoce la causa de la predilección por esta zona de la apoptosis. También se ha demostrado que el córtex motor y el giro dentado son las zonas menos susceptibles al daño axonal difuso, y además no muestra predilección por ningunos de los hemisferios (el contundido o el contralateral), por eso se trata de un daño difuso. Todo esto explica ciertas características clínicas de los Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 38 traumatismos cráneo-encefálicos (amnesia y trastornos cognitivos). En cualquier caso, no cabe duda de que, gracias a la apoptosis, el daño generado por un traumatismo excede los límites de la zona directamente contundida. Las células apoptóticas presentan una morfología redondeada con condensaciones en su citoplasma conocidos como cuerpos apotóticos. También es característica la condensación de la cromatina en regiones marginales del núcleo (Tashlykov y cols, 2007). Estos hallazgos morfológicos no son evidentes hasta una semana tras el traumatismo, y perduran otra semana más, siendo la estirpe celular más afectada la neuronal (Kaya y cols, 1999). Los traumatismos dan lugar a pequeñas roturas del axón lo que provoca la entrada de calcio, proteasas y otras sustancias, que dan lugar a una pérdida de la integridad fisiológica del mismo. Este proceso es conocido como axotomía secundaria. Como resultado, el axón dañado sufre una serie de cambios morfológicos volviéndose cada vez más irregular, ondulado y grueso dando lugar a un aspecto arrosariado; y por último, cuando la desconexión axonal es total, se produce un aspecto de bulbo (bulbos de retracción). Este proceso no es inmediato, sino que conlleva una serie de procesos bioquímicos, cuyo estudio puede ser útil para determinar la cronología de un traumatismo (Dolinak y cols, 2006). El daño axonal se considera una consecuencia del traumatismo cráneoencefálico cerrado mortal. Ha sido demostrado 24 horas tras el traumatismo en el 90% de los casos con un pico de daño axonal entre 10 y 15 horas tras la producción de la lesión (Ohemichen y cols, 1998). El edema axonal y las varicosidades son probablemente reversibles mientras la estructura mitocondrial permanezca intacta. Las tinciones con hematoxilina-eosina y las técnicas argénticas permiten observar axones dañados a las 24, 15-18 horas respectivamente, tras el traumatismo (Orthobagyi y cols, 2007). Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 45 En muertes con un tiempo de supervivencia entre 12 h y 3 días, la PGFA comienza a disminuir en el hipocampo y en la sustancia blanca no afectada por el traumatismo en los casos que presentaban compresión por aumento de la presión intracraneal (PIC). En estos casos, el córtex intacto ya comienza a mostrar pérdida de masa neuronal. En casos de supervivencia prolongada (más de tres días) sin hemorragia subdural, se acentúan los cambios anteriormente descritos (Wang y cols, 2012). También se ha observado un comportamiento paralelo entre la expresión de la PGFA y los depósitos de hierro: ambos son claramente positivos una semana tras el traumatismo tanto en el tálamo como en la cápsula interna ipsilateral, con un patrón punteado; con la particularidad de que los depósitos de hierro tienen su origen en la degradación celular, mientras que la PGFA es signo de la activación de los astrocitos. Quizá este comportamiento paralelo se deba a que los depósitos de hierro originan inflamación crónica perpetuando las reacciones de gliosis (Onyszchuck y cols, 2009). En cualquier caso, no resulta extraña la presencia de astrocitos en estas regiones (hipocampo, tálamo basal y cuerpo calloso), dado que es ahí donde se producen de novo a partir de neuroblastos, pudiendo permanecer en ellas hasta 7 días tras un traumatismo (Bye y cols, 2011). 4.A.b.- VIMENTINA Es el mayor componente del citoesqueleto de la glía inmadura. En el tejido nervioso adulto es sustituida por la proteína glial fibrilar ácida (PGFA). Cuando se produce una lesión, los astrocitos maduros recuperan la capacidad de producirla de forma simultánea a la PGFA. Las células gliales del tejido sano no muestran reacción positiva a vimentina. Sin embargo, en contusiones corticales, la glía adyacente al foco de lesión expresa este marcador siendo visible a partir Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 46 de las 22 horas, resultando francamente positivo entre los 6 días y las 4 semanas. En modelos experimentales, se ha demostrado que la expresión de vimentina comienza en la sustancia blanca subcortical (de la zona contundida) y en el hipocampo. A los tres días se extiende a toda la sustancia blanca subcortical, incluyendo el cuerpo calloso y la cápsula externa. A los siete días persiste en el tálamo y en la cápsula interna, pero en este punto la expresión de esta proteína ha disminuido drásticamente en el córtex y en el hipocampo (Ekmark-Lewén y col. 2013). Janeczko K. (1993) observó la expresión simultánea de este marcador junto con la PGFA y sus resultados fueron que la coexpresión de estos marcadores era insignificante en las primeras 24 horas. A los dos días encontró un pico máximo de expresión de ambos marcadores, descendiendo gradualmente hasta el octavo día (punto en el que concluía su observación). En el segundo día el 67.2% de los astrocitos marcados con PGFA, resultaron también positivos a vimentina. Esta proporción disminuyó al 50,7% y 38,5% en el cuarto y octavo día respectivamente. Así mismo, sonstató una distribución geográfica de los astrocitos positivos a vimentina, siendo más próximos a la región lesionad, aquellos que sólo espresaban la vimentina, después los que expresaban los dos marcadores y por último, los más alejados de la lesión eran aquellos que sólo expresaban PGFA. 4.A.c.- ALFA-1-ANTIQUIMIOTRIPSINA Esta proteína constituye uno de los principales reactantes de fase aguda en procesos inflamatorios y degenerativos del sistema nervioso central, habiendo sido demostrado que su síntesis corre a cargo de los astrocitos, así como su presencia en las placas de -amiloide presentes en enfermedades como el Alzheimer o la corea de Huntinton. Resulta obvio que, en condiciones Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 47 normales no se produce reacción positiva a este marcador, comenzando a ser visible a partir de las 3 horas tras una lesión traumática, aunque no es hasta las 24 horas que se hace francamente positiva, perdurando hasta 13 días en las regiones perilesionales (Haussman y cols, 2001). 4.A.dPROTEOGLICANOS: CONDROITÍNSULFATO, QUERATÁNSULFATO Y DERMATÁNSULFATO: Los proteoglicanos son proteínas unidas a polisacáridos ácidos con múltiples funciones en todos los tejidos, pero en el SNC inhiben el crecimiento axonal y la regeneración celular y forman parte de la cicatriz tras un insulto tisular. En condiciones normales las células no expresan estas proteínas, pero tras un traumatismo se libera TGF-1 que induce la producción de bFGF por la microglía, el cual estimula la producción de TGF-1 en los astrocitos, cerrando así un círculo de retroalimentación positivo. La simple presencia de este factor no determina la producción de proteoglicanos, sino que es necesario que los astrocitos expresen un receptor específico (ErbB1), el cual no se expresa a no ser que haya existido un antecedente traumático. De este modo se ha demostrado la presencia de condroitínsulfato (CS) y queratánsulfato (KS) y de las enzimas que intervienen en su síntesis en células de la microglía 12 h después de que se haya determinado la existencia de TGFβ-1. En resumen, el TGF-1 favorece la actividad de la microglía para la formación de una cicatriz mediante la liberación de citoquinas y de CS y KS, lo cual activa a su vez al sistema mayor de histocompatibilidad tipo II (Yin y cols, 2009). El CS puede dar lugar a distintos proteoglicanos (dermatánsulfato, versicansulfato, neurocamsulfato, agrecansulfato y fosfocansulfato) variando la proteína central y sobre todo la longitud de las cadenas sulfatadas asociadas, lo que modifica su capacidad de adhesión y algunas de sus funciones. Estos Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 48 proteoglicanos se expresan principalmente en astrocitos, oligodendrocitos inmaduros y neuronas, si bien en condiciones normales su presencia se limita al espacio extracelular. El distinto comportamiento de los proteoglicanos se relaciona con los brotes axonales tras un traumatismo, es decir, algunos disminuyen la cicatriz y fomentan la regeneración celular así como la formación de sinapsis (Harris y cols, 2009). No obstante otros como el dermatánsulfato se expresan también por el estímulo del TGFβ-1 sobre los fibroblastos de las meninges, favoreciendo la formación de la cicatriz fibrosa, dado que el dermatánsulfato fija el colágeno (Li, 2013). Todos los proteoglicanos disminuyen a partir de las 24 horas hasta el 7º día tras el traumatismo permaneciendo sus niveles bajos durante dos semanas en el córtex. En la sustancia blanca subyacente aumenta a los 7 días a cargo de los astrocitos. No se han observado cambios en el hemisferio contralateral. El único que presenta un patrón de comportamiento distinto es el agrecánsulfato aumentando entre las primeras 24 horas y los 14 días, pudiendo deberse este aumento a una mayor producción o bien a la pérdida del tejido en el córtex, lo que daría lugar a una aumento relativo de su densidad (Harris y cols, 2009). 4.B.- MACRÓFAGOS Y MICROGLÍA Con microscopía convencional los macrófagos son visibles a los 3 días abundantemente en el tejido contundido, alrededor de los axones dañados y grandes vasos sanguíneos, así como en tejido dañado no adyacente a los vasos sanguíneos (Uryu y cols, 2007). En el SNC, tras un traumatismo, la microglía activada y los macrofágos tienen como función la eliminación del material necrótico, aunque también secretan factores de crecimiento para la regeneración tisular, si bien, dependiendo de las moléculas quimiotácticas liberadas, pueden tener efectos Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 49 destructivos. Tanto los macrófagos como la microglía cambian su morfología, expresan proteínas de membrana y citoquinas que pueden contribuir a la inflamación, la pérdida de tejido y la formación de una cicatriz glial (Perry y cols, 2010). Cuando se produce una lesión, la microglía entra en un estado de equilibrio dinámico entre la activación clásica y la alternativa, dando lugar a procesos celulares contradictorios. Señales muy discretas en el microambiente, inducen la activación clásica de la microglía cuya principal misión es la fagocitosis, lo que conduce a una mayor pérdida de masa neuronal. La activación alternativa promueve la neuroplasticidad, la regeneración axonal y la formación de nuevas sinapsis. Morfológicamente la microglía activada muestra citoplasma más amplio, procesos más numerosos, más ramificados y más gruesos. Si bien esta morfología va normalizándose a partir de la primera semana, no así los marcadores que demuestran esa activación (TNF y CD 45 para la activación clásica; TGF1 y TGFRII para la desactivación adquirida y arginasa 1 para la activación alternativa), los cuales pueden permanecer durante meses (Cao y cols, 2012). Los macrófagos también son sensibles a cambios en el microambiente, por lo que sus fenotipos vendrán determinados por las restantes células inflamatorias vecinas, así como por el tiempo transcurrido desde el traumatismo. Así, los macrófagos M1 se activan por la vía clásica gracias a los lipopolisacáridos y el interferón γ, y producen citoquinas proinflamatorias, como TNF. El fenotipo M2 es activado por la IL-4 e IL-13 y presentan funciones reparadoras y regeneradoras del SNC. Su comportamiento y distribución son similares a las de la microglía tas un TCE (Turtzo y cols, 2014). Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 50 4.B.a.- INTERLEUKINA 1 En el caso del Sistema Nervioso Central es secretada por la microglía y los astrocitos. También es expresada por mononucleares, macrófagos y células endoteliales. Las funciones de este mediador en casos de lesión del tejido nervioso consisten en estimular el crecimiento y diferenciación de los astrocitos; estimular la producción en estos últimos del óxido nítrico, otras interleukinas y factores de estimulación del crecimiento de distintas estirpes celulares, rescatar neuronas en las primeras fases de la inflamación; favorecer la diferenciación neuronal y activar intracerebralmente a los linfocitos T. También presenta un mecanismo de retroalimentación positivo sobre sí misma. (Yan y cols, 1992). En el foco de lesión actúa principalmente sobre la microglía, mientras que a distancia (daño axonal difuso) lo hace sobre neuronas y astrocitos. Es detectable a las pocas horas tras el traumatismo pudiendo perdurar durante meses a cargo del daño secundario. La microglía activada produce IL-1, por lo que también sería un buen marcador de inflamación y por tanto de daño axonal (Gentleman y cols, 2004). De hecho, el grado de activación de la microglía que, en último término depende de la severidad del traumatismo o de las circunstancias isquémicas, puede ser determinado mediante la concentración de marcadores como la IL-1, y el TNF- , los cuales presentan distintas funciones dependiendo del grado de activación, actuando a veces como proinflamatorios y en otras ocasiones como elementos reparadores y estimuladores del trofismo celular. Estos grados de activación dependen de los mediadores celulares liberados por las neuronas dañadas y su concentración (Lai y cols, 2008). Además, se ha demostrado que el tipo de traumatismo determina la cantidad de genes inflamatorios que se expresan. Así, el producido por chorro a presión moviliza 6,5 veces más genes proinflamatorios que el causado por contusión directa (Redel y cols, 2013). Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 51 En los casos de gran activación, que es cuando resultan proinflamatorios, estimula la liberación de moléculas de oxígeno y de nitrógeno reactivas, aumenta los niveles de glutamato hasta rangos tóxicos, dificulta la retirada de potasio por parte de las células de la glía y compromete la integridad de la barrera hematoencefálica, atrayendo más inflamación hacia el cerebro (Atkins y cols, 2007). Dada su implicación en los procesos inflamatorios encefálicos, también puede ser útil para datar casos de traumatismo cráneo-encefálico (TCE), aunque su presencia no exclusiva de esta causa de inflamación neuronal. Se ha demostrado que la producción de IL-1 precede a la producción de IL-6 (Folkersma y cols, 2008) siendo detectable a partir de las 6 horas tras el traumatismo (Harting y cols, 2008; Folkersma y cols, 2008), si bien algunos autores hablan incluso de un periodo de 4 horas (Knoblach y cols, 2000). IL-1 se mantiene positiva hasta las 24 h, momento a partir del cual comienza a disminuir su expresión desapareciendo entre el tercer y quinto día (Knoblach y cols, 2000; Holmin y cols, 2004). En el área de “penumbra” alrededor de la zona contundida, donde las ILs tienen una función paracrina (Holmin y cols, 2004), la expresión sigue una cronología similar pero con menor intensidad, no detectándose en regiones control alejadas del foco de contusión (Harting y cols, 2008). Este patrón muestra una correlación con la clínica inicial: un paciente que ingrese con un Glasgow bajo y que sobreviva poco tiempo, es decir, que presente un traumatismo severo, presentará en el estudio postmórtem una mayor concentración de ILs (Holmin y cols, 2004; Chiaretti y cols, 2005). Yan y cols (1992) refieren una cronología más rápida, la IL-1 y su receptor, además de la IL-6 son positivos a las 2 horas, presentan un pico máximo a las 4 horas y desaparecen totalmente a las 24 horas. También se observaron diferencias en los patrones de distribución, dependiendo de la forma Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 52 de provocar la lesión (chorro a presión, contusión directa, rafia de alguna estructura concreta del SNC, etc). De forma más concreta, se ha estudiado la expresión de su subunidad beta (la cual tiene mayores implicaciones inflamatorias) y su receptor específico. Ambos se hacen visibles a las 6 horas de supervivencia, permaneciendo positivas hasta los 7 días, sólo que la IL-1 se expresa en microglía y macrófagos junto al hematoma y en regiones contralaterales al traumatismo y el IL-1ra se expresa en los astrocitos de la zona lesionada y de forma diferida (a los 3 días) en astrocitos de la región contralateral. También se puede tener en cuenta la actividad de su enzima convertidor (ICE), la cual comienza poco después de observarse la presencia de IL-1 y desaparece a los 7 días de supervivencia (Wasserman y cols, 2007). Otros autores estudiaron estos mismos marcadores, pero en vez de emplear técnicas de tinción, emplearon el estudio de las concentraciones en microdializados neuronales, obteniendo resultados positivos incluso antes de la primera hora de supervivencia y un pico máximo de dos días, descendiendo su concentración hasta el 5º día (Fassbender y cols, 2000). Con esta técnica se han observado diferencias entre sexos en la expresión de esta IL-1 e IL-6 (con una mayor expresividad en mujeres) y también según las consecuencias del traumatismo apreciándose mayor concentración en casos con hemorragia subaracnoidea. En cualquier caso la IL-1 y la IL-6, al ser citoquinas proinflamatorias se relacionan con un peor pronóstico que la presencia de IL10, la cual inhibe la actividad de los linfocitos B y T, así como la de las células presentadoras de antígenos, y es frecuente encontrarla en casos de hemorragia subaracnoidea en mayor concentración que la IL-1 (Mellegard y cols, 2011). Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 53 4.B.b.- INTERLEUKINA 6 La interleukina 6 es sintetizada y secretada por la microglía y, en menor medida, por los astrocitos. Entre sus funciones se encuentran estimular la producción del NGF (neural growth factor), y proteger de la acción estresante del glutamato y del estrés oxidativo. También promueve la neovascularización y la quimiotaxis por lo que constituye uno de los más importantes reactantes de fase aguda (Krady y cols, 2008). Entre sus efectos se encuentra el aumento de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica y la quimiotaxis de células inmunológicas en el SNC (Chiaretti y cols, 2005). Se ha demostrado que la IL-6 aparece poco después de la secreción de IL-1 (retroalimentación positiva) y a su vez estimula la secreción de otros mediadores celulares tales como TNF- y COX-2 (Krady y cols, 2008). Su patrón cronológico es similar al de la IL-1 detectándose a partir de 6h de supervivencia, permaneciendo a lo largo de las primeras 24h y desapareciendo totalmente entre los 3 y los 5 días (Wasserman y cols, 2007; Holmin y cols, 2004). Estudios más recientes sin embargo, demuestran su expresión en la primera hora y su pico máximo a las 2-8 horas en el foco de lesión. En regiones de daño secundario se ha demostrado a las 2 horas manteniéndose durante dos semanas (Krady y cols, 2008). El estudio del ARNm de la IL-6 en casos de daño axonal difuso tras un traumatismo directo, demuestra dos áreas de mayor expresión, que son el hipocampo y el giro dentado (posiblemente por mayor sensibilidad de estas regiones a la hipoxia secundaria). También se observa una mayor expresión de este ARNm en las regiones de hemorragia, pero probablemente, en estas zonas sea de origen macrofágico (Rhodes y cols, 2002). Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 54 4.B.c.-. TNF- El TNF- al igual que la IL-6 es sintetizado y secretado principalmente por las células de la microglía, pero también por los astrocitos. Se encarga de aumentar la permeabilidad endotelial y la expresión de moléculas de adhesión permitiendo el paso de monocitos, neutrófilos y linfocitos al córtex cerebral. Estimula la producción de otras citoquinas y factores de estimulación de crecimiento celular en los astrocitos, inhibiendo el recambio de los mismos y la regeneración celular. Induce la apoptosis en oligodendrocitos e induce la desmielinización. Sin embargo, en las neuronas favorecen la axonogénesis, aunque su función proapoptótica o regeneradora depende de las condiciones y la presencia de otras citokinas, todo lo cual vendrá determinado por la severidad del traumatismo. En resumen, se trata de una citoquina pleiotópica que transduce señales de supervivencia o muerte tras cualquier daño agudo en el SNC como infecciones, neurodegeneración, neurotóxicos, etc (Kita y cols, 2000; Oshima y cols, 2009). El TNF- se relaciona directamente con la presencia de IL-1 e IL-6 con un patrón de distribución y cronología similares, pero en unas concentraciones sensiblemente menores que las de estas interleukinas (Wasserman y cols, 2007). También se ha estudiado su expresión cronológica en distintos tipos celulares. Así, aunque en condiciones experimentales (mediante traumatismo por chorro a presión), su concentración mediante ELISA no se demuestra hasta la primera hora; mediante inmunohistoquímica, se observa en la microglía (sobre todo en el cuerpo calloso y en el tallo cerebral) a partir de los 30 minutos postimpacto. Al cabo de una hora se observa inmunoreactividad en microglía, astrocitos perivasculares y oligdendrocitos de la zona del impacto, en el cuerpo calloso y en el tallo cerebral. Su pico máximo se alcanza entre las 3 y las 6 h y persiste hasta las 24 h (Kita y cols, 2000). Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 61 cualquier causa de exitus) pueden producir reacciones inflamatorias en el espacio subaracnoideo y perivascular, pero sólo los traumatismos hacen que aparezcan infiltrados en el parénquima. (Hausman y cols, 1999). 5.- MARCADORES DE LESIÓN NEURONAL Mediante técnicas inmunohistoquímicas se hace evidente que las primeras células afectadas son las neuronas tanto por el traumatismo, como por el daño axonal difuso, ya que los primeros cambios morfológicos como la ondulación de axones (observable a los 30 min) y los axones elongados (visibles a los 60-120 min) se hacen evidentes mucho antes que la astrogliosis (Tashykov, 2007). 5.A.- NCAM La molécula de adhesión celular neuronal (NCAM) es una proteína de membrana que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas. Entre ellas la NCAM 180 se expresa sólo en neuronas, la NCAM 140 tanto en neuronas como en glía y la NCAM 120 sólo en glía. La restitución del tejido nervioso tras una lesión necesita la generación, supervivencia y migración de nuevas neuronas provenientes de los nichos postnatales. La NCAM es necesaria en todo este proceso para garantizar la correcta diferenciación y migración celular. De hecho, en los estudios experimentales no se observan cambios en su expresión en zonas distantes a la contusión, es decir, no se relaciona con el daño axonal secundario, sino que tan sólo tiene que ver con el intento de regeneración del tejido nervioso y aún en estas circunstancias muestra un comportamiento diferente según la intensidad Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 62 del traumatismo. Así, cuando el traumatismo es de mayor intensidad, su expresión disminuye demostrando una menor posibilidad de recuperación funcional. En casos de traumatismo medio aumenta su expresión con un pico máximo a las 24h, desciende entre 24 y 48h y posteriormente asciende de forma gradual manteniéndose al menos 3 semanas después del traumatismo (Budinich, 2012). 5.B.- ENOLASA NEURONAL ESPECÍFICA La enolasa neuronal específica (NSE) es una forma característica de la enzima glicolítica enolasa presente en las neuronas, siendo una de las proteínas más abundantes del tejido nervioso. Se localiza en cuerpos neuronales y sus prolongaciones pero no en células de la glía (Ogata y cols, 2007). El acúmulo de proteínas en axones dañados se produce por una alteración de su citoesqueleto y del transporte neuronal, por aumento de la entrada de calcio dentro de la neurona. El β-APP tiene un transporte rápido por lo que en caso de lesión, se acumula también a gran velocidad. La enolasa tiene un transporte más lento pero su abundancia hace que se acumule en niveles similares al -APP. En comparación con tinciones más o menos convencionales como el azul rápido de luxol para la mielina que permite detectar axones dañados a los dos días tras un traumatismo, la inmunohistoquímica para enolasa neuronal específica permite observar axones dañados con una supervivencia mínima de 1,5 a 3,5 horas (aunque otros autores la detectan incluso en tiempos inferiores a 1 hora (Tashykov y cols, 2007). El patrón de distribución y el tiempo mínimo de positividad es idéntico al del -APP, tal y como muestra la siguiente tabla (Ogata y cols, 1999): Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 63 Comparación de los hallazgos histológicos de los axones y la mielina del cuerpo calloso con distintas técnicas (Ogata y cols, 1999) Caso Supervivencia Tinción argéntica LFB Enolasa -APP Axones retraídos Axones varicosos Mielina globoide Bulbos axonales Bulbos axonales 1 80 dias + + + ++ ++ 2 80 dias - - + - - 3 7 días + + + ++ ++ 4 3 días + + - ++ ++ 5 2días + + ++ ++ ++ 6 17 horas - + ++ ++ + 7 9 horas - + ++ ++ ++ 8 9 horas - + ++ ++ ++ 9 9 horas - + + + + 10 8,5 horas - + ++ ++ ++ 11 5 horas - + ++ ++ ++ 12 3,5 horas - - ++ ++ ++ 13 1,5 horas - - ++ ++ ++ 14 1,5 horas - - ++ ++ ++ 15 Muy corto - - + + - 16 Muy corto - - - - No test 17 Muy corto - - + + - 18 Muy corto - - + + + 19 Muy corto - - - - No test Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 64 6.- MARCADORES BIOLÓGICOS DE DAÑO AXONAL DIFUSO 6.A.- PROTEÍNA PRECURSORA DEL BETA-AMILOIDE (-APP) El -APP es una glicoproteína de membrana y un constituyente normal de la neurona. Sus funciones no están del todo descritas pero parece intervenir en la adhesión y crecimiento celular en respuesta a los traumatismos. Se transporta por transporte axonal rápido anterógrado y se acumula tras la alteración del citoesqueleto axonal (Mckenzie y cols, 1996; Itoh y cols, 2009). Así, se ha demostrado en el soma neuronal de la zona contundida una vez que se ha producido la lesión axonal. En estudios forenses, la presencia de bulbos axonales no se observa en supervivencias menores de 6 h, momento en el que también se produce el acúmulo de -APP y NF en el soma (Bisht, 2013). Lejos de la zona traumatizada, a partir del 3-7 días post-trauma se observan axones varicosos y edematosos (mediante anticuerpos anti APP y NF) disminuyendo su número a partir de los 6 meses. Sin embargo, β-APP se ha demostrado a las 3 horas tras la lesión (antes de que aparezcan alteraciones morfológicas del axón), y a los 6 meses permanece positivo en el parénquima y junto a los vasos (Uryu y cols, 2007). Las primeras regiones donde se detecta son el tracto parasagital y las estructuras de la línea media encefálica, incluyendo la parte caudal del cuerpo calloso, pero no en las cápsulas interna y externa (Li y cols, 2013). Otros autores, lo detectan a las primeras 24 h postraumatismo en neuronas edematosas y con distrofia de sus fibras (Itoh y cols, 2009). En casos de traumatismos leves se observa un comportamiento temporal del -APP característico: es positivo entre 1,5 horas y 3 horas tras la producción de la lesión, pero después el número de axones que expresan esta proteína aumenta hasta alcanzar su pico máximo a las 10-15 horas, estabilizándose tras este momento (McKenzie y cols, 1996). Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 65 Además se demostró inmunoreactividad para todos los mediadores y marcadores de la lisis de -APP (BACE, PS-1, CCA, Caspasa 3) y kinesina en las contusiones persistiendo hasta 6 meses. De hecho, su expresión en los axones dañados es anterior a la del -APP Estos precursores se demostraron en un número limitado de neuronas de córtex, hipocampo, cerebelo y en células de la glía en la sustancia blanca a los 3 y 7 días y 6 meses (Uryu y cols, 2007). Los axones dañados son una fuente de -amiloide tras un trauma encefálico. Se cree que la acumulación conjunta de BACE, PS-1, caspasa 3 activada y CCA con -APP en los axones dañados, es debida a un único mecanismo de producción de beta amiloide, secundario a la alteración de la permeabilidad de la membrana que daría lugar a su acumulación patológica (Chen y cols, 2004). Mecanismo de formación de placas de β-amiloide (Chen y cols, 2004) DAD Interrupción aguda y crónica del transporte axonal Acumulación de BACE, PS-1 y caspasas Formación de -amiloide en el compartimento intramembrana Liberación de -amiloide desde los axones Formación de placas de -amiloide y toxicidad Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 66 Este proceso se observa de forma clara a las 24 horas, presenta una meseta de actividad a los 10-14 días, a partir de los cuales comienza a disminuir. Mediante inmunohistoquímica los primeros cambios en el tránsito del -APP (en axones edematosos) se demostraron a los 30 minutos y duran hasta semanas. Se puede considerar positivo a la primera hora, y no solo en la zona contundida, sino también en zonas lejanas al punto de impacto. El pico máximo se produce a las 48 horas y continúa hasta dos semanas en la sustancia blanca bilateral, hipocampo y córtex. En el tallo cerebral permanece durante una semana (Pierce y cols, 1996; Ekmark-Lewén y cols, 2013). Este marcador no sólo se observa en neuronas. Se ha observado su presencia en astrocitos (marcados mediante MAP-2) y también, aunque en menor cantidad, en microglía (marcada con CD11b) cuando su presencia en neuronas comienza a disminuir. Sin embargo, dicha expresión se interpretó que es secundaria a la fagocitosis de axones y no debida a que las células inmunes lo expresen por sí mismas (Itoh y cols, 2009). Es importante señalar que el DAI no es específico del traumatismo craneoencefálico, sino del daño axonal de distintas causas como hipoxia, alteraciones metabólicas y todas aquellas circunstancias en las que existan edema y/o aumento de la presión intracraneal. Por ello, algunos autores (Graham y cols, 2004; Ortobágyi y cols, 2007) han intentado encontrar características que permitan diferenciar las distintas causas. El patrón de distribución de β-APP puede resultar útil para evitar falsos positivos, etiquetando de traumática una muerte. Así podemos encontrar tres grandes patrones de distribución: - Patrón difuso multifocal: representan edemas axonales en la región traumatizada, y a distancia por lesiones de contragolpe y por el edema cerebral en traumatismos craneales severos. Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 67 - Patrón en zig-zag o Z: se produce en regiones perivasculares limítrofes a una región de isquemia o infarto. - Patrón mixto: Son grupos de axones con trauma difuso y otras zonas en Z por la hipoxia secundaria al aumento de la presión intracraneal (típica de alteraciones metabólicas y crisis convulsivas). Estos patrones se encuentran sobre todo en las estructuras de la línea media encefálica, especialmente en el cuerpo calloso y en el puente, aunque pueden observarse también en el córtex. En los casos de hipoxia/isquemia y en aquellos en los que se produce una muerte cerebral aislada los resultados son similares. Es decir, el daño axonal difuso es un mecanismo vital que necesita mecanismos bioquímicos que consumen energía. No son específicos de un solo agente causal, si no que constituye una respuesta del tejido cerebral a cualquier agente de estrés de cierta entidad. Esto no nos sorprende teniendo en cuenta el mecanismo molecular que provoca el acúmulo de -APP. La alteración del citoesqueleto por proteólisis junto con la alteración de las kinasas y las fosfatasas, aumenta la permeabilidad de la membrana; ésta altera el flujo de calcio y la actividad de la calmodulina y altera el transporte axonal debido a la desestructuración y colapso del citoesqueleto por la compactación de los neurofilamentos, la pérdida de los microtúbulos y la fragmentación de la espectrina. Como consecuencia los materiales transportados se acumulan en lugares de máximo daño axonal y los axones sufren una axonotomía secundaria. (Oehmichem y cols, 1998; Kelley y cols, 2006). En este sentido, los estudios de Staal y cols, demuestran el paralelismo entre el acúmulo de calcio en la célula y la aparición del -APP, ya que demostraron que su concentración en los axones aumentaba de forma significativa a las 2 h siguientes tras el traumatismo, presentaba un pico máximo a las 24 h y vuelve a niveles normales a las 48 h posttrauma (Staal y cols, 2010). Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 68 La hipoxia per se no es causa de daño axonal, sino que lo produce de forma secundaria a complicaciones vasculares causadas por el aumento de la presión intracraneal y la herniación del cerebro. Dado que el transporte de - APP es activo (proceso dependiente de energía), es razonable asumir que se acumula en casos de compromiso metabólico grave tales como hipoglucemia, hipoxia global, infección y/o edema cerebral (Ortobágyi y cols, 2007). De este modo, el estudio de la -APP permite diagnosticar la existencia de aumento de la presión intracraneal (incluso cuando sus niveles no han sido tan elevados como para causar herniaciones). El último matiz del diagnóstico, sería el origen de la hipoxia (cardiaco, intoxicación por CO o epilepsia), o de la alteración metabólica (hipo o hiperglucemia), el cual puede ser determinado por los antecedentes clínicos del sujeto (Reichard y cols, 2005). De forma generalizada se acepta que en los casos de daño traumático (a partir de un año de edad), el daño axonal difuso no se puede detectar antes de las 1,5 post-traumatismo (Oehmichen y cols, 1998). Existe correlación entre la positividad para -APP y el tiempo transcurrido entre el traumatismo y la muerte. No se detecta reactividad significativa de esta proteína por debajo de los 30 minutos ya se produzca la muerte por un traumatismo o por otras causas. En cualquier caso se debe ser cauto para no sobreinterpretar las positividades al -APP sin otras características sugerentes del traumatismo, como por ejemplo hemorragias en el tallo cerebral y/o en el cuerpo calloso. Además el intervalo de tiempo en el que podemos detectar la inmunohistoquímica disminuye conforme mayor es la severidad del traumatismo (Ortobágyi y cols, 2007). Según estos autores, y siempre en casos en los que se haya demostrado el traumatismo, podemos establecer su severidad según la expresividad de esta proteína: son los grados de DAI (daño axonal difuso) de Adams: Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 69 I: No existe evidencia visible morfológica de daño axonal pero se observa un patrón difuso de tinción de -APP. II: Se observan hemorragias intraparenquimatosas en el cuerpo calloso y un patrón difuso de -APP III: Hemorragias en cuerpo calloso, en cara dorsal del tallo cerebral y tinción difusa de -APP (Omalu, 2004). Esta clasificación, aunque simple, es útil en casos en los que estemos seguros del antecedente traumático, pero se puede afinar más la severidad del daño axonal, comparando patrones de tinción en casos con un tiempo de supervivencia similar. Así en estudios de casos de corta supervivencia (no superior a 2 horas) se describen distintos grados de tinción en relación a la severidad del traumatismo (Onyszchuk y cols, 2009): 0.- No tinción 1.- Tinción de somas neuronales 2.- Leve tinción axonal 3.- Tinción de axones arrosariados 4.- Tinción de axones edematosos 5.- Tinción de esferoides 6.- Tinción muy abundante de esferoides En los tres primeros grados, la expresión puede ser muy débil y su origen puede ser isquémico. El tiempo de supervivencia determina la evolución del daño axonal, y por tanto, el grado de tinción, siendo casi imposible detectar más de un grado 2 en casos con una supervivencia inferior a 35 minutos. La tinción positiva a -APP debe ser interpretada con cautela: en estudios realizados sobre casos con escasa supervivencia, sólo se apreció presencia de esta proteína en 1% de los casos y en todos ellos había historia de isquemia y/o Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 70 edema cerebral. En resumen, la positividad a -APP no es dato inequívoco de traumatismo, pero sí de daño axonal, por lo que en ningún caso debe ignorarse, sino más bien interpretarse dentro de un contexto clínico y forense concreto (Morrison y cols, 2008). Es importante la realización de un muestreo amplio, observando simultáneamente otros cambios morfológicos que sugieran un origen isquémico, tales como la mayor afectación de la zona C1 del hipocampo (que es la región del encéfalo más vulnerable a la hipoxia), la destrucción de neuronas y su eosinofilia (por necrosis) entre las 2 y 5 horas tras el incidente y constatar la existencia de la proteína asociada a microtúbulos-2, (la cual desaparece en casos de TCE severo). También son observables pequeñas hemorragias en especial en zonas paracentrales y zonas anteriores del lóbulo frontal y temporal (Ogata, 2007). Por todo ello, no se puede hacer el diagnóstico de daño axonal difuso con un solo bloque tisular con reactividad para -APP; son necesarios, al menos, 6 bloques para llegar al diagnóstico (y deben abarcar los dos hemisferios), es decir, para diagnosticar un traumatismo mediante la observación de daño axonal difuso por positividad a -APP, es necesario contar con la historia clínica previa y un muestreo adecuado y suficiente de bloques tisulares. (Smith y cols, 2003). Estos grados pueden relacionarse cronológicamente con la morfología de los axones, a medida que van desestructurándose. Kelley y cols (2006) estudiaron cómo se altera el trasporte axonal, observando el comportamiento del -APP en el núcleo talámico (que es la estructura más sensible a la hipoxia y por tanto, al daño axonal secundario) tras producir una lesión por axotomía: - A los 15 minutos observan inmunoreactividad para esta proteína en el núcleo talámico, en axones que presentan un ligero aumento de su Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 77 granular y edema obvio a las 72 h. Todo este proceso termina con la lesión axonal (Ronchao y cols, 2012). Cuando el axón ya se ha roto y se forma el bulbo axonal, éste consiste en una esfera cuya parte externa está compuesta por precursor del beta amiloide y un núcleo central de NF, por lo que en casos de una supervivencia suficiente, este último marcador puede ser más útil para determinar la extensión del daño axonal difuso (Li y cols, 2013). La compactación de neurofilamentos se hace patente mediante el anticuerpo anti-neurofilamentos RM014 el cual se hace patente con distinta cronología en las distintas regiones del encéfalo: Cuerpo calloso Cíngulo Sustancia blanca Córtex 6 h RM014 – (APP+) RM014+ con edema y elongación de axones (APP +) RM014- (APP+) RM014+ (APP-) 24 h RM014+ (APP+) RM014+ (APP+) RM014+ (APP-) RM014+ Con edema y elongación de axones (APP-) 72 h RM014+ con patrón puntiforme y extenso de degneración axonal. (APP-) RM014 en descenso (APP-) RM014 en descenso (APP-) RM014- (APP-) Cronología de la expresión del Ac RM-014 (DiLeonardi y cols, 2009). Este proceso tiene lugar en axones distintos a los que presentan positividad para el APP, ya que éste marcador presenta una cronología y ubicación distintas (DiLeonardi y cols, 2009). Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 78 En cualquier caso, no es posible detectar ovillos de neurofilamentos antes de las 6 horas de supervivencia dado que mecanismo de transporte es lento. 6.C.b.- MICROTÚBULOS La proteína asociada a los microtúbulos (MAP-2) tiene como función el ensamblaje de los microtúbulos durante la neurogénesis y en la neurona adulta estabiliza los microtúbulos uniéndolos entre sí. Esta proteína es detectable en las neuronas a las 48 horas de un traumatismo en el hipocampo homolateral, sobre todo en regiones sensibles a hipoxia (Kubo y cols, 1998). En casos de TCE muy severo, estas proteínas no se detectan, quizás porque en estos casos también sufran degradación (Ogata, 2007). En las regiones de contusión directa se observa una disminución de la MAP-2 al mismo tiempo que la destrucción del núcleo de la célula (Rhodes y cols, 2002), es decir, puede ser un marcador de destrucción neuronal en la región directa de contusión y de regeneración en casos de daño difuso. Las Tau son proteínas microtubulares que abundan en las neuronas, siendo mucho menos frecuentes fuera del sistema nervioso central. Su principal función es la estabilización de los microtúbulos axonales a través de la interacción con la tubulina. Sin embargo, cuando la cinesina se adhiere a las tiras de la proteína Tau, el motor tiende a desprenderse completamente del microtúbulo. De esta forma, la proteína Tau ayuda a regular el equilibrio del tráfico de células nerviosas, lo que puede explicar que las alteraciones de tau se asocien con las patologías neurodegenerativas. Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 79 La proteína α-Syn se encuentra principalmente en el tejido nervioso constituyendo el 1% de todas las proteínas citosólicas. Se expresa predominantemente en el córtex, el hipocampo, la sustancia negra, el tálamo y el cerebelo, sobre todo en neuronas, aunque también es posible encontrarla en células gliales. Es secretada en terminales presinápticos en determinados momentos de reagrupación de sinapsis. Interactúa con la tubulina y tiene una acción similar a la proteína Tau (Alim y cols, 2002) Ambas proteínas (Tau y Syn) no están presentes en casos control, mientras que se expresan en axones, y algunos cuerpos neuronales, en casos de traumatismos craneoencefálicos con una supervivencia superior o igual a 5 semanas. Es posible detectar la proteína Tau también en astrocitos aunque en menor medida que en neuronas (Uryu y cols, 2007). La SBDP 145 se observa sobre todo en axones dañados, pero también en algunos somas neuronales. Es posible objetivarla a partir de las 3 horas posteriores a un traumatismo en el córtex y la sustancia blanca, llegando incluso ligeramente a tálamo e hipocampo. El pico máximo de expresión se produce entre las 24 y 48 horas y a las 72 horas desaparece del córtex aunque permanece en tálamo e hipocampo (McGinn y cols, 2009). 7.- MARCADORES DE PROLIFERACIÓN CELULAR 7.A.- NESTINA Este es un marcador de precursores neuronales. Se ha demostrado la presencia de células positivas para nestina desde las 8h postraumatismo hasta las 48h, con un pico máximo a las 24 h, en las zonas donde se encuentran los precursores neuronales (principalmente en la región subventricular) y en el Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 80 córtex dañado (como consecuencia de la migración de dichos precursores activados) (Kaneko, 2012). 7.B.- BROMODESOXIURIDINA (BrdU) En caso de lesión del tejido encefálico, y en líneas generales, la inflamación comienza con la presencia de macrófagos provenientes del torrente sanguíneo que tratan de retirar los productos necróticos, posteriormente la microglía se activa en la zona adyacente a la lesión y por último los astrocitos reactivos forman una barrera perilesional hasta que rellenan el espacio desvitalizado para dar lugar a la correspondiente cicatriz. La bromodesoxiuridina es un análogo de la timidina que se incorpora al ADN de las células en proliferación (en este caso precursores de los oligodendrocitos, astrocitos, neuronas y microglía/macrófagos). Por supuesto, para diferenciar en concreto la estirpe celular es necesario marcarla con algún antígeno específico, es decir, es preciso realizar una doble tinción. En las primeras 24 horas en número de células positivas para BrdU es muy escasa. Al segundo y tercer día aumenta mucho alrededor de la región afectada llegando a su máximo al séptimo día. Se demostró que la estirpe celular que proliferaba eran oligodendrocitos (mediante proteoglicano del condroitin sulfato NG2), observándose que éstos mostraban un patrón similar a las células positivas para BrdU, por lo se interpretó que los precursores de los oligodendrocitos en proliferación son los que se encargaban del proceso de reparación tisular en este periodo. Sin embargo, el número de astrocitos (positivos para PGFA) marcados con BrdU es significativo a partir del día 14 y con una expresión mucho más difusa. Dado que las células precursoras de oligodendrocitos pueden diferenciarse tanto en oligodendrocitos como en Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 81 astrocitos, se demuestra así que estos precursores son los primeros en activarse ante un insulto tisular (Tatsumi y cols, 2005). Algunos autores (Rola, 2006) no encontraron neuronas positivas para BrdU en las zonas lesionadas. La inyección de BrdU a ratas en desarrollo demostró que al cabo de 1-3 semanas las neuronas son la estirpe celular más afectada tras un traumatismo, mientras que la microglía activada se encuentra aumentada tanto en el hemisferio contundido como en el contralateral (Rola, 2006). No obstante, existen estudios realizados sobre enfermedades neurodegenerativas que demuestran, mediante el marcaje con PGFA y βIIItubulina, la proliferación de neuronas y de células gliales en el estrato subpendimario (Curtis, 2003). Tal vez, ante los traumatismos cráneo encefálicos de larga evolución, y dado que éstos pueden inducir también la aparición de ciertas enfermedades neurodegenerativas, tales como el Alzheimer, se producen reacciones similares. La capacidad de regeneración neuronal es posible que dependa del tipo o severidad del traumatismo. En principio, no existen diferencias en la neurogénesis entre los controles y los individuos afectados por un traumatismo durante las primeras 8 semanas, pero si existen diferencias en cuanto a maduración y supervivencia neuronal entre los afectados por un traumatismo focal y los que presentaron daño difuso. Estas nuevas neuronas provienen de los neuroblastos presentes en las regiones subventriculares y giro dentado, si bien, la mayoría de estos precursores se diferencian en astrocitos. En cualquier caso, la supervivencia de estas nuevas células suele ser escasa (Bye y cols, 2011). Kernie y cols (2001) han demostrado el distinto comportamiento de la proliferación celular en el lugar del impacto y en el hemisferio no contundido. A los 60 días tras el impacto, en la región afectada, la mayoría de los precursores celulares se diferencias en astrocitos , dando lugar a la cicatriz glial; pero en áreas distantes se produce neurogénesis (cinco veces mayor que en los casos control). Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 82 Todo esto demuestra la puesta en marcha de la neoproliferación celular tras un traumatismo, en un intento de recuperación funcional cerbral, y además este proceso continúa mucho tiempo después del traumatismo . Existen otros marcadores de proliferación celular con los que se han obtenido datos más o menos similares en lo que a estirpe celular se refiere, pero que, en cualquier caso, demuestran la proliferación celular a partir de los precursones celulares de la región subventricular y de la zona subyacente al núcleo dentado; como por ejemplo el Ki-67 (Zheng y cols, 2013) 7.CDNA METILTRANSFERASA-1 Se trata de una enzima presente en condiciones normales en los astrocitos periventriculares, pero a los 4 días tras un traumatismo es posible observarla también en el citoplasma y el núcleo de las células perilesionales, aunque no aparece en el hemisferio contralateral. A partir del 7º día comienza a disminuir y a las dos semanas vuelve a niveles normales. Las células que la expresan son también positivas para nestina (marcador de presursores neuronales y astrocitarios) y para PGFA, de lo que se deduce que se trata de astrocitos activados que han emigrado a la región lesionada (Lundberg y cols, 2009). Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 83 8.- ESTUDIO DE LA APOPTOSIS 8.A.- TÉCNICAS MOLECULARES 8.A.a.- TÉCNICA TUNEL (ADN FRAGMENTADO) Mediante la técnica de TUNEL, las primeras células apoptóticas se detectan a los 45 minutos tras la lesión en la zona de contusión y continúan a las 2 semanas. El pico máximo se produce a las 24 horas y persisten hasta 22 semanas. De todas formas los modelos experimentales muestran variaciones según el traumatismo empleado: - Impacto cortical: Se detectan células apoptóticas a las 6 horas, 24 horas y 2 semanas - Impacto por objeto contundente: Se detectan células apoptóticas desde las 3 horas a 10 días - Percusión por fluido a presión: Pico máximo en el córtex dañado a las 24-48 horas postrauma con un decremento desde los 2 a los 14 días posteriores. Estas diferencias pueden deberse al comportamiento bifásico de la lesión: una primera lesión directa y un daño secundario por mecanismos como la isquemia o el edema cerebral (Raghupathi y cols, 2002; Hausman y cols, 2004). La intensidad del traumatismo (tal y como se verá al hablar de genes pro y antiapoptóticos) determina variabilidad en la cronología y distribución de las células positivas para esta técnica, Así, en casos de traumatismo de intensidad media, las células positivas con la técnica TUNEL son evidentes en la zona Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 84 lesionada en todo momento, aunque no aparecen ni en el córtex ni en el hipocampo contralaterales. El número de células positivas tiene un pico máximo a las 24 horas y desciende con el tiempo. La mayoría de estas células presentan una morfología necrótica, mientras que en zonas perilesionales, las células TUNEL positivas presentan morfología apoptótica, encontrando entre un 10 - 16% de estas células en cualquier tiempo post lesión. La mayoría de las células apotóticas eran neuronas, algunos mononucleares y escasísimos astrocitos en las primeras 48 horas. A los 4-10 días se aprecian neuronas positivas con la técnica TUNEL en la región perilesional y en el hipocampo (Wennersten y cols, 2003). Es importante tener en cuenta el factor del envejecimiento, es decir, a partir de cierta edad (80 años) se admite como fisiológico la presencia de un 2% de células apoptóticas, si bien dados los niveles de fragmentación observados en casos de traumatismo, y a efectos prácticos, podemos considerar que no existe relación entre la edad y la fragmentación del ADN (Dressler, 2007). 8.A.b.- HIBRIDACIÓN IN SITU Mediante esta técnica podemos observar el comportamiento de los genes pro y antiapoptóticos. En condiciones normales se encuentran en equilibrio, pero ante un traumatismo comienzan a expresarse todos ellos. La muerte celular programada se producirá dependiendo de cuáles de estos genes presenten una mayor expresión, y es el gen p53 quien determina este extremo. Así, se ha demostrado la inducción del ARNm del gen p53 en el córtex dañado a las 6 horas tras el traumatismo, a las 24 horas descienden sus niveles y desaparecen a los 3 días. En el hipocampo, los núcleos talámicos ipsilaterales siguen un patrón similar, si bien a las 24 horas ya ha desaparecido, siendo completamente negativo en los contralaterales. Las células que lo expresan son Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 85 sólo neuronas, quedando patente la mayor sensibilidad de la estirpe neuronal a la muerte celular programada (Napieralski y cols, 1999). Del mismo modo, se ha observado que en las mismas circunstancias, el ARNm del gen Bax presenta una amplia replicación a partir de las 2-3 horas tras un impacto de alta intensidad, prolongándose durante una semana (Tweedie y cols, 2007). Mediante esta técnica también podemos detectar ADN monocatenario, el cual puede ser un signo de apoptosis. En casos de isquemia y posterior reperfusión es detectable a los 60 segundos permaneciendo visible hasta 16 horas, pero en casos de traumatismos su expresión depende de la vulnerabilidad de la zona a estudiar; por ejemplo, en el núcleo pálido es detectable a los 30 minutos, mientras que en la sustancia negra no se observa hasta transcurridas 24 horas (Michiue y cols, 2008). Estas diferencias locales hacen que no resulte práctico su estudio para nuestro propósito. 8.B.- INMUNOHISTOQUÍMICA 8.B.a.- CASPASA 3 La caspasa 3 fragmenta una serie de proteínas que regulan la apotosis, la fragmentación del ADN y a integridad del citoesqueleto (actina, espectrina, proteinquinasasa ATP dependientes, laminina, etc). También tiene una función positiva o conservadora gracias a la escisión de la poli ADP ribosa polimerasa, lo que evita la depleción de energía celular (Robert y cols, 1999). El paso de pro-caspasa 3 a caspasa 3 activada depende en gran medida de la severidad del traumatismo y del tiempo transcurrido desde el mismo, detectándose niveles mínimos de caspasa 3 activada a las 8 y a las 72 horas tras Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 86 el impacto, especialmente en casos de traumatismo de baja intensidad. Estos valores mínimos coinciden con los de máxima expresión del gen proapoptótico Bax demostrados por hibridación in situ (Tweedie y cols, 2007). Estos resultados, complementan los obtenidos del estudio de la procaspasa 3, la cual presenta niveles altos de actividad a las 4 horas tras el impacto. Entre las 48 horas y los 4 días, se aprecia un pico máximo de su actividad, simultáneo con la máxima actividad de caspasa 3 activada. A partir del quinto día se hace evidente la disminución de la actividad de ambos marcadores (Cernak y cols, 2002). Otros estudios demuestran diferencias en el comportamiento temporal de esta enzima, según su expresión en los dos grandes grupos celulares que conforman el tejido nervioso (neuronas y glía). En las neuronas se demuestra caspasa 3 a partir de 80 minutos tras la lesión, manteniendo niveles altos durante 4 días, tras lo cual disminuye. En las células gliales comienza a detectarse a las 5 horas pero permanece hasta 18 días, en especial en las células de la microglía que parecen ser las más afectadas por la muerte celular programada. Estas diferencias entre la glía y las neuronas, especialmente a partir del 4º día, sugieren que el mecanismo apoptótico es diferente en las dos estirpes celulares y que la glía es más resistente a este proceso sobreviviendo más tiempo. (Dessler y cols, 2007; 2009). También se ha demostrado que previamente a la activación de la cascada apoptótica, el tejido nervioso presenta un intento de neuroregeneración. Sin embargo, este intento es insuficiente en casos de TCE con clínica evidente, y la cascada apoptótica y la necrosis conducen a las consecuencias neurológicas ya conocidas (Kaneko 2012). Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 93 llegar a la caspasa 3. Todo esto tiene lugar cuando la lesión del ADN es irreparable y por tanto letal. En cambio, si se fosforila en las serinas 15 y 20 cuando aún está en el núcleo, se estabiliza y da lugar al arresto del ciclo celular permitiendo la reparación del ADN y por tanto, la supervivencia de la célula. Este proceso requiere gasto enérgetico, es decir, ATP. En circunstancias en las que no exista ATP, se pondría en marcha la vía extrínseca: la pro-caspasa 8 es capaz de activarse por sí misma y de esta forma comenzaría la cascada hasta la caspasa 3. (Cahill y cols, 2006). En casos de traumatismo medio, el p53 presenta un pico máximo de expresión a las 10 horas mientras que en circunstancias experimentales en las que la lesión cortical se produce por inyección de chorro a presión, presenta un pico máximo a las 48 horas, lo que confirma que el tipo de traumatismo así como su intensidad, determina que las señales que provocaran la muerte celular sean de un tipo o de otro e incluso si estas mismas van a determinar o no la muerte celular. En traumatismos de mayor intensidad, el gen p53 es demostrable incluso en las 2 horas posteriores, presentando un pico máximo a las 24-48 horas y permaneciendo visible hasta una semana. Una vez más se confirma que el equilibrio entre apoptosis y regeneración celular vendrá determinado por la severidad del traumatismo (Kaya y cols, 1999). El gen p53 no sólo activa genes de la familia Bcl-2 sino que también se relaciona con genes que controlan la reducción y oxidación mediante especies reativas del oxígeno, lo cual sugiere que pueden existir otras vías de muerte celular (Napieralski y cols, 1999). La ablación experimental del córtex occipital, induce la activación de mecanismos apoptóticos mediante la detección del p53 en las neuronas. Se hace obvio al 4º día post-lesión, presenta un pico máximo al 5º día y al 6º día se Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 94 extiende a la glía de la lesión y a las neuronas del núcleo dentado contralateral a la lesión. La actividad de las caspasas se comporta de una forma paralela no hallándose cambios significativos el primer día entre los niveles de pro-caspasa3 y caspasa 3 activada. Al 4º día están elevadas las dos y al 5º día se aprecia el pico máximo de caspasa3 mientras que los niveles de pro-caspasa vuelven a los límites basales. Los picos máximos de actividad apoptótica coinciden con la fase de cromatolisis del núcleo, estableciendo así la relación causa-efecto entre la activación de estos genes con el comienzo de la muerte celular. Del mismo modo, también se ha demostrado que la muerte celular programada no puede ocurrir sin gen Bax, ya que en sujetos en los que dicho gen ha sido suprimido, aunque se activa el p53 no se produce apoptosis (Martin y cols, 2003). 8.B.f.- Fas (CD95) y FasL (CD95L) Fas es una proteína de superficie de 36 kDa con un dominio citoplasmático de "muerte celular" conservado. El ligando Fas (FasL o Apo-1) es una proteína de membrana tipo II de 40 kDa miembro de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF). Como se especificó antes, la vía extrínseca de la apoptosis se desencadena tras la unión de ligandos a receptores de apoptosis presentes en la superficie. Uno de estos receptores es Fas (CD95) y su ligando, FasL. Este ligando (FasL) se une a Fas en la misma célula o células adyacentes, formándose grupos de tres o más moléculas de Fas. A causa de esta agregación, los dominios intracelulares de estos receptores agrupados por Fas se unen a una proteína adaptadora que contiene un dominio citosólico (FADD), que determina la muerte celular fijándose a la forma inactiva de la caspasa-8 la cual experimenta una autoactivación catalítica y activa otras caspasas efectoras desencadenando la apoptosis. Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 95 El equilibrio entre la expresión del Fas y FasL y sus formas solubles o de membrana es crucial para iniciar o suprimir la muerte celular, si bien no son marcadores exclusivos de daño traumático, sino que también aparecen en enfermedades neurodegenerativas. Estos marcadores se expresan tanto en neuronas como en los astrocitos y en las células de la microglía, presentando un pico máximo de expresión a las 24 horas (coincidiendo con el pico de apoptosis) y persisten a los 7 días aunque en menor concentración (Grosjean y cols, 2007). 8.B.g.- PROTEÍNAS ASOCIADAS A Fas (Daxx, DED, FADD y FAP1) Estas proteínas no se expresan en células sanas. Aumentan al cabo de una hora tras un traumatismo y alcanzan el pico máximo a las 3 horas, disminuyendo a partir de las 12 horas para desaparecer por completo a las 24h. Esto demuestra que la apoptosis es un proceso activo que requiere la síntesis de novo de proteínas. De todas formas, pueden tener una función pro o antiapoptótica según si su concentración aumenta en el citoplasma o disminuye en el núcleo, respectivamente. En concreto la FP-1 regula la señal inducida por Fas, regulando el equilibrio entre supervivencia y muerte celular (Bi y cols, 2008). 9.- OTROS MARCADORES 9.A.- CITOQUINAS Se han estudiado múltiples citoquinas como la IL-10 (que presenta un pico máximo de expresión a las 6 horas y desaparece en 7 días), TNF-, IFN-γ, IL-8, factores de crecimiento de los granulocitos y monocitos, moléculas de adhesión, Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 96 etc. con distintos resultados, si bien no resultan de especial utilidad en lesiones traumáticas por su gran inespecificidad y baja sensibilidad (Aschner, 1998). 9.B.- METALOPROTEINASAS Las metaloproteinasas de la matriz (MMPs) son una extensa familia de enzimas proteolíticas (dependientes de Zn) que se encargan del remodelado de la matriz extracelular y que pueden degradar todos los constituyentes de la misma, es decir que juegan un papel importante en la muerte neuronal, alteración de la barrera hemato-encefálica (BHE) (daño mirovascular) y la formación de la cicatriz glial. Así, la MMP-9 es detectable en la región adyacente a la contusión a partir de las 24 horas postraumatismo y presenta un pico máximo de expresión a las 48 horas. (Hayashi y cols, 2009). Sin embargo, en la zona directamente afectada por el traumatismo se observa un incremento significativo a las 6 h, si bien el pico máximo coincide en el tiempo con el de las regiones adyacentes (Wei y cols, 2014). Otros estudios demuestran su presencia en regiones ipsilaterales susceptibles a cambios inflamatorios tales como el hipocampo (Hayashi y cols, 2009). La MMP-12 es también detectable a las 24 horas, pero mantiene su expresión al menos una semana y se demuestra tanto en astrocitos, como en neuronas (Wasserman y cols, 2007). 9.C.- PROTEÍNA INDUCTORA DE LAS METALOPROTEINASAS (EMMPRIN o CD147)) La proteína inductora de las metaloproteinasas (EMMPRIN o CD147) es una glicoproteína de la superfamilia de las inmunoglobulinas que estimula la producción de las metaloproteinasas mediante mecanismos autocrinos y paracrinos. Se expresa en distintas estirpes celulares tanto en condiciones normales como en situaciones de inflamación. Se ha relacionado Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 97 también con el desarrollo embrionario de la BHE, con el crecimiento y la angiogénesis de determinados tumores malignos, con la destrucción de tejido en casos de infarto cerebral y con enfermedades como el Alzheimer y la esclerosis múltiple. En los traumatismos se observa un aumento significativo de su expresión en la zona contundida a las 6 horas postraumatismo y alcanza su pico máximo a las 48 horas. Las células que lo expresaban eran células endoteliales, astrocitos, neutrófilos y macrófagos (Wei y cols, 2014) 9.D.- DIACILGLICEROLQUINASA La diacilglicerolquinasa es una enzima de la clase de las transferasas que cataliza la fosforilación de un diacilclicerol para formar un fosfatidato (ambos segundos mensajeros), usando ATP como donador de fosfato. Tiene funciones en el metabolismo neuronal en condiciones fisiológicas, pero en condiciones patológicas deja de expresarse en estas células para hacerlo en las células fagocíticas. Por eso, tras un traumatismo craneoencefálico, se observa una disminución de su expresión en neuronas al cabo de una hora y un aumento significativo de su actividad 7 días más tarde en la microglía activada y en fagocitos sanguíneos que provienen del SNC debido a la alteración de la barrera hematoencefálica. El tipo celular que expresaba esta enzima queda demostrado mediante marcajes múltiples ya que las células DGKz positivas son PGFA negativas y glucosa transferasa positivas (Nakano y cols, 2009). 9.E.- CONJUGADOS DE PROTEÍNAS AUTOFÁGICAS (ATG12 y ATG5) Los conjugados de proteínas autofágicas (ATG12 y ATG5) inducen la formación del fagosoma, sin permanecer como elemento constitutivo del mismo, sino reciclándose después. Dado que son elementos necesarios en el metabolismo celular, su expresión es normal en condiciones fisiológicas, pero Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 98 ante circunstancias adversas, su expresión disminuye (4 horas tras un traumatismo) y vuelven a niveles normales varios días después (Liu y cols, 2008). 9.F.- PROTEÍNA ASOCIADA AL CRECIMIENTO (GAP 43) Y SINAPTOSINA La proteína asociada al crecimiento (GAP43) y la sinaptosina han sido tomadas como marcadores de plasticidad glial, mostrando intervalos de expresión que varían entre las 48 horas y los 7 días dependiendo de la terapia a la que sea sometido el individuo (Loncarevic-Vasiljkovic y cols, 2009). 9.G.- FACTOR NEUTROFÍLICO CILIAR (CNTF) El factor neurotrófico ciliar (CNTF) es una citokina que tiene efectos tróficos sobre neuronas sensitivas y motoras, ya que modifica su expresión génica y afecta a su supervivencia ejerciendo una acción inhibidora sobre la actividad de la COX-2 y aumentando la del factor neurotrófico de las células gliales. Es producido por la microglía, en especial por los oligodendrocitos (Krady y cols, 2008). 9.H.- PROGRANULINA La progranulina es una proteina de 68,5 kDa rica en cisteína que es secretada de forma glicosilada en una forma de 88kDa. Como resultado de su proteólisis por medio de proteasas extracelulares, se forman péptidos activos de 6kDa, cada uno de los cuales contiene de 10 a 12 residuos de cisteína. La PGRN favorece la supervivencia y el crecimiento neuronal en cultivos celulares. En modelos experimentales de lesión del SNC (causadas mediante axotomía), la expresión de PGRN aumenta a las 3 horas, presenta su pico máximo a los 7 días Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 99 y vuelve a límites normales a los 7 días. Este aumento de expresión corre a cargo de las células de la microglía, mientras que en las neuronas disminuye (Moisse y cols, 2009). Sin embargo, el gen de la progranulina (PGRN) no es exclusivo de las neuronas y se expresa también en células epiteliales y hematopoyéticas. Está implicada en muchos procesos como carcinogénesis, cicatrización de heridas y procesos inflamatorios (He y cols, 2003; Eriks y cols, 2008). Tras un traumatismo, la progranulina es producida en fibroblastos y células endoteliales promoviendo la neovascularización (He y cols, 2003). 9.I.- PROTEÍNA DE CHOQUE TÉRMICO 72 (HSP72) La proteína de choque térmico 72 (HSP72) es una proteína muy ubicua asociada a la supervivencia celular y resistencia a los estresantes. La expresión intra o extracelular de esta proteína tiene distintas funciones. La proteína intracelular confiere protección a diferentes circunstancias de estrés, mientras que la porción extracelular juega un papel de presentación de antígenos en los mecanismos inmunológicos. En casos de traumatismos craneoencefálicos, esta proteína es detectable en neuronas alrededor de la zona contusa, en sustancia blanca y tálamo ipsilateral, a las 24 horas subsiguientes (Dunn-Meynell y cols, 1997). Más específicamente en la región C3 del hipocampo homolateral es detectable antes de las 48 horas y perdura varios días, entre otros motivos porque esta región del encéfalo es una de las más resistentes a los procesos postmórtem (Kubo y cols, 1998). Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 100 9.J.- FATOR INDUCIBLE POR HIPOXIA 1 (HiF 1) El factor inducible por hipoxia 1 (HiF-1) es una proteína que sirve de marcador de hipoxia tisular así como el pimonidazol y el TGF-1. Su expresión durante los tres primeros días tras un traumatismo (con un pico máximo a las 24 horas) en las células gliales, demuestra que un traumatismo directo genera hipoxia tisular. La expresión de TGF-1 en el citoplasma neuronal y el núcleo de las células gliales corrobora este hecho, ya que Klempt y cols (1992) demostraron su aumento a los 15 minutos tras la oclusión de la arteria cerebral media, si bien la expresión de este último marcador depende de genes como el Bcl-2 y el Bcl-x, por lo que los resultados cuantitativos pueden ser muy variables. Del mismo modo, el HiF-1α induce la liberación del factor de crecimiento de vasos sanguíneos (VEGF), lo cual reduce el daño isquémico secundario al traumatismo (Huang y cols, 2010). 9.K.- CAVEOLINAS Las caveolas son invaginaciones de la membrana citoplasmática ricas en proteínas y lípidos de las células del sistema inmune. En el caso del SNC se encuentran en células de la microglía. Sus funciones van desde la transducción de señales a la homeostasis del colesterol y la supresión tumoral. Se forman y mantienen gracias a unas proteínas transmembrana llamadas caveolinas. Cuando estas proteínas se fosoforilan en la tirosina 14 se produce la fisión de la caveola dando lugar a la transcitosis de la misma. En circunstancias fisiológicas, el 20% de las células endoteliales vasculares en el SNC son positivas a la caveolina, pero negativas a la fibronectina, lo que demuestra la integridad de la barrera hematoencefálica. Tras un traumatismo aumenta la expresión de esta proteína desde las 12 horas posteriores (momento del pico máximo) aumentando progresivamente hasta el 2º día. Posteriormente su expresión va Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 101 disminuyendo hasta el 4º día. Al 6º día se detecta en macrófagos, que también son positivos a la fibronectina, debido a la fagocitosis secundaria (Nag y cols, 2008). 9.L.- FACTOR DE CRECIMIENTO SIMILAR A LA INSULINA 1 (IGF 1) El IGF-1 es un factor mitogénico importante durante las fases de desarrollo del encéfalo. Promueve la supervivencia neuronal, la maduración de los oligodendrocitos, la mielinización, el crecimiento axonal, la maduración de las dendritas y la sinaptogénesis. Su receptor (IGFR-1) se expresa en neuronas, células madre y células de la glía. A partir de la 1ª hora tras un traumatismo se observa tinción positiva para IGF-1 en el neuropilo y en algunas neuronas salteadas en la zona del impacto, pero lo que más se observa en esta región son neuronas picnóticas y edematosas que van aumentando en número entre las 24 y 72 horas postraumatismo, formándose una cavidad en el córtex contundido. Alrededor de esta cavidad se aprecian células IGF-1 positivas durante las primeras 24-48 horas, las cuales son principalmente PGFA positivas, es decir astrocitos. A las 72 horas el factor similar a la insulina ha vuelto a niveles normales. En la sustancia blanca subyacente comienza a aumentar a las 24 horas y alcanza su pico máximo a las 48 horas. El receptor para este factor se expresa alrededor de la cavidad entre las 24 y 48 horas tras la contusión, a las 72 horas aparecen en los vasos sanguíneos adyacentes a la cavidad, en la sustancia blanca subyacente a las 24 horas y en tálamo homolateral, es decir, en regiones profundas, a las 72 horas. En los bordes de la contusión se produce una alteración del flujo de calcio y de la barrera hemato-encefálica, así como astrogliosis. La expresión Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 102 del IGF-1 limita la progresión de la muerte celular y promueve la diferenciación de células progenitoras y el crecimiento neuronal (Madathill y cols, 2010). 9.M.- AMPc El AMPc es uno de los segundos mensajeros más conocidos y con más funciones descritas, la principal de ellas es activar la proteinkinasa A, que a su vez fosforila distintas proteínas como CREB (AMPc-responsive element binding protein) y el factor nuclear K-B (NF-KB) p50. Estos contribuyen a la supervivencia de la célula, porque el CREB fosforilado estimula al transcripción de genes de supervivencia celular tales como el Bcl-2, y el NF-KBp50 fosforilado suprime los genes que codifican citoquinas proinflamatorias tales como el TNF-α y la IL-1β. El cAMP sufre una disminución a los 15 minutos tras un traumatismo en la región del hipocampo, a las 24-48 horas en el córtex parietal y no sufre cambios en el tálamo. La proteinkinasa disminuye también a los 15 minutos en las neuronas del córtex parietal y permanece así unas 48 horas antes de recuperar sus cifras normales (Atkins y cols, 2007). 9.N.- MOLÉCULA DE INTEGRACIÓN ESTROMAL OLIGOMERIZADA 1 (STIM1) Cuando el retículo endoplasmático libera calcio, la molécula de interacción estromal oligomerizada 1 (STIM1) se acumula en la membrana de esta organela y en las uniones plasmáticas de membrana y activa los canales de calcio operados el acúmulo de este mismo ión. La STIM1 se considera un sensor de la concentración de calcio en el RE. Las alteraciones en la entrada de calcio operada por su propio acúmulo modifican la homeostasis del calcio pudiendo llegar a producir patologías como corea de Huntington o Alzheimer. Revisión bibliográfica _________________________________________________________ 109 macrófagos no se presentan hasta las 24 horas. Del mismo modo el β-APP está totalmente ausente de la zona necrótica, localizándose, como muy próximo, a 12 mm de la trayectoria, hasta 2-4 mm más allá. También es importante señalar que pueden presentar reactividad axones aislados totalmente distantes a la lesión (especialmente en el tallo cerebral, quizá porque la energía liberada por el proyectil provoque presión y sea capaz de comprimir y/o provocar movimientos de torsión en el mismo). En resumen, estos cambios reactivos difusos evidencian el daño secundario paralelo a la cavidad creada directamente por el proyectil. Este daño secundario puede ser el que en última instancia provoque el fallo circulatorio y respiratorio que conduce al éxitus. En cualquier caso, siempre constituyen una evidencia de la vitalidad de la lesión y del tiempo mínimo de supervivencia. (Oehmichen y cols, 2004) En las regiones alejadas del trayecto del proyectil, y cuando la supervivencia es suficiente, se observan dos patrones distintos de agregados axonales positivos a β-APP: - Tipo I: axones en paralelo, ondulados y con edema (provocados por fuerzas mecánicas) - Tipo II: axones agregados de forma irregular, en diagonal o longitudinalmente con mucho edema (provocados por hipoxia y edema) Hay que tener en cuenta que aunque los axones son inmunorreactivos para β-APP la neurona no está muerta todavía, es decir que su situación es reversible, por lo que el tratamiento con ventilación mecánica puede aumentar las posibilidades de supervivencia (Oehmichem y cols, 2001). JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS Justificación y objetivos _________________________________________________________ 113 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS DEL TRABAJO El gran número de muertes traumáticas que se producen al año y sus consecuencias criminalísticas y médico-legales, justifican el desarrollo del estudio de marcadores para conocer la evolución cronológica de los traumatismos cráneoencefálicos y consecuentemente su vitalidad. La finalidad del estudio es establecer un diagnóstico diferencial entre las muertes debidas estrictamente al traumatismo y aquellas otras atribuibles a causas ajenas, pero complicadas en su estudio por la presencia eventual de un traumatismo craneal (muertes súbitas que desencadenan un TCE ulterior). La resolución del problema, pasa por la implementación de nuevas y mejores técnicas de laboratorio que puedan despejar los interrogantes que ofrece el estudio macroscópico. Así pues, técnicas como la Inmunohistoquímica y la Biología molecular entre otras, convierten estos análisis complementarios en imprescindibles para la resolución de los casos judiciales complejos. En particular, la aplicación de técnicas inmunohistoquímicas en la práctica forense habitual para el establecimiento de la cronología y de la vitalidad de la lesión, es un procedimiento de uso excepcional, fuera del alcance de la mayor parte de los laboratorios forenses de nuestro país. Sin embargo, su implantación casi universal en los laboratorios de Anatomía Patológica del sistema sanitario, ha demostrado un elevado grado de fiabilidad en aspectos relacionados, como es el caso de las lesiones de partes blandas. Consideramos que, la aplicación de estas técnicas a los casos forenses y la simplificación al máximo de los procedimientos de laboratorio, podría incrementar la seguridad diagnóstica. Justificación y objetivos _________________________________________________________ 114 Encontrar uno o varios parámetros que definan la evolución cronológica del TCE como mecanismo mortal y/o la vitalidad del mismo es uno de los retos de los investigadores en la actualidad. El objetivo de este trabajo es exponer la situación actual de este tipo de técnicas en los casos de traumatismo craneoencefálicos, así como encontrar una batería de marcadores, cuyo estudio combinado nos permita de forma igualmente sencilla y fiable aproximarnos al diagnóstico y clasificación cronológica de estas las lesiones, mediante el descubrimiento de cambios mínimos y precoces en las distintas estirpes celulares de este tejido debidos a procesos tales como la necrosis, la inflamación y la apoptosis MATERIAL Y MÉTODOS Material y métodos _________________________________________________________ 117 MATERIAL Y MÉTODOS 1.- MATERIAL En el presente estudio se han seleccionado exclusivamente cerebros humanos procedentes de autopsias médico legales. No se tuvo en cuenta el sexo o la edad del sujeto, sino que la muerte se debiera directa o indirectamente a un traumatismo craneoencefálico. La muestra total incluyó 25 cerebros. El tiempo transcurrido entre la muerte y la recogida de la muestra se ha conocido siempre con bastante exactitud, bien a través de la historia clínica o bien a través de la información recabada en el momento del levantamiento. En ningún caso se superaron las 24 horas, durante las cuales, el cuerpo permaneció refrigerado a 4ºC. No se descartó ningún caso por haber sido sometido a tratamiento médico o quirúrgico, aunque sí que se tuvo este dato en cuenta, diferenciando las lesiones originales de las iatrogénicas. Del estudio fueron excluidos aquellos casos en los que el sujeto sufriera accidentes cerebro-vasculares, convulsiones y/o crisis de hipo o hiperglucemia previos, dado que estas patologías producen lesiones neuronales similares al daño secundario por isquemia que tiene lugar en los TCE. Material y métodos _________________________________________________________ 118 Los casos procedían de autopsias médico-legales practicadas en las subdirecciones de Santiago y Pontevedra del Instituto de Medicina Legal de Galicia, en virtud de los procedimientos judiciales instruidos en los Juzgados de Instrucción de Santiago, Padrón, Ribeira, Ordes, Arzúa, Noia, Muros, A Estrada, Lalín, Pontevedra, Caldas de Reis, Cambados, Villagarcía, Cangas de Morrazo y Marín. Para su estudio fueron divididos en dos categorías: - Casos problema: constituido por un total de 21 cerebros pertenecientes a cadáveres de individuos que fallecieron de forma rápida o diferida por un traumatismo craneoencefálico. La autopsia se practicó lo más precozmente posible y siempre dentro de las primeras 24 h y, aunque en los casos de muerte diferida, era normal encontrar patologías asociadas (como neumonías) que pudieron constituir la causa inmediata de la muerte, la causa fundamental de la misma (y motivo del ingreso hospitalario) siempre fue un traumatismo craneoencefálico. - Controles negativos: 4 cerebros de sujetos que fallecieron de forma súbita por causas naturales de origen cardiaco sin TCE asociado. En todos los casos se realizó una autopsia médico-legal completa y se realizaron estudios toxicológicos que descartaran posibles orígenes tóxicos del daño neuronal. Se procedió además al estudio de la historia clínica completa de los casos que recibieron asistencia médica. 1.A.- Selección de los casos: La información respecto a las lesiones encefálicas se obtuvo, mediante el examen directo en el caso de las muertes más rápidas y mediante el estudio detallado de la historia clínica, en los casos de muertes diferidas. En este último Material y métodos _________________________________________________________ 125 Entre las distintas etapas se realizaron 2 lavados de 5 minutos con PBS y tras la DAB el lavado se llevó a cabo con agua destilada. Las diluciones de anticuerpos primarios se prepararon con un diluyente comercial de anticuerpos (Dako). En todos los casos se incluyeron controles negativos, en los que se sustituyó el anticuerpo primario por PBS. Las preparaciones fueron observadas y fotografiadas en campo claro con un microscopio Olympus Provis AX 70, equipado de una cámara digital Olympus DP70 de alta resolución (Olympus Corp, Tokyo, Japan). Se interpretó positividad y por tanto la localización de las proteínas, por la presencia de la coloración marrón-tabaco característica de la DAB. 2.E. Estudio de las muestras En todos los casos se valoraron las características macro y microscópicas convencionales, tales como la presencia de hemorragia intracraneal y su observación microscópica mediante hematoxilina-eosina. Se valoró la positividad del p53, el Bcl-2 por la presencia de somas positivos, y en el β-APP por la presencia de axones teñidos con la coloración marrón característica del DAB. En el caso del CD68 y el PGFA que son siempre positivos, se valoró la morfología celular así como el número de células por campo. En el caso de β-APP también se observó su patrón de distribución y en el de los neurofilamentos la alteración de la morfología axonal. 2.F.- Cuantificación de la inmunorreactividad Para cuantificar los resultados del PGFA y del CD68, se realizó un contaje de las células teñidas por campo. Para ello se fotografiaron, a un Material y métodos _________________________________________________________ 126 aumento de 20x, cuatro zonas de sustancia blanca y cuatro zonas de sustancia gris, que no estuvieran directamente afectadas por la hemorragia o la necrosis, pero que fueran próximas a la lesión. Se contabilizaron las células de visu sobre dichas fotografías y se hizo la media aritmética para obtener la densidad celular de cada caso. Dicho valor se comparó con la media de células marcadas por campo (al mismo aumento) en los controles, graduando así de forma semicuantitativa el grado de positividad. Se consideró por separado el número de células presentes en sustancia gris, del número presente en sustancia blanca. Se consideró que existía hiperplasia cuando con el PGFA se observaba un 50% más de células que en los controles (tanto en sustancia blanca como gris). Se estableció este valor de referencia en base a los estudios de Weber y cols (2013) y de Li y cols (2012). El CD 68 fue considerado positivo cuando su densidad era mayor del 100% que los controles. Cuando el aumento fue de 200 a 300% se le asignaron dos cruces y por encima del 300% se les asignaron tres cruces. Para establecer estos parámetros se tuvo en cuenta el análisis cuantitativo realizado por Smith y cols (2013). Los resultados fueron incluidos en una tabla de Microsoft Excel para Windows 2010, que incluía los siguientes datos: - Nº de caso - Edad - Sexo - Tratamiento médico y/o quirúrgico - Tiempo de supervivencia - Resultados de neurofilamentos (rosarios y bulbos) Material y métodos _________________________________________________________ 127 - Resultados de PGFA (hipertrofia, hiperplasia y distribución geográfica) - Resultados de CD68 - Resultados de β-APP (densidad y patrón) - Resultados de Bcl-2 - Resultados de P53 Los resultados del aumento relativo de la densidad celular expresados por el PGFA y el CD68 se expresaron en tablas de contingencia. 2.G.- Análisis estadístico: Para realizar la comparación estadística de las densidades celulares se utilizó el programa SPSS (IBM versión 20). Para comparar la tendencia central de la densidad celular observada en todos los grupos con PGFA y con CD68 se realizó, en primer lugar, un test ANOVA que resultó significativamente diferente, por lo que se comprobó el comportamiento normal de nuestra muestra con el test de Kosgorov-Smirnov y, posteriormente se aplicó el test de Scheffe para la comparación “post hoc” de cada uno de los grupos con respecto a los controles. RESULTADOS Resultados _________________________________________________________ 131 RESULTADOS 1.- HALLAZGOS MACROSCÓPICOS La mayoría de nuestros casos fueron muertes por traumatismos de alta intensidad (accidentes de tráfico, precipitaciones…), pero también existieron algunos casos de traumatismos por caída que incluso en un primer momento fueron considerados banales y que a medio plazo derivaron en hemorragia subdural y en el fallecimiento del sujeto. En este sentido los hallazgos macroscópicos nos dan una primera aproximación a la intensidad del traumatismo. En la mayoría de los casos eran reconocibles lesiones de los tejidos blandos, que iban desde simples infiltrados hemorrágicos en la galea (hematomas), de mayor o menor extensión, a laceraciones y heridas abiertas (figura 1). En los accidentes de tráfico es frecuente encontrar fracturas multifragmentarias que casi siempre afectan a la base del cráneo (figura 2).En los traumatismos producidos en el contexto de una caída o una precipitación, es más fácil que exista mayor tiempo de supervivencia, y además que las lesiones óseas consistan en fracturas lineales (figura 3.)No siempre se ve afectada la base craneal, lo cual, en un principio es un dato de mejor pronóstico clínico cuando no se asocian a hundimiento del díploe con intrusión de fragmentos. Resultados _________________________________________________________ 132 También era observable mayor o menor grado de remodelación ósea de la fractura dependiendo del tiempo de supervivencia. Los hallazgos macroscópicos en el encéfalo, como el edema y la contusión (figura 4), se producen tanto en los traumatismos de intensidad leve o media como en los de alta intensidad. Sin embargo, las hemorragias intracraneales son características de los de alta energía y fueron una constante en nuestro estudio. Lo más frecuente eran las hemorragias mixtas, habitualmente subaracnoideas asociadas a hemorragias subdurales, pero encontramos todo tipo de hemorragias, incluso intraventriculares (figuras 5, 6 y 7). En nuestro estudio, cabría dividir a este respecto a nuestros sujetos de estudio en dos grandes grupos: aquellos con el hematoma aún presente (que incluirían los tres primeros grupos de supervivencia)y aquellos que tras tratamiento médico o quirúrgico ya han resuelto la hemorragia (que sería nuestro grupo 4). Estos últimos presentan una impregnación de hemosiderina y fibrina tanto en el córtex cerebral como en las meninges que les confieren un aspecto deslustrado y amarillento. En el caso de las hemorragias extradurales, es posible incluso observar el despegamiento de la meninge del hueso (figura 8). En las siguientes tablas se detallan los hallazgos macroscópicos de cada caso concreto Resultados _________________________________________________________ 139 también en parénquima, especialmente en la región perivascular (figura 14). La sustancia blanca ya acusa su afectación que se traduce en huecos en el tejido debido a la desmilinización y la destrucción axonal (figura 15) En la sustancia gris, la afectación neuronal es más evidente, no sólo por la eosinofilia de las células, sino por su deshidratación y pérdida de su morfología. En esta fase aún no se observan ni neuronas fantasmas ni halos de retracción (figura 16). GRUPO 3 (supervivencia entre 24 horas y 30 días) En estos casos fue posible observar la evolución de la hemorragia meníngea, con hialinización del coágulo, mayor presencia de fibras de colágeno, más infiltrado macrofágico y leucocitario y la menor presencia de eritrocitos, los cuales están deformados y retraídos (figura 17) La sustancia blanca muestra infiltrado leucocitario de los focos hemorrágicos, en los que hay cada vez mayor número de macrófagos cargados de hemosiderina, y clara desmielinización, siendo posible identificar axones arrosariados e incluso bulbos distales de retracción (figuras 18 y 19). En la sustancia gris, los focos hemorrágicos presentan las mismas características que en la sustancia blanca. Lo más llamativo es la morfología de las neuronas, que son claramente picnóticas y necróticas. Se observan además neuronas fantasma e incluso neuronas apoptóticas con un núcleo aumentado de tamaño y granular, pudiendo encontrar halos de retracción a su alrededor. (figuras 20, 21 y 22) Resultados _________________________________________________________ 140 También fue posible reconocer focos de astrogliosis, en los cuales se apreciaba una desestructuración del tejido y se distinguían astrocitos reactivos (figura 23) GRUPO 4 (supervivencia superior a 30 días) En este grupo lo más destacable fue la astrogliosis generalizada tanto en la sustancia blanca como en la gris. Resultados _________________________________________________________ 141 Figura 9. Hemorragia subaracnoidea con macrófacos cargados de hemosiderina. (H-E, 40X) Figura 10. En la parte superior de la imagen se observa la desestructuración del tejido debido a una hemorragia intraparenquimatosa. (H-E, 10X) Resultados _________________________________________________________ 142 Figura 11. Las flechas señalan rosarios axonales en sustancia blanca. (HE, 20X) Figura 12. Las flechas señalan algunas de las neuronas eosinofílicas picnóticas que se observan en la imagen. (H-E, 20X) Resultados _________________________________________________________ 143 Figura 13. En esta imagen se observa la desmielinización de la sustancia blanca y astrocitos hipertróficos. (H-E, 20X) Figura 14. Las flechas señalan la presncia de macrófagos cargados de hemosiderina perivasculares. (H-E 20X) Resultados _________________________________________________________ 144 Figura 15. En esta imagen se observan focos hemorrágicos en sustancia blanca asociados a demielinización, sin infiltrado macrofágico asociado.(H-E, 20X) Figura 16. La necrosis neuronal está más avanzada, observándose retracción de los somas lo que da lugar a halos de retracción Resultados _________________________________________________________ 145 Figura 17. Coágulo subaracnoideo con infiltrado leucocitario, hialinización y aumento de las fibras colágenas. (H-E, 20X) Figura 18. Hemorragia en sustancia blanca con macrófagos cargados de hemosiderina, desmielinización y destrucción de los axones. (H-E 20X ) Resultados _________________________________________________________ 146 Figura 19. Las flechas señalan axones edematosos y arrosariados con infiltrado de macrófagos y polimorfonucleares asociado. (H-E 20X) Figura 20. La necrosis neuronal continúa avanzando:mayor eosinofilia, halos de retracción más amplios y citoplasma granular. (H-E 20X) Resultados _________________________________________________________ 147 Figura 21. Al avanzar la necrosis, las neuronas pasan a ser neuronas fantasmas, amorfas, con citoplasma en cristal esmerilado y cariorrexis.(H-E, 40X) Figura 22. El círculo marca una neurona apoptótica en zona de lesión. El núcleo presenta una característica condensación marginal de la cromatina. (H-E 40X) Resultados _________________________________________________________ 148 Figura 23. Las flechas señalan abundantes astrocitos hipertróficos en un tejido desmielinizado (H-E, 20X) Conclusiones _________________________________________________________ 247 CONCLUSIONES 1.- A pesar de la recomendación general de estudiar un muestreo amplio de todas las estructuras del encéfalo cuando se produce una lesión a este nivel, el estudio de la región directamente afectada por el traumatismo, es suficiente para dar respuesta a los problemas médico-legales, siendo recomendable la utilización combinada de varios anticuerpos. 2.- Para obtener un correcto rendimiento de los marcadores resulta aconsejable obtener el bloque objeto de estudio en fresco, 24 h de fijación en formol y conservación en alcohol al 70% hasta su procesado. La extracción y fijación del órgano entero durante días, antes de obtener el bloque, enmascara epitopos y produce numerosos falsos negativos. 3.- Para el estudio del citoesqueleto el anticuerpo para la subunidad del 68 kD y el marcador CD68 PGM1 ofrece mejores resultados que el CD68 KP1 4.- La PGFA demuestra hipertrofia a partir de las dos horas e hiperplasia a partir de las 16 h. Posteriormente también se observa reacción de la BHE. El pico máximo de la hiperplasia se produce entre el 5º y 17º día. 6.- El precursor del β-amiloide se expresa a las 2 h, con un patrón focal. A partir de las 20 h, se observa un patrón difuso coincidiendo con el pico máximo de necrosis y daño axonal observados con neurofilamentos y con el comienzo de la hiperplasia astrocitaria. 6.- La expresión del gen Bcl-2 comienza a observarse a los 11 días, permaneciendo hasta los 30 días, momento a partir del cual desaparece. Dado Conclusiones _________________________________________________________ 248 que su expresión comienza cuando declina la necrosis, este marcador resulta útil para diferenciar traumatismos de días de evolución de otros recientes que asientan sobre lesiones antiguas 7.- El gen p53 no resulta útil en el estudio del foco de lesión. 8.- La vimentina se expresa en el foco de lesión a partir de las 16 horas, incrementándose en las capas más profundas del córtex y de la sustancia blanca conforme avanzan los días. Su utilidad principal es delimitar la extensión de la lesión. 9.- Se han establecido una serie de cambios cronológicos, siendo de especial relevancia los cambios observados en los primeros 30 minutos de evolución (rosarios axonales con neurofilamentos y macrófagos prevasculares) y a las dos horas (necrosis neuronal, hipertorfia astrocitaria, macrófagos en parénquima y patrón focal de marcaje con β-APP). Estos hallazgos reducen significativamente el periodo de incertidumbre a la hora de datar un traumatismo cráneo encefálico. 10.- Nuestros resultados resultan novedosos y diferentes a los establecidos en la literatura actual. Las diferencias radican en las características de nuestra muestra (exclusivamente TCE por impacto de alta energía) y en el estudio circunscrito al área lesionada (aspecto secundario para la mayoría de los autores). BIBLIOGRAFÍA Bibliografía ______________________________________________________________ 251 BIBLIOGRAFÍA  ACOSTA SA, TAJIRI N, SHINOZUKA K, ISHIKAWA H, GRIMMIG B, DIAMOND D, SANBERG PR, BICKFORD PC, KANEKO Y, BORLONGAN CV (2013). Long term upregulation of inflammation and suppression of cell proliferation in the brain of adult rats exposed to traumatic brain injury using the controlled cortical impact model. Plos one 8(1):e53376. 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