Implementación de los métodos de diagnóstico en la Enfermedad de Fabry

TESIS DE DOCTORADO IMPLEMENTACIÓN DE LOS MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO EN LA ENFERMEDAD DE FABRY Cristina Melcón Crespo ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL PROGRAMA DE DOCTORADO EN INVESTIGACIÓN CLÍNICA EN MEDICINA SANTIAGO DE COMPOSTELA AÑO 2019 DECLARACIÓN DEL AUTOR DE LA TESIS Implementación de los métodos de diagnóstico en la Enfermedad de Fabry Dña. Cristina Melcón Crespo Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento, y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) En su caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide con la versión enviada en formato electrónico. 4) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. En Vigo, 22 de Abril de 2019. Fdo Cristina Melcón AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR / TUTOR DE LA TESIS Implementación de los métodos de diagnóstico en la Enfermedad de Fabry D. José Ramón Fernández Lorenzo Dña. Saida Ortolano INFORMAN: Que la presente tesis, corresponde con el trabajo realizado por Dña. Cristina Melcón Crespo, bajo mi dirección, y a utorizo su presentación , considerando que reúne l os r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director de ésta no incurre en las causas de abstención establecidas en Ley 40/2015. En Vigo, 22 de Abril de 2019 Fdo. José R. Fernández Fdo. Saida Ortolano i Tesis Doctoral Implementación de los métodos de diagnóstico en la Enfermedad Fabry Autor: Cristina Melcón Crespo Tutores: José Ramón Fernández Lorenzo Saida Ortolano Santiago de Compostela, Abril de 2019 iii Agradecimientos En primer lugar, quiero agradecer a mis tutores, el Dr Fernández Lorenzo y la Dra Ortolano su dedicación, supervisión, ayuda y apoyo necesario e imprescindible para la realización de este trabajo. Gracias por embarcarme en este viaje, acompañarme durante el trayecto y guiarme hasta la meta. Gracias a todos los niños y las familias que han participado en este trabajo, en especial a los 12 niños pertenecientes a nuestra área sanitaria que aceptaron, después de 10 años, continuar el estudio. Gracias a la Dra Couce y su equipo de la Unidad de Metabolopatías perteneciente al Complejo Hospitalario de Santiago de Compostela por su papel en la realización del estudio de cribado neonatal. En especial querría agradecer al Dr Cristóbal Colón su aportación. Gracias al Dr Garnelo, excelente profesional y persona, por su colaboración y disposición en la búsqueda de los pacientes del grupo control necesarios para este estudio. Gracias a mis compañeros y toda la planta de pediatría del Hospital Álvaro Cunqueiro por su ayuda en la búsqueda de pacientes y recogida de muestras. Gracias al personal de enfermería y auxiliares del Hospital de Día Pediátrico del Hospital Álvaro Cunqueiro por colaborar de forma desinteresada en la extracción de las muestras. Gracias a la Unidad de Metodología y Estadística del Instituto de Investigación Sanitaria Galicia Sur, en especial a Cristina, por su colaboración en la realización del análisis estadístico. Gracias a Irene por el análisis de muestras y ayuda en la interpretación de resultados, por su predisposición y diligencia. En un ámbito personal, querría agradecer la ayuda de mis padres, porque sin ellos hoy no estaría aquí, sin su ejemplo, aliento y apoyo incondicional y continuo a lo largo de toda mi vida, en Salamanca, Oviedo, Madrid y Vigo; esperándome en la elección MIR o acompañándome un 14 de febrero y un 30 de noviembre. Gracias a mi segunda familia, la que me ha acogido, ayudado y cuidado como una hija más, en especial a Ana, siempre dispuesta a quedarse al cargo de todo y todos. Gracias a Rodrigo y Ariadna, porque sois una parte de mí, por hacerme disfrutar de todas las horas del día y por entender tan bien las ausencias de mamá. Y el agradecimiento más especial es para ti, Edu. Gracias por soportarme, animarme, ayudarme y sobretodo quererme. ÍNDICE GENERAL x 5.1 Estudio Descriptivo ............................................................. 83 5.2 Estudio Caso - Control ........................................................ 88 5.2.1 Sujetos a estudio ..................................................................... 88 5.2.2 Manifestaciones Clínicas Sujetos ........................................... 90 5.2.3 Manifestaciones Clínicas Familiares ..................................... 91 5.2.4 Determinación de LysoGb3 .................................................... 92 5.2.5 Estudio de mRNA .................................................................... 96 5.2.6 Estudio de proteína ................................................................. 99 5.2.7 Estudio de Metilación ........................................................... 100 6. DISCUSIÓN ..................................................................................... 107 7. CONCLUSIONES ............................................................................. 125 8. LÍNEAS FUTURAS .......................................................................... 129 9. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................. 133 10. ANEXOS ....................................................................................... 163 Modelo de consentimiento informado Estudio Descriptivo ......... 165 Modelo de consentimiento informado Estudio Descriptivo ......... 166 Hoja de Recogida de Datos Estudio Caso - Control ..................... 167 Modelo de consentimiento informado Estudio Caso -Control...... 168 Aprobación del Comité de Ética Estudio Cribado Neonatal......... 169 Aprobación del Comité de Ética Estudio Caso - Control ............. 170 Artículo: Newborn screening for Fabry disease in the north-west of Spain.............................................................................................. 171 Autorizaciones de empleo de imágenes externas ………………177 xi Índice de figuras Figura 1 Cromosoma X-Localización gen GLA. .................................. 3 Figura 2 Gen GLA ................................................................................ 3 Figura 3 Síntesis de la α-GAL .............................................................. 4 Figura 4 Función α-galactosidasa dentro del lisosoma......................... 5 Figura 5 Progresión natural de la enfermedad de Fabry ...................... 8 Figura 6 Relación entre variantes gen GLA y actividad enzimática αGalA. .......................................................................................... 17 Figura 7 Esquema de tratamiento del dolor Neuropático en EF. ........ 33 Figura 8 Publicaciones científicas sobre enfermedad de Fabry. ........ 63 Figura 9 Protocolo de estudio del cribado neonatal. .......................... 72 Figura 10 Reacción de la enzima α-GalA........................................... 74 Figura 11 Representación esquemática de los parámetros estadísticos graficados.................................................................................... 77 Figura 12 Cronograma del estudio. .................................................... 84 Figura 13 Resultados del estudio del cribado neonatal ...................... 85 Figura 14 GVUS detectadas. .............................................................. 88 Figura 15. Valores LysoGb3 GLOBAL ............................................. 94 Figura 16. Valores LysoGb3 CASOS ................................................ 95 Figura 17. Valores LysoGb3 CONTROLES ...................................... 95 Figura 18. Niveles de trascrito: Datos globales .................................. 98 Figura 19. Niveles de trascrito: Diferencia entre sexos ...................... 99 Figura 20. Niveles de Proteína ......................................................... 100 Figura 21. Análisis de metilación de la región promotora GLA ....... 101 Figura 22. Análisis de metilación del entorno p.(Ala143Thr) .......... 102 Figura 23. Análisis de metilación del entorno p.(Asp313Tyr) ......... 103 Figura 24. Secuencia Diagnóstica GVUS. ....................................... 122 xiii Índice de tablas Tabla 1. Resumen de las manifestaciones clínicas. ............................ 14 Tabla 2. Resumen de manifestaciones clínicas en pacientes con enfermedad de Fabry (recién nacidos-4 años). ........................... 16 Tabla 3. Biomarcadores daño renal/cardiaco. .................................... 21 Tabla 4. Hallazgos fisiopatológicos en cada órgano afectado en la enfermedad de Fabry.. ................................................................ 22 Tabla 5. Preparados de agalsidasa de disponibilidad generalizada.. .. 28 Tabla 6. Tratamiento complementario en Enfermedad de Fabry.. ..... 31 Tabla 7. Seguimiento EF en la edad adulta.. ...................................... 34 Tabla 8. Seguimiento EF en la edad pediátrica.. ................................ 36 Tabla 9. Cribados neonatales realizados en el mundo.. ...................... 42 Tabla 10. Resumen Cribados EF Mujeres 1995-2017.. ...................... 45 Tabla 11. Resumen Cribados EF Varones 1995-2017. ...................... 45 Tabla 12. Cribados en Población con IRC ......................................... 47 Tabla 13. Resumen de Cribados Destacados en Población con MCPH .................................................................................................... 49 Tabla 14. Variantes Intrónicas Patogénicas con afectación en el splicing ....................................................................................... 55 Tabla 15. Variantes gen GLA halladas en Cribado Neonatal ............. 86 Tabla 16. Datos Sujetos Caso ............................................................ 89 Tabla 17. Datos Sujetos Control ........................................................ 89 Tabla 18. Manifestaciones Clínicas Niños Portadores GVUS ........... 91 Tabla 19. Manifestaciones Clínicas Familiares .................................. 92 Tabla 20. Datos LysoGb3 en Sujetos Casos ....................................... 93 Tabla 21. Datos LysoGb3 en Sujetos Control .................................... 93 Tabla 22. Datos Nivel de Transcritos en Sujetos Casos ..................... 97 Tabla 23. Haplotipos presentes en el estudio ................................... 110 Tabla 24. Resumen Variantes gen GLA presentes en el estudio ...... 110 Tabla 25. Equivalencias Nomenclatura Variantes Gen GLA ........... 110 xv Abreviaturas ACV: Accidente Cerebrovascular AIT: Accidente Isquémico Transitorio DBS: Dried Blood Spot DE: Desviación Estándar DNA: Ácido Desoxirribonucleico EF: Enfermedad de Fabry ECG: Electrocardiograma α-GalA: α-galactosidasa A Gb3: Globotriaosilceramida GVUS: Variantes genéticas de significado incierto (Genetic Variants of Unknown Significance) HVI: Hipertrofia Ventricular Izquierda IC: Intervalo de Confianza IRT: Insuficiencia Renal Terminal IRC: Insuficiencia Renal Crónica LysoGb3: globotriaosilesfingosina MCPH: Miocardiopatía Hipertrófica mRNA: Ácido Ribonucleico Mensajero PCR: Reacción en cadena de la polimerasa qPCR: Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real RM: Resonancia Magnética RNA: Ácido Ribonucleico SNP: polimorfismo de un solo nucleótido (Single Nucleotide Polymorphism) TES: Terapia Enzimática Sustitutoria VPP: Valor Predictivo Positivo WB: Western Blot WBC: White blood cell 1 Introducción 1 1 Introducción 1.1 ENFERMEDAD DE FABRY 1.1.1 Definición La Enfermedad de Fabry (OMIM #301500) es una enfermedad de depósito lisosomal. Es una patología hereditaria ligada al cromosoma X y causada por un déficit de α-galactosidasa A (α-GalA, EC 3.2.1.22), una enzima hidrolítica expresada en el lisosoma y codificada por el gen GLA (Xq22, NC_000023.1, mRNA NM_000169.2) (1,2). La Enfermedad de Fabry (EF) se caracteriza por la presencia de depósitos lisosomales de globotriaosilceramida (Gb3) y otros glucoesfingolípidos naturales relacionados con este, por ejemplo, globotriaosilesfingosina (LysoGb3). El acúmulo de glucosfingolipidos en el endotelio vascular y en diferentes órganos provoca manifestaciones progresivas, como insuficiencia renal, cardiomiopatía hipertrófica, infartos de miocardio y accidentes cerebrovasculares (ACV) en edades tempranas, todas ellos relacionadas con un riesgo grave de mortalidad precoz (3). 1.1.2 Recuerdo Histórico Las primeras descripciones de la enfermedad de Fabry han sido realizadas en 1898 por dos médicos en Alemania y Gran Bretaña de forma simultánea pero independiente (4,5). El Dr Johan Fabry dermatólogo de Dortmund y el Dr William Anderson cirujano encargado del Departamento de la piel en el Hospital St Thomas en Londres describieron dos pacientes con angioqueratomas (5–7). El Dr Fabry diagnosticó de “angioqueratoma corporal difuso” a un niño de 13 años con una lesión purpúrica en cuyo análisis objetivó aneurismas de vasos pequeños, vegetaciones en la íntima y trombosis de capilares. Además dicho paciente presentaba albuminuria (6). Por su parte el Dr Anderson describió el caso de un paciente de 39 años con múltiples CRISTINA MELCÓN CRESPO 8 Figura 5 Progresión natural de la enfermedad de Fabry (49). (Licencia Creative Commons) 1.1.5.1 Afectación Cardiovascular La afectación cardiaca aparece en el 40-60 % de los pacientes incluyendo miocardiopatía hipertrófica (MCPH), arritmias e isquemia miocárdica (50). Es el órgano afectado más importante y constituye la mayor causa de morbi-mortalidad, especialmente en la EF de inicio tardío (2). La miocardiopatía hipertrófica progresiva con afectación en la función diastólica es la afectación por excelencia (26). Se caracteriza por una hipertrofia ventricular izquierda concéntrica (51) a partir de los 30 años seguida de fibrosis con el desarrollo consiguiente de arritmias severas e insuficiencia cardiaca (32). La función sistólica está conservada hasta estadios avanzados (2). El hallazgo de fibrosis se considera de mal pronóstico debido a su severidad e irreversibilidad (2). La hipertrofia ventricular no guarda relación con el acúmulo de esfingolípidos, como se señaló en el apartado de Etiología y Patogenia 1.1.3, sino con una hipertrofia miocitaria producida por los esfingolípidos u otros mediadores secundarios (32). Existen otros factores que se creen que tiene relación con el desarrollo de la afectación cardiaca en la EF como la activación neurohormonal, factores genéticos/ambientales…(2). 1. INTRODUCCIÓN 9 Los defectos de conducción y las arritmias se manifiestan de forma precoz con un acortamiento de intervalo PR debido a la aceleración en la conducción del nodo AV. Posteriormente presentan taquicardias supraventriculares, bradicardias, arritmias ventriculares y muertes súbitas (2). La función microvascular coronaria está alterada y también existe una reducción de la perfusión miocárdica (50). A nivel valvular puede existir afectación tanto insuficiencia como estenosis (26). A nivel vascular existe un adelgazamiento de la capa íntima y media que ocurre de manera concomitante al desarrollo de hipertrofia ventricular izquierda en ausencia de placas de ateroesclerosis lo que sugiere una patogénesis común (50). La realización de un electrocardiograma (ECG) en la edad adulta es un método para detectar alteraciones de forma precoz (acortamiento PR) aunque es necesario la realización de una ecocardiografía para caracterizar de manera apropiada todas las alteraciones (26) e incluso la realización de una resonancia cardiaca para identificar los defectos de forma más precisa (2). 1.1.5.2 Afectación Renal La afectación renal se inicia ya en el periodo fetal (2). Las manifestaciones clínicas comienzan hacia los 10 años en forma de microalbuminuria que progresa hacia proteinuria hacia los 20-30 años e IRT precisando terapia renal sustitutiva (diálisis o trasplante) hacia la cuarta-quinta década de la vida (2,26,50). La afectación tubular descrita consiste en hipoestenuria y poliuria (26). A nivel celular se objetiva mayor acumulación de esfingolípidos en los podocitos que en las células endoteliales debido a la ausencia de recambio celular en los podocitos a diferencia de las células del endotelio, que conlleva al acúmulo progresivo de esfingolípidos durante años. La afectación podocitaria se objetiva en la infancia y precede a la aparición de microalbuminuria. Asociado a la pérdida de podocitos se objetiva desarrollo de glomerulonefrosis segmental y focal. La gravedad de dicha glomerulonefrosis junto al grado de proteinuria constituyen factores pronósticos tanto en la historia natural como tras el inicio de la TES (32). CRISTINA MELCÓN CRESPO 10 1.1.5.3 Afectación Neurológica A nivel neurológico podemos hablar de neuropatía periférica, afectación del sistema autónomo y cerebrovascular. La neuropatía periférica es una de las manifestaciones más frecuentes objetivada, hasta en el 80% (2,50) de los pacientes y una de las más precoces ya que se ha descrito en niños de 3 años (52). Se manifiesta por sensación de quemazón, y disminución de la tolerancia al frío seguida de crisis de dolor agudo (acroparestesias) en las palmas y plantas de manos y pies que se irradia por toda la extremidad de manera bilateral y simétrica (50). Las crisis de dolor pueden estar desencadenadas por fiebre, ejercicio, fatiga, stress o cambios bruscos de temperatura (53). Pueden durar desde horas hasta días enteros y en muchas ocasiones no mejoran con tratamiento analgésico (54). También presentan dolor de forma crónica en forma de disestesias (50). La máxima severidad se produce en la 3º y 4º décadas de la vida con una mejoría posterior debido al deterioro de función sensitiva por la gran extensión de la afectación (26). Afecta tanto a fibras mielinizadas como no mielinizadas, ambas de pequeño tamaño por lo que los estudios habituales neurofisiológicos son normales ya que se realizan en fibras de mayor tamaño. Se han descrito depósitos de glicolípidos en perineuro, ganglios sensoriales y células endoteliales. Hay varias hipótesis sobre su patogenia, una de ellas atribuye dichos síntomas al depósito de Gb3 en los ganglios de las neuronas de las raíces dorsales que producirían apoptosis neuronal. También el acúmulo de lysoGb3 en los ganglios y axones de fibras pequeño tamaño afectas puede jugar un papel causal (50). En cuanto a la afectación del sistema nervioso autónomo se debe a la afectación selectiva de un tipo de fibra (Adelta) con preservación del resto y por tanto de algunas de las funciones del sistema nervioso autónomo (55) La afectación autonómica no es severa (50), a diferencia de la sensitiva previamente descrita. La hipo/anhidrosis objetivada afecta entre 50 % de los varones y 30 % de las mujeres (27) pero es uno de los síntomas precoces (56). También presentan afectación en la contracción pupilar, disminución en la formación de la saliva y de las lágrimas, afectación a la motilidad intestinal y alteraciones en el ritmo 1. INTRODUCCIÓN 11 cardiaco así como disminución en la reacción cutánea a la histamina (57). La afectación cerebrovascular incluye la presencia de infartos, accidentes isquémicos transitorios (AIT), cefaleas, vértigo y demencia vascular (2,50). El infarto puede llegar a ser incluso la primera manifestación de la enfermedad y se han descrito casos en niños (58). Está descrita una prevalencia entorno al 7% de los varones y 4% de las mujeres (59,60) se cree que la EF es la casusa de un porcentaje de infartos criptogenéticos (61). La causa de esta afectación cerebrovascular es resultado de una disfunción sistémica vascular multifactorial que incluye acumulación progresiva de Gb3 en las células endoteliales y en el músculo liso de los vasos con progresiva estenosis y oclusiones así como dilataciones en las pequeñas arterias (62), proliferación de músculo liso (36,63) y estado pretrombótico. Dicho estado pretrombótico es consecuencia de una disfunción endotelial (64), una ectasia vascular (65) y un aumento del flujo cerebral (66). Se han encontrado depósitos de glucolípidos en las neuronas de las neuronas del tronco del encéfalo, hipotálamo, amígdala, hipocampo y córtex entorrinal (63). Si bien los infartos ocurren en un porcentaje pequeño de pacientes con EF, las alteraciones en la neuroimagen se objetivan hasta en el 52% de pacientes de 55 años (67) y también han sido descritas en la infancia (68). Existe un hallazgo característico de la EF, el “signo pulvinar” que es objetivado hasta en el 23% de los pacientes con EF hacia los 30 años y es la traducción del aumento de flujo en la circulación posterior (69–72). Otros hallazgos encontrados en pacientes asintomáticos (70) son lesiones en materia blanca periventricular, mircrohemorragias, infartos corticales de la materia gris, infartos lacunares profundos y malformación Arnold Chiari tipo 1 (69,73). A pesar de que la distribución de las alteraciones se puede encontrar en cualquier localización predomina la afectación posterior. 1.1.5.4 Afectación Dermatológica Una de las manifestaciones más frecuentes son los angioqueratomas ya presentes en el 66% de los varones a los 19 años (45). Se describen como lesiones rojo oscuro/azul oscuro en las capas superficiales de la piel, pueden estar ligeramente sobreelevadas y no CRISTINA MELCÓN CRESPO 12 desaparecen con la presión, también se puede objetivar leve hiperqueratosis en lesiones muy extensas (1). Las localizaciones típicas son el tronco, los brazos la zona periumbilical y los genitales (46) de forma bilateral (1). El número y el tamaño de la lesiones cutáneas aumenta con la edad y la presencia de dichas lesiones se correlaciona con la severidad de las manifestaciones sistémicas (74). 1.1.5.5 Afectación Oftalmológica La córnea verticilata es prácticamente una característica obligatoria, ocurre hasta en un 70% de los pacientes (75). Consiste en una opacidad corneal, inferior, coloración crema. Inicialmente se presenta como una lesión difusa en la capa subepitelial, con el tiempo se extiende desde el centro a la periferia (76). Además, también pueden presentar cambios en los vasos conjuntivales, tortuosidad en los vasos retinianos, opacidades lenticulares, edema palpebral, atrofia óptica, papiledema, nistagmus, oftalmoplejía internuclear y oclusiones venosas retinianas (2). La agudeza visual no se ve afectada de forma habitual si bien se pueden producir pérdidas bruscas de visión en relación a oclusiones arteriales retinianas (50). Se ha demostrado una relación entre los cambios a nivel ocular y la severidad y el genotipo de la enfermedad (77). 1.1.5.6 Otras Manifestaciones Clínicas Los depósitos de glucoesfingolípidos en los pequeños vasos intestinales y en los ganglios autonómicos producen episodios de diarrea, náuseas y vómitos y dolores abdominales entre otros (78). A nivel neuropsiquiátrico se han descrito trastornos del aprendizaje y déficit de memoria (2). La afectación en el estado de ánimo también es una complicación descrita en estos pacientes con una prevalencia estimada 15-62% (79). El deterioro cognitivo se ha descrito hasta en un 29,3 de los pacientes con EF, sin encontrar relación con el tiempo de evolución pero sí con la mayor afectación a nivel cerebrovascular (80). Se han descrito problemas audiológicos (hipoacusia y tinnitus) en un porcentaje alto de niños (55% niñas y 39 % niños) (81). Se ha 1. INTRODUCCIÓN 13 descrito una afectación vestibular progresiva en ambos sexos (82) y una relación entre afectación vascular/neuropática y pérdida auditiva en varones (83). Los pacientes afectos de EF también pueden presentar alteraciones endocrinas, la más común es el hipotiroidismo con anticuerpos negativos (84). A nivel respiratorio los pacientes con EF presentan con mayor frecuencia obstrucción de la vía aérea ( 61 % varones y 26 mujeres) (85) que se ha demostrado que mejora tras inicio de TES (86). A nivel óseo varios estudios han demostrado la existencia de osteoporosis y osteopenia (50 % de los pacientes) llegando a producir fracturas lumbares espontáneas (85,87). CRISTINA MELCÓN CRESPO 14 Tabla 1. Resumen de las manifestaciones clínicas (V=Varón, M =Mujer). Modificado de Thomas y colaboradores (27). Órgano Síntomas Detalles Frecuencia estimada Edad media inicio (años) Cardiovas cular Anomalías conducción Atrial o ventricular. Puede requerir marcapasos o colocación de un desfibrilador Hipertrofia ventricular izquierda 46-88% (V) 18-28% (M) 38-42 (V) 49,8-55,4 (M) Anormalidades valvulares Regurgitación mitral o adelgazamiento válvula aórtica 29% (V) 48% (M) Riñón Proteinuria 44-84% (V) 33% (M) 20-30 Fallo renal Inicialmente presenta hiperfiltración renal evolucionando a IRT Anormal 47% (V), 35% (M) IRT 17-30,8% (V), 1-3% (M) Diálisis 36,7 (V) Trasplante Renal 40 (V) Cerebrovas cular ACV Aumento de proporción de eventos cirulatorios posteriores 6,9% (V) 4,3% (M) 39 (V) 46 (M) AIT Habitualmente precede al ACV. Asintomático detectando en resonancia magnética craneal lesiones en sustancia blanca o tortousidad vascular. ACV/AIT: 12-24% (V) 22-27% (M) 38,8 (V) 52 (M) Cefalea/Migra ña Asociado con aumento de riesgo ACV 15% (V) Piel Angioquerato ma Frecuentemente presente en regiones peri-umbilical y genital 71% (V) 17-35% (M) 16,8 años (V) Dismorfias faciales Filtrum corto, prominencia supraorbitaria, nariz bulbosa 56% (V) Hipohidrosis Pueden presentar hiperdrosis 56% (V) 33% (M) Linfedema Edema tobillo no fluctuante 14% (V) 8% (M) Ocular Córnea Verticilata 77 % (V) 73 % (M) Gastrointes tinal Dolor/Alteraci ones movilidad Dolor crónico, diarrea, estreñimiento 69% (V) 58% (M) Audiovesti bular Pérdida auditiva 41% (V) 23% (M) 29 (V) Audiograma patológico Pérdida auditiva neurosensorial para altas frecuencias 78% (V) Tinnitus 38% (V) 25% (M) Neurológica Dolor neuropático Desencadenantes: calor, ejercicio, stress, fiebre. Desaparecen en edad adulta 11 % 77% (V) 43-70% (M) 9,4-10,1 (V) 14-16,9 (M) 1. INTRODUCCIÓN 15 1.1.6 Manifestaciones Clínicas en la Infancia El acúmulo de esfingolípidos se inicia en el periodo fetal ya que se han detectado depósitos en Gb3 en varones afectos en la cara materna y fetal de la placenta, riñón, plexo mesentérico e hígado. La afectación corneal ha sido detectada a partir de la semana 22 de gestación (68). En una revisión realizada en 2014 (68) sobre todas las publicaciones existentes en relación a las manifestaciones clínicas presentadas en los primeros años de vida (< 5 años) se encontraron 120 artículos describiendo un total de 41 niños (ver Tabla 2). Los síntomas más frecuentes en esas edades fueron en primer lugar el dolor neuropático seguido de manifestaciones gastrointestinales. Las primeras lesiones en la sustancia blanca se han objetivado en niños de 8 años y no se han encontrado artículos en los que se haya realizado una resonancia magnética (RM) craneal en menores de 5 años (88). A nivel cutáneo se han objetivado inclusiones en forma de cebra en las células endoteliales y epiteliales en un niño de 12 meses sin objetivar angioqueratomas visibles (89). La afectación cardiaca objetivada en la infancia precoz incluye dolor torácico, enfermedad valvular leve, aumento de la masa de ventrículo derecho, acortamiento del intervalo PR e inversión de la onda T indicando inversión en la repolarización (90–92). Síntomas severos a nivel cardiaco no han sido descritos en periodos previos a la adolescencia (91). Se han descrito depósitos de Gb3 en biopsia renal de un niño de 4 años (93), las manifestaciones clínicas renales objetivadas en la infancia temprana son microalbuminuria, proteinuria y disminución del filtrado glomerular (68). La disminución del filtrado glomerural se ha detectado en un niño de 4 años (94). La determinación de la ratio albúmina/creatinina nos puede informar acerca de la progresión de la enfermedad y de la eficacia del tratamiento (68). En una revisión realizada en 2008 en pacientes pediátricos del Registro de Fabry (94), se objetivó entre un total de 352 niños analizados, una media de edad de comienzo de síntomas entorno a los 6 años en niños y 9 en niñas. El síntoma más común fue el dolor neuropático (58 % niños y 41 % niñas) seguido de los síntomas gastrointestinales. Tan sólo 3 de 352 niños evaluados tenía datos de Insuficiencia renal (estadio II) y otros 3 niños HVI. CRISTINA MELCÓN CRESPO 16 Tabla 2. Resumen de manifestaciones clínicas en pacientes con enfermedad de Fabry (recién nacidos-4 años). Modificado de Laney y colaboradores (68). Signos y síntomas relacionados a Fabry Registro más temprano de síntomas Hallazgos de depósitos de globotriaosylceramide en biopsias de órganos Prenatal Opacidades corneales (Córnea verticillata) Prenatal / recién nacido Trastornos gastrointestinales, incluyendo náuseas, vómitos, diarrea, estreñimiento y dolor abdominal 1 año Retraso en el crecimiento en varones (altura media/peso < percentil 50) 2 años Acroparestesias intermitentes/dolor neuropático desencadenado por stress/calor/cansancio/ejercicio 2 años Hipo/anhidrosis 2,5 años Crisis de Fabry de dolor neuropático agónico, que típicamente comienza en manos y pies y puede irradiar a zonas proximales 2,5 años Intolerancia al frio, calor y/o al ejercicio 3,5 años Tortuosidades en vasos retinianos 4,0 años Tinnitus / vértigo 4,0 años Disminución del filtrado glomerular 4,0 años Inversión de onda T en el ECG 4,0 años Enfermedad valvular cardiaca trivial 4,0 años Angioqueratomas 4,4 años 1.1.7 Diagnóstico La sospecha diagnóstica se establece en base a las manifestaciones clínicas previamente descritas (IRT/HVI/ACV de etiologías desconocidas, angioqueratomas, acroparestesias …) (1). La confirmación diagnóstica en varones se puede realizar determinando la actividad enzimática en leucocitos de la α-galactosidasa, sin embargo, el estudio molecular es importante para establecer el fenotipo clínico, valorar tratamientos específicos (chaperonas) y realizar estudios en el resto de familiares. En las mujeres es necesario el estudio molecular para confirmar la enfermedad ya que la actividad enzimática en sangre puede ser normal aun en presencia de afectación en órganos (95). 1.1.7.1 Actividad enzimática La determinación de la actividad de la enzima α-galactosidasa se puede realizar en leucocitos de sangre periférica, cultivo de fibroblastos o gotas de sangre seca en papel de filtro (49). Consiste en la realización 1. INTRODUCCIÓN 17 de un análisis fluorimétrico utilizando como substrato 4metilumbelliferil-alfa –D-galactopiranosida o un espectómetro de masas. Valores inferiores a 1 % son compatibles con un fenotipo clásico mientras que valores por debajo del rango normal (< 25 %) pero mayores al 1% son detectados en varones con variantes atípicas/ atenuadas (26,50,95). Algunos autores consideran que el valor de la actividad enzimática es de gran importancia ya que se puede considerar que los varones portadores de variantes genéticas de significado incierto (GVUS) pero con actividad enzimática normal no tiene enfermedad de Fabry (95). Otros autores (96) relacionan la actividad enzimática y el tipo de variante del gen GLA teniendo en cuenta que algunas variantes con valores enzimáticos entre el 20 y 50 % precisan de algún otro factor de riesgo para poder producir enfermedad (ver Figura 6). Figura 6 Relación entre variantes gen GLA y actividad enzimática α-GalA. Figura modificada de Schiffmann y colaboradores (96). (Con permiso de Springer Nature) La actividad enzimática en las mujeres no sirve como método de diagnóstico ya que dicho valor puede ser normal en mujeres afectas (49) debido al efecto Lyon que consiste en la inactivación aleatoria del cromosoma X (28,50). Las mujeres heterocigotas son un “mosaico” de células “normales y mutadas” en proporciones variadas en cada órgano (26) según el cromosoma que haya sido inactivado. Por tanto, la determinación de la actividad puede variar dependiendo que cromosoma X se encuentre inactivo en la muestra que se está CRISTINA MELCÓN CRESPO 24 En 2018 se ha publicado un documento de consenso sobre los objetivos terapéuticos específicos y concretos a conseguir según el órgano afecto y el grado de afectación clínica al diagnóstico (117). En general se debe disminuir e incluso detener la progresión de la enfermedad, mejorar la calidad de vida de los pacientes, revertir los daños a nivel fisiopatológico y minimizar la morbilidad intentando así mismo aumentar la supervivencia (117). Múltiples estudios clínicos se están realizando en el momento actual. En el registro de ensayos clínicos y estudios observacionales desarrollado por el Instituto Nacional de Salud de Estados Unidos (118), se registran hasta 142 estudios abiertos en el momento actual, de los cuales 65 son realizados en pacientes < 18 años. 1.1.8.1 Terapia Enzimática Sustitutiva (TES) La piedra angular en el tratamiento de la EF es la TES (32). Está disponible en Europa desde 2001 y en Estados Unidos desde 2003 (50). Consiste en la administración intravenosa bisemanal de αgalactosidasa A humana recombinante (agalsidasa). Dicha molécula se une a receptores de la membrana celular (Mannosa-6-fosfato) para ser posteriormente internalizado hacia el lisoma y activarse debido al pH lisosomal bajo (32). Existen dos preparados comerciales: Agalsidasa alfa (Replagal, producido por la farmacéutica Shire) y Agalsidasa beta (Fabrazyme producido por la farmacéutica Sanofi), este último es el único comercializado en Estados Unidos (ver Tabla 5). Ambas proteínas tienen la misma secuencia de aminoácidos que la enzima nativa humana y se diferencian en el patrón de glicosilación (50), ya que se producen en líneas celulares diferentes. Se han realizado múltiples estudios comparando la eficacia de ambos fármacos sin encontrar diferencias significativas (50) si bien se ha demostrado que solo las dosis elevadas que se utilizan con agalsidasa beta (1 mg/Kg/2 semanas) son capaces de eliminar los depósitos de glucoesfingolípidos de los podocitos debido a que dosis menores con tiempos de infusión más rápidos producen una menor actividad enzimática intracelular (119). En un estudio reciente comparando ambas enzimas sugieren una mayor reducción de los depósitos con la utilización de Agalsidasa beta (120). La eficacia de TES ha sido ampliamente demostrada objetivando 1. INTRODUCCIÓN 25 la disminución de los depósitos de Gb3, la mejora en la función cardiaca, la estabilización de la función renal así como el impacto favorable en la calidad de vida (121). Su utilización en la edad pediátrica y en la adolescencia sugiere que incluso puede cambiar potencialmente el curso natural de la enfermedad (121). Para monitorizar la eficacia del tratamiento se debe comprobar la disminución de los depósitos de glucoesfingolípidos y el daño tisular. La disminución de los depósitos de glucoesfingolípicos se puede comprobar de forma invasiva realizando una biopsia del órgano afecto o de forma no invasiva mediante la determinación de LysoGb3 circulante siendo dicha determinación en el momento actual el mejor marcador no invasivo (32) También es posible la determinación de Gb3 en plasma y orina (117). El daño tisular se comprueba realizando estudio de función renal (ratio albúmina/creatinina, Filtrado Glomerular Estimado), ecocardiografía o Resonancia Magnética (RM) cardiaca, Holter Cardiaco, RM cerebral, audiometrías y/o escalas de dolor (32). El índice de Severidad de Mainz (Mainz Severity Score Index) también se utiliza como sistema de monitorización de la mejoría clínica objetivada en pacientes con enfermedad de Fabry clásica que reciben TES (3). Asociado al uso de TES se ha objetivado la formación de anticuerpos, la mayoría del tipo IgG, que pueden ocasionar desde la neutralización de la actividad enzimática, alteración de la biodisponibilidad o reacciones de hipersensibilidad (27). La frecuencia de aparición de dichos anticuerpos se sitúa en torno a 64 % en varones al administrar Agalsidasa alfa pudiendo incluso no aparecer en mujeres (27) y 88 % en varones (122) y 53 % en mujeres si se utiliza Agalsidasa beta (123). En un estudio reciente comparando ambas enzimas (120) se constató la mayor prevalencia de anticuerpos en aquellos pacientes que recibían tratamiento con Agalsidasa beta (refieren en posible relación a la dosis o a su obtención debido a diferencias en la glicosilación) si bien la progresiva disminución en LysoGb3 no se vería afectada lo que significaría que no tendría relevancia clínica (relacionado con el uso de dosis elevadas que superaría el efecto negativo de la formación de anticuerpos). En aquellos pacientes a los que se les administraba Agalsidasa alfa y desarrollaban anticuerpos sí se objetivaba una CRISTINA MELCÓN CRESPO 26 disminución de LysoGb3 menos prominente. Estudios recientes se encaminan hacia la posibilidad de la utilización de terapia inmunoduladora en pacientes que hayan desarrollado estos anticuerpos (124). El inicio de TES es un tema importante ya que se debe comenzar con dicho tratamiento tan pronto aparezcan los primeros síntomas y signos ya que la eficacia será mayor si se comienza en etapas tempranas teniendo una eficacia limitada en estadios avanzados (50). Según el último documento de consenso en cuanto al comienzo del tratamiento con TES (95) se recomienda el inicio de TES en todo varón portador de una mutación en el gen GLA que provoquen enfermedad típica/clásica independientemente de la edad y de la existencia de sintomatología. Se ha demostrado la evidencia histológica de la acumulación de Gb3 así como el daño celular y vascular en tejido renal en ausencia de manifestaciones clínicas, incluida microalbuminuria, en niños varones portadores de mutaciones con fenotipo clásico (125). En las mujeres portadoras de variantes del gen GLA causantes de EF clásica se debe iniciar TES si presentan afectación clínica sugestiva de EF (dolor neuropático, proteinuria/albuminuria, ACV/AIT, afectación cardiaca, gastrointestinal…) y también se debe considerar iniciar TES si presentan datos de laboratorio/imagen que evidencien inicio de daño renal, cardiaco, cerebrovascular (disminución filtrado glomerular, albuminuria persistente, infartos silentes, MCPH, arritmias…). En aquellos pacientes, varones o mujeres, portadores de variantes causantes de EF de inicio tardío o Variantes de Significado Incierto se debe considerar el inicio de TES ante sintomatología compatible con EF o datos de laboratorio/imagen que evidencien inicio de daño renal, cardiaco, cerebrovascular atribuibles a la EF para lo que puede requerir evidenciar acúmulo de Gb3 de forma histológica o bioquímica. También es importante determinar en qué fases clínicas el tratamiento con TES no se debe iniciar. En 2015 el grupo de trabajo europeo sobre la EF elaboró un documento de consenso sobre el tratamiento con TES y realizó una serie de recomendaciones al respecto de cuando no iniciarlo. Dicho comité de expertos no recomienda iniciar TES en pacientes con importante afectación cardiaca (extensa fibrosis) y en los que la indicación de TES se hace exclusivamente en relación a 1. INTRODUCCIÓN 27 su patología cardiaca (126). En dicho documento no se llegó a ningún consenso acerca de la no recomendación de inicio de TES en pacientes con IRT. Tabla 5. Preparados de agalsidasa de disponibilidad generalizada. Modificada de Ortiz y colaboradores (32). Agalsidasa-α Agalsidasa-β Características del producto Naturaleza Proteína recombinante humana Proteína recombinante humana Obtenida de Células de fibrosarcoma humano Células CHO Disponibilidad Mundial, excluyendo EE.UU. Mundial y EE.UU. Ensayos controlados por placebo y seguimiento a largo plazo Ensayos fase I para determinar la dosis (mg/kg): dosis estudiada 0,007; 0,014; 0,028; 0,056; 0,1 (dosis única) 0,3; 1,0; 3,0 (5 dosis consecutivas, cada 2 semanas) Dosis probadas en ensayos controlados por placebo fase II/III (mg/kg/2 semanas) 0,2 1,0 Publicación de los resultados del seguimiento de 10 años de los pacientes incluidos en los ensayos controlados por placebo fase II/III No Sí Pacientes de ensayos clínicos aleatorizados fase II/III que requirieron duplicar la dosis acumulativa (administración semanal) por respuesta clínica subóptima tras la finalización del ensayo 12/41 (29%) Ninguno reportado Ensayo controlado por placebo fase IV, criterio de valoración primario: sucesos clínicos graves No Sí Comparación directa Ensayo clínico CFDI fase IV alfa 0,2 frente a beta 1 mg/kg/2 semanas. Sucesos clínicos graves por paciente, 8 años de seguimiento 0,65 0,33 Información del prospecto Administración Intravenosa Intravenosa Tiempo de infusión (min) 40 >120 Dosis recomendada (mg/kg/2 semanas) 0,2 1,0 Actividad enzimática intracelular en la dosis e intervalos de dosis del prospecto Actividad intracelular de alfa-galactosidasa A en leucocitos, AUC durante 2 semanas (media [IC95%], h [nmol/h/mg]) a la dosis recomendada en el prospecto 396 (299-493) 3709 (2517-4900) AUC: área bajo la curva; CFDI: Canadian fabry Disease Initiative (“Iniciativa Canadiense para la enfermedad de Fabry”); CHO; Chinese hámster ovary cells (“células de ovario de hámster chino”); IC: intervalo de confianza. 28 29 1.1.8.2 Chaperona Las Chaperonas son pequeñas moléculas que se unen al sitio activo de la α-galactosidasa A y ayudan su correcto plegado (27). Esto hace que la enzima pueda ser trasportada desde el retículo endoplásmico al interior del lisosoma donde pueda ejercer su función (24,27). Por tanto, dichas moléculas solo se podrán utilizar con determinadas variantes del gen GLA que causen enzimas con plegados anómalos (denominadas “mutaciones susceptibles”). La chaperona farmacológica Migalastat (DGJ, 1deoxygalactonojirimycin, AT1001) (27), ha sido la primera chaperona para la EF aprobada por la Agencia Europea del Medicamento en el año 2016 y en agosto 2018 por la FDA (Food and Drug Administration). Está indicada en pacientes con diagnóstico de EF portadores de mutaciones susceptibles, con filtrado glomerular ≥30mL/min/1.73m2 y de edad ≥ 16 años en Unión Europea, Suiza, Australia, Korea, Israel y Japón y ≥18 años en Estados Unidos y Canadá (24,127). Se administra en monoterapia por vía oral a días alternos (128). Para la detección de dichas mutaciones susceptibles se realiza un ensayo de susceptibilidad de migalastat que consiste en medir el aumento en la actividad de la enzima α-galactosidasa A inducido por migalastat en células portadoras de la variante GLA a estudio (127). Se ha estimado que migalastat se podría utilizar en el 30 % del total de pacientes con EF (124). Ha demostrado su eficacia comparada con placebo en el ensayo FACETS con 67 pacientes objetivando disminución en los depósitos de Gb3 renales y en plasma, estabilizando la función renal, disminuyendo la masa cardiaca y mejorando los síntomas gastrointestinales (24,127,129). También se ha constatado su eficacia comparada con TES en el ensayo ATTRACT que incluía 60 sujetos, en el que se detectó similar efecto a nivel de la función renal así como una mayor reducción en la masa cardiaca (24,127,130). En el momento actual se está llevando a cabo un estudio en fase II explorando la terapia combinada (TES+Migalastat) objetivando aumento de la actividad enzimática comparado con TES (124), así como un ensayo clínico para valorar la eficacia en niños mayores de 12 años (Número de identificación del estudio en ClinicalTrials.gov: NCT03500094) (118). CRISTINA MELCÓN CRESPO 30 1.1.8.3 Otros tratamientos La terapia génica ofrece la ventaja de la posibilidad de una actividad enzimática continua a diferencia de la terapia intermitente, tipo bolus, de los otros tratamientos (27). Se están desarrollando terapias tanto ex vivo (extracción de células madre del paciente afecto, corrección genética y reinfusión) como in vivo (introducción de un vector que sobreexpresa la proteína recombinante en el organismo) (27). Asimismo se ha planteado el uso de un vector basado en AAV8 para la edición in vivo del locus de la albumina y la expresión especifica del alfa galactosidasa A en el hígado (21). Se ha demostrado en modelos de ratón que la inyección del virus produce un aumento de actividad enzimática y disminución de Gb3 (17,18) pero falta todavía la prueba de concepto clínica y datos de seguridad (22). En relación a la terapia génica ex vivo para la enfermedad de Fabry se están desarrollando ya en la actualidad varios ensayos en fase clínica (Número de identificación de los estudios en ClinicalTrials.gov: NCT03454893, NCT02800070, NCT03454893). En el ensayo clínico iniciado en 2017 en Canadá por Medin y colaboradores (131) (Número de identificación de los estudios en ClinicalTrials.gov: NCT02800070) se ha llevado a cabo un autotransplante de células recombinantes en 3 pacientes varones con EF clásica objetivando hasta el momento datos de seguridad y eficacia (118). Otros tratamientos en desarrollo son aquellos que pretenden disminuir la generación de esfingolípidos, conocidos como tratamientos de reducción de sustratos (32). Lucerastat (23) es un inhibidor de la enzima glucosilceramida sintasa reduciendo de esta forma la producción de glucoesfingolípidos, su administración es oral e independientemente del tipo de mutación. Actualmente se encuentra en ensayo clínico fase 3 en monoterapia en paciente con EF con la intención de mejorar el dolor neuropático. La molécula de agalsidasa de vida media prolongada también está siendo desarrollada (32). Recientemente se han publicado los resultados del estudio realizado con la molécula Pegunigalsidasa alfa administrada en 16 pacientes con EF que, tras un año de tratamiento, objetivan un perfil farmacocinético único (vida media en plasma 53-121 horas) así 1. INTRODUCCIÓN 31 como menor inmunogenicidad que el resto de moléculas utilizadas habitualmente en TES (132). 1.1.8.4 Tratamiento Complementario Asociado a la TES y a la terapia con chaperonas se debe realizar el tratamiento “órgano-específico” al que nos referiremos como tratamiento complementario. Según el órgano afecto y las manifestaciones clínicas existirán una serie de tratamientos recomendados y disponibles (Ver Tabla 6), (26,95). Tabla 6. Tratamiento complementario en Enfermedad de Fabry. Modificada de Schiffmann y colaboradores (26). Síntomas Terapia Arritmias Desfibrilador Automático Implantable, marcapasos, Anticoagulantes Insuficiencia cardiaca Trasplante Cardiaco Proteinuria Fármacos inhibidores de la enzima convertidora en angiotensina, bloqueantes receptor angiotensina, control de la tensión arterial. Insuficiencia renal Diálisis, trasplante renal Neuropatía Antiepiléptico (Carbamacepina, gabapentina, pregabalina…) Evitar desencadenantes. Afectación cerebrovascular Antiplaquetarios (Clopidrogrel, ácido acetil salicílico), eliminar factores de riesgo (tabaco, hipertensión arterial, hiperlipidemia..) Manifestaciones digestivas Metoclopramida, ranitidina. Depresión Tratamiento antidepresivo Pérdida auditiva Audífonos, implante coclear Hipotiroidismo Tratamiento hormonal sustitutorio 1.1.8.5 Tratamiento en el paciente pediátrico El TES de la EF debe iniciarse en estadios precoces para actuar sobre cambios patológicos potencialmente reversibles y así conseguir reducir al máximo las consecuencias a largo plazo. El efecto de TES es limitado en estadios avanzados al encontrarnos a nivel molecular con cambios histopatológicos irreversibles como la fibrosis (133). En una revisión publicada en 2018 analizando todas la publicaciones realizadas sobre el uso de TES en la edad pediátrica (134) se comprobó cómo tras el inicio del tratamiento con TES los niveles de Gb3 se redujeron significativamente o incluso se normalizaron. Además, objetivaron CRISTINA MELCÓN CRESPO 32 mejoría clínica en relación a los dolores neuropáticos, síntomas gastrointestinales y calidad de vida. De acuerdo con el último consenso sobre el manejo de la EF, el tratamiento con TES en aquellos pacientes varones portadores de una variante del gen GLA asociado a un fenotipo clásico debe considerarse independientemente de la edad (95), otras recomendaciones sitúan a entre los 8-10 años el inicio de TES (133). Según el consenso previamente mencionado sobre el uso de TES, las niñas portadoras de una variante del gen GLA asociado a un fenotipo clásico deben considerarse iniciar TES si se hallan sintomáticas o aquellas asintomáticas pero que presenten micoalbuminuria, alteraciones en sustancia blanca o hallazgos de afectación cardiaca. Mismas indicaciones se recomiendan en aquellos niños/as portadores de variantes del gen GLA de inicio tardío o variantes de significado incierto (95). En cuanto al tratamiento complementario en la infancia, según las manifestaciones clínicas descritas previamente en la edad pediátrica (1.1.6 Manifestaciones Clínicas en la Infancia), la afectación más frecuente y que mayores consecuencias produce en la calidad de vida de los niños es el dolor neuropático. Además de evitar los posibles desencadenantes (calor, stress…) un adecuado manejo farmacológico es de vital importancia tanto en las crisis de dolor agudo como de forma crónica (133) (ver Figura 7 ). El resto de tratamientos complementarios descritos previamente (1.1.8.4 Tratamiento Complementario) también deben ser utilizados según las manifestaciones clínicas presentadas. Figura 7 Esquema de tratamiento del dolor Neuropático en EF. (QoL = Quality of life = Calidad de vida). Modificada de Hopkin y colaboradores (133). (Con permiso de Elservier) 33 CRISTINA MELCÓN CRESPO 40  Debe tener un tratamiento aceptado para los pacientes diagnosticados y debe existir un consenso sobre quién debe ser tratado.  La detección de los casos debe ser un proceso continuo. Dulín-Íñiguez y Col (138) resumen en 5 puntos los puntos previos:  Enfermedad con una morbi/mortalidad grave si no se diagnostica en el periodo neonatal.  No es posible detectarla con una exploración física en el periodo neonatal.  Debe existir un tratamiento efectivo.  Debe poseer una incidencia >1/10000-15000 recién nacidos.  Debe existir un método de cribado rápido, fiable y bajo coste. Dichos criterios se han revisado posteriormente y se incluyen otros como son la relación entre la detección precoz y la reducción de la mortalidad o la relación con la supervivencia….(138) Antes de la ejecución de todo cribado neonatal debe considerarse la relación beneficio/daño ya que la detección en periodo neonatal de dichas enfermedades debe ocasionar un beneficio clínico al paciente. Los cribados neonatales han experimentado un importante aumento en los últimos años en cuanto a las enfermedades incluidas en ellos en parte debido a la utilización de la espectrometría de masas en tándem como método de determinación. La elevada sensibilidad de la espectrometría de masas y la alta selectividad de los aparatos más recientes hace que se hayan convertido en una herramienta estándar en los laboratorios de cribado y potencian la inclusión de múltiples enfermedades en el cribado neonatal, entre otras las enfermedades lisosomales. Además, la existencia de tratamientos específicos para estas patologías es un incentivo adicional para la introducción de estas enfermedades en el cribado (140). La enfermedad de Fabry, al igual que otras enfermedades lisosomales, también ha comenzado a formar parte de los cribados neonatales. La EF posee todas las características necesarias para ser incluida en dichos programas de cribado. Es una enfermedad grave, 1. INTRODUCCIÓN 41 frecuente y que, de no ser detectada en fases precoces, lo que ocurre de forma habitual debido a sus síntomas poco específicos, produce graves morbilidades, así como una reducción de la esperanza de vida. La existencia de un tratamiento eficaz, sobre todo iniciado en fases tempranas favorece aún más su inclusión dentro de los programas de cribado neonatal. Para la realización del cribado de la EF, de forma inicial se cuantifica la actividad enzimática de α-GalA y en aquellos casos con baja actividad enzimática se lleva a cabo el estudio genético permitiendo identificar variante genéticas en el gen GLA causantes de EF. Estudios recientes (97) postulan la alta tasa de falsos negativos existentes entre las mujeres al utilizar como método de cribado inicial la actividad enzimática ya que hasta un 83% de las mujeres portadoras de variante patogénica del gen GLA presentan actividades enzimáticas por encima del punto de corte considerado como patológico necesario para continuar el estudio y realizar el estudio genético. Es por ello que se están comenzado a realizar los primeros estudios pilotos en los que se realiza directamente como método de cribado inicial en las mujeres el estudio genético del gen GLA sin necesidad de presentar una actividad enzimática baja (97). El primer cribado neonatal de la EF se realizó a finales de la década 90 en Países Bajos y Australia. Desde entonces varios estudios piloto se pusieron en marcha en otros países, cuyos resultados figuran en la Tabla 9. En estos cribados se objetivó una incidencia de la EF mayor que la que inicialmente se sospechaba. Esto se debe a la elevada frecuencia de detección de fenotipos de inicio tardío. La EF fue incorporada por primera vez en un panel de cribado neonatal en Missouri en el año 2013 (141). CRISTINA MELCÓN CRESPO 42 Tabla 9. Cribados neonatales realizados en el mundo. Modificada de NavarreteMartínez y colaboradores (142). Localización, año del estudio Individuos testados Incidencia Países Bajos, 1999 1 en 238 100 (varones) Australia, 1999 1 en 117 000 UK, 2001 1 en 366 000 (varones) Italia, 2006 37 104 1 en 3 100 Taiwan, 2009 171 977 1 en 1 250 (varones) 1 en 40 840 (mujeres) 1 en 22 570 (forma clásica) Taiwan, 2009 110 027 1 en 1 368 Japón, 2009 21 170 1 en 7 057 Hungría, 2012 40 024 1 en 13 341 Austria, 2012 34 736 1 en 3 859 Washington, 2013 110 000 1 en 7 800 (varones) Taiwan, 2014 191 767 1 en 2 997 Missouri, 2015 43 701 1 en 2 913 Washington, 2016 43 000 1 en 10 000 (varones) Illinois, 2017 219 973 1 en 8 454 México, 2017 20 018 1 en 2 048 New York, 2018 65 605 1 en 9372 Norte de Italia, 2018 44 411 1 en 8882 La puesta en marcha de los cribados neonatales ha traído consigo el hallazgo de un sinfín de variantes del gen GLA. Algunas son mutaciones consideradas claramente patogénicas (ocasionan EF clásica o de inicio tardío) y un gran número de ellas son mutaciones de significado incierto en las que no se ha podido establecer una clara relación causal con el fenotipo del paciente y por tanto establecer una relación genotipo-fenotipo. La identificación de las variantes patogénicas (EF Clásica o de inicio tardío) de forma precoz permitiría el inicio del tratamiento de forma temprana. Aun así, el diagnóstico precoz de las formas tardías de la enfermedad de Fabry mediante programas de cribado neonatal, plantea varias preocupaciones éticas, como el aumento de la ansiedad de los padres, la privación de autonomía del niño, el incremento de las intervenciones terapéuticas y la realización de múltiples procedimientos diagnósticos que propician un aumento de la ansiedad anticipatoria (141). En un estudio realizado por Lisi y colaboradores en Austria y publicado en 2016 (141) sobre la opinión, en pacientes diagnosticados de EF y otras enfermedades lisosomales (Enfermedad de Pompe de inicio tardío y enfermedad de Gaucher) sobre los programas de cribado neonatal se objetivó una gran aprobación (78.8%) 1. INTRODUCCIÓN 43 para la realización de dichos cribados en periodo neonatal incluso teniendo en cuenta que el inicio de la sintomatología sea tardío y al realizar el diagnóstico tan precoz ocasionemos ansiedad parental o pérdida de autonomía de los niños y su medicalización. Los pacientes manifiestan que el diagnóstico precoz habría evitado retrasos en el diagnóstico (en este estudio, más del 50 % de los pacientes con EF esperaron más de 5 años para ser diagnosticados desde el inicio de los síntomas) y les habría hecho tomar diferentes decisiones en su vida. En concreto en los pacientes afectos de EF, se objetivó como la mayoría (57%) considera que su estado de salud actual habría sido mejor si hubiesen sido diagnosticados en periodo neonatal, el 42% estaría más satisfecho con su vida actual y ningún paciente manifestó que su vida sería peor en el momento actual de haber sido diagnosticado mediante un programa de cribado neonatal. La elevada frecuencia de detección de variantes de significado incierto debe ser un factor a la hora de decidir la incorporación de la EF en el panel del cribado neonatal, evaluando las ventajas y desventajas. Macklin y colaboradores (143) evaluaron el impacto psicosocial del diagnóstico de la condición de portador de una variante de patogenia dudosa [c.427G>A; p.(Ala143Thr)]. La mitad de los encuestados se sentía frustrado por la falta de información clara, pero a pesar la ambigüedad, dadas las consecuencias clínicas, creían que el conocimiento de dicho estado de portador les ayudaría en la práctica clínica. De esta forma, una mejor aproximación diagnóstica de estas variantes es crucial. La importancia de establecer una correlación genotipo-fenotipo se traduciría en una correcta información y clasificación de estos pacientes portadores de variantes de significado incierto y una inclusión precoz en los protocolos de tratamiento de ser considerada la variante encontrada como patogénica. Debido a estas dificultades para establecer una adecuada correlación de genotipofenotipo, la incorporación de la EF en los paneles de cribado neonatal genera mucha controversia. Para poder establecer una correcta relación genotipo-fenotipo es de vital importancia el desarrollo de nuevos métodos diagnósticos que puedan clasificar estas variantes de significado incierto como patogénicas o no en base a su implicación a nivel molecular así como CRISTINA MELCÓN CRESPO 44 conocer la evolución clínica de los pacientes portadores de estas variantes y la de sus familiares afectos. 1.2.2 Cribado en otras poblaciones Doheny y colaboradores (144) llevaron a cabo una búsqueda de los cribados realizados desde 1995 hasta 2017 en varias poblaciones de riesgo (Hemodiálisis, trasplantados renales, patología cardiaca MCPH/Hipertrofia ventrículo izquierdo y ACV). En la Tabla 10 y Tabla 11 se resumen los datos combinados de todos los estudios realizados en varones y mujeres respectivamente. En las poblaciones en hemodiálisis 1/490 varones y 1/670 mujeres son portadores de mutaciones patogénicas del gen GLA. En pacientes con MCPH/hipertrofia de ventrículo izquierdo 1/106 hombres y 1/111mujeres han sido diagnosticados de EF y en los estudios realizados en pacientes que han presentado ACV en 1/780 varones y 1/690 mujeres se han detectado variantes patogénicas del gen GLA. Es de destacar que la mayoría de los pacientes diagnosticados de EF en contexto clínico de hemodiálisis y ACV son portadores de variantes del gen GLA de forma clásica, por lo que dichos pacientes han de presentar otras manifestaciones clínicas sugestivas de EF desde edades tempranas no habiendo siendo diagnosticados previamente lo que pone manifiesto la falta de un diagnóstico precoz incluso en las formas clásicas de EF. Tabla 10. Resumen Cribados EF Mujeres 1995-2017. Modificado de Doheny y colaboradores (144). Revisados por fenotipo Patogénicas Benignas Estudio clínico Estudios (n) Mujeres (n) Positivos Totales n(%) Total n(%) Clásico n(%) Inicio Tardío n(%) Tipo1: Tipo2 ratio Benignas n(%) % de variantes Hemodiálisis 20 12866 87 (0.68) 19 (0.15) 13 (0.10) 6 (0.05) 2:1 68 (0.53) 78.3 Trasplante Renal 2 1043 3 (0.29) 0 (0.00) - - - 3 (0.29) 100.0 Patología Cardiaca (MCPH) 12 1437 22 (1.53) 13 (0.9) 8 (0.56) 5 (0.35) 2:1 9 (0.63) 49.9 ACV 14 2074 23 (1.11) 3 (0.14) 3 (0.14) 0 (0.00) 1:0 20 (0.96) 87.0 Tabla 11. Resumen Cribados EF Varones 1995-2017. Modificado de Doheny y colaboradores (144). Revisados por fenotipo Patogénicas Benignas Estudio clínico Estudios (n) Hombres (n) Positivos Totales n(%) Total n(%) Clásico n(%) Inicio Tardío n(%) Tipo1: Tipo2 ratio Benignas n(%) % de variantes Hemodiálisis 27 23954 101(0.42) 50 (0.21) 33 (0.14) 17 (0.07) 2:1 51 (0.21) 50.5 Trasplante Renal 3 2031 11 (0.54) 5 (0.25) 3 (0.15) 2 (0.10) 3:2 6 (0.30) 54.5 Patología Cardiaca (MCPH) 16 4054 49 (1.21) 38 (0.94) 9 (0.22) 29 (0.72) 1:3 11 (0.27) 22.5 ACV 16 3904 26 (0.67) 5 (0.13) 3 (0.08) 2 (0.05) 3:2 21 (0.54) 80.8 45 46 1.2.2.1 Cribado en Población con Enfermedad Renal Crónica Se han llevado a cabo múltiples estudios de cribado en pacientes con insuficiencia renal crónica (IRC) como se detalla en la Tabla 12 (145). Según la población incluida en el cribado, IRC/Pacientes dializados/trasplantados renales…. Las prevalencias varían entre 0-1 siendo una estimación media de la prevalencia 0.2-0.3 %. Debido a la gran cantidad de pacientes con enfermedad renal crónica portadores de GVUS detectados en dichos estudios de cribado realizados en poblaciones con afectación en la función renal de forma severa sin diagnóstico etiológico, Van der Tol y colaboradores recomiendan realizar una biopsia renal en aquellos individuos afectos de una enfermedad renal crónica que sean portadores de una variante del gen GLA de significado incierto con el objeto de confirmar o rechazar el diagnóstico de EF y de este modo iniciar o no TES además de la implicación que ello conlleva en la realización de cribado de otros familiares (146). 1. INTRODUCCIÓN 47 Tabla 12. Cribados en Población con IRC. (DBS= Dried Blood Spot; WBC=White blood cell). Modificado de Trachoo y colaboradores (145). País Género Tipo de muestra Prevalencia Referencia Japón M y F Plasma 0,28 Utsumi et al., 2000 Japón M Plasma, WBC, genética 1,17 Nakao et al., 2003 Holanda M Plasma 0,20 Linthorst et al., 2003 Austria M y F DBS, WBC, genética 0,16 Kotanko et al., 2004 Francia M y F WBC, genética 0,94 Bekri et al., 2005 Japón M Plasma, genética 0,22 Ichinose et al., 2005 Japón M y F Plasma, WBC, genética 0,72 Tanaka et al., 2005 Rep. Checa M y F DBS, WBC 0,15 Merta et al., 2007 Lituania M DBS 0 Maslauskiene et al., 2007 Canadá M Plasma, WBC 0 Andrade et al., 2008 Brasil M DBS, plasma 0,36 Porsch et al., 2008 Holanda M y F Plasma, genética 0.33 Terryn et al., 2008 España M y F DBS, genética 0,55 Gaspar et al., 2010 UK M DBS, plasma, WBC 0 Wallin et al., 2011 Japón M y F DBS, genética 0,32 Nishimo et al., 2012 Japón M Suero, genética 0,19 Doi et al., 2012 Turquía M Plasma, genética 0,25 Kalkan Ucar et al., 2012 Japón M Plasma, genética 0,21 Maruyama et al., 2013 Turquía M y F DBS, genética 0,18 Okur et al., 2013 Líbano M DBS, genética 0 Kabalan et al., 2013 España M y F Plasma, genética 0,30 Herrera and Miranda et al., 2014 Tailandia M y F DBS, genética 0 Trachoo et al., 2017 Módena M y F DBS, plasma, genética 0 Alfano et al., 2018 Taiwan M DBS y genética 0,59 Lin et al., 2018 1.2.2.2 Cribado en Población con MCPH No son muchos los estudios de cribado realizados entre pacientes con MCPH de etiología desconocida (ver Tabla 13). Se han objetivado prevalencias entre 0.5-6 % de pacientes con EF (42,43,147–151) con prevalencia media estimada 0.5-1%. En dichos estudios se han encontrado una gran cantidad de pacientes portadores de GVUS en el gen GLA por lo que se ha realizado un consenso sobre la actitud diagnóstica y con ello terapéutica en estos CRISTINA MELCÓN CRESPO 48 pacientes. Aquellos pacientes adultos que presentan una hipertrofia ventricular izquierda (adelgazamiento máximo de la pared en diástole > 12 mm) y son portadores de GVUS en gen GLA si además NO presentaban voltajes bajos en el ECG (< 1.5 mV) y la severidad de la hipertrofia en edades tempranas NO es severa (adelgazamiento máximo de la pared en diástole 12-15 mm en menores de 20 años) se debe sospechar EF y por tanto se debe considerar realizar una biopsia endomiocárdica para confirmar un diagnóstico definitivo. No se debe considerar la EF como causa etiológica de la presencia de hipertrofia ventricular izquierda y por tanto no se debe realizar cribado de EF en aquellos pacientes que además de presentar hipertrofia ventricular izquierda tengan voltajes bajos en el ECG y la hipertrofia sea severa en edades tempranas (152). Recientemente se ha publicado un estudio de cribado en pacientes con MCPH (153) en el que se realizó una estimación del coste de dicho cribado utilizando el estudio enzimático de forma inicial independientemente del sexo y realizando la secuenciación del gen GLA en aquellos sujetos en los que la actividad enzimática se encuentre reducida. La prevalencia obtenida (0.42 %) concuerda con la descrita en otros estudios similares (ver Tabla 13) y el coste estimado para la detección de 1 paciente con EF es de 24000 dólares, menor que lo que los 60000 dólares estimados que supondría un estudio de cribado en el que se realizase la determinación de actividad enzimática a los varones y la secuenciación del gen GLA a todas las mujeres y a aquellos varones con actividades enzimáticas bajas. Concluyen que la realización de un programa de cribado de EF en pacientes con MCPH determinando la actividad enzimática supone un menor coste por diagnóstico. 1. INTRODUCCIÓN 49 Tabla 13. Resumen de Cribados Destacados en Población con MCPH (42,43,147–151) Localización, año Pacientes estudiados Pacientes con variantes GLA Prevalencia Japón, 1995 230 7 3% Reino Unido, 2002 79 5 6.3% España, 2007 508 5 1% Francia, 2011 392 4 1% Europa, 2011 1386 7 0.5% Japón, 2016 177 (Varones) 2 1.1% EEUU, 2018 585 2 0.34% 1.2.2.3 Cribado en Población con ACV Se han realizado múltiples estudios de cribado de EF entre población joven con ACV (AIT, Infarto isquémico) con prevalencias en la mayoría de ellos menores al 1% (154). Existen algunos estudios con prevalencias mayores, por ejemplo, en el estudio realizado por Rolfs y colaboradores en 2006 se detectan prevalencias 4.9% en varones y 2.4% en mujeres (61) pero no especifica el tipo de variantes incluidas como patogénicas. En el estudio realizado en Portugal por Baptista y colaboradores (155) se describen prevalencias de 2.4 % y se incluyen como variantes patogénicas del gen GLA determinados genotipos clasificados en la actualidad como GVUS. Sólo existe un estudio realizado en Latinoamérica (Argentina) objetivando prevalencias de EF en pacientes jóvenes que habían sufrido AIT, infartos isquémicos o hemorrágicos de 0.3 % (156). En 2018 Lee y colaboradores revisaron los estudios de cribado de EF realizados hasta la fecha en pacientes jóvenes con infartos según hayan sido realizados en población asiática o no encontrando frecuencias similares en ambas poblaciones (0.620.88 % respectivamente) aunque destacan el menor número de diagnósticos de EF en mujeres asiáticas (0.58 %) (157). Debido a todos los estudios de cribado realizados se recomienda considerar el diagnóstico de EF en pacientes jóvenes que han presentado infartos criptogenéticos, sobre todo en aquellos con infartos recurrentes (158). 1.2.2.4 Cribados en otras poblaciones Existe un estudio de cribado de EF realizado en población con dolor neuropático de fibra pequeña de etiología desconocida. Dicha sintomatología está presente en una gran cantidad de los pacientes con EF (80%) y ocasiona un alto impacto clínico. En dicho estudio se CRISTINA MELCÓN CRESPO 56 Duro y colaboradores (172) han objetivado mutaciones en regiones no codificantes del gen GLA localizadas fuera del lugar del splicing agrupadas en haplotipos cuya prevalencia es el doble en sujetos con sintomatología compatible con EF respecto a sujetos sanos. Todos ellos presentan actividad enzimática normal y valores de LysoGb3 también dentro del rango de la normalidad. Cabrera y Perretta (185) han descrito recientemente a dos hermanos varones con sintomatología compatible con fenotipo clásico de EF, disminución de la actividad enzimática α-GalA y portadores de variante intrónica del gen GLA c.640-1G>C. Recomiendan estudiar las regiones no codificantes del gen GLA en pacientes con fenotipo sugestivo de EF en los que no se encuentren alteraciones en las secuencias codificantes que son las estudiadas de forma rutinaria. Recomendaciones similares realizan Pisani y Colaboradores al describir un mujer con fenotipo clásico de EF portadora de haplotipo intrónico complejo en el gen GLA y no detectar otra alteración genética en gen GLA (167). De esta forma se podría confirmar el diagnóstico de EF en pacientes con sintomatología compatible con EF y estudio genético GLA (rutinario, sin incluir regiones intrónicas) normal. Sin embargo, contrariamente a todo lo descrito previamente, en un estudio realizado en 2012 (190) investigando la relevancia clínica de varios haplotipos del gen GLA que contienen una combinación de varias variantes en secuencias intrónicas concluyen que su hallazgo debe considerarse incidental y no relevante para el diagnóstico de EF. En dicho estudio se analizaron 67 mujeres con sintomatología compatible con EF objetivando variantes en secuencias intrónicas en 12 de ellas, agrupados en haplotipos compuestos. 2 Hipótesis y Objetivos 59 2 Hipótesis y Objetivos 2.1 HIPÓTESIS La detección precoz a través de la realización de un cribado neonatal de los sujetos portadores de variantes del gen GLA productoras de fenotipo clásico o tardío de la EF permitiría el inicio temprano de la terapia sustitutiva mejorando el pronóstico a largo plazo. La presencia de polimorfismos validados/mutaciones en secuencias no codificantes (englobadas en GVUS) en el gen GLA puede contribuir a la alteración de la expresión de la α-GalA por mecanismos de regulación epigenéticos anómalos o en asociación a defectos en genes relacionados (ej. factores de transcripción), generando un fenotipo clínicamente parecido al de la EF. 2.2 OBJETIVOS 2.2.1 Objetivo Principal Se pretende realizar el diagnóstico de EF en poblaciones en fases precoces y asintomáticas mediante la elaboración de un Programa de Cribado Neonatal. De este modo podríamos, por un lado, estimar la dimensión real de la prevalencia de la EF en la población española y, por otro lado, realizar el diagnóstico en estas fases tempranas, iniciando el tratamiento de forma precoz. En aquellos sujetos que presentan estudios genéticos de interpretación dudosa en la fase de cribado se pretende conocer más exhaustivamente el mecanismo molecular de la EF mediante el análisis de la transcripción del gen GLA, cuantificación de la cantidad de proteína, detección de los depósitos mediante la determinación de LysoGb3 y estudio del patrón de metilación. Esto permitiría establecer una aproximación diagnóstica más precisa en ausencia de manifestaciones clínicas. CRISTINA MELCÓN CRESPO 60 2.2.2 Objetivos Secundarios Realizar una valoración y seguimiento clínico de los sujetos portadores de GVUS con el fin de detectar, en edades tempranas, manifestaciones clínicas compatibles con EF lo que implicaría el inicio de tratamiento de forma precoz con los beneficios en relación a la morbilidad y mortalidad reconocidos. Realizar una evaluación médica de los familiares en línea ascendente de primer y segundo grado que presenten el mismo defecto genético de los sujetos portadores de GVUS a estudio para evaluar la expresividad clínica a distintas edades. 3 Justificación del estudio CRISTINA MELCÓN CRESPO 63 3 Justificación del estudio 3.1 RELEVANCIA CIENTÍFICA DE LA INVESTIGACIÓN Al realizar una revisión bibliográfica en el buscador PUBMED utilizando como MESH "Fabry Disease” (búsqueda realizada en Marzo 2019) el número total de artículos es de 3244 (ver Figura 8). Es importante destacar como las publicaciones sobre la enfermedad de Fabry han crecido de manera exponencial en los últimos años según se puede objetivar en la Figura 8. Este aumento, llamativo desde el comienzo del siglo XXI, ha sido en gran parte debido al inicio de tratamiento con TES a partir del año 2001, generando numerosas publicaciones tanto en relación a la eficacia clínica del mismo como los estudios de cribados neonatales o en poblaciones de riesgo realizados. Van der Tol y colaboradores describieron en 2014 que el 45% de los estudios de cribados realizados hasta entonces había sido financiados por empresas productoras de terapia enzimática suplementaria (161). Figura 8 Publicaciones científicas sobre enfermedad de Fabry. (Imagen de elaboración propia) CRISTINA MELCÓN CRESPO 64 En relación a los cribados neonatales, tal y como se ha descrito previamente (ver 1.2.1Cribado Neonatal), se han realizado 17 desde que se iniciaron en la década de los 90 si bien ninguno, salvo el presentado, ha sido llevado a cabo en España. Si reducimos nuestra búsqueda bibliográfica a aquellos artículos focalizados en el diagnóstico, el número es aún más escaso (1127). Y si seleccionamos las publicaciones que investigan la parte genética de la EF el número de artículos disminuye hasta 1081. Los estudios centrados sobre el diagnóstico en casos dudosos (baja actividad de α-GalA con alteraciones genéticas en GLA identificables como polimorfismos o mutaciones en las secuencias no codificantes) son escasos y no concluyentes. Aunque estas variantes no sean directamente relacionables con la EF, es posible que su presencia en asociación con alteraciones epigenéticas o defectos en genes relacionados (ej. factores de transcripciones que se unen al gen GLA) contribuya a la alteración de los niveles de expresión de GLA. Aclarar estos mecanismos, facilitaría el diagnóstico de los sujetos que presentan las condiciones descritas y en consecuencia su inclusión en protocolos terapéuticos adecuados. Por otro lado, las dificultades a la hora de diagnosticar EF en fases iniciales se deben en parte al desconocimiento de los mecanismos moleculares implicados en su patogenia. Al estudiar el análisis de transcritos en pacientes con defectos genéticos validados hasta la fecha como no patológicos y que presenta afectación en la actividad enzimática nos ayudaría a entender los mecanismos fisiopatológicos de la enfermedad y a avanzar en la búsqueda de métodos diagnósticos fiables en fases precoces. 3.2 RELEVANCIA PRÁCTICA DE LA INVESTIGACIÓN Debido al aumento de la capacidad tecnológica que favorece la expansión de los cribados neonatales y los avances en el campo de la genética, cada vez son más los estudios de cribado realizados detectando un mayor número de pacientes portadores de variantes de significado incierto del GLA en fases presintomáticas. 3. JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO 65 La realización de un diagnóstico definitivo y precoz de EF en dichos pacientes permitiría su inclusión en protocolos terapéuticos de forma precoz lo cual redundaría en beneficios tanto para el paciente (minimiza la aparición de secuelas, disminuye la morbilidad y aumentando tanto la calidad como la esperanza de vida) como para el Sistema Nacional de Salud al disminuir los gastos derivados de la afectación multisistémica por el retraso diagnóstico. El estudio de los mecanismos de regulación del gen ayudaría en la investigación de nuevas dianas terapéuticas y biomarcadores fiables para la monitorización de las terapias. CRISTINA MELCÓN CRESPO 72 Se recogió la información sobre la edad gestacional y el peso al nacimiento que se recibe asociado a las muestras del cribado neonatal sistemático. Figura 9 Protocolo de estudio del cribado neonatal. (Imagen de elaboración propia) Posteriormente, se seleccionaron los sujetos pertenecientes al área sanitaria Pontevedra-Sur que presentaban baja actividad enzimática de α-GalA y eran portadores de GVUS y se llevó a cabo, entre Noviembre del año 2015 y Enero del 2016, una valoración clínica realizando, previa obtención de consentimiento informado, una completa historia clínica (recogiendo datos sociodemográficos, sintomatología sugestiva de EF desarrollada en ellos y sus familiares afectos, así como cualquier otro tipo de manifestación clínica) y una exhaustiva exploración física. Se recogió una nueva muestra sanguínea donde se determinó de nuevo la actividad enzimática de α-GalA y se secuenció el gen GLA. A continuación, se realizó una cuantificación de LysoGb3, mRNA y cantidad de proteína, así como un estudio de metilación. (Ver Anexo: Hoja de Recogida de Datos Estudio Caso - Control. En dicha Hoja de Recogida de Datos no figura la cuantificación de LysoGb3 ya que dicha cuantificación se determinó posteriormente a la realización de dicho 4. METODOLOGÍA 73 documento). A lo largo de los años 2017, 2018 y 2019 se realizaron revisiones sucesivas de la historia clínica de dichos sujetos. Por otro lado, la formación del grupo control se llevó a cabo a lo largo de los años 2015-2016. Se realizaba en el mismo momento, una entrevista clínica, una exploración física y se recogía una muestra sanguínea, todo ello previa obtención de la firma del consentimiento informado. En dicha muestra sanguínea se analizó la actividad enzimática α-GalA, se secuenció el gen GLA, se determinó LysoGb3, mRNA y cantidad de proteína, así como se llevó a cabo un estudio de metilación. La doctoranda ha participado en el diseño del estudio y la interpretación de los datos obtenidos tanto para el cribado neonatal como para el estudio caso-control. En este último, la doctoranda ha realizado asimismo el reclutamiento de los pacientes, la recogida de muestras para análisis y el seguimiento clínico. La recogida y procesado de las muestras del estudio de cribado neonatal ha sido realizada por parte de la Unidad de Diagnóstico y Tratamiento de Enfermedades Metabólicas Congénitas del Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela. El procesamiento de las muestras del estudio caso-control se ha realizado en los laboratorios del Instituto de Investigación Sanitaria Galicia Sur, ubicados en Vigo en el Hospital Álvaro Cunqueiro 4.4 PROCESADO DE MUESTRAS El análisis de las muestras del estudio de cribado neonatal se realizó en los laboratorios de la Unidad de Diagnóstico y Tratamiento de Enfermedades Metabólicas Congénitas del Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela. El análisis de las muestras del estudio caso-control (a excepción del estudio de LysoGb3 como se detalla posteriormente) se realizó en los laboratorios del Instituto de Investigación Sanitaria Galicia Sur, ubicados en Vigo en el Hospital Álvaro Cunqueiro. La determinación de la actividad enzimática de α-GalA se realizó por fluorimetria en muestras de sangre en forma de gota seca según el método de Chamoles (192). Se utilizó fluorímetro Twinkle LB 970. El ensayo se realizó en tampón fosfato-citrato 0.15M a pH 4.2, usando 4- CRISTINA MELCÓN CRESPO 74 metilumbeliferil-α-D-galactopiranoside 4mM (4-MU, #44039, Glycosinth) como sustrato y en presencia de N-acetil-D-galactosamina 50mM (Ver Figura 10). La actividad enzimática se calculó con referencia a una recta patrón (Fluorescencia/concentración de sustrato) y se expresó como μmoles de substrato hidrolizado por hora y litro de sangre. Las muestras se midieron por duplicado. Figura 10 Reacción de la enzima α-GalA . (Imagen de elaboración propia) Para la secuenciación de GLA se utilizó un termociclador (Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700) y un secuenciador automático por electroforesis capilar AB PRISM 310, con software para análisis de secuencias (Genescan). Se realizó con método de Sanger sobre fragmentos de Ácido Desoxiribonucleico (DNA) correspondientes a los 7 exones que forman el gen. Estos fragmentos se obtienen por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando la muestra de gota seca y primers específicos complementarios a las secuencias intrónicas que flanquean cada exón. La determinación de LysoGb3 se llevó a cabo en el Laboratorio lisosomal del Centro Médico Universitario de Hamburgo-Eppendorf localizado en Hamburgo, Alemania, mediante el envío de muestras debidamente conservadas. Se realizó con el análisis de muestra en papel de filtro. Se duplicó el análisis en todas las muestras. Los niveles de LysoGb3 se determinaron mediante espectrometría tandem masas de ionización por electroespray y cromatografía líquida de alta prestación utilizando un dispositivo médico clase 1 Shimadzu 8050 y adaptando el método descrito por Gold y colaboradores (193). Se utilizó un estándar interno para la cuantificación de LysoGb3 (se cubrió el rango de 0 a 120 ng/mL, límite bajo de cuantificación 0.3 ng/mL). Para el control de calidad se utilizaron 3 niveles de calibración (3, 30 y 100 ng/mL). El 4. METODOLOGÍA 75 rango de referencia se definió como el intervalo de predicción que incluye el 95 % de los valores del grupo de referencia (punto de corte < 1.1 ng/mL). El análisis de trascritos de GLA se llevó a cabo con el equipo para PCR en tiempo real (qPCR) AB Prism7300, Applied Byosistem, y se utilizó el software de análisis ABIprism. Se realizó mediante qPCR con sondas Taqman para medir los niveles de expresión del gen y determinar eventuales alteraciones de la expresión del mRNA. De muestras de sangre periférico (10 ml de sangre recogido con EDTA) se purificaron los leucocitos por depleción de las otras poblaciones y se extrajeron simultáneamente RNA total, DNA y proteínas usando el kit All-Prep (Qiagen). El mRNA se retrotranscibió con Ominiscript kit, (Qiagen) usando un cebador de oligodTs. El c-DNA obtenido se utilizó para el análisis cuantitativo de los transcritos (Taqman probes GLA #186786874 aparato 7300 Abiprism de Life Technologies). La cantidad de transcrito se calculó en referencia a un gen constitutivo (GAPDH #186786874) utilizando el método de los ciclos celulares (Pfaffl, 2001) y normalizando los datos a la muestra control. Las mediciones se realizaron por triplicado y se realizaron 3 experimentos independientes en cada sujeto a estudio. En cada experimento se utilizaron diferentes muestras control para la normalización de los datos. El estudio semicuantitativo de la expresión de α-GalA a nivel de proteína se realizó mediante Western blot utilizando un anticuerpo específico para la enzima (Abcam#). Previamente se corrieron las muestras obtenidas de la lisis de leucocitos de pacientes en un gel de polyacrilamida en condiciones desnaturalizantes para permitir la separación de las muestras. (biorad#). Las proteínas se trasfirieron a membranas Transblot Turbo (#1704157) de Biorad utilizando el analizador ChemiDoc MP Imaging System. Se utilizó la expresión del marcador de lisosomas LAMP1 como gen de referencia para la cantidad de proteína. Una vez tratadas las membranas con anticuerpos secundarios HRP conjugados, se reveló la señal luminiscente de las bandas con Clarity Western ECL substrate (#170-5060). Las imágenes se adquirieron con el analizador de imagen ImageLab (Biorad). El estudio de metilación se realizó mediante el análisis del DNA tratado con bisulfito utilizando la PCR específica de metilación CRISTINA MELCÓN CRESPO 76 (methylation-specific PCR, MSP) y la secuenciación del DNA tratado (Bisulfite sequencing). Se estudió la región promotora de GLA (- 152_+193), que contiene las variaciones intrónicas c.-10C>T y c.- 12G>A, el entorno de la variación p.(Ala143Thr) (g.11068 – g.11271) y el entorno de la variación p.(Asp313Tyr) (g.14253 – g.14563). Para la conversión con bisulfito se utilizó el kit EZ DNA Methylation-Direct Kit (Zymo Research) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utiliza el programa MethPrimer (194) para la identificación de las islas CpG, el diseño de los juegos de cebadores MSP (estado metilado y estado no metilado) y el de los cebadores para la secuenciación del DNA tratado. Los resultados de la amplificación específica de metilación se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa. Para el análisis por secuenciación de los dinucleótidos CpG se realiza el clonaje de los productos de PCR en el vector pCR® 2.1-TOPO incluido en el kit comercial TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, Life Technologies). Transformamos bacterias competentes TOP10 de E. coli con nuestros plásmidos mediante la técnica de choque térmico. Posteriormente se aíslan entre 3-4 colonias de cada, se crecen y se extrae el DNA plasmídico con el kit de extracción NZYMiniprep kit (Nzytech). Por último, se secuencian por Sanger a través de la empresa STABVIDA (Portugal). 4.5 ANÁLISIS DE LOS DATOS El programa empleado para el registro de los datos será microsoft Excel. Se utilizó el software libre estadístico R para la realización del análisis estadístico de los datos En las variables cuantitativas se ha calculado la media y la desviación estándar (DE). Se establecen los Intervalos de Confianza 95% (IC 95%) así como el nivel de significación estadística comparando grupos de media ± DE mediante la prueba t-student. Los parámetros estadísticos estudiados en el análisis de resultados son: los valores máximo y mínimo muestral, primer, segundo y tercer cuartil, empleando la representación gráfica que se muestra esquemáticamente en la Figura 11. 4. METODOLOGÍA 77 Figura 11 Representación esquemática de los parámetros estadísticos graficados. (Imagen de elaboración propia) La correlación enzimática con el peso al nacimiento y la edad gestacional fue analizada mediante el coeficiente de correlación de Pearson. Para estudiar la asociación entre la actividad enzimática y la edad gestacional (<35 semanas Vs >35 semanas) o el peso al nacimiento (< 2500 g Vs > 2500 g) se utilizó el test χ2 para tablas de contingencia. El punto de corte para determinar la actividad enzimática se ajustó utilizando el percentil 0.5 y se ajustó teniendo en cuenta variables como el sexo, peso y edad gestacional. Para establecer el punto de corte apropiado se cuantificó la actividad enzimática de la α-GalA en 2168 recién nacidos sanos. La actividad media fue de 5.1 µmol/Lh (IC 95% 5.0-5.2) con una mediana 4.57 (IC 95% 4.46-4.71). Estos valores pueden estar sobrestimados teniendo en cuenta que dicha población incluye tanto varones como mujeres. La prevalencia, el valor predictivo positivo (VPP) y la precisión del método para el protocolo diagnóstico se calculó utilizando el software MedCalc 16.4.3 (Universidad de Oostende, Bélgica) En el análisis de las secuencias en el gen GLA se utilizó el software Chromas 2.4 para detectar mutaciones puntuales o pequeñas deleciones/inserciones en los exones y las regiones intrónicas cercanas. La nomenclatura aplicada en las variantes genéticas de GLA sigue la normativa HGVS (Human Genome Variation Society) utilizando como CRISTINA MELCÓN CRESPO 78 referencia la secuencia LRG_672 tanto a nivel genómico como de DNA codificante (LRG_642t1) y proteína (LRG642p1). El punto de corte óptimo en nuestra muestra en relación al acúmulo de LysoGb3 se estableció mediante la realización de curva ROC estableciendo el valor con mejor relación sensibilidad/especificidad. Los niveles de LysoGb3 se analizaron con el test t-student para comparar grupos de media +/- DE. Se determinó como significación estadística p<0.05. La cantidad de transcritos se calculó en base a la referencia del gen constitutivo GAPDH #Hs02758991, usando el método de la amplificación de ciclos (ΔΔCt), descrito por Pfaffl (195) y normalizando los valores a aquellos obtenidos de la muestra de calibración (valor de 1), (extracción de mARN de voluntarios sanos). Se repitieron 3 experimentos independientes para cada sujeto usando muestras de calibración de dos individuos control diferentes. El dato cuantitativo de transcrito representado por cada sujeto es el valor medio de los tres experimentos realizados, ± la desviación estándar. Los niveles de transcrito de GLA se analizaron con el test t-student para comparar grupos de media +/- DE. Se determinó como significación estadística p<0.05. Las imágenes de WB se realizaron con el programa Image Lab (Biorad) y la expresión de α-Gal A se comparó con la expresión LAMP en cada muestra. La cuantificación relativa entre las dos bandas de proteína se calculó utilizando el programa Image lab 5.2.1 de Biorad para cada muestra. Se calculó sucesivamente la media y la desviación estándar de la intensidad relativa de las bandas para cada grupo [controles, casos con la variante p.(Ala143Thr), casos con SNPs (polimorfismos de un solo nucleótido) en intrones, casos con variantes p.(Asp313Tyr)] y se analizó mediante t-test la significancia de las diferencias entre grupos. Las secuencias obtenidas tras la realización del estudio de metilación se analizaron con el programa Chromas Pro (Technelysium Pty Ltd). 4. METODOLOGÍA 79 4.6 DIFICULTADES Y LIMITACIONES DEL ESTUDIO La realización del estudio de cribado neonatal limitándose a la población perteneciente a la Comunidad autónoma de Galicia puede constituir un sesgo de selección a la hora de extrapolar nuestros resultados a otras poblaciones. Por otro lado, el realizar el estudio de la expresión de α-GalA en una muestra aún más seleccionada (sujetos pertenecientes al área de salud de Pontevedra-Sur) vuelve a constituir de nuevo un sesgo de selección a la hora de poder extrapolar los resultados a otras poblaciones y, además, el tamaño muestral es demasiado bajo para poder encontrar diferencias significativas. 4.7 ASPECTOS ÉTICO-LEGALES Cumplimiento de las Normas de Buena Práctica Clínica y de la Declaración de Helsinki. Confidencialidad de la información. El tratamiento, comunicación y cesión de los datos se hará conforme a lo dispuesto por la Ley Orgánica 15/1999, de 13 de diciembre, de protección de datos de carácter personal. Sólo el equipo y las autoridades sanitarias, que tienen el deber de guardar la confidencialidad, tendrán acceso a todos los datos recogidos por el estudio. Se podrá transmitir a terceros la información que no pueda ser identificada. En el caso de que alguna información sea transmitida a otros países, se realizará con un nivel de protección de los datos equivalente, como mínimo, al exigido por la normativa de nuestro país. Manejo de muestras biológicas conforme a la Ley 14/2007 y el RD 1716/2011. Las muestras y los datos asociados serán guardados de forma codificada. Esta información está a cargo del investigador principal y sólo pueden acceder a ella los miembros del equipo investigador y las autoridades sanitarias en el ejercicio de sus funciones. Los Responsables de la custodia de las muestras son por un lado, en lo referente al estudio de cribado neonatal la Unidad de Diagnóstico y Tratamiento de Enfermedades Metabólicas Congénitas del Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela donde permanecen almacenadas y en lo relativo al estudio Caso-control el responsable de la custodia de las muestras es el investigador principal CRISTINA MELCÓN CRESPO 80 (Cristina Melcón Crespo) y son almacenadas en el Instituto de Investigación Sanitaria Galicia Sur durante el tiempo necesario para realizar el estudio o de manera indefinida en el caso de que el paciente haya accedido a la conservación en la colección de muestras “Estudios de diagnósticos y de mecanismos moleculares de la Enfermedad de Fabry” nº C.0003361 dada de alta en la Red Nacional de Biobancos cuya responsable es la Dra Saida Ortolano. Ver Anexo: Modelo de consentimiento informado Estudio Descriptivo Cribado neonatal y Modelo de consentimiento informado Estudio Caso -Control. Obtenido el dictamen favorable del Comité de Ética de la Investigación Clínica de Galicia para el estudio del Cribado Neonatal con fecha 5/03/2009 (Código de Registro 2008/390) (Ver Anexo: Aprobación del Comité de Ética Estudio Cribado Neonatal) y el dictamen favorable del Comité de Ética de la Investigación de Pontevedra-Vigo-Ourense para el estudio caso-control con fecha 14/07/2015 (Código de Registro 2015/464) (Ver Anexo: Aprobación del Comité de Ética Estudio Caso - Control). 5 Resultados CRISTINA MELCÓN CRESPO 88 actividad enzimática como método de cribado, ya que podríamos tener en nuestra cohorte falsos negativos. En todo caso, si estudios posteriores confirmasen a la variante p.F18Y;c.53T>A como patogénica podríamos concluir que la prevalencia estimada en nuestra población de forma global, incluyendo tanto varones como mujeres, es de 0.014 % (1:7297) con VPP de 2%, precisión de 99.3 % (IC 75-100) y tasa de FP de 0.67 % que son valores similares a los obtenidos para la población masculina. Esto sugiere que el porcentaje de falsos negativos en la población estudiada no es significativo, a pesar de utilizar la actividad enzimática como método de cribado. 5.2 ESTUDIO CASO - CONTROL 5.2.1 Sujetos a estudio Se incluyeron en el análisis un total de 12 sujetos portadores de GVUS que cumplían los criterios de inclusión, que constituyen el total de los sujetos susceptibles a estudio. 8 de ellos eran mujeres (66 % del total). Para el grupo control se recogieron muestras de 16 pacientes (43% mujeres) todos ellos con actividades, enzimáticas de α-GalA dentro de la normalidad y sin presentar alteraciones en las regiones del gen GLA estudiadas, comprobado por secuenciación Sanger. Para los casos se secuenciaron unos tramos más amplios de regiones intrónicas para comprobar la presencia de otros SNPs en intrones frecuentemente detectados en cribado de población adulta con riesgo de EF (198) y se confirmó que en 9 de ellos se hallaban más de 2 SNPs. En la Figura 14 se muestran las GVUS detectadas en los sujetos caso a estudio. Figura 14 GVUS detectadas 5. RESULTADOS 89 En la Tabla 16 se detallan los datos obtenidos de los casos y en la Tabla 17 la información detallada de los controles. Tabla 16. Datos Sujetos Caso (Portadores GVUS) (M=masculino; F=femenino) Tabla 17. Datos Sujetos Control (Sanos) (M=masculino; F=femenino; SNP= polimorfismo de un solo nucleótido) Muestra Sexo Actividad Enzimática Genotipo 15-01-C M 10,51 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-02-C M 5,6 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-03-C F 10,75 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-04-C M 9,8 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-05-C M 6,08 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-06-C F 16,3 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-07-C M 15,07 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-08-C F 16,19 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-09-C M 13,46 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-10-C M 10,39 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-11-C F 10,93 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-12C M 9,75 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-13C M 9,09 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-14C F 10,88 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 17-15C F 9,79 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 17-16C F 13,78 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 Muestra Sexo Actividad Enzimática Genotipo 15-01-F F 1,9/1,5 c. -10C>T, c.370-81_370-77del, c.640-16A>G, p.(Asp313Tyr), c.1000-22C>T 15-02-F F 1,7/1,9 p.(Ala143Thr) 15-03-F F 2/1,9 c. -10C>T, c.370-81_370-77del, c.640-16A>G, c.1000-22C>T 15-04-F M 1,9/1,9 c. -10C>T, c.370-81_370-77del, c.640-16A>G, c.1000-22C>T 15-05-F F 1,9/1,7 c. -10C>T, c.370-81_370-77del, c.640-16A>G, c.1000-22C>T 15-06-F F 1,4/1,9 c. -12G>A, g.5051C>T, c.370-81_370-77del, c.640-16A>G, c.1000-22C>T 15-07-F F 1,9/1,7 c. -10C>T, c.370-81_370-77del, c.640-16A>G, c.1000-22C>T 15-08-F M 0,7/1,1 p.(Ala143Thr) 15-09-F F 1,9/1,8 c. -10C>T, c.370-81_370-77del, c.1000-22C>T 15-10-F M 1,7/1,6 p.(Asp313Tyr) 16-11-F F 1,8/1,8 c.370-81_370-77del, c.640-16A>G, c.100022C>T 16-12-F M 1,8/1,6 c. -10C>T, c.370-81_370-77del, c.640-16A>G, c.1000-22C>T CRISTINA MELCÓN CRESPO 90 5.2.2 Manifestaciones Clínicas Sujetos Ninguno de los 12 sujetos portadores de GVUS analizados (edad cronológica actual de 10-11 años) presenta manifestaciones clínicas propias de la EF tal y como se detalla en la Tabla 18. Ninguno de los pacientes refiere dolor del tipo neuropático, lesiones cutáneas sugestivas de angioqueratoma (el sujeto 4 presenta una lesión cutánea en el muslo que tras realización de biopsia se tipificó como un nevus fusocelular y otra lesión en el tobillo izquierdo etiquetada como nevus de células fusiformes pigmentado) o manifestaciones gastrointestinal frecuentes en los pacientes con EF en la edad pediátrica. El paciente 10 presenta hipoacusia en relación a una displasia coclear. 5. RESULTADOS 91 Tabla 18. Manifestaciones Clínicas Niños Portadores GVUS Paciente Enfermedades Edad de presentación Tratamiento 1 Invaginación intestinal Diarrea funcional Tics motores transitorios Tiroiditis autoimune subclínica 24 meses <6 años 6 años 11 años - 2 Cefalea tensional (RM SNC normal) Actitud cifoescoliótica Dismetría leve MMII 10 años 10 años 10 años - - - 3 - - - 4 Nevus fusocelular pigmentado en muslo Nevus de células fusiformes pigmentado en tobillo izquierdo BRD completo 9 años 10 años 9 años Resección Resección - 5 Deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena corta Portadora heterocigota (p.Val282Leu) en gen CYP21A2 Nacimiento 10 años Riboflabina - 6 2 crisis febriles atípicas 12 y 30 meses - 7 Pigmentaciones dentales 11 años - 8 Actitud cifoescoliótica Dismetria Miembros inferiores 9 años 9 años - - 9 - - - 10 Displasia coclear-hipoacusia Trastorno del Espectro Autista/Trastorno por Déficit de Atención e Hiperactividad 2 años 6 años - Tratamiento Psicoeducativo 11 - - - 12 Fractura de fémur Tic fónico Valoración cardiológica normal por sospecha cardiomegalia 8 meses 10 años 10 años Inmovilización - - 5.2.3 Manifestaciones Clínicas Familiares Ninguno de los familiares de los pacientes portadores de GVUS en el gen GLA presenta manifestaciones clínicas sugerentes de EF (ver Tabla 19). Es necesario destacar que el abuelo del paciente 3 ha fallecido por MCPH. Desgraciadamente en este sujeto se desconoce si la variante genética es heredada en rama materna o paterna ya que no consintieron la realización del estudio en los progenitores. CRISTINA MELCÓN CRESPO 92 Tampoco en el sujeto 1 se realizó el estudio genético en los progenitores al no emitir su consentimiento. En el sujeto 12 no se encontró la variante del gen GLA ni en el padre ni en la madre. En el sujeto 6 sólo pudo ser estudiada la madre, no siendo portadora de la variante genética de su hija. Tabla 19. Manifestaciones Clínicas Familiares Paciente Grado de parentesco Enfermedad 1 Madre Tío de la madre Madre de la abuela materna Hipotiroidismo IAM ACV a los 60 años 2 - - 3 Padre Abuelo paterno Padre abuelo materno Elevacion CPK. Arritmias MCPH (fallecido) Marcapasos a los 50 años 4 Abuela materna Bisabuelo materno ACV a los 78 años ACV 5 Abuela materna IAM a los 54 años (fallecida) 6 Padre Atopia. HTA 7 Padre Arritmia cardiaca 8 Padre Abuelo materno Arritmia cardiaca Bypass a los 48 años 9 - - 10 - - 11 Abuelo materno Hermana del padre IAM a los 55 años Fallecida RN por malformación cardiaca 12 Hermana del abuelo materno Monorreno 5.2.4 Determinación de LysoGb3 Para establecer el punto de corte óptimo del biomarcador LysoGb3 en nuestra muestra se calculó curva ROC. Se estableció como punto de corte el valor 3,95 ng/mL con una sensibilidad 0,42 (IC 95% 0,10-0,74) y una especificidad 0.81 (IC 95% 0,59-1). El área bajo la curva fue de 0,63 (IC 95% 0,42-0,84). Dicho punto de corte fue superado por cinco sujetos en el grupo de los casos (Sujetos 2, 6, 7, 8 y 9) y tres en el grupo control (7, 8 y 9). El sujeto 2 del grupo Caso, portador de la variante p.(Ala143Thr), supera en 2,45 puntos el valor calculado como punto de corte mientras que el sujeto 8 del grupo Caso, también portador de la variante p.(Ala143Thr), supera dicho punto de corte en 1 punto. De forma detallada se describen en la Tabla 20 los valores de LysoGb3 en los casos y en la Tabla 21 los valores de LysoGb3 en los controles. 5. RESULTADOS 93 Tabla 20. Datos LysoGb3 en Sujetos Casos (Portadores GVUS) (M=masculino; F=femenino) Tabla 21. Datos LysoGb3 en Sujetos Control (Sanos) (M=masculino; F=femenino; SNP= polimorfismo de un solo nucleótido) Muestra Sexo Actividad Enzimática LysoGb3 (ng/mL) Genotipo 15-01-C M 10,51 2,6 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-02-C M 5,6 2,3 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-03-C F 10,75 3,6 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-04-C M 9,8 2,9 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-05-C M 6,08 3,8 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-06-C F 16,3 3,6 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-07-C M 15,07 4,7 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-08-C F 16,19 5,5 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-09-C M 13,46 4 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-10-C M 10,39 2,9 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-11-C F 10,93 2,5 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-12C M 9,75 2,8 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-13C M 9,09 2,9 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 16-14C F 10,88 3,9 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 17-15C F 9,79 3,9 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 17-16C F 13,78 3,1 no SNPs en región promotora, intrón 2, 4, 6 En el análisis del biomarcador LysoGb3 comparando el grupo caso con el grupo control se objetiva que no hay diferencias significativas entre los valores medios de LysoGb3 en el grupo de los Casos (Media Muestra Sexo Actividad Enzimática LysoGb3 (ng/mL) Genotipo 15-01-F F 1,9/1,5 2,9 c. -10C>T, c.370-81_370-77del, c.640-16A>G, p.(Asp313Tyr), c.1000-22C>T 15-02-F F 1,7/1,9 6,4 p.(Ala143Thr) 15-03-F F 2/1,9 3,1 c. -10C>T, c.370-81_370-77del, c.640-16A>G, c.1000-22C>T 15-04-F M 1,9/1,9 2,6 c. -10C>T, c.370-81_370-77del, c.640-16A>G, c.1000-22C>T 15-05-F F 1,9/1,7 2,9 c. -10C>T, c.370-81_370-77del, c.640-16A>G, c.1000-22C>T 15-06-F F 1,4/1,9 4 c. -12G>A, g.5051C>T, c.370-81_370-77del, c.640-16A>G, c.1000-22C>T 15-07-F F 1,9/1,7 4,1 c. -10C>T, c.370-81_370-77del, c.640-16A>G, c.1000-22C>T 15-08-F M 0,7/1,1 5 p.(Ala143Thr) 15-09-F F 1,9/1,8 4,3 c. -10C>T, c.370-81_370-77del, c.1000-22C>T 15-10-F M 1,7/1,6 3,4 p.(Asp313Tyr) 16-11-F F 1,8/1,8 3,7 c.370-81_370-77del, c.640-16A>G, c.100022C>T 16-12-F M 1,8/1,6 3,7 c. -10C>T, c.370-81_370-77del, c.640-16A>G, c.1000-22C>T CRISTINA MELCÓN CRESPO 94 3,84 ng/mL con IC 95%: 3,24-3,44) y el grupo Control (Media 3,43 ng/mL con IC 95%: 3,02-3,86). La ausencia de significación estadística se puede explicar dado el pequeño tamaño muestral pero se objetiva como los valores son superiores en los sujetos portadores de GVUS evaluados de forma global o de forma independiente por sexos (ver Figura 15). Figura 15. Valores LysoGb3 GLOBAL (entre paréntesis se indica el número de sujetos de cada grupo) Llama la atención que tanto en el grupo de los casos como el grupo control los valores medios son superiores en las mujeres respecto a los hombres (ver Figura 16 y Figura 17). 5. RESULTADOS 95 Figura 16. Valores LysoGb3 CASOS. (Portadores GVUS) Figura 17. Valores LysoGb3 CONTROLES. (Sanos) CRISTINA MELCÓN CRESPO 96 5.2.5 Estudio de mRNA Los niveles de transcritos del gen GLA están significativamente disminuidos en algunas de las muestras de los pacientes portadores GVUS analizadas (ver Tabla 22). Los porcentajes de transcritos en cada muestra se determinaron con respecto a una muestra calibradora en tres experimentos independientes en los que las mediciones se realizaron por triplicado. El valor indicado representa la media de los tres experimentos, más o menos la desviación estándar. Los valores indicados como “n.d” (no detectables) se deben a que por la escasa calidad de la muestra de RNA extraída no ha sido posible obtener resultados de qPCR concluyentes. En las muestras indicadas con asterisco los valores indicados proceden de un único experimento, ya que por la escasa cantidad del RNA extraído los resultados de los otros dos experimentos son inconcluyentes. A pesar de que el error de las mediciones relativas de transcritos es bastante elevado por la heterogenicidad de las muestras calibradoras utilizadas, llama la atención como los niveles de expresión en las muestras del sujeto 7 y el sujeto 8 del grupo de los Casos están disminuidos en todos los experimentos realizados de GLA, a pesar de las diferentes muestras calibradoras. 5. RESULTADOS 97 Tabla 22. Datos Nivel de Transcritos en Sujetos Casos (Portadores GVUS) (*= un solo experimento; n.d = no detectables; M=masculino; F=femenino) Muestra Sexo Actividad Enzimática LysoGb3 (ng/mL) Genotipo Niveles de transcrito 15-01-F F 1,9/1,5 2,9 c. -10C>T, c.370-81_37077del, c.640-16A>G, p.(Asp313Tyr), c.100022C>T 68%±28% 15-02-F F 1,7/1,9 6,4 p.(Ala143Thr) 77%±34% 15-03-F F 2/1,9 3,1 c. -10C>T, c.370-81_37077del, c.640-16A>G, c.1000-22C>T 105%* 15-04-F M 1,9/1,9 2,6 c. -10C>T, c.370-81_37077del, c.640-16A>G, c.1000-22C>T 20%* 15-05-F F 1,9/1,7 2,9 c. -10C>T, c.370-81_37077del, c.640-16A>G, c.1000-22C>T 50,77%±58% 15-06-F F 1,4/1,9 4 c. -12G>A, g.5051C>T, c.370-81_370-77del, c.64016A>G, c.1000-22C>T 80%* 15-07-F F 1,9/1,7 4,1 c. -10C>T, c.370-81_37077del, c.640-16A>G, c.1000-22C>T 30%±4% 15-08-F M 0,7/1,1 5 p.(Ala143Thr) 75%±2% 15-09-F F 1,9/1,8 4,3 c. -10C>T, c.370-81_37077del, c.1000-22C>T n.d 15-10-F M 1,7/1,6 3,4 p.(Asp313Tyr) 75%±42% 16-11-F F 1,8/1,8 3,7 c.370-81_370-77del, c.64016A>G, c.1000-22C>T 48%±37% 16-12-F M 1,8/1,6 3,7 c. -10C>T, c.370-81_37077del, c.640-16A>G, c.1000-22C>T n.d 6 Discusión 107 6 Discusión Este cribado constituye el primero realizado en nuestro país en el ámbito neonatal si bien cribados en otras poblaciones ya han sido realizados en España con anterioridad (42,198–200). Los datos de prevalencia de la EF obtenidos en nuestro estudio (1:7575 varones portadores de fenotipo clásico) son mayores de los descritos inicialmente, en 1999 Meikle y colaboradores describieron prevalencias 1:117000 (39), pero similares a los descritos en otros programas de cribado neonatal realizados en distintas regiones en el mundo (ver 1.2.1 Cribado Neonatal) describiendo prevalencias entre 1:7000 y 1:3000 según incluyan sólo pacientes portadores de variantes causante de fenotipo clásico o GVUS respectivamente (201–203). Van der Tol describió como el 90 % del total de variantes del gen GLA encontradas en los estudios de cribado eran GVUS (161). Se están realizando estudios de seguimiento en los sujetos portadores de variantes del gen GLA detectados en cribados neonatales para determinar si dichos sujetos desarrollan sintomatología compatible con EF lo que es esencial para poder establecer un diagnóstico definitivo (41). Las variantes más frecuentemente encontradas en los estudios de cribado realizados en Europa (161) son c.427G>A; p.(Ala143Thr), p.R112H y c.937G>T; p.(Asp313Tyr) también presentes de forma frecuente en la población general [p.(Ala143Thr) = 0.09%, c.335G>A; p.R112H = 0.04% y p.(Asp313Tyr) = 0.3%] (96,161). En nuestro estudio varios pacientes portadores de estas variantes han sido descritos. Dada su frecuencia en la población general antes descrita, algunos autores recomiendan realizar biopsia para confirmar la presencia de depósitos antes de considerar a los pacientes portadores de estas variantes como enfermos (96). Múltiples variantes en secuencias intrónicas han sido descritas en el estudio, en muchos casos constituyendo haplotipos complejos. En varios estudios (163,204) se ha demostrado que estas variantes producen defectos de transcripción pero las consecuencias de dichas CRISTINA MELCÓN CRESPO 108 alteraciones aún no han sido claramente definidas y por tanto no se puede clasificar a dichos individuos como afectos de EF. El método escogido para la realización del cribado neonatal en este estudio presenta datos de precisión, VPP y tasa de falsos positivos similares a los descritos en otros métodos de cribado de otras patologías ya incluidas en los cribados neonatales sistemáticos. En nuestro estudio obtenemos VPP de 1.47% con una precisión de 99.12 % (CI 98.9-99.3) y una tasa de FP de 0.88 %. Para la detección neonatal de fibrosis quística se utiliza la tripsina inmunoreactiva con VPP 4% y precisión del 99.2 %, del mismo modo, para la detección neonatal del hipotiroidismo congénito se determina el valor de TSH con VPP 18% y precisión del 99.8 %. En relación a la inclusión de la EF en los paneles de cribado neonatal existe mucha controversia. Por un lado, el Comité Asesor sobre Trastornos Hereditarios en Recién Nacidos y Niños ha rechazado la inclusión de la EF en los paneles de cribado neonatal, sin embargo, en determinados lugares, por ejemplo, en Missouri o Illinois, la EF ya forma parte dichos paneles de cribado gracias al apoyo de los padres y al desarrollo de unos adecuados protocolos de seguimiento. También en otros estados (Nuevo México o Nueva Jersey) se han desarrollado programas pilotos (41). Actualmente la discusión sobre la inclusión de la EF dentro de los programas de cribado neonatal se ha reabierto debido al desarrollo de nuevas dianas terapéuticas de administración oral como las chaperonas (24). Puntos a favor para la inclusión de la EF en los programas de cribado neonatal son tanto la prevalencia como la existencia de adecuados métodos de diagnóstico y el indiscutible efecto beneficioso del inicio precoz del tratamiento (117). Sin embargo, la existencia de un considerable número de sujetos portadores de GVUS (161) dificulta la inclusión de la EF en dichos programas de cribado. Con todo, dado los numerosos estudios que informan de prevalencias cada vez más elevadas (40,41), el gran beneficio de la inclusión en programas de tratamiento a los sujetos con EF en fases precoces (117) y el desarrollo de nuevas perspectivas terapéuticas (terapia génica, terapias reducción de sustratos…) (23,27) hacen que la EF deba ser candidata a su inclusión en los paneles de cribado neonatal. 6. DISCUSIÓN 109 Debido el elevado número de sujetos portadores de GVUS detectados en nuestro programa de cribado y en otros (161), es necesario poder realizar una mejor caracterización de dichas variantes para clasificar a dichos individuos de forma precisa e incluirlos correctamente en protocolos de seguimiento y tratamiento. Esto también facilitaría la inclusión de la EF en los programas de cribado sistemáticos. En nuestro estudio detectamos 35 sujetos portadores de GVUS. Se seleccionaron los pacientes portadores de GVUS pertenecientes a nuestra área de salud Pontevedra Sur (en total 12 pacientes) para continuar el estudio y se realizó un seguimiento clínico, así como una serie de determinaciones bioquímicas y análisis moleculares para intentar realizar una mayor aproximación diagnóstica e implicación de dichas variantes del gen GLA en el desarrollo de EF. Solamente se continuó el estudio en los pacientes de esta área de salud ya que es en esta área donde se disponen de competencias para realizarlo. Sería importante ampliar el estudio en el resto de pacientes portadores de GVUS detectados en el programa de cribado. En los 12 sujetos estudiados se realizó de nuevo estudio genético objetivando un mayor número de variantes del gen GLA que las descritas inicialmente (196) debido a la utilización de primers diferentes que incluyen fragmentos mayores de las regiones intrónicas. De los 12 sujetos estudiados, 3 sujetos son portadores de polimorfismos del gen GLA, otro es portador de un polimorfismo del gen GLA asociado a otra serie de variantes en secuencias intrónicas y el resto de los sujetos (8) presenta una haplotipo que combina varias sustituciones de nucleótidos en secuencias intrónicas (ver Tabla 23 y Tabla 24). Debido a la variedad de nomenclaturas que existen en la literatura en la Tabla 25 se detallan las equivalencias en diversas nomenclaturas de las GVUS detectadas en nuestra área sanitaria. CRISTINA MELCÓN CRESPO 110 Tabla 23. Haplotipos presentes en el estudio Nº Total Pacientes (Nº Caso) Haplotipo 2 (2 y 8) c.427G>A; p.(Ala143Thr) 1 (10) c.937G>T; p.(Asp313Tyr) 1 (1) c. -10C>T, c.370-81_370-77del, c.640-16A>G, p.(Asp313Tyr), c.1000-22C>T 5 (3,4,5,7 y 12) c. -10C>T, c.370-81_370-77del, c.640-16A>G, c.1000-22C>T 1 (6) c. -12G>A , c. -10C>T , c.370-81_370-77del, c.640-16A>G, c.1000-22C>T 1 (9) c. -10C>T, c.370-81_370-77del, c.1000-22C>T 1 (11) c.370-81_370-77del , c.640-16A>G, c.1000-22C>T Tabla 24. Resumen Variantes gen GLA presentes en el estudio Nº Pacientes Variante Gen GLA 9 c.370-81_370-77del 9 c.1000-22C>T 8 c. -10C>T 8 c.640-16A>G 2 p.(Ala143Thr) 2 p.(Asp313Tyr) 1 c. -12G>A Tabla 25. Equivalencias Nomenclatura Variantes Gen GLA Región en GLA DNA genómico LRG_642 DNA codificante (transcrito) LRG_642t1 Proteína LRG_642p1 ID dbSNP Promotor g.5049G>A c. -12G>A — rs3027585 Promotor g.5051C>T c. -10C>T — rs2071225 Intrón 2 g.11074_11078del c.370-81_370-77del — rs5903184 Exón 3 g.11212G>A c.427G>A p.(Ala143Thr) rs104894845 Intrón 4 g.14002A>T c.640-16A>G — rs2071397 Exón 6 g.14532G>T c.937G>T p.(Asp313Tyr) rs28935490 Intrón 6 g.14843C>T c.1000-22C>T — rs2071228 Los sujetos 2 y 8 de nuestro estudio son portadores de la variante p.(Ala143Thr). En uno de los primeros cribados neonatales realizados en Italia en 2006 (201), se describió la variante p.(Ala143Thr) como una variante de inicio tardío relacionada con patología renal. También se ha identificado en sujetos con hipertrofia ventricular izquierda (42) 6. DISCUSIÓN 111 y Blaydon y colaboradores en 2001 describieron un sujeto portador de esta variante que presenta un fenotipo clásico (186). En 2013 Rolfs y colaboradores describen a esta variante como ligado a infartos cerebrales en la EF (205). Sin embargo, Terryn (206) realizó un estudio exhaustivo en 12 sujetos portadores de esta variante concluyendo que la asociación de las manifestaciones clínicas que dichos sujetos presentaban estaban sometidas al sesgo de selección ya que provenían de programas de cribado y la falta de depósitos de Gb3 en biopsia cardiaca y renal en varios de los sujetos cuestionaba su papel etiológico. También Lenders y colaboradores (207) concluyen en un estudio realizado en 2016 tras analizar 25 sujetos portadores de la variante p.(Ala143Thr) que dicha variante no debe ser considerada como patogénica ya que a pesar de que se han descrito pacientes con ACV portadores de esta variante y con actividad enzimática reducida la mayoría de los varones portadores de esta mutación presentan actividades enzimáticas cercanas al 50 % y niveles normales de LysoGb3. Además, debido a que se ha estimado una frecuencia poblacional de la variante de 0.078% se deberían haber identificado más casos de pacientes con EF portadores de esta variante. Consideran que los pacientes con ACV portadores de esta mutación debe ser estudiados en profundidad para descartar otras causas que expliquen dicha sintomatología y que no deben ser subsidiarios de recibir TES. Van der Tol (161) considera esta variante como GVUS en base a los estudios que no objetivan depósitos de Gb3 en muestras de biopsias cardiacas o renales y a la falta de síntomas característicos de EF en los sujetos portadores de dicha variante. En un estudio reciente se señala la posibilidad de que esta variante sea potencialmente causante de EF pero debido a su relativamente alta actividad residual deben existir otros modificadores genéticos que regulen su patogenidad por lo que los sujetos portadores de esta variante deben ser evaluados de forma individual de cara a la indicación de tratamiento (208). Arends y colaboradores (209) describieron a 3 pacientes de una misma familia portadores de esta variante que presentaban fenotipo clásico de EF, disminución de actividad enzimática y aumento de LysoGb3 y apuntan la posibilidad de que o dichos pacientes presentasen otra variante en gen GLA y/o existiesen otros modificadores genéticos que pueden CRISTINA MELCÓN CRESPO 112 producir este fenotipo clásico. Existe también la teoría sobre la relación de p.(Ala143Thr)con la variante de la región promotora c.-10C>T (210) mediante la cual se considera a dicha variante de la región promotora como modificadora de la presentación clínica de sujetos portadores de p.(Ala143Thr). En nuestro estudio no se han descrito manifestaciones clínicas sugestivas de la EF ligadas a esta variante ni en los familiares portadores. Hay que destacar que los dos pacientes portadores de dicha variante presentan ya niveles elevados de LysoGb3 (6,4 y 5 ng/mL) en contraposición a lo objetivado en otros estudios (161,206,207). También se objetivan niveles reducidos de transcritos y, además, comparando con los sujetos casos y también con los otros sujetos portadores de GVUS objetivamos un aumento de la cantidad de proteína en probable relación a proteína no funcionante. También hemos encontrado en estos sujetos la pérdida de un sitio de metilación, ya que la mutación implica la sustitución de una citosina que forma parte de un dinucleotido CpG y que normalmente se encuentra metilada. Por tanto, debido a que los dos pacientes de nuestro estudio portadores de la variante p.(Ala143Thr) (caso 2 y 8) presentan además de una baja actividad enzimática, unos niveles elevados de LysoGb3 asociados a una disminución en la transcripción de GLA, hace necesario, a pesar de no presentar en el momento actual ninguna manifestación clínica sugestiva de EF el mantener un seguimiento exhaustivo para vigilar la aparición de sintomatología compatible e iniciar, de ser el caso, terapia enzimática sustitutoria. Dos de nuestros sujetos (Caso 1, combinado con otras variantes en secuencias intrónicas y caso 10) son portadores de la variante p.(Asp313Tyr) del gen GLA, descrita por primera vez en 1993 y cuestionada ampliamente su patogenidad desde entonces. Se relacionó inicialmente con la producción de un fenotipo clásico (178), sin embargo existen varios estudios que la relacionan con patología en el Sistema Nervioso como se detalla a continuación. Blaydon y colaboradores (186) describieron un mujer con acroparestesias portadora de dicha variante, Lenders y colaboradores (211) la consideran productora de lesiones en la sustancia blanca tras objetivar estas alteraciones en 7 miembros de una misma familia portadores de 6. DISCUSIÓN 113 esta variante y la ausencia de dichas lesiones en otros dos miembros de la misma familia que no presentan dicha variante genética. Refieren su relación en el daño neural y recomiendan valorar en profundidad estos sujetos. Becker corroboró dicha sospecha (212). Pero también existen autores que ponen en duda su patogenidad (213,214). Niemann et al en 2013, demostraron en dos pacientes portadores de esta variante que a pesar de tener actividades enzimáticas bajas, no presentaban ninguna manifestación clínica sugestiva de EF y mantenían niveles normales de LysoGb3 (215). Dicha observación fue corroborada por el mismo grupo un año después detectando en varios pacientes portadores de la variante p.(Asp313Tyr) también niveles normales LysoGb3 (110) . En un estudio de seguimiento a lo largo de 4 años realizado en 6 pacientes portadores de esta mutación con niveles enzimáticos y de LysoGb3 normales se objetivó que ninguno de ellos desarrolló manifestaciones clínicas desde el punto de vista renal o cardiaco, tan solo una mujer presento AIT y en otro paciente se objetivaron lesiones en sustancia blanca (216). Algunos autores la consideran una Pseudodeficiencia (217) dado que la proteína sí llega a ser transportada dentro del lisosoma y presenta un 75 % de la actividad enzimática, objetivando disminución de la actividad e inestabilidad en pH neutro (213). Otros autores se refieren a ella como un polimorfismo ya que su frecuencia es mayor de 1 % en la población general (214,218). Recientemente en 2018 du Moulin y Muschol argumentan que el hallazgo de aumento de LysoGb3 y la mejoría clínica en las acroparestesias de un niño de 11 años portador de dicha variante tras inicio de TES contradicen la clasificación de la variante p.(Asp313Tyr) del gen GLA como polimorfismo inocuo (219). Los estudios realizados en los dos sujetos portadores de la variante p.(Asp313Tyr) de nuestra serie apoyan la consideración de dicha variante como una pseudodeficiencia ya que amén de la baja actividad enzimática detectada, no se ha detectado alteraciones a nivel transcripcional, ni en relación al patrón de metilación, ni alteración a nivel de cantidad de proteína y tampoco existe acúmulo de LysoGb3 en ninguno de los dos pacientes (Valores LysoGb3 2,9 y 3,4 ng/mL). El resto de sujetos estudiados que presentan GVUS son portadores de haplotipos complejos de variantes intrónicas. El hallazgo de dichos CRISTINA MELCÓN CRESPO 120 (concretamente los sujetos 2 y 8 ambos portadores de la variante p.(Ala143Thr) ya que ambos pacientes presentan aumento de LysoGb3, reducción de transcritos y alteración en el patrón de metilación, y los sujetos 7 y 11 portadores de haplotipos complejos de variantes intrónicas que presentan valores de LsyoGb3 en los límites altos de la normalidad y reducción de transcritos). En la Figura 24 se describe la secuencia diagnóstica en un programa de cribado de EF en relación a los hallazgos de GVUS en sujetos clínicamente asintomáticos. De inicio se propone la utilización de la medición de la actividad enzimática en los varones y en aquellos con actividades < 2 µmol/Lh realizar la secuenciación del gen GLA. En las mujeres se recomienda iniciar el cribado mediante la secuenciación del gen GLA para evitar posibles falsos negativos. En aquellos sujetos en los que se objetiven variantes de significado incierto se debe continuar el estudio realizando análisis de transcritos y medición de LysoGb3. Si encontramos datos sugestivos de EF (aumento de LysoGb3 y disminución de RNA) se realizará una secuenciación completa de GLA y si no se objetiva ninguna otra variante patogénica se realizará un seguimiento clínico estrecho así como determinaciones seriadas de LysoGb3 con objeto de vigilar la aparición de sintomatología clínica sugestiva de EF y acúmulo de LysoGb3, lo cual aumentaría la sospecha de EF y promovería la realización de un estudio anatomopatológico (análisis ultraestructural e inmunohistoquímico). En este caso, para analizar el acúmulo de Gb3 se podría llevar a cabo una biopsia de piel debido a la posibilidad de estudio de múltiples tejidos (fibroblastos, sistema nervioso, músculo liso y/o glándulas ecrinas) unido a que constituye un procedimiento menos invasivo comparado con la toma de otro tipo de muestras (renales/cardiacas). Se puede valorar la realización del estudio anatomopatológico a nivel renal o cardiaco en función de las manifestaciones clínicas observadas en el sujeto a estudio o si se obtiene un resultado dudoso mediante el análisis de la muestra cutánea. En el caso de no detectar depósitos de Gb3 a nivel tisular se considerará a dicha variante como probablemente benigna. Si por el contrario se detectan depósitos de Gb3 en la muestra tisular estudiada se podrá considerar a dicha variante como muy probablemente patogénica e 6. DISCUSIÓN 121 incluir a dicho sujetos en protocolos específicos de seguimiento de EF e iniciar terapia enzimática sustitutiva. CRISTINA MELCÓN CRESPO 122 Figura 24. Secuencia Diagnóstica GVUS 7 Conclusiones 125 7 Conclusiones 1. La prevalencia del fenotipo clásico de EF en varones en Galicia es de 0.013%. 2. Estos datos junto con la viabilidad y la eficacia del método propuesto (Precisión 99.12 % y VPP 1.47%) postulan a la EF como candidata para formar parte de los programas de cribado neonatal sistemáticos. 3. Las GVUS en GLA no están generalmente asociadas con el fenotipo de la EF, aunque en casos puntuales se detectan alteraciones en la expresión del gen (Disminución en la transcripción). 4. El seguimiento clínico de los sujetos con GVUS es importante para discriminar entre individuos con variantes benignas e individuos con predisposición a expresar un fenotipo clínico por efecto de modificadores genéticos todavía desconocidos. 5. Se ha realizado un árbol de decisión en la secuencia diagnóstica de un paciente asintomático portador de GVUS. 8 Líneas Futuras 129 8 Líneas Futuras Desarrollo de biomarcadores específicos, fiables y de fácil determinación. Aproximación fenotipo-genotipo. Papel de la terapia inmunomoduladora (como mecanismo etiopatogénico y en relación al desarrollo de anticuerpos asociados al uso de TES). Utilización de tratamientos combinados (TES + Chaperonas + Terapia de reducción de sustratos). Desarrollo de la terapia génica como tratamiento definitivo.