Andamiajes compuestos de ácido poliláctico y bioapatitas derivadas de dientes de tiburón fabricados mediante tecnología de impresión 3D. Ensayos preclínicos

ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA USC Iván Alonso Fernández Tesis doctoral Andamiajes compuestos de ácido poliláctico y bioapatitas derivadas de dientes de tiburón fabricados mediante tecnología de impresión 3D. Ensayos preclínicos. Lugo, 2024 Programa de doctorado en Investigación Básica y Aplicada en Ciencias Veterinarias TESIS DOCTORAL ANDAMIAJES COMPUESTOS DE ÁCIDO POLILÁCTICO Y BIOAPATITAS DERIVADAS DE DIENTES DE TIBURÓN FABRICADOS MEDIANTE TECNOLOGÍA DE IMPRESIÓN 3D. ENSAYOS PRECLÍNICOS. Autor Iván Alonso Fernández Director: Antonio González Cantalapiedra y Fernando María Muñoz Guzón Tutor/a: Antonio González Cantalapiedra PROGRAMA DE DOCTORADO EN INVESTIGACIÓN BÁSICA E APLICADA EN CIENCIAS VETERINARIAS LUGO 2024 DECLARACIÓN CONFLICTO DE INTERESES Yo, Iván Alonso Fernández, con DNI 53520364-P y con domiciliación a efectos de notificación en Camino Molino, nº1, 1D (Castro Riberas de Lea, Lugo, Galicia), declaro que esta Tesis Doctoral no presenta conflictos de intereses. En Lugo, a 3 de febrero de 2024. Firmado: Iván Alonso Fernández DECLARACIÓN DE TESIS CON EXPERIMENTACIÓN ANIMAL Yo, Iván Alonso Fernández, con DNI 53520364-P y con domiciliación a efectos de notificación en Camino Molino, nº1, 1D (Castro Riberas de Lea, Lugo, Galicia), declaro que esta Tesis Doctoral se realizó bajo el amparo de proyectos de investigación aprobados por el Comité de Bioética de la Universidad de Santiago de Compostela y de la Xunta de Galicia conforme al marco legal establecido por la Unión Europea (Directiva 2010/63/UE) y por la legislación española (Real Decreto 53/2013). Los procedimientos experimentales que implicaron el manejo de animales vivos fueron realizados por el estudiante de doctorado y los profesores Fernando María Muñoz Guzón y Antonio González Cantalapiedra. En Lugo, a 3 de febrero de 2024. Firmado: Iván Alonso Fernández FINANCIACIÓN El estudio fue autofinanciado por el Grupo de Investigación “Cirugía, Radiología y Ecografía Experimental Veterinaria” (GI-1708), la ayuda de la Xunta de Galicia para la consolidación y estructuración de unidades de investigación competitivas y otras acciones de fomento en las universidades SUG-GRG (GRC ED431C 2021/19 y ED431C 2021/49) y el proyecto IBEROS+ de la Unión Europea (0072_IBEROS_MAIS_1_E) financiado por el programa FEDER POCTEP 2021-2027. Durante el período de realización de la Tesis de Doctorado, Iván Alonso Fernández fue beneficiario de una Ayuda predoctoral de la Consellería de Cultura, Educación e Universidades de la Xunta de Galicia (Ref. ED481A 2021/137). AGRADECIMIENTOS Si cualquiera me pregunta cuánto tiempo me llevó terminar la Tesis, podría simplemente contestarle que fueron 4 años y 4 meses, sin embargo, me gusta pensar en este período de un modo ligeramente distinto. Una opción, mi preferida, consiste en contabilizar el tiempo en campañas, concretamente esta Tesis Doctoral duró 5 campañas de maíz y 4 campañas de hierba, durante las cuales pude disfrutar de hacer una de las cosas que más me gusta, andar en tractor. Y, además, no en uno cualquiera… ¡Nunca en la vida habría imaginado que llegaría a conducir un Fendt! Así que no puedo despedir esta etapa sin acordarme de aquellos que lo hicieron posible: José Manuel, Mari Carmen, Nuria y sobre todo de Juanjo. Gracias por apoyarme y tratarme como uno más de la familia durante todo este tiempo, espero que aún nos queden muchas más campañas y momentos por disfrutar juntos. Y la otra, consiste en desglosar este período en puestos de trabajo, y así poder recordar a la gente con la que pude compartir este camino. Todo comenzó con un año de internado, donde además de aprender, tuve la oportunidad de disfrutar de unos compañeros maravillosos ¡Gracias a todos! Después, el ideal de una vida tranquila y cómoda me llevo a intentar preparar una oposición, 5 meses tirados a la basura, que cosa más aburrida por favor, está claro que eso no es lo mío… Tras una temporada de contratos puntuales, y muchas, muchas, muchas horas de granja, la beca predoctoral de la Xunta de Galicia me dio el empujón (…y el dinero…) que necesitaba para poder centrarme en la Tesis. La disfruté durante 2 años y 6 meses, y tuve la suerte de coincidir con Estrella, Ana, Mónica y María. Sinceramente, fue una época que recordaré con mucho cariño y de la que espero llevarme amistades para toda la vida. Muchas horas de laboratorio, experimentales, cenas y alguna que otra fiesta, me he sentido infinitamente cómodo trabajando con vosotras, ¡gracias! Además, a lo largo de este período tuve la suerte de poder realizar una estancia en Noruega, allí conocí a dos de las personas que más me han ayudado para conseguir terminar la Tesis y pude disfrutar de viajes increíbles… Fiordos, lagos helados, auroras boreales, saunas y nieve, mucha nieve. Por ello, quiero dar las gracias a Håvard y a Liebert, quienes desde el momento de mi estancia se han mostrado siempre dispuestos a colaborar para que esto pudiera salir adelante, ¡Sin vosotros esto no habría sido posible! Actualmente, puedo decir que trabajo haciendo lo que más me gusta, Diagnóstico por Imagen, y con la suerte de disfrutar de la compañía de excelentes profesionales, pero sobre todo excelentes personas, Dani, María, Ali y Mó, creo que no hay palabras de cariño y agradecimiento suficientes para expresar lo que siento al poder trabajar cada día a vuestro lado. Además, durante esta época también me tocó mudarme a la “preciosa” villa de Castro Riberas de Lea, lo que se hace por amor… Pero bueno, todo tiene su lado positivo, y en este caso fue conocer a personas que hacen que 360 días anuales de niebla y 2 dedos de moho en las paredes por culpa de la humedad se conviertan en minucias mientras pueda disfrutar de su compañía. Susi, Romina, Uxía, Andrea y Rober, ¡Gracias por vuestro apoyo y por muchos buenos momentos! Por cierto, los miércoles son día de feria, se come un pulpo bueno, bonito y barato, os lo recomiendo. Como veis, 4 años y 4 meses pueden dar para mucho, por ello quiero agradecerles a mis directores, Fernando y Antonio, su infinita paciencia conmigo y sobre todo su gran ayuda. Fer, a ti te tocó un poco más de cerca, así que gracias por tantas horas de charlas, por tu buen humor, tu positividad y por brindarme tu ayuda siempre que la necesité, poder contar con tu apoyo durante todo este tiempo me dio la fuerza y el ánimo para seguir adelante, cuando la opción más fácil habría sido dejarlo todo. Quiero dar las gracias también a mi familia, a la que está y a la que se fue, que siempre creyó que podría sacar adelante este proyecto, que lo financió en momentos de crisis, y que tuvo prohibido hablar de él desde el mismo momento en que formalicé la matrícula. Papá, mamá, Andrés, solo vosotros sabéis lo que me lleváis aguantado y lo que os queda por aguantar, pero creedme cuando os digo que no os puedo querer más, y que sois lo más importante de mi vida. Como sé que habitualmente no os lo digo mucho, ahora os queda aquí por escrito para que no se os olvide nunca. Por último, tengo que dar las gracias a otras de las personas más importantes de mi vida, aquella con la que compartí los últimos 8 años, y con la que espero compartir los próximos 53 en base a la esperanza de vida media de los hombres en Lugo. Helena, gracias por ser como eres y por acompañarme durante este viaje, por quererme incondicionalmente, por cuidarme, por aguantarme, por respetarme, por animarme a dejar la Tesis cuando no quería seguir con ella y por animarme a acabarla cuando cambiaba de opinión, este trabajo es tan tuyo como mío, ¡Te quiero mucho! Espero que este solo sea el primero de los muchos objetivos que consigamos cumplir juntos. Para finalizar, como he visto que se estila mucho lo de incluir frases profundas citadas por personajes célebres al inicio o final de los agradecimientos, me gustaría recordar unas palabras de nuestro querido Mariano, quien en contestación a la frase “Si bien me quieres, Mariano, da menos leña y más grano”, concluyó: “Si quieres grano, Aitor, te dejaré mi tractor” ABREVIATURAS AFM: Microscopio de fuerza atómica AINE/NSAID: Antiinflamatorios no esteroideos ALT: Estructura alterna AM: Fabricación Aditiva ARRIVE: “Animals in Research: Reporting In Vivo Experiments” AW: Apatita-wollastonita BCP: Fosfato cálcico bifásico BG: Biovidrios BIC: Contacto hueso-implante BioCaP: Bioapatitas derivadas de los dientes de tiburón BMPs: Proteínas óseas morfogenéticas BMSCs: Células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea BS: Superficie ósea BTE: Ingeniería de tejidos óseos BV: Volumen óseo CAD: Modelo matemático 3D CAM: Membrana corioalantoidea CaP: Fosfato cálcico CCD: Dispositivo de carga acoplada CDL: Defecto caudal izquierdo CDR: Defecto caudal derecho CG: Grupo control COL-1: Colágeno tipo I CRL: Defecto craneal izquierdo CRR: Defecto craneal derecho CSD: Defectos óseos de tamaño crítico CSIC: Consejo Superior de Investigaciones Científicas CT: Tomografía computarizada DBM: Matriz ósea desmineralizada DLP: Procesamiento digital de luz DMLS: Sinterizado directo de metal por láser DPSC: Células madre de la pulpa dental EBM: Fusión por haz de electrones eBM: Médula ósea mejorada ECM: Matriz extracelular EDS: Analizador por dispersión de energía de rayos X EG: Grupo experimental EMA: Agencia Europea del Medicamento EMF: Campos electromagnéticos sinusoidales FDA: “United States Food and Drug Administration” FDM: Modelado por deposición fundida FESEM: Microscopio electrónico de barrido de emisión de campo FFF: Fabricación por deposición de filamento fundido FGFs: Factores de crecimiento fibroblásticos FTIR: Espectroscopía de infrarrojos por transformada de Fourier GAGs: Glicosaminoglicanos GPC: Cromatografía por permeación de gel HA: Hidroxiapatita HEL: Estructura helicoidal hMSC: células madre mesenquimales humanas. HSCs: Células madre hematopoyéticas ICBG: Injerto óseo de cresta iliaca IFN-γ: Interferón-γ IIM: Instituto de Investigaciones Marinas ILs: Interleuquinas IM: Intramuscular IMT: Técnica de Membrana Inducida IP: intraperitoneal IS: Superficie del implante ISL: Microestereolitrografía IV: Intravenoso La: Lantano LLFC: Cóndilo femoral lateral izquierdo MD: Densidad mineral MDS: Sistema de mini-deposición MEB: Impresión 3D basada en microextrusión MG-63 cell line: Línea cellular de osteoblastoma humano MHDS: Sistemas de deposición de cabezales múltiples Micro-CT: Microtomografía computarizada MIT: Instituto de Tecnología de Massachusetts MRI: Resonancia magnética MSCs: Células madre mesenquimales MSK: Musculoesquelética n-HA: Nano-hidroxiapatita NCPs: Proteínas no colágenas NIR: Espectroscopía del infrarrojo cercano Obj S/V: Superficie del objeto en función del volumen OC: Osteocalcina OCP: Octacalcio fosfato PBS: Tampón salino fosfato PCL: Policaprolactona PDLA: Ácido poli-L,D-láctico PEEK: Poliéter éter cetona PGA: Ácido poliglicólico PLA: Ácido poliláctico PLGA: ácido poli(láctico-co-glicólico) PLLA: Ácido poli-L-láctico PCL: Policaporlactona PPF: Polipropileno fumarato rhBMP-2: Proteína ósea morfogenética recombinante humana-2 RLFC: Cóndilo femoral lateral derecho ROI: Región de interés SC: Subcutáneo SD: Desviaciones estándar SEM: Microscopía Electrónica de Barrido SL: Estereolitografía SLM: “Selective laser melting” SLS: “Selective laser sintering” St.Sp.: Separación entre líneas o “struts” / Tamaño de poro St.Th.: Grosor de las líneas o “struts” SYRCLE: “Systematic Review Centre for Laboratory animal Experimentation” Tb.Pf.: Factor de Patrón Trabecular Tb.Th.: Grosor trabecular TE: Ingeniería de tejidos TEM: Microscopía de transmisión de electrones TGA: Análisis termogravimétrico TNF-α: Factor de necrosis tumoral-α TPP: Polimerización de dos fotones TS: Superficie tisular TV: Volumen tisular UV: Ultravioleta VOI: Volumen de interés VPP: Técnica de fotopolimeración en cubeta WD-10: 10-Dodeciltrimetoxisilano WOS: “Web of Science” XDR: Difracción de rayos X b -TCP/TCP: b-fosfato tricálcico 2D: 2 Dimensiones 3D: 3 Dimensiones 7 SUMMARY The need for new treatments for patients with musculoskeletal pathologies has increased over the last few decades, attracting the research’s community attention. Specifically, the regeneration of bone defects represents a significant challenge for modern medicine, given their implications on the patient’s quality of life. Thus, once the healing physiologic capacity of the bone is surpassed or impaired, it becomes evident the need to develop alternative therapeutic strategies for bone generation. To date, the “gold standard” technique have been autografts, however their use is limited by the existence of several drawbacks such as morbidity, deformities, limited availability, chronic pain, scarring or dysesthesia. Therefore, in recent decades, bone tissue engineering has focused on searching for clinically relevant bone substitutes to synthesize and/or regenerate the bone. For this purpose, a wide variety of biological and synthetic biomaterials have been tested. Among them, metals, polymers, bioceramics and composites have been the most frequently used ones. Furthermore, developing new 3D-printing techniques, such as Additive Manufacturing, has proven to be a promising alternative to satisfy the demand for customizable implants, since they allow the synthesis of porous three-dimensional structures with controlled shape and architecture. In addition, these structures can support cellular colonization, proliferation, and differentiation. The main objective of the present Doctoral Thesis was to evaluate the use of 3D-printed scaffolds composed by polylactic acid (PLA) and bioapatites derived from shark teeth (bioCaP) manufactured by fused deposition modeling for the regeneration of bone defects in a rabbit model. To this end, the effects of the composition and design of the customized scaffolds on new bone formation were analyzed, to overcome the existing limitations so far in the field on bone tissue engineering. In addition, a systematic review was conducted regarding the use of PLA-bioceramic scaffolds in “in vivo” clinical trials, to better understand the effects, functioning and characteristics of the implanted materials. The systematic review demonstrated the feasibility of synthesizing composite scaffolds from a combination of a polymeric matrix and a bioceramic material, with the obtained implants being biocompatible and suitable for their use in bone regeneration. Additionally, an increase of the implant’s osteogenic capacity secondary to the addition of bioceramics to a polymeric matrix was observed. However, this work also showed the need for further manuscript refinement and standardization in terms of experimental design and anaesthetic protocol selection to obtain higher quality information for the research community. Regarding to the experimental procedures, all the manufactured and implanted scaffolds demonstrated their biocompatibility for being used in the bone healing process. The scaffolds gradually enriched with bioCaP particles were implanted in rabbit calvarial defects without resulting in significamt enhancement of their osteogenic potential compared with PLA alone groups. Although their addition positively modifies scaffolds’ characteristics, bone regeneration process could be probably impaired by the use of low proportions of bioCaP, an insufficient exposure of bioCaP particles on the scaffold’s surface, or several drawbacks derived from the polymer, such as the appearance of mild inflammatory response or the IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 8 acidification of the environment. However, when designing and implanting scaffolds with alternate and helical designs in critical femoral defects, the results demonstrated that changes in scaffolds’ architecture positively affected the new bone formation. These findings were probably occasioned by a greater porosity, pore size and accessible porosity of the helical structures. Nonetheless, the achievement of these characteristics is usually related to a sacrifice of the implant’s mechanical properties, hence an adequate balance between porosity and mechanical properties is essential to obtain satisfactory results. Further investigations should be performed to the optimization of both, the composition and the design, as well as to evaluate the possible use of cell or other substances that may promote the osteogenic capacity of the implants. INTRODUCCIÓN 11 1 INTRODUCCIÓN 1.1 JUSTIFICACIÓN Uno de los principales objetivos de la investigación médica temporánea es la regeneración de tejidos dañados [1]. El incremento de la esperanza de vida y el envejecimiento de la población mundial están produciendo un aumento en el número de tratamientos relacionados con las patologías óseas y sus costes derivados [2,3]. Uno de los daños tisulares más frecuentes son los defectos óseos, posicionándolos como un importante problema clínico y socioeconómico, con efectos muy perjudiciales sobre la calidad de vida de los pacientes y la sociedad en general [4– 6]. De hecho, el hueso es el segundo tejido más trasplantado después de la sangre [7]. Trastornos musculoesqueléticos tales como fracturas, infecciones óseas, tumores, malformaciones congénitas, patologías maxilofaciales o enfermedades reumáticas, son algunas de las alteraciones más comunes [2,3,8]. En la actualidad, el tratamiento de defectos óseos continúa siendo un reto en muchas cirugías reconstructivas [2,9], sobre todo en casos donde existe alguna condición que pueda retrasar o alterar el proceso de curación ósea, como por ejemplo defectos de gran tamaño o con riego sanguíneo comprometido. Es por ello que en las últimas décadas se ha incrementado la necesidad de nuevos tratamientos para pacientes con patologías musculoesqueléticas, atrayendo la atención de la comunidad investigadora [2,3,10]. En Estados Unidos y Europa, más de medio millón de pacientes se someten anualmente a cirugías de reparación de defectos óseos, suponiendo un coste estimado superior a los 3 mil millones de dólares [7]. La ingeniería de tejidos (TE) constituye un campo de investigación interdisciplinar que combina conocimiento biológico y de ingeniería, con el principal objetivo de desarrollar estrategias terapéuticas alternativas para la reparación y/o la reconstrucción de tejidos u órganos dañados [11,12]. Una de sus ramas de estudio es la ingeniería de tejidos óseos (BTE), cuyo objetivo es inducir la formación de nuevos tejidos óseos funcionales basándose en la comprensión de su biología y desarrollo [2,13,14]. Para ello, una de las principales herramientas es el uso de injertos, definidos como un material o una combinación de varios, que se implantan para promover la curación ósea [3]. Hasta el momento, el trasplante de tejido óseo autólogo ha sido la técnica “gold standard” para la regeneración de defectos. Sin embargo, su uso se ve limitado por la aparición de numerosas complicaciones que esta técnica puede producir en los pacientes [7]. La gran demanda de este tipo de sustitutos óseos, junto con la ausencia de otras alternativas disponibles actualmente en el mercado con una características idóneas, ha llevado a los investigadores al desarrollo de nuevos biomateriales [7,15]. Así mismo, la BTE ha propuesto un nuevo y esperanzador enfoque a dicho problema mediante el desarrollo de andamiajes 3D porosos, biomiméticos y con actividad osteoinductora [16]. La presente tesis doctoral trata de probar mediante la realización de una revisión bibliográfica sistemática y de un ensayo preclínico, la viabilidad del uso de andamiajes compuestos sintetizados a partir de ácido poliláctico (PLA) y biocerámicas para la regeneración de defectos óseos. Para ello, se utilizó una combinación de PLA y bioapatitas derivadas de IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 12 dientes de tiburón sintetizando andamiajes porosos compuestos mediante tecnología de impresión 3D. 1.2 PREVALENCIA DE LA ENFERMEDADES MUSCULOESQUELÉTICAS La prevalencia de enfermedades musculoesqueléticas es un importante indicador de la calidad de vida entre la población. Un 17,4% de las personas entre los 45 y los 60 años padece alguna patología musculoesquelética (MSK), suponiendo uno de los primeros motivos de consulta a los profesionales de la salud, y ocupando el segundo lugar en cuanto a costes totales generados. Pese a que raramente son causantes de muertes o de ingresos en hospitales, este tipo de patologías se caracterizan por su cronicidad y sus efectos sobre la salud física y mental [17]. A nivel mundial, la prevalencia de casos relacionados con alteraciones MSK en el año 2017 fue de 1,3 billones. Concretamente en España, ese mismo año, fue de entre 18000 y 19000 casos por cada 100.000 habitantes. Generalmente, los trastornos musculoesqueléticos aumentan con la edad en ambos sexos, siendo más habituales en el caso de las mujeres [18]. Por ello, no es de extrañar que sea la condición incapacitante más común en los países de Occidente, y la segunda a nivel mundial. Se estima que las discapacidades ocasionadas por trastornos MSK aumentó un 45% entre 1990 y 2010, y se espera que esta cifra continúe incrementándose debido a una población cada vez más obesa, sedentaria y envejecida. Algunas de las patologías más frecuentes son el dolor lumbar, dolor de cuello, osteoartritis, artritis reumatoide, gota u osteoporosis, siendo esta un factor de riesgo de fracturas [17–19]. Además, deben tenerse en cuenta las enfermedades profesionales y las lesiones derivadas del deporte, dado que pueden suponer patologías en sí mismas, o predisponer su aparición [20,21]. La cirugía ortopédica, concretamente, es una de las grandes contribuyentes a los costes generales relacionados con el tratamiento de las enfermedades musculoesqueléticas, siendo algunas de las más frecuentes y costosas la fijación de fracturas del cuello femoral en pacientes osteoporóticos, el manejo de fracturas traumáticas, las cirugías de reemplazo de cadera y rodilla, y los procedimientos de columna vertebral [21]. De acuerdo con estudios epidemiológicos, en el período comprendido entre 2010 y 2025, la prevalencia de fracturas en Europa se incrementará anualmente un 28%, suponiendo una carga económica adicional del 25% (Zhu et al., 2021). La importancia de este grupo de patologías ha sido también demostrada en medicina veterinaria, concretamente en perros y gatos. Así, un estudio realizado en el Reino Unido en 2014 demostró que las enfermedades musculoesqueléticas (MSK) constituían la tercera alteración más frecuente (11,8 %) en perros, tras las enteropatías (17,8%) y las alteraciones dermatológicas (15,5%). Además, otros trastornos como neoplasias, heridas traumáticas, obesidad o heridas por mordisco reportaron prevalencias del 9,5%, 9,0%, 6,1% y 3,8%, respectivamente, pudiendo todas ellas, a su vez, conllevar y/o desencadenar la aparición de trastornos MSK [22]. Años después, en 2021, el mismo autor publicó otro estudio incluyendo un mayor número de pacientes, y observó que los trastornos MSK descendían al cuarto lugar como grupo de patologías más frecuentes en perros con una prevalencia del 8,64%, después de alteraciones dentales (14,1%), desórdenes cutáneos (12,58%) y enteropatías (10,43%). El mismo estudio destacó una mayor aparición problemas MSK en perros machos y perros esterilizados [23]. Del mismo modo, un trabajo realizado en Estados Unidos basado en una encuesta telefónica, recogió como alteraciones más frecuentes en perros las enfermedades MSK, las dentales y las del tracto gastrointestinal o hepáticas; pudiendo deberse las discordancias entre ambos estudios a la fuente de información seleccionada y los métodos de extracción de los datos [23,24]. Introducción 13 En el caso de los gatos, la interpretación de su bienestar puede suponer un desafío para los propietarios, dado el enmascaramiento de los signos clínicos, que pueden manifestarse únicamente como modificaciones comportamentales o en el estilo de vida, y que comúnmente suelen relacionarse erróneamente con la vejez. A modo de ejemplo, la osteoartritis, un problema relativamente frecuente en gatos, únicamente se diagnostica en un 2% de los mismos, sin ser la cojera una característica clínica común como ocurre en el caso de los perros. Esto es probablemente debido a su adaptación para ocultar signos de enfermedad, al tratarse tanto de un animal de presa, como depredador [25]. Como consecuencia, los estudios de prevalencia realizados en gatos mostraron que los desórdenes MSK eran mucho menos frecuentes, con una prevalencia del 3,2%. Sin embargo, otros procesos como las heridas traumáticas ocuparon la segunda posición como trastornos más habituales (12,9%), pudiendo estas inducir la aparición de alteraciones como fracturas, desgarros musculares, enfermedad articular degenerativa, etc. La obesidad y las neoplasias en el caso de los gatos presentaron prevalencias del 6,7% y 3,4% [26]. Datos actualizados publicados en el año 2021 elevaron la prevalencia de las enfermedades MKS en esta especie hasta el 4,1%, al igual que la de la obesidad y las neoplasias reportando porcentajes del 5,8% y 1,8%, respectivamente. Por el contrario, la aparición de heridas traumáticas se redujo hasta un 11,6%. Dicho estudio demostró además el efecto sobre la prevalencia de parámetros como el sexo de los animales, observándose un mayor riesgo de atropello, obesidad, cojeras y heridas por mordedura en gatos machos; y la edad, siendo más frecuentes en gatos jóvenes las heridas por mordedura y los atropellos [25]. 1.3 EL TEJIDO ÓSEO El hueso es un tejido biomineral, dinámico y altamente vascularizado que desarrolla múltiples funciones en la fisiología del organismo, incluyendo metabólicas (controlando la homeostasis mineral y ácido-base, almacenando calcio y fósforo, y albergando la médula ósea) y mecánicas (actuando como soporte estructural y de cargas, necesarios para la locomoción y la protección de los órganos internos). Se caracteriza por poseer una matriz extracelular (ECM) mineralizada, compuesta de fibras de colágeno, iones de calcio y fosfato, y proteoglicanos; en la cual se encuentran embebidas las células que componen la unidad básica multicelular [2,27–31]: - Osteoblastos: Células derivadas de células progenitoras de origen mesenquimal especializadas en la formación de hueso, con un papel importante en el proceso de remodelación ósea por medio de la síntesis, deposición y mineralización de la matriz ósea. - Osteocitos: Constituyen entre el 90% y el 95% del total de células ósea, son osteoblastos en una fase terminal de diferenciación que se encuentran embebidos en la matriz ósea. - Osteoclastos: Células mieloides diferenciadas que se encuentra en las depresiones de la superficie ósea, son altamente migratorios y están adaptados únicamente para la reabsorción ósea. - Células de revestimiento óseo: Se trata de osteoblastos en fase de quiescencia alineados en la superficie ósea. Poseen un papel esencial en la remodelación ósea permitiendo la comunicación con los osteocitos, y siendo responsables del acoplamiento entre formación y resorción ósea. 1.3.1 Composición y estructura ósea La ECM del hueso constituye un entramado complejo que desempeña un papel crucial en sus propiedades mecánicas y su capacidad de adhesión celular. Se compone de una fracción orgánica (30%) y una inorgánica (70%). La fase orgánica está constituida principalmente de IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 14 fibras de colágeno (~90%), formadas por fibrillas de 35-60 nm de diámetro y 1 µm de longitud, las cuales a su vez se componen de moléculas de colágeno formando una triple hélice (triples hélices de tropocolágeno) (Figura 1). El ~10% restante está constituido por otras proteínas no colágenas tales como osteocalcina, osteonectina, fibronectina, etc. La fase inorgánica consiste esencialmente en cristales hexagonales de hidroxiapatita (Ca10(PO4))6(OH)2) que se localizan en el intersticio de las fibras de colágeno, proporcionándoles una mejora de sus propiedades mecánicas. Esta fase constituye un importante punto de almacenamiento de minerales, albergando el 99% del calcio del cuerpo, el 85% del fósforo y el 40-60% del magnesio y el sodio [10,30,31]. Figura1. Estructura del hueso. Las osteonas son la unidad funciona del tejido óseo, que se organizan para forma formal la cortical ósea. Así mismo, el hueso lamelar se organiza en trabéculas para formal es hueso esponjoso. Ambos son los encargados de proporcionar un soporte mecánico al tejido óseo. En cuanto a la ECM, está formada por una fase orgánica, esencialmente colágeno, y una fase inorgánica, compuesta de cristales de hidroxiapatita. HAP: hidroxiapatita; GAGs: glicosaminoglicanos, NCPs: proteínas no colágenas. “Reimpreso con permiso de [10] bajo los términos de la Licencia Creative Commons Attribution 4.0 International, CC BY-NC.ND 4.0”. El hueso lamelar representa una estructura jerárquica organizada en capas o lamelas. Las estructuras que conforma el hueso lamelar se componen esencialmente de hueso cortical denso y hueso trabecular esponjoso, cuya distribución varía entre las diferentes partes anatómicas [10,13,32]. - El hueso cortical posee una alta resistencia mecánica y rodea al hueso esponjoso en su periferia, proporcionándole estabilidad y soporte. A nivel microscópico, se compone de osteonas, unidad funcional del tejido óseo, que se disponen en círculos concéntricos longitudinalmente al eje largo del hueso, y en cuyo interior transcurren vasos sanguíneos y fibras nerviosas formando los Sistemas Haversianos (Figura 1). - El hueso trabecular o esponjoso posee una estructura porosa (50-90% de porosidad) con baja resistencia mecánica, y a nivel microscópico se compone de trabéculas dispuestas formando una red similar a un panal de abeja, cuyo interior está relleno de vasos sanguíneos y médula ósea, donde se albergan a su vez las células madre hematopoyéticas (HSCs) y las células madre mesenquimales (MSCs). Este ofrece por tanto un espacio adecuado para el desarrollo del metabolismo óseo y la función hematopoyética (Figura1). 1.3.2 Proceso de curación ósea Los huesos experimentan un crecimiento dinámico constante, con procesos de remodelación continuos a lo lago de la vida del individuo [2,10,27–29]. Por tanto, a diferencia de otros tejidos y órganos, el tejido óseo posee la capacidad de repararse de forma espontánea Introducción 15 tras una lesión recuperando su estructura y resistencia mecánica originales sin que exista la formación de una cicatriz, siempre que se encuentre bajo condiciones ambientales y fisiológicas adecuadas. Este fenómeno se conoce como proceso de curación ósea [6,10,33]. El proceso de formación ósea atiende a dos tipos de osificación, que comienza en ambos casos con la presencia de una condensación de células progenitoras mesenquimales, que actúan como una base para la posterior formación ósea. En la osificación intramembranosa dichas células se diferencian directamente a osteoblastos. Por el contrario, en la osificación endocondral estas se diferencian en condrocitos que son los responsables de depositar una plantilla cartilaginosa que posteriormente será mineralizada y reemplazada por hueso [13]. Con respecto al proceso de curación ósea existen dos mecanismos principales para la reparación de facturas: la remodelación directa, con formación mínima de callo óseo, y la remodelación indirecta, con formación de callo mediante una combinación de osificación intramembranosa y endocondral, que es la más frecuente. Generalmente este proceso incluye 3 fases superpuestas [6,13]: - Fase Inflamatoria: Comienza en el momento en el que se produce la fractura con la formación del hematoma, acompañada de una respuesta inflamatoria cuyo pico se alcanza a las 24 horas, y el reclutamiento de moléculas señalizadoras involucradas en la regulación de la formación ósea (Interleuquinas (ILs), Factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), factores de crecimiento fibroblásticos (FGFs), proteínas óseas morfogenéticas (BMPs), etc.). - Fase de Formación Ósea o de Renovación: Tiene lugar 7-10 días después de la fractura. Las células madre mesenquimales proliferan y se diferencian en osteoblastos produciéndose una osificación intramembranosa inmediata a nivel del periostio y la corteza, estabilizando de este modo la fractura por medio de la formación del callo. A continuación, se inicia la condrogénesis en el tejido dañado (osificación endocondral), y al final de dicha fase el cartílago se calcifica y es sustituido por hueso inmaduro (“woven bone”). Una característica importante de la fase de renovación es la ausencia de mediadores inflamatorios. - Fase de Remodelación Ósea: En la fase final, los osteoblastos y los osteoclastos ya diferenciados colaboran en el reemplazo del hueso inmaduro por hueso lamelar, por medio de procesos de formación y resorción ósea. En la regulación de la fase de remodelación están involucradas numerosas señales proinflamatorias, que pueden detectarse en la zona de fractura (ILs, TNF-α e interferón-γ (IFN-γ)). 1.4 INGENIERÍA TISULAR ÓSEA Aunque la gran mayoría de los defectos óseos se pueden curar de forma espontánea bajo unas condiciones fisiológicas y ambientales adecuadas, la regeneración ósea es un proceso fisiológico complejo que dependerá, entre otras variables, del tipo y extensión de la lesión, la edad y el sexo del paciente [6,33]. En defectos de gran tamaño, también conocidos como defectos críticos, la curación puede verse afectada por las dimensiones del defecto, unas propiedades biomecánicas inestables, un entorno desfavorable de la herida o una técnica quirúrgica subóptima, así como por factores metabólicos, hormonales, nutricionales o de estrés [6,10,33]. En estas situaciones es necesaria la realización de intervenciones quirúrgicas terapéuticas debido al limitado potencial de regeneración [34]. Las limitaciones existentes a las que se deben hacer frente para lograr una adecuada reconstrucción y reparación óseas, han dado lugar a la aparición de la ingeniería de tejidos óseos como una solución emergente y prometedora [35,36], convirtiéndose en una de las piedras angulares de la investigación médica contemporánea desde su descripción en 1993. Durante las IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 16 últimas décadas ha tenido lugar un avance significativo en este campo, en busca del desarrollo de estructuras funcionales que promuevan la regeneración de órganos dañados o enfermos [27,36,37]. La ingeniería tisular ósea o ingeniería de tejidos óseos (BTE) es el campo de investigación más avanzado dentro de la ingeniería de tejidos, cuyo objetivo es inducir la formación de nuevos tejidos óseos funcionales basándose en la comprensión de su biología y desarrollo [2,13,14]. Para ello, busca crear injertos clínicamente relevantes, centrándose en métodos para sintetizar y/o regenerar hueso manteniendo, restaurando o incluso mejorando su funcionalidad “in vivo” [3,32]. Por ello, la capacidad regenerativa del hueso ha proporcionado un nuevo paradigma para el desarrollo de nuevas estrategias de regeneración ósea, postulándose el injerto óseo como una de las principales alternativas de tratamiento para lesiones óseas [3]. El objetivo es sintetizar un biomaterial, o una combinación de varios, con unas características inmunológicas, funcionales, estructurales y mecánicas, que se asemejen lo máximo posible al hueso nativo [1,38]. Para ser utilizado como injerto óseo, un biomaterial debe poseer ciertos requisitos biológicos esenciales como ser: biocompatible, osteoinductivo, osteoconductivo, no inmunogénico, seguro desde un punto biológico, mecánicanicamente resistente, con potencial angiogénico, y biorreabsorbible, para en última estancia ser completamente degradado y sustituido por hueso neoformado. Así mismo, existen otras características de gran interés tales como porosidad, estabilidad volumétrica, fácil disponibilidad, acceso y uso; larga vida útil, rentabilidad y costos de producción razonables [2,4,7,38,39]. Con el fin de cumplir estos criterios, se han ensayado gran variedad de biomateriales para la regeneración del tejido óseo “in vivo” [4,27]. Actualmente, existen cuatro tipos principales de injertos óseos: los injertos óseos autólogos o autoinjertos, los injertos óseos alogénicos o aloinjertos, los injertos óseos xenogénicos o xenoinjertos y los sustitutos de injertos óseos o sustitutos óseos. Los autoinjertos son actualmente la técnica “gold standard” en regeneración ósea. Su composición, basada en células óseas y una matriz celular mineralizada con gran poder osteoconductor, le proporciona una gran capacidad osteoinductora, osteoconductora y osteointegradora, así como una ausencia de propiedades inmunogénicas, siendo la única alternativa que parece cumplir con todas las especificaciones requeridas para un injerto óseo ideal. Sin embargo, dicha técnica implica la realización de un procedimiento quirúrgico secundario que puede conllevar la aparición de numerosas complicaciones como morbilidad, deformidades, dolor crónico, infección, disestesia, cicatrices o hemorragias. Además, la técnica está también limitada por la cantidad de hueso disponible en el área donante del paciente [4,7,40,41]. Como técnicas alternativas a los autoinjertos, existen los aloinjertos y los xenoinjertos. Estos consisten en el trasplante de tejido óseo a partir de otros donantes humanos (cadáveres o donantes vivos), o de otras especies, respectivamente [7]. Sin embargo, la respuesta inmunológica, la falta de capacidad osteogénica con respecto a los autoinjertos, su alta tasa de fracasos y el riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas representan una serie de inconvenientes que deben ser tenidos en cuenta y que limitan el uso de ambas opciones [7,40– 42]. Frente a las limitaciones de los injertos óseos autólogos, alogénicos y xenogénicos, los sustitutos óseos han surgido como una posible solución para la obtención de nuevos biomateriales de origen biológico o sintético que puedan ser implantados para el tratamiento de defectos óseos, definiéndose un biomaterial como una matriz temporal que proporciona un entorno y arquitectura específica para el crecimiento y el desarrollo óseo. Si bien gran parte de los biomateriales disponibles comercialmente son osteoconductivos, solo unos pocos parecen Introducción 23 1.4.3.2 Biocerámicas Las cerámicas, cerámicas bioactivas o biocerámicas poseen propiedades efectivas y seguras para promover la reconstrucción y remodelación ósea debido a sus similitudes con el hueso natural [7,59]. La capacidad de estos materiales para inducir la osteogénesis y la angiogénesis por medio de la liberación de iones biológicamente activos ha atraído gran interés entre los investigadores [30]. Se trata de compuestos con gran resistencia a la compresión, pero baja ductilidad, por lo que resisten la deformación aunque presentan gran fragilidad. Pueden ser de origen natural o sintético, siendo las más comunes las derivadas de corales, los fosfatos de calcio (CaP) o fosfatos cálcicos, los sulfatos de calcio y los vidrios bioactivos [2,49]. Entre ellos, los CaP como la hidroxiapatita (HA) y el fosfato beta-tricálcico (b-TCP), se utilizan comúnmente como materiales de injerto óseo, dadas su semejanzas con el principal componente inorgánico del hueso (fase mineral), la hidroxiapatita [7,39]. Las biocerámicas de CaP se caracterizan por su biocompatibilidad y bioactividad debido a su abundancia en el organismo, y a la disolución y liberación parcial de productos iónicos que aumentan la concentración de iones calcio y fosfato. Por tanto, tienen propiedades osteoconductoras e incluso osteoinductivas, estructura cristalina, alto punto de fusión y bajas características mecánicas. Su comportamiento frágil es un problema crítico que restringe su uso a localizaciones donde no deban soportar cargas [7,38,49,60]. Otro grupo prometedor son los biovidrios (“bioglasses”, BG) o vidrios bioactivos, muchos de ellos basados en el sistema de Na2O, CaO, P2O5 and SiO2, y con un porcentaje en peso de SiO2 menor del 55% [61–63]. Presentan una biocompatibilidad, bioactividad, y osteoconducción suficientes, actuando como fuente de minerales para las células óseas, y sin inducir una respuesta inflamatoria [36,57,61,62]. Además, los biovidrios pueden inhibir el crecimiento de numerosas cepas bacterianas, algunas de ellas incluso multirresistentes [61]. A pesar de esto, se trata de materiales frágiles, con una baja tasa de degradación y que carecen de características mecánicas (baja tenacidad a la fractura) para formar por sí mismos andamiajes de alta calidad [36,57]. El uso de materiales biocerámicos ha sido aprovado por la FDA, y pueden encontrarse diferentes productos comercialmente disponibles, como Cerapatite® (HA), Cerasorb® (b-TCP) o BonAlive® (Bioglass). Desde que la primera formulación recibió la aprobación en 1996, un total de 15 productos con HA, 21 con b-TCP y 11 con Bioglass han sido aprobados hasta diciembre del 2020 [64,65]. En cuanto al uso de dichas biocerámicas en medicina humana, Cannio et al. [63] realizaron una revisión bibliográfica sobre las aplicaciones de los vidrios bioactivos en ensayos clínicos en humanos, y Stachi et al. [66] compararon hidroxiapatita sintética con hueso bovino inorgánico en una técnica de elevación del seno maxilar en humanos, obteniendo resultados de regeneración ósea similares para ambos grupos (ClinicalTrials.gov Identifier NCT03077867). Sin embargo, sigue siendo necesaria la búsqueda de nuevas biocerámicas alternativas a las cerámicas de fosfato cálcico para lograr una mejora de las propiedades de los biomateriales utilizados en regeneración ósea [67,68]. Frente a esta situación, las bioapatitas derivadas de los dientes de tiburón (bioCaP), también denominadas bioapatitas marinas, fosfatos cálcicos marinos bioderivados o biocerámicas de origen marino, han surgido como un material de injerto óseo alternativo que revaloriza subproductos de la pesca de Isurus oxyrinchus y Prionace glauca, dándoles una utilidad y proporcionándoles un valor añadido [67,69]. Esta biocerámica se obtiene tras unas fases de molienda, tamizado y pirólisis, y posee una estructura cristalina [70]. Su composición se basa en una combinación de una fase apatítica del 65-70 wt% (hidroxiapatita y fluorapatita), y una fase no apatítica del 25-30 wt% (b-TCP y whitlockite). Además, presenta elementos traza como F (1.0+-0.5 wt%), Na (0.9+-0.2 wt%) y Mg (0.65+- IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 24 0.04 wt%) en su estructura basada en apatita [69]. López-Álvarez et al. [69] demostraron por primera vez la biocompatibilidad in vitro de las bioapatitas derivadas de dientes de tiburón. Posteriormente, el mismo grupo realizó un ensayo preclínico en ratas, comparando esas bioapatitas con un injerto óseo comercial sintético bifásico HA/β-TCP (60/40%). Los resultados confirmaron una mayor osteointegración y crecimiento horizontal del tejido óseo, así como propiedades osteoconductivas y osteoinductivas [67]. Asimismo, García-González et al. [68] llevaron a cabo un ensayo clínico preliminar en perros y gatos con resultados exitosos, demostrando que las bioapatitas son candidatas adecuadas para la cirugía ortopédica en el ámbito veterinario. 1.4.3.3 Polímeros Los polímeros pueden ser de origen natural o sintético. Los polímeros de origen natural como el ácido hialurónico, el quitosano o el colágeno se caracterizan por su buena biocompatibilidad, osteoconductividad y baja inmunogenicidad, pero que sin embargo se ven limitados por el difícil control de su tasa de degradación (habitualmente degradados por enzimas naturales entre 2 y 24 semanas) y su baja estabilidad química [2,7,30,38]. Por otro lado, los polímeros de origen sintético como el polipropileno fumarato (PPF), el policaprolactona (PCL), ácido poliláctico (PLA), poliéter éter cetona (PEEK) y ácido poliglicólico (PGA) muestran una tasa de degradación controlada, con la posibilidad de poder ser diseñados de acuerdo con las propiedades mecánicas del hueso, sintetizando estructuras complejas, que mejoran la adhesión celular e incluso con la capacidad de libera moléculas solubles. Además, pueden sintetizarse a costos reducidos y tienen una larga vida útil. Como principal desventaja, poseen una menor capacidad de interacción con las células en comparación con los polímeros naturales [2,7,30,71]. Los biopolímeros ofrecen una alterativa a los materiales biocompatibles tradicionales (cerámicos y metálicos) y a los polímeros no biodegradables [47]. El ácido poliláctico (PLA) es un biopolímero empleado comúnmente como materia prima en los procesos de impresión 3D. Concretamente, ha recibido gran atención su empleo en aplicaciones biomédicas utilizando técnicas de fabricación aditiva o “additive manufacturing”, como el FDM, que permiten la fabricación de andamiajes de forma sencilla y con alta reproducibilidad. Desde su aprobación en 1970 por la Administración de Alimentos y Medicamentos en los EE.UU (FDA) para el contacto directo con fluidos biológicos, han sido utilizados en aplicaciones médicas relevantes como andamiajes para ingeniería tisular, dispositivos liberadores de fármacos, membranas de recubrimiento, fijación ósea, diferentes dispositivos médicos biorreabsorbibles y suturas. El PLA destaca por su biocompatibilidad, bajo coste, procesabilidad, un extenso perfil de propiedades mecánicas, biodegradabilidad y ausencia de efectos tóxicos o cancerígenos. Sin embargo, también presenta varios inconvenientes que deberán ser resueltos para lograr una adecuada regeneración ósea, como son una tasa de degradación lenta, un comportamiento hidrofóbico, una baja afinidad celular, o la liberación de subproductos ácidos derivados de su degradación que pueden dar lugar a la aparición de una respuesta inflamatoria en la zona de implantación, superior a la ocasionada habitualmente [7,42,45,47,49,50,72,73]. Dada su baja afinidad celular y la importancia de la adhesión de las células al polímero, las propiedades de superficie del biomaterial juegan un papel crítico, especialmente en la biocompatibilidad, permitiendo el crecimiento vascular, y la unión, migración y proliferación celular. Es por ello que se han desarrollado diferentes estrategias para la consecución de unas propiedades de superficie deseables en andamiajes sintetizados con PLA, como métodos físicos, químicos, inducidos por plasma o radiación; o la creación de recubrimientos (“coatings”) o de compuestos (“composites”) [7,47,73]. Introducción 25 1.4.3.4 Biomateriales compuestos Los biomateriales compuestos o “composites” consisten en una combinación de dos o más materiales con propiedades diferentes, generalmente una matriz y un agente de refuerzo, logrando un efecto sinérgico entre ambos [2,39,40]. Para superar las limitaciones de los polímeros y obtener una estructura más práctica y funcional, se han sintetizado “composites” combinando dos o más fases cuidadosamente integradas [48,74]. El uso de “composites” de PLA en lugar de polímeros puros, tiene el objetivo de aumentar su resistencia mecánica, actividad biológica y propiedades osteoconductivas [73,75]. Se fabrican incorporando un gran variedad de biomateriales como metales, cerámicas bioactivas, materiales orgánicos, inorgánicos, nanomateriales e incluso otros polímeros, en una matriz polimérica [73]. Algunos ejemplos de dichos “composites” son los fabricados mediante la combinación de matriz de PLA y otros materiales como el ácido hialurónico [45], policaprolactona (PCL) [76], HA [77,78], n-HA [62,79], biovidrios [78,80], cáscara de huevo [81] o b-TCP [82]. Típicamente, las combinaciones más utilizadas son las de polímero-polímero (copolímeros) o polímero-cerámica. Los copolímeros derivan de la unión de dos o más monómeros, como por ejemplo la combinación del ácido poliláctico (PLA) y el ácido poliglicólico (PGA), que dan lugar al ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA), considerado como un excelente candidato en ingeniería de tejidos óseos dada su biodegradabilidad y fácil fabricación [2,30,71]. Otro ejemplo es la combinación de PLGA y polifosfazenos que proporciona una posible solución a la necrosis tisular y al posible fracaso de la implantación derivadas de los productos ácidos de degradación del PLGA, por medio de la liberación de productos neutros o básicos, que ejercen un efecto tampón [2]. La combinación polímero-cerámica resulta en la síntesis de “composites” biomiméticos, una idea que surge de la base de que el hueso está compuesto de una mezcla de cristales inorgánicos de HA y un polímero de origen natural como es el colágeno [2]. La combinación de ambos materiales puede evitar algunas de las desventajas de cada uno, mejorando sus características individuales, propiedades físicas y mecánicas, tasa de degradación y bioseguridad; haciéndolos más atractivos para su uso en regeneración ósea [57,73,78]. La idoneidad de las biocerámicas para ser impresas mediante técnicas de fabricación aditiva permite su empleo en la producción de andamiajes compuestos [73,78], lo que optimiza la biocompatibilidad de los materiales poliméricos, manteniendo unas propiedades mecánicas adecuadas, y evitando su fragilidad [38]. Estas además, equilibrarán el entorno ácido que se origina durante la degradación del PLA y aumentarán su hidrofilicidad y tasa de degradación, con notables beneficios sobre la proliferación ósea y la regeneración celular [8]. Se han logrado fabricar con éxito compuestos de ácido poliláctico (PLA) y biocerámicas, demostrando mejorar la formación ósea in vivo [8]. A nivel comercial puede encontrase a la venta algún “composite” sintetizado a partir de PLA e HA, como el denominado SuperFIXSORB30® [64]. Sin embargo, no han sido encontrados ensayos clínicos publicado a cerca del uso de estos biomateriales. Pese al gran avance realizado en la síntesis de “composites” fabricados a partir de PLA y biocerámicas, todavía existe una brecha de conocimiento en cuanto a la composición y estructura óptimas. El comportamiento de las biocerámicas en la matriz polimérica tiene un efecto dependiente de la dosis, por lo que la osteoconductividad y las propiedades mecánicas serán, respectivamente, directa e inversamente proporcionales a la cantidad de material cerámico añadido. Por lo tanto, es esencial equilibrar la fragilidad del CaP y la ductilidad del PLA para evitar la pérdida de la bioactividad del andamiaje [8,75,77]. Una vez solucionados dichos aspectos, y dada la necesidad de nuevos biomateriales para la regeneración ósea, los IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 26 “composites” de PLA-Biocerámicas podría llegar a adquirir gran importancia, llegando a equipararse con los autoinjertos [51]. En el caso de las bioapatitas marinas, también han sido utilizadas como agente de refuerzo de una matriz polimérica para la síntesis de materiales compuestos, y su posterior impresión mediante el uso de técnicas de fabricación aditiva [70]. Su adición supondrá una mejora sustancial de sus características físicas y biológicas, con efectos sobre las propiedades mecánicas, humectabilidad, topografía de las superficies, etc., todos ellos estrechamente relacionados con las propiedades osteoconductivas in vivo del andamio. Además, iones como el F y Mg presentes en el bioCaP, también favorecerán la regeneración ósea al potenciar la síntesis de factores de crecimiento celular y de la hormona paratiroidea, respectivamente [69]. 1.4.4 Geometría de los andamiajes para regeneración ósea Además de la importancia de la composición del “scaffold”, en relación a los biomateriales utilizados, también son esenciales algunos aspectos específicos relacionados con el diseño de dichas estructuras para lograr la regeneración ósea. La hipótesis actual más aceptada hace referencia a que el proceso de curación dependa de la capacidad de los andamiajes para permitir o favorecer el transporte de fluidos, células o vasos sanguíneos, así como la difusión de nutrientes y productos de deshecho. Sin embargo, pese a los conocimientos existentes, no se ha logrado conseguir un diseño ideal para lograr una adecuada osteointegración [83,84]. La síntesis de andamiajes compuestos mediante impresión 3D para regeneración tisular es una alternativa prometedora en la regeneración de defectos óseos. Dada su amplia oferta de características biológicas, mecánicas y estructurales, puede servir como nicho para la proliferación celular y la formación tisular. La Tabla 1 muestra de forma resumida algunas de las características esenciales que se requieren de un andamiaje para su uso en regeneración de defectos óseos. Algunos de estos aspectos ya han sido mencionados anteriormente, y así mismo serán analizados de nuevo a lo largo del presente trabajo [12]. Concretamente, los métodos de deposición capa por capa, como el FDM, están siendo utilizados en la actualidad con gran efectividad en el diseño de la arquitectura, porosidad e interconectividad de los andamiajes. Mediante estos sistemas de fabricación, es posible la producción de “scaffolds” complejos con diseños bien definidos y una interconectividad de poro optimizada [13]. Tabla 1. Propiedades de los andamiajes en relación con su diseño. Modificado de Pedrero et al. [30] "Reimpreso con permiso de [30] bajo los términos de la Licencia Creative Commons Atribución 4.0 Internacional, CC BY-NC.ND 4.0." Área de superficie Crucial para las interacciones entre células y andamiajes, facilitando la vascularización e infiltración celular. La macroporosidad podría promover la osteogénesis a través de la facilitación del transporte celular e iónico. La microporosidad mejora el área de superficie para la adsorción de proteínas, aumento de la solubilidad iónica y de los puntos de adhesión para los osteoblastos. Tamaño de poro Poros > de 300 µm facilita la neoformación ósea y la vascularización. Se piensa que tamaños de poro de 75-100 µm promueven la angiogénesis. Un tamaño de poro de 200 a 500 µm resulta en una óptima penetración tisular y vascular in vivo. Interconectividad de poro Estimula la tasa de deposición ósea y la profundidad de infiltración. Un diámetro óptimo de conexiones entre poros oscila entre 700 y 1200 µm. Topografía de superficie Las superficies rugosas promueven la osteointegración y favorecen la adhesión epitelial. Propiedades mecánicas Los valores del módulo de Young deben de ser cercanos a 7-30 GPa y los de la resistencia a la tracción a 50-151MPa. Introducción 27 La resistencia a la compresión debe ser comparable a la del hueso cortical (100-230 MPa). Propiedades mecánicas y tasa de degradación La tasa de degradación debe coincidir con el crecimiento de la ECM nativa para asegurar el soporte mecánico del andamiaje. Las características geométricas de los andamiajes 3D como la arquitectura de poro, el tamaño de poro, la porosidad, la interconectividad y las propiedades mecánicas, así como la relación existente entre todas ellas, puede tener una gran influencia en la capacidad de regeneración ósea [7,10,85]. Estas propiedades son esenciales para la migración, proliferación y diferenciación de los osteoblastos y las células mesenquimales. Además, la interconectividad de poro o permeabilidad es esencial para favorecer el crecimiento hacia el interior del andamiaje, debido a que permite la invasión de vasos sanguíneos y el suministro de nutrientes [86]. Los “scaffolds” también deben proporcionar un efecto de soporte estructural adecuado en el lugar del defecto [87]. Las propiedades mecánicas van a ser en gran medida dependientes, además de los biomateriales que componen el andamiaje, de la porosidad, forma y tamaño del poro, grosor de filamentos, etc.; de modo que estas características determinarán el grado de estímulo mecánico que será capaz de soportar la estructura [84]. A su vez, todos estos parámetros estarán influidos por el diseño del “scaffold”, a través de la modificación de la posición y orientación de las fibras, dando lugar a estructuras con filamentos alineados o escalonados, filamentos en capas repetidas, o filamentos con diferentes orientaciones (como por ejemplo 0º/90º o 0º/60º/120º), dependiendo del patrón de impresión [88]. La variabilidad de dichos parámetros se encuentra ejemplificada en la Figura 3. Figura 3. Ejemplo de algunas de las estrategias de impresión 3D con respecto a la arquitectura de los andamiajes 3D. Modificado de Gleadall et al. [88]. "Reimpreso con permiso de [88] bajo los términos de la Licencia Creative Commons Atribución 4.0 Internacional, CC BY-NC.ND 4.0." Diferentes autores han estudiado el efecto de las modificaciones en el diseño de los “scaffolds” sobre la curación ósea in vivo. Algunos ejemplos son Berner et al. [34], que evaluaron el efecto de la arquitectura de los andamiajes en un modelo de regeneración ósea en hueso del cráneo, Lim et al. [43], que estudiaron el efecto de diferentes arquitecturas de poro, o Enterazi et al. [89], quienes demostraron que la manipulación del tamaño de poro y la permeabilidad de andamiajes impresos mediante tecnología 3D es una estrategia valiosa para mejorar los resultados obtenidos en un estudio de regeneración ósea. IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 28 Sin embargo, actualmente todavía existe una importante brecha entre la fabricación de “scaffolds” utilizando distintos patrones de impresión y su evaluación in vivo en estudios controlados, aislándose cualquier otro tipo de variable que pueda influir sobre el crecimiento óseo. OBJETIVOS 31 2 OBJETIVOS El objetivo general de la presente Tesis Doctoral es evaluar el uso de andamiajes compuestos de ácido poliláctico y bioapatitas derivadas de dientes de tiburón fabricados mediante tecnología de impresión 3D para la regeneración de defectos óseos en un modelo de conejo. Para ello se fijaron una serie de objetivos específicos que se corresponden con cada uno de los siguientes capítulos: I. Analizar mediante una revisión sistemática de la literatura científica actual el uso de andamiajes compuestos de ácido poliláctico y biocerámicas impresos mediante tecnología 3D para la regeneración de tejidos óseos en modelos preclínicos in vivo. II. Comparar el efecto sobre la regeneración ósea del enriquecimiento progresivo de andamiajes de ácido poliláctico con bioapatitas marinas en defectos óseos practicados en calvaria de conejo. III. Evaluar la influencia de la geometría de los andamiajes sobre la regeneración ósea en defectos de tamaño crítico creados en cóndilo femoral lateral de conejo. Material y métodos 39 Para la evaluación del efecto sobre la regeneración ósea del enriquecimiento progresivo de andamiajes de ácido poliláctico con bioapatitas marinas derivadas de dientes de tiburón (Capítulo II), se utilizaron los filamentos de PLA, PLA-1CaP, PLA-2CaP y PLA-12CaP. Con los que se sintetizaron andamiajes porosos en forma de disco con un tapón ciego con dimensiones de 8 mm de diámetro y 1 mm de grosor en la tapa, y 6 mm de diámetro y 2 mm de grosor/altura en el cuerpo o sección interior que será introducida en el defecto, siguiendo un patrón de impresión alterno, donde cada una de cordones o “struts” es depositado perpendicularmente a la capa opuesta. La Figura 7 (a-d) muestra simulaciones del proceso de impresión y el resultado final del implante, utilizando el software “Simplify3D Professional”. Figura 7. Ilustraciones del proceso de impresión obtenidas del software “Simplify3D Professional” (a-c), y del resultado final de la misma (d). Imagen propia. Así mismo, con el fin de evaluar la influencia de la modificación de la arquitectura geométrica de los andamiajes sobre la regeneración ósea (Capítulo III), se seleccionaron únicamente filamentos de PLA-12CaP. En este caso, se sintetizaron andamiajes cilíndricos de 6 mm de diámetro y 10 mm de altura, utilizando dos patrones de impresión diferentes. Se fabricaron por un lado andamiajes porosos con un patrón de impresión alterno (denominándose dicha estructura alterna, ALT), variando el ángulo de deposición en 0º/90º/180º; y por otro lado andamiajes sintetizados siguiendo un ángulo de deposición de 0º/45º/90º/135º/180º, que se denominaron helicoidales (HEL). Al igual que en el caso anterior, el software “Simplify3D” fue utilizado para mostrar una simulación del proceso de impresión y el resultado final , como puede apreciarse en la Figura 8. IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 40 Figura 8. Ilustraciones del proceso de impresión obtenidas del software “Simplify3D Professional”. Simulación de fabricación de estructuras alternas (a) y helicoidales (b), y resultado final, disposición alterna (c y e) y helicoidal (d y f). Imagen propia. Finalmente, todas los andamiajes fueron envasados en condiciones de asepsia en una cabina de flujo laminar, y sometidos posteriormente a un proceso de esterilización mediante irradiación gamma utilizando una dosis de 15 kGy (Aragogamma, Barcelona). 3.2.4 Caracterización de los andamiajes 3.2.4.1 Ensayos de caracterización fisicoquímica y morfológica La caracterización fisicoquímica de los andamiajes fue realizada sobre los discos fabricados mediante impresión 3D (PLA, PLA-1CaP, PLA-2CaP, PLA-12CaP), correspondientes al Capítulo II. Esta se llevó a cabo en el Grupo de Novos Materiais (Universidade de Vigo) mediante espectroscopía “FT-Raman” utilizando el instrumento B&WTEK i-Raman-785S (Metrohm, Herisau, Suiza) equipado con una sonda BAC 100 (785 mm), para identificar las vibraciones moleculares correspondientes a los principales grupos funcionales. Además, su estructura cristalina fue evaluada por medio de difracción de rayos X (XDR) utilizando un difractómetro Siemens D-5000 (Siemens AG, Munich, Alemania). La microestructura se analizó por Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) con un equipo JEOL JSM-6700 FEG (JEOL Ltd., Tokyo, Japón) operando a un voltaje de aceleración de 5 kV. Para ello se tomaron micrografías de la parte superior de los implantes, previamente recubiertos de una fina capa de carbono. Las técnicas XRD y SEM se caracterizaron con los equipos de los Servicios Centrales (CACTI) de la Universidad de Vigo. La topografía de la superficie de los andamiajes, y la exposición en la misma de las partículas de bioCaP fue del mismo modo evaluada por medio del uso de Microscopía Electrónica de Barrido (TM3030, Hitachi, Japón), en el Departamento de Biomateriales del Instituto de Odontología Clínica (Universidad de Oslo). Para ello, los implantes fueron montados sobre soportes de aluminio con una cinta de carbono conductora, y recubiertos con oro hasta conseguir una capa de 2 nm. Posteriormente, las imágenes fueron obtenidas con un voltaje de aceleración de 15 kV. Material y métodos 41 3.2.4.2 Análisis de la morfología del poro La microestructura de los implantes fue determinada de manera no destructiva a partir de imágenes tridimensionales obtenidas mediante el uso de un microtomógrafo computarizado (micro-CT) “SkyScan” 1172 (Bruker Micro-CT NV, Kontich, Bélgica) en el Departamento de Biomateriales del Instituto de Odontología Clínica (Universidad de Oslo). Para ello, los parámetros de escaneo fueron establecidos en 70 kV y 141 mA para la fuente de rayos, seleccionando un filtro de aluminio de 0,5 mm y configurando un tamaño de píxel de 13,54 µm. Las muestras se rotaron 360º alrededor de su eje vertical, siendo recogidas las imágenes cada 0.4 grados. Éstas fueron a continuación reconstruidas utilizando el software “NRecon” (Bruker Micro-CT NV, Kontich, Bélgica) en base a tomografías seriadas con orientación coronal utilizando un algoritmo de retroproyección modificado [93]. Posteriormente, el software “CTAn” (Bruker Micro-CT NV, Kontich, Bélgica) fue empleado para el análisis cuantitativo de los andamiajes fabricados. Los discos sintetizados para el desarrollo del Capítulo II fueron analizados a partir de secciones axiales transversales. El volumen de interés (VOI) fue definido como una región cilíndrica de 5,5 mm centrada en el andamiaje con una longitud total de 1,8 mm (133 cortes). Para el análisis, se utilizó un filtro de difusión anisotrópica seguido de la aplicación un método que establece un umbral de forma manual basándose en histogramas [94], estableciendo los valores de escala de grises entre 35 y 255 (siendo 0: negro y 255: blanco). A continuación, una herramienta de “despeckle” se empleó para eliminar los píxeles blancos excepto no incluidos en el objeto de mayor tamaño, y aquellos píxeles menores de 27 vóxels para eliminar el ruido existente en las imágenes. Finalmente, se llevó a cabo un análisis 3D y de parámetros morfológicos, obteniéndose mediciones de porosidad, diámetro de los “struts” (Grosor de las líneas o “struts”; St.Th.) y separación entre “struts” (tamaño de poro, St.Sp.). Así mismo, la interconectividad de los andamiajes fue calculada utilizando un algoritmo descrito previamente [95,96], el cual considera únicamente el volumen de poros abiertos y accesibles en el interior de la estructura. Este método permite cuantificar el crecimiento óseo hacia la parte interna del implante en función del tamaño de los poros accesibles basándose en su diámetro, obteniéndose por tanto la constricción o estrechez de poro que conecta cada vóxel con la periferia del andamio [97]. Los cilindros fabricados en el Capítulo III fueron igualmente analizados a partir de secciones axiales transversales. En este caso el volumen de interés fue definido como una región cilíndrica de 5,5 mm de diámetro y una longitud de 8 mm (591 cortes). Para su análisis, al igual que en caso anterior, se utilizaron un filtro de difusión anisotrópica, un método para establecer un umbral de forma manual basándose en histogramas y una herramienta de “despeckle”, previamente a la cuantificación de parámetros específicos como la porosidad abierta, el ratio de la superficie del objeto en función del volumen (Obj S/V ratio), diámetro de los “struts” (St.Th.) y separación entre “struts” (tamaño de poro, St.Sp.). Del mismo modo, la interconectividad fue calculada con un algoritmo que considera únicamente el volumen de poros abiertos y accesibles dentro de la estructura, según lo previamente indicado en esta sección. 3.2.4.3 Ensayos mecánicos Las pruebas de compresión mecánica (Zwicki, Zwick/Roell, Ulm, Alemania) fueron realizados en el Departamento de Biomateriales del Instituto de Odontología Clínica (Universidad de Oslo), para evaluar la resistencia mecánica de los andamiajes impresos mediante tecnología 3D. Para ello se utilizó una célula de carga de 1 kN, con una fuerza de precarga fijada en 0,5 N. Los discos (F6 x 2 mm) y los cilindros (F6 x 10 mm) se comprimieron a lo largo de su eje longitudinal a una velocidad de compresión de 1 mm/min hasta alcanzar el IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 42 fallo. La fuerza y el desplazamiento se registraron durante el proceso de compresión, y se transformaron en datos de tensión y deformación basándose en las dimensiones iniciales de los andamiajes. Finalmente, la resistencia a la compresión se midió al final del módulo elástico. 3.2.4.4 Ensayos de humectabilidad La humectabilidad de los andamiajes, concretamente de los discos fabricados en el Capítulo II, fue determinada mediante la medición del ángulo de contacto estático con el agua utilizado el goniómetro “OCA Plus 20" (DataPhysics Instrument GmbH; Alemania) en el Departamento de Biomateriales del Instituto de Odontología Clínica (Universidad de Oslo). En torno a un 1 µl de agua destilada fue inyectado sobre la superficie de los implantes de cada grupo (n=2), y a continuación, tras la formación de la gotas, se obtuvieron imágenes de las mismas para llevar a cabo el análisis por medio de la técnica de la gota sésil en 3 puntos de cada una de las muestras. 3.2.5 Modelo animal y consideraciones éticas Diez conejos adultos, esqueléticamente maduros, de la raza New Zealand White (Granja San Bernardo, Navarra, España) con un peso medio de 4,825 kg fueron utilizados en este estudio. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Santiago de Compostela (España) (Número de Referencia - 02/20/LU-002) y autorizados por la Xunta de Galicia. Así mismo, todos los experimentos animales fueron realizados según la normativa europea y española sobre la protección de animales utilizados con fines científicos (Directiva 2010/63/UE y Real Decreto 53/2013). Además, la descripción de la metodología experimental fue realizada según las directrices ARRIVE (“Animals in Research Reporting In Vivo Experiments”) [91], para la correcta comunicación de los resultados obtenidos de estudios con animales. Los procedimientos experimentales, así como el alojamiento de los animales, se llevaron a cabo en el Centro de Experimentación Animal de Universidad de Santiago de Compostela, REGA: ES270280331701 (Campus de Lugo, España), donde los animales fueron manejados y monitorizados por personal experimentado y debidamente cualificado (Iván Alonso Fernández, Antonio González Cantalapiedra y Fernando María Muñoz Guzón). Los animales fueron alojados en jaulas para conejos individuales (R-Suite, Tecniplast, Varese, Italia), ventiladas y enriquecidas mediante el uso de hierba esterilizada mediante autoclave, rollos de papel y palos de madera. Las salas donde se albergaban los animales se mantuvieron bajo unas condiciones de humedad y temperatura controladas, bajo un ciclo luz-oscuridad de 12 horas. En cuanto a su alimentación, se proporcionaron comida y agua ad libitum. Los animales fueron utilizados para le experimento tras un período de cuarentena/aclimatación de 3 semanas desde su llegada a las instalaciones. Para la elección del tamaño muestral del estudio, se tomó como referencia en establecido en los estándares UNE-EN ISO 10993-6:2017. 3.2.6 Procedimiento experimental e implantación de los andamiajes El protocolo anestésico fue diseñado específicamente para la realización de las cirugías, tratando de reducir al máximo el dolor y la angustia de los animales. Para ello, los conejos fueron premedicados mediante la administración intramuscular de una combinación de medetomidina (50 µg/kg IM, Domtor, Esteve, Barcelona, España), ketamina (25 mg/kg IM, Imalgène 1000, Merial, Toulouse, Francia) y buprenorfina (0.03 mg/kg IM, Buprex, RB Pharmaceuticals, Berkshire, Reino Unido). Y a continuación, la anestesia general fue inducida y mantenida por medio del uso de anestesia inhalatoria, concretamente de isoflurano Material y métodos 43 (Inspiratory Fraction ISO 2.5-4%, Isova-vet, Schering-Plow, Madrid, España). Adicionalmente se les administraron mediante inyección subcutánea durante el período preoperatorio enrofloxacino (5 mg/kg SC, Ganadexil 5%, Invesa, Barcelona, España) como profilaxis antibiótica, y meloxicam (0.2 mg/kg SC, Metacam, Boehringer Ingelheim, Barcelona, España) como fármaco analgésico adicional a la buprenorfina para el control del dolor y la inflamación. Para la descripción de las cirugías llevadas a cabo durante el proceso experimental, procederemos a describir los procedimientos realizados para el cumplimiento de los objetivos correspondientes al Capítulo II y Capítulo III. Capítulo II: Una vez anestesiados, la región frontoparietal de los conejos fue rasurada y desinfectada con una mezcla al 50/50 de alcohol y povidona iodada. Posteriormente, se realizó una incisión longitudinal en la calota a lo largo de la línea media sagital, y el hueso frontoparietal de la calota fue expuesto por medio de la elevación de un colgajo mucoperióstico. Una vez identificadas las suturas sagitales y coronales que delinean los huesos frontal, parietal izquierdo y parietal derecho; se crearon cuatro defectos óseos circulares de 6 milímetros a cada lado de las suturas coronal y mediana, utilizando una tefrina (227B.204.060, Komet, Alemania) acoplada en una pieza de mano quirúrgica con abundante irrigación con solución salina fisiológica. La osteotomía fue realizada cuidadosamente para evitar dañar la duramadre expuesta subyacente. Finalmente, los segmentos óseos bicorticales fueron luxados utilizando un osteotomo, y a cada uno de los defectos se les asignó uno de los discos pertenecientes a los grupos de tratamiento según la aleatorización en bloques (Tabla 3): PLA (grupo control positivo), PLA-1CaP, PLA-2CaP y PLA-12CaP. La Figura 9 muestra imágenes relevantes del proceso quirúrgico correspondiente al Capítulo II. Tabla 3. Aleatorización de los grupos de tratamiento en calota. CRL (Defecto Craneal Izquierdo), CRR (Defecto Craneal Derecho), CDL (Defecto Caudal Izquierdo) y CDR (Defecto Caudal Derecho) PLA (control) PLA-1CaP PLA-2CaP PLA-12CaP Conejo 1 CDR CDL CRL CRR Conejo 2 CDL CRL CRR CDR Conejo 3 CRL CRR CDR CDL Conejo 4 CRR CDR CDL CRL Conejo 5 CDR CDL CRL CRR Conejo 6 CDL CRL CRR CDR Conejo 7 CRL CRR CDR CDL Conejo 8 CRR CDR CDL CRL IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 44 Figura 9. Imagen intraoperatoria de los defectos realizados en calota. Realización de los defectos con una fresa tefrina (a), imagen tras la luxación de los fragmentos óseos bicorticales (b) e implantación de los andamiajes (c). Imagen propia. Capítulo III: En este caso, una región delimitada entre las diáfisis del fémur y la tibia fue rasurada y desinfectada. A continuación, la piel, el tejido subcutáneo y el músculo fueron incididos y diseccionados capa por capa, para la realización un defecto óseo circular de 6 mm de diámetro en el cóndilo femoral lateral de ambas extremidades con el uso una tefrina (227B.204.060, Komet, Alemania). Tras la luxación del fragmento óseo monocortical con un osteotomo, los cilindros fabricados con disposiciones ALT y HEL fueron implantados en cada uno de los defectos, según lo establecido en la aleatorización en bloques (Tabla 4): PLA-12CaPALT (estructura alterna) y PLA-12CaP-HEL (estructura helicoidal). La Figura 10 muestra imágenes relevantes del proceso quirúrgico correspondiente al Capítulo III. Tabla 4. Aleatorización de los grupos de tratamiento en cóndilo femoral. RLFC (Cóndilo Femoral Lateral Derecho) y LLFC (Cóndilo Femoral Lateral Izquierdo). PLA-12CaP-ALT PLA-12CaP-HEL Conejo 1 RLFC LLFC Conejo 2 RLFC LLFC Conejo 3 RLFC LLFC Conejo 4 RLFC LLFC Conejo 5 LLFC RLFC Conejo 6 LLFC RLFC Conejo 7 LLFC RLFC Conejo 8 RLFC LLFC Material y métodos 45 Figura 10: Imagen intraoperatoria de los defectos realizados en cóndilo femoral lateral. Realización de los defectos con una fresa tefrina (a), imagen tras la luxación del fragmento óseos monocortical (b) e implantación del andamiaje (c). Imagen propia. Tras la implantación de los andamiajes, se utilizó un patrón de sutura continuo simple para cerrar los planos subcutáneo y muscular con VYCRYL 4/0 (Ethicon, Johnson & Johnson, Madrid, España). Y se seleccionó un patrón de puntos simples para el cierre de la piel con la misma sutura. Finalmente, se revirtió la sedación por medio de una inyección intramuscular de atipamezol (25 ug/kg IM, Nosedorm, Karizoo, Barcelona, España). Así mismo, como tratamiento postoperatorio durante los 5 días siguientes a la cirugía se administró a los conejos enrofloxacino (5 mg/kg, Ganadexil 10%, Invesa, Barcelona, España) por vía oral para evitar la aparición de infecciones, y meloxicam (0.1 mg/kg SC, Metacam, Boehringer Ingelheim, Barcelona, España) por vía subcutánea para el control del dolor. Los conejos fueron monitorizados semanalmente por veterinarios para la detección de dehiscencias, inflamación o infecciones, y la evaluación de su salud general hasta el momento del sacrificio. 12 semanas tras la implantación, los animales fueron sedados mediante una inyección intramuscular de medetomidina (50 ug/kg, Domtor, Esteve, Barcelona, España) y ketamina (25 mg/kg IM, Imalgène 1000, Merial, Toulouse, Francia), y posteriormente eutanasiados por medio de la inyección de pentobarbital sódico (100 mg/kg IV, Dolethal, Vétoquinol, Madrid, España) en la vena auricular lateral. Inmediatamente tras la eutanasia, las muestras de calvaria y fémur fueron disecadas de piel, tejidos blandos y músculo, y fijadas en formalina tamponada al 10% durante 2 semanas. 3.2.7 Evaluación de la regeneración ósea 3.2.7.1 Análisis con microtomografía computarizada Una vez fijadas las muestras, estas fueron envueltas en una gasa humedecida con formalina tamponada al 10% y se escanearon previamente a ser procesadas para su análisis histológico. Las muestras fueron escaneadas utilizando un instrumento de microtomógrafía computarizada de alta resolución (“Skyscan” 1172, Bruker micro-CT NV, Kontich, Bélgica), IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 46 equipado con una cámara CCD de 11-Mpixel. Los parámetros de adquisición fueron establecidos en 70 kV, 141 uA, filtro de aluminio de 0.5 mm, paso de rotación de 0.400º sobre un total de 360 º, y un tiempo de exposición de 1710 ms por proyección. La reconstrucción de las proyecciones de rayos X se realizó utilizando un algoritmo de retroproyección modificado [93], mediant el uso del software “NRecon” (Bruker Micro-CT NV, Kontich, Bélgica), obteniéndose un tamaño final de vóxel de 13,58 µm. El análisis quantitativos de la formación de hueso nuevo en los defectos se realizó mediante uso del software “CTAn” (Bruker MicroCT NV, Kontich, Bélgica) Para los andamiajes implantados en calota, correspondientes al Capítulo II, el volumen de interés (VOI) se definió a partir de cortes axiales como una región de cilíndrica de 5,96 mm, centrada en el defecto y ajustándose a los márgenes del mismo, y que transcurre desde la tapa del implante hasta su parte inferior excluyéndose los extremos. De este modo se obtiene una altura total de 1,45 mm (107 cortes). En el caso de los cilindros sintetizados para su implantación en cóndilo femoral lateral, correspondientes al Capítulo III, el volumen de interés (VOI) fue establecido como una región cilíndrica centrada en el defecto de 5,98 mm de diámetro y 6 mm (442 cortes) de altura. Excluyéndose del análisis al igual que en el caso anterior los extremos. Posteriormente, se aplicaron sobre las imágenes un filtro de difusión anisotrópica, se estableció el valor de la escala de grises de 80 a 255 (siendo 0: negro y 255: blanco)[94] y se empleó la herramienta “despeckle” para eliminar puntos blancos con un tamaño inferior a 27 vóxels. Esto nos permiten evaluar la formación de nuevo tejido mineralizado, y distinguirlo del implante y de otros tejidos conectivos fibrovasculares radiolúcidos adyacentes. Finalmente, para evaluar la capacidad de regeneración ósea de los andamiajes, se analizaron los siguientes parámetros: - Volumen Óseo/Volumen Tisular (BV/TV): Esta medida cuantifica el hueso neoformado existente en un determinado volumen de interés con respecto a la cantidad total de tejido. - Superficie Ósea/Volumen Óseo (BS/BV): Describe la relación entre la superficie de nuevo hueso formado y su volumen, y es un indicador del área disponible del hueso regenerado. - Grosor Trabecular (Tb.Th.): Parámetro que indica el grosor medio del hueso trabecular regenerado. - Factor de Patrón Trabecular (Tb.Pf.): Refleja cuantitativamente el ratio de conectividad intertrabecular. 3.2.7.2 Preparación y análisis histológico Tras su análisis microtomográfico, las muestras se mantuvieron en formalina tamponada durante una semana más. Tras este período, fueron cuidadosamente cortadas a lo largo de las suturas sagital y coronal de la calota, y cada uno de cuatro defectos con su respectivo implante fueron individualizados. A continuación, se procedió a procesar cada uno de los especímenes según el método descrito por Donath [98], para la obtención de secciones histológicas sin descalcificar. Las muestras fueron deshidratadas por medio de una serie disoluciones con grados ascendentes de etanol (70-100% EtOH), y luego infiltradas e incluidas en una resina de metacrilato fotopolimerizable (“Technovit” 7200-VLC, Heraus Kulzer GmbH, Werheim, Alemania). Concretamente, estas fueron infiltradas primero en una serie de soluciones mixtas de alcohol etílico y resina, con concentraciones ascendentes de esta última, para posteriormente lograr una adecuada penetración de la resina por medio del uso de un Material y métodos 47 sistema de inclusión por vacío, y la fotopolimerización de la resina a través del uso de radiación UV. En el siguiente paso, los bloques de resina fueron seccionados por la línea media del defecto (secciones centrales) utilizando una sierra de banda (“EXAKT”, Apparatebau, Norderstedt, Alemania). La misma herramienta, fue utilizada a continuación para obtener secciones transversales de cada bloque con un grosor inicial de 250 ± 50 µm, que fueron pulidas con una micropulidora (“EXAKT”, Apparatebau, Norderstedt, Alemania) empleando láminas de carburo de silicio con un tamaño de grano de 1200 y 4000 (Struers, Conpehagen, Dinamarca), hasta obtener sección con un grosor de aproximadamente 40 µm. Finalmente, estas fueron teñidas por el método de Lévai-Laczkó. Para el análisis histológico, todas las muestras con andamiajes implantados en defectos en calota fueron evaluadas microscópicamente (Olympus BX41 microscope; Olympus Corporation, Tokyo, Japón) de acuerdo a lo establecido en los estándares UNE-EN ISO 109936:2017, para el análisis de los efectos locales existentes tras la implantación, como son la respuesta inflamatoria, la formación de nuevos vasos sanguíneos y la presencia de fibrosis o infiltrados grasos. Por consiguiente, los andamiajes implantados fueron clasificados en base a la siguiente escala de graduación como: no irritantes, levemente irritantes, moderado o severo. Además, también se realizó una descripción detallada de los hallazgos histológicos más relevantes. 3.2.7.3 Análisis histomorfométrico Para los análisis quantitativos, las secciones al completo fueron capturadas con un microscopio “Olympus” BX51 (Olympus Corporation, Tokyo, Japón), con aumentos x10 en el caso de las muestras provenientes de calvaria (Capítulo II), y x4 para las muestras extraídas de cóndilo femoral lateral (Capítulo III). A continuación, las imágenes fueron coloreadas con el programa “Adobe Photoshop CS6” (Adobe Systems Incorporated, San Jose, EE.UU.), diferenciando el hueso nuevo regenerado, el hueso maduro, el material implantado y los tejidos blandos. Dichas imágenes coloreadas fueron posteriormente analizadas para medir los diferentes parámetros histomorfométricos que se expondrán a continuación utilizando el software “Olympus CellSens 1.5” (Olympus Corporation, Tokyo, Japón). Para dicha valoración, se definió una región de interés (ROI) entre los márgenes delimitados lateral y medialmente por el hueso nuevo y el hueso maduro, y dorsal y ventralmente por los extremos de los andamiajes. Los parámetros histomorfométricos evaluados fueron: - Contacto Hueso-Implante (BIC): Este parámetro hace referencia al porcentaje de hueso en contacto con el implante, con respecto al perímetro total del mismo. - Superficie del Implante/Superficie Tisular (IS/TS): Cuantifica la relación entre la superficie de implante y la superficie tisular total dentro de la ROI. - Superficie Ósea/ Superficie Tisular (BS/TS): Evalúa la cantidad de hueso neoformado en la ROI, basándose en la relación entre la superficie del hueso regenerado y la superficie tisular total. 3.2.8 Análisis estadístico El análisis realizado para la evaluación de los resultados se mostrará de forma individualizada para el Capítulo II y el Capítulo III. En ambos casos se llevó a cabo utilizando el software SigmaPlot 12.5 (Systat Software Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Todos los datos se expresaron como medias ± desviaciones estándar (SDs). Capítulo II: La normalidad de las variables fue evaluada utilizando la prueba de ShapiroWilk, y la prueba de Levene fue empleada para evaluar la igualdad de las varianzas de las IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 48 variables normales. La comparación estadística se realizó mediante un análisis de varianza unidireccional (ANOVA), seguido de una prueba post-hoc para las comparaciones múltiples por pares mediante el método Holm-Sidak. En el caso de variables no normales, una prueba de Friedman fue realizada para evaluar las comparaciones estadísticas, seguida de un análisis posthoc utilizando una prueba de Tuckey. Además, se llevaron a cabo estudios de correlación utilizando el análisis de correlación de Pearson. El nivel de significación se fijón en p<0,05 para todos los parámetros. Capítulo III: En el análisis estadístico de la morfología del poro y las pruebas mecánicas, la normalidad de las variables fue evaluada mediante las pruebas de Kolmogoron-Smirnov o Shapiro-Wilk, y las comparaciones estadísticas de los resultados obtenidos de los distintos grupos se realizó por medio de una prueba T pareada. Además, se llevaron a cabo estudios de correlación utilizando el análisis de correlación de Pearson. Sin embargo, en el caso de los resultados obtenidos de los análisis microtomográficos e histomorfométricos, la normalidad de las variables fue evaluada por medio de la prueba de Shapiro-Wilk, y continuación la igualdad de las varianzas se verificó mediante una prueba de Igualdad de Varianzas. En caso de que se superasen ambas pruebas, la comparación estadística de las muestras pertenecientes a ambos grupos se realizó mediante la prueba T de Student. Por el contrario, en aquellos casos donde las variables eran normales, pero no se superaba la prueba de Igualdad de Varianzas, la comparación estadística de los resultados se llevó a cabo mediante la prueba Mann-Whitney U. El nivel de significación se fijó en p<0,05 para todos los parámetros. Results 55 Likewise, many few procedures can also favor bone regeneration, such as sinusoidal electromagnetic fields (EMF) [219] or induced membrane technique (IMT) [212]. EMF triggered a higher new bone formation and vascularization. And IMT generated membranes similar to the periosteum, giving interesting results for treating large bone defects when combined with autografts [227]. There are different methods to assess bone healing in clinical trials. The ones utilized in selected studies were summarized in Tables 8 and 9. Histological evaluation was the most frequently used (n=14), being able to distinguish between a qualitative histological analysis (n=13), which described the results without the use of objective measurement techniques; and a quantitative or histomorphometric analysis (n=5), that supplies objective data about the parameters analyzed such as angiogenesis or osteogenesis. In addition, these procedures can be carried out by decalcifying the bone and embedding it in paraffin (n=10) or dehydrating and embedding it in a resin (n=4). Likewise, micro-computed tomography analysis was widely used (n=9), providing objective measurements to quantify bone regeneration. Other methods are radiographic evaluation, fluorescence imaging, immunohistochemistry (osteocalcin (OC), type I collagen (COL-1) or CD31) or biochemical analysis. Follow-ups varied between 4 and 16 weeks, a single observation time was reported in 4 out of 13 studies [77,216,217,221,222] and in the other ones, multiple observation times were utilized. 4.1.2.1 Studies in rats – main features In vivo trials for testing biomaterials were conducted in the included reports through unilateral or bilateral defects in the calvaria of adult rats without any adverse reactions to the implanted scaffolds being reported. The main characteristics and results of the studies are summarized in Table 8 (Included at the end of this Chapter). First, regarding the anaesthetic protocols, different drugs and their combinations were utilized by the authors. Intraperitoneal injection of pentobarbital was administered in two studies, as a single drug [222], or in combination with inhaled isoflurane [219]. Ketamine was used alone [75], combined with xylazine [217,221], or with xylazine and midazolam [218]. Kwon et al. [220] chose a mixture of tiletamine, zolazepam and xylazine. Besides, only one study reports the use of local anaesthesia, with lidocaine, and/or postoperative analgesia, in this case, buprenorphine [217]. Given the importance of the anaesthetic protocol, both from an ethical and experimental process point of views, it will be analyzed in more in detail in the discussion section. HA was the main bioceramic added to a PLA matrix for synthesizing composites, which will be later used to produce 3D porous scaffolds via 3D-printing. They were tested in rats in three studies [75,217,219]. Gendviliene et al. [217] manufactured PLA-HA scaffolds and showed a low potential to induce bone growing (BV (mm3) micro-CT: male 3.86±0.99, new bone (mm2) histology: 2.90±0.06), that was slightly higher than PLA alone scaffolds and negative control, but less than the one showed by the Bio-Oss (BV (mm3) micro-CT: male 4.24±0.51, new bone (mm2) histology: 4.15±0.58). However, these results seemed to be improved by the incorporation of dental pulp stem cells to obtain cellularized scaffolds (PLAHA-cells), or the production of decellularized extracellular matrix PLA-HA (PLA-HA-dECM) scaffolds. Thus, achieving a bone formation in vivo similar o even superior to that obtained with the Bio-Oss (PLA-HA-cells BV (mm3) micro-CT: male 4.11±0.72, new bone (mm2) histology: 3.66±0.29; PLA-HA-ECM BV (mm3) micro-CT: male 5.09±1.27, new bone (mm2) histology: 3.80±0.24). Interestingly, significant differences between male and female groups can be appreciated in relation to bone growth (Figure 12). IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 56 Figure 12. Micro-CT and histology results according to gender (All parameters are presented as mean SD). Processed micro-CT images taken with an X-Ray 3D Computer tomograph RayScan 250E. (a,d) Negative control (purple) and Geistlich Bio-Ossâ (blue). (b,e) Pure PLA (blue) and PLA-HA (purple) scaffolds. (c,f) PLA-HA cellularized with dental pulp stem cells (blue) and PLA-HA-dECM scaffolds (purple) [217]. “Reprint with permission from [8] under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License, CC BYNC.ND 4.0.” Nevertheless, Zhang et al. [75] demonstrated the osteogenic capability of 3D-printed PLA-HA scaffolds, as confirmed by histological examination and the results of the tomographic analysis, which was performed at 4 and 8 weeks, showing that scaffolds’ bone volume per total volume (BV/TV) presented values around 45% at 8 weeks. On the other hand, defects filled with bTCP presented the highest BV/TV value, almost reaching 50%, and those filled with demineralized bone matrix (DBM) and the empty ones got the lowest values. Tu et al. [219] utilized nano-grade HA to manufacture 3D-printed PLA-HA composite scaffolds. Micro-CT results at 4 weeks after surgery indicate a BV/TV of about 10% approximately, a lower value than that obtained by Zhang et al. [75] at the same time point, approximately 20%. Histological and micro-CT results of the PLA-HA scaffold group were superior to the control group at both time points (PLA-HA BV/TV and New Bone Area Fraction (%) 4w and 8w: ~10% and ~20%). However, Tu et al. [219] applicated two different treatments to PLA-HA scaffolds to improve their bone regeneration capability, seeding rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), applying electromagnetic fields (EMF) or both, thus generating another 3 experimental groups. The results showed a higher percentage of bone growth in all groups, being more notable in the one that combined BMSCs and EMF (PLA-HA BMSCs + EMF BV/TV; 4w and 8w: ~35% and ~70%; New Bone Area Fraction (%) 4w and 8w: ~30% and ~60%). When used independently, the amount of new bone is lower without significant differences between PLA-HA BMSCs and PLA-HA EMF groups at any time point (Figure 13). Results 57 Figure 13. Bone regeneration evaluated by HE staining. Coronal HE stained sections in the calvarial defect region of different groups were taken 4 and 12 weeks post-operation. The dotted line indicates the boundary of the 6-mm defect. Blue wary lines designate newly formed bone, and asterisks point to residual scaffolds. Scale bars in lower magnification images represent 1000 µm, and scale bars in higher magnification images represent 250 µm [219]. “Reprint with permission from [8] under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License, CC BY-NC.ND 4.0.” Almost no direct comparisons could be performed among papers that used HA in rat’s calvaria model [75,217,219], because of differences in time points, PLA-HA mixing ratios and the defects’ number and/or size. Octacalcium phosphate (OCP) is thought to be one of the precursors for the formation of bone apatite crystals, being converted to HA under physiological environments. OCP powders were synthesized and mixed with PLA to create 3D-printed porous scaffolds [222]. Likewise, OCP with different concentrations of Lanthanum (0.2/0.5/1La-OCP) were prepared via coprecipitation methods. In vivo trials showed that OCP promoted positive bone formation, an 0.2 La-OCP-PLA scaffolds showed an improvement in bone defect regeneration compared with the other groups. b-tricalcium phosphate (b-TCP) was added to PLLA scaffolds by Kwon et al. [220], demonstrating effective support of bone regeneration. Micro-computed tomography showed a higher percentage of bone regeneration when a weight fraction (w.t.) of 30 TCP (~25% at 12 weeks) was used, compared with PLLA-TCP10 w.t. (~10% at 12 weeks) or PLLA (~0% at 12 weeks) at all time points. The same trend was maintained when MG-63 cells were added to the scaffold, reaching 45% of bone regeneration values in the PLLA-30TCP group at 12 weeks. Besides, Massons’s trichrome staining of cranial bone showed the formation of new bone tissue with a typical mature bone structure when MG-63 cells are added. CaP biomimetic coatings have shown their capability to confer osteoconductivity properties to scaffolds. Maia-Pinto et al. [218] developed and evaluated PLA scaffolds biomimetically coated with apatites, with and without loading rhBMP-2. After 6 months, trim bone formation levels were appreciated in PLA group (New formed bone: 11.2%), compared with PLA-CaP and PLA-CaP-BMP2 groups, which presented significantly better biological responses of newly formed bone, 31.2% and 44.85%, respectively. Besides, PLA-CaP-BMP2 groups presented bone tissue formation with a more advance degree of maturity filling larger areas, as compared to PLA-CaP group, nevertheless no significant degradation of the implants, was observed. Finally, Tcacencu et al. [221] created a composite structure by manufacturing PLA and apatite-wollastonite (AW) disks combined with thermal bonding, creating AW/PLA porous IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 58 composite structures. Despite the confirmation by histological assessment of the in vivo biocompatibility of PLA, AW and AW/PLA scaffolds, the AW/PLA implants resulted in the group with the most considerable amount of newly formed bone, with a percentage of newly formed bone between 15 and 25%, versus other groups like AW disks, which showed percentages of 1-2%. 4.1.2.2 Studies in rabbits – main features Studies in rabbits were performed on appendicular limbs, including the femur, tibia, and radius. No adverse effects were found when evaluating the behavior of the biomaterials. The main characteristics and results of the reports are summarized in Table 9 (Included at the end of this Chapter). Curiously, 4 out of the 7 anaesthetic protocols selected in rabbits [77,212–214] included only an injection of pentobarbital, without the complementary administration of any drug. Regarding the other 3 studies, one reported the use of xylazine [211], and in the other one [215], no information about the anaesthetic protocol was provided. Eventually, Minto et al. [216] selected combination of ketamine, midazolam and morphine for preanaesthetic medication, besides they administered isoflurane for the induction and maintenance of the general anaesthesia, and performed a right brachial plexus block using lidocaine. Likewise, authors used tramadol and meloxicam for postoperative pain control. As it was mentioned above, HA is the most commonly used bioceramic, having been selected in all the studies in rabbits [77,211–216]. Specifically n-HA, was utilized in 4 reports [77,211,213,214]; and 3 of them used a 5-millimeter circular defect in the femoral diaphysis to assess their bone regeneration properties [77,213,214]. Wang et al. [213] synthetized PLA30%n-HA scaffolds and compared them with PLA-0%n-HA scaffolds. In vivo trials showed new bone tissue growing in all groups at any time points without inflammatory reaction or tissue necrosis, demonstrating the biocompatibility of the implant. Micro-CT results indicated a higher bone growth in PLA-30%n-HA groups at 4, 8 and 12 weeks, with BV/TV percentages of 40%, vs 30% in PLA-0%n-HA group. Wang et al. [214] manufactured 3D-printed porous scaffolds with a 5:5 mass ratio PLA-n-HA showing that high n-HA content composite materials were biocompatible and osteogenic inductors conducting new bone growth at 1,2 and 3 months. Statistical differences (p<0.001) were found when comparing BV/TV between PLA (~35% BV/TV at 3 months) and PLA-50%n-HA groups (~60% BV/TV at 3 months) (Figure 14). Likewise, these results were superior to those obtained by Wang et al. [213] at the same time point, 40% BV/TV PLA/30%n-HA vs 60% BV/TV PLA/50%n-HA, so a higher amount of nHA on composites is related with an improved bone regeneration of femoral defects. Zhang et al. [77], for their part, reported the implantation during 4 weeks of porous PLLA/n-HA scaffolds loaded with 0%, 30% and 50% n-HA, and despite not having performed a quantitative analysis of the results, histological observations demonstrated that all the specimens were utterly integrated with surrounding host tissue, with a little bone tissue formation in the internal pores of PLLA/30% n-HA scaffolds and even less in PLLA ones, which presented the least new bone tissue. However, in the PLLA/50%n-HA scaffolds, all the pores were filled with new bone tissue, with signs indicating bone maturation. This reaffirms what was previously indicated about the relation between the presence of HA, and bone regeneration (Figure 15). The latest report on n-HA composites is the one carried out by Chen et al. [211], who developed porous PLA/n-HA composite scaffolds with the following PLA/n-HA mixing ratio 9:1 m/m, and evaluated their in vivo osteogenic effects by means of circular defects in the distal part of the femur. Quantitative analysis of micro-CT showed that BV/TV increased with the increased implant time, from 6% at 4 weeks to 20% at 12 weeks; besides the histological section indicated Results 59 no inflammation signs and the presence of bone in bone/implant contact region and inside the pores. Figure 14: Micro-CT analysis of the implanted scaffolds. The PLA and PLA-n-HA composite scaffolds were implanted into the rabbit femoral defect. (a) At 1,2 and 3 months after scaffold implantation, the bone defect area was scanned using micro-CT, and 3D reconstruction was performed. The reconstructed scaffold was shown in red and the bone in gold; (b) the scaffold-implanted area of the cortical bone (5 mm in diameter and 2 mm in depth) was reconstructed in 3D; and (c and d) quantitative calculation of new bone growth based on microCT data, mineral density (MD), and bone tissue volume (BV)/total tissue volume (TV). *p<0.05; **p<0.01;***p<0.001. [214]. “Reprint with permission from [8] under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License, CC BY-NC.ND 4.0.” Figure 15: HE evaluation of PLLA-n-HA implanted scaffolds. Cross-section HE histological images of PLLA, 30%nHA and 50%n-HA explants after 4 weeks implantation in vivo (a,d,g); high magnification images of PLLA crosssections and new bone (b,c); high magnification images of 30%n-HA cross-section and new bone (e,f); high magnification images of 50%n-HA cross-sections and new bone (h,i) (M: materials cross-sections, NB: new bone) [77]. “Reprint with permission from [8] under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License, CC BY-NC.ND 4.0.” IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 60 No nano-hydroxyapatite powders were utilized in 3 reports in rabbits. Liu et al. [212] designed a 3D-printed scaffold with a PLA-HA mass ratio of 7:3, and tested it in long bone defects, specifically in a segmental defect in the middle of the left radius. Besides, they studied the effect of its use with induced membranes (IM), alone and combined with enhanced bone marrow (eBM), or iliac crest bone graft (ICBG), which is considered the gold standard in bone regeneration to improve the bone healing process. Micro-tomographic analysis was performed at 16 weeks and showed the following results: PLA/HA group obtained the lowest BV/TV values (~30%), then IM+PLA-HA group (~50%), and finally IM+ICBG (~70%) and IM+PLAHA+eBM (~70%), which had demonstrated the best effects on bone regeneration, without significative differences between them. Thus, IM and eBM significantly enhanced bone repair, achieving greater ratios of woven bone than PLA-HA and IM+PLA-HA groups. Likewise, histomorphometry results showed the same trend, with the following area ratios of WB at 8 weeks: PLA-HA (~20%) < IM+PLA-HA (~40%) < IM + ICBG (~70%) = IM + PLA-HA + eBM (~70%). Minto et al. [216] manufactured a 3D-printed PLLA-HA non-porous scaffolds to fill a defect in the right radius diaphysis, and compared it with empty control and iliac crest autologous graft groups. No severe lameness was detected in any of the groups, however, the PLLA-HA ones showed grater lameness, edema, and pain, compared with the others. Likewise, radiographic, and histopathologic studies showed smaller bone callous and grater inflammation signs, respectively, when animals included in PLLA-HA group were analyzed. The autologous graft group, as expected, was the one which led to superior results. Finally, 3D-printed PLA-HA composites scaffolds were combined with in vivo bioreactor strategies to generate vascularized tissue-engineered bone of customizable size and geometry by Zangh et al. [215]. The scaffolds were seeded with autologous BMSCs, crossed with a vascular bundle (experimental group, EG) or not (control group, CG) and inserted in a tibial periosteum capsule. The histological examination revealed neovascular formation and ossified tissue regeneration in both groups at 4 and 8 weeks. Microangiography and micro-CT measurements showed a higher vessel number and volume in the EG than CG at any time point. In the same way, BV/TV analysis of the EG was significantly greater than CG, 35% vs 20% at 4 weeks, and 70% vs 30% at 8 weeks. 4.1.3 Study qualitiy and risk of bias assessment The quality assessment of the studies was performed according to the essential items of the ARRIVE guidelines, which are summarized in Figure 16. The individual analysis of the manuscripts showed that at item 3. “Inclusion and exclusion criteria”, 6. “Outcome measures”, 8. “Experimental Animals”, 9. “Experimental Procedures”, and 11. “Results” the information was adequate and reported with percentages of 85.7%, 78.6%, 85.7%, 64.3% and 64.3%; thus, it graded as “reported”. However, items 4. “Randomisation”, 5. “Blinding” and 10. “Adverse events” were considered as “not reported” because there is an evident lack of information in the reported studies, with frequencies 35.7%, 100% and 64.3%. Other items, such as 1. “Study Design”, 2. “Sample Size” and 7. “Statistical Methods”, were classified as “unclear reported”, due to incomplete items reported, insufficient experimental details provided, or no subitems included. Results 61 Figure 16. Study quality assessment (ARRIVE). “Reprint with permission from [8] under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License, CC BY-NC.ND 4.0.” The risk of bias was evaluated using the SYRCLE in all the included reports and is shown in the Figure 17, as a frequency distribution percent. Most of the questions were graded as “Low Risk of Bias”, as shown in item 2. “Baseline characteristics”, 6. “Random outcome assessment”, 8. “Incomplete outcome data addressed”, 9. “Free from selective outcome reporting” and 10. “Free from other sources of Bias”, with percentages from 64.3% to 100%. By contrast, items 1. “Allocation sequence generation” and 5 “Blinding of care giver/investigator”, were assigned as “High Risk of Bias” showing frequencies of 42.9% and 100%. Finally, “Unclear Risk of Bias” was detected at items 3 “Allocation concealment”, 4 “Random housing” and 7 “Blinding of Outcome Assessor” with frequencies of 35.7%, 78.6% and 50%, respectively. Figure 17. Risk of Bias Assessment (SYRCLE). “Reprint with permission from [8] under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License, CC BY-NC.ND 4.0.” IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 62 Table 7. Characterization of the scaffolds in the studies. “Reprint with permission from [8] under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License, CC BY-NC.ND 4.0.” I. Alonso-Fernández, H.J. Haugen, M. López-Peña et al. Acta Biomaterialia 168 (2023) 1–21 Table 3 Characterization of the scaffolds in the studies. References Biomaterials (s) Mixing ratio (wt PLA: wt Bioceramic) Bioceramic particle size Production Method Morphology Porosity (%) Pore Size (µm) Elastic Modulus (GPa or MPa) Compressive Strength (MPa) In vitro Degradability Sterilization Scaffolds analysis [161] PLA + HA 90: 10 50 µm FFF 3D porous interconnected structure 58 450 - - - - Ethylene Oxide SEM [162] PLA + CaP Coating Uncoated - FDM 3D porous interconnected structure 49.93 + -5.28 - 0.512 ±0.24 GPa 20.50 ±1.95 MPa Yes - Ethylene Oxide SEM, FTIR, XRD, TGA, Mechanical Test 98: 2 49.09 ±3.2 0.510 ±0.11 GPa 18.22 ±2.67 MPa [163] PLA + n-HA 80:20 - FDM 3D porous interconnected structure 70 ±2.23 - 10.12 ±1.24 GPa 31.18 ±4.86 MPa Yes - Ethylene Oxide SEM, Mechanical Test, Porosity evaluation [164] PLLA + β -TCP 100: 0 250 µm 3D Bioplotter 3D porous interconnected structure ∼62 100 258 ±102MPa Yes PLLA/TCP30 % Remaining scaffold - SEM, µCT, Mechanical Test, Degradability test (GPC, NIR fluorescence imaging) 90: 10 310 ±40MPa Week GPC NIR 70: 30 349 ±51MPa 4 8 12 ∼87 ∼79 ∼71 ∼91 ∼84 ∼69 [165] PLA + AW 70% AW AW + 30%MD powder (maltodextrin) 50:50 55% - 90 µm 15% - 0-53 µm AWBinder jetting/sintering (Indirect 3D-printing) PLA-FFF 3D porous interconnected structure AW disks 41.85 + -0.94% PLA 60% - - - Yes - AW –Autoclave PLA and composite – gamma radiation SEM, µCT, Digital Microscope, XDR, Porosity evaluation (Archimedes method) [166] PLA + HA 85: 15 2.1 ±0.4 µm MDS 3D porous interconnected structure. 60 ±1.5 500 ±20 - - Yes - Ethylene oxide SEM [167] PLA + OCP (octacalcium phosphate) 40: 60 - MEB 3D porous interconnected structure. - 500 - 1 MPa Yes - - FESEM, Mechanical Test [156] PLA + n-HA 100: 0 50-80 nm FDM 3D porous interconnected structure. ∼50 - - ∼35MPa Yes Degradation rate: Pn50 > Pn 30 > Pn0 - SEM, XDR, TEM, Mechanical Test; Porosity evaluation (Archimedes method), Degradability test (GPC) 90: 10 ∼29MPa 80: 20 ∼28MPa 70: 30 ∼25 MPa 60: 40 ∼23 MPa 50: 50 ∼17 MPa [157] PLA + n-HA 100:0 75 ±20 nm FDM 3D porous interconnected structure. 30 0-40 0 - 35.41 ±2.07 MPa Yes - - TEM, AFM, SEM, EDS, µCT, Mechanical Test 50: 50 17.8 ±1.92 MPa [158] PLLA + n-HA 100: 0 50-80 nm FDM 3D porous interconnected structure. 60 - 43 ±0.09 MPa 44.02 ±6.85 MPa Yes Degradation rate and mass change: 50%nHA > 30%n-HA > 0%n-HA - SEM, Contact angle, Mechanical test, Degradability test (GPC) 70: 30 45.54 ±0.11 MPa 29.68 ±1.92 MPa 50: 50 44.31 ±0.10 MPa 14.22 ±0.20 MPa [155] PLA + HA 70: 30 50 µm 3D Bioplotter 3D porous interconnected structure. 60 500 - - No - - µCT, SEM [154] PLA + n-HA 90: 10 63 ±1.5nm FDM 3D porous interconnected structure. 26.4 292 ±1.8 - 23.36 ±0.48 MPa Yes - Ethylene oxide SEM, EDS, Mechanical test, Porosity evaluation [159] PLA + HA 85: 15 2.1 ±1 µm MDS 3D porous interconnected structure. 60 500 - - Yes - Ethylene oxide - [160] PLA + HA - - FDM 3D non-porous structure - - - - No - Ethylene oxide - PLA: polylactic-acid); HA: hydroxyapatite; n-HA: nanohydroxyapatite; β -TCP: Beta-tricalcium phosphate; AW: apatite-wollastonite; OCP: octacalcium phosphate; wt: percentage by mass; FDM: Fused Deposition Modeling = FFF: Fused Filament Fabrication; MDS: Mini-Deposition System; MEB: Micro-extrusion based 3D-printing; SEM: scanning electron microscope; FTIR: Fourier transform infrared spectroscopy; XDR: X-ray diffraction; TGA: Thermogravimetric analysis; FESEM: field emission scanning electron microscope; TEM: Transmission Electron Microscope; AFM: Atomic Force Microscope; EDS: Energy-dispersive X-ray spectroscopy; µCT - Microcomputed tomography 6 Results 63 Table 8. Main features of the studies in rats. “Reprint with permission from [8] under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License, CC BY-NC.ND 4.0.” I. Alonso-Fernández, H.J. Haugen, M. López-Peña et al. Acta Biomaterialia 168 (2023) 1–21 Table 4 Main features of studies in rats. Reference Animal Anesthetic Protocol Biomaterial groups Sample Size Defect CSD Empty Control Groups Bone metabolisms substances Sacrifice Weeks Assessment method Main findings [161] Rat Wistar 300 gr 4 m/o 1/2 female y 1/2 male Anesthesia: Ketamine 2.4 ml/kg, and Xylacine 5 mg/kg (IP) Local anesthesia: 2% Lidocaine 0.25 ml (SC) Postoperative Analgesia: Buprenorphine 0.01 mg/kg(SC) PLA/HA 24 Calvarial Bone Circular bilateral defect ø5.5mm. Yes Yes Empty n = 8 Bio-Oss n = 8 PLA n = 8 PLA/HA ( n = 8) PLA/HA + DPSC ( n = 8) PLA/HA + ECM ( n = 8) DPSC ECM 8 w µCT analysis Qualitative histological analysis Quantitative histological analysis Paraffin PLA/HA ECM scaffolds presented bone-forming ability comparable to that of Bio-Oss, based on histology and µCT analysis. Otherwise, PLA/HA scaffolds can potentially be used in bone tissue engineering, especially combined with the ECM. [162] Rat Wistar 30 0-40 0 gr Anesthesia: Ketamine 100 mg/kg, Xylazine 10 mg/kg and Midazolam 5 mg/kg (IM) PLA/CaP 45 Calvarial Bone Circular unilateral defect ø8 mm Yes No PLA n = 15 PLA/CaP n = 15 PLA/CaP + rhBMP2 n = 15 rhBMP-2 1, 3 and 6 m Qualitative histological analysis Histomorphometric analysis Paraffin The clinical trials have shown that the PLA-CaP scaffolds have proven to be biocompatible, promoting new bone formation after 6 months, even without rhBMP-2, based on histological results. [163] Rat Sprague-Dawley 280-320 g weight 12-13 w/0 male Anesthesia: Pentobarbital 35 mg/kg and Inhaled Isofluorane PLA/n-HA 126 Calvarial Bone Circular unilateral defect ø6 mm No Yes Empty = 24 PLA/n-HA n = 24 PLA/n-HA + EMF n = 24 PLA/n-HA + BMSCs n = 24 PLA/nHA + EMF + BMSCs n = 24 BMSCs Sinusoidal EMF: 15 Hz, 1mT. 4h/day) 4 and 12 w µCT analysis Quantitative histological analysis Paraffin The histological and microtomographic analysis revealed that PLA + HA scaffolds + BMSCs with EMF exposure present the best bone integration among all the groups, positioning itself as a promising candidate for craniofacial reconstruction. [164] Rat Sprague-Dawley 320-350 g. 8 w/o Anesthesia: Combination of tiletamine and zolazepam, and Xylazine, 1:1, 1,5 ml/kg PLLA/ β -TCP 90 Calvarial Bone Circular unilateral defect ø5 mm No No PLLA n = 15 PLLA/TCP10 n = 15 PLLA/TCP30 n = 15 PLLA + MG63 n = 15 PLLA/TCP10 + MG63 n = 15 PLLA/TCP30 + MG63 n = 15 MG-63 4,8 and 12 w µCT analysis Qualitative histological analysis Paraffin 3D-printed PLLA + TCP scaffold effectively supports bone regeneration in rats. The results show a greater bone regeneration rate in those animals with higher percent of TCP, and after adding of MG-63 to the scaffolds. [165] Rat Sprague-Dawley 350 g. adult male Anesthesia: Ketamine and Xylacine PLA/AW 15 Calvarial Bone Circular unilateral defect ø8mm Yes No PLA dics n = 3 AW discs n = 6 AW/PLA discs n = 6 - 12 w Qualitative histological analysis Histomorphometric analysis Paraffin All three types of scaffolds were biocompatible. AW/PLA, the ones with the largest amount of new formed bone. AW scaffolds showed excellent osseointegration with the formation of new bone, and PLA ones have been well tolerated but were not osteogenic. [166] Rat Sprague-Dawley 300-350 g. 8 w/o Male Anesthesia: Ketamine PLA/HA 32 Calvarial Bone Circular unilateral defect ø5mm No Yes 3DP PLA/HA n = 8 β -TCP n = 8 DBM n = 8 Blank control n = 8 - 4 and 8 w µCT analysis Qualitative histological analysis Immunohistochemistry (OC and COL-1) Paraffin The percentage of new bone area in 3DP PLA/HA scaffolds was larger than in DBM (demineralized bone matrix) and control groups but less than β -TCP (Beta-Tricalcium phosphate) groups. The same tendencies were found at 4 and 8 weeks. So, PLA/HA scaffolds might be a promising candidate for bone defect repair, with little inflammation response, relatively larger resorption rate and superior osteoinductive activity. [167] Rat 6-8 w/o Anesthesia: Pentobarbital (IP) PLA/OCP ? Calvarial Bone Circular unilateral defect. ø5mm No Yes Control n = ? PLA/OCP n = ? PLA/OCP + 0.2La n = ? PLA/OCP + 0.5La n = ? PLA/OCP + 1La n = ? La 8 w Qualitative histological analysis Paraffin The scaffolds enhanced bone defect regeneration in vivo. 0.2La-OCP/PLA scaffolds are significantly more likely to enhance bone defect regeneration in vivo than other groups. Our study suggests that La-OCP/PLA porous scaffolds have markedly potential in clinical bone tissue engineering. m/o: months old; w/o: weeks old; PLA: polylactic-acid; HA: hydroxyapatite; n-HA: nanohydroxyapatite; β -TCP: Beta-tricalcium phosphate; AW: apatite-wollastonite; OCP: octacalcium phosphate; IP: intraperitoneal injection; SC: subcutaneous injection; IM: intramuscular injection; PLA:; HA:; n-HA:; OCP:; DPSC: dental pulp stem cells; ECM: extracellular matrix; rhBMP-2: recombinant human bone morphogenetic protein-2; BMSCs: bone marrow mesenchymal stem cells; EMF: electromagnetic fields; MG-63: human osteoblastoma cell line; DBM: demineralized bone marrow; La: Lanthanum; months: m; weeks: w; OC: osteocalcin; COL-1: type I collagen; µCT: microcomputed tomography. 8 IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 64 Table 9. Main features of the studies in rabbits. “Reprint with permission from [8] under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License, CC BY-NC.ND 4.0.” I. Alonso-Fernández, H.J. Haugen, M. López-Peña et al. Acta Biomaterialia 168 (2023) 1–21 Table 5 Main features of studies in rabbits. Reference Animal Anesthetic Protocol Biomaterial Sample Size Defect CSD Empty Control Groups Bone metabolisms substances Sacrifice Weeks Assessment method Main findings [156] Rabbit New Zealand White 2-3 kg, male Anesthesia: Pentobarbital 40 mg/kg (IV) PLA/n-HA 18 Femoral Diaphysis Circular Unilateral Defect ø5 mm No No PLA n = 9 PLA/n-HA30% n = 9 - 4, 8 and 12 w µCT analysis Qualitative histological analysis Resin PLA/n-HA can be printed when the n-HA ratio is less than or equal 50%, the increasing incorporation of n-HA doesn’t affect significantly the overall mechanical strength in a limited range (0-30%), but it really enhances the osteogenesis in vivo. [157] Rabbit New Zealand White 2-3 kg, male Anesthesia: Pentobarbital 40 mg/kg PLA/n-HA - Femoral Diaphysis Circular ¿Unilateral? Defect ø5 mm No No PLA n = ? PLA/n-HA 50% n = ? - 1,2 and 3 m µCT analysis Qualitative histological analysis Resin The new bone growth of the composite material (PLA + 50%n-HA) is significantly higher than that of the PLA group. Consequently, it has a high potential for use as implant for the critical bone defects [158] Rabbit New Zealand White 2-3 kg, male Anesthesia: Pentobarbital 40 mg/kg (IV) PLLA/n-HA 9 Femoral Diaphysis Circular bilateral Defect ø5 mm No No PLLA n = 3 PLLA/30%nHA n = 3 PLLA/50%nHA n = 3 - 4 w Qualitative histological analysis Resin The PLLA/50%n-HA has shown a preferable capability of bone regeneration, also supported by the discovery of the Harversian Canals, compared with the PLLA-30%n-HA specimens, which in turn have presented a bigger amount of new bone tissue than the PLLA ones. [155] Rabbit New Zealand White 2,5 + /- 0.25 kg, 6 m/o Anesthesia: Pentobarbital 30 mg/kg (IM) PLA/HA 36 Diaphysis Left Radius Segmental Unilateral Defect 15 mm Yes No ICBG + IM n = 9 PLA/HA n = 9 IM + PLA/HA n = 9 IM + PLA/HA + eBM n = 9 eBM ICBG IMemb 4, 12 and 16 w µCT analysis Qualitative histological analysis Histomorphometric Analysis Paraffin The IM combined with 3D-printed PLA-HA scaffold and eBM has a bigger efficiency for treatment of large bone defects than the PLA-HA and the IM/PLA-HA groups, and similar to the IM/ICBG group (Gold Standard), based on the X-ray, µCT and histological results. [154] Rabbit New Zealand White 4.2 + /-0.18 kg, male, adult Anesthesia: Xylazine 0,.1 ml/kg (IM) PLA/n-HA 3 Distal Right Femur Circular Unilateral Defect ø4.5 mm and Depth 10-13 mm No No PLA/HA n = 3 - 4, 8 and 12 w µCT analysis Qualitative histological analysis Resin In vivo trials confirmed that the printed PLA/n-HA scaffold can enhance osteogenesis and osteoconductivity. It was showing bone formation within the femoral defect at 4,8 and 12 weeks, and no inflammation signs. [159] Rabbit New Zealand White 2.5 + /-0.2 kg., 6 m/o - PLA/HA 24 Tibial Diaphysis Periosteum. Cuboid shaped periosteal pockets 10 mm in length and 7.5 mm in diameter. - No Experimental Group (EG) PLA/HA + BMSCs with blood vessel Control Group (CG) PLA/HA + BMSCs without blood vessel BMSCs 4 and 8 w µCT analysis Qualitative histological analysis Immunohistochemistry (OC and CD31) Paraffin 3D-printed PLA-HA composite scaffolds in an in vivo bioreactor prove to be a promising tool for the prefabrication of large volume, customized, vascularized bone tissues. Besides, adding a vascular bundle allows the construction of large vascularized bone grafts that translate into a bigger BV/TV, Tb.N and Tb.Th in the in vivo trials. [160] Rabbit 4-5.5 kg, female, > 7 m/o Anesthesia: Ketamine 20 mg/kg, midazolam 2 mg/kg, and morphine 2 mg/kg (IM). Inhaled isoflurane Local anesthesia: 2% Lidocaine 6 mg/kg – Right brachial plexus block Postoperative Analgesia: Tramadol 4 mg/kg and meloxicam 0.1 mg/kg (SC) PLA/HA 60 Diaphysis Right Radius Segmental Unilateral Defect 15 mm Yes Yes Control Group n = 20 ICBG n = 20 PLA/HA Group n = 20 - 2, 4, 8 y 12 w Radiographic analysis Qualitative histological analysis Paraffin Scaffold created with anatomical characteristics similar to the radios proved to be biocompatible and allow cell multiplication around the composite. Despite of the fact that less bone callus and bone bridge was formed compared to the gold standard method (ICBG). m/o: months old; w/o: weeks old; PLA: polylactic-acid; PLLA: poly-L-lactic-acid; HA: hydroxyapatite; n-HA: nanohydroxyapatite; IM: intramuscular injection; IV: intravenous injection; BMSCs: bone marrow mesenchymal stem cells; DBM: demineralized bone marrow; La: Lanthanum; eBM: enhanced bone marrow; ICBG: iliac crest bone graft; IMemb: induced membranes; w: weeks; m: months; OC: osteocalcin; µCT: micro-computed tomography; BV/TV: Bone Volume/Tissue Volume; Tb. N: Trabecular Number; Tb. Th: Trabecular thickness. 9 Results 71 sections of porous materials: a linear elasticity phase, an intermediate plateau phase and further densification, with stress increasing with the strain. Figure 25. Compressive strength-strain curves of 3D printed scaffolds (Own Image). Furthermore, compressive strength was correlated with several pore architectural characteristics of the scaffold (Table 12). As expected, strong correlations were found between compressive strength and open porosity, surface area-to-volume ratio, and strut thickness. Thus, the scaffolds’ porosity influences their mechanical properties, so that by increasing open porosity or surface area to volume ratio, the compressive strength of the scaffold will decrease. And in contrast, when increasing strut thickness, the compressive strength will increase, too. Table 12. Correlation study between compressive strength and pore architectural characteristics of the fabricated scaffolds (n=8, *p<0.05). Pearson’s correlation coefficient Open Porosity Surface area-to-volume ratio Strut Thickness Compressive Strength -0.79* -0.80* 0.80* 4.2.1.4 Wettability The water contact angle of the scaffolds was measured, and the results are given in Table 13. Each value is the average of contact angle measurements in 3 points. As results showed, the increasing content of bioCaP in the composites is not enough to modify the hydrophobic behavior of PLA. Contrary to what was expected, adding CaP increases the scaffolds’ hydrophobicity. Table 13. Contact angle measurements. All parameters are represented as mean ± SD. PLA PLA1CaP PLA2CaP PLA12CaP Contact Angle (Degrees) 100±10 100±20 130±20 120±20 IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 72 4.2.2 Animal model Two animals suffered complications derived from the surgical intervention, and they death after accidentally incise the dura mater. So, both animals were excluded from both studies. The other rabbits did not present complications, and no other adverse effects were observed after implantation. At the time of sacrifice, all the rabbits were healthy and did not present observable inflammatory reactions, furthermore, neurological reactions were absent. During the necropsy, macroscopical examinations were conducted over all the implants, to ensure they had anchored adequately to the bone and fitted well in the defect. Furthermore, the absence of macroscopical signs of inflammation, hematoma or infection was confirmed. After the dissection of the implants’ regions, only one rabbit presented adherences between the bottom of the implant and the dura mater, but it could be extracted without complications. 4.2.3 Micro-CT Micro-tomographic analysis were performed to evaluate the bone morphometric parameters mentioned above (BV/TV, BS/BV, Tb.Th. and Tb.Pf.) in the stablished volume of interest. Results are shown in Figure 26. As it could be seen, there were no statistically significant differences for parameters referring to bone regeneration, such as BV/TV, which was higher for PLA (11.11 ± 3.26%) and PLA-12CaP (11.07 ± 4.33%) groups. In addition, there were no differences for bone surface-to-bone volume ratio (BS/BV), or trabecular thickness (Tb.Th.), which were very similar for all groups. PLA-12CaP group despite not being statistically significant, showed the highest trabecular values. Likewise, the same group showed statistically significant differences in terms of trabecular pattern factor (Tb.Pf) with PLA and PLA-1CaP groups. Representative images were included in Figure 27. Figure 26. Micro-CT histomorphometric measurements. BV/TV: Bone Volume/Tissue Volume, BS/BV: Bone Surface/Bone Volume, Tb.Th.: Trabecular Thickness and Tb.Pf.: Trabecular Pattern Factor. **p<0.05 (Own Image). Results 73 Figure 27. Representative micro-CT images of the effect of composite scaffolds on bone regeneration at 12 weeks in calvarial rabbit defects. The measured volume of interest (VOI) was highlighted in red color. PLA a), PLA-1CaP b), PLA-2CaP c) and PLA-12CaP d) (Own Image). 3D images demonstrated good biocompatibility of the different scaffolds implanted in vivo. Most presented good integration with the host bone without signs of rejection. Strongly mineralized tissue ingrowth within the scaffolds could be observed, initially at the edge of the bone defect and then gradually filling inwards and toward the center. Same samples showed isolated bone growing in the inner part of the scaffold, probably occasioned by the migration of bone marrow cells because of the bleeding and clot formation during the surgical procedure. Bone tissue ingrowth occurred through the pores and following its orientation, providing the scaffold with notable support to the host bone. 4.2.4 Histology 4.2.4.1 Qualitative histology A rabbit model of calvarial defects was used to evaluate the osteogenic potential of rising concentrations of bioCaP mixed with PLA. Figure 28 shows optical images of the histological slides. For the histological assessment, Lévai-Laczkó stained slides were subjected firstly to semi-quantitative evaluation techniques to quantify the inflammatory response, new blood vessel formation, presence of fibrosis and fatty infiltrates, to assess the local effects after implantation following UNE-EN ISO 10993-6:2017 standards (Figure 29). IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 74 Figure 28. Histological sections of the calvarial bone after 12 weeks of healing (Lévai-Laczkó staining). Sections clearly show typical findings of the samples. PLA-12CaP a), PLA-1CaP c), and PLA b) and d). The bone grows from the edges to the defects’ center through the pore. Connective tissue filling the empty space. Absence of bone growing when the scaffold is not in contact with the margin of the defect. Struts with different thicknesses were present depending on where the section was performed (Own Image). Figure 29: UNE-EN ISO 10993-6:2017 evaluation results summarized, classifying each parameter into different scores, being 0 equal to its absence, and 1, 2, 3, and 4, equal to slight, moderate, marked, and severe presence, respectively (Own Image). Optical microscopy of the whole specimens was used to quantify cellular response by counting the number of polymorphonuclear cells, lymphocytes, plasma cells, macrophages and giant cells per high powered (400x) field (phf), focusing specifically on the biomaterials’ contour (Figure 30). They were scored from 0 to 5, denoting absence, presence of 1-5 cells/phf, presence of 5-10 cells/phf, heavy infiltrates or packed, respectively. Among the mentioned inflammatory cells, macrophages were the main ones found in the different specimens and were usually very Results 75 close to the implant’s surface, with scores between 1 and 3. In addition, lymphocytes were identified in 4 samples, being three of them scored as 1, and the other one as 2. Finally, 1 to 5 giant cells/phf appeared in one of the samples. There were no signs of necrosis in any of the specimens. Figure 30. Lévai-Laczkó stained slides demonstrated the findings described during the semi-quantitative evaluation. Fatty infiltrates could be observed (*), as well as fibrous band with different thicknesses (), and macrophages were present near the composite material (black square) (Own Image). Then, the rest of the parameters included in the UNE-EN ISO standards were evaluated. Firstly, fibrosis was the main finding in all the samples, narrow (1), to moderately thick (2) and even thick (3) bands were identified filling the inner part of the implants and avoiding bone-implant contact, both inside the implant pores and with the bony surface of the defect. Likewise, fatty infiltrates were found in all the samples, usually associated with fibrosis. Among minimal amounts of fat (1), and elongated and broad accumulations of fat cells (3) were observed filling the spaces inside the implants. The neovascularization was also a phenomenon shared by almost all the specimens, which was semi-quantified as focal minimal capillary proliferation (1), groups of 4 to 7 capillaries (2) or broad bands (3) with supporting fibroblastic structures (Figure 30). Besides, there was no evidence of traumatic necrosis or foreign debris. Under the condition of this study, and in accordance with the provisions of the UNE-EN ISO 10993-6:2017 standards, the tested samples were considered as non-irritant (PLA-1%CaP and PLA-2%CaP groups), and slight irritant (PLA-12%CaP group) to the tissue as compared to PLA group (positive control). Furthermore, statistically significant differences among the different groups, were only found for the quantification of macrophages between the PLA and PLA-12%CaP groups (p=0.042), presenting the latter higher score values. Another interesting aspect to highlight from the qualitative evaluation is the absence of bone growth in those points where the implants are not in contact with bone defect margins (Figure 28), since the defects were sometimes slightly bigger than implants. These findings may demonstrate the ability of the implants to stimulate bone growth and the proposal of the defect size as critical. As it was explained in Micro-CT section, usually new bone was formed from the edge towards the center, and the formation of bone bridges could be seen between scaffold’s pores (Figure 28). Furthermore, isolated bone islands could be appreciated in the middle of the scaffolds, without connections with the newly formed bone present at the edges of the defect. All the scaffolds remained inside the defect, maintaining their structural integrity and without significant degradation observed. 4.2.4.2 Histomorphometric analysis Histomorphometric parameters such as Bone-to-Implant Contact (BIC), Implant Surface to Tissue Surface (IS/TS) and New Bone Surface to Tissue Surface (BS/TS), were assessed inside the region of interest (ROI) for every single sample (Figure 31). The analysis IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 76 was performed after digital coloring of the images (Figure 32), and the following results were obtained. Firstly, the percentage of implant surface inside the ROI was similar for all the groups without statistically significant p values, and mean values ranging between 41.52% ± 5.08 and 47.85% ± 8.78. This could indicate a similar degradation of the implants belonging to the different groups, even though there may be variations in these values since the arrangement of the struts could change depending on the place where the histological sections were performed, as it could be demonstrated in Figure 28. Concerning BIC results, no statistical differences were found among the groups. PLA scaffolds showed the highest BIC values, 7.90% ± 7.22, and PLA-12CaP group obtained the lowest ones, 3.78% ± 4.41, despite of the fact that it was the group with a higher percentage of calcium phosphate added. Finally, the measurement of the percentage of new bone surface (BS/TS) was performed in the assessed ROI. PLA group (18.23% ±5.70) was the one that had the greatest amount of newly formed bone, followed by scaffolds belonging to PLA-12CaP group (14.67% ± 5.26). In this case, statistically significant differences were found among PLA and PLA-2CaP groups (18.23% ±5.70 vs 11.69% ±3.06). Figure 31. Histomorphometric measurements. BIC: Bone-to-Implant Contact, IS/TS: Implant Surface to Tissue Surface, BS/TS: New Bone Surface to Tissue Surface. *p<0.05 (Own Image). Histomorphometric measurements BIC IS/TS BS/TS Pertcentage (%) 0 10 20 30 40 50 60 PLA PLA-1CaP PLA-2CaP PLA-12CaP * Results 77 Figure 32. Histological Lévai-Laczkó stained sections, belonging to PLA group, before and after being colored and indicating the analyzed Region of Interest (Own Image). IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 78 4.3 CHAPTER III 4.3.1 Alternate and helical scaffolds characterization BioCaP was successfully composited in the PLA matrix for the synthesized scaffolds with different laydown patterns through the fused deposition modeling technique. As mentioned before, the scaffold’s design is a key factor for bone tissue engineering. The following results try to describe how the laydown pattern may affect varying implant characteristics. Different laydown patterns of the 3D printed scaffolds could be observed macroscopically (Figure 33); both structures seemed to be highly interconnected along their circumferences, being this more significant for the helical one. The alternate structure (Figure 33, a) showed parallel lines of 0.8 mm thick with a separation between them of 0.4 mm perpendicularly alternating the direction of the processing lines between each overlapped layer. The helical structure (Figure 33, b) also exhibited 0.8 mm thick lines with a separation of 0.4 mm. However, their direction varied in 45 degrees about the already printed lines. This difference resulted in a higher separation among perpendicular struts and a higher pore size. In the case of the alternate structure, regular square-shaped pores could be seen from dorsally and lateral views. Nevertheless, the helical structure presented bigger and more irregular-shaped pores. Figure 33. The macroscopic architecture of the 3D printed scaffolds (Ø: 6mm x h: 10 mm): alternate structure (a) and helical structure (b) (Own Image). 4.3.1.1 Pore morphology 3D micro-tomographic images confirmed the differences in the pores’ size and shape. Furthermore, 3D analysis was performed to quantify them (Table 14). Firstly, printing patterns had great importance in the degree of infilling of the scaffolds, so this explained that alternate structures, with a higher infill ratio, presented higher scaffold volumes compared to helical ones (100±10 mm3 vs 70±2 mm3). Furthermore, the object surface per volume ratio (Obj S/V) was evaluated, and obtained information suggested that helicoidal structures provided more surface area available for biological contact than the alternate groups, with mean values of 10.6±0.7 mm-1 and 8±2 mm-1, respectively. The porosity of the scaffolds was also evaluated in samples with alternate and helical structures, and the results confirmed what was suspected, obtaining mean porosity values of 45±6 % and 63±1 %, for alternate and helical groups. In addition, pore Results 79 size was measured, and mean values were established in 400±20 µm for alternate structures, and 560±6 µm for helical structures. Regarding pore size distribution (Figure 34), a more comprehensive range of pore sizes could be observed for helical structures, with peaks at 514.8 µm and 731.5 µm. However, this range is narrower in the case of alternate structures, with smaller pore sizes and a high peak at 460.6 µm. Thus, these issues provide the helical structure with better features to promote bone cells growth, neovascularization, and diffusion of nutrients, oxygen, and waste products. Table 14. Pore morphology measurements in micro-CT. All parameters are represented as mean ± SD. Scaffold Volume Obj S/V Open Porosity Strut Thickness Pore Size mm3 mm-1 % µ m µ m ALT 100±10 8±2 45±6 430±80 400±20 HEL 70±2 10.6±0.7 63±1 350±20 560±6 Besides, to confirm this statement, a detailed study of the interconnectivity was performed through the pore accessibility or open and accessible pore volume within the scaffold. This method, as explained before, gives the smallest pore constriction connecting every voxel of the scaffold, quantifying bone ingrowth as a function of accessible pore size [97]. Although both structures were highly interconnected, the analysis showed notable differences. As it could be seen in Figure 35, interconnectivity values lower than 90% were achieved at minimum connection sizes of 162.6 µm for the alternate structure, and 270.9 µm for the helical structure. Likewise, differences between them increased as the percentage of interconnectivity decreased, reaching values less than 80% when openings were greater than 270.9 µm in the alternate group, and 433.5 µm in the helical group. The highest pore throat studied was 650.2 µm, providing pore accessibility percentages of 26 % and 53 % for both structures, respectively. Concerning strut thickness, higher mean values were appreciated in the alternate group compared with the helicoidal one (430±80 µm vs. 350±20 µm) (Table 14). Furthermore, apparent differences could also be observed between alternate and helical structures regarding strut thickness distribution (Figure 34). Even though both structures peaked at 352.2 µm, the alternate one presented a more comprehensive range of sizes, reaching strut thicknesses up to 800 µm. These results were probably caused due to the differences between both laydown patterns, since the filaments were aligned in the alternate structure, and they could merge and be interpreted as one during micro-tomographic analysis. Something that will hardly happen in the helical structure, due to a layer configuration which involves the deposition of staggered fibers varying 45 degrees. The micro-tomographic evaluation also allowed us to confirm an adequate dispersion of the bioCaP particles along the longitudinal and cross-sectional axes of cylindrical structures. Figure 36 shows the homogeneous dispersion of the particles in the surface and the inner part of the struts. IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 80 Figure 34. Strut Thickness and Pore Size Distribution of 3D printed composite scaffolds (Own Image). Figure 35. Pore accessibility assessment in micro-CT (Own Image). Pore Accessibility Minimum Connection size (µm) 0100 200 300 400 500 600 Interconnectivity (%) 0 20 40 60 80 100 PLA-12bioCaP-ALT PLA-12bioCaP-HEL Results 87 Figure 42. Histomorphometric measurements. BIC: Bone-to-implant Contact, IS/TS: Implant Surface to Tissue Surface, BS/TS: New Bone Surface to Tissue Surface. *p<0.05 (Own Image). GENERAL DISCUSSION 91 5 GENERAL DISCUSSION Bone tissue engineering is one of the main fields of biomedicine study, due to the tremendous impact of musculoskeletal disorders on people’s quality of life. The importance of using scaffolds in bone tissue engineering has risen notably in recent years, to provide an alternative to autografts and allografts [75]. The development of additive manufacturing techniques has provided important advancements, since they allow the customization of the implants when dealing with complicated and irregular geometries, with precise control of the internal and external architecture [75,77,218,240]. Furthermore, bone substitutes should be tested in vivo before being implanted in human beings to ensure that it works effectively and safely. Rabbits are the most used preclinical model for bone tissue’s testing, commonly for cortical and cancellous bone implant studies. In addition to their easy availability, housing, and handling, they reach skeletal maturity at an early age after puberty, present similarities in bone mineral density and fracture toughness with humans, and their bone turnover is faster than other species like primates or rodents. The calvarial bone defect model had been extensively used, mainly in rodent-models, when studying bone healing and regeneration processes. Due to its easy performance, there is no need for external fixation and it is possible to assess bone healing quickly using micro-CT and histology. However, it does not allow the evaluation of the scaffolds under physiological mechanical loads [217]. Likewise, femoral condyles support defects more significant than 3 mm to test biocompatibility and osteoinduction in cancellous bone, so they allow the performance of critical defects to test biomaterials in load-bearing conditions, which should be 6 mm according to the species and location. [33,241–244]. Critical size defects are defined as the smallest wound that does not heal spontaneously over a long period of time, so they are commonly performed to evaluate the scaffold’s bone healing properties [8,33]. The purpose of the present Doctoral Thesis was firstly to review the feasibility of using 3D-printed PLA-bioceramic composite scaffolds as bone grafting materials, attending not only to results regarding newly formed bone, but also carefully analyzing the characterization of the implants and several aspects related to the in vivo trials, such as planification or the selection of the anaesthetic protocol. The systematic review provided us with the necessary knowledge for the correct design of the experimental procedures carried out below and for the understanding and discussion of the results obtained therein. 3D-printed PLA-bioCaP composite scaffolds were fabricated through FDM and studied carefully during both experimental processes, delving deeper in the understanding of the effect of modifications on the composition or the geometry of the scaffolds. The calvarial model was used to evaluate the effects of PLA’s gradual enrichment with marine bioapatites over the characteristics of the scaffolds and their osteogenic capacity. Likewise, the femoral model sought to demonstrate that the structural existing differences between helical and alternate scaffolds derived from the modification of the laydown patterns, could have a notable effect on the characteristics of the implants and their capacity to induce bone regeneration. Even though scaffolds’ osteogenic capabilities should be improved in future research, the absence of an inflammatory response that could harm bone regeneration, their high mechanical properties, IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 92 and their personalized architecture, allowed them to meet the vast majority of the requirements for a bone graft. Thus, positioning 3D-printing technology and composite materials as exciting alternatives to heal impaired fractures supports and favoring the growth of new bone and vascular tissue. The results obtained from each chapter will be discussed throughout the following sections. 5.1 CHAPTER I: “USE OF 3D-PRINTED POLYLACTIC ACID/BIOCERAMIC COMPOSITE SCAFFOLDS FOR BONE TISSUE ENGINEERING IN PRECLINICAL IN VIVO STUDIES: A SYSTEMATIC REVIEW” The main objective of the systematic review, as mentioned above, was to evaluate the possible use, as bone graft substitutes, of 3D-printed scaffolds synthesized form PLA/bioceramic composites in preclinical studies with animal models, as a promising approach to bone repair and reconstruction. Other authors have reviewed over the last years the possible use in bone tissue engineering of several additive manufacturing technologies [35,36,38,73,245] and/or biomaterials, such as biopolymers [47,72], bioceramics [60] or composites [28,74]. However, most of them focused on the manufacturing process, characterization aspects, or applications without paying much attention to their behavior when used in preclinical trials with animal models, a key factor of translational research. Hassan et al. [27] evaluated the effect of using 3D-printed templates on bone tissue regeneration in critical bone defects induced in experimental animal studies, specifically in calvarial defect models. Their findings confirmed 3D-printed templates as an alternative for bone tissue regeneration, compared to conventional porous templates fabricated from the same material [27]. Likewise, bioceramic scaffolds, alone or combined with polymeric materials, have demonstrated better support of new bone formation, compared to untreated empty defects, and a similar bone growth compared to defects filled with deproteinized bovinederived bone mineral [39], which is in agreement with the results obtained in the present systematic review. Some of the scaffold’s main studied parameters were the pore interconnection, overall porosity, and pore size. A wide range of pore sizes can be selected for bone regeneration. Generally, macroporosity promotes osteogenesis, and microporosity improves surface area for protein adsorption, providing attachment points for osteoblasts. Hence, studies suggested that pore size should range from 200 to 600 micrometers. Typically, pores should be higher than 300 µm to facilitate osteoblast proliferation and enhance neovascularization, and 100 µm is the very minimum size, since it is associated with the formation of non-mineralized osteoid or fibrous tissue, limiting oxygen and nutrient diffusion throughout the scaffolds [7,13,30,217,226]. Likewise, pore interconnectivity positively influences bone deposition rate and depth of infiltration, improving nutrient and oxygen supply to the scaffold’s inner part and allowing cell growth [30,226]. Another feature that influences bone regeneration rate is pore’s geometry, due to different morphologies giving rise to differences in pore width and curvature of the surface, leading to variations in tissue morphology and growth rate. For example, tissue formation favors concave surfaces compared with flat and convex regions [226]. Bioactive properties are also important, it was demonstrated that the addition of an appropriate amount of calcium phosphate to a PLA matrix provides the implant an improvement in its biological activity [213], by reducing possible inflammatory reactions that could limit PLA applications [75]. Likewise, the addition of bioceramics influenced mechanical properties and biodegradability. Balancing PLA’s ductility and CaP’s brittleness is the key issue regulating composite’s mechanical properties [77]. Kwon et al. [220] observed that adding b-TCP in mixture ratios of General Discussion 93 10% and 30%, increased the compressive strength of the implants from approximately 258 MPa (PLA alone), to 310 MPa and 349 MPa, respectively. However, other studies observed that when higher concentrations of hydroxyapatite were added to a PLA matrix, the compressive strength of the implants decreased [77,213,214]. Zhang et al. [77] showed that PLA scaffolds had a compressive strength of around 44.02 MPa, which decreased progressively as hydroxyapatite was added, with 29.68 MPa and 14.22 MPa values for 30% and 50%HA concentrations, respectively. An ideal biodegradable material should have a degradation rate matching the growth rate of native ECM, to ensure mechanical support throughout the lifecycle of the scaffold, while leaving space for tissue growth [30,75]. PLA is degraded by simple hydrolysis, and the degradation products are then transformed into non-toxic subproducts that are eliminated through regular cellular activity and urine [47]. Nevertheless, lactate’s releasing triggers the acidification of the environment affecting the defect site’s acid-base balance, which can lead to hampered biological response towards the scaffold [29,213]. Like other bioceramics, HA performed the neutralizing capacity to the acidic products formed in vivo by degraded polymers and partially blocked the unfavorable acidic environment [211,246]. Besides, HA is hydrophilic, increasing the ability to absorb the water, and accelerating the degradation process [213,217]. Wang et al. [213] observed that Pn50 group (PLA/50%HA) degraded faster than the other groups (Pn30, PLA/30%HA and Pn0, PLA/0%HA) after 7 days. Zhang et al. [77] also obtained similar results with higher mass and molecular weight losses in PLA/50%HA scaffolds than PLA/30% HA and PLA/0%HA ones. The higher content of HA seemed to alleviate environmental acidity, and the lowest pH values were found in samples without HA. By contrast, Kwon et al. [220] concluded from their in vivo degradability analysis that the degradation rates among PLLA, PLLA+TCP10, and PLLA+TCP30 scaffolds did not vary significantly. Regarding to the modification of PLA scaffolds’ characteristics, it is worth highlighting some of the other available possibilities that may be interesting for bone tissue engineering. Shuai et al. [165] concluded in their work that the addition of poly (glycolic acid) (PGA) to PLLA/HA scaffolds results in an improvement of the hydrophilic behavior, with higher water absorption and the degradation rate, increasing the contact area between PLLA and body fluid. Consequently, there is a higher exposure of the HA embedded in the PLA matrix, which contacts with body fluids to exchange ions, and therefore the deposition of bone-like apatites, providing a suitable environment for osteoblastic growth and proliferation. Another possibility is using a copolymer of the PLA, derived from natural monomers of lactide and glycolide, such as poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA). Its amorphous structure allows water molecules to diffuse easily into the scaffold, providing greater degradability and bioactivity compared to the ones made by PLA [247]. Generally, when manufacturing the implants, the bioceramic powders were mixed or dissolved with a PLA solution to be later printed using additive manufacturing techniques. However, Tcacencu et al. [221] synthesized apatite-wollastonite disks independently and then adhered them to PLA porous disks through a thermal bonding process; and Maia-Pinto et al. [218] biomimetically coated with apatite 3D-printed polylactic acid scaffolds. Regarding the manufacturing process of PLA-HA implants, the most frequent combination, and the variations among the mixing ratios, it could be seen that most of the studies chose one proportion [75,211,212,214,215,217,219], but readers do not know why it was selected. However, others tested different concentrations of HA to evaluate their influence on scaffolds’ performance [77,213]. At this point, it was observed that when HA ratio was more significant than 50%, the composite material could not be printed coherently and stably due to its high brittleness, but IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 94 values less than or equal to 50% can be printed satisfactorily by FFF [77,213,214]. Zhang et al. [77] achieved a successful impression of a composite with 50% HA by using a silane couple agent called dodecyl trimethoxy silane (WD-10), which can combine with the polymer molecular chain more effectively. By contrast, Wang et al. [213] were able to print PLA/50%HA scaffolds but did not test them in vivo, probably because of the presence of apparent fractures in the cuboids, and the negative effects of proportions of HA higher than 30% had over the composite’s ductility, as they reported. Sterilization processes have a major significance when manufacturing scaffolds for bone regeneration and need to be raised at the beginning of implant development. For this purpose, there are many available options as steam sterilization (also called autoclaving), ethylene oxide sterilization, hydrogen peroxide sterilization, γ-irradiation, electron-beam irradiation (also called β-irradiation) and UV sterilization. However, not all of them can be used on biodegradable polymers and/or bioceramics, because it may produce adverse reactions such as physico-chemical and morphological changes or the formation of toxic byproducts by degrading the material [38,223]. UV exposure, γ-irradiation and β-irradiation are suitable processes to sterilize biodegradable polymers. Nevertheless, autoclaving, plasma sterilization and ethylene oxide, the most used process in the included papers, should be avoided because they produce respectively, a shrinkage of the materials, physical alterations, and toxicity [38,248–250]. Regarding bioceramics, γ-irradiation is the most indicate sterilization process. However, autoclaving and ethylene oxide have been demonstrated to degrade some calcium phosphate phases [38,60]. Therefore, neither has proven to be a suitable technique for sterilizing composites synthesized from PLA and bioceramics. 3D-printed templates have been shown to have adequate characteristics for their use in bone regeneration when composites originated from the addition of HA, b-TCP or octacalcium phosphate to a PLA matrix, the combination between PLA and apatite-wollastonite discs or the use of biomimetic CaP coatings, were utilized for their synthesis. Starting from this, we can extract certain ideas. First of all, we could see that higher concentrations of HA [77,213] or b-TCP [220], as expected, will lead to higher percentages of new bone area. Furthermore, the addition of different substances to functionalize the scaffolds showed an improvement in the results compared with not functionalized groups. Ss Minto et al. [216] described in their paper: “A factor that could assist the scaffold would be the use of precursor cells for osteogenesis to optimize bone healing, since biologically active 3D implants are promising in tissue regeneration.” Dental pulp stem cells [217], bone marrow stem cells [215,219] or enhanced bone marrow [212] increased the migration of the stem cells to the site of the injury, and induce angiogenesis and osteogenic differentiation by the release of growth factors. Indeed, growth factors with great osteoinductive potential can also be applied, such as bone morphogenetic proteins (BMP) [218], which stimulate bone formation via recruiting osteoprogenitor cells. BMP-2 has been widely studied because of its ability to directly target BMP receptors at the cell surface and trigger stem cell differentiation in bone, and it has been demonstrated to be an alternative to stem cell implantation [49]. Likewise, other substances have demonstrated a positive effect on bone growth, such as human osteoblastoma cell lines [220], a potential osteoblast-like sourc that allows rapid bone proliferation; or lanthanum, a foreign ion capable of enhancing bone formation by influencing the hydrolysis of OCP to HA. Nevertheless, functionalizing substances is not the only strategy different authors use to stimulate bone regeneration. General Discussion 95 Applying electric fields [219] and induced membranes technique [212] have also benefited bone healing. Among the substances that can be added to scaffolds to improve the biological effects, even the use of metals has been reported. Wang et al. [251] recently published the addition of lithium to PLA/n-HA composites, which plays an important role in bone development, homeostasis, osteoblast differentiation and bone formation via the activation of Wnt signaling pathway. Likewise, in vivo trials have demonstrated that in lithium doped groups presented higher osteogenic induction than not doped ones. Regarding to animal models, Zeiter et al. [244] reported in their manuscript the massive variations in the chosen models used to test bone substitutes, in terms of animal species, strain or breed, age and gender. Rabbits and rats were the most frequently used models but without a clear preference for a specific gender. Besides, there is a high variability in the age of the animals, something with critical influence regarding the closure of growth plates and the skeletal maturity. Literature revealed that important information such as age or gender, was missed in many studies, hindering the interpretation and replicability of the results. These results were in agreement with those obtained in the present review. Al-allaq and Kashan [59] also reported more trials in rodents (rats, mice) than in the rest of the models, probably because of their ease of handling and small size. However, large animal models should be considered for future investigations due to the similarities with human clinical conditions, which are essential for investigating bone scaffold interactions. Among the available species for the evaluation of bone formation, rats and rabbits were selected for testing different composite materials in the studied manuscripts, and information about age or gender was variable between them or was not reported or specified [75,77,211– 222]. Calvaria and femur were the main anatomical regions selected to make the defects. However, because of protocol differences such as defect size, the number of defects, observation times or scaffolds composition, no cross-study comparisons could be performed, and the generalizability of the results was limited. Furthermore, the following limitations were found when evaluating the preclinical trials with animal models of the different reports: - The sample size was not specified in two studies [214,222] and another one utilized only 3 animals [211], which is a deficient number of specimens to obtain significative statistical results. - The critical-sized defect (CSD) model, commonly proposed for the evaluation of bone healing, was just observed in 5 papers [212,216–218,221]. - There was a lack of control groups since empty controls were only utilized in 5 of 14 studies [75,216,217,219,222], and iliac crest bone graft control or positive control was used in 2 [212,216]. - The low report of adverse effects, usually present in this kind of procedures, as seen in the study quality assessment. - The absence of quantitative methods when evaluating bone regeneration among the different groups, such as micro-CT analysis, quantitative histologic analysis or histomorphometric analysis, was identified in 2 reports [77,216,222]. Likewise, the choice of the anaesthetic protocol is also an essential step in the design of any animal experiment, and must reach a state of unconsciousness, analgesia, and muscle relaxation. Scientists sometimes decide to leave the animals’ pain untreated since using potent anaesthetic and analgesic drugs may strongly affect the animals’ biology. However, animal pain management in laboratories is an ethical imperative [252], specifically when performing most orthopedic and wound healing models, since they produce moderate to severe pain [253]. Below, we will analyze some of the main features of the drugs used for surgical procedures. IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 96 Since pentobarbital is a barbiturate that produces hypnosis but has poorly analgesic properties, it is typically not used alone in painful procedures. In this case, it was administered alone in rabbits [77,212–214] and rats [222], although in the latter report, it was combined in one case with isoflurane (an inhalational anaesthetic with little or no analgesic activity) [219]. Ketamine is a dissociative anaesthetic that reaches high somatic analgesic levels. It was utilized in rats alone [75] or combined with other drugs, such as xylazine [217,221], xylazine and midazolam [218] or midazolam and morphine [216]. Xylazine is an alpha-2 agonist with powerful tranquillizing properties and moderate visceral analgesic action; midazolam, is a benzodiazepine with relatively low tranquillizing-sedative effects and no analgesic properties, which is usually utilized as an adjunctive drug to ketamine; and morphine is a pure opioid with potent analgesic action and bad hypnotic properties, which is very useful given its lasting effects for animal’s premedication, but also for the postoperative period. Tiletamine, as well as ketamine, is a dissociative anaesthetic used commonly in conjunction with zolazepam, a benzodiazepine drug, providing sedation, but not so potent analgesia. It was administered to rats in combination with xylazine [220]. Furthermore, only two reports included the use of local anaesthesia or postoperative analgesia. Gendviliene et al. [217] selected respectively, lidocaine, a short-acting local anaesthetic commonly applied through the infiltration of the tissue, and buprenorphine, a partial agonist opioid which provides analgesia and is considered as an effective treatment for postsurgical pain. Buprenorphine is one of laboratory animals’ most widely used analgesics [254]. Likewise, Minto et al. [216] administered lidocaine to perform a right brachial plexus block, a local anaesthesia technique; and used meloxicam and tramadol for the control of the pain during the postsurgical period. Meloxicam is a non-steroidal antiinflammatory drug (NSAID) that provides a moderate analgesic action, usually used for the treatment of pain or inflammatory processes; and tramadol is another opioid commonly administered in rabbits to treat mild acute and chronic pain, that has a low activity at the muopioid receptors and inhibits noradrenaline and serotonin reuptake [255]. Once reviewed the anaesthetic protocols of the different studies, we can conclude that pain management is deficient in most of the articles, especially in the ones in rabbits. In addition, the use of local anaesthesia techniques and postoperative pain control are non-standardized practices. But, what are the implications of choosing an ideal anaesthetic protocol that includes an effective pain management when designing an in vivo preclinical trial to evaluate biomaterials? Physiologic response to surgery and pain has been described as “surgical stress response”. This phenomenon induced several changes in animals’ physiology, such as muscle wasting, weight loss, impaired wound healing and a generalized state of immunosuppression, leading to the appearance of septic complications in the postoperative period. Furthermore, untreated pain can produce a reduction of food and water intake, disrupted sleep, and cause changes in activity and behavior in rodents, which also can delay bone healing [253]. In matter of orthopedic procedures, pain control is also essential, because it favors continued limb usage, and thus, stimulate bone healing [253,256]. So, this is why the concepts of balanced anaesthesia and multimodal analgesia become important, since on the one hand they will help us to achieve a quick recovery and bone healing, and prevent chronic pain [253]. And on the other hand, it will allow us to reduce the possible bias outcomes that pain and stress can exert on animal bone regeneration. The results of Carbone and Austin [252] also suggest that animal post-surgical pain is likely undertreated, likewise poor reporting of pain management can lead to the belief that analgesics are not or cannot be used, and as a consequence, other researchers published their work whit referring neither to pain or its treatment; so finally “under-reporting encourages under-treatment”. General Discussion 103 hydrolysis. However, those with low degradation rates and robust mechanical properties can be highly porous [271]. Trabecular bone is characterized by a highly trabecular foam-like cellular microstructure, with porosity levels ranging from 50 to 90% and pore sizes of 1 mm, surrounded by cortical bone creating a highly porous environment [41,274]. Alternate and helical structures resulted, respectively, in mean pore sizes of 400±20 µm and 560±6 µm, and porosity of 45±6% and 63±1%. And, after being implanted, helical PLAbioCaP composite scaffolds achieved higher values of newly formed bone than alternate ones. According to what was stated above, the greater pore size and the larger porosity of the helical structure and a greater available surface area could explain the differences in bone regeneration between both groups. The effect on tissue formation of different 3D-printed scaffold designs has been extensively studied [19,31,35]. However, no similar studies in vivo with PLA composites were found. Larger pore sizes do not always mean a higher percentage of bone regeneration, mainly when working with sizes greater than 800 µm. Liu et al. [41] manufactured macro-pore-sized (800, 1200, and 1600 µm) bioceramic scaffolds with identical porosity of 70%. For this purpose, they used biphasic calcium phosphate (BCP), the combination of HA and b-TCP, and they could isolate the importance of pore sizes in a rabbit calvarial defect model by maintaining a constant porosity. The results showed higher BV values for BCP 800 and 1200 groups than for BCP1600. This was explained because the surface area of porous scaffolds is closely related to bone formation, and the specific surface area of the scaffolds decreases with the increasing pore size. Nevertheless, in our study, the scaffolds with greater pore sizes also resulted in higher surface area values due to the differences between alternate and helical laydown patterns. To study the effect of pore size and permeability, Entezari et al. [89] fabricated Strontium doped (Sr-HT-Gahnite) scaffolds with four different architectures, maintaining the same interconnectivity (100%) and similar porosity (49.3±1.9%). Architecture A was a conventional square mesh-like pattern; Architecture B was a double-lined pattern of bimodal pore sizes; Architecture C was a displaced double-layer pattern; and Architecture D was a quatrefoil pattern. Micro-tomographic results showed that architectures B and D presented greater volumes of regenerated bone. Likewise, both presented higher permeability and larger pore sizes than the other two architectures. Authors concluded that higher tortuosity induced by displacing the layers (C) limited nutrient transportation and formed pillar-shaped bone constructs to carry bone loads. They also found that pore sizes to enhance bone formation should range between 390 and 590 µm since larger pores did not show any improvements. Those findings agreed with our results. Even though the permeability was not analyzed, an equivalent parameter, such as the pore accessibility, was measured. It varies as a function of the scaffolds’ porosity and pore size [89], and as reported previously, it reflects the interconnectivity of the network of pores, giving the smallest pore connection (pore throat) between the scaffold edge and any voxel within the scaffold pore space [97]. Pore throat size determines whether cells can enter the pore structure smoothly and affects cell proliferation and differentiation functions since more pore accessibility provides the cells with a larger surface for attachment [87]. In vivo trials confirmed these statements, showing higher values of bone formation and better access of cells to the inner parts of the scaffolds in the helical structures, the ones with superior pore accessibility. However, based on the obtained results, both structures should be adequate to ensure mass transfer and oxygen perfusion to allow bone regeneration [88]. Regarding the effect of different laydown patterns, several authors studied their effects in vitro and in vivo. Domingos et al. [275] designed polycaprolactone (PCL) scaffolds varying the pore size from 550 to 750 µm and changing the deposition angle (0º/90º, 0º/60º/120º and IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 104 0º/45º/90º/135º), but maintaining a regular filament distance of 650 µm. Increasing the deposition angle achieves quadrangular, triangular, and complex polygonal internal pore geometries without modifying the scaffolds’ porosity. Then, biological experiments were carried out using hMSCs (human mesenchymal stem cell) cultures, and a strong influence of pore size and geometry on cell viability was observed. Briefly, larger pore sizes could accommodate more viable cells, probably related to a large surface area and higher porosity. Regarding the influence of pore shape, decreasing deposition angles resulted in incremented cell viability, revealing that quadrangular pores (0º/90º) improved cell accessibility and colonization [275]. Similarly, Kook et al. [83] manufactured PCL scaffolds with combinations of different laydown patterns (0º/45º or 0º/90º) and pore sizes (150, 250, and 350 µm), and the optimum scaffold architecture was determined by an MMT assay to measure the proliferation of MC3T3-E1 cells. Nevertheless, highest cell proliferation was observed in scaffolds with 0º/45º strut layout pattern and 150 µm pore size; thus, based on these results, authors selected scaffolds with 45º/150 µm and 45º/350 µm for in vivo trials. Their results agreed with those obtained in the present study but were contrary to those obtained by Domingos et al. [275], who found that the most suitable laydown pattern in vitro was 0º/90º. After in vivo implantation, Kook et al. [83] found that the scaffolds with 150 µm pore size achieved higher amounts of newly formed bone than those with 350 µm, which is controversial considering the abovementioned results and reviewed literature. Variations in pore shape for bone regeneration were also studied by Berner et al. [34], who used different laydown patterns, and developed silanized polycaprolactone/tricalcium phosphate scaffolds with 0º/90º and 0º/60º/120º fiber orientations and implanted them in rat skull defects. The analysis showed that a higher degree of newly formed bone was observed in 0º/90º scaffolds, compared to 0º/60º/120º ones, where the bone formation was closer to the host bone with less ingrowth to the center of the scaffold. The authors reported that differences could not only be explained by the variations in higher porosity, large pore size, and lower surface area of the 0º/90º groups, but rather that struts’ architecture must also play a main role in bone formation. The absence of a unanimous agreement on optimal pore size and shape can be attributed to the variability in materials employed and the specific sites of implantation [10]. Additionally, the body of research examining scaffold geometry through in vivo studies is comparatively small. In addition, one of the challenges when studying the effects of pore shape is the lack of isolation of architectural parameters. Mirkhalaf et al. [85] synthesized Baghdadite 3D-printed scaffolds with 5 different structures, maintaining similar values of pore size (500 µm), porosity (50%) and surface-to-volume ratio (10 mm-1). They were implanted in rabbit cranial defects to assess the effects of the surface convexity (cylindrical struts with convex surfaces vs. concave surfaces), the relative orientation of the scaffold concerning the defect site (scaffolds with cubic pores vs. rotated cubic pores), and interconnectivity (body-centered cubic scaffold). The results showed that only pore interconnectivity significantly affected the scaffold’s bone tissue regeneration capacity, which is in agreement with the data obtained from alternate and helical structures, where the one with greater interconnectivity got better results in bone regeneration trials. Another important requirement for bone regeneration is the degradability of the implants, which, regardless of the material, is closely related to the porosity, the pore size, and the interconnectivity. In the present Doctoral Thesis, the degradation of the scaffolds was subjectively more evident in the helical group, with lower values of IS/TS and a lack of connection between the struts in the histological sections. As mentioned above, the degradation pattern of porous structures is linked to pore size, so smaller pores result in slower hydrolysis General Discussion 105 and, thus, low degradation rates. As expected, the same happens with the porosity since higher values result in further permeability and faster degradation. Likewise, it was observed that scaffolds with large pore sizes and lower porosity degraded faster than those with smaller pore sizes and higher porosity due to the effect of higher available surfaces in scaffolds with macropores [41,226]. Besides, scaffolds with square pores provided faster degradability and higher weight loss than other pore morphologies such as triangular or parallelogram [276]. However, Domingos et al. [277] reported after in vitro degradation studies that the degradation rate of PCL scaffolds was notably affected by porosity and pore size, since 0º/90º and 0º/45º/90º/135º filament orientations resulted in similar degradation rates when porosity and pore size values remained similar. The scaffold design also has an essential effect on the mechanical properties of the scaffolds since as porosity and mean pore size increase, the mechanical strength is sacrificed. Thus, an adequate balance among these parameters is essential for synthesizing an ideal scaffold for bone tissue engineering [13]. The present work shows that helical structures have demonstrated much lower mechanical properties than alternate structures. Furthermore, this lack of mechanical resistance in helical scaffolds could be the reason for the fracture of two femoral condyles after the scaffold’s implantation in rabbits, even though their compressive strength values were within the range for those stipulated for natural bone (2-12 MPa) [213]. Similarly, Domingos et al. [275] reported that increases in pore size, reductions in laydown patterns’ deposition angle or increases in the number of deposition angles (from 0º/90º to 0º/45º/90º/135º) resulted in scaffolds with lower compressive modulus, and therefore in weaker structures. Regarding to pore size, the compressive modulus decreases from 52.5±4.5 MPa to 23.1±2.8 MPa, and referring to deposition angle, the measurements showed reductions from 34.2±3.8 MPa to 19.1±2.8 MPa. The authors’ explanation for these results was the larger fused area between struts occasioned by a reduced deposition angle, leading to lower local stress experienced by scaffolds and a greater ease of sliding, increasing consequently the scaffold’s deformability [275,278,279]. Furthermore, high mechanical properties in scaffolds with 0º/90º and 0º/60º/120º laydown patterns are related to the aligned crossover points on every layer. By contrast, 0º/45º/90º/135º orientations produced misaligned crossover points among different layers, and thus the elastic modulus may be lower [88]. Nevertheless, Liu et al. [41], who synthesized scaffold using a brittle material such as BCP, observed that an increase in the size of the macropores resulted in similar compressive strength values. Regarding differences between scaffolds with aligned or staggered fibers, many authors confirmed that staggered filaments had notably lower mechanical properties than aligned filaments, as reviewed by Gleadall et al. [88]. Specifically, Serra et al. [280] described that PLA-based composite scaffolds with staggered fibers showed 50-75% lower elastic modulus than others with aligned fibers. Likewise, regarding the mechanism by which scaffolds collapse, it could be appreciated that a solid column from the top to the bottom of the scaffolds, as it happened in those structures with 0º/90ª laydown patterns, provide them with a pillar that strongly resists compression. When fibers are staggered, such as 0º/45º/90º/135º/180º laydown patterns, filaments bend slightly and the structure easily collapses in a concertina manner [88]. The present chapter delved deeper into how specific scaffold designs resulted in significant changes in pore size, porosity, interconnectivity, available implant surface, and mechanical properties. But it also demonstrated, through the implantation of the scaffolds in an animal model, the effects of these modifications on bone regeneration, with their subsequent implications in the context of bone tissue engineering. Thus, the results confirmed the initial hypothesis since they demonstrated that scaffold architecture could influence bone regeneration capabilities. Critical defects were performed in a rabbit femoral condyle model, which allowed IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 106 us to confirm the advantages of using scaffolds with 0º/45º/90º/135º/180º (helical) orientations. As described above, laydown patterns have greatly influenced the implant’s characteristics and suitability for bone graft use. Changes deriving from printing paths, which theoretically should trigger a series of biological changes in vivo, favored, or hindered bone ingrowth through different mechanisms. Mainly by facilitating or not facilitating the access of cells and new vessels to the inner part of the scaffolds, but also because of their differences in degradability rate. 5.4 LIMITATIONS OF THE STUDY The impossibility of manufacturing scaffolds with bioCaP concentrations higher than 12% due to the selected nozzle size, limited us in obtaining implants with greater osteogenic capabilities. The lack of degradation analysis prevents us from ensuring different degradability rates among the synthesized structures, as well as analyzing its buffering capacities in an acidified environment and its implications on scaffold’s mechanical integrity. And in addition, the absence of long-term clinical trials, the low number of animals used in the study, the absence of an empty negative control, and the variable distribution and limited amount of trabecular bone in rabbit models, represented some constrains that can limit the scope of the study and should be addressed in future investigations. 5.5 FUTURE RESEARCH Controversial published results regarding scaffold’s composition and architecture, as presented in this section, highlighted the importance of further investigations on this topic to validate and expand the knowledge. Further research should be performed to improve implant’s osteogenic capabilities. One widely used alternative is the addition of different substances to functionalize the scaffolds (growth factors, rhBMP-2, stem cells, etc.), showing successful results as reported in Chapter I of the present Doctoral Thesis. Another possible strategy could be the combination of the synthesis of composite scaffolds with a biomimetic mineralization by using calcium phosphate coatings, as described by Maia-Pinto et al. [218]. In addition, scaffold’s surface hydrophobicity and environment acidification are some issues that should be addressed to avoid inflammation signs and favor the bone healing process. Likewise, synthesizing and comparing a wider variety of scaffold laydown patterns could provide more interesting information regarding scaffold characterization and degradation analysis. Besides, the analysis of their osteogenic capabilities in in vivo trials is also crucial since in vitro findings are not always correlated to in vivo ones [38]. New alternative approaches may also be used to search highly porous and interconnected but, at the same time, resistant structures. A possible alternative are the bimodal pore topologies, described by Entezari et al. [35], which allowed the creation of larger pores without increasing porosity or sacrificing mechanical properties, or the combination of different laydown patterns, such as 0º/90º/180º and 0º/45º/90º/135º/180º orientations, to achieve porous structures that facilitate bone ingrowth without compromising its mechanical resistance. Challenges in the clinical adoption of 3D-printed scaffolds include the need for medicalgrade materials, fabrication costs for patient-specific products, clinician training, and scaffold sterilization [38]. Research and additive manufacturing efforts must focus on these areas to enhance clinical applicability. Adapting techniques for bone applications to weight-bearing sites, like long bone defects, is complex due to different bone environments and implant requirements. Therefore, extensive pre-clinical studies are crucial for clinical relevance, particularly on larger animals at intended implantation sites. CONCLUSIONS 109 6 CONCLUSIONS I. After being successfully tested in preclinical trials in rabbit and rat models, 3Dprinted composite scaffolds have demonstrated to be a promising alternative for treating bone defects in human and veterinary medicine. Composite scaffolds have been proven to be biocompatible and mechanically resistant when implanted in vivo. Furthermore, no adverse reactions that could impair bone growth were reported, and the incorporation of higher amounts of bioceramics to a polymeric matrix was positively related with bone formation. The use of different substances and techniques to functionalize the scaffolds has also improved their biological activity and enhanced their bone regeneration capabilities. Nevertheless, a refinement and standardization on the design of experimental processes and anaesthetic protocols is needed to reduce the risk of bias and provide quality information to help the research community. II. Gradually enriched PLA-bioCaP composite scaffolds were successfully manufactured using fused deposition modeling. The implants were characterized and despite their low hydrophilic behavior, they showed suitable properties for their use in bone tissue engineering. These findings were later corroborated, demonstrating a favorable biocompatibility and making evident their possible use as bone substitutes in repairing defects in humans and animals. However, the gradual enrichment of the polymeric matrix, contrary to what was expected, did not increase the scaffold’s osteogenic potential. Something that should be addressed in future investigations to achieve an optimal application of the implants. III. PLA-bioCaP composite scaffolds with alternate and helical laydown patterns were designed and fabricated to delve into the understanding of the impact of scaffold architectures on bone regeneration. The results revealed that both designs were biocompatible, and support and facilitate bone growth in load-bearing sites, with the helical structures showing a notable advantage in enhanced bone regeneration due to their larger pore size and increased porosity and accessible porosity. However, this architectural benefit comes at the cost of reduced mechanical strength, posing several limitations for their applications. These findings highlight scaffolds architecture’s critical role in bone tissue engineering and the intricate balance required between mechanical stability and scaffold porosity for optimal bone healing. The insights gained from this work are instrumental for future advancements in scaffold design, particularly for applications involving criticalsized bone defects. BIBLIOGRAFÍA Bibliografía 119 Bioglass-Containing 3D printable PLA Composite for Bone Tissue Engineering, International Journal of Bioprinting 8 (2022) 65–81. https://doi.org/10.18063/ijb.v8i4.602. [81] S. 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El resto de las imágenes empleadas fueron realizadas por el autor (imágenes propias) o cedidas por el Grupo de Novos Materiais de la Universidade de Vigo. El origen de cada imagen fue especificado en el pie de figura junto a su descripción. IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 140 8.2 ANEXO II: LISTA DE VERIFICACIÓN ARRIVE Lista de verificación para Tesis con animales de experimentación. EXPERIMENTACIÓN ANIMAL ARRIVE Sí/no/NA página Título Sí Proporcionar una descripción tan exacta y concisa como sea posible sobre el contenido del trabajo. Portada Resumen Sí Proporcionar un resumen preciso de los antecedentes, los objetivos de la investigación, incluyendo detalles de la especie y cepa de los animales utilizados, métodos relevantes, hallazgos principales y conclusiones del estudio. 7-8 Antecedentes Sí Incluir suficientes antecedentes científicos (incluyendo las referencias pertinentes al trabajo anterior) a fin de comprender la motivación y el contexto para el estudio, y explicar las bases y el enfoque experimental. 11-28 Sí Explicar cómo y por qué la especie y el modelo animal utilizados permiten abordar los objetivos científicos y, cuando sea apropiado, la relevancia del estudio para la biología humana. 89 Objetivos Sí Describir claramente los objetivos primarios y secundarios del estudio, o las hipótesis específicas que se van a probar. 31 Declaración Ética Sí Indicar el permiso del comité ético, y las leyes o decretos pertinentes para el cuidado y uso de animales, bajo las que se realiza la investigación. 42 Diseño del estudio Sí Número de grupos experimentales y control. 42-45 Sí Cualquier medida adoptada para minimizar los efectos de sesgo subjetivo al asignar los animales a los grupos de tratamiento (por ej., procedimiento aleatorio) y al evaluar los resultados (por ej., si se hace, describir quiénes eran ciegos y cuándo). 42-45 Sí La unidad experimental (por ej., un solo animal, grupos o jaulas de animales). Un diagrama cronológico o de flujo pueden ser útiles para ilustrar cómo se realizaron los diseños de estudio complejos. 42-45 Procedimientos experimentales Sí Cómo (por ej., formulación y dosis del tratamiento, el sitio y la vía de administración, anestesia y analgesia utilizadas [incluyendo la monitorización], procedimiento quirúrgico, el método de eutanasia). Proporcionar detalles de cualquier equipo especializado utilizado, incluyendo proveedor(es). 43-45 NA Cuándo (por ej., la hora del día). No procede NA Dónde (por ej., jaula de alojamiento, laboratorio, prueba del laberinto acuático). No procede Sí Por qué (por ej., fundamentos para la elección del anestésico específico, la vía de administración, dosis del fármaco utilizado). 43-45 Animales de experimentación Sí Proporcionar detalles de los animales utilizados, incluyendo especie, cepa, sexo, etapa de desarrollo (por ej., edad media o mediana de edad y rango) y peso (por ej., media o mediana más rango de peso). 42 Sí Proporcionar otra información pertinente, como la procedencia de los animales, nomenclatura internacional de la cepa, modificación genética (por ej., animal deficiente o transgénico), genotipo, estado de salud/inmune, si los animales han sido incluidos en estudios o recibido tratamientos anteriormente, procedimientos previos, etc. 42 Animales Sí Alojamiento (tipo de instalación por ej., libre de patógenos específicos [SPF], tipo de jaula o habitáculo, material del lecho, número de animales por jaula, forma y material del tanque, etc. para peces). 42 Sí Condiciones de cría (por ej., programa de reproducción, ciclo de luz/oscuridad, temperatura, calidad de agua, etc. para peces, el tipo de alimentación, el acceso a los alimentos y al agua, enriquecimiento ambiental). 42 Sí Evaluaciones e intervenciones relacionadas con el bienestar que se llevaron a cabo antes, durante o después del experimento 42-45 Tamaño de la muestra Sí Especificar el número total de animales utilizados en cada experimento, y el número de animales en cada grupo experimental. 42-45 Sí Explicar cómo se determinó el número de animales. Proporcionar detalles del cálculo del tamaño muestral utilizado. 42 NA Indicar el número de repeticiones independientes de cada experimento, si es pertinente. No procede Asignación de animales a grupos experimentales Sí Proporcionar detalles completos de la forma en que los animales fueron asignados a grupos experimentales, incluyendo distribución aleatoria o asignación específica, si así se hizo. 43-45 Sí Describir el orden en el que los animales en los diferentes grupos experimentales fueron tratados y evaluados. 43-45 Sí Resultados experimentales 12 Definir claramente los resultados primarios y secundarios evaluados (por ej., muerte celular, marcadores moleculares, cambios de comportamiento). 36-48 Métodos estadísticos Sí Proporcionar detalles sobre los métodos estadísticos utilizados para cada análisis. 47-48 Sí Especificar la unidad de análisis para cada grupo de datos (por ej., un solo animal, grupo de animales, neurona individual). 42-45 Sí Describir los métodos utilizados para evaluar si los datos corroboran las suposiciones del método estadístico. 47-48 Datos basales Sí Para cada grupo experimental, indicar las características relevantes y estado de salud de los animales (por ej., peso, estado microbiológico, si los animales han sido incluidos en estudios o recibido drogas anteriormente) antes de iniciar el tratamiento o prueba. (Esta información puede ser a menudo tabulada). 42 Cantidades analizadas Sí Indicar el número de animales en cada grupo incluido en cada análisis. Presentar números absolutos (por ej., 10/20, no 50 %2). 42-45 Sí Si alguno de los animales o datos no fue incluido en el análisis, explicar por qué. 72, 82-84 Resultados y Discusión Sí Indicar los resultados de cada análisis llevado a cabo, con una medida de precisión (por ej., error estándar o intervalo de confianza). 65-87 Eventos adversos Sí Dar detalles de todos los eventos adversos importantes en cada grupo experimental. 42,72,82 NA Describir las modificaciones a los protocolos experimentales realizadas para reducir los eventos adversos. No procede Interpretación /implicaciones científicas Sí Interpretar los resultados, teniendo en cuenta los objetivos y las hipótesis del estudio, la teoría actual y otros estudios pertinentes en la literatura. 91-106 Sí Comentar las limitaciones del estudio incluyendo cualquier fuente potencial de sesgo, cualquier limitación del modelo animal y la imprecisión asociada con los resultados 95,106 Sí Describir cualquier implicación de los métodos experimentales o hallazgos para el reemplazo, refinamiento o reducción (las 3 R) del uso de los animales en investigación. 96,97 Capacidad de generalización/aplicabilidad Sí Comentar si, y de qué forma, los hallazgos de este estudio son aplicables a otras especies o sistemas, incluyendo cualquier relevancia para la biología humana. 91-106, 109 Financiación Sí Listar todas las fuentes de financiación (incluyendo el número del proyecto) y el papel de la fuente(s) de financiación en el estudio. Apartado Financiación Basado en The ARRIVE guidelines: Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments. Firma Doctorando IVÁN ALONSO FERNÁNDEZ 144 8.3 ANEXO III: AUTORIZACIÓN DEL COMITÉ DE BIOÉTICA Y CERTIFICADOS DE CAPACITACIÓN