Valor de la técnica fish para la detección de translocaciones en linfomas no Hodgkin, linfoma folicular, linfoma de células del manto y linfoma B de células grandes

UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Departamento de Anatomía Patológica y Ciencias Forenses VALOR DE LA TÉCNICA FISH PARA LA DETECCIÓN DE TRANSLOCACIONES EN LINFOMAS NO HODGKIN. Linfoma Folicular, Linfoma de Células del Manto y Linfoma B de Células Grandes. Memoria presentada por MARTA TOJO CASTRO Para optar al Grado de Doctor en Biología. Santiago de Compostela, 30 de Abril de 2009. D. MÁXIMO FRAGA RODRÍGUEZ Y D. JERÓNIMO FORTEZA VILA, CATEDRÁTICOS DEL DEPARTAMENTO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA Y CIENCIAS FORENSES DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA, INFORMAMOS Que la Licenciada en Biología D. Marta Tojo Castro, realizó el presente trabajo, titulado: “VALOR DE LA TÉCNICA FISH PARA LA DETECCIÓN DE TRANSLOCACIONES EN LINFOMAS NO HODGKIN. Linfoma Folicular, Linfoma de Células del Manto y Linfoma B de Células Grandes”, bajo nuestra dirección, para optar al Grado de Doctora en Biología. Trabajo que consideramos concluido, autorizando su presentación ante el Tribunal Calificador. Y para que así conste, expedimos el presente informe en Santiago de Compostela, el 30 de Abril del 2009. Dr. Máximo Fraga Rodríguez Dr.Jerónimo Forteza Vila ELENA ANGEL SONIA JOSE LUZ RAQUEL DR BARROS PAULA ROSANNA LUISA DRA EUGENIEVA DR FRAGA DR FORTEZA MANUEL ARANCHA DR GARCÍA-CABALLERO CARRY JAVI DR ABDULKADER DRA SOBAS EZEQUIEL DRA PINTOS A TODOS VOSOTROS QUE DE ALGUNA HABEIS CONTRIBUIDO PARA QUE ESTE TRABAJO SEA POSIBLE CONCHITA MANOLO MARIA JOSÉ ESTHER MANOLO CONCHA CRIS ALEX HELGA BEA PAULA ANA DUBI A Bea Dubert y a todos los que la ciencia llega demasiado tarde. Glosario de abreviaturas ADN: Ácido desoxirribonucleico. Ácido citríco: Ácido 3-Hidroxi-1,3,5-pentatricarboxílico. Ag: Antígeno. ARN: Ácido ribonucleico. ARNm: Ácido ribonucleico mensajero. ATM: Ataxia telangiectasia mutated. BCL1: B-cell leukemia/lymphoma 1. BCL2: B-cell leukemia/lymphoma 2. BCL6: B-cell leukemia/lymphoma 6. BCR: B cell receptor. CALA: Antígeno de la leucemia linfocítica aguda común. C: Región constante de las IgH. CCND1: Ciclina D1. CD: Cluster differentiation. CG: Centro germinal. CDK: Ciclina dependiente de kinasa. CDR1: Complementary determining regions. D: Region de diversidad de las IgH. DAPI: 4´-6´-diamidino-2-feniloide. EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético. Fig: Figura. FISH: Fluorescence in situ hybridization. FR: Framework. Icr: Intermedial cluster region. Ig: Inmunoglobulina. IgH: Cadena pesada de las inmunoglobulinas. IgL: Cadena ligera de las inmunoglobulinas. IPI: Índice pronóstico internacional. J: Joining, de unión. 1. Introducción Introducción 3 Las neoplasias linfoides se entienden como proliferaciones clonales originadas a partir de una única célula B o T, que frecuentemente refleja un determinado estadío de maduración. Realizar una clasificación diferenciada y precisa de los linfomas ha constituido siempre una fuente de discusión y controversia para clínicos, patólogos e investigadores básicos, presentando problemas para determinar un diagnóstico. De ahí la importancia de recopilar el mayor número de datos acerca de ellas y correlacionar la información clínica, morfológica, fenotípica y genética. En los inicios, el diagnóstico histopatológico de las neoplasias linfoides dependía exclusivamente del reconocimiento de las alteraciones morfológicas, mediante un examen microscópico: detallando el patrón histológico, la citología (linfocito o histiocito)1 y el patrón de diferenciación celular (bien diferenciado o pobremente diferenciado). En algunos casos, las características morfológicas por sí solas, no son concluyentes para afirmar que un proceso es maligno o benigno, sobre todo cuando se trata de linfomas extremadamente polimorfos, en lugar de ser una población monótona de células neoplásicas. A mediados de los 70 aparecen nuevas técnicas de diagnóstico que complementan a las morfológicas. Se trata de técnicas inmunohistoquímicas desarrolladas para hacer un estudio inmunofenotípico, que ayudan a discriminar y determinan la estirpe celular B2. En la última década se produce un avance en el conocimiento de los linfomas, gracias al desarrollo de las técnicas moleculares, que permiten determinar la clonalidad de los procesos linfoides e identificar translocaciones cromosómicas características. Estas técnicas son de gran ayuda en el diagnóstico de tumores no concluyentes morfológica o inmunofenotípicamente y han sido incorporadas gradualmente a la rutina diagnóstica de los laboratorios de Anatomía Patológica. Sus resultados han de ser interpretados, dentro de un contexto clinicopatológico, como una herramienta más de ayuda en el diagnóstico diferencial. De hecho, el diagnóstico de los procesos linfoproliferativos debe tener en cuenta la información procedente de: • Estudio Clínico. • Estudio Histológico. Introducción 4 • Estudio Inmunofenotípico. • Estudio molecular y citogenético. Es importante recalcar que cualquier resultado ha de ser interpretado en el contexto de estos criterios. Realizar una buena correlación entre los datos clínicos, morfológicos, fenotípicos, y genéticos es clave para un diagnóstico correcto y preciso. Introducción 5 1.1. LINFOMAS; CONCEPTO Y CLASIFICACIÓN. Los linfomas o neoplasias linfoides son procesos proliferativos clonales malignos que comprenden varios grupos de entidades. En muchos casos, aunque no en todos, el fenotipo de la célula neoplásica se parece mucho al de un determinado estadio de la diferenciación normal de los linfocitos, dato que se utiliza en el diagnóstico y la clasificación de estos procesos. 3 La inmensa mayoría de las neoplasias linfoides (80-85%) tienen su origen en las células B, y casi todas las restantes son tumores de células T; muy raras veces se observan tumores derivados de las células NK o de origen histiocítico.3 Clásicamente, se consideran que todas las neoplasias linfoides son malignas, pero se observan comportamientos muy variables desde las formas aparentemente benignas hasta otras que son rápidamente mortales.3 La clasificación y descripción de los linfomas, ha ido evolucionando paralelamente con la aparición de nuevas técnicas. Así encontraremos multitud de clasificaciones cada vez de mayor precisión, desde la primera descripción de los linfomas atribuida a Thomas Hodgkin 4 en 1832 hasta nuestros días. En 1994 la “Revised European-American Classification of Lymphoid Neoplasms” realiza una clasificación, sustento de la clasificación realizada en 2001 por la “World Health Organization Classification of Tumour”5, 6, modificada en el 2003 y la vigente publicada en el 20087. Se trata de una clasificación específica de los tumores hematopoyéticos y tejido linfoide, en donde se da prioridad a la simplificación, evitando hacer una clasificación compleja y de menor valor práctico. Sólo se reconocen enfermedades con rasgos característicos, tanto morfológicos como clínicos. Se establecen grados histológicos y grupos pronósticos. Dentro del amplio grupo de los linfomas, hay que separar, a la enfermedad de Hodgkin (EH) (Linfoma de Hodgkin) de las otras formas que constituyen los Linfomas no Hodgkin (LNH), ya que presentan diferencias clínicas, histológicas y reciben distinto Introducción 6 tratamiento. Nuestro estudio se centrará en 3 tipos de LNH: LF (Linfoma Folicular), LCM (Linfoma de Células del Manto) y LBCG (Linfoma B de Células Grandes), en la tabla 1 mostramos su clasificación. Células precursoras Leucemia/Linfoma linfoblástica B Células maduras Leucemia linfocítica crónica B/Linfoma de linfocitos pequeños. Leucemia prolinfocítica B. Linfoma B esplénico de la zona marginal (+/-linfocitos vellosos). Leucemia de células peludas. Linfoma linfoplasmocítico. Linfoma folicular. Linfoma de células del manto. Linfoma B de la zona marginal, del tejido linfoide asociado a mucosas. Linfoma ganglionar de la zona marginal. Linfoma B difuso de células grandes: Linfoma primario de cavidades Linfoma primario mediastínico. Linfoma de Burkitt. Granulomatosis linfomatoide. Neoplasias de células plasmáticas: Mieloma múltiple. Plasmocitoma. Gammapatía monoclonal de significado incierto. Enfermedades por depósito de inmunoglobulina. Amiloidosis y otras. Tabla 1. Clasificación de la Organización Mundial de la Salud de los linfomas B. Esta clasificación ha sido posible gracias a la progresión en los campos de la inmunología, citogenética y biología molecular, convirtiendo estas técnicas en herramientas indispensables para el estudio de estas neoplasias. Con respecto a las características genéticas existen reordenamientos estructurales bien definidos y de gran ayuda para el diagnóstico en LF, LCM y LBCG. Dichos Introducción 7 reordenamientos, que más adelante describiremos en profundidad, se pueden detectar mediante técnicas de PCR y FISH. A continuación realizamos una revisión de las características más sobresalientes de estos LNH que en conjunto constituyen la mayor parte de los Linfomas B. 1.1.1. LINFOMA FOLICULAR. El Linfoma Folicular (LF) es un subtipo de linfoma no Hodgkin de fenotipo B. Representa alrededor del 22-40% de todos los linfomas8. Es un tumor derivado de linfocitos del centro germinal, caracterizado por la sobreexpresión de la proteína BCL2. Denominado folicular ya que la célula tiende a crecer en patrón circular o nodular en los ganglios linfáticos. Presenta un crecimiento lento e indolente. La edad media de presentación es superior a 30 años, siendo raro verlos en individuos más jóvenes9. Morfología: Prácticamente todos los casos muestran un patrón folicular aunque puede afectar tan sólo a una fracción del ganglio biopsiado. Ocasionalmente, la demostración del patrón folicular puede requerir inmunotinción para células dendríticas (CD21 o CD23). La citología muestra siempre una mezcla de centrocitos y centroblastos, si bien lo hace en proporción variable. Además existen abundantes células foliculares dendríticas y linfocitos T entremezclados con el tumor, hasta el punto de que la abundancia de células T puede llegar a enmascarar a las células neoplásicas. Grado del linfoma: El conocimiento del grado del linfoma folicular es de importancia capital a la hora de plantear el tratamiento más adecuado. Atendiendo a la proporción relativa del centroblasto, se consideran como grados citológicos provisionales los siguientes: • Grado I: de 0-15 centroblastos por hpf (high-power field de 0.159 mm2) • Grado II: Mixto, células pequeñas y grandes. 6-15 centroblastos por hpf • Grado III: células grandes. Predominio de centroblastos. Aquí habrá que distinguir entre Grado IIIa (presencia de centrocitos) y Grado IIIb (ausencia de centrocitos). Introducción 8 Los diferentes estudios de correlación clínica, muestran que el grado III se asocia con una conducta clínica más agresiva, si bien su reconocimiento tiene una baja reproducibilidad. Específicamente se ha encontrado que el tiempo libre de enfermedad es más corto en linfomas de grado III, aunque la supervivencia global no parece diferir significativamente10. Desde el punto de vista práctico se agrupan los grados I y II como tumores de bajo grado histológico y el III como tumores de alto grado, algo que ahora reconoce la clasificación de la OMS del 20087, 11, 12. Inmunofenotipo: expresan antígenos asociados a células B tales como CD19, CD20, CD22, además pueden expresar BCL2+, BCL6+, CD10+, IgG de superficie. Algunos casos, especialmente el grado IIIb, pueden ser CD10-, pero mantienen la expresión de BCL613, 14. El 85% de los LF muestran alta expresión de la proteína BCL2. Esta expresión se ha convertido en un rasgo útil de diagnóstico que permite identificar fases precoces del LF. Son negativos para los receptores de antígenos: IgM+/-, IgD-, CD43-, CD23-, CD5La inmunotinción para marcadores de células dentríticas foliculares revela la presencia de una malla densa soportando células tumorales. Otro rasgo característico son los folículos neoplásicos con bajo índice proliferativo mediante inmunotinción con Ki67 en casos de bajo grado15. Características genéticas: alrededor del 85% de los LF sufren reordenamientos que afectan al gen BCL2. La variante frecuente es la t(14;18)(q32;q21), otras variantes son t(2;18)(p12;q21) y la t(18;22) (q21;q11). Dichas alteraciones están presentes en el 85-90% de los linfomas de grado I y II y en un 59 % los de grado IIIa.16. Sin embargo esta alteración no es característica de los linfomas de grado IIIb, ya que tan solo aparece en un 13%10, 17, ni para los linfomas cutáneos con ausencia de la translocación y expresión de la proteína BCL2. Existe un pequeño subgrupo de linfomas foliculares que no expresan BCL2 y sin embargo suelen caracterizarse por tener la t(3;14) u otra de las alteraciones estructurales 3q27 situada en el locus de BCL617. Normalmente se corresponde con linfomas de grado IIIb, lo que apunta a que se trata de un subtipo biológico diferente18. Esta translocación Introducción 9 también puede presentarse asociada al mismo tiempo que t(14;18)(q32;q21) o junto a otras alteraciones que también involucran al locus de BCL2 como puede ser la trisomía 18. 1.1.2. LINFOMA DE CÉLULAS DEL MANTO. El Linfoma de Células del Manto (LCM) es un subtipo de linfoma no Hodgkin de fenotipo B que representa entre un 3 - 10% de todos los linfomas19. Se origina a partir de un proceso linfoproliferativo de un subgrupo de células B en un estadio previo al paso por el centro germinal. Se caracteriza por una proliferación monomorfa de linfocitos vírgenes entre tamaño pequeño e intermedio20. El comportamiento biológico de LCM es muy agresivo, con una supervivencia media de 3-5 años. Ocurre en individuos de edad avanzada con una media de 60 años y principalmente en varones21, 22. Grado de linfoma: histológicamente puede presentar un patrón de crecimiento en la zona del manto, nodular o difuso y muy rara vez un patrón folicular23-25. Aunque clásicamente se ha postulado que la citología de los LCM es monomorfa, estos tumores pueden mostrar cierto grado de variabilidad citológica, más acentuada cuando las células tumorales que infiltran los centros germinales. Morfologicamente se distinguen dos variantes muy agresivas: • Blastoide: es la variante más agresiva, las células presentan una morfología similar a los linfoblastos con cromatina dispersa y alto índice mitótico. • Pleomórfica: las células son muy pleomórficas y aunque poseen un núcleo ovalado de contorno irregular con un citoplasma claro y prominente nucleolo en al menos algunas células. Otras formas menos frecuentes de LCM son: el LCM de células pequeñas y el linfoma Marginal Zone-Like. Introducción 16 El mecanismo del reordenamiento de la región variable se debe a unas secuencias señalizadoras recombinantes (SSR) en el ADN, son secuencias conservadas que aparecen flanqueando los segmentos VDJ; al lado 3´ de cada segmento V, al lado 5´ de cada segmento J, y ambos lados de cada segmento D. Las SSR tienen una estructura primaria característica: • Un heptámero palindrómico conservado. • Un nanómero conservado, rico en AT. Entre el heptámero y el nanómero, existe una secuencia no conservada que se caracteriza por tener 12 ó 23 nucleótidos. Esto supone que podemos distinguir dos tipos de secuencias SSR. • SSR de una vuelta (con doce nucleótidos intercalados entre heptámero y el nanómero). • SSR de dos vueltas (con veintitrés nucleótidos intercalados). La forma de emparejarse es siempre un SSR de una vuelta con SSR de dos vueltas. En las cadenas pesadas, tanto el lado 3´ de V´ como el 5´ de J poseen una SSR de dos vueltas, mientras que ambos lados de cada segmento D posee un SSR de una vuelta. Esta regla asegura que los segmentos V-DJ se unan en el orden adecuado. Estas regiones provocan que la IgH sea el blanco de recombinación con otros genes. El segundo mecanismo por el que las Igs adquieren una mayor variabilidad es la diversidad de unión, está caracterizada por la adición de N-Nucleótidos a nivel polipéptido. Las zonas de unión DHJH y VH-DH contienen algunos aminoácidos que no están codificados en los respectivos segmentos VDJ. De hecho estos aminoácidos no tienen una codificación propiamente dicha, sino que vienen determinados por los llamados nucleótidos N, que se adicionan durante la fase de unión D-J, VDJ. La reacción viene catalizada por la desoxinucleotidiltransferasa Terminal (TdT) que va añadiendo aleatoriamente hasta 15 nucleótidos, de modo que la región final la podemos representar como VH-N-DH-N-JH. Introducción 17 El tercer mecanismo por el que las Igs adquieren un nivel adicional de variación es la hipermutación somática: se produce una vez que los linfocitos B entran en contacto con el antígeno y migran a los folículos linfoides para crear los centros germinales. Los genes reordenados de las regiones V, tanto de las cadenas H como L, sufren una altísima tasa de mutación, que va generando nuevas variantes de Igs a partir de la reordenación génica original. Gracias a estos mecanismos las Igs producidas por linfocitos B son capaces de reconocer a cualquier antígeno. La suma de todos los anticuerpos distintos que puede generar un individuo10, 11 se conoce como repertorio de anticuerpos y su alto valor diferencial es debido a la propia organización de los genes de las inmunoglobulinas y a su peculiar mecanismo de expresión. Por último, podríamos sugerir como cuarto mecanismo, el cambio que van a sufrir la Igs, un cambio de clase denominado: Conmutación de la clase de la inmunoglobulina; es un proceso biológico que tiene lugar tras la activación de los linfocitos B, lo cual le permite la producción de diferentes clases de anticuerpos (IgA, IgE, o IgG) Estas clases están definidas por las regiones constantes (C) de la cadena pesada de la Ig. Inicialmente los linfocitos B vírgenes expresan sólo IgM e IgD de superficie con regiones de unión al antígeno idénticas. Cada isotipo está adaptado para una función distinta y por tanto, tras la activación se necesita un anticuerpo con un efector IgG, IgA o IgE para la eliminación eficaz del antígeno. La conmutación de clase permite a la progenie de un solo linfocito B producir anticuerpos de diferentes isotipos. Sólo la región constante de la cadena pesada del anticuerpo cambia durante la conmutación de clase. Las regiones variables, y por tanto la especificidad de antígeno, permanece invariable. De ese modo se producen efectores con la función adecuada para cada antígeno. La conmutación de clase es iniciada por citoquinas. El isotipo generado depende de qué citoquinas estén presentes en el entorno del linfocito B. El proceso tiene lugar en el gen de la cadena pesada por un mecanismo conocido como recombinación de conmutación de clase ("class switch recombination" o CSR) (Fig 2). Este mecanismo se basa en secuencias de nucleótidos conservadas, llamadas regiones de conmutación (Regiones switch o S), que se encuentran en un punto de la secuencia de ADN anterior a los genes de la región constante (excepto en la cadena δ). La hebra de ADN se escinde por la actividad de ciertas enzimas en dos regiones S concretas. Introducción 18 El exón del dominio variable se vuelve a empalmar mediante un proceso llamado unión de extremos no homóloga ("non-homologous end joining" o NHEJ) a la región constante elegida (γ, α o ε). Este proceso concluye formando un gen de inmunoglobulina que codifica un anticuerpo de un isotipo diferente. Fig 2. Representación de cómo se recombinan las diferentes clases de Igs. 1.2.2. GEN DE BCL2 . TRANSLOCACIÓN t(14;18)(q32;q21). BCL2 (B-cell CLL/ lymphoma 2) es un proto-oncogén situado en el brazo largo del cromosoma 18, banda 2, subbanda 1. Pertenece a la superfamilia de BCL2 involucrada en la regulación de la apoptosis, que codifica para miembros antiapoptóticos como son BCL2 (B-cell lymphoma protein 2) BclxL, Mcl1, Bclw y Bfl1 o A1 y miembros pro-apoptóticos: como Bax y Bak. El gen de BCL2 media el control transcripcional por dos promotores. El promotor 5´-P1 que está localizado en 1386-1423 pb hebra arriba del lugar de inicio transcripcional, Introducción 19 esta región es una TATA-less, promotor rico en CG donde se une varios factores de transcripción. El otro promotor es 3´- P2 que se encuentra localizado 1.3 Kb hebra abajo del promotor 5´-P1. El gen de BCL2 está constituido por 3 exones. El exón 1 y la parte 3´ del exón 3 son regiones no codificadoras. Las regiones codificantes de BCL2 por “splicing” (ensamblamiento alternativo) van a dar lugar a dos tránscritos que originan dos isoproteínas que difieren en su C-terminal. Presentando variaciones en la región 3´UTR. • “B-cell lymphoma protein 2 alpha isoform”: representa la isoforma de mayor tamaño, una proteína de 26.2 kDa (239 aminoácidos). Contiene la cola hidrofóbica que se ancla a la membrana que parece ser esencial para la función anti-apoptótica. Además contiene los dominios necesarios para la homo o heterodimerización (BH)40. • “B-cell lymphoma protein 2 beta isoform”: es la isoforma más corta, con 25 kDa (205aminoácidos). Su misión principal es el bloqueo de la muerte por apoptosis de células linfocitarias41 confiriendo longevidad a las células en fase G0. Los mecanismos mediante los cuales ejecuta su acción son diversos: • BCL2 forma complejos con las caspasas 9 y Apaf1 que inhiben la cascada de proteasas que da lugar a la apoptosis. Esta función la lleva a cabo en una gran variedad de células donde además regula la permeabilidad de la membrana mitocondrial evitando la liberación del citocromo C42. • Mediante la formación de dímeros con Bax. En la célula normal existe un balance de equilibrio entre los miembros de esta familia. BCL2 actúa como antagonista de Bax en una acción recíproca. Los miembros de las familias anti y pro-apoptóticas pueden formar homo y heterodímeros y se piensa que según su concentración, actúan de una manera u otra sobre el programa apoptótico. Se ha podido comprobar que los dominios de unión con BH1, BH2 y BH3 son los más importantes en este tipo de interacciones. Se trata de potentes dominios de muerte celular pertenecientes a Bax que se pueden conjugar con BCL2 como una interacción proteína-proteína, formando dímeros. La célula en estado basal forma homodímeros de BCL2. Cuando se daña se empiezan a formar heterodímeros de BCL2-BAX y cuando este daño es irreparable se forman los homodímeros BAX que Introducción 20 permitirán la salida al citoplasma del citocromo C y el desencadenamiento de los procesos apoptóticos. Si hay demasiada proteína BCL2 se unirá a BAX, inhibiendo la desencadenación de la apoptosis. • BCL2 junto con C-MYC, también inhibe el transporte de p53 desde el citoplasma al núcleo durante la fase G0/G1 del ciclo celular, periodo en que la célula sería susceptible de inducción a apoptosis dependiente de p53. El producto normal de BCL2 se va a expresar durante el estadio madurativo de preB cell La expresión de esta proteína se puede localizar en la membrana externa mitocondrial, en el retículo endoplasmático liso, y en la membrana perinuclear. . La desregulación de la expresión de BCL2 provocada por alguna anomalía hará que se exprese en los centros germinales, en células B maduras.43 TRANSLOCACIÓN t(14;18)(q32;q21): Citogenéticamente, la translocación t(14;18)(q32;q21) (immunoglobulin heavy Chain/B-cell leucemia/lymphoma 2) se encuentra presente en el 70%-80%17, 44 de LF (excepto para los Linfomas Foliculares IIIb)45, en el 30% de los LBCG, en el 10-40% de Linfomas Hodgkin46, esporádicamente aparece en el Linfoma de Burkitt47, 48 y en Leucemias Linfocíticas Crónicas. Se podría decir que está presente en el 25% de todos los linfomas de células B, aunque también se ha detectado en algunas hiperplasias foliculares49. Esta translocación afecta al gen de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas(IgH) situada en el cromosoma 14, en el brazo largo(q) de la región 3, banda 2 y al gen de BCL2 ubicado en el cromosoma 18, en el brazo largo(q) de la región 2, banda 150. (Fig 3). Introducción 21 Fig 3. Representación cromosómica de la t (14;18). Los puntos de rotura causantes de la translocación son variables, tanto en el gen de BCL2 como en el de IgH. El gen de BCL2 va a presentar a partir del extremo 3´ del exón 3 un conjunto de puntos de rotura que se extienden a lo largo de unas 30Kb (Fig 4). La región más importante de rotura consta de 150 pb, localizadas en el extremo 3´ del exón 3 y se denomina MBR (Major Breakpoint region). Próxima a ésta, hebra abajo (en la región más distal del exón 3), se localiza la región de rotura 3´MBR. Entre ambas regiones se localizan el 70% de las secuencias génicas donde se originan las translocación. (Fig 4) Siguiendo la dirección 3´, a unas 4.3 Kb de MBR, y ya fuera del exón 3, Buchonnet51 descubrió otro cluster adicional de rotura denominado 3´BCL2. En esta región se encuentran entre el 5-10% de los puntos causantes de la translocación52, 53. (Fig 4) Siguiendo la misma dirección a una distancia de 14.6Kb de 3´BCL2, se localiza ICR (intermedial cluster region54). La frecuencia de las translocaciones que implican a estos puntos es todavía más baja que la de 3´BCL2. (Fig 4) Introducción 22 A 9.3 Kb hebra abajo de la región ICR, encontramos la región mcr (minor cluster region). Se trata de un cluster de unos 500bp donde se distribuyen los puntos de rotura con una frecuencia del 10-15%55, 56,57, 58. (Fig 4) A 1,8 Kb de mcr Buchonnet51 describió otra región de rotura que se denominó 5´mcr, y cuya frecuencia ronda el 5%. (Fig 4) Existe además otra región de rotura descrita; localizada en una región distinta, en el extremo 5´ del primer exón del gen de BCL2, denominado vcr (variant cluster region) que tiene una mayor tendencia a sufrir reordenamiento con los loci que codifican para las cadenas ligeras de las Igλ59, aunque también puede hacerlo con IgH. Incluso se han descrito linfomas foliculares con un doble reordenamiento de la región 3´ y 5´ de BCL2 con inclusión en locus IgH39, 60. (Fig 4) En la actualidad se siguen descubriendo nuevos puntos de rotura localizados entre las regiones de icr y mcr61, que se caracterizan por sufrir un reordenamiento con IgH. Fig 4. Puntos de rotura implicados en la t(14;18)(q32;q21)62. 3´bcl2 icr 5´mcr mcr 3´MBR 1 , 4KB 9.3KB 14 , 6KB 4.3KB S μ E μ S μ E μ Introducción 23 Los puntos de rotura correspondientes al cromosoma 14 (Fig 4) se encuentran localizados en el área cercana a los miembros de la familia génica que codifican para JH entre los segmentos J y D. Generalmente se localizan en un cluster cerca del final J, en el cuarto o sexto segmento de JH 56, 63, 64, lugar de combinación con las regiones D por las secuencias SSR. Estos puntos se sitúan muy próximos a las regiones Eμ de la Ig. Otro punto de rotura descrito para IgH puede encontrarse en el extremo final 3´ entre α1 y ε2 aunque este punto ha sido detectado en muy pocas ocasiones63. En un principio, el origen de la t(14;18)(q32;q21) se relacionó sólo a los estadios iniciales de maduración de los linfocitos B: pre-B-cell, al mismo tiempo que ocurría el reordenamiento de los segmentos D y J. Se produce como resultado de un error en la recombinación de estos segmentos56 que, cuando se recombinan, lo hacen en dos cromosomas distintos, en vez de ensamblar los segmentos separados en el mismo cromosoma. Con el paso del tiempo se ha demostrado que la translocación puede ocurrir como un evento tardío durante el desarrollo de células B en el centro germinal39. La causa de que IgH recombine con el gen de BCL2 puede ser motivada por que las regiones de MBR y mcr sean estructuras vulnerables y con capacidad de unión a otras proteínas, con elementos que pueden facilitar la recombinación homóloga. MBR y mcr contienen regiones polipurinas-polipiramidinas que potencian las conformaciones alternativas de ADN (ADN-Z o ADN-H) con secuencias repetitivas Alu (encontradas también para el punto de rotura de C-MYC) y octámeros de “Chi-Like” parecidas a las que recombinan Escherichia Coli65,56. Además en la región polipurínica existe una secuencia rica en tetranucleótidos G muy similar a la encontrada en la clase S de la IgH. Al suceder la translocación, el oncogén BCL2 queda bajo el control de IgH Eμ (región de expresión génica muy alta66). (Fig 5) Introducción 24 Fig 5. Posibles dímeros IGH-BCL2 que se originan como resultado de la translocación. El resultado del reordenamiento es una proteína de estructura normal, porque los puntos de rotura están localizados fuera de la región codificante (Fig 4). Lo que va a experimentar es una desregulación en la expresión del gen de BCL2 con la consiguiente sobreexpresión proteica. Como BCL-2 funciona como un factor de supervivencia celular protegiendo a las células frente a la apoptosis, provoca que los linfocitos portadores de la translocación IgH-BCL2 no entren en apoptosis, teniendo una mayor supervivencia aunque con ello no se esté aumentando la proliferación de células B que desarrollan el LF. Otro dato a tener en cuenta es que la translocación por sí sola no va a originar la neoplasia. Aunque la translocación característica por excelencia de los LF es la t(14;18)(q32;q21), existen otras de menor frecuencia donde también se va a ver involucrado el gen de BCL2. Se trata de la t(18;22)(q21,q11), una translocación que implica al gen de BCL2 con la cadena ligera de las IgL, y la t(2;18)(p11.q21) que implica a los genes de BCL2 con IgLκ. Incluso hay descritos casos donde existe una translocación que implica a 3 genes t(3;14;18)67. 1.2.3. GEN DE LA CICLINA D1. TRANSLOCACIÓN t(11;14)(q13;q32). CCND1 ó BCL1 (B-cell leukemia/lymphoma 1) es un proto-oncogén también conocido como ciclina D1, D11S287E, PRAD1, U21B31. Se sitúa en el locus BCL1, l en el cromosoma 11, banda 1, subbanda 3. Introducción 25 El gen de la ciclina D1 está constituido por 5 exones con un total de 13,37 Kb y codifica una proteína CCND1 que puede ser transcrita en dos isoformas, de 4,5 Kb y de 1.5 kb. Ambos transcritos contienen todas las regiones codificantes y difieren únicamente en el extremo 3´ de la región no codificante. El ARNm de 4.5 Kb tiene en su extremo 3’ una región AUUUA que disminuye la estabilidad de la CCND1, por lo que existirá una mayor expresión de proteínas en LCM de la isoforma 1.5 Kb68. La CCND1 interviene en la regulación del ciclo celular, durante la transición de la fase G1 a S. Altos niveles de CCND1 pueden traer como consecuencia el acelerar la transición de la fase G1 a S con la consiguiente proliferación de células tumorales. Esto se produce mediante dos mecanismos: • La CCND1 se ensambla con el dominio catalítico de las kinasas dependientes de ciclinas 4 y 6 (CDK4 y CDK6). El resultado es la fofosforilación e inactivación del Rb (retinoblastoma), inhibiendo su efecto represivo en la proliferación del ciclo celular69 . • El complejo CCND1/CDK puede secuestrar a los inhibidores de CDK que son p27, kip1 y p21 y se encuentran por lo general unidos al complejo CDK2/ciclina E. Este, en estado libre de sus inhibidores va a fosforilar al Rb provocando una aceleración del ciclo celular. Todos estos estudios sugieren que la sobreexpresión de CCND1 juega un papel importante en la patogénesis de los LCM. Ya que permite un mayor crecimiento de las células linfomatosas. Se produce una proliferación de las células incontroladas, un crecimiento anormal de los tejidos y como consecuencia la posible aparición del tumor. TRANSLOCACIÓN t(11;14)(q13;q32): Citogenéticamente la t(11;14)(q13;q32) es el resultado de la yuxtaposición del locus de BCL-1 e IgH. Es altamente específica de linfomas de células de manto ya que se encuentra en el 95% de los casos. Aunque puede aparecer en otros linfomas pero en un porcentaje mucho más bajo, por ejemplo, en un 20% de las Leucemias Prolinfocíticas consideradas ya LCM en su fase leucémica, entre un 2 y 4% de los Mielomas Múltiples70, Introducción 32 Fig 9. Dímeros originados tras la translocación de el gen BCL6 con las cadenas ligeras de las Igs92 Cuando la translocación se origina con genes no-Ig es más difícil encontrar genes que aporten datos con propiedades comunes y explicar su relación con la sobreexpresión de BCL6. Lo que sí se conoce es que estas translocaciones producen un mayor crecimiento de las células neoplásicas frente a las normales. La fusión del gen se producirá en la misma orientación transcripcional, y los puntos de rotura de estos genes se localizan próximos a su secuencia promotora. El reordenamiento de BCL6 es una alteración primaria, se cree que se origina cuando la Ig ya ha tenido contacto con el antígeno, en la etapa de conmutación de clases de la inmunoglobulina Existe otro mecanismo por el que también se desregula la expresión de BCL6. Se trata de un fenómeno de hipermutación somática que ocurre a unos 730 pb del dominio MMC (major mutation cluster), en una región entre el primer intrón y exón que afecta no solo al gen de BCL6 en los LNH sino también a células B de individuos normales. Es decir, van a existir mutaciones somáticas en extremo 5´ no codificante y en la región reguladora 5´; esto aparece independientemente de que exista translocaciones o su histología. Estas mutaciones de BCL6 han sido propuestas como marcador para saber si las células B han pasado por el CG ya que se han encontrado en LF y LBCG y están ausentes en leucemias linfoblásticas y LCM. Introducción 33 La propuesta de cómo la alteración de BCL6 afecta a la homeostasis de células normales es por tres vías: • Aumentando el crecimiento y proliferación celular. • Previniendo la muerte celular. • Bloqueando la diferenciación terminal a célula plasmática104. 1.2.5. GEN DE MYC. TRANSLOCACIÓN t(8;14)(q24;q32). MYC (myelocytomatosis viral oncogen homolog) se trata de un proto-oncogén situado en el cromosoma 8, en el brazo largo banda 2. Está presente en casi todas las células eucariotas y pertenece a los genes de respuesta precoz inmediata, genes que se activan rápidamente cuando las células en reposo reciben la señal que promueve la división. Se encuentra constituido por 3 exones, en donde el primer exón no tiene la señal de inicio AUG. Según dónde se encuentre la pauta de lectura para la traducción de la proteína, bien en el exón 2 en su fragmento AUG o en la región no-AUG cerca del extremo 3´ del exón 1, puede presentar dos isoformas variando en su N-terminal105. C-MYC es una fosfoproteína nucleares de transcripción, la forma de actuar es entrando en el núcleo y mediante señales de vías de traducción contactan con diferentes genes que responden a ellas. La proteína se une al ADN mediante secuencias específicas de aminoácidos llamados motivos hélice-giro-hélice, dedos de zinc y cremallera de leucina. Esta unión se puede producir en lugares específicos donde pueden activar o inhibir la transcripción de genes adyacentes. En el caso de C-MYC no se conocen del todo las bases moleculares de su función, pero sí que tras su traducción pasa rápidamente al núcleo, y forma un heterodímero con otra proteína llamada MAX. El heterodímero MYC-MAX se une a unas zonas específicas del ADN (llamadas zonas E) convirtiéndose en un potente activador. Max también se puede unir a otra proteína MAD que forman un heterodímero que inhibe la transcripción. De ello se puede deducir que el grado de activación de C-MYC no sólo depende de los niveles de proteínas MYC, sino también de la abundancia y disponibilidad de las proteínas MAX y MAD. Introducción 34 Sus fundones más características son • Progresión del ciclo celular. Controla el paso de G0 a G1 en la proliferación celular. y tras un aumento transitorio del ARN del C-MYC la expresión vuelve a descender a sus valores iniciales. • Apoptosis. • Transformación celular. • Funciona como factor de transcripción nuclear La mutación sobreexpresión, reordenamiento y translocación de C-MYC ha sido relacionada con diversos tumores hematopoyéticos, especialmente con el linfoma de Burkitt106. TRANSLOCACIÓN t(8;14)(q24;q32). La t(8;14)(q24;q32) translocación, y sus variantes t(2;8)(p12;q24) y t(8;22)(q24;q32), se detectan en el 80% de los linfoma de Burkitt (BL), pero también se han encontrado en un 15%, LBDCG 5, en un 2% de LF y en otros NHL.107 La t(8;14)(q24;q32) involucra al oncogén MYC que se yuxtapone con la cadena pesada de la IgH, en la translocación resulta alterada la expresión de MYC lo que va influir en el desarrollo de la neoplasia. Similarmente las variantes de esta translocación involucran al gen MYC con lo genes de las cadenas ligeras IgLκ en 2p12, y IgLλ en 22qll.108 (Fig10). Los puntos de rotura para C-MYC son muy variados, uno de ellos se cree que está en el extremo 5´ exón no codificante pero que se encuentra involucrado en la expresión del gen, mutaciones en este punto pueden ser responsables de la actividad transcripcional. Otro punto de rotura se localiza en el 3´MYC. Asimismo IgH va a tener diferentes regiones recombinantes lo que sugiere diferentes modelos de activación del gen. Generalmente se ven involucrados en la translocación los segmentos VDJ. Aunque una de las primeras recombinaciones estudiada ha sido la región Sμ “switch” de las IgH con la región 5´ entre el primer intrón y primer exón.108, 109 Introducción 35 Pese a los diferentes puntos de rotura el dímero de fusión c-MYC-IGH que se origina en LB y en LBCG, es el mismo, compartiendo las mismas características clínicas aunque con una distribución diferente de edades.110 Fig 10. Representación cromosómica de las translocaciones t(8;14), t(8;22) y t(8;2). Que haya puntos de rotura tan heterogéneos va implicar la existencia de varios mecanismos que produzcan la sobreexpresión de MYC. Estos todavía no se conocen con exactitud pero si las consecuencias de la translocación: • Actividad transcripcional propiciada por la proximidad a secuencias Eμ. • Actividad transcripcional distanciada de las secuencias Eμ111. • Inactivación del extremo 5´ regulador de las secuencia de MYC, provocada por la actividad mutacional de IgH. • Alteración la vida media y cinética de la proteína MYC. Cómo consecuencia de ello se produce una sobreexpresión de MYC que implica: Introducción 36 • Un aumento de la apoptosis. • Promueve continuamente la proliferación de la célula y retarda la diferenciación112. 1.3. DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LOS LINFOMAS B. Las técnicas moleculares nos van a permitir, en general, sondear la complejidad y variabilidad del contenido genético de un organismo. En el estudio de los linfomas, las técnicas moleculares tienen un valor confirmativo de la hipótesis diagnóstica planteada en base al estudio histológico e inmunohístoquímico. En la mayoría de estas técnicas los resultados positivos ayudan a inclinar la balanza para un diagnóstico, sin embargo los resultados negativos tienen mucho menos valor, debido a las limitaciones del método. En el momento actual las técnicas moleculares utilizadas para diagnóstico tienen dos objetivos: • Detección de clonalidad. • Detección de translocaciones. 1.3.1. DETECCIÓN DE CLONALIDAD. La respuesta inmune adaptativa está mediada por los linfocitos B. Estas células son capaces de reconocer antígenos solubles y sintetizar anticuerpos específicos. Para ello se valen de una estructura de membrana, un agregado de proteína denominado receptor para el antígeno del linfocito B (complejo BCR) B cell receptor. La parte variable de este complejo BCR la constituye la molécula de inmunoglobulina (Ig) que es el componente implicado en la unión con el ligando (antígeno), por lo que las Igs son distintas en cada linfocito B38 (gracias a que sus genes se reordenan como explicamos en el apartado 1.121) De este modo, todos los linfocitos circulantes presentan una secuencia reordenada específica que da lugar a la gran variedad de receptores antigénicos. Sin embargo, en una Introducción 37 neoplasia linfoide, al proceder todas las células de una clona maligna, éstas presentarán el ADN reordenado de la misma forma. El estudio del reordenamiento de los genes que codifican las cadenas pesadas de las Igs puede ser utilizado como detector en el estudio de clonalidad. Dichos genes se presentan en su configuración germinal como segmentos discontinuos de ADN tales como: regiones variables (V), de diversidad de unión (D), joining (J), y constantes (C). Las regiones de variabilidad (V) de las IgH están formadas por tres regiones hipervariables denominadas regiones determinantes de complementariedad con el antígeno (complementary determining regions CDR1, CDR2 y CDR3). Las regiones CDR alternan con cuatro regiones relativamente invariables denominadas Framework region (FR1, FR2, FR3, FR4), blancos de las regiones de estudio113, 114. Existen varios métodos para estudio de clonalidad por técnicas moleculares. Los primeros estudios fueron por Southern-blot (SB). Se trata de una técnica muy específica pero que presentaba ciertas limitaciones. A mediados de los 80 aparece PCR (“polymerase chain reaction”), y soluciona parte de los problemas de SB. Con esta técnica puede usarse muestras fijadas en formol o incluidas en parafina, es una técnica simple y rápida con una eficacia mayor que el SB y es indispensable para el análisis de clonalidad en los procesos linfoproliferativos. Se trata de obtener producto amplificado de la región de interés. Utilizando cebadores consenso de las secuencias más conservadas de las regiones V (FR3 y FR2) y J del gen de IGH115. Los cebadores deben flanquear los sitios de unión V- (D)-J, donde se genera a una gran heterogeneidad de tamaños si el ADN procede de una población policlonal, mientras que se obtendrá un único producto PCR dominante en células tumorales detectando clonalidad en un 30-70% de los linfomas B115, por lo que sigue siendo una técnica con limitaciones. La visualización del producto de PCR se puede realizar mediante electroforesis en geles de acrilamida o electroforesis capilar. Lo que observaremos son múltiples bandas discretas en el caso de una población policlonal o una o dos bandas en el caso de una población monoclonal (Fig11C). Mediante electroforesis capilar observaremos múltiples picos con una distribución Gaussiana de pesos moleculares en el caso de poblaciones policlonales y uno o dos picos en las poblaciones monoclonales. (Fig 11B). Introducción 38 Fig 11. A. Interpretación esquemática de la unión de los cebadores con su secuencia diana en el DNA. B Visualización del producto de PCR para estudios de clonalidad en electroforesis capilar. Visualización del producto de PCR para estudios de clonalidad en geles de acrilamida115 Los resultados de estudios moleculares deben ser siempre interpretados en un apropiado contexto clínico y morfológico ya que la PCR es una técnica con limitaciones que puede dar: “Falsos” positivos por estar detectando subclones seleccionados por una respuesta inmune exagerada en situaciones reactivas (infecciones por EBV (Epstein Barr), CMV(citomegalovirus), linfadenitis hiperinmunes,…) o por una técnica inadecuada (de PCR o de electroforesis), con excesiva sensibilidad o escasa capacidad de resolución. “Falsos” negativos en el 30% de los procesos neoplásicos. La razón por la cual no se detecta clonalidad en la totalidad de caso son varias: presencia de mutaciones que impiden que los cebadores se unan al ADN, neoplasias que se originen en una célula progenitora muy inmadura en la que todavía no se ha producido el reordenamiento de los genes de las Igs, ADN no amplificable, inadecuado anillamiento de los cebadores, mutaciones somáticas o reordenamientos de IgVH en neoplasias post-foliculares, presencia de reordenamientos aberrantes, infidelidad de línea, neoplasias bilineales, …). IGH tube B V -FR2–J HH MwM PB-MNC tonsil ES-6 GBN-10 FR-5 200 - 300 - 400 - 500 - 600 - 700 - 800 - bp 50 100 0 150 100 400300200 100 200 0 300 100 400300200 1250 2500 0 3750 100 400300200 1500 3000 0 4500 100 400300200 1500 3000 0 4500 100 400300200 250-295 nt D H J H J primer H V -FR2 primers H V H BIOMED-2 report: Leukemia 2003; 17: 2257-2317 tonsil ES-6 GBN-10 FR-5 PB-MNC A B C Introducción 39 Por eso encontrar un resultado negativo no quiere decir que no sea una neoplasia. Hay que tener en cuenta que clonalidad no equivale necesariamente a malignidad. 1.3.2. DETECCIÓN DE TRANSLOCACIONES. A través de estudio citogenéticos se observó que en los linfomas de células B existían mutaciones estructurales características; se trataba de translocaciones específicas de cada subtipo de linfoma. La identificación de estas alteraciones citogenéticas en los desórdenes neoplásicos contribuyen a entender lo mecanismos oncogenéticos que sufren las células en su transformación, y son marcadores genéticos de la enfermedad52. Se trata de alteraciones primarias caracterizadas por el paso de material genético de un cromosoma a otro. Por lo general son translocaciones recíprocas, dónde los puntos de rotura suelen localizarse cerca de los telómeros de los cromosomas acrocéntricos, implicando una rotura en al menos dos cromosomas no homólogos, con intercambio de fragmentos. Cuando el intercambio recíproco se produce en fragmentos más o menos del mismo tamaño es muy difícil detectarlo por técnicas citogenéticas. Estos errores suceden como consecuencia de fallos fisiológicos ocurridos durante los reordenamientos de los genes que codifican para receptores de antígenos, se trata Igs (IgH, κ, λ)63 y se van a translocar recíprocamente con genes que presentan puntos de rotura variables, generalmente oncogenes, cuya expresión es desregulada por yuxtaposición con el gen receptor antígeno. Para la determinación de las translocaciones, los laboratorios han empleado diversas estrategias, las de mayor éxito son: citogenética convencional que aunque tiene un bajo coste económico, aporta información sobre todos los cromosomas, tiene ciertas carencias ya que requiere células en división del clon neoplásico, presenta una interpretación dificultosa en caso de obtener cromosomas de mala calidad, permite el análisis de pocas células y tiene una baja sensibilidad, además es proceso largo que puede durar semanas. Por lo que su uso para detección exclusiva de translocaciones es poco recomendado. Como alternativa a la citogenética en la búsqueda de translocaciones surge la PCR que nos permite trabajar con núcleos en interfase y metafase, con material parafinado y es mucho más sensible. Esta técnica tampoco está exenta de problemas sobre Introducción 40 todo cuando los puntos de rotura son excesivamente amplios y variables, podemos obtener falsos negativos. En respuesta a estas carencias surge otra técnica, la FISH, como problemas podríamos decir que su coste económico es más elevado, y aunque en estudios genéticos sobre frotis de sangre periférica de leucemias su uso está muy extendido, presenta dificultades técnicas para su realización en cortes de tejido incluido en parafina116. Por otro lado debemos tener muy presente que translocación no es siempre sinónimo de malignidad, resultados positivos deben ser interpretados con precaución y en su contexto clinicopatológico. Dada la importancia del estudio de las translocaciones como información adicional para el diagnóstico de linfomas debemos desarrollar herramientas fiables, sencillas y poco exigentes en cuanto a las condiciones de conservación tisular, de forma que puedan realizarse estudios tanto prospectivos como retrospectivos. Nuestro trabajo se centrará en el estudio de la eficacia de las técnicas de PCR y FISH para la clasificación de LF, LCM, LBCG en tejidos incluidos en parafina. Estos linfomas presentan alteraciones genéticas recurrentes muy características y por tanto de gran interés diagnóstico. El material incluido en parafina es la forma más usual de conservación de los tejidos y representa la principal fuente de trabajo en los laboratorios anatomopatólogos, permitiendo realizar estudios retrospectivos. Un buen resultado va a depender en gran medida del procesamiento previo de la muestra. Cada fase en la secuencia de fijación, deshidratación, inclusión, corte, puede provocar artefactos (distorsiones de la arquitectura celular, por ejemplo arrugas). El tipo de fijación previa a la inclusión en parafina, refiere una mención aparte, ya que un problema frecuente tanto en microscopia óptica, electrónica o de fluorescencia es la necesidad de evitar la degeneración autolítica y conservar la estructura celular. Para ello se recurre a fijadores como el formaldehido, glutaraldehido, B-5 (Zenker-Formol) que evitan la aoutolisis y putrefacción derivada de la muerte celular y tratan de conservar la arquitectura y composición tisular conforme se conservaba el organismo in vivo. En este caso, el fijador que vamos a usar es formol o formaldehido al 10%, ya que otros como el B-5 dificultan el éxito tanto las técnicas de PCR como de FISH. Introducción 41 Desde el punto de vista químico, el formaldehido en disolución acuosa se hidrata a radical metilenglicol. Esta sustancia tiende a formar enlaces con todos los grupos químicos, excepto con los de carácter ácido. Por este motivo tras la rotura de los puentes de hidrógeno intramoleculares forma puentes metílicos entre las moléculas proteicas adyacentes, de forma que los surgidos entre los grupos amino, imino, imido, guanidil, hidroxilo, carboxilo y sulfhidrilo son reversibles. Por el contrario, los que se forman entre aminoácidos aromáticos, como la tirosina, son indelebles. Estos puentes que detienen la degradación biológica y hacen que las células acepten mejor la tinción117, pero dificultan la accesibilidad de la sonda para unirse al ADN en el caso del FISH , o los cebadores en el caso de la PCR118. Desde el punto de vista de la fijación, los artefactos más notables son desgarros y retracción que ocurre entre las diferentes partes del tejido al someterlo a la acción de un agente fijador. Por lo común estos cambios se relacionan sobre todo con la distinta proporción de agua que albergan los tejidos, y resultan potenciados por las notables diferencias que existen entre la presión osmótica del fijador y de los tejidos119. El tiempo de fijación en formaldehído no debe superar las 24h si queremos disponer de un ADN celular en buenas condiciones para técnicas de biología molecular. La inclusión en parafina es preferible realizarla con deshidratantes y líquidos intermediarios donde el punto crucial es la conservación de la temperatura por debajo del límite de 60ºC, ya que elevaciones incluso transitorias, provocan inactivación génica. 1.3.2.1. Técnica de PCR. Es una técnica molecular desarrollada por Mullis en 1983, mediante la cual podemos obtener copias in vitro de un fragmento de ADN o ARN de forma rápida y económica. En realidad lo que hace esta técnica es reproducir en un tubo de ensayo el fenómeno natural de replicación del ADN aunque en condiciones definidas para que tan sólo una precisa región del ADN sea duplicada por la enzima ADN polimerasa. Esta región es acotada por dos oligonuleotidos sintéticos, cebadores, que se aparean con las hebras monocatenarias de ADN una vez que la configuración de doble cadena se ha desnaturalizado por acción del calor. En presencia de abundantes deoxinucleótidos Introducción 48 clonado de las regiones cromosómicas que queramos examinar126 o mediante PCR y RTPCR), y reciben el nombre de sondas convencionales; si se desarrollan por medio de una síntesis química de nucleótidos se denominan sondas sintéticas. Las sondas convencionales, también llamadas sondas genómicas, comprenden: • Sondas de ADN de doble hebra: se forman a partir de fragmentos de ADN clonados o por PCR. Su longitud es variable; de 100 pb a cientos de Kb. Tienen el inconveniente que precisan desnaturalización antes de la hibridación. • Sondas de ARN o ribosondas: Sondas sintetizadas a partir de la transcripción de un fragmento de ADN previamente clonado. Son muy sensibles. Las sondas sintéticas son en general más cortas que las anteriores y hay los siguientes tipos: • Oligonucleótidos u oligos: sondas cortas de ADN monocatenario (15-30 pb). Su sensibilidad es menor debido al menor número de moléculas marcadas que pueden incorporar. • Sondas PNA (peptide nucleic acid): Análogo sintético de un oligonucleótido, en el cual el esqueleto de las pentosas se reemplaza por una cadena peptídica, sobre la que se insertan los residuos de nucleósidos. Las sondas de PNA presentan mayor especificidad que las de ADN. En general el estudio de las neoplasias se emplea diferentes sondas sintéticas PNA que según a la región del cromosoma que se unan distinguimos: 1. Sondas centroméricas. 2. Sondas de pintado cromosómico. 3. Sondas de locus específico. 1. Las sondas centroméricas: están formadas por secuencias repetitivas de ADN e hibridan en la región centromérica del cromosoma. Éstas, permiten detectar alteraciones cromosómicas de tipo numérico y valorar la ausencia o presencia de Introducción 49 alteraciones numéricas (monosomías, trisomías) tanto de núcleos metafásicos como interfásicos, sin la necesidad de tener células en división. 2. Las sondas de pintado cromosómico: están formadas por una batería de sondas que en su conjunto hibridan con todo el cromosoma. Permiten visualizar alteraciones citogenéticas tanto numéricas como estructurales, pero sólo lo hacen sobre metafases. Confirman de forma inequívoca cariotipos con translocaciones complejas o con cromosomas marcadores, esta técnica es de gran utilidad cuando los cromosomas son de mala calidad y la citogenética convencional, por si sola no puede resolver el cariotipo. 3. Sondas de locus específico (LSI): se conocen también con el nombre de sondas de secuencia única, hibridan con el ADN de una región genómica concreta, correspondiente a un gen o una banda cromosómica. Con ellas es posible detectar alteraciones numéricas y estructurales tanto en metafase como en interfase. Estas sondas son de gran utilidad para detectar alteraciones cromosómicas difíciles de identificar en las técnicas de bandeo convencional, como translocaciones crípticas o microdelecciones. Según la estrategia empleada para la detección de translocaciones con sondas de locus específico se distinguen dos tipos de sondas: IIIA: Sondas de fusión o de colocalización. IIIB: Sondas de separación, “split” o “Break-Apart”. IIIA: Sondas de fusión o colocalización: se basan en el empleo de una sonda específica para cada uno de los loci involucrados en la translocación, de tal manera que presentan dos fluorocromos, uno denominado Spectrum Orange que tiene un espectro de absorción de 559-560nm y emite a 588nm, es lo que vemos como color rojo, en un determinado par cromosómico, y el otro es Spectrum Green con un espectro de absorción a 497-509nm y emite a 538-524nm, es lo que vemos como color verde, en un par cromosómico distinto. La presencia de la translocación producirá una yuxtaposición de señales (roja y verde juntas o color amarillo si hay una gran superposición). Existen varios tipos: Introducción 50 3.A.a. Sondas Dual Color dual fusion. 3.A.b. Sondas Dual-Color Extra-Signal (ES). 3.A.c. Sondas Dual-Color Single Fusion. 3.A.a. Sondas “Dual color dual fusion”. Son las más utilizadas en el estudio de translocaciones en linfomas. Se trata de una mezcla de dos sondas para los dos genes implicados en la translocación, cada una de ellas marcadas con un fluorocromo distinto y diseñadas de tal modo que ambas se extienden a ambos lados del punto de rotura, de tal manera que veremos en un color (rojo) un determinado par cromosómico y en otro color distinto (verde) el cromosoma recíproco. El diseño de estas sondas disminuye el límite de detección de la técnica, al obviar resultados falsos positivos por colocalización espacial de la señal (Fig13). Con estas sondas, si la célula presenta un patrón normal veremos 2 señales rojas y dos señales verdes. Cuando se produce la rotura y la translocación los fragmentos implicados se intercambian, apareciendo señales de fusión en ambos derivativos. Los núcleos con translocación equilibrada presentarán una señal roja (cromosoma A normal), una señal verde (cromosoma B normal) y dos señales de fusión correspondientes a los dos derivativos (roja y verde juntas o color amarillo si hay una gran superposición) (Fig 14). Fig 13. (A) Célula con sondas dual fusion normal (B) Célula con sondas dual fusion translocada Introducción 51 Fig 14. Representación esquemática de cómo hibridan las sondas dual color dual fusion con su secuencia blanco. El primer esquema se corresponde con el patrón de no translocación, y el segundo con el patrón translocado. 3.A.b. Sondas Dual-Color Extra-Signal (ES): Al igual que la anterior se trata de una mezcla de dos sondas para los dos genes implicados en la translocación, cada una de ellas marcadas un fluorocromo diferente. Pero en este caso están diseñadas de tal modo que una de ellas (la que se ve como una señal roja) se extiende a ambos lados del punto de rotura, mientras que la otra sonda (la verde) finaliza cerca del punto de rotura, sin atravesarlo. Cuando se produce la rotura y la translocación, los fragmentos implicados se intercambian y aparece una señal de fusión (der. B) más una señal extra roja (der. A) (Fig 15). El patrón de normalidad es el mismo que el de las sondas anterior: dos señales rojas y dos señales verdes, correspondientes a las dos copias de cada uno de los loci implicados. Al igual que en el caso anterior puede darse la colocalización de las señales sin translocación. Los núcleos con translocación equilibrada presentarán una señal roja (cromosoma A normal), una señal verde (cromosoma B normal), una señal de fusión correspondiente a uno de los derivativos y una señal roja extra (Fig 15). Introducción 52 Fig 15. Representación esquemática de cómo hibridan las sondas Dual-Color Extra-Signal con su secuencia blanco. El primer esquema se corresponde con el patrón de no translocación, y el segundo con el patrón translocado. 3.A.c. Sondas“Dual-Color Single Fusion”: Se trata de una mezcla de dos sondas para los dos genes implicados en la translocación, cada una de ellas marcadas un fluorocromo diferente. Pero en este caso ambas sondas finalizan cerca del punto de rotura, pero sin atravesarlo. Cuando se produce la rotura y la translocación los fragmentos implicados se intercambian y aparece una señal de fusión (derivativo. B), sin dejar ninguna señal en el otro cromosoma derivativo A (Fig 16). El patrón de normalidad: dos señales rojas y dos señales verdes, correspondientes a las dos copias de cada uno de los loci implicados. Los núcleos con translocación equilibrada presentarán una señal roja (cromosoma A normal), una señal verde (cromosoma B normal) y una señal de fusión correspondiente a uno de los derivativos. El otro cromosoma derivativo no presenta señal ninguna. (Fig 16) Introducción 53 Fig 16. Representación esquemática de cómo hibridan las sondas Dual-Color Single Fusion con su secuencia blanco. El primer esquema se corresponde con el patrón de no translocación, y el segundo con el patrón translocado. 3.B: Las sondas de separación, “Split o Break-Apart”: Estas sondas han sido diseñadas para la detección de translocaciones de loci que pueden reordenarse con diversos cromosomas es decir son muy útiles para el estudio de translocaciones en los que los genes diana presentan múltiples posibles “partners” son muy promiscuos.(Fig18) Van dirigidas contra regiones que flanquean el punto de rotura de modo que una de ellas se extiende desde el punto de rotura hacia el centrómero y la otra desde el punto de rotura hacia el telómero de un mismo gen. En este caso se trata de una mezcla de dos sondas cada una de ellas marcadas con un fluorocromo: uno denominado Texas Red que tiene un espectro de absorción de 595nm y emite a 620nm, es lo que vemos en color rojo, en un segmento del par cromosómico, y el otro es FITIC con un espectro de absorción a 595nm y emite a 620nm, es lo que vemos en color verde, en el otro segmento del mimo par cromosómico. Por tanto, en el patrón de normalidad se ven dos señales yuxtapuestas. Cuando se produce la rotura y la translocación uno de los fragmentos implicados permanece en el Introducción 54 cromosoma derivativo A, mientras que el otro se separa. Así, los núcleos con translocación presentarán una señal roja correspondiente a un derivativo, una señal verde correspondiente al otro derivativo y una señal de fusión correspondiente al cromosoma normal (Fig 17). Fig 18. (A) célula con sondas split normal (B) célula con sondas split translocada Fig 17. Representación esquemática de cómo hibridan las sondas “Split o Break-Apart” con su secuencia blanco. El primer esquema se corresponde con el patrón de no translocación, y el segundo con el patrón translocado. Todas las sondas pueden ser sintetizadas y marcadas fácilmente, con una mezcla de oligonucleótidos frente a diferentes áreas de la secuencia diana para incrementar la sensibilidad. Las sondas de mayor tamaño formarán híbridos más estables permitiendo Introducción 55 detectar casi el 100% de los puntos de rotura. Sin embargo es recomendable para el estudio de las neoplasias el uso de sondas desarrolladas comercialmente que permiten estandarizar el método y poder trabajar de forma homogénea en todos los laboratorios.127 2. Justificación y Objetivos Material y Métodos 64 • Cortes a 4μm para el estudio inmunohistoquímico. Posteriormente se estiran en agua destilada y se recogen en portas silanizados. Desecar las secciones a ± 55ºC toda la noche. • Cortes a 3μm del tejido para estudio de translocaciones mediante la técnica FISH, igualmente las muestras se estiran previamente en agua destilada y se recogen en portas silanizados. Desecar las secciones a ±55ºC toda la noche. • Cortes a 14μm para la extracción de ADN, depositar en tubos eppendorf en condiciones estériles para extracción y posterior estudio de PCR. El tissue array se construyó a partir de 12 bloques independientes de parafina, donde a través de una hematoxilina buscábamos la región tumoral de interés que posteriormente seleccionábamos con MTA- (Manual Tissue Arrayer Beecher Instruments, Sun Prairie, WI, USA) con una aguja de 1.5 mm que luego introducíamos en otro bloque de parafina. Esta misma operación se repetía con todas las muestras, de tal manera que el diseño del bloque parafinado resultante era: 5 muestras puestas consecutivamente en la primera fila, 5 muestras en la segunda fila y dos muestras en la tercera fila. El mismo esquema lo pondríamos por duplicado en las siguientes filas. De modo que integramos en un mismo bloque parafinado 10 muestras tumorales y 2 controles (todo por duplicado). 3.2.2. TÉCNICA DE FISH. Se realizaron cortes a 3μm del tissue array, 1 amígdala reactiva, 2 LBCG, 2 LF. Para la optimización de la técnica de FISH se sometieron las muestras a 5 soluciones de lavado distintas y en todas ellas se probaron diferentes temperaturas: según el siguiente protocolo: Material y Métodos 65 3.2.2.1. Optimización de las soluciones y las temperaturas. EDTA. Protocolo FISH Tiocianato Sódico Protocolo FISH Ác. Citrico Protocolo FISH Citrato Sódico. Protocolo FISH Pretratamiento de DAKO. Protocolo FISH Desparafinación (Xilol)..…………………………………................................2 x 5' Rehidratación Etanol 100º...………………………………………………………………..2 x 3' Etanol 96º…...………………………………………………………………2 x 3' Solución de lavado……………………………………………………………2 x 3' EDTA 1mM Baño María 30´ 80ºC Microondas 10´ 99ºC y 15 TA ó Olla a presión 10´sobre 100ºC NaSCN 1Mm Baño María 30´ 80ºC ó Microondas 10´ 99ºC y 15 TA ó Olla a presión 10´sobre 100ºC Ac CÍtrico 10mM Baño María 30´ 80ºC ó Microondas 10´ 99ºC y 15 TA o Olla a presión 10´sobre 100ºC Citrato Sódico. Baño María 30´ 80ºC o Microondas 10´ 99ºC y 15 TA o Olla a presión 10´sobre 100ºC Pretratamiento de Dako Baño María 30´ 80ºC o Microondas 10´ 99ºC y 15 TA o Olla a presión 10´sobre 100ºC SSC2X→ 2x5´ Vaso con 50 mL con agua destilada +10mL HCL 37% +50 mL pepsina 0.01M SSC2X→ 2x5´ OH 70ºC...........................................................................................................2´ OH 85ºC...........................................................................................................2´ OH 96ºC..........................................................................................................2´ secar TA........................................................................................................10´ Echamos 3 μL Sondas Split DAKO:BCL2 85ºC......................5´ Incubar a 45ºC toda la noche Lavar a 65ºC con stringent wash buffer durante 10´ Lavar 3´en solución de lavado. Deshidratar con etanoles. Echamos 3 μL Sondas Dual fusion VYSIS t(14;18)(q32;q21) 72ºC……………..5´ Incubar a 37ºC las Sondas Dual Fusion toda la noche. Lavados: SSC 0.4X / 0.3% NP-40 73ºC……………..3´ SSC 2X / 0.1% NP-40 TA………………..1´ Dejar secar 10´. Añadir 10μL de DAPI. Almacenar a 4ºC durante 15´ antes de ver la hibridación Tabla 4. Protocolos empleados para la realización de la técnica FISH. Material y Métodos 66 Soluciones de trabajo. • EDTA1mM : Empleamos 50 mL, pH 8. • NaSCN 1M: Empleamos 50 mL de NaSCN 1M. • Ácido Cítrico 10mM: Empleamos 50 mL a pH 6. • Citrato Sódico 1M: Empleamos 50 mL a pH 6. • Pretratamiento de DAKO: Son pretratamientos comerciales que vienen concentrados al 20X, trabajaremos al 1X. • SSC2X: Empleamos 50mL, pH 7 – 7,5. • El uso de HCL 0.2M es recomendado porque puede actuar como agente desproteínizante incrementando la penetración de la sonda. 100 mL A-D + 2 mL HCl 37%. • SSC 0.4X / NP-40 0.3% (pH 7 – 7,5): Empleamos 50mL. Preparamos una disolución para 500 mL, 50 mL de SSC20X en 400mL de agua destilada y añadir 1,5 μl de NP-40, ajusta a pH 7.5. Enrasar a 500 mL con agua destilada. • SSC 2X / NP-40 0.1% (pH 7-7.5): Empleamos 50mL. Disolver para 500 mL, 50 mL de SSC20X en 400mL de agua destilada y añadir 5 μ de NP-40, ajusta a pH 7.5. Enrasar a 500 mL con agua destilada. Material utilizado. • Olla a presión Duromatic Supreme. • Baño María BO2-2 200ºC. • Microondas Whirpool JT359 tiene un sensor que cuando la temperatura baja o sube de lo requerido, la vuelve a ajustar. • Hybridizer Dakocytomation: desnaturaliza el ADN e incuba toda la noche. • Microscopio (Olympus: DP70, Tokio, Japon) para visualizar las muestras resultantes de la hibridación: equipado con un filtro para el DAPI y un filtro doble para Material y Métodos 67 Texa-Red/FITIC espectro verde y naranja. Observamos las muestras con el objetivo de inmersión 100X. Con este microscopio trabajaremos tanto para ver y hacer fotos de FISH con la fluorescencia, como para ver con luz normal la inmunohistoquímica. Las fotos fueron realizadas con los programas DP-manager que visualiza la imagen, DP-controller desde donde hacemos las fotos y ajustamos el color, y el Adobe PhotoShop CS2 para fusionar los núcleos teñidos con el DAPI con la foto de los núcleos con las señales de hibridación. 3.2.2.2. Optimización de los tiempos de digestión. Para monitorizar la digestión trabajamos con 5 LBCG. De cada una de las muestras se hicieron 4 cortes seriados a 3 micras. Realizamos los pasos correspondientes al FISH tal y como aparece en la tabla 4, con el pretratamiento de NaSCN. En el paso de la digestión enzimática, dejamos el primer corte de una misma preparación 5 min digiriéndolo en pepsina, el siguiente corte de la misma preparación estaba los 5 min (como el primero) y a mayores 3-5 minutos más en pepsina y así sucesivamente para las 4 preparaciones del mismo tejido. Al parar la reacción en SSC2X, se deja secar la muestra, inmediatamente después se observa su morfología al microscopio. Después se continúa con el proceso de hibridación. Para realizar el estudio utilizamos las Sondas LSI Dual fusion de Vysis, para las translocaciones: t(14;18)(q32;q21), t(11;14)(q13;q32), t(8;14)(q24;q32). Posteriormente se realizó mediante este método el control de la digestión mediante la forma de helecho en un total de 36 casos correspondientes a: • 8 LF correspondientes con dos bloques endoscópicos, tres quirúrgicos y tres autopsias. • 4 LCM correspondientes con dos bloques endoscópico, dos quirúrgicos. Material y Métodos 68 • 9 LBCG correspondientes a tres bloques endoscópico, tres quirúrgicos, tres autopsias. • 9 LB correspondientes a tres bloques endoscópico, tres quirúrgico, tres autopsias. • 6 amígdalas reactivas: correspondientes a tres bloques quirúrgicos y 3 autopsias. Proteasas utilizadas: Pepsina: Una solución stock con 5mL de glicerol, 5mL de agua y 0´1 gr de pepsina. Preparamos 10 mL de HCl al 0,01N y añadimos 50μl de la solución stock. Nuestra solución final de trabajo es pepsina sigma 0.5 mg/mL en solución de HCl 0.01N. También se probó a digerir las muestras con otra pepsina comercial de Dako cuya concentración desconocemos, pero las muestras adquirían la forma de helecho antes. Otra proteasa con la que probamos fue Proteínasa K: Solución de Trabajo de Proteínasa K (50 μ/mL): Proteínasa K liofilizada 5 mg, añadimos 500 μL agua destilada. Cogemos 500 μL Solución Stock de Proteínasa K y ponemos en 10 mL TE (Tris 10mM, EDTA 1 mM, pH 8). Material y Métodos 69 3.2.2.3. Comparación entre sondas: colocalización o separación. La eficacia de las sondas de “split” (separación) o “dual fusion” (colocalización) fueron probadas en 4 LCM, 4 LF, 4LBCG y 4LB. Algunos de estos tejidos se corresponden con muestras antiguas donde la realización de la técnica FISH presenta mayores complicaciones. Sondas de “Dual Fusion” de la casa comercial VYSIS: • La sonda utilizada que detecta la t(14;18)(q32;q21) es la LSI IGH/BCL2 dual fusion (Fig 20 y 21) Fig 20. Sonda que hibridará con el cromosoma 14 para el locus de IGH abarcando una región de 1´5 Mb, que incluye casi el locus entero para IGH y 300 Kb más allá del extremo final 3´. Su espectro se verá en color verde. Esta será la empleada tanto para el estudio de la t(14;18)(q32;q21)como de la t(8;14)(q24; q32). Fig 21. Sonda para el cromosoma 18 para el locus de BCL2 abarca una región de 750Kb que va incluir la secuencia entera del gen BCL2 y 250 Kb más del extremo distal y proximal de este gen. Su espectro se verá en color rojo. Material y Métodos 70 • La sonda que detectan la t(8;14)(q24;q32) es la LSI IGH/MYC,CEP8 tricolor dual fusion. (Fig 22) Fig 22. La sonda roja se va unir al cromosoma 8q24 en una región de 821Kb y emitiendo un espectro rojo y también se unirá al centrómero emitiendo un espectro aqua que queda enmascarado por el DAPI. La sonda que detecta el cromosoma 14 es la misma que la de la Fig 17. • La sonda que detecta la t(11;14)(q13;q32) es la LSI IGH/CCND1 dual fusion (Fig 23). Fig 23. Las sondas marcarán en verde el locus de IGH flanqueado por dos regiones de 450 Kb y en rojo el gen de la CCND1 y a lo largo de 350Kb. Material y Métodos 71 Preparación de las Sondas de Dual Fusion de VYSIS: 7μL LSI/WCP Hybridization Buffer + 1μL de sonda.+ 2μL de agua ultrapura Centrifugar la mix 3´´-VortexCentrifugar 3´´. La interpretación para un núcleo de células normales será: dos señales rojas y dos señales verdes separadas. Para una célula con la translocación veremos una señal roja, una verde separadas y dos señales fusionadas. A veces puede que en lugar de ver una única señal roja o verde aislada aparezcan tres o cuatro señales procedentes de una única señal que se verán en un área muy cercana esto es debido al grado de condensación de los cromosomas. No estaríamos viendo una amplificación para que esto sucediera tendríamos que ver tres o cuatro señales en la mayoría de las células. Adicionalmente puede que falte una señal roja en todas o casi todas las células sería el caso de una deleción. Sondas de Split casa comercial Dako: Sondas de PNA que reconocen un único locus: • BCL2 FISH ADN probe split DAKO: reconoce cualquier translocación en la que este involucrada el locus de BCL2.(Fig 24) Fig 24. La sonda se va unir hebra arriba y hebra abajo entre los 3 exones del gen, quedando unida la sonda verde a un segmento de 641 Kb hacia la región telomérica, y la roja sobre un segmento de 375Kb hacia la región centromérica. Material y Métodos 72 • CCND1 FISH ADN probe split DAKO: está indicada para translocaciones donde participa el locus de BCL1. (Fig 25) Fig 25. La sonda se va unir hebra arriba y hebra abajo entre los 5 exones del gen quedando unida la sonda verde a un segmento de 644 Kb hacia la región telomérica, y la roja sobre un segmento de 163Kb hacia la región centromérica. • MYC FISH ADN probe split DAKO: está indicada para translocaciones donde participa el locus MYC. (Fig 26) Fig 26. La sonda se va unir hebra arriba y hebra abajo a partir de los 3 exones que originan el gen, quedando unida la sonda roja a un segmento de 418Kb hacia la región telomérica, y la verde sobre un segmento de 652Kb hacia la región centromérica. • BCL6 MYC FISH ADN probe split DAKO: está indicada para translocaciones donde participa el locus BCL6.(Fig 27) Fig 27. La sonda se va unir hebra arriba y hebra abajo a partir de los 10 exones que originan el gen, quedando unida la sonda roja a un segmento de 352Kb hacia la región telomérica, y la verde sobre un segmento de 573Kb hacia la región centromérica. Material y Métodos 73 3.2.2.4. Niveles de corte. Para cada una de las sondas (fusión y colocalización) establecimos los niveles de corte,”cut off” estudiando 15 amígdalas reactivas. Así comparábamos split DAKO BCL2 frente a Dual Fusion de Vysis IGH/BCL2, split DAKO CCND1 frente a Dual Fusion de Vysis IGH/CCND1; y split C-MCY frente Vysis IGH/MCY en las 15 amígdalas indistintamente. Para cada una de las muestras analizadas se contaron 100 núcleos, anotando las separaciones encontradas para las sondas de separación, y las fusiones encontradas aunque sólo fuera una para las sondas de dual fusion. Los resultados los analizamos con el programa estadístico SPSS, según la fórmula estadística descrita por Haralambieva37. 3.2.2.5. Aplicación de la técnica de FISH. Analizamos 59 LF, 30 LCM, 64 LBCG, para estudiar las translocaciones mediante la técnica de FISH. Utilizando para el estudio LF las sondas Vysis que detecta la t(14;18)(q32;q21) LSI/IGH/BCL2, las sonda de BCL6 split DAKO. Para el estudio de LCM la sonda de Vysis para t(11;14)(q13;q32) LSI/IGH/CCND1 y las sondas BCL2, BCL6, MYC sondas split DAKO en los LBCG. 3.2.3 TÉCNICA DE PCR. Se procedió a la extracción de ADN de muestras parafinadas según el siguiente protocolo: KIT PUREGENE; Gentra Systems. Poner 5-10mg de tejido en tubo de 1,5 ml. Cortes a 14 micras. Desparafinación. 1. 500 μl de xilol. Incubar 5 min. con agitación suave. 2. Centrifugar a 24ºC-14.000 rpm → 3 min → Ovillo → retirar xilol. 3. Repetir 2 veces. (3 lavados). 4. 500 μl de etanol (100%). Incubar 5 min. con agitación suave. Resultados 81 4.1. OPTIMIZACIÓN DE LA TÉCNICA FISH: 4.1.1. SOLUCIONES DE LAVADOS Y TEMPERATURAS La temperatura es condicionante en la técnica de FISH. Las señales de hibridación más nítidas se obtienen a una temperatura de 99ºC durante 10 min seguido de enfriamiento durante 15 min a T.A. (Fig 28). El tipo de pretratamiento no influye en mejorar el rendimiento de la técnica de FISH, se obtienen señales de hibridación interpretables con todas las soluciones de lavado (Ác Cítrico, Citrato Sódico, NaSCN, EDTA, la solución de pretratamiento comercial DAKO). Aunque podemos decir que las señales mejor definidas las obtenemos con la solución comercial. (Tabla 6) (Fig 28) El tipo de pretratamiento no es el causante de que exista un mayor desprendimiento de los tejidos en el tissue array, ya que éste no se produce durante el paso de las soluciones de lavado, sino en el paso previo de la rehidratación con alcoholes, por lo que es un problema de cómo el tejido se fija al cristal, y no de la solución de lavado empleada. 4.1.2. OPTIMIZACIÓN DE LOS TIEMPOS DE DIGESTIÓN. Tiempos de digestión cortos o excesivos van a enmascarar la presencia de la señal. (Fig 29 y 30). La mejor señal de hibridación se corresponde siempre con el tiempo de digestión en el que el tejido muestra la formación de una especie de “helecho” al microscopio óptico, independientemente de la sonda empleada (Fig 30). El control de la digestión mediante la forma de helecho es la forma más adecuada para monitorizar la digestión. Ya que los tiempos de digestión van ser siempre muy variables de unas muestras a otras dependiendo del tiempo de fijación y de la concentración de enzima que estemos utilizando. Como regla general podemos decir que a igual concentración enzimática, las autopsias necesitan un mayor tiempo que las muestras quirúrgicas y estas que las endoscópicas (Tabla 7). Resultados 82 4.1.3. ELECCIÓN DE LA SONDA ADECUADA. Para poder determinar un diagnóstico acertado es necesario buscar la interpretación visual más sencilla. Tanto las sondas de separación como las de colocalización ofrecen esta oportunidad en las 16 muestras analizadas, pero cuando existe mucha autofluorescencia de fondo bien por la antigüedad de la muestra o por el propio tejido, es mucho más gráfico tratar de localizar señales aisladas (muestras positivas con sondas de split) que buscar señales fusionadas (sonda dual fusion) que podrían proceder de la interacción de la señal de la sonda con la autofluorescencia de fondo. En la Fig 31 A analizamos una muestra con mucha autofluorescencia de fondo, donde la señal positiva para LSI/IGH/BCL2 “Sondas Dual Fusion” es difícil de interpretar, no se puede decir si hay señales de fusión ni dar un diagnóstico. En la Fig 31.B analizamos la misma muestra pero con las Sondas “Split Dako”, aunque la morfología celular no está definida, y existe mucha inespecificidad de fondo podemos interpretar señales, se observan señales separadas que se pueden interpretar como positivas para la translocación. Las sondas de “split” ofrecen un patrón de interpretación mucho más claro. 4.1.4. NIVELES DE CORTE. El resultado de analizar 15 amígdalas reactivas contando 100 núcleos y anotando las señales que encontramos positivas, se muestra en la Tabla 8. Se calcula la media de sus frecuencias positivas más 3 veces la desviación estándar, según Haralambieva37. Resultado: 8.533+11.1599 = 19.7% de falsos positivos para las sondas de dual fusion. Resultado: 3,800+6.23127 = 6.11% de falsos positivos para las sondas de split. 4.2. LINFOMA FOLICULAR: Estudiamos 59 LF de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina. Correspondientes con 26 LF de grado I, 15 LF de grado II, 6 LF de grado IIIa, 9 LF de grado IIIb, 2 LF in situ y 1 LF en anillo de sello. Resultados 83 Los resultados obtenidos se reflejan en la Tabla 9 y se describen a continuación. (Fig 32) 4.2.1. DETECCIÓN DEL DÍMERO BCL2-IGH Y REORDENAMIENTO DE BCL6 MEDIANTE FISH. El estudio de la t(14;18)(q32;q21) mediante técnicas de FISH con sondas dual fusion resulta positivo en 39/59 LF analizados. Es decir el 66,1% de las muestras son positivas para el dímero BCL2-IGH. (Tabla 9). El estudio del reordenamiento de BCL6 mediante técnicas de FISH con sondas split resulta positivo en 7/59 LF analizados. Es decir el 11,9% de muestras son positivas para el reordenamiento de BCL6. (Tabla 9). 4.2.2. RELACIÓN ENTRE LA t(14;18)(q32;q21), REORDENAMIENTO DE BCL6 Y GRADO HISTOLÓGICO EN LF. Estudiamos 26 LF grado I. La incidencia para la presencia de la t(14;18)(q32;q21) es del 73% (19/26 muestras analizadas). Para el estudio del reordenamiento del gen de BCL6 sólo hay una única muestra positiva (1/26), esta misma muestra también mostraba positividad para el reordenamiento de BCL2 es lo que se denomina una translocación de double-hit (Tabla 9). Estudiamos 15 LF de grado II. La incidencia para la presencia del dímero IGHBCL2 es del 73.3% (11/15 muestras analizadas). Para el reordenamiento del gen de BCL6 sólo hay una única muestra positiva (1/15). Al igual que ocurre con la muestra del LFI esta muestra también es positiva para BCL2, se trata de una translocación de double-hit (Tabla 9). Estudiamos 6 LF grado IIIa. La incidencia para la presencia de la t(14;18) (q32;q21) es del 16,6% (1/5 muestras analizadas). La incidencia para el reordenamiento de BCL6 fue del 40%(2/5). Las 2 muestras positivas para BCL6 resultaron negativas para la translocación que implica al gen de BCL2 (Tabla 9). Estudiamos 9 LF grado IIIb. La incidencia para la presencia del dímero IGHBCL2) es del 55,5% (5/9 muestras analizadas). La incidencia para el reordenamiento de Resultados 84 BCL6 fue del 33%(3/9), una de las muestras también resulta ser positiva para el reordenamiento de BCL2 (double-hit) y las otras 2 son negativas para éste reordenamiento (Tabla 9). Se estudian dos variantes del linfoma folicular, dos LF in situ y uno en anillo de sello. Las 3 muestras resultaron positivas para la alteración t(14;18)(q32;q21) y negativas para el reordenamiento de BCL6 (Tabla 9). 4.2.3. ESTUDIO COMPARATIVO FISH-PCR PARA DETECCIÓN DE t(14;18)(q32;q21). En el estudio de la t(14;18)(q32;q21) mediante técnicas de FISH con sondas dual fusion pudimos valorar 59/59 casos analizados (100%), y son positivas para este reordenamiento 39/59 casos. Mientras que para técnicas de PCR pudimos valorar 57/59 casos analizados (96,6%), y son positivas para el dímero JH-MBR 24/57 casos. En las muestras que son negativas para JH-MBR (33 casos) se analizó otro punto de rotura, la región mcr-JH, y encontramos positividad en 4/33 casos. Es decir que el total de muestras positivas obtenidas para el dímero de IGH-BCL2 por técnicas de PCR es 28/57 casos analizados (Tabla 10). Si comparamos las muestras positivas para la t(14;18)(q32;q21) obtenidas por FISH y por PCR, obtenemos tal y como se muestra en la Tabla 10, un 26.3% más de muestras positivas mediante la técnica de FISH (hay que tener en cuenta que hay 2 muestras que no se pueden valorar por PCR por lo que no las comparamos). Esto demuestra que la técnica de FISH es más sensible para detectar la presencia de t(14;18)(q32;q21) frente a la técnica de PCR. 4.2.4. COMPARACIÓN ENTRE LAS TRANSLOCACIONES Y EXPRESIÓN PROTEICA DE BCL2 Y BCL6. En el estudio de la expresión de BCL2 por métodos IHQ hemos encontrado positividad en el 89.8% de los casos (53/59), una positividad débil en el 8.5% (5/59) de los casos y negatividad en un 1.7% (1/59) (Tabla 11). Resultados 85 La translocación positiva y la expresión inmunohistoquímica positiva están presentes en 38 muestras. Mientras que hay 15/53(22,6%) casos que muestran expresión proteica por técnicas IHQ pero no se detecta presencia de la translocación por técnicas de FISH (Tabla 11). En los casos diagnosticados con expresión de positividad débil, 4 muestras se corresponden con translocación negativa y 1 muestra con translocación positiva (Tabla 11). En el único caso donde no hay expresión de BCL2 tampoco se encuentra la translocación. 4.3. LINFOMA DE CÉLULAS DEL MANTO. 4.3.1. DETECCIÓN DEL DÍMERO CCND1-IGH MEDIANTE FISH. Estudiamos 30 casos diagnosticados como LCM para la t(11;14)(q13;q32) con sondas dual fusion. Los 30 muestras estudiados de LCM resultan positivas para la translocación, es decir 100% de positividad. Los resultados se reflejan en la Tabla 12. Fig 33. 4.3.2. ESTUDIO COMPARATIVO FISH-PCR PARA DETECCIÓN DE t(11;14)(q13;q32). En el estudio de la t(11;14)(q13;q32) mediante técnicas FISH con sondas dual fusion pudimos valorar 30/30 casos analizados (100%), resultaron positivos 30/30 casos de LCM. (Tabla 12). Mientras que para técnicas de PCR pudimos valorar 29/30 casos analizados, y obtuvimos resultados positivos para el dímero JH-MTC en 18/29 casos. En las muestras negativas para JH-MTC (11casos) se valora la región JH-mTCs donde no se encontró ninguna muestra positiva. (Tabla 13). Lo que viene a significar que mientras por técnicas FISH obtuvimos positividad para un 100% de los casos, sólo un 60% resultaron positivos mediante PCR (Tabla 13). Con la técnica de FISH obtenemos un 36,7% más de resultados positivos (hay que tener en cuenta que hay 1 muestra que no se puede valorar por PCR) (Tabla 13), lo que Resultados 86 convierte al FISH en una técnica más sensible para detectar la presencia de la translocación t(11;14)(q13;q32) frente a la técnica de PCR. 4.3.3. COMPARACIÓN ENTRE LA TRANSLOCACIÓN Y EXPRESIÓN PROTEICA DE CCND1 En el estudio de la expresión de CCND1 encontramos positividad en 29/30 casos (96.7%), y negatividad 1/3 (3,3%) casos. Hay un caso que fue negativo por IHQ y sin embargo por FISH resultó tener el reordenamiento de la CCND1. (Tabla 12). Mientras que por FISH obtuvimos un 100% (30/30) de reordenamientos para la CCND1, la expresión mediante técnicas IHQ es del 96,7% (29/30), lo que implica que por ambas técnicas se obtienen resultados similares. 4.4. LINFOMA B DIFUSO DE CÉLULAS GRANDES: 4.4.1. DETECCIÓN DE LOS REORDENAMIENTOS DE BCL2, BCL6 Y MYC. Los resultados de los 64 pacientes diagnosticados como LBCG, se corresponden a 53 LBCG de Novo, 6 LBCG transformados de LF y 5 LBCG transformados de LNH, vienen reflejados en la Tabla 14 (Fig 34). Se estudiaron las siguientes alteraciones estructurales: El estudio del reordenamiento de BLC2 mediante sondas split es positivo en 13/64 (20.3%) LBCG analizados. De las muestras positivas 6 muestras se corresponden con los 6 LBCG transformados de LF 6/6 (100%) y las otras 7 proceden de los 53 LBCG de Novo 7/53 (13,2%)(Tabla 14). El estudio del reordenamiento de BLC6 mediante sondas split es positivo en 15/64 (23.4%) LBCG analizados. De los resultados positivos, 2 muestras se corresponden con LBCG transformados de LNH 2/5 (40%) y 13 muestras lo hacen con LBCG de Novo 13/53 (24,5%) (Tabla 14). Resultados 87 El estudio del reordenamiento de MYC mediante sondas split es positivo en 5/64 (7.8%) LBCG analizados. De los resultados positivos 1 muestra se corresponde con LBCG transformado de un LF que a su vez se presenta con el reordenamiento de BCL2, translocación de double-hit. Los otros 4 reordenamientos positivos para MCY se corresponden con LBCG de novo (4/53), una de estás muestras también presentaba una doble translocación con el reordenamiento de BCL6 (Tabla 14). En conclusión, 2/5 (40%) casos analizados para el reordenamiento de MYC se manifestaban con otra alteración, lo que indica que es frecuente que el reordenamiento de MYC ocurra como una lesión secundaria. Resumiendo los datos de nuestro estudio podemos afirmar que alguno de estos tres reordenamientos están identificados en el 46,9% (39/54) de los LBCG de nuestra serie (Tabla 14). De las muestras positivas un 43,3% estaban representadas por el reordenamiento de BCL2, un 50% por el reordenamientos de BCL6, y un 16,6% se correspondían con el reordenamiento de MYC. El reordenamiento del BCL6, BCL2 son los más comunes en LBCG. 4.4.2. COMPARACIÓN ENTRE EL REORDENAMIENTO Y EXPRESIÓN PROTEICA DE BCL2 Y BCL6. En el estudio de la expresión de BCL2 por métodos IHQ encontramos positividad en el 83.8% (52/62) de los casos, negatividad en el 16,2% (9/62) y 3/64 (4,7%) muestras que no pudieron ser valoradas por técnicas IHQ. (Tabla 15). Hay 12 casos que muestran translocación de BCL2 positiva y presentan expresión proteica. Mientras que hay 40/52 (76,9%) casos que muestran expresión proteica por técnicas IHQ pero no se detecta la translocación por técnicas de FISH (Tabla 15). Hay un caso que es negativo por IHQ y sin embargo por FISH resulta tener el reordenamiento de BCL2. En el estudio de la expresión de BCL6 por métodos IHQ encontramos positividad en 44/59 (81,4%) y positividad focal en 7/59 (11.8%), negatividad en 8/59 (13,5%) y hay 5/64 (7,8%) muestras que no pueden ser valoradas. (Tabla 16). Resultados 88 Encontramos 11 casos que muestran expresión proteica y translocación positiva. Mientras que hay 33 casos que muestran expresión de BCL6 por técnicas IHQ pero no se detecta la translocación por técnicas FISH (Tabla 16). En cuanto a las muestras diagnosticadas con positividad focal 5 de ellas no presentan el reordenamiento de BCL6 por técnicas de FISH y dos muestras sí la presentan. Si consideramos como positivas las muestras focales podemos afirmar que por técnicas IHQ encontramos 74,5% (38/51) de muestras con expresión de BCL6 y reordenamiento negativo de BCL6 por FISH. 4.4.3 IMPLICACIÓN DE LAS ALTERACIONES GENÉTICAS EN EL PRONÓSTICO Y LA SUPERVIVENCIA. Comparamos el reordenamiento de BCL2, BCL6 y MYC con los siguientes parámetros: Sexo, edad, localización, estadío, ECOG, LDH, número de localizaciones ganglionares, número de localizaciones extraganglionares, infiltración de médula ósea, IPI, y respuesta al tratamiento. No hay ninguna asociación estadísticamente significativa entre estos parámetros y los reordenamientos, por lo que no existe una implicación del reordenamiento de BCL2, BCL6 ó MYC y el impacto pronóstico. Tan sólo hay una asociación estadísticamente significativa (p<0,005) entre el reordenamiento de BCL2 y el estadío ( Tablas 17, 20, 23). Supervivencia La prueba de igualdad de distribuciones de supervivencia mediante el estadístico de contraste Log Rank (Manrel-Cox) muestran los siguientes niveles de significación: • Para el reordenamiento de BCL2, BCL6 y MYC y supervivencia: p=0,557, p= 0,581, p= 0,387, respectivamente. • Para los 3 reordenamientos y la supervivencia p= 0,518. • Para la sobreexpresión de BCL2 y BCL6 y supervivencia p= 0,762 y p= 0,037 respectivamente. No hay diferencias estadísticamente significativas entre los reordenamientos de BCL2, BCL6 y MYC y el tiempo libre de supervivencia. (Tabla 18, Tabla 21, Tabla 24). Resultados 89 No hay diferencias estadísticamente significativas entre el conjunto de los 3 reordenamientos y el tiempo libre de supervivencia. (Tabla 25). No hay diferencias estadísticamente significativas entre la sobreexpresión de BCL2, y el tiempo libre de supervivencia (Tabla 19). Si existen diferencias estadísticamente significativas entre la sobreexpresión de BCL6 y el tiempo de supervivencia (p<0,005). Las formas que presentaban sobreexpresión de BCL6 tienen una supervivencia global mayor. Resultados 96 Fig 34. A: Imagen histológica de LBCG, técnica (H-E 40X). B: IHQ de LBCG anticuerpo de BCL2(40x). C: IHQ de LBCG anticuerpo de BCL6 (20X). D: FISH de LBCG con sondas split, translocación positiva para BCL2. E: FISH de LBCG con sondas split, translocación negativa para BCL2 (100X). F: FISH de LBCG con sondas split, translocación positiva para BCL6(100X). G: FISH de LBCG con sondas split, translocación amplificación de MYC(100X). H: FISH de LBCG con sondas split, translocación positiva para MYC(100X). Resultados 97 4. 6. TABLAS. Pretratamiento DAKO Citrato sódico Ac cítrico NaSCN EDTA Dual fusion +++ +++ ++ ++ ++ Split ++++ ++ +++ ++ ++ Tabla 6. Éxito en la técnica de FISH con diferentes pretratamientos a 99º 10 min y 15 min TA. Tabla 7. Máximos y mínimos de los tiempos digestión en distintas muestras hasta encontrar la forma de helecho. Sondas dual fusion LSI VYSIS Sondas Split DAKO Señales positivas frecuencias Señales positivas frecuencias 3 2 1 2 5 1 2 3 6 2 3 3 7 2 4 1 8 1 5 2 9 1 6 2 10 1 11 1 12 1 13 2 15 1 Tabla 8. Frecuencias de las señales positivas contabilizadas en 100 núcleos de 15 amígdalas reactivas. autopsia quirúrgica endoscópica LF 35´ 40´ 14´ 33´ 7´ 12´ mínimo máximo LCM - - 20´ 25´ 7´ 10´ mínimo máximo LB 40´ 70´ 20´ 35´ 10´ 12´ mínimo máximo LBCG 70´ 120´ 12´ 35´ 10´ 15´ mínimo máximo amígdala 40´ 60´ 15´ 20´ - - mínimo máximo Resultados 98 Nº año edad sexo tejido Grado IHQ CD10 IHQ BCL2 FISH BCL2 MBR mcr FISH BCL6 1 1996 61 V GL I P P P P ND N 2 1996 60 H GL II P P P P ND N 3 1996 69 H GL I P P P P ND N 4 1996 96 H GL IIIa P P P P ND N 5 1996 54 V GL I P P P P ND N 6 1997 66 H GL I P P P P ND N 7 1997 57 H GL IIIb P P P P ND N 8 2000 76 V GL I P P P N N N 9 2001 91 V GL II P débil P N N N 10 2001 43 H GL I P P P P ND N 11 2001 76 H GL II P P P P ND N 12 2001 53 H GL II P P P N P N 13 2002 81 H GL I P P P N N N 14 2002 58 H GL II N P N N N N 15 2002 47 V GL IIIb P P P P ND N 16 2002 88 V GL II P P P N N N 17 2003 79 V GL I P P P N N N 18 2003 66 H GL IIIb P P P P ND N 19 2003 53 V GL II P P P N P P 20 2003 69 V GL I P P P P ND N 21 2003 82 V GL I débil P N N N N 22 2003 50 V GL I P P P N N N 23 2003 84 H glúteo IIIb P P N N N P 24 2003 56 V GL I P P P N P N 25 2003 50 H GL I P P N N N N 26 2003 77 H GL II P débil N N P N 27 2004 62 H GL IIIa P P N N N N 28 2004 33 V GL IIIb P P N N N N 29 2004 55 V GL IIIb P P N N N N 30 2004 68 V GL II P P P P ND N 31 2004 73 V GL I P P P N N N 32 2004 73 V GL I P P P N N N 33 2004 60 H GL I débil N N N N 34 2005 61 V GL I P P P N P P 35 2005 36 H GL II P P N N N N 36 2005 80 H GL LF anillo sello P P P P ND N 37 2006 44 H GL I P P N N N N 38 2006 52 H GL IIIa P P N N N N 39 2006 68 H GL IIIa P P N N N P 40 2006 78 H GL II débil débil N N N N 41 2006 62 H GL IIIa P N N N N N 42 2006 59 H GL I P P N N N N 43 2006 48 H parauterina I P P N N N N 44 2006 35 H GL I P P N NV NV N 45 2006 71 V GL II P P P P ND N 46 2006 48 V GL II P P P P ND N 47 2006 60 V GL IIIb P P P P ND N 48 2006 58 H GL I P P P P ND N 49 2006 65 H GL I P P P N N N 50 2007 75 V GL II P P P P ND N 51 2007 75 H GL LF In Situ P P P P ND N Resultados 99 52 2007 44 V GL I P P P P ND N 53 2007 74 V GL II P P P P ND N 54 2007 38 V GL LF In Situ P P P NV NV N 55 2007 48 V GL I P P P N N N 56 2008 55 V GL IIIb P débil N N N P 57 2008 65 V GL LBCG vs IIIb P P P P ND P 58 2008 75 H GL IIIa débil P N N N P 59 2008 77 V duodeno I P P P P ND N Tabla 9. V: varón, H: hembra; GL: ganglio linfático; LF: linfoma folicular, LBCG: linfoma de células grandes; VS: versus, P: positiva, N: negativa, NV: no valorable: ND: no diagnosticable. PCR: JH-MBR, JH-mTCs negativo positivo Total 19 0 19 negativa % de FISH-BCL2 100,0% ,0% 100,0% 10 28 38 BCL2/FISH positiva % de FISH-BCL2 26,3% 73,7% 100,0% 29 28 57 Total % de FISHB-CL2 50,9% 49,1% 100,0% Tabla 10. Comparación entre las frecuencias encontradas para el reordenamiento de BCL2 mediante técnicas de FISH y PCR en LF. BCL2/ IHQ débil negativa positiva Total 4 1 15 20 negativa % de FISH-BCL2 20,0% 5,0% 75,0% 100,0% 1 0 38 39 BCL2/FISH positiva % de FISH-BCL2 2,6% ,0% 97,4% 100,0% 5 1 53 59 Total % de FISH-BCL2 8,5% 1,7% 89,8% 100,0% Tabla 11. Relación de la sobreexpresión de BCL2 con el reordenamiento de BCL2 en LF. Resultados 100 Nº año Edad sexo fijador Tejido IHQ CD5 IHQ CCND1 FISH CCND1 MTC mTCs 1 2000 50 H formol GL NV P P P ND 2 2000 35 V formol GL P P P P ND 3 2001 77 H formol GL P P P N ND 4 2001 67 V formol GL P P P N ND 5 2003 67 V formol GL N P P N N 6 2003 82 H formol GL P P P N N 7 2003 69 V formol GL P P P N N 8 2004 67 H formol Lengua P P P P ND 9 2004 50 H formol GL P P P N N 10 2005 53 V formol GL ND N P N N 11 2005 62 H formol GL P P P P N 12 2005 93 V formol GL ND P P P ND 13 2005 53 V formol GL N P P P ND 14 2005 71 V B5 MO P P P P ND 15 2005 53 V B5 MO P P P P ND 16 2005 53 H formol GL P P P P ND 17 2005 71 H formol GL P P P P ND 18 2005 83 H formol GL N P P P ND 19 2005 56 V formol GL N P P P ND 20 2006 79 V formol GL N P P P ND 21 2006 65 V formol GL P P P P ND 22 2006 70 V formol GL P P P N N 23 2006 70 V formol GL P P P N ND 24 2006 70 V formol GL ND P P N N 25 2007 76 V formol GL P P P P ND 26 2007 61 V formol GL P P P P ND 27 2007 90 H formol GL débil P P N N 28 2007 82 V B5 MO P P P NV NV 29 2008 72 H formol GL P P P P ND 30 2008 70 V formol GL P P P ND Tabla 12. V: varón. H: hembra. GL: ganglio linfático. MO: Médula ósea. P: positivo. N: negativo. NV: no valorable. ND: no diagnosticable. PCR: JH-MTC, JH-mTCs negativo positivo N.V. Total 11 18 1 30 FISH/CCND1 positiva % de FISH-CCND1 36,7% 60,0% 3,3% 100,0% 11 18 1 30 Total % de FISH-CCND1 36,7% 60,0% 3,3% 100,0% Tabla 13. Comparación entre las técnicas de FISH y PCR para el estudio de la t(11;14)(q13;q32) Resultados 101 Nº AÑO SEXO EDAD DIAGNÓSTICO ORIGEN IHQ BCL2 IHQB BCL6 FISH BCL2 FIHS MYC FISH BCL6 1 1999 H 63 LBCG EX P N N N N 2 2003 H 76 LBCG G P NV N N P 3 2003 H 76 LBCG G P P N N P 4 2003 H 60 LBCG G N N N N N 5 2003 H 58 LBCG EX N N N N N 6 2003 H 66 LBCG transf LF G P P P N N 7 2003 H 70 LBCG G P NV N N N 8 2003 H 63 LBCG transf LF G P P P N N 9 2003 V 60 LBCG EX P P N N P 10 2004 V 80 LBCG G P P N N N 11 2004 H 79 LBCG G N P N N N 12 2004 H 85 LBCG EX P P N N N 13 2004 H 56 LBCG G P P P N N 14 2004 V 43 LBCG G NV focal N N N 15 2004 V 45 LBCG G N P N P N 16 2004 H 27 LBCG G P P N N N 17 2004 H 68 LBCG EX N P N N N 18 2004 H 59 LBCG G P P P N N 19 2004 V 23 LBCG EX P P N N N 20 2004 V 48 LBCG G P P N N N 21 2005 H 62 LBCG EX P P N N P 22 2005 H 28 LBCG G P P N N N 23 2005 H 68 LBCG G P P N P N 24 2005 V 68 LBCG G P P N N N 25 2005 V 58 LBCG EX P P N N N 26 2005 V 91 LBCG G P P N N N 27 2005 H 85 LBCG EX N P N N N 28 2006 V 74 LBCG EX P P N N N 29 2006 V 64 LBCG EX P P N N P 30 2006 V 72 LBCG EX P focal N N N 31 2006 V 44 LBCG G P N N P N 32 2006 H 74 LBCG EX P P N P P 33 2006 V 57 LBCG transf LF EX P focal P N N 34 2006 V 67 LBCG EX P P N N N 35 2006 V 73 LBCG G N P N N P 36 2006 H 64 LBCG G P P N N N 37 2006 H 74 L BCG transf LNH EX NV NV N N P 38 2006 V 65 LBCG G N P P N N 39 2006 H 61 LBCG G P focal N N N 40 2006 V 71 LBCG EX P focal N N P 41 2006 V 60 L BCG transf LNH G P N N N N 42 2006 V 48 LBCG EX NV P N N N 43 2007 H 45 LBCG transf LF G P P P N N 44 2007 H 66 LBCG EX P P N N N 45 2007 H 73 LBCG EX P P N N P 46 2007 V 48 L BCG transf LNH G N NV N N N 47 2007 H 53 LBCG G P P P N N Resultados 102 48 2007 H 42 LBCG G P NV N N N 49 2007 H 92 LBCG G P P N N N 50 2007 H 81 LBCG EX P N P N N 51 2007 H 35 LBCG EX P focal N N N 52 2007 H 58 LBCG EX P P N N P 53 2007 V 62 L BCG transf LNH G P N N N N 54 2007 V 71 LBCG transf LF G P P P N N 55 2008 V 77 LBCG transf LF G P P P P N 56 2008 V 70 LBCG G P P N N N 57 2008 H 77 L BCG transf LNH G P P N N P 58 2008 H 26 LBCG G P P P N N 59 2008 V 58 LBCG G P P N N P 60 2008 H 93 LBCG G P N N N N 61 2008 H 66 LBCG G P P P N N 62 2008 V 75 LBCG G P P N N P 63 2008 V 65 LBCG G P focal N N P 64 2008 H 82 LBCG EX P P N N N Tabla 14. Varón; H: hembra; LBCG: linfoma B difuso de células grandes; LBCG Transf LNH: linfoma B de células grandes transformado de un linfoma no Hodgking. LBCG Transf. LF: Linfoma B de células grandes transformado de Linfoma Folicular. G: ganglionar; Ex: extraganglionar; P: positiva; N: negativa. BCL2/IHQ negativa positiva N. V. Total 8 40 3 51 negativa % BCL2FISHS 15,7% 78,4% 5,9% 100,0% 1 12 0 13 BCL2/FISH positiva % BCL2FISHS 7,7% 92,3% ,0% 100,0% 9 52 3 64 Total % BCL2FISHS 14,1% 81,3% 4,7% 100,0% Tabla 15. Tabla de contigencia relación entre la sobreexpresión de BCL2 y el reordenamiento en LBCG BCL/6IHQ negativa positiva focal N.V. Total BCL6/FISH negativa 8 33 5 3 49 %BCL6FISH 16,3% 67,3% 10,2% 6,1% 100,0% positiva 0 11 2 2 15 %BCL6FISH ,0% 73,3% 13,3% 13,3% 100,0% Total 8 44 7 5 64 %BCL6FISH 12,5% 68,8% 10,9% 7,8% 100,0% Tabla 16. Tabla de contigencia relación entre la sobreexpresión de BCL6 y el reordenamiento en LBCG Resultados 103 BCL-2 germinal Nº (%) BCL-2 reordenado Nº(%) P SEXO mujeres 27 (52.9) 9 (69.2) hombres 24(47.1) 4(30.8) NS (Fisher) AÑOS media+DT <65 24(47.1) 8(61.5) ≥65 27(52.9) 5(38.5) NS (Fisher) LOCALIZACIÓN ganglionar 29(56.9) 11(84,6) 0,052 (Fisher) extraganglionar 22(43.12) 2(15,4) ECOG 0 10(20.4) 5(41.7) 1 15(30.6) 4(33.3) NS(Chi-cuadrado) 2 11(22.4) 1(16.7) 3 5(10.2) 1(8.3) 4 8(16.3) 0(0) ESTADÍO I 6(11.8) 1(7.7) II 11(21.6) 0 (0) III 6(11.8) 6(46.2) 0,035(Chi-cuadrado) IV 26(51) 5(38.5) NV 2(3.9) 1(7.7) LDH NORMAL<250 7(14.3) 2(16.7) ALTA>250 42(85.7) 10(83.3) NS (Fisher) Nº LOCALIZACIONES EXTRAGANGLIONAR. ninguna 6(11.8) 3(23.1) 1 -2 31(60.8) 4(30.8) NS(Chi-cuadrado) >2 12(23.5) 5(38.5) MO libre 27(52.9) 7(53.8) infiltrado 11(21.6) 2(15.4) NS (Fisher) NV 13(25.5) 4(30.8) Nº LOCALIZACIONES GANGLIONARES ninguna 8(15.7) 2(15.4) 1 -2 14(27.5) 4(30.8) >2 27(52,9) 6(46.2) NS(Chi-cuadrado) IPI bajo 0-1 10(20.4) 3(25) Intermedio bajo (2) 9(18.4) 3(25) Intermedio alto (3) 18(36.7) 4(33.3) NS(Chi-cuadrado) alto (4 -5) 12(24.5) 2(16.6) Respuesta Remisión completa 21(41.2) 5(38.5) Remisión Parcial 2(3.9) 0(0) NS(Chi-cuadrado) recaída 8(15.8) 5(38.5) no respuesta 16(31.4) 3(23.1) NV 4(7.8) 0 OS 23(95%CI36,3-65,4%) 5 (95% CI 32,58-116,6%) NS (Log-Rank) Tabla 17. Relación entre el reordenamiento de BCL2, evolución pronóstica y supervivencia. NS: no significativo Resultados 104 Censurado BCL2/FISHS Nº total Nº de eventos Nº Porcentaje negativa 47 23 24 51,1% positiva 13 5 8 61,5% Global 60 28 32 53,3% Supervivencia en meses 125,00100,0075,0050,0025,000,00 Supervivencia acumulada 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 p ositiva-censurad o negativa-censurad o positiva negativa REORDENAMIENTO BCL2 Censurado BCL2/IHQ Nº total Nº de eventos Nº Porcentaje negativa 9 4 5 55,6% positiva 49 23 26 53,1% Global 58 27 31 53,4% Supervivencia en meses 125,00100,0075,0050,0025,000,00 Supervivencia acumulada 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 p ositiva-censura d negativacensurado positiva negativa EXPRESIÓN PROTÉICA DE BCL2 Tabla18. Resumen del procesamiento de los casos para la curva y curva de Supervivencia global (KaplanMeier) comparación entre pacientes diagnosticados con LBCG con y sin reordenamiento de BCL2 Tabla 19. Resumen del procesamiento de los casos para la curva y curva de Supervivencia global (KaplanMeier) comparación entre pacientes diagnosticados con LBCG con y sin expresión de BCL2 Resultados 105 BCL-6 germinal (%) BCL-6 reordenado (%) P SEXO mujeres 28(57.1) 8(53.3) NS (Fisher) hombres 21(42.9) 7(46.7) AÑOS media+DT <65 26(53.1) 6(40) NS (Fisher) ≥65 23(46.9) 9(60) LOCALIZACIÓN ganglionar 33(67.3) 7 (46.7) NS (Fisher) extraganglionares 16(37.7) 8 (53.8) ECOG 0 12(25.5) 3(21.4) 1 16(34) 3(21.4) 2 10((21.3) 3(21.4) NS (Chi-cuadrado) 3 3(6.4) 3(21.4) 4 6(12.8) 2(14.3) ESTADÍO I 7(14.3) 0 (0) II 8(16.3) 3(20) III 9(18.4) 3(20) NS (Chi-cuadrado) IV 23(46.9) 8(53.8) NV 2(4.1) 1(6.7) LDH NORMAL<250 8(17) 1((7.1) NS (Fisher) ALTA>250 39(83) 52(85.2) MO libre 27(55.1) 7(46.7) infiltrado 10(20.4) 3(20) NS (Fisher) NV 12(24.5) 5(33.3) Nº LOCALIZACIONES EXTRAGANGLIONAR. ninguna 5(10.2) 4(26.7) 12 26(53.1) 9(60) NS (Chi-cuadrado) >2 16(32.7) 1(6.7) Nº LOCALIZACIONES GANGLIONARES ninguna 9(18.4) 1(6.7) 1 -2 1(6.7) 1(6.7) 0,059(Chi-cuadrado) >2 21(42.8) 12(80) IPI bajo 0-1 11(23.40) 2(14.28) Intermedio bajo (2) 10(21.3) 2(14.28) Intermedio alto (3) 16(34) 6(42.9) NS (Chi-cuadrado) alto (4 -5) 10(21.27) 4(28.57) Respuesta Remisión completa 18(36.7) 8(53.3) Remisión Parcial 2(4.1) 0(0) recaída 12(24.5) 1(6.7) NS (Chi-cuadrado) no respuesta 14(28.6) 5(33.3) NV 3(6.1) 1(6.7) OS 14(95%CI 53,13-94,23%) 6(95%CI 9,48-21,68%) NS Log-Rank Tabla 20. Relación entre el reordenamiento de BCL6, evolución pronóstica y supervivencia. Artículos publicados 112 most Anatomic Pathology laboratories, formalin is the standard fixative. Formalin results in the formation of methylene bridges between amino groups in the DNA and/or proteins, which helps to preserve the cellular composition and morphology of the tissue but reduces the penetration of acid nuclei probes. 11 Therefore, pretreatment of sections, usually in the form of enzymatic digestion, is a key step in FISH technique on formalinfixed tissues. An extended fixation time is known to substantially reduce the number of hybridization signals. 5 There is general agreement that the longer the fixation, the stronger should be the pretreatment of tissue sections, 12 which is similar to other techniques, such as immunohistochemistry. 13 As fixation may be quite variable between specimens, the use of a standard pretreatment may result in failure of FISH technique. Consequently, if initial results are unsatisfactory, a ‘‘trial and error’’ approach is usually performed; that is, analysis is repeated with increased pretreatment. 14 However, this may be time consuming. Another option is to perform FISH simultaneously on several sections from the same specimen with different pretreatment intensities. However, this requires tissue sections that could be employed for other purposes. There are considerable technical variations in FISH on paraffin-embedded samples, especially regarding factors such as section thickness and dilution as well as time and type of enzyme. Pepsin and proteinase K are widely used in enzymatic digestion. With these proteases, digestion usually takes between 10 and 30 minutes, which is obviously influenced by tissue-section thickness and enzyme concentration. 1,8,15,16 We present a simple method that improves hybridization in FISH on paraffin-embedded samples by monitoring the time of enzymatic digestion under microscopic control and also saves time and reactives by reducing repetition and increasing reproducibility. MATERIALS AND METHODS Tissue Samples To perform this study, we analyzed 65 formalinfixed paraffin-embedded tissue samples from the Hospital Clı´nico-Universitario de Santiago: 12 normal tonsils as negative control for translocation for each probe set, 15 follicular lymphomas, 15 mantle cell lymphomas, 15 Burkitt lymphomas, and 8 anaplastic cell lymphomas. Three-micron thick sections were cut from each case and placed in pretreated slides (ChemMate Capillary Gap Microscope Slides, DakoCytomation, Glostrup, Denmark). Probes The detection of chromosome translocations was carried out using 4 probe sets from Vysis, Inc (Downers Grove, IL): (1) LSI IGH SpectrumGreen/LSI BCL2 SpectrumOrange for t(14;18) detection, (2) LSI IGH SpectrumGreen/LSI CCND1 SpectrumOrange for t(11;14) detection, (3) LSI IGH SpectrumGreen/MYC SpectrumOrange/CEP8 SpectrumAqua for t(8;14) detection, and (4) LSI ALK Dual Color Probe SpectrumGreen/SpectrumOrange for translocations involving band 2p23. Pretreatment Protocol Slides were dried overnight at 551Corat601C for 20 minutes. Deparaffination and rehydratation was carried out with 3 xylene washes, 2 absolute-alcohol washes, two 961C alcohol washes, and 1 distilled-water wash, each for a period of 3 minutes. After deparaffination and rehydratation, slides were placed in SSC2 (saline sodium citrate) wash for 3 minutes in water bath. To avoid or mitigate tissue autofluorescence, slides were immersed in HCl (acid chlorhydric) 0.1 M for 20 minutes (in our experience, this step is not essential). Paraffin-embedded sample pretreatment was carried out with a NaSCN (sodium thiocyanate) 1 M, at 801C for 30 minutes (some samples were pretreated with citric acid yielding similar results). Afterwards, slides were placed in distilled water for 1 minute and in SSC2 for 5 minutes. Enzymatic Digestion To perform the enzymatic digestion protocol, we used 0.05 mg/mL pepsin solution in HCl 0.01 N or 0.01 mg/mL proteinase K solution in buffer TE (Tris 10 mM, ethylene diaminetetra acetic acid 1 mM pH 8). Initially, to find optimal digestion time, series sections were made for 24 cases. Enzyme activity for the various sections taken from each specimen was stopped at different times (3-min intervals for biopsies and 10-min intervals for autopsy samples). Stop process consisted in slide immersion in SSC2 for 1 minute and tissue drying in thermal plate at 451C; this wash step proved to be indispensable for discerning morphologic tissue modifications, as we will describe later. Tissue appearance was then observed under light microscopy with 10 and 40  lenses with slightly closed diaphragm. After that, the FISH technique was continued to evaluate the efficiency of each digestion time. From these initial tests, it became evident that optimal tissue digestion was achieved when tissue showed fernlike formations under light microscopy. This method for optimizing digestion was then applied to the remaining routine pathologic diagnostic samples (41 more cases). After detecting fernlike formations, the slides were placed in 2 baths of SSC2 for 3 minutes and dehydrated in increasing alcohol solutions of OH70, OH96, and OH1001C for 2 minutes each. Then the slides were air dried at room temperature for 15 minutes. Probe Preparation and Hybridization Probe mix was carried out according to the manufacturer’s specifications. We avoided using formamide because of its health risks. Hybridization was performed either on a thermal plate or on the DakoCytomation Hybridizer (Dako Co, Denmark), first at 841C for 5 minutes and finally at 371C overnight. Tojo et al Diagn Mol Pathol  Volume 17, Number 1, March 2008 60 r 2008 Lippincott Williams & Wilkins Artículos publicados 113 Stringent Wash and Preparation Mounting For posthybridization washes, we used SSC0.4  with 0.3% NP-40 (Nonidet P-40) at 731C for 3 minutes. Then the slides were placed in SSC2 with 0.1% NP-40 at room temperature. Afterwards, the slides were air dried for 20 minutes and mounted in DAPI II (4 0 -6 0 -diamidino2-feniloide) counterstain from Vysis, Inc (Downers Grove, IL). Image Analysis Image analysis was performed and photographed using an Eclipse E400 Nikon fluorescence microscope (Nikon, Tokyo, Japan) equipped with DAPI (nuclei) and SpectrumGreen/SpectrumOrange dual bandpass filter sets. RESULTS As previously described, we initially tried to optimize the digestion step in 24 paraffin-embedded samples by stopping enzymatic digestion at 3/10-minute intervals. Every stop was followed by observation of tissue appearance under light microscopy. After that, the FISH technique was continued to evaluate the effectiveness of different digestion times. We found that optimal tissue digestion was achieved when tissue showed fernlike formations under light microscopy, regardless of whether pepsin or proteinase K was used. When fernlike formations were not observed, either by shorter or longer digestion, the hybridization signals were lacking or very weak. It must be stressed that the only stop solutions with which we found fernlike arrangement was SSC2 . This method for optimizing digestion was then applied to the remaining routine pathologic diagnostic samples (41 additional cases). Accordingly, digestion time was highly variable and related to the type of sample. The extreme values were 9 and 120 minutes; the longest value was extraordinary and occurred in only one autopsy sample (Fig. 1). The usual digestion times were 9 to 12 minutes for endoscopic biopsies, 15 to 30 minutes for surgical biopsies, and 25 to 40 minutes for autopsies. With this microscopic monitoring of digestion time procedure, an adequate hybridization signal was obtained in every case. DISCUSSION FISH is a powerful technique for the detection of numerical and structural chromosomal aberrations. In this respect, it has well-known advantages over classic cytogenetics and molecular techniques such as Southern blot and PCR; for example, the ability to study interphase cells, and its very high sensitivity. The availability of commercial probes for FISH detection of chromosomal abnormalities has facilitated its incorporation into the routine diagnostic armamentarium, best exemplified in hematopathology. 17,18 FISH is a well-established technique that is easy to perform in fresh cell suspensions or lymph node imprints that have been fixed with methanol and glacial acetic acid. However, its application on paraffin-embedded tissues is hampered by several technical problems, mainly the inability to obtain an optimal signal from probes. One reason for this is that fixatives and paraffin interfere with the hybridization step that can give rise to nonconclusive results. 5 Nevertheless, efforts must be made to solve such problems, because paraffin-embedded samples are a common source of diagnostic material in pathology laboratories and are essential for carrying out retrospective studies. 11,19 A variety of pretreatments, such as microwaving and/or protease digestion, 6,15,16 has been proposed for obtaining good results with FISH on paraffin sections. With respect to protease digestion, both proteinase K and pepsin have been used, but there is considerable heterogeneity among studies concerning their concentration and digestion time. Although relatively good results have been reported using a common digestion time for all biopsies in paraffin sections (usually ranging from 10 to 30 min), 1,10,15,16 individual optimization is often recommended to obtain best results and greater reproducibility. 20 In our opinion, empirical optimization is a timeconsuming and reactive-consuming approach, owing to ample variations in biopsy fixation times. This is particularly evident in samples of consultation cases from other centers, it may be even more dramatic in autopsy samples, 21 where fixation is usually intense. An extreme example was one autopsy case in which digestion pretreatment was as long as 120 minutes. When we began method testing (24 initial cases), we checked the morphologic appearance of the tissue in 3/10-minute intervals (see section Materials and Methods). Afterwards, when additional cases were being evaluated, we realized that monitoring under the microscope could be more spaced if the morphology did not change after the first visual control, and it could be adapted to the type of sample, thus avoiding unnecessary morphologic checking: in general, endoscopic samples required a total digestion time of about 10 minutes, routine biopsies 15 to 30 minutes, and autopsy samples 20 to 40 minutes. On the other hand, if the fernlike pattern begins to appear, usually in the edge of the section, the digestion should be stopped shortly thereafter. Required digestion time is influenced not only by fixation and enzyme concentration, but also by thickness of paraffin sections. In our experience, 3-mm thick sections were most suitable for digestion control and interpretation of the results (data not shown). Thicker sections need longer digestion and are more prone to overlapping of nuclei. 8,22 The fernlike pattern was observed regardless of whether pepsin or proteinase K were used. Proteinase K has been reported to leave highly fluorescent speckles within the cells. 11 Other authors mention the influence of enzymatic pretreatment on the efficiency of hybridization, and they note that the best results were obtained with Diagn Mol Pathol Volume 17, Number 1, March 2008 FISH Optimization on Paraffin-embedded Tissues r 2008 Lippincott Williams & Wilkins 61 Artículos publicados 114 pepsin. 5 However, these observations are not supported by our experience. The advantage of using pepsin is that it is dependent on pH and ceases to act without the need for a stop reactive when pH is changed. As we have done for FISH, some authors have also stressed the appropriateness of other PCR techniques for the morphologic evaluation of pretreated samples. For in situ PCR, Bagasra and Harris 23 recommend stopping FIGURE 1. An outstanding example of the influence of digestion time in tissue morphology and hybridization efficiency (autopsy sample): as digestion time increases (A, B), 10 minutes; (C, D), 40 minutes; (E, F), 80 minutes; (G, H), 120 minutes fernlike image (left side) is more clearly displayed and hybridization signals are improved (right side). BCL2/IgH probe set from Vysis, Inc (Downers Grove, IL) (green signals, IgH; red signals, BCL2; no nuclear counterstaining). Tojo et al Diagn Mol Pathol  Volume 17, Number 1, March 2008 62 r 2008 Lippincott Williams & Wilkins Artículos publicados 115 digestion when small round bubbles appear on the cytoplasmic membrane of the cells-of-interest. In conclusion, the method here proposed, controlling digestion time until visualization of fernlike structures on the sample under light microscopy, is highly useful insofar as optimizing the results of hybridization is concerned. Repeated attempts are not necessary for a successful technique, thus saving time and reactives and it is particularly useful when dealing with consultation cases or autopsy samples. ACKNOWLEDGMENT The authors are indebted to Luisa Anllo for her expert technical assistance. REFERENCES 1. Einerson RR, Kurtin PJ, Dayharsh GA, et al. FISH is superior to PCR in detecting t(14;18)(q32;q21)-IgH/bcl-2 in follicular lymphoma using paraffin-embedded tissue samples. Am J Clin Pathol. 2005;124: 421–430. 2. Siebert R, Weber-Matthiesen K. Fluorescence in situ hybridization as a diagnostic tool in malignant lymphomas. Histochem Cell Biol. 1997;108:391–402. 3. Tinguely M, Frigerio S. Assessment of translocations in routine diagnostics of a surgical pathology unit. Ther Umsch. 2006;63:279–285. 4. Cook JR. Paraffin section interphase fluorescence in situ hybridization in the diagnosis and classification of non-Hodgkin lymphomas. Diagn Mol Pathol. 2004;13:197–206. 5. 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Discusión Discusión 119 El estudio de las anomalías genético-moleculares en tumores, es importante tanto desde el punto de vista patogénico como diagnóstico, pronóstico y terapéutico. “The World Health Organization” (WHO) reconoce las alteraciones genéticas como uno de los criterios más fiables que ayudan a la clasificación de los linfomas. Realizar una correcta diferenciación de los linfomas, va a ser factor clave en el tratamiento y la supervivencia. Así por ejemplo, los MCL son de peor pronóstico y menor tiempo de supervivencia que los LF. Por ello es necesario desarrollar herramientas y técnicas fiables, sencillas y poco exigentes en cuanto a las condiciones de conservación tisular, de forma que se puedan realizar estudios tanto prospectivos como retrospectivos; técnicas que nos permitan diferenciar y clasificar estos tumores correctamente134. 6.1. ASPECTOS METODOLÓGICOS DE LA TÉCNICA DE FISH EN EL MATERIAL HISTOLÓGICO DE RUTINA. A principios de los años 90 se introdujo en los laboratorios de hematología la técnica HIS, aplicada en el seguimiento de las neoplasias malignas. Se trataba de una técnica complementaria a la citogenética convencional, con la gran ventaja que la HIS era capaz de detectar alteraciones cromosómicas que afectaban a regiones génicas muy pequeñas, incluso en núcleos en interfase. Esta técnica se vio mejorada con la aparición de sondas marcadas con fluorocromos: la FISH. Su uso pronto se popularizó para el estudio de las alteraciones cromosómicas, tanto en tejidos frescos como en sangre periférica, y se extendió como método de trabajo en los laboratorios de hematología135, 136, convirtiendo la técnica de FISH en una herramienta fundamental para la clasificación y pronóstico de los LNH.137 El desarrollo de la FISH, permite trabajar con distintos materiales, improntas de tejido fresco138, 139, material congelado, sangre periférica, e incluso tejidos incluidos en parafina37, 140, 141, permitiendo la posibilidad de estudiar series mucho más amplias, que conducirán a un conocimiento más preciso de la biología de los linfomas. Mientras que el empleo de la FISH en tejido fresco está completamente estandarizado, su aplicación en material parafinados se ha visto restringida142, debido a que presenta numerosas dificultades técnicas37, 126, 127, 143, y todavía es poco reproducible en la rutina diagnóstica. El principal problema, pasa por la obtención de señales demasiado Discusión 120 débiles o enmascaradas por una autofluorescencia de fondo que van a impedir la correcta interpretación de los resultados. Se pueden reunir en dos grupos las dificultades de la técnica FISH. Por un lado las derivadas de factores inherentes al propio tejido (tejido inicial, edad de la muestra, inclusión en parafina, fijación) y por otro los debidos a la propia técnica (pretratamiento, digestión enzimática, temperatura, lavados). Todo esto va a interferir en la eficacia de la hibridación. Además, la interpretación de los cortes en tejidos parafinados es complicada y puede llevar a error, debido a que a veces puede existir una colocalización de la señal producida por el azar o por la disposición de los cromosomas en los núcleos144. Para solventar estos problemas relacionados con la inclusión, fijación, e interpretación de los tejidos parafinados, se han propuesto algunos cambios de variación protocolaria en la técnica FISH, como son: el aislamiento de núcleos a partir de tejido parafinado139, 145, 146,32, 142, 146 o la extracción de los núcleos con aguja fina32, 142,147. El objetivo de todos ellos es mejorar el método. Sin embargo nosotros consideramos que una de las principales ventajas de la FISH es poder trabajar con secciones finas de tejidos incluidos en parafina, ya que permite hacer una valoración de los linfomas en su propio contexto histológico. En esta técnica va a ser un factor fundamental, asegurarse que lo que estamos viendo son células tumorales para no dar falsos resultados. Un ejemplo muy significativo, son los linfomas foliculares in situ donde las células tumorales se encuentran confinadas en regiones muy pequeñas y sería muy fácil dar un diagnóstico erróneo si lo que estamos valorando no la hacemos in situ, tal y como pudimos comprobar en nuestros casos de linfoma folicular in situ. Realizar un análisis genético molecular en su contexto histológico nos permite correlacionar lo que vemos en la FISH con la HematoxilinaEosina, y analizar subpoblaciones del tumor. Consideramos que lo ideal es mejorar el rendimiento de la FISH sobre cortes finos de material parafinado. Para ello hay que tener en cuenta todos los factores que pueden intervenir a la hora de conseguir resultados. óptimos Establecer el espesor del corte más adecuado ha sido un aspecto muy debatido en la literatura124, 125, 142, 143. Los primeros estudios revelaban que había diferencias en los resultados al realizar un corte a 15-20μm o a 5-6μm. En cortes demasiado finos podríamos estar seccionando alguna de las señales de hibridación al seccionar parte de la arquitectura Discusión 121 celular 124, 125, constituyendo un problema, sobre todo si buscamos amplificaciones o duplicaciones de genes. Prueba de ello es que podríamos observar hasta 8 patrones artefactazos de diferentes señales según dónde coincida el corte celular148. Por otro lado, cortes demasiado gruesos exigen un pretratamiento más agresivo que daña la morfología y un procesamiento de la muestra mucho más largo, además requieren una mayor cantidad de tejido. Otra desventaja es que requieren tecnología más avanzada, como por ejemplo microscopía confocal149, que permite hacer el solapamiento de los distintos planos, y de la que no se dispone en todos los laboratorios de Anatomía Patológica. De nuestra experiencia, concluimos que es mejor trabajar con secciones finas, ya que lo que estamos analizando son translocaciones recíprocas. La interpretación se realizará valorando sólo los núcleos intactos, aunque se hayan seccionado algunas células. Teóricamente obtendríamos una mayor información si observamos todos los patrones con las diferentes señales de los núcleos37, pero la confusión que implica esto es mucho mayor que los datos que pueda aportar en el estudio de translocaciones para la rutina diagnóstica. Fig 35. Análisis de las distintas posibles secciones de cortes en tejido parafinado37. Discusión 128 detectado por PCR. Pero si lo hacen en la región mcr (frecuencia del 20%) el segmento resultante de la translocación BCL2-JH varía entre 350-1000 pb, así que habrá dímeros donde la PCR de falsos negativos. Si lo hacen en icr, 3´BCL2, o 5´mcr se sitúan de forman muy variada y no van a ser detectados por PCR. • La variación en el tamaño del dímero JH. En LF es característico que las regiones de JH sufran mutaciones somáticas en curso, añadiendo nucleótidos a la región J que aumentan el tamaño del fragmento, además originan cambios en su secuencia haciendo que estos fragmentos no sean reconocidos por los cebadores de la PCR.141 Al existir tantos puntos diferentes de rotura, para evitar falsos negativos deberemos analizar todas las regiones. La FISH tiene capacidad de analizarlos todos, mientras que la PCR aunque intenta desarrollar estrategias que traten de combinar estos puntos no es capaz de analizarlos todos. En el estudio de CCND1-IGH los resultados descritos son parecidos, sólo que los puntos de rotura todavía son más variables lo que explica que hayamos encontrado todavía un porcentaje mayor de falsos negativos en la técnica de PCR frente al FISH que para el reordenamiento IGH-BCL2. El 80% de los puntos de rotura se extienden por un área que abarca entre 15 y 400kb, esto representa un fragmento demasiado grande para los cebadores de la PCR que no cubrirán ni el 50% de esos puntos175. Al igual que ocurría con el dímero IGH-BCL2, el análisis de un mayor número de puntos de rotura reducirá el numero de falsos negativos. Así, por ejemplo, se ha descrito en la literatura que si sólo analizaremos los MTC con técnicas de PCR obtendremos entre un 60-70 % de falsos negativos y si analizáramos MTC+mMtc un 50% de falsos negativos. Poe ello es necesario estudiar un mayor número de regiones. Por el contrario nuestros análisis de la región de mMTc no aportaron ninguna positividad añadida. En resumen, las diferencias entre los ratios de detección positivos existentes entre el FISH y la PCR encontradas en nuestros, datos pueden justificarse por las limitaciones específicas de cada método147. La PCR tiene la escasa aplicabilidad cuando hay variabilidad en los puntos de rotura, los cebadores de la PCR requieren secuencias absolutamente complementarias para la detección de la translocación y sólo se unen a la región a la que van dirigida. Las sondas de FISH tienen un mayor tamaño, se extienden a Discusión 129 lo largo de toda la región de estudio y cubren todos los posibles puntos de rotura, además no necesitan ser totalmente homólogas para unirse a la región de interés. Independientemente de los aspectos técnicos existen otras desventajas de la PCR frente a la FISH. La PCR no puede correlacionar las alteraciones genéticas con determinadas poblaciones celulares en el tejido de estudio. Además ofrece una información más escasa limitándose a detectar presencia o ausencia de la translocación. La técnica de FISH permite valorar si existe un patrón de translocación complejo, independientemente de estudiar la señal de colocalización, estas mismas valen para detectar otras anomalías genéticas tales como delecciones o amplificaciones. Por último, el estudio de las translocaciones mediante PCR no va a poder estar disponible en muchas de las translocaciones genéticas, ya que la PCR amplifica una alteración puntual, no puede examinar miles de genes. Sólo podemos estudiar aquellas translocaciones en las que conozcamos el partner con el que se va a translocar. Por eso, la mayoría de los autores detectan por PCR los dímeros CCND1-IGH ó BCL2-IGH pero tanto la CCDN1 como BCL2 van a tener otros partners reconocidos tales como los genes que codifican para las cadenas ligeras de Ig. Cuando esto sucede obtendríamos de nuevo falsos negativos, la solución pasaría por usar cebadores específicos que reconozcan IgLκ, IgLλ. En este sentido la PCR nos daría la misma información que las sondas de fusión. Pese a los diferentes esfuerzos hechos para mejorar las técnica de PCR58, 115, basados en la aparición de cebadores que reconocen nuevos y más puntos de rotura, siguen siendo más eficientes las sondas de FISH116, 176. Los datos obtenidos en nuestro estudio coinciden con otros estudios, en los que se afirma la superioridad de la técnica de FISH frente a la PCR58, 61, 116, 147, 174, 176, 176, 177. Hasta ahora se había recomendado utilizar las técnicas de FISH combinadas con PCR58, o utilizar la PCR como técnica de cribado y hacer sólo por FISH los casos que salen negativos por PCR147, debido a que la FISH es una técnica más cara y las dos técnicas conjuntas pueden aumentar la sensibilidad178. Sin embargo, nosotros creemos que ya existen suficientes datos que demuestran que el porcentaje de éxito en tejido parafinado de la técnica FISH es mucho mayor que el de la PCR, siendo además la FISH una técnica mucho más específica y donde es muy difícil que se produzcan resultados erróneos. Por Discusión 130 todo ello postulamos que debería ser la técnica preferentemente empleada para el estudio de las translocaciones en el diagnóstico de linfomas de Anatomía Patológica. 6.3. LINFOMA FOLICULAR: 6.3.1. DETECCIÓN DEL DÍMERO BCL2-IGH Y REORDENAMIENTO DE BCL6 MEDIANTE FISH. RELACIÓN ENTRE LA t(14;18)(q32;q21), REORDENAMIENTO DE BCL6 Y GRADO HISTOLÓGICO EN LF. Los LF son neoplasias caracterizadas por un patrón histológico que contiene la arquitectura y las características citológicas del centro germinal, comprendiendo una gran variedad de centrocitos y centroblastos. Según la proporción de centroblastos se distinguen 3 categorías: grado I, grado II, grado III. Las 2 primeras entidades son consideradas como LF de bajo grado. Mientras que los LF grado III son denominados de alto grado. Estos últimos se subdividen en grado IIIa (con centrocitos) y grado IIIb (sin centrocitos) considerados de alto grado y como una categoría no homogénea del tumor10. Nuestros resultados, al igual que lo descrito en la literatura, encuentran una mayor incidencia de la t(14;18)(q32;q21) para linfomas foliculares de grado I y II. Esto puede justificarse porque la expresión de BCL2 bloquea la muerte celular179 manteniendo la viabilidad de las células. Además conduce a la acumulación celular de las formas iniciales tumorales que llevan dicha translocación, más que a la evolución del tumor con la consiguiente adquisición de nuevas alteraciones, que sería más propio de fases más avanzadas180. Las frecuencias obtenidas para la t(14;18)(q32;q21), son iguales entre los grados I y II, ambos del 73%, sugiriendo que no existen diferencias moleculares entre estos dos subtipos de linfoma y que quizás puedan ser diagnosticados como una única entidad agrupada en linfomas de bajo grado. Este 73% es un valor un poco más bajo de lo referenciado para la población Europea (entorno al 85-90%181-184), sobre todo cuando nos referimos a los linfomas de bajo grado. En cuanto a la incidencia de la translocación de BCL2 en el estudio de linfomas foliculares independientemente del grado, ésta fue aun más baja (66%). En este caso nuestras frecuencias coinciden más con las de la población China descritas por Loke185, Discusión 131 Chen186, Sekiguchi et al158 que atribuían la baja incidencia de la translocación a una distribución poblacional, siendo más alta en Europa y América y más baja en Asia187. Sin embargo nosotros presentamos frecuencias parecidas indicando que posiblemente la translocación no va a depender de la localización geográfica. La transformación histológica de linfomas foliculares de bajo a grado alto grado durante el curso clínico, suele estar presente entre el 60% al 80% de los pacientes. Los eventos que conducen a esta transformación aun no se comprenden bien, y el background biológico de los linfomas de grado III está pobremente entendido. Aun así, se definen como entidades más agresivas y de peor pronóstico y deberán ser tratadas de acuerdo con esto188, 189. La WHO recomienda la subdivisión de los linfomas de grado III basándose en diferencias biológicas y morfológicas, haciendo distinción entre grado IIIa y IIIb10. Las principales diferencias que intentan establecer hacen referencia a que los LF de grado IIIa presentan una proporción de centrocitos, además de la t(14;18)(q32;q21) en un porcentajes 60% y tienen más características en común con los linfomas de grado I y II. En cambio los LF de grado IIIb están compuestos únicamente por centroblastos y sólo un 13% de ellos tienen la t(14;18)(q32;q21), teniendo más características en común con los LBCG190. En contraste a esta baja frecuencia del reordenamiento de BCL2, presenta reordenamiento del gen BCL6. Nuestros datos, no muestran estas variaciones citogenéticas entre el grado IIIa y IIIb. Es más son contradictorios con lo citado por algunos autores10, 11, 191. La frecuencia para la t(14;18)(q32;q21) en linfomas de grado IIIa fue del 16%, distando mucho del 60% referenciado en la literatura, la razón podría deberse al bajo número de casos analizados (tan sólo 6). Por otra parte en los linfomas de grado IIIb encontramos un 55% de positividad (en 9 casos analizados) para el dímero de BCL2-IGH, un valor muy alto con respecto al 13% encontrado en la literatura. Además la frecuencia del dímero de BCL6 es más o menos igual para los dos grupos (30-40%), incluso algo mayor en los de grado IIIa (40%). Estos datos nos hacen pensar y siempre con precaución, debido a la baja serie analizada, que no existe una gran diferencia a nivel molecular entre los linfomas de grado IIIa y IIIb. Este hecho nos ayudaría a justificar que entre ambos subgrupos no se hayan encontrado diferencias que afecten a la supervivencia o al tiempo libre de enfermedad192. Discusión 132 Aunque se ha postulado que los grados IIIa y IIIb tienen características citomorfológicas, inmunohistoquímicas y citogenéticas diferentes, la bibliografía no ha sido capaz de evidenciar la implicación en la respuesta al tratamiento o la mayor supervivencia de una entidad respecto a otra, ya que ambos grados se comportan igual. En donde sí se encuentran estas diferencias es en el curso clínico de los linfomas de alto grado (IIIa y IIIb) respecto a los LF de bajo grado (I y II). La frecuencia del reordenamiento del gen de BCL6 en linfomas de grado I y II, en nuestro estudio han sido muy bajas, sólo del 3%, y como peculiaridad se manifestaban paralelamente con el dímero IGH-BCL2. Lo cual refuerza la teoría de que la alteración de BCL6 se adquiere también en etapas tempranas de la evolución histológica, como afirmaron Keller et al103, y no es exclusivo de la etapa de diferenciación de isotipos en el CG. Además demuestra que la alteración del BCL6 en linfomas de bajo grado se adquiere consecuentemente como una alteración secundaria, gracias al alargamiento de la vida celular provocada por la expresión de BCL2. Alteraciones secundarias que sumadas a las primarias se podrían relacionar con la progresión del tumor10, de hecho se cree que la existencia de esta mutación juega un papel importante en la transformación de LF a LBCG193. Pero no hay una opinión unánime en este tema ya que otros estudios no encuentran aceleración en la progresión de la enfermedad97 y la presencia del reordenamiento de BCL6. Nuestros datos han mostrado la alteración de la región 3q27 en el 40 y 33% de los linfomas de grado IIIa y IIIb respectivamente, siendo estos negativos para la t(14;18)(q32;q21) (a excepción de un caso en que hemos encontrado doble reordenamiento). Esto evidencia que la alteración de BCL6 puede surgir en este grado de linfoma como una alteración primaria. Ambas alteraciones BCL2 y BCL6 surgirán como eventos primarios aislados y se cree que están relacionadas con las diferentes vías de transformación del tumor10. En el caso de los LF IIIa la presencia de la alteración de BCL6 se cree que tiene que ver con la progresión del tumor a LBCG. Sin embargo en los LF IIb se ha demostrado que el punto de rotura que conlleva a la alteración del gen de BCL6 se produce en región de ABR, mientras que en los LBCG el punto de rotura se localizará en la región MBR12, por lo tanto no habría una progresión de los LF IIIb a LBCG. La frecuencia 33-40% de muestras reordenadas para BCL6, no se puede considerar muy alta con respecto a lo citado en la bibliografía (50%). Esta diferencia se puede Discusión 133 justificar porque nuestros datos son únicamente referidos a la translocación del gen de BCL6 y esta no es la única alteración por la cual la proteína va a ser sobreexpresada, ya que existen otros mecanismos como amplificación de la región la 3q27 o hipermutaciones que provocan la sobreexpresión de BCL6194. En resumen, podemos hablar de dos grupos de linfomas claramente diferenciados por sus características genéticas: los de bajo grado, caracterizados por estar presente el dímero de IGH-BCL2 y los de alto grado, caracterizados por el reordenamiento de BCL6. 6.3.2. TRANSLOCACIONES Y EXPRESIÓN PROTEICA. La detección de BCL2 mediante técnicas de inmunohistoquímica es de gran ayuda en el diagnóstico de LF, el patrón de sobreexpresión que presenta en los núcleos permite distinguir centros germinales de centros reactivos195. La expresión alterada de la proteína BCL2 se encuentra en el 90% de los LF. Aunque en un principio se sugirió que la t(14;18)(q32;q21) era la única causante directa de la expresión de BCL2 en estas neoplasias41, 196 se ha visto que no es así64, 197. Existe un porcentaje de casos de LF que tienen sobreexpresión de la proteína y sin embargo no presentan la translocación. En nuestro caso, la proteína BCL2 se expresaba en el 90% de los casos mientras que la translocación sólo era positiva en el 66%. Estos resultados implican la existencia de otros mecanismos moleculares que pueden ser responsables de la desregulación y consiguiente sobreexpresión de BCL-2: • Anomalías del cromosoma 18: la existencia de una copia extra del cromosoma 18198 o la amplificación del gen de BCL2, que se aparecen en un porcentaje similar al de la translocación199. • Interacciones con otros miembros de la familia de BCL2200. Además la translocación también podría estar enmascarada por complejos reordenamientos crípticos201. Otro motivo que puede justificar ausencia de la translocación pero la sobreexpresión de la proteína, es que la translocación pase desapercibida porque existe una variación muy grande de los puntos de rotural17, pasando desapercibidos. Discusión 134 Incluso se ha sugerido que los casos con t(14;18)(q32;q21) negativos y con expresión de BCL2 merecen ser considerados como otro subgrupo17, aunque la implicación pronóstica no está muy bien conocida130, 202. De nuestro estudio, 17 casos pertenecerían a este grupo. Otro grupo diferenciado sería el que presenta la t(14;18)(q32;q21) y expresa BCL2. En la literatura estos casos se asocian por lo general con un mejor pronóstico 203, 204, aunque existen autores que afirman que representa un peor curso clínico 204. Esta contrariedad se puede deber a que el punto de rotura donde ocurre dicha translocación podría influir en el pronóstico130. En nuestro estudio hemos encontrado un caso donde no hay translocación ni expresión de BCL2. En un principio se sugirió que estos casos con ausencia de translocación y expresión de BCL2 representaban un subtipo de enfermedad de peor pronóstico con características clínicas más agresivas, y deberían ser clasificados como otra entidad. Pero existen muy pocos en la literatura como replantearla clasificación. Otros dos casos donde a pesar de que la expresión de BCL2 era muy débil, sí había translocación. Este hallazgo lo podemos relacionar con los casos donde está presente la t(14;18)(q32;q21) pero no hay sobreexpresión de BCL-244. Este fenómeno podría deberse a que BCL2 puede sufrir otras mutaciones somáticas que originan cambios en la secuencia aminoácidica de la región del epitopo que es reconocida por el anticuerpo. En realidad sí existe expresión de BCL2 pero no es reconocida por el anticuerpo, serían pues falsos negativos para BCL244. Todavía se desconoce su importancia clínica. La presencia o ausencia conjunta de la translocación y estudio inmunohistoquímico puede ser muy útil para diferenciar grupos de LF que permitan monitorizar la progresión de la enfermedad61. 6.4. LINFOMA DE CÉLULAS DEL MANTO: 6.4.1. DETECCIÓN DEL DÍMERO CCND1-IGH MEDIANTE FISH. La t(11;14)(q13;q32) fue detectada en el 100% de nuestros casos, poniendo de manifiesto que es un marcador clave para confirmar el diagnóstico de estos linfomas. Discusión 135 Incluso hay casos en la literatura donde la presencia del dímero IGH-CCND1 ha servido para confirmar el diagnóstico de LCM con un inmunofenotipo raro205. La CCND1-IGH funciona como un oncogén aunque las habilidades para la transformación y la formación del tumor son menos potentes que las de un oncogén. Ratones transgénicos para la CCND1 no eran capaces de desarrollar espontáneamente linfomas y necesitaban la cooperación de otros oncogenes alterados como MYC 85 para poder desarrollarlos. A menudo la t(11;14)(q13;q32) puede ser detectada en células sanguíneas normales, esto refuerza la hipótesis de que se necesitan otros mecanismo para poder desarrollar el tumor, además es un reflejo de que la técnica de FISH debe ser integrada dentro del contexto clínico de cada paciente, entendiendo sus resultados como tal. La t(11;14) (q13;q32) no es la única alteración encontrada en los LCM206 ya que se han descrito múltiples inestabilidades cromosómicas que surgen como eventos secundarios, pero sí que es la única común que se puede utilizar para su diagnóstico. 6.4.2. TRANSLOCACIONES Y EXPRESIÓN PROTEICA. En lo referente a la expresión de la CCDN1 en LCM podemos decir que existe una muy buena correlación entre la sobreexpresión de la CCDN1 y la existencia de la translocación como ya quedara patente en otros estudios207. Ha sido descrito algún caso donde había expresión de CCND1 y ausencia de translocación, aunque esto es muy raro208. En algunos casos lo atribuyen a que el análisis se hizo en cultivos celulares donde evolucionaron las células normales en vez de las tumorales209. En nuestra serie no hemos encontrado ningún caso con estas características. La translocación estaba presente en el 100% de los casos y coincidían con la sobreexpresión de la CCND1, a excepción de un caso dónde estaba presente la translocación pero no había expresión de CCND1 esto se puede ser explicado por una mutación en la región del epitopo que es la que reconoce al anticuerpo, al igual que sucedía con BCL2, otro motivo tendría que ver con problemas derivados de una mala fijación que alterase la proteína. En un principio se creía que la sobreexpresión de ciclina D1 era imprescindible para el desarrollo de la patogénesis de LCM, sin embargo en la literatura se ha descrito Discusión 136 casos de células tumorales que no expresan CCND1 ni tampoco la translocación (aunque no son muy abundantes). En un primer momento se atribuyó a un error diagnóstico, a un inadecuado análisis genético o a una mala inmunohistoquímica. Estas sospechas quedaron desechadas tras el empleo de técnicas más sensibles como la RT-PCR o cADN microarrays210 y vio que había casos de LCM que no expresaban CCND1. Yatabe Y. et al211 consideran que estos casos con CCND1 negativa representan una entidad diferente y que deberían ser clasificados en grupos distintos, debido a que los casos CCND1+, tienen un curso clínico más agresivo211. Kai Fu et al 212 observaron en reducido número de pacientes con morfología y características genéticas de LCM que carecían de expresión de ciclina D1 y t(11;14), pero en su lugar sobreexpresaban CCND2 (ciclina D2) CCND3 (ciclina D3). La sobreexpresión no se debía a amplificaciones o translocaciones en los genes CCND2 Y CCND3, y clínicamente los pacientes se comportaban como los casos CCND1 positivos. En conclusión, la desregulación de CD2 y CD3 provoca el mismo efecto que la de la CCND1. Esto vuelve a justificar la estrecha relación entre la desregulación de las ciclinas y la aparición del tumor, convirtiendo a las ciclinas en marcadores de LCM. A pesar de que existe algún caso aislado descrito en la literatura de ausencia de translocación en CCND1 y linfoma del manto, podemos decir que la translocación y la sobreexpresión de la ciclina D1 es un método sensible y fiable para la detección de linfoma del manto30, 213. Como marcador de supervivencia, los casos con CCND1 presentan mejor pronóstico aunque hay que tener en cuanta que existen otros factores como son las delecciones o ganancias cromosómicas que afectan a la supervivencia de LCM214. 6.5. LINFOMA B DIFUSOS CÉLULAS GRANDES. 6.5.1. DETECCIÓN DE LOS REORDENAMIENTOS DE BCL2, BCL6 Y MYC. Los LBCG son considerados como una entidad definida en la clasificación de la WHO, pero su presentación clínica, morfológica, genética y molecular sugiere que estos tumores representan a un grupo heterogéneo de neoplasias34. Se trata del grupo más frecuente perteneciente a los LNH, por lo que es muy útil ampliar los conocimientos sobre su comportamiento. En la actualidad se han definido varias subcategorías de estos tumores. Discusión 137 Entre ellas encontramos los LBCG que pueden surgir de Novo (referidas a las formaciones primarias) aquellos que representan la progresión y transformación de un tumor previo menos agresivo como el linfoma folicular (referidos como secundarios)34. Otra clasificación hace referencia a su ubicación ganglionar (con nódulos linfáticos involucrados) o extraganglionar (Médula ósea, tracto intestinal, hígado, tejido, piel, ovario, tiroides, pulmón, próstata)215, o la que hace referencia al subgrupo molecular CGB (centro germinal B-Cell-Like) o ABC (activado B-Cell-Like) post-CG activados216. Parámetros clínicos pronósticos tales como el IPI (Índice de Pronóstico Internacional) es utilizado en los LBCG como un modelo predictivo del curso clínico de los pacientes, aunque se ha visto que pacientes con el mismo IPI exhiben un pronóstico variable. La identificación de un grupo de pacientes de riesgo con mayor probabilidad de recaída podría ser beneficioso34 para establecer un tratamiento protocolario que permita la remisión completa de la enfermedad. Sin embargo este modelo predictivo se encuentra condicionado por marcadores moleculares que van a afectar a la evolución de los LBCG217. Las diferencias entre las características clínicas y la respuesta al tratamiento dependerán de las características moleculares que modifican la enfermedad agresivamente218. La heterogeneidad del curso clínico que presenta cada paciente puede ser el reflejo de las diferentes caracterizaciones biológicas de las células tumorales. Por lo que debemos buscar nuevos marcadores que ayuden a predecir el curso de estas enfermedades219. En la literatura se ha referenciado que el desarrollo de los LBCG se ha asociado con algunas alteraciones moleculares concretas, aunque el papel que desarrollan como marcador pronóstico y significancia clínica es todavía controvertido a diferencia de otro tipo de linfomas220,129. De aquí, la importancia de nuestro estudio que trata de esclarecer el papel que juega los reordenamientos de BCL2, BCL6 y MYC en la evolución de los pacientes. Las frecuencias que encontramos en cuanto a los 3 reordenamientos demostraron que su identificación puede ser de gran ayuda en el diagnóstico de los diferentes subgrupos de LBCG. Se detectó el reordenamiento de BCL2 entre los 64 casos de LBCG analizados en un porcentaje del 20.3%, De éste el 100% de los pacientes que debutaron en su forma primaria como LF tenían esta translocación, mientras que los que provenían de otro tipo de