Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA. DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR CARACTERIZACIÓN DE AUTOANTÍGENOS EN LA DIABETES TIPO 1. PAPEL DE LAS GALECTINAS EN LA ETIOPATOGENIA DE LA ENFERMEDAD. Tesis doctoral. IRIA MARÍA GÓMEZ TOURIÑO ISBN 978-84-9887-830-1 (edición digital PDF) Rubén Varela Calviño, profesor titular del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela. Manuel Félix Camiña Darriba, profesor titular del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela. INFORMAN: Que la presente Tesis Doctoral titulada “Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad”, que presenta Iria María Gómez Touriño para optar al grado de Doctora en Biología, ha sido realizada en este Departamento bajo su dirección y que, considerando que se halla concluida, autorizan su presentación para que sea evaluada por el Tribunal correspondiente. Y para que así conste, firman el presente informe, Fdo: Rubén Varela Calviño Fdo: Manuel Félix Camiña Darriba Fdo: Iria María Gómez Touriño Santiago de Compostela, 22 de Junio de 2011. El trabajo recogido en la presente memoria ha sido realizado en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela, bajo la dirección del Doctor Rubén Varela Calviño y del Doctor Manuel Félix Camiña Darriba. Iria María Gómez Touriño ha disfrutado de las becas para la realización de los estudios de tercer ciclo de la Xunta de Galicia, del contrato María Barbeito para la formación de doctores de la Xunta de Galicia, y de una beca de la Xunta de Galicia para realizar una estancia predoctoral de 6 meses en el Instituto de Investigación Germans Trias i Pujol (Badalona). A Marcos. A mis padres y mi hermano. Agradecimientos. A Marcos, por estar ahí en los momentos buenos, en los malos y en los regulares. Por sacarme una sonrisa cuando todo está oscuro. Por compartir mis momentos de felicidad. Por aguantar mis “apasionantes” explicaciones sobre linfocitos… Gracias. A mis padres y mi hermano, por apoyarme en todo momento en este largo viaje, por entender mis extraños horarios de trabajo y mi mal humor cuando un experimento no quería salir bien. Por orientarme en mi camino y por enseñarme a vivir. A Rubén y a Félix, por haber creado juntos todo lo que aparece (y lo que no aparece) en esta tesis. Por enseñarme todo lo que sé sobre técnicas de laboratorio. Por no desesperar conmigo cuando en los comienzos hacía casi todo al revés. Por permitirme hacer los experimentos que se me ocurren. Por las conversaciones buscando explicaciones a los resultados sorprendentes. Por los truquis de fontanería, de electricidad y de informática para que HPLC y ordenadores decidieran funcionar como debían (¡el ajo sirvió de mucho!). Gracias, sin vosotros esto no hubiera sido posible. A mis amigas de toda la vida (Adela, Ana y las Marías), por las largas conversaciones de los viernes donde desahogarnos de nuestras cosas. Por todo lo que hemos vivido juntas (media vida ya), ¡y lo que nos queda! Por seguir compartiendo juntas todos los momentos importantes que nos esperan. A l@s biólog@s (Vane, Sara, Raquel, Teresa, Lorena, Marta y Martín), por haber sobrevivido junt@s a las fisiologías y las FBAs, y por seguir junt@s desde entonces. Por esas charlas apasionantes sobre células, PCRs a tiempo real y western blots. Por su apoyo estén donde estén. A Iria y Ramón, por los momentos de laboratorio juntos. A los que estáis o habéis estado en el laboratorio de enfrente (Rebe, Irene, Javi, Alberto, Lisa, Leti, los dos Joses, Javier, Mark, Pablo, Sergio, las dos Patricias, Lois…) por la compañía, las conversaciones, ¡y los paseos en barco! Al resto de compañeros del departamento (Óscar, Antonio, Lina, Paz, Luis, Malú, Víctor, Verónica, Montse) por tener siempre un saludo cariñoso conmigo. A Rosa por las risas y los momentos marujiles de las tardes… A Joan, por acogerme tan bien y con tanto cariño en su grupo, y enseñarme tantas cosas. Por darme la oportunidad de aprender y compartir con ellos. A todos los compañeros de Can Ruti (Jorge Carrascal, Silvia, Raquel, Rosa, Darnel, Aroa, las dos Martas, Patricia, Begoña, Dàlia, Irma, Eva, Ricardo, Jorge Carrillo, Maricarmen, las dos Mª Josés, Marga, Francesc, Eduard…) por tantos momentos especiales (las comidas en el hospital, sus traducciones del menú del día, las conversaciones, los Journal clubs a mediodía…) y especialmente por su amistad. A todos los que me habéis ayudado con diversas técnicas empleadas en esta tesis: a Jana por su ayuda en el “complejo e inabarcable” mundo de la espectrometría de masas, por intentar ayudarme en todo lo que estaba de su mano (¡gracias!); a Raquel, Mari y Ángel por su ayuda con la PCR en tiempo real; a Miguel Ángel por las tinciones de inmunofluorescencia en rata; a Juan por la ayuda con el citómetro; a Javier, Luis, Santiago y todas las enfermeras de Bioquímica Especial, Marcos, África, Christian, Andrea y Eduardo por ayudarnos a conseguir muestras para nuestros estudios. Y por supuesto a todos los pacientes diabéticos y controles sanos (los voluntarios y los no tan voluntarios) por donar sangre para mis investigaciones. Porque sin gente solidaria como ellos no se podría hacer ciencia. Muchas gracias. ABREVIATURAS 2.2.1.5. Ligación, transformación, selección de clones positivos y secuenciación ...................... 68 2.2.2. Manipulación de proteínas ........................................................................................................ 69 2.2.2.1. Electroforesis en geles de poliacrilamida conteniendo dodecil-sulfato sódico (SDS-PAGE) .................................................................................................... 69 2.2.2.2. Western blot .................................................................................................................... 69 2.2.3. Manipulación de células ............................................................................................................ 70 2.2.3.1. Condiciones de manipulación ......................................................................................... 70 2.2.3.2. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica............................................ 70 2.2.3.3. Propagación y conservación de líneas celulares. ............................................................. 71 2.2.4. Cromatografía líquida de alta eficiencia en fase reversa (RP-HPLC) ....................................... 71 2.2.5. Espectrometría de masas (MS y MS/MS) ................................................................................. 72 2.2.6. Análisis estadístico .................................................................................................................... 73 2.3. Métodos específicos............................................................................................................................ 74 2.3.1. Clonaje, expresión y purificación de autoantígenos................................................................... 74 2.3.1.1. Glucosa-6-fosfatasa específica de los islotes (IGRP) ..................................................... 74 2.3.1.2. Proteína ácida de la glía .................................................................................................. 76 2.3.1.3. S100β............................................................................................................................... 78 2.3.2. Determinación de autoanticuerpos contra GFAP y S100β en pacientes con diabetes tipo 1............................................................................................................................ 80 2.3.2.1. Diseño de un ensayo de ELISA y western blot para la detección de autoanticuerpos contra GFAP ................................................................................................................. 80 2.3.2.2. Detección ex vivo de autoanticuerpos anti-GFAP por inmunofluorescencia .................. 81 2.3.2.3. Diseño de un ensayo de ELISA y western blot para la detección de autoanticuerpos contra S100β ................................................................................................................. 82 2.3.3. Péptidos derivados de S100β procesados y presentados de manera natural por el alelo de histocompatibilidad HLA-DRB1*04:01 ........................................................... 84 2.3.3.1. Puesta a punto del sistema de presentación de antígeno (SPA) ...................................... 84 2.3.3.2. Crecimiento de células Priess con el SPA ....................................................................... 85 2.3.3.3. Preparación de la columna de afinidad anti-DR/proteína A ........................................... 86 2.3.3.4. Inmunopurificación de DR4 de extractos de células Priess.Fraccionamiento por RP-HPLC ................................................................................................................ 88 2.3.3.5. Espectrometría de masas. Selección de péptidos consenso ............................................. 89 2.3.3.6. Unión de los péptidos consenso derivados de S100β a la molécula DR4. Estabilidad del complejo péptido/DR4........................................................................... 91 2.3.3.7. Análisis por ELISPOT (IFN-γ, IL-10, IL-17) de la inmunogenicidad de los péptidos consenso derivados de S100β en sujetos control y pacientes diabéticos........ 92 2.3.4. Péptidos derivados de S100β procesados y presentados de manera natural por el alelo de histocompatibilidad HLA-A*02:01 .................................................................. 94 2.3.4.1. Clonaje de S100β en pcDNA 3.1 (+)/Zeo ....................................................................... 94 2.3.4.2. Transfección de las células A2.1/K562 con S100β. Comprobación de la expresión de S100β ............................................................................................... 94 2.3.4.3. Crecimiento de K562/A2.1 y K562/A2.1-S100β. Preparación de extractos con citrato ........................................................................................................ 98 2.3.4.4. Purificación de péptidos por extracción por fase sólida. Fraccionamiento por RP-HPLC ................................................................................................................ 99 2.3.4.5. Espectrometría de masas. Síntesis de péptidos candidatos.............................................. 99 2.3.4.6. Digestión in vitro de S100β por el proteosoma. Identificación de . extremos carboxi-terminales.......................................................................................... 100 2.3.4.7. Ensayo de estabilización de A2.1 de los péptidos candidatos........................................ 101 2.3.5. Generación de hibridomas de linfocitos T infiltrantes de islotes de Langerhans de NOD: estudio preliminar de su especificidad............................................ 102 2.3.6. Análisis de la expresión de galectinas...................................................................................... 107 2.3.6.1. Aislamiento celular, cultivo y polarización ................................................................... 107 2.3.6.2. Cuantificación de ARNm de galectina-1 y -3, Tbet, GATA3 y RORC2....................... 108 2.3.6.3. Western blot de extractos celulares para galectina-1 y -3.............................................. 110 2.3.6.4. Cuantificación de galectinas y citocinas en medio de cultivo mediante ELISA............ 111 2.3.6.5. Detección de galectina-1 de superficie y tinción con PHA-L ....................................... 112 2.3.6.6. Eliminación de los ligandos de las galectinas de la superficie de linfocitos T .............. 112 3. Capítulo 3: Clonación, expresión y purificación de autoantígenos importantes en la diabetes tipo 1 ............................................................................................................... 113 3.1. Clonaje, expresión y purificación de la glucosa-6-fosfatasa específica de los islotes (IGRP)............................................................................................................................. 115 3.2. Clonaje, expresión y purificación de la proteína ácida de la glía (GFAP) ................................ 118 3.3. Clonaje, expresión y purificación de S100β................................................................................... 120 3.4. Resumen............................................................................................................................................ 122 4. Capítulo 4: Determinación de autoanticuerpos contra GFAP y S100β en pacientes con diabetes tipo 1 ...................................................................................................................................... 123 4.1. Determinación de autoanticuerpos contra GFAP ........................................................................ 125 4.2. Determinación de autoanticuerpos contra S100β ......................................................................... 133 4.3. Resumen ........................................................................................................................................... 140 5. Capítulo 5: Péptidos derivados de S100β procesados y presentados de manera natural por el alelo de histocompatibilidad de clase II DRB1*04:01 .................................................................141 5.1. Optimización del sistema de presentación de antígeno (SPA) ..................................................... 143 5.2. Crecimiento de células Priess con el SPA, inmunopurificación de DR4 y elución de péptidos presentados por dichas moléculas de histocompatibilidad ...................................... 146 5.3. Fraccionamiento de péptidos por RP-HPLC y análisis mediante espectrometría de masas..... 148 5.4. Unión a la molécula de histocompatibilidad DR4 de los péptidos consenso derivados de S100β. Estabilidad del complejo péptido/DR4....................................................... 162 5.5. Análisis mediante ELISPOT (IFN-γ, IL-10, IL-17) de la inmunogenicidad de los péptidos consenso de S100β en sujetos control y pacientes diabéticos ...................................... 170 5.6. Resumen............................................................................................................................................ 181 6. Capítulo 6: Péptidos derivados de S100β procesados y presentados de manera natural por el alelo de histocompatibilidad de clase I HLA-A*02:01 ................................................................. 183 6.1. Clonaje de S100β y generación de la células presentadoras de antígeno K562/A2.1-S100β ..... 185 6.2. Crecimiento de K562/A2.1 y K562/A2.1-S100β: purificación y fraccionamiento de epitopos procesados y presentados de manera natural por la molécula HLA-A*02:01 ........... 189 6.3. Espectrometría de masas e identificación de masas únicas.......................................................... 191 6.4. Determinación de la capacidad de generación por proteosoma y de la unión a HLA-A*02:01 por parte de los péptidos identificados por espectrometría de masas ....................................... 195 6.5. Resumen............................................................................................................................................ 200 7. Capítulo 7: Obtención de hibridomas de linfocitos T infiltrantes de islotes de Langerhans en NOD: determinación de su reactividad frente a S100β ..................................................................... 201 7.1. Obtención de hibridomas de linfocitos T a partir de linfocitos T infiltrantes de islotes de Langerhans de ratones NOD ................................................................................................... 203 7.2. Determinación preliminar de la expecificidad antigénica de hibridomas de linfocitos T ......... 205 7.3. Resumen............................................................................................................................................ 209 8. Capítulo 8: Importancia de las galectinas en los linfocitos T colaboradores: síntesis de galectina-1 en la diabetes tipo 1 ............................................................................................................... 211 8.1. Estudio del patrón de síntesis de galectina-1 y -3 por parte de diferentes subtipos de linfocitos T colaboradores (Th) ...................................................................................................... 213 8.2. Síntesis in vitro de las galectinas-1 y -3 en pacientes con diabetes tipo 1 y controles sanos ...... 219 8.3. Estudio de la secreción de galectina-1 y citocinas por distintos tipos celulares en sujetos control y pacientes diabéticos: células CD4-, CD4+, Th17 y linfocitos T reguladores ............... 222 8.4. Estudio del nivel de galectina-1 en la superficie celular y su relación con azúcares de superficie en distintos tipos celulares ....................................................................................... 229 8.5. Efecto de la eliminación de los ligandos naturales de las galectinas sobre el comportamiento in vitro de linfocitos T ........................................................................................ 238 8.6. Resumen ........................................................................................................................................... 240 9. Capítulo 9: Discusión .............................................................................................................................. 241 10. Conclusiones ............................................................................................................................................ 263 11. Publicaciones derivadas de la presente investigación ........................................................................... 267 12. Bibliografía............................................................................................................................................... 271 Capítulo 1: Introducción C Ca ap pí ít tu ul lo o 1 1: : I In nt tr ro od du uc cc ci ió ón n. . 1 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. 2 Capítulo 1: Introducción 1.1. Introducción histórica. “Agua del lago donde beben los pájaros, fibras de la planta asit, leche fresca, arbusto remojado en cerveza, flores del pepino y dátiles no maduros”. Éste es el primer tratamiento conocido para la diabetes, descrito en el papiro de Ebers encontrado en 1862 en Luxor, Egipto. Este papiro constituye uno de los primeros tratados médicos conocidos (siglo XV antes de Cristo), con 110 páginas conteniendo 700 fórmulas magistrales y remedios para distintas patologías. En él se describe una enfermedad de características muy semejantes a las de la diabetes, así como su tratamiento, cuya finalidad principal era disminuir la poliuria observada en los enfermos. También la antigua literatura hindú en los Vedas describe pacientes cuya orina atrae a las hormigas, resultando ser pegajosa y con sabor a miel. De hecho Súsruta, el padre de la medicina hindú, ya describió la enfermedad y clasificó a los pacientes en pacientes jóvenes y delgados y que morían pronto, y pacientes obesos y mayores, lo que claramente se relaciona con la diabetes tipo 1 y la tipo 2. El término “diabetes” fue probablemente acuñado por Areteo de Capadocia de los términos Dia "a través" y Betes "pasar", para describir que el agua pasaba a través del paciente sin permanecer en él mucho tiempo, generando un estado de debilidad, sed y poliuria. No fue hasta finales del siglo XVIII cuando John Rollo añadió el término “mellitus” (miel en latín) para diferenciar la poliuria producida por diabetes de otros tipos de poliuria. Hasta el siglo XIX se pensó que la causa de la diabetes provenía del riñón, pero en ese siglo Minskowski y von Mering pancreatomizaron un perro, descubriendo que el animal acababa desarrollando todos los síntomas de una diabetes severa, con poliuria, polidipsia, polifagia, hiperglucemia y glucosuria. Este descubrimiento llevó a muchos investigadores a intentar purificar del páncreas la sustancia que regulaba los niveles de azúcar. Por ese entonces Paul Langerhans había observado unos racimos de células pancreáticas bien diferenciadas de las demás y que finalmente se llamaron islotes de Langerhans, descubriéndose que presentaban actividad exocrina. Shafer y otros observaron que la diabetes estaba ocasionada por la carencia de una proteína producida en las células de los islotes de Langerhans y que denominaron insulina. Sus intentos por tratar a pacientes diabéticos con extractos de páncreas fueron infructuosos, seguramente por la presencia de proteasas en los extractos. Uno de los descubrimientos importantes y críticos en el tratamiento de esta enfermedad, y que les valió el premio Nobel, 3 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. fue llevado a cabo por Banting y Best cuando consiguieron obtener un extracto de páncreas de perro libre de tripsina, el cual comprobaron que reducía o anulaba la glucosuria en perros donde se había inducido una diabetes experimental. Tiempo después aplicaron este extracto a un paciente de 14 años, alargando su vida en 12 años más. A partir de entonces los descubrimientos acerca de la etiología y tratamiento de la diabetes han ido creciendo exponencialmente hasta nuestros días, desde el descubrimiento de la estructura primaria de la insulina a la producción de insulina recombinante y mecanismos de detección más tempranos, mejorando significativamente la esperanza y calidad de vida de estos enfermos. 1.2. Clasificación de la diabetes. La diabetes se puede definir como un desorden metabólico provocado bien por una deficiencia en la producción de insulina por parte de las células β de los islotes de Langerhans o por una resistencia de los tejidos periféricos al efecto de la insulina, cursando con hiperglicemia y glucosuria. A día de hoy se distinguen diferentes tipos de diabetes en función de su etiología y cuya clasificación ha sido establecida por la Asociación Americana para la Diabetes (ADA) (Expert Committee on the diagnosis and classification of Diabetes Mellitus. 2003):  Diabetes tipo 1. Caracterizada por la destrucción de las células β del páncreas con la consiguiente deficiencia absoluta de insulina. Se consideran dos subtipos: o Diabetes tipo 1 autoinmune. También denominada T1DM (“type 1 diabetes mellitus”) o diabetes insulino-dependiente, la cual se caracteriza por estar fuertemente asociada al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), por la presencia de autoanticuerpos específicos contra antígenos de los islotes de Langerhans y por la dependencia de insulina. Los pacientes suelen desarrollar la enfermedad antes de los 30 años. o Diabetes tipo 1 idiopática. De etiología desconocida y en la que no existe evidencia de autoinmunidad contra la célula . Tiene un carácter fuertemente hereditario y no se ha encontrado asociación con ningún haplotipo del sistema HLA. Los pacientes con este tipo de diabetes son de origen africano o asiático. 4 Capítulo 1: Introducción  Diabetes tipo 2. También denominada diabetes no insulinodependiente. Este tipo de diabetes comprende situaciones que van desde una fuerte resistencia a la insulina con deficiencia relativa en la secreción a una secreción fuertemente disminuida de insulina con resistencia moderada. Aparece de manera más habitual en adultos, siendo la mayoría de ellos obesos, y sólo una porción de los pacientes acaba necesitando tratamiento crónico con insulina.  Otros tipos de diabetes. Causados por defectos en la función de las células β o en la propia insulina, como por ejemplo la diabetes juvenil de debut tardío (MODY, “maturity onset diabetes of the young”); enfermedades del páncreas exocrino como las pancreatitis; endocrinopatías como la acromegalia; la diabetes inducida por drogas o compuestos químicos como por ejemplo la diabetes inducida por el raticida 1-(4-nitrofenil)-3-(3-piridilmetil) urea (“Vacor”); la diabetes inducida por infecciones como la rubéola congénita; formas poco frecuentes de diabetes inmune como el síndrome de la persona rígida (“Stiff-man sindrome”); y otros síndromes genéticos asociados a veces con la diabetes como es el síndrome de Down.  Diabetes gestacional. Intolerancia a la glucosa que comienza o es detectada por primera vez durante el embarazo y que en la mayoría de los casos desaparece tras el parto. En el presente estudio nos hemos centrado en el estudio de la diabetes tipo 1 autoinmune (T1DM), enfermedad causada por la muerte de las células β iniciada y/o acelerada por desencadenantes ambientales aún por definir y que tiene lugar en individuos con una predisposición genética a la enfermedad (Winter y cols. 2010). Aunque este tipo de diabetes se puede controlar con inyecciones de insulina, los pacientes que la presentan pueden desarrollar complicaciones a largo plazo como ceguera, fracaso renal, y complicaciones micro y macrovasculares que pueden conducir a la muerte. En esta patología las células β del páncreas, productoras de insulina, son atacadas por el sistema inmune del propio individuo, ataque en el que parecen participar tanto linfocitos T CD4+ y CD8+ autorreactivos (Yoon y cols. 2005), siendo las dianas moleculares sobre las que actúan muy dispares y heterogéneas (Lieberman y cols. 2003a). 1.3. Etiología de la diabetes tipo 1. En el desarrollo de la T1DM autoinmune están implicados tanto factores genéticos como ambientales. El concepto tradicional sobre el origen de esta enfermedad es que factores 5 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. ambientales, tales como agentes microbianos y químicos, pudieran actuar como iniciadores de la respuesta inmune contra la célula β en un individuo genéticamente predispuesto al desarrollo de la enfermedad (Peng y cols. 2006; Rabinovich. 1994). Esta enfermedad constituye el paradigma de la autoinmunidad órgano-específica (Somoza y cols. 1994). Comprender la compleja relación que existe entre los factores genéticos, los factores ambientales y los componentes inmunológicos de la enfermedad en relación con los antígenos propios y extraños es la conditio sinequa non para proponer estrategias válidas contra la diabetes y eventualmente plantear aproximaciones terapéuticas posibles y seguras (Bertera y cols. 1999). Con la idea de entender mejor dicha relación repasaremos a continuación los factores genéticos, ambientales y los aspectos inmunológicos que se han relacionado con la patogénesis de la T1DM quedando, no obstante, muchas lagunas en el conocimiento de la misma. 1.3.1. FACTORES GENÉTICOS. La susceptibilidad de desarrollar T1DM es hereditaria y existen diferencias marcadas en el riesgo de padecerla en función de la relación familiar con el paciente diabético. En este sentido, el riesgo máximo se produce en los gemelos monocigóticos de los pacientes afectados, seguido de los familiares en primer, segundo y tercer grado. Si el paciente es el padre, el riesgo de que el hijo desarrolle la enfermedad es del 6%; sin embargo, si es la madre este riesgo se encuentra entre el 1 y el 4%, variando en función de la edad a la que se conciba el hijo. Si el debut diabético de la madre tuvo lugar antes de los 11 años de edad este riesgo se duplica (American Diabetes Association). Se sabe que hijos de madres con autoanticuerpos relacionados con la diabetes poseen al nacer títulos detectables de anti-GAD65 o anti-IA2, los cuales desaparecen con el tiempo, y estos niños presentan un menor riesgo de desarrollar la enfermedad en los siguientes 5-8 años, de forma que parece que la presencia de estos autoanticuerpos en el nacimiento transferidos vía materna protege o retrasa, al menos parcialmente, la aparición de la T1DM. Quizás esto influya en el distinto porcentaje de riesgo observado según si el progenitor diabético del individuo en consideración sea el padre o la madre (Peng y cols. 2006). Existen varios loci que confieren susceptibilidad a padecer T1DM de los cuales la región del antígeno leucocitario humano (HLA; locus IDDM1 o “insulin-dependent diabetes mellitus 1”) es el más importante; otros loci importantes identificados hasta la fecha son el 6 Capítulo 1: Introducción locus del gen de la insulina o IDDM2, el locus del gen de la tirosina fosfatasa LYP (PTPN22), el locus del antígeno-4 asociado al linfocito T citotóxico (CTLA-4) o el locus para la cadena α del receptor de la IL-2 (IL2RA), aunque existen otros loci minoritarios que también aportan cierto riesgo (para una revisión de los datos expuestos a continuación consultar Jahromi y cols. 2006). 1.3.1.1. El complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). La principal región génica asociada con la predisposición o protección frente al desarrollo de la T1DM es la región del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), la cual aporta el 40-50% del riesgo genético a padecer la enfermedad. Incluye una región única de genes estrechamente ligados en el cromosoma 6 humano (6p21.31), cuyos productos aparecen representados de forma notable en las superficies celulares y constituyen una barrera frente a los transplantes. En el ser humano la región del MHC se denomina también región del antígeno leucocitario humano (HLA o “human leukocyte antigen”). Dentro de esta región del MHC se distinguen tres regiones importantes en función de los productos génicos codificados:  Región del MHC de clase I. Se encuentran los loci para las denominadas moléculas de histocompatibilidad de clase I. Estas moléculas se expresan en la superficie celular de casi todas las células. De todos los loci identificados, tres de ellos (HLA-A, -B y –C) codifican antígenos importantes en la respuesta inmune y definidos a nivel serológico. Cada uno de estos antígenos de clase I consta de una cadena pesada polimorfa (cadena α) con tres dominios extracelulares, de los cuales dos de ellos determinan la especificidad de unión a antígenos de la molécula; y una subunidad β2-microglobulina invariable, común para los tres loci de clase I y cuyo gen se encuentra en el cromosoma 2 (Figura 1A y 1C).  Región del MHC de clase II. Los antígenos expresados por los genes presentes en estos loci se expresan, en condiciones normales, sólo en los linfocitos B, algunos monocitos y los linfocitos T activados. También en este caso, tres de los loci presentes en esta región (HLA-DR, -DQ y -DP) codifican antígenos que participan directamente en la respuesta inmune. Los antígenos de clase II constan de dos cadenas polipeptídicas polimorfas ( y β), con la excepción de las moléculas de histocompatibilidad DR donde sólo la cadena  es polimorfa. Ambas cadenas 7 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. ya que algunos estudios han identificado virus en islotes de Langerhans de pacientes con diabetes tipo 1 (Yoon y cols. 1979; Hashimoto y cols. 2003). También es posible que esta autoinmunidad venga determinada por procesos de mimetismo molecular (Kaufman y cols. 1992), o por activación inespecífica de la respuesta inmune adaptativa debida a la activación de la respuesta inmune innata (Ellerman y cols. 1996). Quizás una de las relaciones más claras entre infecciones virales y el desarrollo de diabetes tipo 1 sea el del caso de la rubeóla, ya que más del 12% de niños con rubeóla congénita acabaron desarrollando la enfermedad (Ginsberg-Fellner y cols. 1985). De hecho, la progresión hacia la diabetes en pacientes con rubeóla congénita se ha asociado con la presencia de haplotipos que confieren susceptibilidad a la T1DM (Menser y cols. 1974). Sin embargo, y ya que la prevalencia de la rubéola ha disminuido significativamente en los últimos años, ésta no puede explicar el aumento en la prevalencia de la diabetes tipo 1. Aparte del virus de la rubéola, de todos los otros grupos víricos la familia de los Picornavirus es la que ha atraído mayor atención y la que ha sido más ampliamente estudiada. Así, se han asociado con el desarrollo de la T1DM infecciones con virus entéricos, especialmente el virus Coxsackie B, capaz de infectar selectivamente a las células β del islote. La infección con este virus provoca una expresión dos a tres veces superior de GAD65 en los islotes de ratones NOD, y la mayoría de los animales infectados desarrollan más tarde anticuerpos anti-GAD e hiperglucemia (Hou y cols. 1993). Es posible que la infección por este virus induzca la expresión aumentada de IFN-α, con el consiguiente aumento de la expresión de moléculas de HLA de clase I, hechos que son iniciadores de la respuesta autoinmune en islotes. Se ha detectado la presencia de infección por enterovirus, mediante detección de la proteína enteroviral de la cápside vp1, en el 61% de pacientes con T1DM de reciente diagnóstico, frente a sólo un 6% de controles, aunque el 40% de pacientes con diabetes tipo 2 también mostraron trazas de infección (Richardson y cols. 2009). Otro estudio que analizaba la presencia de ARN de enterovirus en suero por RT-PCR detectó que el 57% de los pacientes diabéticos presentaba ARN enterovírico durante los 6 meses previos a la primera aparición de autoanticuerpos, frente al 31% de controles (Lönnrot y cols. 2000). Además, en el intestino delgado del 75% de pacientes con T1DM se ha detectado la presencia de enterovirus, en comparación con el 10% de controles (Oikarinen y cols. 2007). Además de la posibilidad de que la propia infección desencadene autoinmunidad o exacerbe la ya existente, existen ciertos datos que apoyarían la hipótesis del mimetismo molecular, según la cual epitopos de las proteínas expresadas por el virus podrían ser 14 Capítulo 1: Introducción semejantes estructuralmente a moléculas no relacionadas codificadas por genes del huésped. Esta similitud antigénica pudiera dar lugar a una reacción cruzada de algunas células T activadas contra el agente infeccioso, que atacarían tejidos propios que tuvieran determinantes antigénicos similares. Esta similitud se ha demostrado entre la proteína P2C del Coxsackievirus B y el autoantígeno GAD65 (Vreugdenhil y cols. 1998), aunque estudios recientes parecen descartar esta posibilidad en el caso de linfocitos T CD8+ (Varela-Calviño y cols. 2004). Aunque existen estudios que relacionan el inicio de la reacción autoinmune en la T1DM e infecciones con enterovirus, estudios a gran escala como DAISY o BABY-DIAB no han encontrado esta asociación (Graves y cols. 2003; Füchtenbusch y cols. 2001). Otros autores han propuesto a los rotavirus como posibles agentes etiológicos de la T1DM ya que éstos constituyen una causa frecuente de gastroenteritis en niños y además podría darse una situación de mimetismo molecular entre proteínas víricas de rotavirus y los autoantígenos GAD65 e IA-2 (Honeyman y cols. 1998). El papel de otros virus en el inicio y/o desarrollo de la T1DM como citomegalovirus (Pak y cols. 1988), parvovirus (Kasuga y cols. 1996) y el virus de la encefalomiocarditis (Craighead y cols. 1968) han sido también objeto de estudio.  Bacterias. La composición bacteriana del intestino de pacientes con T1DM parece desempeñar un papel importante en la susceptibilidad y/o protección frente a la enfermedad. Se ha sugerido que la pared intestinal de pacientes diabéticos tipo 1 no tiene la suficiente capacidad para constituir una barrera eficaz que separe las bacterias del lumen del sistema inmune intestinal (Vaarala y cols. 2008). De este modo se aumenta la exposición de antígenos bacterianos al sistema inmune, teniendo lugar una activación inmune subclínica (WesterholmOrmio y cols. 2003), dando lugar a una función deficiente de los linfocitos Treg (Tiittanen y cols. 2008). Por otra parte, parece ser que la administración de probióticos podría prevenir la autoinmunidad en los islotes (Calcinaro y cols. 2005; Ljungberg y cols. 2006). En ratones NOD el mantenimiento en condiciones SPF (libres de patógenos específicos), así como el suministro de antibióticos, aumentan la prevalencia de la enfermedad, al disminuir la carga bacteriana a la que el ratón está expuesto, sugiriendo que algún tipo concreto de bacteria podría estar protegiendo de la aparición de la enfermedad. (Bach y cols. 2002). En el polo opuesto, ratones NOD deficientes en una proteína adaptadora para diversos receptores del 15 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. sistema inmune innato que reconocen estímulos microbianos (MyD88) no sufren diabetes tipo 1, aunque se les transfieran linfocitos T CD4+ diabetogénicos. La administración de antibióticos o el mantenimiento en condiciones SPF restableció el potencial de padecer la enfermedad. Se postula entonces que el reconocimiento anormal de algunas bacterias intestinales puede ser indispensable para el desarrollo de la diabetes en el ratón NOD, mediante una vía que se halla interrumpida en el ratón NOD deficiente para MyD88 (Wen y cols. 2008). 1.3.2.2. Factores dietéticos. Existen componentes de la alimentación que pueden influir en el inicio, desarrollo y/o protección de la diabetes tipo 1. Así, lactancia materna, zinc, vitaminas C, D y E parecen proteger de la aparición de la diabetes tipo 1, mientras que parece existir una relación entre la administración de determinados alimentos a edades tempranas como la leche de vaca, cereales/gluten, patatas, zanahorias o bayas y el desarrollo de T1DM; de la misma forma inhalación de compuestos N-nitrosos como los utilizados para curar la carne de oveja, o un consumo excesivo de calorías parecen favorecer el desarrollo de la enfermedad (Peng y cols. 2007). Se ha encontrado que los pacientes con T1DM presentan elevados títulos de anticuerpos contra la proteína láctea seroalbúmina bovina (BSA) y que estos anticuerpos reconocen principalmente un péptido de 17 aminoácidos derivado de ésta (ABBOS). Anticuerpos contra ABBOS reconocen además de forma cruzada una proteína presente en la superficie de las células β, lo que podría conllevar la muerte de dichas células, sugiriendo que la toma de leche de vaca podría influir en el desarrollo de la T1DM (Karjalainen y cols. 1992). Existen sin embargo varios estudios que descartan la asociación entre la inmunidad contra la leche de vaca y la autoinmunidad en las células β, incluyendo el estudio a gran escala DAISY (Diabetes Autoimmunity Study in the Young) (Atkinson y cols. 1993; Norris y cols. 1996). El consenso actual parece ser que más que un consumo temprano de leche de vaca, la menor duración de la lactancia materna junto con una mayor ingestión calórica a edades tempranas y/o una alteración de la inmunidad de la mucosa serían los verdaderos factores que aumentarían el riesgo de desarrollar la enfermedad. Una dieta libre de leche de vaca pero basada en cereales como el trigo causó una mayor incidencia de diabetes en ratones NOD, induciendo una polarización hacia un fenotipo tipo Th1 en el intestino (Flohé y cols. 2003). En cuanto a pacientes con T1DM, se ha 16 Capítulo 1: Introducción observado en ellos un mayor porcentaje de linfocitos T reactivos al gluten de trigo, afirmando que dicha exposición al gluten durante la infancia temprana podría influir en el debut de la T1DM (Klemetti y cols. 1998; Norris y cols. 2003). Sin embargo, más que iniciar la enfermedad se cree que, al igual que para la leche de vaca, la respuesta inmune no sería específica, sino más bien causada por defectos en la inmunidad de la mucosa intestinal (van Belle y cols. 2011). La vitamina D ha demostrado ser un claro factor protector en la diabetes tipo 1. De hecho, la aparición de la diabetes tiene lugar más frecuentemente durante el invierno, período en el que la intensidad y duración de la luz del sol es limitada, sintetizándose por ello menor cantidad de vitamina D. Esta vitamina inhibe la diferenciación de células dendríticas y la activación inmunitaria (Adorini y cols. 2008). Se han encontrado menores niveles de vitamina D en plasma de pacientes con T1DM de debut reciente respecto de controles (Littorin y cols. 2006), y el aumento en la ingesta de vitamina D disminuye la incidencia de la enfermedad en ratones NOD y en humanos (Mathieu y cols. 1994 y 2005). Sin embargo, el suministro de esta vitamina como agente terapéutico supone graves efectos secundarios, principalmente en el metabolismo óseo, por lo que la tendencia actual es la de desarrollar análogos de la vitamina D que carezcan de estos efectos (Mathieu y cols. 2002). 1.3.2.3. Factores perinatales. Los estudios DAISY y EURODIAB determinaron que, en niños con haplotipos HLA que confieran susceptibilidad a padecer T1DM, factores como una mayor edad de la madre, un parto complicado, incompatibilidad de grupos sanguíneos entre la madre y el feto (sistemas AB0 y Rh) y pre-eclampsia materna se asocian con un aumento en el riesgo de padecer la enfermedad por parte del niño (Stene y cols. 2004; Dahlquist y cols. 1999). Se ha estudiado la posibilidad de que la transferencia vía placenta de autoanticuerpos al feto por parte de madres con diabetes tipo 1 aumente el riesgo (Lindberg y cols. 1999), si bien otros estudios cuestionan esta afirmación (Stanley y cols. 2005). En lo que respecta a este tipo de factores se puede generalizar que un embarazo estresante junto con un mayor peso del niño al nacer predisponen moderadamente a padecer T1DM en un futuro (van Belle y cols. 2011). 1.3.2.4. Ambiente psicosocial: Se ha asociado el aumento en el estrés psicosocial con un aumento en el riesgo de padecer T1DM en individuos genéticamente predispuestos. Así, situaciones como la muerte de un familiar, guerra, discusiones entre los padres, ataques físicos, e incluso climas fríos, 17 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. tanto sobre el niño como sobre su familia, se asocian con un mayor riesgo de padecer T1DM, ya que estas situaciones pueden afectar negativamente al niño debido a la relación existente entre los niveles hormonales y las señales nerviosas, que acaban influyendo tanto en la sensibilidad a la insulina como a los requerimientos de esta hormona y al funcionamiento del propio sistema inmune (Sepa y cols. 2005; Thernlund y cols. 1995). 1.4. El sistema inmune: su papel en la diabetes tipo 1. Las moléculas de histocompatibilidad de clase I y II unen péptidos durante su maduración y transporte hacia la superficie de las células presentadoras de antígenos (CPAs), de forma que proporcionan una actualización continua de la composición proteica intracelular y exógena, respectivamente, de la célula para su escrutinio por los linfocitos T. El reconocimiento de antígeno conlleva a la activación del linfocito T, su proliferación y diferenciación en una célula efectora cuyo fenotipo puede ser tremendamente variable y que influye de forma decisiva en el tipo de respuesta adaptativa resultante. En esta sección se introducirán de forma muy resumida estos aspectos y su relación con el desarrollo y evolución de la T1DM. 1.4.1. PROCESAMIENTO DE ANTÍGENOS Y SU PRESENTACIÓN A LINFOCITOS T CD4+. La mayoría de los péptidos antigénicos que estimulan la respuesta de linfocitos T CD4+ derivan de proteínas exógenas, las cuales son capturadas por diversas células presentadoras de antígenos mediante procesos de endocitosis mediada por receptor, fagocitosis y/o macropinocitosis. La eficiencia en la captura de antígeno es un factor clave que determina el nivel de expresión de los péptidos antigénicos derivados de éste unidos a moléculas del MHC de clase II (Lanzavecchia, 1990). Dicha eficiencia está determinada por i) la presencia de receptores específicos o semi-específicos para el antígeno, ii) la agrupación de estos receptores en regiones endocíticas como las recubiertas por clatrina, iii) la actividad endocítica general de la célula y iv) la forma física del antígeno (Colin, 1997). Una vez endocitado por la CPA, parece que una segunda etapa de clasificación y direccionamiento de estas vesículas endocíticas es necesaria para que se generen y presenten la mayoría de los epitopos antigénicos capaces de estimular linfocitos T CD4+ (Mitchell y cols. 1995). Las moléculas del MHC de clase II están formadas por un dímero αβ (Figura 1) el cual interacciona con la denominada cadena invariable (Ii), formando un complejo que permite su transporte eficiente desde el retículo endoplasmático pero que impide que dichas moléculas 18 Capítulo 1: Introducción puedan interaccionar con ligados peptídicos (Cresswell, 1994), debido a que la hendidura de unión está ocupada por la región CLIP de la cadena invariable (Cresswell, 1996). La mayoría de estos complejos son dirigidos directamente hacia los endosomas por el motivo similar a dileucinas de la cadena Ii, lo que permite su interacción con antígenos endocitados (Wolf y cols. 1995). La cadena Ii es eliminada mediante la acción conjunta de proteasas, pH ácido y de la molécula DM (Kropshofer y cols. 1995; Roche, 1995). La molécula DM codificada en la región del MHC media la liberación de CLIP y otros péptidos de baja afinidad y favorece la captura de péptidos, incluyendo péptidos antigénicos, que se unen estrechamente a la molécula de clase II. Una vez ensamblados los complejos molécula MHC de clase II-péptido, éstos son enviados a la superficie celular donde pueden persistir y acumularse durante días, dando la oportunidad a una célula presentadora de antígeno de interaccionar con un linfocito T CD4+ específico para dicho péptido antigénico (Figura 2). Las proteasas responsables del procesamiento antigénico y de la cadena invariable no están bien definidas. El conocimiento actual de este proceso está basado en i) el uso de inhibidores de proteasas, ii) la localización de dichas proteasas en células y compartimentos subcelulares específicos, y iii) intentos de reconstruir in vitro el procesamiento de antígenos, y de la cadena Ii, empleando proteasas purificadas. De todas formas, se sabe que las catepsinas, un grupo de aspartato (catepsinas D y E) y cisteína proteasas (catepsinas B, L, S y H), son proteasas que participan activamente en este proceso (Colin, 1997). Además, diversos estudios han demostrado que la reducción de puentes disulfuro es importante en la presentación antigénica, algo esperado ya que muchos epitopos antigénicos contienen cisteínas que se sabe están implicadas en la formación de dichos puentes en la proteína nativa (Collins y cols. 1991). Es importante señalar que la presentación efectiva de un epitopo antigénico requiere un balance entre la generación y la destrucción de dicho péptido de forma que la actividad endopeptidasa de enzimas como las catepsinas D, E, L y S pueden ser importantes a la hora de generar epitopos de linfocitos T pero también pueden destruirlos, así como la actividad exopeptidasa amino-terminal o carboxi-terminal de las catepsinas H y B, respectivamente (Rodríguez y cols. 1992). La unión de péptidos antigénicos a las moléculas del MHC de clase II implica varios enlaces de hidrógeno entre residuos aminoacídicos presentes en la hendidura de unión a péptidos y en el esqueleto peptídico, así como contactos entre cadenas laterales de aminoácidos del péptido y de la hendidura de la molécula de clase II (Stern y cols. 1994). A diferencia de lo que ocurre en las moléculas de histocompatibilidad de clase I (ver apartado 19 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. 4.2.), los extremos de la hendidura de unión a péptidos de las moléculas de clase II están abiertos por los extremos y no limitan la longitud de los péptidos presentados por estas moléculas. De hecho la secuenciación de los péptidos unidos asociados a las moléculas de clase II ha identificado péptidos de longitudes comprendidas entre los 10 y 34 residuos (Rudensky y cols. 1991). Además, muchos de esos péptidos asociados con las moléculas de clase II comprenden grupos solapantes de péptidos que comparten una misma secuencia central pero que varían en la longitud de sus extremos aminoy carboxilo-terminal. 1.4.2. PROCESAMIENTO DE ANTÍGENOS Y SU PRESENTACIÓN A LINFOCITOS T CD8+. Las moléculas del MHC de clase I unen péptidos derivados de proteínas celulares y los presentan en la superficie celular para su escrutinio por linfocitos T CD8+. De esta manera, el sistema inmune proporciona un sistema continuo de vigilancia frente a células infectadas por virus y células tumorales comprobando si las células expresan antígenos desconocidos. Las moléculas del MHC de clase I son moléculas heterodiméricas, formadas por una cadena  variable y una cadena constante denominadaβ2-microglobulina (Figura 1) las cuales se ensamblan en el retículo endoplasmático (RE) (para una revisión consultar York y cols. 1996). Antes de unirse a un péptido, las moléculas de clase I recién sintetizadas son retenidas en el RE, mediante interacciones con diversas chaperonas moleculares como la calnexina (Williams y cols. 1995) y otras proteínas asociadas como la tapasina (Ortmann y cols. 1997). En ausencia de un péptido apropiado, los heterodímeros de clase I son intrínsecamente inestables y se disocian rápidamente a temperatura fisiológica. La unión de un péptido de una longitud comprendida entre los 8 y 10 residuos estabiliza el heterodímero y permite su transporte hacia la membrana plasmática (York y cols. 1996). La mayoría de los epitopos antigénicos unidos a moléculas de clase I son generados a partir de proteínas normalmente presentes en el citoplasma celular. La prueba definitiva de que el citoplasma es el lugar donde se generan la mayoría de estos péptidos vino del análisis de células mutantes carentes del transportador TAP (“transporter of antigen presentation”) (Townsend y cols. 1989). Esta proteína integral de la membrana del RE es un miembro de la familia ABC de transportadores dependientes de ATP y cuya función es la de transportar péptidos, de forma más eficiente aquellos con longitudes comprendidas entre los 7 y 15 aminoácidos, desde el citoplasma al RE (Momburg y cols. 1998). En células deficientes en TAP, la mayoría de las moléculas de clase I no pueden unir péptidos y son retenidas en el RE (Momburg y cols. 1998). 20 Capítulo 1: Introducción La mayoría de los epitopos peptídicos presentados a linfocitos T CD8+ son generados en la célula por las mismas rutas proteolíticas responsables del reciclado continuo de proteínas citosólicas y nucleares (Kenneth y cols. 1999). Prácticamente todas las proteínas celulares están sometidas a un ciclo de degradación y síntesis continuo (Goldberg y cols. 1976). La tasa de degradación de cada proteína es muy variable y va desde unos pocos minutos hasta semanas (Kenneth y cols. 1999). Además, las células eliminan muy eficientemente proteínas plegadas incorrectamente, dañadas o mutantes con conformaciones anormales, lo que previene su acumulación (Rechsteiner y cols. 1987; Hershko y cols. 1992). Hace tiempo se había demostrado que la degradación no lisosomal de proteínas requería ATP (Gronostajski y cols. 1985), lo que llevó a la identificación del proteosoma 26S, un complejo multiproteico, como el mecanismo principal de proteolisis citoplasmática y, en definitiva, de generación de epitopos antigénicos presentados por moléculas de clase I (Hershko y cols. 1992) (Figura 2). La estructura tridimensional de varios complejos molécula de clase I-péptido muestran que los péptidos se unen a la molécula de clase I principalmente a través de sus extremos aminoy carboxilo-terminales y las cadenas laterales de algunos residuos internos (Madden, 1995). Los bolsillos complementarios formados por aminoácidos que rodean la hendidura de unión a péptidos varían debido al extenso polimorfismo de estas moléculas de histocompatibilidad, y como resultado cada molécula de histocompatibilidad prefiere conjuntos de péptidos con secuencias consenso diferentes caracterizadas por la conservación de algunos tipos de aminoácidos en posiciones concretas del péptido (Shastri y cols. 1998). Hoy en día estas secuencias consenso han sido establecidas para un gran número de moléculas de histocompatibilidad (Engelhard, 1994; Rammensee y cols. 1995), permitiendo el desarrollo de algoritmos pensados para predecir epitopos antigénicos capaces de estimular linfocitos (Shastri, 1996; van den Eynde y cols. 1997). En general, los péptidos unidos a las moléculas de histocompatibilidad de clase I poseen una longitud comprendida entre los 8-10 aminoácidos, contienen uno o varios residuos internos conservados y comparten un residuo alifático, aromático o cargado positivamente en su extremo carboxilo-terminal (Shastri y cols. 1998). 21 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. RE ApG Núcleo Clase I Clase II Proteosoma Péptidos MHC clase I TAP Cadena invariante CLIP MHC clase II Proteína citosólica Antígeno extracelular HLA-DM Figura 2. Procesamiento de antígenos y presentación por moléculas de histocompatibilidad de clase I y de clase II. En el caso de proteínas citosólicas (propias o derivadas de patógenos) las proteínas son degradadas por el proteosoma, generándose péptidos que entran al retículo endoplasmático (RE) a través del transportador asociado al procesamiento de antígeno (TAP). Por su parte la cadena α del MHC-I y la β2-microglobulina se asocian en el RE, no adoptando el plegamiento correcto hasta la unión de un péptido que haya entrado a través del TAP. Tras la unión MHC-péptido la molécula es enviada vía aparato de Golgi (ApG) a la membrana celular. En el caso de antígenos extracelulares el antígeno es fagocitado y degradado por proteasas endosomales. Por su parte las cadenas α y β de la molécula MHC-II son ensambladas en el RE junto con la cadena invariante (Ii), que impide la unión de péptidos presentes en el RE a moléculas del MHC-II. Tras su paso por el ApG la cadena invariante es degradada de tal modo que sólo una pequeña porción (CLIP) permanece bloqueando el sitio de unión. Tras la fusión con vesículas endocíticas, la molécula HLADM libera el fragmento CLIP y los péptidos contenidos en las vesículas se unen a la molécula MHCII, presentándose finalmente el complejo MHC-II/péptido en la superficie celular (adaptado de Janeway y cols. 2003). 22 Capítulo 1: Introducción 1.4.3. DIFERENCIACIÓN Y SUBTIPOS DE LINFOCITOS T CD4+: PLASTICIDAD DE LOS DIFERENTES LINAJES. En respuesta a un antígeno presentado mediante una molécula de histocompatibilidad de clase II, los linfocitos CD4+ o colaboradores (Th; “T helper”) se activan y diferencian para desarrollar una serie de papeles críticos durante la respuesta inmune adaptativa (Zhu y cols. 2008), como la colaboración con linfocitos B para inducir la síntesis de anticuerpos y el cambio de clase o el reclutamiento y activación de linfocitos T CD8+. Las distintas funciones desempeñadas por los linfocitos Th están determinadas por su patrón de secreción de citocinas y su localización tisular. En 1986 se demostró la existencia de clones de linfocitos Th, denominados Th1 y Th2, que diferían entre sí por el tipo de citocinas que secretaban (Mosmann y cols. 1986). Los linfocitos Th1 producen fundamentalmente IFN-, el cual es importante en la activación de macrófagos y la eliminación de patógenos intracelulares, mientras que los linfocitos Th2 secretan IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, las cuales son críticas en la síntesis de IgE, reclutamiento de esosinófilos y eliminación de parásitos extracelulares (Ansel y cols. 2006; Szabo y cols. 2003). Además, los linfocitos Th1 y Th2 están implicados en el desarrollo de numerosas enfermedades, de forma que el consenso existente hoy en día es el de que los linfocitos Th1 causan la mayoría de las enfermedades autoinmunes específicas de órgano, como la T1DM (ver adelante), mientras que los linfocitos Th2 son los responsables del asma y otras reacciones alérgicas. Con el descubrimiento de la IL-23, que comparte la subunidad p40 del receptor de la IL-12, se hizo patente el hecho de que muchas enfermedades autoinmunes atribuidas en un principio a linfocitos Th1 eran inducidas por otro subtipo de linfocito Th sensible a IL-23 (Cua y cols. 2003). Este nuevo linaje de linfocitos Th fue identificado como el linaje de linfocitos Th17, los cuales producen muchas citocinas incluyendo IL-17A, IL-17F, IL-22 e IL-21 (Harrington y cols. 2005; Park y cols. 2005). Además de su implicación en el desarrollo de enfermedades autoinmunes como esclerosis múltiple, lupus sistémico eritematoso, colitis mediada por linfocitos T y diabetes tipo 1 (Lock y cols. 2002; Wong y cols. 2000; Yen y cols. 2006; Honkanen y cols. 2010), los linfocitos Th17 también juegan un papel importante durante la respuesta inmune contra bacterias extracelulares y hongos (Weaver y cols. 2007). Finalmente, en el timo se genera un linaje de linfocitos T reguladores naturales (nTreg) (Sakaguchi, 2004). La señalización por parte de las citocinas IL-2 y el factor de 23 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. pueden inducir la apoptosis de células β mediada por Fas. Por otra parte, linfocitos B autorreactivos pueden funcionar como CPAs, mostrando el antígeno para el que son específicas por MHC-II a linfocitos T. El reconocimiento por parte del TCR, y las señales coestimuladoras de CD4 y CD40/CD40L ocasiona la activación del linfocito T, que a su vez activa al linfocito B, favoreciendo su conversión a célula plasmática. Esta célula producirá autoanticuerpos contra el antígeno de célula β para el que son específicas. Ya que las células β pueden actuar como CPAs mostrando péptidos propios por MHC-II, los autoanticuerpos generados podrán reconocer estos péptidos mostrados, ocasionando la muerte de la célula β mediada por células dependientes de anticuerpos (Modificado de Kukreja y cols. 1999). Sin embargo, el mecanismo que desencadena su activación y su infiltración en los islotes pancreáticos no está dilucidado existiendo básicamente tres modelos que intentan explicar cómo los linfocitos T autorreactivos son activadas durante el desarrollo de la enfermedad: 1. Hipótesis del mimetismo molecular (Oldstone, 2004; revisado en Christen y cols. 2004): basada en datos epidemiológicos, clínicos y experimentales que ponen de manifiesto la asociación entre los agentes infecciosos y los procesos autoinmunes. Asume que epitopos derivados de antígenos provenientes de agentes infecciosos podrían ser semejantes estructuralmente a aquellos derivados de autoantígenos. Esta similitud antigénica pudiera dar lugar a una reacción cruzada de algunos linfocitos T activados contra el agente infeccioso los cuales destruirían tejidos propios que tuviesen determinantes antigénicos similares. Sin embargo, el principal obstáculo para aceptar esta hipótesis como una explicación convincente en la etiopatogenia de la diabetes tipo 1 reside en la falta de evidencias directas de mimetismo molecular en T1DM en humanos. 2. Hipótesis de la proliferación de linfocitos T no específica de antígeno o “bystander T cell proliferation” (Tough y cols. 1996): esta hipótesis se basa en que, aunque las infecciones son capaces de inducir respuestas inmunes vigorosas, el aumento en el número total de células T no sólo es el resultado de la expansión de clones de linfocitos T antígeno-específicos, sino también de linfocitos T no antígeno-específicos reclutados al área de infección y estimulados por distintas citocinas secretadas durante la reacción inflamatoria. Esta estimulación no es dependiente del receptor de antígenos del linfocito T y podría ser provocada incluso por virus heterólogos en tanto en cuanto son agentes infecciosos y pueden promover la liberación de citocinas como el IFN- y el IFN-β. Esta hipótesis fue contrastada con la del mimetismo molecular para 30 Capítulo 1: Introducción explicar específicamente el mecanismo inmunopatológico que daría lugar a la T1DM en respuesta a la infección por virus coxsackie B (Horwith y cols. 1998). Se observó cómo la infección vírica era capaz de activar indirectamente linfocitos T autorreactivos, que podrían generar un daño inicial del tejido pancreático. Las células β dañadas liberarían autoantígenos previamente ignorados que pudieran activar un proceso autoinmune, provocando insulitis y finalmente síntomas clínicos. 3. Hipótesis de la proliferación de linfocitos T mediada por superantígenos (Conrad y cols. 1994): hipótesis propuesta en base a los resultados obtenidos en la caracterización de linfocitos T que infiltraban el páncreas de niños que murieron al inicio de la enfermedad. Los superantígenos interaccionan con los heterodímeros del MHC de clase II y con los receptores de antígeno de linfocitos T en una configuración trimolecular inusual que activa todos aquellos linfocitos T que poseen cadenas β del receptor de linfocitos T concretas (Vβ). Debido a esta característica, los superantígenos pueden activar hasta el 30% del total de linfocitos T de un individuo dependiendo de la frecuencia inicial de linfocitos con esa región V específica. De esta manera, aquellas infecciones en las que el agente causal expresase un superantígeno, durante la estimulación masiva de linfocitos T se encontrarían algunos con capacidad autorreactiva que iniciarían la destrucción de las células  de los islotes. 1.5. Autoanticuerpos y Autoantígenos. 1.5.1. AUTOANTICUERPOS CLÁSICOS. Uno de los primeros signos del desarrollo de la diabetes tipo 1 así como de la intervención del sistema inmune en el desarrollo de la enfermedad es la generación de autoanticuerpos, que preceden en varios meses e incluso años a la aparición de síntomas clínicos de la enfermedad. Los autoanticuerpos son sintetizados por el sistema inmune cuando éste falla en la distinción de lo propio y lo no propio (Wong y cols. 2005a). Para que la síntesis de autoanticuerpos pueda tener lugar, el autoantígeno correspondiente debe estar accesible al sistema inmune para que pueda tener lugar la inmunización. Con la excepción de la insulina y la carboxipeptidasa H, todos los autoantígenos descritos en la T1DM son intracelulares. La 31 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. liberación de estos antígenos intracelulares es posiblemente el resultado de la destrucción, mediada por el sistema inmunitario, de las células  pancreáticas haciendo disponibles a linfocitos B y T CD4+ antígenos normalmente secuestrados en el interior celular (Yoon y cols. 2005). La presencia de autoanticuerpos para proteínas específicas presentes en los islotes pancreáticos, los hoy conocidos como anticuerpos de células de islote (ICA, “islet cell antibodies”), fue descrita por primera vez hace 37 años mediante estudios de inmunofluorescencia indirecta sobre secciones de páncreas (Bottazzo y cols. 1974). Como los autoanticuerpos presentes en ICAs reconocen autoantígenos específicos, estudios posteriores han tratado de identificar dichos antígenos demostrándose la amplia variedad de proteínas que son objeto de la respuesta humoral en la diabetes de tipo 1 humana (Tabla 1). Características Autoantígeno Referencia Carboxipeptidasa H Yang y cols. 2008b Insulina Palmer y cols. 1983 Proinsulina Kuglin y cols. 1990 Insulina, procesamiento y almacenamiento ZnT8 Wenzlau y cols. 2008 IA-2A Verge y cols. 1996 Tirosina fosfatasas IA-2β Kawasaki y cols. 1996 Anhidrasa carbónica II Taniguchi y cols. 2001 Antígeno pancreático de 30 kDa relacionado con el quimiotripsinógeno Kim y cols. 1993 ADN topoisomerasa II Chang y cols. 1996 Descarboxilasa del ácido glutámico (GAD) Baekkeskov y cols. 1990 Enzimas Descarboxilasa de 51 kDa de Laminoácidos aromáticos Rorsman y cols. 1995 Diversas Aminoacil-ARNt sintetasa Park y cols 2010 Glima 38 Aanstoot y cols. 1996 GLUT2 Johson y cols. 1990 Glucolípido Cabrera-Rode y cols. 1995 Gangliósido del islote GM-2 Dotta y cols, 1997 32 Capítulo 1: Introducción Proteínas de choque térmico Jones y cols. 1990 Superficie de células de islote Maclaren y cols. 1975 Características Autoantígeno Referencia Células de islote Bottazzo y cols. 1974 Proteína de 38 kDa específica de islote Pak y cols. 1990 Proteína de 52 kDa de insulinoma de rata Karounos y cols. 1990 Proteína fibrilar ácida de la glía Winer y cols. 2003. GómezTouriño y cols. 2010. Tabla 1. Autoanticuerpos descritos en la diabetes tipo 1 humana. Actualmente, los principales autoanticuerpos de interés clínico e investigador, además de los ICAs, son los anticuerpos dirigidos contra la isoforma de 65 kDa de la decarboxilasa del ácido glutámico (GAD65) (GADA), la insulina (IAA) y la tirosina fosfatasa IA-2 (antígeno 2 de insulinoma) (IA-2A), los denominados en algunas ocasiones como “anticuerpos bioquímicos” (Pihoker y cols. 2005). La principal razón de este interés en estos tres autoantígenos es que están disponibles como proteínas recombinantes que pueden ser marcadas de forma radiactiva, de forma que ha sido posible desarrollar ensayos reproducibles y precisos para la determinación de estos autoanticuerpos. Además de la información aportada por los ICAs, GADA, IAA e IA-2A para conocer el proceso autoinmune que tiene lugar en el desarrollo de la T1DM, y debido al largo periodo asintomático entre la detección inicial de autoanticuerpos y el desarrollo de síntomas clínicos, así como el alto valor predictivo de éstos, la determinación de ICAs, GADA, IAA e IA-2A son empleados como marcadores útiles en la predicción de la enfermedad. Los ICAs están presentes en el 70-80% de los pacientes diabéticos de tipo 1 recién diagnosticados, mientras que sólo se detectan en el 0,5% de los individuos sanos no diabéticos. Estos anticuerpos dejan de detectarse en la mayoría de los pacientes a los dos o tres años del diagnósticos, aunque aproximadamente un 5% de los pacientes son positivos para ICA 10 años después del diagnóstico y en estos casos es más frecuente la presencia de otros autoanticuerpos como los antitiroideos o contras las células parietales gástricas. Se ha demostrado que la sensibilidad de estos anticuerpos es de un 81% (mediana) (rango 44-100%) con una especificidad del 96% (mediana) (rango 64-100%) (Lernmark y cols. 1991). Por otra 33 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. parte, en el estudio DPT-1 (“Diabetes Prevention Trial-1) se ha encontrado que aquellos familiares de pacientes diabéticos positivos para ICA con secreciones anormales de insulina en respuesta a inyecciones intravenosas de glucosa tenían un riesgo del 60% de desarrollar la enfermedad a los 5 años y cerca del 90% a los 10 años (Diabetes Prevention Trial-Type 1 Diabetes Study Group. 2002). Aunque estos autoanticuerpos se determinan todavía en muchas ocasiones, las dificultades técnicas que presenta su detección entre las que se incluyen la necesidad de páncreas fresco, preferiblemente humano, la subjetividad en la interpretación, la baja reproducibilidad y la variabilidad intra-laboratorio hacen que se empleen otros anticuerpos en el diagnóstico de la enfermedad. Los anticuerpos anti-insulina (IAA) fueron descritos por primera vez en pacientes con T1DM recién diagnosticados antes del inicio del tratamiento con insulina (Palmer y cols. 1983). La presencia de IAA es más frecuente en pacientes jóvenes recién diagnosticados (un 60% aproximadamente) que en pacientes adultos; de hecho la mayor sensibilidad diagnóstica de estos autoanticuerpos (50-60% aproximadamente) se encuentra en pacientes menores de 10 años (Bingley y cols. 1997), y una vez que se administra la insulina exógena (>10 días) la determinación de estos anticuerpos ya no es válida porque la insulina exógena induce la síntesis de anticuerpos que no pueden ser distinguidos de los IAA. El programa de estandarización de anticuerpos en la diabetes (DASP; “Diabetes Antibody Standardization Program”) muestra que la sensibilidad de estos anticuerpos es de sólo un 45% (mediana) (rango 22-57%) y de una especificidad del 98% (mediana) (95-99%) (Schlosser y cols. 2010), siendo, junto con los ICA, los autoanticuerpos cuya determinación resulta más difícil de reproducir y estandarizar. La decarboxilasa del ácido glutámico (GAD) es una enzima intracelular que cataliza la conversión del ácido glutámico en ácido -aminobutírico (GABA) y cuyo papel en la fisiología de la célula  no se conoce. En 1990, GAD se identificó como el autoantígeno de 64 kDa de los islotes que era inmunoprecipitado por el suero de pacientes diabéticos (Baekkeskov y cols. 1990). Además de en los islotes, diversos estudios muestran que GAD se expresa en gran variedad de tejidos, expresándose en mayor cantidad en tejidos del sistema nervioso, razón que explicaría por qué GAD constituye también un autoantígeno contra el que se generan anticuerpos en pacientes con el síndrome de la persona rígida (“stiff-man síndrome”) (Alexopoulos y cols. 2010). El programa de estandarización de anticuerpos en la diabetes (DASP; “Diabetes Antibody Standardization Program”) ha mostrado que la sensibilidad de los GADA es muy alta, un 82% (mediana) (rango 54-94%) así como su 34 Capítulo 1: Introducción especificidad, del 96% (mediana) (91-100%) (Törn y cols. 2008). Los autoanticuerpos contra GAD se detectan en un 70-80% de pacientes diabéticos caucásicos recién diagnosticados independientemente de la edad (Graham y cola. 2002) y estudios longitudinales de seguimiento han mostrado que siguen detectándose altos títulos hasta 12 años después del diagnóstico (Borig y cols. 2002), una observación muy interesante porque la hipótesis generalmente aceptada es que los niveles de autoanticuerpos sólo se mantienen si existe una estimulación repetida con antígeno. Los anticuerpos contra la tirosina fosfatasa IA-2 fueron detectados en ensayos de cribado de una librería de expresión derivada de un insulinoma (Christie y cols. 1993). IA-2 es una proteína transmembrana y se ha detectado su expresión tanto en las células  como en las  de los islotes pancreáticos (Notkins y cols. 2001). La sensibilidad, 70% (mediana) (rango 54-78%), y especificidad, 99% (mediana) (rango 82-100%) de los IA-2A son similares o algo inferiores a los descritos para GADA (Törn y cols. 2008). Diversos estudios muestran que en torno a un 65% de los pacientes diabéticos muestran autoanticuerpos contra IA-2 en el momento del diagnóstico en comparación con sólo un 2,5% de individuos sanos no diabéticos (Leslie y cols. 1999), anticuerpos que están dirigidos contra la parte citoplasmática de la proteína y cuyo título, a diferencia de lo que ocurre con los GADA, se ve reducido rápidamente con la duración de la enfermedad (Borg y cols. 2002). 1.5.2. NUEVOS AUTOANTICUERPOS. Recientemente se ha descrito la presencia de autoanticuerpos contra un miembro de la familia de los transportadores de zinc (ZnT8A) (Wenzlau y cols. 2001). Los autoanticuerpos dirigidos contra este nuevo antígeno fueron detectados en un 60-80% de pacientes diabéticos recién diagnosticados en comparación con sólo <2% de sujetos sanos no diabéticos. Se ha visto que la presencia de ZnT8A se detecta desde los dos años de edad y su nivel va aumentando hasta el momento del diagnóstico. Una observación interesante es que estos autoanticuerpos fueron detectados en un 26% de pacientes diabéticos de tipo 1 clasificados como negativos para los cuatro autoanticuerpos clásicos, de forma que la determinación conjunta de ZnT8A, GADA, IA2A e IAA eleva la sensibilidad de detección de individuos diabéticos hasta el 98% en el momento del diagnóstico (Wenzlau y cols. 2008). Además de la identificación de antígenos expresados por las propias células  de los islotes pancreáticos como objetivos de la respuesta autoinmune, trabajos recientes han 35 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. demostrado que tanto en el modelo murino NOD (“non obese diabetic”) como en pacientes diabéticos humanos, la respuesta se dirige también contra un grupo de células nerviosas que rodean los islotes pancreáticos denominadas células de Schwann peri-islote (pSC) (Winer y cols. 2003). Estas células expresan antígenos específicos entre los que la periferina (Puertas y cols. 2007), la proteína fibrilar ácida de la glía (GFAP; “glial fibrillary acidic protein”) y la proteína de unión a calcio S100 parecen ser objetivos de la respuesta autoinmune. La presencia de IgG específicas para GFAP fue detectada mediante métodos de espectrometría de masas (SELDI; “surface-enhanced laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry”) en el suero del 75% de pacientes recién diagnosticados (6/8), en el 80% de familiares de primer grado positivos para ICA (12/15) pero sólo en el 17% (2/12) de personas sanas. Estos datos preliminares empleando un número muy reducido de pacientes apoya la idea de que estos autoanticuerpos podrían ser útiles en la detección de pacientes diabéticos. En el caso del otro autoantígeno, S100, aunque este trabajo preliminar y otros (Banwell y cols. 2008) han detectado claramente la presencia de linfocitos T autorreactivos dirigidos contra la proteína, la detección de autoanticuerpos no se ha realizado o cuando se ha hecho no se han encontrado diferencias significativas entre pacientes diabéticos y personas sanas (Hovsepyan y cols. 2004). Finalmente, tal y como se señala en la Tabla 1, se están identificado un número cada vez más elevado de autoantígenos reconocidos por el sistema inmune de pacientes con T1D, contra los cuales se han detectado en el suero de estas personas la presencia de autoanticuerpos. De todas formas, en muchos casos la determinación de estos autoanticuerpos es técnicamente difícil de realizar y/o no son lo suficientemente sensibles o específicos para su uso en estudios del desarrollo de la enfermedad. 1.5.3. UTILIDAD DE LOS AUTOANTICUERPOS. Se han realizado hasta la fecha multitud de estudios en diversos laboratorios para determinar la relación que existe entre los autoanticuerpos GADA/IA2A/IAA y la diabetes tipo 1 (Notkins y cols. 2001). Tal y como se ha descrito, un 70-80% de los pacientes diabéticos de tipo 1 recién diagnosticados tienen anticuerpos dirigidos contra GAD65 y un número similar o algo inferior contra IA-2; además, un número menor de pacientes tienen anticuerpos contra la insulina aunque en este caso la edad es un factor determinante a la hora 36 Capítulo 1: Introducción de detectar estos anticuerpos. En comparación, en torno al 1% de las personas sanas no diabéticas poseen autoanticuerpos contra alguno de estos tres antígenos clásicos. Aunque el interés inicial se centró en determinar la presencia de estos autoanticuerpos en el momento del diagnóstico y en el seguimiento de la enfermedad, pronto se hizo evidente que la generación de estos anticuerpos precedía el desarrollo de síntomas clínicos por meses/años (Leslie y cols. 2001). En el momento actual existen un gran número de estudios que muestran que la presencia de autoanticuerpos en personas completamente normales puede ser usado como un marcador de predicción para identificar aquellos con un elevado riesgo de desarrollar T1DM (Notkins y cols. 2001). El riesgo más elevado está asociado con aquellos sujetos que poseen dos o tres de estos autoanticuerpos. Por ejemplo, la presencia de GADA e IA2A confiere casi un 50% de riesgo de desarrollar T1DM a los 5 años, riesgo aún mayor a los 10 años (Leslie y cols. 1999); otros estudios han mostrado que cuando un individuo posee no sólo anticuerpos contra IA2 y GAD65 sino también contra insulina, el riesgo de desarrollar síntomas clínicos a los 5 años subía hasta el 70% (Verge y cols. 1996). Todos estos estudios muestran que la presencia de dos o más autoanticuerpos está mucho más relacionada con el riesgo de desarrollar la enfermedad en el futuro que el título de alguno de estos autoanticuerpos en particular. Es más, la combinación entre la presencia de alelos del MHC que confieren riesgo al desarrollo de T1D y autoanticuerpos mejora aún más el valor predictivo de éstos, existiendo datos que sugieren que estos anticuerpos aparecen mucho antes en niños con alelos del MHC susceptibles del desarrollo de T1D (Ilonen y cols. 1998). Esto lleva a pensar que la combinación futura de alguno de estos “anticuerpos bioquímicos” con nuevos autoanticuerpos como los dirigidos contra ZnT8, GFAP y/o S100 podrían mejorar estas predicciones. En la actualidad se están haciendo cribados poblacionales empleando autoanticuerpos contra GAD65, IA-2 e insulina con el fin de identificar sujetos de alto riesgo a desarrollar la enfermedad para su inclusión en ensayos terapéuticos. La utilidad práctica de esta aproximación es obvia si se considera que la prevalencia de individuos de riesgo a desarrollar T1D, aunque con diferencias poblacionales, se encuentra en torno a 1 de cada 400 individuos. De esta forma, para estudiar el efecto de un fármaco o una terapia experimental en 100 individuos que desarrollarán T1D tendrían que participar en el estudio unas 40.000 personas. Por el contrario, empleando autoanticuerpos como marcadores de riesgo, sólo sería necesario reclutar 200 personas positivas para dos autoanticuerpos ya que casi un 50% de estos individuos de alto riesgo desarrollarán la enfermedad en un periodo de 5 años. 37 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. 1.5.4. NUEVOS AUTOANTÍGENOS EN LA DIABETES TIPO 1 HUMANA. Existen excelentes, extensas y numerosas revisiones sobre los tres antígenos clásicos asociados al desarrollo de la diabetes tipo 1 humana como son GAD65, IA-2 e insulina, razón por la cual no se comentará mucho más de lo que ya se ha dicho en párrafos anteriores o posteriores, remitiendo a la lectura de alguna de estas revisiones (Uibo y cols. 2008; Knip y cols. 2008; Narendran y cols. 2003; Wong. 2005b). Tal y como se ha señalado previamente, se han descubierto toda una serie de nuevos autoantígenos cuyo papel en el desarrollo de la T1DM humana está aún por estudiar en detalle. Se describen a continuación tres de estos nuevos autoantígenos, la subunidad catalítica de la glucosa-6-fosfatasa específica de islotes (IGRP; “islet glucose-6-phosphatase catalytic subunit-related protein”), la proteína fibrilar ácida de la glía (GFAP; “glial fibrillary acidic protein”) y S100, los cuales presentan una serie de características que los hacen especialmente atractivos a la hora de estudiar su papel en la patogénesis de la T1DM humana. 1.5.4.1. Subunidad catalítica de la glucosa-6-fosfatasa específica de islotes (IGRP). La mayoría de los autoantígenos identificados hoy en día en la T1DM humana han sido descubiertos mediante serología, como GAD65 o IA-2. Por otra parte, clones de linfocitos T CD4+ y CD8+ han sido aislados del bazo, nódulos linfáticos o infiltrados de los islotes de ratones NOD pre-diabéticos o recién diagnosticados (Haskins y cols. 1996). Muchos de estos clones de linfocitos T no seleccionados inicialmente con ningún antígeno concreto son particularmente interesantes e informativos ya que es muy posible que sus objetivos moleculares estén implicados en el desarrollo espontáneo de la enfermedad en este modelo murino; de hecho, la mayoría de estos clones no son específicos para los antígenos identificados mediante serología. Empleando uno de estos clones, el clon CD8+ NY8.3 (Verdaguer y cols. 1997), aislado a partir de infiltrados pancreáticos de ratones NOD diabéticos y el cual aceleraba el desarrollo de la enfermedad al ser transfundido a ratones NOD jóvenes, fue como se pudo identificar a la proteína IGRP como un antígeno importante en la T1DM (Lieberman y cols. 2003). IGRP es una proteína transmembrana localizada en la membrana del retículo endoplasmático, con el extremo amino-terminal hacia el lumen del retículo y el carboxiterminal hacia el citoplasma, y 9 segmentos transmembrana. Pertenece a la familia de las 38 Capítulo 1: Introducción glucosa-6-fosfatasas (G6Pasas), familia formada por 3 miembros conocidos como son la G6Pasa- (G6PC), expresada principalmente en hígado, riñón e intestino; la G6Pasa-β (G6PC3) ampliamente distribuida, y por último IGRP (G6PC2) detectada tan sólo en el páncreas (Shieh y cols. 2005). El gen humano para IGRP se encuentra localizado en el cromosoma 2q24-31, cercano a los genes del glucagón y GAD67 y donde los estudios de asociación genética localizan una región, IDDM7, que confiere susceptibilidad al desarrollo de la enfermedad (Pociot y cols. 2002). A pesar de que IGRP comparte el 50% de su secuencia con la G6Pasa-, y que conserva 39 aminoácidos de los 45 residuos del centro activo necesarios para presentar actividad fosfatasa, siendo postulada como un elemento clave en el control del metabolismo energético de la célula β (Arden y cols. 1999; Martin y cols. 2001), existen datos contradictorios acerca de la capacidad catalítica de la proteína con autores que proponen que la actividad G6Pasa de IGRP es nula (Arden y cols. 1999), hasta otros que cifran dicha actividad enzimática en aproximadamente un 5% de la actividad de la G6Pasa- (Petrolonis y cols. 2004). La importancia de IGRP en el desarrollo de la diabetes tipo 1 radica en cuatro hechos fundamentales. En primer lugar, hasta un 40% de los linfocitos CD8+ que infiltran los islotes pancráticos del ratón NOD parecen ser específicos para el epitopo contra el cual responde el clon NY8.3 (Trudeau y cols. 2003); en segundo lugar, un número significativo y elevado (0,8% aproximadamente) de linfocitos CD8+ de sangre periférica parecen tener la misma especificidad antigénica que NY8.3 y además este número correlaciona con el desarrollo futuro de síntomas clínicos en el ratón NOD, siendo éste un hecho de vital importancia debido a la imposibilidad de cuantificar linfocitos T autorreactivos en páncreas o nódulos linfáticos que drenen este órgano en humanos; en tercer lugar, la manipulación de la inmunidad contra IGRP empleando ligandos peptídicos alterados derivados del epitopo reconocido por el clon NY8.3 previene el desarrollo de la enfermedad en el ratón NOD (Han y cols. 2005); y finalmente, IGRP parece ser también reconocida en el ratón NOD por linfocitos T CD4+ (Mukherjee y cols. 2005). Todos estos datos obtenidos en el ratón NOD han conducido a la búsqueda e identificación, en pacientes diabéticos humanos, de epitopos peptídicos derivados de IGRP reconocidos tanto por linfocitos T CD4+ y presentados por la molécula del MHC DRA1*01:01/DRB1*04:01 (Yang y cols. 2005) como reconocidos por linfocitos T CD8+ y presentados por la molécula del MHC A*02:01 (Jarchum y cols. 2008). 39 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. en condiciones fisiológicas, o bien porque el clon CD4+ ha sido generado de forma errónea contra contaminantes presentes en la preparación peptídica (Vincent y cols. 1994; Nagvekar y cols. 1999; Stevens y cols. 1997). Finalmente, el uso de péptidos solapantes obtenidos de forma arbitraria no proporciona ninguna información de si dicho epitopo será generado de forma natural de forma que no se podrá distinguir un falso positivo de una respuesta linfocitaria específica para un epitopo generado de manera natural por una CPA.  Identificación directa mediante espectrometría de masas. Esta tercera estrategia soluciona muchos de los problemas que presentan las anteriormente descritas y está basada en la elución de los epitopos peptídicos presentes en una molécula del MHC concreta y su detección e identificación mediante espectrometría de masas. A día de hoy existen numerosos trabajos donde dicha estrategia ha permitido identificar epitopos procesados y presentados de forma natural por una CPA derivados de proteínas propias y/o autoantígenos importantes en el desarrollo de la T1DM humana (Rudensky y cols. 1991; Arif y cols. 2004; Peakman y cols. 1999; Skowera y cols. 2008). Uno de los puntos fuertes de esta estrategia es su alta sensibilidad: por ejemplo, si tenemos en cuenta que una célula normal posee en su superficie en torno a 104 péptidos diferentes unidos a sus 105-106 moléculas del MHC de clase I (Stevanović y cols. 1999), y que el número de copias por célula de un epitopo peptídico concreto capaz de estimular a un linfocito T citotóxico se encuentra en el rango de 1-1000 copias (Christinck y cols. 1991), la cantidad de un péptido concreto procesado de forma natural y presentado en la superficie de una CPA se encuentra en torno a los femtomoles, cantidad que los métodos actuales de espectrometría de masas son capaces de identificar (Lemmel y cols. 2003). La necesidad de cultivar hasta 109-1010 células a partir de las cuales obtener la cantidad de péptido necesario para poderlo identificar mediante espectrometría de masas es probablemente uno de los puntos débiles de esta estrategia. 1.5.5.2. Estrategias en la identificación y caracterización de linfocitos T autorreactivos. Para comprender el proceso patológico que tiene lugar en la T1DM y poder eventualmente llegar a predecir el desarrollo de síntomas clínicos, se han desarrollado diversas herramientas y tecnologías que permiten evaluar y caracterizar el papel de los 46 Capítulo 1: Introducción linfocitos T en el proceso patológico que tiene lugar en la T1DM. Por esta razón, se describen a continuación diferentes estrategias analíticas encaminadas a la identificación de linfocitos autorreactivos específicos para un antígeno concreto, así como el potencial de dichas estrategias a la hora de comprender el desarrollo de los síntomas clínicos de la T1DM humana.  Ensayos de proliferación celular. Estos ensayos han sido empleados en estudios de la T1DM desde hace más de 20 años (Miller y cols. 1987). La proliferación celular sirve como parámetro para medir la especificidad antigénica de los linfocitos T frente a un antígeno (Schloot y cols. 1997), la tolerancia inmunológica o recurrencia del proceso autoinmune (Roep y cols. 1999). Las ventajas de estos ensayos donde se cultivan conjuntamente linfocitos T, linfocitos B y monocitos/macrófagos son varias e incluyen i) la sencillez y rapidez de dichos ensayos, ii) la posibilidad de analizar un número elevado de individuos al mismo tiempo y iii) el análisis de las células inmediatamente después de su aislamiento sin una excesiva manipulación y cultivo in vitro. Entre las limitaciones de esta aproximación experimental podemos citar, en primer lugar, que este tipo de ensayos detectan de forma preferente linfocitos T CD4+ tipo Th1 secretores de IL-2 específicos para el antígeno, ya que mediante la secreción autocrina de esta citocina estos linfocitos T generan sus propios factores de crecimiento. De esta forma, linfocitos T CD4+ o CD8+ de memoria que no sinteticen IL-2 sino otro tipo de citocinas importantes como el IFN- o la IL-4 no son detectadas en estos ensayos (Geginat y cols. 2001). En segundo lugar, además de reflejar la proliferación de linfocitos T específicos para el antígeno, los ensayos de proliferación realizados con células mononucleares periféricas (PBMCs, “peripheral blood mononuclear cells”) poseen un componente importante de proliferación no específica (“bystander”), donde la IL-2 secretada por los linfocitos específicos de antígeno puede inducir la proliferación de linfocitos T presentes en el cultivo pero específicos para otros antígenos. En tercer lugar, durante el periodo de cultivo in vitro la acumulación de citocinas reguladoras como la IL-10 o el factor de crecimiento tumoral- (TGF-) puede ocasionar la supresión de la proliferación de linfocitos T específicos para el antígeno. Finalmente, como los ensayos de proliferación están basados en la proliferación celular de PBMCs completos el análisis de síntesis de 47 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. citocinas, análisis de especificidad de epitopo o de reacción cruzada a nivel de linfocito T individual es imposible.  Cuantificación de citocinas mediante ELISA. Los ensayos de ELISA (“enzyme-linked-immuno-sorbent-assay”) constituyen actualmente el ensayo oro (“gold standard”) para la determinación de la concentración de citocinas en fluidos biológicos como el suero o el plasma sanguíneo, además de emplearse habitualmente en la determinación de la concentración de citocinas en los medios de cultivo de células inmunes estimuladas in vitro. Los inmunoensayos son altamente específicos y relativamente fáciles de realizar sobre un número elevado de muestras, aunque a menudo estos ensayos no son capaces de detectar determinadas citocinas por su baja secreción por parte de células estimuladas ex vivo, un problema resuelto por los ensayos de ELISPOT (ver más adelante). En el pasado, se han documentado diversos fenómenos de interferencia en la detección de algunas citocinas generando falsos positivos. Entre estos fenómenos de interferencia, la presencia de anticuerpos heterófilos y/o factores reumáticos puede inducir la interacción no específica de los anticuerpos empleados en el ELISA y dar lugar a una respuesta positiva en ausencia de la citocina. Así, en un estudio donde se describe la síntesis de citocinas por parte de linfocitos T con el receptor de antígenos invariable V24-JQ se señalan niveles elevados de IL-4 en el suero de familiares de pacientes diabéticos y de sujetos sanos, concluyéndose en dicho estudio que la cantidad de IL-4 detectada en el suero estaba asociada con la protección frente al desarrollo de la T1DM; sin embargo estas medidas de ELISA resultaron ser falsos positivos debidos a la presencia de anticuerpos heterófilos (Wilson y cols. 1998). Hoy en día, diversas variaciones como la adición de suero fetal bovino durante el desarrollo del ELISA (She y cols. 1999; Redondo y cols. 1999) o la cuantificación de un suero positivo empleando un anticuerpo de detección no específico para la citocina han permitido controlar el efecto de los anticuerpos heterófilos y los falsos positivos.  Cuantificación de citocinas mediante ELISPOT. Durante una respuesta inmune, un número bajo de linfocitos T en reposo vírgenes o de memoria se expanden de forma clonal y adquieren la capacidad de secretar citocinas. Para poder detectar una respuesta temprana específica para un antígeno por parte de distintas subpoblaciones linfocitarias al nivel de célula individual se desarrolló el ELISPOT (“enzyme-linked immunospot assay”) (Czerkinsky y cols. 1983 y 1988; van der Meide y cols. 1995). Este ensayo es fundamentalmente una modificación del ELISA, con la importante 48 Capítulo 1: Introducción diferencia de que después de su secreción por parte del linfocito T, las citocinas son capturadas y fijadas directamente en la superficie de la placa de ELISPOT. De esta forma, el ELISPOT permite la evaluación de la respuesta de linfocitos T de memoria específicos de antígeno al nivel de célula individual en relación con su frecuencia o tamaño clonal y su perfil de citocinas. Debido al hecho de que las citocinas se unen directamente a la placa una vez secretadas, éstas no se diluyen en el medio de cultivo o se unen a receptores de citocinas presentes en células adyacentes; por estas razones, los ensayos de ELISPOT poseen una sensibilidad 400 veces mayor que la de un ELISA (Helms y cols. 2000). Además, a diferencia de la tinción intra-citoplasmática de citocinas, en el caso del ELISPOT se determina la síntesis de citocinas por parte de células sin manipular no tratadas farmacológicamente; además las células sobreviven y potencialmente pueden ser usadas en estudios posteriores. Por varias razones, los ensayos de ELISPOT han ganado popularidad para la determinación directa ex vivo de linfocitos T específicos de antígeno. Tal y como se ha mencionado permite la cuantificación del tamaño clonal de linfocitos T específicos para un antígeno después de un periodo de cultivo muy corto ex vivo (≈ 24 horas), periodo demasiado corto como para permitir la expansión clonal in vitro reflejando en consecuencia las frecuencias de estos linfocitos T específicos in vivo, una de las características clave de la inmunidad adaptativa como es la expansión clonal específica. Ni los ensayos de proliferación celular, ni los ensayos de ELISA ni la detección mediante RT-PCR de ARN mensajeros específicos para una citocina aportan información sobre la frecuencia de linfocitos T específicos, de forma que no permiten distinguir si la respuesta neta observada es el resultado de la actividad elevada de un número reducido de células o una respuesta débil de un gran número de linfocitos T. Además, mientras que el límite de detección de los ensayos de tinción intra-citoplasmática de citocinas se encuentra en torno a 1:10.000 células, en los ensayos de ELISPOT dicho límite de detección puede ser tan bajo como 1:1.000.000 células (Karulin y cols. 2000). Esta sensibilidad añadida es crítica a la hora de detectar linfocitos T específicos de antígeno ya que el tamaño clonal de estas células, con pocas excepciones, se encuentra en el rango de 1:10.000 – 1:1.000.000 células. 49 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. 1.6. Las galectinas y su papel en el sistema inmune. Una de las características del proceso autoinmune que tiene lugar en la T1DM, tanto en el ratón NOD como en seres humanos, es la presencia de una frecuencia elevada de linfocitos T autorreactivos en los pacientes diabéticos. Diversos mecanismos, no necesariamente excluyentes, como una regulación incorrecta de la tolerancia central (Chentoufi y cols. 2008), de la tolerancia periférica (Tisch y cols. 2008) o del funcionamiento de los linfocitos Treg (Brusko y cols. 2008), podrían explicar el por qué en estos pacientes existe esta frecuencia de linfocitos T CD4+ y CD8+ activados frente a diversos autoantígenos de los islotes. Las galectinas pertenecen a la familia de las lectinas, un tipo de proteínas que reconocen oligosacáridos unidos a glicoproteínas y glicolípidos. Estas proteínas se hallan fuertemente conservadas a lo largo de la evolución, encontrándose tanto en esponjas y nematodos como en seres humanos. Hasta la fecha se han descrito 15 galectinas diferentes en mamíferos con patrones de expresión muy variados y que participan en funciones tan importantes como la adhesión celular, la regulación del crecimiento celular o la apoptosis. Además, su nivel de expresión varía no sólo con las diferentes etapas del desarrollo o el tejido sino también en condiciones inflamatorias o tumorales, asociándose en este último caso su nivel de expresión con el potencial metastático del tumor (Rabinovich y cols. 2002 y 2007; Camby y cols. 2006; Perillo y cols. 1998). Estructuralmente, los miembros pertenecientes a esta familia de lectinas de mamíferos comparten una secuencia aminoacídica de 130 aminoácidos que constituye el dominio de reconocimiento de carbohidratos (CRD; “carbohydrate recognition domain”) y que es el responsable de su unión preferencial a β-galactósidos (Barondes y cols. 1994). Algunas de ellas contienen un solo CRD y son biológicamente activas como monómeros (galectinas -5, -7 y -10), homodímeros (galectinas -1, -2, -11, -13, -14 y -15) u oligómeros que se agregan a través de su dominio no-lectina (galectina-3); otras galectinas contienen 2 CRDs conectados por un pequeño péptido, las denominadas galectinas en tándem- (galectinas -4, -6, -8, -9 y - 12) (Camby y cols. 2006). Aunque la unidad mínima de reconocimiento por parte del CRD es la N-acetil-lactosamina, cada galectina presenta una afinidad específica hacia pequeñas modificaciones de esta unidad mínima (Hirabayashi y cols. 2002), como ocurre por ejemplo entre la galectina-1 y la -3, donde ambas galectinas se unen a la N-acetil-lactosamina pero la galectina-3 se puede unir además a la lacto-N-hexosa, ligando al que la galectina-1 es incapaz de unirse (Ahmad y cols. 2004). 50 Capítulo 1: Introducción Aunque no poseen el péptido señal necesario para su secreción a través de la ruta secretora vía retículo endoplasmático y aparato de Golgi, algunas galectinas son translocadas al medio celular mediante vías secretorias no clásicas no muy bien caracterizadas a día de hoy, posiblemente previniendo su unión prematura a oligosacáridos de glicoproteínas en formación (Cooper, 1997; Mehul y cols. 1997). Aunque el mecanismo de secreción no se conoce, la localización celular de las galectinas tiene una gran importancia en su función; así, se ha descrito que la actividad intracelular de la galectina-1 es independiente de sus propiedades de lectina mientras que su función extracelular depende principalmente de su capacidad de unir azúcares (Camby y cols. 2006); de la misma manera, mientras que la galectina-3 intracelular posee actividad anti-apoptótica en linfocitos T una vez secretada al exterior induce la apoptosis de esos mismos linfocitos (Hsu y cols. 2009). La actividad de estas lectinas parece basarse en el entrecruzamiento que inducen en glicoproteínas de superficie regulando procesos de señalización importantes como son la proliferación y diferenciación celular o la síntesis de citocinas (Liu y cols. 2005). De este modo, la sensibilidad de un tipo celular concreto al efecto ejercido por las galectinas depende de su patrón de glicosilación, patrón que varía según el estado funcional de la célula (Rabinovich y cols. 2002). En lo que respecta al sistema inmune, las galectinas se expresan en diversas células activadas como los macrófagos y células dendríticas, linfocitos B y linfocitos T, incluyendo linfocitos Treg (Rabinovich y cols. 2007). Estudios recientes muestran que las galectinas juegan un papel importante en las fases de iniciación y resolución de las respuestas inflamatorias y autoinmunes, al promover efectos antio pro-inflamatorios (Rabinovich y cols. 2007). En este sentido se ha propuesto que la misma galectina puede ejercer efectos antio pro-inflamatorios en función de factores como la concentración alcanzada en el lugar de la inflamación, el microambiente extracelular y el tipo de célula diana afectada por la galectina (Toscano y cols. 2007b). La expresión de estas proteínas se regula durante los procesos de activación y diferenciación celular y está mediada por hormonas, citocinas y quimiocinas, y puede estar significativamente alterada en procesos patológicos (Camby y cols. 2006; Liu y cols. 2005). 1.6.1. GALECTINA 1. La galectina-1 es una lectina que ha demostrado desempeñar un papel clave en el funcionamiento del sistema inmune al inducir apoptosis durante la selección negativa en el 51 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. timo de linfocitos T autorreactivos (Perillo y cols. 1997), además de inducir también apoptosis en linfocitos T activados (Perillo y cols. 1995) limitando la respuesta inmune mediada por linfocitos T en la periferia, por lo que se puede postular que una alteración en su expresión o función podría permitir el escape y/o supervivencia de linfocitos T autorreactivos. Tal y como se ha señalado previamente, la galectina-1 es una lectina con un solo CRD la cual puede formar homodímeros. Se expresa en la mayoría de órganos, principalmente en nódulos linfáticos, bazo, timo, placenta, próstata, diversos tumores y en tipos celulares como los linfocitos B y T, entre otros (Rabinovich y cols. 2002). Se han descrito un gran número de funciones asociadas a esta lectina, las cuales parecen depender del equilibrio monómero/dímero, su estabilidad en el tejido, su concentración y su estado de oxidación, el tipo celular sobre el que actúa y el microambiente en el que ha de desarrollar su función (Rabinovich y cols. 2007). Describiremos principalmente las funciones que desarrolla como reguladora de la respuesta inmune. Como ya se ha comentado previamente, la galectina-1 se expresa en las células epiteliales del timo, teniendo un papel importante en la selección negativa (Perillo y cols. 1997) y también se expresa en linfocitos T activados, en los que induce apoptosis (Perillo y cols. 1995). Estas dos acciones combinadas permiten, por una parte, la eliminación de linfocitos T autorreactivos en el timo y, por otra, la limitación de la respuesta inmune a nivel periférico limitando el posible daño tisular. El nivel de glicosilación de glicoproteínas receptoras sobre las que actúa la galectina-1 es clave para que pueda inducir apoptosis en linfocitos activados. Uno de estos receptores es CD45: en linfocitos T deficientes en la glicosiltransferasa C2GnT, responsable de la adición de poli-N-acetil-lactosaminas a Oglicanos, los receptores CD45 poseen niveles disminuidos de poli-N-acetil-lactosaminas, preentando estas células una tolerancia mayor a la muerte celular inducida por galectina-1 (Nguyen y cols. 2001). La galectina-1 regula también la señalización a través del receptor de antígenos del linfocito T, de tal modo que antagoniza con las vías de señalización que requieren coestimulación y fosforilación de tirosina-fosfatasas, como la producción de IL-2 y la proliferación celular, pero es permisiva para respuestas iniciadas por el TCR que sólo requieran señalización parcial a través del mismo, como la producción de IFN-γ, la expresión de CD69 o la apoptosis (Chung y cols. 2000). 52 Capítulo 1: Introducción Se ha descrito que la galectina 1 modifica el patrón de síntesis de citocinas y, de forma general, esta lectina inhibe la función de linfocitos Th1 favoreciendo por el contrario la función de linfocitos Th2 (Motran y cols. 2008). A nivel extracelular, la galectina-1 a concentraciones relativamente bajas (0,01 a 0,1 µM) y unida a una matriz extracelular, inhibe la adhesión de los linfocitos a dicha matriz así como la secreción de citocinas proinflamatorias como el IFN-γ y el TNF-α por parte de linfocitos T activados (Rabinovich y cols. 1999a). Además, tanto en linfocitos T CD4+ como CD8+ sin activar y activados se observa un aumento en los niveles de ARN mensajero para IL-10 en presencia de galectina-1 (van der Leij y cols. 2007). Se ha demostrado que los linfocitos Treg constituyen un linaje que sintetiza y secreta elevados niveles de galectina-1; de hecho la supresión de la expresión de esta lectina limita la función supresora de estas células (Garín y cols. 2007). Además de linfocitos T, la galectina-1 también es expresada por el linfocito B. De esta forma, en linfocitos B activados mediante señales procedentes del entrecruzamiento de su receptor de antígeno y CD40 se observa un aumento en la expresión de esta lectina, y la galectina-1 secretada por estos linfocitos induce la apoptosis de linfocitos T pero no la de las propias células B (Zuñiga y cols. 2001). La galectina-1 inhibe la producción de óxido nítrico por parte de macrófagos activados (Correa y cols. 2003); además regula la expresión y función de ciertas proteínas en monocitos, como las moléculas de histocompatibilidad de clase II (Barrionuevo y cols, 2007). En cuanto a las células dendríticas, la adición in vitro de galectina-1 induce la expresión de marcadores de maduración de estas células como CD40, CD83, CD86 y HLADR, aumenta la secreción de citocinas proinflamatorias como IL-6 y TNF-, pero no de IL-12 y favorece su migración a través de la matriz extracelular (Fulcher y cols. 2006). Además, células dendríticas que sobreexpresan galectina-1 son capaces de estimular linfocitos T vírgenes e inducir apoptosis en linfocitos T activados (Perone y cols. 2006b). Se han ensayado terapias empleando galectina-1 en diversos modelos animales de enfermedades inflamatorias debido a sus propiedades anti-inflamatorias, entre las que podemos citar la miastenia gravis (Levi y cols. 1983), artritis inducida por colágeno (Rabinovich y cols. 1999b), hepatitis inducida por concanavalina A (Santucci y cols. 2000), colitis inducida por haptenos (Santucci y cols. 2003), uveitis inducida por la proteína de unión al interfotorreceptor (Toscano y cols. 2006) y enfermedad de injerto contra huésped (Baum y cols. 2003). 53 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. Por lo que respecta a la diabetes tipo 1, se ha demostrado que células dendríticas que sobre-expresan galectina-1 reducen la infiltración linfocitaria y retrasan la aparición de la diabetes en ratones NOD. Este efecto terapéutico va acompañado de un aumento en el porcentaje de linfocitos T apoptóticos y la presencia de un menor número de células CD4+ secretoras de IFN-γ en los nódulos linfáticos del páncreas (Perone y cols. 2006a). Además, la administración de galectina-1 soluble a ratones NOD reduce el número de linfocitos Th1 y aumenta la frecuencia de linfocitos Th2 y Treg, con el consiguiente aumento de IL-10 e IL-4, acompañándose de la eliminación periférica de linfocitos T específicos para autoantígenos de la célula β (Perone y cols. 2009). 1.6.2. GALECTINA 3. Esta lectina se expresa principalmente en células tumorales, macrófagos, células epiteliales y, al igual que la galectina-1, en linfocitos T activados (Rabinovich y cols. 2002). La galectina-3 también induce apoptosis de linfocitos T y entre ellos de los timocitos dobles negativos del timo (Stillman y cols. 2006). A nivel extracelular, induce la apoptosis de los linfocitos T al parecer mediante una vía de señalización diferente a la empleada por la galectina-1 y mediando en este caso los receptores CD45 y CD71 pero no CD7, el cual sí juega un papel importante en la apoptosis mediada por galectina-1 (Stillman y cols. 2006). Además, tiene también un efecto negativo en el crecimiento de linfocitos T al inhibir la proliferación de PBMCs inducida por mitógeno (Müller y cols. 2006). Sin embargo, a nivel intracelular la galectina-3 tiene una función antiapoptótica, quizás debida a que posee un dominio proteico, altamente conservado entre miembros de la familia de la proteína Bcl-2, clave para la actividad supresora de la apoptosis mediada por Bcl-2, de tal forma que esta lectina es un regulador positivo de la proliferación de linfocitos T (Yang y cols. 1996). En cuanto a su papel en la regulación de la secreción de citocinas, la galectina-3 impide la síntesis de IL-5 por parte de eosinófilos, PBMCs y linfocitos T (Cortegano y cols. 1998), además de inhibir la secreción de IL-12 por parte de las células dendríticas (Bernardes y cols. 2006), favoreciendo en este último caso la respuestas linfocitarias de tipo Th2. Favorece también la secreción de IL-1 por parte de monocitos (Jeng y cols. 1994), de IL-2 por parte de linfocitos T (Hsu y cols. 1996) y de IL-8 por parte de neutrófilos (Nieminen y cols. 2005), promoviendo además la actividad fagocítica de estos últimos (Fernández y cols. 2005). 54 Capítulo 1: Introducción En general, la galectina-3 favorece la adhesión a la matriz extracelular y la adhesión célula-célula, como por ejemplo la adhesión de los neutrófilos a la laminina de la matriz extracelular y a células endoteliales, favoreciendo su participación en la respuesta inmune (Kuwabara y cols. 1996) o la adhesión de linfocitos T a células dendríticas y macrófagos, favoreciendo la activación del linfocito por parte de estas CPAs (Swarte y cols. 1998). La galectina-3 induce la producción de IgE por parte de linfocitos B (Kimata, 2002), provocando la liberación de mediadores por parte de mastocitos sensibilizados y no sensibilizados por IgE (Frigeri y cols. 1993). Además de las múltiples funciones que ejerce esta lectina, se ha visto que la galectina3 es reconocida como un autoantígeno en varias enfermedades autoinmunes y en cáncer. Así, se han encontrado anticuerpos anti-galectina-3 en el lupus eritematoso sistémico, polimiositis y dermatomiositis (Lim y cols. 2002), en la enfermedad de Chron (Jensen-Jarolim y cols. 2001) y en diversos tumores (Mathews y cols. 1995; Suárez-Álvarez y cols. 2001). En cuanto al papel de la galectina-3 en la diabetes, se ha demostrado que ratones deficientes (“knockout”) para galectina-3 en los que se induce diabetes con estreptozotocina son relativamente resistentes a la diabetogénesis en lo que respecta a la glicemia, la histología y el contenido de insulina; presentan además menor expresión de IFN-γ y ausencia de TNF-α e IL-17 en nódulos linfáticos pancreáticos, lo que lleva a pensar que la galectina-3 modula la progresión de la enfermedad (Mensah-Brown y cols. 2008). Otros autores, sin embargo, han demostrado que la galectina-3 posee un papel protector contra la angiogénesis retinal en la diabetes (Stitt y cols. 2005). Se ha demostrado además que se produce un aumento en la cantidad intracelular de galectina-3 en islotes de rata expuestos a la citocina proinflamatoria IL-1β, lo que podría apuntar a un papel protectivo de la galectina-3 en las células β de los islotes frente a las citocinas proinflamatorias (Karlsen y cols. 2006). Estos resultados, aparentemente contradictorios, pueden deberse a las funciones opuestas que presenta la galectina-3 según su localización celular (intracelular-antiapoptótica; extracelularproapoptótica). A pesar de todas estas propiedades claramente inmunoreguladoras de las galectinas-1 y -3, y del prometedor papel de la galectina-1 en la terapia para la diabetes autoinmune en el ratón NOD, resulta sorprendente que no existan hasta el momento estudios acerca de la síntesis de estas galectinas en humanos con diabetes tipo 1. 55 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. 2.1.1.4. Muestras humanas. La utilización de especímenes biológicos humanos en esta investigación contó con el consentimiento informado de los pacientes así como con la correspondiente aprobación del Comité Etico de la Universidad de Santiago y del Comité Etico de Investigación Clínica de Galicia (nº 2006/290). Plasmas: Fueron cedidos por el Centro de Transfusión de Galicia con la aprobación del Dr. Carlos Arean, director de hemodonación y del Dr. Julio Carrera, director del centro. Los plasmas de pacientes diabéticos fueron obtenidos de muestras sobrantes del análisis de hemoglobina glicada del laboratorio de Bioquímica Especial del Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela (CHUS). Sangre total: Los pacientes con diabetes tipo 1 fueron reclutados de aquellos que acudieron al Complejo Hospitalario Universitario de Vigo (Hospital Meixoeiro), del Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela (Hospital Provincial) y/o del King’s College Hospital de Londres, tanto con diagnóstico reciente (< 1 año) como de larga duración (> 1 año). Los controles sanos no diabéticos sin historia familiar de diabetes tipo 1 fueron reclutados como voluntarios entre el personal de plantilla del departamento y del laboratorio Central del CHUS durante el mismo período, y fueron emparejados con los pacientes diabéticos para edad y sexo. La sangre fue recogida en tubos conteniendo heparina sódica. 2.1.1.5. Animales. Todos los procedimientos para el manejo y sacrificio de los animales estuvieron de acuerdo con las normas de la Comisión Europea (86/609/CEE). Ratas Sprage-Dawley: estos animales fueron mantenidos en el animalario de la Universidad de Santiago de Compostela (cortesía del Dr. Miguel A. Rodríguez, Departamento de Biología Celular y Ecología, Universidad de Santiago de Compostela), y empleados en experimentos de inmunofluorescencia. Ratones NOD: ratones no obesos diabéticos, modelo animal de la diabetes tipo 1 humana (Jackson Laboratories), del grupo del Dr Joan Verdaguer, mantenidos en condiciones libres de patógenos específicos con la aprobación del Comité Ético para la Experimentación Animal del Hospital Germans Trias i Pujol en el estabulario de dicho hospital. 62 Capitulo 2: Materiales y Métodos 2.1.2. MATERIALES NO BIOLÓGICOS. Salvo indicación en sentido contrario todos los compuestos químicos fueron adquiridos de Sigma-Aldrich. 2.1.2.1. Disoluciones y tampones. Azul Coomassie: 50% metanol, 10% ácido acético, 0,2% Brilliant Blue R. Disolución de desteñido: 40% metanol, 10% ácido acético. Disolución para el gel concentrador de SDS-PAGE: 4% acrilamida, 0,1% bisacrilamida, 125 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,1% SDS, 0,075% persulfato amónico, 0,0015% TEMED. Disolución para el gel separador de SDS-PAGE: 10-14% acrilamida, 0,26-0,37% bis-acrilamida, 0,3 M Tris-HCl pH 8,8, 0,1% SDS, 0,05% persulfato amónico, 0,0005% N, N, N’, N’-tetrametiletilendiamina (TEMED). PBS 1% BSA: PBS 1% albúmina bovina. PBS 3% BSA: PBS 3% albúmina bovina. PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 5,7 mM Na2HPO4 anhidro, 1,8 mM KH2PO4. PBST 0,5% leche: PBST 0,5% leche desnatada en polvo. PBST: PBS 0,05% Tween-20. Tampón de carga para ADN (6x): 1,17 M sacarosa, 0,025% azul de bromofenol en tampón TE. Tampón de carga para SDS-PAGE (5x): 0,3 M Tris-HCl pH 6,8, 5% SDS, 50% glicerol, 100 mM ditiotreitol, azul de bromofenol. Tampón de electroforesis para SDS-PAGE: 25 mM Tris-HCl, 192 mM glicina, 3,5 mM SDS. Tampón de lisis de células eucariotas: 20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% IGEPAL, 5 mM EDTA e inhibidores de proteasas (Sigma-Aldrich). Tampón de RP-HPLC para la bomba A: 0,05% TFA en agua destilada. Tampón de RP-HPLC para la bomba B: 0,05% TFA en 60% ACN. Tampón de transferencia para western blot: 25 mM Tris-HCl, 192 mM glicina. 63 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. Tampón Tris-acetato-EDTA (TAE): 0,4 M Tris-HCl, 20 mM EDTA, 1,14% ácido acético glacial. Tampón Tris-EDTA (TE): 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA. 2.1.2.2. Medios de cultivo. Medio Luria-Bertani (LB): medio de cultivo líquido para bacterias. 10 g/L triptona (Cultimed), 5 g/L extracto de levadura (Cultimed), 5 g/L NaCl. Placas de LB: medio de cultivo sólido para bacterias. Medio LB suplementado con 15 g/L de agar. R10: medio de cultivo de células humanas, consistente en medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FCS, Gibco), 1 U/mL de penicilina, 1 µg/mL de estreptomicina y 2,92 µg/mL de L-glutamina (Gibco). H10: medio semejante al R10 pero suplementado con 10% de suero humano (SigmaAldrich). R10-PB: medio de cultivo de células murinas, consistente en medio R10 suplementado con 1 mM de piruvato (Gibco) y 50 µM de β-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich). HAT: medio R10-PB suplementado con 100 mM hipoxantina, 0,4 mM aminopterina y 16 mM timidina (Sigma-Aldrich). HT: medio R10-PB suplementado con 100 mM hipoxantina y 16 mM timidina (Sigma-Aldrich). Medio de congelación: 90% FCS, 10% dimetilsulfóxido (Sigma-Aldrich). 2.1.2.3. Cebadores. Todos los cebadores fueron adquiridos de Sigma-Genosys, y se muestran en la Tabla 2. 64 Capitulo 2: Materiales y Métodos Nombre Secuencia Uso IGRP-F GGAAGCTTATGGATTTCCTTCAC Clonaje IGRP en pCR 2.1/TOPO IGRP-R GGCTCGAGCTACTGACTCTTCTTTCC Clonaje IGRP en pCR 2.1/TOPO IGRP2-F ATGGATTTCCTTCACAGG Clonaje IGRP en pBAD/Thio-TOPO IGRP2-R CTGACTCTTCTTTCCGC Clonaje IGRP en pBAD/Thio-TOPO GFAP-F ATGGAGAGGAGACGCATCACC Clonaje GFAP en pCR T7/NT-TOPO GFAP-R TCAATGGTGATGGTGATGGTGCATCACATC CTTTGTG Clonaje GFAP en pCR T7/NT-TOPO GFAP2-F GGGGATCCATGGAGAGGAGACGCATCACC Clonaje GFAP en pMAL-c2X GFAP2-R GGGGATCCTCAATGGTGATGGTGATGGTGC ATCACATCCTTGTG Clonaje GFAP en pMAL-c2X S100B-F GGATCCGGGATGTCTGAG Clonaje S100β en pCR T7/NT-TOPO Biotag1 CTCGAAGATGTCGTTCAGACCGCCACCCTC ATGTTCA Clonaje S100β en pCR T7/NT-TOPO Biotag2 GGATCCTTATTCGTGCCATTCGATTTTCTGA GCCTCGAAGATG Clonaje S100β en pCR T7/NT-TOPO 47-F GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA Genotipado DRB1*04 37-R CTGCACTGTGAAGCTCTCAC Genotipado DRB1*04 38-R CTGCACTGTGAAGCTCTCCA Genotipado DRB1*04 CtrlDR4-F TGCCAAGTGGAGCACCCAA Genotipado DRB1*04 CtrlDR4-R GCATCTTGCTCTGTGCAGAT Genotipado DRB1*04 S100pcDNA-F TAATACGACTCACTATAGGG Clonaje S100β en pcDNA3.1 (+) y pcDNA 3.1/Zeo (+) S100pcDNA-R TAGTTATTGCTCAGCCGGTGG Clonaje S100β en pcDNA3.1 (+) S100pcDNAZ-R TAGAAGGCACAGTCGAGG Clonaje S100β en pcDNA 3.1/Zeo (+) Gal1-F GACGCTAAGAGCTTCGTGCT PCR en tiempo real para galectina-1 65 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. Nombre Secuencia Uso Gal1-R GATGCACACCTCTGCAACAC PCR en tiempo real para galectina-1 Gal3-F GCCTACCCATCTTCTGGACA PCR en tiempo real para galectina-3 Gal3-R GTGGAAGGCAACATCATTCC PCR en tiempo real para galectina-3 GAPDH-F GCACCGTCAAGGCTGAGAAC PCR en tiempo real para GAPDH GAPDH-R ATGGTGGTGAAGACGCCAGT PCR en tiempo real para GAPDH Tbet-F CTGCCTACCAGAATGCCGAGA PCR en tiempo real para Tbet Tbet-R AAGCGGCTGGGAACAGGATAC PCR en tiempo real para Tbet GATA3-F CGAGATGGCACGGGACACTA PCR en tiempo real para GATA3 GATA3-R TGGTCTGACAGTTCGCACAGG PCR en tiempo real para GATA3 RORC2-F CAGTCATGAGAACACAAATTGAAGTG PCR en tiempo real para RORC2 RORC2-R CAGGTGATAACCCCGTAGTGGAT PCR en tiempo real para RORC2 Tabla 2: Cebadores empleados en este trabajo. Se indica el nombre, la secuencia en dirección 5’3’ y el procedimiento en el que se ha empleado. 2.2. Métodos generales. 2.2.1. MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS. 2.2.1.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En las reacciones de PCR se emplearon dos polimerasas distintas en función del uso: polimerasa Pfu (Stratagene) en reacciones de PCR de alta fidelidad o polimerasa Taq (Promega) para el resto de reacciones. El tampón suministrado con la Pfu contiene 20 mM MgCl2 (10x), mientras que el de la Taq contiene 15 mM MgCl2 (10x). La mezcla de desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs) utilizados fue adquirida en Promega, así como el H20 libre de RNasas/DNasas. Las concentraciones finales de los reactivos utilizados para preparar la mezcla de reacción se muestran en la siguiente tabla (Tabla 3): 66 Capitulo 2: Materiales y Métodos Reactivo Pfu Taq Tampón (suministrado con cada enzima) 1x 1x dNTPs 100 µM de cada uno 10 µM de cada uno Cebadores 0,72 µM de cada uno 0,36 µM de cada uno ADN molde 1:12,5 2:12,5 Enzima 0,1 U/µL (1,25U totales) 0,08 U/µL (1U total) Tabla 3: concentraciones finales del los reactivos empleados en las reacciones de PCR. El volumen final de la reacción fue ajustado con H2O libre de RNasas/DNasas. Las amplificaciones se realizaron en un termociclador Gene Cycler (BioRad). Después de un ciclo inicial de desnaturalización de 5 min a 94ºC, se ejecutaron 35 ciclos con una etapa de desnaturalización a 94ºC durante 30 seg, de hibridación a la temperatura recomendable para cada pareja de cebadores (ver tabla 2), y de extensión a 72ºC por un minuto. Por último se mantuvo la reacción 5 minutos a 72ºC. Las amplificaciones se realizaron en un termociclador Gene Cycler (BioRad). Las condiciones habituales de tiempo y temperatura para las PCRs fueron: 1 ciclo de 94ºC 5 min; 35 ciclos consistentes en 94ºC 30 seg, temperatura de hibridación (Th) variable según el par de cebadores 30 seg y 72ºC 1 min; y 1 ciclo final de 72ºC 5 min. 2.2.1.2. Electroforesis en gel de agarosa. La electroforesis para ADN se llevó a cabo utilizando geles de agarosa de concentración variable dependiendo del tamaño del fragmento de ADN de interés (0.8% ó 1.3%), preparados en tampón TAE conteniendo 1 µg/mL de bromuro de etidio (SigmaAldrich), en el sistema Mini-Sub Cell GT (BioRad), en tampón TAE aplicando una diferencia de potencial de 120 V durante 20 min. Las muestras provenientes de reacciones de PCR con Pfu fueron mezcladas con la cantidad correspondiente de tampón de carga 6x para ADN antes de ser cargadas en el gel. En las reacciones de PCR con Taq el tampón de reacción ya incluía los reactivos necesarios para su carga en los geles de electroforesis. Como marcador de peso molecular se emplearon 5 µL/pocillo del marcador Hyperladder I (Bioline). Los geles fueron 67 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. visualizados en un GelDoc XR (BioRad), y analizados mediante el software Quantity One 4.6.5 (BioRad). 2.2.1.3. Purificación de ADN. Para purificar ácidos nucleicos éstos fueron separados por electroforesis sobre geles de agarosa, la banda correspondiente aislada del resto del gel, y el ADN purificado mediante el QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN) y cuantificado por absorbancia a 260 nm con un espectrofotómetro (Nanodrop ND-1000), o por comparación con cantidades conocidas de ADN analizadas simultáneamente en el mismo gel. 2.2.1.4. Corte de ADN con enzimas de restricción. Para la digestión de ADN se emplearon distintas enzimas de restricción (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante, incubando 2 horas a 37ºC y posteriormente 20 min a 65ºC para detener la reacción, tras lo cual el ADN cortado fue purificado (ver apartado 2.2.1.3). 2.2.1.5. Ligación, transformación, selección de clones positivos, secuenciación. Las reacciones de ligación se ensamblaron del siguiente modo:100 ng de plásmido fueron mezclados con la cantidad correspondiente del segmento a clonar para alcanzar una relación molar de 1:3 (vector : inserto). La mezcla fue incubada 5 min a 45ºC y, tras enfriar en hielo, se añadieron 3 unidades de T4 DNA ligasa (Promega) junto con 1 µL del tampón 10x suministrado con la enzima (concentraciones finales de 30 mM Tris-HCl pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT y 1 mM ATP), incubándose la reacción 24 horas a 4ºC. La ligasa fue posteriormente inactivada por incubación a 65ºC durante 10 min, tras la cual células One Shot TOP10F’ (Invitrogen) fueron transformadas con 2 µl de la reacción de ligación siguiendo instrucciones del fabricante, y sembradas en placas de medio LB suplementado con 100 µg/mL de ampicilina. Las bacterias recombinantes fueron identificadas mediante PCR con los cebadores específicos para la secuencia de interés, y su identidad fue posteriormente confirmada por secuenciación (Sistemas Genómicos). 68 Capitulo 2: Materiales y Métodos 2.2.2. MANIPULACIÓN DE PROTEÍNAS. 2.2.2.1. Electroforesis en geles de poliacrilamida conteniendo dodecil-sulfato sódico (SDS-PAGE): La separación de proteínas en función de su tamaño se realizó utilizando geles discontinuos de acrilamida:bisacrilamida en presencia de SDS y bajo condiciones desnaturalizantes. Los geles fueron polimerizados en el sistema Mini-PROTEAN 3 Cell (BioRad), cargando 3,5 mL de la disolución para el gel separador, dejando polimerizar y cargando a continuación 1 mL de la disolución para el gel concentrador. La desnaturalización de las proteínas se consiguió añadiendo la cantidad correspondiente de tampón de carga 5x a la muestra, calentando 5 min a 98ºC en un baño seco (ACCUBLOK Digital Dry Bath; Labnet International). Tras una breve centrifugación 10-15 µL fueron cargados en cada pocillo. Como marcador de peso molecular se empleó el SDSPAGE Molecular Weight Standard -Broad Range- (BioRad). La electroforesis se realiza en dos etapas: en primer lugar se focaliza la muestra en una banda estrecha mientras las proteínas migran por el gel concentrador a una diferencia de potencial de 70 voltios; en segundo lugar las proteínas se separan en función de su tamaño a lo largo del gel separador, a una diferencia de potencial de 130 voltios hasta que el frente de migración comienzó a salir del gel. La visualización de las diferentes bandas proteicas se consigue tras un proceso de tinción en tampón con azul Coomassie durante 10 min y varias etapas de destiñido. Finalmente, los geles se documentaron, registraron y analizaron utilizándo el equipo GelDoc controlado por el software Quantity One 4.6.5. 2.2.2.2. Western blot: La identificación de proteínas específicas que se separaron por electroforesis se llevó a cabo mediante la técnica de western blot en dos versiones distintas: a) quimioluminiscente, para los casos que requirieron una alta sensibilidad de detección, y b) colorimétrica, en los demás casos. Tras la electroforesis las proteínas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa (Hybond C-Extra para western blot colorimétrico; Hybond ECL para western blot quimioluminiscente; ambas de GE Healthcare) en el sistema Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell (BioRad) en tampón de transferencia durante 1 hora a 100 V. La eficacia de la transferencia se verificó mediante tinción con Rojo Ponceau S (SigmaAldrich). 69 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. En el caso del western blot colorimétrico después de 2 lavados con agua miliQ la membrana fue colocada en un cassette y montada en el sistema SNAP I.D. (Millipore), siguiendo instrucciones del fabricante. La membrana fue bloqueada con tampón PBST 0,5% leche, para a continuación ser incubada con el anticuerpo correspondiente diluido en el mismo tampón durante 30 min. La membrana fue lavada varias veces con tampón PBST para a continuación ser revelada con tetrahidrocloruro de 3,3’-diaminobenzidina (SIGMAFAST DAB; Sigma-Aldrich) o con 3,3’-5,5’-tetrametilbenzidina (TMB; Promega), deteniendo la reacción con varios lavados de agua miliQ tras el correcto desarrollo de las bandas. En el caso del western blot quimioluminiscente después de 2 lavados con agua miliQ se utilizó el kit Amersham ECL Advance western blotting Detection Kit (GE Healthcare), siguiendo instrucciones del fabricante. La membrana fue revelada en films Amersham Hyperfilm ECL (GE Healthcare) en un revelador Curix-60 (Agfa). El análisis de todas las imágenes de western blot se realizó con el software Quantity One 4.6.5. En ocasiones se llevaron a cabo pequeñas modificaciones de este protocolo, convenientemente indicadas en la sección correspondiente. 2.2.3. MANIPULACIÓN DE CÉLULAS. 2.2.3.1. Condiciones generales de manipulación. Todas las líneas celulares humanas, así como las células humanas aisladas de sangre periférica y las líneas celulares murinas fueron manipuladas en condiciones estériles en una campana de flujo laminar modelo BV-100 (Telstar), y mantenidas a 37ºC y 5% CO2 en un incubador Sanyo modelo MCO-20AIC. El material desechable empleado para su manejo (de Beckton Dickinson y/o Corning) fue autoclavado antes de su desecho. 2.2.3.2. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs). Los PBMCs se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare). Para ello 20 mL de sangre total anticoagulada con heparina fueron diluidos con PBS (Gibco) hasta un volumen final de 35 mL. La sangre diluida fue depositada sobre 15 mL de Ficoll-Paque PLUS, y centrifugada a 400 xg 30 min a 20ºC sin freno. El plasma fue retirado (o una alícuota conservada a -80ºC, según la aplicación posterior) y la 70 Capitulo 2: Materiales y Métodos capa leucocitaria recogida y lavada 3 veces con 50 mL de PBS a 300 xg 10 min a 20ºC. El pellet resultante fue resuspendido y utilizado en el ensayo correspondiente. 2.2.3.3. Propagación y conservación de líneas celulares. Las líneas celulares de origen humano (Priess, K562) y de origen murino (P815, BW5147) fueron cultivadas en suspensión en frascos de cultivo (de 25 o 75 cm2) en medio R10 o R10-PB, respectivamente, a densidades variables entre 0,1 y 1x106 células/mL. El medio de cultivo fue renovado cada tres días (dos días en el caso de las células P815 debido a su rápida proliferación). Las células humanas aisladas de sangre periférica fueron cultivadas en suspensión en placas de 6, 24, 48 o 96 pocillos según el tipo de ensayo, en medio R10 o H10, a una concentración de 1x106 células/mL. Para la congelación de cualquier tipo celular las células fueron centrifugadas a 300 xg 5 min a 4ºC (centrífuga modelo Allegra X-12R, Beckman-Coulter), resuspendidas en 1 mL de medio de congelación frío, dispensadas en un criotubo (Nunc) y congeladas a -80ºC. Tras la congelación las células fueron mantenidas en nitrógeno líquido. Para la descongelación de cualquier tipo celular las células fueron descongeladas por inmersión en un baño de agua a 37ºC, y tras la descongelación de aproximadamente el 90% del contenido éste fue añadido a un tubo de 15 mL conteniendo 10 mL del medio de cultivo pre-calentado a 37ºC. Tras centrifugar a 200 xg durante 10 min las células fueron resuspendidas en medio y mantenidas en cultivo en el soporte deseado. 2.2.4. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA EN FASE REVERSA (RPHPLC): Para el fraccionamiento de péptidos se utilizó un HPLC System Gold de BeckmanCoulter, al cual se conectó una columna BioBasic-18 (Thermo Scientific) de 150 mm de longitud y un diámetro interno de 2,1 mm. Se completó el equipo con un regulador de presión por retorno de pequeño volumen muerto (5 ul) (Thermo Scientific), con el fin de facilitar la recogida de las fracciones de interés y evitar la dilución y difusión de los componentes tras la separación. Los tampones utilizados fueron 0,05% ácido trifluoroacético (TFA; Merck) en agua en la bomba A y 60% acetonitrilo (ACN; Panreac) con 0,05% TFA en la bomba B, con un flujo de 0,150 mL/min. 71 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. fueron combinadas, cuantificadas y almacenadas a -20ºC hasta su uso en experimentos de ELISA y western blot. La identidad de las proteínas purificadas fue confirmada por SDS-PAGE (12,5%) y western blot colorimétrico con un anticuerpo monoclonal anti-GFAP (dilución 1:1500; Abcam) en combinación con un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado a HRP (dilución 1:4000; Sigma-Aldrich) y/o un anticuerpo anti-MBP conjugado a HRP (dilución 1:3000; New England Biolabs). Como control, la proteína MBP fue también expresada y purificada siguiendo el mismo protocolo empleado para la proteína recombinante MBP-GFAP, y su identidad confirmada por western blot colorimétrico con el anticuerpo anti-MBP conjugado a HRP (dilución 1:3000). 2.3.1.3. S100β. El ADN complementario para la S100β humana fue obtenido de Geneservice Ltd (número de acceso BE276927) y subclonado en el vector pCR T7/NT-TOPO siguiendo instrucciones del fabricante. El ADN complementario fue clonado de tal modo que la proteína expresada fuera una proteína recombinante que posea la secuencia de biotinilización in vitro GGGLNDIFEAQKIEWHE (de aquí en adelante biotag) en posición carboxi-terminal. El clonaje en pCR T7/NT-TOPO añade además 6 histidinas y el epitopo Xpress en el extremo amino-terminal. Para ello añadimos la secuencia del biotag a la secuencia codificante (CDS) de S100β mediante 2 reacciones de PCR. En la primera reacción los cebadores utilizados fueron S100BF y Biotag1 (Th=57ºC). El cebador reverso está diseñado de tal modo que añade la mitad de la secuencia del biotag al extremo 3’ del CDS de S100β. Este producto de PCR fue purificado de un gel de agarosa y a continuación fue utilizado como molde en una segunda reacción de PCR. Para esta reacción se utilizó el mismo cebador directo y el cebador reverso Biotag2 (Th=57ºC), que añade los nucleótidos necesarios al extremo 3’ del CDS de S100β para completar la secuencia del biotag. A continuación este producto de PCR fue purificado de gel de agarosa y se ligó al vector pCR T7/NT-TOPO, siguiendo instrucciones del fabricante. La identidad de la construcción fue confirmada por secuenciación. Bacterias BL21 (DE3) pLysS fueron transformadas con la construcción S100β-pCR T7/NT-TOPO y cultivadas para expresar S100β tal y como se ha descrito para GFAP y MBP78 Capitulo 2: Materiales y Métodos GFAP. El pellet bacteriano fue descongelado en hielo y resuspendido en 40 mL de tampón 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, pH 7,0. Se añadieron 300 µL de inhibidores de proteasas y se lisaron las células por 3 pases a través de un homogeneizador French Press. El lisado así obtenido fue clarificado por centrifugación a 10.000 xg 30 min a 4ºC. La purificación de S100β se llevó a cabo mediante cromatografía de afinidad utilizando una resina de níquel (Ni-NTA agarose) en condiciones nativas siguiendo indicaciones del fabricante. Brevemente, el extracto bacteriano fue mezclado con la cantidad apropiada de resina e incubado con agitación durante 1 hora a 4ºC. Tras 2 lavados con 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol (Fluka), pH 8,0, la resina conteniendo S100β fue empaquetada en una columna y lavada una vez más. Tras los lavados, la proteína S100 fue eluida con 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 500 mM imidazol, pH 8,0. Las fracciones conteniendo S100β se combinaron, cuantificaron y se almacenaron a -80ºC. La identidad de la proteína purificada fue confirmada por SDS-PAGE (14%) y western blot colorimétrico con anticuerpos anti-histidinas (dilución 1:2000; Sigma-Aldrich) y un anticuerpo monoclonal antiS100β (dilución 1:10000; Abcam) combinado con un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado a HRP (dilución 1:5000). A continuación la proteína S100β fue biotinilada in vitro con la enzima BirA producida y purificada en nuestro laboratorio siguiendo el protocolo del profesor Tom Schumacher (The Netherlands Cancer Institute, Holanda. http://research.nki.nl/schumacherlab/Schumacher.htm). La enzima BirA purificada fue finalmente conservada en 50 mM de imidazol, 50 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoetanol y 50% de glicerol a -20ºC hasta su utilización. Para las reacciones de biotinilización un volumen de S100β fue mezclado con 1 volumen de solución de biotinilización e incubado toda la noche con agitación a temperatura ambiente. La solución de biotinilización estaba compuesta por 0,04 volúmenes de 5 mM biotina (Sigma-Aldrich) en 0,1 M tampón fosfato pH 7,5, 0,2 volúmenes de ATP a 55 mg/mL (Sigma-Aldrich), 0,01 volúmenes de la enzima BirA a 350 µg/mL, 0,2 volúmenes de tampón de ligación 10x (1,5 M NaCl, 50 mM MgCl2, 0,5M Tris pH 7,5), 0,08 volúmenes de inhibidores de proteasas y 0,47 volúmenes de H20 libre de RNasas/DNasas. A continuación la reacción de biotinilización fue dializada durante toda la noche a 4ºC contra 2 L de tampón fosfato 0,1 M pH 7,6. La proteína S100β biotinilada fue purificada por cromatografía de afinidad empleando la resina SoftLink (SoftLink Soft Release Avidin Resin, Promega), la cual posee sitios de unión para biotina. La resina fue pre-equilibrada en tampón fosfato 0,1 M pH 7,6 e incubada 1 hora 79 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. con agitación junto con la mezcla conteniendo S100β biotinilada. A continuación se efectuó un lavado con 20 mL de tampón fosfato por centrifugación, y la resina fue resuspendida en 10 mL de tampón y empaquetada en una columna. La proteína S100β fue eluída con tampón fosfato conteniendo 5 mM de D-biotina. La identidad de S100β fue comprobada por SDS-PAGE (14%) y western blot colorimétrico con estreptavidina conjugada a HRP (dilución 1:500; Sigma-Aldrich) y el anticuerpo monoclonal anti-S100β empleado anteriormente. La proteína fue alicuoteada y conservada a -80ºC hasta el momento de su utilización. 2.3.2. DETERMINACIÓN DE AUTOANTICUERPOS CONTRA GFAP Y S100Β EN PACIENTES CON DIABETES TIPO 1. 2.3.2.1. Diseño de ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y western blot para la detección de autoanticuerpos contra GFAP. Para determinar las concentraciones óptimas de cada uno de los componentes del ELISA, éstos fueron titulados siguiendo el esquema descrito en Crowther y cols. (2009). Placas de 96 pocillos (Maxisorp F96, NUNC) fueron tapizadas con 5 µg/mL de GFAP durante toda la noche a 4ºC. Tras 5 lavados con PBST en un lavador automático Wellwasher (Thermo Scientific, modelo 4Mk2), los pocillos fueron bloqueados con PBST 3% BSA durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras los lavados los plasmas fueron diluidos 1:256 en PBST, añadidos por triplicado a la placa, e incubados 2 horas a temperatura ambiente. En cada placa se incluyó un plasma positivo para GFAP y otro negativo, con el objetivo de determinar un índice de positividad (ver más abajo). Tras la incubación y el lavado se añadió un anticuerpo biotinilado de ratón contra la IgG humana (dilución 1:1000; Abcam) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar de nuevo la placa se añadió estreptavidina-HRP (dilución 1:500), incubando a continuación durante 45 min a temperatura ambiente. La placa fue lavada 7 veces y se añadió el sustrato ortofenilendiamina (SigmaFast OPD, Sigma-Aldrich). La reacción se detuvo por adición de HCl 1 M, y la absorbancia a 490 nm fue cuantificada en un lector de ELISA de BioRad modelo 680 con el software Microplate Manager 5.2. La señal específica anti-GFAP fue calculada utilizando el siguiente índice: 80 Capitulo 2: Materiales y Métodos 100 negativo)estándar aAbsorbanci - positivoestándar ia(Absorbanc negativo)estándar aAbsorbancimuestra ia(Absorbanc Índice Para analizar las diferencias en las frecuencias de sujetos positivos para anti-GFAP se excluyeron del análisis todas aquellas muestras con niveles de autoanticuerpos por debajo del límite de detección del ELISA. El valor de corte para determinar la positividad fue establecido en el percentil 99º de los controles sanos. Para el western blot colorimétrico se llevó a cabo un gel de SDS-PAGE de las proteínas GFAP o MBP y MBP-GFAP (éstas últimas cargadas conjuntamente en el mismo pocillo), cargando 1 µg/pocillo; tras la transferencia las secciones correspondientes a cada pocillo fueron recortadas e incubadas por separado en placas de 24 pocillos. Las membranas fueron bloqueadas 1 hora con 1 mL de PBST 3% BSA, y tras 2 lavados de 10 min con PBST fueron añadidos los plasmas diluidos 1:100 en PBST 1% BSA, tanto de sujetos GFAPpositivos como GFAP-negativos, incubando 1 hora. Tras dos nuevos lavados se añadió como anticuerpo secundario un anticuerpo policlonal biotinilado de cabra contra la IgG humana durante 1 hora (dilución 1:100 en PBST 1% BSA; Southern Biotech), para a continuación lavar e incubar con estreptavidina-HRP (dilución 1:500 en PBST 1% BSA) 30 min. Tras dos últimos lavados las membranas fueron reveladas con DAB. Para verificar la especificidad de la reacción en el western blot, 5 µg/mL de MBP-GFAP fueron añadidos a los plasmas diluidos e incubados 1 hora antes de añadirlos a las membranas, para bloquear la posible presencia en plasma de anticuerpos anti-GFAP o anti-MBP. 2.3.2.2. Detección ex vivo de autoanticuerpos anti-GFAP por inmunofluorescencia. Los animales empleados en esta sección fueron ratas macho Sprage-Dawley. Esta serie de experimentos fue llevada a cabo en el Departamento de Biología Celular y Ecología de la USC. Secciones de córtex cerebral de 40 µm de grosor fueron fijadas en paraformaldehído, y la peroxidasa endógena bloqueada. A continuación se incubaron toda la noche con plasma humano o con un anticuerpo monoclonal de ratón contra la GFAP humana, ambos diluidos 1:2000) en tampón salino (0,05 M Tris pH 7,4; TBS) conteniendo 0,2% de Triton X-100 (Analema) y 15% de suero de cabra (Sigma-Aldrich). Las secciones se lavaron con TBS y se incubaron durante 1 hora con un anticuerpo de cabra contra la IgG humana conjugado con Alexafluor 488 (Fluoroprobes) o un anticuerpo de cabra contra la IgG murina conjugado con Alexafluor 546 (Invitrogen), ambos diluidos 1:50 en TBS conteniendo Triton X-100 y suero 81 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. de cabra. Tras lavar con agua destilada las secciones fueron montadas con el medio de montaje Vectashield (Vector) y visualizadas en un microscopio confocal (Leica TCS-SP2). 2.3.2.3. Diseño de ELISA y western blot para la detección de autoanticuerpos contra S100β. Para determinar las concentraciones óptimas de cada uno de los componentes del ELISA, éstos fueron titulados siguiendo el esquema descrito por Crowther y cols. Para el desarrollo del ELISA una placa de 96 pocillos fue tapizada con 50 µL/pocillo de S100β a 10 µg/mL en PBS e incubada toda la noche a 4ºC. Tras 5 lavados con 350 µL/pocillo de PBST cada pocillo fue bloqueado con 100 µL de PBST 3% BSA durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de repetir los lavados los plasmas en estudio fueron diluidos 1:20 en PBST, tanto sin prebloquear como con prebloqueo desde el día anterior con 30 µg/mL de S100β, con el fin de detectar la inespecificidad de señal para cada muestra, y fueron añadidos a la placa, a razón de 50 µL/pocillo. Se preparó además una curva estándar con un anticuerpo monoclonal generado en ratón contra la S100β humana (clon SH-B1, Abcam) usando diluciones seriadas (87 µg/dL a 5,4 µg/dL). Tras incubar 2 horas a temperatura ambiente, la placa fue lavada 5 veces y los anticuerpos secundarios fueron añadidos (50 µL/pocillo): para los plasmas se utilizó un anticuerpo policlonal producido en conejo contra la fracción constante de la IgG humana conjugado a HRP (Abcam) diluido a 0,2 µg/mL en PBST. Para la curva estándar se utilizó un anticuerpo policlonal contra la IgG completa de ratón conjugado a HRP (Sigma-Aldrich), diluido 1:20.000 en PBST. Se añadieron 50 µL/pocillo de cada anticuerpo secundario a los pocillos correspondientes y se incubó 1 hora a temperatura ambiente. El exceso de anticuerpo secundario fue eliminado con 5 lavados con PBST y se añadieron 50 µL/pocillo de estreptavidina-HRP diluida en PBST a 4,4 µg/mL. Tras incubar 30 min a temperatura ambiente la placa fue lavada 7 veces y 50 µL del sustrato OPD fueron añadidos a cada pocillo. Se dejó desarrollar el color durante 30 min y la reacción fue detenida mediante la adición de 50 µL/pocillo de HCl 1M. La intensidad de color fue leída a 490 nm. La señal específica anti-S100β fue obtenida restando a la absorbancia observada en los pocillos con plasma sin bloquear la señal obtenida en los pocillos prebloqueados con S100β, y 82 Capitulo 2: Materiales y Métodos esa absorbancia específica fue comparada con las absorbancias obtenidas en la curva estándar, para trasladar el valor a µg/dL de unidades equivalentes de monoclonal. Para el western blot colorimétrico de plasmas de sujetos control y pacientes con diabetes tipo 1 se cargó 1 µg de S100β en cada pocillo de un gel de poliacrilamida al 14%. Todos los procedimientos posteriores fueron los mismos que los llevados a cabo para el western blot para GFAP (sección 2.3.2.1.). Como controles positivos se utilizaron como anticuerpos primarios un anticuerpo monoclonal de ratón contra la S100β humana (dilución 1:5000), un anticuerpo policlonal de conejo contra la S100β humana (dilución 1:1000; Abcam), un anticuerpo anti-histidinas conjugado a HRP (dilución 1:2000) y estreptavidinaHRP (dilución 1:500). Los anticuerpos secundarios empleados, todos ellos conjugados a HRP, fueron los siguientes: para las membranas incubadas con plasma se empleó un anticuerpo contra IgGs humanas (empleado anteriormente en el ELISA; dilución 1:5000); para las incubadas con anticuerpo monoclonal anti-S100β se usó un anticuerpo contra la IgG de ratón (dilución 1:5000); para las incubadas con anticuerpo policlonal anti-S100β se usó un anticuerpo contra IgGs de conejo (Abcam; dilución 1:3000). Los resultados del western blot mostraron que ciertos plasmas reconocían no sólo a S100β (banda de mayor peso molecular) sino también a otra banda de menor peso molecular, reconocida también por el anticuerpo policlonal anti-S100β y la estreptavidina-HRP. Para comprobar si la banda de menor peso molecular observada en los western blot (ver Capítulo 4) era S100β tanto la porción de gel conteniendo la banda mayor como la menor fueron extraídas de un gel de poliacrilamida al 14% y enviadas al servicio de espectrometría de masas del Instituto de Investigación Sanitaria de Santiago de Compostela. Allí las piezas de gel fueron lavadas tres veces con tampón AmBic (50 mM (NH4)2CO3 en 50% de metanol – grado HPLC, Scharlau-) y reducidas con 10 mM ditiotreitol. A continuación las piezas fueron lavadas dos veces con tampón AmBic y secadas en un concentrador centrífugo antes de alquilarlas con 55 mM de yodoacetamida en 50 mM (NH4)2CO3. De nuevo las piezas fueron lavadas dos veces con tampón AmBic, para ser entonces deshidratadas mediante la adición de acetonitrilo (Scharlau) y secadas en un concentrador centrífugo. A los geles secos se les añadió tripsina porcina modificada (Promega) a una concentración final de 20 ng/µL en 20 mM de (NH4)2CO3, y se incubó 16 horas a 37ºC. Los péptidos fueron extraídos 3 veces mediante una incubación de 20 min en 60% de acetonitrilo con 0,5% de ácido fórmico. Los extractos peptídicos resultantes fueron mezclados, secados en el concentrador centrífugo y almacenados a -20ºC hasta su posterior análisis por espectrometría de masas. 83 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. 2.3.3. PÉPTIDOS DERIVADOS DE S100 PROCESADOS Y PRESENTADOS DE MANERA NATURAL POR MHC DE CLASE II. 2.3.3.1. Puesta a punto del sistema de presentación de antígeno (SPA). El SPA está basado en la incubación secuencial de las células Priess con una lectina biotinilada (la cual se une a glicoproteínas de superficie con dominios Ig), a continuación con avidina y finalmente con S100β biotinilada, con el objeto de que el complejo lectina/avidina/S100β biotinilada sea internalizado, procesado y presentado por MHC de clase II. Durante todo el proceso de alimentación las células Priess son mantenidas en frío. Tras dos lavados con tampón salino de Hank (HBSS, de Gibco) mediante centrifugación a 370 xg durante 10 min a 4ºC las células son resuspendidas en HBSS a 108 células/mL, y se incuban con la cantidad apropiada de lectina durante 30 min en hielo, agitando cada 10 min. Tras esta incubación las células son lavadas nuevamente, resuspendidas a 108 células/mL e incubadas con avidina a la concentración óptima durante 30 min en hielo (agitación cada 10 min). Las células se lavan 2 veces, se resuspenden a 108 células/mL y se incuban con la cantidad apropiada de S100β biotinilada 30 min en hielo con agitación cada 10 min. Las células se lavan nuevamente y se resuspenden en medio R10 a 5x106 células/mL, para a continuación ser incubadas durante 2 horas en un frasco de agitación a 37ºC y 5% CO2. Tras ese tiempo las células son recogidas y centrifugadas a 770 xg 10 min a 4ºC. El pellet es congelado en nitrógeno líquido y a continuación almacenado a -80ºC hasta la preparación del extracto celular. La lectina utilizada fue el mitógeno de la hierba carmín (pokeweed mitogen, PWM; Sigma-Aldrich), que fue biotinilada con el éster de biotina (brazo largo)-Nhidroxisuccinimida (Biotin (long arm) NHS; Vector Laboratories), siguiendo instrucciones del fabricante. Finalmente la lectina fue dializada contra 2 L de PBS para eliminar la biotina libre sobrante de la reacción. La lectina biotinilada fue denominada b-PWM. Para comprobar que la biotinilización había tenido lugar con éxito se llevó a cabo un SDS-PAGE (14%) y western blot con estreptavidina-HRP (dilución 1:500). Para determinar la cantidad óptima de b-PWM para el SPA, 107 células fueron incubadas con cantidades crecientes de b-PWM (0, 1, 2, 6, 10 o 20 µL) durante 30 min en hielo. A continuación las células fueron lavadas 2 veces con PBS frío, resuspendidas en 100 µL de PBS e incubadas con 5 µL de un conjugado de avidina con R-ficoeritrina (RPE-Extravidin, Sigma-Aldrich) durante 30 min en hielo. Las células fueron 84 Capitulo 2: Materiales y Métodos lavadas 2 veces con PBS frío y fijadas con 300 µL de PBS conteniendo 0,5% paraformaldehído. Tras lavarlas fueron resuspendidas en PBS y analizadas en un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson). La cantidad óptima resultó ser de 6 µL/107 células. Para determinar la concentración óptima de avidina 107 células fueron incubadas con 6 µL de b-PWM durante 30 min en hielo, y tras dos lavados con PBS frío se incubaron con concentraciones crecientes de avidina conjugada con isotiocianato de fluoresceína –FITC- (0, 0,25, 0,5, 0,75 o 1 mg/mL; Sigma-Aldrich). Las células fueron lavadas, fijadas con PBS conteniendo 0,5% paraformaldehído y analizadas por citometría. La concentración óptima resultó ser de 0,25 mg/mL. Finalmente para determinar la cantidad óptima de S100β biotinilada unimos FITC a la S100β biotinilada para que la proteína S100β biotinilada/FITC pudiera ser detectada por citometría. Así pues, 5 mL de S100β biotinilada (a 0,5 mg/mL) fueron concentrados en un Centricon con un punto de corte de 5 kDa (Millipore) por centrifugación a 2900 xg 20 min a temperatura ambiente, hasta concentrar a un volumen final de 750 µL. Se añadieron 100 µL de PBS y se pasó la proteína por una columna PD Miditrap G25 (GE Healthcare) equilibrada con tampón carbonato pH 8,0. Al eluído se le añadieron 35 µL de FITC a 4 mg/mL (SigmaAldrich), y se incubó la mezcla 90 min a 4ºC en oscuridad. La mezcla de S100β biotinilada/FITC y FITC libre fue pasada por una nueva columna G25 y la fracción eluída, conteniendo S100β biotinilada/FITC, fue cuantificada y conservada a -20ºC hasta su utilización. Para la titulación 107 células fueron incubadas sólo con 10 µg de S100β biotinilada, o con el SPA completo (6 µL b-PWM y 0,25 mg/mL avidina) y cantidades crecientes de S100β biotinilada (0, 1, 2, 5, 10 y 20 µg). Tras incubar según se ha descrito previamente las células fueron lavadas, fijadas y analizadas en el citómetro. La cantidad óptima resultó ser de 5 µg/107 células. Para cada nuevo lote de S100β biotinilada se llevó a cabo esta titulación. 2.3.3.2. Crecimiento de células Priess con el SPA. Las células Priess fueron cultivadas en medio completo en Hyperflasks (Corning). Estos frascos de cultivo con las mismas dimensiones que los T175 tradicionales constan de 10 capas permeables que permiten el intercambio de gases, de tal modo que se pueden llenar por completo sin necesidad de dejar aire en su interior. En nuestro caso demostraron ser el soporte óptimo para crecer grandes cantidades de estas células. Así, células Priess fueron cultivadas a una concentración máxima de 1x106 células/mL, y a continuación recogidas, 85 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. lavadas, y tratadas con el SPA tal y como se ha descrito anteriormente. 1,2x1010 células fueron alimentadas sólo con el SPA, y 1,1x1010 células fueron alimentadas con el SPA y S100β biotinilada. 2.3.3.3. Preparación de la columna de afinidad anti-DR/Proteína A. Con el fin de purificar las moléculas DR4 de las células Priess alimentadas sólo con el SPA o con el SPA conteniendo S100β biotinilada preparamos una columna anti-DR/proteína A, para a continuación obtener un extracto de membranas de Priess e inmunopurificar las moléculas DR4 a través de la columna. El anticuerpo anti-DR se obtuvo mediante cultivo del hibridoma HB-55 (clon L243, American Type Culture Collection –ATCC-) en medio sin suero (BD Cell Mab medium serum free; Becton-Dickinson) en un frasco de doble compartimento (CELLine CL1000 Flask; Becton-Dickinson), siguiendo instrucciones del fabricante. El medio de cultivo conteniendo el anticuerpo fue recolectado en 3 semanas consecutivas, y conservado a -20ºC hasta su utilización. El anticuerpo anti-DR fue cuantificado mediante electroforesis en gel de agarosa con el kit SAS-MX Serum Protein (Helena Biosciences Europe), dializado contra 2 L de tampón 0,05 M borato pH 8,0 y conservado a -20ºC hasta su utilización. A continuación pasamos a preparar la columna anti-DR/proteína A. Para ello 15 mL de una resina unida covalentemente a proteína A purificada (Affi-Prep Protein A Support; BioRad) fueron cargados en una columna vacía de 15 cm de largo y 1,5 cm de diámetro interno (BioRad). La resina fue equilibrada con 150 mL de tampón de carga de proteína A (0,05 M tampón borato pH 8,0), para a continuación hacer pasar el anticuerpo (a una concentración de 1-10 mg/mL) a través de la resina. El anticuerpo se pasó 2 veces por la columna para asegurar que todo el anticuerpo quedaba unido a la proteína A. La resina fue lavada con 300 mL de tampón de carga de proteína A, hasta que la absorbancia a 280 nm fue prácticamente igual a 0. La resina fue entonces acondicionada con 200 mL de 0,2 M trietanolamina pH 8,2 preparada justo antes de su utilización y mantenida a temperatura ambiente. Para unir covalentemente la fracción constante del anticuerpo a la proteína A se hicieron pasar 80 mL de solución de dimetil-pimelimidato (40 mM dimetilpimelimidato·2HCl -Flukaen 0,2 M trietanolamina pH 8,3). A continuación la columna se mantuvo a temperatura ambiente durante 1 hora, para permitir la unión del anticuerpo y la proteína A. Para terminar la reacción, la columna fue lavada consecutivamente con 100 mL de tampón 0,2 M Tris-HCl pH 8,0 frío, 100 mL de 0,1 M tampón borato pH 8,0 frío, y con 100 86 Capitulo 2: Materiales y Métodos mL de 0,1 M tampón borato con 0,05% de azida sódica. La columna fue conservada a 4ºC hasta su utilización. Se prepararon dos columnas, una para la inmunopurificación de DR4 de células Priess tratadas solamente con el SPA, y otra para las tratadas con el SPA y S100β biotinilada. La Figura 6 muestra que este proceso de unión del anticuerpo anti-DR a la proteína A tuvo lugar con éxito. En la calle 1 se muestra el medio de cultivo obtenido del hibridoma HB55, en el que se distinguen varias bandas correspondientes al anticuerpo desnaturalizado (tamaños aproximados de 25 y 50 kDa; flechas), así como la albúmina fetal bovina añadida al medio de cultivo (banda de 66 kDa). Tras pasar el anticuerpo por la columna se recoge la fracción no unida (calle 2), que contiene solamente la albúmina, de lo que se deduce que el anticuerpo sí se ha unido a la proteína A. Finalmente la calle 3 muestra la resina lista para su uso, en la que se observan las bandas correspondientes al anticuerpo desnaturalizado (flechas). Figura 6. Preparación de la columna anti-DR/proteína A. Análisis SDS-PAGE (14%) de diversas etapas de la elaboración de la columna de afinidad anti-DR4. Calle M: marcador de peso molecular (valores en kDa). 1. Medio de cultivo del hibridoma HB-55 conteniendo anti-DR (50 y 25 kDa; flechas). 2. Medio de cultivo del hibridoma HB-55 tras pasar por la resina de proteína A, y que sólo contiene principalmente albúmina bovina (66 kDa). 3. Resina anti-DR/proteína A lista para su uso, en la que se observa la presencia del anticuerpo anti-DR (flechas). La resina fue resuspendida en tampón de carga de SDS-PAGE 1x, hervida a 98ºC 5 minutos y centrifugada. El sobrenadante resultante fue el analizado por electroforesis. 87 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. 2.3.4. PÉPTIDOS DERIVADOS DE S100Β PROCESADOS Y PRESENTADOS DE MANERA NATURAL POR MHC DE CLASE I. 2.3.4.1. Clonaje de S100β en pcDNA 3.1 (+)/Zeo. La pauta de lectura abierta para S100β fue clonada en el vector pcDNA 3.1 (+) y subclonada en pcDNA 3.1/Zeo (+). Para ello llevamos a cabo una reacción de PCR con los cebadores S100pcDNA-F y S100pcDNA-R (Th=53ºC), y la polimerasa Pfu, utilizando como molde la construcción S100β-pCR T7/NT-TOPO (apartado 2.3.1.3.). El producto obtenido fue cortado con la enzima BamHI (Promega), purificado de gel de agarosa, y cuantificado por gel. El vector pcDNA 3.1 (+) fue también digerido con BamHI, tratado con fosfatasa alcalina termosensible (TSAP, de Promega; incubado 15 min a 37ºC y 15 min a 74ºC), purificado de gel y cuantificado. A continuación se llevó a cabo la ligación entre el inserto y el vector tal y como se ha descrito anteriormente (apartado 2.2.1.5.). Una vez confirmado el éxito del clonaje por secuenciación se realizó el subclonaje en el plásmido pcDNA 3.1/Zeo (+). En este caso se llevó a cabo una PCR de la construcción S100β/pcDNA 3.1 (+) con la polimerasa de alta fidelidad Pfu, el cebador directo descrito en el párrafo anterior y el cebador reverso S100pcDNAZ-R (Th=55ºC). Al igual que en el clonaje anterior, el producto de PCR fue cortado con BamHI, purificado de gel de agarosa y cuantificado. El vector pcDNA 3.1/Zeo (+) fue tratado de igual modo que pcDNA 3.1 (+). La ligación se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente. En ambos casos la identidad de los clones positivos fue comprobada mediante secuenciación. 2.3.4.2. Transfección de las células A2.1/ K562 con S100β. Comprobación de la expresión de S100β. La línea celular A2.1/K562 fue obtenida mediante transfección estable de la línea celular de leucemia eritromieloblastoide K562 para que exprese la molécula de histocompatibilidad de clase I HLA A*02:01 (A2.1) en superficie. Esta línea que expresa A2.1 es resistente a geneticina y fue obtenida de C. Britten (Britten y cols. 2002). Llevamos a cabo entonces una transfección estable de esta línea con la construcción S100β/pcDNA 3.1Zeo (+), para obtener una línea celular doble transfectante que exprese tanto A2.1 como S100β. Las células A2.1/K562 se mantuvieron en cultivo en frascos de 75 cm2 (T75) en medio R10 suplementado con 0,7 mg/mL de geneticina (Invitrogen) como antibiótico de selección. 94 Capitulo 2: Materiales y Métodos Antes de llevar a cabo la transfección se hizo una curva de resistencia a zeocina para las células A2.1/K562 cultivando las células con distintas concentraciones de zeocina (Invitrogen), resultando ser 0,2 mg/mL la concentración óptima. La construcción S100β/pcDNA 3.1-Zeo (+) fue linearizado mediante digestión con la enzima de restricción ScaI (Promega), que corta al plásmido en el gen que confiere resistencia a ampicilina. Tras el corte el plásmido linearizado fue separado de la enzima y otros componentes de la reacción (QIAquick PCR purification kit, QIAGEN) y cuantificado por gel. Para las transfecciones utilizamos la Lipofectamina 2000 (Invitrogen) siguiendo indicaciones del fabricante. En primer lugar llevamos a cabo una transfección transitoria para comprobar la viabilidad de la transfección con S100β y determinar la relación óptima de ADN/Lipofectamina. Para ello 0,8 µg de plásmido linearizado fueron mezclados con cantidades crecientes de Lipofectamina, en proporciones 1:1 a 1:5. 0,8x106 células/pocillo fueron incubadas en 500 µL de medio R10 en placas de 24 pocillos con la mezcla de ADN/Lipofectamina correspondiente durante 72 horas. Se incubaron también células tratadas sólo con Lipofectamina (control negativo). Tras las 72 horas de cultivo las células fueron recogidas, lavadas, y se preparó un extracto citoplasmático para lo cual las células fueron resuspendidas en 250 µL de tampón de lisis de células eucariotas e incubadas 30 min en hielo. A continuación se centrifugó el lisado a 10.000 xg 10 min a temperatura ambiente, y el sobrenadante (extracto) fue conservado a - 20ºC hasta su posterior análisis mediante electroforesis en geles de SDS-PAGE al 14% y western blot quimioluminiscente. En la identificación de S100 se empleó un anticuerpo monoclonal de ratón contra la S100β humana (dilución 1:5000), y un anticuerpo secundario contra la IgG de ratón conjugado a HRP (dilución 1:10000; Sigma-Aldrich). La relación óptima ADN/Lipofectamina resultó ser de 1:3. La Figura 7 muestra que S100β sí puede ser expresada por las células A2.1/K562, siendo la ratio 1:3 la ratio a la que se produce mayor cantidad de la proteína. 95 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. Figura 7. Transfección transitoria de la línea celular A2.1/K562 con S100β/pcDNA 3.1 (+) Zeo. Se llevaron a cabo transfecciones con distintas relaciones de ADN-Lipofectamina (calles 1:1 a 1:5). Se observa hay expresión de S100β con los ratios 1:2, 1:3, 1:4 y 1:5. La proteína expresada tiene el tamaño esperado (13 kDa) (flecha). Como control positivo para el western blot se ha incluido una calle (calle “S100β”) con S100β producida y purificada en nuestro laboratorio (tamaño esperado de 16 kDa). Si no se añade ADN a la Lipofectamina no hay expresión de S100β (calle “Sin ADN”). Para la transfección estable 8 µg del plásmido linearizado fueron mezclados con 24 µL de Lipofectamina. 8x106 células A2.1/K562 fueron sembradas en 4 mL de R10 en un frasco de cultivo de 25 cm2 (T25) y la mezcla de ADN/Lipofectamina añadida sobre ellas. Otras 8x106 células recibieron sólo Lipofectamina (control negativo de transfección). Tras 24 horas en cultivo las células fueron diluidas 1:5 con R10 suplementado con 0,7 mg/mL de geneticina y sembradas en un T75. A los 5 días de cultivo se añadió el agente selectivo, zeocina, a 0,2 mg/mL. 5 días más tarde la concentración de zeocina se bajó a 0,1 mg/mL. Se mantuvieron en cultivo hasta alcanzar un número suficiente, y las células que sobrevivieron fueron congeladas y almacenadas en nitrógeno líquido. En este punto se tomaron células de la línea K562/A2.1 y de la nueva línea K562/A2.1-S100β y se prepararon extractos celulares, tal y como se ha descrito para la transfección transitoria. De nuevo se llevó a cabo un western blot quimioluminiscente, que confirmó que la línea K562/A2.1-S100β expresaba S100β (ver Capítulo 5). Con el fin de obtener células con expresiones elevadas de S100, se realizó una clonación por dilución límite de la línea celular obtenida anteriormente. El medio de clonación utilizado fue medio R10 con 12,5% de medio condicionado (medio recogido de un cultivo de la línea celular y filtrado por 0,22µm), 0,7 mg/mL de geneticina y 0,1 mg/mL de zeocina. Para la clonación las células se lavan en DPBS (Gibco), se cuentan y se diluyen a 25.000 células/mL. De esta suspensión se siembran 200 µL en 24 pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo plano. Las células sobrantes son diluidas a la mitad y sembradas en otros 24 96 Capitulo 2: Materiales y Métodos pocillos, y así sucesivamente hasta cubrir toda la placa. Los cuatro grupos de diluciones seriadas obtenidas (2,5, 1,25, 0,63 y 0,31 células/pocillo) se monitorizan a partir del 4º día de crecimiento, y los pocillos en los que se ven dos focos distintos creciendo se descartan. A los 7 días se retiran 175 µL de medio y se añaden otros 175 µL de medio de clonación. Tras 10 días se observan ya conjuntos de células creciendo; los pocillos se duplican (la mitad de las células se pasa a un pocillo nuevo y a ambos pocillos se les añade más medio condicionado). A partir de este punto se empiezan a expandir los clones a placas de 6 pocillos, a T25 y finalmente a T75, para acabar congelando varias alícuotas de cada clon. En este proceso de expansión ya no es necesario utilizar medio de clonación, se usa R10 con 0,7 mg/mL geneticina y 0,1 mg/mL zeocina. Para comprobar que S100β estaba efectivamente siendo expresada por cada uno de los clones obtenidos se llevó a cabo una citometría de flujo y una inmunofluorescencia. Para la citometría de flujo 1x106 células de cada clon, así como células K562 sin transfectar, fueron resuspendidas en PBS 3% FCS, y teñidas con 1 µg de un anticuerpo monoclonal generado en ratón contra la molécula HLA-A2 humana conjugado con FITC (BD Pharmingen) durante 30 min en hielo y en oscuridad. A continuación las células se lavaron 3 veces con 1 mL PBS 3% FCS, y se fijaron y permeabilizaron con 100 µL de Cytofix/Cytoperm (BD Pharmingen) 20 min a 4ºC en oscuridad. Tras 2 lavados con 1 mL de tampón Perm/Wash (BD Pharmingen) las células fueron resuspendidas en 100 µL de ese mismo tampón y se añadió 1 µg de un anticuerpo monoclonal de ratón contra la S100β humana. Una vez incubadas 30 min en hielo y en oscuridad fueron de nuevo lavadas con el tampón Perm/Wash, resuspendidas en 100 µL de ese mismo tampón y teñidas con 1 µg de un anticuerpo policlonal de cabra contra el fragmento F(c)-F(ab)2 de la IgG de ratón conjugado con ficoeritrina (Abcam), 30 min en hielo y en oscuridad. Tras 2 lavados con el tampón Perm/Wash las células fueron resuspendidas en PBS 3% FCS y analizadas en el citómetro de flujo. La identidad de los distintos clones fue también verificada mediante inmunofluorescencia para detectar la presencia de A2.1 y S100. En el caso de la tinción para A2.1, varios cubreobjetos fueron recubiertos con 400 µL de poli-L-lisina (Sigma-Aldrich) e incubados 10 min a temperatura ambiente. Tras aspirar el exceso de poli-L-lisina los cubreobjetos se dejaron secar y se añadieron sobre cada uno 97 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. 0,5x106 células en 600 µL de R10, durante 10 min a 37ºC. Tras 3 lavados con 600 µL de PBS los cubreobjetos fueron bloqueados con 100 µL de PBS 10% FCS, durante 20 min a temperatura ambiente. A continuación las células fueron teñidas con 1 µg de un anticuerpo anti-HLA-A2/FITC, en PBS con 10% FCS, durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras lavar 3 veces con PBS, las células fueron fijadas con 400 µL de Cytofix/Cytoperm durante 20 min a 4ºC. De nuevo se lava 3 veces con PBS, y se incuba con 100 µL de diclorhidrato de 4’,6diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 5 min a temperatura ambiente. A continuación se vuelve a lavar 3 veces y se monta sobre un portaobjetos utilizando el medio de montaje Vectashield (Vector Laboratories), para a continuación visualizar la muestra en un microscopio de fluorescencia Olympus BX51 acoplado a una cámara digital Olympus DP-71. Para detectar la presencia de S100β los cubreobjetos fueron tratados con poli-L-lisina, las células añadidas sobre ellos, y tras la incubación fueron lavados 3 veces con PBS, todo tal y como se ha descrito en el párrafo anterior. Se fijaron y permeabilizaron las células mediante una incubación de 10 min a -20ºC con 400 µL de metanol pre-enfriado a -20ºC. Tras 3 lavados con PBS se añadió el anticuerpo monoclonal anti-S100β-FITC, a una concentración final de 20 µg/mL, durante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavó 3 veces con PBS, y tras teñir con 100 µL de DAPI se lavaron los cubreobjetos y se montaron sobre portaobjetos con Vectashield. 2.3.4.3. Crecimiento de K562/A2.1 y K562/A2.1-S100β. Preparación de extractos con citrato. Las células fueron cultivadas en medio R10 suplementado con el surfactante PluronicF10 (GIBCO), además del/los antibióticos de selección correspondientes (0,7 mg/mL de geneticina para las células control K562/A2.1; 0,7 mg/mL de geneticina y 0,1 mg/mL de zeocina para las células K562/A2.1-S100β. Lás células se crecieron en suspensión en frascos de cultivo de volúmenes crecientes (0,25, 1 y 3 L) con agitación, diluyendo las células a una concentración máxima de 0,2-0,3x106 células/mL al cambiarlas de frasco. Una vez alcanzados los 3 L, las células se dejaron crecer hasta una densidad aproximada de 1x106 células/mL, tras lo cual fueron recogidas y tratadas para eluir los péptidos de superficie. Para ello las células fueron lavadas 2 veces con PBS frío, resuspendidas a 1x108 células/mL en tampón citrato (0,131 M ácido cítrico, 0,066 M Na2HPO4, 0,150 M NaCl, pH 3,3), e incubadas 5 min a temperatura ambiente. Tras centrifugar, el extracto fue filtrado por 0,22 µm y a continuación ultrafiltrado por un Amicon Ultra de 3 kDa (Millipore). La fracción 98 Capitulo 2: Materiales y Métodos ultrafiltrada conteniendo los péptidos fue conservada a -80ºC hasta su posterior análisis. Una vez extraídos los péptidos, las células fueron lavadas 2 veces con PBS, resuspendidas en medio R10 con Pluronic y los antibióticos correspondientes y puestas de nuevo en cultivo, para utilizarlas una vez más en la producción de péptidos. Para verificar la eficacia de este método de extracción de péptidos presentados por las moléculas A2.1 de superficie 2,5x106 células fueron incubadas con PBS o con tampón citrato, tras lo cual las células fueron lavadas y la mitad de ellas puestas de nuevo en cultivo. La otra mitad fue fijada con Cytofix/Cytoperm y teñida con 1 µg de anticuerpo anti-HLA-A2/FITC en PBS suplementado con 10% de FCS. Tras dos lavados con PBS 10% FCS las células fueron analizadas en el citómetro. Al día siguiente las células puestas en cultivo fueron recogidas, lavadas y teñidas tal y como se ha descrito. 2.3.4.4. Purificación de péptidos por extracción por fase sólida (SPE). Fraccionamiento por cromatografía líquida de alta eficiencia de fase reversa (RP-HPLC). Para la purificación mediante extracción por fase sólida (SPE) la resina empleada fue la DSC-18 (Sigma-Aldrich) empaquetada en nuestro laboratorio en columnas vacías de 1 mL de capacidad (Empty Rezorian Tube Kit, SUPELCO). Para cada purificación se utilizaron 2 columnas conectadas en serie. Las columnas fueron acondicionadas con 10 volúmenes de columna (v.c.) de metanol, y a continuación fueron equilibradas con otros 10 v.c. de tampón citrato. Se añade a continuación el extracto peptídico, tras lo cual las columnas fueron lavadas con 5 v.c de 0,1% TFA. La elución se llevó a cabo con cada columna por separado empleando 4 mL de 70% ACN con 0,1% TFA. Las fracciones eluídas conteniendo los péptidos fueron concentradas en un concentrador centrífugo hasta un volumen final de aproximadamente 100 µL, y conservadas a -80ºC hasta su posterior fraccionamiento por RP-HPLC. Se emplearon diferentes columnas para purificar los péptidos de K562/A2.1 y K562/A2.1-S100β. Para el fraccionamiento de los péptidos se utilizó la técnica de RP-HPLC, tal y como se ha descrito con anterioridad (apartado 2.2.4). 2.3.4.5. Espectrometría de masas. Síntesis de péptidos candidatos. Las fracciones recuperadas de la separación por RP-HPLC y que contenían péptidos (fracciones 17 a 60) fueron enviadas al servicio de espectrometría de masas y analizadas tal y como se ha descrito previamente (apartado 2.2.5.). Los espectros derivados de péptidos de 99 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. K562/A2.1 y K562/A2.1-S100β fueron comparados entre sí en búsqueda de fracciones equivalentes. Los valores de m/z obtenidos de las fracciones de K562/A2.1-S100β fueron enviados al programa Findpept, para seleccionar aquellos que podían haber sido derivados de S100β. De ahí se escogieron los péptidos de una longitud comprendida entre 7 y 11 aminoácidos, y se compararon manualmente con las fracciones equivalentes de K562/A2.1, además de con la inmediatamente anterior y la inmediatamente posterior. De los m/z únicos se seleccionaron aquellos que poseían una longitud de entre 8 y 10 aminoácidos y que fueran intensos. Obtuvimos así 4 m/z candidatos. Para que un péptido se una a moléculas de clase I debe haber sido generado por el proteosoma y/o el inmunoproteosoma, por lo que todas las predicciones para los 4 valores de m/z candidatos fueron analizadas para comprobar si cumplían esta premisa. Este objetivo se llevó a cabo utilizando a) el Servidor para la Predicción de Fragmentación por Proteosoma (PCP; http://imed.med.ucm.es/Tools/pcps/index.html; Diez-Rivero y cols. 2010), que emite predicciones de generación de péptidos a partir de una secuencia dada tanto para el proteosoma como para el inmunoproteosoma (modelo 1), y b) el Algoritmo de Predicción de Fragmentación por Proteosoma (PAProC; proteosoma humano tipo III. http://www.paproc.de/; Kuttler y cols. 2000; Nussbaum y cols. 2001). Obtuvimos así 5 péptidos candidatos (S100 10-18, S100 20-28, S100 38-45, S100 54-61 y S100 67-75), que fueron sintetizados por GenScript con una pureza del 95%, resuspendidos en dimetilsulfóxido (DMSO), cuantificados en nuestro laboratorio mediante RP-HPLC comparando áreas bajo picos respecto de péptidos de concentración conocida, y conservados a -20ºC hasta su utilización. 2.3.4.6. Digestión in vitro de S100β por el proteosoma. Identificación de los extremos carboxi-terminales generados. Para el ensayo de digestión in vitro 15 µg de S100β fueron incubados en tampón de digestión (30 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol, 0,01% SDS) con 2,62 µg de la subunidad 20S del proteosoma (Enzo Life Sciences) (relación molar 250:1) a 37ºC durante 16 horas. Como control se incubó la proteína S100β en el tampón de digestión sin proteosoma, o bien con proteosoma en el tampón de digestión conteniendo 1% de ácido acético para inactivarlo. Para detener la reacción la mezcla fue congelada a -80ºC. A continuación 70 µL de cada muestra fueron pasados a través de una resina de intercambio catiónico (ZipTip SCX, Millipore) siguiendo instrucciones del fabricante, con el fin de 100 Capitulo 2: Materiales y Métodos eliminar las sales presentes en las mezclas, descartar al proteosoma y a la proteína S100β que no hubiera sido digerida, y concentrar los péptidos que se hubieran generado. Finalmente los péptidos capturados por la resina fueron eluidos con 3 µL de 5% NH4 en 30% de metanol, depositados mediante el método de capa fina descrito con anterioridad y analizados en el espectrómetro de masas. Los espectros de MS y MS/MS fueron analizados tal y como se ha descrito previamente (apartado 2.2.5.). 2.3.4.7. Ensayo de estabilización de A2.1 de los péptidos candidatos. Los péptidos candidatos fueron utilizados en ensayos de estabilización de A2.1 (Varela-Calviño y cols. 2004) Para ello se utilizaron células T2 transfectadas para expresar A2.1, las cuales carecen del transportador asociado con el procesamiento (TAP), por lo que las moléculas de HLA A2.1 no unirán péptidos, no serán estables y no se encontrarán en la superficie celular. La adición de péptidos capaces de unirse a A2.1 permite la estabilización de la molécula en la superficie, permitiendo su detección mediante tinción específica para A2.1 y análisis por citometría de flujo. Así pues, 105 células fueron lavadas dos veces con el medio libre de suero AIM-V (Gibco), e incubadas con 50 µL de este medio de cultivo conteniendo 5 µg/mL de β2microglobulina (Sigma-Aldrich) y concentraciones decrecientes del péptido a probar (100, 50, 25, 12,5 y 0 µM). Se empleó como control positivo de unión a A2.1 el péptido derivado del virus influenza GILGFVFTL (“Flu 58-66”) que se sabe se une a A2.1 con gran afinidad (Parker y cols. 1992), y como control negativo el péptido EVKEKGMAA (“GAD 261-269”), perteneciente a la descarboxilasa 65 del ácido glutámico (GAD65), ya que se ha demostrado que no se une a A2.1 (Varela-Calviño y cols. 2004). Asimismo también se cultivaron células conteniendo la cantidad equivalente de DMSO como control negativo. Las células fueron incubadas 16 horas a 37ºC y 5% CO2, tras lo cual fueron lavadas con PBS frío, resuspendidas en 100 µL de PBS conteniendo 3% FCS y teñidas con 0,2 µg de anticuerpo monoclonal antiHLA-A2 conjugado a FITC durante 30 min en hielo y en oscuridad, con agitación cada 10 min. Tras 2 lavados con PBS las células fueron fijadas con 100 µL de Cytofix/Cytoperm durante 20 min a 4ºC. Tras dos lavados con PBS las células fueron analizadas en el citómetro. El valor de la fluorescencia media empleada en las gráficas es el obtenido para cada pocillo menos el valor de fluorescencia media para el pocillo conteniendo la cantidad equivalente de DMSO. 101 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. Para evaluar la capacidad teórica de unión de los péptidos candidatos a A2.1 se enviaron sus secuencias a los siguientes programas on-line:  SYFPEITHI: base de datos ya descrita con anterioridad. La puntuación máxima asignada por el programa varía según el alelo, para el caso de A2.1 la puntuación máxima es de 36, teniendo el epitopo derivado de la proteína de la matriz del virus de la gripe A GILGFVFTL una puntuación de 30.  HLA-Affi: es uno de los muchos programas desarrollados por el grupo del doctor G.P.S. Raghava. Utiliza las bases de datos MHCBN y Antijen. Los péptidos incluidos para desarrollar el programa son aquellos nonámeros cuyo valor de afinidad (IC50) ya ha sido determinado experimentalmente. La puntuación que suministra es el logaritmo natural de la capacidad de unión: cuanto menor sea la puntuación mayor es la capacidad de unión del péptido. Establece un punto de corte para considerar a un péptido capaz de unirse a A2.1.  SVMHC: ya descrito en la sección dedicada a MHC de clase II. Valores más altos indican mejor capacidad de unión.  MHC-I binding: es una de las muchas herramientas presentes en la página web del Immune Epitope Database and Analysis Resource (http://www.immuneepitope.org/; Lundegaard y cols. 2008a y 2008b). Esta herramienta suministra los valores de IC50 (nM) para cada péptido, de tal modo que cuanto más pequeño sea este valor mayor afinidad tendrá el péptido por A2.1. Así, los péptidos con IC50 menor de 50 nM son considerados de gran afinidad, los menores de 500 nM de afinidad intermedia y los menores de 5000 nM de baja afinidad. La mayor parte de los epitopos conocidos de células T tienen afinidad alta o intermedia, si bien algunos de ellos muestran baja afinidad. Hasta el momento no se conoce ningún epitopo de célula T con un valor de IC50 superior a 5.000 nM. 2.3.5. GENERACIÓN DE HIBRIDOMAS DE LINFOCITOS T INFILTRANTES DE ISLOTES DE LANGERHANS DE NOD: ESTUDIO PRELIMINAR DE SU ESPECIFICIDAD. Los ratones NOD empleados en el estudio fueron mantenidos en el estabulario del Hospital Universitario Germans Trias i Pujol (Badalona) bajo condiciones libres de patógenos específicos de ratón (SPF) de acuerdo con las Directivas de la Unión Europea de protección de animales de experimentación. El aislamiento de islotes, generación de hibridomas y generación de transfectantes S100β/P815 fueron llevadas a cabo durante una estancia 102 Capitulo 2: Materiales y Métodos predoctoral en el grupo de investigación del doctor Joan Verdaguer, en el Instituto de Investigación Germans Trias i Pujol. Los islotes de Langerhans fueron aislados mediante digestión enzimática del páncreas tal y como han descrito otros autores (Carrillo y cols. 2005; Schmidt D. y cols. 1997; Vargas y cols. 2001). Brevemente, el ratón es anestesiado en éter y sacrificado mediante dislocación cervical. Tras ser rociado con etanol al 70% se realizó una incisión todo a lo largo de la línea media, desde la parte inferior del abdomen hasta las glándulas salivares. A continuación el diafragma fue cortado y las costillas extraídas. La masa abdominal fue desplazada hacia el lado izquierdo del animal, y la ampolla de Vater pinzada con una pinza tipo mosquito. Se pinzó a continuación la vesícula biliar con un segundo mosquito, para finalmente pinzar la cara inferior del hígado por el lóbulo hacia el que se dirige el colédoco (Figura 8). De este modo el colédoco queda a la vista, por lo que se sujeta con una pinza dentada y se introduce una aguja de 30G, previamente insertada en una jeringa conteniendo 3 mL de colagenasa fría (CLS-4, Whortington) a 470 U/mL en HBSS. Si el pinzamiento de la ampolla de Vater, vesícula biliar e hígado ha tenido lugar con éxito la colagenasa llenará por completo el páncreas del ratón. Figura 8: Pinzamiento previo a la inyección del páncreas con colagenasa. Tras efectuar un corte longitudinal por la línea media del animal y extraer las costillas, se pinza la ampolla de Vater (1), la vesícula biliar (2) y la ramificación hepática izquierda del colédoco (3), quedando el colédoco a la vista (4). La colagenasa es introducida en el páncreas mediante inyección a través del colédoco empleando una aguja de 30G. 103 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. existen dímeros de cebadores). Las temperaturas de fusión obtenidas fueron: 91,5ºC (galectina-1), 90ºC (galectina-3), 87,5ºC (GAPDH), 86,5ºC (Tbet), 89ºC (GATA3) y 82,5ºC (RORC2). Se llevó a cabo una PCR en tiempo real sólo con los cebadores para la GAPDH para comprobar que la amplificación de GAPDH en todas las muestras tenía lugar en el mismo ciclo. A continuación se llevaron a cabo las reacciones de PCR en tiempo real para todas las muestras con cada par de cebadores (galectina-1, galectina-3, Tbet, GATA3 y RORC2) conjuntamente con el par de cebadores para la GAPDH. El método ΔΔCt fue el empleado para analizar los niveles de expresión normalizados a la expresión de GAPDH (Pfaffl y cols. 2001; Iglesias-Fernández y cols. 2009). Los resultados mostrados han sido relativizados respecto a la muestra con menor expresión. 2.3.6.3. Western blot de extractos celulares para galectina-1 y galectina-3. Las células provenientes de cada polarización (Th0, Th1, Th2 y Th17) fueron resuspendidas en 250 µL de tampón de lisis de células eucariotas e incubadas 30 min en hielo. A continuación se centrifugó el lisado a 10.000 xg 10 min a temperatura ambiente, y el sobrenadante (extracto) fue congelado a -20ºC hasta su posterior utilización. Para la galectina-1 se llevó a cabo un western blot quimioluminiscente tal y como se ha descrito previamente. En un gel de SDS-PAGE del 14% se cargaron 1 µg de galectina-1 (Sigma-Aldrich) y 10 µL de cada extracto. Tras la transferencia y el bloqueo la membrana fue teñida con un anticuerpo monoclonal anti-galectina-1 (Abcam) a 0,5 µg/mL, para a continuación añadir un anticuerpo monoclonal anti-IgG de ratón conjugado a HRP (1:5000; Sigma-Aldrich). Los films fueron expuestos 2 min. Otra membrana conteniendo las mismas muestras se analizó mediante western blot colorimétrico con un anticuerpo monoclonal antiβ-actina conjugado a HRP (1:1000; Sigma-Aldrich), revelando con TMB. Para la galectina-3 se llevó a cabo un western blot colorimétrico, siguiendo las instrucciones dadas previamente. Para ello en un gel de SDS-PAGE del 12,5% se cargaron 1 µg de galectina-3 (Sigma-Aldrich) y 10 µL de cada extracto. Tras la transferencia y el bloqueo la membrana fue teñida con un anticuerpo policlonal para la galectina-3 conjugado a biotina (0,2 µg/mL; R&D Systems), y a continuación con estreptavidina conjugada a HRP (1:100). Otra membrana conteniendo las mismas muestras fue teñida con el anticuerpo anti-βactina descrito para el western blot de galectina-1. Las membranas fueron reveladas con TMB. 110 Capitulo 2: Materiales y Métodos 2.3.6.4. Cuantificación de galectinas y citocinas mediante ELISA. Para cuantificar la cantidad de galectina-1 en medios de cultivo desarrollamos un ensayo de ELISA específico. Las concentraciones óptimas de anticuerpo de captura, curva estándar, anticuerpo de detección biotinilado y estreptavidina conjugada a HRP fueron determinados siguiendo el esquema propuesto por Crowther y cols. Brevemente, la placa de 96 pocillos fue tapizada con un anticuerpo monoclonal antigalectina-1 (Abcam) a 5 µg/mL en PBS, e incubada toda la noche a 4ºC. Tras 5 lavados con PBST los pocillos fueron bloqueados con PBST conteniendo 3% de BSA durante una hora a temperatura ambiente. Las muestras fueron diluidas 1:3 en PBST conteniendo 1% de BSA, y añadidas por duplicado a la placa. Se preparó también una curva estándar de galectina-1 recombinante (Sigma-Aldrich) de 10 a 640 ng/mL. Muestras y estándares se incubaron 2 horas a temperatura ambiente, y tras 5 lavados se añadió el anticuerpo de detección (anticuerpo policlonal contra la galectina-1 conjugado a biotina; Abcam) a una concentración de 1 µg/mL. Una vez transcurrida una hora de incubación la placa fue lavada 5 veces e incubada 30 min a temperatura ambiente con estreptavidina-HRP (dilución 1:250). La placa se lavó 7 veces para eliminar el exceso de estreptavidina y se incubó 30 min a temperatura ambiente en oscuridad con el sustrato OPD. Finalmente se detuvo la reacción por adición de HCl 1M. La absorbancia fue medida a 490 nm restando la absorbancia a 655 nm. Para cuantificar la cantidad de galectina-3 se diseñó un ELISA semejante al descrito para galectina-1, con las siguientes modificaciones: el anticuerpo monoclonal de captura específico para la galectina-3 (R&D Systems) se utilizó a 5 µg/mL; la curva estándar de galectina-3 recombinante (Sigma-Aldrich) abarcó de 0,2 a 25 ng/mL; las muestras fueron añadidas sin diluir, y el anticuerpo de detección biotinilado (R&D Systems) se utilizó a 0,25 µg/mL. La cuantificación de IFN-γ, IL-10, IL-13, IL-17 e IL-21 se llevó a cabo mediante kits comerciales de ELISA (kits Ready-SET-Go! –eBioscienceo kits ELI-pair -Gen-Probe Diaclone-) siguiendo instrucciones del fabricante. Todos los datos de concentración de galectinas y citocinas en medios de cultivo y/o plasmas se indican en pg o ng (según corresponda) por millón de células y por mL de medio de cultivo. 111 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. 112 2.3.6.5. Determinación de galectina-1 de superficie y tinción con PHA-L. Tras el período de 72 horas de estimulación las células fueron recogidas, lavadas en frío con PBS y teñidas con 1,5 µg del anticuerpo policlonal anti-galectina-1 conjugado con biotina durante 30 min en hielo, con agitación cada 10 min. Tras lavar el anticuerpo no unido con PBS frío se añadieron a las células avidina conjugada a FITC (0,83 mg/mL; Zymed), fitohemaglutinina conjugada a Alexa Fluor 647 (1 µg; PHA-L; Molecular Probes), y anticuerpo monoclonal anti-CD4 (0,4 µg; AbD Serotec) o anticuerpo monoclonal anti-CD25 (20 µL; BD Pharmingen), ambos conjugados a PE. Tras incubar 30 min en hielo con agitación cada 10 min las células fueron lavadas 2 veces y analizadas en un citómetro de flujo, y los resultados se trataron con el software WinMDI 2.9. 2.3.6.6. Eliminación de los ligandos de las galectinas de la superficie celular de linfocitos T. Para determinar el efecto de la glicosilación de la membrana celular en la síntesis de galectina-1 y el comportamiento de las células T, linfocitos T CD3+ de controles sanos fueron aislados empleando el kit Pan T Cell Isolation Kit II (Miltenyi Biotec), siguiendo instrucciones del fabricante. Los linfocitos T CD3+ fueron teñidos con 1 µM de 5(6)- carboxifluoresceína diacetato N-succinimidil éster (CFSE), sembrados a una concentración de 1x106 células/mL en medio R10 y estimulados con partículas anti-CD3/CD28 a razón de una partícula por célula. La swainsonina se añadió a los pocillos correspondientes a una concentración final de 200 nM. Tras 72 horas de estimulación las células fueron recogidas por centrifugación para su tinción con la lectina PHA-L y el posterior análisis por citometría de flujo; los medios de cultivo fueron almacenados a -80ºC hasta la cuantificación de galectina-1 y citocinas por ELISA, tal y como se ha descrito con anterioridad. C Ca ap pí ít tu ul lo o 3 3: : C Cl lo on na ac ci ió ón n, , e ex xp pr re es si ió ón n y y p pu ur ri if fi ic ca ac ci ió ón n d de e a au ut to oa an nt tí íg ge en no os s i im mp po or rt ta an nt te es s e en n l la a d di ia ab be et te es s t ti ip po o 1 1. . 113 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. 114 Capitulo 3: Clonación, expresión y purificación de autoantígenos importantes en la diabetes tipo 1. 3.1. Clonaje, expresión y purificación de la glucosa-6-fosfatasa específica de islotes (IGRP). Se ha descrito que en el modelo animal de la diabetes tipo 1 (ratón diabético no obeso; NOD) tanto en el infiltrado linfocitario de los islotes de Langerhans como en sangre periférica la mayor parte de los linfocitos T CD8+ citotóxicos eran específicos contra un péptido de la proteína relacionada con la subunidad catalítica de la glucosa-6-fosfatasa específica de islotes (IGRP) (Lieberman y cols. 2003). Además, el porcentaje de linfocitos reactivos contra IGRP en sangre periférica permitía predecir si el animal padecería finalmente la enfermedad. Esta elevada reactividad contra IGRP también se ha observado en ratones NOD humanizados que expresan la molécula de histocompatibilidad humana HLA-A*02:01, que se sabe confiere susceptibilidad a padecer la enfermedad (Takaki y cols. 2006); también se han detectado linfocitos T CD4+ específicos para IGRP en humanos (Yang y cols. 2006). Vista la importancia de IGRP como autoantígeno en la diabetes tipo 1 decidimos intentar su expresión y purificación con el fin de utilizar la proteína en investigaciones posteriores que permitan ampliar el conocimiento acerca del papel de IGRP en el desarrollo de la diabetes tipo 1. El cDNA conteniendo la pauta abierta de lectura para IGRP y obtenido mediante RTPCR a partir de ARN mensajero de páncreas humano, fue clonado en el vector pCR 2.1TOPO y su identidad confirmada por secuenciación. IGRP es una proteína de membrana localizada en el retículo endoplasmático, con su extremo amino-terminal dirigido hacia el lumen del retículo y su extremo carboxi-terminal hacia el citoplasma y, aunque no se ha determinado su estructura tridimensional, diversos algoritmos predicen hasta 9 dominios transmembrana (Shieh y cols. 2004). Este dato, unido al hecho de que las proteínas de membrana presentan numerosos problemas en su expresión y purificación en sistemas procariotas, como son toxicidad y baja solubilidad, pueden explicar los resultados infructuosos de expresión de esta proteína en nuestro laboratorio empleando sistemas de expresión habituales en bacterias como pMAL y pCR T7/NT-TOPO, los cuales poseen promotores (TAC y T7, respectivamente) cuya expresión basal parece suficiente para eliminar aquellas bacterias recombinantes conteniendo el vector recombinante (datos no mostrados). Decidimos entonces emplear un sistema de expresión mucho más específico para proteínas que presentan dificultades de expresión debido a su toxicidad y basado en el empleo de una cepa bacteriana específica, C43 (DE3) (Miroux y cols. 1996). Esta cepa bacteriana contiene membranas internas que permiten la expresión de proteínas transmembrana como 115 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. IGRP y que es mucho más resistente a la expresión de un gran número de proteínas tóxicas (Dumon-Seignovert y cols. 2004) (ver Figura 5 en Material y Métodos). En combinación con la cepa C43 (DE3) la pauta de lectura abierta de IGRP fue subclonada en un vector de expresión que permite un mayor control de expresión de la proteína, el vector pBAD/Thio-TOPO. Este vector posee el promotor araBAD, el cual está positiva y negativamente regulado por el producto del gen AraC (Ogden y cols 1980; Schleif 1992), un factor regulador de la transcripción que forma un complejo con la L-arabinosa. En ausencia de arabinosa, el dímero de AraC se une al promotor de tal modo que se forma un lazo que impide la transcripción. Al añadir L-arabinosa ésta se une al dímero de AraC, deshaciendo el lazo, y permitiendo el inicio de la transcripción. Este sistema de expresión limita la producción basal de la proteína anulando el efecto tóxico observado con otros vectores de expresión procariotas. Además, el vector genera una proteína de fusión con tiorredoxina lo que aumenta la solubilidad de las proteínas mejorando la eficiencia de la expresión. Finalmente, el proceso de purificación de proteínas de membrana implica el empleo de detergentes que permitan la correcta solubilización de los microsomas donde dicha proteína está insertada. Tras una búsqueda en la literatura decidimos emplear el detergente fos-colina 12 (FC12) ya que permite la solubilización de un gran número de proteínas de membrana diferentes (Eshaghi y cols. 2005). De esta manera, la combinación específica de cepa bacteriana-vector de expresión-detergente permitió finalmente obtener IGRP en un sistema procariota tal y como se muestra en la Figura 9. En la Figura 9A se muestra un análisis mediante SDS-PAGE y tinción con azul de coomassie de los diferentes pasos seguidos en la purificación de IGRP. Se puede observar que a pesar de que el nivel de expresión no es muy elevado (Figura 9A, comparar calles 1 y 2) sí es suficiente para obtener una proteína del tamaño esperado para la construcción Thio-IGRPV5-His (IGRP con tiorredoxina en el extremo amino-terminal y el epitopo V5 junto con una cola de 6 histidinas en el extremo carboxi-terminal; 57 kDa) con un rendimiento de 0,1 mg/L y al menos un 95% de pureza (Figura 9A, calle 6). La identidad de la proteína purificada como IGRP se llevó a cabo mediante análisis por western blot empleando un anticuerpo monoclonal dirigido contra el epitopo V5, ya que no existen anticuerpos monoclonales dirigidos contra IGRP (Figura 9B). 116 Capitulo 3: Clonación, expresión y purificación de autoantígenos importantes en la diabetes tipo 1. A pesar de conseguir expresar y purificar una proteína transmembrana como IGRP, que presenta una elevada toxicidad en bacterias y cuyo papel en el desarrollo de la diabetes tipo 1 parece establecida, la cantidad obtenida no fue suficiente para poder desarrollar un ELISA que permitiese detectar autoanticuerpos dirigidos contra ella en el suero de individuos diabéticos o para identificar epitopos capaces de activar linfocitos T autorreactivos. Figura 9. Purificación de la glucosa-6-fosfatasa específica de islotes (IGRP). A. Electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE (12,5%) de las distintas etapas seguidas en la purificación de IGRP. Calle M: marcador de peso molecular (kDa); calle 1: lisado de E. coli sin inducir con IPTG; calle 2: lisado de E. coli tras inducir con IPTG; calle 3: fracción insoluble del extracto bacteriano; calle 4: fracción soluble del extracto bacteriano; calle 5: microsomas solubilizados con foscolina-12; calle 6: IGRP purificada mediante cromatografía de afinidad. B. Análisis por western blot empleando un anticuerpo monoclonal contra el epitopo V5 de las muestras indicadas en A. La flecha señala la posición esperada para IGRP (57 kDa). 117 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. 3.2. Clonaje, expresión y purificación de GFAP. Muchos de los autoanticuerpos descritos para la diabetes tipo 1 reconocen proteínas constituyentes del sistema nervioso central y/o periférico (GAD65, IA-2), lo que hace de las proteínas expresadas por células de este tipo un interesante campo de búsqueda de nuevos autoantígenos. Las células de Schwann que rodean a los islotes de Langerhans parecen ser unas de las primeras células en sufrir el ataque autoinmune en la diabetes tipo 1 ya en estadíos prediabéticos. Se han derivado líneas de linfocitos T a partir de ratones NOD específicas contra la proteína ácida de la glía (GFAP), proteína expresada por las células de Schwann. Dichas líneas celulares GFAP-específicas son capaces de transferir la enfermedad a ratones inmunodeficientes. Asimismo la inmunoterapia con GFAP previene la diabetes en ratones NOD (Winer y cols. 2003). Es por ello que decidimos abordar la expresión y purificación de GFAP, con el fin de ampliar el conocimiento sobre su papel en la diabetes tipo 1 en humanos. La pauta de lectura abierta para la proteína fibrilar ácida de la glía (GFAP) fue subclonada en el vector de expresión pCR T7/NT-TOPO. Al inducir la síntesis de la proteína mediante IPTG se observa la acumulación en cuerpos de inclusión de una proteína con un tamaño aproximado de 54 kDa, que es el tamaño esperado para GFAP (Figura 10). Ninguna de las modificaciones en las condiciones del cultivo como la disminución de la temperatura de inducción o la reducción de la concentración de IPTG permitieron la expresión de dicha proteína de forma soluble, razón por la cual se emplearon condiciones desnaturalizantes para purificarla y conservarla para evitar su precipitación, tal y como se describe en Materiales y Métodos. La identidad de dicha proteína purificada como GFAP fue comprobada mediante análisis de western blot empleando un anticuerpo monoclonal específico para GFAP (Figura 10B). Con el fin de producir una forma soluble de GFAP la pauta de lectura abierta de GFAP fue subclonada en el vector pMAL-c2 para generar una proteína de fusión con la proteína de unión a maltosa (MBP) en el extremo amino-terminal, con un tamaño aparente de 96 kDa. Dicha proteína de fusión fue purificada mediante cromatografía de afinidad empleando columnas de amilosa (Figura 10C) y su identidad como la proteína de fusión MBP-GFAP fue comprobada mediante análisis por western blot empleando anticuerpos monoclonales dirigidos tanto contra GFAP como contra MBP (Figura 10D). La pureza con que se obtuvieron ambas formas de GFAP fue de al menos un 95%, con rendimientos de 20 mg/L para GFAP y 8 mg/L para MBP-GFAP. 118 Capitulo 3: Clonación, expresión y purificación de autoantígenos importantes en la diabetes tipo 1. Figura 10. Purificación de la proteína fibrilar ácida de la glía (GFAP) y GFAP fusionada con la proteína de unión a maltosa (MBP-GFAP). A. Electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE (12,5%) de las diferentes etapas de purificación de GFAP. Calle M: marcador de peso molecular (kDa); calle 1: lisado de E. coli sin inducir con IPTG; calle 2: lisado de E. coli tras inducir con IPTG; calle 3: fracción soluble en 8M urea del extracto bacteriano conteniendo GFAP; calle 4: GFAP purificada mediante cromatografía de afinidad empleando resina de níquel. La flecha señala la posición esperada para GFAP (57 kDa). B. Confirmación mediante análisis por western blot de la purificación de GFAP. Calle 1: proteína separada mediante electroforesis SDS-PAGE y visualizada mediante tinción con azul de coomassie; calle 2: membrana de nitrocelulosa visualizada empleando un anticuerpo monoclonal anti-GFAP. C. Electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE (12,5%) de las diferentes etapas de purificación de MBP-GFAP. Calle M: marcador de peso molecular (kDa); calle 1: lisado de E. coli sin inducir con IPTG; calle 2: lisado de E. coli tras inducir con IPTG; calle 3: fracción soluble del extracto bacteriano conteniendo MBP-GFAP; calle 4: MBP-GFAP purificada mediante cromatografía de afinidad empleando resina de amilosa. La flecha señala la posición esperada para MBP-GFAP (96 kDa). D. Confirmación mediante análisis por western blot de la purificación de MBP-GFAP. Calle 1: proteína separada mediante electroforesis SDS-PAGE y visualizada mediante tinción con azul de coomassie; calle 2: membrana de nitrocelulosa visualizada empleando un anticuerpo monoclonal antiGFAP; calle 3: membrana de nitrocelulosa visualizada empleando un anticuerpo monoclonal antiMBP. 119 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. Utilizando como punto de corte el percentil 99º de los niveles observados en individuos sanos no diabéticos, 28 pacientes diabéticos (26,2%) fueron positivos para autoanticuerpos anti-GFAP (Figura 12, columna diabético). Esta frecuencia es significativamente mayor que la observada en controles sanos (p<0,0001, test exacto de Fisher). En el caso de pacientes diabéticos de tipo 1, 18 pacientes (24,7%) fueron positivos para anticuerpos contra GFAP (Figura 12, columna T1DM), comparado con sólo 1 individuo control no diabético (p<0,0001, test exacto de Fisher). Para este grupo de pacientes la sensibilidad del ensayo es del 24,6% y su especificidad del 98,9%, con un valor predictivo positivo del 94,7%. En el caso de pacientes diabéticos de tipo 2, 10 individuos (29,4%) fueron positivos para anticuerpos contra GFAP (Figura 12, columna T2DM) y, aunque esta diferencia es estadísticamente significativa al compararse con los controles sanos (p<0,0001, test exacto de Fisher), hay que tener en cuenta que existe igualmente una diferencia significativa de edad (p<0,0001, test t de student) entre los pacientes diabéticos de tipo 2 y los otros grupos de estudio (Tabla 4). Controles T1DM T2DM Número 98 73 34 Edad (media ± SD) 33,4 ± 13,0 27,0 ± 11.6 53,3 ± 8.3 * Hombres 58 (59,2%) 44 (60,3%) 21 (61,8%) Mujeres 40 (40,8%) 20 (39,7%) 13 (38,2%) Glucosa (mg/dl; media ± SD) 94 ± 14 198 ± 82 222 ± 83 HbA1c (%; media ± SD) 5,6 ± 0,6 9,2 ± 2,3 9,1 ± 1,8 Fructosamina (µmol; media ± SD) 254 ± 0,38 538 ± 144 405 ± 114 Tiempo transcurrido desde el diagnóstico (meses) 119 ± 117 129 ± 72 Mediana de los niveles de anti-GFAP (índice) 22,85 25,22 † 29,58 ‡ Tabla 4. Parámetros demográficos y bioquímicos de individuos sanos (controles), pacientes diabéticos de tipo 1 (T1DM) y pacientes diabéticos de tipo 2 (T2DM). *p < 0,0001 comparado con controles sanos o pacientes con T1DM (t-student con la corrección de Welch). †p = 0,019 comparado con controles sanos (test de Mann-Whitney). ‡p = 0,016 comparado con controles sanos (test de Mann-Whitney). Además de una mayor frecuencia de individuos diabéticos con niveles de autoanticuerpos anti-GFAP superiores a los de individuos sanos no diabéticos, al comparar las medianas de los niveles de anti-GFAP se observan diferencias estadísticamente significativas entre los pacientes diabéticos y los controles sanos, de forma que tanto los pacientes 126 Capitulo 4: Determinación de autoanticuerpos contra GFAP y S100β en pacientes con .diabetes tipo 1. diabéticos de tipo 1 como los de tipo 2 presentan mayores niveles de estos autoanticuerpos (25,22 y 29,58 respectivamente) comparado con los controles sanos (22,85) (Tabla 4). La razón de por qué los diabéticos tipo 2 presentan niveles de anti-GFAP elevados podría explicarse por el hecho de que los niveles de estos autoanticuerpos parecen aumentar con la edad, hasta adquirir en controles sanos, según algunos autores, niveles prácticamente equivalentes a los mostrados en pacientes con la enfermedad de Alzheimer en su estado presenil (Mecocci y cols. 1995). Nosotros hemos observado diferencias de edad estadísticamente significativas entre el grupo de pacientes con diabetes tipo 2 y los otros dos grupos (controles sanos y pacientes con diabetes tipo 1), por lo que, al menos a priori, dichas diferencias en los niveles de anticuerpos anti-GFAP en este grupo pueden venir determinadas por una edad significativamente mayor respecto de los controles. Es por ello que decidimos analizar la posible correlación entre el nivel de autoanticuerpos anti-GFAP tanto con el tiempo transcurrido desde el diagnóstico de la enfermedad como con la edad en aquellos pacientes positivos para anti-GFAP. Hay que tener en cuenta que GFAP es una proteína expresada en muchos otros tipos celulares, además de las células de peri-Schwann que rodean los islotes, y su persistencia o nivel podrían indicar una respuesta inmune contra esta proteína continuada en el tiempo. Este análisis muestra una asociación estadísticamente significativa entre los niveles de anti-GFAP y el tiempo transcurrido desde el diagnóstico (coeficiente de correlación de Pearson: 0,497; p = 0,036) (Figura 13A), pero no con la edad del paciente (coeficiente de correlación de Pearson: 0,09; p = 0,72) (Figura 13B). En individuos sanos tampoco existe correlación entre los niveles de anti-GFAP y la edad (coeficiente de correlación de Pearson: 0,21; p = 0,17) (Figura 13C). Esto nos permite sugerir que, en realidad, en aquellos pacientes donde se detecta la presencia de autoanticuerpos la respuesta inmune contra este antígeno continúa a pesar de haber sido destruidos gran parte de los islotes, como indica el desarrollo de síntomas clínicos de la enfermedad en pacientes diabéticos de tipo 1, y que en pacientes diabéticos de tipo 2 más que la edad la explicación más plausible a los niveles de estos anticuerpos anti-GFAP sea el daño neurológico causado por la enfermedad de forma que estos autoanticuerpos podrían servir como un marcador de daño del sistema nervioso en estos pacientes. 127 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. A CB Índice anti-GFAP Tiempo desde diagnóstico (meses) Índice anti-GFAP Índice anti-GFAP Edad (años) Edad (años) r = 0,497 *p = 0,036 r = 0,090 p = 0,720 r = 0,210 p = 0,170 Figura 13. Correlaciones entre los niveles de anticuerpos anti-GFAP y el tiempo transcurrido desde el diagnóstico y la edad. A. Correlación entre los niveles de anticuerpos IgG anti-GFAP en pacientes diabéticos positivos para estos anticuerpos y el tiempo transcurrido desde el diagnóstico. B y C. Correlación entre la edad y los niveles de anticuerpos anti-GFAP en pacientes diabéticos positivos para estos anticuerpos (B) o en sujetos sanos (C). Las líneas punteadas representan el intervalo de confianza del 95%. Para comprobar que el sistema de ELISA desarrollado en nuestro laboratorio detecta una respuesta específica contra GFAP y no respuestas contra posibles contaminantes que copurifiquen con GFAP, plasmas de pacientes diabéticos de tipo 1 tanto positivos como negativos para anti-GFAP por ELISA fueron analizados mediante western blot. Como se puede observar en la Figura 14A, cuando membranas de nitrocelulosa conteniendo GFAP fueron incubadas con plasmas de pacientes diabéticos de tipo 1 positivos para autoanticuerpos anti-GFAP y reveladas para mostrar la presencia de IgGs, se detecta claramente la presencia de una banda de unos 54 kDa que coincide con la posición esperada para GFAP (Figura 14A, GFAP positivo, tira -); sin embargo, membranas conteniendo GFAP pero incubadas con plasmas de pacientes diabéticos de tipo 1 negativos para autoanticuerpos anti-GFAP no se detecta la presencia de dicha banda (Figura 14A, GFAP negativo, tira -). Además, dicha señal se ve significativamente reducida al preincubar los plasmas positivos mediante ELISA con la forma soluble de GFAP, la proteína de fusión MBP-GFAP (Figura 14A, GFAP positivo, comparar tiras – y +). 128 Capitulo 4: Determinación de autoanticuerpos contra GFAP y S100β en pacientes con .diabetes tipo 1. Para comprobar la especificidad de la señal observada en los análisis de western blot, realizamos dicho análisis empleando membranas que contenían tanto MBP como MBPGFAP, y que fueron incubadas con plasmas positivos para autoanticuerpos anti-GFAP obtenidos tanto de individuos sanos (Figura 14B, control sano) como de pacientes diabéticos de tipo 1 (Figura 14B, T1DM) o pacientes diabéticos de tipo 2 (Figura 14B, T2DM). Cuando estas membranas fueron incubadas con dichos plasmas sólo se detectó la banda correspondiente a MBP-GFAP (Figura 14B, calles 1). De nuevo, esta detección es específica para la región GFAP de la proteína de fusión porque no hay detección de MBP, y porque la banda correspondiente a la proteína de fusión desaparece al preincubar las muestras con MBP-GFAP (Figura 14B, calles 3) pero no al preincubar con MBP sola (Figura 14B, calles 2). Figura 14. Análisis por western blot de autoanticuerpos IgG anti-GFAP en plasma y especificidad de la detección. A. Para la detección de anticuerpos IgG anti-GFAP mediante western blot se incubaron membranas de nitrocelulosa conteniendo GFAP con plasmas de individuos positivos por ELISA para estos anticuerpos (GFAP positivo) o negativos (GFAP negativo) y se revelaron empleando anticuerpos secundarios anti-IgG humana. La especificidad de esta detección se comprobó mediante la preincubación (membranas +) o no (membranas -) del plasma con la proteína de fusión soluble MBP-GFAP. B. Para el análisis de la especificidad de la detección de anticuerpos anti-GFAP mediante western blot, la proteína de unión a maltosa (MBP) y la proteína de fusión MBP-GFAP fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa e incubadas con plasmas de individuos positivos por ELISA para anticuerpos anti-GFAP. Al revelar las membranas, los anticuerpos presentes se unen sólo a la proteína de fusión MBP-GFAP (calles 1). El prebloqueo de dichos plasmas con la proteína de fusión MBP-GFAP (calles 3) pero no con MBP (calles 2) elimina la detección de la proteína MBPGFAP, confirmando la especificidad por GFAP de estos autoanticuerpos. 129 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. Los anticuerpos dirigidos contra GFAP fueron detectados utilizando un antígeno obtenido en bacterias, las cuales carecen de muchos de los elementos necesarios para una correcta y completa modificación post-traduccional de proteínas eucariotas, por lo que para verificar que dichos autoanticuerpos reconocen a la proteína GFAP sintetizada y modificada en una célula eucariota, plasmas positivos y negativos para autoanticuerpos anti-GFAP fueron utilizados en tinciones de doble inmunofluorescencia en córtex somatosensorial de rata adulta junto con un anticuerpo monoclonal contra GFAP. En dichas secciones de tejido neuronal se detecta un número elevado de células teñidas con el anticuerpo monoclonal dirigido contra GFAP y que poseen la típica morfología estrellada de los astrocitos, siendo éstas células que expresan GFAP (Bignami y cols. 1974) (Figura 15, paneles A y D). Estas mismas células GFAP+ son también inmunoreactivas cuando se usa un plasma de un paciente diabético de tipo 1 positivo para anticuerpos antiGFAP por ELISA (Figura 15, panel B) tal y como muestra la superposición de ambas tinciones (Figura 15, panel C). Sin embargo, al emplear un plasma de un paciente diabético de tipo 1 negativo para estos autoanticuerpos no se observa una tinción de células con morfología de astrocitos (Figura 15, panel E) ni una superposición con las células inmunoreactivas frente al anticuerpo monoclonal (Figura 15, panel F). Figura 15. Detección de anticuerpos anti-GFAP mediante microsocopia confocal en córtex somatosensorial de rata. Un plasma positivo por ELISA para anticuerpos anti-GFAP (paneles A-C) y 130 Capitulo 4: Determinación de autoanticuerpos contra GFAP y S100β en pacientes con .diabetes tipo 1. otro negativo (paneles D-F) fueron incubados con secciones de córtex de rata y con un anticuerpo monoclonal anti-GFAP. La unión del anticuerpo monoclonal contra GFAP (paneles A y D, rojo) revela células con la típica morfología estrellada de los astrocitos. Sin embargo, sólo en el caso del plasma positivo para anticuerpos anti-GFAP (panel B, verde) pero no en el plasma negativo (panel E) se detecta la presencia de células inmunoreactivas que coinciden con los astrocitos (panel C, flechas) situación que no ocurre en el caso de un plasma negativo (panel F, flechas). Las complicaciones crónicas de la diabetes afectan a diferentes órganos y son responsables de la elevada morbilidad y mortalidad de la enfermedad. Nosotros hemos analizado la relación entre la detección de autoanticuerpos anti-GFAP y distintas complicaciones diabéticas como retinopatía, nefropatía y neuropatía (Tabla 5). Un elevado porcentaje de pacientes diabéticos con autoanticuerpos anti-GFAP tienen al menos una complicación diabética crónica, variando desde el 67,9% de pacientes con retinopatía al 28,6% con neuropatía; la diferencia en este porcentaje es estadísticamente significativa en pacientes positivos para anticuerpos anti-GFAP (Anti-GFAP +) comparados con pacientes negativos para dichos autoanticuerpos (Anti-GFAP -) en el caso de la retinopatía (Tabla 5; p = 0,015, test exacto de Fisher). Complicación diabética Anti-GFAP + % (pacientes positivos/ pacientes totales) Anti-GFAP – % (pacientes negativos/ pacientes totales) Retinopatía * 67,9% (19/28) 39,2% (31/79) Nefropatía 39,2% (11/28) 20,3% (16/79) Neuropatía 35,7% (10/28) 20,3% (16/79) Tabla 5. Porcentaje de complicaciones diabéticas en pacientes diabéticos de tipo 1 con y sin autoanticuerpos anti-GFAP. *p = 0,015 comparando pacientes diabéticos anti-GFAP – y pacientes diabéticos anti-GFAP + (test exacto de Fisher). No existe diferencia de edad entre ambos grupos (Anti-GFAP + y Anti-GFAP -, 41,9  15,3 vs. 45,1  16,5, años; p = 0,51, test U de Mann-Whitney), pero sí una clara tendencia de los pacientes positivos para anticuerpos anti-GFAP a que haya transcurrido más tiempo desde el diagnóstico de la enfermedad (Anti-GFAP +: 203,7  100,2. Anti-GFAP –: 152,1  77,1; 131 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. meses), aunque dicha tendencia no es estadísticamente significativa (p = 0,07, test U de Mann-Whitney). Un análisis más detallado de los datos (Figura 16) muestra que los pacientes con dos o tres complicaciones diabéticas crónicas tienden a ser de mayor edad que aquellos que tienen una sola complicación (Figura 16A; 47,7  15,1 vs. 40,6  16,4; años), ha transcurrido más tiempo desde su diagnóstico (Figura 16B; 224,7  107,7 vs. 137,4  46; meses) y tienen un mayor nivel de autoanticuerpos anti-GFAP (Figura 16C; 85,8  41 vs. 68,8  46,5). Sin embargo sólo existen diferencias estadísticamente significativas para el caso del tiempo transcurrido desde el diagnóstico (p = 0,006; test U de Mann-Whitney) (Figura 16B), de nuevo apoyando la idea de que la respuesta autoinmune contra GFAP continua aún después del desarrollo de síntomas clínicos de la enfermedad y que su nivel depende del tiempo transcurrido desde el diagnóstico más que de la edad del paciente. Edad (años) 12/3 Nº complicaciones Tiempo desde diagnóstico (meses) 12/3 Nº complicaciones 12/3 Nº complicaciones Índice anti-GFAP *p=0,006 Figura 16. Distribución de edad, tiempo transcurrido desde el diagnóstico y nivel de anticuerpos anti-GFAP en pacientes diabéticos con complicaciones crónicas. Pacientes con sólo una complicación crónica (columna “1”) fueron comparados con aquellos pacientes con dos o tres complicaciones (columna “2/3”) para comprobar si existen diferencias en edad (A), tiempo transcurrido desde el diagnóstico (B) y/o niveles de anti-GFAP (C). Las tres variables tienden a tener valores mayores en aquellos pacientes con 2 o 3 complicaciones, siendo esta diferencia estadísticamente significativa en el caso del tiempo transcurrido desde el diagnóstico (panel B) (Test U de Mann-Whitney). Las complicaciones estudiadas fueron retinopatía, nefropatía y neuropatía. 132 Capitulo 4: Determinación de autoanticuerpos contra GFAP y S100β en pacientes con .diabetes tipo 1. 4.2. Determinación de autoanticuerpos contra S100β. Al igual que en el caso ya descrito de GFAP, hemos desarrollado también un sistema de ELISA para cuantificar el nivel de autoanticuerpos anti-S100β en controles sanos y pacientes con diabetes de tipo 1 o de tipo 2. El ELISA aquí descrito tiene un límite de detección de 5,4 µg/dL de equivalentes de monoclonal, y las variaciones intrae inter-ensayo son del 7% y del 9% respectivamente. La Figura 17 muestra la distribución del título de equivalentes de monoclonal de antiS100β tanto en controles sanos como en pacientes diabéticos. Tomando el percentil 95º de los niveles observados en controles como punto de corte (equivalente a un título de monoclonal de 15 µg/dL o menor), 4 pacientes diabéticos (6%) fueron positivos para autoanticuerpos antiS100β. Se observó una frecuencia similar en los controles sanos (3 individuos; 5%) y las diferencias entre ambos grupos no fueron estadísticamente significativas (p = 1,00, test exacto de Fisher). De los pacientes diabéticos de tipo 1, 3 fueron positivos para anti-S100β (6,8%) mientras que sólo un paciente diabético de tipo 2 (4,2%) fue positivo para estos autoanticuerpos. Control Diabético T1DM T2DM Anti-S100β(µg/dL) Figura 17. Distribución de los niveles de anticuerpos anti-S100 en plasma. Se muestra la distribución del título de anticuerpos anti-S100, expresado en equivalentes de anticuerpo monoclonal (µg/dL), en controles sanos (círculos blancos), pacientes diabéticos de tipo 1 y 2 (círculos negros), pacientes diabéticos de tipo 1 (triángulos) y pacientes diabéticos de tipo 2 (estrellas). La línea punteada representa el percentil 95º de la distribución de los individuos sanos. Las líneas continuas representan la media para cada distribución. No se hallaron diferencias significativas entre ninguno de los grupos. 133 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. Los resultados de ELISA muestran que no existen diferencias estadísticamente significativas en los niveles de autoanticuerpos anti-S100β entre controles sanos y pacientes diabéticos, algo que a primera vista resulta sorprendente si consideramos que en los pacientes diabéticos de tipo 1 S100β es un claro objetivo de la respuesta autoinmune (Winer y cols. 2003; Banwell y cols. 2008). Sin embargo, nuestros resultados son consistentes con los observados por otros autores que detectan niveles equivalentes de autoanticuerpos anti-S100β entre individuos sanos y pacientes diabéticos, tanto de tipo 1 como de tipo 2, empleando un sistema de western blot como sistema de detección (Hovsepyan y cols. 2004). Para tratar de averiguar la razón de por qué aparentemente no existen diferencias entre ambos tipos de sujetos en cuanto al nivel de autoanticuerpos anti-S100β, decidimos analizar los plasmas de 26 sujetos control y 29 pacientes diabéticos de tipo 1 mediante western blot de forma que también podríamos confirmar o desmentir los datos de otros autores (Hovsepyan y cols. 2004). Dicho análisis muestra un resultado sorprendente ya que se observan cuatro patrones claros de respuesta frente a la proteína S100β empleada en este trabajo, patrones que se muestran en la Figura 18. Estos cuatro patrones se corresponden con la no presencia de autoanticuerpos anti-S100 (Figura 18, membrana 1), la detección de una proteína de unos 13 kDa (Figura 18, membrana 2), la detección de una proteína del tamaño esperado para S100β - 16 kDa- (Figura 18, membrana 3) o la detección de ambas proteínas a la vez (Figura 18, membrana 4). La clara detección de una proteína de un tamaño menor al esperado para S100β es interesante ya que, como se señala más adelante, la mayor parte de los diabéticos respondían más frecuentemente contra esta proteína que contra la proteína de fusión S100β completa, de forma que decidimos estudiar la identidad de dicho antígeno partiendo de la idea de que podría tratarse de un fragmento de la proteína S100 empleada en este trabajo (ver Figura 20 para un esquema). 134 Capitulo 4: Determinación de autoanticuerpos contra GFAP y S100β en pacientes con .diabetes tipo 1. Figura 18. Detección de anticuerpos anti-S100 mediante western blot en sujetos sanos y pacientes diabéticos de tipo 1. 1µg de S100β biotinilada in vitro fue transferida a membranas de nitrocelulosa y dichas membranas incubadas con distintos anticuerpos policlonales, monoclonales o plasmas de individuos sanos o pacientes diabéticos de tipo 1. Las distintas membranas muestran los cuatro patrones de bandas observados mediante este tipo de análisis (membranas representativas de un total de 26 controles sanos y 29 pacientes diabéticos de tipo 1). Panel 1: sin banda (plasma negativo); panel 2: sólo banda menor de 13 kDa; panel 3: sólo banda de S100 completa (16 kDa); panel 4: ambas bandas; panel 5: anticuerpo monoclonal anti-S100β; panel 6: anticuerpo policlonal anti-S100β; panel 7: anticuerpo monoclonal anti-histidinas, y panel 8: estreptavidina. Además del patrón observado empleando plasmas humanos, empleamos un anticuerpo monoclonal (Figura 18, membrana 5) o policlonal (Figura 18, membrana 6) específicos contra S100β para revelar membranas conteniendo S100β. Como se puede comprobar en la Figura 18, con el anticuerpo policlonal pero no con el monoclonal se detecta la presencia de una proteína de menor peso molecular. Además, al emplear un anticuerpo monoclonal dirigido contra la cola de histidinas presente en el extremo amino-terminal de la proteína, dicho anticuerpo detecta sólo la presencia de la S100β completa y no la proteína de menor peso molecular (Figura 18, membrana 7) lo que sugiere que la banda menor podría corresponderse con una forma truncada de S100 por su extremo amino-terminal. Este dato parece confirmarse al emplear estreptavidina para revelar las membranas, ya que ésta reaccionaría con la cola biotinilada situada en el extremo carboxi-terminal de la proteína y como puede verse en la Figura 18 tanto la proteína de menor tamaño como la proteína S100β completa son detectadas en este caso (Figura 18, membrana 8), reforzando la idea de que la banda de menor peso molecular detectada en western blot empleando plasmas de pacientes diabéticos se corresponde con una forma truncada de S100β (ver más adelante, Figura 20). 135 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. 8.5. Efecto de la eliminación de los ligandos de las galectinas sobre el comportamiento in vitro de linfocitos T. A continuación decidimos estudiar cuál sería el efecto de la eliminación de los ligandos naturales de las galectinas en la superficie celular sobre el comportamiento in vitro de los linfocitos de sujetos control. La swainsonina (SW) es un inhibidor de la α-manosidasa II que bloquea la ruta de síntesis de N-glicanos, disminuyendo significativamente la cantidad de N-acetil-lactosaminas unidas a proteínas de superficie, las cuales son el ligando natural de la galectina-1 (entre otras galectinas). En primer lugar, comprobamos el efecto que sobre la proliferación celular tendría el tratamiento con SW de linfocitos T CD3+ estimulados policlonalmente durante tres días, determinando la dilución del marcaje con CFSE de dichos linfocitos. La adición de SW reduce la tinción con CFSE en un 8,5% (test de rangos de Wilcoxon, p < 0,001), indicando que la adición de SW induce un mayor proliferación de los linfocitos CD3+ (datos no mostrados). Asimismo comprobamos el efecto que sobre la glicosilación de proteínas de superficie tiene la adición de SW mediante la tinción de las células con la lectina PHA-L. Tal y como era de esperar, los linfocitos incubados con SW muestran una reducción significativa de la tinción, ya que con la SW disminuye el número de ligandos potenciales para esta lectina. (Figura 70A). La cantidad de galectina-1 en el medio aumenta significativamente (Figura 70B), lo que puede deberse a que la falta de ligandos adecuados en el glucocálix aumenta la cantidad de galectina-1 libre en el medio de cultivo al no unirse ésta a la superficie celular. Además la adición de SW dirige a los linfocitos T hacia una respuesta tipo Th1, produciendo mayores niveles de IFN-γ (52,6 vs. 65,4 ng/millón de células/mL) y menores de IL-10 (Figura 70C), lo que ocasiona una elevación significativa de la relación de citocinas Th1/Th2 (Figura 70D). Sin embargo la cantidad de IL-17 secretada al medio se ve significativamente reducida con la adición de la SW, lo que nos lleva a pensar que quizás la galectina-1 de superficie podría ser necesaria para la supervivencia in vitro de las células Th17, o bien que existe una elevada diferenciación de estas células hacia un fenotipo tipo Th1 debida a una mayor proliferación celular, ya que los linfocitos Th17 parecen ser un fenotipo celular plástico capaz de diferenciación (Annunziato y cols. 2007). Así pues la eliminación de los ligandos potenciales para galectina-1 en superficie ocasiona un aumento de los niveles de esta lectina en el medio extracelular, además de 238 Capítulo 8: Importancia de las galectinas en los linfocitos T colaboradores: síntesis de galectina-1 en la T1DM. conducir a los linfocitos T hacia una respuesta Th1, disminuyéndose además los niveles de IL-17. 100 0 120 0 140 0 160 0 180 0 2 00 0 2 20 0 IMF PHA-L Sin SW Con SW *p<0,05 IL-10 Sin SW Con SW IL-17 Sin SW Con SW *p<0,01 *p<0,05 Sin SW Con SW Sin SW Con SW *p<0,05 AB DC Figura 70. Efecto del inhibidor de glicosilación swainsonina en el patrón de azúcares de superficie y la producción de galectina-1 y citocinas por parte de linfocitos T. Linfocitos T CD3+ de controles sanos fueron cultivados en presencia (columnas “con SW”) o ausencia (columnas “sin SW”) de 200 nM de swainsonina. Al final del periodo de estimulación se determinó la tinción con la lectina PHA-L (A), la secreción de galectina-1 (B), la secreción de citocinas (C) y la relación de citocinas Th1/Th2 (D) en dichos cultivos. En A los símbolos representan distintos individuos. En B, C y D los asteriscos/círculos señalan muestras que se hallan por encima/por debajo del intervalo de confianza del 95%. La línea en las barras muestra el valor de la mediana (valores p, test de rangos de Wilcoxon). 239 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. 240 8.6. Resumen. Hemos demostrado que los linfocitos Th17 expresan y presentan mayores niveles de galectina-1 (intray extracelular) y galectina-3 (intracelular) que los linfocitos Th1 y Th2. La cantidad de galectina-1 secretada por pacientes con diabetes tipo 1 es significativamente menor a la secretada por controles sanos, lo cual ocurre en un entorno Th1/Th17 aumentado. Hemos comprobado que existe una secreción disminuida de galectina1 por parte de células pertenecientes a la población CD4en sujetos diabéticos. Asimismo existe un aumento de la secreción de galectina-1 en linfocitos Treg de diabéticos, la cual podría deberse a los menores niveles de esta lectina en la superficie de estas células. Además, aunque la secreción de galectina-1 por parte de linfocitos CD4+ en diabéticos es normal, la cantidad de galectina-1 en superficie es superior a la presentada por los controles, posiblemente debido a una menor presencia de ácido siálico en posición α 2,6; esta diferencia no es observada en el caso de los linfocitos Th17 polarizados in vitro, indicando que la polarización hacia este fenotipo celular es normal en estos pacientes. Aunque el TDG no es un inhibidor específico para la galectina-1, su empleo nos permite afirmar que la inhibición de la unión a la superficie celular de proteínas con actividad de lectina provoca una disminución de la diferenciación linfocitaria hacia un fenotipo proinflamatorio tipo Th1 y un incremento de un fenotipo más inmunoregulador tipo Th2/Treg. Futuros estudios permitirán dilucidar cuál o cuáles de estas lectinas son las responsables del fenotipo observado en pacientes diabéticos. La disminución de ligandos naturales para galectinas en linfocitos T ocasiona que la galectina-1, y probablemente otras lectinas, no sea capaz de unirse a la superficie celular, por lo que aumenta su concentración en el medio extracelular, ocasionando una polarización hacia un fenotipo Th1, en detrimento de una respuesta tipo Th17. C Ca ap pí ít tu ul lo o 9 9: : D Di is sc cu us si ió ón n. . 241 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. 242 Capítulo 9: Discusión. La expresión y purificación de proteínas integrales de membrana supone hoy en día un reto debido a la toxicidad que presentan dichas proteínas en los sistemas de expresión procariota habitualmente utilizados (Saida y cols. 2006). De hecho, y hasta nuestro conocimiento, no existe en la literatura ninguna descripción de la expresión de IGRP en un sistema procariota. Existen trabajos en los que la pauta abierta de lectura para IGRP ha sido empleada para transfectar células eucariotas con el fin de obtener células transfectantes utilizadas en ensayos de inmunofluorescencia o de actividad enzimática (Shieh y cols. 2004; Petrolonis y cols. 2004; Arden y cols. 1999). Asimismo, Petrolonis y cols. describen la expresión y purificación de esta proteína empleando un sistema de expresión baculoviral, si bien sólo se muestra un western blot en el que se aprecia poca cantidad de proteína y de baja pureza, sugiriendo un bajo rendimiento del proceso de purificación. En este trabajo, sin embargo, demostramos que este sistema es capaz de producir y purificar una mayor cantidad de IGRP con un alto grado de pureza. La IGRP producida y purificada por estos autores fue clonada conteniendo una cola de 6 histidinas en el extremo carboxi-terminal o en el amino-terminal, observándose que la cola en amino-terminal disminuye en 10 veces su actividad. De este resultado se puede deducir que la cola en posición amino afecta de algún modo a la estructura de IGRP, pudiendo explicar la aparente falta de expresión en nuestro sistema baculoviral, ya que nuestra proteína recombinante portaba la cola de seis histidinas en dicha posición. Asimismo, hemos comprobado que la cola en amino-terminal impide de algún modo la unión de anticuerpos anti-histidinas. Nuestra intención a la hora de purificar IGRP era obtener suficiente cantidad de proteína para desarrollar, en primer lugar, un sistema de ELISA para detectar autoanticuerpos contra ella y, en segundo lugar, analizar mediante el sistema de presentación de antígenos los epitopos procesados de manera natural a partir de IGRP. La producción de proteínas en un sistema procariótico frente a uno eucariótico presenta la ventaja principal de poder obtener grandes cantidades de la proteína de interés. En este trabajo describimos un sistema de producción procariota de IGRP basado en la combinación de tres elementos con los cuales esperamos obtener en el futuro cantidades suficientes de proteína para continuar con su caracterización como autoantígeno en la diabetes tipo 1 humana. Dichos elementos son el empleo de una cepa bacteriana muy concreta, la cepa C43 (DE3), que ofrece la ventaja de permitir la expresión de proteínas que son tóxicas para la mayoría de cepas bacterianas. El segundo elemento importante consiste en el empleo del vector pBAD, un vector diseñado para 243 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. la expresión de proteínas tóxicas ya que, a diferencia de los vectores convencionales, el promotor AraC de este vector permite un mejor control de la expresión basal de la proteína de interés.. Finalmente, el tercer elemento del sistema lo constituye el empleo del detergente Foscolina 12 (FC12), un detergente que permite la solubilización eficaz de dicha proteína para poder purificarla. De hecho, aunque en trabajos previos (Petrolonis y cols.) describen la purificación de IGRP constatan la inestabilidad de la proteína tras su solubilización. Nosotros hemos encontrado que el detergente Fos-colina 12 (FC12) es, de los detergentes estudiados en este trabajo, el más eficaz a la hora de solubilizar IGRP de las membranas bacterianas y mantener la proteína estable en solución. El empleo de este detergente, junto con la purificación mediante cromatografía de afinidad empleando resinas unidas a un anticuerpo que reconoce el epitopo V5 de la IGRP recombinante nos ha permitido en este trabajo el diseñar un sistema de expresión y purificación de IGRP. Sería importante en el futuro mejorar el rendimiento de nuestro sistema (0,1 mg/L), para poder obtener anticuerpos monoy policlonales contra esta proteína, los cuales no existen hasta el momento, con el fin de, llevar a cabo ELISAs para cuantificar los niveles de autoanticuerpos en suero y/o plasma de controles sanos y pacientes con diabetes tipo 1, así como para estudiar el procesamiento de este autoantígeno e identificar epitopos antigénicos derivados de maneral natural de IGRP. En el presente estudio, las proteínas GFAP y S100β producidas en E. coli con elevada pureza y rendimiento han sido empleadas para desarrollar un sistema de ELISA que permite una cuantificación relativa del nivel de autoanticuerpos dirigidos contra ellos en pacientes con T1DM. La presencia de autoanticuerpos contra GFAP ha sido descrita previamente en estudios de ionización por láser inducida en superficie (SELDI) y espectrometría de masas (Winer y cols. 2003). Sin embargo, no existen estudios previos sobre la detección y prevalencia de este tipo de autoanticuerpos empleando técnicas más rutinariamente empleadas en el diagnóstico clínico, como podrían ser el ELISA o el western blot. Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que es posible detectar la presencia y cuantificar el nivel de autoanticuerpos contra GFAP tanto en pacientes con diabetes tipo 1 como con diabetes tipo 2, y que dichos autoanticuerpos persisten durante años. La sensibilidad del ELISA para anti-GFAP (24,6%) parece baja cuando es comparada con la obtenida para otros autoanticuerpos presentes en plasma de diabéticos tipo 1, como GADA o IA-2A, para los cuales se han determinado sensibilidades de un 82% y un 62-70%, respectivamente (Törn y cols. 2008). Una de las posibles razones que permiten explicar esta 244 Capítulo 9: Discusión. diferencia es el hecho de que los ensayos en fase sólida generalmente poseen menor sensibilidad en comparación con los ensayos en fase líquida, siendo ésta una de las debilidades de nuestro ensayo (Törn y cols. 2008). Asimismo, la relativa baja prevalencia de los autoanticuerpos anti-GFAP observados por ELISA comparados con los obtenidos por SELDI (Winer y cols. 2003) podrían deberse al hecho de que los autoanticuerpos pueden haberse unido al antígeno diana en el tejido nervioso, lo cual resultaría en bajas o indetectables concentraciones del anticuerpo en plasma. Mejoras futuras que incluyan un aumento en la sensibilidad podrían permitir el uso de la detección de anticuerpos anti-GFAP por ELISA como marcadores de respuestas autoinmunes en pacientes con diabetes tipo 1. Además, se podría evaluar la presencia de estos autoanticuerpos como un marcador precoz de la enfermedad ya que serían originados en respuesta a la destrucción de las células de Schwann que rodean los islotes. La presencia de autoanticuerpos contra GFAP ha sido descrita en diferentes condiciones neurológicas como la enfermedad de Alzheimer, demencia vascular, depresión, epilepsia, esclerosis múltiple o Parkinson (Tanaka y cols. 1989; Mecocci y cols. 1995; Poletaev y cols. 2000), sugiriendo todos estos estudios una posible relación entre los títulos de autoanticuerpos y la edad, y un posible papel como marcadores de una alteración de la barrera hematoencefálica (Mecocci y cols. 1995). Nuestros resultados muestran que los títulos de autoanticuerpos anti-GFAP aumentan con el tiempo transcurrido desde el diagnóstico de la enfermedad. Estos niveles de anti-GFAP en pacientes diabéticos de largo recorrido parecen además estar asociados con un aumento en el número de complicaciones crónicas en estos pacientes. Estos datos nos llevaron a especular que los autoanticuerpos anti-GFAP podrían ser utilizados como marcadores de daño nervioso y/o de la barrera hematoencefálica. La neuropatía diabética autónoma es una complicación seria y frecuente tanto en diabéticos de tipo 1 como de tipo 2; su etiología no es conocida, pero hay evidencias que sugieren que existen factores inmunológicos que pueden tener un papel importante en su desarrollo (Duchen y cols. 1980). En pacientes con diabetes tipo 1 son frecuentemente detectados autoanticuerpos contra componentes del sistema nervioso autónomo en ganglios simpáticos, médula adrenal y nervio vago, y su presencia parece estar asociada con la neuropatía autónoma (Zanone y cols. 1993; Ejskjaer y cols. 1999). La determinación de autoanticuerpos contra componentes del sistema nervioso es llevada a cabo mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta de fijación del complemento, los cuales emplean en la mayoría de los casos tejidos animales no humanos (Canal y cols. 1997). De momento no se 245 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. han identificado los antígenos específicamente reconocidos por estos autoanticuerpos detectados por fijación del complemento, pero en un estudio se detectaron dos bandas por western blot frente a las que sí había reactividad, una de 74 kDa en la médula adrenal y otra de 33 kDa en el nervio vago (Stroud y cols. 1997). Sin embargo la identidad de esas proteínas no ha sido investigada, y los pesos moleculares no coinciden ni con GFAP ni con S100β. De todos modos, ya que algunos de los tejidos empleados en la técnica de fijación del complemento expresan GFAP (por ejemplo células gliales satélite presentes en ganglios simpáticos (Shi y cols. 2008), es posible que la reactividad observada por fijación del complemento en estos tejidos pueda ser dirigida, al menos en parte, contra GFAP. Los niveles plasmáticos de autoanticuerpos contra S100β detectados por nuestro ELISA son bajos, lo cual coincide con los resultados expuestos por otros autores (Hovsepyan y cols. 2004), y no observamos diferencias en el nivel de autoanticuerpos entre controles sanos y pacientes con diabetes (tipo 1 o tipo 2), a pesar de que existen estudios que determinan que S100β es una diana del sistema inmunológico en esta enfermedad (Winer y cols. 2003. Banwell y cols. 2008), y que otros autores han descrito la presencia de autoanticuerpos contra S100β mediante ELISA en pacientes con enfermedad de Alzheimer, demencia vascular, depresión, epilepsia, esclerosis múltiple o Parkinson (Mecocci y cols. 1995; Janković y cols. 1991; Wilhelm y cols. 2007; Poletaev y cols. 2000). Al efectuar análisis mediante western blot observamos que, efectivamente, tanto controles como pacientes presentan autoanticuerpos específicos contra S100β. Sin embargo observamos que los pacientes diabéticos poseen un perfil de autoanticuerpos que aparentemente reconoce una forma truncada de S100β, que carece como máximo de los 6 primeros aminoácidos. Es difícil explicar estos resultados, pero una de las posibilidades podría ser que el perfil de autoanticuerpos presente en pacientes con T1DM no se pueda unir eficientemente a la forma completa de la proteína empleada en este trabajo por algún tipo de impedimento estérico causado por la cola de histidinas cercana a la secuencia de S100β, por lo que no se apreciaría reacción contra la proteína completa pero sí contra la truncada. Otra posibilidad es que la reactividad contra la proteína de pequeño tamaño observada en los western blot de pacientes diabéticos esté dirigida contra alguna proteína contaminante derivada de E. coli y presente en esa zona concreta del blot donde también se encuentre la forma truncada de S100 que hemos detectado mediante espectrometría de masas. Es sabido que los linfocitos B tienen un papel importante como células presentadoras de antígeno en los islotes de Langerhans durante el desarrollo de la diabetes (Serreze y cols. 246 Capítulo 9: Discusión. 1998; Tian y cols. 2006; Noorchashm y cols. 1997; Carrillo y cols. 2005), y que el tejido nervioso que rodea al islote parece ser uno de los primeros en sufrir la destrucción mediada por linfocitos T (Winer y cols. 2003). Es posible que tras la muerte de las células de Schwann se libere S100 o péptidos derivados de ésta, generados por proteolisis inespecífica de la proteína como consecuencia de la lisis celular, y que serán diferentes de los que se generarían por procesamiento antigénico normal por parte de una CPA. Así, los linfocitos B autorreactivos presentes podrían presentar directamente estos péptidos por MHC de clase II, activando a linfocitos T autorreactivos en el nódulo linfático pancreático, lo que conllevaría en último término a la activación del linfocito B y a su paso a célula plasmática, produciendo autoanticuerpos contra ese epitopo de S100β. Recientemente se ha descrito que existen dos tipos de linfocitos T: tipo A, que responden frente a la proteína y a los péptidos procesados por las CPAs, y tipo B, que responden únicamente a péptidos que han sido ofrecidos de manera exógena a la CPA, pero no a ese mismo péptido obtenido por el procesamiento intracelular de la proteína. Estos péptidos serían idénticos pero tendrían diferentes conformaciones cuando se encontraran unidos a las moléculas del MHC de clase II (Pu y cols. 2002). Se ha sugerido que las células T tipo B específicas para proteínas autólogas podrían participar en la inducción de autorreactividad (Lovitch y cols. 2003; Kawamura y cols. 2008). De hecho Mohan y cols. (2010) han encontrado un tipo de linfocitos T CD4+ autorreactivos que reconocen un péptido antigénico derivado de la insulina cuando éste suministrado exógenamente a las CPAs, pero no cuando este mismo péptido procede del procesamiento intracelular de la insulina por parte de una CPA. Así pues, las células B actuando como CPAs de péptidos ofrecidos de manera exógena derivados de S100β podrían estar activando a linfocitos T autorreactivos de tipo B, lo cual acabaría activando a la propia célula B e induciéndola a producir autoanticuerpos contra ese péptido, obteniéndose un anticuerpo que será conformacionalmente diferente al obtenido a partir de ese mismo péptido procesado por la célula B. Una de las formas para concretar la reactividad de estos autoanticuerpos dirigidos contra S100 y observado en pacientes diabéticos podría ser el diseño de péptidos solapantes derivados de la proteína completa o el clonaje y purificación de formas truncadas de S100 sin ninguna secuencia adicional, para su empleo en sistemas de ELISA, western blot y/o dot blot. 247 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. desequilibrado a favor de Th1 y Th17 es en donde detectamos una menor secreción de galectina-1 y galectina-3 por parte de PBMCs de pacientes con diabetes tipo 1. Aunque existen un gran número de estudios acerca del papel de las galectinas en el desarrollo de la respuesta inmune, poco se conoce sobre el papel de estas lectinas en la diabetes tipo 1, o sobre cómo el tipo de respuesta inmune influye en la síntesis de estas moléculas. Nosotros hemos observado que la activación de PBMCs induce la secreción de galectina-1 y galectina-3, y que además los PBMCs estimulados de pacientes con diabetes tipo 1 secretan niveles significativamente menores de ambas lectinas cuando son comparados con PBMCs de controles; en el caso de la galectina-1 estas diferencias existen incluso a nivel basal en PBMCs sin estimular. Así pues parece haber una deficiencia en la secreción de galectina-1 y -3 en pacientes diabéticos, hecho que ocurre en otras enfermedades autoinmunes, como la galectina-3 y la enfermedad de Crohn (Jensen-Jarolim y cols. 2002). La galectina-3 extracelular inhibe la secreción de IL-12 por parte de células dendríticas impidiendo la polarización de linfocitos T CD4+ vírgenes hacia un fenotipo Th1 y favoreciendo la diferenciación hacia un fenotipo Th2. La menor cantidad de galectina-3 producida por PBMCs de diabéticos posiblemente no sea suficiente para impedir la secreción de IL-12, favoreciéndose la polarización hacia una respuesta proinflamatoria Th1 en detrimento de una respuesta inmunorreguladora tipo Th2 (Bernardes y cols. 2006). Con el fin de conocer qué población de las contenidas en los PBMCs era la defectiva en la secreción de galectina-1 cuantificamos la galectina-1 secretada por linfocitos T CD4+, linfocitos Th17 diferenciados in vitro, linfocitos Treg y células CD4-. Así, ni los linfocitos CD4+ ni los Th17 presentan secreción defectiva de galectina-1 en pacientes con diabetes tipo 1, mientras que la producción por parte de los linfocitos Treg se halla aumentada. Sorprendentemente son las células CD4-, conteniendo principalmente monocitos, linfocitos B y linfocitos T CD8+, las que presentan una secreción disminuida de galectina-1 en diabéticos. Estudios preliminares llevados a cabo en nuestro laboratorio (datos no mostrados) muestran que, de los distintos tipos celulares presentes en la población CD4-, son los monocitos los que mayores niveles de galectina-1 secretan (≈ 2.000 ng/mL) en comparación con linfocitos B (≈ 300 ng/mL) y linfocitos T CD8+ (≈ 30 ng/mL). Cuando se compara la secreción de galectina-1 por parte de estos tres tipos celulares en controles sanos y pacientes con diabetes tipo 1 se observa una secreción claramente disminuida por parte de los monocitos, por lo que podemos concluir que es éste el tipo celular responsable de la secreción disminuida de galectina-1 observada en estos pacientes. Es sabido que la galectina-1 desactiva 254 Capítulo 9: Discusión. los macrófagos activados (Rabinovich y cols. 2007) de forma que niveles reducidos de galectina-1 podrían favorecer la activación prolongada de estas células con posible destrucción tisular. Tras la estimulación antigénica, los ratones knockout para galectina-1 producen mayores niveles de IFN-γ, IL-2 e IL-17, y niveles similares de IL-5 e IL-10 en comparación con ratones normales (Toscano y cols. 2007a), resultados que coinciden con la idea de que la galectina-1 endógena controla la supervivencia y expansión de linfocitos Th1 y Th17 in vivo, por lo que su deficiencia conllevaría asociada una mayor susceptibilidad a padecer neuroinflamación (Toscano y cols. 2007a). Así pues el ambiente defectivo en galectina-1 presente en pacientes diabéticos de tipo 1 debido a la deficiente secreción por parte de células CD4- (previsiblemente monocitos) podría estar desviando la respuesta inmune a favor de Th1 y Th17 en estos sujetos En función de su concentración, la galectina-1 juega un papel dual pudiendo inducir proliferación o apoptosis (Adams y cols. 1996). Al igual que su concentración, su estado redox (Outenreath y cols. 1992), su estructura (monómero u homodímero; Perillo y cols. 1995; Cho y cols. 1995) o su localización (intrao extracelular; Camby y cols. 2006) parecen determinar el papel que juega esta lectina en el desarrollo de la respuesta inmune, favoreciendo la supervivencia linfocitaria o por el contrario su apoptosis. Algunos autores (Toscano y cols. 2007a) han afirmado que la galectina-1 soluble es apoptótica para los linfocitos T activados, especialmente para Th1 y Th17; sin embargo, en su estudio la galectina-1 fue añadida de modo exógeno a unas concentraciones (75-150 µg/mL) que son más de 100 veces superiores a las concentraciones máximas detectadas in vitro por nosotros (máximo de 0,77 µg/mL para las células CD4de controles sanos) y por otros autores (He y cols. 2004). Estos últimos demostraron que la galectina-1 soluble no es muy eficaz a la hora de desencadenar la apoptosis de células T activadas, al menos in vitro. De hecho, estos autores demuestran que la galectina-1 induce más efectivamente la apoptosis cuando se encuentra unida a la matriz extracelular (MEC), ya que la matriz presenta esta proteína de un modo bidimensional, una conformación en la que es reconocida más eficazmente por las células T activadas sufriendo entonces apoptosis y llevando en último término a una regulación a la baja de la respuesta inmune. Así, las concentraciones de galectina-1 requeridas para provocar la apoptosis cuando ésta se halla unida a la MEC son como mínimo 10 veces inferiores respecto de la galectina-1 soluble. Otro studio (Allen y cols. 1990) afirma que 255 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. elevadas cantidades de galectina-1 unida a la superficie celular generan enlaces cruzados entre glicoproteínas, reduciendo la habilidad de la célula para unirse a la MEC. Nosotros hemos observado que los linfocitos T CD4+ activados de pacientes con diabetes tipo 1 presentan mayor cantidad de galectina-1 unida a la superficie celular respecto de los controles sanos. Así pues, y teniendo en cuenta los resultados obtenidos por otros autores hemos propuesto un modelo (Figura 71) para explicar el papel que podría jugar la galectina-1 en el desarrollo de la respuesta autoinmune observada en pacientes con T1DM. En individuos sanos (Figura 71A) los linfocitos T CD4+ activados presentan un determinado nivel de ligandos para galectina-1 en superficie, y secretan una pequeña cantidad de esta lectina, uniéndose parte de ella a la superficie celular. Por otra parte células de la población CD4secretan grandes cantidades de galectina-1, parte de la cual acaba por unirse a la MEC, conformando una estructura bidimensional de galectina-1 tal y como han descrito He y cols. Los azúcares libres de los linfocitos T les permiten unirse a la galectina-1 de la MEC, produciéndose la apoptosis de estos linfocitos T activados, limitándose con ello la respuesta inmune. Por el contrario, las células CD4+ activadas de pacientes diabéticos (Figura 71B) secretan aproximadamente los mismos niveles de galectina-1 que los controles sanos, pero la presencia de grandes cantidades de ligandos para la galectina-1 en superficie ocasiona que mucha más galectina-1 se una al glicocálix, lo cual probablemente sea debido a que estas glicoproteínas contienen menores cantidades de ácido siálico en posición α 2,6, que impide la unión de la galectina-1, lo que viene indicado por la elevada tinción con PHA-L con respecto de los controles sanos (Zhuo y cols. 2010). Así, al aumentarse el nivel de enlaces cruzados entre glicoproteínas el linfocito no podrá unirse a la MEC y no se inducirá apoptosis. Por otra parte, aunque alguno de los linfocitos se pudiera unir a la MEC, las células de la población CD4de diabéticos secretan menor cantidad de galectina-1, por lo que la MEC tendrá menos galectina-1 unida permitiendo que estos linfocitos puedan eventualmente escapar de una muerte por apoptosis. Finalmente, concentraciones bajas de galectina-1 soluble impiden la adhesión a la MEC mediada por IL-2 (Rabinovich y cols. 1999), otro mecanismo más que contribuiría a impedir la apoptosis de los linfocitos CD4+ activados, manteniéndose entonces la respuesta inmune. 256 Capítulo 9: Discusión. CD4 + activado CD4 + activado MEC CD4 - Limitación respuesta inmune CD4 - CD4 + activado MEC CD4 + activado CD4 + activado CD4 + activado CD4 + activado AB CD4 + apoptótico CD4 + apoptótico CD4 + apoptótico Mantenimiento respuesta inmune Galectina-1 Ligando para galectina-1 Secreción Unión Estimulación Inhibición Figura 71. Modelo propuesto del papel de la galectina-1 en el desarrollo de la T1DM. A. En personas sanas, los linfocitos T CD4+ activados secretan galectina-1, parte de la cual se une a los ligandos presentes en la superficie celular. Las células CD4-, como monocitos, secretan niveles mucho mayores de galectina-1, parte de la cual se uniría a la matriz extracelular (MEC). Cuando los ligandos libres en linfocitos T CD4+ se unen a la galectina-1 presente en la MEC se desencadenan una serie de señales que llevan en último término a la apoptosis del linfocito, limitándose la respuesta inmune. B. En pacientes diabéticos, los linfocitos T CD4+ activados secretan cantidades de galectina-1 similares a las observadas en personas sanas, pero la presencia de un mayor número de ligandos para esta lectina provoca que ésta se una a la superficie celular, estableciéndose enlaces cruzados entre las glicoproteínas e impidiéndose con ello la unión a la MEC. Por otra parte, células CD4como los monocitos secretan mucha menos galectina-1, por lo que la cantidad de esta lectina unida a la MEC sería mucho menor, lo que conllevaría a una supervivencia prolongada del linfocito T CD4+ activado, manteniéndose en último término la respuesta inmune y la posibilidad de daño tisular en estos pacientes. El hecho de que las células inmunes estén ejerciendo su función en un ambiente defectivo en galectina-1 puede influenciar el comportamiento de otras células además de los linfocitos T CD4+. Por ejemplo, es conocido que las células dendríticas diferenciadas en presencia de galectina-1 adquieren un fenotipo regulador, promoviendo entonces la tolerancia de células T y terminando la inflamación autoinmune a través de mecanismos en los que 257 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. intervienen la IL-27 y la IL-10. Así pues es posible especular que el ambiente defectivo en galectina-1 descrito en pacientes diabéticos y causado por la población CD4pueda modificar el comportamiento de las células dendríticas, reduciendo su habilidad para terminar la inflamación autoinmune (Ilarregui y cols. 2009). Además las propias células dendríticas también pueden expresar galectina-1, induciendo en ese caso la apoptosis de linfocitos T activados (Perone y cols. 2006b), mecanismo que podría entonces estar alterado en diabéticos. La importancia de la galectina-1 para las células dendríticas viene subrayada por el hecho de que células dendríticas que sobre-expresan galectina-1 pueden retrasar la aparición de la diabetes autoinmune en ratones NOD así como disminuir el grado de insulitis (Perone y cols. 2006a). Los linfocitos T reguladores desempeñan un papel importante en la regulación del sistema inmune. En lo que respecta a la diabetes tipo 1 hay autores que sugieren que en pacientes diabéticos existe un menor número de linfocitos T reguladores respecto de controles sanos, lo que podría explicar en parte la falta de regulación de su respuesta inmune (Kukreja y cols. 2002). Sin embargo tanto nosotros como otros autores no hemos detectado diferencias en la frecuencia de aparición de estos linfocitos Treg (controles sanos 2,1% ± 0,8%; pacientes diabéticos: 2,4% ± 0,6%; media ± desviación estándar) (Lindley y cols. 2005; Putnam y cols. 2005; Brusko y cols. 2005 y 2007; Tree y cols. 2006). De hecho actualmente se propone que, si bien el número de linfocitos Treg es normal, la función supresora de éstos se halla disminuida (Lindley y cols. 2005; Brusko y cols. 2005). Se sabe que al menos parte de la acción supresora de los Treg viene mediada por la galectina-1 unida a la superficie de estas células, que les permite establecer enlaces cruzados entre los receptores glucoproteicos de las células diana, conduciendo a la supresión de la respuesta inmune (Garín y cols. 2007). Teniendo en cuenta estos resultados previos descritos por otros autores, y los resultados obtenidos por nosotros en lo que respecta a la producción de galectina-1 por parte de linfocitos Treg, hemos propuesto el modelo de la Figura 72 para explicar el papel de la galectina-1 en el funcionamiento de linfocitos Treg a la hora de regular la respuesta inmune. En controles sanos (Figura 72A), los linfocitos Treg secretan galectina-1 (en concordancia con lo expuesto por Garín y cols. 2006) y parte de ella permanece unida a superficie celular, donde interacciona mediante contacto célula-célula con las glicoproteínas de linfocitos T CD4+ activados, llevando a cabo enlaces cruzados entre ellas e induciendo apoptosis, suprimiendo con ello la respuesta inmune. Sin embargo en diabéticos (Figura 72B) 258 Capítulo 9: Discusión. por alguna razón la galectina-1 no es capaz de permanecer unida a la superficie, hecho constatado en nuestros experimentos por la menor tinción en superficie y la mayor cantidad de galectina-1 libre detectada en el medio de cultivo por ELISA. Así el papel supresor de los linfocitos Treg se vería claramente afectado, ya que no se establecerían enlaces cruzados entre glicoproteínas en el linfocito T CD4+ y éste permanece activado, manteniéndose la respuesta inmune, con la consiguiente posibilidad del desarrollo de una respuesta autoinmune. Así pues, los niveles y distribución de galectina-1 detectados en este trabajo podrían explicar, al menos en parte, la pérdida de poder supresor presente en los linfocitos Treg de diabéticos observada por diversos grupos de investigación. Hemos descrito además que en controles sanos existe una elevada correlación directa entre niveles de galectina-1 de superficie y CD25 en linfocitos Treg, lo cual coincide con lo expuesto por Garín y cols. (2007) acerca de que los linfocitos Treg, que son los que mayores niveles de CD25 expresan, expresan grandes cantidades de galectina-1. En pacientes diabéticos esta relación es inversa, lo cual apoya la idea de que son los linfocitos Treg (los CD25alto) , y no otras células activadas CD25+ que pudiéramos haber copurificado, los que presentan una cantidad disminuida de galectina-1 en superficie. CD4 + activado Treg CD4 + apoptótico CD4 + activado Treg CD4 + activado Limitación respuesta inmune A B Mantenimiento respuesta inmune Galectina-1 Secreción Inducción de apoptosis Figura 72. Modelo sobre el papel de la galectina-1 sobre la función de los linfocitos T reguladores (Treg) en la diabetes. A. En personas sanas, los linfocitos Treg presentan grandes cantidades de galectina-1 unida a su superficie, secretando además al medio extracelular cantidades importantes de esta lectina. Cuando el linfocito Treg encuentra un linfocito T CD4+ activado se une a 259 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. él, estableciendo gracias a la galectina-1 presente en el linfocito Treg enlaces cruzados entre los receptores de superficie del linfocito T CD4+ activado induciendo su eliminación por apoptosis y limitando con ello la respuesta inmune. B. En el paciente diabético, por el contrario, los linfocitos Treg presentan niveles reducidos de galectina-1 en la superficie (lo que aumentaría la cantidad de galectina1 extracelular y explicaría la diferencia encontrada con personas sanas). Esta carencia de galectina-1 en superficie impide que los Treg establezcan enlaces cruzados entre glicoproteínas de la superficie de linfocitos T CD4+ activados, enlaces que son determinantes para inducir la apoptosis, permitiéndose entonces la supervivencia del linfocito y manteniéndose la respuesta inmune con posible daño tisular. Las causas que conducen a esta pérdida de poder supresor por parte de los Treg de diabéticos mediada por galectina-1 podrían ser diversas: por una parte es posible que el patrón de azúcares de superficie sea diferente en pacientes diabéticos respecto de controles (patrón que ya hemos demostrado ser diferente al menos en linfocitos T CD4+), y que ese nuevo patrón impida la unión de galectina-1 a la superficie celular, si bien nosotros no hemos detectado diferencias en lo que a tinción con PHA-L se refiere. Por otro lado hemos detectado una mayor secreción de IL-17 por parte de linfocitos Treg de diabéticos, y ya que recientemente se ha indicado la posibilidad de que los linfocitos Treg sean un tipo celular plástico capaz de convertirse a un fenotipo tipo Th17 en condiciones proinflamatorias y con niveles reducidos de TGF-β (Xu y cols. 2007), es posible que el ambiente proinflamatorio y con bajos niveles de TGF-β descrito en la T1D (Azar y cols. 2000) induzca a las células Treg a convertirse en Th17, que según hemos observado poseen mucha menos galectina-1 en superficie respecto de las Treg, disminuyéndose su capacidad supresora. Sería entonces de interés estudiar el patrón de azúcares de superficie de linfocitos Treg de pacientes diabéticos para comprobar si el problema radica en la no unión de la galectina-1 a la superficie más que a un cambio en el fenotipo de las células Treg. Habría también que caracterizar la población Treg que presenta galectina-1 de superficie disminuida, mediante tinción para IL-17, RORγ(t), FOXP3, CCR6 y/o otros marcadores, con el fin de determinar si realmente ha tenido lugar la conversión de Treg a Th17. Sorprendentemente, tanto los linfocitos T CD4+ como los Th17 polarizados in vitro en diabéticos secretan menores cantidades de IL-17 respecto de los controles sanos. Se ha demostrado recientemente que cuando linfocitos Th17 autorreactivos para antígenos del islote y diferenciados in vitro fueron transferidos a ratones NOD.scid estos animales desarrollaron rápidamente diabetes, y cuando las células introducidas fueron recuperadas se observó que éstas producían predominantemente IFN-γ, en detrimento de IL-17, indicando que aunque los linfocitos Th17 promueven la inflamación pancreática sólo son capaces de inducir diabetes tras su conversión a Th1 (Martin-Orozco y cols. 2009; Bending y cols 2009). Esto explicaría 260 Capítulo 9: Discusión. por qué los linfocitos CD4+ de diabéticos producen menos IL-17, ya que es posible que las células Th17 hayan pasado a ser Th1, produciendo niveles mayores de IFN-γ y menores de IL-17. Esto explicaría también por qué los Th17 diferenciados in vitro producen menos IL-17; estos linfocitos, a diferencia de nuestros experimentos previos de polarización, no han sido diferenciados a partir de linfocitos T CD4+ vírgenes, sino directamente de linfocitos CD4+, células que en diabéticos ya están desviadas hacia Th1, por lo que las condiciones de polarización establecidas por nosotros (IL-1β e IL-23) se ven alteradas por la presencia de citocinas proinflamatorias producidas por los linfocitos Th1. Para determinar entonces el comportamiento real de los linfocitos Th17 de diabéticos sería necesario aislar linfocitos T CD4+ vírgenes y polarizarlos hacia Th17. También se podría analizar mediante citometría de flujo la población CD4+ CCR6+ RORγ(t)+ y determinar en ella el patrón de citocinas y de galectina-1, ya que ésta sería la verdadera población de células Th17, resultando entonces innecesaria la polarización in vitro. Experimentos en esta última línea están actualmente siendo llevados a cabo en nuestro laboratorio, y resultados preliminares parecen indicar que los linfocitos CD4+ CCR6+ RORγ(t)+ de pacientes con diabetes tipo 1 presentan menores niveles de galectina-1 total (intracelular y de superficie) en comparación con controles sanos. Un hecho destacable es la mayor producción de IL-10 por parte de linfocitos Th17 de diabéticos, citocina que puede ser producida por este subtipo celular y que estudios recientes sugieren que actúa limitando los efectos patológicos de las mismas Th17 que la producen (McGeachy y cols. 2007), por lo que es posible pensar que la secreción de IL-10 detectada por nosotros actúe como un mecanismo de control negativo para limitar la proliferación de Th17 en diabéticos. Además se ha demostrado que la IL-23, empleada en las polarizaciones, induce no sólo la secreción de IL-17 sino también la de IL-10 (Vanden Eijnden y cols. 2005), reforzando la idea de la existencia de este mecanismo de control negativo, que parece estar especialmente activado en diabéticos. El tiodigalactósido (TDG) compite con la galectina-1, y posiblemente con otras galectinas, a la hora de unirse a las glicoproteínas (Bianchet y cols. 2000). Sería de esperar que la adición de este inhibidor favoreciera una respuesta tipo Th1, al no poder unirse la galectina-1 a la superficie, sin embargo lo que se produce es un desplazamiento hacia un fenotipo inmunorregulador tipo Th2/Treg, en detrimento del fenotipo proinflamatorio tipo Th1 esperado. Estudios posteriores permitirán determinar qué otras lectinas poseen el mismo ligando que la galectina-1, permitiendo conocer qué galectinas son causantes del efecto observado. Una alternativa sería emplear anticuerpos neutralizantes contra galectina-1, o 261 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. 262 ARN interferente, para bloquear de un modo más específico la galectina-1, y observar qué efectos son realmente causados por la ausencia de esta lectina y no por la combinación de la ausencia de otras lectinas. Curiosamente en los pacientes diabéticos sí aumenta la producción de IL-17 al añadir el inhibidor TDG. Así pues, hemos propuesto un modelo que explica la resistencia de los linfocitos T CD4+ activados de diabéticos a la apoptosis mediada por galectina-1, así como la disminución del poder supresor de Treg y la secreción defectiva de galectina-1 por parte de células de la población CD4- (monocitos, linfocitos B y/o linfocitos T CD8+, observadas en pacientes con diabetes tipo 1. Posteriores estudios de caracterización fenotípica de la población de linfocitos Treg que presenta menor galectina-1 de superficie y de la población Th17 presente de manera natural en los PBMCs de diabéticos nos conducirán a un mejor conocimiento del papel de la galectina-1 en el desarrollo de la diabetes tipo 1 humana. Conclusiones. 263 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. 270 Bibliografía. 271 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. 272 Referencias. Aanstoot HJ, Kang SM, Kim J, Lindsay LA, Roll U, Knip M, Atkinson M, MoseLarsen P, Fey S, Ludvigsson J, Landin L, Bruining J, Maclaren N, Akerblom HK, Baekkeskov S. Identification and characterization of glima 38, a glycosylated islet cell membrane antigen, which together with GAD65 and IA2 marks the early phases of autoimmune response in type 1 diabetes. J Clin Invest. 1996 Jun 15;97(12):2772-83. Abbas KA, Lichtman AH, Pillai S. Inmunología celular y molecular. 6ª ed. Editorial Elsevier Saunders. 2008. Adams L, Scott GK, Weinberg CS. Biphasic modulation of cell growth by recombinant human galectin-1, Biochim. Biophys. Acta. 2 (1996) 137-144. Adorini L, Penna G. Control of autoimmune diseases by the vitamin D endocrine system. Nat Clin Pract Rheumatol. 2008 Aug;4(8):404-12. Epub 2008 Jul 1. Aguilar MI. HPLC of peptides and proteins. Methods and protocols. 1ª Ed. (2004). Methods in Molecular Biology, Vol. 251. Humana Press. Ahmad N, Gabius HJ, Sabesan S, Oscarson S, Brewer CF. Thermodynamic binding studies of bivalent oligosaccharides to galectin-1, galectin-3, and the carbohydrate recognition domain of galectin-3. Glycobiology. 2004; 14:817-25. Alexander, WS. Progressive fibrinoid degeneration of fibrillary astrocytes associated with mental retardation in a hydrocephalic infant. Brain 1949; 72: 373-81. Alexopoulos H, Dalakas MC. A critical update on the immunopathogenesis of Stiff Person Syndrome. Eur J Clin Invest. 2010; 40:1018-25. Allen HJ, Sucato D, Woynarowska B, Gottstine S, Sharma A, Bernacki RJ. Role of galaptin in ovarian carcinoma adhesion to extracellular matrix in vitro. J Cell Biochem. 1990 May; 43(1):43-57. American Diabetes Association. http://www.diabetes.org/diabetes-basics/genetics-ofdiabetes.html. Anderson MS, Bluestone JA. The NOD mouse: a model of immune dysregulation. Annu Rev Immunol 2005; 23: 447-85. Anjos S, Nguyen A, Ounissi-Benkalha H, Tessier MC, Polychronakos C. A common autoimmunity predisposing signal peptide variant of the cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 results in inefficient glycosylation of the susceptibility allele. J Biol Chem. 2002 Nov 29;277(48):46478-86. Epub 2002 Sep 19. Annunziato F, Cosmi L, Santarlasci V, Maggi L, Liotta F, Mazzinghi B, Parente E, Filì L, Ferri S, Frosali F, Giudici F, Romagnani P, Parronchi P, Tonelli F, Maggi E, Romagnani S. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med. 2007 Aug 6; 204(8):1849-61. Epub 2007 Jul 16. Ansel KM, Djuretic I, Tanasa B, Rao A. Regulation of Th2 differentiation and Il4 locus accessibility. Annu Rev Immunol 2006; 24:607-656. Arden SD, Zahn T, Steegers S, Webb S, Bergman B, O'Brien RM, Hutton JC. Molecular cloning of a pancreatic islet-specific glucose-6-phosphatase catalytic subunit-related protein. Diabetes. 1999 Mar; 48(3):531-42. Arechaga I, Miroux B, Karrasch S, Huijbregts R, de Kruijff B, Runswick MJ, Walker JE. Characterisation of new intracellular membranes in Escherichia coli accompanying large scale over-production of the b subunit of F1Fo ATP synthase. FEBS Letters. 2000 482: 215219. 273 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. Arif S, Moore F, Marks K, Bouckenooghe T, Dayan CM, Planas R, Vives-Pi M, Powrie J, Tree T, Marchetti P, Huang GC, Gurzov EN, Pujol-Borrell R, Eizirik DL, Peakman M. Peripheral and islet interleukin-17 pathway activation characterizes human autoimmune diabetes and promotes cytokine-mediated {beta}-cell death. Diabetes 2011. DOI: 10.2337/db10-1643. Arif S, Tree TI, Astill TP, Tremble JM, Bishop AJ, Dayan CM, Roep BO, Peakman M. Autoreactive T cell responses show proinflammatory polarization in diabetes but a regulatory phenotype in health. J Clin Invest 2004; 113:451–63. Arnold PY, La Gruta NL, Miller T, Vignali KM, Adams PS, Woodland DL, Vignali DA. The majority of immunogenic epitopes generate CD4+ T cells that are dependent on MHC class II-bound peptide-flanking residues. J Immunol 2002, 169:739-749. Asemissen AM, Haase D, Stevanovic S, Bauer S, Busse A, Thiel E, Rammensee HG, Keilholz U, Scheibenbogen C. Identification of an immunogenic HLA-A*0201-binding Tcell epitope of the transcription factor PAX2. J Immunother. 2009 May; 32(4):370-5. Atkinson MA, Bowman MA, Kao KJ, Campbell L, Dush PJ, Shah SC, Simell O, Maclaren NK. Lack of immune responsiveness to bovine serum albumin in insulindependent diabetes. N Engl J Med. 1993 Dec 16;329(25):1853-8. Azar ST, Salti I, Zantout MS, Major S. Alterations in plasma transforming growth factor beta in normoalbuminuric type 1 and type 2 diabetic patients. J Clin Endocrinol Metab. 2000 Dec; 85(12):4680-2. Bach JF. The effect of infections on susceptibility to autoimmune and allergic diseases. N Engl J Med. 2002 Sep 19; 347(12):911-20. Baekkeskov S, Aanstoot HJ, Christgau S, Reetz A, Solimena M, Cascalho M, Folli F, Richter-Olesen H, De Camilli P. Identification of the 64K autoantigen in insulin-dependent diabetes as the GABA-synthesizing enzyme glutamic acid decarboxylase. Nature. 1990 Sep 13;347(6289):151-6. Banwell B, Bar-Or A, Cheung R, Kennedy J, Krupp LB, Becker DJ, Dosch HM; Wadsworth Pediatric Multiple Sclerosis Study Group. Abnormal T-cell reactivities in childhood inflammatory demyelinating disease and type 1 diabetes. Ann Neurol. 2008; 63:98111. Barondes SH, Castronovo V, Coopera DNW, Cummings RD, Drickamer K, Felzi T, Gitt MA, Hirabayashi J, Hughes C, Kasai K, Leffler H, Liu FT, Lotan R, Mercurio AM, Monsigny M, Pillai S, Poirer F, Raz A, Rigby PWJ, Rini JM, Wang JL. Galectins: a family of animal beta-galactoside-binding lectins. Cell. 1994; 25; 76:597-8. Barreto M, Santos E, Ferreira R, Fesel C, Fontes MF, Pereira C, Martins B, Andreia R, Viana JF, Crespo F, Vasconcelos C, Ferreira C, Vicente AM. Evidence for CTLA4 as a susceptibility gene for systemic lupus erythematosus. Eur J Hum Genet. 2004 Aug;12(8):6206. Barrett JC, Clayton DG, Concannon P, Akolkar B, Cooper JD, Erlich HA, Julier C, Morahan G, Nerup J, Nierras C, Plagnol V, Pociot F, Schuilenburg H, Smyth DJ, Stevens H, Todd JA, Walker NM, Rich SS; Type 1 Diabetes Genetics Consortium. Genome-wide association study and meta-analysis find that over 40 loci affect risk of type 1 diabetes. Nat Genet. 2009 Jun;41(6):703-7. Epub 2009 May 10. Barrionuevo P, Beigier-Bompadre M, Ilarregui JM, Toscano MA, Bianco GA, Isturiz MA, Rabinovich GA. A novel function for galectin-1 at the crossroad of innate and adaptive 274 Referencias. immunity: galectin-1 regulates monocyte/macrophage physiology through a nonapoptotic ERK-dependent pathway. J Immunol. 2007; 178: 436-45. Bartnes K, Leon F, Briand JP, Travers PJ, Hannestad K. N-terminal elongation of a peptide determinant beyond the first primary anchor improves binding to H-2 I-Ad and HLADR1 by backbone-dependent and aromatic side chain-dependent interactions, respectively. Eur. J. Immunol. 1999; 29:189–195. Baum LG, Blackall DP, Arias-Magallano S, Nanigian D, Uh SY, Browne JM, Hoffmann D, Emmanouilides CE, Territo MC, Baldwin GC. Amelioration of graft versus host disease by galectin-1. Clin Immunol. 2003; 109: 295-307. Begovich AB, Carlton VE, Honigberg LA, Schrodi SJ, Chokkalingam AP, Alexander HC, Ardlie KG, Huang Q, Smith AM, Spoerke JM, Conn MT, Chang M, Chang SY, Saiki RK, Catanese JJ, Leong DU, Garcia VE, McAllister LB, Jeffery DA, Lee AT, Batliwalla F, Remmers E, Criswell LA, Seldin MF, Kastner DL, Amos CI, Sninsky JJ, Gregersen PK. A missense single-nucleotide polymorphism in a gene encoding a protein tyrosine phosphatase (PTPN22) is associated with rheumatoid arthritis. Am J Hum Genet. 2004 Aug;75(2):330-7. Epub 2004 Jun 18. Bending D, De la Peña H, Veldhoen M, Phillips JM, Uyttenhove C, Stockinger B, Cooke A. Highly purified Th17 cells from BDC2.5NOD mice convert into Th1-like cells in NOD/SCID recipient mice. J Clin Invest 2009;119:565–72. Berman MA, Sandborg CI, Wang Z, Imfeld KL, Zaldivar F,Jr, Dadufalza V, Buckingham BA. Decreased IL-4 production in new onset type I insulin-dependent diabetes mellitus. J Immunol 1996; 157:4690-6. Bernardes ES, Silva NM, Ruas LP, Mineo JR, Loyola AM, Hsu DK, Liu FT, Chammas R, Roque-Barreira MC. Toxoplasma gondii infection reveals a novel regulatory role for galectin-3 in the interface of innate and adaptive immunity. Am J Pathol. 2006; 168: 1910-20. Bertera S, Alexander A, Giannoukakis N, Robbins PD, Trucco M. Immunology of type 1 diabetes. Intervention and prevention strategies. Endocrinol and Metab Clin Nor Amer 1999; 28: 841-864. Bettelli E, Korn T, Kuchroo VK. Th17: The third member of the effector T cell trilogy. Curr Opin Immunol 2007; 19:652-7. Bettelli E, Korn T, Oukka M, Kuchroo VK. Induction and effector functions of T(H)17 cells. Nature 2008; 453:1051-7. Bhasin, M, Singh, H, Raghava, G.P.S. MHCBN: A comprehensive database of MHC binding and non-binding peptides. Bioinformatics. 2003. 19, 666-667. Bian H, Reidhaar-Olson JF, Hammer J. The use of bioinformatics for identifying class IIrestricted T-cell epitopes. Methods 2003, 29, 299–309. Bianchet MA, Ahmed H, Vasta GR, Amzel LM. Soluble beta-galactosyl-binding lectin (galectin) from toad ovary: crystallographic studies of two protein-sugar complexes. Proteins. 2000 Aug 15; 40(3):378-88. Bignami A, Eng LF, Dahl D, Uyeda CT. Localization of the glial fibrillary acidic protein in astrocytes by immunofluorescence. Brain Res. 1972 Aug 25;43(2):429-35. Bingley PJ; Bonifacio E, Williams AJK, Genovese S, Botazzo GF, Gale EAM. Prediction of IDDM in the general population: strategies based on combinations of autoantibody markers. Diabetes 1997; 46:1701-10. 275 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. Blaser C, Kaufmann M, Muller C, Zimmermann C, Wells V, Mallucci L, Pircher H. Beta-galactoside-binding protein secreted by activated T cells inhibits antigen-induced proliferation of T cells. Eur J Immunol 1998; 28:2311-9. Bodington MJ, Muzulu SI, Burden AC. Spatial clustering in childhood diabetes: evidence of an environmental cause. Diabet Med. 1995 Oct;12(10):865-7. Bongcam-Rudloff E, Nistér M, Betsholtz C, Wang JL, Stenman G, Huebner K, Croce CM, Westermark B. Human glial fibrillary acidic protein: complementary DNA cloning, chromosome localization, and messenger RNA expression in human glioma cell lines of various phenotypes. Cancer Res. 1991; 51:1553-60). Borg H, Gottsatter A, Ferlund P, Sundkvist G. A 12-year prospective study of the relationship between islet antibodies and beta-cell function at and after the diagnosis in patients with adult-onset diabetes. Diabetes 2002; 51: 1754-62. Bottazzo GF, Dean BM, McNally JM, MacKay EH, Swift PG, Gamble DR. In situ characterization of autoimmune phenomena and expression of HLA molecules in the pancreas in diabetic insulitis. N Engl J Med. 1985; 313: 353-60. Bottazzo GF, Florin-Christensen A, Doniach D. Islet-cell antibodies in diabetes mellitus with autoimmune polyendocrine deficiencies. Lancet. 1974 Nov 30;2(7892):1279-83. Bottini N, Musumeci L, Alonso A, Rahmouni S, Nika K, Rostamkhani M, MacMurray J, Meloni GF, Lucarelli P, Pellecchia M, Eisenbarth GS, Comings D, Mustelin T. A functional variant of lymphoid tyrosine phosphatase is associated with type I diabetes. Nat Genet. 2004 Apr;36(4):337-8. Epub 2004 Mar 7. Bouvier M, Wiley DC. Importance of peptide amino and carboxyl termini to the stability of MHC class I molecules. Science. 1994 Jul 15; 265(5170):398-402. Britten CM, Meyer RG, Kreer T, Drexler I, Wölfel T, Herr W. The use of HLA-A*0201transfected K562 as standard antigen-presenting cells for CD8+ T lymphocytes in IFN-gamma ELISPOT assays. J Immunol Methods. 2002 Jan 1; 259(1-2):95-110. Brusko T, Wasserfall C, McGrail K, Schatz R, Viener HL, Schatz D, Haller M, Rockell J, Gottlieb P, Clare-Salzler M, Atkinson M. No alterations in the frequency of FOXP3+ regulatory T-cells in type 1 diabetes. Diabetes. 2007 Mar; 56(3):604-12. Brusko TM, Putnam AL, Bluestone JA. Human regulatory T cells: role in autoimmune disease and therapeutic opportunities, Immunol. Rev. 2008; 371-390. Brusko TM, Wasserfall CH, Clare-Salzler MJ, Schatz DA, Atkinson MA. Functional defects and the influence of age on the frequency of CD4+ CD25+ T-cells in type 1 diabetes. Diabetes. 2005 May; 54(5):1407-14. Burgler S, Ouaked N, Bassin C, Mantel PY, Siegmund K, Meyer N, Akdis CA, SchmidtWeber CB. Differentiation and functional analysis of human T(H)17 cells. J Allergy Clin Immunol 2009; 123:588, 95, 595.e1-7. Buus S, Lauemøller SL, Worning P, Kesmir C, Frimurer T, Corbet S, Fomsgaard A, Hilden J, Holm A, Brunak S. Sensitive quantitative predictions of peptide-MHC binding by a 'Query by Committee' artificial neural network approach. Tissue Antigens 2003. 62:378384. Cabrera-Rode E, Diaz-Horta O, Fernandez LE, Carr A, Marquina G, Valiente O, Gonzalez-Suarez RM, Uriarte A. Glycolipids as the major autoantigens of cytoplasmatic islet cell antibodies. Autoimmunity. 1995;20(3):145-51. 276 Referencias. Calcabrini A, Rainaldi G, Santini MT. Cytoskeletal rearrangement in K562 erythroleukaemic cells forced to grow on a positively charged polymer surface. J Mater Sci Mater Med. 1999 Oct-Nov; 10(10/11):613-20. Calcinaro F, Dionisi S, Marinaro M, Candeloro P, Bonato V, Marzotti S, Corneli RB, Ferretti E, Gulino A, Grasso F, De Simone C, Di Mario U, Falorni A, Boirivant M, Dotta F. Oral probiotic administration induces interleukin-10 production and prevents spontaneous autoimmune diabetes in the non-obese diabetic mouse. Diabetologia. 2005 Aug; 48(8):156575. Epub 2005 Jun 29. Calvo-Calle JM, Oliveira GA, Nardin EH. Human CD4+ T cells induced by synthetic peptide malaria vaccine are comparable to cells elicited by attenuated Plasmodium falciparum sporozoites. The Journal of Immunology. 2005. 175:7575-7585. Camby I, Le Mercier M, Lefranc F, Kiss R. Galectin-1: a small protein with major functions. Glycobiology. 2006; 16: 137R-157R. Canal N, Nemni R. Autoimmunity and diabetic neuropathy. Clin Neurosci. 1997; 4:371-3. Carrillo J, Puertas MC, Alba A, Ampudia RM, Pastor X, Planas R, Riutort N, Alonso N, Pujol-Borrell R, Santamaria P, Vives-Pi M, Verdaguer J. Islet-infiltrating B-cells in nonobese diabetic mice predominantly target nervous system elements. Diabetes. 2005 Jan; 54(1):69-77. Carson RT, Desai DD, Vignali KM, Vignali DA. Immunoregulation of Th cells by naturally processed peptide antagonists. J. Immunol. 1999 162:1–4. Carson RT, Vignali KM, Woodland DL, Vignali DA. T cell receptor recognition of MHC class II-bound peptide flanking residues enhances immunogenicity and results in altered TCR V region usage. Immunity 1997; 7:387–399. Castano L, Eisenbarth GS. Type-I diabetes: A chronic autoimmune disease of human, mouse, and rat. Annu Rev Immunol 1990; 8:647-79. Cattaneo V, Tribulatti MV, Campetella O. Galectin-8 tandem-repeat structure is essential for T-cell proliferation but not for co-stimulation. Biochem J. 2011 Jan 27; 434(1):153-60. Chang YH, Hwang J, Shang HF, Tsai ST. Characterization of human DNA topoisomerase II as an autoantigen recognized by patients with IDDM. Diabetes. 1996 Apr;45(4):408-14. Chen W, Jin W, Hardegen N, Lei KJ, Li L, Marinos N, McGrady G, Wahl SM. Conversion of peripheral CD4+CD25– naive T cells to CD4+CD25+ regulatory T cells by TGF-β induction of transcription factor Foxp3. J Exp Med 2003; 198:1875-1886. Cheng Y, Zhang J, Hou W, Wang D, Li F, Zhang Y, Yuan F. Immunoregulatory effects of sinomenine on the T-bet/GATA-3 ratio and Th1/Th2 cytokine balance in the treatment of mesangial proliferative nephritis. Int Immunopharmacol 2009; 9:894-9. Chentoufi AA, Binder NR, Berka N, Abunadi T, Polychronakos C. Advances in type I diabetes associated tolerance mechanisms. Scand J Immunol. 2008 Jul;68(1):1-11. Chicz RM, Urban RG, Gorga JC, Vignali DA, Lane WS, Strominger JL. Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles. J Exp Med. 1993 Jul 1; 178(1):27-47. Chicz RM, Urban RG, Lane WS, Gorga JC, Stern LJ, Vignali DA, Strominger JL. Predominant naturally processed peptides bound to HLA-DR1 are derived from MHC-related molecules and are heterogeneous in size. Nature 1992 Aug 27; 358(6389):764-8. 277 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. Cho M, Cummings RD. Galectin-1, a beta-galactoside-binding lectin in Chinese hamster ovary cells. I. Physical and chemical characterization. J Biol Chem. 1995 Mar 10; 270(10):5198-206. Christen U, von Herrath MG. Induction, acceleration or prevention of autoimmunity by molecular mimicry. Mol Immunol. 2004; 40: 1113-20. Christie MR, Hollands JA, Brown TJ, Michelsen BK, Delovitch TL. Detection of pancreatic islet 64,000 M(r) autoantigens in insulin-dependent diabetes distinct from glutamate decarboxylase. J Clin Invest 1993; 92:240-248. Christinck ER, Luscher MA, Barber BH, Williams DB. Peptide binding to class I MHC on living cells and quantitation of complexes required for CTL lysis. Nature 1991; 352: 67-70. Chung CD, Patel VP, Moran M, Lewis LA, Miceli MC. Galectin-1 induces partial TCR zeta-chain phosphorylation and antagonizes processive TCR signal transduction. J Immunol. 2000; 165: 3722-9. Colin W. Capture and processing of exogenous antigens for presentation on MHC molecules. Annu. Rev. Immunol 1997; 15:821–50. Collins DS, Unanue ER, Harding CV. Reduction of disulfide bonds within lysosomes is a key step in antigen processing. J. Immunol. 1991; 147:4054–59. Conrad B, Weidmann E, Trucco G, Rudert WA, Behboo R, Ricordi C, Rodriquez-Rilo H, Finegold D, Trucco M. Evidence for superantigen involvement in insulin-dependent diabetes mellitus aetiology. Nature. 1994; 371: 351-5. Cooper DNW. Galectin-1: secretion and modulation of cell interactions with laminin. Trends Glycosci Glycotech. 1997; 45:57. Coppieters KT, von Herrath MG. Histopathology of type 1 diabetes: old paradigms and new insights. Rev Diabet Stud. 2009; 6:85-96. Correa SG, Sotomayor CE, Aoki MP, Maldonado CA, Rabinovich GA. Opposite effects of galectin-1 on alternative metabolic pathways of L-arginine in resident, inflammatory, and activated macrophages. Glycobiology. 2003; 13: 119-28. Cortegano I, del Pozo V, Cárdaba B, de Andrés B, Gallardo S, del Amo A, Arrieta I, Jurado A, Palomino P, Liu FT, Lahoz C. Galectin-3 down-regulates IL-5 gene expression on different cell types. J Immunol. 1998; 161: 385-9. Craighead JE, McLane MF. Diabetes mellitus: induction in mice by encephalomyocarditis virus. Science. 1968 Nov 22; 162(856):913-4. Cresswell P. Assembly, transport and function of MHC class II molecules. Annu. Rev. Immunol. 1994; 12:259–93. Cresswell P. Invariant chain structure and MHC class II function. Cell 1996; 84:505–7. Crome SQ, Wang AY, Kang CY, Levings MK. The role of retinoic acid-related orphan receptor variant 2 and IL-17 in the development and function of human CD4+ T cells. Eur J Immunol. 2009 Jun; 39(6):1480-93. Crowther JR. The ELISA Guidebook. 2a Ed. (2009). Methods in Molecular Biology, Vol. 516, Humana Press. Cua DJ, Sherlock J, Chen Y, Murphy CA, Joyce B, Seymour B, Lucian L, To W, Kwan S, Churakova T, Zurawski S, Wiekowski M, Lira SA, Gorman D, Kastelein RA, 278 Referencias. Sedgwick JD. Interleukin-23 rather tan interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain. Nature 2003; 421:744-48. Curotto de Lafaille MA, Lafaille JJ. Natural and adaptive foxp3+ regulatory T cells: more of the same or a division of labor? Immunity 2009; 30:626-635. Czerkinsky C, Andersson G, Ekre HP, Nilsson LA, Klareskog L, Ouchterlony O. Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production. I. Enumeration of gamma-interferon secreting cells. J Immunol Methods 1988; 110: 29–36. Czerkinsky CC, Nilsson LA, Nygren H, Ouchterlony O, Tarkowski A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods 1983; 65: 109–121. Dahlquist GG, Patterson C, Soltesz G. Perinatal risk factors for childhood type 1 diabetes in Europe. The EURODIAB Substudy 2 Study Group. Diabetes Care. 1999 Oct;22(10):1698702. Delovitch TL, Singh B. The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD. Immunity. 1997 Dec; 7(6):727-38. Di Lorenzo TP, Peakman M, Roep BO. Translational mini-review series on type 1 diabetes: Systematic analysis of T cell epitopes in autoimmune diabetes. Clin Exp Immunol. 2007 Apr; 148(1):1-16. Diabetes Prevention Trial-Type 1 Diabetes Study Group. Effects on insulin in relatives of patients with type 1 diabetes mellitus. N Eng J Med 2002; 346: 1685-91. Dieckmann D, Bruett CH, Ploettner H, Lutz MB, Schuler G. Human CD4(+)CD25(+) regulatory, contact-dependent T cells induce interleukin 10-producing, contact-independent type 1-like regulatory T cells. J Exp Med. 2002 Jul 15;196(2):247-53. Diez-Rivero CM, Lafuente EM, Reche PA. Computational analysis and modeling of cleavage by the immunoproteasome and the constitutive proteasome. BMC Bioinformatics 2010, 11:479 (http://imed.med.ucm.es/Tools/pcps/index.html). Dönnes P, Elofsson A. Prediction of MHC class I binding peptides, using SVMHC. BMC Bioinformatics 2002 3: 25. Dorman JS, LaPorte RE, Stone RA, Trucco M. Worldwide differences in the incidence of type I diabetes are associated with amino acid variation at position 57 of the HLA-DQ beta chain. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Oct; 87(19):7370-4. Dotta F, Falorni A, Tiberti C, Dionisi S, Anastasi E, Torresi P, Lernmark A, Di Mario U. Autoantibodies to the GM2-1 islet ganglioside and to GAD-65 at type 1 diabetes onset. J Autoimmun. 1997 Dec;10(6):585-8. Duchen LW, Anjorin A, Watkins PJ, Mackay JD. Pathology of autonomic neuropathy in diabetes mellitus. Ann Intern Med. 1980; 92:301-3. Dumon-Seignovert L, Cariot G, Vuillard L. The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21 (DE3), C41 (DE3), and C43 (DE3). Protein Expr Purif. 2004 Sep; 37(1):203-6 Eisenlohr LC, Yewdell JW, Bennink JR. Flanking sequences influence the presentation of an endogenously synthesized peptide to cytotoxic T lymphocytes. J Exp Med. 1992 Feb 1; 175(2):481-7 279 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. Lieberman SM, DiLorenzo TP. A comprehensive guide to antibody and T-cell responses in type 1 diabetes. Tissue Antigens. 2003 Nov; 62(5):359-77. Lieberman SM, Evans AM, Han B, Takaki T, Vinnitskaya Y, Caldwell JA, Serreze DV, Shabanowitz J, Hunt DF, Nathenson SG, Santamaria P, DiLorenzo TP. Identification of the beta cell antigen targeted by a prevalent population of pathogenic CD8+ T cells in autoimmune diabetes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jul 8; 100(14):8384-8. Epub 2003 Jun 18. Lim Y, Lee DY, Lee S, Park SY, Kim J, Cho B, Lee H, Kim HY, Lee E, Song YW, Jeoung DI. Identification of autoantibodies associated with systemic lupus erythematosus. Biochem Biophys Res Commun. 2002; 295: 119-24. Lindberg B, Ivarsson SA, Lernmark A. Islet autoantibodies in cord blood could be a risk factor for future diabetes. Diabetologia. 1999 Nov;42(11):1375. Lindley S, Dayan CM, Bishop A, Roep BO, Peakman M, Tree TI. Defective suppressor function in CD4(+)CD25(+) T-cells from patients with type 1 diabetes. Diabetes. 2005 Jan; 54(1):92-9. Lippolis JD, White FM, Marto JA, Luckey CJ, Bullock TN, Shabanowitz J, Hunt DF, Engelhard VH. Analysis of MHC class II antigen processing by quantitation of peptides that constitute nested sets. J Immunol 2002, 169:5089-5097. Littorin B, Blom P, Schölin A, Arnqvist HJ, Blohmé G, Bolinder J, Ekbom-Schnell A, Eriksson JW, Gudbjörnsdottir S, Nyström L, Ostman J, Sundkvist G. Lower levels of plasma 25-hydroxyvitamin D among young adults at diagnosis of autoimmune type 1 diabetes compared with control subjects: results from the nationwide Diabetes Incidence Study in Sweden (DISS). Diabetologia. 2006 Dec;49(12):2847-52. Epub 2006 Oct 27. Liu FT, Rabinovich GA. Galectins as modulators of tumour progression. Nat Rev Cancer. 2005; 5: 29-41. Liu GY, Fairchild PJ, Smith RM, Prowle JR, Kioussis D, Wraith DC. Low avidity recognition of self-antigen by T cells permits escape from central tolerance. Immunity 1995; 3:407–415. Liu S, Wang H, Jin Y, Podolsky R, Reddy MV, Pedersen J, Bode B, Reed J, Steed D, Anderson S, Yang P, Muir A, Steed L, Hopkins D, Huang Y, Purohit S, Wang CY, Steck AK, Montemari A, Eisenbarth G, Rewers M, She JX. IFIH1 polymorphisms are significantly associated with type 1 diabetes and IFIH1 gene expression in peripheral blood mononuclear cells. Hum Mol Genet. 2009 Jan 15;18(2):358-65. Epub 2008 Oct 16. Ljungberg M, Korpela R, Ilonen J, Ludvigsson J, Vaarala O. Probiotics for the prevention of beta cell autoimmunity in children at genetic risk of type 1 diabetes--the PRODIA study. Ann N Y Acad Sci. 2006 Oct; 1079:360-4. Lochner M, Peduto L, Cherrier M, Sawa S, Langa F, Varona R, Riethmacher D, SiTahar M, Di Santo JP, Eberl G. In vivo equilibrium of proinflammatory IL-17+ and regulatory IL-10+ Foxp3+ RORγt+ T cells. J Exp Med 2008; 205:1381-93. Lock C, Hermans G, Pedotti R, Brendolan A, Schadt E, Garren H, Langer-Gould A, Strober S, Cannella B, Allard J, Klonowski P, Austin A, Lad N, Kaminski N, Galli SJ, Oksenberg JR, Raine CS, Heller R, Steinman L. Gene-microarray analysis of multiple sclerosis lesions yields new targets validated in autoimmune encephalomyelitis. Nat Med. 2002 May;8(5):500-8. 286 Referencias. Lönnrot M, Korpela K, Knip M, Ilonen J, Simell O, Korhonen S, Savola K, Muona P, Simell T, Koskela P, Hyöty H. Enterovirus infection as a risk factor for beta-cell autoimmunity in a prospectively observed birth cohort: the Finnish Diabetes Prediction and Prevention Study. Diabetes. 2000 Aug;49(8):1314-8. Lovitch SB, Walters JJ, Gross ML, Unanue ER. APCs present A beta(k)-derived peptides that are autoantigenic to type B T cells. J Immunol. 2003 Apr 15;170(8):4155-60. Lowe CE, Cooper JD, Brusko T, Walker NM, Smyth DJ, Bailey R, Bourget K, Plagnol V, Field S, Atkinson M, Clayton DG, Wicker LS, Todd JA. Large-scale genetic fine mapping and genotype-phenotype associations implicate polymorphism in the IL2RA region in type 1 diabetes. Nat Genet. 2007 Sep;39(9):1074-82. Epub 2007 Aug 5. Lundegaard C, Lamberth K, Harndahl M, Buus S, Lund O, Nielsen M. NetMHC-3.0: Accurate web accessible predictions of Human, Mouse, and Monkey MHC class I affinities for peptides of length 8-11. NAR. 2008. 36:W509-512. Lundegaard C, Lund O, Nielsen M. Accurate approximation method for prediction of class I MHC affinities for peptides of length 8, 10 and 11 using prediction tools trained on 9mers. Bioinformatics 2008. 24:1397-1398. Lundegaard C, Nielsen M, Lund O. The validity of predicted T-cell epitopes. Trends Biotechnol 2006. 24: 537-538. Maclaren NK, Huang SW, Fogh J. Antibody to cultured human insulinoma cells in insulindependent diabetes. Lancet. 1975 May 3;1(7914):997-1000. Madden DR. The three-dimensional structure of peptide-MHC complexes. Annu. Rev Immunol 1995; 13:587-622. Maier LM, Lowe CE, Cooper J, Downes K, Anderson DE, Severson C, Clark PM, Healy B, Walker N, Aubin C, Oksenberg JR, Hauser SL, Compston A, Sawcer S; International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, De Jager PL, Wicker LS, Todd JA, Hafler DA. IL2RA genetic heterogeneity in multiple sclerosis and type 1 diabetes susceptibility and soluble interleukin-2 receptor production. PLoS Genet. 2009 Jan;5(1):e1000322. Epub 2009 Jan 2. Manel N, Unutmaz D, Littman DR. The differentiation of human T(H)-17 cells requires transforming growth factor-beta and induction of the nuclear receptor RORgammat. Nat Immunol 2008; 9:641-9. Manel N. In vitro differentiation of human Th-17 CD4+ T cells. Protocol Exchange. 2008. DOI:10.1038/nprot.2008.122. Published online 3 June 2008. Mariño E, Grey ST. A new role for an old player: do B cells unleash the self-reactive CD8+ T cell storm necessary for the development of type 1 diabetes? J Autoimmun. 2008; 31: 3015. Marron MP, Graser RT, Chapman HD, Serreze DV. Functional evidence for the mediation of diabetogenic T cell responses by HLA-A2.1 MHC class I molecules through transgenic expression in NOD mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Oct 15; 99(21):13753-8. Epub 2002 Oct 2. Martin CC, Bischof LJ, Bergman B, Hornbuckle LA, Hilliker C, Frigeri C, Wahl D, Svitek CA, Wong R, Goldman JK, Oeser JK, Lepretre F, Froguel P, O'Brien RM, Hutton JC. Cloning and characterization of the human and rat islet-specific glucose-6phosphatase catalytic subunit-related protein (IGRP) genes. J Biol Chem. 2001 Jul 6; 276(27):25197-207. 287 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. Martin-Orozco N, Chung Y, Chang SH, Wang YH, Dong C. Th17 cells promote pancreatic inflammation but only induce diabetes efficiently in lymphopenic hosts after conversion into Th1 cells, Eur. J. Immunol. 1 (2009) 216-224. Mathews KP, Konstantinov KN, Kuwabara I, Hill PN, Hsu DK, Zuraw BL, Liu FT. Evidence for IgG autoantibodies to galectin-3, a beta-galactoside-binding lectin (Mac-2, epsilon binding protein, or carbohydrate binding protein 35) in human serum. J Clin Immunol. 1995 ; 15:329-37. Mathieu C, Gysemans C, Giulietti A, Bouillon R. Vitamin D and diabetes. Diabetologia. 2005 Jul;48(7):1247-57. Epub 2005 Jun 22. Mathieu C, van Etten E, Gysemans C, Decallonne B, Bouillon R. Seasonality of birth in patients with type 1 diabetes. Lancet. 2002 Apr 6;359(9313):1248. Mathieu C, Waer M, Laureys J, Rutgeerts O, Bouillon R. Prevention of autoimmune diabetes in NOD mice by 1,25 dihydroxyvitamin D3. Diabetologia. 1994 Jun;37(6):552-8. Mäurer M, Ponath A, Kruse N, Rieckmann P. CTLA4 exon 1 dimorphism is associated with primary progressive multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 2002 Oct;131(1-2):213-5. McGeachy MJ, Bak-Jensen KS, Chen Y, Tato CM, Blumenschein W, McClanahan T, Cua DJ. TGF-beta and IL-6 drive the production of IL-17 and IL-10 by T cells and restrain T(H)-17 cell-mediated pathology. Nat Immunol. 2007 Dec; 8(12):1390-7. Epub 2007 Nov 11. McGuire HM, Walters S, Vogelzang A, Lee CM, Webster KE, Sprent J, Christ D, Grey S, King C. Interleukin-21 is critically required in autoimmune and allogeneic responses to islet tissue in murine models. Diabetes. 2011 Mar; 60(3):867-75. Meccoci P, Parnetti L, Romano G, Scarelli A, Chionne F, Cecchetti R, Polidori MC, Palumbo B, Cherubini A, Senin U. Serum anti-GFAP and anti-S100 autoantibodies in brain aging, Alzheimer's disease and vascular dementia. J Neuroimmunol 1995; 57: 165-70. Mehul B, Hughes RC. Plasma membrane targetting, vesicular budding and release of galectin 3 from the cytoplasm of mammalian cells during secretion. J Cell Sci. 1997; 110: 1169-78. Mensah-Brown EP, Al Rabesi Z, Shahin A, Al Shamsi M, Arsenijevic N, Hsu DK, Liu FT, Lukic ML. Targeted disruption of the galectin-3 gene results in decreased susceptibility to multiple low dose streptozotocin-induced diabetes in mice. Clin Immunol. 2009 Jan;130(1):83-8. Epub 2008 Oct 8. Menser MA, Forrest JM, Honeyman MC, Burgess JA. Letter: Diabetes, HLA antigens, and congenital rubella. Lancet. 1974 Dec 21;2(7895):1508-9. Messing, A, Head, MW, Galles, K, Galbreath, EJ, Goldman, JE, Brenner, M. Fatal encephalopathy with astrocyte inclusions in GFAP transgenic mice. Am J Path 1998; 152: 391-98. Miller GG, Pollack MS, Nell LJ, Thomas JW. Insulin-specific human T cells. Epitope specificity, major histocompatibility complex restriction, and alloreactivity to a diabetesassociated haplotype. J Immunol 1987; 139:3622–29. Miroux B, Walker JE. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J Mol Biol. 1996 Jul 19; 260(3):289-98. 288 Referencias. Mitchell RN, Barnes KA, Grupp SA, Sanchez M, Misulovin Z, Nussenzweig MC, Abbas AK. Intracellular targeting of antigens internalized by membrane immunoglobulin in B lymphocytes. J. Exp. Med. 1995; 181:1705–14. Mohan JF, Levisetti MG, Calderon B, Herzog JW, Petzold SJ, Unanue ER. Unique autoreactive T cells recognize insulin peptides generated within the islets of Langerhans in autoimmune diabetes. Nat Immunol. 2010 Apr;11(4):350-4. Epub 2010 Feb 28. Momburg F, Hammerling GJ. Generation and TAP-mediated transport of peptides for major histocompatibility complex class I molecules. Adv. Immunol. 1998; 68:191–256. Moreno A, Clavijo P, Edelman R, Davis J, Sztein M, Sinigaglia F, Nardin E. CD4+ T cell clones obtained from Plasmodium falciparum sporozoite-immunized volunteers recognize polymorphic sequences of the circumsporozoite protein. J Immunol. 1993 Jul 1; 151(1):48999. Mosmann TR, Cherwinski H, Bond MW, Giedlin MA, Coffman RL. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol 1986; 136:2348-57. Mosmann TR, Coffman RL. TH1 and TH2 cells: Different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu Rev Immunol 1989; 7:145-73. Motran CC, Molinder KM, Liu SD, Poirier F, Miceli MC. Galectin-1 functions as a Th2 cytokine that selectively induces Th1 apoptosis and promotes Th2 function. Eur J Immunol. 2008; 38: 3015-27. Müller S, Schaffer T, Flogerzi B, Fleetwood A, Weimann R, Schoepfer AM, Seibold F. Galectin-3 modulates T cell activity and is reduced in the inflamed intestinal epithelium in IBD. Inflamm Bowel Dis. 2006 Jul;12(7):588-97. Mukherjee R, Wagar D, Stephens TA, Lee-Chan E, Singh B. Identification of CD4+ T Cell-Specific Epitopes of Islet-Specific Glucose-6-Phosphatase Catalytic Subunit-Related Protein: A Novel β Cell Autoantigen in Type 1 Diabetes. J Immunol 2005; 174: 5306-15. Murphy E, Shibuya K, Hosken N, Openshaw P, Maino V, Davis K, Murphy K, O'Garra A. Reversibility of T helper 1 and 2 populations is lost after long-term stimulation. J Exp Med 1996; 183:901-13. Nagvekar N, Corlett L, Jacobson LW, Matsuo H, Chalkley R, Driscoll PC, Deshpande S, Spack EG, Willcox N. Scanning a DRB3*0101 (DR52a)-restricted epitope cross-presented by DR3: overlapping natural and artificial determinants in the human acetylcholine receptor. J. Immunol. 1999; 162:4079–4087. Narendran P, Mannering SI, Harrison LC. Proinsulin—a pathogenic autoantigen in type 1 diabetes. Autoimmunity reviews 2003; 2: 204-210. Nejentsev S, Walker N, Riches D, Egholm M, Todd JA. Rare variants of IFIH1, a gene implicated in antiviral responses, protect against type 1 diabetes. Science. 2009 Apr 17;324(5925):387-9. Epub 2009 Mar 5. Nguyen JT, Evans DP, Galvan M, Pace KE, Leitenberg D, Bui TN, Baum LG. CD45 modulates galectin-1-induced T cell death: regulation by expression of core 2 O-glycans. J Immunol. 2001; 167: 5697-707. Niedermann G, Butz S, Ihlenfeldt HG, Grimm R, Lucchiari M, Hoschutzy H, Jung G, Maier B, Eichmann K. Contribution of proteasome-mediated proteolysis to the hierarchy of 289 Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad. epitopes presented by major histocompatibility complex class I molecules. Immunity. 1995. 2:289–99. Nielsen M, Lundegaard C, Worning P, Lauemøller SL, Lamberth K, Buus S, Brunak S, Lund O. Reliable prediction of T-cell epitopes using neural networks with novel sequence representations. Protein Sci 2003. 12:1007-1017. Nieminen J, St-Pierre C, Sato S. Galectin-3 interacts with naive and primed neutrophils, inducing innate immune responses. J Leukoc Biol. 2005; 78: 1127-35. Nisticò L, Buzzetti R, Pritchard LE, Van der Auwera B, Giovannini C, Bosi E, Larrad MT, Rios MS, Chow CC, Cockram CS, Jacobs K, Mijovic C, Bain SC, Barnett AH, Vandewalle CL, Schuit F, Gorus FK, Tosi R, Pozzilli P, Todd JA. The CTLA-4 gene region of chromosome 2q33 is linked to, and associated with, type 1 diabetes. Belgian Diabetes Registry. Hum Mol Genet. 1996 Jul;5(7):1075-80. Noorchashm H, Noorchashm N, Kern J, Rostami SY, Barker CF, Naji A. B-cells are required for the initiation of insulitis and sialitis in nonobese diabetic mice. Diabetes. 1997 Jun;46(6):941-6. Norris JM, Barriga K, Klingensmith G, Hoffman M, Eisenbarth GS, Erlich HA, Rewers M. Timing of initial cereal exposure in infancy and risk of islet autoimmunity. JAMA. 2003 Oct 1;290(13):1713-20. Norris JM, Beaty B, Klingensmith G, Yu Liping, Hoffman M, Chase HP, Erlich HA, Hamman RF, Eisenbarth GS, Rewers M. Lack of association between early exposure to cow's milk protein and beta-cell autoimmunity. Diabetes Autoimmunity Study in the Young (DAISY). JAMA. 1996 Aug 28;276(8):609-14. Notkins AL, Lernmark A. Autoimmune type 1 diabetes: resolved and unresolved issues. J. Clin. Invest. 2001; 108:1247–52. Nurieva R, Yang XO, Martinez G, Zhang Y, Panopoulos AD, Ma L, Schluns K, Tian Q, Watowich SS, Jetten AM, Dong C. Essential autocrine regulation by IL-21 in the generation of inflammatory T cells. Nature. 2007 Jul 26;448(7152):480-3. Epub 2007 Jun 20. Nussbaum AK, Kuttler C, Hadeler KP, Rammensee HG, Schild H. PAProC: A Prediction Algorithm for Proteasomal Cleavages available on the WWW. Immunogenetics. 2001. 53: 87-94. O'Brien C, Flower DR, Feighery C. Peptide length significantly influences in vitro affinity for MHC class II molecules. Immunome Research 2008, 4:6. Ogden S, Haggerty D, Stoner CM, Kolodrubetz D, Schleif R. The Escherichia coli Larabinose operon: binding sites of the regulatory proteins and a mechanism of positive and negative regulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1980 Jun; 77(6):3346-50. Oikarinen M, Tauriainen S, Honkanen T, Oikarinen S, Vuori K, Kaukinen K, Rantala I, Mäki M, Hyöty H. Detection of enteroviruses in the intestine of type 1 diabetic patients. Clin Exp Immunol. 2008 Jan;151(1):71-5. Epub 2007 Nov 7. Oldenhove G, Bouladoux N, Wohlfert EA, Hall JA, Chou D, Dos Santos L, O'Brien S, Blank R, Lamb E, Natarajan S, Kastenmayer R, Hunter C, Grigg ME, Belkaid Y. Decrease of Foxp3+ Treg cell number and acquisition of effector cell phenotype during lethal infection. Immunity 2009; 31:772-786. Oldstone MB. Molecular mimicry and autoimmune disease. Cell. 1987; 50: 819-20. 290 Referencias. Ortmann B, Copeman J, Lehner PJ, Sadasivan B, Herberg JA, Grandea AG, Riddell SR, Tampe R, Spies T, Trowsdale J, Cresswell P. A critical role for tapasin in the assembly and function of multimeric MHC class I-TAP complexes. Science 1997; 277:1306–9. Outenreath RL, Jones AL. Influence of an endogenous lectin substrate on cultured dorsal root ganglion cells. J Neurocytol. 1992 Nov; 21(11):788-95. Pak CY, Cha CY, Rajotte RV, McArthur RG, Yoon JW. Human pancreatic islet cell specific 38 kilodalton autoantigen identified by cytomegalovirus-induced monoclonal islet cell autoantibody. Diabetologia. 1990 Sep;33(9):569-72. Pak CY, Eun HM, McArthur RG, Yoon JW. Association of cytomegalovirus infection with autoimmune type 1 diabetes. Lancet. 1988 Jul 2; 2(8601):1-4. Palmer JP, Asplin CM, Clemons P, Lyen K, Tatpati O, Raghu PK, Paquette TL. Insulin antibodies in insulin-dependent diabetes before insulin treatment. Science 1983; 222:1337-9. Panagiotopoulos C, Qin H, Tan R, Verchere CB. Identification of a beta-cell-specific HLA class I restricted epitope in type 1 diabetes. Diabetes. 2003 Nov;52(11):2647-51. Panina-Bordignon P, Lang R, van Endert PM, Benazzi E, Felix AM, Pastore RM, Spinas GA, Sinigaglia F. Cytotoxic T cells specific for glutamic acid decarboxylase in autoimmune diabetes. J Exp Med. 1995 May 1;181(5):1923-7. Parel Y, Chizzolini C. CD4+ CD8+ double positive (DP) T cells in health and disease. Autoimmun Rev. 2004 Mar;3(3):215-20. Park H, Li Z, Yang XO, Chang SH, Nurieva R, Wang YH, Wang Y, Hood L, Zhu Z, Tian Q, Dong C. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nat Immunol 2005; 6:1133-41. Park SG, Park HS, Jeong IK, Cho YM, Lee HK, Kang YS, Kim S, Park KS. Autoantibodies against aminoacyl-tRNA synthetase: novel diagnostic marker for type 1 diabetes mellitus. Biomarkers. 2010 Jun;15(4):358-66. Parker KC, Bednarek MA, Hull LK, Utz U, Cunningham B, Zweerink HJ, Biddison WE, Coligan JE. Sequence motifs important for peptide binding to the human MHC class I molecule, HLA-A2. J Immunol. 1992 Dec 1; 149(11):3580-7. Peakman M, Stevens EJ, Lohmann T, Narendran P, Dromey J, Alexander A, Tomlinson AJ, Trucco M, Gorga JC, Chicz RM. Naturally processed and presented epitopes of the islet cell autoantigen IA-2 eluted from HLA-DR4. J Clin Invest 1999; 104:1449–57. Peng H, Hagopian W. Environmental factors in the development of Type 1 diabetes. Rev Endocr Metab Disord. 2006 Sep; 7(3):149-62. Perillo NL, Marcus ME, Baum LG. Galectins: versatile modulators of cell adhesion, cell proliferation, and cell death. J Mol Med. 1998 May; 76(6):402-12. Perillo NL, Pace KE, Seilhamer JJ, Baum LG. Apoptosis of T cells mediated by galectin-1. Nature. 1995 Dec 14;378(6558):736-9. Perillo NL, Uittenbogaart CH, Nguyen JT, Baum LG. Galectin-1, an endogenous lectin produced by thymic epithelial cells, induces apoptosis of human thymocytes. J Exp Med. 1997 May 19; 185(10):1851-8. Perone MJ, Bertera S, Shufesky WJ, Divito SJ, Montecalvo A, Mathers AR, Larregina AT, Pang M, Seth N, Wucherpfennig KW, Trucco M, Baum LG, Morelli AE. Suppression of autoimmune diabetes by soluble galectin-1. J Immunol. 2009; 182: 2641-53. 291 [Document text truncated for crawler view.]