Estudio de la fauna silvestre como reservorio de cepas de Escherichia coli productoras de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) y del grupo clonal pandémico ST131 en el noroeste de España

TESIS DOCTORAL Estudio de la fauna silvestre como reservorio de cepas de Escherichia coli productoras de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) y del grupo clonal pandémico ST131 en el noroeste de España Susana Viso González DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOXÍA Y PARASITOLOXÍA. FACULTADE DE VETERINARIA. Lugo, 2017 AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR DE LA TESIS Dña. Azucena Mora Gutiérrez Profesor Contratado Doctor del Departamento de Microbioloxía e Parasitoloxía de la USC. Como Directora de la Tesis Doctoral titulada “ESTUDIO DE LA FAUNA SILVESTRE COMO RESERVORIO DE CEPAS DE ESCHERICHIA COLI PRODUCTORAS DE BETALACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO (BLEE) Y DEL GRUPO CLONAL PANDÉMICO ST131 EN EL NOROESTE DE ESPAÑA” Presentada por Dña. SUSANA VISO GONZÁLEZ Alumna del Programa de Doctorado: Microbioloxía e Parasitoloxía. Autoriza la presentación de la tesis indicada, considerando que reúne los requisitos exigidos en el artículo 34 del Reglamento de Estudios de Doctorado, y que como Director de la misma no incurre en las causas de abstención establecidas en la Ley 40/2015. Documento asinado dixitalmente e accesible en:/Documento firmado digitalmente y accesible en:/Digitally signed document with accessibility at: https://sede.usc.es/csv/116D-33E1-4B58-80A6 Ver detalle da sinatura na derradeira páxina/Ver detalle de la firma en la última página/See detail of the signature on the last page CSV: 116D-33E1-4B58-80A6 1 / 2 1 / 2 Sinatura dixital / Firma digital / Digital signature Asinante/Firmante/Signer: AZUCENA DEL CARMEN MORA GUTIÉRREZ, NIF 32801273F, 22/02/2017 12:27:59. CSV: 116D-33E1-4B58-80A6 Documento asinado dixitalmente e accesible en:/Documento firmado digitalmente y accesible en:/Digitally signed document with accessibility at: https://sede.usc.es/csv/116D-33E1-4B58-80A6 Ver detalle da sinatura na derradeira páxina/Ver detalle de la firma en la última página/See detail of the signature on the last page CSV: 116D-33E1-4B58-80A6 2 / 2 El presente estudio ha sido financiado por: El proyecto nacional AGL2013-47852-R (Ministerio de Economía y Competitividad, Gobierno de España), los proyectos autonómicos EM2014/001 y 10MRU261023PR, y el programa de Consolidación y Estructuración de Unidades de Investigación Competitivas CN2012/303 (Consellería de Economía e Industria; Consellería de Cultura, Educación e Ordenación Universitaria, Xunta de Galicia; Fondo Europeo para el Desarrollo Regional). II 3.4.2. Secuenciación ................................................................................................. 117 3.5. IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA ................................................... 117 3.5.1. Identificación y sensibilidad antimicrobiana ................................................ 118 3.5.1.1. Prueba de sinergia de doble disco ....................................................................... 119 3.5.1.2. Prueba de discos combinados con inhibidor ...................................................... 121 3.5.2. Serotipado ....................................................................................................... 122 3.5.2.1. Determinación del antígeno O ............................................................................ 122 3.5.2.2. Determinación del antígeno H ........................................................................... 125 3.6. TIPADO MOLECULAR................................................................................................ 127 3.6.1. Clonotipado .....................................................................................................128 3.6.2. Tipado mediante secuenciación multilocus .................................................128 3.6.3. Análisis de las relaciones genéticas mediante el algoritmo eBURST ..........129 3.6.4. Electroforesis en campo pulsado ...................................................................130 3.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO .............................................................................................. 135 4.1. AISLAMIENTO EN MEDIOS SELECTIVOS ..................................................................... 139 4.1.1. Medio chromIDTM ESBL de bioMérieux .......................................................139 4.1.2. Medio MacConkey Lactosa ........................................................................... 140 4.1.3. Análisis comparativo de los medios selectivos.............................................. 141 4.2. ESCHERICHIA COLI PRODUCTORAS DE BLEE Y OTRAS BETALACTAMASAS ................. 143 4.2.1. Prevalencia y tipos .......................................................................................... 143 4.2.2. Caracterización de las cepas BLEE ............................................................... 154 4.2.2.1. Tipado de BLEE y otras betalactamasas ............................................................. 154 4.2.2.2. Detección del gen mcr-1 y WGS ......................................................................... 165 4.2.2.3. Genes de virulencia ............................................................................................. 170 4.2.2.4. Filogrupos: esquema ampliado de Clermont .................................................... 174 4.2.2.5. Serotipos ............................................................................................................... 180 4.2.2.6. Patrones de resistencia ....................................................................................... 184 4.2.2.7. Secuencias Tipo ................................................................................................... 197 4.2.2.8. Clonotipos ........................................................................................................... 203 4.2.2.9. Tipado mediante PFGE ....................................................................................... 212 4.3. GRUPO CLONAL ST131 .............................................................................................. 221 4.3.1. Detección y prevalencia .................................................................................. 221 4.3.2. Caracterización de las cepas del grupo clonal ST131 ................................... 222 4.3.2.1. Genes de virulencia y virotipos .......................................................................... 222 4.3.2.2. Patrones de resistencia ....................................................................................... 224 4. Resultados y Discusión Í n d i c e III 4.3.2.3. Secuencias Tipo y Clonotipos............................................................................. 225 4.3.2.4. Tipado mediante PFGE ....................................................................................... 227 4.3.2.5. Análisis comparativo del grupo clonal ST131 con cepas de otros orígenes .... 227 4.4. ANÁLISIS POBLACIONAL: ALGORITMO EBURST ...................................................... 236 5.1. CONCLUSIONES DEL ESTUDIO .................................................................................. 255 6.1. BIBLIOGRAFÍA EMPLEADA ........................................................................................ 259 5. Conclusiones 6. Bibliografía IV ÍNDICE DE ACRÓNIMOS Y TÉRMINOS A/E: del inglés “attaching and effacing” AA: autoaglutinante AC: Àcido Clavulánico ADN: Ácido desoxirribonucleico AMC: amoxicilina/clavulánico AMP: ampicilina APEC: del inglés “Avian Pathogenic Escherichia coli” ARN: Ácido ribonucleico ATM: aztreonam ATP: Adenosin trifosfato AVI: agentes antimicrobianos veterinarios de importancia AVIC: agentes antimicrobianos veterinarios de importancia crítica AVMA: del inglés “American Veterinary and Medical Association” AVMI: agentes antimicrobianos veterinarios de importancia elevada BLEE: betalactamasas de espectro extendido BSA: del inglés “Bovine Serum Albumin” BURST: del inglés “Based Upon Related Sequence Types” CAZ: ceftazidima CC. AA.: Comunidades Autónomas CC: Complejos Clonales CEF: cefalotina CFZ: cefazolina CGA: del inglés “Clonal Group A” cgMLST: del inglés “Core Genome Multilocus Sequence Typing” CH: Colitis Hemorrágica/clonotipado CIP: ciprofloxacina CLSI: del inglés “Clinical and Laboratory Standards Institute” Í n d i c e V CMI: Concentración Mínima Inhibitoria CMT: del inglés “Complex Mutant TEM” COL: colistina CRFS: Centro de Recuperación de Fauna Silvestre CSB: del inglés “Cell Suspension Buffer” CTX: cefotaxima CXM: cefuroxima DDST: del inglés “Double Disc Synergy Test” DHFR: dihidrofolato-reductasa DLV: double locus variant EAST: del inglés “enteroaggregative E. coli heat-stable enterotoxin” EC: Enfermedad de Crohn ECAD: Escherichia coli con adherencia difusa ECAI: Escherichia coli adherente-invasivo ECD: Escherichia coli diarreagénico ECEA: Escherichia coli enteroagregativo ECEH: Escherichia coli enterohemorrágico. ECEI: Escherichia coli enteroinvasivo ECEP: Escherichia coli enteropatógenos ECET: Escherichia coli enterotoxigénico ECVT: Escherichia coli verotoxigénicos EDTA: ácido etilendiaminotetraacético EE. UU: Estados Unidos EFSA: del inglés “European Food Safety Authority” ELISA: del ingés “enzyme-linked immunosorbent assay” ESBL: del inglés “Extended Spectrum Beta Lactamases” ETP: ertapenem EU-RL: del inglés “European Union Reference Laboratory” VI ExPEC: del inglés “Extraintestinal Escherichia coli” FEP: cefepima FGa: filogrupo esquema ampliado FGC: Federación Galega de Caza FGr: filogrupo esquema reducido FOF: fosfomicina FOX: cefoxitina FQ: Fluoroquinolonas FV: Factor de Virulencia GEN: gentamicina GTAs: del inglés “Gene Transfer Agents” HNM: antígeno H No Móvil HNT: antígeno H No Tipable HULA: Hospital Universitario Lucus Augusti IA: Influenza Aviar IAAP: Influenza Aviar Altamente Patógena IABP: Influenza Aviar de Baja Patogenicidad INE: Instituto Nacional de Estadística IPM: imipenem IS: del inglés “Insertion Sequence” ITU: Infección del Tracto Urinario LN: linfonodos LREC: Laboratorio de Referencia de Escherichia coli LT: del inglés “Heat-labile enterotoxin” MAGRAMA: Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente MBL: metalobetalactamasas MDR: del inglés “multidrug-resistant” MH: agar Mueller-Hinton Í n d i c e VII ML: agar MacConkey Lactosa MLEE: del inglés “Multilocus enzyme electrophoresis” MLST: del inglés “Multi Locus Sequence Typing” MSSSI: Ministerio de Sanidad, Servicios Sociales e Igualdad NAL: ácido nalidíxico NIT: nitrofurantoina NMEC: del inglés “Neonatal Meningitis Escherichia coli” NOR: norfloxacina OIE: Organización Mundial de Sanidad Animal OMS/WHO: Organización Mundial de la Salud / World Health Organization ONT: antígeno O No Tipable p.e.: por ejemplo PAI: del inglés “pathogenicity island” pb: pares de bases PBPs: del inglés “Penicillin-Binding Proteins” PCR: del inglés “Polymerase Chain Reaction” PDR: del inglés “pandrug resistant” PFGE: del inglés “Pulsed Field Gel Electrophoresis” PNVFS: Plan Nacional de Vigilancia de Fauna Silvestre RD: Real Decreto rpm: revoluciones por minuto SACRE: programa de seguimiento de aves comunes reproductoras SARS: del inglés “Severe Acute Respiratory Syndrome” SEIMC: Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica SEO: Sociedad Española de Ornitología SEPEC: del inglés “sepsis Escherichia coli” SLV: del inglés “Single Locus Variant” SNP: del inglés “Single Nucleotide Polymorphism” VIII Sp: especie Spp: especies ST Cplx: Complejos de secuencia tipo ST: del inglés “Heat-stable enterotoxin” / secuencia tipo Stx: shigatoxinas SUH: Síndrome Urémico Hemolítico TAE: buffer Tris-Acetato sódico-EDTA TBE: buffer Tris-Borato-EDTA TE: buffer Tris-EDTA TGH: Transmisión Genética Horizontal TMP-SMZ: Trimetoprim-sulfametoxazol TOB: tobramicina TSA: agar triptona de soja TSB: caldo de triptona de soja TZB: Tazobactam UPEC: del inglés “uropathogenic Escherichia coli” UPGMA: del inglés “Unweighted Pair Group Method using Arithmetic averages” USA: del inglés “United States of America” v/v: volumen/volumen VNO: Virus del Nilo Occidental VT: Verotoxinas WGS: del inglés “Whole genome sequencing” XDR: del inglés “extreme drug resistant” Í n d i c e IX RESUMEN Desde la década de los 80, las cefalosporinas de espectro extendido se han estado utilizando para tratar una amplia variedad de infecciones causadas por bacterias Gram negativas. Es a partir del año 2000 cuando comienza a producirse un rápido incremento de resistencia a las mismas, debido a la diseminación de enzimas de tipo CTX-M, que actualmente son las betalactamasas de espectro extendido (BLEE) más frecuentes en todo el mundo. La presencia de cepas de Escherichia coli portadoras de BLEE de orígenes distintos al humano, incluidos animales de compañía y de producción, está ampliamente descrita, pero, aunque numerosos trabajos sugieren el potencial zoonósico de las cepas de E. coli BLEE de origen animal para causar infecciones humanas, aún no ha sido firmemente confirmado o refutado. La elevada prevalencia y diversidad de genes BLEE presentes en las cepas aisladas de los animales, hace que éstos tengan el potencial de actuar como reservorio para los seres humanos, bien por transmisión directa de cepas, o bien sirviendo como donantes de plásmidos portadores de genes BLEE a través de transmisión horizontal. Los animales silvestres, sin entrar directamente en contacto con los antibióticos, se ven afectados por su uso en la medicina humana y veterinaria. Su proximidad a los seres humanos y a los animales domésticos juega un papel importante en el intercambio de patógenos, creándose un reservorio ambiental adicional de bacterias resistentes a los antibióticos. En el presente estudio nos planteamos i) conocer si los animales silvestres de nuestro entorno geográfico son portadores de cepas de E. coli MDR, productoras de BLEE y/o del grupo clonal pandémico ST131; ii) identificar la posible fuente de adquisición de este tipo de cepas por parte de la fauna silvestre; iii) conocer el potencial X zoonósico de las cepas aisladas, mediante el análisis de su grado de clonalidad con respecto a aislamientos de origen clínico humano. De acuerdo con los resultados obtenidos, confirmamos la presencia generalizada de portadores de cepas de E. coli productoras de BLEE y MDR en los animales silvestres del noroeste español, aisladas de los 7 grupos muestreados. Los tipos BLEE determinados sugieren que sería el origen animal la fuente principal de adquisición de este tipo de genes por parte de la fauna silvestre, salvo en el caso específico de blaCTX-M-15, con un probable origen humano. Asimismo, los resultados de la combinación de los 8 loci de los esquemas de MLST y clonotipado sugieren el origen animal de la mayoría de las cepas de E. coli BLEE presentes en la fauna silvestre. No obstante, se demuestra la presencia de determinados subgrupos que podrían estar circulando bidireccionalmente, como serían ST10-A-CH11-54, ST88-C-CH4-39, ST156-B1-CH29-38, ST410-C-CH4-24 y ST602B1-CH19-86. Hemos detectado la presencia del grupo clonal pandémico ST131 en aves y mamíferos silvestres, y aunque las cepas aisladas no fueron BLEE ni pertenecían al clado C, implicado en la rápida expansión y diseminación global de aislamientos MDR/portadores de CTX-M-15, demostramos la alta similitud entre cepas aisladas de jabalíes y cepas de origen clínico humano del clado B, virotipo D. Por último, cabe destacar que una de las cepas BLEE aislada de un zorro resultó ser portadora del gen plasmídico mcr-1 para la resistencia a la colistina. Según nuestros datos, se trata del primer aislamiento de E. coli de estas características en mamíferos silvestres, y específicamente en zorro, a nivel mundial. En resumen, en este estudio hemos demostrado la presencia generalizada en la fauna silvestre del noroeste español de una población altamente diversa de cepas de E. coli productoras de BLEE, incluidos grupos clonales MDR de gran importancia clínica Í n d i c e XI como son ST10, ST117, ST131, ST155, ST354 o ST410. Además, hemos detectado una alta similitud entre aislamientos humanos y silvestres de grupos específicos, lo que da idea de la complejidad escasamente explorada de las rutas de transmisión. Los animales silvestres, especialmente las aves (migratorias o no), pueden desempeñar un importante papel en la circulación de clones epidemiológicamente importantes de E. coli, lo que supone un importante riesgo de contaminación ambiental. En el futuro, sería interesante investigar a fondo la relación de los aislamientos de E. coli de animales silvestre y aquellos de otros orígenes que compartieron ST y alta similitud, mediante WGS; así como los mecanismos mediante los cuales ciertos plásmidos parecen estar asociados a múltiples hospedadores, mientras que otros parecen aparentemente restringidos a un tipo específico. PALABRAS CLAVE: Escherichia coli, Betalactamasas de espectro extendido (BLEE), ST131, Fauna silvestre. I n t r o d u c c i ó n 21 1.1. El papel de la fauna silvestre en el mantenimiento y transmisión de agentes zoonósicos El artículo 3.5 de la Ley 8/2003 del 24 de abril de sanidad animal, define a la fauna silvestre como “el conjunto de especies, subespecies, población e individuos animales que viven y se reproducen de forma natural en estado silvestre en el territorio nacional, incluidos los que se encuentran en invernada o están de paso, con independencia de su carácter autóctono o alóctono, y de la posibilidad de su aprovechamiento cinegético”. La fauna silvestre es, por tanto, un conjunto muy heterogéneo que incluye, además de las especies autóctonas, animales asilvestrados y animales exóticos. En el noroeste español, el sistema agrario, de base predominantemente ganadera, se organiza sobre extensas superficies de prados minifundistas que ocupan buena parte del territorio de Galicia y Asturias, donde las zonas arboladas, tanto naturales como de repoblación, ocupan también grandes extensiones hasta hacerse dominantes en las sierras y macizos (Instituto Geográfico Nacional. http://www.ign.es/ign/main/index.do). Ambas comunidades cuentan con una superficie total estimada de 4.017.659 ha, de las cuales cerca del 40% se dedica a la actividad agroganadera y en torno al 50% constituye las zonas forestales (Pereira et al. 2007; INE, 2009). Dado que la abundancia de fauna silvestre en un territorio está condicionada en gran medida por la disponibilidad de recursos tróficos, agua y cobijo, las características que se dan en nuestra región (climas suaves, abundancia de vegetación, distribución del terreno mixta o en mosaico, proximidad de zonas urbanas a zonas 22 agroganaderas…) favorecen en gran medida, no solo la existencia de una amplia comunidad de animales silvestres, sino también la interacción de los mismos con el ser humano, ya sea de manera directa (caza) o indirecta (contacto de los animales silvestres con zonas de actividad ganadera, pastos o vertederos). Al igual que ha sucedido en otras partes del mundo, en las últimas décadas se ha producido un fenómeno de sinantropización de los ecosistemas en contacto con actividades humanas, afectando tanto a la vegetación como la fauna circundante. Factores como el abandono de las zonas de cultivo o el crecimiento paralelo de las zonas periurbanas, han favorecido la adaptación de los animales a la actividad humana, traduciéndose en un incremento de población de determinadas especies de fauna silvestre. De hecho, la alimentación artificial, bien sea directa a través del contacto con zonas de producción animal, o indirecta, a través de basureros o zonas de residuos no controladas, se perfila como una de las principales razones de esta adaptación y del consecuente incremento de dichas poblaciones (Cahill et al. 2012; Navarro-González et al. 2013). Concretamente, las poblaciones de zorros (Vulpes vulpes) en España, al igual que en otras partes de Europa, han experimentado un crecimiento tal en las últimas décadas que se ha producido su expansión por casi toda la Península Ibérica, invadiendo asentamientos humanos tanto en zonas rurales como urbanas (Deplazes et al. 2004). Un crecimiento demográfico similar está ocurriendo con los ciervos (Capreolus capreolus) y los jabalíes (Sus scrofa) en diversas áreas geográficas (Ruiz-Fons, 2017). En el caso de las aves silvestres de nuestro país, los resultados del Programa de Seguimiento de Aves Comunes Reproductoras (SACRE), realizado cada primavera por la Sociedad Española de Ornitología (SEO)/BirdLife, muestran una tendencia de mantenimiento o I n t r o d u c c i ó n 23 incremento de la mayoría de las especies reproductoras (125 de 179) (www.mapama.gob.es/es/biodiversidad). 1.1.1. Principales zoonosis transmitidas por la fauna silvestre Durante las últimas décadas ha tenido lugar la emergencia y reemergencia de un gran número de enfermedades infecciosas en humanos, favorecidas por cambios ecológicos que han implicado un mayor contacto con la fauna silvestre. Estos cambios incluyen: el crecimiento exponencial de las poblaciones humanas y de animales de producción, la rápida instauración de nuevas zonas periurbanas, los cambios en los sistemas de agricultura y ganadería y la globalización del transporte de animales y sus subproductos (Calistri et al. 2013). Dado el aumento en las interacciones con el medio silvestre, existe un mayor riesgo de transmisión de agentes infecciosos entre las distintas poblaciones. Se estima que, de todos los organismos capaces de causar infección en el ser humano (incluyendo virus, priones, bacterias, hongos, protozoos y helmintos), el 61% son de carácter zoonósico, es decir, pueden ser trasmitidos de los animales al hombre y viceversa de una forma directa o indirecta (Daszak et al. 2000; Cleaveland et al. 2001; Taylor et al. 2001). Cerca del 70% de las patologías emergentes (como la influenza aviar, el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), el virus del Nilo occidental o la encefalopatía espongiforme bovina) y reemergentes (como la rabia, el ántrax, la brucelosis y la tuberculosis) están catalogadas como enfermedades zoonósicas (Coker et al. 2011). Dadas las múltiples variables implicadas en el estudio del origen, mantenimiento y transmisión de las patologías zoonósicas, se crea 24 el concepto “OneWorld-OneHealth”. La AVMA (American Veterinary and Medical Association) describe este término en el año 2008 como “los esfuerzos colaborativos de múltiples disciplinas que trabajan local, nacional y globalmente para atender la óptima salud de las personas, animales y el medio” con el objetivo de dar a entender que, la interacción entre hombres, animales de producción o silvestres, y patógenos que comparten un mismo hábitat deben entenderse como un único sistema. En España, el Real Decreto (RD) 1940/2004 del 27 de septiembre, sobre la vigilancia de las zoonosis y los agentes zoonósicos, asegura la adecuada vigilancia de las zoonosis, los agentes zoonósicos y la resistencia a los antimicrobianos asociada, así como la debida investigación epidemiológica de los brotes de zoonosis en nuestro país. De acuerdo con este RD, “serán objeto de esta vigilancia las zoonosis y los agentes zoonósicos enumerados en la parte A del anexo I” (brucelosis y sus agentes causales, campilobacteriosis y sus agentes causales, equinococosis y sus agentes causales, listeriosis y sus agentes causales, salmonelosis y sus agentes causales, triquinosis y sus agentes causales, tuberculosis por Mycobacterium bovis y Escherichia coli verotoxigénica). Además, cuando la situación epidemiológica lo justifique, también se someterán a vigilancia las zoonosis y los agentes zoonósicos enumerados en la parte B del mismo anexo. Asimismo, el RD 526/2014, del 20 de junio, por el que se establece la lista de las enfermedades de los animales de declaración obligatoria y se regula su notificación, tiene por objeto la determinación de las enfermedades de los animales sujetas a declaración obligatoria en el ámbito de España, de la Unión Europea y de la Organización Mundial de Sanidad Animal, así como los I n t r o d u c c i ó n 25 requisitos para su notificación; muchas de las enfermedades recogidas en este RD son también zoonosis. Las enfermedades zoonósicas de la fauna silvestre comprometen la producción cinegética y alteran la conservación de los propios ecosistemas, además, son de una gran relevancia para la actividad ganadera y para la propia sanidad humana, al tratarse de patologías comúnmente compartidas con animales de producción y de compañía, pudiendo ser trasmitidas de forma directa o indirecta al hombre. Las principales enfermedades zoonósicas padecidas por la fauna silvestre europea se recogen en la Tabla 1. TABLA 1. PRINCIPALES PATÓGENOS DE CARÁCTER ZOONÓSICO PRESENTES EN FAUNA SILVESTRE EUROPEA PATÓGENO HOSPEDADOR SILVESTRE PRINCIPAL Víricos Influenza Aviar aves acuáticas Lyssavirus (virus de la rabia) zorro, mapache West Nile rapaces, córvidos, galliformes Louping ill (virus de la encefalomielitis) galliformes Tick-borne (virus de la encefalitis centroeuropea) pequeños mamíferos Hantavirus topillo y otros roedores Hepatitis E jabalí Borna amplio rango de hospedadores Sindbis aves migratorias Bacterianos y Fúngicos Mycobacterium bovis jabalí, ciervo, tejón M. avium paratuberculosis ciervos, conejos M. phocicerebrale focas Yersinia spp. roedores, lagomorfos Yersinia pestis roedores Francisella tularemis roedores, lagomorfos Pasteurella spp. lagomorfos Brucella spp. jabalí, rumiantes, liebres Chlamydia/Chlamydophila spp. palomas y otras especies aviares Borrelia sp. amplio rango de hospedadores Anaplasma amplio rango de hospedadores E. coli amplio rango de hospedadores Salmonella spp. amplio rango de hospedadores Campylobacter spp. paseriformes Leptospira spp. amplio rango de hospedadores Coxiella burnettii ungulados, roedores Listeria spp. amplio rango de hospedadores Staphylococcus spp. amplio rango de hospedadores Streptococcus spp. amplio rango de hospedadores Erysipelothrix rhusiopathiae (mal rojo) jabalí Trichophyton mentagrophytes (tiña) erizo Parasitarios Sarcocystis ungulados, roedores, aves Echinococcus multilocuraris carnívoros, ungulados 26 PATÓGENO HOSPEDADOR SILVESTRE PRINCIPAL Toxoplasma gondii amplio rango de hospedadores Trichinella britovi jabalí, zorro, comadrejas Trichinella nativa mustélidos, focas Giardia lamblia amplio rango de hospedadores Taenia hydatigena carnívoros (herbívoros hospedadores intermediarios) Taenia multiceps carnívoros (herbívoros hospedadores intermediarios) Por todo ello, el estudio de la fauna silvestre como portadora y reservorio de agentes zoonósicos se ha convertido, en los últimos años, en un tema de creciente importancia. Se puede hablar de un punto de inflexión en esta materia con la reemergencia, en el año 2003, de la influenza aviar altamente patógena (IAAP) por el virus H5N1. El virus H5N1 se detectó por primera vez en 1996 en gansos en China, y en 1997 en seres humanos, en el discurso de un brote originado en aves de corral en Hong Kong; desde entonces, este subtipo se ha detectado en aves de corral y aves silvestres en más de 50 países de África, Asia, Europa y Oriente Medio. Además, desde su reaparición generalizada en 2003, las infecciones esporádicas y poco comunes por este virus en seres humanos, comenzaron a detectarse en Asia y posteriormente en África, Europa y Oriente Medio (http://espanol.cdc.gov/enes/flu/avianflu/h5n1virus.htm). Según la última actualización de la Organización Mundial de la Salud (OMS/WHO), publicada el 19 de julio de 2016, esta zoonosis ha dejado, desde el inicio del brote en el año 2003 hasta la actualidad, un total de 854 personas afectadas por el virus H5N1 de 16 países diferentes, incluyendo 450 casos con un desenlace mortal. En España, la IA y otras zoonosis están contempladas en el Plan Nacional de Vigilancia de Fauna Silvestre (PNVFS) del Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente (MAGRAMA), con el objetivo de conocer la situación sanitaria particular de la fauna silvestre, además de prevenir y proteger la Salud Pública. Las I n t r o d u c c i ó n 27 especies clave y las principales enfermedades objeto de vigilancia en España se listan en la Tabla 2. TABLA 2. PRINCIPALES ENFERMEDADES OBJETO DE VIGILANCIA EN LOS DISTINTOS GRUPOS DE ANIMALES SILVESTRES EN ESPAÑA (ADAPTADO DEL PNVFS, MAGRAMA) GRUPO TAXONÓMICO ENFERMEDAD PROGRAMA MUESTRAS ANÁLISIS OBSERVACIONES Aves (principalmente acuáticas, pero también galliformes, columbiformes…) Influenza aviar* Dependiente del MAGRAMA Para monitorización de IABP (por su interés para IAAP) hisopos cloacales o heces frescas y sueros. Para IAAP: Hisopos orofaringe, suero PCR, ELISA de competición Fiebre del Nilo Occidental* Dependiente del MAGRAMA Hisopos de orofaringe, suero PCR, ELISA Lagomorfos Mixomatosis PVFS Tumores PCR Vigilancia pasiva Enfermedad Vírica Hemorrágica PVFS Hígado PCR, ELISA de antígeno Vigilancia pasiva Tularemia PVFS Bazo, suero Cultivo o PCR, aglutinación Jabalí y cerdo asilvestrado Peste porcina clásica* Dependiente del MAGRAMA Tejido linfoide. Suero PCR. ELISA Peste porcina africana Propio dependiente del MAGRAMA Tejido linfoide. Suero PCR. ELISA Enfermedad de Aujeszky* Propio dependiente del MAGRAMA Tejido linfoide. Suero PCR. ELISA Enfermedad Vesicular Porcina* Propio dependiente del MAGRAMA Tejido vesículas. Suero PCR. ELISA Tuberculosis bovina PVFS Linfonódulos mandibulares, suero Cultivo, PCR, examen de lesiones, ELISA Confirmación inspecciones/ cultivo/PCR Brucelosis (B. suis) PVFS Linfonódulos inguinales, bazo, suero Rosa de Bengala en suero, ELISA Confirmación positiva por cultivo/PCR Triquinelosis* Dependiente del MSSSI 34 1.1.2. Presencia de cepas resistentes a antibióticos en fauna silvestre La presencia de resistencias antimicrobianas y de sus correspondientes determinantes genéticos en el medio es consecuencia de un proceso natural, resultante de la adaptación de los microorganismos comensales a un determinado nicho ecológico (D´costa et al. 2011; Forsberg et al. 2014). Algunos de los genes que confieren resistencia a los antibióticos parecen tener otros roles primarios en el medio, como en el caso de algunos tipos de bombas de expulsión que movilizan elementos dañinos (como metales pesados) al exterior de la célula, funcionando también en la expulsión de distintos antibióticos y moléculas tóxicas para la bacteria. Sin embargo, desde el comienzo de la era antibiótica hace unos 65 años, se ha detectado un incremento de la presencia de resistencias no intrínsecas en bacterias de naturaleza patógena, lo que sugiere una correlación entre su aparición y el aumento de la presión selectiva que ejerce el uso de estos antibióticos (Allen et al. 2010). Uno de los ejemplos más conocidos y estudiados es el aumento, especialmente durante la última década, de los patógenos multirresistentes como las bacterias Gram negativas productoras de BLEE. En particular E. coli, detectada sobre todo en aislamientos clínicos humanos, pero también en muestras procedentes de ganadería y de animales de compañía y silvestres (Guenther et al. 2011). Este alarmante incremento de la resistencia bacteriana a los antibióticos es actualmente uno de los mayores problemas en materia de Salud Pública, ya que estos compuestos constituyen una I n t r o d u c c i ó n 35 de las principales herramientas para controlar y tratar las infecciones bacterianas, tanto en medicina humana como en veterinaria (WHO, 2014). Las infecciones causadas por microorganismos resistentes están asociadas directamente con el aumento de la tasa de mortalidad debido al fracaso terapéutico, estancias más prolongadas en los hospitales y con el consecuente aumento de los costes sanitarios (Kraker et al. 2011). Los investigadores, sociedades científicas y autoridades sanitarias han alertado sobre las graves consecuencias de este problema y han coincidido en la necesidad de analizar en profundidad el fenómeno de la resistencia. Ya en el año 2001, la OMS apuntaba hacia el aspecto global de la resistencia a los antimicrobianos, definiéndolo como un problema complejo, impulsado por múltiples factores y que exigía la búsqueda de respuestas multisectoriales (WHO, 2001). El papel de la fauna silvestre en la ecología de dichas resistencias ha pasado desapercibido hasta fechas recientes (Greig et al. 2015; Huijbers et al. 2015). Pese a que la fauna silvestre no se encuentra normalmente expuesta a los agentes antimicrobianos utilizados en clínica humana o veterinaria, puede adquirir diversos microorganismos portadores de resistencias antibióticas a través del contacto con los seres humanos, animales de producción y medio ambiente. En el caso de la fauna silvestre, el estudio de la evolución de las resistencias se vuelve más complejo, ya que las vías de adquisición y dispersión de los antibióticos y las de los propios microorganismos resistentes, configuran un intrincado entramado (Figura 1) que conecta directa e indirectamente a las comunidades humanas, hospitales, plantas de tratamiento de agua, granjas y vida silvestre (Woerther et al. 2013; Arnold et al. 2016), siendo el agua contaminada con heces el vehículo de transmisión más probable para dicha adquisición (Xi et al. 2009; Huijbers et al. 2015). 36 FIGURA 1. DISPERSIÓN DE LAS RESISTENCIAS ANTIMICROBIANAS EN EL ENTORNO (FUENTE: WOERTHER ET AL. 2013) Las consecuencias de la presencia e incremento de cepas resistentes a los antibióticos para la fauna silvestre son probablemente escasas, ya que no se trata de una enfermedad propiamente dicha, y no está comprobado que reduzca la supervivencia de estos animales. Además, el tratamiento de patologías con antibióticos resulta un hecho infrecuente y aislado en este tipo de poblaciones. Sin embargo, el primer problema que plantea la presencia de organismos resistentes en fauna silvestre es la posibilidad de que estos animales actúen a modo de reservorio o potencial fuente de infección, tanto para los seres humanos como para los animales de producción, sobre todo teniendo en cuenta que, aproximadamente un 40% de las enfermedades emergentes en humanos parecen estar originadas en el medio silvestre (Jones et al. 2008). En segundo lugar, la fauna silvestre puede servir como un I n t r o d u c c i ó n 37 crisol de nuevas cepas resistentes ya que, al estar sus determinantes genéticos principalmente localizados en elementos móviles, pueden producirse nuevas combinaciones entre diversas cepas de la misma o distinta especie (Alekshun & Levy, 2007). En tercer lugar, existe el riesgo de una diseminación de las resistencias a largas distancias, debido a los comportamientos migratorios de muchas especies (aves en su mayoría) (Báez et al. 2015; Saviolli et al. 2016). De acuerdo con distintos estudios, en la microbiota de los animales silvestres están presentes bacterias con niveles de resistencia antibiótica relacionados con los ecosistemas de las especies estudiadas. El primer caso documentado de resistencias en fauna silvestre, fue en cepas de E. coli y Enterococcus spp. detectadas en aves silvestres japonesas (Sato et al. 1978). Con el nuevo milenio, varios estudios en diferentes continentes, han descrito el aumento progresivo de resistencias en estas especies bacterianas aisladas de animales silvestres (Souza et al. 1999; Sherley et al. 2000; Lillehaug et al. 2005; Skurnik et al. 2006; Dolejska et al. 2007; Gaukler et al. 2009; Schierack et al. 2009; Allen et al. 2010; Silva et al. 2011; Marinho et al. 2013; Navarro-González et al. 2013; Pesapane et al. 2013; Santos et al. 2013). Asimismo, se han detectado resistencias en otros patógenos importantes como Salmonella spp. (Botti et al. 2013) y Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (Porrero et al. 2013). Pese a que son varios los microorganismos implicados en la transmisión de las resistencias antibióticas, la detección de cepas de E. coli productoras de BLEE resulta clave a la hora de estudiar la evolución de la multirresistencia en el medio natural, y plantear un programa de vigilancia de emergencia de patógenos 38 multirresistentes, teniendo en cuenta que este grupo reune una serie de características fundamentales para dichos estudios: o Se encuentran distribuidas globalmente, formando parte de la microbiota normal del tracto gastrointestinal de aves y mamíferos y también están presentes en el medio natural. Algunas cepas tienen, además, la capacidad de actuar como patógenas interespecíficas (Mora et al. 2012b). o Pueden mantenerse y diseminarse en diferentes ecosistemas a través del medio acuático (Franz et al. 2015; Calero-Cáceres & Muniesa, 2016; Zanotto et al. 2016). o Están implicadas habitualmente en infecciones (humanas y animales) que requieren tratamientos antibióticos, por lo que se encuentran expuestas a la presión selectiva que ejerce su uso sobre las cepas resistentes (Martelius et al. 2016). Aunque la publicación de datos de detección de E. coli BLEE en fauna silvestre es un hecho relativamente reciente (Costa et al. 2006), el número de estudios, así como las especies y hábitats investigados, se ha ido incrementando. El conjunto de estos estudios revela que la presencia de cepas de E. coli productoras de BLEE en la microbiota comensal supone un importante porcentaje en algunas de las poblaciones estudiadas, en especial en el caso de gaviotas y aves de presa (Poeta et al. 2008; Bonnedahl et al. 2009; Pinto et al. 2010; Radhouani et al. 2010; Simões et al. 2010; Ho et al. 2011). Incluso se ha detectado su presencia en animales de ecosistemas remotos y en áreas con especies preservadas del contacto con el ser humano (Radhouani et al. 2009; Hernández et al. 2010; Pinto et al. 2010; Guenther et al. 2012; Gonçalves et al. 2013), aunque sí parece existir una buena correlación entre el tipo de enzimas de I n t r o d u c c i ó n 39 resistencia detectadas en fauna silvestre y los aislamientos clínicos de la región estudiada (Pitout, 2010; Smet et al. 2010). Todo parece indicar que la fauna silvestre constituye un buen grupo centinela del estatus sanitario de un ecosistema y que podría ejercer como reservorio de cepas multirresistentes potencialmente patógenas para el hombre y para los animales de producción. Teniendo en cuenta el escaso conocimiento de las diversas rutas de transmisión implicadas y la poca uniformidad entre el tipo y número de especies estudiadas, este tipo de investigaciones son fundamentales para poder determinar el potencial zoonósico real de estas especies. 1.2. Antibióticos y mecanismos bacterianos de resistencias Un antibiótico se define como una molécula de origen natural (producida por un organismo vivo), sintética o semisintética, con la propiedad de inducir la muerte (antibiótico bactericida) o la inhibición del crecimiento (antibiótico bacteriostático) de ciertos microorganismos. El descubrimiento por parte del científico Alexander Fleming de los efectos que ejercía una sustancia producida por Penicillium notatum (a la que denominó penicilina) sobre S. aureus en 1929, estableció el inicio de la antibioterapia moderna. Desde entonces, han sido múltiples los descubrimientos y síntesis de moléculas con propiedades antimicrobianas que han dado lugar a numerosas familias y grupos con diferentes mecanismos de acción (Tabla 3). 40 Mecanismos de acción Los mecanismos mediante los cuales los agentes antibióticos inhiben el crecimiento o causan la muerte de las bacterias dependen de las dianas afectadas, tal y como se aprecia en la Tabla 3 y en la Figura 2 (McDermott et al. 2003; Calvo & Martínez, 2009). De forma esquemática, estos mecanismos de acción se basan en: o Inhibición de la biosíntesis de la pared bacteriana. o Alteración de la membrana citoplasmática. o Inhibición de la síntesis protéica en sus distintas fases. o Alteración del metabolismo del ADN o de su estructura. o Bloqueo de las vías metabólicas (en especial aquellas que utilizan para obtener elementos esenciales como los aminoácidos o las bases nitrogenadas). Mecanismos de resistencia En la Figura 2 se muestran los principales mecanismos de defensa desarrollados por las bacterias frente a la acción de los antimicrobianos (van Hoek et al. 2011), que podrían resumirse en: o Producción de enzimas capaces de modificar o inactivar el antimicrobiano. o Modificación de la diana celular. o Cambios en la permeabilidad de la membrana, restringiendo el acceso del antibiótico a la diana. o Expulsión activa del antibiótico. o Superproducción de la diana del antibiótico. I n t r o d u c c i ó n 41 TABLA 3. PRINCIPALES GRUPOS DE ANTIBIÓTICOS DE ACUERDO CON SU MECANISMO DE ACCIÓN MECANISMO DE ACCIÓN CLASIFICACIÓN ANTIBIÓTICOS Inhibición de la síntesis/ disrupción de la pared bacteriana Betalactámicos Penicilinas Naturales Penicilina G, penicilina V Aminopenicilinas Ampicilina, amoxicilina Carboxipenicilinas Ticarcilina, carbenicilina Ureidopenicilinas Piperaciclina, mezlocilina Cefalosporinas 1ª generación Cefalexina, cefalotina, cefazolina, cefapirina, cefadrina 2ª generación Cefaclor, cefuroxima, cefamandol Cefamicinas Cefoxitina, cefotetán 3ª generación Cefixima, cefotaxima, ceftriaxona, ceftazidima, cefpodoxima 4ª generación Cefepima, cefpiroma 5ª generación Ceftobiprol, ceftarolina Carbapenemas Imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem Monobactámicos Aztreonam Glucopéptidos Vancomicina Otros Polimixina B, polimixina E (colistina) Inhibición de la síntesis protéica en sus distintas fases Aminoglucósidos Amikacina, gentamicina, tobramicina, estreptomicina, neomicina Tetraciclinas Doxiciclina, tetraciclina, tigeciclina Macrólidos Eritromicina, azitromicina Lincosamidas Lincomicina, clindamicina Otros Cloranfenicol Alteración del metabolismo del ADN/ARN o de su estructura Quinolonas Ácido nalidíxico Fluoroquinolonas Ciprofloxacina, levofloxacina, norfloxacina, enrofloxacina Nitroimidazol Metronidazol Rifamicinas Rifampicina Bloqueo de vías metabólicas Sulfonamidas Sulfametoxazol Cotrimoxazol (Trimetroprim+Sulfametoxazol) Inhibidores DHFR* Trimetoprim Inhibidores de betalactamasas Sulbactam, tazobactam, ácido clavulánico, avibactam * dihidrofolato-reductasa 42 FIGURA 2. PRINCIPALES DIANAS DE ACCIÓN DE LOS ANTIMICROBIANOS Y MECANISMOS DE RESISTENCIA DESARROLLADOS POR LOS MICROORGANISMOS (FUENTE: WRIGHT, 2010) Estos mecanismos de resistencia pueden, a su vez, dividirse en dos grandes grupos según sean de origen natural o adquirido (AusinaRuiz & Moreno-Guillén, 2006). La resisitencia natural o intrínseca es propia de un determinado género o especie bacteriana y está asociada a una ruta de biosíntesis presente de forma natural en el microorganismo (como, por ejemplo, la resistencia de la mayoría de bacterias Gram negativas a la vancomicina). Por el contrario, se habla de resistencia adquirida cuando ésta solo aparece en ciertas bacterias de una especie, que es sensible de forma natural a un antimicrobiano, e implica la adquisición de la misma (como sería el caso de la aparición de cepas de E. coli resistentes a la colistina). Las vías principales de adquisición de mecanismos de resistencia en las bacterias son las mutaciones y la incorporación de genes mediante transferencia horizontal. I n t r o d u c c i ó n 43 Las mutaciones ocurridas al azar que tienen lugar en genes que codifican la síntesis de proteínas fundamentales para la actuación del antibiótico (proteínas implicadas en el transporte, en la diana de acción, en la expulsión, etc) pueden permitirle a la bacteria sobrevivir en presencia del antibiótico. La misma presión selectiva de éste va a favorecer la aparición de una población bacteriana resistente, en detrimento de la población sensible, que morirá. (Torres, 2012). Hoy en día se sabe que los antibióticos no se limitan únicamente a favorecer la selección de bacterias resistentes, sino que también son capaces de incrementar la tasa de mutación de las bacterias, acelerando la variabilidad genética. Cuando la resistencia a los antibióticos se debe a mutaciones en genes intrínsecos, tiene menor implicación epidemiológica, ya que solo se transfiere por vía vertical pero no por transferencia horizontal, como en el caso de la resistencia a quinolonas por mutación de las dianas de unión al antibiótico que afectan a la replicación del ADN (Torres, 2012). Sin embargo, las bacterias utilizan generalmente otro tipo de sistemas para adquirir resistencias, basados, en primer lugar, en acumular genes de resistencia a antibióticos y, posteriormente, movilizarlos a otras bacterias, incluso de géneros diferentes. Este fenómeno se conoce con el nombre de transmisión genética horizontal (TGH) y es llevada a cabo mediante diferentes elementos genéticos móviles (integrones, transposones y plásmidos) capaces de integrar y diseminar estas resistencias. Los integrones han sido definidos como elementos dinámicos de ADN que contienen determinantes genéticos para un sistema de recombinación específica, con la capacidad de reconocer y capturar genes en cassettes móviles (secuencias de ADN, normalmente cortas que codifican para un gen específico y que poseen un sitio de recombinación) que pasan a formar parte de ellos una vez que han 50 su crecimiento en presencia del antibiótico, pero no se destruyen de manera completa (Suárez & Gudiol, 2009). Existen múltiples mecanismos de resistencia a la acción de los antibióticos betalactámicos desarrollados por las distintas bacterias, de manera que la resistencia puede ser debida a uno de ellos o a la combinación de varios. Los principales, en bacterias Gram negativas son (Fernández, 2016): o Alteración de las PBPs: puede implicar una pérdida de afinidad por los betalactámicos, impidiendo una interacción normal entre el fármaco y su diana, con la consecuente disminución de su actividad y resistencia al mismo. o Alteración en la permeabilidad: debido principalmente a la pérdida o modificación de ciertas porinas; en el caso de E. coli, la pérdida de sus dos porinas principales (OmpF y OmpC), asociada a la presencia de ciertas betalactamasas, causa resistencias a los betalactámicos. o Mecanismos de expulsión activa del antimicrobiano: denominados así por tratarse de procesos complejos dependientes de energía, siendo esta fuente de energía en la mayoría de casos el ATP. Pueden afectar a varias familias de antimicrobianos o ser específicos para un antimicrobiano o familia concreta; en el primer caso están codificados por genes ampliamente conservados del cromosoma bacteriano y su expresión depende de cambios o mutaciones en los genes reguladores de los mismos; por el contrario, las bombas de expulsión específicas se encuentran codificadas, generalmente, por genes localizados en plásmidos que llevan genes de resistencia adicionales. I n t r o d u c c i ó n 51 o Enzimas inactivadoras: en el caso de las enterobacterias suponen el principal mecanismo de resistencia frente a antibióticos betalactámicos, y se denominan betalactamasas. 1.2.2. Betalactamasas Las betalactamasas son, por tanto, enzimas bacterianas que hidrolizan de forma irreversible el enlace amida del anillo betalactámico, generando compuestos sin actividad antimicrobiana. Desde su descubrimiento en 1940 en una cepa de E. coli, se han descrito más de 900 enzimas de este tipo. Los genes codificantes de estas enzimas pueden localizarse tanto en plásmidos como en el cromosoma bacteriano. En el primer caso, pueden ser transferibles incluso entre distintas especies de microorganismos. En el segundo caso, suelen ser de naturaleza inducible (aumentan su producción tras la exposición a betalactámicos, especialmente a cefalosporinas). Según su expresión, algunas betalactamasas se expresan de manera constitutiva (se producen siempre) y otras de manera inducible (suele ser el caso de las cromosómicamente codificadas, como el gen ampC) y pueden pasar a ser hiperinducibles o incluso constitutivas con hiperproducción, debido a determinadas mutaciones en los complejos sistemas reguladores que rigen dicha expresión (Bennet & Chopra, 1993; Fernández, 2016). Actualmente, los sistemas de clasificación más utilizados son 2, el propuesto por Ambler en 1980 que clasifica las betalactamasas en 4 clases (A, B, C, D) atendiendo a su secuencia nucleotídica y aminoacídica (Ambler, 1980), y el propuesto por Bush, Jacoby y Medeiros en 1995 y actualizado en 2010, en base a sus características bioquímicas estructurales y funcionales (Bush et al. 1995; Bush & Jacoby, 2010). En la Tabla 5 se correlacionan ambas clasificaciones junto con una breve descripción. 52 TABLA 5. CLASIFICACIÓN DE LAS BETALACTAMASAS (ADAPTADO DE BUSH & JACOBY, 2010) BushJacoby (2010) Ambler (1980) Substrato principal Inhibido por ACa o TZBb Inhibido por EDTAc Característica(s) principal(es) Enzima(s) representativo(s) 1 C Cefalosporinas No No Mayor hidrólisis de las cefalosporinas que de las benzilpenicilinas; hidroliza cefamicinas E. coli AmpC, P99, ACT-1, CMY-2, FOX-1, MIR-1 1e C Cefalosporinas No No Hidrólisis incrementada de la ceftazidima y de otros oximino betalactámicos* GC1, CMY-37 2a A Penicilinas Sí No Mayor hidrólisis de las benzilpenicilinas que de las cefalosporinas PC1 2b A Penicilinas, cefalosporinas 1ª gción. Sí No Similar hidrólisis de las benzilpenicilinas que de las cefalosporinas TEM-1, TEM-2, SHV-1 2be A Cefalosporinas espectro extendido, monobactámicos Sí No Hidrólisis incrementada de oximino betalactámicos* TEM-3, SHV-2, CTXM-15, PER-1, VEB-1 2br A Penicilinas No No Resistencia al ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam TEM-30, SHV-10 2ber A Cefalosporinas espectro extendido, monobactámicos No No Hidrólisis incrementada de oximino betalactámicos*+ resistencia al ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam TEM-50 2c A Carbenicilina (carboxipenicilina) Sí No Hidrólisis incrementada de carbenicilinas PSE-1, CARB-3 2ce A Carbenicilina, cefepima Sí No Hidrólisis incrementada de carbenicilinas, cefepima y cefpiroma RTG-4 2d D Cloxacilina Variable No Hidrólisis incrementada de cloxacilina y oxicilina OXA-1, OXA-10 2de D Cefalosporinas espectro extendido Variable No Hidroliza cloxacilina, oxicilina y oximino betalactámicos* OXA-11, OXA-15 2df D Carbapenemas Variable No Hidroliza cloxacilina, oxicilina y carbapenémicos OXA-23, OXA-48 2e A Cefalosporinas espectro extendido Sí No Hidroliza cefalosporinas. Inhibido por el ácido clavulánico, pero no por el aztreonam CepA 2f A Carbapenemas Variable No Hidrólisis incrementada de carbapenémicos, cefamicinas y oximino betalactámicos* KPC-2, IMI-1, SME-1 3a B(B1) Carbapenemas No Sí Hidrólisis de amplio espectro, incluyendo carbapenémicos, pero no monobactamas IMP-1, VIM-1, CcrA, IND-1 B(B3) L1, CAU-1, GOB-1, FEZ-1 3b B(B2) Carbapenemas No Sí Hidroliza preferentemente los carbapenémicos CphA, Sfh-1 A ÁCIDO CLAVULÁNICO/ B TAZOBACTAM/ C ÁCIDO ETILENDIAMINOTETRAACÉTICO *CEFOTAXIMA, CEFTAZIDIMA, CEFTRIAXONA, CEFEPIMA, AZTREONAM I n t r o d u c c i ó n 53 Grupo 1 (clase Ambler C) Las enzimas integrantes de este grupo, también denominadas cefalosporinasas, se caracterizan por ser resistentes a los inhibidores de betalactamasas (como el ácido clavulánico), a penicilinas, cefamicinas y a cefalosporinas de hasta 3ª generación. Son sensibles a la cefepima y a las carbapenemas. Se trata de enzimas codificadas en genes de localización cromosómica, denominadas enzimas de tipo AmpC, están presentes en la mayoría de las enterobacterias y en Pseudomona aeruginosa. Además, se ha descrito la integración de algunos de estos genes en plásmidos, siendo denominadas cefamicinasas plasmídicas o AmpC plasmídicas. Entre las más conocidas se encuentran las del tipo CMY, FOX, DHA, MOX, y EBC (Pérez-Pérez & Hanson, 2002). El subgrupo 1e está formado por variantes con mayor actividad frente a la ceftazidima y otros oximino betalactámicos como resultado de sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos, e incluyen la GC-1 y las CMY-10, CMY-19 y CMY-37 (Bush & Jacoby, 2010). Grupo 2 (clase Ambler A y D) Representa el grupo más numeroso de betalactamasas y se compone de 12 subgrupos de enzimas (Tabla 5), la mayoría de tipo plasmídico. Dentro de la clase A, los subgrupos más destacados, bien por su incidencia clínica o por el reciente incremento en su detección son: o Subgrupo 2b, formado por enzimas con capacidad para hidrolizar penicilinas y cefalosporinas de 1ª generación, siendo sus principales representantes TEM-1, TEM-2 y SHV1. Un porcentaje de estas enzimas habrían adquirido, además, resistencia al ácido clavulánico e inhibidores 54 relacionados, pasando a conformar el subgrupo 2br que actualmente englobaría unas 36 enzimas de tipo TEM (por ejemplo, TEM-30 o TEM-31) y 5 de tipo SHV (por ejemplo, SHV-10). o Subgrupo 2be, constituido por las denominadas BLEE, hidrolizan penicilinas, cefalosporinas de hasta 4ª generación y monobactámicos, pero no las carbapenemas. Está formado tanto por enzimas derivadas del subgrupo 2b, que habrían sufrido distintas sustituciones aminoacídicas adquiriendo un mayor espectro de actividad, como por las enzimas de tipo CTX-M y por un pequeño conjunto de BLEE menos comunes no relacionadas con la familia TEM, SHV o CTX-M, entre las que destacan las pertenecientes a las familias PER y VEB. Pese a que este subgrupo se caracteriza por ser inhibido por el ácido clavulánico, un porcentaje de enzimas derivadas de la familia TEM, denominadas CMT (complex mutant TEM) presentan relativa resistencia frente a dicho inhibidor, y constituyen el subgrupo 2ber (por ejemplo, TEM-50) (Bush & Jacoby, 2010; Calvo et al. 2011). Las enzimas de la clase D (subgrupos 2d, 2de y 2df) hidrolizan principalmente las oxacilinas y cloxacilinas y se conocen como enzimas tipo OXA. Algunas como la OXA-23 u OXA-48 han cobrado gran importancia clínica debido al desarrollo de resistencia a los antibióticos carbapenémicos (Fernández, 2016). Grupo 3 (clase Ambler B) Son enzimas dependientes de iones Zn2+, por lo que también se denominan metalobetalactamasas (MBL). Las cepas productoras de MBL muestran resistencia a penicilinas, cefalosporinas, I n t r o d u c c i ó n 55 carbapenemas y a los inhibidores de betalactamasas, pero no siempre al aztreonam, y su actividad es inhibida por agentes quelantes como el EDTA. Se han descrito al menos 9 tipos distintos de MBL plasmídicas. Las más importantes desde el punto de vista de la relevancia clínica y la diseminación epidemiológica son los tipos IMP, VIM, y NDM (Cornaglia et al. 2011). 1.2.3. Uso de agentes antimicrobianos en medicina y producción A nivel mundial, la ganadería intensiva ha logrado aumentar la producción de alimentos a un bajo costo por unidad producida, pero probablemente a un precio difícil de estimar derivado del aumento de resistencias a los antimicrobianos. Demostrar el vínculo entre el consumo de antimicrobianos en animales y las infecciones resistentes de los seres humanos es muy complejo, debido a la intervención de múltiples factores. Sin embargo, en los últimos años, el análisis de los datos evidencia la hipótesis de que el uso rutinario de antimicrobianos en sistemas intensivos de producción animal, constituye un gasto de recursos naturales en relación a la pérdida de efectividad antimicrobiana, que es de crucial importancia en medicina humana. Las prácticas agrícolas intensivas no sólo se han asociado con la presencia de resistencias a los antimicrobianos en animales, humanos y carne, sino también con numerosas enfermedades del ganado, como la gripe aviar altamente patógena H5N1 y el síndrome reproductivo y respiratorio porcino. Además de la salud animal y la resistencia a los antimicrobianos, otros efectos colaterales derivados de una agricultura intensiva poco regulada incluyen la contaminación del agua y del suelo, la pérdida de biodiversidad, y la disminución de la calidad nutricional de la carne. Todos estos factores tienen graves consecuencias que 56 potencialmente superan los beneficios del aumento de la productividad (Van Boeckel et al. 2015; Robinson et al. 2016). Van Boeckel et al. (2015) estimaron en 63.151 (± 1.560) toneladas el consumo mundial de antimicrobianos del año 2010 en animales de producción, con una previsión de incremento del 67%, a 105.596 (± 3.605) toneladas, para el 2030. En cuanto a la acuicultura, la situación es menos clara ya que puede tener mayores consecuencias ambientales y efectos secundarios en los ecosistemas acuáticos (Henriksson et al. 2015; Robinson et al. 2016). Con el fin de preservar la eficacia de los antimicrobianos, la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) estableció una clasificación basada en la lista de agentes antimicrobianos autorizados importantes para la medicina veterinaria, cuya última actualización tuvo lugar en mayo de 2015 (OIE, 2015). Basándose en las contribuciones de los Países Miembros de la OIE, el grupo decidió tratar todos los agentes antimicrobianos usados en animales destinados a la producción de alimentos, dividiéndolos en agentes antimicrobianos de importancia crítica, agentes de importancia elevada y agentes de importancia (Tabla 6). Dentro de la categoría de agentes antimicrobianos veterinarios de importancia crítica, algunas clases lo son también para la salud humana, como es actualmente el caso de las fluoroquinolonas (FQ) y de la 3ª y 4ª generación de cefalosporinas. Por lo tanto, esas dos clases de agentes antimicrobianos deberán emplearse de acuerdo con las siguientes recomendaciones:  No usarse como tratamiento preventivo aplicado en los alimentos o el agua en ausencia de signos clínicos en los animales tratados. I n t r o d u c c i ó n 57  No usarse como primer tratamiento a menos que esté justificado; cuando se emplee como segundo tratamiento, en teoría deberá hacerse sobre la base de los resultados de pruebas bacteriológicas.  Su uso fuera de lo indicado en su autorización de comercialización, o diferente del resumen de las características del producto, deberá limitarse y reservarse a los casos en los que no existan otras opciones de sustitución. TABLA 6. CLASIFICACIÓN DE LOS AGENTES ANTIMICROBIANOS VETERINARIOS IMPORTANTES PARA LOS ANIMALES DESTINADOS A LA PRODUCCIÓN DE ALIMENTOS. (ADAPTADO DE: OIE, 2015) AGENTES ANTIMICROBIANOS (CLASE, SUBCLASE, SUSTANCIA) ESPECIE AVIC AVMI AVI AMINOCUMARINAS X Novobiocina BOV, CAP, OVI, PIS AMINOGLUCÓSIDOS X AMINOCICLITOL Espectinomicina AVI, BOV, CAP, EQU, LEP, OVI, PIS, SUI Estreptomicina API, AVI, BOV, CAP, EQU, LEP, OVI ,PIS, SUI Dihidroestreptomicina AVI, BOV, CAP, EQU, LEP, OVI, SUI AMINOGLUCÓSIDOS + 2 DEOXIESTREPTAMINA Kanamicina AVI, BOV, EQU, PIS, SUI Neomicina API, AVI, BOV, CAP, EQU, LEP, OVI, SUI Framicetina BOV, CAP, OVI Paromomicina AVI, BOV, CAP, OVI, LEP, SUI Apramicina AVI, BOV, LEP, OVI, SUI Fortimicina AVI, BOV, LEP, OVI, SUI Gentamicina AVI, BOV, CAM, CAP, EQU, LEP, OVI, SUI Tobramicina EQU Amikacina EQU ANFENICOLES X Florfenicol AVI, BOV, CAP, EQU, LEP, OVI, PIS, SUI Tianfenicol AVI, BOV, CAP, OVI, PIS, SUI ANSAMICINA – RIFAMICINAS X Rifampicina EQU Rifaximina BOV, CAP, EQU, LEP, OVI, SUI ARSENICALES X Roxarsona AVI, SUI Nitarsona AVI, SUI BICICLOMICINA X Bicozamicina AVI, BOV, PIS, SUI CEFALOSPORINAS X CEFALOSPORINAS 1ª Gción. Cefacetril BOV Cefalexina BOV, CAP, EQU, OVI, SUI Cefalotina EQU Cefapirina BOV Cefazolina BOV, CAP, OVI Cefalonium BOV, CAP, OVI 58 AGENTES ANTIMICROBIANOS (CLASE, SUBCLASE, SUSTANCIA) ESPECIE AVIC AVMI AVI CEFALOSPORINAS 2ª Gción. Cefuroxima BOV CEFALOSPORINA 3ª Gción. X Cefoperazona BOV, CAP, OVI Ceftiofur AVI, BOV, CAP, EQU, LEP, OVI, SUI Ceftriaxona AVI, BOV, OVI, SUI CEFALOSPORINAS 4ª Gción. Cefquinoma BOV, CAP, EQU, LEP, OVI, SUI ÁCIDO FUSÍDICO X Ácido fusídico BOV, EQU IONÓFOROS X Lasalocid AVI, BOV, LEP, OVI Maduramicina AVI Monensina API, AVI, BOV, CAP Narasina AVI, BOV Salinomicina AVI, LEP, BOV, SUI Semduramicina AVI LINCOSAMIDAS X Pirlimicina BOV, SUI, AVI Lincomicina API, AVI, BOV, CAP, OVI, PIS, SUI MACRÓLIDOS (C hace referencia a la estructura química) X MACRÓLIDOS C14 Eritromocina API, AVI, BOV,CAP, EQU, LEP, OVI, PIS, SUI Oleandomicina BOV MACRÓLIDOS C15 Gamitromicina BOV Tulatromicina BOV, SUI MACRÓLIDOS C16 Carbomicina AVI Kitasamicina AVI, SUI, PIS, SUI Tilmicosina AVI, BOV, CAP, LEP, OVI, SUI Tilosina API, AVI, BOV, CAP, LEP, OVI, SUI Mirosamicina API, AVI, SUI, PIS Terdecamicina AVI, SUI Tildipirosina BOV, SUI Tilvalosina AVI, SUI MACRÓLIDOS C17 Sedecamicina SUI ORTOSOMICINAS X Avilamicina AVI, LEP PENICILINAS X PENICILINAS NATURALES benethamine penicilina BOV Bencilpenicilina AVI, BOV, CAM, CAP, EQU, LEP, OVI, SUI Penetamato (iohidrato) BOV Bencilpenicilina procaina / Penicilina benzatina BOV, CAM, CAP, EQU, OVI, SUI AMDINOPENICILINAS Mecilinam BOV, SUI AMINOPENICILINAS Amoxicilina AVI, BOV, CAP, EQU, OVI, PIS, SUI Ampicilina AVI, BOV, CAP, EQU, OVI, PIS, SUI Hetacilina BOV AMINOPENICILINA +INHIBIDOR DE LA BETALACTAMASA Amoxicilina + Ácido clavulánico AVI, BOV, CAP, EQU, OVI, SUI Ampicilina + Sulbactam AVI, BOV, SUI CARBOXIPENICILINAS I n t r o d u c c i ó n 59 AGENTES ANTIMICROBIANOS (CLASE, SUBCLASE, SUSTANCIA) ESPECIE AVIC AVMI AVI Ticarcilina EQU Tobicilina PIS UREIDOPENICILINA Aspoxicilina BOV, SUI FENOXIPENICILINAS Fenoximetilpenicilina AVI, SUI Feneticilina EQU PENICILINAS ANTIESTAFILOCOCOS Cloxacilina BOV, CAP, EQU, OVI, SUI Dicloxacilina BOV, CAP, OVI, AVI, SUI Nafcilina BOV, CAP, OVI Oxacilina BOV, CAP, EQU, OVI, AVI, SUI ÁCIDO FOSFÓNICO X Fosfomicina AVI, BOV, PIS, SUI PLEUROMUTILINAS X Tiamulina AVI, CAP, LEP, OVI, SUI Valnemulina AVI, SUI POLIPÉPTIDOS X Enramicina AVI, SUI Gramicidina EQU Bacitracina AVI, BOV, LEP, SUI, OVI POLIPÉPTIDOS CÍCLICOS Colistina AVI, BOV, CAP, EQU, LEP, OVI, SUI Polimixina BOV, CAP, EQU, LEP, OVI, AVI QUINOLONAS X Flumequina AVI, BOV, CAP, EQU, LEP, OVI, PIS, SUI Miloxacina PIS Ácido nalidíxico BOV Ácido oxolínico AVI, BOV, LEP, PIS, SUI, OVI FLUOROQUINOLONAS X Ciprofloxacina AVI, BOV, SUI Danofloxacina AVI, BOV, CAP, LEP, OVI, SUI Difloxacina AVI, BOV, LEP, SUI Enrofloxacina AVI, BOV, CAP, EQU, LEP, OVI, PIS, SUI Marbofloxacina AVI, BOV, EQU, LEP, SUI Norfloxacina AVI, BOV, CAP, LEP, OVI, SUI Ofloxacina AVI, SUI Orbifloxacina BOV, SUI Sarafloxacina PIS QUINOXALINAS X Carbadox SUI Olaquindox SUI SULFONAMIDAS X Sulfaclorpiridazina AVI, BOV, SUI Sulfadiazina AVI, BOV, CAP, OVI, SUI Sulfadimetoxina AVI, BOV, CAP, EQU, LEP, OVI, PIS, SUI Sulfadimidina (Sulfametazina, Sulfadimerazina) AVI, BOV, CAP, EQU, LEP, OVI, SUI Sulfadoxina BOV, EQU, OVI, SUI Sulfafurazol BOV, PIS Sulfaguanidina AVI, CAP, OVI Sulfamerazina AVI, BOV, CAP, EQU, LEP, OVI, PIS, SUI Sulfadimetoxazol AVI, BOV, SUI Sulfametoxina AVI, PIS, SUI Sulfamonometoxina AVI, PIS, SUI Sulfanilamida AVI, BOV, CAP, OVI Sulfapiridina BOV, SUI Ftalilsulfatiazol SUI 66 1.3.2.1. E. coli patógenos intestinales Los patotipos de E. coli que están asociados con enfermedades intestinales son conocidos colectivamente como E. coli patógenos intestinales o E. coli diarreagénicos (ECD), aunque no todos los subtipos en este grupo necesariamente causan diarrea. Los patotipos individuales de ECD incluyen E. coli enteropatogénicos (ECEP), E. coli enteroinvasivos (ECEI), E. coli enterotoxigénicos (ECET), E. coli verotoxigénicos (ECVT), E. coli enteroagregativos (ECEA), E. coli con adherencia difusa (ECAD) y E. coli adherenteinvasivos (ECAI) (Nataro & Kaper, 1998, Kaper et al. 2004, Croxen et al. 2013). Además, todo el género Shigella es un patotipo ECD, que se asemeja mucho a los ECEI en términos de virulencia y patogenicidad, pero se distingue de otras cepas de E. coli en virtud de su actividad bioquímica (Lan et al. 2004). En consecuencia, las shigelas pueden considerarse miembros del patotipo ECEI. Cada patotipo de ECD representa una colección de cepas que poseen factores de virulencia similares entre sí y causan enfermedades similares con patología similar. A diferencia de los E. coli patógenos extraintestinales (ExPEC), donde no existen determinantes específicos de virulencia que definan exclusivamente cada subtipo, la mayoría de los patótipos ECD se definen por la posesión de uno o más marcadores de virulencia específicos del patotipo, y a veces por la ausencia de otros (Tabla 7). Varios de los marcadores que caracterizan los patotipos ECD son probados determinantes de virulencia de dicho patotipo, pero para los ECEA, ECAD y ECAI no está probado el papel de estos marcadores en la virulencia (Robins-Browne et al. 2016). I n t r o d u c c i ó n 67 E. coli enteropatógénicos (ECEP) Se caracterizan por la presencia del locus LEE de la isla de patogenicidad (PAI) de borrado de enterocitos que codifica para la intimina eae (Kenny et al.1997; Croxen et al. 2013). La expresión de la PAI provoca una lesión histopatológica característica denominada attaching and effacing (A/E) (adhesión y borrado) (Finlay et al. 1992; Goosney et al. 2000). El gen bfp (bundle-forming pilus) propio de este patotipo, codifica para un factor de virulencia accesorio implicado en procesos clínicos humanos, aunque algunos ECEP pueden causar enfermedad incluso careciendo de él. Estas cepas se denominan ECEP atípicas y presentan una elevada diversidad genética y un grado variable de virulencia (Trabulsi et al. 2002; Nguyen et al. 2006; Tennant et al. 2009; Ingle et al. 2016). TABLA 7. MARCADORES DE VIRULENCIA ASOCIADOS DE ECD EN HUMANOS. (FUENTE: ROBINS-BROWNE ET AL. 2016) A. NO PRESENTE EN TODAS LAS CEPAS. B. EN REVISIÓN, SIGUIENDO CRITERIOS DE ESPECIFICIDAD. CLAVES: AAIC (GEN DE SECRECCIÓN DE PROTEÍNA DE ECEA), AATA (GEN PROTEÍNA TRANSPORTADORA ECEA), AFA (ADHESINA AFIMBRIAL), AGGR (GEN DE REGULADOR DE TRANSCRIPCIÓN) BFPA (GEN DE PROTEÍNA ESTRUCTURAL DEL PILI), ELT (GEN DE ENTEROTOXINA TERMOLÁBIL), EST (GEN DE ENTEROTOXINA TERMOESTABLE), IPAH (GEN PROTEÍNA TIPO 3 DE SECRECCIÓN DE ECEI Y SHIGELLA, LEE PAI (LOCUS DE LA ISLA DE PATOGENICIDAD DE BORRADO DE ENTEROCITOS), LT (ENTEROTOXINA TERMOLÁBIL), PAA (PLÁSMIDO DE VIRULENCIA DE ECEI Y SHIGELLA, ST (ENTEROTOXINA TERMOESTABLE) 68 E. coli verotoxigénicos (ECVT) También denominados E. coli shigatoxigénicos, se caracterizan por la producción de dos tipos de citotoxinas denominadas verotoxinas (VT) o shigatoxinas (Stx) 1 y 2 (Mora et al. 2011b). Son uno de los principales agentes causales de la colitis hemorrágica (CH) y del síndrome urémico hemolítico (SUH) en el hombre, y de la enfermedad de los edemas en porcino. E. coli enterotoxigénicos (ECET) Este patotipo está caracterizado por la capacidad de producir una o más enterotoxinas de tipo termolábil o termoestable (LT y ST, respectivamente). Las enterotoxinas ST presentan 2 variedades principales, STa y STb, siendo la primera la más importante en patología humana (Qadri et al. 2005; Taxt et al. 2010). E. coli enteroinvasivos (ECEI) Muy similares al género Shigella en términos clínicos, poseen un determinante plasmídico (pINV) que les permite penetrar e invadir células epiteliales adyacentes (Marteyn et al. 2012; Croxen et al. 2013) E. coli enteroagregativos (ECEA) Las cepas pertenecientes a este patotipo se caracterizan por su disposición en “ladrillo” adoptada al poseer diferentes tipos de fimbrias agregativas de carácter hidrofóbico, conocidas como AAF y localizadas principalmente en el plásmido pAA, que también puede codificar para la presencia de la citotoxina Pet y para una enterotoxina conocida como toxina enteroagregativa estable (EAST1) (Okeke & Nataro, 2001; Croxen et al. 2013). I n t r o d u c c i ó n 69 E. coli de adherencia difusa (ECAD) Las ECAD se caracterizan por conformar un grupo genéticamente heterogéneo que presenta un patrón difuso de adherencia a las células epiteliales del intestino. La adhesina implicada en el patrón de adherencia difusa (AIDA-I) puede encontrarse en cepas que portan factores de virulencia propios de las ECET o de las ECEP, por lo que este patotipo no se encuentra totalmente definido (Gomes et al. 2016). E. coli adherente-invasivos (ECAI) Las cepas de ECAI han sido aisladas frecuentemente en pacientes con lesiones ileales relacionadas con la enfermedad de Crohn (EC). Este patotipo se caracteriza por adherirse e invadir las células epiteliales del intestino, siendo capaz de sobrevivir en dichas células, así como en los macrófagos del hospedador. Los determinantes genéticos de este grupo, aunque se relaciona habitualmente con la EC, permanecen poco definidos (Nash et al. 2010). 1.3.2.2. E. coli patógenos extraintestinales Aunque la diferenciación entre cepas comensales y cepas que causan infecciones intestinales es relativamente clara, la separación categórica entre cepas comensales y productoras de infecciones extraintestinales es más tenue. El acrónimo ExPEC para "E. coli patógenos extraintestinales” ha sido propuesto de forma paralela y para equiparar siglas como ECEP o ECEH (E. coli enterohemorrágicos) (Russo & Johnson, 2000). Según su definición, una cepa ExPEC debe portar factores de reconocida virulencia extraintestinal (Tabla 8) o demostrar una virulencia in vivo en el modelo animal de infección extraintestinal apropiado. El aislamiento de una cepa de E. coli de un paciente con infección extraintestinal no 70 es suficiente para definirla como ExPEC, puesto que algunas cepas comensales pueden causar infecciones extraintestinales en pacientes inmunocomprometidos y algunas cepas ExPEC pueden aislarse de ambientes comensales (Russo & Johnson, 2000). El acrónimo ExPEC incluye las cepas de E. coli relacionadas con infecciones del tracto genitourinario (UPEC), las asociadas con meningitis neonatal (NMEC) o las causantes de sepsis (SEPEC) (Johnson & Russo, 2002, 2005; Smith et al. 2007). Además, las cepas de E. coli que provocan infecciones sistémicas y respiratorias en aves (APEC) han mostrado ser similares a ciertas cepas ExPEC humanas, por lo que fueron incluidas en la definición de este grupo (Johnson et al. 2003; Moulin-Schouleur et al 2007; Bélanger et al. 2011; Clermont et al. 2011a). Las cepas ExPEC forman parte de la microbiota de los hospedadores sanos y, en situaciones fisiológicas normales, colonizan el tracto gastrointestinal de manera asintomática, sin embargo, ante la combinación de una serie de eventos dependientes tanto del hospedador (compromiso del sistema inmunitario, dieta, complexión…), como de la propia cepa (adquisición de determinados factores de virulencia), pueden colonizar otras localizaciones extraintestinales y provocar infección (Köhler & Dobrindt, 2011; Erjavec & Bertok 2015; Johnson et al. 2015; Micenková et al. 2016). I n t r o d u c c i ó n 71 TABLA 8. FACTORES DE VIRULENCIA ASOCIADOS CON LAS CEPAS EXPEC (FUENTE: DALE & WOODFORD, 2015) Las cepas NMEC y UPEC han demostrado pertenecer principalmente a los filogrupos B2, D y F (Bingen et al. 1998; Picard et al. 1999; Bonacorsi et al. 2003; Jaureguy et al. 2008), las cepas APEC se encuentran asociadas a los grupos filogenéticos A, C y B2 (Rodriguez-Siek et al. 2005; Clermont et al. 2011a), mientras que los clados crípticos de Escherichia recientemente descritos se aíslan de manera muy puntual (<1%) en localizaciones extraintestinales (Clermont et al. 2011b). Pese a la variabilidad de patrones de virulencia asociados al grupo 72 de las ExPEC, algunas cepas APEC y NMEC han mostrado una elevada similitud genética, compartiendo filogrupos, factores de virulencia (FV) y/o serotipos; al igual que cepas ExPEC de origen humano y cepas aviares, analizadas mediante MLST (Ewers et al. 2007; Moulin-Schouleur et al. 2007; Johnson TJ. et al. 2012). Incluso se ha documentado la existencia de un grupo clonal (O1:K1:H7-B2ST95) que engloba cepas ExPEC de naturaleza UPEC, APEC y NMEC (Mora et al. 2009). Por tanto, la definición de ExPEC y la de sus subgrupos pronto comenzó a considerarse anticuada, ya que cepas clasificadas en alguno de los grupos específicos, demostraron ser capaces de causar infección en múltiples localizaciones anatómicas de distintas especies, y cepas de tipo comensal portaban diversos FV considerados potencialmente patógenos (Dale & Woodford, 2015). Desde la creación del término ExPEC (Russo & Johnson, 2000), se han realizado diversas propuestas de clasificación, atendiendo a la presencia de los FV aislados frecuentemente de las ExPEC (Tabla 8). Así, inicialmente el estatus ExPEC de una cepa fue definido por Johnson et al. (2003) si ésta presentaba al menos 2 de 5 factores de virulencia predictivos independientes (papAH y/o papC, sfa/focDE, afa/draBC, kpsM II, y iutA). Sin embargo, estos genes no resultaron específicos de ningún subgrupo ExPEC ya que pueden ser portados por cepas de E. coli de tipo UPEC, NMEC, APEC o incluso de tipo comensal. Con el objetivo de buscar FV predictivos de ExPEC que permitiesen asignar las cepas a sus diversos subgrupos, se han creado diversos modelos estadísticos, analizando la relación de estos FV entre sí (Vigil et al. 2011; Mitchell et al. 2015), siendo los utilizados por Spurbeck et al. (2012) para definir la capacidad de uropatogenicidad (≥3 de los 4 marcadores: vat, fyuA, chuA e yfcV), los que han logrado un mayor nivel de definición, permitiendo diferenciar las cepas UPEC de las APEC, comensales y ECD, aunque no establece I n t r o d u c c i ó n 73 diferencias entre UPEC y NMEC o entre APEC y comensales, siendo por el momento necesario el análisis conjunto de diversos factores (FV, filogenia, cultivo en medios selectivos, lugar de aislamiento, síntomas clínicos…) para completar la clasificación de una cepa ExPEC. 1.3.3. Subtipado de E. coli Además del patotipo, las cepas individuales de E. coli pueden subtipificarse usando diferentes criterios. Éstos incluyen secuencia tipo (ST), serotipo (O:K:H), pulsotipo (PFGE), tipo de fago y biotipo. Secuencia Tipo Como vimos en el apartado 1.3.1., la naturaleza conservada del genoma del core de E. coli permite determinar la distancia genética existente entre cepas. Mediante MLST se evalúa la variación alélica presente en estos genes conservados, asignándose una ST a cada combinación de alelos obtenida (Maiden et al. 1998). De los 3 esquemas de MLST propuestos para E. coli, el creado por Achtman, basado en la secuencia de 7 de estos genes altamente conservados, parece ser el más estable y congruente con la filogenia del genoma completo (Chaudhuri & Henderson, 2012; Clermont et al. 2015). Recientemente se han incorporado a la base de datos del Warwick Medical School (www.enterobase.warwick.ac.uk) más de 2500 genes del core (cgMLST), formando parte de un nuevo esquema de E. coli (Maiden et al. 2013). La determinación de la ST ha mostrado ser de gran utilidad en diversos estudios relacionados con la expansión de determinadas cepas en diferentes localizaciones, como en el caso del grupo clonal ExPEC multirresistente ST131 (Nicolas-Chanoine et al. 2014; Petty et al. 2014). 74 Serotipo El serotipado, basado en la variación de los antígenos de superficie (O), capsular (K) y flagelar (H), ha sido empleado clásicamente para la idenficación preliminar de los patotipos ECD. Aunque los distintos grupos de cepas patógenas de E. coli suelen pertenecer a unos serotipos concretos, el serotipado como técnica de identificación preliminar pronto fue remplazado por la determinación de los FV específicos de los mismos. La superioridad de otros métodos como el MLST sobre el serotipado se hace patente, por ejemplo, en el caso del grupo clonal pandémico ST131, en el que la mayoría de las cepas pertenecen al serotipo O25b:H4 pero que también cuenta con cepas de otros serotipos, principalmente O16:H5 (López-Cerero et al. 2014; Nicolas-Chanoine et al. 2014). Las ventajas que ofrece la secuenciación genómica completa, capaz de predecir los serotipos de las cepas sin presentar los inconvenientes técnicos relacionados con la disponibilidad y viabilidad de los antisueros necesarios para llevar a cabo esta técnica (176 antisueros O; 72 K y 53 H), hace suponer que acabará remplazándola en el futuro (Ingle et al. 2016). Pulsotipo Mediante PFGE se lleva a cabo la macrorrestricción del ADN cromosómico, permitiendo conocer la clonalidad de diferentes cepas aisladas (idealmente) en situaciones epidémicas, con tiempo y espacio definido. Se detecta la variabilidad (polimorfismo) existente entre los puntos de restricción elegidos, mediante la obtención de un patrón de bandas denominado pulsotipo (Tenover et al. 1995). Los principales inconvenientes de esta técnica son que los cambios puntuales en genes concretos no son detectables y que no es posible obtener información detallada de ciertos elementos (plásmidos, transposones, etc.) que pueden provocar la variación I n t r o d u c c i ó n 75 genética de las cepas con el paso del tiempo. Sin embargo, se reveló como la técnica ideal para los estudios que implicaban grupos de cepas que habrían evolucionado de manera muy reciente, por lo que pronto pasó a considerarse esencial en los estudios de brotes de enfermedades infecciosas (Barrett et al. 2006). 1.3.4. E. coli productores de BLEE y otras betalactamasas En las bacterias Gram negativas son bastante comunes las betalactamasas producidas naturalmente y de codificación cromosómica. Derivadas probablemente de proteínas de unión a la penicilina, cuando se producen en pequeña cantidad no contribuyen significativamente a la resistencia a los antibióticos. Fue la aparición de la primera betalactamasa TEM-1 plasmídica (Datta y Kontomichalou, 1965) la que marcó, en los años 60, el comienzo de un fenómeno imparable. Desde entonces, la introducción de nuevas drogas naturales o sintéticas, para reemplazar a las viejas en un intento de limitar la emergencia de bacterias resistentes a los antibióticos, ha desencadenado una reacción en cadena a través de la presión selectiva que favorece diferentes mecanismos de resistencia (Medeiros, 1997). Las principales betalactamasas asociadas a la producción, por parte de E. coli, son: TEM TEM-1 es capaz de hidrolizar penicilinas y cefalosporinas de primera generación, es la enzima betalactamasa más común en las bacterias Gram negativas y hasta el 90% de resistencia a la ampicilina en E. coli es debido a la producción de TEM-1 (Livermore, 1995), además es frecuente detectarla en plásmidos que codifican para otras BLEE en grupos clonales pandémicos de E. coli, como el ST131 (Nicolas- 82 de E. coli mediante su movilización plasmídica (Hawkey et al. 2001). En el año 2005, se produce un brote en Melbourne asociado a cepas de Serratia marcescens y de P. aeruginosa productoras de IMP, con su consecuente dispersión a otras especies de enterobacterias (incluyendo cepas clínicas de E. coli), hasta el punto de llegar a considerarse endémica en el este de Australia (Peleg et al. 2005). En el año 2009 vuelve a informarse de la presencia de IMP-4, esta vez en China (junto con IMP-8 y KPC-2), clasificándose en este país como las carbapenemasas emergentes con mayor prevalencia, tras ser aisladas de cepas de K. pneumoniae, E. coli, Enterobacter cloacae, E. aerogenes, y C. freundii (Yang et al. 2010). Las variedades de IMP pertenecen a la clase 3 de Ambler, denominadas metalobetalactamasas, al estar implicado un metal (Zn) en su estructura química por lo que son inhibidas por agentes quelantes como el EDTA. Actualmente es raro su aislamiento en Europa y Norteamérica, aunque su elevada presencia en Australia y China sugiere que puede ser cuestión de tiempo el que sea detectada de manera más frecuente. Carbapenemasas NDM En el año 2008 se identifica en Suecia, en un paciente retornado de la India, una nueva MBL, lejanamente relacionada a nivel genético con IMP y que denominan, dado su origen, como Nueva Dehli Metalobetalactamasa-1 (NDM-1) (Yong et al. 2009). Tras este hallazgo se producen casos esporádicos de detección de la NDM-1 en Reino Unido, en un 50% de los casos relacionados con haber recibido cuidados sanitarios en India, Bangladesh o Pakistán (Kumarasamy et al. 2010). Desde entonces, se ha diseminado a otras localizaciones, principalmente británicas y surasiáticas, I n t r o d u c c i ó n 83 asociada a cepas de Klebsiella spp. y en menor medida de E. coli (Zhiyuan et al. 2013; Datta et al. 2014). 1.3.5. Grupos clonales emergentes Uno de los factores que contribuye en mayor medida a la dispersión de las betalactamasas a nivel global, es el hecho de que se encuentren asociadas a linajes exitosos de microorganismos desde el punto de vista clínico y epidemiológico. El término clon o grupo clonal se utiliza frecuentemente para describir un organismo que desciende de una cepa precursora común y que posee características genotípicas similares, identificadas mediante métodos de subtipado. En el caso de E. coli se han caracterizado en los últimos años distintos grupos clonales que han contribuido a la expansión de las resistencias antibióticas a través de distintos hospedadores y áreas geográficas. Entre los más destacados se encuentran: o E. coli A-ST10 (cepas del filogrupo A, secuencia tipo 10 y perteneciente a varios serotipos) es un grupo muy amplio y heterogéneo y, aunque suele poseer un bajo perfil de virulencia y ser sensible frente a los antibióticos, también ha sido aislado en infecciones humanas, productos alimentarios y animales destinados al consumo; asociado a la producción de BLEE (Oteo et al. 2009; Cortés et al. 2010; Peirano et al. 2011; Cohen et al. 2012). o E. coli O11/O17/O77:K52:H18-D-ST69 (también llamado CGA por “clonal group A”; cepas del filogrupo D, secuencia tipo 69 y perteneciente a varios serotipos) identificado inicialmente en California como responsable de hasta un 52% de la 84 resistencia antibiótica en casos de ITU (Manges et al. 2001), se caracteriza por su perfil multirresistente y varios estudios lo han considerado causante de entre un 10 a un 20% de todas las infecciones humanas por E. coli (Johnson et al. 2005, 2011; Dias et al. 2009; Blanco J. et al. 2011). También ha sido relacionado frecuentemente con reservorios animales (Ramchandani et al. 2005; Jakobsen et al. 2012). o E. coli O1/O2/O18:K1:H7-B2-ST95 (cepas del filogrupo B2, secuencia tipo 95 y perteneciente a varios serotipos) es un reconocido grupo clonal de APEC (Antão et al. 2009), que ha mostrado compartir perfiles de PFGE relacionados, entre aislados de aves de producción y de seres humanos (Johnson TJ. et al. 2008; Mora et al. 2009; Vincent et al. 2010). o E. coli D-ST117 (cepas del filogrupo D, secuencia tipo 117 y perteneciente a varios serotipos) es otro linaje de APEC asociado a resistencia antibiótica y que ha sido identificado en cepas de origen alimentario y humano (causantes de septicemias y de ITU) con alta similitud entre ellas (Vincent et al. 2010; Leverstein-van Hal et al. 2011; Overdevest et al. 2011; Mora et al. 2012b). o E. coli O15:K52:H1-D-ST393 (cepas del filogrupo D, secuencia tipo 393 y perteneciente al serotipo O15:H1), identificado por primera vez a finales de los años 80 durante un brote de infecciones extraintestinales en Londres (Phillips et al. 1988) es un grupo clonal históricamente asociado con multirresistencia antibiótica (O'Neill et al. 1990; Prats et al. 2000; Olesen et al. 2009). Este grupo está relacionado genéticamente con el D-ST69, compartiendo patrones de I n t r o d u c c i ó n 85 resistencia y virulencia, lo que apunta a un posible antecesor común (Johnson et al. 2003, 2006). o E. coli D-ST405 (filogrupo D, secuencia tipo 405 y perteneciente a varios serotipos), aislado a nivel mundial, multirresistente y, posiblemente el segundo contribuyente a la diseminación de las BLEE de tipo CTX-M-15 en seres humanos después del ST131 (Manges et al. 2008; Tian et al. 2011). o E. coli O(varios):H9-A-ST410 (filogrupo A, secuencia tipo 410 y perteneciente a varios serotipos), es uno de los grupos clonales descritos más recientemente y resulta de especial interés debido a la producción asociada de BLEE (generalmente CTX-M-15) con diversos genes de resistencia como: blaOXA-1-group, aac-(6´)-Ib, tet(A), sul1, sul2 y strA/B (Sidjabat et al. 2009b; López-Cerero et al. 2011). Se caracteriza por conformar un grupo relativamente homogéneo y que ha sido determinado tanto en cepas de origen clínico humano como en alimentos, animales domésticos y silvestres (Fischer et al. 2014, 2016; Ben Sallem et al. 2015; Falgenhauer et al. 2016; Timofte et al. 2016; Schaufler et al. 2016). o E. coli del CC648, que está siendo detectado como linaje emergente dentro del filogrupo F (anteriormente incluido en el D) y asociado a resistencia antibiótica, suponiendo en algunos casos hasta un 28% de las cepas resistentes de E. coli analizadas (Pitout et al. 2012; Cao et al. 2014; Sato et al. 2014; Xia et al. 2014; Sherchan et al. 2015; Zhao SY. et al. 2015). Los perfiles de resistencia detectados en este grupo incluyen FQ, betalactámicos (CTX-M y CMY-2), 86 carbapenemas (OXA-48, NDM y KPC), fosfomicina (fosA3) y colistina (mcr-1). Se encuentra distribuido a nivel mundial como patógeno extraintestinal y como cepa comensal de humanos y animales (de producción, compañía y silvestres) y en el medio ambiente (Hornsey et al. 2011; Mushtaq et al. 2011; Ho et al. 2013; Sato et al. 2014; Guo et al. 2015; Rodrigues et al. 2015; Wailan et al. 2015; Xu et al. 2015; Gonçalves et al. 2016; Liu et al. 2016; Müller et al. 2016; Nakane et al. 2016; Zhang et al. 2016). Pero sin embargo, entre todos los grupos clonales de E. coli portadores de resistencias y genes de virulencia extraintestinales, el grupo clonal ST131, sigue siendo considerado como el linaje predominante entre las cepas ExPEC causantes de un gran porcentaje de las ITU y septicemias humanas, distribuido a nivel mundial y señalado como el principal responsable de la diseminación de BLEE del tipo CTX-M-15 entre los seres humanos. 1.3.5.1. Grupo clonal ST131 En el año 2008 investigadores de España y de Francia llevaron a cabo sendos estudios en cepas de E. coli portadoras de BLEE del tipo CTX-M-15 procedentes de distintos países, incluyendo: España, Francia, Portugal, Suíza, El Líbano, Kuwait y Corea del Sur. Encontraron que todas las cepas de E. coli multirresistentes pertenecientes a la ST131 mostraban el serotipo O25b:H4, el filogrupo B2 y portaban plásmidos del tipo IncF con la BLEE CTX-M15, sugiriendo que este grupo clonal habría aparecido de una forma simultánea en áreas distantes y entre pacientes sin ninguna relación obvia entre sí. (Coque et al. 2008; Nicolas-Chanoine et al. 2008). En el año 2009 la presencia de este grupo clonal se hizo patente en cepas aisladas de la población, de hospitales, entornos sanitarios e I n t r o d u c c i ó n 87 incluso de animales de compañía (Cagnacci et al. 2008; Lau et al. 2008; Suzuki et al. 2009; Yumuk et al. 2008; Literacka et al. 2009; Peirano et al. 2010a, 2010b, 2011). E. coli ST131 pertenece al filogrupo B2 y, aunque la mayoría de las cepas de esta ST pertenecen al serotipo O25b:H4, se han detectado otros, siendo el O16:H5 el segundo más detectado (Johnson et al. 2014; Dahbi et al. 2014). Pese a que la BLEE predominante en este grupo clonal es la CTX-M-15, también ha sido asociado con la producción de otras BLEE, principalmente CTX-M-14, CTX-M-3 y CTX-M-27 (Petty et al. 2014). Puede presentar múltiples perfiles de FV típicos extraintestinales, distintos patrones de resistencia frente a los antimicrobianos y diversos perfiles de PFGE, algunos predominantes globalmente, incluyendo la denominada cepa epidémica A del Reino Unido o el pulsotipo 968 (Johnson et al. 2012a; Lau et al. 2008; Banerjee et al. 2013a). Esta diversidad dentro del mismo grupo clonal se encuentra en relación con la compleja estructura evolutiva que lo caracteriza. Los primeros análisis llevados a cabo mediante PFGE y MLST, en combinación con la secuenciación de los alelos fimH, gyrA y parC, evidenciaron que el ST131 no era un grupo uniforme, permitiendo la identificación de múltiples linajes con distintos patrones de resistencia (Johnson et al. 2013). El más prevalente, denominado H30 por contener esta variante alélica de la adhesina fimbrial fimH mostraba una mezcla de cepas sensibles y resistentes a las FQ y productoras y no productoras de CTX-M-15, sugiriendo una frecuente TGH de las resistencias (Price et al. 2013). Sin embargo, la incorporación de técnicas como la WGS y el análisis de SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) revelaron que la resistencia a las FQ se localizaba en un único subgrupo que 88 presentaba mutaciones puntuales en los genes cromosómicos gyrA y parC que conferían dicha resistencia, denominado H30R y que, la mayoría de las cepas productoras de CTX-M-15, que también portaban dichas mutaciones, formaban un clúster definido relacionado de manera cercana con el H30R, dentro del H30, el cual se denominó H30Rx. Los datos obtenidos de este estudio indicaban que ambos subclones habrían derivado de un ancestro común H30 sensible a las FQ y no productor de BLEE (Price et al. 2013). Mediante estas nuevas técnicas, Petty et al. (2014) confirmaron dichos hallazgos y establecieron en 3 grandes grupos o clados (A, B y C) la estructura clonal del ST131. El clado A, genéticamente más divergente en relación al resto, se caracteriza por la presencia del alelo fimH41 y del alelo de fliC correspondiente al antígeno H5. Este clado pertenece al serotipo O16:H5 y, en comparación con otras cepas ST131, posee distintas combinaciones alélicas de gyrA y parC y una mayor prevalencia de resistencia al trimetoprim-sulfametoxazol y a la gentamicina. El clado B se asocia a la presencia del fimH22 y presenta variantes de gyrA y parC acordes con su sensibilidad frente a las FQ. Se encuentra más relacionado genéticamente con el clado C, compartiendo con él el fliC H4 y mostrando el mismo serotipo (O25b:H4). El clado C agrupa la mayoría de las cepas ST131, porta el alelo fimH30 y comprende dos subgrupos denominados C1 y C2, correspondiéndose con los clados H30R y H30Rx, anteriormente descritos (Figura 7). I n t r o d u c c i ó n 89 FIGURA 7. DENDROGRAMA ESQUÉMATICO DE LA FILOGENIA DEL ST131 RECONSTRUIDO UTILIZANDO WGS. LAS FLECHAS INDICAN LA EMERGENCIA DEL ALELO FIMH30, RESISTENCIA A FQ Y BLEE CTX-M-15. LOS COLORES MUESTRAN LA RESISTENCIA SIGNIFICATIVAMENTE ASOCIADA (AUNQUE NO EXCLUSIVA) DE LOS LINAJES ESPECÍFICOS. TMP-SMZ (TRIMETOPRIM-SULFAMETOXAZOL), R (RESISTENTE). FUENTE: BANERJEE & JOHNSON, 2014. Según las estimaciones de Stoesser et al. (2016), el ancestro común del ST131 habría surgido hace unos 130 años, cuando tuvo lugar la divergencia del clado A en relación al B y C, siendo hace unos 25 años cuando el clado C se separó del B, dividiéndose a continuación en los subclados C1 y C2. Según los resultados del análisis filogenético, la adquisición de múltiples elementos móviles, eventos de recombinación y mutaciones puntuales ocurridas de manera conjunta, serían la causa más probable de la aparición de los subclados más prevalentes (C1 y C2), a consecuencia de la fuerte presión selectiva ejercida por la masiva introducción y uso de las FQ y las cefalosporinas de espectro extendido, marcando así el inicio de la dispersión de las cepas resistentes en todo el mundo y evidenciando la importancia que juega la expansión clonal (además de la TGH) en el éxito del grupo ST131 (Price et al. 2013; Petty et al. 2014; Stoesser et al. 2016). La prevalencia real del grupo clonal ST131 es difícil de estimar dado a que los datos de los que se disponen provienen, en su mayoría, de 90 estudios llevados a cabo en cepas seleccionadas en base a la resistencia antibiótica o a la producción de BLEE. En general se asume que, dentro de la población de E. coli productoras de BLEE, la prevalencia del grupo ST131 es mayor en EE. UU (hasta el 50%) que en Francia (36%) o en España (23%) (Brisse et al. 2012; Banerjee et al. 2013a, 2013b; López-Cerero et al. 2014). En cuanto a los datos extraídos de análisis de muestras clínicas humanas (ITU, bacteremias…) se observa una tendencia claramente ascendente del aislamiento de cepas de E. coli BLEE del grupo ST131 implicadas en dichas infecciones, entre inicios del 2000 al año 2010 a nivel global (Johnson et al. 2012b; Peirano et al. 2012; Karfunkel et al. 2013). En mascotas se aísla por primera vez asociado a la producción de BLEE del tipo CTX-M-15 en el año 2009, en un perro con ITU en Portugal (Pomba et al. 2009), hecho que se interpreta como la posible entrada de este grupo clonal humano en la población animal, siendo detectado posteriormente, tanto en otros animales de compañía como en animales destinados al consumo humano, aislándose cepas ST131 productoras de BLEE del tipo CTX-M, SHV, resistentes a FQ, cepas sensibles y cepas no productoras de BLEE, en ocasiones genéticamente idénticas a cepas aisladas de humanos de la misma zona, evidenciando una posible transmisión, no sólo entre los propios animales, si no entre los humanos y los animales analizados (Johnson et al. 2009; Cortés et al. 2010; Ewers et al. 2010; Guenther et al. 2010a; Mora et al. 2010; Platell et al. 2010; Vincent et al. 2010; Albrechtova et al. 2012; Giufrè et al. 2012; Harada et al. 2012; Guo et al. 2013). La primera aparición del grupo ST131 en fauna silvestre se registra en el año 2010 en cepas aisladas de gaviotas de Bering (Larus glaucescens) en las remotas islas Commander (Rusia) evidenciando la presencia del grupo clonal O25b:H4-ST131 productor de CTX-M- I n t r o d u c c i ó n 91 15 en las poblaciones de aves silvestres. A partir de este estudio, el grupo clonal ST131 ha sido detectado en distintas especies de género Larus en varias localizaciones como Portugal, Chile, o Canadá, portando enzimas CTX-M-15, CTX-M-14, CTX-M-1 o CTXM-32 (Simões et al. 2010; Báez et al. 2015; Bonnedahl et al. 2015). Además, han sido aisladas cepas de E. coli pertenecientes a este grupo clonal productoras de CTX-M-9 en otras especies animales, como en el caso de ratas pardas (Rattus norvegicus) en la ciudad de Berlín (Guenther et al. 2010a). Recientemente, Alcalá et al. (2016) aislaron una cepa de E. coli ST131 resistente a FQ y productora de la BLEE CTX-M-14 en un milano negro (Milvus migrans) procedente del norte de España. El alcance de la diseminación geográfica de este grupo clonal en fauna silvestre es tal, que ya está presente en ecosistemas marinos antárticos (Power et al. 2016). M a t e r i a l e s y M é t o d o s 99 3.1. Cepas control y conservación de las cepas En todos los ensayos de PCR se incluyeron cepas control para las características analizadas (Tabla 9). TABLA 9. CEPAS CONTROL DE REFERENCIA CEPA DIANA ExPEC FV10041 fimH, fimAvMT78, papEF, papG III, sfa/focDE, cnf1, hlyA, iroN, KpsM II, KpsM II-K2, neuC, ibeA, malX, usp, uidA FV10042 fimH, papEF, papG I, cnf1, hlyA, iroN, KpsM II, KpsM II-K2, kpsM II-K5, neuC, malX, usp, uidA FV14003 fimH, papEF, papG II, cdtB, sat, iroN, KpsM II, KpsM II-K2, kpsM II-K5, malX, usp, uidA FV10044 iucD, iutA, cvaC, iss, traT, tsh FV10045 afa/draBC, sat, iucD, iutA, traT FV17134 KpsM III ECVT/ECEP IH2859f eae, bfpA FV10096 eae-β1 RESISTENCIAS FV9650 blaCTX-M, blaCTX-M grupo 1, blaCTX-M grupo 9, blaTEM FV10798 blaSHV FV17090 blaCTX-M grupo 1 H2397 blaCTX-M grupo 9 FV17881 LAT-1 a LAT-4, CMY-2 a CMY-7, BIL-1 FV20151 mcr-1 GRUPO FILOGENÉTICO FV10042 chuA, yjaA, TSPE O157-1103 arpA, filogrupo E FV19459 trapA, filogrupo C ANTÍGENOS O Y H FV17090 rfbO25b, fliCh4 LREC-O16 wzx-O16 LREC-H1 fliCh1 LREC-H2 fliCh2 LREC-H4 fliCh4 LREC-H7 fliCh7 LREC-H8 fliCh8 LREC-H9 fliCh9 LREC-H10 fliCh10 LREC-H11 fliCh11 LREC-H21 fliCh21 100 Las cepas de E. coli identificadas en este estudio, al igual que todas las cepas control, se conservaron sembrándolas por picadura en agar nutritivo 0,75% (p/v) y fueron almacenadas a temperatura ambiente en tubos Vacutainer™ estériles. En estas condiciones, las cepas de E. coli mantienen su viabilidad sin necesidad de resiembra durante al menos 5 años. Para la preparación del medio de conservación agar nutritivo 0,75% (p/v) se empleó una mezcla de agar nutritivo (11,5 g/l) (DifcoTM) y caldo nutritivo (4 g/l) (DifcoTM). 3.2. Naturaleza y procedencia de las muestras En el presente estudio se analizaron las muestras recogidas mediante hisopado cecal de una selección de aves (rapaces, láridos, columbiformes, zancudas y córvidos) y mediante hisopado rectal de dos especies de mamíferos silvestres (zorros y jabalíes), recogidas en el marco de sendos proyectos de investigación desarrollados en el Laboratorio de Referencia de Escherichia coli (LREC), del Departamento de Microbioloxía e Parasitoloxía de la USC: “Las aves silvestres como trasmisoras de Escherichia coli productoras de betalactamasas de espectro extendido (BLEE)” y “Fuentes de transmisión del grupo clonal pandémico ST131 de Escherichia coli. Caracterización molecular del patógeno y de su virulencia in vivo, evaluación de riesgos”. 3.2.1. Aves silvestres En el primer estudio se muestrearon 390 aves silvestres procedentes de las 4 provincias gallegas y de Asturias, recogidas entre los años M a t e r i a l e s y M é t o d o s 101 2012 y 2015. La mayoría de las gaviotas y palomas del estudio se obtuvieron en las campañas de control de poblaciones. Estas campañas fueron realizadas por empresas autorizadas, de acuerdo con la legislación correspondiente y bajo control veterinario. El resto de las aves muestreadas provenían de ingresos en alguno de los Centros de Recuperación de Fauna Silvestre (CRFS) donde habían fallecido por diversos motivos, o habían sido sacrificadas por tratarse de casos clínicos irrecuperables. Cabe destacar que las aves analizadas en este estudio no habían recibido ningún tipo de tratamiento antibiótico, ni habían permanecido un tiempo prolongado en los CRFS. La necropsia de todas las aves se llevó a cabo en las instalaciones de la Facultade de Veterinaria de Lugo (USC), momento en el que fue realizada la toma de datos (procedencia, sexo y edad) de cada animal (Figura 8), así como la toma de muestras para el aislamiento microbiológico directamente del contenido cecal mediante el uso de hisopos estériles con medio de transporte Amies (Deltalab®). Los hisopos recogidos se conservaron a 4 ºC hasta su análisis en el laboratorio. En la Tabla 10 figura la correlación de las 390 muestras con el tipo de ave de procedencia. 102 FIGURA 8. DISTRIBUCIÓN DE LAS 390 AVES SILVESTRES MUESTREADAS SEGÚN ORIGEN, SEXO Y EDAD DE LOS EJEMPLARES. Nº MUESTRAS (%) TABLA 10. TIPO Y NÚMERO DE AVES ANALIZADAS EN EL PRESENTE ESTUDIO GRUPO Nº MUESTRAS TIPO DE AVE (Nº) Rapaces 103 ratonero (49), lechuza (26), gavilán común (9), cárabo (5), azor común (4), halcón peregrino (5), mochuelo (2), milano negro (1), águila calzada (1), cernícalo (1) Láridos 107 gaviota patiamarilla (107) Columbiformes 100 paloma común (97), tórtola (2), paloma torcaz (1) Zancudas 60 cigüeña blanca (28), garza real (10), cormorán (22) Córvidos 20 corneja (10), urraca común (5), grajilla (3), arrendajo (2) 3.2.2. Mamíferos silvestres En relación con el segundo estudio se muestrearon 230 mamíferos silvestres, concretamente 123 zorros y 107 jabalíes procedentes de las 4 provincias gallegas (Figura 9). La mayoría de las muestras se obtuvieron en el ámbito de las actividades cinegéticas legalmente autorizadas por los organismos competentes de la Xunta de Galicia M a t e r i a l e s y M é t o d o s 103 durante los años 2014 y 2015, atendiendo a sus limitaciones temporales (épocas de caza y batidas), o espaciales (respetando los espacios protegidos y libres de caza) (LEY 13/2013). Dichas muestras se obtuvieron en colaboración con la Federación Galega de Caza (FGC), asociaciones cinegéticas (representan, aproximadamente, a medio centenar de TECORES colaboradores de las 4 provincias gallegas) y clínicas veterinarias asociadas. Finalmente, una pequeña parte de las muestras de mamífero procedió de los CRFS, correspondiendo a animales atropellados, que habían sufrido algún otro tipo de traumatismo, caza ilegal o que resultaron muertos durante su estancia por diversos motivos. En la Figura 9 se muestra la distribución de los mamíferos muestreados según su procedencia y sexo. FIGURA 9. DISTRIBUCIÓN DE LOS 230 MAMÍFEROS SILVESTRES MUESTREADOS SEGÚN SU PROCEDENCIA Y SEXO. Nº MUESTRAS (%) 104 De cada animal analizado (proveniente de los CRFS o de las batidas controladas), fue recogida una muestra in situ por los equipos veterinarios mediante hisopado rectal. Se emplearon hisopos estériles con medio de transporte Amies (Deltalab®). Las muestras se conservaron a 4 ºC hasta su envío al laboratorio para su análisis microbiológico. Por tanto, en el presente estudio se muestrearon un total de 620 animales silvestres, 390 aves y 230 mamíferos, incluyendo 24 especies que habitan o transitan habitualmente el noroeste de la Península Ibérica y que, debido a sus hábitos alimentarios o territoriales, mantienen un contacto estrecho con hábitats de influencia humana (Tabla 11). Para ninguno de los muestreos fue necesario solicitar el informe favorable del Comité de Bioética de la USC, puesto que no entraban en el ámbito de aplicación del RD 53/2013 (artículo 2, punto 5) por no tratarse de animales de experimentación, ni infringirse daño alguno al animal. M a t e r i a l e s y M é t o d o s 105 TABLA 11. DISTRIBUCIÓN POR FAMILIA Y ESPECIE DE LOS 620 ANIMALES DEL ESTUDIO FAMILIA ESPECIE NOMBRE COMÚN NÚMERO DE ANIMALES Accipitridae Buteo buteo ratonero 49 Accipiter nisus gavilán común 9 Accipiter gentilis azor común 4 Milvus migrans milano negro 1 Hieraaetus pennatus águila calzada 1 Tytonidae Tyto alba lechuza común 26 Strigidae Strix aluco cárabo común 5 Athene noctua mochuelo 2 Falconidae Falco peregrinus halcón peregrino 5 Falco tinnunculus cernícalo 1 Laridae Larus michahellis gaviota patiamarilla 107 Columbidae Columba livia paloma doméstica 97 Columba palumbus tórtola 2 Streptopelia turtur paloma torcaz 1 Ciconiidae Ciconia ciconia cigüeña blanca 28 Ardeidae Ardea cinerea garza real 10 Phalacrocoracidae Phalacrocorax aristotelis cormorán moñudo 2 Phalacrocorax carbo cormorán grande 20 Corvidae Pica pica urraca común 5 Corvus corone corneja 10 Garrulus glandarius arrendajo 2 Corvus monedula grajilla 3 Suidae Sus scrofa jabalí 107 Canidae Vulpes vulpes zorro rojo 123 3.3. Aislamiento y detección de cepas de E. coli Para el aislamiento y detección de cepas de E. coli productoras de BLEE, de otras resistencias y del grupo clonal ST131, las 620 muestras obtenidas por hisopado cecal (aves) y rectal (mamíferos) se sembraron por duplicado en los medios selectivos y diferenciales agar MacConckey Lactosa, Oxoid (ML) y agar chromID de bioMérieux (ESBL) siguiendo el protocolo esquematizado en la Figura 10. 106 El ESBL es un medio cromogénico diseñado especialmente para la detección de cepas productoras de BLEE. Se compone de varias peptonas nutritivas y de una mezcla de antibióticos, incluyendo la cefpodoxima (uno de los marcadores de BLEE recomendados por el Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI), que facilitan el crecimiento selectivo de enterobacterias productoras de estas enzimas (Amélie Carrër et al. 2010). Además, contiene dos sustratos cromogénicos que permiten la identificación directa de las enterobacterias productoras de BLEE más frecuentes (Imagen 1). Mediante la reacción de las enzimas producidas por las bacterias presentes con dichos sustratos podremos distinguir: o Cepas de E. coli productoras de beta-glucuronidasa como colonias rosas/rojizas. o Cepas de los géneros Klebsiella, Enterobacter, Serratia y Citrobacter productoras de beta-glucosidasa como colonias de verde a azuladas. o Cepas del género Proteus productoras de enzimas desaminasas como colonias marrones. IMAGEN 1. DENTIFICACIÓN CROMOGÉNICA DE DIFERENTES CEPAS PRODUCTORAS DE BLEE. FUENTE: HTTP://WWW.BIOMERIEUX-DIAGNOSTICS.COM K. pneumoniae ATCC 700603 E. coli CIP 103982 P. mirabilis ATCC BAA-896 M a t e r i a l e s y M é t o d o s 107 En este estudio hemos valorado por primera vez la eficacia del medio ESBL frente a medios convencionales (ML) para la recuperación de cepas de E. coli productoras de BLEE en coprocultivos de animales silvestres. Además, incluimos el medio ML para la posible recuperación de colonias del grupo clonal ST131 no productoras de BLEE. FIGURA 10. ESQUEMA DEL PROTOCOLO UTILIZADO PARA EL AISLAMIENTO Y DETECCIÓN DE CEPAS DE E. COLI 114 DIANA PRIMERS SECUENCIA NUCLEOTÍDICA (5´- 3´) TAMAÑO (pb) Tª DE HIBRIDACIÓN °C REFERENCIA malX MALX-F GCATGAGCAGTGCGATACATCGC 828 56 Mora et al. 2013 MALX-R AGGGCTGGGAAGTGGTTTAGCC usp usp-F ACATTCACGGCAAGCCTCAG 440 66 Bauer et al. 2002 usp-R AGCGAGTTCCTGGTGAAAGC iutA aer-851F GGCTGGACATCATGGGAACTGG 301 58-62 Johnson et al. 1997 aer1152R CGTCGGGAACGGGTAGAATCG tsh tsh03 GGTGGTGCACTGGAGTGG 640 64 Dozois et al. 2000 tsh15 AGTCCAGCGTGATAGTGG * DETERMINACIÓN DEL TIPO DE CÁPSULA EN BASE A LOS RESULTADOS DE PCR PARA ESTAS REGIONES DIANA (VER TABLA 16) TABLA 16. TIPO DE CÁPSULA ASIGNADA EN BASE A LOS RESULTADOS DE PCR PARA KPSM II, NEUC, KPSM II-K2 Y KPSM II-K5 TIPO DE CÁPSULA REGIÓN DIANA kpsM II neuC kpsM II-K2 kpsM II-K5 kpsM II-K1 + + + - kpsM II-K2 + - + - kpsM II-K5 + - + + TABLA 17. PRIMERS UTILIZADOS PARA LA DETERMINACIÓN DEL ANTÍGENO O DIANA PRIMERS SECUENCIA NUCLEOTÍDICA (5´- 3´) TAMAÑO (pb) Tª DE HIBRIDACIÓN °C REFERENCIA rfbO25b rfb. 1bis.f ATACCGACGACGCCGATCTG 300 55 Clermont et al. 2008 rfbO25b.r TGCTATTCATTATGCGCAGC wzx-O16 wzx-F GGTTTCAATCTCACAGCAACTCAG 302 66 Li et al. 2010 wzx-R GTTAGAGGGATAATAGCCAAGCGG M a t e r i a l e s y M é t o d o s 115 TABLA 18. PRIMERS UTILIZADOS PARA LA DETERMINACIÓN DEL ANTÍGENO H EN BASE A LA DETECCIÓN DE GEN FLIC ESPECÍFICO DIANA PRIMERS SECUENCIA NUCLEOTÍDICA (5´- 3´) TAMAÑO (pb) Tª DE HIBRIDACIÓN °C REFERENCIA fliCH1 H1-F2 TATCCGGTCAGACCCAGTTC 828 60ºC LREC (Mamani, 2014) H1-R2 TTGCGGATGTATCACCGTTA fliCH2 H2-F AACGACGGCGAAACAATTAC 828 58ºC LREC (Mamani, 2014) H2-R AGAACGCAACGAGTCAACCT fliCH4 H4-F GCAGCGTATTCGTGAACTGA 713 66ºC Mora et al. 2011 H4-R GCTGGATAATCTGCGCTTTC fliCH7 H7-F GCGCTGTCGAGTTCTATCGAGC 625 55ºC Gannon et al. 1997 H7-R CAACGGTGACTTTATCGCCATTCC fliCH8 H8-F TAACAGCGCAAAAGACGATG 393 58ºC Mora et al. 2012 H8-R CCGAGAGTTTTCGCATCAAT fliCH9 H9-F ACGAAATCAAATCCCGTCTG 649 62ºC Mora et al. 2012 H9-R GCGGTATCGTTACCTGCATT fliCH10 H10-F AGCAAGTGGCAGTAGGTGCT 624 62ºC LREC (Mamani, 2014) H10-R GCTGGATAATCTGCGCTTTC fliCH11 H11-F ACTGTTAACGTAGATAGC 248 52ºC Durso et al. 2005 H11-R TCAATTTCTGCAGAATATAC fliCH18 H18-F1 TTCTGACCTGGACTCCATCC 827 60ºC LREC (Mamani, 2014) H18-R1 CGTTAGCAAACGTTGAAGCA fliCH21 H21-F GGCGATTGCTAACCGTTTTA 549-556 58ºC Mora et al. 2012 H21-R3 CGTAAGTGAACCATCCGCAG La determinación de los principales grupos filogenéticos A, B1, B2 y D se llevó a cabo siguiendo el método descrito por Clermont et al. (2000), utilizando para ello los primers para la detección de los genes chuA, yjaA y el fragmento TSPE4.C2 (Tabla 21). La interpretación de los resultados de las amplificaciones y la asignación a los filogrupos se realizó en base a la presencia o ausencia de los 3 marcadores genéticos. (Tabla 20). 116 TABLA 20. GRUPO FILOGENÉTICO ASIGNADO EN BASE A LOS RESULTADOS DE PCR PARA LAS 3 REGIONES DIANA GRUPO FILOGENÉTICO chuA yjaA TSPE4.C2 A - + / - - B1 - + / - + B2 + + + / - D + - + / - Inicialmente, y puesto que la mayoría de los estudios publicados utilizan este esquema reducido de grupos filogenéticos, lo aplicamos en el filogrupado de las cepas de nuestro estudio. Sin embargo, actualmente están reconocidos 8 grupos filogenéticos de E. coli, 7 pertenecientes a E. coli propiamente dicho (A, B1, B2, C, D, E, F) y uno correspondiente a Escherichia clade I (Ludo et al. 2011; Clermont et al. 2013). Decidimos aplicar el nuevo esquema ampliado descrito por Clermont et al. (2013) y completar la caracterización del grupo filogenético de nuestras cepas, incluyendo la detección del gen arpA y de las dianas específicas para el filogrupo E y C (Tabla 21). Al igual que en el protocolo anterior, la asignación del filogrupo se basa en la determinación de la presencia o ausencia de marcadores genéticos (en este caso 6), tal y como se refleja en la Tabla 22. TABLA 21. PRIMERS UTILIZADOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LOS GRUPOS FILOGENÉTICOS DIANA PRIMER SECUENCIA NUCLEOTÍDICA (5´- 3´) TAMAÑO (pb) Tª DE HIBRIDACIÓN REFERENCIA chuA ChuA.1 GACGAACCAACGGTCAGGAT 279 62 Clermont et al. 2000 ChuA.2 TGCCGCCAGTACCAAAGACA yjaA YjaA.1 TGAAGTGTCAGGAGACGCTG 211 54 Clermont et al. 2001 YjaA.2 ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC TSPE4.C2 TspE4.C2.1 GAGTAATGTCGGGGCATTCA 152 54 Clermont et al. 2002 TspE4.C2.2 CGCGCCAACAAAGTATTACG arpA AceK.f AACGCTATTCGCCAGCTTGC 400 62 Clermont et al. 2013 ArpA1.r TCTCCCCATACCGTACGCTA arpA ArpAgpE.f GATTCCATCTTGTCAAAATATGCC 301 58 Lescat et al. 2013 (filogrupo E) ArpAgpE.r GAAAAGAAAAAGAATTCCCAAGAG trapA trpAgpC.1 AGTTTTATGCCCAGTGCGAG 219 58 Lescat et al. 2013 (filogrupo C) trpAgpC.2 TCTGCGCCGGTCACGCCC M a t e r i a l e s y M é t o d o s 117 TABLA 22. GRUPO FILOGENÉTICO ASIGNADO EN BASE A LOS RESULTADOS DE PCR PARA 6 REGIONES DIANA GENOTIPO arpA chuA yjaA TSPE4.C2 FILOGRUPO PCR ESPECÍFICAS GRUPO E y C + - - - A + - - + B1 - + - - F - + + - B2 - + + + B2 - + - + B2 + - + - A/C Usar primers específicos trpAgpC. Si C+=C, si C- =A + + - - D/E Usar primers específicos arpAgpE. Si E+=E, si E- =D + + - + D/E Usar primers específicos arpAgpE. Si E+=E, si E- =D + + + - E/Clade I Usar primers específicos arpAgpE. Si Econfirmar Clade I usando primers Clade (a) ADAPTADO DE CLERMONT ET AL. 2013 (A). CLERMONT ET AL. (2011) 3.4.2. Secuenciación La secuenciación de fragmentos de ADN para el tipado molecular de genes blaBLEE y de otros factores de resistencia, clonotipado y secuenciación multilocus de las cepas se llevó a cabo en el servicio de Secuenciación e Xenómica Funcional del departamento de genética de la Facultade de Veterinaria del Campus de Lugo (USC). La secuenciación fue realizada mediante el método Sanger, empleando un analizador genético ABI 3100 (Applied Biosystems) con los reactivos BigDye Terminador v3.1 cycle sequencing kit. Los primers utilizados para la secuenciación figuran en las Tablas 12, 24 y 25. 3.5. Identificación y caracterización fenotípica Se realizaron las pruebas de identificación fenotípica, así como las pruebas de sensibilidad antimicrobiana de las cepas. Además, se determinaron mediante técnicas de aglutinación, los antígenos O y H 118 que permitieron la determinación del serotipo. 3.5.1. Identificación y sensibilidad antimicrobiana La identificación fenotípica de las cepas y las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos se realizaron en la Unidad de Microbiología del Hospital Universitario Lucus Augusti (HULA) mediante el sistema automatizado MicroScan WalkAway 96 Plus (Siemens Healthcare Diagnostics, CA, USA), utilizando los paneles para bacilos gram negativos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los 20 antibióticos incluidos en los paneles para la determinación de su concentración mínima inhibitoria (CMI) fueron los siguientes (Tabla 23): penicilinas (ampicilina); inhibidores de betalactamasas (amoxicilina/ácido clavulánico, piperacilina/tazobactam,); cefalosporinas (cefalotina, cefazolina, cefuroxima, cefotaxima, ceftazidima y cefepima); cefamicinas (cefoxitina), carbapenemas (imipenem, ertapenem); aminoglucósidos (gentamicina, tobramicina); quinolonas (ácido nalidíxico, ciprofloxacina y norfloxacina); sulfonamidas (trimetoprim-sulfametoxazol); fosfonatos (fosfomicina) y nitroderivados (nitrofurantoína). Las CMI para cada antimicrobiano se determinaron en base a los estándares establecidos por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2015) (Tabla 23). Los valores de sensibilidad intermedios se muestran con un asterisco en nuestros resultados. Todas las cepas que superaron los valores de concentración intermedia establecida se clasificaron como resistentes. M a t e r i a l e s y M é t o d o s 119 TABLA 23. ESTÁNDARES ESTABLECIDOS POR EL CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE PARA LAS CMI DE LOS ANTIBIÓTICOS UTILIZADOS (CLSI, 2015) FAMILIA/GRUPO AGENTE ANTIMICROBIANO CRITERIO DE INTERPRETACIÓN (μg/ml) SENSIBLE INTERMEDIO RESISTENTE PENICILINAS ampicilina (AMP) ≤ 8 16 ≥ 32 INHIBIDORES DE BLEE amoxicilina+ ac. clavulánico (AMC) ≤ 8/4 16/8 ≥ 32/16 piperaciclina+ tazobactam (TZP) ≤ 16/4 32/4–64/4 ≥ 128/4 CEFALOSPORINAS cefazolina (CFZ) ≤ 16 ≥ 32 cefalotina (CEF) ≤ 8 16 ≥ 32 cefuroxima (CXM) ≤ 8 16 ≥ 32 ceftazidima (CAZ) ≤ 4 8 ≥ 16 cefotaxima (CTX) ≤ 1 2 ≥ 4 cefepima (FEP) ≤ 2 4–8 ≥ 16 CEFAMICINAS cefoxitina (FOX) ≤ 8 16 ≥ 32 CARBAPENEMAS imipenem (IPM) ≤ 1 2 ≥ 4 ertapenem (ETP) ≤ 0,5 1 ≥ 2 AMINOGLUCÓSIDOS gentamicina (GEN) ≤ 4 8 ≥ 16 tobramicina (TOB) ≤ 4 8 ≥ 16 NITRODERIVADOS nitrofurantoína (NIT) ≤ 32 64 ≥ 128 FOSFONATOS fosfomicina (FOF) ≤ 64 128 ≥ 256 QUINOLONAS ácido nalidíxico (NAL) ≤ 16 ≥ 32 ciprofloxacina (CIP) ≤ 1 2 ≥ 4 norfloxacina (NOR) ≤ 4 8 ≥ 16 SULFONAMIDAS sulfametoxazol+trimetoprim (SXT) ≤ 2/38 ≥ 4/76 3.5.1.1. Prueba de sinergia de doble disco En algunos casos, la comprobación de la producción de betalactamasas de espectro extendido y de tipo AmpC se realizó, además, mediante las pruebas fenotípicas de sinergia y disco combinado (Seral et al. 2012). La prueba de sinergia de doble disco (Double Disc Synergy Test, DDST) fue el primer método propuesto para la detección de cepas productoras de BLEE en enterobacterias (Jarlier et al. 1988). Se lleva a cabo en medio sólido (placa de agar MuellerHinton (MH), Panreac) aplicando el siguiente procedimiento: o A partir del crecimiento de la cepa seleccionada en TSA, recoger el equivalente a 3-5 colonias y suspender en 5 ml de suero fisiológico o en medio líquido caldo de triptona de soja, Oxoid (TSB). Ajustar el inóculo a una turbidez equivalente a 0,5 de la 120 escala McFarland (1,5 x108 bacterias/ml). o Realizar una siembra en césped en la placa de MH y esperar de 3 a 5 minutos antes de depositar los discos. Se debe utilizar un disco de amoxicilina-clavulánico (20 μg/10 μg) y en torno a éste, separados 30 mm (de centro a centro), disponer discos de cefotaxima, ceftazidima (cefalosporinas de 3ª generación); aztreonam (monobactama) y cefepima (cefalosporina de 4ª generación) con una carga estándar de 30 μg. Esperar 15 min e incubar las placas 37 ºC/24 h. Considerar el resultado positivo cuando se produzca una ampliación del halo de inhibición en los discos colocados en torno a la amoxicilina-clavulánico (Imagen 2) con una imagen característica de “cerradura” o “corcho de champagne” (Drieux et al. 2008). Si además se observara algún indicio de resistencia en torno al inhibidor y/o indicios de sensibilidad frente a la cefepima podría sugerir que la cepa es productora de betalactamasas de tipo AmpC. IMAGEN 2. CONFIRMACIÓN FENOTÍPICA DE BLEE MEDIANTE LA PRUEBA DE SINERGIA DE DOBLE DISCO (DDST) M a t e r i a l e s y M é t o d o s 121 3.5.1.2. Prueba de discos combinados con inhibidor El procedimiento se lleva a cabo en medio MH, a partir del crecimiento de la cepa seleccionada en TSA. Se debe recoger la cantidad suficiente para obtener un inóculo en suero fisiológico o en TSB ajustable a 0,5 en la escala McFarland. El fundamento de esta prueba es el estudio de sensibilidad frente a la cefotaxima y la ceftazidima en presencia o ausencia de ácido clavulánico, mediante la prueba de difusión en agar con discos. Para ello, se disponen discos de cefotaxima y ceftazidima con y sin inhibidor (habitualmente ácido clavulánico) en torno a un disco de cefoxitina. Se confirma la presencia de una cepa productora de BLEE cuando la sensibilidad a cualquiera de los 2 antibióticos en presencia del ácido clavulánico aumenta, en más de 5 mm, el diámetro de inhibición (Imagen 3). Un halo indicativo de resistencia frente al disco de cefoxitina también podría sugerir la presencia de enzimas tipo AmpC, aunque en este caso se recomienda la utilización de cloxacilina o ácido borónico como inhibidor para evaluar el cambio de diámetro de los discos y evitar la posibilidad de enmascarar dicho efecto (Calvo et al. 2011). IMAGEN 3. CONFIRMACIÓN FENOTÍPICA DE BLEE MEDIANTE LA PRUEBA DE DISCOS COMBINADOS CON INHIBIDOR 122 El tipado molecular de los genes blaBLEE de las cepas positivas se llevó a cabo según se especifica en el apartado 3.4.2, usando los primers descritos en la Tabla 12. 3.5.2. Serotipado La determinación del antígeno O y H de las cepas fue realizada siguiendo la metodología originalmente descrita por Guinée et.al (1981). 3.5.2.1. Determinación del antígeno O La determinación del antígeno O de las cepas se llevó a cabo mediante la técnica de microaglutinación en placa. Para ello se emplearon 176 antisueros O capaces de reaccionar específicamente con los antígenos O1 a O185 de E. coli. Estos antisueros se obtienen en el LREC mediante inmunización de conejos con las cepas de referencia correspondientes. Los sueros extraídos de los animales son adsorbidos para eliminar reacciones cruzadas. Además de los antisueros O monovalentes, se dispone de 24 antisueros O polivalentes (A–X) formados por 6 ó 7 de los antisueros monovalentes, cuya dilución final en el polivalente coincide con la dilución de ensayo (1/40 ó 1/80). Preparación de las suspensiones bacterianas o Cultivar las cepas problema en TSA e incubar (37 °C/18 h). o Suspender el crecimiento que hemos obtenido en TSA en 2 ml de solución salina (0,85% ClNa p/v) y ajustar la concentración bacteriana (1,8 x 109 bacterias/ml) por comparación con el tubo número 6 de la escala McFarland. M a t e r i a l e s y M é t o d o s 123 o Calentar las suspensiones a 100 °C/1 h en baño de agua, permitiendo destruir el antígeno K en caso de que la cepa posea cápsula y desenmascarar así el antígeno O. o Una vez enfriadas las suspensiones, añadir a cada tubo 2 ml de solución salina formalinizada (0,5% v/v) con violeta de genciana (0,005% p/v). Conservar las suspensiones bacterianas a 4 °C durante un máximo de 1 semana. o Algunas cepas de los serogrupos O8, O9, O20 y O101 se caracterizan por tener una variedad de antígeno K que es termorresistente, por lo que necesita una exposición a 121 °C/2,5 h para su inactivación. Por ello, si la cepa problema resulta negativa tras enfrentarla con todos los antisueros, preparar una segunda suspensión y autoclavar a 121 °C/2,5 h para enfrentarla con los antisueros O8, O9, O20 y O101. Determinación presuntiva del serogrupo O o Enfrentar las suspensiones calentadas a 100 C/1 h con los 24 antisueros polivalentes y las tratadas a 121 C/2,5 h con los antisueros monovalentes O8, O9, O20 y O101 a la dilución de ensayo. Para ello, añadir a 50 μl de cada antisuero, 50 μl de la suspensión bacteriana calentada, formalinizada y teñida. Tapar la placa e incubar (37 C/18 h). o En los pocillos positivos, la aglutinación provoca la formación de una biopelícula que impide la sedimentación de las bacterias. En los pocillos negativos, las bacterias sedimentan dando lugar a la formación de unos cúmulos que se visualizan en forma de botones azulados (Imagen 4). 130 población bacteriana, para las que se presupone un ancestro común reciente (complejo clonal), y en conocer cómo emergieron y se diversificaron (Feil et al. 2004). Por tanto, este algoritmo permite: generar grupos que reflejan las relaciones entre las ST de una población y compararlos con una base de datos MLST, predecir el genotipo fundador (ancestro) para cada complejo clonal, y calcular el valor bootstrap para cada asignación (Spratt et al. 2004). En el presente estudio analizamos mediante el algoritmo eBURST V3 (http://www.eburst.mlst.net/) los resultados de MLST obtenidos para nuestras cepas, junto con la base completa MLST de E. coli obtenida a través de la página web de la universidad de Warwick (http: //mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli/GetTableInfo_html), que a fecha de marzo 2016 incluía 4.910 ST y 56 complejos ST. Para el análisis se aplicó el criterio más conservador, de forma que los datos de MLST fueron subdivididos en grupos no solapantes de ST relacionadas o Complejos Clonales (CC), de manera que todos los miembros de un mismo grupo compartieron alelos idénticos en ≥6 de los 7 loci con al menos otro miembro del grupo. El genotipo fundador (ancestro) de cada CC quedó identificado como aquel dentro del grupo con el mayor número de variantes en un único locus = single locus variants (SLV) relacionados. En algunos casos, un SLV del fundador primario puede diversificar para producir múltiples SLV y se identifica como un fundador de un subgrupo (Feil et al. 2004). 3.6.4. Electroforesis en campo pulsado La técnica de PFGE es una herramienta de subtipado molecular con un poder de discriminación superior a los métodos de ribotipado y MLST. Es un método de referencia para muchas redes y M a t e r i a l e s y M é t o d o s 131 organizaciones mundiales (PulseNet, FoodNet, EU-RL VTEC) especialmente en estudios epidemiológicos locales en los que interesa detectar cepas implicadas en brotes y sus fuentes de origen (Tenover et al. 1995). Esta técnica se basa en el análisis de perfiles de macrorrestricción obtenidos mediante el empleo de enzimas de restricción (en nuestro caso utilizamos XbaI, Thermo scientific). Esta enzima corta de manera infrecuente el ADN cromosómico para generar grandes fragmentos de ADN (mayores de 40 kb), que no se podrían separar mediante electroforesis convencional. Para conseguir separar estos fragmentos, se alterna cíclicamente la orientación del campo eléctrico durante el proceso (Figura 11). FIGURA 11. ESQUEMA DE LA TÉCNICA DE PFGE. FUENTE: HTTP://WWW.CDC.GOV/PULSENET/PATHOGENS/PROTOCOL-IMAGES.HTML#PFGE Para el análisis de los perfiles de macrorrestricción obtenidos con XbaI se utilizó el programa BioNumerics version 5.0. (Applied Maths, 132 Sint-Martens-Latem) para generar dendrogramas mediante el método de UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic averages) utilizando medias aritméticas, y aplicando el coeficiente de similitud Dice con un nivel de tolerancia en la posición de bandas del 1,0%. Mediante esta metodología, se consideró que las cepas comparadas estaban próximamente relacionadas (alto grado de similitud) y definían un clúster, si el valor del coeficiente Dice era ≥85%, en concordancia con el criterio definido por Tenover (≤6 bandas de diferencia). La técnica de PFGE se llevó a cabo en un equipo CHEF MAPPER (Bio-Rad) de acuerdo con el protocolo estandarizado de PulseNet (http://www.cdc.gov/pulsenet/PDF/ecolishigella-salmonella-pfgeprotocol-508c.pdf) con pequeñas modificaciones. Brevemente: Lisis celular o Suspender en 2 ml de CSB (100 mM Tris; 100 mM EDTA; pH 8) las cepas bacterianas crecidas en TSA 18-24 h a 37 °C, incluida la cepa control Salmonella Braenderup. o Medir absorbancia a 420 nm. o Preparar 400 μl de la suspensión a una concentración de 0,9 (ajustar con CSB). o Añadir a cada suspensión 20 μl de proteinasa K (Thermo scientific) de una concentración de 20 mg/ml. o Mezclar los 400 μl de la suspensión bacteriana anterior con 400 μl de agarosa al 1% previamente atemperada a 55 °C [agarosa para bloques = 0,50 g de agarosa SeakemGold (Lonza), 50 ml de buffer TE (10 mM Tris (Sigma), 1 mM EDTA (Merck); pH 8)], y preparar los bloques (2 bloques por muestra). Dejar solidificar unos 15 min a temperatura ambiente o 5 min a 4 °C. M a t e r i a l e s y M é t o d o s 133 o En tubos de 10 ml añadir 5 ml de buffer de lisis [50 mM Tris: 50 mM EDTA + 1% Sarkosyl (Sigma); pH8] y 25 μl de proteinasa K (20 mg/ml). Depositar los bloques en los tubos correspondientes. o Incubar 3 h a 55 °C en agitación. o Retirar el buffer de lisis. Lavar con 5 ml de agua bidestilada previamente atemperada a 50 °C, 20 min en agitación a 50 °C. o Realizar otro lavado con agua en las mismas condiciones. o Retirar el agua y realizar 3 lavados con 5 ml de buffer TE (10 mM Tris: 1 mM EDTA; pH 8) previamente atemperado a 50 °C. Cada lavado será de 20 min a 50 °C en agitación. o Retirar el TE y añadir 5 ml de TE fresco. Conservar así los bloques a 4 °C hasta el día siguiente. Digestión del ADN o Cortar una porción del bloque de agarosa de un grosor de 1 a 2 mm e introducirlo en un tubo eppendorf. Se realiza en 2 pasos: 1. Preincubación: en el termobloque a 37 °C durante 15 min en 200 μl del buffer Tango (Thermo scientific) 10X con BSA (bovine serum albumin) diluido en agua bidestilada. Pasado ese tiempo retiramos el buffer de preincubación y añadimos la enzima. 2. Incubación: en el termobloque a 37 °C durante 180 min en 200 μl de dilución de la enzima XbaI (10 U/μl por muestra) en buffer H. Electroforesis Una vez terminada la digestión, montar los cortes de bloque sobre los 15 dientes del peine para la electroforesis, incluyendo la cepa 134 control Salmonella Braenderup en las posiciones 1, 8 y 15. Preparar el gel con 150 ml de TBE (Panreac) 0,5X y agarosa SeakemGold al 1%. Atemperar la agarosa a 55 °C antes de añadirla al molde en el que ha sido colocado el peine. Preparar 2 l de tampón TBE, de manera que las concentraciones 1X sean de 0,089 M de Tris base; 0,089 M de ácido bórico (LKB, pH 8,3) y 2 mM Na2EDTA (diluir 200 ml de TBE 5x con 1.800 ml de agua destilada). Verter el tampón diluido en la cubeta de electroforesis y enfriar a 14 °C. Colocar el gel y programar la electroforesis. Condiciones de electroforesis en el CHEF Mapper para E. coli:  Auto Algorithm  30 kb-low MW-600 kb-high MW  Pulso inicial: 2,16 s; Pulso final: 54,17 s; Tiempo de electroforesis: 20 h Revelado del gel Teñir el gel en agua destilada con 0,3 μl/ml de GelRedTM (Biotium) durante 20-30 min en agitación suave. A continuación, eliminar el baño y lavar el gel al menos 1 h en agua destilada en agitación. La captura de imagen de los geles para su posterior tratamiento con el programa BioNumerics fue realizada con el sistema de fotodocumentación GelDoc (BioRad) y el programa Quantity One 4.6.3. (Imagen 5). M a t e r i a l e s y M é t o d o s 135 3.7. Análisis estadístico Para determinar el grado de asociación estadística entre las variables en estudio, se aplicó el test exacto de Fisher, considerando significativos valores menores a 0,05 (p <0,05). IMAGEN 5. IMAGEN OBTENIDA CON EL SISTEMA GELDOC. EN LAS POSICIONES 1, 8 Y 15 SE SITÚA EL CONTROL DE SALMONELLA SER. BRAENDERUP H9812. LAS CEPAS INCLUIDAS EN LAS POSICIONES 5 Y 9 RESULTARON AUTODIGERIDAS R e s u l t a d o s y D i s c u s i ó n 139 En el presente estudio se analizaron las muestras fecales de un total de 620 animales silvestres: 390 hisopos del contenido cecal de aves procedentes de Galicia y Asturias, y 230 hisopos rectales de zorros y jabalíes procedentes de Galicia. En las 620 muestras se estudió la presencia de cepas de E. coli productoras de BLEE del tipo CTX-M y SHV y de otras betalactamasas, así como la presencia del grupo clonal ST131. 4.1. Aislamiento en medios selectivos De las 620 muestras recogidas, 618 se sembraron por el método de agotamiento en estría en los 2 medios selectivos y diferenciales: ESBL y ML, siguiendo el protocolo diseñado en este estudio (Figura 10). Las 2 primeras muestras del estudio solo se sembraron en el medio ESBL. Teniendo en cuenta las 618 muestras sembradas en ambos medios, el 84,8% (524) crecieron en ESBL y ML, el 11,6% (72) solo en ML y el 1,3% (8) solo en ESBL. Además, las 2 muestras sembradas únicamente en ESBL presentaron crecimiento positivo. Solo 14 de las 620 muestras no crecieron en ninguno de los 2 medios. 4.1.1. Medio chromIDTM ESBL de bioMérieux De las 534 muestras con crecimiento en el medio ESBL, 104 presentaron colonias con apariencia compatible con E. coli productoras de BLEE (coloración rosa/burdeos) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Entre esas 104 no se incluían las 8 muestras que solo crecieron en ESBL. Mediante PCR, 83 (79,8%) de 242 fauna silvestre (68,6%). En el Diagrama 2 generado por eBURST se representan las relaciones de estas 28 ST dentro del CC10. De las 22 ST restantes identificadas en el presente estudio, 20 ST quedaron distribuidas en 15 complejos clonales (CC69, CC73, CC131, CC38, CC648, CC641, CC117, CC354, CC156, CC68, CC1011, CC135, CC3672, CC2628 y CC676) de los grupos 2, 3, 4, 5, 7, 9, 14, 20, 25, 45, 49, 59, 83, 105 y 167, respectivamente (Figura 27). Concretamente la nueva STNew_2 quedó incluida en el CC38 (grupo 5). Es interesante destacar, además, que 11 de estas 20 ST aparecen identificadas como genotipos fundadores; entre ellas la ST131 identificada en 5 cepas de nuestro estudio que, con la ST2279, quedaron englobadas en el grupo 4 del CC131. La cepa FV19437 O16:H5 de la ST676, pertenece a otro CC, del que además sería el genotipo fundador (gupo 167). Por último, las ST3014 y ST4980 (de los grupos 246 y 248, respectivamente) no formarían CC por incluir solo 2 ST. El análisis eBURST refleja la alta diversidad de la colección de cepas obtenidas en este estudio. R e s u l t a d o s y D i s c u s i ó n 243 DIAGRAMA 1. ‘POPULATION SNAPSHOT’ DEL ANÁLISIS EBURST V3 (HTTP://EBURST.MLST.NET) QUE MUESTRA LOS CLÚSTERS DE ST VINCULADAS Y LAS ST INDEPENDIENTES DE LA BASE DE MLST (HTTP: //MLST.WARWICK.AC.UK/MLST/DBS/ECOLI/GETTABLEINFO_HTML), QUE A FECHA DE MARZO 2016 INCLUÍA 4.910 ST. CADA ST SE REPRESENTA COMO UN NODO. SLV APARECEN CONECTADAS CON UNA LÍNEA. LAS ST IDENTIFICADAS EN NUESTRO ESTUDIO APARECEN SEÑALADAS (EXCEPTO LAS 28 ST QUE PERTENECEN AL CC10, QUE SE DETALLAN EN EL DIAGRAMA 2). EN AZUL: GENOTIPOS FUNDADORES; EN AMARILLO: FUNDADORES DE SUBGRUPOS 244 DIAGRAMA 2. REPRESENTACIÓN DEL CC10 DEFINIDO POR EBURST V3 (HTTP://EBURST.MLST.NET) (GRUPO 1). EN AZUL: GENOTIPOS FUNDADORES; EN AMARILLO: FUNDADORES DE SUBGRUPOS; EN FUCSIA: ST IDENTIFICADAS EN ESTE ESTUDIO Y EN VERDE: NUEVAS ST R e s u l t a d o s y D i s c u s i ó n 245 La caracterización de las estructuras poblacionales juega un papel fundamental para la comprensión de los brotes y la dinámica de la propagación bacteriana. En E. coli, el uso generalizado de la combinación de los esquemas de PCR multiplex para la determinación de filogrupos, junto con el algoritmo eBURST tiene algunas limitaciones. Incluso, en el mejor de los escenarios, las técnicas basadas en PCR múltiplex fallan previsiblemente a la hora de identificar variantes recombinantes que pueden dar lugar a la emergencia de combinaciones exitosas, derivadas de filogrupos muy relacionados como el A y B1 (Turrientes et al. 2014). En el presente estudio utilizamos diferentes aproximaciones (esquema simplificado y ampliado de Clermont, clonotipado, algoritmo eBURST) con objeto de conocer la estructura filogenética de nuestra colección y compararla con las de otros orígenes. Sin embargo, constatamos la complejidad de las asignaciones a filogrupos de determinados grupos clonales, especialmente en relación a los filogrupos C, F y E recombinantes. Por tanto, realizamos una visualización de la estructura de la población basada en las secuencias concatenadas de genes MLST, para construir un árbol Neighbor-Joining (N-J) con un número de réplicas bootstrap de 1000. Para dicho análisis se utilizó el programa MEGA versión 6 (Tamura et al. 2013) (Figura 29). La distribución de las ST en el árbol mostró que las asignaciones de filogrupos realizada mediante los esquemas de PCR múltiplex era coherente en todos los casos, salvo en el de la ST1725 (B1/B1) que, tanto en el árbol N-J como en el análisis eBURST (Figura 26), aparece vinculada a las ST90, ST88 y ST410 (A/C). 246 FIGURA 29. ÁRBOL NEIGHBOR-JOINING CONSTRUIDO CON MEGA V6 BASADO EN LOS GENES CONCATENADOS DE MLST R e s u l t a d o s y D i s c u s i ó n 247 4.5. Grupos clonales de interés clínico Constantemente emergen en todo el mundo linajes/grupos clonales patógenos de E. coli productores de BLEE, no sólo en el contexto de la salud humana, sino también en el medio ambiente, entre los animales, e incluso en entornos con baja presión a los antimicrobianos. Esta aparición global de resistencias, incluidas las BLEE, se ve favorecida no solo por los plásmidos que codifican estos factores, sino que, además, está influenciada de manera crucial por la presencia de grupos clonales pandémicos. Es particularmente notable el éxito del grupo clonal patógeno de E. coli BLEE perteneciente a la ST131 y al filogrupo B2, asociado a la virulencia extraintestinal (Nicolas-Chanoine et al. 2014), pero además de éste, se han descrito otros grupos clonales con altas prevalencias de cepas MDR responsables de infecciones comunitarias y hospitalarias, como son la ST10, ST69, ST95, ST117, ST405 o ST648 (Woodford et al. 2011; Manges & Johnson, 2012; Sato et al. 2017). En la Tabla 58 se resumen las características de las 33 cepas aisladas de animales silvestres pertenecientes a grupos clonales de importancia clínica, y que supusieron el 32,3% de las 102 cepas caracterizadas en este estudio. 248 A FILOGRUPO ST B CC BLEE C TIPO BLEE Nº CEPAS A/A ST10 CC10 sí SHV-12, CTX-M-9, CTX-M-14, CTX-M-32 12 cepas A/C ST410 CC23 sí CTX-M-1, CTX-M-15 4 cepas Zorro (4) B1/B1 ST155 CC155 sí SHV-12, CTX-M-1, CTX-M-9, CTX-M-15 7 cepas D/F ST117 CC117 sí SHV-12, CTX-M-1 4 cepas D/F ST354 CC354 sí SHV-12 1 cepa B2/B2 ST131 CC131 no 5 cepas Cormorán (1), paloma (1), jabalí (3) Cárabo (1) ORIGEN DE AISLAMIENTO (Nº CEPAS) Lechuza (2), paloma (2), jabalí (3), zorro (5) Ratonero (1), paloma (1), gaviota (5) Ratonero (1), lechuza (1), halcón (1), gaviota (1) TABLA 58. PRINCIPALES GRUPOS CLONALES DE IMPORTANCIA CLÍNICA IDENTIFICADOS EN EL PRESENTE ESTUDIO A FILOGRUPO SEGÚN AMBOS ESQUEMAS DE CLERMONT ET AL. (2000, 2013): REDUCIDO / AMPLIADO B COMPLEJO CLONAL IDENTIFICADO EN EL ANÁLISIS POBLACIONAL MEDIANTE EL ALGORITMO EBURST C TIPOS DE BLEE IDENTIFICADOS ENTRE LOS AISLAMIENTOS DE LA ST CORRESPONDIENTE R e s u l t a d o s y D i s c u s i ó n 249 De las 19 cepas aisladas de animales silvestres pertenecientes al CC10, 12 pertenecían a la ST10. Como se comentó en el apartado anterior, el CC10 es el más amplio y diverso de la población de E. coli y se ha identificado entre cepas de distintos patotipos: ECEA, ETEC, ExPEC, así como en cepas comensales de E. coli aisladas en humanos y animales productores de alimentos (Manges & Johnson, 2012; Olesen et al. 2012; Shepard et al. 2012). Los miembros de CC10 están ampliamente implicados en la difusión de genes BLEE y AmpC en infecciones de tipo hospitalario (Peirano et al. 2012; Izdebski et al. 2013), pero también se han notificado en animales de producción en los Países Bajos, el Reino Unido y Francia (Cohen et al. 2012; Wu et al. 2012; Dahmen et al. 2013), además de aislarse en alimentos (Herrera, 2015). Después del CC10, los CC23 y CC155 fueron los más prevalentes en nuestro estudio (11 cepas, respectivamente). El CC23 productor de BLEE se aisla frecuentemente en ambientes hospitalarios en España y Francia (Crémet et al. 2010; Oteo et al. 2012), pero este complejo clonal también ha sido detectado en muestras obtenidas de animales productores de alimentos y carne de pollo (Cohen et al. 2012; Wu et al. 2012; Herrera, 2015; Gómez, 2017). Cuatro de nuestras 11 cepas CC23 presentaban la ST410. Este grupo clonal está considerado como emergente asociado a la producción de BLEE y presente en humanos, animales domésticos, animales de producción y en alimentos (López-Cerero et al. 2011; Fischer et al. 2014; Schaufler et al. 2016; Timofte et al. 2016; Herrera, 2015; Gómez, 2017). Es importante señalar que una de las 4 cepas O20:H9 aisladas en nuestro estudio resultó productora de CTX-M-15, al igual que las cepas de significancia clínica humana aisladas en hospitales de Mauritania, Alemania, Pensilvania (Sidjabat et al. 2009b; Ben Sallem et al. 2015; Falgenhauer et al. 2016) y en Lugo (datos no publicados), de hecho, el ST410 está reconocido como un grupo clonal internacional diseminador de CTXM-15. Recientemente en China se ha informado del primer aislamiento ST410 portador de múltiples genes BLEE, incluidos blaNDM-4, blaCTX-M-15, blaSHV-12, blaTEM-1 y blaCMY-61; procedente de un hemocultivo (Qin et al. 2016). El CC155 productor de CTX-M está estrechamente vinculado a las ITU (Valverde et al. 2009), y recientemente se ha descrito en Italia, España e Israel (Izdebski et al. 2013). Además, algunas ST del CC155 se han descrito asociadas a diversas infecciones en el ganado en Europa (Wu et al. 2012; Dahmen et al. 2013). En nuestro estudio, de las 11 cepas del CC155, 7 fueron ST155, presentes en distintas especies de aves y portadoras de distintos tipos BLEE, incluido CTX-M-15. Las 4 cepas ST117 de nuestro estudio se aislaron en 4 tipos de aves distintas. Este grupo clonal se ha asociado a cepas APEC con potencial riesgo para seres humanos en España (Mora et al. 2011). Además, Leverstein-van Hall et al. (2011) describieron la relación entre cepas ST117 productoras de BLEE de origen humano, carne de ave y aves de producción en los Países Bajos, y en Canadá demostraron la alta similitud entre cepas O114:H4-ST117 aisladas de un caso de ITU y carne de pollo (Manges et al. 2007). Por último, aunque detectamos el grupo clonal pandémico ST131 en aves y mamíferos silvestres de nuestra área geográfica, ninguna de las cepas resultó ser productora de BLEE. Las 6 cepas CC131 de nuestro estudio mostraron importantes diferencias con cepas procedentes de animales de producción o sus productos derivados, en cuando a sus perfiles de virulencia (número de genes y virotipos), clonotipos y perfiles de resistencia. Sin embargo, es importante R e s u l t a d o s y D i s c u s i ó n 251 señalar que encontramos alta similitud en los perfiles genéticos y de macrorrestricción entre cepas aisladas de jabalíes y cepas de origen clínico humano, aisladas en el mismo entorno geográfico. Esto señalaría a la fauna silvestre como receptora de subgrupos (virotipos) específicos del complejo clonal ST131 con potencial patógeno para el ser humano. En resumen, en este estudio hemos demostrado la presencia generalizada en la fauna silvestre del noroeste español de una población altamente diversa de cepas de E. coli productoras de BLEE, incluidos grupos clonales MDR de gran importancia clínica como son ST10, ST117, ST131, ST155, ST354 o ST410. Además, hemos detectado una alta similitud entre aislamientos humanos y silvestres de grupos específicos, lo que da idea de la complejidad escasamente explorada de las rutas de transmisión. Los animales silvestres, especialmente las aves (migratorias o no), pueden desempeñar un importante papel en la circulación de clones epidemiológicamente importantes de E. coli, lo que supone un importante riesgo de contaminación ambiental. En el futuro, sería interesante investigar a fondo la relación de los aislamientos de E. coli de animales silvestres, y aquellos de otros orígenes que compartieron ST y alta similitud, mediante WGS; así como los mecanismos mediante los cuales ciertos plásmidos parecen estar asociados a múltiples hospedadores, mientras que otros parecen aparentemente restringidos a un tipo específico. B i b l i o g r a f í a 259 6.1. Bibliografía empleada Abraham S, Jordan D, Wong HS, Johnson JR, Toleman MA, Wakeham DL, Gordon DM, Turnidge JD, Mollinger JL, Gibson JS, Trott DJ. 2015. First detection of extendedspectrum cephalosporin-and fluoroquinolone-resistant Escherichia coli in Australian food-producing animals. J Glob Antimicrob Resist. 3:273-277. Albrechtova K, Dolejska M, Cizek A, Tausova D, Klimes J, Bebora L, Literak I. 2012. 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