Patata de reempleo: técnicas de producción y selección y condiciones de utilización en A Limia (Ourense, Galicia)

ESCOLA POLITÉCNICA SUPERIOR Departamento de Producción Vexetal TESIS DOCTORAL PATATA DE REEMPLEO: TÉCNICAS DE PRODUCCIÓN Y SELECCIÓN Y CONDICIONES DE UTILIZACIÓN EN A LIMIA (OURENSE, GALICIA) AUTOR: D. Lucio García Calvo DIRECTORA: Dra.Cristina Cabaleiro Sobrino ESCOLA POLITÉCNICA SUPERIOR Departamento de Producción Vexetal PATATA DE REEMPLEO: TÉCNICAS DE PRODUCCIÓN Y SELECCIÓN Y CONDICIONES DE UTILIZACIÓN EN A LIMIA (OURENSE, GALICIA) Memoria Presentada por: Lucio García Calvo Ingeniero Agrónomo Para optar al grado de Doctor Lugo, 27 de Julio de 2012 Lucio García Calvo La doctora Cristina Cabaleiro Sobrino, profesora titular del Departamento de Producción Vegetal en la Escuela Politécnica Superior de Lugo de la Universidad de Santiago de Compostela, en calidad de directora, CERTIFICA: que la presente Memoria Doctoral titulada: “Patata de reempleo: técnicas de producción y selección y condiciones de utilización en A Limia (Ourense, Galicia)”, elaborada por el Ingeniero Agrónomo Lucio García Calvo, ha sido realizada bajo su dirección y cumple con las condiciones exigidas para optar al grado de Doctor. Y para que conste, firma el presente certificado en Lugo a 27 de Julio de 2012: Cristina Cabaleiro Sobrino AGRADECIMIENTOS Agradezco el apoyo y dedico este trabajo a todos los que han colaborado directa o indirectamente en su realización, y son muchos… A mi directora Cristina Cabaleiro porque sin su apoyo e inestimable ayuda no hubiera sido posible llevar el trabajo a cabo. Al sector de la patata de la comarca de A Limia, tanto agricultores, como industriales y empresas de servicios, por estar siempre dispuestos a probar e innovar. A las dos instituciones en las que he desarrollado mi vida laboral y a su personal: INORDE y Centro Tecnológico de la Carne y Calidad Alimentaria de Galicia. Al profesorado del departamento de Producción Vegetal de la Universidad de Santiago y del grupo de investigación GI-1988, a Begoña Martín por su colaboración los ensayos de 2004 y a Paloma Pérez por su ayuda en el seguimiento e identificación de vectores. Y muy especialmente a varios estudiantes de la Escola Politécnica Superior de la USC, hoy Ingenieros Agrónomos: Carolina Couceiro, José Antonio Chao, Silvia Marnotes y Melania Magán cuyos Trabajos Fin de Carrera y/o Trabajos de Investigación Tutelados forman parte de los resultados de los Proyectos de Investigación que culminan hoy en esta tesis. Y por último a mi familia, a Yolanda y Elena a las que les quité tiempo de compañía. Los trabajos que constituyen esta tesis fueron parcialmente financiados por diversas instituciones, mediante los siguientes Proyectos de Investigación: “Virosis y bacteriosis en el cultivo de la patata en Xinzo de Limia: epidemiología, diagnóstico rápido y saneamiento de ecotipos de cultivo antiguo en Galicia”. FEDERCICYT (2000-2001). “Estrategias de control de virosis en la producción de patata de siembra en Galicia”. Xunta de Galicia. Recursos agropecuarios PGIDIT02PR (2002-2005). “Desenvolvemento de kits de diagnose e introdución de técnicas sostibles de control de viroses e nematodos en patacas”. PGIDT/PGIDIT - 2010/CG870 y Agro Xinzo S.L. (2010-2012).              ÍNDICES          vi solani. Figura 1.13 Evolución del porcentaje de lotes de patatas en los 4 años de estudio (2000 a 2003) según intervalos de afección por golpes 43 Figura 1.14 Porcentaje de lotes a los que se recomendó sembrar, sembrar tratando, sembrar escogiendo, sembrar tratando+escogiendo o no sembrar, en los 4 años de estudio (2000 a 2003) para cada tipo de lotes (1 = Siembra, 2 = Siembra + Consumo y 3 = Consumo). 44 Figura 1.15 Pérdidas medias estimadas para los 4 años de estudio (2000 a 2003): con todos los datos (1-4, Siembra + 5, No siembra) y con la eliminación de los datos en los que se recomienda “no sembrar” (Siembra). 44 Figura 1.16 Media del porcentaje de pérdidas estimadas en los 4 años de estudio (2000 a 2003) según tipo de producción (1 = Siembra, 2 = Siembra + Consumo y 3 = Consumo). En el año 2000 no hubo producciones tipo 1. 45 Figura 2.1 Efecto del estado sanitario de la semilla (sin tener en cuenta virosis) en la producción bruta media de los lotes de re-empleo de Agria y Kennebec en 2008. 1: óptimo para siembra; 2: gromo en mal estado, daños leves o presencia de síntomas de micosis; 3: gromo en mal estado, daños importantes o presencia de signos de hongos. Letras diferentes indican diferencias significativas con p<0,05 según el test de Tuckey b. 60 Figura 2.2 Efecto del estado sanitario de la semilla (sin tener en cuenta virosis) en la producción bruta media de los lotes de re-empleo de Agria y Kennebec en 2011. 1: óptimo para siembra; 2: gromo en mal estado, daños leves o presencia de síntomas de micosis; 3: gromo en mal estado, daños importantes o presencia de signos de hongos. Letras diferentes indican diferencias significativas con p<0,05 según el test de Tuckey b. 60 Figura 2.3 Escala de recomendación de siembra y producción bruta media conseguida en las parcelas sembradas con los lotes correspondientes en 2008 (Agria y Kennebec). Letra diferentes indican diferencias significativas con p<0,05 según el test de Tuckey-b. 1: sembrar; 2: sembrar tratando; 3: sembrar escogiendo; 4: sembrar tratando y escogiendo; 5: no sembrar. En 2008 no hubo lotes de Kennebec en el grupo 3. 61 Figura 2.4 Escala de recomendación de siembra y producción bruta media conseguida en las parcelas sembradas con los lotes correspondientes en 2011 (global para Agria y Kennebec). Letra diferentes indican diferencias significativas con p<0,05 según el test de Tuckey-b. 1: sembrar; 2: sembrar tratando; 3: sembrar escogiendo; 4: sembrar tratando y escogiendo; 5: no sembrar. 62 Figura 2.5 Porcentaje de PVY frente a producción por ha en las parcelas de ensayo de la variedad Agria en 2008 y recta/ecuación de regresión lineal ( - - - ). 63 Figura 2.6 Porcentaje de PLRV frente a producción por ha en las parcelas de ensayo de la variedad Agria en 2008 y recta / ecuación de regresión 63 Índices vii lineal ( - - - ). Figura 2.7 Porcentaje de PVY+PLRV frente a producción por ha en las parcelas de ensayo de la variedad Agria en 2008 y recta/ecuación de regresión lineal ( - - - ). 63 Figura 2.8 Porcentaje de PVY frente a producción por ha en las parcelas de ensayo de la variedad Kennebec en 2008 y recta / ecuación de regresión lineal ( - - - ). 64 Figura 2.9 Porcentaje de PLRV frente a producción por ha en las parcelas de ensayo de la variedad Kennebec en 2008 y recta/ecuación de regresión lineal ( - - - ). 64 Figura 2.10 Porcentaje de PVY+PLRV frente a producción por ha en las parcelas de ensayo de la variedad Kennebec en 2008 y recta/ecuación de regresión lineal ( - - - ). 64 Figura 2.11 Porcentaje de PVY frente a producción por ha en las parcelas de ensayo de la variedad Agria en 2011 y recta/ecuación de regresión lineal ( - - - ). 65 Figura 2.12 Porcentaje de PLRV frente a producción por ha en las parcelas de ensayo de la variedad Agria en 2011 y recta/ecuación de regresión lineal ( - - - ). 65 Figura 2.13 Porcentaje de PVY+PLRV frente a producción por ha en las parcelas de ensayo de la variedad Agria en 2011 y recta/ecuación de regresión lineal ( - - - ). 65 Figura 2.14 Porcentaje PVY frente a producción por ha en las parcelas de ensayo de la variedad Kennebec en 2011 y recta/ecuación de regresión lineal (- - -). 66 Figura 2.15 Porcentaje PLRV frente a producción por ha en las parcelas de ensayo de la variedad Kennebec en 2011 y recta/ecuación de regresión lineal (- - -). 66 Figura 2.16 Porcentaje PVY+PLRV frente a producción por ha en las parcelas de ensayo de la variedad Kennebec en 2011 y recta/ecuación de regresión lineal ( - - - ). 66 Figura 2.17 Producción bruta y comercial (kg·ha-1) en parcelas sembradas con lotes de Fina de Carballo con niveles ascendentes de PVY en 2009. 68 Figura 2.18 Producción bruta (kg·ha-1) media ±dt en parcelas sembradas con lotes de Fina de Carballo con 100% de PVY y/o PLRV en los ensayos de 2010. 68 Figura 3.1 Revelado de impresiones de muestra positiva para PVY y PLRV (a), positiva para PVY (b) y positiva para PLRV (c) y negativa para ambos (d). 79 Figura 3.2 Variación en resultados de análisis de PVY y PLRV en los tubérculos de viii una misma planta; gráfico en base a los análisis de todos los tubérculos de 21 plantas 80 Figuras 3.3 a 3.6 Histogramas de % de coincidencia de métodos de análisis DIP/DASELISA referidos a placas (3.3 y 3.4) o a lotes analizados (3.5 y 3.6), para PVY y PLRV. 82 Figura 3.7 Membranas DIP reveladas; a y b: membrana con impresiones irregulares, sucias, alteradas y/o quebradas; c y d: membranas con un número óptimo de impresiones, ordenadas, claras; e: membrana de 9 cm con un total de 240 muestras bien ordenadas aprovechando el espacio; f: membrana con impresiones de brotes de tubérculos recién brotados, ordenada pero pocas muestras por membrana. 87 Figura 4.1 Capturas en la trampa Moericke de La Laguna, próxima al ensayo de 2001. Muestreos 2 veces por semana. Flecha roja: aplicación herbicida de contacto (Diquat) para eliminación de matas. 101 Figura 4.2 Ensayo de O Corgo 2003. Porcentaje medio de PVY en planta a finales de julio de 2003 (colores claros) y en tubérculo (análisis global por planta) en enero/febrero de 2004 (colores oscuros). Letras diferentes indican diferencias significativas con p<0,01 (contraste χ2). 102 Figura 4.3 Plano de localización de la finca de ensayos en el Instituto do Campo en 2004 y mapeo de infecciones tempranas. Porcentaje de plantas infectadas por PVY (análisis en hoja antes de cosecha) en las parcelas de ensayo y en cultivos de patata contiguos (ensayos de variedades y abonado). Los recuadros vacíos indican 0% de infección 103 Figura 4.4 Porcentajes de plantas con tubérculos positivos para PVY, PLRV e infección mixta. Colores distintos de borde en los bloques indican diferencias significativas (P<0,05) comparados dos a dos con la prueba χ2. Letras distintas dentro de cada bloque indican diferencias significativas entre los tratamientos (P<0,05) comparados dos a dos con una prueba χ2. La escala de color rojo decreciente indica los distintos niveles (%) de incidencia de cada una de las virosis analizadas 105 Figura 4.5 Porcentajes de PVY, PLRV, infecciones mixtas y total virosis en las parcelas con y sin borde de maíz en el ensayo de 2004. 106 Figura 4.6 Niveles de PVY en todas las subparcelas de cada uno de los bloques de las parcelas con o sin borde de maíz del ensayo de 2004. 106 Figura 4.7 Índice medio de contenido en clorofila (CCI) en hoja para los distintos tratamientos a lo largo del verano en el ensayo de 2004. Distintas letras indican diferencias significativas (P<0,05) según Modelo Lineal General Univariante y test HSD de Tukey. 108 Figura 4.8 Mapa de las parcelas del ensayo de 2004 con los colores –verde oscuro a amarillo fuerte - asignados a la escala de agostamiento descrita en Índices ix Materiales y Métodos 109 Figura 4.9 Comparación del índice de agostamiento por parcela y tratamiento (0-5 de menor a mayor agostamiento) en el ensayo de 2004. Distintas letras indican diferencias significativas (P< 0,05) según Modelo Lineal General Univariante y test HSD de Tukey. 110 Figura 4.10 Porcentaje de PVY en los tubérculos cosechados frente a la Producción Bruta (kg·ha-1) en el global de las dos parcelas en el ensayo de 2004; recta/ecuación de regresión lineal. Coeficiente de Spearman ρ= -0,305; p= 0,05. 111 Figura 4.11 Producción bruta (kg·ha-1) (media±dt) en la parcela con borde de maíz y en la rodeada de suelo desnudo en el ensayos de 2004 en la finca experimental del Instituto do Campo en A Limia. 112 Figura 4.12 Comparación de la producción media (kg·ha-1) de patata de siembra según los tratamientos aplicados en la parcela con o sin borde de maíz en el ensayo de la finca experimental del Instituto do Campo en 2004. 112 Figura 5.1 Niveles de producción bruta (kg·ha-1) en función del nivel de virosis (0% PVY y certificada / 60-100% PVY) de los lotes de patata de reempleo de la variedad Kennebec utilizados para siembra en 2008 y 2009. Letras diferentes indican diferencias significativas entre niveles de virosis con p<0,05 según el test de Tuckey-b. 130 Figura 5.2 Efecto del abonado nitrogenado en cobertera (0-75-125 uds) sobre lotes de patata de siembra Kennebec sin PVY (0% y certificada) y con valores altos de PVY (60 y 100%) en la producción bruta (kg·ha-1) en 2008 y 2009. Sólo hay diferencias significativas (p<0,05) entre las producciones de los dos años. 130 Figura 5.3 Efecto del abonado nitrogenado en cobertera (0-75-125 uds) sobre lotes de patata de siembra Kennebec sin PVY (0% y certificada) y con valores altos de PVY (60 y 100%) en el porcentaje de materia seca (media±dt) en tubérculo en 2009. 131 Figura 5.4 Producción (kg·ha-1) (media±dt) de lotes de patata de siembra de la variedad Fina de Carballo con 100% PVY y 0% PLRV abonadas en cobertera con 0, 100 ó 150 uds. de N, en comparación con un lote libre de virus con abonado estándar de 75 uds N en cobertera. 131 x              INTRODUCCIÓN           Introducción - 3 - INTRODUCCIÓN GENERAL 1. LA PATATA Y SU PROPAGACIÓN. La patata pertenece a la familia Solanaceae. El género Solanum es muy amplio, con alrededor de 200 especies tuberosas que se agrupan en el subgénero Potatoe (G. Don) D´Arcy, sección Petota Dumort (anteriormente denominada Tuberarium), subsección Potatoe G. Don (anteriormente Hyperbasarthum) (Rossignol y RousselleBourgeois, 1996). Hay especies desde diploides hasta hexaploides. La especie tetraploide Solanum tuberosum L. es la más productiva y la más extendida. En esta especie se diferencian dos subespecies: andigena, con origen en Perú y Bolivia, y tuberosa, desarrollada como resultado de la selección bajo condiciones de día largo, en la costa de Chile y durante varios siglos en Europa. 1.1 Origen y fundamento de la producción de patata de siembra. El cultivo de la patata se propaga a través de la denominada patata de “siembra”, “simiente” o “semilla”, aunque en realidad no se realice una verdadera siembra sino una plantación de tubérculos. Este método de propagación vegetativa de la patata por tubérculos conlleva la transmisión a la descendencia de diversos patógenos entre los que se encuentran hongos, bacterias, nematodos, virus, viroides y fitoplasmas, además de algunas plagas (Rouselle et al., 1999). Muchos de estos patógenos no inducen síntomas visibles en los tubérculos e incluso no muy aparentes en las plantas, por lo que no es posible una selección visual previa. A finales del siglo XIX las enfermedades que hoy sabemos tienen etiología viral se contemplaban como procedentes de una “modificación hereditaria” de las características de la planta que produce una “degeneración” del tubérculo. Pero no todas las plantas presentaban esa degeneración y por tanto se empieza a pensar en organizar racionalmente selección de la producción de patata para siembra libre de problemas sanitarios (Ellissèche et al., 1999). Hacia 1900, los agricultores alemanes se dieron cuenta de que, además de transmitirse a las siguientes generaciones a través de tubérculos infectados, los síntomas de la degeneración de las plantas de patata se transmitían entre plantas en campo. También comprobaron que la selección de plantas - 4 - sanas y vigorosas para la obtención de tubérculos para la replantación, podía eliminar o disminuir el efecto degenerativo. El sistema alemán de producción de patata de siembra fue copiado por Estados Unidos y Canadá (Slack y Singh, 1998). Además de la degeneración, se vio también que la entrada de patata sin controlar daba lugar a la introducción de patógenos que no existían en una zona determinada; el primer paso para evitarlo se dio en Estados Unidos con la prohibición de entrada de patata con el hongo Synchitrium endobioticum, mediante el Plan Nacional de Cuarentena. En 1913 Canadá y seis estados de Estados Unidos establecieron sus programas de certificación y en 1914 se crea la Asociación Americana de la Patata (Slack y Singh, 1998). Durante la puesta en funcionamiento de los sistemas oficiales de certificación de tubérculos para siembra el sistema de selección sufrió una evolución notable a medida que se iba conociendo tanto el origen de la degeneración como los sistemas de transmisión de enfermedades y los métodos para diagnosticarlas (Shepard y Claftin, 1975). Inicialmente, la selección se hacía en pleno campo y consistía en eligir las matas aparentemente sanas, marcarlas por medio de una estaquilla (controladores) y cosechar aparte sus tubérculos para destinarlos a replantación. Esos tubérculos “seleccionados" se multiplicaban en una zona apropiada, donde la degeneración aparentemente no se manifestara. El inconveniente de este sistema de selección es que sólo se detectan infecciones tempranas. Hacia los años 1950 se consigue, mediante la utilización de rindita, eliminar el letargo que impide brotar a los tubérculos recién cosechados y se puede proceder al “pre-cultivo” de una muestra representativa a final de verano y observar los síntomas para descartar plantas infectadas mucho antes. Además de la mejora de los métodos de selección de tubérculos, se ponen también a punto técnicas que permiten la producción más segura de patata certificada, entre ellas la aplicación de insecticidas y/o aceites que limitan la transmisión de los virus por sus vectores (Ellisèche et al., 1999). Pero lo que revoluciona definitivamente el sistema de certificación es el uso de técnicas indirectas de diagnóstico, sobre todo las inmunoenzimáticas. En 1977, Clark y Adams publican el protocolo base de la técnica DAS-ELISA (“Double antibody sandwich – Enzyme linked immunosorbent assay”) y a principios de los años 80 se pone a punto el análisis de tubérculo brotado con este método serológico, sensible y Introducción - 5 - fiable, que permite analizar muchas muestras en poco tiempo y espacio, a un precio que puede ser competitivo, cuando se evalúan grandes cantidades de tubérculos y que, además, se puede automatizar (Bokx y Maat, 1979; Clarke et al., 1980). En la actualidad existen anticuerpos comerciales para prácticamente todos los virus de patata con importancia económica y este método es la técnica oficial de análisis en países de todo el mundo. Surgen muchas variantes del ELISA, incluso sistemas para muestras individuales que pueden tener interés en campo para evaluar con rapidez (en varios minutos) plantas control (SpotCheck® de ADGEN o Pocket Diagnostics de Forsite Diagnostics Limited, por ejemplo). Con el objetivo de que las técnicas serológicas puedan aplicarse en circunstancias en las que no es fácil disponer de la infraestructura necesaria para el DAS-ELISA, se ponen a punto en la década de 1990 métodos que evitan el triturado de muestras y presentan ciertas ventajas como son la posibilidad de impresión de cortes en campo, mayor rapidez y menor precio que el método oficial (Cambra et al., 1994; Guzmán et al., 2002). A partir de 1990 se empiezan a diseñar métodos moleculares de detección de ácidos nucleicos (cDNA, RT-PCR, Taq-Man, NASH) que son muy sensibles y específicos y que van sustituyendo a los serológicos como método de diagnóstico (Barker et al. 1993; Balme et al., 2006; Rolland et al., 2008) aunque todavía, a gran escala, presentan problemas diversos (Martin et al., 2000). Son imprescindibles para diagnosticar razas de algunos virus, como la NTN del PVY (Schubert et al., 2007; Mallik et al., 2012). Técnicas como PC-RT-PCR (Print capture – reverse transcriptasaPCR) podrían sustituir a las técnicas de inmunoimpresión directa (Cambra et al., 2000; Gawande et al., 2011). En algunos casos, sobre todo en variedades ya antiguas, el material para seleccionar llega a no ser válido y/o rentable para su multiplicación; dado que la mayoría de los virus no infectan ni la semilla botánica ni los ápices meristemáticos, la regeneración a partir de éstos o la termoterapia y cultivo de ápices, permite obtener y cultivar in vitro los clones saneados (Ellisèche et al., 1999). La asociación de termoterapia, cultivo de meristemos y propagación in vitro para obtener microtubérculos, ha permitido regenerar la mayor parte de las variedades antes infectadas crónicamente frente a diferentes virus (Belle de Fontenay, Bintje, BF 15, etc.). Hay virus más difíciles de eliminar que otros, en orden creciente de dificultad de eliminación estarían PLRV, PVA, PVY, PVM, PVS y PVX (Ellisèche et al., 1999). La - 12 - 2. VIRUS QUE AFECTAN AL CULTIVO DE LA PATATA. Los virus vegetales son los principales agentes infecciosos que afectan a la patata. Aparentemente la patata fue la primera herbácea en la que se encontraron síntomas que apuntaban a una infección viral y eso ocurrió poco después de su introducción en Europa antes de 1570 (Salazar, 2003) pero no se empezó a tener en cuenta hasta el siglo XIX cuando empezaron a peligrar las producciones en Alemania e Inglaterra. La degeneración se atribuía a cambios fisiológicos debidos a la multiplicación vegetativa repetida. Con la información disponible era imposible diagnosticar el agente causante de la enfermedad; el descubrimiento de la primera enfermedad de la patata causada por un virus marcó el principio de la investigación de virus como agentes causantes de enfermedades (Sutic et al., 1999). Tabla 6. Distribución y transmisión de virus que infectan a Solanum tuberosum. Virus Acrónimo Género Distribución geográfica Vector Modo de transmisión Potato virus A PVA Potyvirus Mundial Pulgones No persistente Potato virus V PVV Potyvirus Europa y América Pulgones No persistente Potato virus Y PVY Potyvirus Mundial Pulgones No persistente Henbane mosaic virus HeMV Potyvirus Europa Pulgones No persistente Potato virus X PVX Potexvirus Mundial Hongos Mecánica y contacto Potato leaf roll virus PLRV Luteovirus Mundial Pulgones Persistente Potato virus M PVM Carlavirus Mundial Pulgones No persistente Potato virus S PVS Carlavirus Mundial Pulgones No persistente, contacto Potato virus T PVT Capillovirus América del Sur - Tubérculos infectados Andean potato mottle virus APMV Comovirus Perú, Bolivia Escarabajos Contacto Cucumber mosaic virus CMV Cucumovirus Inglaterra, Escocia Pulgones No persistente Potato mop-top virus PMTV Furovirus América N y S y CEuropa Hongos Esporas fúngicas Alfalfa mosaic virus AMV Mundial Pulgones No persistente Tomato black ring virus TBRV Nepovirus Norte y CEuropa Nematodos – Potato black ring spot virus PBRSV Nepovirus Región andina Nematodos – Tobacco rattle virus TRV Tobravirus Europa, Asia y América Nematodos – Beet curly top virus BCTV Geminivirus Utah Saltamontes Circulativa Solanum apical leaf curl virus SALCV Geminivirus Andes, India Saltamontes Circulativa Potato yellow dwarf virus PYDV Rhabdovirus Canadá, USA Saltamontes Circulativa Tobacco mosaic virus TMV Tobamovirus Mundial Hongos Contaminación Tobacco necrosis virus TNV Necrovirus Holanda, Italia Hongos Contaminación Tomato spotted wilt virus TSWV Tospovirus Mundial Thrips Propagativa Tobacco streak virus TSV Ilarvirus Europa Thrips Propagativa Andean potato latent virus APLV Tymovirus Región andina Escarabajos Contacto Arracacha virus B AVB – Perú – Tubérculos infectados Egg plant mottled dwarf virus EMDV Rhabdovirus Irán – Tubérculos infectados Potato aucuba mosaic virus PAMV – Mundial – Tubérculos infectados Potato yellow vein virus PYVV a Región andina – Tubérculos infectados Potato deforming mosaic virus PDMV a Región andina – Tubérculos infectados Fuente: Mih y Atiri, 2005 Introducción - 13 - La primera mención a la causa que provocaba el enrollamiento de las hojas y que causaba grandes daños la realizó Appel en 1905 (Bagnall, 1988). Los datos de esas investigaciones contribuyeron a la determinación de la naturaleza viral de la degeneración que se venía produciendo desde muchos años atrás (Salazar, 2003). Las patatas pueden ser infectadas por muchos virus diferentes que pueden reducir la calidad de tubérculo y la producción. En 1971 se habían contabilizado 33 virus y fitoplasmas que afectaban a la patata y Salazar hace una revisión en 1996 que actualiza en 2003 (Salazar, 2003). En 2005, Mih y Atiri describen los mas importantes (Tabla 6). En Europa hay 22 especies patógenas de las cuales sólo 10 causan graves pérdidas económicas (Sutic et al., 1999). Los virus en patata reducen el vigor de las plantas y la posibilidad de utilizar los tubérculos como semilla porque se perpetúan en los tubérculos; las plantas de patata pueden ser portadoras de virus sin presentar síntomas (Alonso, 2002). En muchos casos, los síntomas de distintos virus son similares y consisten en mosaicos sobre las hojas, atrofia de la planta y malformaciones tanto de hojas como de tubérculos. Los síntomas no siempre son expresados debido a interacciones entre el virus, la planta de patata, las condiciones de cultivo (fertilidad del suelo), las condiciones ambientales, o la edad de la planta cuando es infectada. Los tubérculos infectados dan lugar a plantas con una expresión de síntomas más clara que cuando lo adquieren durante el cultivo. Los principales vectores de transmisión de virus en el cultivo de patata son los pulgones (Homoptera: aphididae). Uno de los pulgones más comunes encontrados sobre la patata, el pulgón verde del melocotón (Myzus persicae), transmite más de 100 virus a muchas plantas diferentes. M. persicae, en regiones templadas, pasa el invierno en plantas leñosas (como melocotoneros) y el verano sobre plantas no leñosas, como la patata, formando colonias. M. persicae es el vector de virus más eficiente (Harrison, 1984). Para la transmisión de virus no persistentes un pulgón no necesariamente tiene que ser plaga de la patata, basta con tiempos muy cortos de cata para el paso de los virus. Otras vías de propagación, aunque solo de algunos virus, son medios mecánicos mediante el troceo de semilla, la maquinaria e incluso la propia fricción normal de unas plantas contra otras en campo (Alonso, 2002). Algunos virus afectan a la producción más que otros por lo que es importante determinar cuál es el virus que afecta a la patata porque los métodos de control varían en función del virus y su forma de transmisión. Salazar, en 2003, hace una clasificación - 14 - de 5 niveles de importancia de los principales virus de la patata en función de su efecto en el rendimiento, análisis de riesgo y distribución; PVY y PLRV aparecen en el primer nivel, con pérdidas potenciales de producción de hasta el 90%, distribución mundial y riesgo alto. 2.1 Potato virus Y (PVY) El PVY es el virus tipo del genero Potyvirus incluido en la familia Potyviridae. Los síntomas de ésta enfermedad varían mucho en función de la raza de PVY de que se trate y de la variedad de patata: desde clorosis muy suave hasta necrosis severas y muerte de la planta afectada y daños en el tubérculo. La reducción de la producción en variedades sensibles puede ser de más del 50% (Spaar y Hamann, 1977) pero casi todas las variedades modernas tienen buenos niveles de resistencia y se siguen incorporando genes que dan una resistencia extrema ( Mendoza et al., 1989; Dalla Rizza et al., 2006). Las razas del PVY se han clasificado en tres grupos básicos basándose en los síntomas característicos en la patata, el tabaco y en Physalis floridana (Sutic et al., 1999): PVY0 (raza común); PVYc; PVYN (raza necrótica). Además, hay razas híbridas combinación de otras como PVYN0 y PVYNTN. Las infecciones primarias de PVY0 no causan síntomas de importancia, sobre todo si la transmisión por pulgones es tardía. Las infecciones secundarias de PVY0 dan lugar a plantas más pequeñas de lo normal, hojas rugosas, con mosaicos, moteadas y acartonadas y a veces necrosis en el follaje y tallos (Smith et al., 1992). El mosaico en las hojas puede ser enmascarado cuando se produce a altas temperaturas o cuando el abonado nitrogenado ha sido muy fuerte, pero la enfermedad se puede identificar por la rugosidad de la superficie y bordes de las hojas (Sutic et al., 1999). Los nervios del envés de las hojas más bajas de la planta afectada suelen presentar zonas necróticas que parecen líneas negras. Las plantas afectadas están como atrofiadas y mueren prematuramente. En los tubérculos, el único síntoma es la reducción de su tamaño debido a los daños sufridos por la vegetación (Sutic et al., 1999). En los últimos años se está extendiendo cada vez más la raza PVYNTN, que algunos autores consideran un nuevo virus; fue identificada por primera vez en Eslovenia (Le Romancer et al. 1994)). Además de los síntomas típicos del PVY sobre la vegetación, en el tubérculo al principio aparecen unos anillos circulares de color marrón que sobresalen sobre la piel del tubérculo, sobre todo en la zona de las yemas; Introducción - 15 - posteriormente estas zonas se deprimen al morir las células que las forman y a medida que van muriendo células hacia el interior del tubérculo, se va acentuando la depresión y el tejido muerto va tomando apariencia corchosa, llegando a producirse grietas al romperse la piel (Alonso, 2002). La transmisión de PVY y de otros potyvirus, como el PVA, se realiza con ayuda de un coadyudantre presente en la savia de la planta infectada (Thornbury y Pirone, 1983). Este virus es llevado en el estilete de los pulgones y transmitido en pocos segundos en forma no persistente, es decir, el pulgón después de entre 2 y 7 horas de ayuno tarda en adquirir el virus de una planta enferma entre 0,5 y 5 minutos y lo va transmitiendo a plantas sanas, permaneciendo infectivos entre 1 minuto y 1 hora (Spaar y Hamann, 1977; Martínez-García et al., 2001). Aphis nasturtii, Myzus persicae, Rhopalosiphoninus latysiphon, se encuentran entre sus vectores más importantes (Tabla 7). Tabla 7. Principales vectores de PVY y PLRV en patata. Virus transmitido Pulgón PLRV PVY Aphis nasturtii + + Aulacorthum solani + -/+ Macrosiphom euphorbiae + -/+ Myzus persicae + + Rhopalosiphoninus latysiphon + + El PVY en combinación con el PVX tiene una reacción sinérgica que causa síntomas muy fuertes, y dañan particularmente la producción (Sutic, et al., 1999). Para evitar la transmisión de virus no persistentes, como el PVY y otros muchos, está especialmente recomendada la producción de patata de siembra en regiones altas (montaña) donde las condiciones ambientales no son favorables para el desarrollo del vector y no se produce patata para consumo. También está bien documentado que el uso de aceites de distintos orígenes puede reducir la transmisión de virus no persistentes - 16 - (Bradley et al., 1962; Simons y Zitter, 1980; Ioannou y Iordanou, 1987; Bell, 1989; Legorburu, 2000; Martín-López et al, 2006) y que los cultivos borde actúan como barrera y como trampa (Difonzo et al., 1996; Marnotes, 2005). Se sabe que también que los acolchados pueden actuar como repelentes de vectores (Döring y Saucke, 2002). Los productos relacionados con la inducción de resistencia sistémica adquirida (SAR) parecen prometedores en la producción de patata de siembra pero tras las primeras pruebas no se ha registrado ninguno para este cultivo en España. El PVY supone un gran problema en la producción de patata de siembra, superior en los últimos años al PLRV que se controla mejor con insecticidas. 2.2 Potato leafroll virus (PLRV) El virus del enrollado de la patata pertenece al género Luteovirus, en la familia Luteoviridae y es una de las enfermedades de etiología viral más serias que afectan al cultivo de la patata; ampliamente distribuido, es responsable de importantes reducciones en el rendimiento (hasta un 80% de la producción de una planta normal, en variedades sensibles) (Smith et al, 1992; Alonso, 2002). Se multiplica y está restringido a las células de los tejidos del floema (Harrison, 1984). La necrosis del floema ocurre en tallos y tubérculos de plantas infectadas lo que impide el movimiento normal de los carbohidratos asimilados que se acumulación en las hojas causando el enrollamiento de las mismas. Los síntomas iniciales se presentan en las hojas jóvenes, las cuales se muestran erectas, enrolladas y con enrojecimientos o clorosis en los bordes. Los síntomas de la infección primaria son más pronunciados en la zona apical (hojas) y se caracterizan por su rigidez, descenso y cambio del color (las hojas se enrollan y se vuelven azuladas o rojizas en la base dependiendo del cultivar). Los síntomas son más pronunciados en caso de infecciones tempranas, pero no producen enanismo y pueden no manifestarse en el caso de infecciones tardías (Smith et al, 1992; Sutic, et al., 1999; Alonso, 2002). Las plantas con infecciones secundarias (cuando la planta se origina a partir de un tubérculo infectado) presentan los foliolos inferiores enrollados y las hojas superiores con síntomas de clorosis. Normalmente las hojas se ponen rígidas y coriáceas y crujen si se frotan con la mano. Cuando las plantas crecen, el enrollado se extiende a las hojas de la parte superior y suelen afectar a la planta completa. Cuando el ataque es fuerte, al cortar Introducción - 17 - el tubérculo puede apreciarse a simple vista una necrosis reticulada interna que depende de la variedad de la que se trate (Alonso, 2002). El PLRV puede ser transmitido por tubérculos enfermos y por pulgones de manera persistente - circulativa. Al ser un virus persistente necesita un período de incubación dentro del pulgón y éste será infectivo después de la muda. Los pulgones que transmiten el PLRV requieren entre 48 y 72 horas para transmitirlo (Spaar y Hammann, 1977). Adquieren el virus tras 12 a 14 horas de alimentación. Durante otras 12-24 horas el virus se mueve a través del canal intestinal hasta las glándulas salivares y tarda entre 12-14 horas en ser capaz de infectar plantas sanas. Los afidos colonizadores son los vectores más importantes para este virus porque la transmisión requiere un período de alimentación amplio. Entre sus vectores más importantes, además de los citados como transmisores del PVY, se encuentran Aulacorthum solani, y Macrosiphom euphorbiae (Tabla 7). Ya que la extensión del virus del enrollado necesita más tiempo que en el caso del PVY, el factor más importante en la prevención de la infección primaria es la completa protección del cultivo durante los primeros vuelos de los pulgones. El uso de insecticidas puede ser eficaz si las poblaciones de pulgones son controladas adecuadamente (Were et al, 2003). La eliminación de plantas infectadas (“roghing”) ayuda a prevenir la extensión de PLRV y la cosecha temprana o la destrucción precoz de matas puede ayudar a prevenir las infecciones de final de temporada. El manejo de plantas no extenderá el virus, ya que PLRV no es transmisible mecánicamente. El control de la infección secundaria sólo se consigue usando material libre de virus (Slack y Singh, 1998). - 18 - REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Almekinders, C. J. M., Chujoy, E. y Thiele, G. 2009. The Use of True Potato Seed as Pro-poor Technology: The Efforts of an International Agricultural Research Institute to Innovating Potato Production. Potato Research 52(4): 275-293. Alonso, F. 2002. El cultivo de la patata, 2nd ed. Ediciones Mundi-Prensa. Madrid. Bagnall, R.H. 1988. Epidemics of potato leaf roll in North America and Europe linked to drought and sunspot cycles. Canadian Journal Plant Pathology. 10: 193-202. 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El agricultor puede: o Adoptar prácticas de manejo del cultivo para intentar compensar los daños producidos por los virus: abonado, riego, densidad de plantación. o Seleccionar los tubérculos para la siembra Los costes de producción en este caso se incrementarían solo ligeramente. Para optimizar la utilización o producción de esta patata de re-empleo se marcaron los siguientes objetivos en esta Tesis: 1. Evaluar la calidad del material de reempleo en A Limia entre los años 2001 y 2003 – CAPITULO 1. 2. Evaluar el efecto en la producción de patata en A Limia cuando se utilizan lotes de patata de reempleo con niveles conocidos de virosis (PVY y PLRV), otros patógenos y daños – CAPITULO 2. 3. Optimizar el protocolo DIP-ELISA de detección rápida y económica de PVY y PLRV que pueda ser utilizados por los técnicos o los propios agricultores – CAPITULO 3. 4. Utilizar cultivos borde y tratamientos con aceites para limitar la transmisión de PVY en parcelas para producción de patata de siembra/reempleo con niveles de virosis aceptables – CAPITULO 4 5. Estudiar el efecto del manejo del abonado nitrogenado en cobertera sobre los cultivos de patata de reempleo – CAPITULO 5.              CAPITULO1                 CAPITULO 1 - 27 - CAPITULO 1: Evaluación de la calidad del material de patata de reempleo en A Limia entre los años 2001 y 2003. RESUMEN En el año 2001 se inicia en el Instituto do Campo (INORDE) un programa de evaluación de calidad de lotes de patata para reempleo que se clasificaron en función de su procedencia en “siembra”, “siembra+consumo” y “consumo”. Entre 2001 y 2003 participaron 275 agricultores que enviaron 463 lotes de patata, principalmente de las variedades Agria y Kennebec. Para cada lote se analizaron las virosis y otros patógenos y daños según la normativa a aplicar a la patata de siembra certificada y se hicieron recomendaciones de siembra / no siembra / siembra condicionada y estimación de pérdidas en caso de siembra. Los factores que más condicionan la calidad de la patata para reempleo son el tipo de producción que lleva a cabo el agricultor y las peculiaridades de cada año. El virus predominante fue el PVY pero el que dio lugar a más recomendaciones de no siembra fue el PLRV y presencia de ambos. La media de ambas virosis en agricultores tipo 1 fue inferior al 15%, nivel aceptable para la tolerancia de Agria y Kennebec. Alternaria solani, Phytophthora infestans, Phoma spp., Fusarium spp. y bacterias de podredumbre aparecen sólo ocasionalmente pero en todos los tipos de producción y todos los años; solo la sarna plateada Helminthosporium solani tiene alta prevalencia. La producción de patata específicamente para reempleo (agricultor tipo 1) puede permitir a algunos agricultores conseguir un material de siembra de calidad aceptable con una reducción importante de costes. El uso de patata sin análisis previo es una práctica de alto riesgo, aunque solo un porcentaje bajo de lotes presentaron niveles de virosis y otros daños superiores al 70%. Palabras clave: patata de siembra, reempleo, virus INTRODUCCIÓN La producción de patata de siembra certificada en la actualidad se basa por un lado en el cultivo en condiciones controladas para conseguir tubérculos libres de los patógenos que se transmiten vía tubérculo (Gudmestad, 1991) y por otro en la existencia de métodos rápidos de diagnóstico (Clark y Adams, 1977) de esos patógenos presentes en los tubérculos que permitan descartar lotes “degenerados”. Las virosis son las principales causas de degeneración y el PVY la principal causa de descalificación de lotes en muchas zonas de producción a pesar de que la resistencia o tolerancia a ese virus está ya incluida en mayor o menor medida en la mayoría de las variedades comerciales (Mendoza et al., 1989; Solomon y Barker, 2001). Tradicionalmente, son las zonas altas o las zonas costeras con vientos dominantes procedentes del mar las que se dedican a la producción de patata de siembra pues la Evaluación del material de re-empleo - 28 - ausencia o menor actividad de pulgones permite conseguir bajos niveles de virosis en los tubérculos. En muchos paises hay zonas de producción costeras (Bretaña en Francia; Escocia en el Reino Unido) y la hubo en Coristanco (A Coruña). En España la mayor parte de la producción está en zonas de cierta altitud de Castilla León y País Vasco. El mayor grado de degeneración se produce cuando coinciden varios virus, aunque sean débiles, en el mismo tubérculo, pero en la normativa en vigor (Tablas 1, 2 y 3 de la Introducción General) se contempla exclusivamente la suma de muestras positivas para PVY y PLRV, como los dos virus más importantes y con mayor influencia en la producción de patata de consumo (Salazar, 2003). Muestras de los tubérculos producidos siguiendo la normativa de producción de patata de siembra certificada son analizadas y de esos análisis se obtiene una estimación del total de virosis en el lote y con ello la adjudicación de la categoría correspondiente (Ellisèche et al., 1999). Aunque las virosis son el factor que marca la calificación objetiva de los lotes y, por tanto, su categoría, otros problemas son evaluados (Tabla 2 de la Introducción General), normalmente de forma visual siguiendo escalas/porcentajes de superficie cubierta con sígnos de algún patógeno concreto (esclerocios de Rhizoctonia), aunque a veces se agrupan síntomas que pueden pertenecer a diferentes patógenos: hongos/bacterias (“sarnas”, “podredumbres secas o húmedas”), fisiopatías o daños físicos (heridas, golpes, deformaciones, restos de tierra). Los patógenos de cuarentena (Tabla 3 de la Introducción General) deben estar completamente ausentes de toda patata certificada, sea cual sea su categoría y hay inspecciones independientes para detectarlas. Según la normativa vigente, hay una serie de motivos para descalificar un terreno o una zona de producción pero lo más frecuente es la presencia de patógenos de cuarentena en el suelo, como es el caso de los nematodos del quiste del género Globodera (Rouselle et al., 1999). Son patógenos que están muy extendidos por todas las zonas de producción pero todavía hay países y/o zonas libres y por tanto no puede circular material certificado que pueda venir de suelos infestados. En A Limia, G. rostochiensis se detectó por primera vez en 1973 (Martínez-Beringola et al., 1987) y pronto se vio que estaba ya muy extendido; se hizo una prospección en 2000 (Rosende et al., 2003) y en varios muestreos posteriores desde esa fecha se ha podido apreciar cómo G. rostochiensis y ahora también G. pallida se han ido extendiendo. La comarca CAPITULO 1 - 29 - de A Limia deja, por tanto, de producir patata de siembra cerfificada definitivamente en los años 80. Sin embargo, algunas zonas de esta comarca siguen presentando buenas características para la producción de patata de siembra teniendo en cuenta los niveles de pulgones vectores (Pérez et al., 2004) y, por tanto, podrían ser válidas para producción de “siembra propia” por parte de los agricultores o para el reempleo, haciendo una selección previa de lotes (Gildemacher et al., 2007). El coste de la patata de siembra certificada se estimó en 2000 en torno a un 29% de los costes de producción de la patata en A Limia (www.institutodocampo.com) pero con los datos recogidos en 2011 que se reflejan en el apartado de Justificación y Objetivos, habrían pasado a suponer casi el 35%. Ese coste se ve considerablemente reducido utilizando patata de reempleo. En la provincia de Ourense se estima, en base a los datos nacionales, que en los años de este estudio se utilizan cada año entre 1200 y 1800 t de patata de reempleo (“reserva para siembra”) lo que supuso un 15-20% del total de siembra empleado (Tabla 1.1) pero concretamente en A Limia es superior (en torno al 30%). En todo caso, son valores muy variables por depender en gran medida del precio de venta de la patata de consumo, del precio y disponibilidad de patata de siembra certificada y de la cantidad de patata sin vender en los almacenes. Hasta la creación por el INORDE (Instituto Ourensan de Desenvolvemento) del Instituto do Campo (hoy denominado “Centro de Desenvolvemento Agrogandeiro“) ese reempleo se hacía sin ningún tipo de control. Los primeros trabajos en la zona tuvieron como objetivo determinar la presencia de virosis en la zona, en los campos de patata de consumo, a final de temporada, obteniéndose valores relativamente bajos (Cabaleiro et al., 2000) que indicaban que se podría obtener patata para siembra con unos niveles aceptables si se seguían una serie de recomendaciones en la producción. Tabla 1.1 La patata en la provincia de Ourense (superficie, producción, semilla utilizada y reserva de siembra) en los años del estudio (2000 a 2003). Superficie (ha) Producción (t) Total semilla utilizada (t) Reserva siembra (t)* 2000 6.289 177.769 10.832 1.815 2001 6.900 198.415 10.377 1.633 2002 6.462 189.277 9.468 1.291 2003 6.211 175.045 9.897 1.292 Fuente: MAPA. *Valores estimados sobre totales españoles. Evaluación del material de re-empleo - 30 - En este Capítulo 1 se presenta el análisis de datos resultante de los controles llevados durante los cuatro primeros años de puesta en marcha del programa de análisis de patata para reempleo llevado a cabo en el Instituto do Campo. MATERIALES Y MÉTODOS Análisis de material de re-empleo Formularios base. Los datos de partida fueron recogidos en el Instituto do Campo en Xinzo de Limia, perteneciente al INORDE y dependiente de la Diputación de Ourense. En la actalidad ha pasado a llamarse Centro de Desenvolvemento Agrogandeiro. Se trata de la puesta en marcha del programa y por tanto los primeros años de toma de datos. Se pretende que sirvan, en primer lugar, como evaluación de la situación, para convertirse posteriormente en un programa de asesoría para intentar limitar el uso de patata de reempleo y para que, en caso de siembra de reempleo, los lotes de siembra cumpliesen unos mínimos que garanticen una productividad media y que no contribuyan al aumento de patologías en la zona. Al ser el inicio del programa, el número de usuarios no estaba estabilizado y por tanto mucha información sólo se puede interpretar pero no realizar un tratamiento de datos detallado. El número total de lotes analizados y de agricultores participantes, para cada año, se resume en la Tabla 1.2. También cabe destacar la gran diferencia en el número de tubérculos de cada lote a analizar, que depende de la cantidad total del lote, entre 6 y 200, aunque en escasos casos este número es superior a 100 tubérculos. Tabla 1.2 Número de lotes y agricultores participantes en el programa de evaluación de calidad de patata de reempleo del Instituto do Campo entre 2000 y 2003. 2000 2001 2002 2003 Nº Lotes 81 58 129 195 Nº Agricultores 50 37 68 120 CAPITULO 1 - 31 - Los datos personales de los agricultores, número de muestras, variedad, finca, etc se recogen en una base de datos (Microsoft Office Access) que se completa con los datos de las analíticas realizadas (virosis, hongos y bacterias, fisiopatías y daños). El tratamiento de datos posterior se hizo empleando la hoja de cálculo Microsoft Office Excel. Clasificación de producciones. Los lotes que se llevaron para analizar al Instituto do Campo se clasificaron en tres grupos según el manejo y el destino final del cultivo realizado en el año anterior. De esta forma obtenemos la siguiente clasificación: -Producción tipo 1 (Siembra): Plantación de patata categoría E o SE para obtención de patata de siembra y por tanto siguiendo aproximadamente la normativa de producción de siembra certificada: - semilla tratada con insecticidas sistémicos residuales y fungicidas contra Rhizoctonia (si son necesarios). - Siembra tardía (después del 1 de mayo) - En todos los tratamientos fitosanitarios aplicados se introducen insecticidas para combatir el pulgón. - Fertilización con menos nitrógeno y más fósforo. - Siembra se realiza más densa de lo habitual, con menos riego o en secano. - Las matas se queman con diquat desde la última semana de julio. -Producción tipo 2 (Siembra + Consumo): Plantación para producción de patata de consumo, pero reservando la patata de menor calibre para reempleo. - En un 80 % es siembra de Kennebec E o SE, el 20 % restante cultiva Kennebec o Agria certificada clase A. - Tratamiento insecticida para pulgón en siembra y durante los tratamientos del verano. -Producción tipo 3 (Consumo): Producción de patatas para consumo; ya sea por escasa demanda o por querer aprovechar la patata de menor calibre, el agricultor la envía para el análisis por si la puede reemplear. Evaluación del material de re-empleo - 32 - Análisis. El material vegetal entregado por los agricultores fue sometido a los siguientes análisis, observaciones y evaluaciones establecidos en el Reglamento Técnico de Control y Certificación de Patata de Siembra: *Virosis: a todos los tubérculos entregados, salvo escasas excepciones, por muestra y agricultor. El análisis se hizo para los dos virus que figuran específicamente en la normativa de patata certificada, PLRV y PVY; el primer año se analizó también PVX. Los análisis se hicieron a tubérculos brotados, por el método DAS-ELISA (Clark y Adams, 1977) utilizando los anticuerpos y el protocolo recomendado por la empresa que los comercializa (Bioreba A.G., Basilea, Suiza). *Otros patógenos: se determinó por cada lote de tubérculos el porcentaje de los mismos, en relación a su peso, con sintomatología de cada una de las siguientes patologías (representadas en la Figura 1.1):  Phytophtora infestans  Alternaria solani  Rhizoctonia solani  Phoma spp.  Fusarium spp.  Hemilthosporum solani  Streptomyces scabies  Otras bacterias (podredumbres) *Fisiopatías: al igual que ocurría con los patógenos, las fisiopatías también se establecen en porcentaje de tubérculos afectados por: grietas, golpes y manchas en la carne. CAPITULO 1 - 33 - Figura 1.1 Patógenos analizados en el Instituto do Campo: 1. Phytophtora infestans, 2a y 2b. Alternaria solani, 3. Fusarium spp., 4. Hemilthosporum solani, 5. Streptomyces scabies y 6. Rhizoctonia solani. Recomendaciones. Con los valores correspondientes a los análisis realizados a cada agricultor, lote y año, se elaboraron columnas de datos de recomendaciones de uso de los lotes que se dieron a los agricultores. Estas columnas de datos tienen una parte de cálculo en base a los umbrales que marca la normativa (Tablas 1.3 y 1.4), sobre todo virosis, aunque sólo se considera como referencia pues los márgenes pueden ser más amplios teniendo en cuenta el virus predominante y la presencia de uno o de los dos virus. Pero la recomendación tiene también un fuerte componente “subjetivo”, basado en la experiencia sobre las fincas y agricultores. La “recomendación de siembra” se hizo en base a 5 categorías: 1. No sembrar 2. Sembrar incluyendo alguna técnica de cultivo específica: aumentar el abonado nitrogenado, aumentar la densidad de siembra, aplicar tratamientos específicos, etc. 3. Sembrar escogiendo Evaluación del material de re-empleo - 40 - Figura 1.8 Media del porcentaje de infección de virosis total (PVY+PLRV) según tipo de producciones (1 = Siembra, 2 = Siembra + Consumo y 3 = Consumo). Letras diferentes indican diferencias significativas con p<0,05 según Tukey-b. Variedades mayoritarias/virosis. Los pocos lotes de la variedad minoritaria Desiree fueron los que presentaron mayores porcentajes de los tres virus (PVX, PVY y PLRV) casi todos los años y los de otras variedades fueron muy variables y normalmente altos (Fig. 1.9). En Agria fueron mayores los porcentajes de infección de PVX (sólo 2000) y PLRV y en Kennebec los de PVY. Considerando el total de virosis Agria siempre presentaron valores menores pero tanto Agria como Kennebec mejoraron a lo largo de los años de estudio 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Agria Kennebec Desiree Otras % medio virosis PVY+(PLRV ) Figura 1.9 Porcentajes medios de infección de virosis total (PVY+PLRV) para las principales variedades de estudio (Agria, Kennebec, Desiree y otras). Media de los cuatro años de estudio (2000 a 2003). b b a 0 5 10 15 20 25 30 35 Siembra Siembra+consumo Consumo Tipo de productor % medio virosis (PVY+PLRV ) CAPITULO 1 - 41 - Otros Patógenos Rhizoctonia solani: un 90% de los lotes se encontraron en valores menores del 10% de infección. Cabe destacar un 41% de lotes del conjunto de los cuatro años de estudio con un porcentaje hasta el 1% de Rhizoctonia que ascendió al 83% si tenemos en cuenta lotes con infecciones hasta el 6%. (Fig. 1.10). 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 1-10 11-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90 91-100 nº de lotes 2000 2001 2002 2003 Figura 1.10 Evolución del porcentaje de lotes de patata en los 4 años de estudio (2000 a 2003) según intervalos de nivel de infección de Rhizoctonia solani. Streptomyces spp: Para la sarna común, el mayor porcentaje de casos estuvo en el intervalo del 1 al 10% de infección tal como se muestra en la Figura 1.11. Un 61% de los lotes de tubérculos recogidos en los cuatro años de estudio solo tendrían un 5% de infección o menos, valores positivos de cara al reempleo. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 1-10 11-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90 91-100 nº de lotes 2000 2001 2002 2003 Figura 1.11 Evolución del porcentaje de lotes de patata en los 4 años de estudio (2000 a 2003) según intervalos de nivel de infección de Streptomyces scabies. Evaluación del material de re-empleo - 42 - Hemilthosporum solani: la sarna plateada no aparece como tal en la normativa y sin embargo es el patógeno que, con diferencia, se encontró con más frecuencia en los lotes analizados y en el que se observó un mayor crecimiento en la incidencia. En 2000 los porcentajes más altos de lotes infectados se encuentraron en el intervalo del 11 al 20%, en 2001 entre el 10 y el 30% y en 2002 y 2003 casi la totalidad de los datos pertenecieron a los intervalos que van desde el 21 al 40% (Fig. 1.12). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 1-10 11-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90 91-100 nº de lotes 2000 2001 2002 2003 Figura 1.12 Evolución del porcentaje de lotes de patata en los 4 años de estudio (2000 a 2003) según intervalos de nivel de infección de Hemilthosporum solani. Los análisis de frecuencia muestran que otros patógenos minoritarios y fisiopatías aparecen con frecuencias muy bajas (Phytophtora infestans, Alternaria solani, Fusarium spp., Phoma spp. y bacterias). En esos casos los valores cumplen la normativa y los tubérculos podrían utilizarse sin problemas para siembra. Para la mayoría de estos patógenos las producciones tipo 1 presentaron porcentajes de presencia menores, pero la variabilidad de los datos fue muy alta y en todos los casos hubo algún año “excepcional” o algún lote con niveles muy altos que hacieron que las desviaciones fueron muy grandes y que sólo se pueda hablar de tendencias. CAPITULO 1 - 43 - Tanto Agria como Kennebec tuvieron un comportamiento similar en los años de estudio, con excepciones en algunos años concretos (más sarna común en 2000 y Rhizoctonia en 2001 en Agria, por ejemplo). En cuanto a las fisiopatías, entre los datos recogidos por el Instituto do Campo figuran los “golpes”, pero al igual que ocurre con algunas enfermedades mencionadas, no es un factor de especial relevancia para llevar a cabo un reempleo; el porcentaje admitido por legislación es del 3%. La mayoría de lotes afectados tuvieron valores inferiores al 10%, 0 en el 72% de los casos y llegaron al 81% tomando como límite el 3%. Hubo un claro descenso de los golpes a medida que avanzan los años, desapareciendo totalmente en el 2003; las patatas de producción tipo 1 presentaron menor incidencia de golpes que el resto (Fig. 1.13). Figura 1.13 Evolución del porcentaje de lotes de patatas en los 4 años de estudio (2000 a 2003) según intervalos de afección por “golpes”. Recomendaciones. En las recomendaciones se ven las diferencias entre tipos de producciones. Todos los años se produjo un aumento del porcentaje de recomendaciones de no sembrar y de sembrar tratando en el tipo 3 frente al 2, mientras disminuyó o se mantuvo en valores semejantes el porcentaje de recomendaciones de sembrar. Por lo que respecta a las producciones tipo 1, hay menos datos y con mayor variabilidad, pero se recomendó sembrar hasta a un 80% en 2002; sin embargo, en 2003 a un 50% de los lotes de ese grupo no se les recomendó la siembra (Figura 1.14). Golpes 0 50 100 150 200 250 0 1-10 11-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90 91-100 nº de lotes 2000 2001 2002 2003 Evaluación del material de re-empleo - 44 - 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 123123123123 2000 2001 2002 2003 Sembrar S. Esc.+Trat S. Trat. S. Esc. No sembrar Figura 1.14 Porcentaje de lotes a los que se recomendó sembrar, sembrar tratando, sembrar escogiendo, sembrar tratando+escogiendo o no sembrar, en los 4 años de estudio (2000 a 2003) para cada tipo de lotes (1 = Siembra, 2 = Siembra + Consumo y 3 = Consumo). Pérdidas. Las pérdidas estimadas para los distintos lotes a los que se recomendó sembrar o sembrar condicionado, fueron disminuyendo con los años con la excepción del 2003 donde se observó un ligero ascenso que pudo ser debido al aumento de virosis relacionado con ese año (Fig. 1.15). Tanto en 2002 como en 2003 se obtuvo un mayor porcentaje de lotes infectados de Hemilthosporum solani y las pérdidas estimadas alcanzaron valores más altos para producciones tipo 2 y, sobre todo, 3 (Fig. 1.16). 0 5 10 15 20 2000 2001 2002 2003 Media de pérdidas estimadas (%) Siembra Siembra+No siembra Figura 1.15 Pérdidas medias estimadas para los 4 años de estudio (2000 a 2003): con todos los datos (1-4, Siembra + 5, No siembra) y con la eliminación de los datos en los que se recomienda “no sembrar” (Siembra). CAPITULO 1 - 45 - 0 5 10 15 20 2000 2001 2002 2003 Pérdidas Estimadas (%) Siembra Siembra+Consumo Consumo Figura 1.16 Media del porcentaje de pérdidas estimadas en los 4 años de estudio (2000 a 2003) según tipo de producción (1 = Siembra, 2 = Siembra + Consumo y 3 = Consumo). En el año 2000 no hubo producciones tipo 1. DISCUSIÓN Desde que finalizó el derecho exclusivo de comercialización, la calidad de la patata de siembra de la variedad Kennebec ha descendido considerablemente y lo mismo ha empezado a ocurrir con Agria (Quintas, 2000). La Comunidad Autónoma Gallega y el sector demandan la producción de material garantizado y a precios asequibles. En el año 2000 se iniciaron estudios para determinar la viabilidad del cultivo de patata de siembra en varias comarcas de Ourense (Cabaleiro et al., 2000) y varias empresas han producido Kennebec y otras variedades desde 2002 pero los costes de producción son altos y la rentabilidad es baja por lo que no parece que en un futuro próximo se vayan a incrementar las producciones. Las dos variedades mayoritarias (80%) son variedades libres, poco interesantes para los productores de siembra certificada. Además, Galicia y más concretamente A Limia, son de las últimas zonas de siembra y la falta de semilla es bastante habitual. Al no haber contratos de producción de siembra nacionales o extranjeros a veces falta semilla y la que hay es de menor calidad. Muchos años el material a la venta es insuficiente o su precio es muy elevado: suele estar entre 0,60 y 0,80 € de media para calibres 35/50 pero hay años en los que Evaluación del material de re-empleo - 46 - alguna variedad ha superado 1,40 € en calibres 28/35 (Ríos, 2007). Si, además, el precio de venta de la patata de consumo ha sido muy bajo (en torno a 0,15 € en 2008; 0,06 € en 2011) o se ha vendido mal, la “tentación” de utilizar la propia patata para siembra es muy alta. Incluso en la normativa de la Indicación Geográfica Protegida Pataca de Galicia se contempla la posibilidad del reempleo: “Únicamente podrán dedicarse a la obtención de patatas amparadas por la Indicación Geográfica Protegida (I.G.P.) "Pataca de Galicia" o "Patata de Galicia", las patatas de consumo de la variedad KENNEBEC, procedentes de semilla certificada, o reempleo controlado procedente de la propia explotación, cultivadas y obtenidas en las parcelas aptas (sanas, sin ningún tipo de enfermedades) y ubicadas dentro de las subzonas de producción definidas e inscritas en los registros del Consejo Regulador”. El reempleo es una práctica relativamente frecuente en A Limia, a pesar que es bien sabido que el uso de patata de siembra certificada garantiza unas mejores producciones (Andrade et al., 2008); es común en otras muchas zonas de producción, a nivel de la UE se estima (en base al mencionado estudio de la OEVV) en un 62% el uso de semilla de reempleo (Mateos, 2009) porque en muchos países – sobre todo los del Este – “el uso de la semilla de reempleo sigue bastante arraigado en la práctica agrícola de las pequeñas explotaciones”. Ese mismo estudio de la OEVV destaca que su uso está estrechamente vinculado a las estructuras agrarias, al tamaño de la explotación y a la tradición de reutilizar la semilla en la propia explotación, más que a cualquier otro parámetro relacionado con el tipo de sistema de remuneración establecido. En otras zonas del mundo y en países en vías de desarrollo, la selección de semilla propia se contempla como una alternativa cuando no es posible la producción controlada de semilla (Gildemacher et al., 2007). La puesta en marcha por el Instituto do Campo del programa de análisis y evaluación de lotes de reempleo se hizo en principio para conocer el nivel de calidad de esa patata que los agricultores estaban utilizando y posteriormente como una vía para evitar que se haga reempleo de lotes que puedan ocasionar grandes pérdidas al agricultor y/o incremento de los patógenos del cultivo que pueden perjudicar a toda la comarca. El número de agricultores que ha participado en el programa de análisis aumentó todos los años, salvo 2001; en 2003 era más del doble del inicial. En la actualidad los agricultores llevan muestras tanto al Instituto do Campo como al Centro Tecnolóxico da Carne y algunos incluso han empezado a utilizar los kits (PATAKIT) CAPITULO 1 - 47 - que se describen en el Capítulo 3 cuyo revelado hace, en una primera fase piloto, la empresa AgroXinzo S.L. La calidad de los lotes analizados en estos primeros años fue muy variable, dependiendo de la variedad, el año y el tipo de agricultor. Algunos patógenos y fisiopatías aparecen sólo ocasionalmente: Phytophthora infestans, Alternaria solani, Phoma spp. y Fusarium spp., bacterias, manchas en la carne y grietas. Otros aparecen siempre con unos niveles similares todos los años, sobre todo, PVY, PLRV y sarna común. En sarna plateada los porcentajes de infección parecen demasiado altos para recomendar la siembra a pesar de que la sarna plateada no está regulada por la normativa de producción de patata certificada. Los altos niveles de sarna plateada en semilla son debidos principalmente a las deficientes condiciones de conservación de la semilla, es decir, a falta de cámaras frigoríficas. Es un patógeno que en los últimos años está causando problemas, no tanto de daños directos o en conservación sino porque impide la comercialización de la patata como “patata lavada” que empieza a ser una característica casi imprescindible para obtener mejores precios de venta, aunque en A Limia se ha implantado poco (Popkova et al., 1981; Alonso, 2002). En la producción de patata de siembra certificada se busca, sobre todo, conseguir bajos niveles de virosis que suelen ser el principal motivo de descalificación porque no hay forma de hacer una selección visual previa. La producción de patata de siembra certificada en algunas zonas tradicionales se encuentra amenazada por la imposibilidad de conseguir un control adecuado de virosis, sobre todo de PVY (Handizi y Legorburu, 2002). Los niveles de PLRV se han estabilizado gracias al empleo de insecticidas sistémicos en siembra pero El PVY causa cada vez mayores problemas en todas las zonas de producción. Los datos de este estudio, correspondientes a los años 2000 a 2003, indican que más de un 50% de todos los lotes analizados estaban por debajo del 10% de PVY lo cual es un valor más que aceptable considerando que la mayoría de los agricultores no realizan medidas especiales de cultivo. En el caso de las producciones tipo 1 que sí llevaron a cabo un manejo especial encaminado a reducir virosis, el porcentaje de lotes por debajo del 10% fue aun mayor, destacando en 2002 donde prácticamente todos estuvieron libres de virosis. Tanto para PVX como para PLRV se obtuvieron mejores resultados para producciones tipo 2, lo cual es de esperar puesto que realizan algunas medidas de las recomendadas para siembra, pero no ocurre lo mismo para PVY donde en 2001 y 2002 se invierten los resultados. Hay que tener en cuenta Evaluación del material de re-empleo - 48 - que la mayor parte de las medidas más eficaces contra PLRV (transmisión persistente) no lo son tanto para PVY (transmisión no persistente). La siembra tardía y quema de matas son realizadas sólo en producciones tipo 1, por tanto es lógico que no haya muchas diferencias entre las producciones tipo 2 y 3. Teniendo en cuenta que en las zonas de producción “profesional” de patata de siembra el número de lotes descalificado por sobrepasar el límite de PVY es cada vez mayor, se pueden considerar valores positivos los obtenidos en estos primeros años de programa de análisis de lotes de reempleo en A Limia. Cuando se considera el total de virosis (PVY+PLRV) para todos los años y agricultores, un 26 % de los lotes cumplirían como certificada B y un 18 % como certificada A. El virus mayoritario en A Limia también es PVY, con una media global en torno al 15,8 % de infección. Los daños por PVY están bien documentados (Zaag, 1987) pero dependen mucho de la variedad y un buen número de las variedades tienen altos niveles de resistencia. Teniendo en cuenta que no se trata de lotes de patata para certificar y que las dos variedades mayoritarias, Agria y Kennebec, presentaron un buen nivel de tolerancia a PVY como se podrá ver en el Capítulo 2, en esos años se recomendó la siembra de un buen número de lotes con niveles medio/altos de PVY aunque a veces aconsejando fertilización extra en cobertera. Hay que resaltar que la variedad Agria siempre presentó menores porcentajes de PVY que Kennebec que en parte se pueden atribuir a una peor detección de este virus en Agria como se ha comprobado en ensayos de campo con las dos variedades (Couceiro et al., 2005). Dado que la mayoría de las nuevas variedades de patata que salen al mercado presentan un nivel mas que aceptable de resistencia a este virus, desde algunos sectores se plantea la revisión del límite actual en la normativa de producción de patata certificada que está dando lugar a muchas descalificaciones y propiciando el abandono de la producción de patata de siembra en muchas zonas. Pero es un tema polémico, sobre todo por el sinergismo que se produce cuando se presentan varios virus en el mismo lote. Reestman, ya en 1970, ponía de manifiesto que el tema de las pérdidas que producen los virus en patata, hasta ciertos niveles, es bastante controvertido. PLRV aparece con menos frecuencia que PVY pero es una virosis más grave para las variedades mayoritarias, sobre todo en Kennebec y, por ello, su presencia, aún en pequeños porcentajes, sobre todo cuando va unida a PVY, hace que no se recomiende la siembra. El PLRV puede reducir el rendimiento hasta en un 80% (Zaag, 1987); en CAPITULO 1 - 49 - ensayos de campo (Debrot, 1972) se comprobó que con semilla de patata de reempleo de la variedad “Sebazo” 100% infectada con dicho virus, las plantas provenientes de ellas rindieron un 48,3% menos que las de semilla certificada. En casos de lotes que sólo se descalificarían por PLRV, el aumento de densidad de siembra puede compensar las pérdidas puesto que PLRV da lugar un peor desarrollo de las plantas, de forma que las plantas adyacentes pueden cubrirlas por completo. También hay algunos trabajos antiguos que indican que el abonado nitrogenado puede reducir la sintomatología (Wilson, 1955; Watson y Wilson, 1956), que deberían actualizarse. Los pocos lotes analizados de la variedad Desiree presentaban en general valores muy altos de las dos virosis principales y también de PVX, virus que sólo se analizó un año una vez comprobado que aparece sólo ocasionalmente (3,7%) en las producciones tipo 3 y que un 90% de los lotes tienen menos del 10%. Este virus produce daños menores cuando es el único presente pero puede dar lugar a daños graves en caso de aparecer junto a los otros dos; además, como se transmite mecánicamente puede causar problemas graves al persistir en el terreno o por ser llevados a otras parcelas con la maquinaria. La recogida de datos de poblaciones de pulgones, habitual en las zonas de producción de patata de siembra, puede ser valiosa para, en base a los picos de muchos años, estimar los momentos oportunos de intervención. Por los datos recogidos en varias zonas y años, las poblaciones son muy irregulares y en todo caso no parece que haya una relación clara entre los niveles de población de un verano y el nivel de virosis en los lotes analizados en invierno (Pérez et al., 2004). Las recomendaciones realizadas a los agricultores pretenden reducir las pérdidas que se producen habitualmente por el reempleo y, en muchos casos, la recomendación de no sembrar está encaminada a evitar un aumento de patógenos no sólo en las parcelas del agricultor concreto sino en toda la comarca. No hay datos sobre el cumplimento de lo que no son más que “sugerencias de manejo”, pero el hecho de que los agricultores sigan llevando lotes a analizar y que cada año nuevos agricultores se incorporen al programa, soliciten este servicio de otros laboratorios o incluso se animen a utilizar kits de autoanálisis, parece indicar que lo valoran positivamente por haber mejorado sus rendimientos y reducido sus costes. Aunque hay estimaciones de lo que se “reserva” para reempleo (Tabla 1.3), no hay datos precisos y es difícil cuantificar el ahorro que supone a los agricultores el reempleo con patata de calidad aceptable pues es muy variable de un año a otro y para distintas Influencia de la utilización de lotes de reempleo en la producción… - 54 - y a menudo pueden ser diagnosticados por mosaicos sobre las hojas, atrofia de las plantas, malformaciones de hojas y malformaciones de tubérculos no específicas; de hecho, la nomenclatura de la mayoría de virus de la patata no sigue las normas que rigen para la mayoría de los virus vegetales, “Huésped-Síntomas-Virus” (Hull, 2002), entre otros motivos por esa inespecifidad de los síntomas que impide dar una “segunda letra” identificativa (PVA, PVY, PVX, PVA, PVM…) (Singh et al., 2008). Esto no ocurre, por ejemplo, en el PLRV (Potato leafroll virus en alusión a los claros síntomas de hojas enrolladas), único virus, de los principales que se nombra con las sigla del cultivo y los síntomas. Los síntomas y daños no siempre se expresan claramente debido a interacciones entre el/los virus, a la variedad de patata, a las condiciones de cultivo (ambientales y de fertilidad del suelo) y también a la edad de la planta cuando es infectada y la forma en la que se haya transmitido el/los virus (Cervera y García, 1996). Los tubérculos infectados dan lugar, una vez sembrados, a plantas con una expresión de síntomas algo más clara y por ello, aunque los virus se pueden transmitir de muchas maneras diferentes, el tubérculo “semilla”, es la vía más importante de propagación (Johnson, 2007). El número de virus vegetales que se transmiten por semilla-tubérculo de patata es muy alto (Tabla 6)). En la patata de siembra, los virus son sólo uno de los grupos de patógenos que se evalúan y, para muchas variedades –con buenos niveles de resistencia -, quizá no el más importante; pero se han convertido en el factor básico “objetivo” para el descarte de lotes, pues al no producir síntomas en el tubérculo no es posible una selección previa por parte de los agricultores y es la prueba serológica la que determina la clasificación. Las dos variedades más cultivadas en A Limia, Kennebec y Agria, se considera que tienen un buen nivel de resistencia a PVY (8 sobre 10) y, sobre todo Kennebec, son sensibles a PLRV, lo cual ha sido tenido en cuenta cuando se establecen los umbrales para la utilización o no o en qué condiciones de la patata de reempleo (Capítulo 1). De las variedades tradicionales recuperadas o en intento de recuperación en Galicia (García-Calvo, 2002): Fina de Carballo, Cazona de Vilalba, Ganade de A Limia y Habanera de O Valadouro, sólo de la Fina hay un cultivo medianamente consolidado en la comarca de Bergantiños. Dado que de esta variedad apenas hay patata de siembra certificada, casi todo lo que se siembra es reempleo y el nivel de infección por PVY es muy alto porque, como en la mayoría de zonas de cultivo de patata, en Galicia el PVY está ampliamente distribuido (Cabaleiro et al., 2000). Como, en su zona y circunstancias, el cultivo sigue siendo rentable, esta variedad debe tener una buena CAPITULO 2 - 55 - tolerancia a ese virus, pero no se ha evaluado. La Xunta de Galicia lleva un tiempo intentando la recuperación del cultivo y para ello se ha encargado su saneamiento al centro tecnológico NEIKER (Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario), que cada año produce pequeñas cantidades (4.625 kg en la campaña 2010/11) que se utilizan en ensayos y para su propagación por parte de agricultores o asociaciones y grupos de desarrollo que, por ejemplo, en 2012 sembraron 450 kg procedentes de la multiplicación del material saneado entregado desde el Centro de Investigaciones Agrarias de Mabegondo. Para los ensayos en 2009 y 2010, por tanto, se disponía de material libre de virus para comparar con el material de reempleo. MATERIALES Y MÉTODOS Ensayos en 2008 y 2011: Agria y Kennebec Los ensayos se llevaron a cabo en 2008 (38 lotes) y en 2011 (41 lotes) en una parcela experimental de la Xunta de Galicia gestionada por el CTC en Laguna de Antela (concello 78 Parcela nº71 pol. 177), Sandiás (Ourense). Se marcaron dos líneas de siembra de unos 240 m de longitud y de cuatro surcos cada una. Estas líneas se dividieron en parcelas de 2,5 m de largo por los 4 surcos, dejando un pasillo de 1,5 m entre cada una de ellas. Las patatas se sembraron a mano a 30 cm de separación entre ellas (8 patatas por surco y 32 patatas por parcela). El diseño fue en bloques al azar con tres repeticiones por lote de siembra. Cada lote de siembra fue analizado por DIP ELISA (según el protocolo propuesto en el Capítulo 3) para detectar la presencia de PVY y PLRV. Se evaluó también la presencia de síntomas de otros patógenos y fisiopatías en base una escala de 3 puntos en función de la presencia o no de esclerocios de Rhizoctonia, daños mecánicos, sarnas etc donde: 1 = sin daños; 2 = daños o patógenos presentes; 3 = dañadas y con patógenos. También se clasificaron a nivel global (considerando virus y otros daños) los resultados de producción en función de la escala de recomendación de 5 puntos (donde 1 = “sembrar” y 5 = “no sembrar”) propuesta en el Capítulo 1. Se analizaron un mínimo de 20 patatas por lote (50 de media, dependiendo del tamaño del lote). Con todos los datos se hizo también una “estimación de pérdidas” en caso de siembra. La siembra se realizó el 3 de Mayo en 2008 y el 10 de mayo en 2011 y las parcelas se cosecharon el 6 de septiembre de 2008 y el 16 de septiembre de 2011, Influencia de la utilización de lotes de reempleo en la producción… - 56 - respectivamente; se tomaron todos los tubérculos de los dos surcos centrales de todas las parcelas para estimar producciones brutas (PB) por ha (P muestra x 10.000)/(2.5 x 1.5) y producciones comerciales (PC) por ha en función del calibre (entre 40 y 80 mm). A lo largo del desarrollo del cultivo se tomaron datos de diferentes observaciones tales como: marras, desarrollo, heterogeneidad de las plantas y síntomas de virosis; además, en 2011, a medio ciclo (Julio) se realizaron mediciones de nivel de clorofila con un Fluorímetro Opti-sciences CCM 20 (Tyngsboro, MA, USA), con 10 medidas por parcela (30 por lote). Un primer análisis estadístico de los datos de producción indica que no hay diferencias significativas entre repeticiones de los mismos lotes (p=0,257 en 2008 y p=0,498 en 2011) y sí diferencias entre variedades en 2008 (p=0,038) aunque no en 2011 (p=0,298) de ahí que se estudien los datos de Agria y Kennebec por separado. Los datos de porcentaje de virosis en siembra (PVY, PLRV y suma de ambos) y otros parámetros medidos para obtener una calificación de lotes de siembra se representan gráficamente frente a los correspondientes valores de producción por ha (según se indica en Capítulo 1) y se calcula el nivel de correlación y la significación estadística de dicha correlación utilizando el coeficiente de Spearman ρ (ro) que es una medida de la asociación o interdependencia entre dos variables aleatorias continuas (McDonald, 2009; Wessa, 2012). El coeficiente de Spearman oscila entre -1 y +1, indicándo asociaciones negativas o positivas respectivamente. Los análisis se realizan con el software de acceso libre disponible en la web de P. Wessa (www.wessa.net/rwasp_spearman.wasp/). Ensayos en 2009 y 2010: Fina de Carballo La variedad Fina de Carballo es una variedad de ciclo tardío, con gran desarrollo foliar, poco productiva (en secano no supera las 20 t·ha-1) y con bajo porcentaje de tubérculos de calibre comercial, de piel amarilla y carne muy blanca, redondos y con ojos bastante profundos (García-Calvo, 2002). En 2009 se estableció un ensayo con tres repeticiones en bloques al azar en una finca en Cardeita (Sandiás, Ourense) del agricultor colaborador Manuel Cid Quintas (concello 78 pol 502 parcela 1071). En 2010 se repitió el ensayo, con modificaciones, en la mencionada finca de la Xunta de Galicia gestionada por el CTC en Laguna de Antela. Las parcelas experimentales fueron de 4,5 m2. En 2009 los tipos de semilla comparados fueron lotes con 0, 20, 40 y 100% de CAPITULO 2 - 57 - PVY, todos ellos seleccionados entre el material cultivado a partir del que la Consellería de Medio Rural recibía de NEIKER tras el saneamiento y primeras multiplicaciones; se incluyó también patata de consumo de la misma variedad, equivalente al que utilizan los agricultores, con alto nivel de virosis. En 2010 se compararon lotes de semilla con 100% PVY o PLRV con lotes de patatas libres de uno o de los dos virus. Se tomaron datos de producción (según calibres), se analizó materia seca y presencia de otros daños (daños mecánicos, verdeo, agusanado, etc.). Los datos se analizaron mediante un Modelo Lineal General (MLG) univariante, con el programa PASW Statistics 18 y la comparación de medias se hizo mediante el test de Tuckey-b. RESULTADOS Ensayos en 2008 y 2011: Agria y Kennebec La observación a media estación de las parcelas con los diferentes lotes con distintos niveles de virosis no evidenció diferencias importantes, aunque a principios del verano, se distinguían algunos lotes por su menor desarrollo y coloración más clara. Las medidas del nivel de clorofila realizadas a medio ciclo no reflejaron el nivel de virosis inicial de los lotes y la mayoría de medidas oscilaron entre los 40 y 50 CCI (clorophyl content index), tanto en Agria como en Kennebec. En las Tablas 2.1 y 2.2 se presentan los resultados de los análisis de los lotes a evaluar y las producciones (kg·ha-1) medias (± desviación típica) obtenidas en las parcelas de cada lote en los dos años de estudio. Además, se incluye la escala de Recomendación de siembra utilizada en el Capítulo 1 y las pérdidas esperadas en caso de siembra del lote, además de las pérdidas reales respecto a los testigos con patata certificada de la misma variedad. La variabilidad entre producciones del mismo lote fue muy alta (dt media 4500 kg·ha-1) y las pérdidas respecto al control con patata certificada normalmente son mayores que las estimadas pero hay casos en los que la producción superó al testigo incluso cuando tienen niveles de virosis y otros patógenos altos. En general hubo una correlación significativa (p<0,001) entre las pérdidas estimadas y las reales de las dos variedades respecto a los lotes certificados en 2008 pero no en 2011. Como media, los lotes clasificados como “no sembrar” o sembrar con algún tipo de tratamiento (2, 3, 4 y 5) tuvieron producciones comerciales un 10% inferiores a las del control. Influencia de la utilización de lotes de reempleo en la producción… - 58 - Tabla 2.1 Resultado del análisis serológico del material vegetal de partida (PVY y PLRV y suma de ambos, ΣV) de los lotes a evaluar y producciones medias bruta (PB) y comercial (PC) (kg·ha1±dt) obtenidas en las tres parcelas de cada lote en 2008; recomendación (Rec) y pérdidas estimadas en función de calidad de lote (PE%); además se incluyen las pérdidas respecto a la PB o PC de las parcelas testigo de cada variedad (PBT% y PCT%) Lote PVY % PLRV % ΣV % PB Kg/ha ±dt PC kg/ha ±dt Rec PE % PBT % PCT % A-cert 0 0 0 60148,1 2699,9 52908,1 2374,9 1 0 - - A-P59 11 7 18 43044,4 2526,6 41159,3 2415,9 4 15 28,4 22,2 A-P64 10 0 10 62666,7 9879,6 49195,0 7755,7 2 5 -4,2 7 A-P82 0 1 1 64474,1 5868,1 63055,1 5738,9 2 3 -7,2 -19,2 A-P83 2 3 5 64637,0 4506,7 50438,4 3516,8 2 5 -7,5 4,7 A-P85 1 1 2 61466,7 2151,4 57489,1 2012,2 1 2 -2,2 -8,7 A-P89 10 0 10 50111,1 2685,0 43965,4 2355,7 2 8 16,7 16,9 A-P91 0 0 0 55229,6 2575,6 49128,4 2291,1 1 1 8,2 7,1 A-P93 10 5 15 45066,7 1361,9 40803,6 1233,1 2 15 25,1 22,9 A-P97 15 4 19 56570,4 2531,2 53164,1 2378,8 2 15 5,9 -0,5 A-P98 5 11 16 47540,7 4741,7 47466,1 4734,3 3 15 21,0 10,3 A-P99 0 38 38 56088,9 8106,8 51971,2 7511,7 5 30 6,7 1,8 A-P102 22 7 29 44088,9 2595,7 43088,8 2536,8 3 15 26,7 16,6 A-P104 10 0 10 66770,4 3666,4 62440,3 3428,6 4 5 -11,0 -18 A-P114 3 3 6 46311,1 1833,0 43262,6 1712,4 1 4 23,0 15,2 A-P118 26 7 33 50829,6 4747,3 49461,3 4619,5 4 5 15,5 6,5 A-P123 2 5 7 60600,0 8852,4 52162,5 7619,9 1 4 -0,8 1,4 A-P124 3 3 6 53444,4 8745,5 52326,6 8562,6 5 25 11,1 1,1 A-P120 34 8 42 45555,6 3840,8 28538,4 2406,1 5 30 24,3 46,1 K-cert 0 0 0 48185,2 5208,8 46814,3 5060,6 1 0 - - K-P60 35 7 42 33792,6 3138,4 23341,3 2167,8 5 25 29,9 50,1 K-P63 36 13 49 39992,6 1760,5 37856,2 1666,5 5 35 17,0 19,1 K-P86 52 2 54 42896,3 2021,7 37692,9 1776,4 5 25 11,0 19,5 K-P87 55 0 55 48911,1 4334,6 45208,2 4006,4 5 25 -1,5 3,4 K-P90 30 0 30 38933,3 4822,8 34537,6 4278,3 4 15 19,2 26,2 K-P92 6 26 32 34844,4 6383,5 30617,8 5609,1 5 20 27,7 34,6 K-P100 20 0 20 57688,9 3506,0 41325,2 2511,5 4 10 -19,7 11,7 K-P101 44 28 72 33400,0 8755,5 30901,8 8100,6 5 50 30,7 34 K-P103 15 5 20 55177,8 7214,2 48561,2 6349,1 2 10 -14,5 -3,7 K-P106 22 22 44 46311,1 7703,5 43375,6 7215,2 5 25 3,9 7,3 K-P108 0 0 0 50051,9 2087,3 40858,7 1703,9 2 3 -3,9 12,7 K-P109 5 0 5 60355,6 4466,8 55318,6 4094,1 4 3 -25,3 -18,2 K-P110 5 5 10 53155,6 8737,0 44001,4 7232,4 4 8 -10,3 6 K-P115 0 6 6 59200,0 3420,5 50489,1 2917,2 5 5 -22,9 -7,8 K-P116 66 0 66 51718,5 6278,5 47929,5 5818,5 5 30 -7,3 -2,4 K-P117 17 0 17 55074,1 2143,5 41529,8 1616,4 4 10 -14,3 11,3 K-P122 31 5 36 38281,5 10841,2 35565,9 10072,1 5 25 20,6 24 A: Agria; K: Kennebec; en negrita, parcelas testigo con patata certificada CAPITULO 2 - 59 - Tabla 2.2 Resultado del análisis serológico del material vegetal de partida (PVY y PLRV y suma de ambos, ΣV) de los lotes a evaluar y producciones media bruta (PB) y comercial (PC) (kg/ha±dt) obtenidas de las tres parcelas de cada lote en 2011; recomendación (Rec) ) y pérdidas estimadas en función de calidad de lote (PE%); además se incluyen las pérdidas respecto a la PB o PC de las parcelas testigo de cada variedad (PBT% y PCT%). Lote PVY % PLRV % ΣV % PB Kg/ha ±dt PC kg/ha ±dt Rec PE % PPT % PPC % A-cert 0,0 0,0 0,0 80438,5 11090,1 74106,6 10036,8 1 0 A-4 0,0 0,0 0,0 62186,7 14106,7 52771,1 4505,1 4 0 28,0 33,1 A-6 8,0 4,0 12,0 78311,1 18539,5 59404,0 25443,0 2 8 9,4 24,6 A-8 5,7 5,7 11,4 85360,0 4563,2 60514,6 1113,3 2 8 1,2 23,2 A-9 0,0 2,3 2,3 73955,6 11057,2 54716,9 7809,8 2 1 14,4 30,6 A-14 13,2 0,0 13,2 63448,9 10878,7 51056,2 14545,7 4 6 26,6 35,2 A-15 4,8 2,4 7,1 81600,0 7335,2 67260,8 3122,7 4 3 5,6 14,7 A-16 2,1 0,0 2,1 95217,8 5524,4 79276,4 9326,7 1 0 -10,2 -0,6 A-19 5,7 2,9 8,6 56160,0 19984,9 50764,4 16966,9 5 25 35,0 35,6 A-20 2,9 2,9 5,9 88302,2 3818,6 76062,8 6342,5 4 4 -2,2 3,5 A-21 5,4 0,0 5,4 67306,7 17229,8 41837,6 13993,6 2 2 22,1 46,9 A-23 40,0 6,7 46,7 58524,4 16378,3 46074,4 13596,4 5 25 32,3 41,6 A-26 25,7 5,7 31,4 69884,4 6575,7 44162,7 5864,2 4 20 19,1 44,0 A-27 4,5 9,1 13,6 53253,3 26964,3 36750,8 4830,7 1 5 38,4 53,4 A-30 0,0 4,0 4,0 81066,7 77013,3 3 2 6,2 2,3 A-31 0,0 3,2 3,2 80462,2 6350,3 65591,0 4820,9 1 1 6,9 16,8 A-32 0,0 3,1 3,1 71608,9 1786,7 54810,3 8521,5 1 2 17,1 30,5 A-33 3,4 3,4 6,9 84604,4 3647,5 75015,9 18470,1 3 5 2,1 4,8 A-36 5,3 10,5 15,8 72017,8 4160,8 61084,4 6998,7 3 12 16,7 22,5 A-37 8,3 0,0 8,3 77048,9 7069,3 62337,3 2784,3 4 4 10,8 20,9 A-39 0,0 0,0 0,0 88320,0 528,0 64028,0 7554,2 1 0 -2,2 18,8 K-12 0,0 0,0 0,0 69706,7 16356,6 54449,3 11868,3 1 0 K-5 32,3 0,0 32,3 69973,3 62556,2 4 20 -0,4 -14,9 K-7 0,0 0,0 0,0 58968,9 13410,2 45739,8 19249,9 3 2 15,4 16,0 K-11 41,7 5,6 47,2 68675,6 18515,4 50424,0 28160,6 5 30 1,5 7,4 K-17 5,6 2,8 8,3 61475,6 13315,4 44224,3 4181,6 2 5 11,8 18,8 K-18 6,8 0,0 6,8 77564,4 11216,8 56230,0 3981,2 2 2 -11,3 -3,3 K-24 18,6 7,0 25,6 64266,7 1206,8 60348,2 2647,0 4 15 7,8 -10.8 A: Agria; K: Kennebec; En negrita, parcelas testigo con patata certificada Influencia de la utilización de lotes de reempleo en la producción… - 60 - Los lotes clasificados como 3 según la escala descrita en el capítulo 1, dieron menores producciones independientemente del nivel de virosis en las 2 variedades en 2008 (Figura 2.1) y también en Agria en 2011 pero para Kennebec en este año las diferencias no fueron significativas (Figura 2.2). a a a a b b 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Agria Kennebec Producción B (kg/ha) 1 2 3 Figura 2.1 Efecto del estado sanitario de la semilla (sin tener en cuenta virosis) en la producción bruta media de los lotes de re-empleo de Agria y Kennebec en 2008. 1: óptimo para siembra; 2: gromo en mal estado, daños leves o presencia de síntomas de micosis; 3: gromo en mal estado, daños importantes o presencia de signos de hongos. Letras diferentes indican diferencias significativas con p<0,005 según el test de Tuckey b. a a a ab b 0 15000 30000 45000 60000 75000 Agria Kennebec PB kg/ha 123 Figura 2.2 Efecto del estado sanitario de la semilla (sin tener en cuenta virosis) en la producción bruta media de los lotes de re-empleo de Agria y Kennebec en 2011. 1: óptimo para siembra; 2: gromo en mal estado, daños leves o presencia de síntomas de micosis; 3: gromo en mal estado, daños importantes o presencia de signos de hongos; este año no hubo lotes de Kennebec con calificación 3. Letras diferentes indican diferencias significativas con p<0,05 según el test de Tuckey b. CAPITULO 2 - 61 - Cuando se utiliza la escala de recomendación de siembra propuesta en el Capítulo 1 que incluye el nivel de virosis como factor de clasificación además del estado sanitario general, los resultados son poco claros en 2008 y las diferencias de producción observadas, tanto en Kennebec como en Agria, no se corresponden con la recomendación de siembra, aunque la producción de los lotes a no sembrar fue menor, especialmente en Kennebec (Fig. 2.3). En 2011 sí hay un descenso de producción importante entre los lotes a sembrar sin problemas y aquellos que se recomendó no sembrar, con una media de 14000 kg menos por ha (Fig. 2.4); todavía menos clara fue la influencia de otros daños. ab ab b b a b b a ab 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Agria Kennebec Producción B (kg/ha) 12345 Figura 2.3 Escala de recomendación de siembra y producción bruta media conseguida en las parcelas sembradas con los lotes correspondientes en 2008 (Agria y Kennebec). Letra diferentes indican diferencias significativas con p<0,05 según el test de Tuckeyb. 1: sembrar; 2: sembrar tratando; 3: sembrar escogiendo; 4: sembrar tratando y escogiendo; 5: no sembrar. En 2008 no hubo lotes de Kennebec en el grupo 3. Influencia de la utilización de lotes de reempleo en la producción… - 62 - a ab ab ab b 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 12345 Escala de recomendación de siembra Producción B (kg/ha) Figura 2.4 Escala de recomendación de siembra y producción bruta media conseguida en las parcelas sembradas con los lotes correspondientes en 2011 (global para Agria y Kennebec). Letra diferentes indican diferencias significativas con p<0,05 según el test de Tuckey-b. 1: sembrar; 2: sembrar tratando; 3: sembrar escogiendo; 4: sembrar tratando y escogiendo; 5: no sembrar. En las figuras 2.5 a 2.16 se representan las correspondencias entre nivel de virosis (PVY, PLRV y suma de ambos) y las producciones alcanzadas para cada una de las variedades en los dos años de estudio. En 2008 se puede ver por las pendientes negativas de las rectas de regresión lineal, que a medida que aumenta el nivel de virosis inicial en la patata de siembra, disminuye la producción en todos los casos pero esa disminución es muy progresiva, sobre todo para PVY y sólo cuando los dos virus están presentes las pérdidas alcanzaron valores importantes. Para tener una visión global de todos los lotes y sus repeticiones se optó por hacer, además de los análisis de datos por escalas, un estudio de correlación, utilizando el coeficiente de Spearman. En la tabla 2.3 se presentan los resultados de dicho análisis y los niveles de significación del mismo. En 2008 la correlación entre nivel de virosis y producción fue siempre significativa y en 2011 sólo en algunos casos en Agria pero no en Kennebec. CAPITULO 2 - 63 - y = -396,31x + 57876 0 20000 40000 60000 80000 0 5 10 15 20 25 30 35 40 % PVY PB (kg/ha) Figura 2.5 Porcentaje de PVY frente a producción por ha en las parcelas de ensayo de la variedad Agria en 2008 y recta/ecuación de regresión lineal ( - - - ). y = -190,93x + 55490 0 20000 40000 60000 80000 0 5 10 15 20 25 30 35 40 %PLRV P (kg/ha) Figura 2.6 Porcentaje de PLRV frente a producción por ha en las parcelas de ensayo de la variedad Agria en 2008 y recta/ecuación de regresión lineal ( - - - ). y = -307,6x + 58778 0 20000 40000 60000 80000 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 % (PVY+PLRV) PB (kg/ha) Figura 2.7 Porcentaje de PVY+PLRV frente a producción por ha en las parcelas de ensayo de la variedad Agria en 2008 y recta/ecuación de regresión lineal ( - - - ). Influencia de la utilización de lotes de reempleo en la producción… - 70 - sin embargo, al seleccionar los tubérculos en base a calibre, forma y sanidad, el rendimiento comercial fue un hasta un 40% inferior en el reempleo. La variedad Fina de Carballo, por su parte, no pareció afectada por el PVY, sea cual sea su nivel (incluso el 100%) y, sin embargo, hay algunas pérdidas de producción cuando se presentó PLRV. Hay que tener en cuenta que estas parcelas de ensayo son de regadío y que las condiciones son óptimas para el desarrollo de las plantas. En condiciones normales, en su zona de cultivo y en secano, la producción de la Fina de Carballo suele estar entre los 15 y los 20000 kg·ha-1 aunque en algunas parcelas establecidas con material certificado procedente de NEIKER también se han superado en ensayos los 25000 kg·ha-1 (Alberto Martínez Pose, GDR Bergantiños, comunicación personal). Como la venta es directa en muchos casos y el agricultor consigue precios en torno a 1€·kg-1 esas producciones se consideran rentables (Ia2P, 2010). En todo caso, la variabilidad en las producciones es tan grande y dependiente de las condiciones del año que descensos de producción en torno a un 10%, no serían suficientemente importantes como para que, en las condiciones de secano en las que habitualmente se planta la Fina de Carballo, el agricultor perciba los daños por virus. Por tanto, se puede afirmar que el reempleo es bastante seguro y más si se controlan los pulgones y circunstancias en las que puede transmitirse PLRV y, sobre todo, si se eliminan las plantas con síntomas lo antes posible en campo y se hace selección de tubérculos, descartando para siembra los que presentan ciertas características, como deformaciones y, sobre todo, el aspecto del brote, que sale como en rosetas en los tubérculos con PLRV. Indudablemente se debe hacer selección para evitar todos los patógenos del suelo o al menos los que son susceptibles de ser detectados en el tubérculo mediante una adecuada observación. Pero en el medio/largo plazo, una regeneración periódica de estas variedades minoritarias es imprescindible para evitar que una acumulación excesiva de patógenos sistémicos acabe por reducir tanto las producciones que haga inviable económicamente su cultivo. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Alonso, F. 2002. El cultivo de la patata. Ediciones Mundi-Prensa, Madrid. 495 pp. Andrade, N., Contreras, A. y Castro, I. 2008. Evaluación comparativa del efecto en el rendimiento y sanidad en el cultivo de la papa al utilizar semilla certificada y sin certificar. Agro Sur 36(2): 111-114. CAPITULO 2 - 71 - Cabaleiro, C., García-Calvo, L., Alvarez-Pousa, S. 2000. Virosis en el cultivo de la patata en Xinzo de Limia. Patata 2000, Congreso Iberoamericano sobre Investigación y Desarrollo en patata. Vitoria-Gasteiz, 2-6 Julio 2000. Cervera, M.T. y García, J.A. 1996. Patogénesis de virus de plantas. En: G. Llacer, M.M. López, A. Trapero y A. Bello (eds), SEF-Phytoma España. García-Calvo, L. 2002. Estudio de cultivares comerciales de patatas (Solanum tuberosum L.). Memoria para la obtención del Diploma de Estudios Avanzados. Escola Politécnica Superior. Departamento de Producción Vegetal. Universidad de Santiago de Compostela. Hane, D.C. y Hamm, P.B. 1999. Effects of seedborne potato virus Y infection in two potato cultivars expressing mild disease symptoms. Plant Disease 83:43-45. Hull, R. 2002. Matthews' Plant Virology, 4th ed. Academic Press, S. Diego (CA, USA) 1001 pp. Ia2p. 2010. Situación de la variedad Fina de Carballo. Proyecto de cooperación interterritorial “Nuevos Horizontes”. Asociación para o desenvolvemento rural da comarca de Ordes. Entrada en Nov. 2010, consultado el 11/03/2012. 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Discussion paper: The naming of Potato virus Y strains infecting potato. Archives of Virololy 153: 1–13. Influencia de la utilización de lotes de reempleo en la producción… - 72 - Wessa, P. 2012. Spearman Rank Correlation (v1.0.1) in Free Statistics Software (v1.1.23-r7), Office for Research Development and Education; consultado el 23/04/12, URL http://www.wessa.net/rwasp_spearman.wasp/ Whitworth, J. L., Nolte, P., McIntosh, C., y Davidson, R. 2006. Effect of Potato virus Y on yield of three potato cultivars grown under different nitrogen levels. Plant Disease 90:73-76. Zaag, van der, D.E. 1987. Yield reduction relation to virus infection. En: J.A. De Bokx y J.P.H. Van der Want (Eds). Viruses of potatoes and seed-potato production. Pudoc, Wageningen, 2nd ed. pp: 146-150.             CAPITULO3  CAPITULO 3 ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 73 CAPITULO 3: Optimización de la Inmunoimpresión directa ELISA (DIP-ELISA) para la detección de PVY y PLRV en patata de re-empleo. Kits de detección. RESUMEN La inmunoimpresión directa ELISA es el método más sencillo y económico de detección de virus vegetales y es el método que mejor se adapta a una utilización por parte de técnicos y agricultores, al no necesitar infraestructura ni condiciones especiales para su utilización. Se estudia la viabilidad de su uso para la detección de virus de la patata (PVY y PLRV) en tubérculos brotados y se compara la sensibilidad y fiabilidad, los tiempos y los costes con los que se producen utilizando el método oficial de análisis DAS-ELISA. La concentración tanto de PVY como de PLRV en las plantas y tubérculos, no es homogénea y varía con el tiempo y por tanto la muestra y la fecha afectan al resultado de las analíticas. Con la sensibilidad actual de los métodos serológicos se podría estar subestimando el nivel de virosis en la patata certificada, sobre todo cuando los análisis se hacen recién rota la dormancia de forma artificial. El protocolo de DIP-ELISA propuesto, mejora los costes y tiempos propuestos por otros autores, tiene suficiente sensibilidad para la detección de PVY y PLRV, con un coste 56 veces inferior y permite obtener los resultados en menos tiempo (3,2 h vs. 14 h) que el DAS-ELISA. El diseño de kits completos y su comercialización pueden ser una valiosa herramienta para los agricultores que quieren hacer reempleo de su propia patata para siembra. Palabras clave: patata, virus, diagnóstico, DIP, ELISA, PVY, PLRV INTRODUCCIÓN Desde que en 1977 Clark y Adams pusieran a punto un método de detección de virus vegetales basado en reacciones inmunoenzimáticas, el ELISA (Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay), se fueron desarrollando un buen número de variantes de la técnica (Hawkes et al., 1982; Koening y Paul, 1982). En 1985, Banttari y Goodwin, y algo más tarde Powell (1987) describieron un procedimiento de impresión de cortes de tejidos en membranas de nitrocelulosa y su posterior revelado inmunológico, que ofrece la posibilidad de detectar los antígenos localizados en la impresión del tejido vegetal y evita la realización de extractos. La Inmuno-impresión directa (Direct ImmunoprintigDIP) conocida también como Tissue Printing (TP), Tissue Blot Immunoassay (TBIA), Direct Tissue Blot Assay (DTBA), Nitrocelulose Membrane (NCM-ELISA) y otras denominaciones, ha sido puesta a punto y utilizada desde entonces para la detección de varios virus, bacterias y fitoplasmas en diferentes cultivos y tipos de material vegetal como una variante más de ELISA para ser utilizada como alternativa al Double Optimización de la Inmunoimpresión directa ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 74 Antibody Sandwich (DAS) (Powell, 1987; Lin et al, 1990; Hsu y Lawson, 1991; Makkouk et al, 1993; Cambra et al., 1994; Gabler et al., 2004.). Precisamente en patata (Clark y Adams, 1977; Banttari y Goodwin, 1985) es donde primero se utilizaron las técnicas ELISA (Gugerli y Gehriger, 1980) y los principales virus de la patata, que deben estar por debajo de ciertos límites en patata de siembra certificada, se pueden detectar bien por DIP (Lizarraga, 1989; Bravo-Almonacid et al., 1992; Samson et al., 1993; Whitworth et al., 1993; Chao et al., 2002; Guzman et al., 2002). Sin embargo DAS-ELISA sigue siendo la técnica oficial más utilizada en todo el mundo para la certificación de tubérculo para siembra (Slack y Singh, 1998) porque los laboratorios encargados de realizar análisis rutinarios de la patata de siembra están ya bien equipados para seguir los protocolos DAS-ELISA estándar, que tienen la ventaja de tener un sistema objetivo de medida de las reacciones positivas (colorimétrico) (Hampton et al., 1990). Pero el DAS-ELISA requiere bastante tiempo y trabajo al necesitar una extracción previa de la muestra procedente del tubérculo y varios pasos con periodos de incubación largos. Si bien el proceso se puede automatizar en cierta medida, no todos los laboratorios están dotados con ese tipo de instalaciones y el coste de esas analíticas puede no ser asequible en según qué circunstancias y zonas de producción. En un análisis particular, en el que lo que el asesor del agricultor o el propio agricultor busca es una orientación de la calidad de su patata para reempleo en cuanto a la presencia de virosis graves, no compensa económicamente hacer DAS-ELISA y la inmunoimpresión directa puede ser una técnica muy adecuada, ya utilizada por agricultores y viveristas de otros sectores, sobre todo de huerta para virus como el TSWV (Tomato spotted wilt virus) (Hsu y Lawson, 1991) y también en frutales, sobre todo en cítricos para la detección de Citrus tristeza virus (CTV) y Plum pox virus (PPV) en viveros (Cambra et al., 1991, 2000 a y b; Garsey et al., 1993; Lin et al., 2000). También se ha usado con éxito en estudios epidemiológicos de Grapevine leafroll associated virases (GLRaV) (Couceiro et al., 2006) o en estudios de la distribución de closterovirus en plantas de piña tropical (Hu et al., 1997), entre otros. La mayor parte de los investigadores han encontrado una buena correlación entre los resultados del DAS y el DIP ELISA en el caso de virus de patata y una sensibilidad similar (Banttari yGoodwin, 1985; Bravo-Almonacid et al., 1992; Whitworth et al., 1993, 2000), aunque en algunos casos DIP-ELISA detectó más muestras positivas que DAS-ELISA (Guzman et al., 2002). A pesar de que es un método ampliamente utilizado y de probada fiabilidad, DAS-ELISA presenta algunos inconvenientes: baja CAPITULO 3 ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 75 sensibilidad en tubérculos recién o poco brotados, muchos pocillos y placas con un número excesivo de falsos positivos y reacciones inespecíficas, resultados irregulares en los positivos y resultados poco consistentes con anticuerpos de diferentes casas comerciales. Además, aunque DAS-ELISA es una técnica bastante sencilla, hay muchos pasos, varios tampones a utilizar, lavados que se repiten etc. que deben ser hechos a mano cuando no se dispone de equipamiento automático y por personal no especializado. Uno de los objetivos de este trabajo es proporcionar a los técnicos y/o agricultores una herramienta sencilla y barata, pero que mantenga los estándares de fiabilidad, para utilizarla en el análisis del material de reempleo. Para ello se propone optimizar los protocolos de impresión de tejidos para evitar errores y reducir costes y tiempo necesario por muestra y comparar DIP y DAS ELISA. Las modificaciones de los protocolos incluyen el uso de membranas de nitrocelulosa más baratas (filtros de agua), bloqueo de membranas con reactivos comunes o más rápidos, incubación en soluciones de anticuerpo más diluidas de lo que se utiliza en DAS ELISA, reutilización de soluciones de anticuerpo e incubación en una mezcla de varios anticuerpos para detectar más de un virus por análisis (PVY y PLRV). MATERIALES Y MÉTODOS Anticuerpos: se utilizaron anticuerpos policlonales específicos para PVY y PLRV (ocasionalmente también contra PVX, PVA, PVM y PVS); en el caso de DIP ELISA sólo se utilizaron anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina; en DAS se emplearon ambos. La mayoría de los análisis se hicieron con anticuerpos de la casa Loewe y en el Instituto del Campo con Bioreba AG (Basilea, Suiza). Los anticuerpos se diluyeron en PBS (para 1 L: NaCl 8 g, KH2PO4 0,2 g, Na2HPO4·12H2O 2,9 g, KCl 0,2 g, pH 7,2-7,4) o en el tampón conjugado recomendado por Bioreba AG para los DAS-ELISA (para 1 L: Tris 2,4 g; NaCl, 8 g; PVP K25, 20 g; Tween 20, 0,5 g; BSA 2 g: MgCl2·6H2O, 0,2 g; KCl, 0,2 g; pH 7,2-7,4). Material vegetal: pecíolos, tallos y brotes de tubérculo, tanto para DAS como para DIP ELISA; la mayoría de los tests se hicieron con brotes de 1-2 cm. Optimización de la Inmunoimpresión directa ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 76 DIP-ELISA. En esencia, consiste en cortar el material vegetal a analizar y apretar suavemente el corte fresco sobre una superficie de nitrocelulosa del tamaño adecuado; la membrana se bloquea con proteínas durante un periodo corto de tiempo y posteriormente se incuba en una solución de anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina diluidos en un tampón. Después de lavar cuidadosamente la membrana, varias veces, con tampón salino, se incuba en una solución substrato (BCIP-NBT) que reaccionará con la fosfatasa alcalina del anticuerpo dando lugar a una coloración azul/púrpura. En todas las membranas deben ir cortes de muestras positivas y negativas para el virus que se esté analizando. Dependiendo del virus, en las muestras positivas el color se desarrolla en la impresión completa (PVY) o sólo en la sección correspondiente al floema (PLRV). Es recomendable que dos personas observen la misma membrana independientemente en caso de dudas y para los virus del floema puede ser necesario observar la membrana bajo una lupa. Los distintos protocolos descritos en la bibliografía son muy variados en lo que se refiere a tipos de membrana, soluciones de bloqueo, tampones, preparación o estado del substrato y proceso de revelado, tiempos y temperaturas de incubación y material vegetal utilizado (Banttari y Goodwin, 1985; Power, 1987; Lin et al., 1990; Hsu y Lawson, 1991; Bravo-Almonacid et al., 1992; Makkouk et al., 1993; Whitworth et al., 1993; Guzman et al., 2002). En los trabajos previos de este estudio comparamos la mayoría de los procedimientos y dieron resultados similares por lo que la optimización del protocolo se hizo en función de costes de materiales, facilidad de manejo o reducción de tiempo. Por ejemplo, se compararon las membranas de nitrocelulosa de 0,45 μm de tamaño de poro con las de 0,2 μm y los resultados fueron similares, pero las membranas de 0,2 μm se quiebran con más facilidad y son más difíciles de manejar y, además, en el caso de las de 0,45 μm existen en el mercado membranas estándar, ya cortadas y cuadriculadas, destinadas a otros usos (análisis de aguas) y con un precio mucho más competitivo. El protocolo óptimo resultante es el siguiente: Las membranas de nitrocelulosa de 0,45 μm (Sartorius ref. 11406-047 ACN) se bloquean en leche descremada al 1% en agua destilada durante 1 hora a temperatura ambiente o toda la noche a 4-6 ºC; otra alternativa más corta y con iguales resultados contempla la posibilidad de boquear en polyvinyl alcohol (al 1% en agua destilada) durante un minuto (aunque lleva un tiempo conseguir la disolución, al menos 5 minutos) (Makkouk et al., 1993). Se recomienda agitar durante el bloqueo. Las membranas se pueden pasar directamente a la solución de CAPITULO 3 ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 77 anticuerpo o aclararlas con un tampón salino (0.085% NaCl y 0.05% Tween 20® en agua destilada), sobre todo si se va a utilizar varias veces la solución de anticuerpo. El tiempo de incubación en la solución de anticuerpo específico puede ser de 1,5-2,5 h a temperatura ambiente o toda la noche a 4ºC. Los anticuerpos pueden/deben diluirse hasta 2-2,5 veces más que para ELISA y la solución se puede usar simultáneamente para más de una membrana (máximo 2-3) y reutilizarse al menos 3 veces. Después de la incubación las membranas se lavan 3-4 veces en agitación suave en solución salina, durante 5 minutos. Por último, las membranas, de una en una, se cubren con una solución de substrato (BCIP-NBT) listo para usar (SIGMA B-1911) y el color morado comienza a revelarse después de 5-10 minutos; la reacción se para con agua corriente una vez que los controles positivos están claros. Las membranas son observadas a simple vista y después bajo la lupa para confirmar positivos/negativos dudosos, sobre todo en el caso de PLRV. Para la detección de PVY y PLRV simultáneamente, se pueden mezclar los anticuerpos y, aun en el caso de muestras positivas para ambos virus, se pueden diferenciar bien las marcas, porque PLRV aparece sólo en el floema y aunque PVY da coloración morada en toda la impresión, normalmente las punteaduras de PLRV siguen claras. Si no se precisa saber qué virus está presente sino simplemente identificar muestras virosadas o no, se pueden mezclar anticuerpos para varios virus diferentes (PLRV, PVY, PVX, PVA, PVM, y PVS) en la misma solución y todo el test se hace con una sola membrana e impresión. Esto puede ser útil en el caso de muestras que se espera estén prácticamente libres de virus y sólo las que aparecen con marca positiva serían reanalizadas en membranas separadas para cada virus. DAS-ELISA. El análisis se hizo siguiendo los protocolos estándar basados en el descrito por Clark y Adams (1977), con los anticuerpos diluidos como indica la casa que los comercializa: 1:200 (Loewe Biochemica GMBH, Sauerlach, Alemania), 1:1000 (Bioreba AG, Basilea, Suiza) y siguiendo los tiempos de incubación recomendados por los fabricantes. Como tampón de extracción se utilizó PBS-Tween y como tampón conjugado el descrito antes. Las muestras se consideran positivas cuando el valor de absorbancia es 3 veces superior al de la media de muestras negativas y siempre sobre un valor de 0,100. Optimización de la Inmunoimpresión directa ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 84 (Tabla 3.2). Pero ese sería el coste de DIP sin utilizar las medidas de ahorro propuestas; si el anticuerpo conjugado se diluye dos veces más de lo que se recomienda para ELISA, algo que además es recomendable, y la solución se utiliza para un mínimo de 3 membranas (podrían ser bastantes más, Bravo-Almohacid et al., 1992, llegan a 5 veces), el coste para un número de muestras igual al que se hace en una placa ELISA, podría ser de unos 5,2 €, y bajaría hasta 2,6 € por 45 muestras si en cada tanda se meten 2 membranas por placa (Tabla 3.3). En el DAS ELISA la dilución no es recomendable, al menos para PLRV, y aunque también es posible la reutilización de anticuerpo, las pérdidas de reactivo en los trasvases y el tiempo necesario para extraer los anticuerpos puede ser elevado. Además debido a la duración del análisis y la incubación a temperaturas de 35-37 ºC en cámara, hay mayor riesgo de que se degraden los reactivos. Dado el tiempo transcurrido (casi 20 años), es complejo comparar los costes con los que presentaron Samson et al. en 1993, aunque los precios de los reactivos y, sobre todo, de las membranas, no parecen haberse encarecido demasiado; sobre todo en el caso de las membranas, el tipo de membrana/filtro de aguas utilizado, que es un producto de gran consumo, fue responsable de la disminución de precio. Haciendo una estimación en base al precio de las membranas y de los anticuerpos en 1993 y 2012, los 8,78 $ de coste total/membrana con 72 muestras que figuraban en el artículo de Samson podrían ser hoy unos 12 €, es decir, casi lo mismo que la membrana estándar con la misma concentración de anticuerpo que en DAS-ELISA. Ese coste es el que se compararía con los 7,7-11,3 € estimados para una membrana estándar. Algunos autores, para reducir costes, han recurrido a otros soportes, incluso papel, con resultados aparentemente buenos (Makkouk y Kumari, 2002.). En el presente trabajo, los positivos no fueron suficientemente claros cuando se hicieron pruebas con papeles similares. En cuanto a tiempos, el mínimo para llevar a cabo DIP puede ser de unas 3,2 horas, incluyendo el tiempo de impresión de las 48 muestras duplicadas y los tiempos de incubación. En el caso de DAS-ELISA el mínimo sería en torno a 14 horas (4,4 veces más) aunque algunos tiempos de incubación del DAS podrían reducirse sin mucho problema pero al superar las 8 horas, siempre obliga a hacer el test en dos jornadas laborables (Tabla 3.4). En el artículo de Samson et al. (1993), la inmunimpresión lleva unas 6 horas: el bloqueo con polivinil alcohol y el uso de substrato líquido listo para usar redujo considerablemente el tiempo. CAPITULO 3 ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 85 Tabla 3.2 Coste de los materiales y reactivos para analizar 45 muestras + controles (positivo y negativo) por duplicado con DIP o DAS-ELISA (1 virus). DIP-ELISA DAS-ELISA Membrana de 4,5 cm  0.45 μm 1.25 € Bolsas plásticas para triturado x 47 3 € Polyvinyl alcohol 1% (o leche des) 0,01 € Placa y puntas de pipeta 1,5-3,5 € Placa Petri 50 mm  0,3 € Anticuerpo (10-20 mL3) 14,3-28,6 € Tampones1 0,1 € Tampones2 0,6-1 € Anticuerpo conjugado4 (10-20μL/5 mL) 3,6-7,2€ Anticuerpo conjugado(10-20 mL3) 14,3-28,6 € Substrato (3 mL) 2,5 € Substrato (10-20 μg tablets3) 2,5-5 € Total 7,7-11,3 € Total 36,2– 69,7 € 1 Lavado y conjugado ; 2 Tapizado, lavado, conjugado y substrato; 3 según sean 100 o 200 μL por pocillo; 4 Loewe: sobre precio de ½ lote; Tabla 3.3 Coste de los materiales y reactivos cuando se procesan 3 membranas (45x3=135 muestras por duplicado) con el mismo anticuerpo conjugado por DIP-ELISA en comparación con el procedimiento estándar sin reutilizar anticuerpo analizando las 135 muestras por DAS-ELISA. DIP-ELISA DAS-ELISA Membrana de 4,5 cm  0.45 μm 3x1,25 € Bolsas plásticas para triturado x 47 3x3 € Polyvinyl alcohol 1% (o leche des) 3x0,01 € Placa y puntas de pipeta 3x1,5-3,5 € Placa Petri 50 mm  0,3 € Anticuerpo (10-20 mL3) 3x(14,3-28,6) € Tampones1 3x0,1 € Tampones2 3x0,6-1 € Anticuerpo conjugado 4 (10-20μL/5 mL) 3,6-7,2 € Anticuerpo conjugado4 (10-20 mL3) 3x(14,3-28,6) € Substrato (3 mL) 3x2,5€ Substrato (10-20 μg tabletas3) 3x2,5-5 € Total 15,5-19,1 € Total 85,8–209,1 € Por membrana 5,2-6,4 Por placa 36,2-69,7 1 Lavado y conjugado ; 2 Tapizado, lavado, conjugado y substrato; 3 según sean 100 o 200 μL; 4 Loewe, dos diluciones en DIP Optimización de la Inmunoimpresión directa ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 86 Tabla 3.4 Tiempos mínimos necesarios para el análisis de 45 muestras+controles por duplicado con DIP o DAS-ELISA DIP-ELISA DAS-ELISA Paso Tiempo espera Paso Tiempo espera Organización de las muestras y confección del mapa de la membrana. 15’ Organización de las muestras y confección del mapa de la placa. 15’ Impresión de la membrana 30’ Preparación, dispensado e incubación del anticuerpo. 10’ 180’ Triturado de las muestras. 60’ Preparación y bloqueo de membranas con Poly (vinyl alcohol) o leche descremada 5’ 1’ Dispensado e Incubación. 30’ 180’ Preparación e incubación del anticuerpo. 5’ 90’ Preparación, dispensado e incubación del anticuerpo conjugado. 10’ 180’ Lavado de membranas 5’ 15’ Lavados de la placa después de cada incubación ( 3 x 3 x 5’) 15’ 45’ Adicción del substrato 1’ 10’ Preparación, dispensado e incubación del substrato. 10’ 30’ Lectura de la membrana y procesado de datos 15’ Lectura de la placa y procesado de datos. 15’ 90’ Tiempo total en horas 1.5+1,7=3,2 Tiempo total en horas 2,75+11,9=14,7 * Tiempos de espera. El coste mínimo de materiales y reactivos de los dos tipos de PATAKIT se muestra en la tabla 3.5. En 2011 se hizo el primer reparto para validar la utilidad de los kits y, sobre todo, determinar el coste real medio por muestra ya que los datos obtenidos en el laboratorio suponen que una membrana pequeña pueden soportar 96 impresiones de brotes de tubérculo y una grande hasta 240 (Fig. 3.7e). Eso es así cuando se hace con un cierto orden y brotes de tamaño uniforme (Fig. 3.7c y d) pero puede variar mucho por habilidad, orden y tipo de brotes según estado y variedad (Fig. 3.7a,b,f). Además, la mayoría de agricultores tienen varios lotes, procedentes de fincas distintas, que deben ir en membranas diferentes para evitar confusiones y ello puede implicar que muchas membranas no se cubran por completo. Cabe esperar que como el precio final tendrá que ser fijo, los agricultores aumentarán su pericia con el tiempo para reducir el número de kits que tienen que adquirir. CAPITULO 3 ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 87 Tabla 3.5 Coste de los materiales y reactivos de dos modelos de PATAKIT, con 3 membranas de 4,5 cm (para 135 muestras) o 3 membranas de 9 cm (para 450 muestras). PATAKIT 3 x 4,5 cm  PATAKIT 3 x 9 cm  Membranas de 4,5 cm  0.45 μm 3x1,25 € Membranas de 9 cm  0.45 μm 3x4,4 € Polyvinyl alcohol 1% (o leche des) 3x0,01 € Polyvinyl alcohol 1% (o leche des) 3x0,03 € Placa Petri 50 mm  0,3 € Placa Petri 91 mm  - Tampones1 3x 0,1 € Tampones1 3x0,3 € Anticuerpo conjugado 4 (10μL/5 mL) 3,6 € Anticuerpo conjugado 4 (20μL/10 mL) 7,2 € Substrato (3 mL) 3x2,5€ Substrato (6 mL) 3x5 € Total 15,5 € Total 36,39 € Por muestra, óptimo (96x3) 0,054 € Por muestra, óptimo (240x3) 0,05 € Por muestra, posible (50x3) 0,1 € Por muestra, posible (150x3) 0,08 € Figura 3.7 Membranas DIP reveladas (4,5 cm Ø salvo e); a y b: membrana con impresiones irregulares, sucias, alteradas y/o quebradas; c y d: membranas con un número óptimo de impresiones, ordenadas, claras; e: membrana de 9 cm con un total de 240 muestras bien ordenadas aprovechando el espacio; f: membrana con impresiones de brotes de tubérculos recién brotados, ordenada pero pocas muestras por membrana. Optimización de la Inmunoimpresión directa ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 88 El protocolo descrito para DIP-ELISA es una forma de análisis simple, barato, rápido, preciso, consistente y sensible que se ajusta perfectamente al trabajo en laboratorios con poco equipamiento como pueden ser los de una empresa de servicios/asesoría, una cooperativa o un agricultor con cierta entidad. Existen comercialmente otros sistemas mucho más rápidos, que pueden dar un resultado en 2 minutos (SpotCheck® de ADGEN, por ejemplo) pero que tienen un coste elevadísimo por muestra por lo que sólo sirven para casos excepcionales; además son recomendables para brotes de tubérculo y en la actualidad no hay para PLRV que es la virosis más grave. Los métodos de detección molecular tienen mayor sensibilidad pero no están suficientemente estandarizados y si no se llega a cierta escala todavía no pueden competir en precio de reactivos, facilidad de realización y, sobre todo, para el uso que se indica en este trabajo, necesidades de infraestructura (Martin et al., 2000). El DIPELISA permite, a bajo coste y con un mínimo de medios, el análisis sencillo de muchas muestras y por tanto puede ser utilizado por agricultores o extensionistas para estimar el estado sanitario de patata de siembra en variedades y regiones donde no hay patata de siembra certificada y, en este caso, para garantizar un reempleo seguro. Los kits de inmunoimpresión como los que se comercializan en España para otros virus por empresas como Plant Print SL (CTV, TSWV, TYLCV, PFBV) han tenido un buen resultado comercial a juzgar por los años que llevan en el mercado y todos ellos se utilizan en planta (viveros o campo). Además de para el uso propuesto, hay casos en los que la inmunoimpresión es especialmente útil como alternativa a DAS: análisis ocasionales de pocas muestras de campo dado que las membranas se pueden cortar a medida y usar recipientes pequeños para reducir el gasto de reactivos (mejoradores, depuración en producción de patata de siembra certificada), también para control de calidad en inspecciones de patata de siembra o en mercado. Es evidente que la posibilidad de hacer las impresiones en campo/almacén, sin destruir el material vegetal para posibles contra-análisis o de almacenar membranas ya impresas para procesarlas más tarde da mucha flexibilidad y permite reducir costes al realizar muchos análisis al mismo tiempo reutilizando reactivos. Asimismo, en investigación permite el análisis rápido/económico de muchas muestras en estudios de seguimiento epidemiológico (incluso con impresiones hechas ya en campo), comprobaciones de transmisión de virus en cámaras sin toma de muestras y para la detección de virus a diferentes tiempos tras la ruptura de la dormancia. En un reciente estudio comparativo (Gawande et al., 2011) se concluye que de todas las técnicas evaluadas la combinación de la impresión en CAPITULO 3 ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 89 membranas con la PCR (Print Capture (PC) - RT-PCR) fue la técnica más simple, económica y fiable y no necesita anticuerpos y largos procesos de extracción de RNA. Por tanto, el futuro pasa por la combinación de la impresión en campo con una mejora sustancial de la sensibilidad gracias a los métodos moleculares (Cambra et al., 2000b; Gawande et al., 2011), que permita analizar de forma fiable el cultivo antes de cosecha; ello podría dar lugar a un cambio radical en la forma de trabajar de los agricultores en la producción de patata de siembra certificada y también una gran mejora para el agricultor que produce su propia patata de siembra: se podría hacer una estimación fiable de la calificación del cultivo y, en caso de superar los máximos de virosis, decidir destinarlo a consumo pero permitiendo al tubérculo alcanzar mayor calibre y por tanto obtener una producción rentable. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Banttari, E.E., y Goodwin, P.H. 1985. Detection of potato viruses S, X and Y by enzyme-linked immunosorbent assay on nitrocellulose membranes (Dot-ELISA). Plant Disease 69: 202-205. Bravo-Almonacid, F., Haim, L., y Mentaberry, A. 1992. 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Y un aceite de colza refinado de la empresa MOYRESA (Molturación y Refino, S.A., A Coruña, España) obtenido de semillas de Brassica napus L.) que se aplicó también al 1% (añadiendo un 10% de Tween 20 como agente emulsionante). Se aplicaron semanalmente desde la emergencia de las plantas hasta una semana antes de la eliminación (mecánica) de las matas a principios de agosto (8 tratamientos). Las aplicaciones se hicieron con una sulfatadora manual y la cantidad de caldo aplicado estuvo entre los 1000 L/ha de las primeras aplicaciones y los 1500 L/ha en las aplicaciones realizadas cuando las plantas cubrían completamente el terreno. Las 12 parcelas elementales constaban de 4 líneas de 7 plantas a las que se asignaron al azar los tratamientos con aceites y el control con agua y se realizaron 4 repeticiones de cada tratamiento. Se realizaron dos tratamientos con imidacloprid (50 mL/hL, Confidor® 20SL, Bayer, Mannheim an Rhein, Alemania) para el control de escarabajo (y pulgones) además de un tratamiento contra Phytophthora infestans. A primeros de agosto, antes de la eliminación manual de matas, se tomaron dos hojas por planta de las 10 plantas centrales de cada subparcela y se analizaron por DIP-ELISA para PVY. En septiembre se recogieron 6 tubérculos por planta y se almacenaron en sacos de rafia para su posterior análisis. Se analizaron dos tubérculos en enero y, en caso de no coincidencia, se analizaron otros dos tubérculos en febrero llegando, en algunos casos, hasta 6 análisis. El motivo de esa repetición de análisis es la constatación, en trabajos previos (Capítulo 3), de que no todos los tubérculos de una planta están infectados (o dan positivo) y de que el número de tubérculos que dan positivo por métodos serológicos aumenta a medida que crecen los brotes. Los datos de porcentajes de infección en los tubérculos almacenados se compararon entre sí mediante una prueba χ2. Año 2004 Tomando como preliminares los resultados anteriores, se decidió establecer en 2004, en la finca del Instituto do Campo, un ensayo combinado de efecto de cultivos CAPITULO 4 - 99 - borde y tratamientos con aceites o insecticidas y un estudio de la distribución espacial de plantas virosadas para determinar la procedencia y dispersión del inóculo. La parcela limita al este con ensayos de patata, al oeste con ensayos de maíz y su tamaño podría aproximarse a la parcela tipo empleada por los agricultores que hacen su propia patata de siembra (“Producción tipo 1”, Capítulo 1). Los tratamientos utilizados fueron el aceite mineral de verano Sunspray Ultrafine, al 1%; aceite refinado de colza (obtenido de semillas de Brassica napus) y de soja (obtenido de semillas de Glicine max), ambos de la mencionada empresa MOYRESA aplicados al 1% y el insecticida Cekumetrin 10EC (Cipermetrin 10% p/v), comercializado por la empresa Cequisa S.A. (Barcelona) a una dosis del 0,05%. Se establecieron dos parcelas iguales , una rodeada completamente con un borde de cuatro filas de maíz (variedad PR38A24, ciclo 300) y otra con suelo desnudo como borde (labrado). La parcela se estableció el 29 de abril de 2004, la distancia entre filas fue de 75 cm y entre plantas de 32 cm. Para que el material vegetal de partida fuera idéntico en ambas parcelas, los tubérculos de siembra de la variedad Kennebec (categoría Elite Belga calibre 50/60 cm) se dividieron en dos y se adjudicó una mitad a cada parcela; los tubérculos se trataron con insecticida sistémico (ESCOCET®, Imidaclorprid 35% N; 40 cc/Qm en 1-1,5 L) como es habitual en la producción de patata de siembra, para control tanto de Leptinotarsa decemlineata como de pulgones. En cada parcela se hicieron cuatro bloques y en cada bloque se distribuyeron al azar 5 parcelas para los 5 tratamientos con aceites y controles: aceite mineral, aceites vegetales de soja y de colza, insecticida y una parcela control tratada con agua. Cada parcela experimental constaba de 5 filas de 10 patatas cada una (50 plantas) y se rodeó de una fila de borde de patata de igual variedad y categoría (2 líneas de borde en el centro). El manejo de la parcela (abonados, riegos, tratamientos contra Phytophthora infestans) se hizo en la forma habitual en la finca experimental. Los tratamientos con aceites se empezaron a dar cada semana a partir de la nascencia completa del cultivo de patata (28 de mayo). Se espaciaron los tratamientos a 10 días a partir del cuarto tratamiento momento en el que se detectó una disminución en el conteo de pulgones en las trampas amarillas situadas en la parcela. El 27 de julio se hizo un muestreo aleatorio de tanteo para analizar PVY y PLRV en las hojas de las plantas de patata antes de la eliminación de matas con el herbicida Reglone (diquat 20% p/v 2,5 L/ha). Se analizaron 10 plantas de cada tratamiento, en Utilización de cultivos borde y aceites para el control de la transmisión de PVY __________________________________________________________________________________________________________ - 100 - cada bloque y parcela. A lo largo de los bordes de las parcelas se tomaron al azar 5 muestras de los bordes SO y NE, y 10 de los bordes NO y SE. La detección de PVY y PLRV en hojas se realizó por DIP-ELISA con anticuerpos de la casa Loewe siguiendo el protocolo establecido en el Capítulo 3. El día 22 de septiembre se levantó la cosecha y se tomaron 2 tubérculos por planta, en total 4000 tubérculos que se marcaron convenientemente para identificar su posición exacta en campo. Los tubérculos se mantuvieron hasta su brotación en cámara caliente y en semioscuridad. Se analizaron por DIP-ELISA por primera vez en cuánto los primeros brotes alcanzaban los 2 cm (mediados de diciembre) y se repitió el análisis dos meses y medio después (principios de marzo) a los tubérculos que habían resultado negativos y a todos los casos dudosos o no brotados en diciembre. Se marcaron las patatas para su posterior localización tras el revelado de las membranas, de modo que se pudiera identificar la parcela, bloque, tratamiento, fila y columna, de cada patata analizada. Con los resultados finales de los análisis de las 50 plantas por parcela frente a PVY y PLRV se hizo un mapa completo de la parcela, planta a planta, para el estudio de la distribución espacial de cada uno de los virus (gradientes de enfermedad y agrupaciones) y las infecciones mixtas siguiendo la metodología descrita por Campbell y Maden (1990) y ya utilizada por el equipo de investigación en diversos trabajos (Cabaleiro y Segura, 1997; Cabaleiro et al., 2008). Se utilizó el programa PATCHY diseñado por Maixner (1993). Los posibles efectos fitotóxicos de los aceites o perjudiciales de los bordes de maíz se evaluaron realizando mediciones con un fluorímetro (Opti-sciences CCM 200) en tres fechas a lo largo del ciclo del cultivo y también mediante una escala de grado de senescencia de las plantas (0, no agostado; 5 agostado total). Para estimar la producción de cada parcela se recogieron todos los tubérculos de las plantas de los 4,8 m2 centrales de la parcela. Los tubérculos de cada subparcela se calibraron y se separó la producción en 4 calibres: <40 mm, 40-60 mm, 60-80 mm y >80 mm. RESULTADOS Año 2001 Los análisis realizados al final del ciclo vegetativo no dieron ningún resultado positivo para PVY, lo que indica que no hubo infecciones tempranas que son las únicas CAPITULO 4 - 101 - que se detectan bien en planta por métodos serológicos a final de ciclo. En la trampa Moericke se recogieron, a lo largo del ciclo, 3560 pulgones (Fig. 4.1), de los cuales más de 3000 fueron especies del género Aphis y sólo 53 fueron Myzus persicae y no se observaron colonias en el cultivo. Estas cifras son muy superiores a otros años de los que se dispone de datos (Pérez et al., 2004). La eliminación de matas se hizo antes del pico de final de verano (25 de julio), antes de ese pico la media recogida en las trampas estuvo en torno a los 120 pulgones por fecha de recogida siendo el máximo en época de riesgo el del muestreo del 23 de Julio, con 246 pulgones. Parece que esas poblaciones tardías de pulgones, a pesar de no ser un pico muy alto, dieron lugar a una transmisión importante de PVY porque en los análisis de los tubérculos brotados se detectaron niveles de PVY en torno al 40% de media. No hubo diferencias entre los tubérculos de las plantas de las zonas con distintos cultivos borde y sin borde para Penélope y Kennebec (χ2 = 2,6 y χ2 = 2,4 respectivamente), pero sí entre ellas, con porcentajes en torno al 57% de PVY en Penélope frente al 23% en Kennebec (χ2 = 18,3). La distribución espacial de plantas que adquirieron el PVY no indicó ningún gradiente hacia las zonas labradas ni fue menor en la zona interior. 0 100 200 300 400 500 600 14-jun 18-jun 22-jun 26-jun 30-jun 4-jul 8-jul 12-jul 16-jul 20-jul 24-jul 28-jul 1-ago 5-ago 9-ago 13-ago 17-ago 21-ago 25-ago 29-ago 2-sep 6-sep 10-sep 14-sep 18-sep nº pulgones 0 100 200 300 400 500 600 14-jun 18-jun 22-jun 26-jun 30-jun 4-jul 8-jul 12-jul 16-jul 20-jul 24-jul 28-jul 1-ago 5-ago 9-ago 13-ago 17-ago 21-ago 25-ago 29-ago 2-sep 6-sep 10-sep 14-sep 18-sep nº pulgones Figura 4.1 Capturas totales de pulgones en la trampa Moericke de La Laguna, próxima al ensayo de 2001. Muestreos 2 veces por semana. Flecha roja: herbicida de contacto para eliminación de matas de patata. Año 2003 Los resultados de los análisis realizados a hojas tomadas al final del ciclo vegetativo y a varios tubérculos por planta en distintas fechas tras su brotación, se Utilización de cultivos borde y aceites para el control de la transmisión de PVY __________________________________________________________________________________________________________ - 102 - muestran en la figura 4.2. Sólo el aceite mineral redujo significativamente (χ2 = 26,5) las transmisiones tempranas, que parecen haber sido importantes, puesto que el virus se ha detectado claramente por DIP-ELISA en los brotes que empezaban a agostar. En los análisis realizados en enero a los tubérculos que iniciaban su brotación el número de positivos aumentó significativamente en todos los tratamientos, pero se mantuvieron las diferencias a favor del aceite mineral; los valores medios de tubérculos infectados están en torno al 49% para el testigo, 47% para el aceite de colza y 28% para el aceite mineral, pero como no siempre coinciden los resultados de los análisis de los distintos tubérculos y se considera una planta positiva con que uno de los tubérculos de positivo, los valores totales, por planta, fueron 75%, 68% y 43%, respectivamente (Fig. 4.2). En todos los casos se mantuvieron las diferencias entre el aceite mineral y el testigo mientras que el aceite vegetal no redujo la transmisión. La presencia de pulgones fue importante en cultivos hortícolas y frutales cercanos observándose alados ocasionalmente en las plantas de patata, pero no colonias. b a a b a a 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Testigo Vegetal Mineral Figura 4.2 Ensayo de O Corgo 2003. Porcentaje medio de PVY en planta a finales de julio de 2003 (colores claros) y en tubérculo (análisis global por planta) en enero/febrero de 2004 (colores oscuros). Letras diferentes indican diferencias significativas con p<0,01 (contraste χ2). Año 2004 Virosis Los resultados de los análisis de virosis realizados en hoja antes de cosecha se muestran en el mapa de situación de las parcelas (Fig. 4.3). Aunque el número de plantas con PVY es bajo en este primer análisis, se observa ya una mayor presencia del CAPITULO 4 - 103 - virus dentro de la parcela sin bordes (2 plantas positivas frente a 6, de un total de 200 plantas analizadas en los dos casos). Los bordes de la parcela sin maíz presentaron el mayor número de positivas. Sólo se detectaron 2 plantas positivas de PLRV en la parcela sin maíz dentro de la subparcela del bloque 3 tratada con aceite de soja. Ensayo variedades Ensayo abonado M M MM CC C C I I IIII A A A A S S S S S S S S C C C C I II I M M M M A A A A Parcela de maíz Camino Camino 40 20 40 Soja Colza Mineral Insecticida Agua S C M I A Parcela con maíz Parcela sin maíz Figura 4.3 Plano de localización de la finca de ensayos en el Instituto do Campo en 2004 y mapeo de infecciones tempranas. Porcentaje de plantas infectadas por PVY (análisis en hoja antes de cosecha) en las parcelas de ensayo y en cultivos de patata contiguos (ensayos de variedades y abonado). Los recuadros vacíos indican 0% de infección. Tras el análisis de brotes de los tubérculos, a nivel global la incidencia de PVY (19,8%) fue significativamente mayor que la de PLRV (2,5%) y hubo pocas infecciones mixtas (1,2%). Por tratarse de datos en porcentaje de postivos de los 50 Utilización de cultivos borde y aceites para el control de la transmisión de PVY __________________________________________________________________________________________________________ - 104 - tubérculos/parcela elemental, se analizaron mediante una prueba ² comparando borde, bloque (situación de las parcelas) y tratamiento respecto a la presencia o ausencia de PVY, PLRV e infección mixta por planta analizada. Cuando se analizó la parcela completa sólo existieron diferencias significativas para PVY (Tabla 4.1). Tabla 4.1 Resultados del contraste χ2 para presencia de virus (PVY, PLRV y ambos) en el ensayo de 2004. Efecto PVY PLRV PVY+PLRV Valor χ2 110.905 0.521 1.531 P 0.000* 0.470 0.213 BORDE g.l. 1 1 1 Valor χ2 43.055 5.208 4.680 P 0.000* 0.131 0.183 BLOQUE g.l. 3 3 3 Valor χ2 26.933 1.293 0.695 P 0.000* 0.874 0.947 ACEITES g.l. 4 4 4 La parcela con borde de maíz redujo significativamente el número de plantas positivas de PVY (9,2% vs 30,4% en sin maíz) (Figuras. 4.4 y 4.5). Comparando dos a dos los tratamientos mediante la prueba χ2 hubo diferencias en el bloque 1 de la parcela con maíz y en los bloques 2, 3 y 4 de la parcela sin maíz (Fig. 4.4). Analizando las dos parcelas por separado, cuando no hay un cultivo borde hay un efecto notable de la posición (bloque) de las parcelas en la incidencia del PVY pero no de PLRV. Los dos bloques próximos a la parcela de ensayos de variedades de patata tuvieron la mayor incidencia (Fig. 4.4). Los tratamientos con aceite mineral y de colza disminuyeron significativamente el nivel de transmisión del PVY en la parcela sin maíz. El aceite de colza controló mejor en el bloque con mayor presión de virosis (el 4) y el aceite mineral fue el de mejor comportamiento general. En la parcela con borde de maíz los niveles de incidencia tanto de PVY como de PLRV fueron similares en toda la parcela y solamente se apreciaron diferencias significativas en uno de los bloques en el que todos los tubérculos de las plantas tratadas con el aceite mineral fueron negativas para PVY. Para PLRV se observó un cierto efecto borde aunque no estadísticamente significativo, pues en cualquiera de los tratamientos salvo el control (agua) fue menor el porcentaje de virosis en la parcela con maíz (1,6% vs. 2,8%). CAPITULO 4 - 105 - 41-50 0,1-5 5,1-10 11-15 16-20 21-30 31-40 51-70 71-80 Parcela con maíz Parcela sin maíz Porcentaje de PVY Parcela con maíz Parcela sin maíz Porcentaje de PLRV M M MM CC C C I I I I A A A A S S S S S S S S C C C C I II I M M M M A A A A Parcela con maíz Parcela sin maíz Porcentaje de PVY+PLRV Porcentaje de virosis Soja Colza Mineral Insecticida Agua S C M I A S S S S C C C C I II I M M M M A A A A S S S S C C C C I II I M M M M A A A A M M MM CC C C I I I I A A A A S S S S M M MM CC C C I I I I A A A A S S S S Figura 4.4 Porcentajes de plantas con tubérculos positivos para PVY, PLRV e infección mixta. Colores distintos de borde en los bloques indican diferencias significativas (P<0,05) comparados dos a dos con la prueba χ2. Letras distintas dentro de cada bloque indican diferencias significativas entre los tratamientos (P<0,05) comparados dos a dos con una prueba χ2. La escala de color rojo decreciente indica los distintos niveles (%) de incidencia de cada una de las virosis analizadas. Utilización de cultivos borde y aceites para el control de la transmisión de PVY __________________________________________________________________________________________________________ - 106 - 0 10 20 30 40 PVY PLRV PVY+PLRV TOTAL % plantas (+) CON MAÍZ SIN MAÍZ Figura 4.5 Porcentajes de PVY, PLRV, infecciones mixtas y total virosis en las parcelas con y sin borde de maíz en el ensayo de 2004. 0 10 20 30 40 50 60 70 B1 B2 B3 B4 B1 B2 B3 B4 Con maíz Sin maíz % PV Y agua mineral colza soja insecticida Figura 4.6 Niveles de PVY en todas las subparcelas de cada uno de los bloques de las parcelas con o sin borde de maíz del ensayo de 2004. El estudio de la distribución espacial de plantas virosadas (Fig. 4.4 y tabla 4.2), mostró un importante gradiente de plantas que fueron infectadas durante el verano con PVY hacia la zona Este del conjunto de las dos parcelas (con y sin borde) y, menos marcado, hacia el Sur, justo las dos zonas en las que hay patata de consumo. No hubo ningún tipo de gradiente a nivel global de plantas con PLRV. Considerando las dos parcelas por separado, en la que tiene borde de maíz la distribución de plantas con PVY fue bastante homogénea, pero en la parcela con borde labrado hubo un claro gradiente CAPITULO 4 - 107 - hacia el Este y hacia el Norte. Las infecciones mixtas PVY+PLRV, a nivel de toda la parcela presentaron un gradiente significativo hacia el Este, aunque dado el escaso número de plantas con infección mixta no se aprecia muy claramente en el mapa de la parcela de la figura 4.4. También se hizo un estudio de agregación bidimensional (datos no presentados) en el que se apreciaron agrupaciones significativas (focos) de plantas con PVY desde 2 x 2 plantas y muy marcado a nivel subparcela (5 x 10) y bloque (50 x 5) en la parcela sin bordes. En el caso de PLRV los focos son más pequeños y con poca diferencia de tamaño entre el mínimo y el máximo foco significativo. Tabla 4.2 Pendientes e interceptos de las rectas de regresión de los gradientes de enfermedad relacionando la incidencia de virosis con la posición de la fila y columna de las plantas cuyos tubérculos se analizaron para PVY y PLRV; el análisis se hizo utilizando el modelo lineala, para los datos de las parcelas con y sin borde de maíz. Las flechas indican la dirección del gradiente. Virus Parcela nc b a R2 b Entera f→ c↓ 200 10 0.1295 2.0729 7.1641 8.6120 1.000*** 0.9896* Con maíz f c 100 10 0.0512 0.3235 7.4961 8.0964 0.8246ns 0.4639ns PVY Sin maíz f→ c↑ 100 10 0.1551 3.7859 37.5861 9.0889 0.9918* .9942** Entera f c 200 10 0.0107 - 0.0203 1.3973 2.5454 0.8760ns 0.1164ns Con maíz f c 100 10 0.0106 - 0.1396 2.5288 2.6164 0.4497ns 0.4429ns PLRV Sin maíz f c 100 10 0.0261 0.0966 1.7028 2.4707 0.8185ns 0.6916ns Entera f→ c 200 10 0.0098 - 0.0166 0.3016 1.4602 0.9515* 0.2093ns Con maíz f c 100 10 0.0045 - 0.1327 0.5393 1.6554 0.3277ns 0.6865ns Mix Sin maíz f c 100 10 0.0097 0.0968 1.3257 1.2687 0.4641ns 0.7100ns a I = a  D + b; I: % virosis; D: Distancia de filas (f) y columnas (c) desde borde; a: intercepto; b: pendiente; b ns= no significativo; *,**,*** significativo con P< 0,05, P<0,01, P<0,001, respectivamente; c Número de filas y columnas que determinan el tamaño de la parcela evaluada; Efectos de los tratamientos en el estado general del cultivo, producción y calidad Los niveles de clorofila en hoja crecieron desde la primera medida a la segunda y, posteriormente, coincidiendo con el inicio del agostamiento de las plantas, se produjo un nuevo descenso. No se apreciaron manchas o necrosis marginales que pudieran indicar un efecto fitotóxico de los aceites y tampoco se apreciaron, aparentemente, Utilización de cultivos borde y aceites para el control de la transmisión de PVY __________________________________________________________________________________________________________ - 114 - también dificultaron algo el manejo de un cultivo como la patata en el que es necesario “entrar” para aplicar los tratamientos fitosanitarios. Los aceites por si solos tuvieron algún efecto positivo puntual, tanto en el ensayo de 2003 como en el de 2004, pero el descenso en la transmisión no se ve compensado por el elevado número de tratamientos necesario para conseguir que las plantas estuvieran protegidas durante su crecimiento. En el ensayo de 2004 los aceites tampoco redujeron la presencia de pulgones alados sobre el cultivo (Martín et al., 2006). El insecticida piretroide es el tratamiento que mejor controló la colonización de plantas por alados en la parcela sin borde (Martín et al., 2006), pero como ocurrió en ensayos en Chipre (Ioannou y Iordanou, 1987) éste no interfirió en la transmisión del virus, pues las parcelas tratadas con el piretroide presentaron niveles de virosis similares al control. Algunos autores afirman que los insecticidas, especialmente piretroides, cuando se aplican en dosis subletales pueden aumentar el nivel de transmisión porque los pulgones aumentan su actividad (Khurana y Garg, 1998; Satapathy, 1998). El aceite mineral fue el único que disminuyó de forma significativa la transmisión de PVY en el ensayo de 2003, donde la presión de inóculo fue muy alta por la cercanía de huertos en los que la presencia de Aphis fabae y otras especies de ese y otros géneros no colonizantes era importante. Los aceites minerales se han utilizado en la prevención de la transmisión de virus no persistentes como PVY con buenos resultados en patata y otros cultivos según muchos autores ya citados en la Introducción y en el ensayo de 2004 fue también el de mejor comportamiento a nivel general frente a PVY pero también el aceite de colza redujo significativamente la incidencia de PVY respecto a la parcela control y en el bloque de mayor incidencia de virosis. En el estudio de Varela (2003) sobre aceites en pimiento, con bajos niveles de transmisión, el aceite de colza fue capaz de suprimir la inoculación de Cucumber mosaic virus (CMV) (Martín et al., 2004). El aceite de soja, que otros autores han utilizado con éxito para controlar M. persicae (Sams y Deyton, 2002), en este ensayo no controló la transmisión de PVY y en muchas de las parcelas los niveles de incidencia fueron similares a los del control. En ensayos de transmisión realizados en condiciones controladas en los últimos años, el aceite mineral siempre fue el que tuvo un mejor comportamiento pero también los aceites de colza, soja y pescado disminuyeron la transmisión (Martín et al., 2004 y 2006). En algunos casos se ha visto que la utilización de aceites en el control de virosis produce problemas de fitotoxicidad en algunos cultivos (Hodgkinson et al., 2002), CAPITULO 4 - 115 - incluida la patata de siembra (Gibson y Cayley, 1984) lo que puede dar lugar a bajada de rendimiento en cosecha (Simons y Zitter, 1980). Sin embargo, hay también casos en los que no se ha observado efecto fitotóxico o en los que la fitotoxicidad y disminución de rendimientos dependen de la concentración a la que se apliquen (Ioannou y Iordanou, 1987). En los trabajos previos realizados por nuestro equipo, si las dosis de aceite se mantenía en torno al 1% y se limitaba el número de aplicaciones, no se observaron efectos dañinos sobre grosellero negro o vid (Cabaleiro et al., 2003; Martín et al., 2005). En estudios sobre aceites minerales Johnson y Hodgkinson (2002) comprobaron que su aplicación afectaba a la eficiencia fotosintética pues las hojas tratadas se oscurecen indicando que los espacios intercelulares están empapados de aceite. Algo similar ocurre en vid (Silvarrey, 1999). En los ensayos de 2003 y 2004 no se apreciaron manchas o necrosis marginales que pudieran indicar un efecto fitotóxico de los aceites; tampoco hubo, aparentemente, diferencias en la tonalidad de verde que pudieran indicar un descenso en el contenido en clorofila y así lo confirman los datos de CCI. Tanto una aceleración del agostamiento, como un mal agostamiento, podrían indicar un efecto fitotóxico de los aceites. Los índices de agostamiento que se registraron en la parcela en 2004 no indican que el cultivo sufriera ningún efecto por el uso de aceites. El caso de las parcelas tratadas con aceite de soja que agostaron antes podría ser debido a que son también las que tienen una mayor incidencia de PVY ya que cuando se observa el esquema de la parcela con la escala de color, se aprecia ese mayor agostamiento coincidiendo con las zonas de mayores niveles finales de PVY. El dato definitivo de ausencia de fitotoxicidad en patata fue la no existencia de variaciones en la producción total ni en los calibres comerciales de la cosecha. En otros ensayos en los que se utilizó aceite mineral tampoco se produjeron efectos sobre los rendimientos en patata de siembra siempre que no se utilizaran concentraciones mayores de 1,5% (Bell, 1989). En pimiento, la aplicación del aceite mineral consiguió controlar la transmisión no persistente de PVY y CMV en un 15% y aumentar los rendimientos un 22% por encima del control sin que se observen daños directos sobre el cultivo (Marco, 1993). Sin embargo, en sandía la aplicación de aceite mineral al 0,75% cada 4-5 días fue fitotóxica, hubo menos flores y la mayoría de las sandías cosechadas tuvieron un peso menor que el control; pero al reducir las infecciones tempranas de WMV-2, PRSV-W y ZYMV se redujeron los daños (Webb y Linda, 1993). Utilización de cultivos borde y aceites para el control de la transmisión de PVY __________________________________________________________________________________________________________ - 116 - En los ensayos de 2001 y 2004 apenas hubo infecciones tempranas y sin embargo, en el de 2003, el nivel de virosis detectado en hoja a final del cultivo era ya muy alto, lo que indica que las infecciones se produjeron al inicio del cultivo, época que coincidió con los mayores ataques de Aphis fabae en Vicia faba presente en las cercanías de la parcela experimental. En 2004, las infecciones tempranas de PVY detectadas en hoja, fueron relativamente bajas, tanto en la parcela con maíz, como en la de borde labrado, pero ya significativamente superiores en esta última. Sin embargo, estas plantas infectadas en varias de las subparcelas y en los bordes pudieron ser fuente de inóculo interna para la posterior dispersión del virus. En esas primeras semanas tras la brotación de la patata, el borde de maíz estaba germinando y en todo caso no superaba en altura a la patata por lo que no parece estar implicado el borde como barrera en la prevención de la transmisión y es posible que sea la atracción por el color amarillo del maíz la que haya facilitado la pérdida de infectividad de los pulgones durante la cata. En los bordes de las parcelas sí se detectó un mayor número de plantas positivas por infecciones tempranas (40%), especialmente cerca de la zona labrada de separación entre las dos parcelas en las que posiblemente brotaron patatas “bortas” que quedaron de cultivos anteriores y que actuaron como fuente de inóculo antes de ser eliminadas (Jones et al., 1996). También actuaron claramente como fuente de inóculo las patatas de los ensayos colindantes, situadas al Este y Sur de las parcelas estudio, puesto que se detecta un gradiente significativo de plantas con PVY en esta orientación del ensayo completo. El hecho de que en la orientación N-S se produjera el mayor nivel de virosis podría relacionarse también con la dirección de los vientos, aunque otros autores como Legorburu et al. (1999) en ensayos de patata de siembra no encontraron diferencias entre 4 trampas orientadas a los 4 puntos cardinales situadas a 25 m de cada campo de patata. En este análisis del 27 de julio no se detectó ningún positivo (en planta) en las parcelas tratadas con aceite mineral por lo que este aceite parece haber tenido un buen efecto en la prevención de las infecciones tempranas. Los cultivos borde, que en el ensayo de 2001 no evitaron la transmisión de PVY ni la de PLRV, tuvieron un efecto importante en 2004. Como se mencionó antes, el diseño del ensayo en 2001 quizá no fue el más adecuado y/o el nivel de inóculo fue excesivamente alto. No se encontraron diferencias entre soja y maíz y dado que el maíz es un cultivo habitual en A Limia, se consideró que era una mejor opción. Para Difonzo CAPITULO 4 - 117 - et al. (1996) la elección de especies para el borde no afecta a la incidencia de PVY siempre que no sean huéspedes de este virus. Considerando el ensayo entero, los valores totales de virosis detectados en tubérculo (PVY+PLRV) fueron 11,87% en la parcela con borde de maíz y 35,04% en sin maíz. Estaríamos produciendo, con este borde de maíz, patata de siembra próxima a la certificada B (<10%) en una zona de cultivo de patata de consumo y por lo tanto donde la presión de inóculo es importante. Como se vio en el Capítulo 2, en variedades como Kennebec, Agria y Fina de Carballo, niveles hasta el 15% son aceptables para un reempleo, siempre que no presenten otros daños. El ensayo de 2004, y el de 2003, se plantearon para el control de la transmisión de PVY al ser el virus con mayor presencia y más problemático en el cultivo de patata de siembra y susceptible de ser controlado con aceites por su transmisión no persistente, puesto que los aceites no ejercen control contra la transmisión persistente circulativa de PLRV (Simons y Zitter, 1980; Ioannou y Iordanou, 1987). El insecticida sistémico aplicado a los tubérculos en siembra controló satisfactoriamente el PLRV (2,5% de incidencia en tubérculo) pues aunque las poblaciones de vectores específicos de este virus fueron bajas, cuando en 2001 no se aplicó insecticida los niveles de infección por PLRV fueron altos y similares a los de PVY. Los pequeños focos dispersos de plantas infectadas con ese virus provienen seguramente de infecciones tardías pues el imidacloprid proporciona una protección de unas 10-12 semanas y el herbicida quemante se aplicó justo a las 12 semanas de plantación y a los rebrotes a las 14. El maíz parece haber ejercido tanto de barrera contra los pulgones como de trampa en la que los pulgones redujeron su carga viral al realizar pruebas de reconocimiento de la planta (Avilla et al, 1996). Los cultivos borde aparecen como un método efectivo y práctico para reducir la incidencia de PVY en generaciones tempranas de patata de siembra. Difonzo et al. (1996) probaron los bordes de soja, sorgo, trigo y patata en el control de PVY, reduciendo la infección en todos los casos (media de 2,7% vs. 6,8% en el testigo). En 2004 la utilización del cultivo borde además de reducir la incidencia de PVY en la parcela con borde de maíz, hace que ésta se reparta de forma más uniforme sin que haya gradientes significativos hacia ninguna zona de la parcela, probablemente por crear un ambiente más cerrado, sin corrientes. Utilización de cultivos borde y aceites para el control de la transmisión de PVY __________________________________________________________________________________________________________ - 118 - En la parcela con borde de maíz el ambiente más protegido retrasó ligeramente el agostamiento al presentar las plantas una vegetación más desarrollada que en la parcela con el borde labrado. En un cultivo de patata de siembra esos retrasos en la finalización del ciclo no interesan pues en algunos casos puede ser necesario adelantar la eliminación de matas cuando se detecta un incremento de las poblaciones de pulgones y sería conveniente que la madurez de los tubérculos se hubiera alcanzado en ese momento. En todo caso el retraso no fue significativo y no hubo repercusiones en la cosecha, más bien todo lo contrario pues las producciones fueron ligeramente superiores a las de la parcela sin cultivo barrera. Ya en campo se había observado un mayor vigor en las plantas al parecer relacionado con el microclima favorable que se creó en la parcela rodeada por el maíz que llegó a alcanzar más de 2 m de alto. Ese mayor vigor y retraso en el ciclo podría haberse traducido en una menor producción o menores calibres puesto que todas las matas se eliminaron el mismo día, pero no fue así. La mayor producción puede deberse también, y los datos en la Figura 4.9 lo avalan, a la diferencia en el nivel de incidencia final de PVY, inferior en la parcela con borde de maíz. En ensayos realizados por Avilla et al. (1996) los cultivos barrera de maíz y girasol utilizados en pimiento, hicieron que disminuyera la producción por competencia y tuvieron que ser eliminados, pero se registró un 9% menos de infección global en la parcela con borde de maíz frente al control (suelo desnudo). Posteriormente, estos mismos autores, al aumentar la separación entre borde y cultivo a 2,5 metros en el ensayo con maíz y sorgo consiguieron evitar esa competencia y mejoraron las producciones, consecuencia también de un retraso de la infección de PVY y CMV. El estudio de la distribución espacial de plantas con PVY en el ensayo de 2004 indica que la incidencia está relacionada con la posición de las parcelas de los tratamientos dentro de los bloques, de forma que los más cercanos a las esquinas reflejaron mayor porcentaje de virosis al ofrecer mayor superficie de “borde” al exterior y hay un claro gradiente, en la parcela sin borde de maíz, tanto hacia la zona próxima a otros ensayos de patata como hacia el terreno entre ambas parcelas en el que pudo haber patatas “bortas” y malas hierbas en algún momento que hicieran de fuente de inóculo y/o vectores. En general la incidencia de virosis está negativamente relacionada con la distancia a áreas sin cultivar o sin labrar (Maixner, 1993). El estudio de la distribución espacial de los dos virus analizados y de la infección mixta nos confirmó que en todos los casos existieron agregaciones, lo común CAPITULO 4 - 119 - en una transmisión vectorial (Maixner, 1993; Cabaleiro y Segura, 1997). Hay claras diferencias entre la dispersión de PVY y PLRV, por la incidencia diferente pero también por el tamaño de focos. En el caso de PLRV, con incidencia muy baja, los focos, de 2-3 plantas, fueron muy claros. Las plantas individuales con PLRV obedecen probablemente a la llegada de pulgones infectivos que llegaron a alimentarse en la planta pero murieron (por el insecticida sistémico) antes de hacer colonias que permitieran la dispersión a plantas vecinas. En el caso de PVY se distinguen focos desde tamaños muy pequeños pero el mayor grado de agregación se dió en focos grandes y cuando se hace el estudio para tamaño de foco igual a tamaño de bloque o de subparcela, se encontraron agrupaciones significativas que indican las diferencias entre tratamientos. El estudio de la distribución espacial de plantas con virus es una herramienta válida para conocer los modos de transmisión, la existencia o no de vectores, la fuentes de inóculo internas y externas, los huéspedes alternativos y el efecto de las medidas de control (Maixner, 1993; Madden et al., 2007). El estudio de los gradientes nos permite ver claramente el efecto del borde de maíz que “independiza” de alguna manera al cultivo de patata de las condiciones de su entorno. Un análisis antes de cosecha de un buen número de plantas permite detectar al menos las infecciones tempranas y descartar lotes para siembra sin realizar los análisis en tubérculo que, aunque por DIP-ELISA son rápidos y económicos, implican forzar la brotación o esperar a que se produzca para poder hacer un análisis. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Asjes, C.J. y Blom-Barnhoorn, G.J. 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