Interacciones en monocapas de colesterol con ácidos grasos saturados e insaturados (omega-3, omega-6 y omega-9)

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Facultad de Farmacia Departamento de Química-Física INTERACCIONES EN MONOCAPAS DE COLESTEROL CON ÁCIDOS GRASOS SATURADOS E INSATURADOS (OMEGA-3, OMEGA-6 Y OMEGA-9) JOSÉ LUIS FIDALGO RODRÍGUEZ Santiago de Compostela, 2015 Departamento de Química-Física Facultad de Farmacia LOS DOCTORES JOSÉ MIÑONES CONDE Y OLGA CONDE MOUZO, PROFESORES TITULARES DEL DEPARTAMENTO DE QUÍMICA-FÍSICA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA CERTIFICAN Que el trabajo descrito en la presente memoria, con el título “INTERACCIONES EN MONOCAPAS DE COLESTEROL CON ÁCIDOS GRASOS SATURADOS E INSATURADOS (OMEGA-3, OMEGA-6 Y OMEGA-9)”; que presenta el Licenciado en Farmacia José Luis Fidalgo Rodríguez para optar al grado de doctor en Ciencia y Tecnología Química, ha sido realizado bajo su dirección y tutoría en el Departamento de Química-Física de la Universidad de Santiago de Compostela. Y para que así conste, firman la presente en Santiago de Compostela, a 12 de Noviembre de 2015. Director: José Miñones Conde Tutora: Olga Conde Mouzo A mis padres “There is no expedient to which a man will not resort to avoid the real labor of thinking” Joshua Reynolds ÍNDICE I Índice 1 INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 1 1.1 GRASAS ............................................................................................................. 3 1.2 ÁCIDOS GRASOS................................................................................................ 7 1.2.1 Nomenclatura ............................................................................................. 8 1.2.2 Ácidos grasos omega-3 (n-3): Tipos y Fuentes ......................................... 13 1.2.3 Ácidos grasos omega-6 (n-6): Tipos y Fuentes ......................................... 15 1.2.4 Ácidos grasos omega-9 (n-9): Tipos y fuentes .......................................... 17 1.2.5 Biosíntesis de PUFAs a partir de ácidos grasos esenciales ω-3 y ω-6 ...... 19 1.2.5.1 PUFAs de la serie omega-3 ................................................................ 19 1.2.5.2 PUFAs de la serie omega-6 ................................................................ 19 1.2.6 Biosíntesis de Eicosanoides ...................................................................... 23 1.2.6.1 Eicosanoides de la serie 2 ................................................................. 23 1.2.6.2 Eicosanoides de la serie 3 ................................................................. 25 1.2.6.3 Eicosanoides de la serie 1 ................................................................. 27 1.2.7 Inflamación: Eicosanoides como mediadores químicos .......................... 29 1.3 COLESTEROL.................................................................................................... 33 1.3.1 Generalidades ........................................................................................... 33 1.3.2 Metabolismo ............................................................................................. 35 1.3.2.1 Biosíntesis del colesterol ................................................................... 35 1.3.2.2 Rutas metabólicas ............................................................................. 38 1.3.3 Aterosclerosis ........................................................................................... 43 1.4 MONOCAPAS DE LANGMUIR .......................................................................... 47 1.4.1 Técnica de monocapas ............................................................................. 49 1.4.2 Presión superficial .................................................................................... 52 1.4.3 Estabilidad de las monocapas................................................................... 53 1.4.4 Estados físicos de las monocapas ............................................................. 55 1.4.4.1 Monocapas en estado gaseoso ......................................................... 57 1.4.4.2 Monocapas expandidas ..................................................................... 59 1.4.4.3 Monocapas condensadas .................................................................. 62 1.4.4.4 Transición entre los estados de las monocapas ................................ 65 1.4.4.4.1 Transición de monocapas gaseosas .............................................. 67 1.4.4.4.2 Transición de líquido expandido a líquido condensado ............... 68 1.4.4.5 Relación del estado físico y el área molecular .................................. 71 1 INTRODCUCCIÓN 3 1.1 GRASAS En el año 1823, Michel Eugène Chevreul, tras años de investigaciones con sustancias lipídicas, determinó que la grasa que consumimos se podía dividir en dos tipos básicos: sólida, a la que denominó stearine, y líquida, la cual bautizó como elaine (en francés). Años después, estas dos sustancias acuñarían el nombre de ácido esteárico y ácido oleico, respectivamente. Según Chevreul, las diferencias observadas en las propiedades de las grasas examinadas eran debidas a las diferentes proporciones de estas dos sustancias. En sus memorias, también acuñó el nombre de cholesterine para la sustancia cristalina que purificó a partir de cálculos biliares (Chevreul, 1823). Desde entonces, la comunidad científica avanzó extraordinariamente en el estudio y conocimiento de las grasas, término genérico que hoy en día se utiliza para designar a varias clases de lípidos, concretamente acilglicéridos, ésteres en los que uno, dos o tres ácidos grasos se unen a una molécula de glicerina formando monoglicéridos, diglicéridos o triglicéridos, respectivamente. En nuestro organismo el consumo de grasas es importante, no solo porque constituyen la principal reserva de energía del cuerpo humano, sino también por otros motivos: ●Intervienen en la formación de productos esenciales como son los fosfolípidos, el colesterol, las hormonas, prostaciclinas, tromboxanos, leucotrienos y neurotransmisores. ●Aportan los ácidos grasos esenciales, no sintetizables por el propio organismo, pero imprescindibles en cuestiones tan decisivas como la formación de la membrana celular, el buen funcionamiento del cerebro o la acción hormonal, entre otras. ●Son necesarias para la circulación sanguínea, la absorción digestiva y el transporte de las vitaminas liposolubles. Estas vitaminas son fundamentales para diversas funciones esenciales del organismo. ●Contribuyen, con las ingestas adecuadas, al equilibrio y la variedad necesarias (se recomienda que el 30-35 % de las kilocalorías ingeridas provengan de lípidos). ●Constituyen una protección mecánica para diversos órganos vitales (riñones, corazón…). 1 INTRODCUCCIÓN 4 ●Desde el punto de vista dietético, mejoran la textura de los alimentos, aumentando aspectos organolépticos como el sabor, el aroma, el gusto, la suavidad… haciéndolos más agradables y placenteros. Por lo general, los ácidos grasos constituyentes de las grasas poseen una estructura lineal, no ramificada, con un número par de átomos de carbono, predominando los saturados en las grasas de origen animal y los insaturados en las de origen vegetal. En el primer caso se trata de grasas formadas por triglicéridos (Figura 1.1.A) sólidos a temperatura ambiente. Entre las grasas saturadas se encuentran el sebo, tocino, panceta, baicon, y diversas mantecas (cacao, cacahuete, etc). Figura 1.1.A.- Triglicérido de una grasa saturada Las grasas de este tipo formadas por ácidos grasos de cadena larga (más de 10 átomos de carbono), como son los ácidos láurico, mirístico y palmítico, se consideran que elevan los niveles plasmáticos del colesterol asociado a las lipoproteínas de baja densidad LDL (conocido popularmente como “colesterol malo”). Un segundo tipo de grasas son las constituidas en su mayor parte por ácidos grasos insaturados. Estas grasas insaturadas son líquidas a temperatura ambiente y comúnmente se les conoce como aceites (aceite de oliva, de girasol, de soja…). Son beneficiosas para el cuerpo humano por sus efectos sobre los lípidos plasmáticos (Sacks & Katan, 2002) (Wardlaw & Snook, 1990) y algunas contienen ácidos grasos esenciales, 1 INTRODCUCCIÓN 5 que el organismo no puede fabricar, siendo la ingesta directa el único modo de conseguirlos. A su vez, las grasas insaturadas pueden subdividirse en dos grupos: Grasas monoinsaturadas Contienen ácidos grasos con un solo doble enlace, como el ácido oleico o el erúcico (ácido docosanoico). Reducen los niveles plasmáticos de colesterol asociado a las lipoproteínas LDL (Williams, y otros, 1999) y elevan los de las lipoproteínas HDL (llamadas comúnmente “colesterol bueno"), por lo que facilitan la eliminación de la acumulación de placas en las paredes arteriales, que pueden ser la causa de un ataque cardíaco o accidente vascular. Además de las aceitunas, se encuentran en el aguacate y en algunos frutos secos. Grasas poliinsaturadas Formadas por ácidos grasos de las familias omega-3 y omega-6, denominados así por la posición que ocupa el primer doble enlace de la molécula, contado a partir del grupo metilo de su cadena hidrocarbonada. Cada una de estas familias presenta un precursor a partir del cual se sintetizan los demás ácidos grasos que forman parte de las mismas: el ácido alfa-linolénico (ALA) es el precursor de los omega-3 y el linoleico (LA) de los omega-6. Ambos son ácidos grasos esenciales, necesarios para un correcto funcionamiento fisiológico del organismo, pero que no pueden ser sintetizados por el cuerpo humano. Su ausencia en el organismo está relacionada con numerosas enfermedades: cáncer, hipertrofia prostática, ateroesclerosis, disminución del cociente intelectual, obesidad, diabetes, reuma, problemas circulatorios, etc. La mayoría de las grasas insaturadas son de origen vegetal. Grasas trans. Por regla general, los dobles enlaces de los ácidos grasos insaturados que se encuentran en los aceites vegetales poseen configuración cis, pero si estos aceites sufren un proceso industrial de hidrogenación parcial para transformarlos en grasas semisólidas o sólidas, los dobles enlaces de los ácidos grasos insaturados que perduran tras el proceso de hidrogenación presentan conformación trans. Es por ello por lo que se llaman grasas trans, cuya configuración es parecida a la de las grasas animales 1 INTRODCUCCIÓN 6 (saturadas) (Figura 1.1.B). La industria alimentaria las utiliza para aumentar el tiempo de caducidad y mejorar el sabor y la textura de los productos en los que intervienen: la comida rápida, los alimentos fritos, palomitas de maíz, margarina, bollería, pasteles, galletas… Figura 1.1.B.- Configuración estructural de ácidos grasos saturados e insaturados. Estas grasas son muy perjudiciales para la salud, ya que son altamente aterogénicas (el organismo no las distingue de las saturadas), contribuyendo a elevar los niveles de lipoproteínas LDL y de los triglicéridos y disminuyendo peligrosamente los niveles de HDL. Por esta razón, la Agencia Alimentaria de Estados Unidos (FDA) anunció recientemente que se iría limitando progresivamente el uso de estas grasas en los alimentos comercializados en Estados Unidos. La razón esgrimida para ello es que éstas se consideran, según los términos utilizados por ese organismo, "un peligro para la salud pública". Por otra parte, en ese mismo comunicado la FDA publicó que entre 2003 y 2012 el uso de grasas trans se redujo un 78% en Estados Unidos. Hasta el momento en Europa solo en algunos países como Austria, Dinamarca, Islandia y Suiza disponen de una normativa que establece que las grasas trans no pueden superar el 2% en los productos alimentarios. En el resto de Europa, solo está limitada la cantidad de ácidos grasos trans en leches para lactantes, en cuyo caso la directiva prohíbe que se supere el 3% de contenido graso total. En los demás casos, no es obligatorio especificar en la etiqueta la cantidad de grasas trans que contiene un producto; únicamente se informa al consumidor de que contienen grasas hidrogenadas o parcialmente hidrogenadas. 1 INTRODCUCCIÓN 7 1.2 ÁCIDOS GRASOS Los ácidos grasos se encuentran formando parte de los fosfolípidos, glucolípidos y esfingolípidos de la bicapa de las membranas celulares, confiriéndoles propiedades diferentes de acuerdo con el ácido graso predominante, repercutiendo todo ello en el contenido de los lípidos plasmáticos (HDL, LDL), en la síntesis de prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos, en la acción del endotelio, las enfermedades inflamatorias, las autoinmunes, e incluso en el cáncer. Por otra parte, en los últimos años se han realizado progresos en lo referente al papel de algunos ácidos grasos, o de sus derivados metabólicos, como moduladores de la expresión de genes (Jump, 1999). Al actuar como ligandos de receptores nucleares desencadenan una gran variedad de respuestas celulares: inducen la diferenciación de adipocitos, modifican la resistencia a la insulina, regulan la presión vascular, inducen la apoptósis de células tumorales, modifican el metabolismo de los carbohidratos, etc. Esta nueva función de los ácidos grasos los identifica como importantes reguladores de los genes, con lo cual actualmente se les relaciona con algo más que con la mera producción de energía (Sanhueza & Valenzuela, 2006). Constan de una cadena alquílica con un grupo carboxilo (–COOH) terminal. La coexistencia de ambos componentes convierte a los ácidos grasos en moléculas anfipáticas, con una región hidrófoba (la cadena hidrocarbonada) y otra polar, hidrófila (el extremo carboxilo), que interactúa con el agua. Cuanto más largas sean las cadenas hidrocarbonadas y menos dobles enlaces tengan, mayor es la posibilidad de formación de enlaces de Van der Waals y, en consecuencia, menor es su solubilidad en agua. Por otra parte, esta solubilidad también depende de que el grupo carboxilo se encuentre ionizado o no. Puesto que el valor del pK está comprendido entre 4 y 5, en medios neutros o alcalinos se encuentran ionizados y son más solubles en agua. Cuando se extienden en la interfase aire/agua forman una monocapa (si la cantidad depositada es suficientemente pequeña) en la que las colas hidrocarbonadas se encuentran orientadas hacia el aire, y la cabeza polar se ancla en el agua, estableciéndose puentes de hidrógeno entre el grupo carboxilo y el agua. 1 INTRODCUCCIÓN 8 Por lo general las cadenas hidrocarbonadas poseen un número par de átomos de carbono. La razón de esto es que en el metabolismo, las cadenas de ácido graso se sintetizan y se degradan mediante la adición o eliminación de dos átomos de carbono. No obstante, hay excepciones, ya que se encuentran ácidos grasos de número impar de átomos de carbono en la leche y grasa de los rumiantes, procedentes del metabolismo bacteriano del rumen, y también en algunos lípidos de vegetales, que no son utilizados comúnmente para la obtención de aceites. Los ácidos grasos constituyentes de los mamíferos tienen estructuras relativamente sencillas, presentando una cadena lineal, pero los de otros organismos pueden ser muy complejos; por ejemplo, con un anillo de ciclopropano (ácido lactobacílico) o de ciclopenteno (ácido chaulmógrico), con un triple y un doble enlace (ácido nemotínico, ácido 6,9 octadeceninoico), o con ramificaciones en la cadena: ácido tuberculoesteárico (10-metil esteárico), cerebrónico (2-hidroxi C24:0) o ricinoleico (12hidroxi C18:1) (Devlin, 2004). 1.2.1 Nomenclatura Hay tres formas de denominar los ácidos grasos: 1. Común, impuesta por la tradición. 2. Sistemática, según las reglas de la IUPAC. 3. Abreviadas o numéricas:  sistema “delta” (Δ)  sistema “omega” (ω)  sistema “n” 1. Nombre común Se utilizan nombres no químicos, sino los relacionados con su origen, es decir, con las fuentes de donde fueron aislados por primera vez. Algunos ejemplos son los siguientes: 1 INTRODCUCCIÓN 9 Nombre común Origen Ácido palmítico en el aceite de palma Ácido esteárico del griego stéar: grasa, sebo Ácido oleico en el aceite de oliva Ácido linoleico en el lino Ácido α-linolénico en el lino Tabla 1.2.A.- Ejemplos de nombres comunes de ácidos grasos. 1 INTRODCUCCIÓN 10 Otros nombres comunes son: araquídico y araquidónico (cacahuete), butírico (del latín butyrum, manteca, por su olor a manteca rancia), cáprico, caprílico, caproico (olor a cabras), láurico (laurel), málico (de malum, manzana), cítrico (de citrus, limón, naranja), (margárico (margarina), mirístico (del latin mirystica fragans, nuez moscada), pelargónico (aceite de pelargonium), valérico (valeriana). 2. Nomenclatura sistemática o química (IUPAC) Los nombres describen las estructuras en detalle en función de las reglas de nomenclatura de la química orgánica definidas por la IUPAC. Al carbono carboxílico le corresponde el número 1 y las demás posiciones se definen en referencia a éste. Ejemplos: En la Tabla 1.2.B se indica la nomenclatura sistemática correspondiente a los mismos ácidos que se utilizaron en la denominación común, comparando ambas. Nombre común Nombre sistemático Descripción Ácido palmítico Acido hexadecanoico 16 átomos de C, saturado Ácido esteárico Ácido octadecanoico 18 átomos de C, saturado Ácido oleico Ácido cis-9octadecenoico 18 átomos de C, con un doble enlace entre los carbonos 9 y 10 Ácido linoleico Ácido cis,cis-9,12octadecadienoico 18 átomos de C, con un doble enlace entre los carbonos 9 y 10 y otro entre los carbonos 12 y 13 Ácido αlinolénico Ácido cis,cis,cis-9,12,15octadecatrienoico 18 átomos de C, con tres dobles enlaces: entre los carbonos 9 y 10, entre 12 y 13, entre 15 y 16 Tabla 1.2.B.- Comparación entre la nomenclatura común y la sistemática de los ácidos grasos. 3. Nomenclaturas abreviadas o numéricas Las nomenclaturas abreviadas o numéricas son las más utilizadas; se asume que los dobles enlaces están en configuración cis (la más habitual en los ácidos grasos naturales) y que están separados por un grupo metileno, a menos que se indique lo contrario. 1 INTRODCUCCIÓN 11 En el sistema “delta” (Δ), el primer número en la nomenclatura indica la longitud de la cadena (número de átomos de carbono). Seguidamente, detrás de dos puntos, se señala el número de dobles enlaces. A continuación la letra griega Δ seguida de uno o más números indica la posición de los dobles enlaces, contada desde el grupo carboxilo, al que se le asigna el número 1. Así, el ácido palmítico se designa como 16: 0, en donde 16 es el número de átomos de carbono y 0 el número de dobles enlaces (saturado), mientras que el ácido oleico es 18:1 Δ9 (18 átomos de carbono con un doble enlace situado entre el C 9 y el C 10, contado desde el grupo carboxilo). Del mismo modo, el ácido α-linolénico, con 18 átomos de carbono y tres dobles enlaces, se denomina 18:3 Δ9,12,15. Algunos autores prescinden de la letra Δ sustituyéndola por un paréntesis con la posición de los dobles enlaces. Para el ácido α-linolénico la nomenclatura es: 18:3 (9,12,15). El sistema omega (ω) es bastante popular hoy en día (Holman, 1964) para nombrar a los ácidos grasos insaturados y será el que utilizaremos más frecuentemente. Toma como referencia el extremo metilo (CH3 -) de la molécula (carbono ω, minúscula; Ω mayúscula) e indica la posición del primer doble enlace contando desde el carbono ω, es decir, el carbono más alejado del carboxilo, al que se asigna la última letra del alfabeto griego ya que, tradicionalmente, al carbono contiguo al grupo carboxilo se le ha denominado alfa. De ahí derivan las denominaciones de ácidos ω-3, ω-6 y ω-9. Un ácido graso ω-3 será el que tenga su primer doble enlace entre los carbonos 3 y 4, y un ácido graso ω-6 tendrá el primer doble enlace entre los carbonos 6 y 7, siempre a contar desde el extremo CH3–. La nomenclatura omega es muy útil cuando se consideran los ácidos grasos desde el punto de vista biológico, porque define familias de ácidos grasos (ω-3, ω-6, ω9), las cuales agrupan a los que están sujetos a unos mismos procesos bioquímicos, en los que la estructura terminal del ácido graso no se ve alterada debido a que en los seres vivos las modificaciones metabólicas de los ácidos grasos se producen a partir del extremo carboxilo; así, numerando desde el metilo se mantiene la relación entre los ácidos grasos que pertenecen a una misma serie metabólica. En la designación del número total de átomos de carbono y de enlaces insaturados se sigue el mismo 1 INTRODCUCCIÓN 18 El ácido gadoleico se encuentra en la mostaza blanca, los piñones, los pistachos mostaza, las semillas de amapola, el jengibre, el centeno y, junto con el ácido oleico, en el aceite de cachuete. El ácido erúcico se encuentra en las semillas de plantas crucíferas, como la mostaza, la colza, el aceite de mostaza y de canola. En la Tabla 1.2.G se presentan los alimentos ordenados de mayor a menor contenido en ácidos omega-9. Figura además el contenido en ácidos omega-6 y omega3. Alimento por 100 g Ácido oleico Omega-9 (g.) Ácido linoleico Omega-6 (g.) Ácido linolénico Omega-3 (g.) Aceite de oliva 70 9,1 0,85 Avellanas 45,8 8,5 0,11 Aceite de cacahuete 44,8 32 0 Aceite de palma 37,1 10,1 0,3 Pistachos 34,8 7,9 0 Almendras 32,6 12,6 0,26 Margarina de maíz 32,6 31,3 0,65 Aceite de maíz 29,4 50,4 0,9 Anacardos 24,4 7,2 0,15 Cacahuetes 21,6 12,8 0,35 Aceite de soja 20,8 51,5 7,3 Aceite de girasol 20,2 63,2 0,1 Aceite de hígado de bacalao 18,3 2,6 1,1 Aguacate 15,1 0,7 1,17 Nueces 10,8 34 8 Pipas de girasol 10,7 37,4 0,08 Aceite de coco 5,8 1,8 0 Queso de bola 5,3 0,44 0,25 Queso de Burgos 3,6 0,43 0,46 Atún en aceite vegetal 3,6 5,3 0,13 Coco rallado seco 3,5 1,5 0 Carne de ternera 2,1 0,35 0 Tabla 1.2.G.- Alimentos ricos en ácidos grasos omega 9, omega-6 y omega-3. 1 INTRODCUCCIÓN 19 1.2.5 Biosíntesis de PUFAs a partir de ácidos grasos esenciales ω-3 y ω-6 Los ácidos grasos esenciales omega-3 (α-LA) y omega-6 (LA) comparten un metabolismo oxidativo similar así como el mismo grupo de enzimas implicados en el mismo. Estos ácidos se absorben en el intestino y por medio de la sangre son llevados hasta el hígado donde se metabolizan a través de una serie de reacciones alternas de elongación (alargamiento de la cadena hidrocarbonada) y de desaturación (insaturación de la cadena) mediante la acción de las correspondientes enzimas (elongasas y desaturasas), dando lugar a la formación de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga de hasta 24 átomos de carbono y hasta 6 enlaces dobles (llamados PUFAs, poly unsatured fatty acids). Estas rutas necesitan las enzimas desaturasa Δ-6D y Δ-5D, una elongasa del sistema microsómico y la beta-oxidación en los peroxisomas (Moore, Hurt, Yoder, Sprecher, & Spector, 1995) (Sprecher, 2002) (D’Andrea, y otros, 2002). 1.2.5.1 PUFAs de la serie omega-3 En lo que se refiere a la serie ω-3, el ácido graso esencial α-LA (18:3 n-3), precursor de la serie, se convierte primero en ácido estearidónico (SDA; 18:4 n-3), con un doble enlace más que el ácido inicial, mediante la acción de la Δ-6D desaturasa, para dar lugar posteriormente, tras una elongación y una desaturación Δ-5D al ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5 n-3) tal como recoge la Figura 1.2.A. De este modo, a través de este mecanismo se ha pasado del ácido graso precursor, con 18 átomos de carbono y tres dobles enlaces, a otro de 20 átomos de carbono y 5 dobles enlaces. 1.2.5.2 PUFAs de la serie omega-6 Cuando se trata de los ácidos grasos omega-6, el proceso es similar. Partiendo del LA (18:2 n-6), puede convertirse en el ácido eicosadienoico (EA; 20:2 n-6) por acción de la elongasa correspondiente o dar lugar al ácido γ-linolénico (γ-LA; 18:3 n-6) mediante la actuación de la Δ-6D desaturasa. Ambos ácidos grasos resultantes darán lugar al ácido dihomo-γ-linolénico (Dγ-LA; 20:3 n-6) por mediación de los enzimas Δ-6D o elongasa, respectivamente. A su vez, a partir del Dγ-LA se sintetiza el ácido araquidónico (AA; 20:4 n-6) con la ayuda de la Δ-5D desaturasa. 1 INTRODCUCCIÓN 20 Figura 1.2.A.- Metabolismo ácidos grasos omega 3 y 6 A partir del EPA y del AA, sucesivas elongaciones y desaturaciones en cada una de las series dan lugar a la síntesis de un ácido graso de 24 átomos de carbono con 6 dobles enlaces en el caso de los omega-3 (24:6 n-3), y con 5 dobles enlaces en los omega6 (24:5 n-6). El destino de estos ácidos grasos poliinsaturados es el de sufrir una 1 INTRODCUCCIÓN 21 retroconversión a sus homólogos de 22 átomos de carbono mediante un proceso de oxidación, denominado β-oxidación, debido a que la supresión de los dos átomos de carbono tiene lugar en los carbonos beta de la cadena hidrocarbonada. De este modo se sintetizan los ácidos docosahexaenoico (DHA; 22:6 n-3) en la serie de los omega-3 y el ácido docosapetanoico (DPA; 22:5 n-6) en la serie de los omega-6. Estos procesos se llevan a cabo en las peroxisomas, órganulos del citoplasma que contienen oxidasas y catalasas, que son enzimas que intervienen en el acortamiento de los ácidos grasos de cadena muy larga para su completa oxidación en las mitocondrias, donde sufrirán un proceso catabólico consistente en la eliminación de 2 átomos de carbono en cada ciclo de oxidación hasta quedar reducido el ácido graso a una molécula de acetil-CoA que, a su vez, será oxidada para la obtención directa de energía química (ATP). Existen todavía algunas cuestiones sin resolver relacionadas con la complejidad inherente a los procesos que conllevan a que los precursores de los ácidos grasos omega-3 y omega-6 se conviertan en ácidos PUFAs. Se sabe que en los humanos estos procesos ocurren de forma lenta, pero la ratio de conversión todavía no se conoce de forma exacta. Por ejemplo, no está claro qué cantidad de α-LA se convierte en EPA y DHA, aunque en el caso particular del DHA se sabe que su ratio de síntesis es bajo. Debido a esto, junto con la baja proporción de ácidos grasos omega-3 en las dietas occidentales, y a la importancia de los PUFAs en muchos procesos fisiológicos, se considera necesario aumentar el nivel de los ácidos omega-3 en la dieta, a base de incremetar el consumo de alimentos ricos en estos compuestos, presentes fundamentalmente, tal como se ha comentado, en pescados como el salmón, sardinas, caballas, arenques, etc. Fue precisamente la alta ingesta de este tipo de pescados en las poblaciones de Groenlandia, norte de Canadá y Alaska, relacionada con su reducida tasa de mortalidad cardiovascular a pesar de su alto consumo de grasa, superior al 30% de los requerimientos energéticos, lo que hizo sospechar que los ácidos grasos ω-3, particularmente los de cadena larga, podrían tener propiedades protectoras cardiovasculares (Bang, Dyerberg, & Sinclair, 1980) (Petrova, Dimitrov, Willett, & Campos, 2011). Estos resultados fueron confirmados en estudios realizados posteriormente en poblaciones con una alimentación similar, las cuales evidenciaron, 1 INTRODCUCCIÓN 22 además de una baja incidencia de enfermedades cardiovasculares, una menor manifestación de enfermedades inflamatorias (Egert & Stehle, 2011). Datos similares obtenidos en la población japonesa que, como es bien sabido, tiene una dieta rica en pescados de mar que contienen cantidades elevadas de EPA y DHA, demuestran también una menor incidencia de enfermedades isquémicas cardiacas y ateroesclerosisn (Kinjo, y otros, 1999). Del mismo modo, estudios epidemiológicos han acumulado datos que demuestran que el consumo de ácidos grasos ω-3 de cadena larga reduce el riesgo de muerte cardiovascular (Albert, y otros, 1998). Las dos rutas metabólicas de los ácidos grasos omega-3 y omega-6 que se acaban de describir son independientes entre sí y no se produce reacción cruzada alguna. No obstante, ambas rutas omparten los mismos enzimas, dando lugar a una competencia de los ácidos grasos por ellos. El ácido graso que predomine en la dieta determinará qué tipo de PUFA será el mayoritario en los niveles celulares y plasmáticos. Dado que en las dietas occidentales existe un notable predominio de consumo de alimentos con elevado contenido en ácido linoleico LA (de la serie omega-6), con respecto a los que contienen ácido linolénico (α-LA), de la serie omega-3, los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga mayoritarios corresponden a los de la serie omega-6, es decir, existe un predominio de ácido araquidónico (AA) frente a los PUFAs de la serie omega-3, los cuales, como veremos, están implicados en la formación de eicosanoides, compuestos con importantes propiedades antiinflamatorias, entre otras. En los últimos años el consumo de omega-6 ha aumentado y disminuido el de omega-3 en paralelo con el aumento de enfermedades cardíacas. Por esta razón, se intenta buscar una proporción “ideal” de ácidos grasos omega-6 y omega-3 en la dieta (Simopoulos A. , 2008), habiéndose establecido en una relación 2:1 o 4:1. En una típica dieta norteamericana la proporción de ácidos grasos omega-6 puede llegar a ser de 11 a 30 veces mayor que la de omega-3, explicando el aumento en la tasa de trastornos inflamatorios, enfermedades coronarias, artritis y depresión (Hibbeln, 2006). 1 INTRODCUCCIÓN 23 1.2.6 Biosíntesis de Eicosanoides Los eicosanoides son un grupo de moléculas de carácter lipídico originadas por la oxigenación de los ácidos grasos omega-3 y omega-6 (Figura 1.2.B). Cumplen amplias funciones como mediadores de la inflamación y de la respuesta inmune en vertebrados e invertebrados. Los precursores de los mismos son el AA, el EPA y el Dγ-LA, es decir, ácidos grasos poli-insaturados de 20 átomos de carbono (de ahí su nombre genérico). Los nombres específicos de estos eicosanoides (prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos) derivan del hecho de que son sintetizadas en la próstata, en las plaquetas (trombocitos) y en los leucocitos, respectivamente. Figura 1.2.B.- Biosíntesis Eicosanoides 1.2.6.1 Eicosanoides de la serie 2 Los eicosanoides más abundantes son los correspondientes a la serie 2, procedentes del ácido araquidónico, que es normalmente el ácido graso poliinsaturado más abundante en la dieta. 1 INTRODCUCCIÓN 24 Durante las primeras etapas de un proceso inflamatorio, el AA es liberado desde los fosfolípidos de las membranas celulares por activación de la enzima fosfolipasa A2 (FLA2). Posteriormente, un grupo de enzimas conocidas como ciclooxigenasas (COX-1 y COX-2) y lipooxigenasas (LOX) metabolizan al AA generando eicosanoides bioactivos, entre los que se encuentran las prostaglandinas y tromboxanos de la serie 2 (por contener 2 dobles enlaces) y leucotrienos de la serie 4 (Calder, Yaqoob, Thies, Wallace, & Miles, 2002). Para ello, el AA tiene dos vías distintas de acción: la primera (vía cíclica) (Figura 1.2.C) involucra a las COX (1-2), las cuales convierten el AA en prostaglandina PGH2 (Holinstat, y otros, 2011), la cual, posee una vida muy corta metabolizándose, por una parte para originar el tromboxano A2 (TXA2) y, por otra, en prostaglandinas PGI2 (prostaciclina), PGE2, PGD2 y PGF2. De éstas, la prostaglandina E2 es un potente mediador de la inflamación, del dolor, de la fiebre y del aumento de la permeabilidad vascular (Sampath & Ntambi, Polyunsaturated fatty acid regulation of genes of lipid metabolism, 2005). Es también un mediador importante de la vasodilatación. Por el contrario, el tromboxano A2 es vasoconstrictor. Figura 1.2.C.- Vía cíclica de formación de eicosanoides a paratir del AA. 1 INTRODCUCCIÓN 25 La segunda vía del AA (vía lineal) (Figura 1.2.D) involucra a la enzima 5lipoxigenasa que da lugar a la formación del leucotrieno LTA4, el cual se convierte, por una parte, en leucotrieno B4 (LTB4) gracias a la intervención de la enzima LTA4 hidrolasa, y por otra, en LTC4 (por acción de la enzima LTC4 sintasa) que a su vez origina posteriormente los leucotrienos D4, E4 y F4. Todos ellos son potentes agentes proinflamatorios que aumentan la permeabilidad vascular, la actividad de las células inmunes, y estimulan la liberación de citoquinas inflamatorias (Xi, Cohen, Barve, & Chen, 2001). Figura 1.2.D.- Vía lineal de formación de leucotrienos a partir deAA. En definitiva, los productos del metabolismo del AA (PGE2, TXA2 y LTB4) tienen propiedades pro-inflamatorias, por lo que todos los fármacos que reducen la producción de estos compuestos son beneficiosos para reducir la inflamación y la correspondiente patología vascular. Una clase de medicamentos ampliamente utilizados, los antiinflamatorios no esteroides, tales como iboprufeno, naproxeno, indometacina, etc., actúan sobre las enzimas ciclooxigenasas, inhibiendo su acción y, en consecuencia, la producción de eicosanoides derivados del AA. 1.2.6.2 Eicosanoides de la serie 3 En los humanos y en animales, las dietas ricas en EPA aumentan la proporción de estos ácidos grasos omega-3 en la bicapa de las membranas celulares, particularmente en los linfocitos, lo cual, además de reducir el contenido de AA en la bicapa por un efecto 1 INTRODCUCCIÓN 26 de competencia (Su, Huang, Chiu, & Shen, 2003) (Phinney, Odin, Johnson, & Holman, 1990) disminuye la generación de los productos pro-inflamatorios que acabamos de describir, derivados del AA (Lapillone, Clark, & Heird, 2004) (Sampath & Ntambi, 2004). Esto se debe a que el EPA es un buen sustrato de las enzimas ciclooxigenasas y de la lipooxigenasa-5, por lo que compite con el AA en la generación de eicosanoides, inhibiendo la formación de prostaglandinas PGE2, tromboxanos TXA2 y leucotrienos LTB4, con propiedades pro-inflamatorias (Sampath & Ntambi, 2004) (Wall, Ross, Fitzgerald, & Stanton, 2010), y produciendo, entre otros eicosanoides, prostaglandina TXA3 (una prostaciclina de la serie 3, con tres dobles enlaces), la cual es un inhibidor de la agregación plaquetaria (Calder, y otros, 2009) (Holinstat, y otros, 2011). Los demás productos de la conversión del EPA en eicosanoides de la serie 3 (TXA3, prostaglandinas I3 y E3 y leucotrienos LTB5) (Figura 1.2.B) son significativamente poco potentes en estimular la inflamación, la vasoconstricción y la agregación plaquetaria, e incluso pueden antagonizar los efectos típicamente pro-inflamatorios de los eicosanoides derivados del AA (Layé, 2010) (Cottin, Sanders, & Hall, 2011) (Tabla 1.2.H). Vía AA EPA PLAQUETAS Ciclooxigenasas Tromboxano A2 Agregación plaquetaria Vasoconstrictor Tromboxano A3 Biológicamente inactivo CÉLULAS ENDOTELIALES Ciclooxigenasas Prostaglandinas Serie 2 Proinflamatorias Prostaglandinas Serie 3 Antiagregación Vasodilatador LEUCOCITOS Lipooxigenasas Leucotrieno B4 Proinflamatorio Quimiotáxico Adhesión celular Leucotrieno B5 Antiinflamatorio No quimiotáxico Inhibe adhesión Tabla 1.2.H.- Efectos metabólicos de los tromboxanos, prostaglandinas y leucotrienos derivados del ácido araquidónico (AA) y del ácido eicosapentaenoico (EPA) 1 INTRODCUCCIÓN 27 1.2.6.3 Eicosanoides de la serie 1 Una tercera ruta para la producción de eicosanoides la constituye aquella que parte del ácido ácido dihomo-gamma-linolénico (20:3 n-6) (Dγ-LA) como precursor de eicosanoides de la serie 1 (Figura 1.2.B), los cuales poseen importantes acciones biológicas. La liberación de Dγ-LA de las membranas celulares se produce por la acción de la fosfolipasa A, de igual modo que en el caso del AA. Una vez liberado el Dγ-LA, compite con el AA para unirse a las ciclooxigenasas para dar origen a los eicosanoides de la serie, cuyas prostaglandinas (PG1) y tromboxanos (TXA1) presentan características estructurales similares a los compuestos de la serie 2, pero propiedades biológicas muy diferentes, puesto que son sustancias anti-inflamatorios que inducen la vasodilatación e inhiben la agregación plaquetaria. Por otro lado, cuando el Dγ-LA es sustrato de la enzima 15-LOX no origina leucotrienos como el AA, pero si produce ácido 15-hidroxieicotrienoico (15-HETE), potente inhibidor de la enzima 5-LOX, responsable de la conversión del AA en leucotrieno LTB4 que, como se señaló antes, es un destacado agente inflamatorio. Por tanto, el Dγ-LA también inhibe la inflamación a través de la ruta lineal de los eicosanoides. El ácido Dγ-LA no suele estar presente en grandes cantidades en nuestra dieta habitual, pero se puede encontrar en el aceite de onagra y en el de borraja, comercializados como suplementos alimentario. El problema es que un elevado consumo de estas fuentes de Dγ-LA puede conducir a que este ácido pueda tomar la ruta de formación de AA, tal como se observa en la Figura 1.2.A y, en consecuencia, la producción de prostaglandinas pro-inflamatorias de la serie 2. Para evitarlo, la clave está en la relación entre ácidos grasos omega-6 y omega-3 en la dieta: si faltan ácidos grasos omega-3, concretamente ácido α-linolénico, el Dγ-LA se convertirá en las prostaglandinas "malas" de la serie 2. Si en cambio la dieta es rica en α-LA, el Dγ-LA se convierte en prostaglandinas "buenas" de la serie 1. La causa de esto radica en la enzima Δ5-desaturasa. Como se puede apreciar en la Fihgura 1.2.A, esta enzima actúa en dos reacciones bioquímicas a la vez: por un lado, en la conversión de Dγ-LA en ácido araquidónico (es decir, el camino que queremos evitar), y por otro en la conversión de 1 INTRODCUCCIÓN 34 Por último, el colesterol es necesario para la síntesis y secreción de lipoproteínas, las cuales son necesarias para su transporte y el de triglicéridos en la sangre, puesto que ambas sustancias son insolubles en agua. En la Figura 1.3.A se presenta la fórmula estructural del colesterol. Figura 1.3.A.- Fórmula estructural del colesterol Consta de un núcleo de ciclopentanoperhidrofenantreno o esterano formado por cuatro anillos, denominados A, B, C y D, que presentan varias sustituciones: 1. Dos radicales metilo en las posiciones C-10 y C-13. 2. Una cadena alifática ramificada de 8 carbonos en la posición C-17. 3. Un grupo hidroxilo en la posición C-3. 4. Un doble enlace entre los carbonos C-5 y C-6. Los cuatro anillos del esterano y la cadena hidrocarbonada sustituyente del anillo D del colesterol constituyen una estructura compacta, rígida e hidrófoba aunque la molécula es anfifílica porque tiene una pequeña parte polar constituida por el grupo hidroxilo del carbono 3 y una cola o porción apolar formada por el carbociclo de núcleos condensados y los sustituyentes alifáticos. Así, el colesterol, al igual que otros lípidos, es insoluble en agua y bastante soluble en disolventes apolares como el cloroformo. 1 INTRODCUCCIÓN 35 1.3.2 Metabolismo 1.3.2.1 Biosíntesis del colesterol El colesterol existente en nuestro organismo proviene de dos fuentes principales: 1.- La alimentación (colesterol exógeno) que es la responsable de un tercio de los aportes diarios (0,3 g/día, aproximadamente). Entre los alimentos más ricos en colesterol encontramos sobre todo: ● los de origen animal como la carne roja, el pato, las vísceras, la charcutería (embutidos, foie gras) y el marisco. ● la manteca de cerdo y algunos aceites con alto contenido en ácidos grasos saturados y sus derivados: la bollería industrial, la repostería, patatas fritas y los snacks en general. ● la leche y lácteos enteros, la nata y los quesos grasos. ● los alimentos elaborados que contengan aceites en sus ingredientes como mayonesas, empanadillas y productos rebozados. 2.- La fabricación o síntesis (colesterol endógeno) por parte de las células, que corresponde a la mayor parte de los aportes diarios (1 g/día, aproximadamente). La fabricación del colesterol tiene lugar en el retículo endoplasmático liso de prácticamente todas las células de los animales vertebrados. Aunque el hígado es el lugar principal, se sabe que otros muchos tejidos también lo sintetizan, por ejemplo: intestino, piel, pared arterial y otros. Está regulada en parte por el aporte de colesterol exógeno, ya que niveles dietéticos altos de colesterol o la presencia de precursores del mismo, dan lugar a una disminución de su síntesis hepática. Por el contrario, los factores que causan disminución en los niveles de colesterol sirven para estímulo de su biosíntesis. En consecuencia, el organismo se autorregula para conseguir un nivel óptimo de colesterol en el mismo. No obstante, una ingesta exagerada de colesterol exógeno o una anomalía en la producción de colesterol endógeno, causando un incremento de su producción, puede provocar el deterioro del mecanismo de autorregulación, incrementándose los niveles de colesterol en sangre. 1 INTRODCUCCIÓN 36 La síntesis de colesterol en el hepatocito se produce a partir de la enzima acetilCoA (que como vimos es el producto de la oxidación de las grasas) mediante una cadena de reacciones de condensación, reducción e hidroxilación (Brown & Goldstein, 1978), siendo la conversión de la β-hidroxi-β-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) a mevalonato, catalizada por la correspondiente enzima reductasa, la reacción limitante de la síntesis (Figura 1.3.B). En el hígado e intestino se han detectado las mayores cantidades de este enzima, de forma que de 2/3 a 3/4 partes del colesterol total del organismo se sintetiza en estos órganos (Kenelly & Rodwell, 1985) (Gill, 1985). De un modo resumido se pueden agrupar las reacciones químicas de la síntesis de la siguiente manera (Lehninger, 2009):  Tres moléculas de acetil-CoA se combinan entre sí formando mevalonato, el cual es fosforilado a 3-fosfomevalonato 5-pirofosfato.  El 3-fosfomevalonato 5-pirofosfato es descarboxilado y desfosforilado a pirofosfato de isopentenilo.  El ensamblaje sucesivo de seis moléculas de pirofosfato de isopentenilo origina el escualeno, vía pirofosfato de geranilo y pirofosfato de farnesilo.  La ciclación del escualeno da lanosterol.  El lanosterol se convierte en colesterol después de numerosas reacciones sucesivas, enzimáticamente catalizadas, que implican la eliminación de tres grupos metilo (–CH3), el desplazamiento de un doble enlace y la reducción del doble enlace de la cadena lateral. 1 INTRODCUCCIÓN 37 Figura 1.3.B.- Reacciones químicas en la biosíntesis del colesterol 1 INTRODCUCCIÓN 38 1.3.2.2 Rutas metabólicas En los organismos sanos el colesterol sintetizado en el hígado en virtud de su biosíntesis, junto con el reabsorbido en el tracto digestivo a partir de los alimentos, está en equilibrio con el excretado en las heces y con el utilizado en el metabolismo (síntesis de sales biliares, hormonas, vitamina D, formación de membranas, etc). La resultante de este equlibrio constituye el pool metabólico del colesterol en virtud del cual se logra mantener constante su nivel en el organismo. De lo contrario hay que recordar que la acumulación de este lípido en las arterias está asociada con enfermedades cardiovasculares y apoplejía (suspensión súbita de la acción cerebral debida a derrames sanguíneos en el encéfalo o en las meninges). En la Figura 1.3.C se esquematizan las relaciones entre los tejidos periféricos, el hígado y el intestino en el mantenimiento de la homeostasis del colesterol (Ros, 2006). Figura 1.3.C.- Homeostasis del colesterol en el organismo. HDL: proteínas de alta densidad; rLDL: receptor para las lipoproteínas de baja densidad (LDL); QM: quilomicrones; VLDL: lipoproteínas de muy baja densidad 1 INTRODCUCCIÓN 39 Ruta intestino-higado. Entre un 95%-98% del colesterol que ingerimos está esterificado con ácidos grasos. Los ésteres del colesterol no sufren ninguna modificación en la digestión bucal y gástrica. Es en el intestino delgado en donde la enzima colesterol estereasa hidroliza prácticamente el 100% de los ésteres con la ayuda de las sales biliares, que actúan como activadores de la enzima (Huff, 2003). El colesterol libre difunde en forma de micelas con los ácidos biliares a través de la membrana de las células de la mucosa intestinal y una vez dentro de éstas, en el endotelio intestinal, es de nuevo esterificado en una proporción del 40% con ayuda de la enzima acilCoA-colesterol-acil-tranferasa (ACAT) (Chen, 2001), eliminándose el resto por las heces. (Es necesario destacar que el colesterol, a diferencia de otras moléculas, no se metaboliza hasta originar C02 y H20, de modo que la única vía de eliminación es la intestinal). El colesterol re-esterificado pasa a la sangre para ser conducido hacia los órganos y sistemas del organismo donde se le requiera. Pero como es un compuesto que no se disuelve en agua ni en disoluciones acuosas como el plasma sanguíneo, necesita unirse a sustancias solubles como las proteínas formando parte de unas partículas sintetizadas en el intestino llamadas quilomicrones (QM), que contienen los ésteres de colesterol, proteínas, y triglicéridos procedentes de la dieta. Se trata de una clase de lipoproteínas muy poco densas porque contienen mucha grasa, aunque son las de mayor tamaño (Figura 1.3.D). Figura 1.3.D.- Quilomicrón y lipoproteínas 1 INTRODCUCCIÓN 40 Los quilomicrones llegan a la circulación sanguínea por vía linfática y mientras circulan van descargando sus triglicéridos en los músculos (a los que aportan energía) y en los tejidos adiposos (donde se almacenan como reserva) (Miyazaki, Sakai, Sakamoto, & Horiuchi, 2003). A medida que se van descargando de grasa disminuyen de tamaño, de modo que llegan menguados al hígado, pero enriquecidos en ésteres de colesterol. En las células del hígado estos residuos son captados por moléculas receptoras que los reconocen y los introducen en el hepatocito para que éste haga uso de ellos según sus requerimientos. De esta manera, el colesterol de la alimentación es incorporado a las células hepáticas. Parte del colesterol que las células no utilizan es excretado en forma de ácidos biliares o de colesterol libre, el cual puede ser reabsorbido por el intestino, reiniciándose así el ciclo (Figura 1.3.C, parte derecha). En cada vuelta de este ciclo el organismo pierde algo de colesterol por las heces. Ruta tejidos-higado. Además del colesterol intestinal que llega al hígado a través de los QM, también llega el colesterol sintetizado en los tejidos periféricos, transportado por las lipoproteínas de alta densidad (HDL, high density lipoproteins). Éstas, al igual que las demás lipoproteínas, son partículas esféricas que están constituidas por dos porciones (Figura 1.3.E): un núcleo interno (que contiene ésteres de colesterol y triglicéridos) y una capa externa formada por fosfolípidos, colesterol libre y apoproteínas (el término “apo” se refiere a la proteína en su forma libre) (Packard, 1982). Figura 1.3.E.- Representación esquemática de una lipoproteína. 1 INTRODCUCCIÓN 41 Las lipoproteínas del tipo HDL, originalmente pequeñas, se vuelven como globos al retirar el colesterol de las células, y así llegan al hígado donde hay un receptor específico para la fracción proteica (apoA) del HDL, convirtiéndose el colesterol en ácidos y sales biliares que se excretan con la bilis (parte izquierda de la Figura 1.3.C). Se ha demostrado que niveles altos de HDL se relacionan con la disminución de la incidencia de infarto cardiaco; por eso al colesterol transportado por estas lipoproteínas HDL se le reconoce popularmente como colesterol bueno. El tabaquismo, la obesidad, la vida sedentaria, y los andrógenos disminuyen su concentración en el suero Ruta higado-tejidos Cuando la dieta contiene más ácidos grasos de los que son necesarios, éstos se convierten en triglicéridos en el hígado y se empaquetan con las apolipoproteínas específicas y el colesterol formando lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL, “very low-density lipoproteins”). El exceso de glúcidos en la dieta también se puede convertir en triglicéridos en el hígado, exportándose en forma de VLDL. Estas lipoproteínas circulan durante varios días en la sangre desde el hígado hacia los tejidos muscular y adiposo, donde, al igual que los quilomicrones, descargan parte de sus triglicéridos y proteínas, con participación de la enzima lipoprotein-lipasa, cargándose en colesterol y transformándose sucesivamente en lipoproteínas IDL y LDL; es decir, a medida que van perdiendo estos componentes su densidad va aumentando desde muy baja (VDL), pasando por una intermedia (IDL) y, finalmente, baja (LDL). Las lipoproteínas LDL, que contienen una carga muy alta de colesterol, son las encargadas de transportar la mayor parte de éste en la sangre, casi las tres cuartas partes (Packard, 1982). Las LDL son captadas por cualquier órgano del organismo (incluyendo el hígado) mediante un mecanismo de endocitosis gracias a receptores específicos (rLDL) que se encuentran en la membrana celular (Figura 1.3.C). El 60-80% de estos receptores se encuentra en el hígado, dependiendo su número de la cantidad de colesterol intracelular. Esta vía está autorregulada, de forma que cuando la célula hepática tiene cubiertas sus necesidades de colesterol se suprime la síntesis de receptores de LDL. Por el contrario, ante una demanda de colesterol, la síntesis de receptores específicos para LDL se ve aumentada (Brown & Goldstein, 1978) (Gill, 1985). 1 INTRODCUCCIÓN 42 De este modo el hígado actúa como una computadora: procesa los datos del colesterol recibido procedentes del intestino y de los tejidos periféricos y regula la cantidad de colesterol que debe producir a partir de su propia síntesis con el fin de conseguir un estado de equilibrio entre el colesterol recibido y el consumido en la fabricación de ácidos biliares, en su excreción (McNamara, y otros, 1987) (Jones, y otros, 1996), en la fabricación de membranas celulares, formación de lipoproteínas VLDL, síntesis de hormonas, vitaminas, etc. (Hopkins, 1992). 1 INTRODCUCCIÓN 43 1.3.3 Aterosclerosis Cuando hay un exceso de colesterol en nuestro organismo (por ejemplo, debido a alguna enfermedad genética que da lugar a un incremento de la biosíntesis de colesterol en el hígado), no todo el colesterol transportado por las lipoproteínas LDL puede ser captado por los tejidos extrahepáticos, acumulándose en la sangre y contribuyendo a la formación en el interior de las paredes de los vasos sanguíneos de placas ateroescleróticas (Stary, y otros, 1995) (Figura 1.3.F) constituidas, además de colesterol, por depósitos de lípidos, tejido fibroso, plaquetas, células inflamatorias y calcio, que aumentan el grosor de la pared de la arteria, perdiendo ésta su flexibilidad, y provocando ictus e infartos cardíacos al impedir la circulación sanguínea. Las lesiones características de la aterosclerosis (ateromas) se inician con el aumento de la permeabilidad de la pared de la arteria a las LDL provocado por agresores como tabaco, hipertensión arterial, diabetes, ácidos grasos saturados o determinadas infecciones. Las lipoproteínas LDL se adhieren a la capa íntima de las arterias acompañadas de monocitos (glóbulos blancos), inflamándose la capa por la conversión de los monocitos en macrófagos. Si no hay muchas lipoproteínas LDL, los macrófagos las captan y las digieren, moderándose la reacción inflamatoria. Figura 1.3.F.- Arteria normal y arteria con depósito de placa. 1 INTRODCUCCIÓN 50 Los vectores que definen estas fuerzas son tangenciales a las superficies líquidas correspondientes. La forma de la gota va a depender de la diferencia entre 𝛾B y la suma de 𝛾A + 𝛾AB. Si la resultante de 𝛾A∆l y 𝛾AB∆l es inferior a la fuerza 𝛾B∆l, la superficie de la gota del líquido A se extenderá por toda la superficie libre de B. Si sucede lo contrario, entonces la superficie del líquido A se contraerá adoptando la forma de la figura. En el equilibrio se cumplirá: 𝛾𝐴𝐵 =𝛾𝐵−𝛾𝐴 (1. 1) Esta ecuación se conoce con el nombre de relación de Antonoff. Según lo indicado, la condición de extensión será: 𝛾𝐴+𝛾𝐴𝐵 <𝛾𝐵 (1. 2) lo que es lo mismo que 𝛾𝐵−(𝛾𝐴+𝛾𝐴𝐵)>0 (1. 3) Esta diferencia se define como coeficiente de extensión inicial: 𝑆=𝛾𝐵−(𝛾𝐴+𝛾𝐴𝐵) (1. 4) El coeficiente de extensión también se puede expresar en función del trabajo de adhesión y del de cohesión. El trabajo de adhesión entre dos líquidos inmiscibles A y B se define como el trabajo necesario para separar 1 cm2 de la interfase líquido-líquido y formar dos interfases líquido-aire separadas. Como el trabajo superficial viene dado por 𝛾·∆S y ∆S vale 1 cm2, el trabajo de adhesión (WA) se puede expresar de la forma: 𝑊𝐴 =𝛾𝐴+𝛾𝐵−𝛾𝐴𝐵 (1. 5) Esta expresión se conoce como ecuación de Dupré. El trabajo de cohesión (Wc) de un líquido es el trabajo necesario para separar en dos partes una columna líquida de 1 cm2 de sección: 1 INTRODCUCCIÓN 51 𝑊𝐶=2·𝛾𝐴 (1. 6) A la diferencia entre estos dos trabajos se le denomina coeficiente de extensión: 𝑆=𝑊𝐴−𝑊𝐶=(𝛾𝐴+𝛾𝐵−𝛾𝐴𝐵)−2·𝛾𝐴 (1. 7) o también 𝑆=𝛾𝐵−(𝛾𝐴+𝛾𝐴𝐵) (1. 8) Los trabajos de adhesión y de cohesión de los líquidos están estrechamente relacionados con las energías superficiales de los mismos. Se producirá extensión cuando la tensión superficial del líquido soporte B sea elevada y la correspondiente al líquido a extender A sea baja. La monocapa que así se ha formado será estable si existe un equilibrio adecuado entre los grupos hidrófobo e hidrófilo en las moléculas que la forman, de manera que las características de uno sean suficientes para contrarrestar la atracción que experimenta el otro hacia el soporte acuoso, respectivamente. Sustancia líquida Tensión superficial Ƴ (mN/m) Mercurio 485 Agua 72,75 Ácido oleico 32,5 Benceno 28,85 Tolueno 28,5 Cloroformo 27,13 Acetona 23,7 Alcohol etílico 22,75 Metanol 22,61 n-Hexano 18,43 Tabla 1.4.A.- Tensión superficial de varios líquidos a temperatura de 20°C. 1 INTRODCUCCIÓN 52 1.4.2 Presión superficial Las monocapas presentan una tendencia a ocupar la mayor superficie disponible y, como consecuencia, ejercen un empuje sobre cualquier obstáculo que se oponga a su extensión. En un principio se atribuyó este fenómeno a un origen análogo al que da lugar a la presión de un gas, considerándolo como una consecuencia de la agitación térmica de las moléculas que forman la película, las cuales, al chocar con una barrera que se oponga a un desplazamiento, provocan un empuje bidimensional. Al valor de la fuerza que actúa por unidad de longitud se le denominó presión superficial. La descripción de una monocapa de extensión o de Langmuir, se hace en función de su curva presión superficial-área, es decir, de la relación entre la presión superficial observada y el área ocupada por las moléculas del film sobre la superficie del sustrato acuoso. Para obtener estas representaciones, se necesita, obviamente, realizar la medida de la presión superficial simultáneamente a la del área ocupada por la monocapa a medida que se comprime la misma. En la presente memoria se ha utilizado la lámina de Wilhelmy como método para determinar la presión superficial. En dicho método, se mide la fuerza hacia abajo que sobre una lámina ejerce la superficie o interfase a la cual se desea determinar la tensión cuando ésta toca exactamente dicha superficie. La lámina está unida a un sensor de presión que, a su vez, está acoplado a una cubeta equipada con una barrera, denominada “balanza superficial” (Ilustración 1.4.B). Ilustración 1.4.B.- Ejemplo de balanza superficial de Langmuir. 1 INTRODCUCCIÓN 53 1.4.3 Estabilidad de las monocapas En los sistemas formados por monocapas que no estén firmemente empaquetadas, la barrera de energía que impide que se produzca el fenómeno de disolución es pequeña y la velocidad de destrucción de la monocapa viene determinada fundamentalmente por la difusión de las moléculas hacia el sustrato soporte. La estabilidad de una monocapa se ve condicionada por varios factores, entre los cuales destacan, por su importancia, la presión superficial y la temperatura. Un aumento de la presión superficial suele provocar un incremento en la inestabilidad de la monocapa si el mecanismo de respuesta de la misma es la difusión de moléculas o el colapso. Se conoce como la presión de colapso el valor máximo de presión a la que se puede comprimir una monocapa sin que se produzca una expulsión manifiesta de moléculas que la componen (Lipp, Lee, Zasadzinski, & Waring, 1966). Al sobrepasarse esta presión, la monocapa se destruye y tiene lugar la formación de núcleos y multicapas. En la Figura 1.4.A se muestra una caracterización del colapso de una monocapa mixta de dipalmitoilfasfatidilcolina (DPPC) y 1-palmitoil-2-oleil-sn-fosfatidilglicerol (POPG). En este caso, al comprimir la monocapa cerca del colapso, se forman pequeñas ondulaciones (a) que terminan doblándose (b). Estas dobleces aumentan su tamaño (c y d) dando lugar finalmente a una bicapa (e y f) (Baoukina, Monticelli, Risselada, Marrink, & Tieleman, 2008). Figura 1.4.A.- Monocapa mixta de DPPC (verde) y POPG (amarillo) de proporción 4:1 sobre agua. 1 INTRODCUCCIÓN 54 La temperatura es otro factor que también afecta a la estabilidad. Así bien, es de esperar que la velocidad de pérdida de material desde la monocapa se vea aumentada con el incremento de la temperatura debido al descenso de las fuerzas de atracción entre las moléculas de la monocapa y entre éstas y las de la subfase, incluyendo las de enlace de hidrógeno. No obstante, en algunos casos se ha observado el efecto contrario de la temperatura (Binks, 1991). Por último, cabe mencionar que existen otros factores que influyen en el fenómeno de disolución de las moléculas que constituyen la monocapa: la relación de pK y pH (fundamental en monocapas ionizadas), la masa o el balance hidrofílicolipofílico. 1 INTRODCUCCIÓN 55 1.4.4 Estados físicos de las monocapas Como se ha visto, uno de los indicadores más importantes de las propiedades del material que forman las monocapas viene dado por el registro de la presión superficial en función del área ocupada por cada molécula. Cuando estas medidas se realizan a una temperatura constante, las representaciones obtenidas reciben el nombre de isotermas presión-área (π-A). Las representaciones obtenidas de esta forma son del estilo de la que se presenta en la Figura 1.4.B a partir de la cual se describen los distintos “estados” que puede alcanzar una monocapa. Figura 1.4.B.- Distintos estados por los que puede atravesar una monocapa de una sustancia anfifílica extendida en la interfase aire-agua al ser comprimida según la técnica de Langmuir. Conformación de las moléculas para cada estado. 1 INTRODCUCCIÓN 56 Inicialmente, las moléculas se encuentran flotando en la superficie del sustrato acuoso, sin ejercer ninguna o muy poca fuerza entre ellas. En esta zona de la isoterma la presión se aproxima a cero y diremos que la monocapa se encuentra en estado “gaseoso” (G), por analogía con los estados de la materia. A medida que disminuye el área, las moléculas se aproximan más unas a otras y no sólo eso, sino que tienden a adquirir todas la misma orientación, esta región de la isoterma recibe el nombre de “líquido expandido” (LE). Para algún tipo de sustancias, como es el caso de la AmB, la monocapa presenta un estado de transición (LE-LC) en el que la presión se mantiene constante a pesar de la disminución del área. En esta zona, no hay aumento de presión porque lo único que ocurre es que la parte hibrofóbica de la molécula se está levantando en la interfase aire-agua. Una vez superada esta meseta, la monocapa adquiere un estado de “líquido condensado” (LC), en el que todas las moléculas están orientadas de la misma forma y se produce un aumento brusco de la presión. A continuación, se alcanza un estado de “sólido” (S), en el que las moléculas alcanzan el mayor grado de empaquetamiento y se hallan orientadas perpendicularmente a la superficie del agua. Por último, se llega al colapso, cuando la monocapa se rompe y unas moléculas se superponen sobre otras. Con el objetivo de establecer los estados físicos que atraviesa una monocapa se determina el módulo de compresibilidad (Davies & Rideal, 1963), parámetro calculado a partir de las isotermas π-A que, además, nos permitirá conocer la rigidez o elasticidad de la capa monomolecular, así como la posible presencia de estados de transición, que a veces no son fácilmente observables en las isotermas. El módulo de compresibilidad, Cs-1, se calcula de acuerdo con la ecuación: 𝑪𝒔 −𝟏 =−𝑨(𝒅𝝅 𝒅𝑨 ⁄ ) (1. 9) donde A es el área ocupada por la monocapa según la presión π alcanzada. El módulo de compresibilidad es cero en agua y se incrementa al aumentar la cantidad de material superficialmente activo. Cuanto mayor sea el valor obtenido para este parámetro, menos elástica será la monocapa analizada y, por lo tanto, más condensada. Por otro 1 INTRODCUCCIÓN 57 lado, la presencia de un mínimo en las representaciones del módulo de compresibilidad frente a la presión superficial, es señal de un estado de transición de la monocapa a una presión determinada. De esta forma, en función del valor de Cs-1 se puede determinar el estado físico de la monocapa (Tabla 1.4.B). ESTADO CS-1 (mN/m) Gas (G) 0 – 12 Líquido expandido (LE) 12 – 50 Líquido condensado (LC) 100 – 250 Sólido (S) 1000 – 2000 Tabla 1.4.B.- Valores del módulo de compresibilidad para los distintos estados de una monocapa. 1.4.4.1 Monocapas en estado gaseoso El estado gaseoso es el más simple conceptualmente, al igual que en el caso de la materia en tres dimensiones. En este estado físico, las moléculas se encuentran flotando sobre el sustrato acuoso, encontrándose lo suficientemente separadas como para no ejercer muy poca o ninguna fuerza entre ellas. Tales monocapas se caracterizan por tener una presión superficial que, de manera asintótica, se aproxima a cero a medida que aumenta el área disponible por el film, además de poseer un potencial de superficie constante y una densidad superficial muy baja. En un principio, cualquier sustancia que forme una monocapa puede existir en estado gaseoso si las moléculas están lo suficientemente separadas. La interpretación del comportamiento π-A de estas monocapas es análogo al análisis cinético correspondiente a la teoría de los gases ideales en tres dimensiones, sin tener en cuenta la subfase líquida. Esta aproximación asume simplemente que las moléculas se mueven con una energía cinética de traslación de ½·K·T por cada grado de libertad. Las dos dimensiones en el plano de la superficie conducen a una energía cinética total de K·T , la cual es la que produce la presión superficial, lo que conduce a una ecuación de gas ideal bidimensional: 1 INTRODCUCCIÓN 58 𝜋·𝐴=𝐾·𝑇 (1. 10) A 25 °C, el valor de K·T es de 411,7 mN/m · Å2/molécula y, entonces, a una presión superficial de 1 mN/m, el área ocupada por una molécula es de, aproximadamente, 400 Å2/molécula; si la presión es de 0,5 mN/m, le corresponde un área de 800 Å2/molécula. Puesto que es una ecuación límite, como su análoga en tres dimensiones, la conformidad con la misma solo se alcanza a muy grandes áreas y bajas presiones. El hecho de que la Ecuación 1.10 sea una ecuación límite puede observarse experimentalmente al representar gráficamente π-A frente a la presión, o frente al área: la linealidad se observa a bajos valores de π y se desvía cuando la monocapa es comprimida. La causa de esta desviación parece residir en el tamaño de las moléculas que forman la monocapa, de manera que al encontrarse éstas tendidas en la superficie ocupan un área del orden de 100-200 Å2, por lo que la suposición de que la superficie está esencialmente “vacía” se invalida cuando el área de la monocapa se reduce por debajo de varios miles de Å2/molécula. Con el fin de corregir este defecto se ha introducido un término de co-superficie en la ecuación Ecuación 1.10: 𝜋·(𝐴−𝐴0)=𝐾·𝑇 (1. 11) en la cual A0 es, bien un parámetro ajustable, o se asocia con el área molecular observada en films condensados. Aun cuando esta ecuación se aplica con éxito a las monocapas obtenidas en la interfase agua/aceite, es insostenible en el caso de monocapas en la interfase aire/agua. En la práctica se encuentran desviaciones negativas en el caso de monocapas neutras eléctricamente, lo que requeriría que 𝜋·𝐴 fuese mayor que 𝐾·𝑇. Tal evidencia de la no idealidad se ha atribuido a la existencia de fuerzas atractivas entre las moléculas del film, por analogía con las de van der Waals en el tratamiento de gases. Se han propuesto varias expresiones para corregir estas desviaciones, como es el caso de la ecuación: 1 INTRODCUCCIÓN 59 𝜋·(𝐴−𝐴0)=𝑞·𝐾·𝑇 (1. 12) en donde q es menor que 1 (habitualmente 0,7). En la interfase aire/agua esta atracción intermolecular estaría reducida o sería despreciable. Se ha indicado que las moléculas en monocapas gaseosas están acostadas (Figura 1.4.B). Existe la evidencia experimental de este hecho al comparar el comportamiento de monocapas compuestas de moléculas con grupos polares distribuidos en diferentes partes de las mismas. Por ejemplo, los ésteres dibásicos, con un grupo polar a cada lado de la cadena, tienden a formar films gaseosos, mientras que la simple sustitución de un grupo polar por otro apolar origina una monocapa condensada. De forma similar, esteroles con un solo grupo ceto o hidroxílico forman monocapas condensadas, mientras que monocapas de esteroles con grupos polares distribuidos a lo largo de la molécula tienden a ser gaseosas. No obstante, estos resultados no pueden considerarse como concluyentes, debido a las dificultades experimentales que se han mencionado para su comprobación. Sin embargo, Langmuir señaló que las macromoléculas aisladas sobre la superficie del agua permanecen acostadas (Langmuir, 1917), lo que corresponde a la posición de mínima energía. Esta conclusión ha sido criticada más décadas después, y se ha sugerido que, en vez de ello, las moléculas se proyectan hacia fuera de la superficie en un estado enrollado al azar (Aranov & Witten, 1958). Debido al movimiento térmico, es probable que esto sea cierto durante la mayor parte del tiempo, para un determinado tipo de moléculas. En cualquier caso, el peso de la evidencia sugiere que la configuración media en una monocapa gaseosa está más próxima a la de la extensión horizontal que a la vertical. 1.4.4.2 Monocapas expandidas Las monocapas expandidas, denominadas “líquido” (Dervichian D. G., 1939) y “líquido expandido” (Harkins, 1952) (Adam N. K., The Physics and Chemistry of Surfaces, 1956), presentan un área molecular intermedia entre la correspondiente a las monocapas gaseosas y las condensadas. Las isotermas π-A de estas monocapas 1 INTRODCUCCIÓN 66 Al estudiar la influencia de la temperatura sobre estas isotermas, se pone de manifiesto un cambio regular de la estabilidad de los diferentes estados gaseosos, expandido y condensado, de modo que a temperaturas bajas es más estable el estado condensado, mientras que a elevadas predomina el estado expandido. En series homólogas de compuestos de larga cadena se producen cambios similares en función de la longitud de la cadena. La reducción de la temperatura o el aumento de la longitud de las cadenas, incrementa la efectividad de tales interacciones, tendiendo a hacer la monocapa más coherente y ordenada. 1 INTRODCUCCIÓN 67 1.4.4.4.1 Transición de monocapas gaseosas La transición de una monocapa gaseosa, que se presenta, generalmente, a bajas presiones superficiales, se caracteriza por una “presión de vapor superficial” constante a lo largo de un gran intervalo de áreas. Esta presión es la presión superficial correspondiente al equilibrio entre la monocapa gaseosa y la monocapa más coherente (expandida y condensada). Desde un punto de vista molecular, el fenómeno queda reducido a lo siguiente: a medida que se comprime la monocapa, llega un momento en el que las fuerzas atractivas intermoleculares llegan a ser tan grandes que las moléculas que forman la monocapa se reúnen para formar una monocapa coherente. Este momento corresponde a una licuación bidimensional, de estado gas a líquido (sustancia A en la Figura 1.4.E), o condensación, de estado gas a sólido (sustancia B), y la presión superficial de equilibrio es equivalente a la presión de vapor. 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Sustancia A  (mN/m) Área (Å2/moléculas) Sustancia B Figura 1.4.E.- Ejemplo de isotermas π-A con transición de estado gas a líquido (Sustancia A) y con transición de estado gas a sólido (Sustancia B). 1 INTRODCUCCIÓN 68 La constancia de esta presión de vapor está asociada con una variación de entalpía. Dichos calores de vaporización bidimensionales han sido estimados mediante modificación de la ecuación de Clausius-Clapeyron (Adam N. , 1923). 1.4.4.4.2 Transición de líquido expandido a líquido condensado Una segunda región de transición bien definida es la que existe entre los estados de líquido expandido y liquido condensado. Cuando una monocapa expandida se comprime, aparece bruscamente la transición, caracterizada por un repentino incremento de la compresibilidad; esto ocurre a un área aproximada de 30-40 Å2/molécula para la mayoría de los compuestos grasos de cadena recta. En este punto la curva π-A viene a ser casi paralela al eje del área, como si el área cambiase a presión casi constante. A medida que el área se aproxima a la de la monocapa condensada, la curva adquiere rápidamente mayor pendiente, de modo que no existe ninguna discontinuidad notable de pendiente cuando se alcanza la región de condensada plena. Las monocapas en esta región de transición entre el estado expandido y el condensado son denominadas por Adam y Harkins como monocapas de “transición” o “intermedios”, mientras que Derviachian los denomina “mesomorfos expandidos”. Para explicar el comportamiento de la monocapa en esta región de transición se han propuesto varias teorías. La más antigua de todas considera que el comienzo de la transición tiene lugar porque algunas de las moléculas de la monocapa en estado líquido expandido se organizan en grupos o micelas bidimensionales (Langmuir, 1933). Estas micelas pueden contener hasta 15 moléculas; sobre la base de un empaquetamiento hexagonal, la configuración más estable correspondería a 7 o 13 moléculas simples. A medida que la monocapa se comprime, el número de micelas incrementa hasta que esta se hace condensada. Langmuir considera que la presión superficial observada es la suma de las contribuciones de las moléculas individuales y de las micelas, y que las moléculas en las micelas ocupan el área característica de la monocapa condensada, mientras que el área de las moléculas simples es la que corresponde a la presión límite mayor de la 1 INTRODCUCCIÓN 69 monocapa expandida. Estas suposiciones conducen a una presión superficial total, a cualquier área molecular A, dada por: 𝜋=𝜋𝑒+𝐾·𝑇 𝛽·𝐴𝑒·𝐴𝑒−𝐴 𝐴−𝐴𝑒 (1. 16) en donde πe y Ae son la presión superficial y el área molecular, respectivamente, al comienzo de la transición desde la región de líquido expandido; Ac es el área molecular de la monocapa condensada y β el número de moléculas de la micela. Langmuir aplicó esta ecuación a los datos de Adam para ácidos grasos y encontró valores razonables de β, que varían de 5 a 13 según la naturaleza de la molécula. Diferentes autores han desarrollado otros tratamientos basados en la mecánica estadística de los sistemas condensados (Band, 1940), o en el hecho de que la disminución o impedimento de la rotación molecular (Kirkwood, 1943) puede conducir a la discontinuidad de la compresibilidad que aparece al comienzo de la transición. Aunque esta posibilidad parezca totalmente razonable, la teoría no ha sido aplicada a fin de interpretar cuantitativamente la manera en que se alcanza la disposición ordenada de la fase condensada. La aplicación de la ecuación de Clausius-Clapeyron a la transición de fase que se está considerando, conduce a la expresión: 𝑑𝜋𝑐 𝑑𝑇 =𝑄𝑐 𝑇(𝐴𝑒−𝐴𝑐) (1. 17) donde πc es la presión a la que tiene lugar la condensación superficial y Qc el calor latente de la condensación (es decir, el calor absorbido o emitido en el cambio de fase). Los términos Ae y Ac representan el área correspondiente a la fase expandida y a la condensada, respectivamente; Ae es el área a πc y Ac se obtiene extrapolando la parte de la isoterma condensada a π = πc. 1 INTRODCUCCIÓN 70 Debido a que la transición de fase no ocurre a una presión superficial constante (existe una ligera pendiente en la isoterma π-A durante la transición), Qc no puede igualarse al cambio de entalpía (ΔH), ya que hay que incluir el término: ∫ 𝜋𝑑𝐴 𝐴𝑐 𝐴𝑒 (1. 18) En realidad, las medidas de presión superficial no proporcionan la suficiente información como para poder dilucidar acerca de las diferentes estructuras formadas durante las transiciones de fase. Una de las técnicas empleadas para diferenciar los diferentes estados de las monocapas es la microscopía de luz polarizada bajo el ángulo de Brewster, también conocida como microscopía de ángulo de Brewster (BAM) (Lheveder, Meunier, & Hénon, 2000). Mediante esta técnica se puede visualizar directamente la morfología de la monocapa y, como consecuencia, determinar los cambios estructurales que se producen en la misma cuando es sometida a compresión. Para la transición líquido condensado a líquido expandido, los valores del calor y de la variación de entropía son positivos para muchas sustancias, tales como ácidos grasos. Esto concuerda con la transición en sistemas tridimensionales y refleja un aumento de la energía potencial de las moléculas y el desorden. Es a partir de 1983, cuando se pueden visualizar directamente a nivel microscópico las transiciones de fase. Ello es debido gracias a la utilización de la microscopía de fluorescencia técnica en la que una pequeña cantidad de colorante fluorescente se añade a la monocapa. Si la monocapa es heterogénea, es decir, si está formada por regiones de líquido condensado flotando en una fase continua de líquido expandido, el colorante se reparte entre las dos fases de acuerdo con su solubilidad, de modo que si es menos soluble en la fase más densa (liquido condensado), las regiones de esta fase se observaran oscuras sobre un fondo blanco, que corresponde a la fase de líquido expandido. En consecuencia, la microscopia de fluorescencia proporciona un camino muy útil para poder discriminar las diferentes fases LC, LE o G, asi como para investigar la estructura de la monocapa en las regiones de coexistencia entre tales fases. 1 INTRODCUCCIÓN 71 1.4.4.5 Relación del estado físico y el área molecular La similitud entre las fases tridimensionales y los estados de la monocapa es una herramienta de gran utilidad pero, obviamente, no puede ser exacta debido al importante efecto de la interfase líquido-gas. Sin embargo, a pesar de esta restricción es innegable que existe una gran similitud en la progresión del orden molecular y en la importancia de las fuerzas intermoleculares en las fases gaseosa, líquida y sólida en tres dimensiones por una parte, y los estados gaseoso, expandido y condensado de las monocapas por otra. En una monocapa gaseosa, las moléculas están lo suficientemente alejadas entre ellas, de forma que las interacciones intermoleculares exhibidas son despreciables y hay razones para suponer que tales moléculas están dispuestas de forma casi horizontal en la superficie del sustrato. También se ha indicado que la distribución de los grupos polares en una molécula compleja y grande puede decidir si la sustancia forma una monocapa coherente o gaseosa. Este hecho a veces puede ser útil para obtener información acerca de la estructura molecular en caso de que se forme una monocapa gaseosa. Cuando la configuración estable es una monocapa expandida no existe ninguna relación directa entre el tamaño de las moléculas individuales y el área molecular. Sin embargo, a veces es posible obtener algunas conclusiones. Se acepta generalmente que el área molecular observada no puede ser menor que la proyección de la sección transversal molecular, y esto puede servir de regla para establecer ciertas configuraciones moleculares en la monocapa. También existe una buena razón para pensar que las monocapas expandidas son obtenidas a partir de sustancias que contienen largas cadenas hidrocarbonadas, tipo líquidas, mientras que las monocapas condensadas se forman solo si el empaquetamiento puede permitir interacciones entre las cadenas. La comparación de monocapas de compuestos cuyas estructuras difieren solo ligeramente (como la presencia de un doble enlace o una cadena ramificada) puede ser instructiva, ya que la insaturación de las cadenas es muy específica, puesto que los dobles enlaces cis son más efectivos en evitar el empaquetamiento que los trans. En este sentido, ahora ya se sabe 1 INTRODCUCCIÓN 72 casi con certeza que el efecto de la insaturación es sobre el empaquetamiento, y no está relacionado con ninguna atracción específica entre el doble enlace y el líquido de la subfase, aunque es verdad que en una monocapa expandida los grupos funcionales, tales como los dobles enlaces, son más accesibles a la subfase líquida. En films condensados, en los que las moléculas están relativamente orientadas y empaquetadas, la información sobre el tamaño molecular y forma de las moléculas se obtiene a partir de las curvas π-A. Sin embargo, no existe un criterio uniforme para seleccionar los puntos más significativos de la curva π-A de una monocapa condensada, en relación con la selección molecular transversal. Un método tradicional consiste en extrapolar la parte correspondiente a altas presiones, la de más pendiente, a π=0, y tomar el área de presión cero o área límite, A0(estado), como característica de la monocapa. Si existe alguna curvatura en la curva π-A, tal extrapolación puede ser algo incierta. Langmuir y Schaefer critican el procedimiento sobre la base de que no existe ninguna razón teórica para que esta área sea considerada de particular significación (Langmuir & Schaefer, 1937). Indican que es mejor considerar el área a una presión superficial elevada arbitraria, tal como 15 o 30 mN/m. Así mismo, también se utiliza el área a la cual la presión superficial comienza su ascenso, también conocida como lift-off o área inicial (A0), para señalar de esta manera el punto en el que la monocapa abandona el estado gaseoso. En el caso de las monocapas más condensadas, dicho valor suele coincidir con A0(estado). Otros investigadores prefieren utilizar el área observada en las inflexiones o discontinuidades de las curvas π-A como, por ejemplo, el área de colapso (Ac) o el área de transición (At). Para ello se basan en que dichas variaciones reflejan transformaciones de fase de las monocapas asociadas con algún cambio en la estructura o comportamiento de la monocapa. Además, las transiciones son extremadamente agudas y reproducibles. En el caso del área de colapso de la monocapa, que se corresponde con el área mínima en la que las moléculas pueden agruparse, los efectos cinéticos conducirán a pequeñas variaciones del área molecular para cambios apreciables en la presión del colapso, puesto que los films condensados son menos compresibles cerca del colapso. 1 INTRODCUCCIÓN 73 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 A0(LE) A0 Sustancia A  (mN/m) Área (Å2/molécula) A0(S) c Sustancia B c Figura 1.4.F.- Ejemplo de presión de colapso (πc), área de presión cero (A0(Estado)) y área inicial (A0) para una monocapa que atraviesa por un estado de líquido expandido (sustancia A) y otra por un estado sólido (sustancia B). 1 INTRODCUCCIÓN 74 1.4.5 Monocapas mixtas, consideraciones teóricas El estudio de monocapas mixtas presenta enorme importancia, ya que de él se puede obtener información acerca del empaquetamiento y de las interacciones que se pueden establecer entre las moléculas que constituyen la monocapa. Para determinar la naturaleza de las interacciones moleculares que se producen en estas monocapas mixtas, es necesario conocer el grado de miscibilidad de sus componentes en su estado bidimensional. Cuando los componentes de una monocapa mixta son inmiscibles, la extensión de una mezcla de estos componentes originará “islotes” de un componente distribuidos en la monocapa del otro. Si los “islotes” son suficientemente grandes, será posible detectar su presencia por la aparición de fluctuaciones en el potencial de superficie, si bien lo más natural, es que se originen islotes pequeños conteniendo tan solo algunos cientos de miles de moléculas (imágenes del microscopio de ángulo de Brewster). La Figura 1.4.G (monocapas mixtas) muestra esquemáticamente las posibles distribuciones moleculares que pueden resultar de la extensión de una monocapa mixta. Figura 1.4.G.- Tipos de distribuciones moleculares entre dos componentes. A B C A. Miscibilidad, monocapa homogénea. B. Inmiscibilidad, pequeños islotes. C. Inmiscibilidad, separación completa. 1 INTRODCUCCIÓN 75 Las propiedades de una monocapa en la que sus componentes son inmiscibles, reflejarán las de los componentes por separado, de tal manera que una monocapa mixta puede considerarse como constituida por dos monocapas separadas en equilibrio entre sí, correspondientes cada una de ellas a cada uno de los componentes. El área ocupada por la película mixta será la suma de las áreas qué obtendrían sus componentes por separado. La misma consideración se puede aplicar a cualquier otra propiedad de la monocapa mixta. En las monocapas mixtas se cumplirá entonces que a una determinada presión π: 𝐴1,2 =𝑋1 ·𝐴1+ 𝑋2·𝐴2 (1. 19) A1,2 es el área molecular media de la monocapa mixta a una determinada presión, es decir, la relación existente entre la superficie ocupada por la monocapa y el número total de moléculas que la integran. X1 y X2 son las fracciones molares de los componentes y A1 y A2 las áreas moleculares de los componentes puros en sus respectivas monocapas a la misma presión superficial a la que se mide A1,2. De la misma manera, el potencial de superficie viene dado por: ∆𝑉1,2 =𝑋1 ·∆𝑉1+𝑋2·∆𝑉2 (1. 20) en la medida de la viscosidad superficial es la fluidez, φ= 1/ɳ, quien obedece a estas ecuaciones: φ1,2 =𝑋1·φ1+𝑋2·φ2 (1. 21) Estas ecuaciones son válidas siempre que cada molécula posea un entorno idéntico al que tendría en su monocapa pura, de forma que se puedan despreciar las moléculas que se encuentran en las fronteras de los islotes. En concordancia con estas ecuaciones, la representación gráfica del área molecular media de la monocapa mixta en función de la fracción molar de uno de los componentes dará lugar a una línea recta, cuya ordenada en el origen representa el área molecular del otro componente. 1 INTRODCUCCIÓN 82 Por lo tanto: 𝐴1=(𝜕𝐴1,2 𝜕𝑁1)𝑁2·𝑁1+𝐴1,2 +(𝜕𝐴1,2 𝜕𝑁1)𝑁2·𝑁2 (1. 35) Sacando factor común a (𝜕𝐴1,2 𝜕𝑁1)𝑁2, esta igualdad se transforma en: 𝐴1=𝐴1,2+(𝜕𝐴1,2 𝜕𝑁1)𝑁2·(𝑁1+𝑁2) (1. 36) Ahora bien, la derivada con respecto al número de moléculas N1 se puede transformar en derivada con respecto a la fracción molar X2 mediante la siguiente relación: (𝜕𝐴1,2 𝜕𝑁1)𝑁2=(𝜕𝐴1,2 𝜕𝑋2)𝑁2·(𝜕𝑋2 𝜕𝑁1)𝑁2 (1. 37) Y como 𝑋2=𝑁2 𝑁1+𝑁2, al diferenciar, suponiendo N2 constante, resulta: (𝜕𝑋2 𝜕𝑁1)𝑁2=− 𝑁2 (𝑁1+𝑁2)2 (1. 38) Que al introducir en 1.37 resulta: (𝜕𝐴1,2 𝜕𝑁1)𝑁2=(𝜕𝐴1,2 𝜕𝑋2)𝑁2·[− 𝑁2 (𝑁1+𝑁2)2] (1. 39) Y al sustituir este valor en la ecuación 1.36 se transforma en la expresión: 𝐴1    =𝐴1,2−𝑋2(𝜕𝐴1,2 𝜕𝑋2)𝑁2 (1. 40) O en la equivalente: 𝐴1,2 =𝐴1    +𝑋2(𝜕𝐴1,2 𝜕𝑋2)𝑁2 (1. 41) Con arreglo a la ecuación 1.41, si en un diagrama se representa el área molecular media en función de la fracción molar del componente 2, se obtiene una línea recta de 1 INTRODCUCCIÓN 83 cuya ordenada en el origen se puede calcular el área molecular parcial del componente 1 (o del componente 2, si A1,2 se representa en función de X1). Cualquier tipo de interacción entre los componentes, diferente a la existente entre los mismos cuando forman un sistema ideal, se traducirá en una alteración del valor del área molecular parcial, por lo que en el diagrama A-X se producirá un cambio brusco de la pendiente de la recta en el punto correspondiente a la concentración a la que se verifica la interacción. Otra manera de conocer el grado de interacción que se produce entre los componentes miscibles de una monocapa mixta consiste en la aplicación de un tratamiento termodinámico desarrollado (Joos, Bull. Soc. Chim., 1969). Si la fase colapsada se designa con el supraíndice α, el potencial químico de un componente en esta fase será: µ𝑖𝛼=µ𝑖𝑜,𝛼 +𝐾·𝑇·𝑙𝑛𝑋𝑖𝛼 (1. 42) En donde µ𝑖𝑜,𝛼 es el potencial químico del componente i en el estado normal. Por otra parte, el potencial químico del componente i en la monocapa (µ𝑖𝑠) viene dado por (Defay, Prigogine, Bellemans, & Everett, 1966): µ𝑖𝑠=µ𝑖𝑜,𝑠 +𝐾·𝑇·𝑙𝑛𝛾𝑖·𝑋𝑖𝑠+𝜋·𝐴𝑖 (1. 43) siendo µ𝑖𝑜,𝑠 el potencial químico del componente i en la monocapa bajo las condiciones estándar; 𝛾𝑖 el coeficiente de actividad; π la presión superficial y Ai el área molecular límite. En el colapso (equilibrio): µ𝑖𝑠=µ𝑖𝛼 (1. 44) En una monocapa formada por el componente 1, puro, éste es expulsado de la misma a su presión de colapso, πc,1, y puesto que 𝑋𝑖𝑠=1, 𝑋𝑖𝛼=1, 𝛾𝑖=1 se obtiene de la ecuación 1.42: µ𝑖𝛼=µ1 𝑜,𝛼 (1. 45) 1 INTRODCUCCIÓN 84 Y teniendo en cuenta 1.43 y 1.44, resulta: µ1 𝑜,𝑎 =µ1 𝑜,𝑠+𝜋𝑐,1·𝐴1 (1. 46) En donde A1 es el área molecular límite del componente 1 a su presión de colapso, πc,1. Para una monocapa mixta en la que interviene el componente 1, se obtiene de las ecuaciones 1.42, 1.43 y 1.44: µ1 𝑜,𝛼 + 𝐾𝑇𝑙𝑛 𝑋1 𝛼=µ1 𝑜,𝑠 +𝐾𝑇𝑙𝑛𝛾1𝑋1 𝑠+𝜋𝑐,𝑚𝐴1 (1. 47) En donde πc,m es la presión del colapso de la monocapa mixta de una determinada composición 𝑋1 𝑠. Sustituyendo la ecuación 1.46 en 1.47, resulta: 𝑋1 𝛼=𝑋1 𝑠·𝛾1·𝑒𝑥𝑝(𝜋𝑐,𝑚−𝜋𝑐,1 𝐾·𝑇 .𝐴1) (1. 48) Y de forma similar, para el componente 2: 𝑋2 𝛼=𝑋2 𝑠·𝛾2·𝑒𝑥𝑝(𝜋𝑐,𝑚 −𝜋𝑐,2 𝐾·𝑇 .𝐴2) (1. 49) En donde πc,2 representa la presión de colapso del componente 2. Recordando que 𝑋1 𝛼+𝑋2 𝛼=1, resulta: 1=𝑋1 𝑠·𝛾1·𝑒𝑥𝑝(𝜋𝑐,𝑚 −𝜋𝑐,1 𝐾·𝑇 .𝐴1)+𝑋2 𝑠·𝛾2·𝑒𝑥𝑝(𝜋𝑐,𝑚−𝜋𝑐,2 𝐾·𝑇 .𝐴2) (1. 50) Si entre los componentes de la mezcla superficial no existe ninguna interacción distinta de la pueda existir entre las moléculas de los componentes puros, los coeficientes de actividad 𝛾1 y 𝛾2 se pueden igualar a la unidad. Aplicando, entonces la ecuación 1.48 se puede obtener una curva ideal de πc,m frente a X1 (o frente a X2), la cual coincidirá con la que se obtenga experimentalmente. Si esta curva ideal no coincide con la experimental será como consecuencia de la existencia de una interacción diferente entre los componentes de la mezcla, con relación a la existente entre los componentes puros (Joos, Ruyssen, Miñones, García Fernández, & Sanz Pedrero, 1969) (Joos & Demel, 1969), lo que conduce a que los coeficientes de actividad 𝛾1 y 𝛾2 sean diferentes a la unidad. 1 INTRODCUCCIÓN 85 Para tal mezcla no ideal, 𝛾1 y 𝛾2 están relacionados con un parámetro de interaccion de acuerdo con la relación: 𝛾1 =𝑒𝑥𝑝[𝜉(𝑥2 𝑠)2] (1. 51) 𝛾2 =𝑒𝑥𝑝[𝜉(𝑥1 𝑠)2] (1. 52) Por otra parte, los coeficientes 𝛾1 y 𝛾2 están relacionados entre sí por la ecuación de Gibbs-Duhem: 𝑋1 𝑠· 𝑑 𝑙𝑛𝛾1+𝑋2 𝑠· 𝑑 𝑙𝑛𝛾2=0 (1. 53) De modo que el parámetro de interacción en el colapso puede calcularse a partir de las ecuaciones 1.50, 1.51 y 1.52. El conocimiento del parámetro de interacción ξ permite calcular la energía de interacción ∆E, definida por: ∆𝐸=𝐸1,2−𝐸1,1+𝐸2,2 2 (1. 54) Siendo Ei,j la energía de interacción existente entre una molécula i y otra j. En el caso de que los dos componentes de la monocapa mixta formen una red hexagonal cuando se encuentran densamente empaquetados, de modo que cada molécula de un componente se encuentre rodeada por otras seis del otro (z·L = 6) (Joos, Ruyssen, Miñones, García Fernández, & Sanz Pedrero, 1969) (Joos & Demel, 1969) (Levy, Benita, & Baszkin, 1991) (Mestres, Alsina, Espina, Rodríguez, & Reig, 1992), se puede escribir: ∆𝐸=ξ·𝐾·𝑇 𝑧·𝐿 (1. 55) Este tratamiento puede aplicarse si no existe una gran diferencia de tamaño entre los dos componentes. Si esto ocurre, el empaquetamiento es no hexagonal y varía con la composición del sistema mixto (Kasselouri, Coleman, & Bazskin, 1996). Un procedimiento alternativo para caracterizar las interacciones que tienen lugar en las monocapas mixtas consiste en utilizar la aproximación desarrollada por Goodrich 1 INTRODCUCCIÓN 86 (1957) y por Pagano y Gershfeld (1972) en la que la energía libre de exceso se calcula de acuerdo con la relación: ∆𝐺𝑒𝑥𝑐.=𝑁·∫ 𝐴1,2 𝜋 0·𝑑𝜋−𝑋1·∫ 𝐴1 𝜋 0·𝑑𝜋−𝑋2·∫ 𝐴2 𝜋 0·𝑑𝜋 (1. 56) En donde A1,2 es el área molecular media ocupada por el filme mixto y A1 y A2 son las áreas moleculares de los films puros. Los valores del parámetro de interacción (α) a diferentes presiones superficiales, así como las correspondientes energías de interacción (∆h) pueden calcularse a partir de las ecuaciones: 𝛼= ∆𝐺𝑒𝑥𝑐. 𝑅·𝑇·(𝑋1·𝑋2 2+𝑋2·𝑋1 2) (1. 57) ∆ℎ=𝑅·𝑇·𝛼 𝑧·𝐿 (1. 58) 2 OBJETIVOS 2 OBJETIVOS 89 Los primeros datos que evidenciaron los efectos cardioprotectores de los ácidos grasos ω-3 surgieron a partir de los estudios realizados en los esquimales quienes a pesar de tener una elevada ingesta de grasas (superior al 30% de los requerimientos energéticos) presentaban una muy baja incidencia de enfermedades cardiovasculares, identificándose como fuente dietaria de estas grasas los animales de origen marino (mamíferos y pescados azules, ricos en estos lípidos) (Bang, Dyerberg, & Sinclair, 1980). Estos resultados fueron confirmados en estudios realizados posteriormente en poblaciones con una alimentación similar (Kinjo, y otros, 1999) (Egert & Stehle, 2011) y los efectos benéficos de los ω-3 sobre las enfermedades cardiovasculares han sido abundantemente documentados en estudios realizados en humanos y animales (Wang, y otros, 2006) (Slee, McLennan, Owen, & Theiss, 2010). Algunos se atribuyen al EPA y sus derivados metabólicos (Wang, y otros, 2006) (Cottin, Sanders, & Hall, 2011), aunque actualmente se plantea que el DHA sería un agente cardioprotector más potente que el EPA (Borghi & Cicero, 2006). Estudios epidemiológicos indican que el consumo de PUFAs omega-3 puede afectar favorablemente a la salud cardiovascular. En este grupo de estudios se encuentra el proyecto “The Seven Countries Study”, primer trabajo importante iniciado en 1958 por el Dr. Ancel Keys, fisiólogo de la Universidad de Minessota, para investigar la dieta de 12.763 hombres entre 40-59 años pertenecientes a 7 países (Finlandia, Italia, Holanda, Grecia, Yugoslavia, Estados Unidos y Japón) en relación con las enfermedades cardiovasculares. Tras el seguimiento de los voluntarios, se publicaron en 1980 (Keys, 1980) los resultados en los que se concluye la existencia de bajas tasas de enfermedades coronarias en la región del Mediterráneo gracias al elevado consumo de aceite de oliva y de alimentos que constituyen lo que pasó a denominarse dieta del Mediterráneo. También se concluyó que un consumo de 30 g/día de pescado reducía el riesgo de mortalidad por enfermedad coronaria en un 50% en relación a los voluntarios que no consumían pescado (Kromhout, Bosschieter, & de Lezenne Coulander, 1985). Posteriores estudios (Simopoulos A. , 2004) mostraron que las grasas poliinsaturadas (PUFAs) reducen las lipoproteínas LDL y los triglicéridos, incrementado el colesterol HDL. 2 OBJETIVOS 90 El estudio "The Western Electric" determinó que un consumo de más de 35 g/día de pescado presentaba un riesgo relativo de mortalidad por enfermedad coronaria de 0,62 en comparación con los que casi nunca consumían pescado (Daviglus, Stamler, & Orencia, 1997), mientras que el proyecto "US Physicians' Health" demostró que el consumo semanal de pescado estaba asociado a un riesgo relativo de 0,48 de muerte súbita cardíaca (Albert, y otros, 1998). En el mismo sentido, el estudio sobre "Prevención de aterosclerosis coronaria mediante intervención con àcidos grasos omega-3 de origen marino" (también conocido por "SCIMO") demostró una reducción en el desarrollo de la aterosclerosis al administrar dosis bajas de PUFAs omega-3 (1,65 g/día) (Von Schacky, Baumann, & Angerer, 2001). Otros estudios, como el “Diet and Reinfarction Trial (DART)” (Burr, Fehily, Gilbert, & cols., 1989), el “GISSI-Prevenzione” (Hopper, Ness, Higgins, Moore, & Ebrahim, 1999) o el “Lyon Heart” (Kris-Etherton, Eckel, Howard, & cols., 2001) redundan en la reducción de episodios coronarios, en una proporción que va desde el 30% al 70%, como consecuencia de la ingesta de pescado azul o de la dieta tipo mediterránea, con aporte de ácido oleico y antioxidantes naturales, es decir, de ácidos grasos insaturados. Aunque aún no está claro el mecanismo exacto mediante el cual los ácidos grasos ω-3 ejercen su efecto protector, se han propuesto varios mecanismos posibles, entre los que destacan los siguientes (Carrero, y otros, 2005): 1.- Reducción de triglicéridos (TG). Los triglicéridos elevados son un factor de riesgo independiente de las enfermedades cardiovasculares, especialmente en individuos con valores reducidos de colesterol HDL. La reducción de TG generada por el consumo de ω-3 es uno de los efectos con mayor evidencia tanto en humanos como en animales (Nodari, y otros, 2011).. Estos ácidos disminuyen el colesterol plasmático y los niveles de TG a través de la inhibición de la biosíntesis de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y de triglicéridos en el hígado, sin alterar la biosíntesis de lipoproteínas de elevada densidad (HDL) (Manerba, Vizzardi, Metra, & Dei Cas, 2010). Otros estudios indican que la ingesta de DHA y EPA reduce el aumento de triglicéridos tras el consumo de una dieta rica en 2 OBJETIVOS 91 grasas y, por tanto, produce un efecto beneficioso (Zampelas, Roche, & Knapper, 1998) (Layne, Goh, Jumpsen, Ryan, & Chow, 1996). Sin embargo, el efecto reductor de los niveles plasmáticos de TG, HDL y LDL parece ser inverso cuando se ingieren aceites ricos en ω-6 (Roth & Harris, 2010), indicando que la relación de ácidos grasos ω-3/ω-6 en la dieta opera como un sensor para la regulación hepática del metabolismo lipídico. 2.- Reducción de la agregación plaquetaria y la trombosis. Cuando las células vasculares sufren algún tipo de daño, se desencadena un proceso inflamatorio que conlleva una respuesta inmune que conduce a la agregación plaquetaria, la formación de trombos y la aoarición de placas de ateroma. El contenido en ácidos grasos de las plaquetas origina la producción de tromboxano A2 a partir de eicosanoides de la familia ω-6, o de tromboxano A3 a partir de los de la familia ω-3. Este último posee un efecto proagregante menor que el tromboxano A2, reduciendo, por tanto, la agregación plaquetaria y la trombosis (Schectman, y otros, 1996). Además, el efecto ateroprotector de los omega-3 también parece proceder de su incorporación a los fosfolípidos de las membranas celulares, donde sustituyen parcialmente al ácido araquidónico (AA) produciendo eicosanoides menos protrombóticos y vasoconstrictores que los originados por el AA (Connor, 2000). 3.- Reducción de la presión arterial. La hipertensión es uno de los factores más importantes de riesgo de las enfermedades cardiovasculardes. Entre otros efectos, la hipertensión activa la producción de moléculas de adhesión al endotelio de la pared arterial (Brown & Hu, 2001) contribuyendo al engrosamiento de la misma y al desarrollo de la aterosclerosis. Los ω-3 ejercen leves reducciones en la presión arterial (Wang, y otros, 2006) puesto que estimulan la producción endotelial de óxido nítrico (Harris, 1996), el cual provoca la dilatación de los vasos sanguíneos, reduciendo la presión sanguínea. No obstante, se ha demostrado que sólo cantidades elevadas de aceites de pescado (un mínimo de 3 g/día) producen un descenso significativo de la misma (Appel, Miller, Seidler, & Whelton, 1993) (Morris, Sacks, & Rosner, 1993). Las cantidades de pescado que habría 3 PARTE EXPERIMENTAL 98 Figura 3.1.A.- Estructuras moleculares de las sustancias estudicadas Ácido esteárico (STA). 18:0 Ácido oleico (OA). 18:1 (9) - ω-9 Ácido linoleico (LA). 18:2 (9, 12) - ω-6 Ácido gamma-linolénico (GLA). 18:3 (6, 9, 12) - ω-6 Ácido alfa-linolénico (ALA). 18:3 (9, 12, 15) - ω-3 Ácido estearidónico (SDA). 18:4 (6, 9, 12, 15) - ω-3 Ácido eicosadienoico (EA). 20:2 (11, 14) - ω-6 3 PARTE EXPERIMENTAL 99 Como disolventes se utilizaron etanol y cloroformo, ambos adquiridos a Merck KGaA. Disoluciones de colesterol: el colesterol se disolvió en una mezcla de cloroformo/etanol en proporción de 1:1 (v/v). Disoluciones de ácidos grasos: los ácidos grasos se disolvieron en una mezcla de cloroformo/etanol en proporción de 3:1 (v/v). Las disoluciones de colesterol y ácido esteárico se prepararon pesando una cantidad determinada de dichas sustancias y diluyéndolos en la correspondiente mezcla de disolventes. Con los ácidos grasos restantes, suministrados en disolución, se prepararon disoluciones “madre”, calculando en cada caso el volumen necesario para obtener la concentración deseada. A partir de éstas, se obtuvieron las disoluciones de extensión. Se le añadió a cada una de las disoluciones unas gotas de alcohol amílico (0,5%, adquirido a Merk), con la finalidad de lograr una extensión de la monocapa mucho más eficaz (Dervichian D. , 1939) (Dervichian D. , 1940) (Sánchez-González, Cabrerizo-Vílchez, & Gálvez-Ruiz, 1999). La presencia de este alcohol en las disoluciones no afecta al resultado de las monocapas puesto que se evapora inmediatamente después de la deposición. Las disoluciones se guardaron de forma hermética en recipientes de vidrio opaco que previamente habían sido limpiados con ácido nítrico 65%, abundante agua destilada y posterior secado en estufa. Dichos recipientes fueron almacenados en un desecador herméticamente cerrado y saturado con vapor de los disolventes para evitar la evaporación de los mismos. El tiempo de almacenamiento nunca superó los tres días. La extensión de las mezclas se llevó a cabo de modo que el número total de moléculas depositado fuese siempre el mismo, variándose para ello la cantidad de moléculas de cada componente en la mezcla, de acuerdo con la fracción molar deseada. El hecho de utilizar siempre el mismo número total de moléculas presenta la ventaja de que todas las isotermas π-A, correspondientes a las diferentes mezclas, se puedan representar en un mismo gráfico, sin necesidad de cambiar los ejes de coordenadas del mismo. 3 PARTE EXPERIMENTAL 100 3.1.3 Soporte o sustrato acuoso Las disoluciones de extensión se depositaron sobre agua desionizada de resistividad 18 MΩ·cm, obtenida por el sistema Milli-RO (Milli-Q) de ósmosis inversa, fabricado por la firma Millipore, consistente en un prefiltro “Rogard” de 10 micras, que se encarga de eliminar el cloro del agua y que va colocado en serie con un cartucho RO de acetato de celulosa, el cual permite eliminar el 90% de los iones y el 99% de la materia orgánica presente en el agua, obteniéndose ésta con la calidad de “grado de laboratorio”. A continuación, el agua se hace pasar a través del sistema Milli-Q, formado por un filtro de carbón activo, dos cartuchos de resinas de intercambio iónico y un filtro “Organex”, que permite eliminar las últimas trazas de materia orgánica. Finalmente existe un filtro “Millipack”, que se encarga de retener las partículas o microorganismos de tamaño superior a 0.22 nm. Llegado a este punto, el agua obtenida adquiere la calidad de “grado de reactivo”. Esta agua ultra purificada fue la que se utilizó como sustrato para la elaboración de las monocapas de la presente memoria. El pH del agua desionizada utilizada para la realización de todos los estudios expuestos en este trabajo se mantuvo en el intervalo de 6 - 7. Para su control, se realizaron mediciones periódicas con un pH-metro o sensor electroquímico de laboratorio. 3 PARTE EXPERIMENTAL 101 3.2 DESCRIPCIÓN DE LOS DISPOSITIVOS DE MEDIDA 3.2.1 Balanza de superficies Para el registro de las isotermas presión superficial-área (π-A) se ha utilizado la balanza Nima 601BAM (Figura 3.2.A), manufacturada por la firma Nima Technology, Ltd. (Coventry, Reino Unido). Está compuesta por una cubeta de politetrafluoroetileno (teflón), una barrera móvil recubierta del mismo material y un sensor de presión. Figura 3.2.A.- Esquema de una balanza superficial El uso del teflón, el cual es químicamente inerte, hidrofóbico y oleofóbico, evita la cesión de iones al sustrato y se eliminan problemas existentes con las cubetas metálicas usadas hace años (Miñones Trillo, 1995). Por otro lado, este tipo de revestimiento facilita la limpieza de la misma siendo resistente a la mayoría de las sustancias orgánicas. La balanza presenta unas dimensiones de 7 cm de ancho por 85 cm de largo, ofreciendo una superficie total de 600 cm2, aunque la superficie experimental utilizada para la realización de las isotermas π-A de este estudio, fue de 500 cm2. El volumen total de agua soporte necesitado para llenar la cubeta es de alrededor de 300 mililitros. El segundo elemento importante es la barrera móvil que se apoya sobre los dos bordes de la cubeta y se desliza longitudinalmente de un extremo al otro de la cubeta. Esta barrera está recubierta también de politetrafluoroetileno, material hidrofílico que 3 PARTE EXPERIMENTAL 102 evita que la película se deslice por debajo de la propia barrera al someterla a compresión pero permite que el sustrato pase por debajo. De esta manera, al mover la barrera se consigue que la superficie de la monocapa se expanda o comprima, sin variar el volumen de la subfase de agua. En la cubeta existen unos topes para evitar que la barrera móvil entre en contacto con el dispositivo de medida de la presión o que salga de la cubeta cuando invierte su recorrido y llega al final del mismo. El movimiento de la barrera está controlado por un motor de alta precisión, controlado mediante software por ordenador. Se puede modificar la velocidad de compresión desde 10 cm2/min hasta 100 cm2/min. En el presente estudio se mantuvo constante la velocidad de compresión a lo largo de todo el trabajo, siendo ésta 50 cm2/min. Dicha velocidad se puede expresar también en función del número de moléculas depositadas (como variación del área por número de moléculas y tiempo). En la Tabla 3.2.A aparecen recogidas las velocidades relativas a los diferentes números de moléculas depositadas en el presente estudio. Velocidad de compresión (cm2/min) Número de Moléculas Velocidad de compresión (Å2/molécula·min) 50 2·1016 25 4·1016 12,5 6·1016 8,34 Tabla 3.2.A.- Velocidades de compresión relativas al número de moléculas. El tercer elemento de la balanza es el sensor de presión, situado en uno de los extremos de la cubeta (Figura 2.2.B). Para determinar la presión superficial se utilizó el método de wilhelmy (Gaines G. L., 1977), el cual consiste en una lámina de papel de filtro (con dimensiones de 10 mm de ancho y 0.15 mm de grosor), señalada con el número 1 en la figura, que mide la fuerza ejercida hacia abajo por la superficie del agua contenida en la cubeta. Dicha lámina está unida al sensor de presión mediante dos ganchos en forma de “S” enlazados en serie a un pequeño alambre que sobresale del sensor. Un dispositivo de elevación (número 2) permite subir o bajar la lámina hacia la superficie del líquido. 3 PARTE EXPERIMENTAL 103 Figura 2.2.B.- Sensor de presión. El sensor de presión tiene una espiral magnética y un brazo móvil (número 3) que está iluminado por un diodo infrarrojo (número 4). La sombra producida por el brazo incide en dos detectores de infrarrojos (número 5) y el control electrónico mantiene el brazo fijo de manera que la sombra incidente en cada detector sea siempre la misma. La fuerza requerida para mantener el brazo fijo se calcula midiendo la corriente que pasa por la espiral. La resolución es de 0.1 mg y la precisión viene determinada por la anchura de la lámina; para una lámina de 10 mm de ancho, es factible una precisión de 0.1 mN/m. Todas las operaciones de la balanza Nima están controladas por un programa de ordenador, registrándose en la pantalla del mismo las isotermas -A correspondientes. Por último, la balanza presenta un serpentín situado en el fondo de la cubeta que se conecta a un circuito de refrigeración con el fin de mantener en todo momento el control de la temperatura con la ayuda de un ultratermostato de circulación (Digit-Cool) con una estabilidad de ±0,1 °C. El rango de temperaturas permitidas por el fabricante para este modelo de balanza comprende desde 10 °C hasta 30 °C. La temperatura de la subfase se mide con un termómetro sumergido en la zona de la misma donde no se deposita monocapa. 3 PARTE EXPERIMENTAL 104 3.2.2 Microscopio de ángulo de Brewster 3.2.2.1 Fundamento El conocimiento de la morfología y espesor de los films extendidos en la interfase aire/agua es de considerable interés práctico, ya que, dependiendo de su estructura, la monocapa presenta propiedades diferentes que repercuten en el comportamiento global del sistema. En los últimos años se han obtenido notables progresos en la caracterización estructural de las monocapas, utilizando para ello nuevas técnicas de observación, tales como difracción de rayos X (Kenn, Böhm, Bibo, Peterson, & Möhwald, 1991) (Paudler, Ruths, & Riegler, 1992), microscopía de fluorescencia (Möhwald, 1990) (McConnell H. , 1991) y, más recientemente, microscopía de ángulo de Brewster (BAM) (Hénon & Meunier, 1991) (Hönig & Möbius, 1991) (Möbius, 1998). Esta última, que es la utilizada en este trabajo, presenta la ventaja sobre las demás técnicas microscópicas de que permite revelar la existencia de dominios e irregularidades en los filmes (Vollhardt, 1996) sin necesidad de adicionar a la monocapa ninguna sustancia extraña, como por ejemplo un marcador fluorescente, que puede alterar el estado físico de la misma (Lösche, Sackman, & Möhwald, 1983). El fundamento de esta técnica es el siguiente (Lheveder, Meunier, & Hénon, Physical Chemistry of Biological Interfaces, 2000): cuando la luz blanca (luz no polarizada) incide sobre la superficie de separación de dos medios transparentes, no absorbentes, parte de la misma se refracta y parte se refleja (Figura 3.2.C). La luz reflejada está siempre parcialmente polarizada, con su plano de polarización perpendicular al plano de incidencia. Del mismo modo, la luz refractada también está polarizada, pero en este caso la dirección del plano de polarización es paralela al plano de incidencia. La intensidad de la luz reflejada depende del ángulo de incidencia (i), así como de la naturaleza de la interfase, utilizándose la reflectividad (reflectancia) como una medida de la misma. Esta magnitud viene definida por la relación entre la intensidad de la luz reflejada y la de la luz incidente. 3 PARTE EXPERIMENTAL 105 Figura 3.2.C.- Polarización de la luz por reflexión. Para una interfase Fresnel, es decir, una interfase plana entre dos medios isotrópicos en la que el índice de refracción cambia bruscamente desde n1 (índice de refracción del medio incidente) hasta n2 (índice de refracción del segundo medio), la reflectividad viene dada por las fórmulas de Fresnel: a) La reflectividad del rayo reflejado p-polarizado (polarización paralela al plano de incidencia) es: 𝑹𝒑=[𝒕𝒂𝒏(𝜽𝒊−𝜽𝒓) 𝒕𝒂𝒏(𝜽𝒊+𝜽𝒓)]𝟐 (3. 1) b) La reflectividad del rayo reflejado s-polarizado (polarización perpendicular al plano de incidencia) es: 𝑹𝒔=[𝒔𝒆𝒏(𝜽𝒊−𝜽𝒓) 𝒔𝒆𝒏(𝜽𝒊+𝜽𝒓)]𝟐 (3. 2) en donde r es el ángulo de refracción: 𝒏𝟏·𝒔𝒆𝒏𝜽𝒊=𝒏𝟐·𝒔𝒆𝒏𝜽𝒓 (3. 3) La Figura 3.2.D muestra las reflectividades Rp y Rs, en función del ángulo de incidencia, para n1 = 1 (aire) y n2 = 1,33 (agua). 3 PARTE EXPERIMENTAL 106 Figura 3.2.D.- Reflecividades Rp y Rs en función del ángulo de incidencia. Como puede observarse, Rs aumenta a medida que lo hace el ángulo de incidencia, mientras que Rp disminuye al principio hasta un valor 0 y luego aumenta hasta 1. El ángulo de incidencia para el cual Rp = 0 recibe el nombre de ángulo de Brewster. La ecuación (3.1) muestra que esto sucede cuando 𝐭𝐚𝐧(𝛉𝐢+𝛉𝐫) es infinito, es decir, cuando: 𝜽𝒊+ 𝜽𝒓 = 𝝅 𝟐 (3. 4) lo que significa que los rayos reflejado y refractado son perpendiculares entre sí. Las dos ecuaciones (3.3) y (3.4), en el ángulo de Brewster, permiten escribir: 𝒏𝟐 𝒏𝟏=𝒔𝒆𝒏𝜽𝒊 𝒔𝒆𝒏𝜽𝒓=𝒔𝒆𝒏𝜽𝒊 𝒄𝒐𝒔𝜽𝒊=𝒕𝒂𝒏𝜽𝑩𝒓𝒆𝒘𝒔𝒕𝒆𝒓 (3. 5) 3 PARTE EXPERIMENTAL 107 Figura 3.2.E.- Reflectividades Rp y Rs en función del ángulo de incidencia para una monocapa de índice de refracción 1,5 y espesor 20 Å. De acuerdo con esto, si la luz incidente es p-polarizada, no existe nada de luz reflejada cuando el ángulo de incidencia coincide con el de Brewster, el cual, en el caso del agua, es aproximadamente de 53°. Si se deposita una monocapa sobre la interfase, cambia el índice de refracción del medio (pasa de ser 1.33, que es el índice de refracción del agua, a 1,50 aproximadamente, en una monocapa de 20 Å de espesor), modificándose por ello el valor del ángulo de Brewster y aumentando la reflectividad hasta un valor del orden de 5·10-5 en las proximidades de tal ángulo (Figura 3.2.E). Esta pequeña reflectividad es suficiente como para que se pueda visualizar la monocapa, que se manifiesta como una imagen clara sobre un fondo oscuro, correspondiente al agua. La caracterización cuantitativa del espesor de la monocapa por elipsometría requiere un análisis más complicado (Azzam & Bashara, 1992). En efecto, la intensidad de luz reflejada bajo el ángulo de Brewster depende del espesor y de las propiedades ópticas del filme, estando relacionadas tales magnitudes mediante la ecuación: 𝑰=│𝑹𝒑│ · 𝟐 = 𝑪 ·𝒅 · 𝟐 (3. 6) en donde I es la reflectividad relativa (definida como la relación entre la intensidad reflejada, Ir, y la intensidad incidente, I0) C es una constante; d es el espesor de la monocapa y Rp es la reflectividad del rayo reflejado p-polarizado, la cual 3 PARTE EXPERIMENTAL 114 3.3.2 Obtención de imágenes bam y medida del espesor relativo Tal como se indicó antes, para la realización de nuestros estudios el microscopio de ángulo de Brewster se ha adaptado a la balanza de superficies Nima. Ambos dispositivos experimentales se encuentran situados, a su vez, sobre una mesa antivibracional y en el interior de una vitrina completamente cerrada con el fin de evitar las corrientes externas de aire y la contaminación por el polvo atmosférico. Con el fin de obtener imágenes de la mejor calidad y con un elevado grado de contraste, es necesario colocar en el fondo de la balanza un cristal negro, de forma trapezoidal, justo en la zona en donde va a tener lugar la observación microscópica, de modo que el haz de luz refractado incida sobre la región del plano inclinado del cristal (Figura 3.3.A). De esta forma, el cristal actúa como una “trampa” de luz, absorbiendo el rayo refractado, que suele contener más del 90% de la energía incidente. Esto también supone la absorción del calor procedente del láser, evitando así una subida brusca de temperatura en la zona de incidencia de la monocapa. Figura 3.3.A.- Posición del cristal negro en el fondo de la cubeta. Una vez colocado el cristal y antes de extender la monocapa, se procede a ajustar el ángulo de incidencia del láser al valor de 53° (ángulo de Brewster para la interfase agua/aire). Posteriormente, manipulando el z-lift, se mueve el conjunto ópticomecánico hasta conseguir visualizar la imagen de la interfase. Superada esta fase, se procede al esparcimiento de la sustancia a estudiar. Para conseguir una mejor visualización de las imágenes, se ajustan los parámetros de la cámara a las condiciones AGUA AIRE láser haz reflejado (eje óptico) 3 PARTE EXPERIMENTAL 115 más favorables, eligiendo para ello el shutter, control de ganancia, gamma, etc, más adecuados. Para medir el espesor relativo de la película se necesita realizar un precalibrado de la cámara, puesto que ésta realmente no mide intensidades reflejadas (I), que es la magnitud que está relacionada con el espesor de la monocapa, sino niveles de grises (GL). Por lo tanto, es necesario conocer la relación entre ambos parámetros, la cual fue establecida por Rodríguez Patino y colaboradores (Langmuir, 1999) (Food Hydrocolloids, 1999) (Langmuir, 2001) para diferentes velocidades de shutter (tiempos de exposición de la cámara). A partir de las relaciones obtenidas en cada caso, se puede conocer la reflectividad relativa (I) midiendo los niveles de grises de las imágenes obtenidas durante la compresión de las monocapas y, en consecuencia, determinar el espesor relativo de las mismas, puesto que, como se indicó en diversas ocasiones, ambos parámetros se encuentran relacionados entre sí por la ecuación de Fresnel, recogida en la ecuación (2.5). Cada vez que se realiza la compresión de una monocapa, se inicia simultáneamente la medición del espesor. Con la balanza nima, obtendremos los valores de presión superficial y el área molecular ocupada por el film (isotermas π-A) en función del tiempo al que se registran cada uno de los valores. Por otro lado, con el microscopio BAM obtendremos los niveles de grises y el espesor en función del tiempo. En consecuencia, se obtienen curvas d- (espesor relativo en función de la presión superficial), así como curvas d--t, en las que se representa simultáneamente el espesor relativo y la presión superficial, en función del tiempo (t). La interpretación de los espesores registrados se llevó a cabo mediante la asociación de dichos valores con los tamaños y configuraciones moleculares de las sustancias objeto de estudio registradas en la base de datos del Centro Nacional estadounidense para la Información Biotecnológica (NBCI-pubChem). 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 119 4.1 COLESTEROL 4.1.1 Isoterma π-A y módulo de compresibilidad En la Figura 4.1.A se muestra la isoterma π-A correspondiente a la monocapa de colesterol obtenida mediante el depósito de 4·1016 moléculas sobre agua desionizada a la temperatura de 20 °C y a pH 6-7. Como se puede observar, el colesterol forma una monocapa muy condensada, característica de un estado sólido. El área límite o área extrapolada obtenida a presión cero (A0(S)) es de 38,6 Å2/molécula, valor similar al registrado en la bibliografía por otros autores. Seoane y Makyla registran un valor de 39 Å2/moléculas (Seoane, y otros, J. Phys. Chem. B, 2000) (Makyla & Paluch, 2009); Motomura y Takano obtienen un valor de 38,5 Å2/molécula (Motomura, Terazono, Matuo, & Matuura, 1976) (Takano, Ishida, Iwahashi, Araki, & Figura 4.1.A.- Isoterma π-A de la monocapa de colesterol, correspondiente al depósito de 4·1016 moléculas, extendida sobre agua a pH 6-7 y comprimida a la velocidad de 50 cm2/min. En el interior, representación del módulo de compresibilidad frente a la presión. 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 A0(S) G c Ácido esteárico: Velocidad = 25 cm2/min, Temperatura = 25 ºC, Número de moléculas = 4·1016  (mN/m) Área (Å2/molécula) S 010 20 30 40 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 S  (mN/m) Cs-1 (mN/m) 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 120 Irimaya, 1997); Müller-Landau reporta un valor de 38,4 Å2/molécula (Müller-Landau & Cadenhead, 1979); mientras que Ries registra un valor de 37,8 Å2/molécula (Ries Jr. & Swift, 1978). Cuando el sustrato es una disolución tamponada de pH 6, los valores que figuran en la bibliografía son del orden de 39 o 40 Å2/ molécula, lo mismo que en subfases de NaCl 0,01 M, tampón fosfato 0,04 M (Lundberg, 1973). Sin embargo, sobre tampones de Briton-Robinson el valor de A0 resultó ser de 43 Å2/ molécula (Taneva & Keough, 1997). Un parámetro característico de las monocapas es la presión de colapso, ya que su valor es una medida de la fuerza con la que el film se adhiere al sustrato acuoso, es decir, nos informa acerca de la mayor o menor polaridad de los grupos hidrofílicos de las moléculas que constituyen la monocapa. Cuando la monocapa de colesterol alcanza un área de 36,1 Å2/molec se produce el colapso de la misma, registrándose un valor 44,55 mN/m para la presión de dicho colapso, próximo al obtenido por otros autores (Makyla & Paluch, 2009) (Seoane, y otros, J. Phys. Chem. B, 2000) (Hac-Wydro & Wydro, Chemistry and Physics of Lipids, 2007). Una forma complementaria de evidenciar el comportamiento de las monocapas consiste en representar el módulo de compresibilidad superficial (Cs-1) en función de la presión superficial o del área molecular. El módulo de compresibilidad representa una medida de la pendiente de las curvas π-A, es decir, la rigidez de la monocapa, y viene definido por la expresión: 𝐶𝑠−1 =−𝐴·(𝑑𝜋 𝑑𝐴) (4. 59) Su valor depende del estado superficial del film, de modo que cuanto mayor sea, más rígida y, por tanto, menos compresible es la monocapa (Davies & Rideal, Interfacial phenomena, 1963). La representación gráfica del módulo de compresibilidad de la monocapa frente a la presión superficial se muestra en el recuadro interior de la Figura 4.1.A. A la presión de 5 mN/m el aumento del módulo de compresibilidad con la presión se estabiliza, 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 121 manteniéndose constante hasta una presión de 10 mN/m, dando así lugar a una meseta con valor de Cs-1 = 370 mN/m que puede ser atribuida a un cambio de fase sólido-sólido de segundo orden, puesto que en la isoterma π-A no se pone de manifiesto mediante la existencia de un plateau (meseta) de presión constante como sucede en las transiciones de fase de primer orden. Posteriormente, la curva Cs-1 -π retoma su escalada ascendente hasta alcanzar un valor máximo de 793 mN/m, coincidiendo con una presión superficial de 25,3 mN/m. Como se puede observar, el máximo valor obtenido de Cs-1 es extraordinariamente elevado, tratándose por tanto de una monocapa en estado superficial sólido, de acuerdo con los valores establecidos por Davies y Rideal (antes citados). Resultados similares fueron obtenidos por Baglioni y otros autores (Baglioni, Cestelli, & Dei Gabrielli, 1985) (Luckham, Wood, Frogatt, & Swart, 1993) (Fidelio, Maggio, & Cumar, 1986). Aunque en la bibliografía también existen otros valores más dispares, como los de 650 mN/m que obtiene Makyla (Makyla & Paluch, 2009) o los 900 mN/m de Hac-Wydro (Hac-Wydro & Wydro, Chemistry and Physics of Lipids, 2007). 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 122 4.1.2 Microscopía de ángulo de Brewster 4.1.2.1 Espesor y configuración molecular El registro del espesor relativo de la monocapa en función del área ocupada por la misma permite obtener más información sobre la orientación molecular de la monocapa de colesterol (Figura 4.1.B). Como se puede observar, el film de colesterol se mantiene sobre la superficie acuosa con un espesor de 0,25 nm mientras se encuentra en estado gas. Al comprimir la monocapa y alcanzar el valor de 52 Å2/molécula el espesor experimenta un aumento instantáneo pasando bruscamente de 0,25 nm a 1,15 nm. A este valor comienza una falsa meseta (“seudomeseta”) en la que el espesor continúa incrementándose paulatinamente hasta alcanzar al final de la misma un espesor de 1,5 nm. A partir de este momento existe de nuevo un incremento brusco del espesor, estabilizándose en un valor promedio aproximado de 2,5 nm en una región en la que existen grandes picos de espesor. 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 Isoterma -A Velocidad = 50 cm2/min Temperatura = 20 ºC pH = 6-7 Número de moléculas = 4·1016  (mN/m) Área (Å2/molécula) Espesor (nm) Tiempo (seg) Espesor Figura 4.1.B.- Isoterma π-A y curva del espesor relativo de la monocapa de colesterol, extendida sobre agua a la temperatura de 20 °C, con un depósito de 4·1016 moléculas y comprimida a la velocidad de 50 cm2/min. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 123 En esta figura se observa con claridad la existencia de un desfase de unos 14 Å2/molécula entre el incremento repentino del espesor y el incremento de la presión. Esta circunstancia es debida a que el microscopio de ángulo de Brewster está situado en la balanza de Langmuir en un lugar más próximo a la barrera móvil que comprime la monocapa que a la lámina de Wilhelmy que mide la presión superficial. De este modo, a medida que se comprime la monocapa, el microscopio de Brewster recibe antes la información del estado de la misma que el sensor de presión superficial (lámina de Wilhelmy). Además, la condensación de la monocapa comienza por la región más cercana a la barrera de compresión, por lo que cuando al microscopio le llega la monocapa condensada (en fase sólida), a la lámina de Wilhelmy todavía le está llegando la monocapa en estado expandido (fase gas). Por ello, se registra antes el incremento del espesor que el de la presión superficial. Este “decalaje” es más acusado cuando se comprimen sustancias que forman monocapas condensadas, en cuyo caso al comprimir la monocapa su desplazamiento desde la barrera móvil al sensor de presión es muy lento. Este es el caso del colesterol, cuya monocapa es muy rígida. Sin embargo, cuando se alcanza el colapso, desaparece este desfase debido a que en esta situación la distancia barrera-lámina es muy pequeña y, además, el colapso se transmite instantáneamente a todo el conjunto de la monocapa, llegando al mismo tiempo la información al microscopio y al sensor de presión. De acuerdo con lo anterior, si no existiese este desfase la curva de espesor en la Figura 4.1.B coincidiría más o menos con la de la presión superficial, por lo que el primer incremento brusco del espesor desde 0,25 nm a 1,15 nm debe atribuirse a la transición gas-sólido de la monocapa, visualizada en la isoterma π-A por el aumento casi instantáneo de la presión superficial desde π = 0 a π = 43 mN/m, aproximadamente. Del mismo modo, la falsa meseta de espesor comprendida entre 1,15 nm y 1,5 nm, previa al colapso de la monocapa, podría deberse a un cambio conformacional de la molécula de colesterol, tal como se verá más adelante. Llegado al colapso, el incremento brusco del espesor desde 1,5 nm hasta 2,5 nm se atribuye a la formación y crecimiento de los núcleos de fase colapsada, puestos de manifiesto en las imágenes BAM que se describirán más adelante. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 130 Los valores correspondientes a diferentes parámetros de la monocapa de colesterol a diferentes temperaturas, tales como área inicial bajo la curva (A0), área límite de la fase sólida extrapolada a presión cero (A0(S)), presión superficial de colapso (πc), área molecular a la cual se produce dicho colapso (Ac), valor de módulo de compresibilidad en la meseta (Cs-1(meseta)), y módulo de compresibilidad máximo (Cs-1), se muestran en la Tabla 4.1.B. Temperatura (°C) A0 (Å2/molécula) A0(S) (Å2/molécula) πc (mN/m) Ac (Å2/molécula) Cs-1(meseta) (mN/m) Cs-1 (mN/m) 10 39,6 38,6 45,1 36,2 353 791 20 39,5 38,6 44,5 36,1 370 793 30 39,3 38,6 44,1 36,3 442 790 Tabla 4.1.B.- Valores de parámetros característicos de monocapas de ácido esteárico obtenidos sobre agua a diferentes temperaturas. Figura 4.1.E.- Isotermas π-A de las monocapas de colesterol, extendidas sobre agua a diferentes temperaturas. En el interior, representación de los módulos de compresibilidad frente a la presión. 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Tª = 30 ºC  (mN/m) Área (Å2/molécula) Tª = 10 ºC Tª = 20 ºC Cs-1 (mN/m) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50  (mN/m) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 131 4.2 ÁCIDO ESTEÁRICO 4.2.1 Isoterma π-A y módulo de compresibilidad La isoterma presión superficial-área (-A) resultante de extender una monocapa de ácido esteárico (18:1) sobre sustrato acuoso a la temperatura de 20 °C se muestra en la Figura 4.2.A. A áreas moleculares superiores a 26 Å2/molécula, el film adopta un estado expandido o estado gas (G), en el que las moléculas se encuentran tan alejadas entre sí que la compresión de las mismas no modifica la presión superficial. Sin embargo, al continuar la compresión de la monocapa, se produce un aumento continuo de la presión superficial debido al empaquetamiento molecular progresivo que sufren las moléculas. En estas circunstancias, la monocapa adopta un estado condensado, concretamente el estado de líquido condensado (LC) en un primer momento y, posteriormente, sólido (S). Figura 4.2.A.- Isoterma π-A de la monocapa de ácido esteárico, correspondiente al depósito de 4·1016 moléculas, extendida sobre agua a la temperatura de 20 °C, pH de 6-7 y comprimida a la velocidad de 50 cm2/min. En el interior, representación del módulo de compresibilidad frente a la presión. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 132 La transición entre ambos estados viene marcada por una discontinuidad en el módulo de compresibilidad a la presión de 24,4 mN/m (recuadro en la figura), característica de un cambio de fase de primer orden. Por extrapolación a presión cero de la región de la isoterma correspondiente al estado líquido condensado se obtiene un área límite de A0(LC) = 25,2 Å2/molécula. En el estado sólido la monocapa es muy poco compresible como consecuencia del fuerte empaquetamiento de las moléculas. Su módulo de compresibilidad llega a alcanzar un valor muy elevado (702 mN/m), típico de monocapas en este estado. El área límite de la monocapa correspondiente a esta fase es de A0(S) = 20,3 Å2/molécula, valor coincidente con el obtenido por otros autores (Hifeda & Rayfield, 1985) (TomoaiaCotisel, Zsakó, Mocanu, Lupea, & Chifu, 1987), aunque algunos refieren valores próximos a 22 Å2/molécula (Seoane, y otros, J. Phys. Chem. B, 2000) (Hwang & Kim, 1999) (Datta, Sanyal, Dhanabalan, & Major, 1997). Como vimos anteriormente, la presión de colapso nos informa acerca de la mayor o menor polaridad de los grupos hidrofílicos de las moléculas que constituyen el film. Las monocapas de surfactantes que se encuentran en estado líquido en fase volumen colapsan de forma reversible a valores de presión que coinciden con los de sus presiones de extensión de equilibrio. Sin embargo, las monocapas de surfactantes sólidos, como el ácido esteárico, presentan dos tipos diferentes de colapso: por nucleación y crecimiento de los núcleos o por fractura de la monocapa (Smith & Berg, 1980). Bajo las condiciones experimentales que se señalan en la leyenda al pie de la Figura 4.2.A, el valor obtenido para la presión de colapso del ácido esteárico fue de c = 53mN/m, en cuyo caso el área ocupada por el filme es de 18,7 Å2/molécula. El valor de presión concuerda con el registrado por algunos autores (Seoane, Dynarowicz-tstka, Miñones Jr., & Rey-Gómez Serranillos, 2001) (McFate, Ward, & Olmsted III, 1993) (Hwang & Kim, 1999). Sin embargo, otros refieren presiones de colapso más elevadas (Seoane, y otros, J. Phys. Chem. B, 2000) (Joos, Bull. Soc. Chim. Belg., 1971) (Hac-Wydro & Wydro, Chemistry and Physics of Lipids, 2007). Estas diferencias son debidas a la diferente velocidad de compresión utilizada en estos trabajos, ya que cuanto mayor sea 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 133 ésta, más elevada es la presión de colapso (Gaines G. L., Insoluble Monolayers at LiquidGas Interfaces, 1966). Así mismo, la forma del colapso en la isoterma, terminado en pico con una rápida caída de la presión superficial, fue atribuida a la formación de tricapas (McFate, Ward, & Olmsted III, 1993). En cualquier caso, es evidente que la presión a la que la monocapa alcanza el colapso es muy superior a su presión de extensión de equilibrio (πeq), por lo que se halla en un estado termodinámico inestable, tendiendo espontáneamente a la estabilidad disminuyendo la presión superficial hasta alcanzar el valor de πeq. Esto explica la brusca caída de π inmediatamente después del colapso. La curva obtenida al representar el módulo de compresibilidad (Cs-1) frente a la presión superficial (recuadro interior de la Figura 4.2.A), muestra dos regiones diferenciadas: una primera, donde Cs-1 es prácticamente independiente de la presión, con un valor medio del módulo de compresibilidad del orden de 105 mN/m. Según Davies y Rideal (1963), este valor es característico de monocapas en estado líquidocondensado (LC), como se ha comentado antes. La segunda región muestra un primer aumento rápido de la rigidez de la monocapa hasta alcanzar un valor de 500 mN/m, seguida de un aumento más moderado, hasta llegar finalmente a un valor de 702 mN/m, el cual corresponde, de acuerdo con la clasificación propuesta por los autores mencionados, al estado sólido (S). 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 134 4.2.2 Microscopía de ángulo de Brewster 4.2.2.1 Espesor y configuración molecular El análisis del espesor relativo de las monocapas de ácido esteárico permite obtener información sobre la orientación de las moléculas. En la Figura 4.2.B se observa que el espesor de la monocapa, tras mantenerse constante en un valor aproximado de 0,5 nm desde el inicio de la compresión, experimenta un repentino aumento, adquiriendo un valor de 2,1 nm en un intervalo de áreas muy pequeño (del orden de 2 Å2/molécula), valor que se mantiene prácticamente constante hasta alcanzar el colapso (se debe recordar que debido al desfase entre la curva de espesor y la isoterma π-A la subida del espesor se produce antes que la de la presión superficial sincronizándose en el colapso). 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 Isoterma -A Presión superficial (mN/m) Área molecular (Å2/molécula) Espesor (nm) Tiempo (seg) Espesor Velocidad = 50 cm2/min Temperatura = 20 ºC pH = 6-7 Número de moléculas = 4·1016 Figura 4.2.B.- Isoterma π-A y curva del espesor relativo de la monocapa de ácido esteárico. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 135 El brusco aumento de espesor desde 0,5 nm hasta 2,1nm se atribuye a que las moléculas de ácido graso pasan de tener una posición casi horizontal en la superficie del agua a otra completamente perpendicular a la misma con las cabezas polares ancladas en el sustrato acuoso y las colas hidrofóbicas orientadas hacia el aire. La primera disposición molecular corresponde a la fase gas, mientras que la segunda ocurre durante las fases líquido condensado y, posteriormente, sólida. En todas las experiencias realizadas se observó un leve mínimo del espesor (del orden de 0,1 nm) en el punto inmediatamente anterior al colapso. Es probable que bajo esta circunstancia de elevada presión superficial, las moléculas se hundan ligeramente en el agua en una cuantía próxima al valor mencionado. Con el fin de confirmar la orientación de las moléculas que hemos propuesto para justificar la gráfica del espesor de la monocapa, se han comparado los resultados obtenidos experimentalmente del espesor con los datos teóricos de la longitud de la cadena hidrocarbonada del ácido esteárico. Para ello, se tomó en consideración que la distancia entre dos átomos de carbono unidos por enlace simple es de 1,53 Å y que el ángulo entre los mismos es de 112° (Small, 1988) (estos datos fueron contrastados con los correspondientes a la base de datos del Centro Nacional estadounidense para la Información Biotecnológica, NBCI-pubChem). Por otra parte, se ha considerado que los dos átomos de oxígeno del grupo ácido se encuentran sumergidos en el agua, excluyéndolos en el cálculo de la longitud de la cadena hidrocarbonada. Teniendo en cuenta estas consideraciones, el valor obtenido para la longitud de la cadena fue de 2,19 nm, valor que coincide prácticamente con la medida experimental del espesor al final de la fase condesada (2,1 nm), como puede observarse en la Figura 4.2.B. Ante esta similitud de resultados, la suposición de una orientación perpendicular a la superficie del agua de las moléculas de ácido esteárico en su estado de máxima condensación parece correcta. Cuando la monocapa se halla en estado gaseoso, en los inicios de la compresión, los resultados del espesor (0,5 nm) conducen a una inclinación de las moléculas de aproximadamente 12,5° respecto a la superficie del sustrato acuoso. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 136 En la Ilustración 4.2.A se muestra una representación tridimensional de la configuración molecular de las moléculas del ácido esteárico para las fases gas y las condensadas. 12,5° Estado líquido condensado y sólido Estado gas Ilustración 4.2.A.- Representación tridimensional de la conformación molecular que presenta el ácido esteárico en los diferentes estados por los que atraviesa su monocapa. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 137 4.2.2.2 Imágenes BAM y morfología Para el análisis morfológico de la monocapa de ácido esteárico se registraron imágenes con un microscopio de ángulo de Brewster (BAM). En la Figura 4.2.C se muestra la misma Figura 4.2.B que se acaba de comentar, pero ahora incluyendo los puntos, señalados mediante letras (A-F), en los que se tomaron las imágenes microscópicas, las cuales se presentan en la Ilustración 4.2.B. La imagen A, correspondiente a grandes áreas durante la fase gas, muestra la existencia de grandes dominios de color gris claro, propios del ácido graso, rodeados o incrustados de zonas oscuras, características del sustrato acuoso. A medida que se comprime la monocapa, los dominios grisáceos se van juntando y desapareciendo las regiones oscuras (imagen B). Al llegar al área lift-off (área a la que la presión superficial y el espesor aumentan bruscamente), desaparecen por completo las zonas oscuras, convirtiéndose el ácido esteárico en único protagonista de la fotografía (imagen C). En algunas de estas imágenes se observan con claridad sectores delimitados con diferentes densidades de color en cada dominio, evidenciándose una inversión del contraste de la imagen cuando se gira el analizador. Esto es debido a que el ácido esteárico es ópticamente anisotrópico, propiedad óptica muy frecuente en las monocapas formadas por moléculas anfifílicas alargadas constituidas por un grupo polar y una cadena hidrocarbonada apolar inclinada con un determinado ángulo respecto a la superficie de la interfase. Por ello, dependiendo de la dirección desde la que se observen los dominios, la imagen exhibe un contraste diferente. Sobrepasada la fase gas, a lo largo de la fase líquido condensado, la imagen es más homogénea porque los dominios han crecido de tamaño y ocupan la mayor parte del campo de observación del microscopio. No obstante, esta imagen no es completamente homogénea como corresponde a una fase condensada (imagen D), poniéndose de manifiesto su heterogeneidad por la existencia de grandes saltos de espesor en la curva espesor-área. En la fase sólida (imagen E) desaparece la propiedad anisotrópica, presentando todos los dominios la misma densidad de color. Además, en esta imagen comienza a observarse la presencia de pequeños puntos brillantes 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 138 alineados en filamentos curvilíneos, que corresponden a la formación de “embriones” o pequeños núcleos tridimensionales de condensación, los cuales constituyen los gérmenes del colapso del film. Finalmente, en la imagen F se observa de forma nítida los numerosos núcleos tridimensionales de condensación (puntos brillantes) que han crecido en número y tamaño como consecuencia del colapso de la monocapa. Estos son los responsables de los numerosos picos de ruido observados en la curva espesor-área. 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0  (mN/m) Área (Å2/molécula) Isoterma  Espesor (nm) Tiempo (seg) A C B D E F Espesor Figura 4.2.C.- Isoterma π-A e incremento del espesor de la monocapa de ácido esteárico, extendida sobre agua a la temperatura de 20 °C. Puntos en los que se tomaron las imágenes BAM (A, B, C, D, E y F). 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 139 Ilustración 4.2.A.- Imágenes BAM de la monocapa de ácido esteárico puro, correspondientes al depósito de 4·1016 moléculas, extendida sobre agua a pH 6-7 y comprimida a la velocidad de 50 cm2/min. La barra blanca corresponde a una distancia de 20 μm. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 242 4.11.2.2 Mezcla XOA = 0,7 Tal como se observa en la Figura 4.11.F, el leve aumento de colesterol en la mezcla (XOA = 0,7) no influye en los valores de espesor registrados durante la fase gas, ya que se mantiene el valor de 0,7 nm correspondientes al ácido oleico. En las imágenes microscópicas registradas cuando la monocapa se encuentra en este estado (Imágenes A y B) se pueden observar como los dominios de ambas sustancias se encuentran perfectamente mezclados. A medida que el área molecular va decreciendo, los dominios de ambas sustancias comienzan a fusionarse (Imagen C) mientras, como aparece reflejado en el espesor, las moléculas inician un aumento de su grado de inclinación respecto a la superficie del sustrato. En este caso, la mayor presencia de colesterol en la mezcla retrasa la aparición de la imagen totalmente homogénea hasta que la presión superficial alcanza un valor de 5 mN/m aproximadamente (Imagen D). El colapso tiene lugar cuando el espesor alcanza un valor de 1,05 nm, momento en el que se pueden observar los primeros dominios o puntos correspondientes a dicho fenómeno (Imagen E). Durante este período de tiempo, los valores de espesor registrados tanto para el estado gas como para el estado de líquido expandido coinciden con los obtenidos cuando la monocapa está constituida únicamente por ácido oleico. Sin embargo, tal como se observó en el estudio de las isotermas, a presiones inferiores a 15 mN/m el área para el ácido graso puro es mayor que cuando está presente en la mezcla el colesterol, ya sea en la mezcla con XOA = 0,7 o con XOA = 0,9. En este caso, no se observa un cambio significativo en el incremento del espesor, ya que su gráfica mantiene una misma pendiente de crecimiento aunque sí se observa un aumento del ruido. Posteriormente, el espesor logra un valor de entre 1,3 y 1,4 nm, instante en el que sí aumenta de forma súbita. En este punto, en la Imagen F se observan con mayor claridad los núcleos brillantes correspondientes al colapso del film. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 243 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 Presión superficial (mN/m) Área molecular (Å2/molécula) Isoterma -A F E D C BA XOA= 0,7 Tiempo (seg) Espesor (nm) Espesor Figura 4.11.F.- Curva π-A de la monocapa mixta de ácido oleico y colesterol correspondiente a la fracción molar de XOA = 0,7 y espesor relativo obtenidas a 10 °C, depositando 4·1016 moléculas y comprimiendo a la velocidad de 50 cm2/min. Ilustración 4.11.B.- Imágenes BAM correspondientes a la monocapa mixta formada por ácido oleico y colesterol (XOA = 0,7). La barra blanca corresponde a una distancia de 20 μm. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 244 4.11.2.3 Mezcla XOA = 0,5 De nuevo el ácido oleico es el que limita el valor del espesor correspondiente al estado gas (0,7 nm) manteniéndose constante durante toda esta fase. La Imagen A nos muestra una coexistencia de dominios espumosos correspondientes al colesterol con los círculos de color gris claro propios del ácido oleico. A medida que nos acercamos a la transición de estado, observamos una imagen en la que queda patente un mayor grado de mezcla entre las dos sustancias (Imagen B). Con el inicio de la escalada del espesor, tiene lugar la propia de la presión superficial. La Imagen C, toma a una presión de 1 mN/m, muestra todavía dominios de ambas sustancias en estado gas, aunque probablemente ya nos encontremos en una fase de transición, ya que el incremento de presión nos indica que toda la superficie del sustrato acuoso está cubierta de material de la monocapa, siendo responsable de la zona homogénea parte del ácido oleico en estado de líquido expandido. Se realizó la Imagen D a la presión superficial de 10 mN/m. Nos muestra la coexistencia entre el estado gaseoso y el líquido expandido, correspondientes a los dominios de colesterol en estado gas, con bordes claros y espacios interiores abiertos, y a la imagen homogénea del ácido oleico en estado de líquido expandido, respectivamente. En esta mezcla equimolar, la imagen completamente homogénea se logra obtener finalmente cuando la presión superficial alcanza un valor de 20 mN/m (Imagen E) y se mantiene hasta que la monocapa colapsa. Dicho fenómeno viene acompañado de la captura microscópica de la Imagen F, en la que se observan los dominios brillantes de condensación propios de la ruptura de la monocapa. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 245 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 XOA= 0,5 Tiempo (seg) Espesor (nm) Espesor Presión superficial (mN/m) Área molecular (Å2/molécula) Isoterma A F A B C D E Figura 4.11.G.- Curva π -A de la monocapa mixta de ácido oleico y colesterol correspondiente a la fracción molar de XOA = 0,5 y espesor relativo obtenidas a 10 °C, depositando 4·1016 moléculas y comprimiendo a la velocidad de 50 cm2/min. Ilustración 4.11.C.- Imágenes BAM correspondientes a la monocapa mixta formada por ácido oleico y colesterol (XOA = 0,5). La barra blanca corresponde a una distancia de 20 μm. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 246 4.11.2.4 Mezcla XOA = 0,3 La mayor presencia del colesterol en la mezcla XOA = 0,3 tiene como consecuencia un importante aumento del ruido en la gráfica del espesor, principalmente durante el tiempo que la monocapa permanece en estado gas. La media de los valores de espesor registrados en esta fase es alrededor de 0,7 nm siendo, de esta forma, el ácido oleico el que marca el valor del mismo. En la Imagen A se observa la convivencia de ambas sustancias en estado gas, donde se observa, como cabe esperar, una mayor presencia de colesterol. Tal como podemos observar en la Imagen B, en los instantes previos al incremento de presión superficial, los dominios se van fusionando. Al estar presente el colesterol en mayor proporción, la monocapa se vuelve condensada y, como consecuencia, el incremento del espesor se registra antes que el de la presión superficial. La Imagen C, tomada a una presión de 10 mN/m, muestra una clara fase de transición entre el estado gas y un estado de líquido condensado (a esa presión superficial el valor del módulo de compresibilidad es de 230 mN/m). El incremento del espesor se ve ligeramente estancado con la formación de lo que se podría definir como meseta, entre los 350 y 380 segundos. Dicho estancamiento se produce a un valor de espesor de 1,1 nm, valor cercano al máximo obtenido para el ácido graso puro y, al mismo tiempo, coincide con la conformación del colesterol cuando el esterano forma un ángulo de 90° con la normal, manteniendo paralelo a la misma su radical alquílico. A la presión de 20 mN/m se observa una imagen microscópica totalmente homogénea (Imagen D) que permanece hasta que se produce el colapso, presentando los dominios brillantes típicos de ruptura de la monocapa (Imagen E). Aproximadamente, en este punto el espesor refleja un valor de 1,5 nm correspondientes al máximo valor alcanzado por el colesterol cuando su monocapa se encuentra en estado sólido previo al colapso. Al continuar la compresión, los dominios brillantes se van fusionando, teniendo como consecuencia la génesis de cristales brillantes tridimensionales (Imagen F). 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 247 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 XOA= 0,3 Tiempo (seg) Espesor (nm) Espesor Presión superficial (mN/m) Área molecular (Å2/molécula) Isoterma A F E D C BA Figura 4.11.H.- Curva π-A de la monocapa mixta de ácido oleico y colesterol correspondiente a la fracción molar de XOA = 0,3 y espesor relativo obtenidas a 10 °C, depositando 4·1016 moléculas y comprimiendo a la velocidad de 50 cm2/min. Ilustración 4.11.D.- Imágenes BAM correspondientes a la monocapa mixta formada por ácido oleico y colesterol (XOA = 0,3). La barra blanca corresponde a una distancia de 20 μm. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 248 4.11.2.5 Mezcla XOA = 0,1 Al contrario de lo que ocurría en las anteriores mezclas, en la de XOA = 0,1 el espesor correspondiente al estado gas no viene marcado por el ácido oleico debido a su baja presencia. Así pues, esta mezcla logra el mismo espesor que el del colesterol puro cuando se encuentra como único componente de una monocapa, esto es 0,25 nm. El espesor experimenta alguna subida puntual, como por ejemplo entre los 90 y 95 Å2/molécula, debido a la presencia del ácido graso. Esta circunstancia se explica por la presencia o ausencia del ácido graso omega-9 en la zona de medida del microscopio. Las Imágenes A y B muestran la gran presencia del esterol, resultando de gran dificultad el discernir algún dominio de ácido graso. A medida que disminuye el área los dominios se van fusionando, dando lugar a la Imagen C que se vuelve más homogénea, manteniendo todavía cierta superficie sin ocupar, en concreto, las zonas oscuras marcadas por el sustrato acuoso. Al tratarse de una monocapa condensada, se registra una subida repentina del espesor de igual forma que ocurría con el colesterol puro. Así pues, se logran los mismos valores, esto es, en un primer momento un espesor de 11 Å, que se ven aumentado de forma lenta pero constante debido al cambio de inclinación que sufre el resto radical alquílico del colesterol. De igual manera, al adquirir un valor de espesor relativo de 15 Å, la monocapa sufre el colapso. A la presión superficial de 10 mN/m se vuelve todo homogéneo (Imagen D) manteniéndose así hasta el colapso que tiene lugar a la presión de 45 mN/m. En este momento se observan los dominios brillantes de la Imagen E. Al proseguir con la compresión tiene lugar la formación de las estructuras cristalinas tridimensionales en forma de bastones, características del colesterol puro (Imagen F). 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 249 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 XOA= 0,1 Tiempo (seg) Espesor (nm) Espesor Presión superficial (mN/m) Área molecular (Å2/molécula) Isoterma A A B C D E F Figura 4.11.I.- Curva π-A de la monocapa mixta de ácido oleico y colesterol correspondiente a la fracción molar de XOA = 0,1 y espesor relativo obtenidas a 10 °C, depositando 4·1016 moléculas y comprimiendo a la velocidad de 50 cm2/min. Ilustración 4.11.E.- Imágenes BAM correspondientes a la monocapa mixta formada por ácido oleico y colesterol (XOA = 0,1). La barra blanca corresponde a una distancia de 20 μm. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 250 4.11.3 Área molecular media La representación del área molecular media ocupada por las monocapas mixtas en función de la fracción molar de ácido oleico a diferentes presiones superficiales se recoge en la Figura 4.11.J. A diferencia de lo que ocurría con el ácido esteárico, en este caso sí se observan desviaciones, lo que nos indica la existencia de un comportamiento no ideal de los componentes de la mezcla. Al tratarse de desviaciones negativas se pone de manifiesto la presencia de atracciones intermoleculares. 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 Área (Å2/molécula) XOA  = 2,5 mN/m  = 5 mN/m  = 10 mN/m  = 15 mN/m  = 20 mN/m  = 25 mN/m  = 30 mN/m En casi todos los casos se observa el incumplimiento de la ley de la aditividad de las áreas, poniéndose de manifiesto que cuando la representación se hace a una presión superficial superior a 10 mN/m, la pendiente de la recta es negativa, mientras que a presiones superficiales inferiores las pendientes son positivas. Figura 4.11.J.- Representación del área molecular media ocupada por las monocapas mixtas de ácido oleico y colesterol a diferentes presiones superficiales y en función de la fracción molar de OA a 10 °C. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 251 4.11.4 Funciones de exceso 4.11.4.1 Área de exceso La representación del área de exceso frente a la fracción molar (Figura 4.11.K) confirma, tal como cabría esperar, la existencia de desviaciones negativas respecto al comportamiento ideal. Estas desviaciones son más importantes cuanto menor sea la presión superficial, alcanzándose los mayores valores negativos en la mezcla de fracción molar 0,5. 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 -5,0 -4,5 -4,0 -3,5 -3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 Aexc (Å2/molécula) XOA  = 2,5 mN/m  = 5 mN/m  = 10 mN/m  = 15 mN/m  = 20 mN/m  = 25 mN/m  = 30 mN/m Resultados similares fueron obtenidos por otros autores (Hac-Wydro & Wydro, The influence of fatty acids on model cholesterol/phospholipid membranes, 2007) (Seoane, Miñones, Conde, Iribarnegaray, & Casas, Interactions between Amphotericin B and Sterols in Monolayers. Mixed Films of Amphotericin B-Cholesterol, 1999). Figura 4.11.K.- Representación del área de exceso a diferentes presiones superficiales de monocapas mixtas de ácido oleico y colesterol en función de la fracción molar de OA a 10 °C. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 258 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) Colesterol 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) XLA= 0,1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) XLA= 0,3 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) XLA= 0,5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) XLA= 0,7 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) XLA= 0,9 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) Ácido Linoleico Figura 4.12.D.- Representación de los módulos de compresibilidad frente a la presión superficial de monocapas de ácido linoleico, colesterol y de mezclas de ambos con diferentes fracciones molares (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9) obtenidas a 10 °C, pH = 6-7, depositando 4·1016 moléculas y comprimidas a la velocidad de 50 cm2/min. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 259 Módulo de compresibilidad (mN/m) XLA π = 2,5 π = 5 π = 10 π = 15 π = 20 π = 25 Cs-1 máximo Colesterol 289,41 353,18 373,91 562,99 731,55 788,63 790,6 0,1 165,44 192,2 311,71 397,77 390,64 449,94 533,11 0,3 122,19 154,52 287,4 340,91 329,32 345,82 366,78 0,5 49,5 85,17 207,13 266,89 269,79 229,65 276,25 0,7 28,32 47,49 114,16 160,31 186,85 152,73 191,75 0,9 23,63 44,37 73,58 102,12 125,98 124,86 129,77 Ácido Linoleico 18,73 29,21 48,61 68,23 85,4 91,64 95,43 Tabla 4.12.A.- Valores de los módulos de compresibilidad a diferentes presiones superficiales de monocapas mixtas de ácido linoleico y colesterol a diferentes fracciones molares (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9). 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 260 4.12.2 Microscopía BAM. Imágenes y espesor mezcla 4.12.2.1 Mezcla XLA = 0,9 Durante la fase gas, la mezcla XLA = 0,9 registra un espesor de 0,66 nm (Figura 4.12.M), valor que coincide con el espesor de la monocapa de ácido linoleico puro en fase gas y que resulta notablemente superior respecto a los 0,25 nm obtenidos con el colesterol puro cuando atraviesa ese mismo estado. Esta circunstancia indica que el valor del espesor viene determinado por el ácido linoleico. Al principio de la compresión se observan dominios en forma de espuma iguales que los registrados en la monocapa de este ácido graso omega-6 puro (Imagen A) con huecos oscuros correspondientes al sustrato acuoso. A medida que se reduce el área, las zonas oscuras adoptan un tamaño menor (Imagen B) debido a que la monocapa comienza a ocupar toda la superficie disponible. Se registró la Imagen C a un área de 60 Å2/molécula en la que todavía se ven pequeños dominios que nos indican que el film todavía se encuentra en fase gas. Con el inicio del aumento de la presión superficial tiene lugar un aumento progresivo del espesor hasta alcanzar aproximadamente 1 nm, valor ligeramente superior al obtenido por el ácido graso puro en este punto de la monocapa (1,08 nm). Así pues, las moléculas del colesterol se muestran durante esta fase de líquido expandido en una posición inclinada, interaccionando con el ácido graso, de lo contrario se obtendrían valores más elevados de espesor. En esta zona de la isoterma, se obtiene la Imagen D, una fotografía homogénea característica de esta fase de líquido expandido. Coincidiendo con el máximo valor de espesor registrado para el estado de líquido expandido, se produce el colapso de la monocapa, dando lugar a un aumento más pronunciado del espesor hasta los 1,37 nm. Este espesor es 0,5 nm inferior al del colapso del colesterol puro. Al producirse el colapso de la monocapa se tomó la Imagen E, en la que se observan los dominios brillantes característicos de la ruptura de la monocapa por caída y solapamiento de moléculas. Al reducir el área de compresión, el número de estas estructuras va en aumento así como su tamaño puesto que se unen dando lugar a dominios de mayor tamaño y, por lo tanto, se observan con mayor brillo (Imagen F). 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 261 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 0 5 10 15 20 25 30 35 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 Presión superficial (mN/m) Área molecular (Å2/molécula) Isoterma A XLA= 0,9 A B C D E F Tiempo (seg) Espesor (nm) Espesor Ilustración 4.12.A.- Imágenes BAM correspondientes a la monocapa mixta formada por ácido linoleico y colesterol (XLA = 0,9). La barra blanca corresponde a una distancia de 20 μm. Figura 4.12.E.- Curva π-A de la monocapa mixta de ácido linoleico y colesterol correspondiente a la fracción molar de XLA = 0,9 y espesor relativo obtenidas a 10 °C, depositando 4·1016 moléculas y comprimiendo a la velocidad de 50 cm2/min. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 262 4.12.2.2 Mezcla XLA = 0,7 En la Figura 4.12.F se puede observar como al inicio de la compresión el espesor registrado para la monocapa de la mezcla XLA = 0,7 es de 0,67 nm, el mismo valor que se registró para la monocapa de ácido linoleico puro. Las imágenes microscopias correspondientes a esta fase (Imágenes A y B) presentan huecos oscuros de sustrato acuoso, rodeados por material de monocapa en el que se observan dominios grises más oscuros y otros más claros, mostrándose así una buena interacción de ambos compuestos durante el estado gas. Al aproximarse la monocapa al área inicial, los dominios se reducen, mostrando una tendencia hacia una imagen homogénea (Imagen C). Coincidiendo con el incremento de presión superficial, el espesor sufre una subida lenta e irregular, logrando un espesor aproximado de 1,12 nm, muy próximo al obtenido por el ácido graso puro en el momento previo al colapso, cuando sus moléculas se encuentran prácticamente perpendicular a la superficie. Esta curva de espesor relativo no muestra una subida repentina, lo cual indica que las moléculas de colesterol han experimentado un incremento gradual de su inclinación, de la misma forma que el ácido graso, debido a una interacción entre ambas sustancias. Durante esta fase de líquido expandido se toma la Imagen D, la cual se muestra de forma completamente homogénea. Esta misma imagen se observó desde el primer momento que la presión superficial inicia su subida hasta que se produce el colapso del film. Por último, el colapso muestra de nuevo los dominios característicos del mismo. En un primero momento, pequeños puntos como consecuencia de la pérdida molecular desde la monocapa (Imagen E). Se observa en la Imagen F de forma nítida como aumentan en tamaño, número y brillo al reducirse el área disponible. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 263 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 0 5 10 15 20 25 30 35 40 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 Presión superficial (mN/m) Área molecular (Å2/molécula) Isoterma -A XLA= 0,7 Tiempo (seg) Espesor (nm) Espesor A B C D E F Figura 4.12.F.- Curva π-A de la monocapa mixta de ácido linoleico y colesterol correspondiente a la fracción molar de XLA = 0,7 y espesor relativo obtenidas a 10 °C, depositando 4·1016 moléculas y comprimiendo a la velocidad de 50 cm2/min. Ilustración 4.12.B.- Imágenes BAM correspondientes a la monocapa mixta formada por ácido linoleico y colesterol (XLA = 0,7). La barra blanca corresponde a una distancia de 20 μm. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 264 4.12.2.3 Mezcla XLA = 0,5 Los valores de espesor registrados al inicio de la compresión coincidiendo con la monocapa en estado gas muestran la misma situación que las vistas anteriormente (Figura 4.12.G). Esta mezcla equimolar mantiene durante toda esta fase un espesor promedio de 0,67 nm. correspondiente, como se vio, al propio de la monocapa del ácido graso puro. Las Imágenes A y B, tomadas a elevados valores de área superficial, muestran dominios de ambos componentes en su estado gaseoso. A medida que continúa la compresión, el área molecular disponible se reduce y las zonas oscuras correspondientes al sustrato acuoso desaparecen. La Imagen C muestra una gran reducción de estas zonas oscuras, mientras que los dominios de las mezclas ocupan la totalidad de la superficie disponible. Posteriormente y de forma simultánea a la presión superficial, se produce el incremento de espesor de forma paulatina, siendo este hecho un indicador del cambio de posición experimentado por las moléculas que conforman la mezcla. Así pues, las moléculas empiezan a adoptar una posición cada vez más vertical, produciéndose un cambio de estado en la monocapa, pasando a comportarse como un líquido expandido. El hecho de que el espesor no sufra una subida repentina indica que las moléculas de colesterol se encuentran interaccionando con las del ácido graso omega6. Durante esta fase de líquido expandido, se observa al principio en la Imagen D ciertos dominios a π = 10 mN/m, debido al cambio de configuración por parte de las moléculas que componen la mezcla. Posteriormente se observa una imagen completamente homogénea. El colapso ofrece dominios brillantes característicos (Imagen E). Al disminuir el área se ven con mayor claridad e intensidad como se puede observar en la Imagen F. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 265 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 XLA= 0,5 Tiempo (seg) Espesor (nm) Espesor Presión superficial (mN/m) Área molecular (Å2/molécula) Isoterma A A B C D E F Figura 4.12.G.- Curva π-A de la monocapa mixta de ácido linoleico y colesterol correspondiente a la fracción molar de XLA = 0,5 y espesor relativo obtenidas a 10 °C, depositando 4·1016 moléculas y comprimiendo a la velocidad de 50 cm2/min. Ilustración 4.12.C.- Imágenes BAM correspondientes a la monocapa mixta formada por ácido linoleico y colesterol (XLA = 0,5). La barra blanca corresponde a una distancia de 20 μm. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 266 4.12.2.4 Mezcla XLA = 0,3 Durante el estado gas, la monocapa mixta de ácido linoleico y colesterol con XLA = 0,3 presenta un valor de espesor de entre 0,65 y 0,7 nm (Figura 4.12.H). La Imagen A muestra dominios característicos de ambos compuestos durante esta fase en la que, a medida que el área disponible para las moléculas va disminuyendo, las zonas oscuras correspondientes al sustrato acuoso van desapareciendo (Imagen B). Se observan grandes dominios delimitados por pequeñas zonas más claras que corresponden a colesterol y ácido linoleico respectivamente (Imagen C). El registro del espesor muestra una transición a estado líquido expandido marcada por una subida, la cual presenta una mayor pendiente que las vistas con anterioridad, alcanzando un valor inferior a 1 nm. Esta subida repentina viene determinada por la mayoría de moléculas de colesterol frente a las de ácido graso, de tal forma que en esta mezcla se produce una interacción más débil entre ambas sustancias. Posteriormente, el espesor continúa su ascenso con bastante ruido en un primer momento hasta que, a partir de 1,15 nm, éste se estabiliza. Teniendo en cuenta dicho valor, característico del inicio de la fase condensada del colesterol puro, es muy probable que esta circunstancia se deba a que las moléculas ya se encuentran en una posición perpendicular respecto al sustrato y que el posterior incremento del espesor sea debido al cambio de configuración del resto radical alifático propio del colesterol. La Imagen D muestra una imagen homogénea salpicada por ciertas líneas brillantes correspondientes a las moléculas del ácido linoleico que en este punto se encuentran cambiando de configuración. Posteriormente la imagen se vuelve homogénea hasta producirse el colapso de la monocapa. El colapso muestra un registro de espesor de 1, 37 nm, 0,13 nm inferior al esperado para el colesterol. La Imagen E muestra los típicos dominios brillantes correspondientes a la pérdida y solapamiento de moléculas dando lugar a la destrucción de la monocapa. Estos dominios ven aumentado su tamaño y brillo al disminuir el área, llegando a observarse la formación de pequeñas estructuras con formas de “bastones” características del esterol (Imagen F). 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 267 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 XLA= 0,3 Tiempo (seg) Espesor (nm) Espesor Presión superficial (mN/m) Área molecular (Å2/molécula) Isoterma A A B C D E F Ilustración 4.12.D.- Imágenes BAM correspondientes a la monocapa mixta formada por ácido linoleico y colesterol (XLA = 0,3). La barra blanca corresponde a una distancia de 20 μm. Figura 4.12.H.- Curva π-A de la monocapa mixta de ácido linoleico y colesterol correspondiente a la fracción molar de XLA = 0,3 y espesor relativo obtenidas a 10 °C, depositando 4·1016 moléculas y comprimiendo a la velocidad de 50 cm2/min. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 274 De la misma forma, el colapso de las mezclas ocurre a valores de presión superficial intermedios a los de los componentes puros y su valor se ve incrementado al aumentar la presencia de colesterol (interior Figura 4.13.A), lo cual nos indica que la mezcla está compuesta por componentes miscibles. En la Figura 4.13.B. se muestran los módulos de compresibilidad. En la misma, se pone de manifiesto el elevado poder de condensación que presenta el colesterol sobre los ácidos grasos insaturados. Así, la resistencia de las monocapas de las mezclas a ser comprimidas aumenta a medida que el colesterol se encuentra más presente. De la misma forma, la adición de ácido linoleico provoca una disminución en la rigidez de las monocapas. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Módulo de compresibilidad Cs-1 (mN/m) Presión superficial (mN/m) Ácido Linolénico XLA= 0,9 XLA= 0,7 XLA= 0,5 XLA= 0,3 XLA= 0,1 Colesterol La elevada condensación ejercida por parte del colesterol sobre este ácido graso omega-3 se observa con mayor nitidez en la representación tridimensional del módulo de compresibilidad frente a la presión superficial (Figura 4.13.C). Figura 4.13.B.- Módulos de compresibilidad correspondientes a las isotermas π-A de monocapas de ácido α-linolénico, colesterol y de mezclas de ambos con diferentes fracciones molares (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9). 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 275 0 100 200 300 400 500 600 700 800 C o l e s t e r o l 01 03 05 07 09 Á c id o - L in o lé n ic o 0 10 20 30 40 50 Fracción molar Colesterol XLA= 0,1 XLA= 0,3 XLA= 0,5 XLA= 0,7 XLA= 0,9 Ácido -Linolénico P resión S uperficial (m N /m ) C-1 s  En la Figura 4.13.D se muestran los módulos de compresibilidad individuales para cada mezcla. Los valores de módulo de compresibilidad a diferentes presiones superficiales así como los valores máximos alcanzados correspondientes a estos sistemas se recogen en la Tabla 4.13.A. Figura 4.13.C.- Representación tridimensional de los módulos de compresibilidad frente a la presión de monocapas de ácido α-linolénico, colesterol y de mezclas de ambos con diferentes fracciones molares (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9) obtenidas a 10 °C. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 276 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) Colesterol 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) X-LA= 0,1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) X-LA= 0,3 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) X-LA= 0,5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) X-LA= 0,7 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) X-LA= 0,9 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) Ácido Linolénico Figura 4.13.D.- Representación de los módulos de compresibilidad frente a la presión superficial de monocapas de ácido α-linolénico, colesterol y de mezclas de ambos con diferentes fracciones molares (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9) obtenidas a 10 °C, pH = 6-7, depositando 4·1016 moléculas y comprimidas a la velocidad de 50 cm2/min. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 277 Módulo de compresibilidad (mN/m) XαLA π = 2,5 π = 5 π = 10 π = 15 π = 20 π = 25 Cs-1 máximo Colesterol 289,41 353,18 373,91 562,99 731,55 788,63 790,6 0,1 213,15 249,05 353,85 477,81 561,87 670,46 717,95 0,3 142,03 180,38 328,65 438,13 446,38 400 454,4 0,5 31,22 59,31 167,22 236,57 251,73 202,9 252,4 0,7 18,73 26,96 81,61 119,29 144,7 120,18 146,04 0,9 15,39 28,32 53,96 75,36 91,19 90,97 95,88 Ácido αLinolénico 15,3 25,64 47,27 64,21 80,49 77,81 87,63 Tabla 4.13.A.- Valores de los módulos de compresibilidad a diferentes presiones superficiales de monocapas mixtas de ácido α-linolénico y colesterol a diferentes fracciones molares (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9). 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 278 4.13.2 Microscopía BAM. Imágenes y espesor mezcla 4.13.2.1 Mezcla XαLA = 0,9 Las imágenes microscópicas correspondientes a la mezcla que presenta el menor contenido en colesterol (XαLA = 0,9) vuelven a presentar aparentemente una evidente ausencia de dominios durante el estado gas de la misma forma que ocurría con el ácido α-linolénico puro. Sin embargo, sí se aprecian con cierta dificultad multitud de microdominios de tamaño inferior a 1 µm (Imágenes A y B). Esta diferencia respecto a las imágenes obtenidas para la monocapa de este ácido graso omega-3 se debe, sin lugar a dudas, a la presencia del colesterol en la mezcla. Se registró un valor de espesor de alrededor de 0,55 nm. durante el estado gas, valor ligeramente superior al obtenido para el ácido graso puro (0,51 nm.). Poco antes de cumplirse los 250 segundos desde el inicio del experimento, se produce el aumento simultáneo de espesor y presión superficial, momento en el cual la monocapa pasa de un estado gas a otro de líquido expandido. La Imagen C, realizada a la presión de 10 mN/m, confirma este hecho mostrando la típica fotografía homogénea característica de dicha fase. A medida que transcurre, las moléculas que constituyen el film ven incrementado su ángulo de inclinación respecto de la interfaz acuosa. En el instante del colapso, la monocapa presenta un espesor de 0,88 nm, valor consistente con el obtenido para la monocapa del ácido graso puro. De la misma forma, esto también nos indica que el colesterol no se encuentra perpendicular al sustrato acuoso, sino que presenta una inclinación de, aproximadamente, 50°. La Imagen D, tomada a la presión superficial de 26 mN/m, muestra los “embriones” o gérmenes del colapso de la monocapa. Estos pequeños puntos aumentan su tamaño y brillo al continuar la compresión de las moléculas. Esta evolución aparece reflejada en las Imágenes E y F. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 279 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 0 5 10 15 20 25 30 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 Presión superficial (mN/m) Área molecular (Å2/molécula) Isoterma A XLA= 0,9 A B C D E F Tiempo (seg) Espesor (nm) Espesor Figura 4.13.E.- Curva π-A de la monocapa mixta de ácido α-linolénico y colesterol correspondiente a la fracción molar de XαLA = 0,9 y espesor relativo obtenidas a 10 °C, depositando 4·1016 moléculas y comprimiendo a la velocidad de 50 cm2/min. Ilustración 4.13.A.- Imágenes BAM correspondientes a la monocapa mixta formada por ácido alfa linolénico y colesterol (XαLA = 0,9). La barra blanca corresponde a una distancia de 20 μm. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 280 4.13.2.2 Mezcla XαLA = 0,7 El incremento de la presencia de colesterol en la mezcla (XαLA = 0,7) no parece mejorar la visualización de los dominios de ácido graso en las fotografías, tal como se observa en las Imágenes A y B. El espesor registrado por el microscopio durante el estado gas es ligeramente inferior a 0,5 nm. Dicho valor viene determinado por la molécula que en ese instante presenta una mayor “altura”. Cuando la monocapa de los componentes puros se encuentra en estado gas, el colesterol presenta un valor de aproximadamente 0,25 nm, mientras que el ácido α-linolénico muestra un espesor de 0,51 nm. Por lo tanto, es razonable pensar que mientras la monocapa atraviesa el estado gaseoso ambas moléculas presentarán su disposición e inclinación original. Posteriormente, con el cambio de estado, la imagen microscópica se vuelve homogénea durante la totalidad del tiempo en que transcurre la monocapa en estado líquido expandido (Imágenes C y D). Con el aumento de presión superficial, la inclinación de las moléculas se verá incrementada de tal forma que sus partes apolares se alejarán del sustrato acuoso. En este caso, el valor de espesor alcanzado en el instante previo al colapso de la monocapa es de 0,97 nm. Ya que se trata de una distancia superior a la registrada para el omega-3 en estado puro, es lógico atribuir dicho valor a la molécula del colesterol. Para ese valor, se calcula que el ángulo de inclinación del mismo sería aproximadamente de 57,5°. Finalmente se muestran las Imágenes E y F con los dominios brillantes claros correspondientes al fenómeno de colapso en una fase más temprana y otra más madura, respectivamente. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 281 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 0 5 10 15 20 25 30 35 40 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 Presión superficial (mN/m) Área molecular (Å2/molécula) Isoterma -A XLA= 0,7 Tiempo (seg) Espesor (nm) A B C E F D Espesor Figura 4.13.F.- Curva π-A de la monocapa mixta de ácido α-linolénico y colesterol correspondiente a la fracción molar de XαLA = 0,7 y espesor relativo obtenidas a 10 °C, depositando 4·1016 moléculas y comprimiendo a la velocidad de 50 cm2/min. Ilustración 4.13.B.- Imágenes BAM correspondientes a la monocapa mixta formada por ácido alfa linolénico y colesterol (XαLA = 0,7). La barra blanca corresponde a una distancia de 20 μm. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 282 4.13.2.3 Mezcla XαLA = 0,5 La mezcla equimolar de ácido α-linolénico y colesterol permite observar los dominios del ácido graso. En las Imágenes A y B se puede ver con claridad esferas claras de pequeño tamaño correspondientes al ácido graso rodeadas por los clásicos dominios espumosos del esterol. El espesor, al igual que en las anteriores mezclas, se mantiene en 0,5 nm indicativo de que las moléculas del ácido α-linolénico presentan la misma configuración en estado gas con colesterol que cuando se encuentran constituyendo una monocapa en solitario. La Imagen C se realizó cuando la presión superficial era de 1 mN/m. Se observa que, como consecuencia de la fusión de los dominios, empieza a volverse homogénea. En este punto se produce un cambio de estado de gas a líquido expandido. El estado de líquido expandido de la monocapa mixta presenta una imagen homogénea (Imagen D) y concurre con una subida del espesor que presenta dos pendientes diferentes: una primera sección desde los 0,5 nm hasta 0,87 nm, donde se produce un incremento más veloz y ruidoso y, una segunda, desde 0,87 hasta 1,17 nm donde se observa una disminución de la pendiente así como del ruido. Teniendo en cuanta ambos incrementos así como los espesores que generan ambas sustancias puras en sus respectivas monocapas, es lógico pensar que la primera región pueda tratarse del cambio configuracional experimentado por el ácido graso, mientras que que la segunda sección se corresponde, probablemente, con el giro experimentado por el radical alquílico del colesterol. Sin embargo, el hecho de que no se alcancen los 1,5 nm característicos de la molécula de colesterol cuando esta se encuentra en su conformación más extensa nos indica que el ciclopentanoperhidrofenantreno no se encuentra perpendicular a la normal de la interfase, sino inclinado con un ángulo aproximado de entre 46° y 49° debido a un impedimento estérico provocado por este ácido graso omega-3. El colapso de la monocapa mixta da lugar a la formación de los dominios brillantes o núcleos tridimensionales (Imagen E) cuyo número y tamaño se ven incrementados a medida que prosigue la compresión tal como se muestra en la Imagen F. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 283 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 XLA= 0,5 Tiempo (seg) Espesor (nm) Espesor F A B C D E Presión superficial (mN/m) Área molecular (Å2/molécula) Isoterma A Figura 4.13.G.- Curva π-A de la monocapa mixta de ácido α-linolénico y colesterol correspondiente a la fracción molar de XαLA = 0,5 y espesor relativo obtenidas a 10 °C, depositando 4·1016 moléculas y comprimiendo a la velocidad de 50 cm2/min. Ilustración 4.13.C.- Imágenes BAM correspondientes a la monocapa mixta formada por ácido alfa linolénico y colesterol (XαLA = 0,5). La barra blanca corresponde a una distancia de 20 μm. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 290 4.13.4.2 Energía libre de exceso (ΔGexc) El análisis termodinámico de la interacción entre el ácido α-linolénico y el colesterol en monocapas, mediante el cálculo de la energía libre de exceso (ΔGexc), se muestra en la Figura 4.13.L. Los valores obtenidos son todos negativos a cualquier fracción molar del sistema y a cualquier presión superficial. Esta situación se corresponde con las condiciones termodinámicas de los sistemas de monocapas binarias en las que se producen interacciones de tipo atractivo entre sus componentes. 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 -1600 -1400 -1200 -1000 -800 -600 -400 -200 0 -1600 -1400 -1200 -1000 -800 -600 -400 -200 0 Gexc (J/mol) Fracción molar LA 2,5 5 10 15 20 25 Los valores de energía libre de exceso se vuelven más negativos al aumentar la presión superficial, lo que nos indica que la interacción entre estos dos componentes es mayor a elevadas presiones. Los mayores valores se alcanzan con la fracción molar de XαLA = 0,5 del sistema αLA/COL. Esto nos indica que los films más estables formados por ácido α-linolénico y colesterol se obtienen con una proporción de 1:1. Figura 4.13.L.- Representación de la energía libre de exceso para el sistema αLA/COL frente a la fracción molar de ácido linoleico en dicha mezcla, a los valores de presión superficial indicados. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 291 4.14 MEZCLA DE ÁCIDO ɣ-LINOLÉNICO CON COLESTEROL 4.14.1 Isotermas π-A y módulos de compresibilidad El comportamiento de las monocapas de la mezcla ácido ɣ-linolénico y colesterol (Figura 4.14.A) es muy similar a las observadas en el sistema de ácido α-linolénico y colesterol. En efecto, cuando la fracción molar de ácido ɣ-linolénico es menor a 0,5 las isotermas obtenidas muestran que las monocapas presentan un estado de tipo sólido (curvas 0,1 y 0,3), con una forma muy similar a la del propio colesterol. Cuando su proporción es mayor a 0,5 las monocapas son de tipo líquido expandido (curvas 0,7 y 0,9), similares al del ácido ɣ-linolénico puro. La isoterma correspondiente a la monocapa de mezcla equimolar presenta un comportamiento intermedio. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Presión superficial (mN/m) Área molecular (Å2/molécula) Ácido Linolénico XLA= 0,9 XLA= 0,7 XLA= 0,5 XLA= 0,3 XLA= 0,1 Colesterol Figura 4.14.A.- Curvas π-A de monocapas de ácido ɣ-linolénico, colesterol y de mezclas de ambos con diferentes fracciones molares (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9) obtenidas a 10 °C, depositando 4·1016 moléculas y comprimiendo a la velocidad de 50 cm2/min. En la gráfica interna se muestran los valores de colapso frente a la fracción molar. 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 25 30 35 40 45 Presión de colapso (mN/m) XLA 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 292 El colapso de las mezclas ocurre a valores de presión superficial intermedios entre los de los componentes puros, y su valor se ve incrementado al aumentar la presencia de colesterol (interior Figura 4.14.A), lo cual nos indica que los dos componentes son miscibles. En la Figura 4.14.B. se muestran los módulos de compresibilidad. En la misma, se pone de manifiesto el elevado poder de condensación que presenta el colesterol sobre los ácidos grasos insaturados. Se puede observar como aumenta la resistencia de las monocapas de las mezclas a ser comprimidas a medida que el colesterol se encuentra más presente. De la misma forma, la adición de ácido linoleico provoca una disminución en la rigidez de las monocapas. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Módulo de compresibilidad Cs-1 (mN/m) Presión superficial (mN/m) Ácido Linolénico XLA= 0,9 XLA= 0,7 XLA= 0,5 XLA= 0,3 XLA= 0,1 Colesterol Figura 4.14.B.- Módulos de compresibilidad correspondientes a las isotermas π-A de monocapas de ácido ɣ-linolénico, colesterol y de mezclas de ambos con diferentes fracciones molares (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9). 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 293 Para observar con mayor claridad el efecto condensador del colesterol en la monocapa de ácido ɣ-linolénico se representó el módulo de compresibilidad en tres dimensiones frente a la presión superficial (Figura 4.14.C). 0 100 200 300 400 500 600 700 800 C o l e s t e r o l 01 03 05 07 09 Á c id o - L in o lé n ic o 0 10 20 30 40 50 Fracción molar Colesterol XLA= 0,1 XLA= 0,3 XLA= 0,5 XLA= 0,7 XLA= 0,9 Ácido -Linolénico P resión S uperficial (m N /m ) C-1 s  En la Figura 4.14.D se muestra el análisis individual del módulo de compresibilidad para cada fracción molar de la mezcla de ácido ɣ-linolénico y colesterol, cuyos valores de mayor relevancia vienen recogidos en la Tabla 4.14.A para los valores de presión indicados. Figura 4.14.C.- Representación tridimensional de los módulos de compresibilidad frente a la presión de monocapas de ácido ɣ-linolénico, colesterol y de mezclas de ambos con diferentes fracciones molares (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9). 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 294 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) Colesterol 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) XLA= 0,1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) XLA= 0,3 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) XLA= 0,5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) XLA= 0,7 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) XLA= 0,9 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) Ácido Linolénico Figura 4.14.D.- Representación de los módulos de compresibilidad frente a la presión superficial de monocapas de ácido ɣ-linolénico, colesterol y de mezclas de ambos con diferentes fracciones molares (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9) obtenidas a 10 °C, pH = 6-7, depositando 4·1016 moléculas y comprimidas a la velocidad de 50 cm2/min. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 295 Módulo de compresibilidad (mN/m) XɣLA π = 2,5 π = 5 π = 10 π = 15 π = 20 π = 25 Cs-1 máximo Colesterol 289,41 353,18 373,91 562,99 731,55 788,63 790,6 0,1 183,05 207,13 337,35 416,72 420,29 427,2 458,19 0,3 57,08 80,94 166,78 233,44 238,13 215,38 244,59 0,5 28,76 45,71 68 123,75 155,63 115,5 156,3 0,7 22,74 33,67 48,83 80,04 97,21 83,17 97,66 0,9 20,29 29,65 50,84 68,67 72,46 75,81 79,6 Ácido ɣLinolénico 18,51 28,76 44,82 59,75 68,23 67,34 72,91 Tabla 4.14.A.- Valores de los módulos de compresibilidad a diferentes presiones superficiales de monocapas mixtas de ácido ɣ-linolénico y colesterol a diferentes fracciones molares (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9). 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 296 4.14.2 Microscopía BAM. Imágenes y espesor mezcla 4.14.2.1 Mezcla XɣLA = 0,9 El valor del espesor de la monocapa de la mezcla de colesterol y ácido ɣlinolénico de fracción molecular XɣLA = 0,9 durante el estado gas es muy similar al obtenido para la monocapa del ácido graso puro (0,52 nm). A lo largo de esta fase se observan con claridad la presencia de dominios circulares de un diámetro de entre 3 y 6 µm rodeados de zonas oscuras correspondientes al sustrato acuoso (Imágenes A, B y C). En el caso del ácido α-linolénico, la imagen para esta misma fracción molar apenas permitía diferenciar sus dominios debido a su ínfimo tamaño y a la baja tendencia que presentaban sus moléculas a agruparse. En el caso del ácido ɣ-linolénico se observan con gran claridad, probablemente porque presente una menor tendencia a expandirse respecto a su isómero omega-3. Dichos dominios se van fusionando a medida que se reduce la superficie disponible para la monocapa, logrando una imagen completamente homogénea en el instante en el que la presión superficial y el espesor relativo inician su incremento, permaneciendo así durante toda la fase de líquido expandido (Imagen D). Como vimos, la monocapa presenta un espesor inicial marcado por el ácido ɣlinolénico y, en el momento de la ruptura de la monocapa, despliega un valor muy próximo al del propio ácido graso cuando alcanza el colapso al formar monocapa por sí solo (0,85 nm). Estos datos indican que en el momento del colapso el ácido ɣ-linolénico se encuentra inclinado unos 45° mientras el colesterol alcanza aproximadamente los 48° manteniendo el resto radical alquílico paralelo a la superficie del sustrato acuoso. El colapso de la monocapa concurre primero con la formación de gérmenes de colapso, pequeños puntos que nos indican la expulsión de moléculas desde el film (Imagen E) y, posteriormente, con la maduración de estas estructuras mediante aglomeración en forma de dominios tridimensionales brillantes tal como muestra la Imagen F. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 297 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 0 5 10 15 20 25 30 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 Presión superficial (mN/m) Área molecular (Å2/molécula) Isoterma A XLA= 0,9 A B C D E F Tiempo (seg) Espesor (nm) Espesor Figura 4.14.E.- Curva π-A de la monocapa mixta de ácido ɣ-linolénico y colesterol correspondiente a la fracción molar de XɣLA = 0,9 y espesor relativo obtenidas a 10 °C, depositando 4·1016 moléculas y comprimiendo a la velocidad de 50 cm2/min. Ilustración 4.14.A.- Imágenes BAM correspondientes a la monocapa mixta formada por ácido gamma linolénico y colesterol (X = 0,9). La barra blanca corresponde a una distancia de 20 μm. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 298 4.14.2.2 Mezcla XɣLA = 0,7 El incremento de la presencia de colesterol en la mezcla (XɣLA = 0,7) no muestra influencias sobre el espesor del estado gas de la monocapa. Se mantiene en 0,52 nm hasta que se produce el cambio de estado a líquido expandido. En la Imagen A se observan dominios del ácido graso y alguna forma espumosa correspondiente al esterol. Al disminuir la superficie disponible para las moléculas, los dominios se van fusionando tal como se puede observar en las Imágenes B y C. Los simultáneos incrementos de presión superficial y de espesor marcan el cambio de estado. La imagen microscópica obtenida a lo largo del estado de líquido expandido se mantiene en todo momento homogénea (Imagen D). Durante esta fase el espesor asciende paulatinamente mostrando un elevado ruido y alcanzando un valor aproximado de 0,93 nm en el punto de colapso. Dicho valor supera el alcanzado por el ácido graso objeto de estudio cuando colapsa su film puro. Por lo tanto, el valor vendrá determinado por una mayor inclinación de la molécula de colesterol, concretamente del ángulo que presenta el ciclopentanofenantreno respecto de la interfase. Mediante los cálculos trigonométricos se determina que para un espesor de 0,93 nm, el colesterol se encontrará inclinado unos 54° en el punto inmediatamente anterior al colapso de la monocapa. El colapso ocurre cuando el área correspondiente a cada molécula es de 35 Å2. El microscopio ofrece una visualización clara de los “embriones” o gérmenes de colapso, como se observa en la Imagen E fruto de la expulsión de moléculas del film. A menores áreas, estos dominios se agrupan formando estructuras tridimensionales mediante aglomeración, mostrados en forma de puntos blancos brillantes debido al elevado valor de espesor que registra el microscopio (Imagen F). 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 299 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 0 5 10 15 20 25 30 35 40 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 Presión superficial (mN/m) Área molecular (Å2/molécula) Isoterma -A XLA= 0,7 Tiempo (seg) Espesor (nm) Espesor A B C D E F Figura 4.14.F.- Curva π-A de la monocapa mixta de ácido ɣ-linolénico y colesterol correspondiente a la fracción molar de XɣLA = 0,7 y espesor relativo obtenidas a 10 °C, depositando 4·1016 moléculas y comprimiendo a la velocidad de 50 cm2/min. Ilustración 4.14.B.- Imágenes BAM correspondientes a la monocapa mixta formada por ácido gamma linolénico y colesterol (XɣLA = 0,7). La barra blanca corresponde a una distancia de 20 μm. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 306 4.14.3 Área molecular media La representación del área molecular media en función de la fracción molar de ácido ɣlinolénico, medida a diferentes presiones superficiales da origen a las curvas que se muestran en la Figura 4.14.J. En ella se pone de manifiesto la existencia de desviaciones de la ley de aditividad de las áreas a diferentes valores de presión superficial. Dichas desviaciones son negativas y más acusadas cuanto menor sea la presión. 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 35 40 45 50 55 60 65 Área (Å2/molécula) Fracción molar  = 2,5 mN/m  = 5 mN/m  = 10 mN/m  = 15 mN/m  = 20 mN/m  = 25 mN/m Figura 4.14.J.- Representación del área molecular media frente a la fracción molar de ácido ɣ-linolénico de la mezcla ɣLA/COL, a los valores de presión superficial indicados. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 307 4.14.4 Funciones de exceso 4.14.4.1 Área de exceso El área de exceso frente a la fracción molar del ácido ɣ-linolénico se muestra en la Figura 4.14.K. Todos los valores determinados son negativos a todas las presiones superficiales. Las mayores desviaciones del comportamiento ideal se obtienen en las mezclas de composición 0,5 y 0,3 de ácido graso, siendo estas desviaciones menores con el aumento de la presión. 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 Aexc (Å2/molécula) XÁG  = 2,5 mN/m  = 5 mN/m  = 10 mN/m  = 15 mN/m  = 20 mN/m  = 25 mN/m 4.14.4.2 Energía libre de exceso (ΔGexc) Con el fin de realizar un análisis termodinámico de la interacción entre el ácido ɣ-linolénico y el colesterol, se calculó la energía libre de exceso (ΔGexc) de las monocapas mixtas a partir del área bajo las curvas π-A correspondientes a las mezclas y a los componentes puros. Figura 4.14.K.- Representación del área de exceso de la mezcla ɣLA/COL frente a la fracción molar de ácido ɣ-linolénico en dicha mezcla, a los valores de presión superficial indicados. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 308 Como se puede observar en la Figura 4.14.L, los valores obtenidos son todos negativos a cualquier fracción molar del sistema y a cualquier presión superficial. Esta situación se corresponde con las condiciones termodinámicas de los sistemas de monocapas binarias en las que se producen fuertes interacciones entre sus componentes. 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 -700 -650 -600 -550 -500 -450 -400 -350 -300 -250 -200 -150 -100 -50 0 -700 -650 -600 -550 -500 -450 -400 -350 -300 -250 -200 -150 -100 -50 0 Gexc (J/mol) Fracción molar LA 2,5 5 10 15 20 25 Los valores de energía libre de exceso se vuelven más negativos al aumentar la presión superficial, lo que nos indica que la interacción entre estos dos componentes es mayor a elevadas presiones. Los mayores valores se alcanzan con las fracciones molares de XɣLA = 0,3 y XɣLA = 0,5 del sistema ɣLA/COL. Esto nos indica que los films más estables formados por ácido ɣ-linolénico y colesterol se obtienen con una proporción de 1:2 respectivamente. Figura 4.14.L.- Representación de la energía libre de exceso para el sistema ɣLA/COL frente a la fracción molar de ácido ɣ-linolénico en dicha mezcla, a los valores de presión superficial indicados. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 309 4.15 MEZCLA DE ÁCIDO ESTEARIDÓNICO CON COLESTEROL 4.15.1 Isotermas π-A y módulos de compresibilidad En la Figura 4.15.A se muestran las isotermas correspondientes a las monocapas de la mezcla ácido estearidónico y colesterol. Como se puede observar, a presiones superficiales inferiores a 25 mN/m, la mayor presencia de ácido estearidónico aleja las gráficas del eje de las coordenadas. Sin embargo, a presiones superiores, ocurre lo contrario. Así mismo, la mayor presencia de colesterol en las monocapas mixtas posibilita que se registren mayores presiones superficiales, provocando, de la misma forma, que las isotermas muestren mayor pendiente. Figura 4.15.A.- Curvas π-A de monocapas de ácido estearidónico, colesterol y de mezclas de ambos con diferentes fracciones molares (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9) obtenidas a 10 °C, depositando 4·1016 moléculas y comprimiendo a la velocidad de 50 cm2/min. En la gráfica interna se muestran los valores de colapso frente a la fracción molar. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Presión superficial (mN/m) Área molecular (Å2/molécula) Ácido Estearidónico XSDA= 0,9 XSDA= 0,7 XSDA= 0,5 XSDA= 0,3 XSDA= 0,1 Colesterol 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 25 30 35 40 45 Presión de colapso (mN/m) XSDA 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 310 El colapso de las monocapas de las mezclas ocurre a valores de presión superficial intermedios respecto del registrado por los films de los componentes puros, y su valor se ve incrementado al aumentar la presencia de colesterol (interior Figura 4.15.A), lo cual nos indica que los dos componentes son miscibles a lo largo del rango de las mezclas. En la Figura 4.15.B se muestran los módulos de compresibilidad. En la misma, se pone de manifiesto el elevado poder de condensación que presenta el colesterol sobre los ácidos grasos insaturados. Se puede observar como aumenta la resistencia de las monocapas de las mezclas a ser comprimidas a medida que el colesterol se encuentra más presente. De la misma forma, la adición de ácido linoleico provoca una disminución en la rigidez de las monocapas. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Módulo de compresibilidad Cs-1 (mN/m) Presión superficial (mN/m) Ácido Estearidónico XSDA= 0,9 XSDA= 0,7 XSDA= 0,5 XSDA= 0,3 XSDA= 0,1 Colesterol Figura 4.15.B.- Módulos de compresibilidad correspondientes a las isotermas π-A de monocapas de ácido estearidónico, colesterol y de mezclas de ambos con diferentes fracciones molares (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9). 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 311 La representación tridimensional del módulo de compresibilidad frente a la presión superficial pone de manifiesto de forma clara el elevado poder condensador del colesterol (Figura 4.16.C). 0 100 200 300 400 500 600 700 800 C o l e s t e r o l 01 03 05 07 09 Á c id o E s te a r id ó n ic o 0 10 20 30 40 50 Fracción molar Colesterol XSDA= 0,1 XSDA= 0,3 XSDA= 0,5 XSDA= 0,7 XSDA= 0,9 Ácido Estearidónico P resión S uperficial (m N /m ) C-1 s En la Figura 4.15.D se muestran los módulos de compresibilidad individuales para cada mezcla. Los valores de módulo de compresibilidad a diferentes presiones superficiales así como los valores máximos alcanzados correspondientes a estos sistemas se recogen en la Tabla 4.15.A. Figura 4.15.C.- Representación tridimensional de los módulos de compresibilidad frente a la presión de monocapas de ácido estearidónico, colesterol y de mezclas de ambos con diferentes fracciones molares (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9) obtenidas a 10 °C. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 312 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) Colesterol 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) XSDA= 0,1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) XSDA= 0,3 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) XSDA= 0,5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) XSDA= 0,7 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) XSDA= 0,9 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) Ácido Estearidónico Figura 4.15.D.- Representación de los módulos de compresibilidad frente a la presión de monocapas de ácido estearidónico, colesterol y de mezclas de ambos con diferentes fracciones molares (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9) obtenidas a 10 °C, pH = 67, depositando 4·1016 moléculas y comprimidas a la velocidad de 50 cm2/min. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 313 Módulo de compresibilidad (mN/m) XSDA π = 2,5 π = 5 π = 10 π = 15 π = 20 π = 25 Cs-1 máximo Colesterol 289,41 353,18 373,91 562,99 731,55 788,63 790,6 0,1 217,17 234,78 326,64 445,48 517,95 512,82 519,28 0,3 61,32 109,92 230,32 275,81 266,89 221,85 280,49 0,5 25,42 41,92 63,32 124,19 124,19 64,44 137,57 0,7 18,73 29,43 46,38 71,57 77,59 47,49 78,93 0,9 17,61 26,76 41,25 57,97 58,42 34,11 62,65 Ácido estearidónico 14,27 23,63 36,57 49,49 53,73 33,67 53,96 Tabla 4.15.A.- Valores de los módulos de compresibilidad a diferentes presiones superficiales de monocapas mixtas de ácido estearidónico y colesterol a diferentes fracciones molares (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9). 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 314 4.15.2 Microscopía BAM. Imágenes y espesor mezcla 4.15.2.1 Mezcla XSDA = 0,9 En la Figura 4.15.E se muestran la isoterma π-A y la curva del espesor relativo correspondientes a la monocapa mixta de ácido estearidónico y colesterol con fracción molar XSDA = 0,9. Se registra un valor de espesor de 0,5 nm al comienzo de la compresión coincidiendo con el estado gas, valor muy próximo a los 0,49 nm registrados en la fase gas de la monocapa del ácido graso puro. En este estado es de esperar que las moléculas de colesterol se encuentren con una inclinación de 13°, de la misma forma que en su propia monocapa. Las imágenes correspondientes a esta fase gas ofrecen resultados muy similares a los obtenidos para la monocapa de este ácido graso puro. En efecto, tal como se observa en la Imagen A, la fotografía es completamente homogénea. Sin embargo, en ciertas ocasiones se ven algunos dominios ovoides oscuros huecos producidos por la presencia de colesterol en la mezcla (Imágenes B y C), debido a su tendencia a formar estructuras espumosas con huecos oscuros de sustrato acuoso. Cuando se produce el inicio del incremento de la presión superficial, tiene lugar la escalada lenta y continua del espesor, registrándose una imagen completamente homogénea (Imagen D) desde el comienzo del estado de líquido expandido hasta su final. En el instante previo al colapso, el espesor relativo registrado es de 0,83 nm., exactamente el mismo valor registrado para la monocapa de este ácido graso omega-3. Por otro lado, se vio que el colesterol obtenía valores superiores a 1,1 nm tras su transición a estado sólido. Estos datos nos invitan a pensar que existe cierta interacción entre ambos componentes, la cual impide que el colesterol alcance los valores de espesor tan elevados que logra por sí mismo. El colapso de la monocapa se produce simultáneamente a un cambio de pendiente en el incremento del espesor, ya que el registro del mismo aumenta de forma notable. Al mismo tiempo, se registra la Imagen E, la cual muestra la formación de las estructuras embrionarias de colapso que aumentan en tamaño y número al reducir la superficie disponible para el film (Imagen F). 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 315 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 0 5 10 15 20 25 30 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 Presión superficial (mN/m) Área molecular (Å2/molécula) Isoterma A XSDA= 0,9 Tiempo (seg) Espesor (nm) Espesor A B C D E F Figura 4.15.E.- Curva π-A de la monocapa mixta de ácido estearidónico y colesterol correspondiente a la fracción molar de XSDA = 0,9 y espesor relativo obtenidas a 10 °C, depositando 4·1016 moléculas y comprimiendo a la velocidad de 50 cm2/min. Ilustración 4.15.A.- Imágenes BAM correspondientes a la monocapa mixta formada por ácido estearidónico y colesterol (XSDA = 0,9). La barra blanca corresponde a una distancia de 20 μm. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 322 4.15.2.5 Mezcla XSDA = 0,1 La monocapa de la mezcla de fracción molar XSDA = 0,1 (Figura 4.15.I) presenta un elevado ruido del espesor relativo durante la fase gas. Al inicio de la compresión muestra unos valores comprendidos entre los 0,25 nm y 0,5 nm, similares a los obtenidos por las monocapas de los componentes puros, colesterol y ácido estearidónico respectivamente. Posteriormente, el espesor relativo presenta una leve tendencia al alza. A 51 Å2/molécula se produce una subida repentina del mismo hasta los 1,15 nm, característicos del colesterol. Las Imágenes A y B, correspondientes al estado gas de la monocapa, muestran dominios en forma de “espumas” y esféricos típicos del colesterol. Al reducir el área molecular, se observa una imagen más homogénea debido a que la monocapa mixta ocupa progresivamente la totalidad de la superficie (Imagen C). De la misma forma que ocurre con las monocapas más condensadas, se produce de nuevo un decalaje entre el aumento del espesor relativo y el de la presión superficial El incremento repentino del espesor hasta alcanzar los 1,15 nm corresponde al cambio conformacional de las moléculas del colesterol, tal como se comentó anteriormente. Así, el grupo esterano de esta molécula adopta una posición vertical, perpendicular a la superficie del sustrato acuoso. Posteriormente, el incremento del espesor hasta los 1,5 nm sugiere que el resto radical alquílico del esterol cambia su inclinación desde una posición horizontal a otra vertical. Por último, el aumento abrupto del espesor se corresponde con la fase colapasada. Tal como se puede observar en la Imagen D, la fase condensada muestra una fotografía completamente homogénea. Sin embargo, al producirse el colapso de la monocapa se observan “embriones” o gérmenes propios de esta fase (Imagen E). Dichos dominios se agrupan generando estructuras brillantes tridimensionales en forma de “bastones” (Imagen F). 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 323 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 XSDA= 0,1 Tiempo (seg) Espesor (nm) Espesor F A B C D E Presión superficial (mN/m) Área molecular (Å2/molécula) Isoterma A Figura 4.15.I.- Curva π-A de la monocapa mixta de ácido estearidónico y colesterol correspondiente a la fracción molar de XSDA = 0,1 y espesor relativo obtenidas a 10 °C, depositando 4·1016 moléculas y comprimiendo a la velocidad de 50 cm2/min. Ilustración 4.15.E.- Imágenes BAM correspondientes a la monocapa mixta formada por ácido estearidónico y colesterol (XSDA = 0,1). La barra blanca corresponde a una distancia de 20 μm. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 324 4.15.3 Área molecular media La representación del área molecular media en función de la fracción molar de ácido α-linolénico, medida a diferentes presiones superficiales da origen a las curvas que se muestran en la Figura 4.15.J. En ella se pone de manifiesto la existencia de desviaciones de la ley de aditividad de las áreas a diferentes valores de presión superficial. Dichas desviaciones son negativas y más acusadas cuanto menor sea la presión. 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 35 40 45 50 55 60 65 70 75 Área (Å2/molécula) Fracción molar  = 2,5 mN/m  = 5 mN/m  = 10 mN/m  = 15 mN/m  = 20 mN/m  = 25 mN/m Figura 4.15.J.- Representación del área molecular media frente a la fracción molar de ácido estearidónico de la mezcla SDA/COL, a los valores de presión superficial indicados. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 325 4.15.4 Funciones de exceso 4.15.4.1 Área de exceso El área de exceso frente a la fracción molar del ácido estearidónico se muestra en la Figura 4.15.K. Todos los valores determinados son negativos a todas las presiones superficiales. Las mayores desviaciones del comportamiento ideal se obtienen en las mezclas de composición 0,5 y 0,3 de ácido graso, siendo estas desviaciones menores con el aumento de la presión. 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 Aexc (Å2/molécula) XSDA  = 2,5 mN/m  = 5 mN/m  = 10 mN/m  = 15 mN/m  = 20 mN/m  = 25 mN/m 4.15.4.2 Energía libre de exceso (ΔGexc) Con el fin de realizar un análisis termodinámico de la interacción entre el ácido estearidónico y el colesterol, se calculó la energía libre de exceso (ΔGexc) de las monocapas mixtas a partir del área bajo las curvas π-A correspondientes a las mezclas y a los componentes puros. Figura 4.15.K.- Representación del área de exceso de la mezcla SDA/COL frente a la fracción molar de ácido estearidónico en dicha mezcla, a los valores de presión superficial indicados. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 326 Como se puede observar en la Figura 4.15.L, los valores obtenidos son todos negativos a cualquier fracción molar del sistema y a cualquier presión superficial. Esta situación se corresponde con las condiciones termodinámicas de los sistemas de monocapas binarias en las que se producen fuertes interacciones entre sus componentes. 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 -1000 -900 -800 -700 -600 -500 -400 -300 -200 -100 0 -1000 -900 -800 -700 -600 -500 -400 -300 -200 -100 0 Gexc (J/mol) Fracción molar SDA 2,5 5 10 15 20 25 30 Los valores de energía libre de exceso se vuelven más negativos al aumentar la presión superficial, lo que nos indica que la interacción entre estos dos componentes es mayor a elevadas presiones. Los mayores valores se alcanzan con la fracción molar de XSDA = 0,5 del sistema SDA/COL. Esto nos indica que los films más estables formados por ácido estearidónico y colesterol se obtienen con una proporción de 1:1. Figura 4.15.L.- Representación de la energía libre de exceso para el sistema SDA/COL frente a la fracción molar de ácido estearidónico en dicha mezcla, a los valores de presión superficial indicados. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 327 4.16 MEZCLA DE ÁCIDO EICOSADIENOICO CON COLESTEROL 4.16.1 Isotermas π-A y módulos de compresibilidad El comportamiento de las monocapas de la mezcla de ácido eicosadieonoico y colesterol (Figura 4.16.A) es muy similar al observado en los sistemas de ácido graso insaturado y colesterol estudiados anteriormente. Cuando el ácido eicosadieonoico es el componente mayoritario de la mezcla (curvas 0,7 y 0,9), las monocapas presentan un estado de líquido expandido. Sin embargo, cuando se encuentra en menor proporción (curvas 0,1 y 0,3), las isotermas obtenidas se corresponden a monocapas de tipo sólido. Así mismo, la mezcla equimolar da lugar a una monocapa con un comportamiento intermedio. Figura 4.16.A.- Curvas π-A de monocapas de ácido eicosadienoico, colesterol y de mezclas de ambos con diferentes fracciones molares (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9) obtenidas a 10 °C, pH = 6-7, depositando 4·1016 moléculas y comprimiendo a la velocidad de 50 cm2/min. En la gráfica interna se muestran los valores de colapso frente a la fracción molar. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Presión superficial (mN/m) Área molecular (Å2/molécula) Ácido Eicosadienoico XEA= 0,9 XEA= 0,7 XEA= 0,5 XEA= 0,3 XEA= 0,1 Colesterol 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 25 30 35 40 45 Presión de colapso (mN/m) XEA 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 328 Tal como se observa en el interior de la Figura 4.16.A, el colapso de las mezclas ocurre a valores de presión superficial intermedios al de los componentes puros, y su valor se ve incrementado al aumentar la presencia de colesterol, lo cual nos indica que los dos componentes son miscibles. En la Figura 4.16.B se muestran los módulos de compresibilidad. En dicha gráfica se puede observar como las monocapas con mayor proporción de colesterol presentan una mayor resistencia a la compresión. Así mismo, la mayor presencia del ácido eicosadienoico dota a las monocapas de una menor rigidez. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Módulo de compresibilidad Cs-1 (mN/m) Presión superficial (mN/m) Ácido Eicosadienoico XEA= 0,9 XEA= 0,7 XEA= 0,5 XEA= 0,3 XEA= 0,1 Colesterol La representación tridimensional del módulo de compresibilidad frente a la presión superficial pone de manifiesto de forma clara el poder condensador del colesterol (Figura 4.16.C). Figura 4.16.B.- Módulos de compresibilidad correspondientes a las isotermas π-A de monocapas de ácido eicosadienoico, colesterol y de mezclas de ambos con diferentes fracciones molares (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9). 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 329 En la Figura 4.16.D se muestran los módulos de compresibilidad individuales para cada mezcla. Los valores de módulo de compresibilidad a diferentes presiones superficiales así como los valores máximos alcanzados correspondientes a estos sistemas se recogen en la Tabla 4.16.A. 0 100 200 300 400 500 600 700 800 C o l e s t e r o l 01 03 05 07 09 Á c id o E ic o s a d ie n o ic o 0 10 20 30 40 50 Fracción molar Colesterol XEA= 0,1 XEA= 0,3 XEA= 0,5 XEA= 0,7 XEA= 0,9 Ácido Eicosadienoico P resión S uperficial (m N /m ) C-1 s Figura 4.16.C.- Representación tridimensional de los módulos de compresibilidad frente a la presión de monocapas de ácido eicosadienoico, colesterol y de mezclas de ambos con diferentes fracciones molares (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9) obtenidas a 10 °C. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 330 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) Colesterol 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) XEA= 0,1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) XEA= 0,3 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) XEA= 0,5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) XEA= 0,7 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) XEA= 0,9 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cs-1 (mN/m)  (mN/m) Ácido Eicosadienoico Figura 4.16.D.- Representación de los módulos de compresibilidad frente a la presión de monocapas de ácido eicosadienoico, colesterol y de mezclas de ambos con diferentes fracciones molares (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9) obtenidas a 10 °C, pH = 67, depositando 4·1016 moléculas y comprimidas a la velocidad de 50 cm2/min. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 331 Módulo de compresibilidad (mN/m) XEA π = 2,5 π = 5 π = 10 π = 15 π = 20 π = 25 Cs-1 máximo Colesterol 289,41 353,18 373,91 562,99 731,55 788,63 790,6 0,1 72,91 118,62 172,35 188,63 226,98 261,09 351,62 0,3 45,71 69,34 125,53 164,33 185,95 151,62 185,73 0,5 28,99 54,18 101,23 152,29 177,26 104,12 177,48 0,7 20,07 40,8 81,16 107,02 132,22 120,62 133,56 0,9 24,08 36,12 56,41 78,04 93,87 88,74 94,54 Ácido eicosadienoico 18,51 29,21 48,38 68,45 86,29 83,39 95,43 Tabla 4.16.A.- Valores de los módulos de compresibilidad a diferentes presiones superficiales de monocapas mixtas de ácido eicosadienoico y colesterol a diferentes fracciones molares (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9). 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 338 4.16.2.4 Mezcla XEA = 0,3 En comparación con las mezclas de ácido eicosadienoico y colesterol estudiadas hasta el momento, la monocapa de fracción molar XEA = 0,3 presenta una curva de espesor-área con un elevado ruido, principalmente mientras la monocapa se encuentra en estado gas. Durante esta fase se observan dominios de ambos componentes entremezclados. En efecto, las Imágenes A y B muestran los dominios gris claro con huecos llenos de agua correspondientes al ácido eicosadienoico así como estructuras en forma de “espumas” propias del esterol. Al reducirse el área disponible y antes del comienzo de la fase de líquido expandido, desaparecen paulatinamente las regiones oscuras del sustrato acuoso (Imagen C). El microscopio registra un ascenso del espesor relativo antes de producirse la subida de presión superficial. Como vimos anteriormente, dicho decalaje es típico de monocapas de tipo condensado. El espesor aumenta como consecuencia del cambio de estado a líquido condensado, mostrando un primer tramo con mayor ruido hasta los 1,05 nm y un segundo hasta alcanzar un valor de 1,27 nm donde forma una seudomeseta tras la cual sufre un incremento abrupto fruto de las formación de las estructuras tridimensionales del colapso. Durante esta fase de líquido condensado se toma la Imagen D en la que se observan todavía unos dominios claros curvilíneos como consecuencia del reordenamiento molecular que sufren los componentes de la mezcla. Al reducirse el área molecular, durante el incremento de presión superficial se observa una imagen homogénea en su conjunto. El colapso de la monocapa da lugar a las estructuras recogidas en la Imagen E en la que se observan los “embriones” o gérmenes característicos de dicho fenómeno en forma de puntos brillantes. La fusión de los mismos genera estructuras brillantes tridimensionales de mayor tamaño propias de la fase colapsada (Imagen F). 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 339 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 XEA= 0,3 Tiempo (seg) Espesor (nm) Espesor F A B C D E Presión superficial (mN/m) Área molecular (Å2/molécula) Isoterma A Figura 4.16.H.- Curva π-A de la monocapa mixta de ácido eicosadienoico y colesterol correspondiente a la fracción molar de XEA = 0,3 y espesor relativo obtenidas a 10 °C, depositando 4·1016 moléculas y comprimiendo a la velocidad de 50 cm2/min. Ilustración 4.16.D.- Imágenes BAM correspondientes a la monocapa mixta formada por ácido eicosadienoico y colesterol (XEA = 0,3). La barra blanca corresponde a una distancia de 20 μm. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 340 4.16.2.5 Mezcla XEA = 0,1 La isoterma π-A de la mezcla de ácido eicosadienoico y colesterol de fracción molar XEA = 0,1 presenta una elevada pendiente como consecuencia del elevado estado de condensación que atraviesa. Esta circunstancia es perfectamente lógica dada la elevada proporción de colesterol en la mezcla. Durante la fase gas se observa que la curva de espesor muestra altibajos constantes desde los 0,27 nm hasta los 0,86 nm. Curiosamente, ambos valores son muy similares a los registrados en las monocapas de los puros. En efecto, la monocapa de colesterol exhibe un espesor de 0,25 nm cuando se encuentra en estado gas, mientras que la del ácido eicosadienoico registra un valor de 0,85 nm. Por lo tanto, cuando el microscopio registra los valores de espesor de esta monocapa mixta, en ocasiones se encuentra en la superficie de medida solo moléculas de colesterol, obteniendo así valores cercanos a 0,25 nm, mientras que en otros instantes, la presencia de ácido graso aumenta este valor (0,85 nm). Las imágenes registradas cuando la monocapa se encuentra en fase gas muestran la presencia de dominios correspondientes a ambos componentes (Imagen A). A medida que el área disminuye, las regiones grises aumentan en tamaño, fruto de la unión de los dominios de ambos componentes (Imagen B). La Imagen C tomada a un área de 50 Å2/molécula, muestra una mayoritaria presencia de dominios de monocapa y unas pequeñas zonas oscuras correspondientes al sustrato acuoso. La curva del espesor experimenta una subida anterior a la de la presión superficial, dando lugar a un pequeño desfase como consecuencia de la elevada condensación de la monocapa. Durante la fase condensada se toma la Imagen D en la que se observan dominios curvilíneos de moléculas que experimentan un cambio conformacional. Al disminuir el área la imagen se vuelve completamente homogénea. La Imagen E muestra la génesis de estructuras brillantes de fase colapsada que, ante el descenso del área molecular se agrupan en forma de “bastones” tridimensionales alargados característicos del colapso del colesterol (Imagen F). 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 341 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 XEA= 0,1 Tiempo (seg) Espesor (nm) Espesor Presión superficial (mN/m) Área molecular (Å2/molécula) Isoterma A A B C D E F Figura 4.16.I.- Curva π-A de la monocapa mixta de ácido eicosadienoico y colesterol correspondiente a la fracción molar de XEA = 0,1 y espesor relativo obtenidas a 10 °C, depositando 4·1016 moléculas y comprimiendo a la velocidad de 50 cm2/min. Ilustración 4.16.E.- Imágenes BAM correspondientes a la monocapa mixta formada por ácido eicosadienoico y colesterol (XEA = 0,1). La barra blanca corresponde a una distancia de 20 μm. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 342 4.16.3 Área molecular media La representación del área molecular media en función de la fracción molar de ácido eicosadienoico, medida a diferentes presiones superficiales da origen a las curvas que se muestran en la Figura 3.4.M. En ella se pone de manifiesto la existencia de desviaciones de la ley de aditividad de las áreas a diferentes valores de presión superficial. Dichas desviaciones son negativas y más acusadas cuanto menor sea la presión. 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 35 40 45 50 55 60 Área (Å2/molécula) Fracción molar  = 2,5 mN/m  = 5 mN/m  = 10 mN/m  = 15 mN/m  = 20 mN/m  = 25 mN/m Figura 3.4.M Representación del área molecular media frente a la fracción molar de ácido eicosadienoico de la mezcla EA/COL, a los valores de presión superficial indicados. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 343 4.16.4 Funciones de exceso 4.16.4.1 Área de exceso El área de exceso frente a la fracción molar del ácido eicosadienoico se muestra en la Figura 3.4.N. Todos los valores determinados son negativos a todas las presiones superficiales. Las mayores desviaciones del comportamiento ideal se obtienen en las mezclas de composición 0,5 y 0,3 de ácido graso, siendo estas desviaciones menores con el aumento de la presión. 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 Aexc (Å2/molécula) XEA  = 2,5 mN/m  = 5 mN/m  = 10 mN/m  = 15 mN/m  = 20 mN/m  = 25 mN/m 4.16.4.2 Energía libre de exceso (ΔGexc) Con el fin de realizar un análisis termodinámico de la interacción entre el ácido eicosadienoico y el colesterol, se calculó la energía libre de exceso (ΔGexc) de las monocapas mixtas a partir del área bajo las curvas π-A correspondientes a las mezclas y a los componentes puros. Figura 3.4.N Representación del área de exceso de la mezcla EA/COL frente a la fracción molar de ácido eicosadienoico en dicha mezcla, a los valores de presión superficial indicados. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 344 Como se puede observar en la Figura 3.4.O, los valores obtenidos son todos negativos a cualquier fracción molar del sistema y a cualquier presión superficial. Esta situación se corresponde con las condiciones termodinámicas de los sistemas de monocapas binarias en las que se producen fuertes interacciones entre sus componentes. 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 -600 -550 -500 -450 -400 -350 -300 -250 -200 -150 -100 -50 0 -600 -550 -500 -450 -400 -350 -300 -250 -200 -150 -100 -50 0 Gexc (J/mol) Fracción molar EA 2,5 5 10 15 20 25 Los valores de energía libre de exceso se vuelven más negativos al aumentar la presión superficial, lo que nos indica que la interacción entre estos dos componentes es mayor a elevadas presiones. Los mayores valores se alcanzan con la fracción molar de XEA = 0,5 del sistema EA/COL. Esto nos indica que los films más estables formados por ácido eicosadienoico y colesterol se obtienen con una proporción de 1:1. Figura 3.4.O Representación de la energía libre de exceso para el sistema EA/COL frente a la fracción molar de ácido eicosadienoico en dicha mezcla, a los valores de presión superficial indicados. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 345 4.17 ESTUDIO COMPARATIVO DE LAS FUNCIONES DE EXCESO DE LAS MONOCAPAS MIXTAS DE COLESTEROL-ÁCIDOS GRASOS. Las funciones área y energía libre de exceso obtenidas para cada una de las monocapas mixtas constituidas por colesterol y ácidos grasos ponen de manifiesto la existencia (o no) de interacciones entre los componentes así como la naturaleza de la mismas: atractivas o repulsivas. a.2,5 b.10 c.25 a.2,5 b.10 c.25 a.2,5 b.10 c.25 a.2,5 b.10 c.25 a.2,5 b.10 c.25 a.2,5 b.10 c.25 a.2,5 b.10 c.25 1 STA 2 OA 3 LA 4 aLA 5 gLA 6 SDA 7 EA 0 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10 -11 -12 -13 -14 2,5 10 25 Áreaexc (Å2/molécula) 2,5 10 25 2,5 10 25 2,5 10 252,5 10 252,5 10 25 Ácidos grasos 2,5 10 252,5 10 25 STA (18:0) OA (18:1) -9 LA (18:2) -6 LA (18:3) -3 LA (18:3) -6 SDA (18:4) -3 EA (20:2) -6 En la Figura 4.17.A se muestra un diagrama de barras con los valores de las áreas de exceso (Aexc) correspondientes a tres presiones superficiales: 2,5, 10 y 25 mN/m. En cada caso se seleccionó el mayor de los valores de Aexc, el cual corresponde en la mayoría de los sistemas estudiados a la monocapa mixta de fracción molar de ácido graso igual a 0,5. Como se observa en la figura, los mayores valores de Aexc, es decir, las mayores desviaciones del comportamiento ideal, corresponden a las monocapas mixtas de colesterol y ácido α-linolénico, seguido de las de colesterol y ácido estearidónico. Ambos ácidos grasos pertenecen a la serie omega-3. Los demás sistemas estudiados, en los que intervienen ácidos grasos omega-6 o bien ácido oleico, presentan valores de Aexc inferiores. Figura 4.17.A.-Representación del área de exceso para cada una de las monocapas mixtas estudiadas a la presión superficial señalada. 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 346 En todos los casos los valores de Aexc son negativos, es decir, presentan desviaciones negativas del comportamiento ideal como consecuencia de la existencia de fuerzas de atracción entre las moléculas de los componentes que forman la monocapa mixta. En el sistema constituido por colesterol y ácido esteárico (ácido graso saturado) los valores de Aexc son prácticamente nulos, por lo que los componentes del mismo o bien se comportan de forma ideal o son inmiscibles. Los resultados de las medidas de la presión de colapso muestran que son inmiscibles, es decir, no existen interacciones entre los componentes de este sistema. La otra función de exceso utilizada para comparar el comportamiento de las monocapas mixtas estudiadas fue la energía libre de exceso (ΔGexc). El diagrama de barras de la Figura 4.17.B muestra los valores de esta función correspondientes a nuestros sistemas. 0 -369 -680 -1457 -651 -952 -503 0 -200 -400 -600 -800 -1000 -1200 -1400 -1600 EA (20:2)  - 6 SDA (18:4) - 3 LA (18:3)  - 6 LA (18:3)  - 3 LA (18:2)  - 6 OA (18:1)  - 9 Gexc (J/mol) Ácidos Grasos STA (18:0) De forma similar a lo que ocurre con el área de exceso, los mayores valores de ΔGexc se encuentran en las mezclas de colesterol y ácidos grasos omega-3. De nuevo, la monocapa mixta de colesterol y ácido graso omega-9 (ácido oleico) es la que presenta menor valor de ΔGexc de todos los sistemas mixtos formados por ácidos grasos insaturados. En la monocapa mixta constituida por el ácido graso insaturado, ΔGexc = 0. Figura 4.17.B.-Valores de la energía libre de exceso calculados a la presión superficial de 25 mN/m correspondientes a las monocapas mixtas estudiadas 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 347 En consecuencia, se puede concluir que la interacción entre el colesterol y los ácidos grasos estudiados solo se produce cuando las cadenas hidrocarbonadas de éstos son insaturadas, aumentando la interacción con el grado de insaturación de las cadenas hasta que éstas alcanzan un valor máximo de tres dobles enlaces. Por otra parte, la interacción es mayor cuando el sistema mixto está formado por ácidos grasos de la serie omega-3. Los resultados mostrados permiten formular la siguiente hipótesis: los ácidos grasos insaturados que llegan al intestino tras la digestión, interaccionan con el colesterol libre que se libera en el intestino tras el proceso de hidrólisis de los ésteres de colesterol de la dieta. De este modo, la formación de un complejo colesterol-ácido graso de estequiometria 1:1 (fracción molar 0,5), consecuencia de la interacción, retira del intestino hacia las heces parte del colesterol libre existente. El resto de colesterol que no forma parte del complejo se re-esterifica de nuevo y es enviado al hígado a través de los quilomicrones para que este órgano haga uso de él según sus requerimientos. De esta forma, se disminuiría el contenido de colesterol en el cuerpo humano. Es evidente que en la formación del complejo antes aludido no solo intervendrían los ácidos grasos omega-3, sino también los omega-6 y el ácido oleico (omega-9), aunque con menor efectividad. Así bien, si la dieta es muy rica en ácidos omega-6 o en ácido oleico, la menor efectividad de la interacción con el colesterol se compensaría con el mayor número de moléculas de estos ácidos propicios a interaccionar. De la misma forma, un incremento de la ingesta de ácidos omega-3 disminuiría los niveles de colesterol al impedir su re-esterificación Según esta hipótesis se justifica la acción nociva de las grasas saturadas en la formación de placas de ateroma debidas al exceso de colesterol en la sangre, ya que según los resultados que hemos expuesto los ácidos grasos saturados son incompatibles con el colesterol y por ello son incapaces de formar el complejo necesario para la reducción del colesterol excesivo de la dieta 6 BIBLIOGRAFÍA 6 BIBLIOGRAFÍA 357 Abbas, K. A. (1999). Inmunología Celular y Molecular, 3ª, 431-2. Madrid: Editorial McGraw Hill. Adam, N. (1923). Proc. Roy. Soc. A. 103, 687. London. Adam, N. K. (1956). The Physics and Chemistry of Surfaces, 39-55. Oxford: Clarendom Press. Adam, N. K., & Jessop, G. (1926). The Structure of Thin Films. Part VIII. Expanded Films. Proc. R. Soc. Lond. A, 112 , 362-75. Adkins, Y., & Kelley, D. (2010). 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