Estudio de la actividad neuronal en el putamen durante la ejecución de una tarea multisensorial

ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD NEURONAL EN EL PUTAMEN DURANTE LA EJECUCIÓN DE UNA TAREA MULTISENSORIAL Ana María Fernández Vicente Departamento de Fisioloxía Facultade de Medicina Francisco González García, catedrático de Fisiología de la Universidad de Santiago de Compostela, y María José Álvarez Bermúdez, doctora en Ciencias Biológicas por la Universidad de Santiago de Compostela HACEN CONSTAR Que la presente tesis titulada ‘Estudio de la actividad neuronal en el putamen durante la ejecución de una tarea multisensorial’ elaborada por la licenciada en Psicología Ana María Fernández Vicente, ha sido realizada bajo su dirección en el departamento de Fisioloxía de esta Universidad, y que, hallándose concluida, autoriza su presentación a fin de que pueda ser juzgada por la comisión correspondiente. Santiago de Compostela, a 15 de febrero de 2011. Fdo. Francisco González García Fdo. María José Álvarez Bermúdez AGRADECIMIENTOS Gracias a todas las personas que me han ofrecido su ayuda y apoyo Diseño de portada: Martín Cañedo . ÍNDICE LISTA DE ABREVIATURAS SUMMARY ……………………………….…………….…………................................. 11 INTRODUCCIÓN…………………………………………………..….………………… 19 1. DESCRIPCIÓN ANATÓMICA Y FISIOLÓGICA DE LOS GANGLIOS BASALES ...……………….………………………........................................ 20 1.1 Núcleos de entrada …………........................................................... 25 1.1.1 Estriado (putamen y caudado) ……………………….......... 25 1.1.2 Núcleo subtalámico (NST) ………………………………... 27 1.2 Núcleos intermedios ……………………………............................. 28 1.2.1 Globo pálido externo (GPe) ……………............................. 28 1.2.2 Sustancia negra compacta (SNc) ………………………….. 29 1.3 Núcleos de salida …………………………………………............. 30 1.4 Las tres vías de los ganglios basales …………………………........ 31 1.4.1 La vía directa ……………………….................................... 32 1.4.2 La vía indirecta ……………………………………………. 33 1.4.3 La vía hiperdirecta ………………….................................... 34 2. EL PUTAMEN ………………………………………………..…………...... 35 2.1 Descripción general del putamen ……………………………......... 35 2.2 Funciones del putamen …………………………............................. 37 2.2.1. Procesamiento de estímulos sensoriales ….......................... 38 2.2.2. Aprendizaje ……................................................................. 39 2.2.3 Movimiento ………….......................................................... 41 2.2.4 Somatotopía …….................................................................. 43 2.2.5 Cognición ……….………………………………………… 45 OBJETIVO ………………………………………………………………………………. 49 MATERIAL Y MÉTODOS ……………………………………………………………... 53 1. PREPARACIÓN Y ENTRENAMIENTO DEL ANIMAL …………………. 53 2. TAREA Y SISTEMA DE ESTIMULACIÓN ………………………………. 57 3. REGISTRO DE LOS DATOS ………………………………………………. 59 4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS DATOS …………................ 61 4.1 Datos de comportamiento ….…………………………... 61 4.2 Datos neuronales .………………………………............. 61 5. LOCALIZACIÓN ANATÓMICA DE LOS REGISTROS ............ 66 RESULTADOS ……………………………………………………………..... 69 1. DATOS PSICOFÍSICOS ………………………………………..... 69 2. ACTIVIDAD NEURONAL …………………………………….... 72 2.1 Actividad neuronal relacionada con el componente visual del estímulo ………………………………………. 75 2.2 Actividad neuronal relacionada con la acción …............. 77 2.3 Actividad relacionada con la recompensa ……………... 85 2.4 Actividad neuronal relacionada con más de un evento de la tarea ……............................................................................ 88 2.5 Actividad neuronal relacionada con la acción y tiempo de reacción …………………………………………………. 89 DISCUSIÓN …………………………………………………………….......... 93 1. RESULTADOS PSICOFÍSICOS ……………………………….... 93 2. ACTIVIDAD NEURONAL ………………………………….…... 95 2.1 Neuronas visuales ……………………………………… 96 2.2 Neuronas relacionadas con la acción ………………....... 98 2.3 Neuronas de recompensa ………………………………. 102 2.4 Neuronas con respuestas a varios eventos ……………... 103 2.5 Neuronas fásicas y neuronas tónicas en el putamen …… 104 2.6 Otros aspectos estudiados ……………………………… 105 CONCLUSIONES ……………………………………………………………. 109 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ……………………………………….. 115 LISTA DE ABREVIATURAS ANOVA: test de análisis de la varianza CMP: corteza motora primaria CMS: corteza motora suplementaria DA: dopamina D1 y D2: receptores dopaminérgicos D1 y D2 GABA: neurotransmisor ácido gammaaminobutírico GB: ganglios basales glu: glutamato GPe: globo pálido externo GPi: globo pálido interno IM: índice de magnitud IU: unidades internacionales de medicamento kg: kilogramos KHz: kilohercios M: concentración molar mg: miligramos ml: mililitros mm: milímetros ms: milisegundos N: tamaño de la población NPP: núcleo pedúnculopontino NST: núcleo subtalámico P: probabilidad PANs: neuronas con actividad fásica PE: variabilidad entre grupos pH: potencial de Hidrógeno PI: variabilidad intra-grupos SN: sustancia negra SNc: sustancia negra compacta SNr: sustancia negra reticulada TANs: neuronas con actividad tónica INTRODUCCIÓN Introducción 19 El entorno que nos rodea contiene un gran número de estímulos, pero sólo una parte de los estímulos pasa el filtro atencional. Los estímulos considerados importantes para nuestra supervivencia son procesados por nuestro cerebro y determinarán nuestra conducta. Tras su procesamiento, escogemos la reacción más adecuada y ejecutamos las acciones necesarias para que ésta se lleve a cabo. Una de las reacciones más comunes ante la presentación de un estímulo relevante es una respuesta motora. Para realizar esta compleja acción, el cerebro primero recibe y procesa la información sensorial, después elige la respuesta motora más adecuada y, por último, envía la orden motora a los músculos de los órganos efectores para realizar el movimiento. Los ganglios basales (GB) intervienen en la coordinación motora. Dentro de este conjunto de núcleos cerebrales, el putamen ha sido relacionado tradicionalmente con el control del movimiento (Georgopoulos y cols., 1983; Kimura y cols., 1984). Además muchos estudios sugieren un papel del putamen en el procesamiento de estímulos sensoriales (Chudler y cols., 1995; Graziano y Gross, 1993; Kimura, 1992). A pesar del gran número de estudios centrados en el putamen todavía no se conocen sus funciones específicas ni los mecanismos neuronales a través de los cuales interviene en la coordinación sensoriomotora. El aprendizaje de la relación entre un estímulo y sus efectos es conocido como aprendizaje asociativo. Hay dos tipos de aprendizaje asociativo, el aprendizaje por condicionamiento clásico o Pavloviano y el aprendizaje por condicionamiento operante Descripción anatómica y fisiológica de los GB 20 o instrumental. En el primero, un estímulo que provoca una respuesta en el organismo (estímulo incondicionado) se asocia con otro estímulo neutro que inicialmente no provoca ninguna respuesta (estímulo condicionado). Con el tiempo, el estímulo condicionado provoca la misma respuesta que el estímulo incondicionado. Un ejemplo de este tipo de aprendizaje es la salivación provocada por un sonido (estímulo condicionado) tras ser presentado contingentemente con un alimento (estímulo incondicionado). El aprendizaje por condicionamiento operante implica la realización de una acción como respuesta a un estímulo. Cuando la acción genera un efecto agradable, hablamos de reforzamiento positivo. Cuando la acción evita un efecto desagradable, estamos ante un reforzamiento negativo. En el presente estudio utilizamos una tarea operante con reforzamiento positivo en la que el animal, tras la presentación de un estímulo, debe ejecutar una respuesta motora (el pulsado de una palanca) para obtener una recompensa (zumo de manzana). Ésta es una tarea compleja que requiere el procesamiento de un estímulo y la ejecución de un acto motor adecuado. Con ella hemos podido analizar la actividad de las neuronas del putamen en relación con la presentación de diferentes estímulos sensoriales, la respuesta motora y la obtención de recompensa. 1. DESCRIPCIÓN ANATÓMICA Y FISIOLÓGICA DE LOS GANGLIOS BASALES Los núcleos que forman los GB son el putamen, el caudado, el globo pálido, la sustancia negra y el núcleo subtalámico. Reciben información de gran parte de la corteza cerebral y del tálamo. A su vez, reenvían información a la corteza a través del tálamo y del tronco encefálico (DeLong, 2000; Galvan y cols., 2006; Utter y Basso, 2008). Trabajos recientes han encontrado proyecciones entre los GB y el cerebelo. Hoshi y cols. (2005) observaron que el núcleo dentado del cerebelo (núcleo de salida) está conectado con el estriado (núcleo de entrada). Bostan y cols. (2010) hallaron Introducción 21 conexiones entre el núcleo subtalámico (NST) y la corteza del cerebelo. En la siguiente figura se muestran los núcleos que forman los GB en dos cortes coronales de mono rhesus (macaca mulatta) (Figura 1). Figura 1: Cortes coronales de mono rhesus (macaca mulatta) mostrando el putamen, el caudado, el núcleo subtalámico, la sustancia negra, y el globo pálido. A. Corte coronal 10.65 mm anterior respecto al eje interaural. B. Corte coronal 8.40 mm anterior respecto al eje interaural (Paxinos y cols, 2000). Tomado de www.brainmuseum.org. A nivel funcional, los GB se dividen en una parte dorsal y otra parte ventral. La parte dorsal está formada por el estriado dorsal (que incluye el putamen y el caudado dorsal), el globo pálido dorsal, el NST, y la sustancia negra (que incluye la sustancia negra compacta y la sustancia negra reticulada). Esta parte dorsal de los GB está relacionada con funciones motoras y de asociación. La parte ventral de los GB está formada por el estriado ventral, el globo pálido ventral, y el área tegmental ventral, que es una continuación de la sustancia negra compacta. El área tegmental ventral pertenece al sistema límbico, conjunto de núcleos relacionados con las emociones (Bolam y cols., 2009, Galvan y cols., 2006). La mayor parte de las neuronas de los GB son GABAérgicas, excepto las neuronas glutamatérgicas del NST, las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra compacta (SNc) y una población de interneuronas del estriado que utilizan acetilcolina Descripción anatómica y fisiológica de los GB 22 como neurotransmisor (Bolam y cols., 2000). En cuanto a las conexiones de entrada, los GB reciben en su mayoría neuronas glutamatérgicas que provienen de la corteza y el tálamo. Las proyecciones talámicas y las corticales, formadas por neuronas piramidales, establecen sinapsis con las neuronas medias espinales gabaérgicas del estriado ipsilateral y, en menor medida, del estriado contralateral. Algunas conexiones también llegan al NST. De manera muy esquematizada, la información motora se transmite por los GB tal como se muestra en la Figura 2. La información que proviene de la corteza y del tálamo, es procesada por el estriado y después es enviada a los núcleos de salida de los GB, el globo pálido interno (GPi) y la sustancia negra reticulada (SNr). La información llega a los núcleos de salida a través de dos vías: la vía directa y la vía indirecta, que serán descritas más adelante. Una vez procesada la información, va de nuevo al tálamo, que a su vez conecta con la corteza y con núcleos del tronco encefálico relacionados con el movimiento, como los colículos superiores, el núcleo pedúnculopontino, la habénula lateral, y la formación reticular (Bolam y cols., 2009; DeLong, 2000). Finalmente, la corteza envía las órdenes motoras a los órganos efectores para realizar el movimiento. Figura 2: Dibujo esquemático mostrando el procesamiento de la información en los GB. En color azul se representan los núcleos que utilizan glutamato (glu) como neurotransmisor. En color rojo, los núcleos que utilizan ácido gamma-aminobutírico (GABA) como neurotransmisor. Las flechas indican el flujo de información y el neurotransmisor utilizado. Introducción 23 El tálamo conecta con la corteza a través de diferentes circuitos separados tanto anatómica como funcionalmente. El circuito esqueletomotor envía proyecciones a la corteza motora primaria, premotora, y el área motora suplementaria. El circuito oculomotor se dirige a las cortezas prefontal, dorsolateral y orbitofrontal lateral. Por último, el circuito límbico alcanza el área cingulada anterior y la corteza orbitofrontal interna. Diferentes áreas de la corteza, a su vez, envían conexiones a determinados núcleos de los GB. Las áreas de asociación de la corteza proyectan al caudado y a la parte anterior del putamen, las áreas sensitivomotoras proyectan al putamen central y caudal, y las áreas límbicas proyectan al estriado ventral y al tubérculo olfatorio (Brown y cols., 1997; DeLong, 2000). Dentro de los GB, se diferencian los núcleos de entrada (núcleo del estriado y NST), los núcleos intermedios (globo pálido externo o GPe y SNc), y los núcleos de salida (GPi y SNr). En la Figura 3 se muestran esquemáticamente las principales conexiones entre los diferentes núcleos pertenecientes a los GB, así como las conexiones entre los GB con el tálamo y la corteza. Descripción anatómica y fisiológica de los GB 24 Figura 3: Dibujo esquemático mostrando las conexiones de los núcleos que forman los GB. En color azul se representan los núcleos que utilizan glutamato como neurotransmisor (glu). En rojo, los núcleos que utilizan ácido gamma-aminobutírico (GABA) como neurotransmisor. En verde, el núcleo que utiliza dopamina (DA) como neurotransmisor. Las flechas indican el flujo de información y el neurotransmisor utilizado. Introducción 25 1.1. Núcleos de entrada 1.1.1. Estriado (putamen y caudado) El putamen y el caudado, separados por la cápsula interna, forman el núcleo del estriado. La mayor parte de las neuronas del estriado, entre un 90 y un 95%, utilizan GABA como neurotransmisor principal y establecen sinapsis simétricas (Gray tipo II), en las que las membranas presináptica y postsináptica presentan un grosor semejante. El estriado es el núcleo de los GB que más aferencias recibe de otras estructuras (Figura 4). Recibe conexiones excitatorias glutamatérgicas del tálamo y la corteza, que forman sinapsis asimétricas (Gray tipo I), en las que la membrana presináptica es de menor grosor que la postsináptica. A través de estas conexiones llega información sensorial de tipo auditivo, visual y somatosensorial (Marchand, 2010; Utter y Basso, 2008). Figura 4: Dibujo esquemático mostrando las principales conexiones del estriado. En color azul se representan los núcleos que utilizan glutamato (glu) como neurotransmisor. En rojo, los núcleos que utilizan ácido gamma-aminobutírico (GABA) como neurotransmisor. En verde, los núcleos que utilizan dopamina (DA) como neurotransmisor. Las flechas indican el flujo de información y el neurotransmisor utilizado. Las tres vías de los GB 32 1.4.1 La vía directa La vía directa se origina en las neuronas del estriado que tienen receptores D1. El estriado envía proyecciones inhibitorias a los núcleos de salida (GPi y SNr), por lo tanto, cuando éste se activa los núcleos de salida disminuyen su actividad. Ello provoca una disminución de la actividad inhibitoria de los núcleos de salida sobre los núcleos motores del tálamo y del tronco encefálico. Como consecuencia, los núcleos motores del tálamo y del tronco encefálico aumentan su actividad, lo que provoca la activación de los núcleos de la corteza que inervan. Por último la corteza envía las órdenes motoras necesarias para la realización del acto motor (Figura 9). Por lo tanto, la activación de la vía directa tiene como consecuencia la ejecución de un movimiento. Figura 9: Esquema de la vía directa de los GB mostrando los núcleos implicados y sus correspondientes neurotransmisores. En color azul se representan los núcleos que utilizan glutamato (glu) como neurotransmisor. En rojo, los núcleos que utilizan ácido gamma-aminobutírico (GABA) como neurotransmisor. Las flechas rojas indican inhibición, las flechas azules indican activación, y las flechas tachadas indican que la actividad del núcleo ha sido inhibida. Las flechas indican el flujo de información y el neurotransmisor utilizado. Introducción 33 1.4.2 La vía indirecta En la vía indirecta intervienen más núcleos de los GB que en la vía directa. Esta vía comienza con la activación de las neuronas del estriado con receptores D2, lo que produce una inhibición del GPe que inervan. Como consecuencia, el GPe deja de inhibir a las neuronas del NST provocando la activación de éste. A su vez, el NST envía sus proyecciones excitatorias al GPi y a la SNr, lo que provoca un aumento de la actividad inhibitoria de estos núcleos sobre el tálamo y el tronco encefálico. Como consecuencia, los núcleos de la corteza inervados por el tálamo y el tronco encefálico son inhibidos. Todo este proceso da lugar a una inhibición de los movimientos (Figura 10). Figura 10: Esquema de la vía indirecta de los GB mostrando los núcleos implicados y sus correspondientes neurotransmisores. En color azul se representan los núcleos que utilizan glutamato (glu) como neurotransmisor. En rojo, los núcleos que utilizan ácido gamma-aminobutírico (GABA) como neurotransmisor. Las flechas rojas indican inhibición, las flechas azules indican activación, y las flechas tachadas indican que la actividad del núcleo ha sido inhibida. Las flechas indican el flujo de información y el neurotransmisor utilizado. Las tres vías de los GB 34 1.4.3 La vía hiperdirecta Recientemente se ha planteado la existencia de una tercera vía conocida como la vía hiperdirecta, que provoca el bloqueo de la vía directa a través del NST (Aron y Poldrack, 2006; Nambu y cols., 2002). El NST recibe conexiones de la corteza, por lo tanto, es un núcleo de entrada de los GB, junto con el estriado. La corteza activa al NST mediante sus conexiones excitatorias. A su vez, el NST activa al GPi y a la SNr, lo que da lugar a un aumento de su actividad inhibidora sobre el tálamo y el tronco encefálico. Esto provoca la inhibición de los núcleos corticales, dando lugar a la inhibición motora (Figura 11). Figura 11: Esquema de la vía hiperdirecta de los GB mostrando los núcleos implicados y sus correspondientes neurotransmisores. En color azul se representan los núcleos que utilizan glutamato (glu) como neurotransmisor. En rojo, los núcleos que utilizan ácido gamma-aminobutírico (GABA) como neurotransmisor. Las flechas rojas indican inhibición, y las azules indican activación. Las flechas indican el flujo de información y el neurotransmisor utilizado. Por lo tanto, la inhibición de la respuesta motora puede producirse a través de dos vías: la vía indirecta y la vía hiperdirecta, produciéndose en ambas la activación del NST. La diferencia entre ambos mecanismos es que mediante la vía hiperdirecta la inhibición motora es más rápida al intervenir menos núcleos de los GB. Las tres vías deben funcionar de forma coordinada para que la actividad motora se produzca de forma eficiente. Introducción 35 2. EL PUTAMEN 2.1 Descripción general del putamen El putamen se sitúa lateralmente al caudado y está separado de éste por la cápsula interna (Figura 12). Putamen y caudado forman el estriado, el principal núcleo de entrada de los GB. Ambos núcleos contienen el mismo tipo de neuronas y de circuitos, por ello son considerados por muchos autores una única estructura dividida en dos partes (Utter y Basso, 2008). Figura 12: Localización del putamen y el caudado. Tomado de www.sciencemuseum.org.uk. La mayor parte de las neuronas del putamen son neuronas medias espinales GABAérgicas. Este núcleo también contiene interneuronas que conectan con la SNc (entre un 3 y un 10 % de su total dependiendo de la especie animal), e interneuronas GABAérgicas, de tres tipos. Un tipo de estas interneuronas expresan la proteína parvalbumina, y reciben proyecciones de la corteza, el tálamo y del GPe. Otro tipo de interneurones GABAérgicas expresa la óxido-nítrico-sintasa, y un último grupo expresa Descripción general del putamen 36 calretinina. Por último, el putamen también contiene interneuronas colinérgicas que reciben proyecciones de la corteza, del tálamo, y de las neuronas medias espinales del propio putamen (Bolam y cols., 2009). El putamen recibe numerosa y variada información de otras estructuras del cerebro. Fundamentalmente es información motora y sensorial que proviene de la corteza y del tálamo, por lo que se considera un núcleo importante en la integración de información. En cuanto a la información eferente, el putamen envía proyecciones GABAérgicas al GPe, al GPi y a la SNr, así como al núcleo dopaminérgico del mesencéfalo (Marchand, 2010). El putamen es, junto al caudado, el núcleo donde comienzan la vía directa e indirecta de los GB, por lo que tiene un papel primordial en la función motora. Diferentes estudios electrofisiológicos han demostrado la existencia de dos poblaciones de neuronas en el putamen: neuronas con actividad fásica (PANs) y neuronas con actividad tónica (TANs) (Blázquez y cols., 2002; Yamada y cols., 2004; Lee y cols., 2006). Las PANs son neuronas medias espinales que presentan una descarga basal baja, mientras que las TANs son interneuronas colinérgicas caracterizadas por una descarga basal alta (Apicella y cols., 1997; Kimura y cols., 1996; Wilson y cols., 1990). Más específicamente, las PANs muestran una descarga basal menor de 2 spikes/s mientras que las TANs muestran una descarga basal igual o mayor de 2 spikes/s (Blazquez y cols., 2002; Yamada y cols., 2004; Lee y cols., 2006). Según Apicella. (2002) las PANs aumentan su actividad de forma sostenida o transitoria, en cambio las TANs disminuyen su tasa de descarga ante la presentación de estímulos. Además se han identificado diferentes funciones para estas dos poblaciones neuronales: las PANs se relacionan con el movimiento y aprendizaje de respuestas motoras ante estímulos y se activan en diferentes fases de la ejecución de la tarea. Las TANs se relacionan con el procesamiento de estímulos de la tarea como estímulos condicionados y estímulos reforzantes, por lo que tienen un importante papel en el aprendizaje de la Introducción 37 asociación estímulo-recompensa (Deffains y cols., 2010, Ravel y cols., 2001). En la Figura 13 se presentan ejemplos de neuronas TAN y PAN registradas en el putamen. Figuras 13: Población de TANS (columna de la izquierda) sincronizadas con la presentación del estímulo que predice la presentación de recompensa N=69 neuronas. Población de PANS (columna de la derecha) sincronizadas con el movimiento realizado tras la presentación de un estímulo. N=78 A: Media de la población. B: Histogramas de neuronas que incrementan (negro) o disminuyen (blanco) su actividad basal. Bin=50ms. Modificado de Lee y cols. (2006). 2.2 Funciones del putamen El putamen ha sido relacionado tradicionalmente con el control del movimiento (Georgopoulos y cols., 1983; Kimura y cols., 1984). Esta relación se observó en los pacientes con trastornos motores como la enfermedad del Parkinson, y la enfermedad de Huntington. En general, este tipo de trastornos están relacionados con alteraciones en los GB, y se caracterizan por síntomas motores como temblores, lentitud de movimientos, aparición de movimientos involuntarios, alteración de la postura y del tono muscular, etc. (DeLong y Wichman, 2007). Funciones del putamen 38 Sin embargo, el control motor no es la única función del putamen. Numerosos estudios electrofisiológicos han puesto de manifiesto la importancia del putamen en el aprendizaje asociativo. Se ha demostrado que este núcleo participa en el aprendizaje de las relaciones entre estímulos y sus consecuencias (Blázquez y cols., 2002, HadjBouziane y Boussaoud, 2003). También se ha demostrado su papel en el procesamiento de estímulos sensoriales (Kimura, 1992; Yamada y cols., 2004), así como en varias funciones cognitivas (Brown y cols., 1997; Zgaljardic y cols., 2004). A continuación se realizará una descripción más detallada de las diferentes funciones del putamen. 2.2.1 Procesamiento de estímulos sensoriales El putamen está implicado en el procesamiento de estímulos sensoriales. Esta información sensorial proviene fundamentalmente de los colículos superiores que envían información visual al putamen a través del tálamo (McHaffie y cols., 2005; Redgrave y cols., 2010) y de la corteza, de la que recibe conexiones directas (Bolam y cols., 2009). Kimura (1992) registró en primates neuronas del putamen que se activaban ante la presentación de estímulos visuales. Estas neuronas se agrupaban en dos poblaciones en función de su perfil de activación. Una población mostraba una alta activación ante los estímulos visuales que indicaban al animal que debía realizar un movimiento para obtener recompensa y una baja activación ante los estímulos visuales que indicaban que no debía realizar ningún movimiento. Estos datos sugieren que esta población de neuronas del putamen procesa tanto la información visual como la información relacionada con la recompensa. La otra población neuronal mostraba la misma actividad ante los dos tipos de estímulos visuales, lo que significa que esta población de neuronas únicamente procesa la información visual. Igualmente Graziano y Gross (1993) describieron actividad visual en el putamen de primates y Schulz y cols. (2009) en el estriado de ratas. Introducción 39 Respecto al procesamiento de información auditiva, Kimura (1992) describió actividad auditiva en el putamen de primates. También Chudler y cols. (1995) estudiaron neuronas moduladas por estímulos auditivos en el putamen de ratas. Algunos autores han descrito actividad somatosensorial en el putamen. Así, Graziano y cols. (1993) descubrieron en primates neuronas con respuestas a estímulos somatosensoriales como el movimiento de una articulación o la presión sobre un músculo. Estudios con ratas también muestran actividad somatosensorial en el putamen (Chudler y cols., 1995). Por último, se han descrito neuronas multisensoriales en algunos núcleos de los GB. Graziano y Gross (1993) hallaron neuronas del putamen de primates que mostraban cambios de actividad ante estímulos visuales y somatosensoriales. En un estudio realizado en ratas, Chudler y cols. (1995) registraron actividad neuronal ante estímulos auditivos y somatosensoriales en el putamen. Además, Nagy y cols. (2005) demostraron que en la SN y el caudado de gatos, la misma neurona se activaba ante estímulos visuales, auditivos y somatosensoriales. Todos estos datos sugieren la existencia de proyecciones que llevan información multisensorial procedente de diferentes estructuras cerebrales al putamen, donde es integrada y procesada. 2.2.2. Aprendizaje Estudios electrofisiológicos y estudios de pacientes con alteraciones en los GB han puesto de manifiesto la relación del putamen con el aprendizaje. El sustrato neuronal de esta relación se halla en el circuito límbico, que conecta el tálamo con el área cingulada anterior y la corteza orbitofrontal interna. Numerosos estudios electrofisiológicos han descrito el papel de las neuronas del putamen en el aprendizaje de conductas encaminadas a obtener recompensa. Así, Funciones del putamen 40 trabajos como los de Barnes y cols. (2005), Tang y cols. (2007), y Tang y cols. (2009) en ratas, describen neuronas del putamen que aumentan su actividad basal durante el aprendizaje de una secuencia de movimientos para obtener recompensa. Sin embargo, esta actividad disminuye tras la adquisición del aprendizaje. Estos datos sugieren que el putamen está implicado en el aprendizaje de actos motores. Otro amplio grupo de estudios realizados en primates se centran en analizar la actividad neuronal del putamen ante la presentación de recompensa. Varios autores han descrito cambios de actividad en las neuronas del putamen en ensayos en los que el animal recibía recompensa sin requerimiento motor ni presentación estimular previa (Apicella y cols., 1997; Ravel y cols., 2003). Por otra parte, otros estudios han demostrado que las neuronas del putamen cambian su actividad ante los estímulos presentados antes de la recompensa (Kimura y cols., 1984; Tobler y cols., 2003; Yamada y cols., 2004). Además, Hikosaka y cols. (1989b) mostraron neuronas del putamen que se activaban antes de la presentación de la recompensa, a las que llamaron ‘neuronas relacionadas con la expectación de recompensa’. Los mismos resultados fueron obtenidos por otros autores (Schultz y Romo, 1992; Tremblay y cols., 1998). Asimismo, se ha demostrado que el putamen procesa otras variables relacionadas con un estímulo reforzante como la magnitud (Cromwell y Schutlz, 2003; Cromwell y cols., 2005) y la proximidad temporal de la recompensa (Shidara y cols, 1998). Además, varios estudios muestran que el putamen se activa ante estímulos gratificantes como comida o agua, y también ante estímulos aversivos como un soplo de aire en la cara del animal (Blázquez y cols., 2002; Yamada y cols., 2004). Estos datos indican que el putamen participa en el procesamiento de estímulos que desencadenan tanto consecuencias positivas como consecuencias negativas. Introducción 41 2.2.3 Movimiento El putamen tiene un relevante papel en la ejecución de movimientos. A través de la corteza el putamen recibe información motora, enviando éste a su vez la información a otros núcleos de los GB. Finalmente, los núcleos de salida de los GB (el GPi y la SNr) serán los encargados de enviar información motora a la corteza a través del tálamo. Uno de los mecanismos utilizados para estudiar la actividad motora en el putamen implica el uso de tareas de condicionamiento operante. En ellas los animales deben realizar una acción ante la presentación de ciertos estímulos para conseguir una recompensa, por lo que deben aprender la relación entre un estímulo, una acción concreta y su consecuencia (la presentación de una recompensa en este caso). Mediante el uso de tareas de condicionamiento operante varios autores han mostrado cambios de actividad en neuronas del putamen de monos rhesus (macaca mulatta) durante la ejecución de movimientos, lo que indica que este núcleo participa en la función motora. Por ejemplo, Jaeger y cols. (1995) estudiaron neuronas del putamen que aumentaban su actividad durante la ejecución de varios de movimientos. En un trabajo más reciente, Lee y Assad (2003) registraron neuronas del putamen que se activaban durante el movimiento realizado por el animal sobre un mando para obtener recompensa. Sin embargo, otros autores defienden que el papel del putamen está más relacionado con el control continuo de movimientos sucesivos que con la ejecución de movimientos individuales. Así, trabajos de Afanas’ev y cols (2004), y de Filatova y cols. (2004) describen neuronas del putamen que se activan durante la realización de una secuencia de movimientos. Por otro lado, se ha observado que la actividad neuronal del putamen cambia tras un largo entrenamiento durante la ejecución de tareas motoras. Estudios en los que se entrenaban ratas para realizar movimientos específicos seguidos de recompensa mostraron una disminución de la actividad neuronal tras la repetición de un gran Objetivo 49 El objetivo del presente trabajo ha sido describir las características de la actividad neuronal en el putamen durante la realización de una tarea en la que se presentan estímulos de dos diferentes modalidades sensoriales (visual y auditiva) que requiere una respuesta motora correcta para la obtención de recompensa. MATERIAL Y MÉTODOS Material y métodos 53 El presente estudio se ha realizado con dos monos rhesus macho (macaca mulatta) de aproximadamente 8 kg. de peso entrenados para realizar una tarea en la que se requiere interpretar un mensaje visual y/o auditivo y responder con un acto motor determinado para obtener una recompensa. El método utilizado para el entrenamiento, el sistema de estimulación y los registros neuronales fueron similares a los descritos por Poggio y cols. (1988), Gonzalez y Krause (1994), y Gonzalez y cols. (1993, 1996, 2001). Todos los procedimientos realizados con los animales siguieron las indicaciones y obtuvieron el permiso del Comité de Bioética de la Universidad de Santiago de Compostela. 1. PREPARACIÓN Y ENTRENAMIENDO DEL ANIMAL Antes de iniciar el entrenamiento, se examinaron la refracción, el fondo de ojo y los movimientos oculares del animal para comprobar que no existía ninguna alteración que pudiese afectar a los resultados del experimento. El progreso de los animales durante los entrenamientos fue detalladamente descrito en un diario. En el habitáculo donde se alojaba el animal se colocó un monitor donde se presentaba un estímulo visual, una palanca para responder, y un sistema de dispensación automática de zumo. El estímulo consistía en una línea vertical negra que se presentaba cada 2 segundos en el centro del monitor. El animal, que se mantenía bajo una dieta sin agua, tenía que presionar la palanca ante la presentación de este estímulo y soltarla tan pronto se convertía en cruz. Cada vez que presionaba la palanca correctamente recibía Preparación y entrenamiento del animal 54 0.1 ml de agua. Trabajaba aproximadamente tres horas completando una media de 1000 ensayos al día, por lo que recibía una media de 100 ml de zumo. Si su rendimiento diario no cubría los requerimientos mínimos el agua restante le era suministrada manualmente al final del día. El entrenamiento se realizó controlando el rendimiento. Los tiempos de reacción y el tamaño del estímulo se redujeron progresivamente en función de los avances del animal. Los intervalos entre los ensayos (entre 1 y 3 segundos), eran cambiados de forma aleatoria para evitar la inatención y la emisión de posibles respuestas al azar. El entrenamiento en estas condiciones duró aproximadamente un mes. Cuando el animal aprendió correctamente la tarea (≥ 95% de ensayos correctos), se continuó el entrenamiento en el laboratorio, donde se utilizó la tarea final utilizada para realizar los registros (descrita en el siguiente apartado). Durante dos horas al día de media, el animal realizaba una media de 2.000 ensayos al día, por los que recibía un total 100 ml de zumo. Para realizar estos entrenamientos, el animal se colocaba sobre una silla especialmente diseñada para primates, frente a un monitor y dos altavoces en los que se presentaba la tarea. La silla contaba en su parte frontal con dos puertas a través de las cuales el animal accedía a la palanca con una de sus manos. Mediante un sistema de puertas, se le permitía el acceso a la palanca sólo con una de las dos manos. El animal fue entrenado para realizar la tarea con ambas manos. Una vez realizaron la tarea con un 90% de aciertos, se procedió a una intervención quirúrgica en la que les fue implantado un sistema de fijación, consistente en un poste metálico unido a la parte anterior del cráneo con cemento dental sobre una base de tornillos de acero inoxidable. Este sistema de fijación es necesario para impedir movimientos de la cabeza que desestabilizarían el registro neuronal y dificultarían el control de los movimientos oculares durante la ejecución de la tarea. Los animales se anestesiaron con pentobarbital sódico (10 mg/Kg por vía intravenosa), previa inducción con ketamina (10 mg/Kg por vía intramuscular). Se les administraron 10 mg de pentobarbital sódico cada 25 minutos aproximadamente para mantener un nivel de Material y métodos 55 anestesia constante y estable durante toda la intervención. Al finalizar la intervención se les administraron intramuscularmente antibióticos (Penicilina, 50.000 IU/Kg) y analgésicos (Noramidopirina 150 mg/Kg, Nolotil, Europharma). Después de la implantación del sistema de fijación se realizaba periódicamente una limpieza de la zona del implante. Cuando los animales se recuperaron de la cirugía, se continuó con el entrenamiento en el laboratorio. Los movimientos de los ojos fueron controlados con un sistema de videocámara con luz infrarroja y una tarjeta digitalizadora (Imagenation, modelo PXC200, Oregón, USA). De esta forma se detectaba el reflejo corneal izquierdo, que era almacenado en un ordenador personal convencional con una resolución de 20 minutos de arco y una frecuencia de muestreo de 25 Hz. El reflejo corneal quedaba enmarcado dentro de una ventana que abarcaba el ángulo visual de la imagen de la tarea (18.5x18.5 grados) presentada a los animales. Se excluyeron los ensayos en los que el reflejo corneal salía de los bordes de la ventana ya que en estos casos se consideraba que los animales no estaban mirando hacia la imagen presentada en el monitor. Los movimientos de la mano también eran monitorizados con ayuda de otra cámara infrarroja (Figura 15). Preparación y entrenamiento del animal 56 Figura 15: Dibujo esquemático mostrando la distribución de los componentes de la tarea. Con una cámara infrarroja (izquierda) se monitorizó la posición ocular, y con la otra (derecha) los movimientos de la mano que pulsaba la palanca. Cuando los animales alcanzaron de nuevo un 90% de ensayos correctos en la tarea se les sometió a una nueva intervención quirúrgica para implantar el sistema de registro. Bajo anestesia general y siguiendo un procedimiento similar al descrito anteriormente para el poste de fijación, se implantó en el hemisferio izquierdo, un cilindro de acero inoxidable de 20 mm de diámetro dejando expuesto el cráneo en su interior en las coordenadas estereotáxicas 15 lateral, 13 anterior con respecto al eje interaural. Para acceder al putamen, se anestesiaba a los animales con pentobarbital sódico (10mg/Kg por vía intravenosa), previa inducción con ketamina (10gm/Kg por vía intramuscular), y se realizaron craneotomías de 5 mm de diámetro en el interior del cilindro dejando expuesta la duramadre que era atravesada por los microelectrodos durante los registros. Cuando el engrosamiento de la duramadre impedía su penetración con el microelectrodo, se realizaba una nueva craneotomía dentro del cilindro. Esto sucedía aproximadamente cada 15 penetraciones. Realizábamos una penetración al día. Un micromanipulador de microelectrodos electro-hidráulico (Narishige, Tokio, Japón) acoplado al cilindro durante los experimentos permitía la manipulación del microelectrodo. Material y métodos 57 2. TAREA Y SISTEMA DE ESTIMULACIÓN La tarea consistía en la presentación de vídeos de 2 segundos de duración grabados en nuestro laboratorio con una cámara de vídeo convencional. Los vídeos utilizados eran de dos tipos: en uno se presentaba la cara de una persona diciendo ‘sí’ a la vez que movía la cabeza verticalmente (ensayos ‘Sí’), y en el otro tipo de vídeo aparecía la misma cara diciendo ‘no’ mientras movía la cabeza horizontalmente (ensayos ‘No’) (Figura 16A). Los animales tenían que presionar una palanca ante los ensayos ‘Sí’ para recibir recompensa y no responder ante los ensayos ‘No’. En total se utilizaron 200 vídeos de la misma persona, 100 eran ensayos ‘Sí’ y 100 ensayos ‘No’. Había tres condiciones sensoriales (Figura 16B): presentación de la imagen junto con el correspondiente sonido (Vídeo y Sonido), presentación de la imagen sin el sonido (Sólo Vídeo), y presentación del sonido sin la imagen (Sólo Sonido). Durante los registros también se usó en ocasiones una cuarta condición experimental en la que el animal recibía recompensa sin presentar previamente ningún tipo de estímulo ni realizar ningún tipo de movimiento (Sólo Recompensa). Las tres primeras condiciones sensoriales se presentaban de forma aleatoria. El período de espera entre cada ensayo fue de 300 ms. En los ensayos ‘Sí’, los animales debían responder entre los 120 ms siguientes a la aparición del estímulo y los 2000 ms que duraba cada presentación del estímulo. La imagen de cada vídeo aparecía a los 100 ms del comienzo del ensayo y el sonido a una media de 358 ms. Tras pulsar la palanca ante un ensayo ‘Sí’ los animales recibían inmediatamente la recompensa, que consistía en 0.1 ml de zumo de manzana. En la Figura 16C puede verse un cronograma de la tarea. Análisis estadístico de los datos 64 Para determinar la significación estadística de estas comparaciones se utilizó el test ANOVA con un nivel de significación de P<0.05. Este análisis individual de las neuronas nos permitió clasificarlas en varios grupos funcionales teniendo en cuenta el periodo durante el cual se producían cambios significativos en la actividad (ver Resultados). Para cada condición sensorial, se calculó la latencia de respuesta neuronal, definida como el tiempo transcurrido entre la presentación del estímulo (visual o auditivo) y el inicio del cambio de actividad en cada neurona. En el caso de las neuronas con actividad relacionada con la palanca, se determinó el tiempo entre el cambio de actividad y el momento en el que la palanca era pulsada. Para el cálculo de latencias en las neuronas de recompensa, el estímulo considerado fue la aparición de la recompensa de los ensayos ‘Sí’ en todas las condiciones sensoriales. Para calcular el momento en el que había un cambio significativo de actividad en cada neurona se utilizó la distribución de Poisson que determinaba qué columna (bin) del histograma era significativamente (P<0.05) diferente de la respuesta basal (Maunsell y Gibson, 1992; Bisley y cols., 2004). Para determinar el final del cambio de actividad se realizó el mismo tipo de análisis. El tiempo señalado por el segundo bin significativo del histograma era considerado como el inicio y el antepenúltimo como final del cambio de la actividad neuronal. Finalmente se calculó la media para cada grupo poblacional y cada condición sensorial Una vez agrupadas las neuronas en grupos funcionales, se construyeron histogramas poblacionales para cada tipo de ensayo (Vídeo y Sonido, Solo Vídeo, y Solo Sonido; ‘Sí’ y ‘No’ separadamente para cada uno de ellos) promediando la actividad de todas las neuronas de un mismo grupo funcional. Para determinar el grado de cambio de actividad neuronal, primero se calculó la frecuencia de descarga media basal de todas las neuronas del mismo grupo funcional y después se calculó la frecuencia de descarga media durante la fase de interés de las mismas neuronas. La Material y métodos 65 diferencia entre ambas se expresó como el porcentaje del segundo valor respecto al primero. También se calculó un índice de magnitud (IM) para cada grupo funcional y tipo de ensayo de acuerdo con la ecuación IM=PE/(PE+PI), donde PE representa la variabilidad entre grupos y PI la variabilidad intra-grupos en el análisis ANOVA. Dicho índice tiene valores entre 0 y 1, de forma que un IM cercano a 1 indica un grado importante de selectividad al evento que genera el cambio de actividad, y es similar al utilizado por otros autores para cuantificar el grado de selectividad en la actividad neuronal (Durand y cols., 2002; Prince y cols., 2002; Romero y cols., 2007). Tanto para los histogramas de neuronas individuales como para los histogramas poblacionales, se realizó un suavizado utilizando la función ‘smooth’ de Matlab que utiliza el método ‘moving average’ (Figura 20). Esta función promedia los valores de cada bin del histograma con un número determinado de bin anteriores y posteriores. En nuestro caso se utilizaron los 10 bin anteriores y posteriores, y se repitió la función dos veces. Este suavizado facilitó la clasificación de las neuronas en cada uno de los grupos funcionales. Figura 20: Histograma y suavizado del histograma (línea roja) de una neurona relacionada con la acción motora realizado con un programa desarrollado en Matlab. La línea verde vertical representa el pulsado de palanca. Localización anatómica de los registros 66 5. LOCALIZACIÓN ANATÓMICA DE LOS REGISTROS Se realizó una craneotomía en el hemisferio izquierdo del animal 1 y dos craneotomías en el hemisferio izquierdo del animal 2. Las coordenadas estereotáxicas de cada craneotomía con respecto al eje interaural fueron las siguientes: 13 anterior-14 lateral en el animal 1, y 18 anterior-12 lateral, y 15 anterior-12 lateral en el animal 2. Al final de los registros de cada craneotomía se insertaron unos filamentos de poliproleno (Prolene 4-0, Ethicon Inc., Somerville, New Jersey) perpendiculares a la superficie de la corteza de unos 10 mm de longitud de color azul en el centro de cada craneotomía utilizando una aguja de punción lumbar (Spinocan, 0.47x120 mm, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Alemania). Estos filamentos fueron alojados en la posición en la que se registraron la mayoría de las neuronas presentadas en este trabajo. De esta forma, la zona de las penetraciones quedaba marcada para su posterior identificación en las preparaciones histológicas. Al final de los experimentos, el animal 1 fue profundamente anestesiado con una sobredosis de pentobarbital sódico por vía intravenosa, mediante inducción previa con ketamina (10 mg/Kg por vía intramuscular) y perfundido con formaldehído al 10%. El cerebro fue extraído y embebido durante una semana en solución isotónica (0.2 M, pH=7.4) con sacarosa al 20% para evitar la formación de cristales durante su posterior congelación. Tras esto, se realizaron cortes seriados del cerebro de 50 micras de grosor con un microtomo de congelación que fueron teñidos con azul de Toluidina. La visualización de la histología, junto a las coordenadas estereotáxicas del cilindro de las craneotomías, las notas de laboratorio tomadas durante los registros sobre la actividad neuronal, y la profundidad de los registros marcada por el contador del micromanipulador fueron utilizados para localizar las zonas donde se realizaron los registros. RESULTADOS Resultados 69 1. DATOS PSICOFÍSICOS Se calculó el tiempo de reacción para los dos animales en las 3 condiciones sensoriales mencionadas anteriormente, definido éste como el tiempo transcurrido entre la presentación del estímulo y el pulsado de palanca. Los estímulos que se consideraron para este cálculo fueron: el vídeo para las condiciones Vídeo y Sonido, y Sólo Vídeo, y el sonido para la condición Sólo Sonido. En el caso del vídeo, se consideró como comienzo del estímulo la aparición del primer fotograma del vídeo. En el caso del sonido, se consideró como comienzo del estímulo la aparición del sonido al pronunciar la palabra ‘Sí’. La media del tiempo de reacción para las tres condiciones fue de 484±140 ms para el animal 1 y de 491±233 ms para el animal 2 (ANOVA, P>0.05). Los dos animales pulsaban palanca con mayor rapidez ante la condición Sólo Sonido frente a Vídeo y Sonido, y Sólo Vídeo (ANOVA; Kruskal-Wallis; P<0.05). La media del tiempo de reacción ante Sólo Sonido fue de 472±133 ms para el animal 1 y de 413±205 ms para el animal 2, hallándose diferencias significativas entre los dos animales (ANOVA, P<0.05). No se encontraron diferencias significativas para cada animal de forma independiente entre la condición Vídeo y Sonido, y la condición Sólo Vídeo (ANOVA; Kruskal-Wallis; P>0.05). Para la condición Vídeo y Sonido se hallaron diferencias significativas entre el animal 1, con una media de 483±119 ms, y el animal 2, con una media de 536±247 ms (ANOVA, P<0.05). Respecto a la condición Sólo Vídeo también se hallaron diferencias significativas entre los tiempos de reacción de los dos animales, con una media de 496±136 ms para el animal 1 y de 523±224 ms para el animal 2 (ANOVA, P<0.05). Las latencias de respuestas de los dos animales para las tres condiciones sensoriales se presentan en la Tabla 1. La distribución de los tiempos Datos psicofísicos 70 de reacción se muestra en la Figura 21, en la que se indica la frecuencia de los ensayos (eje vertical) en función del tiempo de reacción (eje horizontal) para las tres condiciones sensoriales (Vídeo y Sonido, Sólo Vídeo, y Sólo Sonido). Puede observarse que en los tres tipos de ensayos hubo diferencias significativas entre los dos animales. El animal 1 respondió más rápidamente que el animal 2 en los ensayos con Vídeo y Sonido y Sólo Vídeo, mientras que la situación fue contraria para los ensayos Sólo Sonido. Tiempo de reacción Tipo de ensayo Animal 1 Animal 2 ANOVA Video y Sonido 483±119 ms 536±247 ms P<0.05 Sólo Vídeo 496±136 ms 523±224 ms P<0.05 Sólo Sonido 472±133 ms 413±205 ms P<0.05 Tabla 1: Tiempos de reacción de los dos animales. Los valores representan el valor medio y la desviación estándar del tiempo de reacción para los ensayos ‘Sí’ correctos. En todos los casos hubo diferencias significativas entre ambos animales. Figura 21: Distribución del tiempo de reacción de los ensayos ‘Sí’ correctos de cada condición sensorial para el animal 1 (arriba; histograma en negro) y el animal 2 (abajo; histogramas en gris). Para normalizar los diferentes histogramas, los datos se representan en forma de porcentajes sobre el total de aciertos de cada condición. Resultados 71 Al analizar los diferentes tipos de errores cometidos, se hallaron diferencias entre los dos animales. El error más común para animal 1 fue el error por omisión, que consistía en no pulsar palanca ante los ensayos ‘Sí’, mientras que para el animal 2 fue la falsa alarma, es decir, pulsar palanca ante los ensayos ‘No’. El error por anticipación, esto es, pulsar palanca antes de los primeros 120 ms tras la presentación del estímulo, no fue frecuente en ninguno de los dos animales, excepto en la condición Sólo Sonido. Los diferentes tipos de errores para cada condición sensorial y cada animal se presentan en la siguiente figura (Figura 22). Figura 22: Porcentaje de los distintos tipos de errores para cada condición sensorial del animal 1 (izquierda, N=1000 ensayos) y el animal 2 (derecha, N=1000 ensayos). A, Error por anticipación (pulsado de palanca antes de los 120 ms tras la presentación del estímulo). F, Falsa alarma (pulsado de palanca en los ensayos ‘No’). O, Error por omisión (no pulsado de palanca en los ensayos 'Sí’). Actividad neuronal 72 2. ACTIVIDAD NEURONAL Hemos registrado 191 neuronas del putamen de las que 45 pertenecían al animal 1 y 146 al animal 2. De estas 191 neuronas, 133 (70%) mostraban cambios de actividad significativos en algún momento durante la ejecución de la tarea (ANOVA, P<0.05), (42 neuronas en el animal 1, y 91 neuronas en el animal 2). De las 133 neuronas, 17 (13%) incrementaron su frecuencia de descarga tras la presentación del estímulo visual en las condiciones Vídeo y Sonido, y Sólo Vídeo, y fueron clasificadas como neuronas visuales. Otro grupo de neuronas, 78 (59%), modificaron su actividad alrededor del pulsado de palanca, y fueron clasificadas como neuronas relacionadas con la acción. Esta población neuronal se dividió en tres grupos funcionales dependiendo de su perfil de actividad: neuronas pre-acción (N=15, 19%), neuronas peri-acción (N=52, 67%), y neuronas activación-supresión (N=11, 14%). Por último, 38 neuronas (29%) mostraron cambios de actividad durante la presentación de la recompensa, y fueron clasificadas como neuronas de recompensa. La Tabla 2 resume los tipos neuronales encontrados en el putamen en nuestro estudio. Las Figuras 23 y 24 muestran el perfil de actividad y la distribución de estos tres tipos de neuronas respectivamente. No se hallaron cambios de actividad relacionados con la aparición del estímulo auditivo. Neuronas registradas en el putamen Total de neuronas registradas 191 (100%) Con cambios de actividad durante la tarea 133 (70%) Relacionadas con el componente visual 17 (13%) Relacionadas con la ejecución de la acción 78 (59%) Pre-acción 15 (19%) Peri-acción 52 (67%) Activación-supresión 11 (14%) Relacionadas con la recompensa 38 (29%) Tabla 2: Neuronas registradas en el putamen, indicando sus tipos funcionales. Resultados 73 0 10 20 30 Visual Recompensa Media de spikes/s Acción 0 10 20 30 250 ms Figura 23: Perfil temporal de actividad de los tres grupos neuronales registrados en nuestros experimentos: neuronas visuales (línea punteada, se calculó el promedio de los ensayos ‘Sí’ y ‘No’ de la condición sensorial Vídeo y Sonido, N=17, sincronizándolos con la aparición del estímulo visual); neuronas relacionadas con la acción (línea negra continua, se calculó el promedio de los ensayos ‘Sí’ de la condición sensorial Vídeo y Sonido, N=78, sincronizándolos con el pulsado de la palanca); y neuronas de recompensa (línea discontinua, se calculó el promedio de los ensayos ‘Sí’ de la condición sensorial Vídeo y Sonido, N=38, sincronizándolos con la aparición de la recompensa). La anchura del bin sobre el que se realizó la suavización era de 20 ms. La base de tiempo se representa con la finalidad de poder comparar los tres perfiles de actividad. % de neuronas 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Visual Acción Recompensa N=17 (13%) N=78 (59%) N=38 (29%) N=133 Tipos de neuronas Figura 24: Porcentaje de los tres tipos de neuronas registradas en el putamen: relacionadas con el componente visual, relacionadas con la acción, y relacionadas con la recompensa (N=133). Actividad neuronal 80 Figura 31: Histograma mostrando el porcentaje de los tres tipos de neuronas registrados relacionados con la ejecución de la acción. Neuronas pre-acción De las 78 neuronas relacionadas con la acción, 15 (19%) mostraron un cambio de actividad significativo antes del pulsado de palanca (Figura 32; ANOVA, P<0.05). Este cambio de actividad tenía un máximo antes del pulsado de la palanca y se reducía progresivamente hasta sobrepasar este punto. Por este motivo se denominaron neuronas pre-acción. En los ensayos en los que no se produjo pulsado de palanca (ensayos ‘No’), no se observó cambio significativo de actividad en estas neuronas. En todos los casos, el cambio consistió en un incremento de actividad. El porcentaje de este incremento en esta población neuronal antes del pulsado de palanca con respecto a la descarga basal fue de 128% para la condición Vídeo y Sonido, de 137% para la condición Sólo Vídeo, y de 130% para la condición Sólo Sonido. No se encontraron diferencias significativas entre las tres condiciones sensoriales (ANOVA, P>0.05). La duración media poblacional del incremento de la actividad en las tres condiciones sensoriales fue de 423±25 ms (Poisson, P<0.05). Esta población neuronal mostró un inicio de la activación a un tiempo medio de 261±72 ms antes del pulsado de la palanca (Poisson, P<0.05) para Resultados 81 las tres condiciones sensoriales. No se hallaron diferencias significativas para el inicio de la activación entre las tres condiciones sensoriales (Vídeo y Sonido, Sólo Vídeo, y Sólo Sonido; ANOVA, P>0.05). El IM de la población de las neuronas pre-acción en los ensayos ‘Sí’ considerando conjuntamente las tres condiciones fue de 0.94. Figura 32: Histogramas de población de las neuronas pre-acción. Estas neuronas aumentan su actividad antes del pulsado de palanca en los ensayos ’Sí’. Arriba: Histogramas sincronizados con el pulsado de palanca para los ensayos ‘Sí’. Medio: Mismos histogramas representados arriba, pero sincronizados con la presentación del estímulo para los ensayos ’Sí’. Abajo: Histogramas de las mismas neuronas representadas en las filas anteriores pero sincronizados con la presentación del estímulo para los ensayos ‘No’. N=10 neuronas registradas con las tres condiciones sensoriales (Vídeo y Sonido, Sólo Vídeo, y Sólo Sonido). Bin=20 ms. Neuronas peri-acción El 67% de las neuronas relacionadas con el acto motor (N=52 neuronas), se caracterizó por el incremento de su actividad antes, durante y después del pulsado de la palanca, coincidiendo su máximo con el momento del pulsado (Figura 33; ANOVA, P<0.05). La cuantificación de la actividad se realizó durante los 125 ms previos y posteriores al pulsado de la palanca. Estas neuronas fueron clasificadas como neuronas Actividad neuronal 82 peri-acción. El porcentaje del incremento de descarga de estas neuronas durante el pulsado de palanca con respecto a la descarga basal fue de 176% para la condición Vídeo y Sonido, 195% para la condición Sólo Vídeo, y de 181% para la condición Sólo Sonido. No se hallaron diferencias significativas entre las tres condiciones sensoriales (Vídeo y Sonido, Sólo Vídeo, y Sólo Sonido; ANOVA, P>0.05). La duración media del incremento de la actividad en las tres condiciones sensoriales fue de 437±26 ms. La activación de estas neuronas comenzó a un tiempo medio de 147±74 ms antes del pulsado de palanca, manteniéndose durante una media de 290±20 ms tras el pulsado de palanca (Poisson, P<0.05) para las tres condiciones sensoriales. No se hallaron diferencias significativas entre las tres condiciones sensoriales (Vídeo y Sonido, Sólo Vídeo, y Sólo Sonido; ANOVA, P>0.05). El IM de la población estas neuronas considerando conjuntamente las tres condiciones fue de 0.99 para los ensayos ‘Sí’. Figura 33: Histogramas de población de las neuronas peri-acción. Estas neuronas aumentaban su actividad alrededor del pulsado de palanca en los ensayos ’Sí’. Arriba: Histogramas sincronizados con el pulsado de palanca para los ensayos ‘Sí’. Medio: Mismos histogramas representados arriba pero sincronizados con la presentación del estímulo para los ensayos ‘Sí’. Abajo: Histogramas de las mismas neuronas representadas en las filas anteriores pero sincronizados con la presentación del estímulo para los ensayos ‘No’. N=36 neuronas registradas con las tres condiciones sensoriales (Vídeo y Sonido, Sólo Vídeo, y Sólo Sonido). Bin=20 ms. Resultados 83 Neuronas de activación-supresión El 14% (n=11) de las neuronas relacionadas con la acción mostró un aumento de su actividad alrededor del pulsado de la palanca en los ensayos ‘Sí’ y una disminución de actividad en la misma ventana temporal en los ensayos ‘No’ (Figura 34; ANOVA, P<0.05). Estas neuronas fueron clasificadas como neuronas de activaciónsupresión. El porcentaje del incremento de descarga de estas neuronas durante el pulsado de palanca con respecto a la descarga basal fue en los ensayos ‘Sí’ de 406% para la condición Vídeo y Sonido, de 444% para la condición Sólo Vídeo, y de 373%% para la condición Sólo Sonido. No se hallaron diferencias significativas entre las tres condiciones sensoriales (Vídeo y Sonido, Sólo Vídeo, y Sólo Sonido; ANOVA, P>0.05). El porcentaje de la disminución de descarga con respecto a la descarga basal de estas neuronas para la ventana temporal correspondiente en los ensayos ‘No’ fue de 164% para la condición Vídeo y Sonido, de 183% para la condición Sólo Vídeo, y de 150% para la condición Sólo Sonido. No se hallaron diferencias significativas entre las tres condiciones sensoriales (Vídeo y Sonido, Sólo Vídeo, y Sólo Sonido; ANOVA, P>0.05). La duración media en las tres condiciones sensoriales del incremento de la actividad para los ensayos ‘Sí’ fue de 453±48 ms, y la duración media de la disminución de la actividad para los ensayos ‘No’ fue de 563±87 ms. La activación de estas neuronas se producía a los 389±66 ms antes del pulsado de la palanca manteniéndose durante una media de 842±39 ms tras el pulsado de palanca para las tres condiciones sensoriales en los ensayos ‘Sí’ (Poisson, P<0.05). No se hallaron diferencias significativas en la aparición y duración del incremento de actividad entre las tres condiciones sensoriales (Vídeo y Sonido, Sólo Vídeo, y Sólo Sonido, ANOVA, P>0.05). La supresión de actividad en esta población neuronal en los ensayos ‘No’ comenzaba a los 271±29 ms después de la presentación del estímulo visual para las condiciones Vídeo y Sonido, y Solo Vídeo, y a los 111±43 ms después de la presentación del estímulo auditivo para la condición Sólo Sonido (Poisson, P<0.05). En este caso, no se pudieron establecer Actividad neuronal 84 comparaciones entre estas tres condiciones sensoriales ya que no es posible sincronizar su actividad con el mismo estímulo. El IM de la población de estas neuronas para los ensayos ‘Sí’ fue de 0.99 considerando conjuntamente las tres condiciones, y para los ensayos ‘No’ fue de 0.95 para las condiciones Vídeo y Sonido, y Sólo Vídeo, y de 0.81 para la condición Sólo Sonido. Figura 34: Histogramas de población de las neuronas de activación-supresión. Estas neuronas mostraron un aumento de actividad alrededor del pulsado de palanca en los ensayos ‘Sí’ y una disminución de actividad en la misma ventana temporal en los ensayos ‘No’. Arriba: Histogramas sincronizados con el pulsado de palanca para los ensayos ‘Sí’. Medio: Mismos histogramas representados arriba, pero sincronizados con la presentación del estímulo para los ensayos ‘No’. Abajo: Histogramas de las mismas neuronas representadas en las filas superiores pero sincronizados con la presentación del estímulo para los ensayos ‘Sí’. N=8 neuronas registradas con las tres condiciones sensoriales (Vídeo y Sonido, Sólo Vídeo, y Sólo Sonido). Bin=20 ms. Resultados 85 2.3 Actividad neuronal relacionada con la recompensa De las 133 relacionadas con la tarea, un total de 38 (29%) mostraron cambios en su frecuencia de descarga en relación con la obtención de la recompensa en las tres condiciones de presentación del estímulo (ANOVA, P<0.05). La mayor parte de estas neuronas (87%, 33 neuronas de las 38) incrementaron su frecuencia de descarga (Figuras 35A, 36A), y un 13% (5 neuronas de las 38) disminuyeron su frecuencia de descarga con respecto a la actividad basal (Figura 35B). El porcentaje del incremento de descarga de estas neuronas tras la presentación de la recompensa con respecto a la descarga basal fue en los ensayos ‘Sí’ de 178% para la condición Vídeo y Sonido, de 167% para la condición Sólo Vídeo, y de 172% para la condición Sólo Sonido. No se hallaron diferencias significativas entre las tres condiciones sensoriales (Vídeo y Sonido, Sólo Vídeo, y Sólo Sonido; ANOVA, P>0.05). El porcentaje de la disminución de descarga de esta población neuronal tras la presentación de la recompensa con respecto a la descarga basal fue en los ensayos ‘Sí’ de 264% para la condición Vídeo y Sonido, de 250% para la condición Sólo Vídeo, y de 247% para la condición Sólo Sonido. La duración media del cambio de actividad para las tres condiciones sensoriales fue 570±72 ms. El cambio de actividad en las tres condiciones sensoriales tuvo una latencia media de 183±64 ms tras la presentación de la recompensa. No se encontraron diferencias significativas en la latencia media entre las neuronas que mostraban un aumento de actividad tras la presentación de recompensa y las que mostraron una disminución de actividad tras la presentación de recompensa (ANOVA, P>0.05). Tampoco se encontraron diferencias significativas en la latencia media entre las tres condiciones sensoriales (ANOVA, P>0.05). El IM de la población de las neuronas de recompensa que mostraron un aumento de actividad fue de 0.99 calculado conjuntamente para las tres condiciones sensoriales (Vídeo y Sonido, Sólo Vídeo, y Sólo Sonido), y el IM de la población de las neuronas de recompensa que mostraron una disminución de actividad fue de 0.97 calculado conjuntamente para las tres condiciones sensoriales (Vídeo y Sonido, Sólo Vídeo, y Sólo Sonido). Actividad neuronal 86 Figura 35: Histogramas y rasters de dos ‘neuronas de recompensa’. A. Neurona que aumenta su actividad tras la obtención de recompensa en los ensayos ‘Sí’. Histogramas y rasters sincronizados con la aparición de la recompensa para los ensayos ‘Sí’. B. Neurona que disminuye su actividad tras la obtención de recompensa. Histogramas y rasters sincronizados con la aparición de la recompensa para los ensayos ‘Sí’. Bin=20 ms. Neuronas registradas con las tres condiciones sensoriales (Vídeo y Sonido, Sólo Vídeo, y Sólo Sonido). Bin=20 ms. En los ensayos ‘No’ en los que los animales no recibían recompensa no se observó ningún cambio en la actividad neuronal. En 26 de las 38 neuronas de recompensa se llevó a cabo un control denominado Sólo Recompensa, que consistía en la liberación de gotas de zumo sin que el animal estuviese realizando la tarea y sin presentación estimular previa (Figura 36B). Estas neuronas modificaban su actividad tras la presentación de la recompensa bajo estas condiciones (ANOVA, P<0.05). El porcentaje del incremento de descarga de estas neuronas tras la presentación de la recompensa con respecto a la descarga basal fue de 144%. La duración media del cambio de actividad fue 600 ms. La latencia media del comienzo del cambio de actividad de este grupo neuronal fue de 209±108 ms tras la presentación de la Resultados 87 recompensa. El IM de la población de las neuronas de recompensa para el control Sólo Recompensa fue de 0.97. Figura 36: Histogramas de población de las neuronas de recompensa. Estas neuronas mostraron un aumento de actividad tras la obtención de la recompensa en los ensayos ‘Sí’. A. Arriba: Histogramas sincronizados con la presentación de la recompensa para los ensayos ‘Sí’. Medio: Mismos histogramas representados arriba, pero sincronizados con la presentación del estímulo para los ensayos ‘Sí’. Abajo: Histogramas de las mismas neuronas representadas en las filas anteriores pero sincronizados con la presentación del estímulo para los ensayos ‘No’. Bin= 20ms. N=26 neuronas registradas con las tres condiciones sensoriales (Vídeo y Sonido, Sólo Vídeo, y Sólo Sonido). B. Histogramas sincronizados con la presentación de la recompensa para los ensayos ‘Sólo Recompensa’. N=22. Bin=20 ms. Actividad neuronal 88 2.4 Actividad neuronal relacionada con más de un evento de la tarea Algunas de las neuronas registradas mostraron cambios de actividad relacionados con más de un tipo de estímulo. Así, ocho neuronas presentaron un aumento de la frecuencia de descarga ante la presentación del estímulo visual y alrededor del pulsado de palanca (Figura 37, ANOVA, P<0.05). Siete neuronas presentaron un aumento de la frecuencia de descarga bimodal, alrededor del pulsado de palanca y tras la presentación de la recompensa (ANOVA, P<0.05). Estas neuronas han sido incluidas dentro del grupo funcional de neuronas relacionadas con la acción porque su cambio de actividad más evidente estaba en relación con el pulsado de la palanca. Figura 37: Histogramas de población de las neuronas que aumentan su actividad tras la presentación del estímulo visual y la ejecución del movimiento. A, Histogramas sincronizados con el pulsado de palanca para los ensayos ‘Sí’. B, Histogramas sincronizados con la aparición del estímulo para los ensayos ‘Sí’ y los ensayos ‘No’. N=8 neuronas registradas con las tres condiciones sensoriales (Vídeo y Sonido, Sólo Vídeo, y Sólo Sonido). Bin=20 ms. Resultados 89 2.5 Actividad neuronal relacionada con la acción y tiempo de reacción Hemos analizado el inicio de la activación neuronal en las neuronas relacionadas con la acción considerándolas conjuntamente y de forma separada en cada animal. Para esto hemos determinado el momento del inicio de la activación en cada neurona individual y estos valores se compararon entre ambos animales (ANOVA).En el caso de las condiciones Vídeo y Sonido, y Solo Vídeo, en el animal 1 (N=13), la activación de esta población neuronal se iniciaba a los 269±75 ms tras la aparición del vídeo, mientras que en el animal 2 (N=32) lo hacía a los 274±59 ms. Estas diferencias no fueron significativas (ANOVA, P>0.05). Para la condición Sólo Sonido, la activación aparecía a los 305±99 ms tras el inicio del estímulo auditivo en el animal 1 (N=12), mientras que para el animal 2 (N=31) aparecía a los 304±133 ms. Estas diferencias no fueron significativas (ANOVA, P>0.05). Actividad neuronal 96 2.1 Neuronas visuales Las neuronas que hemos denominado neuronas visuales mostraban cambios en su actividad relacionados con el componente visual de la tarea. Estos cambios aparecían inmediatamente después de la aparición del vídeo tanto en los ensayos ‘Sí’ como en los ensayos ‘No’ (Figura 26), lo cual sugiere que están relacionados con el procesamiento de estímulos visuales y no con la actividad motora o la presentación de recompensa. Esto también se refleja en la latencia de estas neuronas (Figura 23), que es similar a las descritas por otros autores en el putamen u otras estructuras como el caudado (Hikosaka y cols., 1989a; Kimura, 1992; Romero y cols., 2008). Un trabajo anterior de nuestro grupo de investigación ya describió neuronas del putamen y del caudado que se activaban tras la presentación de un estímulo visual en los ensayos sin actividad motora ni aparición de recompensa (Romero y cols., 2008). Varios estudios han mostrado neuronas del putamen que cambian su actividad tras la presentación de estímulos que predicen la aparición de la recompensa (Aosaki y cols., 1994; Kimura y cols. 1984). Sin embargo, en el presente estudio la actividad neuronal se incrementa tras la presentación del estímulo visual para los ensayos ‘Sí’, y también para los ensayos ‘No’ (que no son recompensados). Además, en la condición Sólo Sonido, en la que era necesario pulsar palanca para obtener recompensa, las neuronas visuales no modificaban su actividad, lo cual demuestra que no estaban relacionadas con la ejecución motora ni con la aparición del estímulo auditivo o de la recompensa. El perfil de respuesta de las neuronas visuales estudiadas en el presente trabajo sugiere que están relacionadas con el procesamiento de información visual pura. Otros autores ya han descrito actividad neuronal relacionada con estímulos visuales en el putamen (Kimura, 1992) y en el caudado (Hikosaka y cols., 1989a, 1898b) en monos rhesus. Además, Nagy y cols. (2003, 2008) describieron esta actividad visual en otros núcleos pertenecientes a los GB como la substancia negra y el núcleo del caudado en Discusión 97 gatos. Sin embargo, en los anteriores trabajos la actividad neuronal relacionada con estímulos visuales también estaba modulada por la ejecución de una acción (Kimura, 1992). Otros autores encontraron actividad visual pero no pudieron demostrar con claridad si estaba o no modulada por la recompensa (Hikosaka, 1989a, 1898b, Nagy y cols., 2003, 2008). En nuestros experimentos queda demostrado que la actividad relacionada con el componente visual de la tarea no está modulada por la ejecución motora o por la obtención de recompensa. Es posible que la actividad de estas neuronas visuales sea una señal que indique al putamen que se ha producido un evento relevante que puede requerir la realización o no de un movimiento. Sin embargo, esta información visual puede no ser suficiente para decidir si se debe o no realizar este movimiento. De hecho, estas neuronas se activan en la misma forma durante los ensayos ‘Sí’ que requieren movimiento que en los ensayos ‘No’ que no requieren movimiento. La orden para realizar o no realizar el movimiento probablemente provenga de la corteza prefrontal, área cortical de la que el putamen recibe conexiones (Nakano y cols., 2000; Parent y Hazrati, 1995), y está relacionada con la toma de decisiones (Genovesio y cols., 2011; Watanabe y Funahashi, 2007). La información visual que nosotros hemos encontrado probablemente llegue al putamen proveniente de los colículos superiores a través del tálamo (McHaffie y cols., 2005; Redgrave y cols., 2010), y de la corteza, de la que recibe conexiones directas (Bolam y cols., 2009, Middleton y Strick, 1996, Seger, 2007). Kimura (1992) registró en primates neuronas del putamen que se activaban ante la presentación de estímulos visuales. Estas neuronas se agrupaban en dos poblaciones en función de su perfil de activación. Una población mostraba una alta activación ante los estímulos visuales que indicaban al animal que debía realizar un movimiento para obtener recompensa y una baja activación ante los estímulos visuales que indicaban que no debía realizar ningún movimiento. Estos datos sugieren que esta población de neuronas del putamen procesa tanto la información visual como la información relacionada con la recompensa. La otra población neuronal mostraba la misma actividad ante los dos tipos de estímulos visuales, lo que significa que esta población de neuronas únicamente procesa la Actividad neuronal 98 información visual. Igualmente Graziano y Gross (1993) describieron actividad visual en el putamen de primates y Schulz y cols. (2009) en el estriado de ratas. 2.2 Neuronas relacionadas con la acción Las neuronas relacionadas con la acción se activaban alrededor del pulsado de palanca. El cambio de actividad en estas neuronas ocurre después del de las neuronas visuales y antes del de las neuronas de recompensa, dato que apoya la distinción de las tres poblaciones neuronales mostradas en la Figura 23. La actividad de las neuronas relacionadas con la acción durante las falsas alarmas y los errores por omisión demuestran su implicación en el acto del pulsado de la palanca (Figura 29). Así, cuando el animal pulsa palanca ante un ensayo ‘No’ (falsa alarma) la actividad neuronal aparece alrededor de la palanca, mientras que cuando no pulsa palanca ante un ensayo ‘Sí’ (error por omisión) no se hallaron cambios de la actividad basal. La actividad motora hallada en el putamen puede ser el resultado de las conexiones de los GB con la corteza motora. De hecho, algunos autores han descrito activación de la corteza motora que precedía a la activación del estriado, formado por putamen y caudado (Crutcher y Alexander, 1990; Fuji y Graybiel, 2005). Estos resultados apoyan la existencia de un procesamiento secuencial de la información motora. En primer lugar se activa la corteza motora, que envía información a los GB, quienes posteriormente procesan esta información y la envían de nuevo a la corteza a través del tálamo y al tronco encefálico. A través de las tres vías de los GB (directa, indirecta e hiperdirecta) la actividad de los núcleos de salida de los GB (el GPi y la SNr), que reciben conexiones del putamen (Bolam y cols., 2000; Marchand, 2010), influye en la actividad cortical a través del tálamo. Cuando los núcleos de salida de los GB son inhibidos mediante la vía directa aumenta la actividad cortical dando lugar a Discusión 99 una activación motora. Cuando los núcleos de salida de los GB son activados mediante la vía indirecta o hiperdirecta disminuye la actividad cortical provocando una inhibición motora. Estas tres vías de los GB son las encargadas de ejecutar los movimientos requeridos por el entorno (vía directa) y de suprimir los movimientos inadecuados e innecesarios (vía indirecta e hiperdirecta). Nagy y cols. (2006) estudiaron neuronas del colículo superior que no mostraban cambios de actividad durante los movimientos realizados por el animal para pulsar un botón, en cambio se activaban durante la fase de pulsado. Estas neuronas fueron clasificadas como motoras-somatosensoriales, ya que su actividad estaba relacionada con el contacto de la mano con el botón pulsado, y no con el movimiento llevado a cabo para pulsar el botón. En nuestros experimentos el animal mantenía la mano sobre la palanca durante todos los ensayos, pero sólo la pulsaba en los ensayos ‘Sí’. Por ello, podemos afirmar que las neuronas relacionadas con el acto motor no están moduladas por el componente somatosensorial del contacto con la palanca, si no que lo están por el pulsado de palanca. Las neuronas relacionadas con la acción las hemos clasificado en tres grupos, en función del momento y del modo en que se activan alrededor del pulsado de la palanca. Estos tres grupos, pre-acción, peri-acción y de activación-supresión, podrían tener diferentes funciones en la ejecución del movimiento. Neuronas pre-acción. Este grupo de neuronas se activaba antes del pulsado de palanca por lo que fueron clasificadas como neuronas pre-acción (Figura 32). La latencia de estas neuronas y la ausencia de actividad en los ensayos en los que no se requería pulsado de palanca (ensayos ‘No’) sugieren que su actividad está relacionada con el inicio o con la programación del movimiento. Es posible que las neuronas preacción procesen información motora relacionada con la preparación de un acto motor para obtener recompensa. Varios estudios han descrito este tipo de actividad en los GB. Por ejemplo, Romo y cols. (1992) registraron neuronas en el estriado de primates que se activaban antes de la ejecución de un movimiento. Asimismo, un estudio reciente en Actividad neuronal 100 primates (Deffains y cols., 2010) describió neuronas en el putamen que presentaban cambios en su descarga basal antes de los movimientos realizados para tocar una pantalla tras la presentación de varios estímulos. Neuronas peri-acción. Un segundo grupo de neuronas aumentaba su actividad antes del pulsado de palanca y esta actividad se mantenía durante y tras el pulsado de palanca. Estas neuronas fueron clasificadas como neuronas peri-acción (Figura 33). Su perfil de activación sugiere que están relacionadas de forma directa con la ejecución del movimiento. Varios autores han hallado neuronas del putamen mostrando cambios de actividad durante la realización de un movimiento (Deffains y cols., 2010; Filatova y cols. 2005; Ueda y Kimura, 2003). Estos hallazgos confirman el papel que el putamen juega en la ejecución de actos motores. Neuronas activación-supresión. El último grupo de neuronas relacionadas con la acción modificaba su actividad alrededor del pulsado de la palanca pero, a diferencia de las anteriores, aumentaban su actividad en los ensayos ‘Sí’ (en los que se pulsaba palanca) y disminuían su actividad durante la misma ventana temporal en los ensayos ‘No’ (en los que no se realizaba el pulsado de la palanca) (Figura 34). Este perfil de actividad sugiere que estas neuronas están relacionadas con la ejecución de movimiento en los ensayos ‘Sí’ y con la ‘omisión’ del movimiento en los ensayos en los que no se lleva a cabo ningún acto motor (ensayos ‘No’). De los tres subgrupos descritos, quizás el último sea el más interesante. Durante los experimentos hemos monitorizado la mano del animal y, como ya se ha dicho, hemos comprobado que el animal la mantenía sobre la palanca tanto en los ensayos ‘Sí’ como en los ensayos ‘No’, pero no hemos observado ningún tipo de movimiento de la mano o el brazo durante los ensayos ‘No’. Los cambios de actividad encontrados en las neuronas de activación-supresión tanto en los ensayos ‘Sí’ como en los ensayos ‘No’ pueden deberse a la automatización del movimiento. Algunos estudios han demostrado que cuando un animal aprende a ejecutar correctamente una tarea Discusión 101 operante, los movimientos se automatizan con el tiempo dando lugar a cambios en la actividad neuronal (Barnes y cols. 2005; Tang y cols. 2007). Asimismo se ha propuesto que las conexiones entre los GB y la corteza prefrontal son responsables de la adquisición de movimientos automáticos (Middleton y Strick, 2002; Draganski y cols., 2008), hallazgos que apoyan la relación del putamen con la ejecución de movimientos automáticos. Otra posibilidad es que la disminución de actividad neuronal durante los ensayos ‘No’ podría estar relacionada con la supresión del movimiento. El incremento de actividad de las neuronas de este grupo estaría entonces relacionada con el movimiento de pulsado, mientras que la supresión de su actividad reflejaría el efecto de alguna aferencia inhibitoria relacionada con la supresión activa del acto motor. Algunas estructuras del cerebro envían conexiones al putamen para cancelar o modular la actividad motora. De hecho la corteza frontal inferior del hemisferio derecho ha sido relacionada con la inhibición de una respuesta iniciada en la corteza (Aron y cols., 2004). Esta área cortical puede inhibir los planes motores a través de sus conexiones con los GB. En apoyo de esta hipótesis está el hecho de que algunos autores han descrito neuronas del estriado que se activan durante ensayos que requieren inhibición de movimiento (Apicella y cols., 1992; Schultz y Romo, 1992; Romero y cols. 2008). Finalmente, otros autores (Lee y Assad, 2003; Lee y cols., 2006) defienden que la actividad neuronal en ausencia de movimientos puede indicar que el movimiento ha sido suprimido correctamente. Por ello, según estos autores esta actividad no estaría relacionada directamente con la ejecución motora. El papel del putamen en la supresión de movimiento puede tener especial relevancia en el conocimiento de trastornos motores como la enfermedad del Parkinson. Esta alteración de los GB se caracteriza por una disminución de los movimientos voluntarios y un incremento de los movimientos involuntarios. Los estudios sobre el mecanismo encargado de suprimir movimientos de forma voluntaria pueden ayudar a avanzar en la etiología de este tipo de desórdenes motores. Actividad neuronal 102 Estas neuronas clasificadas como activación-supresión presentan un perfil de activación que, al menos que nosotros conozcamos, no ha sido descrito por otros autores: la misma neurona aumenta su actividad durante los ensayos motores y disminuye su actividad durante los ensayos no motores. Aunque nosotros aquí sugerimos algunas ideas sobre el papel que pueden jugar en la realización de movimientos, se necesitan experimentos adicionales para establecer una conclusión más clara sobre su función. 2.3 Neuronas de recompensa El tercer grupo de neuronas que hemos encontrado en el putamen modificaban su actividad tras la presentación de la recompensa, por lo que fueron clasificadas como neuronas de recompensa (Figura 36). Varios estudios han demostrado que la actividad del putamen está modulada no sólo por la presentación de la recompensa (Apicella y cols., 1997; Ravel y cols., 2003), sino también por los estímulos que predicen la presentación de la recompensa (Aosaki y cols., 1994; Kimura y cols., 1984). En este último caso, las neuronas responden a la expectativa de futuras recompensas. En el presente trabajo no encontramos este tipo de actividad neuronal debido probablemente al diseño del experimento. En nuestra tarea los animales recibían la recompensa inmediatamente después del pulsado de palanca por lo que no era posible la aparición de la expectación de recompensa. En los ensayos que hemos realizado para determinar la influencia real de la recompensa, el animal recibía una recompensa sin realizar la tarea y sin tener ningún tipo de estímulo previo o posterior a recibirla. De esta forma hemos constatado que las neuronas de recompensa presentaban la misma activación ante la presentación de recompensa en los ensayos realizados durante la tarea normal que cuando se le daba una gota de zumo sin realizar la tarea y sin presentación de ningún tipo de estímulo (Figura Discusión 103 36B). Esto indica que el putamen procesa información directamente relacionada con la recompensa independientemente de la realización de la tarea. También hemos comprobado que durante la realización de la tarea los animales realizaban movimientos bucales similares a los realizados cuando obtenía recompensa, pero en estos casos no hemos observado que se produjesen cambios en la actividad neuronal. Las neuronas implicadas en el procesamiento de estímulos visuales y de recompensa estudiadas en este trabajo apoyan la hipótesis de que los GB procesan información sobre los eventos de nuestro entorno que son relevantes (Blazquez y cols., 2002; Lee y cols., 2006; Yamada y cols., 2004). Las neuronas del putamen que reciben información sobre estos eventos podrían modular los circuitos entre la corteza y los GB para ajustar los movimientos y producir la acción más apropiada al contexto. 2.4 Neuronas con respuestas a varios eventos La mayor parte de las neuronas que hemos registrado estaban moduladas por un único tipo de estímulo, sin embargo un pequeño número de neuronas mostraron cambios de actividad ante diferentes tipos de estímulos sensoriales. En ocho neuronas la actividad estaba modulada por el estímulo visual y por el movimiento, mientras que en otras siete neuronas hemos observado modulación de su actividad por el movimiento y la presentación de la recompensa. Ello indica que algunas neuronas del putamen procesan diferentes tipos de información de forma simultánea y posiblemente la integren para generar señales motoras. En apoyo a estos resultados, otros autores también han encontrado neuronas que se activaban simultáneamente ante diferentes condiciones sensoriales. Por ejemplo, Pasquereau y cols. (2007) estudiaron neuronas del estriado moduladas por la dirección del movimiento de la mano sobre la palanca, y la probabilidad de recompensa. También Kimura (1992) estudió en primates neuronas del putamen que mostraban actividad relacionada con estímulos visuales y con la ejecución de un movimiento. El hecho de que una misma neurona del putamen procese diferentes Actividad neuronal 104 tipos de información sugiere que este núcleo procesa información sobre varios eventos relevantes para el animal. Parte de esta información la podría recibir a través de conexiones de diferentes áreas de la corteza (McFarland y Haber, 2000; Nakano y cols., 2000). 2.5 Neuronas fásicas y neuronas tónicas en el putamen La actividad del putamen se ha clasificado en fásica y tónica en función de varios criterios, como ya se ha explicado en el Apartado 2.2.1 de la Introducción. En función de la descarga basal, las neuronas visuales registradas en el presente trabajo podrían ser clasificadas como fásicas (PANs) ya que presentaban una descarga basal baja (entre 0.3 y 2 spikes/s). Por otro lado, las neuronas relacionadas con la acción y las neuronas de recompensa podrían ser clasificadas como tónicas (TANs) debido a su mayor descarga basal (entre 2.1 y 8 spikes/s). Sin embargo, estos resultados no son completamente coherentes con otras observaciones descritas en la literatura. Según varios autores, las neuronas PANs están relacionadas con la actividad motora, mientras que las TANs están relacionadas con el procesamiento de estímulos, como la recompensa o las señales que predicen ésta (Ravel y cols., 2001, 2003; Deffains y cols., 2010). Aunque nuestros resultados concuerdan con los ya publicados en el caso de las neuronas de recompensa, discrepan con los publicados en relación con las neuronas visuales y con las neuronas relacionadas con la acción. Sin embargo, otros autores, como Lee y cols. (2006), encontraron neuronas relacionadas con el movimiento clasificadas como TANs, lo que coincide con nuestras observaciones. Además, esta actividad se observó en ausencia de estímulos sensoriales, por lo que no estaba relacionada con el procesamiento de información sensorial. Estos hallazgos sugieren que las diferencias funcionales entre neuronas PANs y TANs no están todavía claramente establecidas. Discusión 105 2.6 Otros aspectos estudiados A pesar de haber encontrado actividad neuronal relacionada con el procesamiento de estímulos visuales no hemos encontrado neuronas que respondiesen a estímulos auditivos. De hecho, en la condición Sólo Sonido las neuronas no modificaban su descarga basal tras la presentación del sonido en ninguno de los dos tipos de ensayos (ensayos ‘Sí’ y ensayos ‘No’). Algunos autores han descrito neuronas en el putamen que procesan información auditiva. Por ejemplo, esta actividad auditiva fue descrita por Kimura (1992) en el putamen de primates, por Chudler y cols. (1995) en el putamen de ratas, por Hikosaka y cols. (1989a) en el caudado de primates, y por Nagy y cols. (2005, 2006) en la sustancia negra y el caudado de gatos. El putamen recibe información del lóbulo temporal donde se encuentra la corteza auditiva. Exactamente estas conexiones llegan al estriado asociativo, formado por el putamen rostral a la comisura anterior y la mayor parte del caudado, excepto la zona próxima a la cápsula interna (Parent y Hazrati, 1995). A pesar de que en nuestros experimentos hemos registrado neuronas del estriado asociativo, no hemos encontrado respuestas auditivas. Ello podría deberse a que los estímulos auditivos utilizados en nuestros experimentos no son los adecuados para activar a las neuronas auditivas del putamen. También pudo haber ocurrido que, a pesar de que según nuestros cálculos hemos realizado registros en zonas en las que otros autores encontraron respuestas auditivas, nosotros no hayamos encontrado este tipo de neuronas. El estudio de Kimura (1992) utiliza el sonido producido por la válvula del solenoide como estímulo auditivo seguido de recompensa, por lo que la actividad neuronal que aparece tras este sonido podría estar modulada por la obtención de recompensa y no por la presentación del sonido. En cuanto a la lateralización en los GB, en nuestro estudio el uso de la mano derecha o de la mano izquierda para ejecutar la tarea no influyó en el perfil de activación de las neuronas motoras (Figura 30). Varios trabajos han demostrado que los GB, a diferencia de la corteza motora, se activan bilateralmente durante la ejecución de movimientos unilaterales (Gerardin y cols., 2003; Scholz y cols., 2000). En nuestro REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Referencias bibliográficas 115 Afanas'ev SV, Tolkunov BF, Rogatskaya NB, Orlov AA, Filatova EV (2004). Sequential rearrangements of the ensemble activity of putamen neurons in the monkey brain as a correlate of continuous behavior. Neurosci Behav Physiol, 34:251-258. 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