Carcinoma oral de células escamosas, evaluación pronóstica de variables clínicas, histológicas e inmunohistoquímicas

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGÍA DEPARTAMENTO DE ESTOMATOLOGÍA CARCINOMA ORAL DE CÉLULAS ESCAMOSAS: EVALUACIÓN PRONÓSTICA DE VARIABLES CLÍNICAS, HISTOLÓGICAS E INMUNOHISTOQUÍMICAS TESIS DOCTORAL MÁRCIO DINIZ FREITAS Santiago de Compostela, Marzo de 2005 DIRECTOR: Prof. Dr. Abel García García CO-DIRECTORES: Prof. Dr. Tomás García-Caballero Parada Prof. Dr. José Manuel Gándara Rey AGRADECIMIENTOS Deseo expresar mi más sincero agradecimiento a todas las personas que han prestado su ayuda y colaboración en la realización de la presente tesis, y de forma muy especial: Al Prof. D. Abel García García, por el impulso para el inicio y continuidad de la investigación, así como por su amistad, confianza y apoyo permanente durante todos esos años. Al Prof. D. José Manuel Gándara Rey, maestro y amigo, por sus sabios consejos y su estímulo constante a lo largo de la investigación. Al Prof. D. Tomás García-Caballero Parada, por sus valiosos conocimientos y aportaciones en la investigación y por su desinteresada colaboración y disponibilidad en todo momento. Al Dr. José Antúnez López por su colaboración en la valoración de las piezas histopatológicas. A Elena Couso Folgueiras e Inés Fernández Campos, y todo el personal del Servicio de Anatomía Patológica del Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela, por su ayuda en el procesado de las muestras y en la obtención de los resultados immunohistoquímicos. Al Profesor Xosé Luís Otero Cepeda, por sus orientaciones en el análisis estadístico de los datos. Al personal del Archivo Central del Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela por agilizar el proceso de revisión de las historias clínicas. Índice 1 I. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS....................................................................................................... 8 II. INTRODUCCIÓN............................................................................................................................... 11 II.1.CÁNCER ORAL.................................................................................................................................. 12 II.1.A. Concepto............................................................................................................................ 12 II.1.B. Epidemiología.................................................................................................................... 13 II.1.C. Clínica................................................................................................................................ 14 II.1.D. Histología .......................................................................................................................... 14 II.1.D.a. Frente de Invasión Tumoral.............................................................................. 15 II.1.D.b. Modo de Invasión Tumoral.............................................................................. 16 II.1.E. Topografía.......................................................................................................................... 17 II.1.E.a. Lengua.............................................................................................................. 17 II.1.E.b. Suelo de boca.................................................................................................... 17 II.1.E.c. Reborde alveolar............................................................................................... 18 II.1.E.d. Mucosa yugal.....................................................................................................18 II.1.E.e. Paladar.............................................................................................................. 19 II.1.E.f. Trígono retromolar............................................................................................ 19 II.1.F. Estadiaje............................................................................................................................. 19 II.1.G. Etiopatogenia..................................................................................................................... 21 II.1.H. Pronóstico.......................................................................................................................... 24 II.1.I. Segundos Tumores Primarios y Cancerización de Campo................................................. 25 II.1.J. Tratamiento......................................................................................................................... 28 II.1.J.a. Cirugía............................................................................................................... 29 II.1.J.b. Vaciamiento Ganglionar Cervical..................................................................... 30 II.1.J.c. Radioterapia....................................................................................................... 31 II.1.J.d. Quimioterapia.................................................................................................... 32 II.1.J.e. Futuros conceptos en el tratamiento.................................................................. 32 II.2. BASES GENÉTICAS DEL CÁNCER ORAL................................................................................... 36 II.2.A. Ciclo celular...................................................................................................................... 36 II.2.A.a. Regulación del ciclo celular y cáncer oral....................................................... 39 II.2.B. Oncogenes......................................................................................................................... 40 II.2.B.a. Receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR).................................. 40 II.2.B.b. Ciclina D1........................................................................................................ 43 II.2.C. Genes supresores de tumores............................................................................................ 44 II.2.C.a. Gen P53........................................................................................................... 44 II.2.C.b. Gen P27............................................................................................................ 46 II.2.D. Proliferación celular.......................................................................................................... 47 II.2.D.a. Antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA)......................................... 48 II.2.D.b. Ki-67................................................................................................................ 48 Índice 2 II.2.E. Apoptosis........................................................................................................................... 51 II.2.E.a. Bcl-2................................................................................................................. 52 II.2.E.b. Survivina.......................................................................................................... 53 II.2.F. Angiogénesis..................................................................................................................... 54 II.2.F.a. Factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF).......................................... 55 II.2.G. Invasión y metástasis........................................................................................................ 55 II.2.G.a. Laminina 5 γ2.................................................................................................. 56 II.2.G.b. Cadherina-E..................................................................................................... 58 II.3.EPIGENÉTICA DEL CÁNCER ORAL............................................................................................. 59 III. MATERIAL Y MÉTODOS............................................................................................................... 61 III.1. SELECCIÓN DE LOS PACIENTES................................................................................................ 62 III.1.A. Criterios de inclusión y exclusión.................................................................................... 62 III.2. DATOS CLÍNICOS........................................................................................................................... 62 III.2.A. Factores de riesgo............................................................................................................ 63 II.2.A.a. Tabaco.............................................................................................................. 63 II.2.A.b. Alcohol………………………………………………………………………. 63 III.2.B. Evolución de la enfermedad............................................................................................. 63 III.2.C. Evolución de los pacientes............................................................................................... 64 III.3. ESTUDIO HISTOLÓGICO CONVENCIONAL.............................................................................. 64 III.3.A. Grado de diferenciación histológica................................................................................ 64 III.3.B. Modo de invasión tumoral............................................................................................... 64 III.3.C. Profundidad de invasión tumoral..................................................................................... 65 III.3.D. Invasión perineural.......................................................................................................... 65 III.3.E. Estado de los márgenes quirúrgicos................................................................................. 65 III.4. ESTUDIO INMUNOHISTOQUÍMICO........................................................................................... 66 III.4.A. Preparación de los cortes de parafina.............................................................................. 66 III.4.B. Recuperación antigénica.................................................................................................. 66 III.4.B.a. Ki-67/MIB-1 y Laminina 5 γ2........................................................................ 66 III.4.B.b. EGFR.............................................................................................................. 66 III.4.B.c. Cadherina-E.................................................................................................... 66 III.4.C. Técnica inmunohistoquímica.......................................................................................... 67 III.4.D. Valoración de los marcadores inmunohistoquímicos..................................................... 69 III.4.D.a. Cuantificación de la expresión de Ki-67/MIB-1............................................ 69 III.4.D.b. Cuantificación de la expresión de EGFR....................................................... 70 III.4.D.c. Cuantificación de la expresión de laminina 5 γ2............................................ 70 III.4.D.d. Cuantificación de la expresión de cadherina-E.............................................. 71 III.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO.............................................................................................................. 71 III.5.a. Representación gráfica de los resultados.......................................................................... 72 Índice 3 IV. RESULTADOS................................................................................................................................... 74 IV.1.SELECCIÓN DE LOS PACIENTES................................................................................................. 75 IV.2.DATOS CLÍNICOS........................................................................................................................... 75 IV.2.A. Edad y sexo..................................................................................................................... 75 IV.2.B. Factores de riesgo............................................................................................................ 75 IV.2.B.a. Tabaco............................................................................................................ 75 IV.2.B.b. Alcohol……………………………………………………………………... 76 IV.2.B. Localización del tumor primario..................................................................................... 76 IV.2.C. Estadio TNM................................................................................................................... 76 IV.2.C.a. Tamaño del tumor primario............................................................................ 76 IV.2.C.b. Ganglios linfáticos cervicales (estadio N)...................................................... 77 IV.2.D. Estadio Clínico................................................................................................................. 77 IV.2.E. Tratamiento...................................................................................................................... 78 IV.3. EVOLUCIÓN DE LA ENFERMEDAD........................................................................................... 79 IV.3.A. Recidivas locales............................................................................................................. 79 IV.3.B. Recidivas regionales........................................................................................................ 79 IV.3.C. Metástasis a distancia y segundos tumores primarios..................................................... 79 IV.4. EVOLUCIÓN DEL PACIENTE....................................................................................................... 79 IV.5. ESTUDIO HISTOLÓGICO.............................................................................................................. 80 IV.5.A. Grado de diferenciación histológica................................................................................ 80 IV.5.B. Modo de Invasión Tumoral............................................................................................. 80 IV.5.C. Profundidad de Invasión Tumoral................................................................................... 82 IV.5.D. Invasión Perineural......................................................................................................... 83 IV.5.E. Estado de los márgenes quirúrgicos................................................................................ 83 IV.6. ESTUDIO INMUNOHISTOQUÍMICO........................................................................................... 84 IV.6.A. Índice de Proliferación celular (MIB-1).......................................................................... 84 IV.6.A.a. Correlación entre MIB-1 y Edad.................................................................... 86 IV.6.A.b. Correlación entre MIB-1 y Sexo.................................................................... 86 IV.6.A.c. Correlación entre MIB-1 y Localización........................................................ 87 IV.6.A.d. Correlación entre MIB-1 y Estadio TNM....................................................... 88 IV.6.A.e. Correlación entre MIB-1 y Estadio clínico..................................................... 89 IV.6.A.f. Correlación entre MIB-1 y Grado de diferenciación histológica.................... 90 IV.6.A.g. Correlación entre MIB-1 y Modo de invasión tumoral.................................. 90 IV.6.A.h. Correlación entre MIB-1 y Profundidad de invasión tumoral........................ 91 IV.6.B. Expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR)............................ 93 IV.6.B.a. Correlación entre EGFR y Edad..................................................................... 95 IV.6.B.b. Correlación entre EGFR y Sexo..................................................................... 96 IV.6.B.c. Correlación entre EGFR y Localización......................................................... 97 IV.6.B.d. Correlación entre EGFR y Estadio TNM....................................................... 97 IV.6.B.e. Correlación entre EGFR y Estadio clínico...................................................... 98 Índice 4 IV.6.B.f. Correlación entre EGFR y Grado de diferenciación histológica.................... 98 IV.6.B.g. Correlación entre EGFR y Modo de invasión tumoral................................... 99 IV.6.B.h. Correlación entre EGFR y Profundidad de invasión tumoral......................... 99 IV.6. C. Expresión de laminina 5 γ2........................................................................................... 100 IV.6.C.a. Correlación entre laminina 5 γ2 y Edad........................................................ 103 IV.6.C.b. Correlación entre laminina 5 γ2 y Sexo........................................................ 104 IV.6.C.c. Correlación entre laminina 5 γ2 y Localización........................................... 104 IV.6.C.d. Correlación entre laminina 5 γ2 y Estadio TNM.......................................... 105 IV.6.C.e. Correlación entre laminina 5 γ2 y Estadio clínico........................................ 106 IV.6.C.f. Correlación entre laminina 5 γ2 y Grado de diferenciación histológica....... 106 IV.6.C.g. Correlación entre laminina 5 γ2 y Modo de invasión tumoral..................... 107 IV.6.C.h. Correlación entre laminina 5 γ2 y Profundidad de invasión tumoral........... 107 IV.6.D. Expresión de cadherina-E............................................................................................. 108 IV.6.D.a. Correlación entre cadherina-E y Edad.......................................................... 110 IV.6.D.b. Correlación entre cadherina-E y Sexo.......................................................... 111 IV.6.D.c. Correlación entre cadherina-E y Localización.............................................. 111 IV.6.D.d. Correlación entre cadherina-E y Estadio TNM............................................ 112 IV.6.D.e. Correlación entre cadherina-E y Estadio clínico.......................................... 113 IV.6.D.f. Correlación entre cadherina-E y Grado de diferenciación histológica......... 113 IV.6.D.g. Correlación entre cadherina-E y Modo de invasión tumoral........................ 114 IV.6.D.h. Correlación entre cadherina-E y Profundidad de invasión tumoral............. 114 IV.6.E. Correlación entre marcadores inminohistoquímicos..................................................... 115 IV.6.E.a. Correlación entre Índice de proliferación celular (MIB-1) y EGFR............ 115 IV.6.E.b. Correlación entre Índice de proliferación celular (MIB-1) y Laminina 5 γ2.115 IV.6.E.c. Correlación entre Índice de proliferación celular (MIB-1) y Cadherina-E....116 IV.6.E.d. Correlación entre EGFR y Laminina 5 γ2.................................................... 117 IV.6.E.e. Correlación entre EGFR y Cadherina-E........................................................ 117 IV.6.E.f. Correlación entre laminina 5 γ2 y Cadherina-E............................................ 118 IV.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LAS RECIDIVAS LOCALES.................................................... 118 IV.7.A. Parámetros Clínicos....................................................................................................... 118 IV.7.A.a. Edad.............................................................................................................. 118 IV.7.A.b. Sexo.............................................................................................................. 119 IV.7.A.c. Localización................................................................................................. 120 IV.7.A.d. Estadio TNM................................................................................................ 120 IV.7.A.e. Estadio clínico.............................................................................................. 121 IV.7.A.f. Tratamiento del tumor primario................................................................... 122 IV.7.B. Parámetros Histológicos................................................................................................ 122 IV.7.B.a. Grado de diferenciación histológica............................................................ 122 IV.7.B.b. Modo de invasión tumoral........................................................................... 123 IV.7.B.c. Profundidad de invasión tumoral................................................................. 123 Índice 5 IV.7.B.d. Invasión perineural....................................................................................... 124 IV.7.B.e. Estado de los márgenes quirúrgicos............................................................. 124 IV.7.C. Parámetros Inmunohistoquímicos................................................................................. 125 IV.7.C.a. Índice de proliferación celular (MIB-1)....................................................... 125 IV.7.C.b. Expresión de EGFR..................................................................................... 125 IV.7.C.c. Expresión de laminina 5 γ2.......................................................................... 126 IV.7.C.d. Expresión de cadherina-E............................................................................ 126 IV.8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LAS RECIDIVAS REGIONALES............................................ 127 IV.8.A. Parámetros Clínicos....................................................................................................... 127 IV.8.A.a. Edad.............................................................................................................. 127 IV.8.A.b. Sexo.............................................................................................................. 128 IV.8.A.c. Localización.................................................................................................. 129 IV.8.A.d. Estadio TNM................................................................................................ 129 IV.8.A.e. Estadio clínico.............................................................................................. 130 IV.8.A.f. Tratamiento del tumor primario.................................................................... 131 IV.8.B. Parámetros Histológicos................................................................................................ 131 IV.8.B.a. Grado de diferenciación histológica............................................................. 131 IV.8.B.b. Modo de invasión tumoral............................................................................ 132 IV.8.B.c. Profundidad de invasión tumoral.................................................................. 132 IV.8.B.d. Invasión perineural....................................................................................... 133 IV.8.B.e. Estado de los márgenes quirúrgicos.............................................................. 133 IV.8.C. Parámetros Inmunohistoquímicos.................................................................................. 134 IV.8.C.a. Índice de proliferación celular (MIB-1)........................................................ 134 IV.8.C.b. Expresión de EGFR...................................................................................... 134 IV.8.C.c. Expresión de laminina 5 γ2........................................................................... 135 IV.8.C.d. Expresión de cadherina-E............................................................................. 135 IV.9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DEL INTERVALO LIBRE DE ENFERMEDAD............................ 136 IV.9.A. Parámetros Clínicos....................................................................................................... 136 IV.9.A.a. Edad.............................................................................................................. 136 IV.9.A.b. Sexo.............................................................................................................. 137 IV.9.A.c. Localización................................................................................................. 138 IV.9.A.d. Estadio TNM............................................................................................... 138 IV.9.A.e. Estadio clínico............................................................................................. 140 IV.9.A.f. Tratamiento del tumor primario................................................................... 140 IV.9.B. Parámetros Histológicos................................................................................................ 141 IV.9.B.a. Grado de diferenciación histológica............................................................ 141 IV.9.B.b. Modo de invasión tumoral........................................................................... 142 IV.9.B.c. Profundidad de invasión tumoral................................................................. 142 IV.9.B.d. Invasión perineural...................................................................................... 142 IV.9.B.e. Estado de los márgenes quirúrgicos.............................................................. 143 Índice 6 IV.9.C. Parámetros Inmunohistoquímicos.................................................................................. 144 IV.9.C.a. Índice de proliferación celular (MIB-1)........................................................ 144 IV.9.C.b. Expresión de EGFR...................................................................................... 144 IV.9.C.c. Expresión de laminina 5 γ2........................................................................... 144 IV.9.C.d. Expresión de cadherina-E............................................................................. 145 IV.9.D. Análisis multivariante del intervalo libre de enfermedad.............................................. 148 IV.10. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA SUPERVIVENCIA............................................................. 149 IV.10.A. Parámetros Clínicos..................................................................................................... 149 IV.10.A.a. Edad............................................................................................................ 149 IV.10.A.b. Sexo..............…………………………………………………………….. 150 IV.10.A.c. Localización............................................................................................... 151 IV.10.A.d. Estadio TNM.............................................................................................. 151 IV.10.A.e. Estadio clínico............................................................................................ 153 IV.10.A.f. Tratamiento del tumor primario.................................................................. 153 IV.10.B. Parámetros Histológicos.............................................................................................. 154 IV.10.B.a. Grado de diferenciación histológica........................................................... 154 IV.10.B.b. Modo de invasión tumoral.......................................................................... 155 IV.10.B.c. Profundidad de invasión tumoral................................................................ 155 IV.10.B.d. Invasión perineural..................................................................................... 156 IV.10.B.e. Estado de los márgenes quirúrgicos........................................................... 157 IV.10.C. Parámetros Inmunohistoquímicos................................................................................ 157 IV.10.C.a. Índice de proliferación celular (MIB-1)...................................................... 157 IV.10.C.b. Expresión de EGFR.................................................................................... 157 IV.10.C.c. Expresión de laminina 5 γ2........................................................................ 158 IV.10.C.d. Expresión de cadherina-E.......................................................................... 159 IV.10.D. Análisis multivariante de la supervivencia................................................................. 162 V. DISCUSIÓN....................................................................................................................................... 163 V.1. CONSIDERACIONES SOBRE LA MUESTRA DE PACIENTES ESTUDIADA........................ 164 V.2. CONSIDERACIONES SOBRE LOS PARÁMETROS CLÍNICOS............................................... 165 V.3. CONSIDERACIONES SOBRE LOS PARÁMETROS HISTOLÓGICOS..................................... 168 V.3.A. Grado de diferenciación histológica.............................................................................................. 168 V.3.B. Modo de invasión tumoral............................................................................................................. 169 V.3.C. Profundidad de invasión tumoral.................................................................................................. 170 V.3.D. Invasión perineural........................................................................................................................ 172 V.3.E. Estado de los márgenes quirúrgicos.............................................................................................. 172 V.4.CONSIDERACIONES SOBRE LOS PARÁMETROS INMUNOHISTOQUÍMICOS................... 173 V.4.A. Índice de proliferación celular...................................................................................................... 173 V.4.B. Receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR)............................................................... 177 V.4.C. Laminina 5 γ2................................................................................................................................ 180 II. Introducción 13 II.1.B Epidemiología El cáncer oral constituye un grave problema sanitario en muchos países. No sólo genera una mortalidad significativa, sino también provoca desfiguración extensa, pérdida de función, cambios conductuales y problemas económicos y sociológicos. La OMS predice un aumento continuo de esta enfermedad en todo el mundo.10, 11 El cáncer oral es el undécimo cáncer más común, y representa aproximadamente el 4% de todos los cánceres y un 2% de las muertes por cáncer en el mundo.1,12 Estudios epidemiológicos han mostrado que la incidencia del cáncer oral varía significativamente entre zonas geográficas distintas, y entre países desarrollados y en vía de desarrollo. Aunque el carcinoma de células escamosas de la cavidad oral represente menos de 5% de los tumores malignos en los países desarrollados, en India y en el Sudeste de Asia es la neoplasia más frecuente, representando entre un 20 y un 50% de todas ellas.13, 14 En Estados Unidos (EUA) la predicción en relación al cáncer oral y orofaríngeo es de aproximadamente 30.200 nuevos casos al año (20.200 en varones y 10.000 en mujeres), lo que representa un 3% de todos los cánceres en hombres y un 2% en mujeres, permaneciendo estas estadísticas estables durante muchos años.15, 16 En España, la incidencia del cáncer oral varía entre 12 y 15 casos por 100.000 habitantes/año en los varones y entre 2 y 4 casos por 100.000 habitantes/ año en el sexo femenino.3 En Brasil, la estimación del Instituto Nacional del Cáncer para el año de 2005 es de aproximadamente 13.880 nuevos casos de cáncer oral, con una tasa de 10,99 casos de cáncer por 100.000 habitantes/año en varones y 4,18 casos por 100.000 habitantes/año en el sexo femenino.17 La relación varón/mujer también varía en las distintas series mundiales entre 1,2-3,8:1. Sin embargo, esta proporción está modificándose en los últimos años, existiendo una tendencia hacia el equilibrio intersexual justificado por el mayor consumo de tabaco y alcohol por parte de las mujeres.18 Además, la relación entre II. Introducción 14 ambos sexos varía según las distintas localizaciones en la cavidad oral. Por ejemplo, el carcinoma de encía o reborde alveolar es más frecuente en mujeres.19 Más del 90% de los pacientes con cáncer oral son mayores de 45 años, siendo la edad media de presentación alrededor de los 60 años.20 Entre el 1 y el 3% de todos los carcinomas de células escamosas aparecen en pacientes menores de 40 años.21,22 II.1.C. Clínica Clínicamente, el CCEO se presenta, en estadios precoces, con un aspecto variado, asemejándose a una leucoplasia, eritroplasia o eritroleucoplasia. Con la evolución de la lesión, ésta tiende a ulcerarse, presentando un carácter infiltrativo que resulta en una lesión mal delimitada, endurecida y de superficie granulosa. En algunas ocasiones la lesión puede presentar un carácter exofítico.23 Bagán et al.24 encontraron que el 19,6% de los pacientes con CCEO presentaban una leucoplasia asociada a la lesión primaria en el momento del diagnóstico. La presencia de leucoplasia asociada al tumor primario se correlacionó con tumores en estadios más tempranos. II.1.D. Histología Histológicamente el CCEO se caracteriza por presentar islotes y/o cordones invasivos de células epiteliales malignas similares a las células de la capa espinosa. Las células neoplásicas presentan, en general, citoplasma eosinófilo abundante con núcleos grandes y un aumento de la relación núcleo-citoplasmática.23 Frecuentemente, se observan grados variados de pleomorfismo celular y nuclear. Existen distintas variantes en cuanto al grado de diferenciación, que dependen de la similitud que presente el tumor con la arquitectura normal del epitelio. Los carcinomas que producen cantidades importantes de queratina y muestran algún signo de maduración desde la capa basal hacia los estractos superficiales, se denominan bien diferenciados. Los que no producen queratina, pero es posible reconocer cierto grado de estratificación, a pesar de su desviación de la estructura normal, se denominan moderadamente diferenciados. Cuando no producen queratina, su aspecto apenas II. Introducción 15 muestra semejanza con una estructura epitelial y presentan anomalías celulares frecuentes, se denominan pobremente diferenciados.25, 26 El grado histológico del tumor se relaciona con su comportamiento biológico. Tumores bien diferenciados suelen presentar un crecimiento más lento y producir metástasis en estadios más tardíos. En contraste, los tumores pobremente diferenciados suelen crecer más rápidamente y producir metástasis en estadios precoces. Sin embargo, el proceso de estadiaje histológico del CCEO no deja de ser un proceso subjetivo que depende de los criterios individuales del examinador. El estadiaje clínico parece relacionarse más adecuadamente al pronóstico en la mayoría de los casos. El diagnóstico histológico del CCEO casi siempre se realiza mediante la microscopía óptica convencional, aunque la aplicación de la inmunohistoquímica mediante marcadores para citoqueratinas puede ser útil en distinguir tumores pobremente diferenciados o indiferenciados de otras lesiones malignas.23 Una forma especial de CCEO es el carcinoma verrucoso, que se caracteriza desde el punto de vista histológico por su amplia base de implantación y por la formación papilar. Suelen observarse criptas profundas que contienen tapones de queratina entre las proyecciones superficiales alargadas. El epitelio es displásico, pero muestra en raras ocasiones rasgos displásicos intensos. La membrana basal permanece intacta y a menudo existe un infiltrado de células inflamatorias crónicas en el tejido conjuntivo subyacente. La interfase entre el tumor y el epitelio normal adyacente está generalmente bien definida con invasión mínima, si existe, de las células epiteliales a lo largo de un ancho y romo frente de avance de las crestas epiteliales en forma de bulbo.27 II.1.D.a. Frente de invasión tumoral Los patólogos han observado durante décadas que las células tumorales en las zonas más invasivas de los tumores malignos difieren sustancialmente de las células de las zonas centrales y de la superficie. Basándose en estos hallazgos, Bryne et al.,28 en 1992, publicaron un nuevo enfoque a la hora de clasificar histológicamente los CCEO, examinando solamente las capas celulares que invaden en profundidad y la interfase de defensa del huésped. Esta zona del tumor fue denominada como frente de invasión II. Introducción 16 tumoral. Este acercamiento, el cual es una modificación y simplificación del sistema multifactorial propuesto por Anneroth et al.,29 permite una información altamente significativa e independiente en pacientes con el mismo estadio TNM. El sistema de estadiaje del frente de invasión tumoral en el CCEO se basa en la valoración cualitativa de parámetros histológicos como el grado de queratinización, polimorfismo nuclear, patrón de invasión e infiltrado linfocitario. El significado pronóstico de la valoración del frente de invasión tumoral ha sido confirmado en diversos estudios sobre carcinomas de cabeza y cuello.30,31 II.1.D.b. Modo de invasión tumoral El modo de invasión tumoral, uno de los parámetros en común de las distintas clasificaciones del frente de invasión tumoral, ha mostrado ser uno de los parámetros más importantes a la hora de predecir la evolución y pronóstico del CCEO. Aunque las escalas adoptadas para clasificar el modo de invasión presenten diferencias, éstas suelen coincidir en que a medida que la disociación celular aumenta, y el tumor adquiere un patrón más invasivo, el comportamiento clínico de la lesión es más agresivo, con un mayor número de recidivas locales, regionales y un peor pronóstico. Spiro et al.32, sugirieron una simplificación de la clasificación del frente de invasión tumoral propuesta por Bryne et al.28 (Tabla 1) A Tumor con márgenes bien delimitados que empujan el tejido adyacente. B Tumor con márgenes que infiltran el tejido adyacente en cordones sólidos. C Tumor con márgenes que contienen pequeños grupos o cordones de células infiltrantes (>15 células tumorales). D Tumores con marcada disociación celular en pequeños grupos celulares o incluso células individuales (<15 células tumorales). Tabla 1. Clasificación del modo de invasión tumoral II. Introducción 17 II.1.E. Topografía En cuanto a su localización, si no se considera el cáncer de labio inferior, son la lengua y el suelo de boca las regiones donde con más frecuencia se asientan las lesiones de carcinoma de células escamosas, seguidos por las mucosas yugal y gingival y paladar blando.33 Según la localización intraoral de la lesión primaria, el CCEO puede presentar características distintas. II.1.E.a. Lengua Las superficies póstero-laterales y la cara ventral de la lengua representan casi la totalidad de los CCEO localizados en la lengua. El dorso de la lengua representa una pequeña fracción de estas lesiones y suele asociarse a una lesión crónica de liquen plano oral erosivo, lesiones de sífilis terciaria y lesiones asociadas a la exposición crónica al arsénico. La porción no oral u orofaríngea de la lengua, cuando está afectada por un CCEO, suele dar lugar a síntomas similares a los de una faringitis con distintos grados de disfagia u odinofagia. Ocasionalmente, la metástasis en los ganglios linfáticos regionales puede ser el único o el primer signo de una lesión primaria en base de lengua. La mayoría de los CCE de lengua suelen presentarse como lesiones de 2 ó más centímetros de diámetro.34 El 40% de los casos presentan metástasis linfáticas cervicales en el momento del diagnóstico. II.1.E.b. Suelo de boca El carcinoma de suelo de boca representa aproximadamente 1/3 de todos los carcinomas orales, y se ha notado un aumento en la frecuencia de carcinomas en esta localización en mujeres. La existencia de lesiones precursoras, leucoplasia o eritroplasia, es frecuente en esta localización. La porción anterior del suelo de boca en las proximidades del frenillo lingual y de los ductos de las glándulas submandibulares es la zona que se afecta con más frecuencia, apareciendo como una lesión ulcerosa de márgenes irregulares e indurados. En estadios avanzados, puede ocurrir extensión hacia la encía y en profundidad hacia la lengua, haciendo que la fijación de la lengua sea un hallazgo común. Microscópicamente, los CCE en esta localización suelen presentar un grado moderado de diferenciación. En esta localización, las metástasis a los ganglios II. Introducción 18 linfáticos suelen encontrarse inicialmente en el triángulo submandibular y también en los nódulos de la cadena yugulo-digástrica y en los niveles altos y medios de la cadena yugular (niveles I, II y III). II.1.E.c. Reborde alveolar El CCEO de la mucosa alveolar representa aproximadamente el 5% de todos los carcinomas intraorales, y frecuentemente se presenta como una lesión indolora en los sectores posteriores de la mandíbula. La invasión ósea es un hallazgo precoz encontrado con cierta frecuencia. Microscópicamente suelen ser bien diferenciados. Frecuentemente el ligamento periodontal se encuentra invadido, permitiendo un fácil acceso al alveolo y subsecuentemente, al hueso medular de la mandíbula. En estas circunstancias, la movilidad dentaria en ausencia de enfermedad periodontal puede ser el único signo representativo. Otra circunstancia en que se puede sospechar un CCEO es la presencia de un alveolo que no cicatriza tras una extracción dentaria, presentando en su interior una masa de tejido similar a un tejido de granulación o un granuloma piogénico. II.1.E.d. Mucosa yugal La mucosa yugal representa aproximadamente el 2% de los CCEO. Suelen ser asintomáticos. En fases iniciales, las lesiones tienden a localizarse en las zonas más posteriores, presentándose con frecuencia como una pequeña úlcera o masas induradas que se relacionan con una leucoplasia preexistente, y con mucha menor frecuencia, con una eritroplasia. Dada la localización primaria de estas lesiones, frecuentemente se asocian a un traumatismo debido a la función masticatoria diaria, lo que conlleva a la ulceración de estas lesiones. En estadios más avanzados pueden llegar a presentar trismus. La extensión hacia la mucosa alveolar mandibular o maxilar se presenta en estadios tardíos, usualmente como un componente exofítico en la fase de crecimiento. Ocasionalmente, la lesión puede presentarse en el surco vestibular, principalmente en el mandibular. El CCEO localizado en la mucosa yugal no es frecuente en América del norte ni en Europa occidental. Sin embargo, en otras partes del mundo, particularmente en el II. Introducción 19 sudeste asiático, es una localización mucho más frecuente, lo que se atribuye al hábito de mascar “betel” y tabaco. II.1.E.e. Paladar Los CCEO de paladar duro son relativamente raros. Morfológicamente los CCEO en esta localización suelen adoptar un aspecto ulcerado o verrucoso, a menudo rodeado por una leucoplasia. La invasión local de estructuras adyacentes puede ocurrir en estadios más avanzados y es signo de mal pronóstico. El 30% de los tumores presentan metástasis cervicales, que suelen ser ipsilaterales.35 Cuando se consideran los paladares blando y duro como localizaciones independientes, el 71% de los CCEO afectan al paladar blando y el 29% al paladar duro. Aproximadamente el 40% de los pacientes con lesiones primarias en el paladar blando, desarrollan metástasis en los ganglios linfáticos regionales en comparación con el 13% de los pacientes con lesiones de tamaño similar que afectan al paladar duro.25 II.1.E.f. Trígono retromolar La región del trígono retromolar comprende la mucosa adherida que discurre sobre la rama ascendente de la mandíbula desde la superficie distal al último molar inferior hasta la zona adyacente a la tuberosidad maxilar.36 El trígono retromolar y el paladar blando adyacente, representan aproximadamente un 15% de los CCEO. En estas localizaciones, la presencia de leucoplasias no homogéneas o eritroplasias, que preceden a la lesión maligna, son un hallazgo común. A diferencia de los CCEO localizados más anteriormente, las lesiones en estas localizaciones suelen presentar un grado de diferenciación de moderado a pobre, asociándose la invasión en profundidad a lesiones con pequeñas alteraciones superficiales. Existe un aumento significativo de diseminación regional y a distancia en el momento del diagnóstico inicial, y la presencia de síntomas es frecuente. II.1.F. Estadiaje El estadio del cáncer oral depende del tamaño de la lesión primaria y de la diseminación regional o a distancia de la enfermedad. El estadio es importante ya que, II. Introducción 20 como comentaremos más adelante, tiene influencia sobre el plan de tratamiento y el pronóstico del cáncer oral. Dentro de las clasificaciones más utilizadas se encuentra la TNM, propuesta por American Joint Committee on Cancer (AJCC) 36, la cual se explica a continuación (Tablas 2 y 3 ). TAMAÑO DEL TUMOR PRIMARIO (T) TX Tumor primario no puede ser valorado T0 No existe evidencia de tumor primario Tis Carcinoma in situ T1 Lesión menor de 2 cm en su máximo diámetro T2 Lesión mayor de 2 cm y menor de 4 cm en su máximo diámetro T3 Lesión mayor de 4 cm en su máximo diámetro T4 Lesión mayor de 4 cm que invade estructuras adyacentes (ej. seno maxilar, huesos maxilares, músculos pterigoideos, base de lengua o piel) GANGLIOS LINFÁTICOS REGIONALES (N) NX Adenopatía cervical no puede ser valorada N0 No hay adenopatías cervicales clínicamente positivas N1 Un solo ganglio homolateral clínicamente positivo con 3 cm o menos de diámetro N2 Un solo ganglio homolateral clínicamente positivo mayor de 3 cm y menor de 6 cm de diámetro; o múltiples ganglios homolaterales clínicamente positivos menores de 6 cm de diámetro; o ganglios bilaterales o contralaterales clínicamente positivos, ninguno mayor de 6 cm de diámetro N2a Un solo ganglio homolateral clínicamente positivo mayor de 3 cm y menor de 6 cm de diámetro N2b Múltiples ganglios homolaterales clínicamente positivos menores de 6 cm de diámetro N2c Ganglios bilaterales o contralaterales clínicamente positivos, ninguno con más de 6 cm de diámetro N3 Un ganglio clinicamente positivo con más de 6 cm de diámetro METÁSTASIS A DISTANCIA (M) MX Metástasis a distancia no puede ser valorada M0 No existe metástasis a distancia M1 Existe metástasis a distancia Extensión del tumor primario (T); Ausencia o presencia de afectación de ganglios linfáticos regionales (N); Ausencia o presencia de metástasis a distancia (M) Tabla 2: Clasificación TNM II. Introducción 21 ESTADIOS T N M Estadio 0 Tis N0 M0 Estadio I T1 N0 M0 Estadio II T2 N0 M0 Estadio III T3 T1 T2 T3 N0 N1 N1 N1 M0 M0 M0 M0 Estadio IVA T4 T4 Cualquier T N0 N1 N2 M0 M0 M0 Estadio IVB Cualquier T N3 M0 Estadio IVC Cualquier T Cualquier N M1 Extensión del tumor primario (T); Ausencia o presencia de afectación de ganglios linfáticos regionales (N); Ausencia o presencia de metástasis a distancia (M) Tabla 3: Estadiaje clínico II.1.G. Etiopatogenia La etiopatogenia del cáncer oral es multifactorial, participando en ella fenómenos genéticos, ambientales, agentes químicos, físicos y virales. Globalmente, el consumo de tabaco en sus varias formas y su asociación con el consumo de alcohol son los factores de riesgo más importantes en el desarrollo del cáncer oral. Ambos factores actúan sinérgicamente, aunque cada uno de ellos posee potenciales carcinogenéticos independientes.37 Se estima que 75% de todos los CCEO en los países occidentales se atribuye al consumo de alcohol y tabaco.38 La asociación del tabaco y alcohol está íntimamente relacionada no sólo con el desarrollo del cáncer oral, sino también con el curso de la enfermedad, estando ligada a un mal pronóstico. 39 II. Introducción 22 El hábito de fumar sigue siendo el principal factor de riesgo del cáncer oral y los fumadores presentan un riesgo relativo 7 veces más alto en relación a los no fumadores. Este riesgo es muchas veces más alto en los fumadores que tienen un alto consumo de alcohol. Hay evidencias que sugieren que con el cese del hábito de fumar después de un periodo de 10 años, este riesgo elevado se reduce a niveles cercanos a los de personas que nunca han fumado.40 Esta información puede ser útil a la hora de motivar a los pacientes para que dejen de fumar. Además del hábito de fumar, el uso de tabaco, sea en la forma de snuff (tabaco fino molido) o tabaco de mascar (hojas sueltas de tabaco), han sido asociados al cáncer oral.11 La exposición crónica a las radiaciones solares también constituye un factor etiológico del carcinoma de células escamosas de labio, fundamentalmente del labio inferior.25 Otro factor relevante en el desarrollo del cáncer oral es el nutricional, de forma más específica, el posible papel de la ingestión de micronutrientes con un efecto antioxidante. Compuestos naturales de caroteno, selenio dietético, folato, y vitaminas A, C y E parecen ofrecer efectos protectores contra el desarrollo del cáncer.37 Además, una dieta pobre en frutas y vegetales suele ser común en los enfermos de carcinoma oral41. Según La Vechia et al.16 aproximadamente un 15% de los cánceres orales y orofaríngeos se pueden atribuir a deficiencias o desequilibrios dietéticos. Otros factores etiológicos relacionados al cáncer oral, pero con mucha menos significación estadística, son la sífilis y la disfagia sideropénica.42 Recientemente se ha demostrado la relación etiológica entre el virus del papiloma humano (HPV) y el cáncer oral. Se ha demostrado también, la presencia de este virus en células epiteliales neoplásicas en lesiones in situ, invasivas y en metástasis en ganglios linfáticos, además de su probable integración con la estructura genética de algunos de estos tumores.43 La prevalencia de la infección por el HPV en las lesiones premalignas y malignas de la cavidad oral varía ampliamente según los diversos II. Introducción 29 Tamaño (T) Lengua Suelo de boca Paladar duro Trígono Retromolar Mucosa Yugal Reborde alveolar T1 Cirugía Cirugía Cirugía Cirugía Cirugía o radioterapia Cirugía T2 Cirugía Cirugía o Radioterapia Cirugía Cirugía o radioterapia Cirugía o Radioterapia Cirugía T3 Cirugía + Radioterapia Cirugía + Radioterapia Cirugía + Radioterapia Cirugía + Radioterapia Cirugía + Radioterapia Cirugía + Radioterapia T4 Cirugía + Radioterapia + Quimioterapia Cirugía + Radioterapia + Quimioterapia Cirugía + Radioterapia + Quimioterapia Cirugía + Radioterapia + Quimioterapia Cirugía + Radioterapia + Quimioterapia Cirugía + Radioterapia + Quimioterapia Tabla 4. Tratamiento del carcinoma oral de células escamosas según la localización y tamaño de la lesión II.1.J.a Cirugía La cirugía implica la resección completa de la lesión con un margen de tejido normal adyacente y, cuando está indicado, algunos o todos los ganglios linfáticos cervicales homolaterales y en algunas ocasiones, los contralaterales. La cirugía debe involucrar toda la masa tumoral macroscópica y la presumible extensión microscópica de la enfermedad. En caso de ganglios cervicales positivos, la disección cervical radical o funcional se realiza a continuación.66 Con las técnicas quirúrgicas actuales, lesiones extensas intraorales pueden ser extirpadas con éxito y con resultados funcionales satisfactorios. Además, las técnicas de reconstrucción permiten alcanzar soluciones estéticas favorables. II. Introducción 30 II.1.J.b. Vaciamiento ganglionar cervical La elección de cuando observar o tratar el cuello clínicamente negativo, así como cuando emplear cirugía o radioterapia, sigue siendo motivo de controversia. August et al.67 se posicionan en contra de la actitud conservadora “observar y esperar”, una vez que en muchos casos los ganglios valorados inicialmente como normales son detectados a posteriori cuando la enfermedad ya se extendió a través de su cápsula. Shah y Andersen68 son partidarios del tratamiento quirúrgico profiláctico del cuello clínicamente negativo, sin embargo, apuntan a que las metástasis ocultas en los CCEO de reborde alveolar, paladar duro y labios son infrecuentes y que en estos casos el tratamiento quirúrgico electivo del cuello no es necesario. Vaciamiento cervical radical (VCR) Procedimiento estándar para el tratamiento de los ganglios linfáticos de los niveles I-V con resección simultánea del músculo esternocleiomastoideo, vena yugular interna y nervio accesorio. Vaciamiento cervical radical modificado (VCRM) Disección de los ganglios linfáticos de los niveles I-V, preservando una o más estructuras no linfáticas (músculo esternocleidomastoideo, vena yugular interna, nervio accesorio) haciendo distinción entre 3 tipos: - VCRM IPreservación del nervio accesorio - VCRM IIPreservación del nervio accesorio y vena yugular interna - VCRM IIIPreservación nervio accesorio, vena yugular interna y músculo estrenocleidomastoideo Vaciamiento cervical profiláctico (VCP) Preservación de uno o más grupos de ganglios linfáticos incluidos en el VCRM. Se pueden dividir en: - SupramiohideoDisección niveles IIII - LateralDisección niveles IIIV - Látero-cervicalDisección niveles IIV Tabla 5: Clasificación de las modalidades quirúrgicas de vaciamiento cervical 69 La cirugía posee un papel dominante en el manejo de los pacientes con adenopatías cervicales palpables, y el término vaciamiento cervical se aplica a este tratamiento. El procedimiento original propuesto por Crile70 para el tratamiento de los ganglios linfáticos clínicamente positivos se conoce como vaciamiento cervical radical e II. Introducción 31 implica la extirpación de todos los ganglios linfáticos cervicales profundos (niveles I-V) así como del nervio accesorio, vena yugular interna y músculo esternocleidomastoideo. Desde entonces, se han propuesto modificaciones de la técnica para preservar estructuras, incluyendo la vena yugular interna y el músculo esternocleidomastoideo, con la finalidad de reducir la morbilidad asociada a este procedimiento. Así, la técnica de vaciamiento cervical radical modificada se ha vuelto la técnica quirúrgica estándar para el manejo del cuello. En pacientes con ganglios linfáticos clínicamente negativos, los niveles superiores (I-III) son los de mayor riesgo de metástasis, y por lo tanto el vaciamiento cervical profiláctico, en el cual se extirpan solamente los ganglios linfáticos superiores, debe ser realizado y se describe como vaciamiento supraomohioideo.68 II.1.J.c. Radioterapia Tanto el cáncer primario como los ganglios linfáticos cervicales pueden ser incluidos en el campo de radiación. Un ciclo completo de radioterapia se expresa generalmente en unidades alrededor de los 66-70 Gray (Gy) (1Gy = 100 rads), las cuales se fraccionan en 32-35 dosis de 2 Gy durante 6-7 semanas.64 La radioterapia posee la ventaja de preservación de los órganos, y actualmente es la modalidad de tratamiento primaria de algunos casos de carcinomas de lengua, amígdalas palatinas, paladar blando y faringe. Sin embargo, el tratamiento no está libre de reacciones adversas y es frecuente la aparición de mucositis, xerostomía, candidiasis y en algunos casos osteoradionecrosis.71 La decisión de emplear o no la radioterapia post-operatoria debe considerar tanto la lesión primaria como la extensión regional de la enfermedad. Cuando los factores relacionados con el tumor primario (lesiones primarias extensas, márgenes quirúrgicos positivos, invasión de los espacios perineural, linfático y vascular) indican el uso de la radioterapia, el cuello debe ser incluido en el campo de tratamiento.63 Cuando los factores relacionados con el tumor primario no indican la radioterapia, la decisión se debe basar en los hallazgos histológicos de la pieza de la disección cervical. En los pacientes en los cuales el estudio histológico ha demostrado la ausencia de metástasis ganglionares la radioterapia no está indicada.72 Múltiples ganglios positivos, o la II. Introducción 32 presencia de diseminación a través de la cápsula de los ganglios son indicaciones absolutas de radioterapia.63 Cuando la radioterapia se combina con la cirugía parece haber una preferencia por la radioterapia postoperatoria. La radioterapia induce una fibrosis tisular lo que hace la cirugía más difícil. Además, los tejidos irradiados poseen una capacidad de cicatrización más lenta. II.1.J.d. Quimioterapia El uso de la quimioterapia, en general a través de la combinación de diversas drogas citotóxicas, no ha tenido particular éxito en el tratamiento del CCEO y se considera más una modalidad de tratamiento paliativo que un tratamiento curativo primario. Los principales agentes utilizados han sido el metrotexato, la bleomicina, el cisplatino y el 5-fluoracilo. La quimioterapia puede dar como resultado una disminución temporal del tamaño de la masa tumoral, pero no ha demostrado un aumento significativo en las tasas de supervivencia a los 5 años, control del tumor primario y reducción del potencial metastásico.73 Sin embargo, ensayos clínicos más recientes utilizando la combinación de la quimio y radioterapia en el tratamiento de pacientes con lesiones en estadios avanzados han demostrado resultados preliminares alentadores,74 y deben tener su papel en el futuro. Por ahora, su indicación en el tratamiento del CCEO se limita a tumores en estadios avanzados, que debido a su extensión sean considerados como inoperables, o a las recidivas y metástasis tumorales.75 II.11.J.e. Futuros conceptos en el tratamiento Los buenos resultados alcanzados por la cirugía combinada con la radioquimioterapia en los tumores en estadios precoces no pueden ser siempre alcanzados cuando son aplicados a la enfermedad en estadios avanzados. Estos hallazgos indican la necesidad de nuevas modalidades de tratamiento dirigidas específicamente hacia las células tumorales y con daño limitado sobre las células sanas. La terapia dirigida contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es una de estas alternativas, y estudios preliminares han descrito resultados esperanzadores en una amplia variedad tumores. II. Introducción 33 1) Terapia dirigida contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico Trabajos experimentales e investigaciones clínicas sostienen que el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es una importante diana terapéutica para la terapia del cáncer. Como se explicará en el próximo apartado, durante el complejo proceso que ocurre desde la interacción del receptor con el ligando, a través de la transducción de señales y expresión alterada del gen, existen muchas oportunidades para la intervención terapéutica. Las modalidades de tratamiento inhibidores del EGFR que se encuentran en estadios más avanzados incluyen la utilización de anticuerpos monoclonales directamente contra el dominio externo del EGFR, y la utilización de pequeñas moléculas inhibidoras de la actividad tirosina-quinasa del dominio interno del receptor. Anticuerpos monoclonales Se han desarrollado anticuerpos monoclonales anti-EGFR contra distintos epitopos. Algunos de estos anticuerpos compiten con el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y otros ligandos, pero no activan el EGFR. La unión con el anticuerpo bloquea el efecto de señalización de crecimiento celular asociado al EGFR por el siguiente mecanismo: (i) unión al dominio extracelular; (ii) internalización del complejo receptor/anticuerpo; (iii) inhibición de las vías de señalización y; (iv) estímulo potencial de la respuesta inmunológica.76 Actualmente, diversos anticuerpos monoclonales anti-EGFR se encuentran en distintas etapas de desarrollo clínico, y el cetuximab (Erbitux; ImClone Systems) formalmente conocido como IMC-C225 o C225, es el que más ha sido investigado y está siendo probado en ensayos clínicos.77 El cetuximab es un aticuerpo monoclonal con alta especificidad para el EGFR, compitiendo por los puntos de unión natural del receptor causando la internalización e infrarregulación del receptor.76 Se ha demostrado que el cetuximab inhibe una amplia variedad de líneas celulares neoplásicas de una manera dosis-dependiente. Esta inhibición de la proliferación celular es reflejo de la detención del ciclo celular en la fase G1 y/o aumento de la apoptosis.78 El impacto inhibidor del cetuximab en modelos experimentales de tumores xenografos suele ser más pronunciado en comparación con los resultados observados en cultivos celulares, lo II. Introducción 34 que sugiere que otros mecanismos de inhibición del cáncer estén implicados. Uno de estos mecanismos es la angiogénesis.79 El cetuximab inhibe la producción del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en células de CCE ocasionando una reducción del número de vasos sanguíneos dentro del tumor.80 Estudios fase I/II han sido realizados para investigar la tolerancia al cetuximab en combinación con otras drogas citotóxicas convencionales como el 5-fluoracilo en pacientes con CCE de cabeza y cuello recurrente o metastásico.76 Los resultados de un amplio ensayo clínico fase III en 424 pacientes que recibieron tratamiento con radioterapia y/o cetuximab para el tratamiento de CCE de cabeza y cuello en estadios avanzados han demostrado aproximadamente el doble de la media de supervivencia para los pacientes tratados con radioterapia + cetuximab (54 meses), que para los pacientes tratados solamente con radioterapia (28 meses). También se observó una mejoría significativa en el control local de la enfermedad a favor del grupo tratado con cetuximab.81 Además de proporcionar nuevas opciones potenciales de tratamientos para los pacientes con CCE en estadio avanzado, este ensayo clínico demuestra una mejoría en la supervivencia al utilizar un agente dirigido para aumentar la sensibilidad a la radiación. Estos hallazgos van a favorecer la realización de nuevos ensayos clínicos en otros tipos de cánceres donde la radiación juega un papel principal en el tratamiento. Moléculas pequeñas inhibidoras de la tirosina quinasa. Ésta es la más larga y más prometedora línea terapéutica. Los inhibidores de la tirosina-quinasa son derivados sintéticos, en la mayoría derivados de las quinazolinas, de pequeño peso molecular que interactúan con el dominio intracelular con actividad tirosina-quinasa de diversos receptores, incluyendo el EGFR, inhibiendo la fosforilación inducida por la unión ligando/receptor.82 Estas moléculas actúan directamente en la inhibición de la fosforilación de la tirosina a través de la interacción física con el receptor a través del siguiente mecanismo de acción: (i) unión al dominio intracelular; (ii) inhibición de la actividad tirosinaquinasa y; (III) inhibición de las vías de señalización del EGFR.76 El gefitinib (Iressa, AstraZeneca), formalmente conocido como ZD1839, una quinazolina, es el inhibidor tirosina quinasa EGFR más desarrollado. El gefinitib es una II. Introducción 35 anilinoquinazolina de bajo peso molecular, activo por vía oral, que inhibe diversos receptores con actividad tirosina-quinasa, incluyendo el EGFR. El gefinitib ha demostrado actividad antiproliferativa en células neoplásicas en cultivos y tumores humanos xenografos, tanto como agente único o en combinación con radio y quimioterapia.76 Estudios preclínicos indican que el gefinitib afecta muchas de las vías de señalización intracelular inhibidas por los anticuerpos monoclonales. Estudios in vitro e in vivo han demostrado que el gefinitib inhibe el crecimiento de líneas celulares de diversos tipos de cánceres humanos, y hay evidencias de que esta inhibición se da a través de la detención del ciclo celular y del aumento de la apoptosis.83 En líneas celulares de CCEO, el gefinitib ha inducido la detención de la fase G1 del ciclo celular y la sobrerregulación de la p27.84 Otros estudios experimentales han demostrado que el gefitinib aumenta la radiosensibilidad de líneas de CCEOimplantadas en ratas, por múltiples mecanismos que incluyen la inhibición de la proliferación y regulación del mecanismo de reparación del daño del ADN después de la exposición a la radiación.85 2) Inducción de la apoptosis La elucidación de los mecanismos de la apoptosis y su correlación con la carcinogénesis oral ha generado un optimismo acerca de la aplicación de esos conocimientos con objetivos terapéuticos 86. De hecho, hay investigaciones para el desarrollo de estrategias que permitan manipular la maquinaria apoptótica. Esas intervenciones tienen como objetivo restaurar la función apoptótica o compensar otras alteraciones celulares, permitiendo el tratamiento etiológico de una serie de condiciones.87 88 3) Agentes anti-angiogénesis Los factores asociados con la angiogénesis en los CCEO han sido utilizados como dianas terapéuticas en nuevas modalidades de tratamiento del cáncer oral. Los tumores sólidos no pueden crecer entre 1 y 2 mm en diámetro sin inducir la formación II. Introducción 36 de nuevos vasos sanguíneos que les facilite el aporte de nutrientes necesarios. El bloqueo del desarrollo de nuevos vasos sanguíneos priva al tumor de nutrientes y oxígeno, y por lo tanto inhibiría el crecimiento del tumor y su diseminación a otras zonas del organismo. Actualmente existen distintas estrategias anti-angiogénesis siendo investigadas en ensayos clínicos: 1) bloqueo de la habilidad de las células endoteliales en romper la matriz extracelular adyacente, utilizando inhibidores de las metaloproteinasas (MMPs); 2) inhibición directa del crecimiento de las células endoteliales; 3) bloqueo de los factores que estimulan la angiogénesis, por ejemplo el bloqueo de la señal del factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF); y 4) bloqueo de las integrinas, moléculas de la superficie de las células epiteliales que garantizan la supervivencia de las células endoteliales y promueven la angiogénesis.14 II.2. BASES GENÉTICAS DEL CÁNCER ORAL El conocimiento del ciclo de división celular en condiciones normales es esencial para comprender las alteraciones que ocurren durante el proceso de la carcinogénesis oral. El descontrol del ciclo celular es una marca fundamental de la progresión del cáncer.89 Muchas de las alteraciones moleculares que causan el comportamiento anormal de las células neoplásicas se basan en alteraciones del ciclo celular.90 II.2.A. Ciclo celular El ciclo celular consiste en una serie de fases durante las cuales ocurren cambios que conllevan a la división celular. El ciclo celular consiste en una fase estacionaria G0 Gap 0), que con la recepción de señales celulares adecuados es seguido por las fases G1, S, G2 y finalmente la mitosis (M).91 1. Fase G0 o fase de quiescencia: En esta situación se encuentran la mayor parte de las células del organismo. En esta fase no se detecta actividad de síntesis proteica y la célula no forma parte del ciclo celular, pero, tras un estímulo adecuado, es susceptible a reincorporarse en el ciclo. La duración de esta fase es variable. II. Introducción 37 2. Fase G1: Durante esta fase tiene lugar la síntesis de ARN y proteínas, pero no hay replicación de ADN. Es la fase de mayor duración del ciclo y su duración también es variable. A esta fase se incorporan las células que han estado en la fase G0. 3. Fase S o fase de síntesis: En esta fase tiene lugar la síntesis de ADN y la duplicación del genoma humano. Se inicia la síntesis de ADN y termina cuando el contenido de ADN del núcleo se ha duplicado y cada cromosoma ha dado lugar a dos cromátides idénticas, o sea, durante la fase S el contenido de ADN aumenta desde un estado diploide 2n hasta el valor de replicación 4n. Dura entre siete y doce horas. 4. Fase G2: Es el periodo desde el final de la fase S hasta la mitosis. Es una fase de aparente inactividad, durante la cual la célula tiene dos juegos diploides completos de cromosomas. Dura entre una y seis horas. 5. Fase M o fase de mitosis: Fase en la que se produce la segregación de los cromosomas dando lugar a la división de las cromátides hermanas y tiene lugar tanto la división nuclear (mitosis) como la división del citoplasma (citocinesis). Dura entre una y dos horas. La progresión del ciclo celular requiere la actuación coordinada de una compleja red de proteínas reguladoras que funcionan como interruptores bioquímicos que controlan sus principales fases e integran señales intracelulares y del medio extracelular, mitogénicas o antiproliferativas, para adecuar la división celular a las necesidades celulares o tisulares. La transición de una fase del ciclo celular a la siguiente es controlada en “puntos de control o restricción” antes de que el ciclo pueda progresar. Cuando existe un daño II. Introducción 38 del ADN, los genes que controlan estos puntos de control detienen el ciclo celular para facilitar la reparación del ADN. La detención en la fase G1 previne la replicación del ADN dañado y la detención en la fase G2 permite la segmentación de los cromosomas dañados. Los principales factores que regulan la progresión del ciclo celular son las ciclinas y las quinasas ciclina-dependientes (CDKs). Hay cuatro clases de ciclinas, según el estadio del ciclo celular en el que actúan y a la CDK a la que se unen. De ese modo cada uno de los distintos complejos ciclinas-CDKs sirve como un interruptor molecular que dispara un suceso específico en el ciclo celular. Por ejemplo, la progresión de la fase estacionaria G0 hacia la fase G1 es mediada por dos complejos ciclinas -CDKs (CDK 4/Ciclina D1, y CDK2/Ciclina E). Las CDKs activas conducen el ciclo celular mediante la fosforilación de proteínas específicas que se requieren para la progresión de las células a la siguiente fase. Por ejemplo, las ciclinas pueden fosforilar y por lo tanto inactivar la proteína del gen del retinoblastoma (pRb), mientras los inhibidores de CDK pueden desfosforilar la pRb permitiendo la liberación de factores de transcripción cruciales, como por ejemplo la familia E2F y revertiendo esta inactivación. Las CDKs se encuentran en forma inactiva durante todo el ciclo celular, y únicamente se activan por fosforilación después de unirse a las ciclinas. Las ciclinas, al contrario que las CDKs, se sintetizan únicamente durante algunas fases específicas del ciclo. Por ello, una vez finalizado, el complejo se disocia y los niveles de ciclina disminuyen rápidamente cuando la célula entra en la siguiente fase, siendo sustituida por otro tipo de ciclina específica. II.2.A.a. Regulación del ciclo celular y cáncer oral En condiciones normales, la división de los queratinocitos orales es estimulada por los factores de crecimiento epidérmicos (EGF) al unirse con sus receptores, receptores de factores de crecimiento epidérmicos (EGFR), localizados en la membrana celular de los queratinocitos de la capa basal. La unión entre ligando y receptor activa la II. Introducción 45 proteína es una inhibidora de las CDKs que bloquea la fosforilación de la pRB, que a su vez bloquea la liberación de las proteínas de transcripción (E2F), bloqueando así la replicación del ADN.124 Sin embargo, la expresión del gen WAF1/CIP1 también es inducida por una vía independiente de la p53, como por ejemplo por los factores de crecimiento: factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PTGF), factor de crecimiento fibroblástico (FGF) y factor de crecimiento trasformante beta (TGFβ).98 Si por algún motivo ocurre un fallo en este mecanismo de control, la p53 induce la célula a apoptosis, impidiendo por lo tanto que células con el ADN dañado proliferen. Las mutaciones en el gen P53 permiten que células neoplásicas atraviesen la fase G1-S y propaguen sus alteraciones genéticas que pueden llevar a la inactivación de otros genes supresores de tumores o a la activación de oncogenes.95 En el CCEO, la mutación del gen P53 parece ocurrir durante la transición del carcinoma superficial hacia el carcinoma invasivo.125 Las mutaciones del gen P53 ocurren como mutaciones puntuales o deleciones. Las mutaciones puntuales resultan en una proteína estructuralmente alterada que secuestra la proteína salvaje, causando su inactivación y , por lo tanto, inactivando su actividad supresora. Las deleciones dan lugar a la reducción o pérdida de expresión y función de la p53. Además, las mutaciones del gen de la p53 con subsiguiente sobreexpresión representan un evento frecuente en la displasia epitelial y en el CCEO. El aumento del riesgo de transformación maligna en lesiones displásicas con un aumento de la sobreexpresión suprabasal de la p53 126 y el comportamiento agresivo y el pobre pronóstico del cáncer de cabeza y cuello con mutaciones de la p53 apuntan al significado pronóstico de las alteraciones de la p53.127,128 II.2.C.b. Gen P27 El gen P27/KIPL que se localiza en el cromosoma 12p12-12p13.1, también juega su papel en la detención del ciclo celular en la fase G1, regulando la proliferación a través de la unión e inhibición de las ciclinas G1/complejos CDK. II. Introducción 46 Las mutaciones en el gen P27 son raras, sin embargo han sido descritas en diversos tipos de tumores malignos humanos.129 Por otro lado, diversos estudios han descrito la pérdida o la disminución de la proteína p27 en diversos tipos de neoplasias. Además, se ha asociado la infrarregulación de la proteína p27 con la agresividad de los tumores y la supervivencia.130 Aunque los niveles de RNAm del P27 no cambien durante la progresión del ciclo celular, los niveles de la proteína p27 sufren un cambio durante el ciclo celular, con niveles máximos de expresión durante la fase G1 y G0. La disminución de la expresión de la proteína p27 se debe principalmente a un aumento en su tasa de degradación. En el epitelio oral normal, las células de los estratos espinoso y granular presentan una fuerte expresión de la proteína p27 en el núcleo celular.131 Diversos estudios han descrito una reducción de la expresión de la proteína p27 en lesiones con displasia epitelial severa y que la expresión disminuía con la progresión hacia un CCEO.132,133 Se ha descrito también, la infrarregulación de la proteína p27 en CCEO en estadios muy tempranos de invasión.134 Estos estudios indican que la reducción de la expresión de la proteína p27 ocurre en estadios muy tempranos de la carcinogénesis oral. Diversos estudios sugieren que la disminución de la expresión de la proteína p27 puede ser utilizada como marcador del pronóstico en pacientes con CCEO. Kudo et al.135 han descrito la infrarregulación de la proteína p27 en el 87% de los casos estudiados, y la pérdida de expresión se ha correlacionado con un comportamiento más agresivo del tumor, incluyendo el aumento del potencial metastásico y la disminución de la supervivencia de los pacientes. II.2.D. Proliferación Celular La proliferación celular se puede definir como “el aumento del número de células resultante de la conclusión del ciclo celular”.136 La tasa de proliferación de un cáncer depende de distintos factores tales como la proporción de células que proliferan (fracción de proliferación), la duración del ciclo celular y el factor de la pérdida celular II. Introducción 47 (debido a la muerte y a la diferenciación celular). El estudio de la fracción de proliferación tiene gran importancia, ya que no deja de ser el reflejo del comportamiento del cáncer, cuanto mayor sea la fracción de proliferación, mayor será el crecimiento del tumor. La hiperproliferación es un marcador precoz, aunque no específico, de un desorden en el crecimiento. Se acepta generalmente que un aumento en la proliferación se asocia con lesiones en estadios más avanzados y que la distribución de las células proliferativas en el tejido pueda darnos más información acerca del mecanismo de regulación que pierde su funcionalidad durante el proceso de la carcinogénesis en múltiples pasos. Se han desarrollado distintos métodos para la detección de la tasa de proliferación celular. Estos métodos difieren no solamente en lo que detectan, sino también en la fase del ciclo celular que marcan. Estos métodos incluyen la cuantificación de figuras mitóticas, el marcaje de la fase S mediante timidina tritiada o de su análogo bromodeoxiuridina (Brdu) y, más recientemente, la citometría de flujo y la inmunohistoquímica. El índice de mitosis,137 se basa en la evaluación estática del número de figuras mitóticas en diez campos microscópicos de gran aumento. El índice marcado con timidina tritiada138 o de su análogo bromodeoxiuridina,139 se basa en la evaluación en tejido fresco de la incorporación activa del precursor de la síntesis de ADN. Una autorradiografía permite estimular la cantidad de células que se encuentran en la fase proliferativa. Otro método es la demostración de regiones organizadoras nucleares por métodos argénicos (contaje de AgNORs).140 La citometría de flujo hace posible las estimaciones estáticas141 y dinámicas,142 dependiendo del método empleado. Actualmente hay mucho interés en el estudio de la utilidad clínica de marcadores inmunohistoquímicos de proliferación celular, especialmente de marcadores nucleares. Numerosas proteínas se expresan de manera diferente durante las distintas fases del ciclo celular, incluyendo la duplicación de ADN durante la replicación celular. La proliferación celular de las displasias y del cáncer oral ha sido ampliamente estudiada II. Introducción 48 mediante diferentes técnicas.143 Entre ellas los dos marcadores más comúnmente utilizados son el PCNA y el Ki-67/MIB-1.144 II.2.D.a. Antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) El antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA), miembro de la familia de las ciclinas, es un componente auxiliar de la DNA-polymerasa-δ que aparece en células en proliferación.140 En la mucosa oral normal y en lesiones hiperplásicas, la inmunorreactividad para la PCNA aparece limitada a las células proliferativas de la capa basal, pero en lesiones displásicas esta expresión aumenta e incluso se extiende a las capas suprabasales. El contaje de PCNA se correlaciona inversamente con el grado de diferenciación.140, 145, 146 Un estudio sugiere que el contaje de PCNA disminuye después de la quimioterapia, proponiendo la utilidad de este marcador para monitorizar la respuesta a la terapia.145 II.2.D.b. Ki-67 (MIB-1) El antígeno Ki-67 es una proteína nuclear (no histona) que se expresa en todas las fases del ciclo celular (G1, S, G2 y M), pero está ausente en las células en reposo (G0).147 El gen para este antígeno se localiza en el brazo largo del cromosoma 10 (10q25), y el Ki-67 reconoce dos proteínas de 345 y 390 kDa.148 La expresión de Ki-67 empieza en la fase G1, aumenta progresivamente durante las fases S y G2 y alcanza un pico en la mitosis (M). Después de la división, las células regresan a la fase G0 con un stock de Ki-67, el nivel disminuye progresivamente durante esta fase.149 Durante la interfase, el Ki-67 puede ser detectado exclusivamente dentro del núcleo, mientras que durante la mitosis gran parte de la proteína es trasladada a la superficie de los cromosomas. El antígeno es rápidamente degradado cuando la célula entra en estado no-proliferativo,150 y parece no haber expresión de Ki-67 durante el proceso de reparación del ADN.151 La función exacta de esta proteína sigue sin conocerse.152 II. Introducción 49 El MIB-1 es un anticuerpo monoclonal equivalente al anticuerpo antiKi-67, con la ventaja de que aquél puede ser utilizado en secciones de tejidos conservados en parafina.153 En términos de resultados de tinción, el Ki-67/MIB-1 generalmente posee menos fondo y más contraste que el antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA),153 por lo cual la tinción con el Ki-67/MIB-1 es más fácil de interpretar y cuantificar. Por lo tanto, la determinación de la proteína Ki-67 puede ser empleada para medir la fracción de crecimiento del tejido normal y de tumores malignos.154 Las lesiones premalignas de distintas localizaciones anatómicas se caracterizan por un aumento en la proliferación celular,155,156 y ésta, en general, se relacionan al grado de displasia epitelial. Por lo tanto, los marcadores de proliferación celular pueden ser útiles en la valoración del tipo y grado de las lesiones premalignas orales. Así, los cambios en la capacidad proliferativa de las lesiones premalignas orales puede revelar los cambios preneoplásicos precoces e indicar su potencial de transformación maligna.153 Se ha demostrado también que el índice de marcaje del Ki-67 se corresponde con el grado histológico de las lesiones leucoplásicas de la cavidad oral, siendo éste mayor cuanto mayor es el grado de displasia.157, 158 Estas observaciones sugieren que un desorden en la proliferación puede ser una consecuencia temprana de la exposición a agentes carcinogénicos. El valor pronóstico del Ki-67 en las lesiones premalignas sigue sin ser demostrado.159 Recientemente la expresión de Ki-67 fue estudiada en lesiones malignas y premalignas de la cavidad oral.160 El patrón de distribución de la Ki-67 en lesiones hiperqueratósicas y lesiones con displasia se da principalmente en las capas basal y suprabasales del epitelio, mientras en la mucosa oral normal se da principalmente en la capa basal. En lesiones de CCEO la mayoría de las células malignas se tiñen intensamente con Ki-67. La proliferación celular medida por la expresión de Ki-67 en el frente de invasión tumoral demostró una correlación fuertemente positiva con el grado de diferenciación histológica.161 II. Introducción 50 Se ha demostrado que los altos índices de Ki-67 observados en el CCEO poseen relación con la progresión de la enfermedad siendo indicativos de un pobre pronóstico.133, 162, 163 No sólo la valoración cuantitativa, sino también la valoración cualitativa, parecen ser indicativas del comportamiento del CCEO. La expresión suprabasal de la proteína Ki-67 en lesiones orales con displasia y lesiones malignas se correlaciona con un pobre pronóstico, con recidivas y metástasis linfáticas cervicales.164 Se ha descrito que la expresión de Ki-67 es un factor indicativo del fracaso del tratamiento. En una larga serie de CCE de la cavidad oral y orofaringe tratados con cirugía y radioterapia el índice de proliferación más alto fue indicativo de recidivas tempranas.165 Resultados similares fueron descritos en el CCE de lengua.163 Se ha demostrado también la correlación entre la expresión de las proteínas p53 y Ki-67 en lesiones premalignas y malignas de la cavidad oral.160 En circunstancias normales, como ya hemos visto, la p53 regula el ciclo celular induciendo la detención de la fase G1 o la apoptosis en células dañadas genéticamente.166 Para los autores, la correlación significativa entre la p53 y Ki-67 sugiere que alteraciones en la p53 llevan a un aumento de la proliferación celular. Recientemente se ha demostrado in vitro que tanto la p53 mutante y Ki-67 se sobreexpresan en células malignas y premalignas.167 En conjunto, esos hallazgos indican que la Ki-67 puede ser utilizada como marcador pronóstico en el CCEO. II.2.E. Apoptosis El denominador común de diversos procesos neoplásicos es el crecimiento anárquico y autónomo de sus células. Este aumento se debe tanto a una proliferación celular intensa a como una muerte celular insuficiente.168,169 Consecuentemente, mutaciones y otras alteraciones moleculares que impiden la apoptosis pueden jugar un importante papel en la patogenia y en la progresión de distintas neoplasias. La apoptosis es una forma de muerte celular programada genéticamente que se distingue por la activación de una familia de proteasas cisteína-aspartato (caspasas) que rompen varias proteínas originando cambios morfológicos y bioquímicos característicos de esta forma II. Introducción 51 de muerte celular. Las aberraciones en este proceso, que conllevan una reducción de la muerte celular, podrían participar en la carcinogénesis favoreciendo la aparición de mutaciones transformantes.170 El descubrimiento de una variedad de cambios genéticos, que influyen en la apoptosis y aparecen en neoplasias benignas y malignas, apoya a la teoría de que las aberraciones en la apoptosis contribuyen a la transformación neoplásica.168,171 Esto se demuestra por la alta frecuencia en que mutaciones que afectan al gen supresor de tumores P53 o al oncogen BCL-2 y otros miembros de la familia BCL-2 en diversos tipos de cáncer.169, 172 Evidencias más directas del papel crítico de la desrregulación de la apoptosis en ciertos tipos de cánceres se obtuvieron de experimentos que demuestran que la inhibición de la apoptosis (p.ej., en células transferidas con Bcl-2 o en ratones transgénicos con sobreexpresión de Bcl-2) se relaciona con la adquisición de un fenotipo maligno, mientras la restauración de los defectos en el mecanismo apoptótico (p. ej., a través de transferencia de la p53 salvaje) previene o revierte el crecimiento maligno y su progresión.168, 173 El CCEO ha sido correlacionado con la desrregulación del proceso apoptótico.86, 128, 173, 174, 175 Se ha sugerido que la carcinogénesis oral se correlaciona con la acumulación progresiva de alteraciones genéticas en las moléculas que juegan un papel crucial durante la apoptosis.175, 176 La presencia de cambios en lesiones premalignas de la mucosa oral sugiere el papel significativo de las desviaciones de la apoptosis durante los pasos iniciales de la transformación maligna. Por ejemplo, miembros de la familia Bcl-2 y Bax se expresan diferentemente en el epitelio oral normal, displasia epitelial y en el CCEO.175, 177 Además, una relación baja entre Bcl-2/Bax, y por lo tanto proapoptótica, ha sido demostrada con o un indicador de un pronóstico favorable en el CCE de lengua.175, 178 Parece convincente que durante el proceso en múltiples pasos de la carcinogénesis, la acumulación de daños genéticos resultan en la pérdida del control de la proliferación celular, así el mantenimiento del equilibrio entre la proliferación y la muerte celular depende de la eliminación apoptótica de células con una proliferación anormal173. En este contexto, el déficit en las vías apoptóticas en la displasia y en el II. Introducción 52 cáncer oral dan lugar a tasas de apoptosis, aunque aumentadas en relación al epitelio normal, insuficientes para compensar la proliferación celular acelerada y a la acumulación de células dañadas genéticamente, permitiendo así el crecimiento incontrolado, la adquisición de mutaciones adicionales y la progresión de la enfermedad.173 La identificación de reguladores de la apoptosis, los cuales poseen potencial de influenciar el balance entre muerte y viabilidad celular, ha ganado especial interés en el entendimiento de la carcinogénesis. II.2.E.a. Bcl-2 El protooncogen BCL-2, localizado en el cromosoma 18, fue el primer gen antiapoptótico descrito179 y está involucrado en la regulación de la apoptosis controlada por la p53, demostrando una relación inversa con la expresión de p53.180 La pieza central del programa apoptótico y el efector principal de la muerte celular programada es la familia de proteínas relacionadas con la Bcl-2. El miembro principal de esta familia es la proteína Bcl-2. Todas las proteínas de esta familia exhiben dos dominios, Bh1 y Bh2, que regulan la formación de dímeros entre los antagonistas (Bcl-2 y Bcl-xi) y los agonistas de la apoptosis (Bax).181 La actividad de esta familia de proteínas se regula en función de la competencia entre dímeros pro-apoptóticos y antiapoptóticos. Así, si el nivel de Bcl-2 (anti-apoptótico) es mayor que el de Bax (inductor de la apoptosis), los homodímeros Bcl-2/Bcl-2 prevalecen y las células estarán protegidas de la muerte celular programada. Si, por el contrario, Bax está en exceso, se favorece la formación de heterodímeros Bcl-2/ Bax y se induce la apoptosis. Por tanto la relación (nivel relativo de expresión) entre las proteínas inductoras y protectoras de apoptosis determina el destino final de la célula. 182 Se ha demostrado una reducción de la expresión de la Bcl-2 en el CCEO en comparación con la mucosa oral normal, así como la correlación entre la expresión de Bax y el grado histológico 183. En otro estudio, se ha demostrado que la expresión de Bcl-2 y el índice de apoptosis no poseen un valor pronóstico significativo en una serie de 57 pacientes con II. Introducción 53 CCEO. Sin embargo el aumento de la expresión de Bax se correlacionó con un pronóstico desfavorable.184 En resumen, la disminución de la expresión de Bcl-2 en queratinocitos humanos premalignos y malignos sugiere que, probablemente, la expresión preferente de miembros de la familia Bcl-2 que protegen de la apoptosis es un fenómeno clave precoz en el desarrollo de CCEO,185 haciendo sensibles las células a la aparición de mutaciones y a la progresión tumoral. En condiciones normales, el proceso de apoptosis elimina eficazmente a las células genéticamente dañadas y evita su crecimiento y progresión hacia la malignidad. Si este proceso falla, pueden sobrevivir células con ADN lesionado desarrollando una hiperrespuesta a señales de proliferación. Esta continua persistencia de células resistentes a la apoptosis aumenta la posibilidad de que acontezcan mutaciones adicionales que concluyan finalmente en el fenotipo maligno. II.2.E.b. Survivina Además de las moléculas Bcl-2, pro y anti apoptóticas, una segunda familia de genes inhibidores de la apoptosis (IAP) ha sido identificada.186 La survivina, una proteína anti-apoptótica,187 es indetectable en la mayoría de los tejidos normales en los adultos, mientras su expresión en tumores humanos ha sido relacionada con un aumento de la agresividad tumoral y una disminución de las tasas de supervivencia de los pacientes con cáncer. Existen evidencias de que la inhibición de la apoptosis por la survivina es un parámetro predictivo de un mal pronóstico en cánceres humanos y que la survivina puede ser una diana diagnóstica y terapéutica en tumores malignos.188 Tanaka et al.189 han estudiado la expresión de survivina en el CCEO. En este estudio, los autores han demostrado la ausencia o una débil expresión de la survivina en la mucosa oral normal. El 58% de los CCEO presentaron inmunorreactividad para la survivina en el citoplasma de las células tumorales. Sin embargo, no se han encontrado relaciones significativas entre la expresión de survivina y las características clínicopatológicas de las lesiones. En este mismo estudio, los autores encontraron que el 37% de las leucoplasias presentaron expresión de survivina. Los niveles de survivina en las leucoplasia y en las lesiones malignas fueron significativamente más altos que los II. Introducción 54 encontrados en la mucosa oral normal. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en los niveles de expresión entre las leucoplasias y los CCEO. Lo Muzio et al.190 han investigado el potencial predictivo de la expresión de survivina para identificar las lesiones premalignas (con displasia epitelial) con mayor riesgo de transformación maligna. La expresión de survivina en el tejido oral normal apareció esporádicamente en las capas basal y suprabasal, con una tinción débil. Sin embargo, el 94% de las lesiones premalignas que progresaron hacia un carcinoma presentaron expresión de survivina, mientras que sólo el 33% de las lesiones donde no se observó la transformación maligna presentaron positividad. No se encontró correlación entre la expresión de survivina y el grado de displasia epitelial. El 100% de los CCEO presentaron positividad para la survivina.190 II.2.F. Angiogénesis El crecimiento tumoral está asociado con una actividad celular elevada donde el aumento del soporte sanguíneo es crucial para la continuación de su desarrollo. El proceso de angiogénesis es un proceso de múltiples pasos que parecen estar regulados tanto por factores estimulantes como por factores inhibidores. Los pasos críticos para la neovascularización incluyen la degradación de la matriz extracelular, proliferación de células endoteliales, migración y remodelación de la matriz extracelular. Se ha asociado la angiogénesis con la aparición de metástasis y una disminución de la supervivencia de pacientes con varios tipos de tumores, incluyendo el CCEO. Aunque la valoración directa de la angiogénesis en los cortes histológicos es un procedimiento difícil, se ha sugerido que la cuantificación de microvasos teñidos inmunohistoquímicamente (microdensidad vascular) puede ser utilizada como índice.191 Desafortunadamente, diversos estudios han utilizando anticuerpos distintos para identificar los vasos sanguíneos, lo que hace que la comparación de los resultados sea problemática. III. Material y Métodos 61 III. MATERIAL Y MÉTODOS III. Material y Métodos 62 III.1. SELECCIÓN DE LOS PACIENTES Se han estudiado retrospectivamente las historias clínicas de los pacientes diagnosticados y tratados de CCEO en el Servicio de Cirugía Maxilofacial del Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela, entre los años 1995 y 2000. Debido a la ausencia de un registro de tumores, los casos fueron localizados en el registro de ingresos a quirófano para tratamiento quirúrgico de un carcinoma de células escamosas en el Servicio de Cirugía Maxilofacial durante este periodo. Seguidamente, se procedió a la revisión de las historias clínicas en el Archivo Central del Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela . III.1.A. Criterios de inclusión y exclusión Según los criterios de inclusión se seleccionaron todos aquellos pacientes que hubiesen sido tratados quirúrgicamente de un CCEO con un periodo de seguimiento mínimo de 3 años, salvo que hubiese fallecido a causa de la enfermedad durante este seguimiento. Se incluyeron las lesiones asentadas en las siguientes localizaciones consignadas en la 9ª revisión del Código Internacional de Enfermedades:240 141.1141.4, 141.8 y 141.9, porción móvil de la lengua; 143.0-143.9, encía en todas sus localizaciones; 144.0-144.9 suelo de boca todas sus localizaciones; 145.0-145.9 otras localizaciones cavidad oral (mucosa yugal, vestíbulo, paladar duro y trígono retromolar). Se excluyeron aquellos pacientes que hubiesen recibido tratamiento con radio o quimioterapia anteriormente al tratamiento quirúrgico. Además, se excluyeron los pacientes con metástasis a distancia en el momento del diagnóstico. III.2. DATOS CLÍNICOS De cada historia clínica se obtuvieron los siguientes datos clínicos: edad, sexo, historia de los hábitos tabáquicos y alcohólicos, localización, estadio clínico, clasificación TNM, tratamiento de la lesión primaria, presencia o ausencia de recidiva, aparición de segundos tumores primarios, metástasis a distancia, intervalo libre de enfermedad y supervivencia a la enfermedad (APÉNDICE 1). III. Material y Métodos 63 El estadio tumoral fue clasificado según la 5ª edición del Manual de Estadiaje del Cáncer del AJCC 36 (ver página 18). III.2.A. Factores de riesgo III.2.A.a. Tabaco Se registró el consumo de tabaco según la cantidad de cigarrillos consumida diariamente y los pacientes fueron agrupados de forma semi-cuantitativa en: - fumador leve (menos de 10 cigarrillos/día) - fumador moderado (entre 10 y 20 cigarrillos/día) - fumador importante (más de 20 cigarrillos/día) - no fumador - desconocido III.2.A.b. Alcohol El consumo de alcohol se registró semi-cuantativamente, según la cantidad en gramos consumida diariamente, y los pacientes fueron clasificados en: - bebedor leve (menos de 40 g/día) - bebedor moderado (entre 40 y 80 g/día) - bebedor importante (más de 80 g/día) - no bebedor - desconocido III.2.B. Evolución de la enfermedad La zona de recidiva fue definida como local (localización primaria) o regional (nódulos linfáticos cervicales), segundo tumor primario, o metástasis a distancia. Las metástasis cervicales tardías, y recidivas de las metástasis cervicales fueron identificadas como recidivas regionales. Las metástasis a distancia se definieron como III. Material y Métodos 64 la diseminación tumoral a partir del tumor primario hacia órganos o nódulos linfáticos a distancia.242 El intervalo libre de enfermedad fue medido desde la fecha del tratamiento inicial hasta la fecha del diagnóstico de la recidiva local, regional o a distancia. III.2.C. Evolución del paciente La supervivencia fue definida como el intervalo entre el inicio del tratamiento y la fecha de la muerte o la fecha del último control para los casos censurados. III.3. ESTUDIO HISTOLÓGICO CONVENCIONAL Las muestras histológicas fueron obtenidas del Servicio de Anatomía Patológica del Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela. Las piezas quirúrgicas fueron fijadas en formol tamponado al 10%, por un máximo de 24 horas, e incluidas en parafina. Tras el estudio con técnicas habituales de hematoxilina-eosina, se seleccionaron los bloques más representativos de los tumores y se realizaron nuevos cortes de 5 micras para el estudio histológico e inmunohistoquímico. III.3.A. Grado de diferenciación histológica La diferenciación histológica fue definida según los criterios de la OMS 26 en tumores bien diferenciados, moderadamente diferenciados y pobremente diferenciados. Todas las muestras fueron clasificadas por el mismo observador. III.3.B. Modo de Invasión Tumoral El modo de invasión tumoral se clasificó en 4 categorías:32 A) Tumor con márgenes invasivos bien delimitados que empujan el tejido adyacente. B) Tumor con márgenes que infiltran el tejido adyacente en cordones sólidos. III. Material y Métodos 65 C) Tumor con márgenes que contienen pequeños grupos o cordones de células infiltrantes (> 15 células tumorales). D) Tumores con marcada disociación celular en pequeños grupos celulares o incluso células individuales (< 15 células tumorales). Para el análisis de los resultados se agruparon las categorías A y B (poco invasivos) y C y D (muy invasivos). III.3.C. Profundidad de Invasión Tumoral Para la medición de la profundidad máxima de los tumores se seleccionaron los cortes con el máximo grosor en los cuales se podía observar la mucosa adyacente y que se consideraron que no fueron cortados tangencialmente. Para la medición se utilizó una rejilla micrométrica (Graticules Ltd., Tombridge, Reino Unido) para medir la distancia, en milímetros, a partir de una línea imaginaria reconstruyendo la membrana basal de la mucosa oral sana hasta el punto de invasión máximo del tumor, tanto en lesiones exofíticas como ulceradas.241 III.3.D. Invasión perineural La invasión perineural fue positiva cuando se identificaron células tumorales en el espacio perineural. Los tumores adyacentes a los nervios sin penetrar en el espacio perineural no fueron considerados positivos para la invasión perineural.242 II.3.D. Estado de los márgenes quirúrgicos Para la definición del estado de los márgenes quirúrgicos se han revisado los informes histológicos referentes a la escisión del tumor, así como todos los informes de las biopsias intraoperatorias realizadas durante el acto quirúrgico. Los márgenes quirúrgicos se definieron como libres de infiltración tumoral (márgenes negativos) o con infiltración tumoral (márgenes positivos). III. Material y Métodos 66 III. 4. ESTUDIO INMUNOHISTOQUÍMICO Para las técnicas inmunohistoquímicas se utilizó el sistema automático de tinción Techmate 500 (DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca): III.4.A. Preparación de los cortes de parafina Los cortes de parafina de 5 micras se recogieron en portaobjetos pretratados específicos para su uso en el teñidor Techmate (Dako ChenMate Capillary Gap Microscope, DakoCytomation). Los cortes se dejaron secar durante una noche a 45ºC y posteriormente fueron desparafinados e hidratados. III.4.B. Recuperación Antigénica Según el anticuerpo primario utilizado, las muestras fueron sometidas a distintos métodos de recuperación antigénica. III.4.B.a. Ki-67/MIB-1 y Laminina 5 γ2 Método de recuperación antigénica en baño termostático húmedo a 99ºC durante 40 minutos, en una solución de recuperación antigénica Tris-EDTA, pH 9 (Target Retrieval Solution, S3308, DakoCytomation). III.4.B.b. EGFR Recuperación antigénica mediante tratamiento enzimático con Proteinasa K. Las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente durante 5 minutos con Proteinasa K al 0,1% diluida en solución tampón TrisHCL. III.4.B.c. Cadherina-E Pretratamiento en el horno microondas a una potencia de 750 W durante 20 minutos, en solución tampón citrato, pH 6 (Target Retrieval Solution, S2031, DakoCytomation). III. Material y Métodos 67 III.4.C. Técnica inmunohistoquímica Tras enfriar las secciones durante 20 minutos, éstas fueron introducidas en los contenedores especiales del teñidor automático TechMate 500 (DakoCytomation), el cual realizó la técnica inmunohistoquímica siguiendo los siguientes pasos: 1. Lavado PBS 2. Incubación con anticuerpos primarios a temperatura ambiente durante 30 minutos: Anticuerpo monoclonal anti-Ki-67, dilución 1/10 (clon MIB-1, DakoCytomation); anticuerpo monoclonal anti-EGFR prediluido (clon 2-18C9, DakoCytomation); anticuerpo monoclonal anti-Laminina 5 γ2, dilución 1/10 (clon 2-18C9 , DakoCytomation); y anticuerpo monoclonal anti-cadherina-E, dilución de 1/100 (clon 36, Transduction Laboratories, Lexington, Kentucky, EUA). (Tabla 6). 3. Lavado PBS 4. Bloqueo peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno al 3% durante 5 minutos. 5. Lavado PBS 6. Incubación con sistema de polímeros de dextrano durante 30 minutos. (EnVision Detection Kit,DakoCytomation). El sistema de polímeros de dextrano se basa en la utilización de un polímero de alto peso molecular, al que se conjugan covalentemente un gran número de moléculas de peroxidasa y anticuerpo secundario (inmunoglobulinas anti ratón/conejo) (Figura 1). 7. Lavado PBS 8. La visualización del marcaje inmunohistoquímico se realizó con tetraclorhidrato de diaminobencidina (DakoCytomation). 9. Contratinción con Hematoxilina de Harris durante 2 minutos. 10. Lavado PBS 11. Deshidratación y montaje. III. Material y Métodos 68 Se incluyeron controles negativos y positivos para asegurar la especificidad de la técnica. Figura 1: Técnica inmunohistoquímica: sistema de polímeros de dextrano Anticuerpo Clon Dilución Pretratamiento Casa Comercial País AntiKi-67 MIB-1 1/10 BTH + TE DakoCytomation Dinamarca AntiLaminina 5γ 2 4G1 1/10 BTH+ TE DakoCytomation Dinamarca AntiEGFR 2-18C9 prediluido Proteinasa K DakoCytomation Dinamarca AntiCadherina-E 36 1/100 HMO Transduction Laboratories EUA BTH: Baño termostático húmedo; TE: Solución Tris-EDTA; PK: Proteinasa K; HMO: Horno Microondas Tabla 6: Panel de anticuerpos utilizados AC. PRIMARIO ENVISION: •AC. ANTI-ESPECIE •POLÍMERO DEXTRANO •PEROXIDASA DAB DABDAB DAB TETRACLORHIDRATO DE 3, 3’ DIAMINOBENCIDINA AC. PRIMARIOAC. PRIMARIO ENVISION: •AC. ANTI-ESPECIE •POLÍMERO DEXTRANO •PEROXIDASA DAB DABDAB DAB TETRACLORHIDRATO DE 3, 3’ DIAMINOBENCIDINA DAB DABDAB DAB TETRACLORHIDRATO DE 3, 3’ DIAMINOBENCIDINA III. Material y Métodos 69 III.4.D. Valoración de los marcadores inmunohistoquímicos III.4.D.a. Cuantificación de la expresión de Ki-67/MIB-1 Para la cuantificación de la expresión del Ki-67 se utilizó el método de contaje de puntos de forma manual mediante una rejilla de Mertz con 36 puntos de corte (Mertz Graticule, Klarman Rulings Inc., Litchfield, Holanda) (Figura 2). Las muestras fueron analizadas a un aumento de 400x (objetivo 40x, ocular 10x). Los puntos de la rejilla se utilizaron para registrar los núcleos MIB-1 -positivos/negativos. De esta manera los puntos de corte pueden ser MIB-1-positivos, MIB-1-negativos o ninguno de los dos. Las células se consideraron positivas si se identificaba tinción positiva en el núcleo o nucleolo, independientemente de la intensidad de tinción. El índice de proliferación celular se definió como MIB-1 positivos/MIB-1 positivos + MIB-1 negativos. La cuantificación se realizó en 10-15 campos de visión realizando el recuento de al menos 150 núcleos en cada caso.243 Figura 2: Rejilla de Mertz con 36 puntos de corte usada para la cuantificación del índice de proliferación celular III. Material y Métodos 70 III.4.D.b Cuantificación de la expresión del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) La tinción de la membrana fue valorada en las células tumorales y clasificada en 4 grupos diferentes:244 0; Negativo: No se observó tinción, o tinción en la membrana de <10% de las células neoplásicas. 1+; Positivo débil: Tinción de débil intensidad, completa o incompleta de la membrana celular, en >10% de las células neoplásicas. 2+; Positivo moderado: Tinción de moderada intensidad, completa o incompleta de la membrana celular, en >10% de las células neoplásicas. 3+; Positivo intenso: Tinción de fuerte intensidad, completa o incompleta de la membrana celular, en >10% de las células neoplásicas. Por motivos prácticos y para el análisis estadístico se agruparon los casos 0 y 1+ como expresión negativa/ débil y los casos 2+ y 3+ como expresión moderada/ intensa. III.4.D.c. Cuantificación de la expresión de Laminina 5 γ2 La cuantificación de la expresión de la laminina 5 γ2 fue realizada mediante el método detallado a continuación. Primeramente, los cortes fueron examinados a más baja magnificación para identificar el área con el mayor nivel de expresión, y seguidamente, este área fue examinada a un aumento de 100x (objetivo 10x, ocular x10). Se han comparado dos sistemas para valorar la expresión de laminina 5 γ2, uno cualitativo y otro semi-cuantitativo: 216 A) Pocas o ningunas células tumorales positivas; B) Parte de la periferia de los nidos tumorales es positiva; C) La periferia de los nidos tumorales es circunferencialmente positiva; D) Prácticamente todas las células tumorales son positivas IV. Resultados 77 18 12 7 10 0 5 10 15 20 T1 T2 T3 T4 Tamaño (T) Figura 2: Distribución de los pacientes según el tamaño del tumor primario (estadio T) II.2.D.b. Ganglios linfáticos cervicales (estadio N) Respecto a los ganglios linfáticos cervicales, la mayoría de los casos no presentaban adenopatías cervicales palpables (n= 34, 72,3%) y los casos con adenopatías palpables se repartían en: 8 (17%) N1 y 5 (10,6%) N2. 34 85 0 0 5 10 15 20 25 30 35 N0 N1 N2 N3 Estadio N Figura 3: Distribución de los pacientes según la afectación de los ganglios linfáticos cervicales (estadio N) En el momento del diagnóstico ningún caso presentó metástasis a distancia una vez que este era uno de los criterios de exclusión del estudio. IV.2.E. Estadio Clínico Diecisiete pacientes (36,2%) presentaron tumores en estadio I, 10 (21,3%) en estadio II, 9 (19,1%) en estadio III, y 11 (23,4%) en estadio IV. Al agrupar los pacientes con tumores en estadio I-II (estadios tempranos) y III-IV (estadios avanzados), 26 IV. Resultados 78 (55,3%) pacientes presentaron tumores en estadios tempranos y 21 (44,7%) en estadios avanzados. 17 10 911 0 5 10 15 20 I II III IV Estadio clínico Figura 4: Distribución de los pacientes según el estadio clínico IV.2.F. Tratamiento Todos los tumores primarios fueron extirpados quirúrgicamente con intención curativa. En 5 casos (10,6%) el informe histopatológico confirmó la infiltración neoplásica en los bordes quirúrgicos de la resección tumoral. A los 13 pacientes con adenopatías cervicales palpables se les realizó un vaciamiento cervical terapéutico. En todos los pacientes se obtuvo la confirmación histológica de metástasis ganglionar. El vaciamiento cervical profiláctico fue realizado en 19/34 pacientes (36,2%) sin adenopatías cervicales palpables. Se confirmó la metástasis ganglionar cervical en uno de estos casos (5,3%). Por lo tanto, la diseminación regional a los ganglios linfáticos cervicales se confirmó histológicamente en 14 pacientes (29,78). A los demás 15 pacientes (31,9%), sin adenopatías cervicales palpables, no se les realizó vaciamiento cervical. En total 12 pacientes (25,5%) recibieron radioterapia postoperatoria directamente a la lesión primaria, cuello o ambos. IV. Resultados 79 IV. 3. EVOLUCIÓN DE LA ENFERMEDAD IV.3.A. Recidivas locales Dieciséis pacientes (34%) presentaron recidiva local durante el intervalo del estudio con un intervalo medio de 13 meses ± 7,76 (rango 229 meses). IV.3.B. Recidivas regionales Veinte dos pacientes (46,8%) presentaron recidivas regionales. La media del intervalo de presentación fue de 15,86 meses ± 7,16 (rango 534 meses). IV.3.C. Metástasis a distancia y Segundos tumores primarios Cinco pacientes (10,63%) presentaron metástasis a distancia, las cinco se localizaron en pulmón. Dos pacientes (4,25%) desarrollaron un segundo tumor primario durante el periodo de seguimiento, los 2 se localizaron en laringe. El intervalo medio de presentación de las metástasis a distancia y segundos tumores primarios fue de 38,42 meses ± 16,30 (rango 1964 meses) IV.4. EVOLUCIÓN DEL PACIENTE Al final del estudio, 21 (44,7%) pacientes permanecían vivos, 1 (2,1%) paciente permanecía vivo pero presentaba recidiva local y regional y 25 (53,2%) murieron por la enfermedad. No se han encontrado muertes debido a otras causas durante el periodo de seguimiento. IV. Resultados 80 IV.5. ESTUDIO HISTOLÓGICO IV.5.A. Grado de Diferenciación Histológica Según los criterios establecidos por la OMS para la clasificación histológica de los tumores, 22 (46,8%) eran bien diferenciados y 25 (53,2%) moderadamente diferenciados. No se diagnosticaron tumores pobremente diferenciados. 22 25 20 21 22 23 24 25 Bien diferenciado Moderadamente diferenciado Grado de diferenciación Figura 5: Distribución de los pacientes según el grado de diferenciación histológica IV.5.B. Modo de Invasión Tumoral Al clasificar los tumores según el modo de invasión tumoral, 6 (12,8%) presentaron un patrón de invasión A, 19 (40,4%) patrón B, 13 (27,7%) patrón C y 9 (19,1%) patrón D. Al agrupar los pacientes, 25 (53,2%) presentaron tumores poco invasivos (A y B) y 22 (46,8%) tumores muy invasivos (C y D). Modo de Invasión Tumoral Poco Invasivos Muy Invasivos Patrón A B C D 6 (12,8%) 19 (40,4%) 13 (27,7%) 9 (19,1%) Número/ (%) 25 (53,2%) 22 (46,8% Tabla 8: Distribución de los pacientes según el modo de invasión tumoral IV. Resultados 81 Figura 6: Carcinoma oral de células escamosas que infiltra en forma de nidos (> 15 células tumorales) (H-E 10x). Figura 7: Carcinoma oral de células escamosas que infiltra en forma de pequeños cordones o células individuales (< 15 células tumorales) (H-E 20x). IV. Resultados 82 IV.5.C. Profundidad de Invasión El grosor de 10 tumores no pudo ser valorado debido a la ausencia de mucosa normal adyacente. La media del grosor de las 37 lesiones restantes fue de 6,33 mm ± 3,68 (rango 1,25-16,37mm). Media Desviación Típica Mínimo Máximo Profundidad (mm) (n=37) 6,33 3,68 1,25 16,37 Tabla 9: Profundidad de invasión media de los tumores Figura 8: Profundidad de invasión tumoral. Distancia en mm a partir de una línea imaginaria que reconstruye la membrana basal de la mucosa oral hasta el punto de invasión máximo del tumor (H-E 4x). IV. Resultados 83 IV.5.D. Invasión Perineural La invasión perineural fue observada en 9 (19,14%) de los tumores. Figura 9: Invasión perineural de las células neoplásicas en el carcinoma oral de células escamosas (H-E 20x). IV.5.E. Márgenes quirúrgicos El informe histopatológico final confirmó la infiltración neoplásica en los márgenes quirúrgicos de la resección tumoral en 5 casos (10,6%). IV. Resultados 84 IV.6. ESTUDIO INMUNOHISTOQUÍMICO IV.6.A. Proliferación celular (MIB-1) Los núcleos positivos fueron identificados por su tinción de color marrón. La distinción entre los núcleos positivos y negativos fue inequívoca. No se observó tinción citoplasmática con excepción de las células en mitosis, que presentaron una tinción nuclear de un marrón más oscuro que los otros núcleos positivos, y el citoplasma presentó una tinción marrón amarillenta. El tejido normal del margen de las lesiones presentaron un patrón de tinción positiva en las células basales y parabasales. En la mucosa adyacente con displasia, la tinción positiva se extendía hacia las capas celulares más superficiales. La distribución de los núcleos positivos para MIB-1 en el tumor fue heterogénea, variando desde débil o ausente en las áreas centrales donde se encontraban células maduras o en proceso de queratinización, a una actividad proliferativa más alta en las áreas periféricas. Al contrario, la mayoría o la totalidad de los núcleos en la periferia del frente de invasión tumoral fueron uniformemente positivos. Por lo tanto, esta fue el área establecida para la cuantificación del índice de proliferación celular. Todas las muestras estudiadas, excepto una, mostraron positividad nuclear para el anticuerpo MIB-1 con un índice de proliferación medio de 57,28% ± 16, 40 (rango 23,60-85, 32%). Media Desviación Típica Mínimo Máximo MIB-1 (%) (n=46) 57,28 16,40 23,60 85,92 Tabla 10: Índice de proliferación celular medio de los tumores La distribución de los índices de proliferación del tumor primario según los parámetros clínicos, histolólógicos e inmunohistoquímicos se pueden observar en la tabla 11. IV. Resultados 85 Figura 10: Carcinoma oral de células escamosas con bajo índice de proliferación celular (MIB-1, 20x). Figura 11: Carcinoma oral de células escamosas con alto índice de proliferación celular (MIB-1,10x). IV. Resultados 86 IV.6.A.a. Correlación entre MIB-1 y Edad No existió relación significativa entre la edad del paciente en el momento del diagnóstico y el índice de proliferación celular (R= 0,038, p= 0,804). El índice de proliferación de los tumores en pacientes ≤ 45 años fue de 53,42 ± 13,11, y de 58,21 ± 17,13 en los pacientes > 45 años, esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p=0,438; Test T de Student). 379N = Rango de edad >45 años<=45 años Índice de proliferación celular (MIB-1) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Figura 12: Distribución de MIB-1 según el rango de edad IV.6.A.b. Correlación entre MIB-1 y Sexo Respecto a la relación entre el índice de proliferación del tumor y el sexo del paciente, encontramos un índice de proliferación significativamente más alto (60,15% ± 15,54) entre los hombres en comparación con las mujeres (41,24% ± 11,60) (p= 0,04; T de Student) IV. Resultados 93 IV.6.B. Expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) La expresión de EGFR se localizó predominantemente en la membrana plasmática, aunque también se pudo observar expresión en el citoplasma celular. Solamente una muestra (2,1%) fue clasificada como expresión negativa. De los 46 casos (97,9%) que presentaron positividad para el EGFR, la intensidad de la expresión fue la siguiente: 1+ en 11 casos (23,4%), 2+ en 19 casos (40,4%) y 3+ en 16 (34%) casos. Expresión negativa/débil Expresión moderada/ intensa EFGR 0 1+ 2+ 3+ nº casos/(%) 1 (2,1%) 11 (23,4%) 19 (40,5%) 16 (34%) 12 (25,5%) 35 (74,5%) Tabla 12: Distribución de la expresión de EGFR Figura 21: EGFR en la mucosa oral normal. Se observa tinción de membrana intensa en las capas basales y suprabasales del epitelio, disminuyendo hacia la superficie epitelial (10x). IV. Resultados 94 Figura 22: EGFR en el carcinoma oral de células escamosas. Expresión de intensidad débil en la membrana de las células tumorales (20x). Figura 23: EGFR en el carcinoma oral de células escamosas. Expresión de fuerte intensidad en la membrana de las células tumorales (40x). IV. Resultados 95 IV.6.B.a. Correlación entre la expresión de EGFR y la edad La media de edad de los pacientes con tumores con expresión negativa/débil de EGFR fue de 61,8 años ± 11,23, y de 56,44 años ± 13,67 para los pacientes con tumores con expresión moderada/intensa. Esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p= 0,298; Test T de student). 3512N = Expresión de EGFR moderada/intensanegativa/débil Edad 90 80 70 60 50 40 30 20 Figura 24: Distribución de la edad de los pacientes según la expresión de EGFR Al comparar la expresión de EGFR en los tumores de pacientes ≤ de 45 años con los pacientes > de 45 años, encontramos que el 100% de los tumores en pacientes ≤ de 45 años presentaron expresión moderada/ intensa de EGFR, mientras que este porcentaje se reduce al 68,4% en pacientes > de 45 años. Esta tendencia fue cercana a la significación estadística (χ2= 3,817; p= 0,052; Test de Chicuadrado). 100% 31,6% 68,4% 0 20 40 60 80 100 <= 45 años > 45 años Expresión moderada/ intensa Expresión negativa/ débil Figura 25: Expresión de EGFR según el rango de edad IV. Resultados 96 IV.6.B.b. Correlación entre la expresión de EGFR y Sexo No se encontró asociación entre la expresión de EGFR y el sexo de los pacientes (χ2 =0,001, p= 0,970; Test de Chi-cuadrado). 25% 75% 28,2% 71,8% 0 20 40 60 80 100 Hombres Mujeres Expresión moderada/ intensa Expresión negativa/ débil Figura 26: Expresión de EGFR según el sexo IV.6.B.c. Correlación entre la expresión de EGFR y Localización del tumor primario Los niveles de expresión de EGFR según las distintas localizaciones de los tumores primarios se pueden observar en gráfico. No encontramos diferencias significativas entre los niveles de expresión de EGFR y la localización del tumor primario (χ2= 3,643; p= 0,602; Test de Chicuadrado). 27,8% 72,2% 38,5% 61,5% 11,1% 88,9% 33,3% 66,7% 100% 100% 0 20 40 60 80 100 Lengua Suelo de boca Reborde alveolar Trígono retromolar Paladar duro Mucosa yugal Expresión moderada/ intensa Expresión negativa/ débil Figura 27: Expresión de EGFR según la localización del tumor primario IV. Resultados 97 IV.6.B.d. Correlación entre la expresión de EGFR y Estadio TNM Tamaño del tumor primario (estadio T) Los tumores de mayor tamaño presentaron expresión moderada/intensa de EGFR con más frecuencia que los tumores de menor tamaño. Esta tendencia se acercó a la significación estadística (χ2= 7, 721; p= 0,052; Test de ChiCuadrado). 33,3% 66,7% 50% 50% 14,3% 85,7% 100% 0 20 40 60 80 100 T1 T2 T3 T4 Expresión moderada/ intensa Expresión negativa/ débi Figura 28: Expresión de EGFR según el tamaño del tumor primario (estadio T) Ganglios linfáticos Cervicales (estadio N) No se encontró relación estadísticamente significativa entre la expresión de EFGR y el estadio N (χ2 = 0,097, p=0,952; Test de Chi-Cuadrado). 29,4% 70,6% 25% 75% 20% 80% 0 20 40 60 80 100 N0 N1 N2 Expresión moderada/ intensa Expresión negativa/ débil Figura 29: Expresión de EGFR según el estadio N IV. Resultados 98 IV.6.B.e. Correlación entre la expresión de EGFR y Estadio Clínico El nivel de expresión de EGFR fue más intenso en los estadios más avanzados, probablemente debido a la influencia del tamaño del tumor en esta clasificación, sin embargo no se encontró una relación estadísticamente significativa entre la expresión de EGFR y el estadio clínico del tumor (χ2=2,851; p=0,415; Test de ChiCuadrado). 35,3% 64,7% 40% 60% 22,2% 77,8% 9,1% 90,9% 0 20 40 60 80 100 Estadio I Estadio II Estadio III Estadio IV Expresión moderada/ intensa Expresión negativa/ débil Figura 30: Expresión de EGFR según el estadio clínico IV.6.B.f. Correlación entre la expresión de EGFR y Grado de diferenciación histológica Los tumores moderadamente diferenciados presentaron expresión moderada/ intensa de EGFR con más frecuencia que los tumores bien diferenciados, sin embargo esta relación no fue estadísticamente significativa (χ2=0,860; p=0,354; Test de Chicuadrado). 36,4% 63,6% 20% 80% 0 20 40 60 80 100 Bien diferenciado Moderadamente diferenciado Expresión moderada/ intensa Expresión negativa/ débil Figura 31: Expresión de EGFR según el grado de diferenciación histológica IV. Resultados 99 IV.6.B.g. Correlación entre la expresión de EGFR y Modo de invasión tumoral No se encontró relación estadística entre la expresión de EGFR y el modo de invasión tumoral (χ2=0,66; p=0,767; Test de Chicuadrado). 28% 72% 27,3% 72,7% 0 20 40 60 80 100 Poco invasivos Muy invasivos Expresión moderada/ intensa Expresión negativa/ débil Figura 32: Niveles de expresión de EGFR según el modo de invasión tumoral IV.6.B.h. Correlación entre la expresión de EGFR y Profundidad de invasión La profundidad media de los tumores con expresión negativa/débil de EGFR fue de 6,14 ± 3,67 mm, y de 6,52 ± 3,77 mm para los tumores con expresión moderada/intensa. Esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p=0,840; Test T de Student). 2611N = Expresión de EGFR moderada/intensanegativa/débil Profundidad de invasión tumoral 20 10 0 -10 Figura 33: Profundidad de invasión tumoral según la expresión de EGFR IV. Resultados 100 IV.6.C. Expresión de laminina 5 γ2 La expresión de la Laminina 5 γ2 se detectó claramente en el citoplasma de las células tumorales, pero no en el epitelio normal adyacente, con excepción de algunas áreas con displasia epitelial donde se pudo detectar inmunopositividad en la capa basal. Solamente 4 muestras fueron completamente negativas. Se observaron variaciones en los patrones de expresión en diferentes áreas del mismo tumor. Sin embargo, los patrones de tinción fueron característicos y se pudieron clasificar cada uno de los tumores de acuerdo con el patrón de expresión predominante. Como se explicó en el apartado de material y métodos, la expresión de laminina 5 γ2 se valoró mediante dos escalas. Según el patrón de expresión, 13 (27,7%) de los tumores presentaron un patrón de expresión A, 9 (19,1%) patrón de expresión B, 16 (34%) patrón de expresión C y 9 (19,1%) patrón D. Según el porcentaje de células positivas, 19 (40,4%) tumores presentaron <30% de las células tumorales positivas, 16 (34%) entre 30-60% de las células tumorales positivas y 12 (25,6%) >60% de las células tumorales positivas. El número de células tumorales positivas aumentó significativamente con la progresión del patrón de expresión desde el patrón A hacia el patrón D (χ2 =53,42, p=0,000; Test de Chi-cuadrado). Expresión ausente/ débil Expresión moderada/ intensa A B C D Total 0 4 0 13 1+ 9 6 9 2+ 3 11 2 16 3+ 5 7 9 13 9 16 9 Total 22 25 47 Tabla 13: Distribución de la expresión de Laminina 5 γ2 según las dos escalas de valoración IV. Resultados 101 Figura 34. Laminina 5 γ2 en el epitelio displásico adyacente al carcinoma oral de células escamosas. Se observa inmunotinción citoplasmática en la capa basal del epitelio (10x). Figura 35: Laminina 5 γ2 en carcinoma oral de células escamosas. Se advierte ocasionales células positivas en la periferia de los nidos tumorales (10x). IV. Resultados 102 Figura 36: Laminina 5 γ2 en carcinoma oral de células escamosas. La inmunotinción aparece restringida a la periferia de los nidos tumorales (20x). Figura 37: Laminina 5 γ2 en carcinoma oral de células escamosas. Se observa inmunorreactividad tanto en la periferia como en el centro de los nidos tumorales (10x). IV. Resultados 109 Figura 49: Cadherina-E en mucosa oral con displasia adyacente a una lesión de carcinoma oral de células escamosas. Se observa la pérdida de expresión en la capa basal y suprabasal (10x). Figura 50: Cadherina-E en carcinoma oral de células escamosas. Se observa la pérdida de expresión en el frente de invasión tumoral (20x). IV. Resultados 110 IV.6.D.a. Correlación entre la expresión de cadherina-E y Edad La media de edad de los pacientes con tumores con expresión moderada/ intensa de cadherina-E fue de 57,61 ± 13,61, y de 57,86 ± 11,84 para los pacientes con tumores con expresión negativa/débil. Esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p=0,952; Test T de Student). 3314N = Expresión de cadherina-E moderada/intensanegativa/débil Edad 90 80 70 60 50 40 30 20 Figura 51: Expresión de cadherina-E según la edad Al comparar la expresión de cadherina-E entre los tumores de pacientes ≤ 45 y > 45 años, tampoco obtuvimos una asociación estadísticamente significativa entre la edad y la expresión de cadherina-E (χ2= 0,305; p=0,581; Test de Chi-cuadrado). 22,2% 77,8% 31,6% 68,4% 0 20 40 60 80 100 <=45 años >45 años Expresíon moderada/ intensa Expresión negativa/ débil Figura 52: Expresión de cadherina-E según el rango de edad IV. Resultados 111 IV.6.D.b. Correlación entre la expresión de cadherina-E y Sexo No se encontró una asociación entre la expresión de cadherina-E y el sexo de los pacientes (χ2=0,106, p=0,745; Test de Chi-cuadrado). 30,8% 69,2% 25% 75% 0 20 40 60 80 100 Hombres Mujeres Expresión moderada/ intensa Expresión negativa/ débil Figura 53: Expresión de cadherina-E según el sexo IV.6.D.c. Correlación entre la expresión de cadherina-E y Localización del tumor primario La expresión de cadherina-E no se asoció con la localización primaria del tumor (χ2=0,821 ; p=0,976; Test de Chi-cuadrado). 33,3% 66,7% 30,8% 69,2% 22,2% 77,8% 33,3% 66,7% 33,3% 66,7% 100% 0 20 40 60 80 100 Lengua Suelo de boca Reborde alveolar Trígono retromolar Paladar duro Mucosa yugal Expresión moderada/ intensa Expresión negativa/ débil Figura 54: Expresión de cadherina-E según la localización del tumor primario IV. Resultados 112 IV.6.D.d. Correlación entre la expresión de cadherina-E y Estadio TNM Tamaño del tumor primario(estadio T) No se encontró asociación entre la expresión de cadherina-E y el tamaño del tumor primario (χ2 =0,643, p=0,886, Test de Chi-cuadradro). 33,3% 66,7% 33,3% 66,7% 28,6% 71,4% 20% 80% 0 20 40 60 80 100 T1 T2 T3 T4 Expresión moderada/ intensa Expresión negativa/ débil Figura 55: Expresión de cadherina-E según el tamaño del tumor primario Ganglios linfáticos cervicales (estadioN) No se encontró asociación entre la expresión de cadherina-E y el estadio N del tumor (χ2 =0,339, p=0,844; Test de Chi-cuadradro). 29,4% 70,6% 25% 75% 40% 60% 0 20 40 60 80 100 N0 N1 N2 Expresión moderada/ intensa Expresión negativa/ débil Figura 56: Expresión de cadherina-E según el estadio N IV. Resultados 113 IV.6.D.e. Correlación entre la expresión de cadherina-E y Estadio Clínico No se encontró asociación entre la expresión de cadherina-E y el estadio clínico del tumor (χ2 =1,417, p=0,702; Test de Chi-cuadradro). 29,4% 70,6% 20% 80% 44,4% 55,6% 27,3% 72,7% 0 20 40 60 80 100 Estadio I Estadio II Estadio III Estadio IV Expresión moderada/ intensa Expresión negativa/ débil Figura 57: Expresión de cadherina-E según el estadio clínico IV.6.D.f. Correlación entre la expresión de cadherina-E y Grado de diferenciación histológica Los tumores moderadamente diferenciados presentaron una expresión débil/ausente de cadherina-E con mayor frecuencia que los tumores bien diferenciados, sin embargo, esta relación no fue estadísticamente significativa (χ2 =2,664, p=0,103; Test de Chi-cuadradro). 18,2% 81,8% 40% 60% 0 20 40 60 80 100 Bien diferenciado Moderadamente diferenciado Expresión moderada/ intensa Expresión negativa/ débil Figura 58: Expresión de cadherina-E según el grado de diferenciación histológica IV. Resultados 114 IV.6.D.g. Correlación entre la expresión de cadherina-E y Modo de invasión tumoral Los tumores muy invasivos presentaron expresión negativa/débil de cadherina-E con más frecuencia que lo tumores pocos invasivos: 45,5% y 16%, respectivamente. Esta asociación fue estadísticamente significativa (χ2= 4,854p= 0,028; Test de Chicuadrado). 16% 84% 45,5% 54,5% 0 20 40 60 80 100 Poco invasivos Muy invasivos Expresión moderada/ intensa Expresión negativa/ débil Figura 59: Expresión de cadherina-E según el modo de invasión tumoral IV.6.D.h. Correlación entre la expresión de cadherina-E y Profundidad de invasión tumoral La profundidad media de los tumores con expresión negativa/ débil de cadherina-E fue de 6,25 ± 3,53 mm y de los tumores con expresión moderada/ intensa fue de 6,51 ± 4,12 mm. Esta diferencia no fue estadísticamente significativa. (p=0,842; Test T de Student) 2512N = Expresión de cadherina-E moderada/intensanegativa/débil Profundidad de invasión tumoral (mm) 20 10 0 -10 Figura 60: Profundidad de invasión según la expresión de cadherina-E IV. Resultados 115 IV. 6.E. Correlación entre marcadores inmunohistoquímicos IV.6.E.a. Correlación entre índice de proliferación celular (MIB-1) y EGFR La media de proliferación celular en los tumores con expresión negativa/ débil de EGFR fue de 57,03 ± 12,81, mientras en los tumores con expresión moderada/ intensa el índice medio de proliferación fue de 57,35 ± 17,54. Esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p= 0,956; Test T de Student). 3511N = Expresión de EGFR moderada/intensanegativa/débil Índice de proliferación celular (MIB-1) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Figura 61: Distribución de MIB-1 según la expresión de EGFR IV.6.E.b. Correlación entre índice de proliferación celular (MIB-1) y Laminina 5γ2 La media del índice de proliferación en las lesiones con expresión negativa/débil de laminina 5 γ2 fue de 56,18 ± 17,21 y de 58,19 ± 15,99 en las lesiones con expresión moderada/intensa. Esta diferencia no fue estadísticamente significativa. (p=0,683; Test T de Student) IV. Resultados 116 2521N = Expresión de laminina 5 gamma 2 moderada/intensanegativa/débil Índice de proliferación celular (MIB-1) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Figura 62: Distribución de MIB-1 según la expresión de laminina 5 γ2 IV.6.E.c. Correlación entre Índice de proliferación celular (MIB-1) y Cadherina-E El índice medio de proliferación de los tumores con moderada/intensa cadherina-E fue de 58,45% ± 17,45, y de los tumores con expresión negativa/débil fue de 54,58% ± 13,93. Esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p= 0,467; Test T de Student). 3214N = Expresión de cadherina-E moderada/intensanegativa/débil Índice de proliferación celular (MIB-1) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 5 Figura 63: Distribución de MIB-1 según la expresión de cadherina-E IV. Resultados 117 IV.6.E.d. Correlación entre EGFR y Laminina 5 γ2 No se encontró relación entre la expresión de EGFR y laminina 5 γ2 (χ2=0,66; p=0,797; Test de Chi-cuadrado). 45,7% 50% 54,3% 50% 0 20 40 60 80 100 120 negativa/ débil moderada/ intensa Expresión de EGFR Expresión de laminina 5 gamma 2 moderada/intensa negativa/débil Figura 64: Expresión de laminina 5 γ2 según la expresión de EGFR IV.6.E.e. Correlación entre EGFR y Cadherina-E No se encontró relación entre la expresión de EGFR y cadherina-E (χ2=1,087; p=0,297; Test de Chi-cuadrado). 25,7% 41,7% 74,3% 58,3% 0 20 40 60 80 100 120 negativa/débil moderada/intensa Expresión de EGFR Expresión de cadherina-E moderada/ intensa negativa/débil Figura 65: Expresión de cadherina-E según la expresión de EGFR IV. Resultados 118 IV.6.E.f. Correlación entre Laminina 5 γ2 y Cadherina-E No se encontró una relación entre la expresión de laminina 5 γ2 y cadherina-E (χ2=0,986; p=0,321; Test de Chi-cuadrado). 36% 22,7% 64% 77,3% 0 20 40 60 80 100 120 negativa/débil moderada/intensa Expresión de laminina 5 gamma 2 Expresión de cadherina-E moderada/intensa negativa/débil Figura 66: Expresión de cadherina-E según la Expresión de laminina 5 γ2 IV.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LAS RECIDIVAS LOCALES IV.7.A. Parámetros clínicos IV.7.A.a. Edad No se encontró una diferencia significativa entre la media de edad de los pacientes con recidiva local (53,50 ± 13,72 años) y los pacientes que no presentaron recidiva local (59,84 ± 13,72 años) (p= 0,114; Test T de Student). 1631N = Recidiva local SíNo Edad 90 80 70 60 50 40 30 20 Figura 67: Distribución de la edad de los pacientes en función de la aparición de recidivas locales IV. Resultados 125 IV.7.C. Parámetros inmunohistoquímicos IV.7.C.a. Índice de Proliferación Celular El índice medio de proliferación celular de los tumores que presentaron recidiva local fue de 59,12% ± 18,71, y de los tumores que no recurrieron localmente fue de 56,12% ± 15,36. Esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p= 0,497; Test T Student). 1531N = Recidiva local SíNo Índice de proliferación celular (MIB-1) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Figura 80: Distribución de MIB-1 según la aparición de recidivas locales IV.7.C.b. Expresión de EGFR No se encontró correlación entre la expresión de EGFR y las recidivas locales (χ2 =0,004, p= 0,952; Test de Chi-cuadrado). 66,7% 33,3% 65,7% 34,3% 0 20 40 60 80 100 negativa/ débil moderada/ intensa Expresión de EGFR Sí No Figura 81: Aparición de recidivas locales en función de la expresión de EGFR IV. Resultados 126 IV.7.C.c. Expresión de laminina 5 γ2 No se encontró correlación entre la expresión de laminina 5 γ2 y las recidivas locales ( χ2 = 0,69, p= 0,351; Test de Chi-cuadrado). 59,1% 40,9% 72% 28% 0 20 40 60 80 100 negativa/ débil moderada/ intensa Expresión de laminina 5 gamma 2 Sí No Figura 82: Aparición de recidivas locales en función de la expresión de laminina 5γ2 IV.7.C.d. Expresión de cadherina-E No se encontró correlación entre la expresión de cadherina-E y las recidivas locales (χ2 =0,690; p= 0,406; Test de Chi-cuadrado). 57,1% 42,9% 69,7% 30,3% 0 20 40 60 80 100 negativa/ débil moderada/ intensa Expresión de cadherina-E Sí No Figura 83: Aparición de recidivas locales en función de la expresión de cadherina-E IV. Resultados 127 IV.8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LAS RECIDIVAS REGIONALES Como se describió en el apartado de material y métodos, en el presente estudio, las metástasis cervicales tardías, y recidivas de las metástasis cervicales fueron identificadas como recidivas regionales. IV.8.A. Parámetros clínicos IV.8.A.a. Edad La media de edad de los pacientes que presentaron recidivas regionales fue de 55,77 años ± 10,95, y de 55,55 años ± 16,63 para los pacientes que no presentaron recidivas regionales. Esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p=0,443; Test T de Student). 2225N = Recidiva regional SíNo Edad 90 80 70 60 50 40 30 20 Figura 84: Edad de los pacientes en función de la aparición de recidivas regionales Al valorar la aparición de metástasis regionales en los pacientes ≤ 45 años y > 45 años, nuevamente no se encontró asociación entre la edad y el desarrollo de recidivas regionales (χ2=0,025; p=0,874; Test de Chi-cuadrado). IV. Resultados 128 55,6% 44,4% 52,6% 47,4% 0 20 40 60 80 100 <=45 años >45 años Sí No Figura 85: Aparición de recidivas regionales en función del rango de edad de los pacientes IV.8.A.b. Sexo Aunque la proporción de recidivas locales fue más alta en las mujeres, esta asociación no fue estadísticamente significativa (χ2=0,351; p=0,553; Test de Chicuadrado). 64,1% 35,9% 75% 25% 0 20 40 60 80 100 Hombres Mujeres Sí No Figura 86: Aparición de recidivas regionales en función del sexo de los pacientes IV. Resultados 129 IV.8.A.c. Localización No se encontró asociación significativa entre la localización del tumor primario y la presencia de recidivas regionales (χ2=3,404; p=0,638; Test de Chi-cuadrado). 55,6% 44,4% 38,5% 61,5% 66,7% 33,3% 33,3% 67,7% 66,7% 33,3% 100% 0 20 40 60 80 100 120 Lengua Suelo de boca Reborde alveolar Trígono retromolar Paladar duro Mucosa yugal Sí No Figura 87: Aparición de recidivas regionales en función de la localización del tumor primario IV.8.A.d. Estadio TNM Tamaño del tumor primario (estadio T) Los tumores de mayor tamaño presentaron recidivas regionales con una frecuencia más alta. Sin embargo, esta asociación no fue estadísticamente significativa (χ2=2,785; p=4,26; Test de Chi-cuadrado). 61,1% 38,9% 58,3% 41,7% 57,1% 42,9% 30% 70% 0 20 40 60 80 100 T1 T2 T3 T4 Sí No Figura 88: Aparición de recidivas regionales en función del tamaño del tumor primario IV. Resultados 130 Ganglios linfáticos cervicales (estadio N) No se encontró asociación entre el estadio N y la aparición de recidivas regionales (χ2=2,590; p=0,274; Test de Chi-cuadrado). 55,9% 44,1% 62,5% 37,5% 20% 80% 0 20 40 60 80 100 N0 N1 N2 Sí No Figura 89: Aparición de recidivas regionales en función del estadio N IV.8.A.e. Estadio clínico Los tumores en estadios clínicos más avanzados presentaron recidivas regionales con una frecuencia más alta. Sin embargo, esta asociación no fue estadísticamente significativa (χ2=5,284; p=0,426; Test de Chi-cuadrado). 64,7 35,3 70 30 44,4 55,6 27,3 72,7 0 20 40 60 80 100 Estadio I Estadio II Estadio III Estadio IV Sí No Figura 90: Aparición de recidivas regionales en función del estadio clínico IV. Resultados 131 IV.8.A.f. Tratamiento del tumor primario No se encontró una asociación entre la aparición de recidivas regionales y el tratamiento del tumor primario (χ2=0,066; p=0,717; Test de Chi-cuadrado). 54,3% 45,7% 50% 50% 0 20 40 60 80 100 Cirugía Cirugía + radioterapia Sí No Figura 91: Aparición de recidivas regionales en función del tratamiento del tumor primario IV.8.B. Parámetros histológicos IV.8.B.a. Grado de diferenciación histológica Los tumores moderadamente diferenciados presentaron recidivas regionales con más frecuencia que los tumores bien diferenciados. Sin embargo, esta asociación no fue estadísticamente significativa (χ2=1,812; p=0,178; Test de Chi-cuadrado). 63,6% 36,4% 44% 56% 0 20 40 60 80 100 Bien diferenciados Moderadamente diferenciados Sí No Figura 92: Aparición de recidivas regionales en función del grado de diferenciación histológica IV. Resultados 132 IV.8.B.b. Modo de Invasión Tumoral Los tumores con un patrón histológico más invasivo presentaron una frecuencia más alta de recidivas regionales en comparación con los tumores con un patrón menos invasivo. Sin embargo, esta asociación no fue estadísticamente significativa (χ2=2,506; p=0,113; Test de Chi-cuadrado). 64% 36% 40,9% 59,1% 0 20 40 60 80 100 Poco invasivos Muy invasivos Si No Figura 93: Aparición de recidivas regionales en función del modo de invasión tumoral IV.8.B.c. Profundidad de invasión La profundidad de invasión media de los tumores que presentaron recidivas regionales fue de 6,37mm ± 4,19, y de 6,30 mm ± 3,23 en los tumores que no presentaron recidivas regionales. Esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p=0,953; Test T de Student). 1819N = Recidiva regional SíNo Profundidad de invasión tumoral (mm) 20 10 0 -10 Figura 94: Profundidad de invasión en función de la aparición de recidivas regionales IV. Resultados 133 IV.8.B.d. Invasión Perineural No se encontró diferencia en la incidencia de recidivas regionales entre los tumores con o sin invasión perineural. (χ2 =0,812, p= 0,368; Test de Chi-cuadrado) 50% 50% 66,7% 33,3% 0 20 40 60 80 100 Sin invasión perineural Con invasión perineural Sí No Figura 95: Aparición de recidivas regionales en función de la presencia de invasión perineural IV.8.B.e. Estado de los márgenes quirúrgicos No se encontró asociación entre el estado de los márgenes quirúrgicos y la incidencia de recidivas regionales (χ2 =0,274, p= 0,601; Test de Chi-cuadrado). 47,6% 52,4% 60% 40% 0 20 40 60 80 100 Bordes Negativos Bordes positivos Sí No Figura 96: Aparición de recidivas regionales en función del estado de los márgenes quirúrgicos IV. Resultados 134 IV.8.C. Parámetros inmunohistoquímicos IV.8.C.a. Índice de proliferación celular (MIB-1) El índice de proliferación medio de los tumores en pacientes que presentaron recidivas regionales fue de 59,33 ± 16,29, y de 55,55 ± 16,63 en los pacientes que no presentaron recidivas regionales. Esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p=0,443; Test T de Student). 2125N = Recidiva regional SíNo Índice de proliferación celular (MIB-1) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Figura 97: Distribución de MIB-1 según la aparición de recidivas regionales IV.8.C.b. Expresión de EGFR No se encontró asociación entre la expresión de EGFR y la aparición de recidivas regionales (χ2=0,066, p= 0,797, Test de Chi-cuadrado). 50% 50% 54,3% 45,7% 0 20 40 60 80 100 negativa/débil moderada/intensa Expresión de EGFR Sí No Figura 98: Aparición de recidivas regionales en función de la expresión de EGFR IV. Resultados 141 Intervalo libre de enfermedad (meses) 120100806040200 Supervivencia acumulada 1,2 1,0 ,8 ,6 ,4 ,2 Tratamiento inicial Cirugía+radioterapia Cirugía+radioterapia -censurado Cirugía Cirugia-censurado Figura 108: Función del intervalo libre de enfermedad y tratamiento del tumor primario IV.9.B. Parámetros Histológicos IV.9.B.a. Grado de diferenciación histológica El grado de diferenciación histológica se correlacionó con el intervalo libre de enfermedad; los tumores moderadamente diferenciados presentaron un intervalo libre de enfermedad significativamente menor que los tumores bien diferenciados (p=0,0094; Log Rank Test). Intervalo libre de enfermedad (meses) 120100806040200 Supervivencia acumulada 1,2 1,0 ,8 ,6 ,4 ,2 Dif. histológica Moderadamente dife renciado Moderadamente dife renciado -censurado Bien diferenciado Bien diferenciado -censurado Figura 109: Función del intervalo libre de enfermedad y grado de diferenciación histológica IV. Resultados 142 IV.9.B.b. Modo de invasión tumoral No se encontró una relación significativa entre el modo de invasión tumoral y el intervalo libre de enfermedad (p= 0,1564; Log Rank Test). Intervalo libre de enfermedad (meses) 120100806040200 Supervivencia acumulada 1,2 1,0 ,8 ,6 ,4 ,2 Modo de invasión Muy invasivo Muy invasivo -censurado Poco invasivo Poco invasivo -censurado Figura 110: Función del intervalo libre de enfermedad y modo de invasión tumoral IV.9.B.c. Profundidad de invasión tumoral La profundidad de invasión tumoral no se correlacionó con el intervalo libre de enfermedad (Exp(β)=1,056, p=0,406; Regresión de Cox). Para profundizar el análisis de la relación entre el intervalo libre de enfermedad se ha estudiado diversos valores de cortes, sin embargo, ninguno ha resultado estadísticamente significativo IV.9.B.d. Invasión perineural La media del intervalo libre de enfermedad en los pacientes con tumores con invasión perineural fue 30,97 meses (14,93-47,02) y de 49,08 meses (34,66-63,50) para los pacientes con tumores sin invasión perineural. Esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p=0,9450; Log Rank Test). IV. Resultados 143 Intervalo libre de enfermedad (meses) 120100806040200 Supervivencia acumulada 1,1 1,0 ,9 ,8 ,7 ,6 ,5 ,4 ,3 Invasión perineural Si Si-censurado No No-censurado Figura 111: Función del intervalo libre de enfermedad e invasión perineural IV.9.B.e. Estado de los bordes quirúrgicos La presencia de infiltración neoplásica en los bordes de la pieza quirúrgica demostró una correlación significativa con un intervalo libre de enfermedad reducido (p=0,039; Log Rank Test). La media del intervalo libre de enfermedad en los pacientes con márgenes quirúrgicos positivos fue de 13 meses (2,84-23,16) en comparación con los 52,12 meses (38,15-66,03) para los pacientes con márgenes quirúrgicos negativos. Intervalo libre de enfermedad (meses) 120100806040200 Supervivencia acumulada 1,2 1,0 ,8 ,6 ,4 ,2 0,0 Bordes quirúrgicos Positivo Positivos-censurado Negativos Negativos-censurado Figura 112: Función del intervalo libre de enfermedad y estado de los márgenes quirúrgicos IV. Resultados 144 IV.8.C. Parámetros Inmunohistoquímicos IV.8.C.a. Índice de proliferación celular (MIB-1) No encontramos una asociación estadística entre el intervalo libre de enfermedad y el índice de proliferación celular (Exp(β)=1,006, p=0,651; Regresión de Cox). IV.9.C.b. Expresión de EGFR No se encontró una diferencia estadísticamente significativa entre el tiempo libre de enfermedad de los pacientes con tumores con expresión negativa/débil de EGFR (50,25 meses; 29,41-71,09) y de los pacientes con expresión moderada/intensa (47,32 meses; 31,85-62,80) (p=0,454; Log Rank Test). Intervalo libre de enfermedad (meses) 120100806040200 Supervivencia acumulada 1,1 1,0 ,9 ,8 ,7 ,6 ,5 ,4 ,3 EGFR Moderada/intensa Moderada/intensa - censurado Negativa/débil Negativa/débil - censurado Figura 113: Función del intervalo libre de enfermedad y expresión de EGFR IV.9.C.c. Expresión de Laminina 5 γ2 No se encontró una diferencia estadísticamente significativa entre el tiempo libre de enfermedad en los pacientes con tumores con expresión negativa/débil de laminina 5 γ2 (45,01 meses; 28,35-61,68) y en los pacientes con expresión moderada/intensa (48,28 meses; 30,53-66,03) (p=0,9012; Log Rank Test). IV. Resultados 145 Intervalo libre de enfermedad (meses) 120100806040200 Supervivencia acumulada 1,1 1,0 ,9 ,8 ,7 ,6 ,5 ,4 ,3 Laminina 5 gamma 2 Moderada/intensa Moderada/intensa - censurado Negativa/débil Negativa/débil - censurado Figura 114: Función del intervalo libre de enfermedad y expresión de laminina 5 γ2 IV.9.C.D. Expresión de cadherina-E Los pacientes con tumores con expresión negativa/débil de cadherina-E presentaron un intervalo libre de enfermedad significativamente más corto (16,86 meses; 9,57-24,15) que los pacientes con tumores con expresión moderada/ intensa de cadherina-E (62,08 meses; 45,90-78,20) (p=0,0014; Log Rank Test). Intervalo libre de enfermedad (meses) 120100806040200 Supervivencia acumulada 1,2 1,0 ,8 ,6 ,4 ,2 0,0 Cadherina-E Moderada/intensa Moderada/intensa - censurado Negativa/débil Negativa/débil - censurado Figura 115: Función del intervalo libre de enfermedad y expresión de cadherina-E IV. Resultados 146 Variable N Media Intervalo de confianza de 95% p Rango de edad ≤ 45 años > 45 años 9 38 32,22 48,29 16,72 33,77 47,73 62,81 0,7935 Sexo - Hombre - Mujer 39 8 47,19 35,25 32,88 19,42 61,49 51,08 0,4892 Localización - Lengua - Suelo de boca - Reborde alveolar - Trígono retromolar - Paladar duro - Mucosa yugal 18 13 9 3 3 1 36,01 38,69 29,11 20,00 43,67 38,00 25,61 18,75 11,06 6,23 0 - 48,40 58,64 47,16 33,77 95,31 - 0,6043 Tamaño del tumor primario (estadio T) - T1 - T2 - T3 - T4 18 12 7 10 71,50 41,17 31,04 12,30 50,32 19,91 15,03 7,71 92,68 62,42 47,04 16,89 0,0023 Ganglios linfáticos cervicales (estadio N) - N0 - N1 - N2 34 8 5 58,21 23,63 11,60 42,33 10,94 7,95 74,08 36,31 15,25 0,0170 Estadio clínico - Estadio I - Estadio II - Estadio III - Estadio IV 17 10 9 11 74,71 45,50 29,67 11,64 53,24 21,19 17,14 7,28 96,17 69,81 42,19 15,99 0,0003 Tratamiento del tumor primario - Cirugía - Cirugía + Radioterapia 35 12 55,17 29,33 39,88 8,91 70,47 49,76 0,0589 Grado de diferenciación histológica - Bien diferenciado - Moderadamente diferenciado 22 25 45,32 33,98 34,56 17,76 56,07 50,21 0,0094 Modo de invasión tumoral - Poco invasivo - Muy invasivo 25 22 58,76 25,91 40,16 17,25 77,36 34,57 0,1564 Estado márgenes quirúrgicos - Márgenes negativos - Márgenes positivos 42 5 52,12 13,00 38,15 2,84 66,09 23,16 0,0399 Invasión perineural - Sin invasión - Con invasión 38 9 49,09 30,97 34,66 40,93 63,50 47,02 0,9450 IV. Resultados 147 Variable N Media Intervalo de confianza de 95% p Expresión EGFR - Negativa/débil - Moderada/intensa 12 35 50,25 47,32 29,41 31,85 71,09 62,80 0,4544 Expresión laminina 5 γ2 - negativa/débil - Moderada/intensa 22 25 45,01 48,28 28,35 30,53 61,68 66,03 0,9012 Expresión cadherina-E - Negativa/débil - Moderada/intensa 14 33 16,86 62,08 9,57 45,90 24,15 78,26 0,0014 Tabla 15: Media del intervalo libre de enfermedad, intervalo de confianza y valor de significación (p) para las distintas variables categóricas según el método de Kaplan Meier. Variable N Exp (β) Intervalo de Confianza del 95% p Edad 47 0,997 0,971 1,024 0,830 Profundidad de invasión tumoral 37 1,056 0,928 1,202 0,406 Índice de proliferación (MIB-1) 46 1,006 0,981 1,031 0,651 Tabla 16: Valores de asociación entre las variables cuantitativas continuas y el intervalo libre de enfermedad mediante regresión de Cox. IV. Resultados 148 IV.9.D. Análisis multivariante del tiempo libre de enfermedad El análisis multivariante mediante el modelo de riesgo proporcional de Cox, incluyendo el tamaño tumoral, estadio N, estadio clínico, diferenciación histológica, estado de los márgenes quirúrgicos y expresión de cadherina-E, demostró que solamente el estadio clínico, el estado de los márgenes quirúrgicos y la expresión de cadherina-E tienen valor pronóstico independiente del intervalo libre de enfermedad. IC 95% exp (β) Variable Exp (β)Sig Inferior Superior Estadio I/Estadio II Estadio II/Estadio III Estadio III/EstadioIV 2,605 1,833 8,537 0,103 0,311 0,000 0,823 0,567 2,969 8,605 5,925 24,552 Márgenes quirúrgicos negativo/positivo 3,693 0,028 1,150 11,863 Expresión de cadherina-E (moderada/intensa)/(negativa/débil) 4,018 0,001 1,814 8,898 Tabla 17: Resultados del análisis multivariante mediante el modelo de riesgo proporcional de Cox. IV. Resultados 149 IV.10. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA SUPERVIVENCIA Al analizar la supervivencia del grupo de pacientes estudiados observamos que la media de supervivencia fue de 55,35 meses con un intervalo de confianza del 95% de 42-68 meses. La asociación entre la supervivencia y las distintas variables estudiadas se puede observar en las tablas 18 y 19. Supervivencia (meses) 120100806040200 Supervivencia acumulada 1,2 1,0 ,8 ,6 ,4 ,2 Función de supervive ncia Censurado Figura 116: Función de supervivencia para el grupo de 47 pacientes IV.10.A. Parámetros clínicos IV.10.A.a. Edad No se observó relación entre la edad y la supervivencia. (Exp (β)= 0,994, p= 0,682; Regresión de Cox). Así mismo, para el análisis de las curvas de supervivencia mediante el método de Kaplan Meier, se ha dividido los pacientes en dos grupos según la edad: pacientes ≤ de 45 años y pacientes > de 45 años. Los pacientes ≤ de 45 años presentaron una media de supervivencia de 37,33 meses (25,06-49,61), frente a una media de supervivencia de 59,19 meses (42,32-70,04) para los pacientes > de 45 años; sin embargo, la diferencia entre los dos grupos no fue significativa (p= 0,56; Log Rank Test). IV. Resultados 150 Supervivencia (meses) 120100806040200 Supervivencia acumulada 1,2 1,0 ,8 ,6 ,4 ,2 Rango Edad >= 45 años >= 45 años-censurado <45 años <45 años -censurado Figura 117: Función de supervivencia y rango de edad IV.10.A.b. Sexo El tiempo medio de supervivencia para los hombres fue de 51, 90 meses (38,6865,12) mientras para las mujeres fue de 50,63 (41,91-59,34). Esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p= 0,145, Log Rank Test). Supervivencia (meses) 120100806040200 Supervivencia acumulada 1,2 1,0 ,8 ,6 ,4 ,2 0,0 Sexo hombres hombres -censurado mujeres mujeres -censurado Figura 118: Función de supervivencia y sexo de los pacientes