Nuevos péptidos penetrantes para la entrega intracelular de ácidos nucleicos

1 NUEVOS PÉPTIDOS PENETRANTES PARA LA ENTREGA INTRACELULAR DE ÁCIDOS NUCLEICOS Intracellular delivery of nucleic acids using a new type of cell penetrating peptides IRENE ADÁN BARRIENTOS CURSO ACADÉMICO 2017-2018 FACULTADE DE FARMACIA 2 Índice Resumen y palabras clave 3 Abstract and keywords 4 Introducción 5 Objetivos 15 Materiales y métodos 16 1. Síntesis de los CPPS 17 2. Caracterización estructural de los anfifilos 24 3. Ensayos de transfección y citotoxicidad 26 Resultados y discusión 29 1. Diseño y síntesis de los péptidos 29 2. Caracterización estructural de los anfifilos 32 3. Ensayos de transfección y citotoxicidad 35 Conclusiones 39 Referencias 40 Agradecimientos 44 3 Resumen La terapia génica ha cautivado a la comunidad científica debido a su potencial para tratar las enfermedades genéticas: si un gen se expresa en exceso se inactiva, y si se expresa poco o de forma incorrecta se reemplaza por un gen funcional. Asimismo, también se puede emplear para tratar enfermedades tan prevalentes como el cáncer, lo que incrementa su interés. Su fundamento parece muy sencillo, pero la realidad es que el diseño de vehículos transportadores que permitan hacer llegar esta terapia al lugar de acción supone un gran desafío: es necesario superar todas las barreras fisiológicas de forma eficiente, sin causar toxicidad, y preferentemente de forma selectiva sobre el tejido diana. En este trabajo se presentan nuevos vectores basados en péptidos penetrantes de membrana para la entrega intracelular de plásmidos y RNA interferente. Estos péptidos tienen una carga neta positiva, presentan una estructura anfipática secundaria, y han sido modificados químicamente mediante el acoplamiento de aldehídos de cadena larga a través de un enlace hidrazona. Se realizó su síntesis y caracterización, y se realizaron ensayos de transfección y de citotoxicidad in vitro. Además, se analizó la influencia que ejercía la naturaleza del cargo y la posición de los aldehídos del péptido penetrante sobre la eficiencia de transfección. Palabras clave Terapia génica; vectores no virales; péptidos penetrantes; entrega; ácidos nucleicos. 4 Abstract Gene therapy has attracted the interest of the scientific community, due to its potential to treat genetic diseases: it works by inactivating overexpressed genes or by replacing malfunctioning ones. In addition, this therapy can be used to cure other diseases such as cancer. However, its strong potential is hindered by the delivery problem: designing vehicles that allow the efficient transportation of therapeutic nucleic acids to its target tissue is a considerable challenge, since many physiological barriers must be overcome in an efficient way, and without causing cytotoxicity. A new type of cell penetrating peptide-based vectors for the intracellular delivery of plasmids and short interfering RNAs (siRNAs) is presented in this work. These vectors have an amphiphilic secondary structure, are positively charged, and are chemically modified by coupling long chain aliphatic aldehydes through a hydrazone bond. They have been synthesized and characterized in the laboratory; and in vitro assays have been performed in order to study their transfection efficiency and cytotoxicity. Furthermore, the influence of different factors on transfection efficiency has been studied, such as the position of the aldehyde pendants and the nature of the nucleotide cargo. Keywords Gene therapy; cell penetrating peptides; nucleic acids; delivery; non-viral vectors. 5 Introducción La terapia génica consiste en la modificación de forma intencionada de la expresión génica en ciertas células con el fin de tratar una enfermedad (1,2), mediante la introducción de material genético (dsDNA, ssDNA, mRNA, siRNA, oligonucleótidos...) (1,3), o bien mediante la entrega intracelular de plataformas de edición génica, como pueden ser sistemas basados en CRISPR-Cas9, Nucleasas de dedos de Zinc (ZFNs), o “trancription activator-like effector nucleases” (TALENs) (4). La terapia génica permite inhibir o eliminar permanentemente la expresión de un gen, inducir la expresión deficitaria de otro (mediante la inserción permanente en el genoma o la expresión episomal), o corregir un gen endógeno mediante técnicas de edición génica (2). Con respecto a su regulación, la Agencia Europea del Medicamento (EMA) los clasifica en una categoría especial de medicamentos llamados “productos medicinales de terapia avanzada”. Estos se definen como aquellos medicamentos para uso humano basados en genes, células o tejidos (5), y cuentan con una regulación específica (Regulación (EC) No 1394/2007 y Directiva 2001/83/EC). La EMA define de una forma más tradicional los medicamentos basados en terapia génica, como “aquellos que contienen y usan material genético con un efecto terapéutico, diagnóstico o preventivo de una enfermedad” (5). La terapia génica será una opción de tratamiento más entre los conocidos como medicamentos biológicos, es decir, los que proceden o se producen a partir de un organismo vivo (6). Estos agentes terapéuticos cobraron enorme relevancia cuando se perfeccionó la tecnología del DNA recombinante, que permitió la preparación de productos biológicos altamente puros y en grandes cantidades (7). Medicamentos como la insulina o los anticuerpos monoclonales supusieron una revolución en el tratamiento de muchas enfermedades (6). El siguiente paso en esta revolución será la terapia génica, que pronto comenzará a tener un papel importante en el tratamiento de enfermedades terminales o invalidantes (8), y asimismo ofrecerá posibilidades terapéuticas a condiciones médicas que actualmente no disponen de tratamiento (2). En un principio, se pensó que su principal aplicación sería la corrección de defectos genéticos (9). Actualmente, estas enfermedades solo disponen de tratamientos que, aunque mejoran la calidad de vida de los pacientes, no son capaces de erradicar la enfermedad. Muchas de las opciones terapéuticas disponibles hoy en día, como las “moléculas pequeñas” (moléculas de bajo peso molecular con una estructura química definida), los procedimientos quirúrgicos, o los trasplantes no son muy eficaces (4). Asimismo, ha sido estudiada la posibilidad de emplear la terapia génica en otras enfermedades con alta prevalencia, como el cáncer (10), las enfermedades infecciosas (11), las enfermedades 6 cardiovasculares (12), las enfermedades neurodegenerativas (13), o el asma (14), con resultados positivos (15). De hecho, en la actualidad la mayoría de las líneas de investigación van dirigidas a este tipo de enfermedades (9). Figura 1: Indicaciones a las que van dirigidas los ensayos clínicos de terapia génica (16). A pesar de este horizonte esperanzador, apenas existen productos en el mercado basados en terapia génica. El mayor problema a la hora de desarrollar estos medicamentos es el diseño de la tecnología para su entrega en el lugar deseado de una manera segura y eficiente (1,3,4,15,17,18). Antes de llegar a su lugar de acción, el material genético debe atravesar numerosísimas barreras, ya que el cuerpo humano está diseñado para destruir material genético extraño, y para ello es imprescindible crear un vehículo seguro y eficiente a un precio asequible. Los vehículos para la entrega de material genético pueden ser de tipo viral o no viral. Los primeros son virus modificados genéticamente, en los que se ha sustituido parte de su genoma por el gen de interés. Los virus han evolucionado para introducir y replicar su material genético en las células (3,19,20), y los vectores víricos aprovechan esta característica inherente en ellos: se les despoja de sus propiedades patógenas mediante la supresión de la mayor cantidad de genes víricos posibles (3,9,15) pero se mantienen los necesarios para el empaquetamiento y el transporte del transgén dentro de la cápside viral (3,9). Por otro lado, más recientemente se han desarrollado vectores no virales, que a su vez se subdividen en dos tipos: los vectores físicos y los químicos. Los físicos debilitan la membrana celular para hacerla más permeable al material genético (3); entre estos se incluyen la inyección hidrodinámica y la electroporación (3,4). Sin embargo, los que presentan un mayor potencial para su uso en clínica (ya que son menos invasivos) son los vectores químicos, donde el material genético es encapsulado en nanotransportadores de diferente composición. Entre ellos destacan diversas 7 formulaciones de lípidos catiónicos, de polímeros o de péptidos penetrantes de membrana (CPPs) (2,4). Los medicamentos basados en terapia génica que están comercializados usan vectores víricos, y alrededor del 70% de los que se encuentran en ensayos clínicos también emplean estos vectores (1,19,21). Esto se puede explicar porque los vectores víricos son mucho más eficientes en la entrega de material genético que los no víricos (1–3,15,19), y la tecnología de materiales no ha permitido desarrollar hasta el momento ningún vehículo con una eficiencia de transfección suficiente como para poder ser usada en terapia (3). Limitaciones de los vectores virales El principal problema de los vectores víricos es el riesgo de que provoquen inmunogenicidad y shock anafiláctico. Por ello, se deben administrar concomitantemente con varios inmunosupresores (2), lo cual eleva el riesgo de que se produzcan otras enfermedades (infecciones o tumores, entre otras) (2). Otra gran desventaja es que no se pueden readministrar, ya que se desarrollan anticuerpos contra la cápside viral y ya no son efectivos (son neutralizados por el sistema inmune) (20). Los principales tipos de vectores virales son los lentivirales y retrovirales, que están diseñados para integrarse en el genoma, lo cual puede inducir la oncogénesis (9). En un estudio donde se realizó un tratamiento con vector de origen retrovírico (MLV) para tratar la inmunodeficiencia combinada severa (22), el 25% de los pacientes desarrollaron leucemia (4). Por otro lado, existen vectores víricos que no se integran en el genoma: adenovirus, herpesvirus y los virus adeno asociados (AAV). Estos se expresan de forma episomal, pero aun así sigue estando presente el riesgo de que produzcan toxicidad e inmunogenicidad (20). De hecho, en un ensayo clínico de la universidad de Pensilvania, un paciente tratado con un vector basado en un adenovirus para suplir la deficiencia de ornitina transcarbamilasa murió debido a una respuesta inflamatoria masiva contra el vector (9). Los vectores víricos poseen asimismo una capacidad limitada de almacenaje de material genético (2,9). Los vectores no virales tienen muchas menos restricciones de tamaño, por lo que podrían suponer una alternativa eficaz a la hora de transfectar material genético de mayor tamaño. Por último, los vectores virales acarrean grandes costes, debido tanto a sus dificultades en la producción a gran escala (2) como a la peligrosidad de los ensayos clínicos. Esto se traduce en un coste elevadísimo del medicamento (2). Glybera fue retirado del mercado en octubre de 2017 debido a la escasa demanda de terapia (23): el precio por tratamiento era en torno a un millón de dólares (2). Como se puede apreciar, estos vehículos pueden acarrear graves problemas para el paciente, pero hasta el momento ningún vector no viral posee la eficiencia suficiente como para poder ser comercializado. Sin embargo, la tecnología de materiales ha avanzado mucho en estos últimos años, y 8 se han dedicado muchos esfuerzos al desarrollo de vectores no víricos más eficientes (1). Los vectores no víricos pueden ser preparados en grandes cantidades a bajo coste, pueden transfectar cargos más grandes, pueden ser almacenados durante más tiempo debido a su estabilidad, y provocan menos inmunogenicidad (3). Hasta el momento, los vectores no víricos más prometedores han resultado ser los basados en lípidos y polímeros (2). Sin embargo, existen otras estrategias que no han sido tan investigadas, como son los péptidos penetrantes de membrana (Cell Penetrating Peptides), que también han mostrado un gran potencial (21). Estos péptidos podrían emplearse para el desarrollo de vectores no virales, e incluso también en la mejora de los vectores virales (21). Péptidos penetrantes de membrana (CPPs) Los péptidos penetrantes son cortos (normalmente no exceden los 30 aminoácidos), y poseen la capacidad de cruzar membranas celulares mientras transportan un cargo, sin causar apenas toxicidad (21,24,25). El mecanismo por el cual lo hacen no se comprende perfectamente, pero se sabe que pueden penetrar de forma activa (mecanismo dependiente de energía) o de forma pasiva (mecanismo independiente de energía) (24,25). En general los diferentes CPPs no poseen secuencias homólogas entre ellos, y cada uno presenta diferentes mecanismos de internalización celular (26). Existen dos maneras de combinar el CPP con el cargo: de forma covalente y de forma no covalente. Los CPPs unidos de forma covalente con el material genético resultan en una entidad química definida, y por lo tanto es más fácil conseguir su aprobación para su uso en la clínica (21). No obstante, en algunos casos la unión covalente produce una pérdida en la actividad de la molécula. La unión mediante fuerzas no covalentes (interacciones electrostáticas o hidrofóbicas) es mucho más simple (se produce mediante un simple mezclado), y además no produce pérdida de actividad (21). Mecanismos de internalización El mecanismo de internalización del CPP depende de su estructura (primaria y secundaria), de la concentración de péptido, del tipo de célula a transfectar y de la naturaleza del cargo (27). Asimismo, diferentes mecanismos de internalización pueden ocurrir en las mismas condiciones (25). Básicamente, los CPPs pueden ser internalizados mediante mecanismos independientes o dependientes de energía (25,27,28). Entre los mecanismos independientes de energía destaca la penetración directa a través de una desestabilización transitoria de la membrana, sin llegar a causar toxicidad (27,28). Esta forma de internalización ocurre sobre todo a concentraciones relativamente elevadas de péptido (26,28). Existen diferentes modelos acerca de cómo sucede esta translocación (Figura 2) 9 Para péptidos que transportan cargos, el mecanismo predominante probablemente sea el endocítico (dependiente de energía) (29). En este caso, primeramente el péptido, acompañado o no de cargo, sería endocitado por la célula, y después desestabilizaría el endosoma, permitiendo que tanto este como el cargo accediesen al citosol (27). Figura 2: Posibles mecanismos de internalización de los CPPs (25). Clasificación Según sus características fisicoquímicas se pueden clasificar en tres categorías: catiónicos, anfipáticos e hidrofóbicos (21,26). Muchos de ellos, aunque no todos, están cargados positivamente y son anfipáticos (24,26). A continuación se citan brevemente los diferentes tipos de CPPs en base a sus características fisicoquímicas, sobre la que se puede encontrar amplia información en una revisión de F. Milletti (26). A) Péptidos altamente catiónicos Los péptidos catiónicos fueron los primeros en ser descubiertos, a partir de una secuencia peptídica de internalización del VIH-1 llamada Tat1 (RKKRRQRRR). Se cree este tipo de CPPs son capaces de interaccionar con glucosaminoglicanos, activando la vía endocítica para su internalización (25,26,28); y a altas concentraciones se piensa que también pueden translocar directamente la membrana (26,28). No poseen una estructura tridimensional concreta. B) Péptidos anfipáticos Una segunda categoría la conforman los CPPs anfipáticos, que pueden estar cargados positiva o negativamente a pH fisiológico (aunque la mayoría tienen carga positiva) (26). A su vez se subdividen en: 16 Materiales y métodos Materiales − Síntesis del péptido: La resina Fmoc Rink Amide (carga: 0,71 mmol/g) y Fmoc-L-Lys(Mtt)-OH se compraron a Iris. Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-L-Leu-OH, el triisopropilsilano y la N,Ndiisopropiletilamina (DIEA) se compraron a Sigma-Aldrich. El trifluoroetanol y el hexafluoroisoprpanol se adquirieron a TCI. La dimetilformamida (grado de síntesis de péptidos) se compró a Scharlau. La hidrazida fue sintetizada en el laboratorio según protocolos establecidos (39). El resto de los reactivos se compraron a Sigma-Aldrich, TCI o Fisher. Todos los disolventes utilizados son de grado HPLC. − Obtención de los anfifilos: Los aldehídos se compraron o se sintetizaron en el laboratorio a partir del alcohol correspondiente por oxidación con clorocromato de piridinio (40). − Transfecciones: Lipofectamine 2000 se adquirió a Life Technologies. El medio de cultivo DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) se compró a Gibco. El suero bovino fetal y la mezcla de penicilina-streptomicina-glutamina usada para suplementar el medio celular se compró a Fisher. El reactivo MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetil-2tiazolil)-2,5-difeniltetrazolio) se compró a Alfa Aesar Equipos − El análisis por HPLC acoplado a espectometría de masas se hizo en un equipo Agilent Technologies 1260 Infinity II, equipado con una 6120 Quadrupole LC-MS, en una columna Agilent SB-C18. − La purificación semipreparativa en fase reversa se hizo en un equipo Jasco LC 4000 equipado con detector UV-visible por red de diodos. Se usó una columna Penomenex Luna C18(2)100A. − La señal de dicroísmo circular se midió con un espectropolarímetro Jasco J-1100 CD acoplado a un sistema de control de temperatura. − Para leer los resultados de los ensayos de transfección de siRNA y del ensayo de viabilidad se usó un lector de placas Tecan Infinite F2000pro. − Para los ensayos de citometría se empleó un citómetro Guava EasyCyteTM (Millipore). 17 Métodos 1. Síntesis de los CPPs La síntesis se realizó mediante síntesis peptídica en fase sólida (SPPS). Una vez obtenida la estructura de aminoácidos primaria, el péptido lineal se acetiló en el grupo amino terminal. Posteriormente, todavía con el péptido anclado a la resina, se acoplaron los grupos hidrazida sobre las dos lisinas presentes en la estructura de ambos péptidos. Finalmente, se desancló el péptido y se eliminaron todos los grupos protectores, se purificó mediante HPLC en fase reversa (RP-HPLC) y se liofilizó. El procedimiento aparece resumido en la Figura 6. . Figura 6: Proceso de síntesis de los péptidos. Elaboración propia. 1.1 Síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) La síntesis de los CPPs se realizó de forma manual, en un montaje usando un matraz de fondo redondo (Figura 7). Mediante esta técnica se lleva a cabo la síntesis del péptido mientras está unido de forma covalente a una resina. Durante todo el proceso la resina está colocada en un reactor de fase sólida que contiene un filtro en su parte inferior. De esta manera, es posible ir añadiendo diferentes reactivos disueltos en disolventes y posteriormente filtrar y lavar. Así se eliminan los reactivos y las impurezas, mientras que el producto de la reacción permanece unido a la resina sobre el filtro del reactor. La síntesis mediante esta técnica se realiza de forma rápida y sencilla, con material de laboratorio básico (41). 18 Figura 7: Montaje usado para la SPPS. La resina se encuentra en el reactor de fase sólida, que está situado en la boca derecha del matraz. En la boca superior del matraz se coloca un adaptador con oliva. A través de este se conecta un tubo por el que se hace burbujear nitrógeno mientras la reacción está teniendo lugar, y se hace vacío cuando la reacción ha terminado para eliminar el reactivo y los disolventes. En el matraz se van recogiendo los residuos. A la derecha se ve una imagen ampliada del reactor de fase sólida (42). La SPPS se basa en ciclos de desprotección y acoplamiento, como se esquematiza en la Figura 8. La dirección de síntesis es desde el extremo C-terminal hacia el N-terminal. 1. Desprotección de los grupos amino: El grupo protector Fmoc se elimina mediante la adición de base (20% piperidina en N,N-dimetilformamida (DMF)), (Figura 9). 2. Acoplamiento: Una vez que se ha expuesto el grupo amino, se procede al acoplamiento del siguiente aminoácido. Esta reacción se ve muy favorecida por la adición de un agente de acoplamiento como el HATU o el HBTU (Figura 10) y un medio básico proporcionado por la N,N-diisopropiletilamina (DIEA). Se continúa este ciclo hasta que han sido acoplados todos los aminoácidos de la secuencia lineal. 19 Figura 8: Esquema de la síntesis de péptidos en fase sólida, basado en ciclos de desprotección y acoplamiento. Elaboración propia. Figura 9: Mecanismo de la reacción de desprotección del grupo amino en α mediante la adición de piperidina/DMF 20%. Fuente: (43). 20 Figura 10: Mecanismo de acoplamiento de un nuevo aminoácido a través de la activación mediante un agente de acoplamiento (HATU) (44). Aminoácido Estructura Grupo protector del amino en α. Grupo protector de la cadena lateral Eliminación del grupo protector de la cadena lateral Lisina Fmoc-L-Lys(Mtt)-OH Fmoc1 (eliminación en medio básico) Mtt2: Protección del grupo amino de la cadena lateral Medio ácido débil Arginina Fmoc-L-Arg(Pbf)- OH Pbf3: protección de la guanidina Medio ácido fuerte Leucina Fmoc-L-Leu-OH Ninguno - Tabla 1: Características de los aminoácidos empleados en la síntesis de los péptidos. Figura 11: Estructura de los aminoácidos empleados en la SPPS (45). 1 Fmoc = 9-fluorenilmetoxicarbonilo 2 Mtt = 4-metiltritilo 3 Pbf = 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo 21 Como se puede ver, cada grupo protector es eliminado en diferentes condiciones. Esta característica es muy útil, ya que permite desproteger selectivamente diferentes grupos funcionales. El procedimiento experimental llevado a cabo fue el siguiente: 1. Se pesó la resina en un reactor de fase sólida (70mg). 2. Esta se hinchó en DMF (2mL) burbujeando con una corriente de N2 (15min). 3. Se desprotegieron los grupos amino de la resina mediante la adición de piperidina/DMF (20%, 2mL, 15min). 4. Se filtró y se lavó la resina con DMF (3 veces, 2mL, 3min). 5. Se añadió una disolución (mezclada previamente) de 4 equivalentes de Fmoc-α-aminoácido () junto con 4 equivalentes de HBTU (agente de acoplamiento) y 6 eq de DIEA: N,Netildiisopropilamina (2mL, 25min) 6. Se filtró y se lavó de nuevo. 7. Se verificó el acoplamiento mediante el test TNBS (descrito en el apartado siguiente). 8. Se repitieron los pasos 3-6 hasta finalización de la síntesis. 9. Se acetiló el aminoácido final haciéndolo reaccionar con exceso de anhídrido acético + 2,6lutidina (premezclados), 45min. 1.2 Verificación de los acoplamientos 1.2.1 Test TNBS Se comprobó que cada acoplamiento fue satisfactorio mediante la adición de ácido picrilsulfónico y una base (DIEA) a una pequeña parte de resina en un vial Eppendorf. Si hubiese grupos amino libres (acoplamiento no satisfactorio), aparecería un color rojo (46,47). (Figura 12) Figura 12: Mecanismo de formación del producto anaranjado (trinitrofenilamina) en el test TNBS, en caso de acoplamiento no satisfactorio (46). 22 1.2.2 HPLC-MS Cada cuatro aminoácidos se verificó que la síntesis estuviese siendo realizada correctamente mediante la determinación de la masa molecular del producto principal con un HPLC acoplado a un espectrómetro de masas (HPLC-MS), del péptido liberado de una pequeña porción de resina. Se hizo cromatografía de elución en gradiente: 5:95 H2O(0,1%TFA):CH3CN(0,1%TFA), 5:95→ 95:5 (10min). 1.3 Acoplamiento de las hidrazidas al grupo amino de las lisinas Esta reacción suele dar rendimientos muy bajos y la reacción no es siempre satisfactoria, por lo que se dividió la resina en 2 partes y solo se realizó el acoplamiento de las hidrazidas a una de ellas, aproximadamente 35 mg de resina original. Se procedió de la siguiente manera: 1. Desprotección selectiva de los grupos laterales amino de las lisinas: Se realizan 3 ciclos de desprotección de 2h con agitación en el reactor de fase sólida. En cada ciclo se emplean 2mL de un medio ligeramente ácido compuesto por: diclorometano (1,2mL), hexafluoroisopropanol (0,4mL), trifluoroetanol (0,2mL), triisopropilsilano (0,1mL). Se lavó la resina con diclorometano previamente al primer ciclo y entre ciclo y ciclo. 2. Acoplamiento: Tras volver a colocar el reactor en un montaje como en el de la Figura 7 y lavar con DMF, se añadieron de forma secuencial: 2,5 eq de hidrazida (Ácido 5-hidrazinil-5oxopentanoico) protegida con el grupo protector Boc 4 (disuelta en DMF), 2,5eq de HATU (en DMF) y 10 eq de DIEA (gota a gota). Se dejó reaccionar 45min. Figura 13: Estructura química del ácido 5-hidrazinil-5-oxopentanoico (hidrazida protegida con el grupo Boc). Se procedió a la desprotección de los grupos funcionales y a la separación del péptido de la resina mediante la adición de una solución fuertemente ácida con ácido trifluoroacético (TFA) (900µL TFA, 50µL diclorometano, 25µL triisopropilsilano, 25µL H2O), en agitación durante 2h. La solución de péptido en TFA se concentró por evaporación de parte del TFA mediante burbujeo con N2. Se hizo precipitar el péptido en éter mediante la adición gota a gota de la solución con el péptido. Se centrifugó y se separó el precipitado por decantación. 4 tert-butoxicarbonilo 23 1.4 Purificación del CPP mediante HPLC semipreparativa y liofilización. El precipitado se redisolvió previamente en aproximadamente 1 mL de H2O y 0,5mL de acetonitrilo. Se purificó el péptido en un equipo semipreparativo mediante cromatografía de elución en gradiente: H2O (0.1% TFA):CH3CN (0.1% TFA), 95:5 → 25:75, en 35 minutos a un flujo de 3mL/min. Se realizó el seguimiento de la purificación a la longitud de onda de 222 nm. Rt=21,8min. Se liofilizaron las fracciones recogidas, obteniéndose un polvo blanco. Lamentablemente, no se obtuvo cantidad de producto suficiente como para poder realizar un análisis estructural mediante resonancia magnética nuclear. Sin embargo, se comprobó la pureza del producto mediante la realización de un HPLC-MS (5:95 H2O(0,1%TFA):CH3CN(0,1%TFA), 5:95 → 95:5, 10min), reflejado en la sección de Resultados (Figuras 16 y 17). 1.5 Obtención de los anfifilos Para obtener el anfifilo (formado por el péptido unido covalentemente al aldehído a través de un enlace hidrazona) se realizó una reacción en las condiciones siguientes: Equivalentes µmol Concentración Concentración de la solución stock mL usados de la disolución stock Péptido 1 0,01 1,25mM 5mM 2 µL Aldehído 10 (5 eq por hidrazida) 0,1 12,5mM 50mM 2 µL Tabla 2: Condiciones de la reacción de preparación del anfifilo El medio de disolución es 5% de ácido acético en DMSO. Se dejó reaccionar con agitación durante 1h 30min a 60ºC. La concentración final de los reactivos se preparó a partir de disoluciones stock. El volumen final de reacción fue de 8 µL. Figura 14: Esquema de obtención del anfifilo K4K6-oleico Los anfifilos obtenidos tras la reacción se encuentran a una concentración final de 1,25 mM. 24 2. Caracterización estructural de los anfifilos mediante dicroísmo circular El dicroísmo circular es una técnica espectroscópica que se puede emplear en el análisis de la conformación estructural de moléculas biológicas en disolución (péptidos, proteínas o DNA, entre otras) (48). Aunque no proporciona una información estructural tan profunda como la Resonancia Magnética Nuclear o la cristalografía de rayos X, tiene la gran ventaja de que permite realizar medidas en buffers fisiológicos. Asimismo, permite monitorizar fácilmente los cambios producidos en la conformación estructural de moléculas biológicas cuando se somete a diferentes condiciones (cambios en el pH o a la temperatura, por ejemplo) (48). 2.1 Fundamento de la técnica El fundamento físico de esta técnica radica en que la luz linealmente polarizada está formada por dos componentes polarizados circularmente, que tienen la misma magnitud pero que rotan en sentidos diferentes (49). El dicroísmo circular mide la diferencia entre la absorción de la luz polarizada en un sentido y en otro (50). Si un grupo funcional (cromóforo) presente en el compuesto absorbe por igual ambos componentes, el plano de luz polarizada no se desvía. Sin embargo, si absorbe mejor uno que otro, el plano se desviará hacia la izquierda o hacia la derecha, lo que se denomina luz elípticamente polarizada (49). De forma simple, podría decirse que el dicroísmo circular es similar a la propiedad de rotación óptica que poseen las moléculas quirales, pero en vez de medir la dispersión (refracción) de la luz polarizada como se hace en la rotación óptica, se mide un espectro de absorción de luz polarizada (51). La absorción en longitudes de onda del UV lejano (180-260nm) permite establecer conclusiones acerca de la estructura secundaria de péptidos, mientras que la absorción en el UV cercano (250-320nm) permite estudiar la estructura terciaria de las polipéptidos más grandes (50). Esto se debe a que el enlace peptídico absorbe mayormente en el espectro del UV lejano y se aprovecha para determinar la estructura secundaria del péptido, mientras que las cadenas laterales de los aminoácidos de triptófano, tirosina, fenilalanina y cistina absorben en el UV cercano (50). 2.2 Análisis de la estructura secundaria de los péptidos Las estructuras peptídicas secundarias más características (como la hélice α o la lámina β) han sido ampliamente caracterizadas mediante esta técnica (50), y su patrón de absorción está bien 25 definido. El espectro obtenido por dicroísmo circular de un péptido que tenga una conformación de hélice α, hoja β o random coil del 100% coincidiría con el espectro de la Figura 15. Figura 15: Espectro del UV lejano según la estructura secundaria de un péptido (49). 2.3 Estandarización de los resultados Para poder dilucidar la estructura secundaria a partir del espectro de dicroísmo circular es necesario presentar los resultados de forma estandarizada, independientemente de la longitud del péptido y de la concentración de la solución. Para ello, los resultados se expresan en elipticidad molar media por residuo. [θ]MRt = 0,1 × [θ] 𝐶 × 𝑙 × 𝑁 Ecuación 1: Cálculo de la elipticidad molar media (35). [θ]MRt = Elipticidad molar media (deg.cm2.dmol-1) [θ]= Señal (mdeg) C= concentración de péptido (mol/L) l = longitud de la cubeta (cm) N= número de residuos del péptido 32 2. Caracterización estructural de los anfifilos Como ya se mencionó previamente, la secuencia de ambos péptidos se diseñó de manera que en disolución pudiesen plegarse formando una hélice α. Esto se comprobó mediante la realización de un estudio de dicroísmo circular. El fundamento de esta técnica se explica en Materiales y métodos. Se analizaron dos de los anfifilos que posteriormente se usarían en las transfecciones in vitro: K4K6-olealdehído y P1-olealdehído. En futuros trabajos será necesario estudiar a fondo todos los anfifilos que tengan mayor eficiencia de transfección. Este primer análisis proporcionó una idea de cómo influye la disposición de los aldehídos en el porcentaje de helicidad del péptido. Además, las mediciones se hicieron a 6 temperaturas diferentes (de 10 a 60ºC en intervalos de 10ºC), para comprobar si el anfifilo perdía su estructura de hélice α al incrementarse la temperatura. También se calculó el porcentaje de helicidad, mediante la fórmula que aparece reflejada en la sección de Materiales y métodos. Los resultados aparecen reflejados en las figuras inferiores. Figura 18: Espectro de dicroísmo circular del anfifilo P1-olealdehído. A todas las temperaturas en las que se realizaron las mediciones presenta los mínimos característicos de una hélice α (208 y 222 nm). -4500 -3500 -2500 -1500 -500 500 1500 190 210 230 250 270 290 [θ]MRt (deg.cm2.dmol-1) Longitud de onda (nm) Dicroísmo circular P1-olealdehído 10ºC 20ºC 30ºC 40ºC 50ºC 60ºC 33 Figura 19: Espectro de dicroísmo circular del anfifilo K4K6-olealdehído. Los mínimos a 208 y 222 nm indican una estructura de hélice α. La helicidad va disminuyendo conforme aumenta la temperatura. P1-oleico K4K6-oleico 10ºC 15,80% 16,40% 20ºC 17,70% 15,60% 30ºC 17,10% 14,50% 40ºC 18,00% 14,40% 50ºC 17,20% 13,60% 60ºC 17,00% 13,00% Tabla 4: Porcentaje de helicidad obtenida para los anfifilos a diferentes temperaturas (calculada a partir de [θ]222). Figura 20: Espectro de dicroísmo circular teórico de péptidos con diferentes conformaciones (48). -4500 -3500 -2500 -1500 -500 500 190 210 230 250 270 290 [θ]MRt (deg.cm2.dmol-1) Longitud de onda (nm) Dicroísmo circular anfifilo K4K6-olealdehído 10ºC 20ºC 30ºC 40ºC 50ºC 60ºC 34 Tras analizar los resultados, se pueden establecer las siguientes conclusiones: Primeramente, el espectro permite afirmar que la estructura de ambos anfifilos es de hélice α, ya que coinciden con el espectro característico de esta estructura secundaria (Figura 20), con dos mínimos negativos a 208 y 222 nm (48,50). El porcentaje de helicidad es aceptable, ya que los péptidos cortos no suelen formar hélices muy estables en disoluciones acuosas (48): la formación de puentes de hidrógeno entre el agua y el péptido puede desfavorecer la formación de la estructura helicoidal. En disolventes orgánicos como el trifluoroetanol se incrementa la helicidad de la mayoría de los péptidos (48), por lo que parece razonable suponer que la interacción de los anfifilos con la membrana celular proporcionaría un medio hidrofóbico más apropiado para la estabilización de la hélice α (aumentando su helicidad). Será necesario realizar más estudios al respecto. Curiosamente, se observa que el anfifilo P1-oleico presenta una helicidad relativamente estable a lo largo del rango de temperaturas, mientras que en el anfifilo K4K6-oleico el porcentaje de helicidad disminuye gradualmente al aumentar la temperatura. Es posible que la disposición de los aldehídos de cadena larga hacia el mismo lado contribuya a estabilizar la estructura tridimensional del péptido. Por último, en la Figura 21 se presenta un gráfico comparativo entre las helicidades de P1olealdehído con respecto a K4K6-olealdehído a 40ºC (la temperatura medida que está más próxima a la fisiológica). Ambos conservan el espectro característico de la hélice α a esa temperatura, pero el porcentaje de helicidad es superior en P1-olealdehído que en K4K6-olealdehído (18,0% vs 14,4%). Figura 21: Comparación de los espectros de dicroísmo circular de los anfifilos P1-olealdehído y K4K6-olealdehído a 40ºC. 35 3. Ensayos de transfección y citotoxicidad 3.1 Transfección de pEGFP. Se procedió a la transfección comparativa de pEGFP (plásmido que codifica el gen de la proteína verde fluorescente) mediante los siguientes anfifilos: P1-olealdehído, P1-dodecanal, K4K6olealdehído y K4K6-dodecanal a diferentes concentraciones (10, 5, 1 y 0’5µM). Se escogieron estos aldehídos porque habían dado buenos resultados en estudios anteriores (35). También se ensayaron las mismas concentraciones de P1 y K4K6 sin aldehídos acoplados. Se obtuvieron eficiencias de transfección inusualmente bajas, tanto para el control positivo (Lipofectamina) como para los anfifilos. Aun así, se comprobó que los anfifilos con P1 resultaron ser mucho más eficientes que los anfifilos que contenían K4K6, confirmándose la hipótesis de que la disposición de los aldehídos sí influye en la eficiencia de la transfección. Los más eficientes fueron P1-olealdehído y P1-dodecanal a una concentración final de 5µM. Por otro lado, dado que hay estudios que indican que la adición de ciertos compuestos alifáticos de cadena larga (grupos estearilo, isoprenoides, péptidos grapados) a algunos péptidos incrementan la interacción con la membrana (26) y además favorecen el escape endosomal (34,53), la nula eficiencia de transfección de los péptidos sin aldehído acoplado podría explicarse por un fallo en estos procesos. Figura 22: Resultados del ensayo de transfección de pEGFP en células HeLa, empleando como vectores los anfifilos P1-olealdehído, P1-dodecanal, K4K6-olealdehído y K4K6-dodecanal a diferentes concentraciones. Como control positivo se empleó lipofectamina (LF), y como controles negativos células solas (C.) y células con plásmido (P.). Resultados expresados en porcentaje de células transfectadas, medidas con un citómetro de flujo. 36 3.2 Transfección de siRNA contra GFP. A continuación se realizó una transfección de siRNA comparando anfifilos formados por P1 o por K4K6 en la línea celular HeLaGFP (células HeLa que expresan de forma estable GFP). El mecanismo de silenciación génica del siRNA se explica en la Figura 5. La transfección se realizó con los anfifilos P1-dodecanal, P1-olealdehído, K4K6-dodecanal y K4K6-olealdehído, a concentraciones finales de 2, 4, y 10µM. Se comparó la disminución de fluorescencia de cada anfifilo a cada concentración cuando se transfecta siRNA, con la transfección de siMOCK en las mismas condiciones. SiMOCK es el control negativo: un siRNA cuya secuencia no es complementaria a ningún mRNA de la célula. También se hizo un control positivo realizando la transfección de siRNA y siMOCK con Lipofectamina, y un control de células solas. La disminución de la fluorescencia se midió con un lector de placas. Figura 23: Resultados de la transfección de siRNA contra GFP en células HeLa-GFP. Se compara la disminución de la fluorescencia por la transfección del siRNA (verde claro) con respecto al control de siMOCK (verde oscuro). Se ensayaron los anfifilos P1-olealdehído, K4K6-olealdehído, P1-dodecanal y K4K6-dodecanal, a diferentes concentraciones. Como control positivo se empleó Lipofectamina (LF), y como control negativo células solas (C). 37 Tabla 5: Disminución (en porcentaje) de la fluorescencia de siRNA con respecto al control de siMOCK de los diferentes anfifilos a las diferentes concentraciones. Como aparece reflejado en la Tabla 5, el anfifilo que consiguió una mayor eficiencia en la reducción de fluorescencia (incluso mayor que la de Lipofectamina) fue el anfifilo K4K6-olealdehído 4µM, seguido de P1-olealdehído a 2µM. En general, la eficiencia de transfección de siRNA fue claramente superior a la del plásmido, por lo que se puede deducir que la naturaleza del cargo también influye en la eficiencia de transfección. Generalmente resulta más difícil transfectar plásmidos mediante CPPs, ya que no son capaces de condensar el DNA eficientemente para formar complejos de transfección (54). Además, los plásmidos deben alcanzar el núcleo para expresarse (30), mientras que el siRNA solo tiene que llegar al citoplasma (37). Péptido del anfifilo P1 K4K6 Aldehído del anfifilo Olealdehído 2µM 48% 38% 4µM 20% 61% 10µM 30% 46% Dodecanal 2µM 36% 46% 4µM 38% 2% 10µM 39% 7% Lipofectamina 55% 38 3.3 Ensayos de viabilidad: citotoxicidad de los anfifilos Para que un vector sea aplicable a la clínica, además de eficiente debe ser poco citotóxico. El ensayo MTT permitió comparar la toxicidad de los anfifilos y de la Lipofectamina. Figura 24: Resultados del ensayo de citotoxicidad, expresados en porcentaje de células vivas con respecto al control (células no transfectadas (en amarillo)). Los resultados que aparecen reflejados en la figura superior indican que el compuesto más citotóxico fue la Lipofectamina (LF), que provocó la muerte del 50% de las células. Por otro lado, la toxicidad del anfifilo P1-olealdehído fue dependiente de la concentración, ya que fue aumentando gradualmente con esta (llegando a causar la muerte del 50% de las células a 10 µM). El anfifilo P1dodecanal también pareció presentar ligeramente más toxicidad a mayores concentraciones. El anfifilo menos citotóxico con diferencia fue K4K6-olealdehído. Si se analizan conjuntamente las Figuras 22 y 23, se deduce que el mejor anfifilo para la transfección de siRNA in vitro fue K4K6-olealdehído, puesto que fue el que presentó mayor eficiencia de transfección y menor citotoxicidad (incluso a 10 µM en torno al 74% (siRNA) - 87% (siMOCK) de las células fueron viables). El anfifilo P1-olealdehído también fue poco citotóxico y muy eficaz a bajas concentraciones (2 µM), pero a concentraciones mayores fue menos eficiente y bastante letal. Por último, aunque el anfifilo K4K6-dodecanal no fue demasiado tóxico, tampoco fue muy eficiente. La Lipofectamina también obtuvo una alta eficiencia de transfección (aunque menor que el anfifilo K4K6olealdehído a 4 µM). Sin embargo, debido a su elevada toxicidad, no sería apropiada para su aplicación in vivo. 39 Conclusiones 1. Se ha diseñado o un nuevo péptido penetrante llamado K4K6 a partir de la estructura del péptido P1. Los anfifilos formados a partir del nuevo péptido presentan los aldehídos dispuestos en caras opuestas de la estructura helicoidal del péptido. Se han sintetizado ambos péptidos (P1 y K4K6), y a partir de ellos se han preparado varios anfifilos, constituyendo una primera pequeña librería: P1-olealdehído, P1-dodecanal, K4K6olealdehído y K4K6-dodecanal. 2. Se ha caracterizado la estructura secundaria de dos de los anfifilos (P1-olealdehído y K4K6olealdehído). Se ha llegado a la conclusión de que la disposición de los aldehídos afecta a la estabilidad de la estructura de hélice α. Cuando los aldehídos se disponen en la misma cara del anfifilo, la helicidad es mayor y es más estable a los cambios de temperatura. 3. Se han realizado ensayos in vitro que han permitido estudiar la eficiencia comparativa de transfección y la citotoxicidad de los anfifilos y de la Lipofectamina. a. Se ha comprobado que la disposición de los aldehídos en el espacio influye en la eficiencia de transfección. Los anfifilos con las colas situadas en la misma cara (formados a partir de P1) resultaron ser más eficientes en la transfección del plásmido, mientras que K4K6-olealdehído (que presenta las colas en caras opuestas) fue el más eficiente en la transfección de siRNA. b. Se ha concluido que la naturaleza del cargo también influye en la eficiencia de transfección, siendo mucho más satisfactoria la internalización de siRNA que la de plásmido. c. Mediante el ensayo MTT se ha comprobado que los anfifilos derivados de los péptidos penetrantes presentan baja citotoxicidad y menor que la de la Lipofectamina. 40 Referencias (1) Yin H, Kanasty RL, Eltoukhy AA, Vegas AJ, Dorkin JR, & Anderson DG. Non-viral vectors for genebased therapy. Nature Reviews Genetics. 2014;15(8):541-555. (2) Foldvari M, Chen DW, Nafissi N, Calderon D, Narsineni L, & Rafiee A. 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