Impacto de Aeromonas salmonicida subsp salmonicida en la salud del rodaballo: un estudio morfopatológico e inmunohistoquímico

0 Facultad de Veterinaria Trabajo de Fin de Grado Impacto de Aeromonas salmonicida subsp salmonicida en la salud del rodaballo: Un estudio morfopatológico e inmunohistoquímico. Pedro Caicoya Fernández Grado en Veterinaria Año 2024 Modalidad del Trabajo: Experimental Impacto de A. salmonicida en la salud del rodaballo Pedro Caicoya Fernández. 1 Licencia Excepto donde se haga constar explícitamente, esta obra pertenece a Pedro Caicoya Fernández y está bajo una licencia de “Creative Commons Reconocimiento 4.0 Internacional”. Impacto de A. salmonicida en la salud del rodaballo Pedro Caicoya Fernández. 2 Resumen En el presente trabajo se investiga el impacto de Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida en la salud del rodaballo (Scophthalmus maximus), un pez crucial para la acuicultura gallega. La forunculosis, enfermedad causada por esta bacteria, se caracteriza por provocar lesiones cutáneas y alteraciones en el comportamiento, particularmente bajo condiciones de estrés como altas temperaturas y mala calidad del agua. Los objetivos del estudio fueron evaluar el impacto de A. salmonicida en el rodaballo mediante análisis morfopatológico e inmunohistoquímico, identificar las lesiones causadas por la infección y analizar la distribución de los antígenos bacterianos en diferentes órganos del rodaballo. La metodología incluyó la recolección de rodaballos infectados y el procesamiento de muestras para estudios histológicos. Observación al microscopio de muestras y técnicas inmunohistoquímicas para detectar los antígenos bacterianos. Los hallazgos macroscópicos revelaron lesiones visibles como exoftalmia, nódulos cutáneos y nódulos en el bazo. Los análisis microscópicos mostraron daño tisular significativo en órganos como el corazón, branquias, piel y sistema digestivo. Además, los antígenos de A. salmonicida se localizaron principalmente en las áreas afectadas por lesiones cutáneas y órganos internos. En conclusión, la infección por A. salmonicida subsp. salmonicida tiene un impacto severo en la salud del rodaballo, causando lesiones significativas que pueden identificarse tanto a nivel macroscópico como microscópico. La inmunohistoquímica se demostró como una herramienta útil para detectar la presencia y distribución de la bacteria en los tejidos infectados. PALABRAS CLAVE: Aeromonas salmonicida subsp salmonicida / Rodaballo / Forunculosis / Histopatología / Inmunohistoquímica. Abstract The present study investigates the impact of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida on the health of turbot (Scophthalmus maximus), a fish of great importance in Galician aquaculture. Furunculosis, a disease caused by this bacterium, is characterized by causing skin lesions and behavioral changes, particularly under stressful conditions such as high temperatures and poor water quality. Impacto de A. salmonicida en la salud del rodaballo Pedro Caicoya Fernández. 3 The objectives of the study were to evaluate the impact of A. salmonicida on turbot through morphopathological and immunohistochemical analysis, to identify the lesions caused by the infection, and to analyze the distribution of bacterial antigens in different organs of the turbot. The methodology included the collection of infected turbot and the processing of samples for histological studies. Microscope observation of samples and immunohistochemical techniques to detect bacterial antigens. Macroscopic findings revealed visible lesions such as exophthalmos, skin nodules, and nodules in the spleen. Microscopic analyses showed significant tissue damage in organs such as the heart, gills, skin, and digestive system. Additionally, A. salmonicida antigens were mainly located in areas affected by skin lesions and internal organs. In conclusion, infection by A. salmonicida subsp. salmonicida has a severe impact on the health of turbot, causing significant lesions that can be identified both macroscopically and microscopically. Immunohistochemistry proved to be a useful tool for detecting the presence and distribution of the bacterium in infected tissues. KEYWORDS: Aeromonas salmonicida subsp salmonicida / Turbot / Furunculosis / Histopathology / Immunohistochemistry. Resumo O presente estudo investiga o impacto de Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida na saúde do rodaballo (Scophthalmus maximus), un peixe de grande relevancia na acuicultura galega. A forunculose, enfermidade causada por esta bacteria, caracterízase por provocar lesións cutáneas e alteracións no comportamento, particularmente baixo condicións de estrés como altas temperaturas e mala calidade da auga. Os obxectivos do estudo foron avaliar o impacto de A. salmonicida no rodaballo mediante análises morfopatolóxicas e inmunohistoquímicas, identificar as lesións causadas pola infección e analizar a distribución dos antíxenos bacterianos en diferentes órganos do rodaballo. A metodoloxía incluíu a recollida de rodaballos infectados e o procesamento de mostras para estudos histolóxicos. Observación ao microscopio de mostras e técnicas inmunohistoquímicas para detectar os antíxenos bacterianos. Os achados macroscópicos revelaron lesións visibles como exoftalmia, nódulos cutáneos e nódulos no bazo. As análises microscópicas mostraron danos tisulares significativos en órganos como o corazón, as branquias, a pel e o sistema dixestivo. Ademais, os antíxenos de A. Impacto de A. salmonicida en la salud del rodaballo Pedro Caicoya Fernández. 4 salmonicida localizáronse principalmente nas áreas afectadas por lesións cutáneas e órganos internos. En conclusión, a infección por A. salmonicida subsp. salmonicida ten un impacto severo na saúde do rodaballo, causando lesións significativas que poden identificarse tanto a nivel macroscópico como microscópico. A inmunohistoquímica demostrou ser unha ferramenta útil para detectar a presenza e distribución da bacteria nos tecidos infectados. PALABRAS CLAVE: Aeromonas salmonicida subsp salmonicida / Rodaballo / Forunculose / Histopatoloxía / Inmunohistoquímica. Impacto de A. salmonicida en la salud del rodaballo Pedro Caicoya Fernández. 5 Índice Resumen ........................................................................................................................................ 2 Abstract ......................................................................................................................................... 2 Resumo .......................................................................................................................................... 3 Introducción .................................................................................................................................. 6 Acuicultura y producción .......................................................................................................... 6 Descripción del rodaballo ......................................................................................................... 7 Crianza ...................................................................................................................................... 8 Enfermedades frecuentes en la producción del rodaballo ......................................................... 9 Forunculosis ............................................................................................................................ 10 Diagnóstico ......................................................................................................................... 13 Trasmisión .......................................................................................................................... 14 Prevención .......................................................................................................................... 15 Tratamiento ......................................................................................................................... 16 Material y métodos ...................................................................................................................... 18 Toma de muestras e inspección ............................................................................................... 18 Procesado de las muestras para su estudio histológico ........................................................... 20 Tinción .................................................................................................................................... 20 Inmunohistoquímica ............................................................................................................... 21 Resultados ................................................................................................................................... 22 Hallazgos macroscópicos ........................................................................................................ 22 Hallazgos microscópicos ........................................................................................................ 24 Distribución de los antígenos de Ass ...................................................................................... 29 Discusión ..................................................................................................................................... 32 Conclusiones ............................................................................................................................... 34 Bibliografía ................................................................................................................................. 35 Impacto de A. salmonicida en la salud del rodaballo Pedro Caicoya Fernández. 6 Introducción Acuicultura y producción En el siglo XXI, ha habido un creciente reconocimiento de la importancia de los sectores pesquero y acuícola en la garantía de la seguridad alimentaria y la nutrición a nivel mundial. Para continuar ampliando esta contribución, se requiere acelerar cambios transformadores en políticas de gestión, innovación e inversión, con el objetivo de alcanzar una pesca y acuicultura globales sostenibles y justas. En 2022, la producción mundial de pesca y acuicultura alcanzó un récord de 223,2 millones de toneladas. La producción de animales de acuicultura superó por primera vez la de la pesca de captura (51 %) (FAO, 2024). La acuicultura de peces marinos está dominada por el salmón del Atlántico (Salmo salar), Noruega encabeza su producción, seguido de Chile, Reino Unido, Canadá e Irlanda. Otros peces marinos económicamente importantes son: la dorada (Sparus aurata), la lubina (Dicentrarchus labrax) y el rodaballo (Scophthalmus maximus) en países como Grecia, Italia, Francia, España y Portugal. En Japón, los peces más producidos son: el hamachi (Seriola quinqueradiata), el ayu (Plecoglossus altivelis), la platija de oliva (Paralichthys olivaceus) y la dorada de Japón (Pagrus major) y en el continente africano se cultiva la tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) (Toranzo et al., 2005; APROMAR, 2023). En cuanto al rodaballo, España, es el principal país productor de Europa, cosechó 8.766 toneladas, lo que representa el 11,2% del total, un 1,5% más que en 2021. El tercer productor es Portugal con 3.600 t, lo que representa el 4,6% del total, seguido por Países Bajos y Francia con 100 t, lo que representa el 0,1% del total. Para 2023, se espera que se mantenga una cifra similar de aproximadamente 79.000 t. Aunque tanto las cifras como la especie exacta son imprecisas, China destaca con una producción significativa de alrededor de 66.000 toneladas en 2022 fuera de la Unión Europea (APROMAR, 2023). En los últimos 35 años producción acuícola de rodaballo en Galicia ha experimentado un crecimiento importante que ha situado a la región a la cabeza de las áreas productivas de esta especie en Europa. El entorno físico de la costa gallega presenta buenas condiciones para este tipo de cultivo, sin las cuales su rápida expansión no habría sido posible. La riqueza del agua, su temperatura y su bajo nivel de contaminación son características clave para obtener una producción abundante, de rápido crecimiento y en buenas condiciones higiénico-sanitarias (Fernández-González et al., 2021). Impacto de A. salmonicida en la salud del rodaballo Pedro Caicoya Fernández. 7 Según APROMAR (2023), la comunidad autónoma de Galicia produjo la mayor parte de la cría de rodaballos de España en 2022. El valor medio en primera venta, se estimó un precio de 11,6 € por kilogramo en 2022, generando un total de 101,8 millones de euros. Al igual que con la dorada y la lubina, la cantidad de rodaballo silvestre capturado por la flota española es cada vez más escasa y testimonial para los mercados. En el caso del rodaballo, si comparamos las capturas pesqueras con la producción acuícola, APROMAR (2023) indica que el 91,7% proviene de la acuicultura. Descripción del rodaballo El rodaballo (Scophthalmus maximus L.) es un pez teleósteo que pertenece al Orden Pleuronectiformes y a la Familia Scophthalmidae. Este pez bentónico vive en fondos marinos de arena y piedras a profundidades de 20 a 75 metros en su hábitat natural. Es un pez plano sin simetría con una forma romboidal prácticamente redondeada con ojos en el lado izquierdo (figura 1). Aunque no tiene escamas en su piel, sí tiene protuberancias óseas que se encuentran de manera irregular en su cuerpo. La mayoría de las veces, el flanco inferior carece de pigmentación, pero la parte superior del cuerpo tiene una tonalidad marrón parduzca que puede variar en intensidad dependiendo del entorno en el que vive (Faílde et al., 2014; FAO, s.f). No muestran diferencias entre sexos visibles, sin embargo, los machos tienden a ser más pequeños y a crecer más lentamente. Su madurez sexual se alcanza entre el tercer y quinto año de vida, dependiendo de la temperatura del agua. En la edad adulta, ciertos individuos pueden llegar a pesar hasta 25 kg y medir hasta 1 metro de longitud (APROMAR, 2023). La reproducción ocurre en la región mediterránea entre febrero y abril, mientras que en el Atlántico ocurre entre mayo y agosto. En Galicia, la freza ocurre en los meses de mayo, junio y julio debido a un aumento gradual del fotoperíodo y la temperatura del agua. Se encuentra a lo largo de las costas del Atlántico Nororiental, desde Marruecos hasta las costas de Gran Bretaña e Islandia, el Mediterráneo y el Mar Negro (figura 2) (FAO, s.f). Figura 1: Rodaballo macho de 554g Impacto de A. salmonicida en la salud del rodaballo Pedro Caicoya Fernández. 8 Crianza La riqueza biológica de la costa gallega se debe al afloramiento costero. El viento del norte, predominante en verano, es fundamental al proporcionar agua fría y rica en nutrientes. Si el viento es fuerte y persistente, las temperaturas de la superficie del mar pueden ser incluso inferiores a 16 °C en pleno verano, estas temperaturas son óptimas para la cría y el cultivo del rodaballo (Fernández-González et al., 2021). La producción se divide en tres fases, larvaria o hatchery, preengorde y engorde (figura 3): La cría larvaria ha representado uno de los principales desafíos en la producción comercial del rodaballo. El desarrollo de las larvas se lleva a cabo en sistemas intensivos o extensivos. En el sistema intensivo, se emplean tanques pequeños con un control estricto del entorno, donde se mantienen altas densidades de larvas y presas. Después de la eclosión, las larvas inicialmente se alimentan de las reservas vitelinas que tienen almacenadas. La apertura de la boca se produce alrededor del tercer día y a partir de entonces comienzan a alimentarse de rotíferos y artemia. Las presas utilizadas son cultivadas en laboratorio y tienen un valor nutricional limitado (Cerdà-Cuéllar y Blanch, 2004; Peleteiro, 2001; FAO, s.f). La segunda fase es el pre-engorde, durante la cual los juveniles se crían hasta que alcanzan pesos que oscilan entre 40-100 gramos y se les va introduciendo alimento inerte a partir de los 30-40 días (Person-Le Ruyet, 2010; Peleteiro, 2001; FAO, s.f). La tercera y última etapa es el engorde, donde los ejemplares permanecen hasta que alcanzan el tamaño y peso comercial deseado (>400g). Con una temperatura de media de 18ºC, los rodaballos alcanzan el kilo en 18 meses (Cal et al., 2006; Peleteiro, 2001; FAO, s.f). Figura 2: distribución costera del rodaballo indicada con una línea naranja (Losada, 2013). Impacto de A. salmonicida en la salud del rodaballo Pedro Caicoya Fernández. 15 Otro aspecto importante de la transmisión es la diseminación dentro del hospedador. Se cree que A. salmonicida entra a través de erosiones en piel, boca, branquias y ano, y se distribuye por el organismo hematógenamente (Austin & Austin, 2016). En el estudio realizados por Coscelli, Bermúdez, Sancho Silva, et al., (2014) se llega a la conclusión de que la falta de nódulos en el lado ciego descartaría la entrada de las bacterias favorecida por el efecto traumático de la superficie del fondo y que la llegada de la bacteria a los nódulos ha de ser vía hematógena. Prevención La vacunación es uno de los métodos más efectivos de control de enfermedades, ya que ayuda a reducir significativamente los brotes y el uso de antibióticos en la acuicultura. La vacunación se aplica ampliamente en la industria acuícola debido a su bajo costo (Zhou et al., 2023). La mayoría de las vacunas disponibles comercialmente están específicamente formuladas para salmónidos, sin embargo, el incremento en el número y volumen de producción de especies no-salmónidas en acuicultura, como por ejemplo el rodaballo, plantea la necesidad de avanzar en el desarrollo de nuevas vacunas (Coscelli et al., 2015). La vacuna autógena de antígenos específicos aislados en rodaballo es importante para la estimulación del sistema inmunológico de esta especie. Los ensayos de vacunación en laboratorio muestran claramente que la administración por inyección es efectiva en la protección del rodaballo contra Ass con niveles significativamente altos, y muy bajos o casi ausentes por inmersión. Se sabe que diversos adyuvantes se utilizan frecuentemente en las vacunas para peces para aumentar su efecto protector. Las vacunas con adyuvantes oleosos muestran una mejor eficacia en términos de efectos protectores en comparación con las vacunas acuosas, pero producen celomitis crónica y adherencias fibrosas entre los órganos de la cavidad celómica. En conclusión, las vacunas y los procedimientos de vacunación deben adaptarse a la especie de pez y a las condiciones específicas de cada sistema de producción (Björnsdóttir et al., 2005; Coscelli et al., 2015; Santos et al., 2005; Xiu et al., 2024). El desarrollo de cepas resilientes a través de la cría selectiva es una medida cada vez más aplicada para controlar las enfermedades en las piscifactorías. La resistencia frente a enfermedades específicas que afectan a las especies acuícolas ha mostrado heredabilidades significativas, lo que sugiere su potencial para la mejora genética. A pesar de la naturaleza compleja de este proceso, los avances en tecnologías genómicas han permitido desentrañar la variación genética subyacente a estos rasgos, y se han identificado loci de rasgos cuantitativos que explican una proporción significativa de la varianza fenotípica para su aplicación en programas de cría. Además, en ocasiones ha sido posible desentrañar los diferentes componentes de la resiliencia evaluando la resistencia a ser infectado y la tolerancia para sobrevivir una vez infectado (Aramburu et al., 2023). Impacto de A. salmonicida en la salud del rodaballo Pedro Caicoya Fernández. 16 Tratamiento Actualmente, el tratamiento contra A. salmonicida se enfoca en el uso de antibióticos con el objetivo de disminuir la morbilidad y mortalidad en las poblaciones afectadas. Esto ayuda a limitar la liberación del patógeno en el medio ambiente y previene nuevas infecciones dentro de la población. Los antibióticos utilizados en rodaballos incluyen ampicilina, amoxicilina, gentamicina, trimetoprim, ofloxacina, eritromicina, estreptomicina, cefalotina, sulfadiazina, oxitetraciclina, ácido nalidíxico y sulfamerazina (Hegde et al., 2023). El uso indiscriminado de antibióticos provoca la aparición de resistencia en las poblaciones bacterianas que requiere el desarrollo de tratamientos alternativos. La terapia con fagos puede reemplazar o complementar la terapia con antibióticos en la acuicultura. Los estudios publicados sobre el tratamiento con fagos de infecciones por Aeromonas en peces se basaron en bacteriófagos que atacan a A. hydrophila y A. salmonicida subsp. salmonicida. Sin embargo, los patógenos acuáticos son diversos y a menudo incluyen una mezcla de especies de Aeromonas. Por lo tanto, es esencial ampliar la búsqueda de nuevos fagos específicos para bacterias del género Aeromonas (Morozova et al., 2023). Entre estos métodos alternativos, se ha demostrado que los probióticos desempeñan un papel importante en la acuicultura y han sido ampliamente utilizados en medicina humana y veterinaria. Principalmente consisten en bacterias lácticas del género Lactobacillus spp. El modo de acción general de los probióticos implica que una bacteria benigna coloniza el intestino y evita que las bacterias dañinas hagan lo mismo. Los organismos patógenos son obstaculizados por compuestos inhibidores específicos producidos por los organismos probióticos. Proporcionan beneficios a los huéspedes, como mejorar el crecimiento del huésped, reducir la incidencia de enfermedades, y requerir menos quimioterapia. Además, pueden ser usados en diversos entornos acuáticos: agua dulce, agua salobre y agua de mar. Generalmente, son suplementos alimenticios microbianos vivos y/o muertos o aditivos en agua en forma de cepas únicas, múltiples o en combinación con prebióticos u otros inmunoestimulantes, que se administran para mejorar la calidad del agua de cría, mejorar las respuestas fisiológicas e inmunitarias de los animales acuáticos, y reducir el uso de productos químicos y antibióticos en la acuicultura (Hai, 2015; Hegde et al., 2023). Impacto de A. salmonicida en la salud del rodaballo Pedro Caicoya Fernández. 17 Objetivos El objetivo principal de este estudio es contribuir con la caracterización de la enfermedad causada por Ass en rodaballo, con el propósito de proporcionar una descripción más exhaustiva del cuadro clínico y morfopatológico en infecciones naturales. Se exponen a continuación los objetivos específicos en los que se basa este trabajo:  Caracterización morfopatológica de un brote producido por Ass en una granja de rodaballos.  Descripción detallada de la distribución de los antígenos bacterianos en órganos diana mediane técnicas inmunohistoquímicas. Impacto de A. salmonicida en la salud del rodaballo Pedro Caicoya Fernández. 18 Material y métodos Toma de muestras e inspección Los rodaballos que se emplearon en este estudio procedieron de una piscifactoría marina de instalación fija distribuida en tanques de 81 m² situada en Galicia. La toma de muestras se llevó a cabo entre los meses de febrero y marzo. De los tanques diagnosticado mediante qPCR de aeromoniasis se escogieron los 16 con mayor índice de mortalidad. De cada tanque se seleccionó un pez que presentaba lesiones cutáneas compatibles con forunculosis crónica, y nado errático o exoftalmia que son signos de la forma aguda. Los peces se eutanasiaron mediante una sobredosis de metanosulfonato de tricaína (MS222) y posterior sección de la médula espinal. Cada pez se pesó en una báscula de precisión. A la inspección externa de los peces se observó con detenimiento, se fotografiaron cara ocular, visceral y cualquier alteración cutánea. A continuación, se realizó la necropsia completa (figura 5 y 6) cogiendo muestras de todos los órganos que se fijaron en formol tamponado al 10% durante un mínimo de 48h. Figura 5: técnica de necropsia empleada: A, examen cara ocular. B, examen cara ciega. A B Impacto de A. salmonicida en la salud del rodaballo Pedro Caicoya Fernández. 19 Figura 6: continuación de la técnica de necropsia: A , toma de muestras de branquia., B incisión para exponer cavidad abdominal. C , cavidad celómica expuesta, gónada ( ), tubo digestivo ( ), ciegos pilóricos ( ), hígado ( ). D , toma de muestra de lesión cutánea (flecha). E , apertura de cavidad craneal y extracción de encéfalo (flecha). A B D E C Impacto de A. salmonicida en la salud del rodaballo Pedro Caicoya Fernández. 20 Procesado de las muestras para su estudio histológico El procesado de muestras se realizó de manera rutinaria en el laboratorio y consistió en estos pasos: 1. Tallado: Las muestras se introdujeron en 6 cassetes de plástico por pez, cortándolas en piezas transversales de 1 cm para conseguir una muestra representativa de cada órgano o conjunto de órganos, con la distribución resumida en la tabla 1: Distribución de las muestras Cassete 1 2 3 4 5 6 Órgano Branquias Hígado bazo corazón riñón Sistema digestivo Ojos Piel Encéfalo Tabla 1: distribución de las muestras en cassetes para su tallado. 2. Decalcificación: Los cassetes con branquias y piel se sometieron a un proceso de decalcificación. Se colocaron en un recipiente con un producto decalcificador comercial durante 24h y luego en etanol al 70% por un mínimo de tres días. 3. Inclusión en parafina: Se llevó a cabo un proceso en un inclusor. Las muestras se deshidrataron de forma gradual pasando por varios baños de etanol y xileno acabando en un baño de parafina. 4. Formación de bloques: Las muestras fueron orientadas para su posterior corte. El tejido se cubrió con parafina y se dejó enfriar. 5. Corte: Los bloques de parafina se cortaron mediante un microtomo de rotación con un grosor de 3 μm. Los cortes se colocaron sobre portaobjetos silanizados y se secaron durante un día en una estufa a 60ºC. Tinción Se tiñeron todas las muestras obtenidas siguiendo el protocolo que se resume en la tabla 2 Protocolo de tinción con Hematoxilina-eosina 1 Desparafinado e hidratado 2 Hematoxilina (2 minutos) 3 Lavados con agua corriente 4 Eosina (1 minuto) 5 Deshidratado 6 Montaje de las muestras con DPX Tabla 2: proceso de tinción para microscopía óptica. Impacto de A. salmonicida en la salud del rodaballo Pedro Caicoya Fernández. 21 Inmunohistoquímica El proceso de IHQ se basó en el descrito por Coscelli, Bermúdez, Losada, et al. (2014), con varias modificaciones en los pasos (tabla 3). El revelado se realizó con VIP Substrate Kit, Peroxidase (HRP) (SK-4600) y el tiempo de bloqueo de peroxidasa se redujo de una hora a treinta minutos. Protocolo general de tinción inmunohistoquímica 1 Desparafinar e hidratar 2 Lavar con solución salina tamponada con fosfato (PBS) de 10mM con 0,5% de Tween 20 (pH 7,4) (5 minutos) 3 Bloqueo de la peroxidasa endógena (30 minutos) 4 Lavado en PBS (3 x 5 minutos) 5 Incubación con anticuerpo primario (anti-A. salmonicida T0O96.7.1 diluido 1:30000) (2 horas) 6 Lavado en PBS (3 x 5 minutos) 7 Incubación anticuerpo secundario (30 minutos) 8 Lavado en PBS (3 x 5 minutos) 9 Revelado con VIP (1 minuto) 10 Contraste con hematoxilina (3 inmersiones) Tabla 3: protocolo realizado para la técnica inmunohistoquímica. Se realizó la técnica IHQ en todos los órganos diana, de acuerdo con lo descrito por Coscelli, Bermúdez, Losada, et al. (2014), incluyendo branquias, hígado, bazo, riñón, corazón y piel. Además, se llevaron a cabo inmunohistoquímicas en todos los órganos en los que se detectaron colonias bacterianas compatibles con Ass en la tinción de H-E. Impacto de A. salmonicida en la salud del rodaballo Pedro Caicoya Fernández. 22 Resultados Hallazgos macroscópicos Todos los animales analizados en el presente estudio presentaban en la cara ocular de 1 a 20 lesiones nodulares con un tamaño de 1-10 mm (figura 7 A, B y C), coincidiendo en varias ocasiones con los tubérculos. El área de estas lesiones se encontró elevada y en ocasiones ulcerada, dando lugar a que el centro presentaba un tono de color blanquecino o rojizo. Además, en la capa muscular, también se detectaron lesiones similares a las de tipo “forúnculo” descritas en salmónidos (figura 7 D) que consistían en áreas elevadas y fluctuantes que, al corte, rezumaban contenido amarillento. <<<<<<<<<<< A D C B Figura 7: Lesiones macroscópicas: A, lesiones nodulares con distribución multifocal y bien delimitadas en el lado ocular (flechas). Recuadro: detalle de una lesión nodular ulcerada con forma crateriforme (flecha). B, úlcera en aleta caudal (flecha). C, úlcera cutánea rodeada de un halo blanco (flecha). D , área hipopigmentada con consistencia fluctuante (flecha). Impacto de A. salmonicida en la salud del rodaballo Pedro Caicoya Fernández. 23 Se describieron lesiones macroscópicas en diversos órganos. En primer lugar, se observaron ojos protruidos de las cuencas (figura 8 A), branquias blanquecinas y con presencia de depósitos redondeados en los filamentos (figura 8 B). Otro hallazgo significativo fue la presencia en bazo de 1 a 7 nódulos de unos 0,5 mm de diámetro redondos y de color blanco diseminados por la superficie (figura 8 C). Además, también se detectó distensión abdominal que a la apertura contenía un líquido transparente (figura 8 D). Asimismo, se pudo observar el riñón aumentado de tamaño, friable y amarillento (figura 8 E). En la tabla 3, al final del apartado, se resumen todos os hallazgos macroscópicos clasificándolos por individuos. D C B 0 A E Figura 8: Lesiones macroscópicas: A, protrusión ocular y edema periorbital. B , branquias de color rosáceo con presencia de depósitos (flecha). C, nódulos de 0,5mm con distribución diseminada en el bazo (flecha). D , presencia de líquido transparente en la cavidad abdominal. E, riñón aumentado de tamaño, color amarillento y consistencia friable. Impacto de A. salmonicida en la salud del rodaballo Pedro Caicoya Fernández. 24 Hallazgos microscópicos En la piel se observaron dos tipos de lesiones: nódulos y forúnculos. Las características histológicas de los nódulos incluían engrosamiento de la epidermis (figura 9 A) y posterior desprendimiento, condensación de los melanóforos, tubérculos desprendidos (figura 9 B) y con pérdida de su estructura cónica. Los infiltrados inflamatorios se localizaban en la epidermis y dermis, conformados principalmente por macrófagos y células gigantes. Estos hallazgos son característicos de lesiones granulomatosas. Las lesiones macroscópicas tipo “forúnculo” correspondían histológicamente con una miositis con una marcada reacción inflamatoria predominada por células mononucleares, acompañada de necrosis del tejido muscular con presencia de numerosas colonias bacterianas (figura 9 C). Figura 9: hallazgos microscópicos en piel. A, tubérculo expuesto ( ), epitelio engrosado, desprendido y colonizado por bacterias (flecha). Recuadro: dermis con colonias bacterianas. B , tubérculo totalmente desprendido ( ) al igual que en la dermis el extracto compacto del estrato laxo. C , bacterias colonizando el músculo provocando necrosis y una marcada inflamación (flechas). A B C Impacto de A. salmonicida en la salud del rodaballo Pedro Caicoya Fernández. 31 Tabla 4: Resultados de la inmunohistoquímica y lesiones macroscópicas en cada uno de los individuos recogidos. (+) Positivo. (-) Negativo. (NR) No realizado PECES Nódulos piel Forúnculo Ascitis Nódulos en bazo Exoftalmia Branquias Corazón Bazo Riñón Higado Piel Sistema digestivo Ojo 1 + - + - + + + - - - + DUDOSO + 2 + - + + - + + + + + + NR NR 3 + + - - - + + + + - + NR NR 4 + + - - - + + - + - + NR NR 5 + - - - + + + + + - + + NR 6 + - - - - + + + + - + NR NR 7 + - - - - + + - + - + NR NR 8 + + - + - + + + + + + DUDOSO NR 9 + - - + - + + + + - + NR NR 10 + - - - + + - - - - + NR NR 11 + - - - - - - - - - + NR NR 12 + - - - - - - - - - + NR NR 13 + - - - - - - - - - - NR NR 14 + - - - - - - - - - - NR NR LESIONES MACROSCOPICAS RESULTADOS INMUNOHISTOQUÍMICA Impacto de A. salmonicida en la salud del rodaballo Pedro Caicoya Fernández. 32 Discusión En la investigación realizada por Coscelli, Bermúdez, Sancho Silva, et al. (2014) se describieron las lesiones en piel de rodaballos infectados naturalmente por Ass. Esos peces mostraron nódulos cutáneos ubicados en el lado ocular del cuerpo causando en casos graves ulceración y desprendimiento de los tubérculos dérmicos. Histológicamente estos nódulos correspondían con una dermatitis granulomatosa. Estas fueron las únicas lesiones encontradas en este trabajo, poniendo así en duda el termino forunculosis para referenciar a esta patología. En el presente estudio se ha observado que además de los nódulos también aparecen lesiones que se asemejan a forúnculos en la musculatura como las descritas por Austin & Austin, (2016) típicas de salmones. Las lesiones tipo “forúnculo” y su relación con Ass fue corroborada con la técnica de la inmunohistoquímica. Así que si se discute el término de furunculosis que sea porque las lesiones no se parecen a las encontradas en una condición similar en animales homeotérmicos y no por la ausencia de ellas en rodaballos. Sin embargo, como dijeron Austin & Austin (2016) “el nombre se ha establecido en la literatura pesquera, por lo que se ha mantenido por conveniencia y para evitar la confusión que podría resultar de un nuevo nombre”. Hay una correlación entre las lesiones dérmicas y la infección por Ass, 14 de los 16 peces que mostraban nódulos en la piel del estudio fueron positivos a Ass en la prueba IHQ. Estos datos resultan útiles en el control de la enfermedad pudiendo así identificar externamente a portadores y eliminadores de la bacteria sin necesidad de pruebas laboratoriales. El estudio realizado por Coscelli, Bermúdez, Losada, et al. (2014) describió el perfil morfopatológico de la infección experimental aguda por Ass en rodaballo. Este estudio demostró que a las 96 horas post infección, Ass se dispersó por la superficie serosa de los órganos celómicos y en el parénquima y vasos sanguíneos de todos los tejidos muestreados (excepto el cerebro y el tracto gastrointestinal). El tejido circundante a las colonias bacterianas mostró cambios necróticos, especialmente evidentes en riñón, hígado, bazo y páncreas, mientras que se detectó necrosis leve en branquias, timo y gónadas. En cambio, en este estudio, lo que se ha demostrado es que además de los cambios estructurales descritos por Coscelli, Bermúdez, Losada, et al. (2014), en una infección natural también se ve afectado el sistema digestivo, encontrando en él colonias bacterianas en las vellosidades y en la luz intestinal, provocando necrosis e inflamación. Otra diferencia con el cuadro agudo descrito por Coscelli, Bermúdez, Losada, et al. (2014) sería la presencia de nódulos de color blanco diseminados por la superficie del bazo que histológicamente coinciden con un granuloma. Estos nódulos no están descritos en rodaballos, pero sí que fueron descritos por Morrison et al., (1984) en bacalao (Gadus Morhua) infectados experimentalmente con A. salmonicida. Impacto de A. salmonicida en la salud del rodaballo Pedro Caicoya Fernández. 33 Ringø et al. (2004) y Ringø et al. (2007) describen el daño celular intestinal en el salmón del Atlántico (Salmo salar L.) causado por Ass, demostrando claramente un destacado desprendimiento de enterocitos en la región anterior del intestino tras la exposición al patógeno. En la parte posterior del intestino, observaron poco desprendimiento, pero detectaron daño celular que involucraba microvellosidades, desmosomas y uniones estrechas. Basándose en estos hallazgos, sugieren que Ass puede ingresar al pez al dañar seriamente el revestimiento intestinal. En este estudio, estos hallazgos se ven respaldados ya que, los resultados demostraron que el sistema digestivo se ve alterado cuando este es positivo a Ass, se pudo observar enteritis con una reacción inflamatoria predominada por los macrófagos y los enterocitos engrosados y desprendidos de la lámina propia. Dado que ningún trabajo previo ha evaluado los efectos inducidos por Ass en la histología del tracto gastrointestinal del rodaballo, los resultados del presente estudio sugieren que puede tener un papel en la patogenia de la enfermedad. Se deben llevar a cabo estudios adicionales para aclarar esta hipótesis. Entre los aspectos más relevantes nuestro estudio destaca la coexistencia de dos formas de la enfermedad en el mismo animal, peces con signos de forunculosis aguda como nado errático, letargia y exoftalmia que también exhiben signos crónicos como las ulceras en piel. Con la IHQ comprobamos la existencia de antígenos en las lesiones cutáneas y en los órganos diana de la infección aguda (branquia, bazo, corazón bazo e hígado). Estos datos nos permiten hipotetizar sobre la reagudización de la forma crónica. Serían necesarios más estudios sobre vías de entrada, diseminación y transmisión de la enfermedad. No hay ningún precedente bibliográfico sobre la reagudización de Ass en peces teleósteos. En una revisión multiespecie realizada por Lee Herman (1968) se apuntó a que la disminución de las temperaturas podría causar una regresión de la enfermedad de un estado crónico a uno latente, con una curación concurrente de las lesiones en otoño e invierno. Esta afirmación concuerda con los datos obtenidos en este estudio, en el que se observó que 2 peces del estudio que tenían lesiones cutáneas compatibles con forunculosis crónicas y signos clínicos de septicemia resultaron negativos a la detección del antígeno bacteriano en las lesiones cutáneas y en los órganos internos analizados. Las fechas del estudio (febrero y marzo) reafirman la teoría de que la temperatura puede poner en un estado de latencia a la bacteria. Impacto de A. salmonicida en la salud del rodaballo Pedro Caicoya Fernández. 34 Conclusiones 1. La infección por Ass tiene un impacto severo en la salud del rodaballo, causando lesiones significativas que pueden ser identificadas tanto a nivel macroscópico como microscópico. Un brote en una granja se podría identificar por tener animales con exoftalmia, nado errático y lesiones cutáneas. 2. Además de afectar a los órganos descritos en la bibliografía, Ass también coloniza el tracto digestivo y el ojo. 3. La inmunohistoquímica es una herramienta útil para detectar la presencia y distribución de la bacteria en los tejidos infectados. Los órganos diana son piel, branquias y corazón, y en menor medida hígado, bazo, riñón, sistema digestivo y ojos. Impacto de A. salmonicida en la salud del rodaballo Pedro Caicoya Fernández. 35 Bibliografía APROMAR. (2023). La acuicultura en España 2023 [PDF]. Recuperado de https://apromar.es/wpcontent/uploads/2023/09/La_acuicultura_Espana_2023_APROMAR.pdf. Aramburu, O., Blanco, A., Bouza, C., & Martínez, P. (2023). 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