A kalciumhomeosztázis regulációjában szerepet játszó fehérjék vizsgálata porc- és vázizomsejtekben

1 EGYETEMI DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS A kalciumhomeosztázis regulációjában szerepet játszó fehérjék vizsgálata porcés vázizomsejtekben Tóth Adrienn Témavezető: Prof. Dr. Csernoch László DEBRECENI EGYETEM MOLEKULÁRIS ORVOSTUDOMÁNY DOKTORI ISKOLA DEBRECEN 2015 2 Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke .................................................................................................................. 4 Bevezetés .................................................................................................................................... 6 Irodalmi áttekintés ...................................................................................................................... 6 A porcés a vázizomszövet közös mezenhimális eredete ...................................................... 6 A porcszövet ....................................................................................................................... 7 A porc fejlődése, táplálása, öregedése ................................................................................ 7 A hialinporc felépítése ........................................................................................................ 8 A porcdifferenciálódás tanulmányozására szolgáló modellek .......................................... 10 A porcdifferenciálódás lépései .......................................................................................... 12 A porcdifferenciálódás intracelluláris szabályozása ......................................................... 12 Az intracelluláris Ca2+-koncentráció szerepe a differenciálódási folyamatban ................ 13 Purinreceptorok ................................................................................................................. 15 A vázizom ............................................................................................................................. 17 A vázizomsejtek ................................................................................................................ 17 A vázizom morfológiai sajátságai ..................................................................................... 18 Izomfejlődés ...................................................................................................................... 19 A vázizom élettani sajátosságai ........................................................................................ 20 Rianodin receptor (RyR) ................................................................................................... 21 Szarkoplazmatikus retikulum Ca2+ ATP-áz (SERCA) ..................................................... 21 Az intracelluláris kalcium sejtélettani jelentősége az izomfejlődés során ........................ 23 Célkitűzés ................................................................................................................................. 25 Anyagok és módszerek ............................................................................................................. 27 Sejtkultúrák ........................................................................................................................... 27 Porctenyészet .................................................................................................................... 27 C2C12 vázizomsejtek ....................................................................................................... 28 Liposzóma mediált transzfekció ........................................................................................... 28 Immuncitokémia ................................................................................................................... 30 RT-PCR analízis ................................................................................................................... 31 Fehérjeminták készítése ........................................................................................................ 34 Western-blot analízis ............................................................................................................ 34 Egyedi sejteken történő fluoreszcens intracelluláris [Ca2+]-mérés ....................................... 36 A sejtproliferáció és differenciáció vizsgálata ...................................................................... 40 3 Kalcineurin-enzimaktivitás mérése ...................................................................................... 40 Statisztikai analízis ............................................................................................................... 41 Eredmények .............................................................................................................................. 42 Eredmények I.-Porcszövet .................................................................................................... 42 Az IP3-receptoron keresztül, a belső raktárból felszabaduló Ca2+ spontán Ca2+- tranzienseket okoz CPC sejteken ...................................................................................... 42 A belső Ca2+-raktár fehérjéinek expressziós vizsgálata .................................................... 46 A Ca2+-tranziensek kialakításában szerepet játszó szignalizációs útvonal felderítése ..... 46 Az ATP szerepének vizsgálata a spontán Ca2+-oszcillációk kialakulásában .................... 52 Eredmények II.-Vázizomszövet ........................................................................................... 53 C2C12 sejttenyészetek, transzfekció ................................................................................ 53 A vázizom Ca2+-homeosztázisában és differenciálódásában résztvevő fehérjék expressziós mintázatainak alakulása a csökkent SERCA1b fehérjeszint hatására ........... 54 A csökkent SERCA expresszió hatása a Ca2+-homeosztázisra ......................................... 56 A SERCA1b csökkent expressziója módosítja a differenciálódó izom növekedését ....... 61 Megbeszélés ............................................................................................................................. 66 Porcszövet-kondroprogenitor sejttenyészetek ...................................................................... 66 A citoszólikus [Ca2+] dinamikus változása ....................................................................... 66 A kondroprogenitor sejtek belső Ca2+-raktárának funkcionális jellemzése és szerepe a Ca2+-oszcilláció kialakításában ......................................................................................... 67 Purinerg szignalizáció és a Ca2+-oszcilláció autokrin/parakrin szabályozása .................. 68 Vázizomszövet-C2C12 sejttenyészetek ................................................................................ 70 A SERCA1b fehérje expresszió csökkenése és a Ca2+-homeosztázisban résztvevő fehérjék expressziójára gyakorolt hatása .......................................................................... 70 Az elektromechanikai csatolás vizsgálata kontroll és SERCA1b specifikus shRNS-sel transzfektált sejtekben ....................................................................................................... 72 Összefoglalás ............................................................................................................................ 75 Summary .................................................................................................................................. 77 Irodalomjegyzék ....................................................................................................................... 79 Közleménylista ......................................................................................................................... 90 Idézhető, angol nyelvű absztraktok: ..................................................................................... 92 Angol nyelvű poszterek: ....................................................................................................... 92 Magyar nyelvű poszterek: .................................................................................................... 93 Előadások: ............................................................................................................................ 93 Köszönetnyilvánítás ................................................................................................................. 94 4 Rövidítések jegyzéke 7TM receptor: 7 transzmembrán doménnel rendelkező receptor [Ca2+]e: extracelluláris kalciumkoncentráció [Ca2+]i: intracelluláris kalciumkoncentráció 2-APB: 2-aminoethoxidifenil borát ATP: adenozin-trifoszfát ATPγS: adenozin-5’-O-(3-tiotrifoszfát) ADP: adenozin-difoszfát AdoraR-1/2A/2B/3: adenozin receptor 1/2A/2B/3 AMP: adenozin-monofoszfát AM: acetoxi-metilészter 4-AP: 4-aminopiridin BCA: bicinchoninic acid BMP: bone morphogenic protein, csont morfogenetikus fehérje BSA: bovine serum albumin, borjúszérum albumin CaN: calcineurin, kalcineurin Cavpan: feszültségfüggő Ca2+-csatorna CCPA: 2-Chloro-N6-cyclopentyladenosine CICR: calcium-induced calcium release, kalciumindukált kalciumfelszabadulás CMF-PBS: Ca2+-Mg2+ free phosphate-buffered saline, Ca2+-Mg2+- mentes foszfát puffer oldat COMP: cartilage oligomeric matrix protein, porc mátrix fehérje CPA: cyclopiazonic acid, ciklopiazonsav CPC: kondro progenitor cell, kondroprogenitor sejt CRAC: Ca2+ release activated Ca2+ channel, Ca2+- felszabadulás által aktivált Ca2+-csatorna CREB: cAMP response element-binding protein, cAMP-re reagáló elem CSQ: calsequestrin, kalszekvesztrin DAPI: 4',6-diamidino-2-fenilindole DHPR: dihydropyridin receptor, dihidropiridinreceptor DMEM: Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Dulbecco által módosított Eagle-féle médium ECC: excitation-contraction coupling, elektromechanikai csatolás ECM: extracellular matrix, extracelluláris mátrix ER: endoplasmic reticulum, endoplazmatikus retikulum ERK1/2: extracellular signal-regulated kinase 1 and 2, extracelluláris szignál szabályozta kináz 1 és 2 ESCs: embryonic stem cells, embrionális őssejtek FBS: foetal bovine serum, fötális borjúszérum FGF: fibroblast growth factor, fibroblaszt növekedési faktor FITC: fluoreszcein-izotiocianát FTHM: full time at half maximum, időbeli félértékszélesség GAG: glükózaminoglikán G-protein: guanin nukleotid kötő protein GAPDH: gliceraldehid 3-foszfát dehidrogenáz HD: high density cell culture, nagy sűrűségű sejttenyészet HMG: high mobility group, nagy mobilitású csoport HRP: horse-radish peroxidase, tormaperoxidáz HS: horse serum, lószérum IP3: inozitol 1,4,5-triszfoszfát IP3R: inozitol 1,4,5-triszfoszfát receptor IP3R-1/2/3: inozitol 1,4,5-triszfoszfát receptor 1/2/3 altípusa JNK: c-Jun N-terminal kinase, c-jun N-terminális kináz KO egér: knockout egér MAPK: mitogen-activated protein kinase, mitogénaktivált protein kináz 5 MCIP1.4: modulatory calcineurin interacting protein 2-MeS-ATP: 2-metiltio-ATP MyoD: myogenic transcription factor, miogenikus transzkripciós faktor MSC: mesenchymal stem cell, humán mezenhimális őssejt NFAT: nuclear factor of activated T-cells, aktivált T-sejtek nukleáris faktora NCX: Na+-Ca2+ exchanger, Na+-Ca2+-cserélő fehérje NMDA: N-metil-D-aszpartát NTY: normál Tyrode-oldat PBS: phosphate-buffered saline, foszfát pufferoldat PCR: polymerase chain reaction, polimeráz láncreakció PKA: protein kináz A PKC: protein kináz C PLC: foszfolipáz C pLP1/2: proteolipid protein 1, 2 fehérjék PMCA: plazmamembrán Ca2+-ATPáz PP2A: protein-foszfatáz 2A PP2B: protein-foszfatáz 2B PSM: presomitic mesoderm, preszomítikus mezoderma PTI: Photon Technology International PVmax: a Ca2+-pumpa maximális transzportkapacitása ROCC: receptor-operated calcium channel, ligandvagy receptorvezérelt Ca2+-csatornák RT-PCR: reverz transzkripciós polimeráz láncreakció RyR: ryanodine receptor, rianodinreceptor RyR1/2/3: ryanodine receptor type1/2/3, rianodinreceptor 1/2/3 altípusa SDS-PAGE: sodium dodecyl sulphatepolyacrylamide gel electrophoresis, Na+- dodecilszulfát-poliakrilamid gélelektroforézis SE: standard error, standard hiba SERCA: sarco-endoplasmic reticulum Ca2+- ATPase, szarko-endoplazmatikus retikulum Ca2+- ATPáz SERCA1a/1b/2a/2b/3: szarkoendoplazmatikus retikulum Ca2+-ATPáz 1a/1b/2a/2b/3 izoformái siRNS: kis interferáló RNS shRNS: small hairpin RNS SMOC: second messenger-operated channel, másodlagos messengerek szabályozta Ca2+- csatornák SOCE: store-operated calcium-entry, raktár által vezérelt kalciumbelépés suramin: 8-(3-benzamido-4-metilbenzamido)- naftalén-1,3,5-triszulfonsav SR: szarkoplazmatikus retikulum STIM1: stromal interaction molecule 1, sztrómális kölcsönható molekula 1. altípusa TG: thapsigargin, tapszigargin TM: transmembrane, transzmembrán VICR: Voltage Induced Calcium Release, feszültség által kiváltott kalciumfelszabadulás VOCC: voltage-operated calcium channel, feszültségvezérelt Ca2+-csatornák VSVG: Vesicular stomatitis Indiana virus Gproteinje YM-58483: 4-metil-40-[3,5-bisz(trifluorometil)- 1pirazol-1-yl]-1,2,3-tiadiazol-5-karboxanilid Key words: skeletal muscle, sarcoplasmic reticulum, SERCA1b protein, store operated Ca2+- entry (SOCE), purinergic receptor, single cell Ca2+-measurement, Ca2+-oscillations Kulcsszavak: vázizom, szarkoplazmatikus retikulum, SERCA1b fehérje, raktár által vezérelt kalciumbelépés (SOCE), purinreceptorok, egyedi sejten történő Ca2+-mérés, Ca2+-oszcilláció 6 Bevezetés Irodalmi áttekintés A porcés a vázizomszövet közös mezenhimális eredete A mozgásszervi megbetegedések - különösképpen az ízületi porckopás és a különböző degeneratív ízületi betegségek - az 50 éven felüli lakosság körében leggyakrabban előforduló, az életminőséget jelentősen rontó elváltozások. Az oszteoartritisz (OA) és a reumatoid artritisz az ENSZ Egészségügyi Világszervezete jóslatai alapján 2020-ra a negyedik vezető ok lesz a mozgáskorlátozottság kialakulásában [1,2]. Nem elhanyagolható továbbá a szerzett vagy öröklött vázizombetegségek – disztrófiák, miozitiszek, miopáthiák – előfordulási gyakorisága sem, amelyek mind a tünetek alapján, mind pedig a nemek között nagy heterogenitást mutatnak. Figyelembe véve azt, hogy e betegségek súlyos formái leginkább az idősebb korosztályt érintik, és napjaink vezető problémái közé tartozik a társadalom elöregedése, ezért ezekkel a problémákkal a közeljövőben még hangsúlyosabban kell foglalkoznunk. Így munkánk során a legfontosabb céljaink között szerepelt az érintett szövetek, így a porcszövet és izomszövet részletesebb feltérképezése. A porcés vázizomszövet egyedfejlődése a gerincesekben sok szempontból megegyezik: a gasztruláció során a paraxiális mezoderma elkülönül az axiális és laterális mezodermától, és a velőcső két oldalán szegmentálatlan mezodermacsíkot hoz létre, amit az irodalom preszomítikus mezodermának (PSM) nevez. A PSM kialakulását követően jön létre gerincesekben a tengelyváz, valamint a törzsés a végtagizmok. A szegmentálatlan PSM különböző molekuláris és morfogenetikai változásokon esik át a szegmentálódásig, mely következményeként jönnek létre a szomiták. A 4. hét kezdetére a szomiták ventrális és mediális falát alkotó sejtjei elveszítik addigi kompakt szerveződésüket, a gerinchúr irányába vándorolnak, majd körülveszik azt létrehozva a szklerotomot, ami az embrionális mezenhima laza szövetét alkotja. A miotóm és dermatóm a dorzális szomitafal sejtjeiből áll. A korai embrionális élet során több csíralemez sejtjei is porcszövetté differenciálódhatnak. Testünk porcszövetei a fej-nyak régió kivételével a középső csíralemez származékai: a törzs csontjainak vázát adó porckezdemények a paraxiális mezoderma szegmentálódásaként létrejövő szomiták szklerotom komponenseiből fejlődnek, míg a végtagtelepek porctemplátjai a lateralis mezodermából kialakult mezenhimális szövet származékai. A fej-nyaki régió porcképződményeiért a velőléc (crista neuralis) sejtjei felelősek. Az izomszövet prekurzor 7 sejtjei (premioblasztok) a miotóm sejtjeinek osztódásával alakulnak ki, és további fejlődéssel és fúzióval képezik a vázizomrostokat [3]. A porcszövet A porcszövet egy olyan speciális szövet, amely nemcsak az embrionális korban, hanem a kifejlett egyedek esetében is sokrétű feladattal bír. Ez a speciális kötőés támasztószövet a korai embrionális korban strukturális támaszt nyújt, majd az egyedfejlődés egy későbbi szakaszában ebből a szövetből, endokondriális csontosodással alakul ki a csontok váza. Gyermekés serdülőkorban a csontosodási folyamat során a porcszövet csak részben alakul át csontszövetté, az epifízis-porckorong területén, valamint az ízületi porc formájában megmarad. Az epifízis-porckorong a gyors hossznövekedésért felelős, ezért csak a pubertás kor befejeztéig funkcionál, míg az ízületi porc az egész életünk folyamán megmarad [4]. Porcszövet található továbbá a fej és az arc számos területén (orr, fül) is. A már kialakult porcszövet nem egységes: a makroszkópos és mikroszkópos morfológiai sajátságok eltérőek lehetnek alaki és funkcionális szempontból, továbbá az extracelluláris mátrixot (ECM) tekintve, szerkezeti és biomechanikai szempontból is eltérések figyelhetőek meg. Ezek alapján a porcszövetet három nagy csoportba soroljuk: hialinporc (üvegporc), elasztikus porc és rostos porc. Jelen értekezés tárgya a hialinporc, ezért részletesen csak ezzel foglalkozom. A porc fejlődése, táplálása, öregedése A porc kialakulásának első lépése a mezenhimális sejtek gyors szaporodása, melyek a későbbi porctelepnek megfelelően blasztémát (sűrűn elhelyezkedő sejtekből álló csoport) képeznek. A sejtek lekerekednek, majd maguk körül porcmátrixot termelnek, ezáltal széttolódnak egymástól. Az így kialakult kondroblasztok limitáltan osztódnak, de a sejteket a kialakult porcudvar már nem engedi széttolódni egymástól. Ezt a növekedést intersticiális növekedésnek nevezzük, amely leginkább az embrionális fejlődésre jellemző. A porcszövet a felszín felől képződő, új porcszövet rárakódásával is növekedhet, amit appozicionális növekedésnek nevezünk. E folyamat során a porchártya belső rétegét képező sejtek, a kondroblasztok differenciálódnak. A kezdetben ellapult alakból kerekdeddé válnak. A differenciált porcsejtek a növekedés befejezte után normális körülmények között már nem osztódnak tovább. Ezért a porc sérülése esetén, felnőtt korban a regeneráció minimális, így az elpusztult porcszövet helyét csontvagy tömött kötőszövet tölti ki. 8 A porc érmentes szövet, egészséges porcszövetben ereket csak kivételes esetben találunk. A porcsejteknek, a többi sejttől eltérően, lassú és anaerob jellegű anyagcseréje van. A porchártya ereiből, a környező szövetekből vagy épp a szinoviális folyadékból (ízületi porcok esetében) kapják a tápanyagokat, amelyek a porcmátrixon keresztül diffundálnak [5]. A porcnak, úgy, mint más szövetféleségeknek is, az élet folyamán bizonyos szintű adaptációt kell mutatnia a környezeti megterhelésekkel szemben. A lebomló mátrix egyes komponenseit a porcsejtek újratermelik bonyolult jelátviteli mechanizmusokon keresztül. A kor előrehaladtával a kondrociták alkalmazkodóképessége csökken, és a porcmátrix is kémiai változásokon megy keresztül. Ezért idősebb korban gyakran előfordul, hogy testünk egyes részein a porcszövet elmeszesedik, elcsontosodik. Az ízületi porc regenerációjának csaknem teljes hiánya miatt napjainkban egyre szélesebb körben alkalmazzák az ún. mozaikplasztikai eljárást. A kis és közepes porchiányok (1-2,5 cm2) kezelésére ajánlott műtéti eljárás alapötlete, hogy a térdízületi porcborításából azon részeket, melyek nem vesznek részt a teherviselésben, kis henger alakban szabadon eltávolítva beültetik a porchiány helyére. A beültetett porcos-csontos hengerek a befogadó csontba beépülnek, és körülbelül fél-egy év elteltével az ízület porcborítása teljes egészében épnek tűnik. A módszer hátránya, hogy a hengerek a saját ízületből kerülnek eltávolításra, emiatt az érintett területen fájdalom jelentkezhet [6]. A hialinporc felépítése Felnőtt szervezetben a hialinporcnak három megjelenési formája van: ízületi porc, állandósult porc (gége, légcső, bronchusok), valamint az endokondriális csontosodással kialakuló csontok alakjának stabilitását szolgáló porcok [7]. A hialinporcot a porchártya veszi körül. Külső lemeze (stratum fibrosum) főként I-es típusú kollagénrostokat tartalmaz, szerepe a túlzott hajlítás következtében esetlegesen létrejövő törés elleni védelem. Belső lemeze (stratum chondroblasticum) differenciálatlan sejteket tartalmaz, amelyek a porc növekedésének stádiumában kondroblasztokká alakulnak, porcmátrixot termelnek. A porchártyában találjuk az ereket és az érző idegvégződéseket is. A porcsejtek az alapállományban csoportokat alkotnak, ún. kondront létrehozva [5]. A sejteket közvetlenül a pericelluláris mátrix határolja. Mivel a kondrocitákat az itt elhelyezkedő makromolekulák (VI. kollagén, dekorin, laminin, szulfatált proteoglikánok) kapcsolják a mátrixhoz, a pericellularis mátrix jelenlévő negatív töltésű molekulák igen nagy koncentrációja miatt erősen bazofil festődésű porctokként jelenik meg. Körülötte találhatjuk meg a territoriális 9 mátrixot vagy másnéven porcudvart, amely a nagy koncentrációban jelenlévő proteoglikánok miatt szintén bazofil festődést mutat. A kondronok közötti halványabb festődésű területet interterritoriális mátrixnak nevezzük, amely kollagénben gazdag [7]. 1. ábra: A porcszövet vázlatos felépítése. A kondrocita és az azt körülvevő mátrixkomponensek szerveződése. (CILP-1: pirofoszfo-hidroláz 1; COMP: porc mátrix fehérje; KS: keratán szulfát; PRELP: prolin, arginin és leucin gazdag fehérje, [8]) A csoportosan elhelyezkedő differenciált porcsejtek kerekded alakúak, egy vagy több sejtmagot tartalmaznak. A fiatal, mátrixtermelésben aktívabb sejtekben fejlett, durva felszínű endoplazmatikus retikulum és terjedelmes Golgi-apparátus figyelhető meg. Ezek a sejtek a porchártyához közel helyezkednek el. Ezzel ellentétben a kevésbé aktív, idősebb sejtek többnyire a porc belsejében találhatóak meg, kevesebb sejtorganellumot tartalmaznak, citoplazmájuk jelentős részét glikogén és zsírcseppek töltik ki. A porcszövet jellegzetes mechanikai sajátságait a kollagénrostok, proteoglikánok, a hialuronsav és a különböző glikoproteinből felépülő mátrix adja (1. ábra). A porcban főleg a II-es típusú kollagén molekula fordul elő. A II-es típusú kollagénhez a fibrillumok alkotórészeként kis mennyiségben a XI-es és IX-es típusú kollagénmolekulák csatlakoznak, melyek a többi mátrixalkotót kapcsolják a kollagénhálózathoz. A X-es típusú kollagén a kollagénfibrillumok szabályos hálózatba történő szervezésében játszik szerepet, és az epifízis 16 A purinreceptorok osztályozása A purinreceptorok, mint azt az irodalomból tudjuk, kitüntetett szereppel bírnak az alapvető biológiai folyamatok létrejöttében. A 2. ábrán jól látható, hogy a purinreceptorok extracelluláris nukleotidokra érzékenyek. Ezeket a receptorokat először idegsejtekben fedezték fel, de nem sokkal később kiderült, hogy szinte minden szövetben megfigyelhető az expressziójuk. Az immunrendszerben például a purinerg szignalizáció hatására aktiválódnak és migrálódnak a makrofágok [52,53]. A purinreceptorokat két nagyobb családra oszthatjuk: a P1-receptorcsalád adenozinra, a P2-receptorcsalád pedig ATP-re, ADP-re és UTP-re érzékeny. Az utóbbi csoport két további altípusra, a P2Xés P2Y-receptorokra osztható [54]. A P1-receptorok négy különböző altípusának mindegyike G proteinhez kapcsolt, 7 transzmembrán domént tartalmazó fehérje. A négy receptortípus a következő: Adora 1 (A1R), Adora 2 (A2AR), Adora 2B (A2BR) és Adora 3 (A3R) [55]. Az Adora 1 receptor agonistája a CCPA (2-Kloro-N6-ciklopentiladenozin), antagonistái a metilxantinok. Az Adora 2A agonistái a DPMA (N6-(2-(3,5-dimetoxifenil)-2-(2-metilfenil)etil)adenozin) és a regadenozon, az antagonistái az ATL-444 és MSX-3. Az Adora 2B agonistái a NECA (Netilkarboxamidoadenozin) és a BAY 60-6583, antagonistái az ATL-801 és MRS-1706. Az Adora 3 agonistái a 2-(1-hexinil)-N-metiladenozin és a CF-101, -102, antagonistái a KF26777 és a MRS-545. A legfrissebb irodalmi adatok protektív szerepet tulajdonítanak a P1receptoroknak, például az ateroszklerózisos betegeknél [56]. Az ionotróp P2X receptoroknak 7 típusát ismerjük, amelyek a P2X1-7 alegységek homovagy heteromultimerizációjával jönnek létre [57]. Az alegységek két transzmembrán domént tartalmaznak, intracelluláris Cés N-terminálissal, valamint egy nagy extracelluláris hurokkal rendelkeznek. Amikor az extracelluláris oldal megfelelő helyéhez ATP kötődik, az [Ca2+]i megnő (közvetlenül a külső térből), és a belépő Ca2+ ionok CICR-t indukálnak. A P2X receptorok nyitása emellett depolarizálja a sejtet. Megkülönböztetünk lassan deszenzitizálódó purinreceptorokat, melyek közé a P2X2, P2X4, P2X5 és P2X6 receptor tartozik. Vannak azonban gyorsan deszenzitizálódó receptorok is, így például a P2X1 és P2X3. A P2X7 receptort egy külön csoportba sorolhatjuk, mivel ez a receptor deszenzitizációt nem mutat [58]. A P2X7 receptor fontos szerepet játszik az apoptózisban, és a tumorgenezisben mára elfogadott tumormarker [59]. A szerepét leírták már perifériás idegrendszeri bántalmakban [60], valamint szepszisben is [61]. 17 A metabotróp P2Y-csoport tagjai G-proteinhez kapcsolt, 7 transzmembrán doménnel rendelkező receptorok (7-TM receptorok) [58]. Emlősökben eddig nyolcféle P2Y receptor ismert [62]. A P2Y legkorábban megismert 4 típusa (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6) Gq-proteinen keresztül a PLC-t aktiválja és így IP3-felszabadítás révén hozza létre a citoplazma kalciumkoncentrációjának növekedését. A másik 4 típus (P2Y11, P2Y12, P2Y13, P2Y14) esetében az aktiválás Gs-proteinen keresztül történik, a gátlás pedig Gi-proteinen keresztül valósul meg. A purinerg receptorok legfontosabb agonistáit és antagonistáit az 1. táblázatban foglaltam össze. 1. táblázat: A purinerg receptorok legfontosabb agonistái és antagonistái. (suramin: 8-(3-benzamido-4metilbenzamido)-naftalén-1,3,5-triszulfonsav; ATPγS: adenozin-5’-O-(3-tiotrifoszfát); 2-MeS-ATP: 2-metiltioATP) P2X receptortípusok P2X1 P2X2 P2X3 P2X4 P2X5 P2X6 P2X7 Agonisták ATP, ATPγS Antagonisták Suramin (kivéve P2X6) P2Y receptortípusok P2Y1 P2Y2 P2Y4 P2Y6 P2Y11 P2Y12 P2Y13 P2Y14 Agonisták ATP (kivéve P2Y12) ADP UTP UTP UDP 2-MeSATP ADP ADP UDPglükóz Antagonisták Suramin (kivéve P2Y4) A vázizom A vázizomsejtek Az izomsejt rendszeres és jól szabályozott összehúzódásokra specializálódott sejtféleség. A gerincesekben, szövettani jellegzetességük alapján, az izomszövet két típusát különítjük el. Az egyik típusba tartozik a harántcsíkolt izomszövet, mely fénymikroszkópban harántcsíkolatot mutat. Ebbe a csoportba tartozik a vázizomszövet (a csontváz axiális és perifériás részeihez kapcsolódik), a viszcerális harántcsíkolt izomszövet (nyelv, nyelőcső felső része) és a szívizomszövet. A másik típusba tartozik a simaizomszövet, mely nem mutat a harántcsíkolt izomhoz hasonló rendezettséget [63]. Az izomszövet különböző módon differenciálódott típusai biztosítják a soksejtű állati szervezetek helyváltoztatását és belső szerveik mozgását. Az izomsejtek mellett számos egyéb mezodermális eredetű sejt is képes az aktinés miozinfilamentumok kölcsönhatása révén megvalósuló összehúzódásra. 18 A vázizom morfológiai sajátságai A vázizmot durva kötőszövetes tok, az epimízium határolja, melyen belül az izomrostok kötegei a perimíziumba zárva helyezkednek el (3. ábra). A többmagvú izomrostot az endomízium burkolja, mely vérés nyirokereket, valamint idegeket tartalmaz. Az izomrostok hosszú, henger alakú, nem elágazó óriássejtek, melyek a sejtek szélén, a sejtmembrán alatt ellapult sejtmaggal rendelkeznek. A magok száma akár sok száz is lehet az izomrost hosszától függően, amely néhány millimétertől akár 30-40 cm-ig is terjedhet, átmérője pedig 10 és 100 µm között változik. Szövettani metszeteken, speciális festési eljárással világos és sötét sávok figyelhetőek meg a citoplazmájában. A sötéten festődő sávok anizotrópok (A-sáv), a világosan festődő sávok pedig izotrópok (I-sáv). Az I-sáv közepén vékony sötét vonal látható, melyet Z-vonalnak nevezünk. A sejt citoplazmájának, melyet vázizom esetében szarkoplazmának vagy mioplazmának is neveznek, jelentős tömegét a miofibrillumok alkotják, melyek a vékony (aktin) és vastag (miozin) miofilamentumokból épülnek fel. A miofibrillum két Z-vonala közé eső, ismétlődő szakaszokat szarkomereknek nevezzük. A szarkomer miozint tartalmazó részei alkotják az A-sávot (anizotróp), a csak aktint tartalmazó részek pedig az I-sávot (izotróp). Előbbi közepén a H-zóna, az utóbbi közepén pedig a Z-vonal található. Az aktin szabályozó fehérjéi a tropomiozin és a troponin. Bizonyos fehérjék ugyan nem játszanak szerepet sem a kontrakció folyamatában, sem annak szabályozásában, mégis elengedhetetlen szerepük van a szigorú rendezettség fenntartásában [5]. Ilyen például a nebulin, ami valószínűleg az aktinhosszt szabályozza, a titin, amely az izomrostok rugalmasságát biztosítja, valamint az obscurin, amely a titin és az ankirin megkötésében játszik szerepet. A titin érdekessége, hogy ez az eddig ismert legnagyobb polipeptid (molekulasúly: 3000 kDa) [64]. Az egyes izomrostokat sejtmembrán, a szarkolemma veszi körül. A szarkolemma felépítése azonos más ingerelhető és nem ingerelhető membránokéval: lipid kettősréteg, benne integráns fehérjemolekulákkal. Az izomrost működése szempontjából döntő a feszültségfüggő gyors Na+- és a késői típusú K+- csatornák jelenléte, ezek teszik lehetővé az akciós potenciál terjedését. A szarkolemmában Clés Ca2+- csatornák, valamint különféle receptormolekulák is találhatók. A vázizom igen fejlett intracelluláris membránrendszerrel rendelkezik, mely nem más, mint a szarkoplazmatikus retikulum (SR). A SR-t a rost hossztengelyével párhuzamosan elhelyezkedő vékony csövek (longitudinális, vagy L-tubulusok) alkotják, melyek terminális ciszternákban végződnek. A transzverzális vagy T-tubulusok a felszíni membrán betüremkedései, és a terminális ciszternákkal együtt alkotják a harántcsíkolt izom funkcionális egységét, a triádot, melynek 19 alapvető szerepe van az elektromechanikai csatolás folyamataiban. Ennek részletes tárgyalása „A vázizom élettani sajátosságai” című fejezetben található. 3. ábra: A vázizom felépítése (www.mkk.szie.hu nyomán). A képen egy harántcsíkolt izomrost vázlatos rajza látható a fontosabb sejtalkotókkal. Izomfejlődés Az izomfejlődés és –differenciálódás, valamint a sérülést követő izomregeneráció precízen szabályozott, többlépcsős fejlődési folyamat. A mezodermális eredetű mezenhimális sejtek bipoláris vagy orsó alakú monopoláris sejtek, melyek az izom irányú differenciálódás első lépéseként premioblasztokká, izom prekurzor sejtekké alakulnak. A csíralemezek kialakulását és migrációját követően jönnek létre a törzs és a végtagok izomzatának kezdeményei. A migráció során ezek a mezenhimális sejtek intenzív proliferációval jellemezhetők, amivel párhuzamosan létrejönnek a terminális differenciálódás előtt álló mioblasztok. Ezen sejtek fúziójával történik meg a miotubulusok képződése, először primer miotubulusok keletkeznek, majd pedig a primer izomcsövek körül kialakulnak a szekunder miotubulusok [65]. Az izomcsövek további mioblasztokkal fúzionálva növekszenek, majd elkezdődik az izomspecifikus fehérjék szintézise (vékony és vastag filamentumok), a sejtmagok a szarkolemma alá szorulnak és megjelenik az izomrost. Ez a folyamat szigorú genetikai szabályozás alatt áll [66]. A teljesen differenciálódott izomrost szarkolemmájához hozzásimulva, a lamina bazálison belül vannak olyan kevéssé differenciált sejtek, amelyekből az izomrost részlegesen 20 regenerálódhat, ezek az ún. szatellitasejtek. Az izomrostok felszínéhez M-kadherin sejtadhéziós molekulával kapcsolódnak. Ezek a sejtek nyugvó, tartalék mioblasztoknak felelnek meg, és az egész élet során osztódásra képesek maradnak. Megfelelő növekedési faktorok hatására aktiválódhatnak, osztódhatnak és hozzájárulhatnak a sérült izomrost regenerációjához. Azonban ha az endomízium a sérüléskor szétszakad, a károsodott területre fibroblasztok vándorolnak és hegszövet alakul ki [67]. A vázizom élettani sajátosságai A vázizomzat működésének elemi megnyilvánulása az egyes izomrostok kontrakciója, amelynek mind a nagysága, mind pedig a kialakulási sebessége membránpotenciál-függő jelenség. Az izomrost a vázizom elemi egysége, a membránján kialakuló akciós potenciálra a „minden vagy semmi” törvény érvényes. A szarkolemmán keletkező és terjedő akciós potenciál felszálló száráért a tetrodotoxin érzékeny gyors Na+-csatornák aktiválódása, a repolarizációért ugyanezen csatornák feszültségfüggő inaktiválódása, illetve a késői K+- csatornák megnyílása a felelős. A felszíni membrán depolarizálódása és a kontrakció kialakulása között 2-4 ms idő telik el, amit látenciaidőnek hívunk. Ez alatt az idő alatt mennek végbe azon folyamatok, melyeket összefoglaló néven elektromechanikai vagy excitációskontrakciós kapcsolatnak nevezünk. A csatolás első lépése az akciós potenciál terjedése a Ttubulusok membránján az izomrost belsejébe. A T-tubulusok egyik funkcionális jelentősége az, hogy lehetővé teszik a vázizomrost teljes keresztmetszetének közel egyidejű aktiválódását. A T-tubulus membrán depolarizációját követően a Ca2+-ok intracelluláris tárolóhelyekről szabadulnak fel. A terminális ciszternák az izomrost Ca2+-raktárát képzik, bennük a Ca2+ részben szabadon, részben a kalszekvesztrin nevű Ca2+-kötő fehérjéhez kötötten található meg. A felszíni membrán depolarizációját követően a mioplazmában a Ca2+-koncentráció a kontrakció kialakulását megelőzően kezd el növekedni. A szarkolemmán, valamint a Ttubulus membránon végighaladó akciós potenciál a membránban elhelyezkedő dihidropiridinreceptor (DHPR) konformációváltozását okozza, és ez megnyitja a belső Ca2+-raktárként szolgáló szarkoplazmatikus retikulum Ca2+-csatornáját, a rianodinreceptort (RyR). Nyugalomban a mioplazma Ca2+-koncentrációja 100 nM körüli érték, a kontrakció kialakulásához szükséges koncentráció kb. 1 µM. Kifejlett vázizomban az intracelluláris [Ca2+] megemelkedésének forrása csaknem teljesen a sejten belüli Ca2+-raktár. A Ca2+-kiáramlás kezdetén, maga a Ca2+ is aktiválhatja a RyR-t pozitív visszacsatolás révén, ezt a folyamatot, mint arra korábban utaltunk, CICR-nak nevezzük. A kiáramló Ca2+- 21 okat aktív transzportfolyamat juttatja vissza a SR-ba a SERCA pumpa segítségével. Az izomkontrakció alapja a rendezett kontraktilis fehérjék, aktin és a miozin egymás melletti elcsúszása, ezáltal a szarkomerhossz rövidülése. A vázizomrostok aktiválásának eredményeként kétféle kontrakciót különböztethetünk meg: izotóniás és izometriás kontrakciót [68]. Rianodin receptor (RyR) A RyR nélkülözhetetlen szerepet játszik az elektromechanikai csatolás kialakításában. Maga a receptormolekula a SR membránjában található, a molekula legnagyobb része a citoplazma felé néz, és a vázizomban közvetlen kapcsolatba kerül a DHPR-ral. Alegységei homotetramereket képezve hozzák létre az ioncsatornát, melynek tömege kb. 2,2 MDa. A receptornak három típusa ismert, a vázizomra jellemző RyR1, a szívizomban előforduló RyR2 és először az agyban detektált RyR3 [69]. Szarkoplazmatikus retikulum Ca2+ ATP-áz (SERCA) A mioplazmába kijutott Ca2+ visszavétele a SR-be aktív transzportfolyamat révén valósul meg. A „visszavett” Ca2+ nagy része a kalszekvesztrinhez kapcsolódik a terminális ciszternákban, melyhez diffúzióval jut el és ezután ismét alkalmas lesz a következő kontrakció létrehozására. A mioplazmatikus Ca2+ koncentráció mindaddig magas marad, amíg a korábban felszabadult Ca2+ vissza nem jut a SR-be. A SERCA a P típusú ATP-ázok közé tartozik, melyek közös jellemzője, hogy integráns membránfehérjék, foszforilációjuk egy meghatározott aszparaginsav oldalláncon keresztül történik, aminosavsorrendjükben nagyfokú hasonlóságot mutatnak és mindegyik gátolható a foszfát analóg vanadáttal. A SERCA, szemben a plazmamembránkalciumpumpával, nem igényel kalmodulinkötést működéséhez [70]. A SR-Ca2+-pumpa többlépéses konformáció változás által hajtott folyamatban juttat át két Ca2+- t a citoszólból a SR belsejébe az ATP hidrolíziséből származó energia segítségével. A SERCA a nagy affinitású Ca2+-transzportrendszerekhez tartozik (Km ~400 nM), emiatt érzékenyen reagál a citoszól Ca2+-koncentrációjának a megváltozására. A 110 kDa mólsúlyú transzmembrán fehérje a SR longitudinális szakaszán helyezkedik el [71]. A SERCA az emberi szervezetben több izoformában fordul elő. A SERCA1b az újszülött szervezet gyors rostjaiban van túlnyomórészt jelen. A fejlődés során fokozatosan felváltja a SERCA1a, mely a felnőttkorban már a domináns formát jelenti. A SERCA2a a 22 szívizomsejtekben és a lassú típusú vázizomrostokban található, de nagy mennyiségben expresszálódik a neonatális gyors típusú izomrostokban is. A SERCA2b jelentős mennyiségben a simaizmokban expresszálódik, de gyakorlatilag minden sejtféleségben kimutatható. A szervezetben elsősorban nem-izom típusú sejtekben mutatták ki a SERCA3 gén termékét [72,73,74]. A SERCA tercier szerkezetére vonatkoztatott hipotetikus modell alapján 3 fő egység különíthető el (4. ábra A): - Citoplazmatikus fejrész, ami magába foglalja az ATP-kötő, a foszforilációs és az ún. energia transzdukciós domént. - Penta-helikális szár, ami a nagy affinitású Ca2+-kötő részt tartalmazza és biztosítja a kapcsolatot a fejrész és az intramembrán domén között. - Intramembrán régió, melynek feladata a molekula kihorgonyzása a lipid kettősréteghez és a Ca2+ membránon át történő áramlásának a biztosítása. Legalább 10 transzmembrán hélixből áll. A SERCA-nak kétféle konformációs változata van, az E1 és az E2. Az E1 konformáció kristályosítható kalcium vagy lantanida jelenlétében. Az E2 konformáció akkor jelenik meg, ha a kalciummentes közegben vanadát vagy anorganikus foszfát magas koncentrációban van jelen. Az E1 és E2 közötti konformációs átmenetek a fehérjék másodlagos szerkezetében kevés változást eredményeznek, inkább a domének csúszó és forgó mozgása figyelhető meg. Az E1 konformációs állapotú fehérje két Ca2+-t köt meg a SRmembrán citoplazmatikus oldalán. Ezután a fehérje foszforilálódik egy aszpartilgyök béta-karboxil csoportján miközben ATP-t használ fel. A folyamat eredményeként az enzim konformációs állapota megváltozik (E1-E2 átmenet), s ennek következtében a két Ca2+ átjut a membránon és az intraluminális oldalon ledisszociál a fehérjéről. Végül a pumpa defoszforilálódik és magnéziumion segítségével újra felveszi az E1 konformációs állapotot. Megfelelő körülmények között a folyamat megfordítható, ilyenkor két Ca2+ átvitele történik a SR-ból a citoplazmába miközben egy molekula ATP keletkezik (4. ábra B). 23 4. ábra: A SERCA modellje (A) A SR Ca2+ ATP-áz szerkezeti modellje. A citoplazmatikus fejrész magában foglalja az ATP –kötő (N), a foszforilációs (P) és az ún. energia-transzdukciós domént (A), valamint a proteolítikus hasítási helyeket. Az intramembrán régiót legalább 10 transzmembrán hélix alkotja [75]. (B) A SR Ca2+ ATP-áz ciklikus működése [76]. A SERCA nem-kompetitív inhíbitora a tapszigargin (TG), amely nagy affinitással és irreverzibilisen kötődik az enzimhez [77]. A SERCA-t specifikusan blokkolja az Aspergillus fajok által termelt mikotoxin, a ciklopiazonsav (CPA), melynek hatása reverzibilis és affinitása kisebb a TG-nál. A kutatásokban használatosak kevésbé specifikus blokkolók is, mint a 4-aminopiridin (4-AP), a fluorid, a TBQ (2,5-di(tert-butil)-1,4-benzohidrokinon)[78], a vanadát és a CrATP [75]. Az intracelluláris kalcium sejtélettani jelentősége az izomfejlődés során A differenciálódási folyamat során a mioblasztok fúziójával kialakuló primer, majd szekunder miotubulusok izomspecifikus fehérjéket szintetizálnak [79]. Ezen folyamat számos lépése Ca2+-függő [80]. A belső Ca2+-raktárként funkcionáló SR még fejletlen, annak hálózata, integritása csak fokozatosan alakul ki, ezért a miogenezis korai szakaszában az intracelluláris [Ca2+] növekedésének döntő forrása az extracelluláris tér. A belső raktárakból a Ca2+-felszabadulás főleg az IP3 receptorokon keresztül történhet, G-proteinhez kapcsolt foszfolipáz C (PLC) aktiváció következtében. A PLC több izoformájáról leírták már, hogy aktivitásuk elengedhetetlen a differenciációs folyamatok létrejöttében. A külső Ca2+ belépése depolarizáció hatására a feszültség függő „T”- és „L”-típusú Ca2+-csatornákon keresztül történik. A mioblasztokban Ca2+-belépést biztosítanak még a felszíni membránban diffúzan elhelyezkedő nikotin típusú kolinerg receptorok, valamint a szintén Ca2+-permeábilis P2X purinerg receptorok. Az érés és a miotubulussá történő differenciálódás során valósul meg a 24 SR folyamatos szerveződése, megjelenik a Ca2+-indukált Ca2+-felszabadulás. Később, az egyre fejlettebb SR megjelenésével döntő szerep jut az elektromechanikai kapcsolat révén megvalósuló, RyR-on keresztül történő feszültség-indukált Ca2+-felszabadulásnak (VICR) [81]. 25 Célkitűzés Munkánk egyik részében izomtenyészeteken vizsgáltuk az intracelluláris Ca2+- homeosztázist, és az abban szerepet játszó kulcsfehérjék expressziós mintázatát. Munkánk másik részében pedig az Anatómia, Szövetés Fejlődéstani Intézet Sejtés Szövettenyésztő Laboratóriumának munkatársaival együtt a humán eredetű kondroprogenitor sejtek (CPC-k) vizsgálatával foglalkoztunk. Irodalmi adatokból ismert, hogy bizonyos sejttípusoknál – vázizomsejteken és kondrocitákona differenciálódási folyamat előre haladtával intracelluláris Ca2+- szint változások figyelhetők meg [82]. A proliferáció és differenciálódás ideje alatt számos hormon, citokin, valamint különböző gének átíródása befolyásolja a sejtfolyamatokat, de a [Ca2+]i központi szabályozó szereppel bír [83,84]. Napjaink leginkább kutatott területét képezik a mezenhimális őssejtek, amelyek potenciális szerepet játszanak az oszteogenikus, kondrogenikus differenciálódási folyamatokban. A mezenhimális őssejtek porcsejt irányba történő differenciáltatása, és terápiás célra történő alkalmazása az orvostudomány egyik fiatal területét képviselik. A csontvelőből származó őssejtek esetleges transzplantációját már több betegség kapcsán is tanulmányozzák, például a miokardiális infarktuson átesett betegeknél [85,86], az autoimmun megbetegedéseknél [87], és természetesen a krónikus vázizom és kötőszöveti megbetegedésként számon tartott oszteoartritisznél is, amely kutatásunk egyik fő tárgyát képezte. Ez az ízületi károsodással járó autoimmun megbetegedés a hatvan év felettiek 15%-át érinti a nyugati populációban. A betegség kialakulásáért elsősorban a mátrixbontó proteináz enzimek kontrollálatlan termelődése, a proteoglikánok fokozatos elvesztése, az extracelluláris mátrix átalakulása, valamint a porcsejtek túlzott mértékű differenciálódása tehető felelőssé [88]. A gyulladásos folyamatok csak másodlagos tünetként alakulnak ki a betegség során, de jelentős mértékben hozzájárulhatnak a tünetek súlyosbodásához. A porcés izomszöveti területek kóros elváltozásai gyakran egymás kórkövetkezményeként jönnek létre. A fájdalom mozgásra, terhelésre fokozódik, és sántítás alakulhat ki. Előrehaladott esetben, akár mozgáskorlátozottság is létrejöhet. Ezen ismeretek birtokában a céljaink a következőek voltak: 1. A kondrogenikus progenitor sejtek (CPC-k) Ca2+-homeosztázisának részletes megismerése. 2. A belső Ca2+-raktárak funkcionális jellemzése. 3. A Ca2+-tranziensek kialakításáért felelős szignalizációs útvonalak feltérképezése. 32 (GenBank; www.ncbi.nlm.nih.gov) humán nukleotidszekvenciák alapján állítottunk elő (3. táblázat). A primereket Primer Premier 5.0 számítógépes program segítségével (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA) terveztük. 3. táblázat: A specifikus DNS-szakaszok erősítésére használt primer párok nukleotidszekvenciái és a reakciókörülmények. Gén Primer Nukleotid szekvencia (5’→3’) GenBank ID Annelációs hőmérséklet Amplimer mérete (bp) Vázizom differenciálódás Miosztatin sense antisense ACTGGAATCCGATCTCTGAAACTT (665-688) GACCTCTTGGGTGTGTCTGTCAC (897-875) NM_010834 58.0˚C 233 MCIP1.4 sense antisense AAGGAACCTCCAGCTTGGGCT (25-45) CCCTGGTCTCACTTTCGCTG (184-165) NM_019466.3 60.0˚C 160 Háztartási gén-Kontroll GAPDH sense AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGG (99–121) NM_001289726.1 56.0˚C 322 antisense AATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT (420–399) Az egyenként 50 μl össztérfogatú PCR-reakció elegyek a következő összetevőket tartalmazták: 1 μl cDNS, 2 μl forward és reverz primer (0,4 μM), 1 μl dNTP (200 μM), és 5 egység Promega GoTaq® DNS-polimeráz puffer. A kívánt DNS-szakaszok specifikus felerősítéséhez programozható termosztátot használtunk (Thermal Cycler C1000, Bio-Rad, Budapest, Hungary) a következő beállításokkal: 2 perc 95 °C-on a kezdeti denaturációhoz, amelyet ismétlődő ciklusok követnek: 94 °C 1 perc, majd primertől függő (3. táblázat), optimális hőmérsékleten történő anneláció (1 perc), a lánchosszabbítás (elongáció) 72 °C-on történt, 1,5 percig. Az utolsó, 35. ciklus után további lánchosszabbítási lépés következett 72 °C-on, 10 percig. A PCR-mintákat végül 1,5%-os agarózgélen vizsgáltuk. A 10 cm átmérőjű Petri-csészében tenyésztett megfelelő porckultúrákat először szintén jéghideg RN-áz mentes fiziológiás NaCl-oldattal mostuk. Ezt követően TRIzol (Applied Biosystems, Foster City, CA) reagensben a sejtkultúrákat összegyűjtöttük és 20%-os RN-áz mentes kloroform (Sigma-Aldrich) hozzáadását követően a mintákat 10000 g-n, 15 percig, 4 °C-on centrifugáltuk. A totál RNS-t tartalmazó mintákat 500 μl izopropanollal inkubáltuk 1 órán keresztül -20 °C-on, majd újra centrifugálás következett 10000 g mellett, 10 percig, 4 °C-on. A felülúszó leöntését követően a pellethez 1 ml 75%-os etanolt adtunk, majd pedig az előző centrifugálási protokoll megismétlése következett. Végül a cseppmentesre száradt 33 pelletet nukleáz-mentes vízben beoldottuk és felhasználásig -70 °C-on tároltuk. Az így nyert RNS-mintából High Capacity RT kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) felhasználásával cDNS-t készítettünk. A reverz transzkriptáz reakcióhoz használt oldat 1000 ng RNS-t, 0,25 μl RNáz inhibítort, 2 μl random primert, 0,8 μl dNTP Mix-et (4 mM) és 1 μl MultiScribe RT-t tartalmazott 1× RT-pufferben 20 μl reakció végtérfogatban. Az RT elegyet 2 órán keresztül 37 °C-on tartottuk. A specifikus cDNS-szekvenciák amplifikációja olyan primerekkel történt, amelyeket az interneten hozzáférhető (GenBank; www.ncbi.nlm.nih.gov) humán nukleotidszekvenciák alapján állítottunk elő (4. táblázat). A primereket itt is a Primer Premier 5.0 számítógépes program segítségével terveztük. Az amplifikációhoz felhasznált primer párok szekvenciáit a 4. táblázatban foglaltuk össze. 4. táblázat: A specifikus DNS-szakaszok erősítésére használt primer párok nukleotidszekvenciái és a reakciókörülmények. Gén Primer Nukleotid szekvencia (5’→3’) GenBank ID Annelációs hőmérséklet Amplimer mérete (bp) P2Y Metabotróp purinerg receptorok P2RY5 sense antisense TAC CCA TTT AAG TCA AAG AC (358–377) TTA GCA CCA TAC TAG AAC AAG (625–605) BC070295 50.0˚C 268 P2RY8 sense antisense CAG CGT GTT GCC TTT CCA (219–236) TGC ACC GGG TAG GTG AGA T (503–485) NM_178129 60.0˚C 285 P2RY9 (LPAR4) sense antisense GGG TTT ATC ATT CCT CTA (634–651) CAC AAG GTG ATT GGG TA (893–877) NM_005296 49.0˚C 260 P2RY10 sense antisense TTG GTC GGG ATG ATT AC (583–599) CAA CGG GAC AAC TGC TA (838–822) NM_198333 52.0˚C 256 P2RY12 sense antisense AGT TCG GTC TAG TCT GGC (542–559) TTT GGC TCA GGG TGT AA (790–774) NM_176876 54.0˚C 249 P2RY13 sense antisense TTC CCA GCC CTC TAC AC (139–155) AGC CCT AAC AGC ACG AT (407–391) NM_176894 56.5˚C 269 P2RY14 sense antisense TCT GCC GTG CTC TTC TA (289–305) CCT CCC TAA CAC TCT GGT (499–482) NM_001081455 56.0˚C 211 Háztartási gén-Kontroll GAPDH sense antisense CCA GAA GAC TGT GGA TGG CC (726–745) CTG TAG CCA AAT TC GTT GTC (1136–1117) NM_002046.4 54.0˚C 411 Az egyenként 25 μl össztérfogatú PCR-reakció elegyek a következő összetevőket tartalmazták: 1 μl forward és reverz primer (10 μM), 0,5 μl cDNS, 0,5 μl dNTP Mix (200 μM) 34 és 1 egység (0,2 μl) Promega GoTaq® 1x DNS-polimeráz puffer. A kívánt DNS-szakaszok specifikus felerősítéséhez programozható termosztátot használtunk (Labnet MultiGene 96well Gradient Thermal Cycler, Labnet International, Edison, NJ, USA) a következő beállításokkal: 2 perc 95 °C-on a kezdeti denaturációhoz, amelyet ismétlődő ciklusok követnek: 94 °C 30 s, majd primertől függő (4. táblázat), optimális hőmérsékleten történő anneláció (45 s), majd lánchosszabbítás (elongáció) 72 °C-on, 1,5 percig. Az utolsó, 35. ciklus után további lánchosszabbítási lépés következett 72 °C-on, 7 percig. A PCR-mintákat végül 1,2%-os agarózgélen vizsgáltuk. Fehérjeminták készítése A tenyészeteket jéghideg PBS-sel mostuk le, majd homogenizációs pufferben (összetevői: 20 mM Tris-Cl, 5 mM EGTA, 1 mM 4-(2-aminoetil) benzoszulfonil fluorid, 20 µM leupeptin, pH 7,4; Sigma Aldrich) gyűjtöttük össze. A mintákat folyékony nitrogénes gyorsfagyasztás után a felhasználásig -70 ºC-on tároltuk. A minták feltárását jégen, 5-ször 1010 másodpercig történő szonikálással végeztük (Branson Sonifier, Danbury, USA). A minták fehérjekoncentrációját módosított BCA (bicinchoninic acid) protein assay-vel (Pierce, Rockford, IL, USA) határoztuk meg, melynek során BSA-t használtunk standardként. Western-blot analízis A fehérjekimutatáshoz teljes sejtlizátumot használtunk mindkét sejttípus esetében. A vázizomtenyészetből származó mintákat, szonikálást követően 1/5 térfogatú, ötszörös töménységű elektroforézis mintapuffer (310 mM Tris-HCl, pH 6,8; 10% SDS, 50% glicerol, 100 mM DTT, 0,01% brómfenolkék) hozzáadásával kezeltük, és 5 percig 80 ºC-on főztük. Az immunológiai detektálásához 30 μg fehérjét szeparáltunk 7,5% SDS-PAGE gélben. A fehérjéket nitrocellulóz membránra transzferáltuk (BioRad, Bécs, Ausztria). A membránokat PBS-ben oldott sovány tejpor 5%-os oldatával blokkoltuk, majd egy éjszakán át primer antitestekkel (4 °C-on) inkubáltuk. Háromszor 10 perc PBST-s (0,1% Tween 20-szal kiegészített PBS) mosás után a membránokat szekunder antitestekkel, torma peroxidázzal (HRP) konjugált IgG-vel (Bio-Rad) inkubáltuk, 1:1000 hígításban, 5%-os tejporos PBS oldatban hígítva, 1 órán át (5. táblázat). A jeleket kemilumineszcenciás reakcióval, az intézetünkben rendelkezésünkre álló Gel Logic 1500 előhívó rendszerrel detektáltuk. 35 5. táblázat: A Western-blot analízis során használt elsődleges és másodlagos antitestek vázizomtenyészetből származó minták esetében. Kimutatandó fehérje Elsődleges antitest Másodlagos antitest MyoD monoklonális anti-MyoD 1:200 Santa Cruz anti-egér IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft. p-Akt monoklonális anti-p-Akt 1:1000 Cell Signaling anti-egér IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft. SERCA1b monoklonális anti-SERCA1b 1:800 Szegedi Tudományegyetem (Zádor Ernő) anti-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft. SERCA1 monoklonális anti-SERCA1 1:1000 Thermo Scientific anti-egér IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft SERCA2a monoklonális anti-SERCA2a 1:20000 University of Rotterdam (F. Wuytack) anti-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft. Kalcineurin (PP2B) poliklonális anti-Pan-Kalcineurin 1:1000 Cell Signaling anti-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft. Kalszekvesztrin poliklonális anti-kalszekvesztrin 1:1000 Thermo Scientific anti-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft. STIM1 monoklonális anti-STIM1 1:500 BD Laboratories anti-egér IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft Aktin poliklonális anti-aktin 1:500 Santa Cruz anti-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft. A porcsejtekből származó minták esetében a teljes sejtlizátumot 2000 g mellett, 10 percig centrifugáltuk szobahőmérsékleten, majd a sejtpelletet 100 μl RIPA pufferrel (Radio Immuno Precipitation Assay) szuszpendáltuk (150 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% sodium deoxycholate, 50 mM Tris, 0,1% sodium dodecyl sulphate (SDS; pH 8,0), proteáz inhibítorok: aprotinin (10 µg mL-1), 5 mM benzamidine, leupeptin (10 µg mL-1), trypsin inhibítor (10 µg mL-1), valamint 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 8 mM Na-fluoride, 1 mM Na-orthovanadate). A szonikálást követően a mintákat szintén 1/5 térfogatú, ötszörös töménységű elektroforézis mintapuffer hozzáadásával kezeltük, és 5 percig 95 ºC-on főztük. Az immunológiai detektálásához 50 μg fehérjét szeparáltunk 7,5% SDSPAGE gélben (6. táblázat). A továbbiakban ugyanúgy jártunk el, mint a vázizomtenyészetből származó minták esetében. 36 6. táblázat: A Western-blot analízis során használt elsődleges és másodlagos antitestek porctenyészetből származó minta esetében. Kimutatandó fehérje Elsődleges antitest Másodlagos antitest STIM1 monoklonális anti-STIM1 1:500 BD Laboratories anti-egér IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft. Orai1 poliklonális anti-Orai1 1:100 Sigma-Aldrich anti-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft. IP3RI poliklonális anti-IP3RI 1:200 Santa Cruz anti-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft. IP3RII poliklonális anti-IP3RII 1:200 Santa Cruz anti-kecske IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft. IP3RIII monoklonális anti-IP3RIII 1:2000 BD Laboratories anti-egér IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft. P2X1 poliklonális anti-P2X1 1:100 Alomone Labs anti-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft. P2X4 poliklonális anti-P2X4 1:100 Alomone Labs anti-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft. P2X5 poliklonális anti-P2X5 1:200 Santa Cruz anti-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft. P2X6 poliklonális anti-P2X6 1:200 Santa Cruz anti-kecske IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft. P2X7 poliklonális anti-P2X7 1:100 Alomone Labs anti-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft. P2Y1 poliklonális anti-P2Y1 1:100 Sigma-Aldrich anti-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft. P2Y2 poliklonális P2Y2 1:200 Alomone Labs anti-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft. P2Y4 poliklonális P2Y4 1:200 Santa Cruz anti-kecske IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft. P2Y6 poliklonális P2Y6 1:200 Santa Cruz anti-kecske IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft. Aktin poliklonális anti-aktin 1:200 Santa Cruz anti-nyúl IgG 1:1000 Bio-Rad Hungary Kft. Egyedi sejteken történő fluoreszcens intracelluláris [Ca2+]-mérés A CPC sejttenyészetek, valamint a vázizomtenyészetek (C1 klón, C5 klón, Scr és kontroll sejtek) sejtjeinek intracelluláris [Ca2+]-változásait Fura-2-AM fluoreszcens Ca2+-kötő festék segítségével mértük. A mérés alapelve, hogy a Ca2+-t kötött festék abszorpciós maximuma (380 nm) eltér a Ca2+-t nem kötött festékétől (340 nm), így a két hullámhosszon történő gerjesztést követően emittált fluoreszcens fény intenzitásának hányadosából meghatározható az intracelluláris [Ca2+]. A méréshez a CPC sejttenyészeteket és a 37 vázizomtenyészeteket azonos módon készítettük elő. A sejteket 30 mm-es üveg fedőlemezen tenyésztettük. A feltöltéshez Fura 2-AM festék 10 µM-os törzsoldatából 10 μl végkoncentrációt alkalmaztunk, a festék acetoximetilészter formája biztosítja a sejtmembránon keresztüli festékfelvételt. A 2 ml inkubációs tápoldatot – mely megegyezik a sejtek tenyésztő tápoldatával – további 4 μl, 150 nM-os neostigminnel egészítettük ki, az esetlegesen jelenlevő extracelluláris acetilkolin-észteráz gátlása céljából. A feltöltést 37 ºCon, termosztátban, 90 percen át végeztük. A feltöltött sejteket egy invertáló fluoreszcens mikroszkóp állványára helyeztük, majd 40 x-es olajimmerziós objektív segítségével végeztük a további vizsgálatokat. A sejtekbe juttatott festék 340 és 380 nm hullámhosszúságok között váltakozó gerjesztését a Photon Technology International (PTI) Delta ScanTM kettős monokromátoros berendezése biztosította (7. ábra). Fényforrásként a rendszer xenonlámpája szolgált, melynek fényét egy forgótükrös sugárosztó két nyalábra osztja. A keletkező sugarak külön-külön monokromátoron haladtak át, melyek eredménye a méréseinkhez szükséges 340 és 380 nm hullámhosszúságú fénynyaláb. A monokromátorokból optikai szálak vezetik a fényt egy csatoló egységen, valamint egy dikroikus tükrön keresztül a mikroszkóp tárgyasztalán elhelyezett sejtekre. A Fura-2 által kibocsátott fluoreszcens fényt 510 nm-en, interferenciaszűrő közbeiktatásával, egy fotoelektron-sokszorozó (PMT) segítségével detektáltuk. A jeleket 10 Hz gyakorisággal regisztráltuk. A háttérfluoreszcenciát a tárgylemezek sejtmentes helyein mértük, ezt a program automatikusan levonta a mért fluoreszcenciaértékekből. A méréseket szobahőmérsékleten végeztük. 38 7. ábra: A PTI mérőrendszer felépítése. A sejtekben lévő Ca2+-érzékeny festéket 340 és 380 nm hullámhosszon gerjesztjük, majd az emissziót 510 nm-en detektálva, a hányadosukból az intracelluláris Ca2+- koncentráció kiszámítható. A két hullámhosszon történő gerjesztés során mért fluoreszcenciaértékek hányadosából (R=F340/F380) az alábbi egyenlet alapján kiszámítható az intracelluláris [Ca2+]: [Ca2+]i=KD∙β∙(R-Rmin)/(Rmax-R), (1.) ahol KD a festék disszociációs állandója, Rmax az a fluoreszcencia hányados, ahol a festék Ca2+-mal telített, Rmin az a fluoreszcenciahányados, ahol a festék egyáltalán nem köt Ca2+-ot, R a mért fluoreszcenciaértékek hányadosa, β a rendszerre jellemző állandó. A kísérleti körülmények (oldatok) az 1-4 napos CPC sejttenyészetek, valamint a vázizomtenyészetek esetén különbözőek voltak. Vázizomtenyészetek esetén az intracelluláris [Ca2+]-t valamint a sejtek válaszaiként megjelenő Ca2+-tranzienseket normál Tyrode-oldatban (137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 11,8 mM HEPES, 1 g/L glükóz, pH 7,4) és Ca2+-mentes Tyrodeoldatban vizsgáltuk. Utóbbi esetben a CaCl2 elhagyása mellett az oldat 5 mM EGTA-t tartalmazott. Depolarizáló hatású oldatként 120 mM koncentrációjú KCl-t tartalmazó oldatot alkalmaztunk, melyet normál Tyrode-oldatból készítettünk azonos mennyiségű NaCl 39 elhagyásával. Az oldatok adagolásához lokális perfúziós rendszert használtunk (Valve Bank™ 8 version 2.0, AutoMate Scientific, USA), a vizsgált anyagok oldatát egy vékony lokál-perfúziós tű (belső átmérő: 250 μm, áramlási sebesség: 1,5 μL/s, Perfusion Pencil™, AutoMate Scientific) segítségével juttattuk a mérni kívánt sejtek közvetlen közelébe. A mérési eredményeket egy a Debreceni Egyetem Élettani Intézetében kifejlesztett program segítségével értékeltük ki. CPC sejttenyészetek esetében a méréseket normál Tyrodevagy Ca2+-mentes Tyrodeoldatban végeztük. Az aspecifikus IP3R inhibítort, a 2-aminoethoxidifenil borátot (2-APB) Ca2+-mentes Tyrode-oldatban 75 μM végkoncentrációban (törzsoldat: 1M, DMSO-ban); a nem specifikus TRPC antagonistát, a YM-58483-t 1 μM végkoncentrációban (törzsoldat: 1 mM, DMSO-ban); az aspecifikus Ca2+-csatorna blokkoló LaCl3 –t pedig 500 μM végkoncentrációban (törzsoldat: 300 mM, DMSO-ban) normál Tyrode-oldatban oldottuk be. A normál Tyrode-ból készített koffein-oldatot (30 mM) a RyR stimulálására, valamint a P1 adenozin receptor antagonizálására használtuk. A szarkoplazmatikus/endoplazmatikus retikulum Ca2+-ATP-áz (SERCA) inhibítora a ciklopiazon sav (CPA; 10 μM) Ca2+-mentes Tyrode-oldatban került alkalmazásra (törzs: 10 µM, DMSO-ban). Az általánosan használt P2X és P2Y purinerg receptor agonista ATP-t (180 μM) normál és Ca2+-mentes Tyrodeoldatban is beoldottuk, hasonlóan a P2Y purinerg receptor agonistához (ADP, UTP, UDP; mindegyik 100 μM végkoncentrációjú). A Ca2+-mentes ATP, ADP, UDP és UTP alkalmazását megelőzően a sejtekre 150 másodpercig adagoltunk Ca2+-mentes Tyrodeoldatot. Az aspecifikus, P2X és P2Y purinerg receptorok inhibítoraként ismert suraminoldatot normál Tyrode-oldatból készítettük 10 μM végkoncentrációban. A Ca2+-mentes ATP adagolást megelőzően a sejteket 150 másodpercig Ca2+-mentes Tyrode-oldatban tartottuk. A P1 receptor agonistájaként ismert adenozint 100 μM végkoncentrációban, normál Tyrodeoldatban használtuk. Az [Ca2+]i és a Ca2+-pumpa aktivitásának analizálása Az [Ca2+]i számítását a fluoreszcencia intenzitás hányadosából (R=F340/F380), az (1.) egyenlet segítségével in vivo kalibráltuk. A kalibráció során kapott értékek a következők voltak: Rmin=0.2045, Rmax=8.315, Kd×β=1183 nM. A Ca2+-pumpa aktivitását és a Ca2+- fluxust, az intracelluláris kötőhelyek Ca2+-kötését, valamint az intracelluláris térből történő Ca2+-eltávolítást munkacsoportunk korábban publikált közleményei alapján határoztuk meg [47,92]. A Ca2+-kötődés mértékének meghatározásánál figyelembe vettük a SERCA-pumpa, a troponin C, a parvalbumin és a festék által megkötött Ca2+-t, valamint annak eltávolítását is. A 40 Ca2+-pumpa maximális transzportkapacitása (PVmax) a Ca2+-tranziensek leszálló szárára illesztett görbéből határozható meg, az intézetünk által kifejlesztett, a legkisebb négyzetek módszerét alapul vevő számítógépes program segítségével. A modell többi paraméterét állandóként kezeltük az irodalomból vett adatokat felhasználva [93]. A sejtproliferáció és differenciáció vizsgálata A C2C12 sejteket 3 cm átmérőjű műanyag Petri-csészékben tenyésztettük, és a tenyésztés 1. napjától az 5. napig felvételeket készítettünk, a fázis kontraszt mikroszkóphoz csatlakoztatott fényképezőgép segítségével (Canon EOS-300D, Japan). A nem transzfektált sejtek mellett a SERCA1b shRNS-el transzfektált sejteket (C1, C5, Scr) is nyomon követtük, kontroll és ciklosporinnal (CSA) kezelt körülmények között egyaránt. A 200 nM-os CSA oldattal minden 2. nap kezeltük a sejteket. A tenyésztés minden egyes napján képeket készítettünk a tenyésztőedények (kezelt és kontroll) 5-5 véletlenszerűen kiválasztott látóteréről. A DAPI-val megfestett sejtmagokat manuálisan körberajzoltuk, majd kvantitatív analízisnek vetettük alá őket. A sejtproliferációt a sejtmagok számából határoztuk meg úgy, hogy minden sejttípus sejtmagszámát (C1, C5, Scr, kontroll) a saját 24 órás sejtmagszámára normalizáltuk. A differenciált miotubulusok kvantitatív paramétereit 20-20 random látótérből, 3 független kísérlet eredményeiből állapítottuk meg (40×olajimmerziós objektív, LSM 510 META, Zeiss). A miotubulusok átmérőjét Image Browser (Zeiss, Oberkochen, Németország) segítségével értékeltük ki. Kalcineurin-enzimaktivitás mérése Az in vitro kalcineurin-enzimaktivitás (CaN) méréséhez 10 cm átmérőjű műanyag Petri-csészében tenyésztettük a sejteket, majd fiziológiás sóoldatos mosást követően összegyűjtöttük a mintát. Centrifugálást követően a sejtpelletet, 100 µl RIPA -pufferben (150 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% nátrium-deoxikolát, 50 mM Tris, pH 8,0) homogenizáltuk, amely tartalmazott még proteáz-inhibítorokat is (aprotinin (10 ug/mL), benzamidin (5 mM), leupeptin (10 µg/mL), tripszin inhibítor (10 µg/mL), PMSF (1 mM), EDTA (5 mM), EGTA (1 mM), Na-fluorid (8 mM), Na-ortovanadát (1 mM)). A szonikálását követően (Cole-Parmer, Illinois, USA) a mintákat centrifugáltuk (10000 g, 10 perc, 4°C), s a felülúszó fehérje koncentrációjának meghatározását (BCA) követően végeztük az enzimaktivitás mérést. A kalcineurin aktivitás detektálásához RII foszfopeptid szubsztrátot adtunk a mintákhoz, és meghatároztuk a felszabaduló PO43mennyiségét malachite green kolorimetriás assay segítségével (Abcam, Cambridge, UK). Az assay útmutatóját követve minden mérési 41 csoportban 6 db tenyészetet használtunk fel, 2 független kísérleti sorozatban. A detektálást 650 nm-en végeztük Multifunctional plate reader (Chameleon Hidex, Turku Finland) segítségével. Statisztikai analízis Minden értéket az átlag ± az átlagok standard hibája (SE) formában adtunk meg. A statisztikai szignifikanciát Student-féle t-próbával számoltuk, p<0,05 értékeket tekintve szignifikánsnak. Az eredményeink legalább 2 független kísérlet eredményeit tükrözik (az esetek döntő többségében 3 független kísérlet). 48 amplitúdójú (338 ±29 nM, n=44 sejt a 48-ból, 91%) Ca2+-tranzienst sikerült detektálnunk normál Tyrode-oldatban, melyet újabb ATP adagolása mellett ismételten tudtunk detektálni (4. táblázat, 12. ábra A). A tranziensek átlagos időtartamát az időbeli félértékszélességgel (FTHM, full time at half maximum) jellemeztük, ami 16,1 ±2,6 s-nak adódott. Ahhoz, hogy bizonyítani tudjuk a P2X és P2Y receptorok funkcionális szerepét, nem-specifikus P2 receptor antagonistát, suramint (10 μM) alkalmaztunk. Suramin adagolására a Ca2+- tranziensek jellemző paraméterei nem változtak a csak ATP adagolása mellett rögzített adatsorhoz képest, sem normál, sem pedig Ca2+-mentes Tyrode-oldatban regisztrált adatsorokban (12. ábra B, D, E), ami arra utal, hogy a Ca2+-oszcillációk kialakulásáért a főbb suramin-inszenzitív P2 purinerg receptorok (P2X4, P2X6 és/vagy P2Y4) a felelősek. A kísérletet Ca2+-mentes körülmények között megismételve a repetitív tranziensek ugyanúgy detektálhatóak voltak, de a kontrollhoz képest szignifikánsan kisebb amplitúdóval (205 ±25 nM, n=35; 12. ábra D). Ugyancsak szignifikáns különbséget tapasztaltunk a felszálló szár meredekségében is, a kontroll és Ca2+-mentes körülmények között regisztrált adatsorban (72,9 ± 12,6 nM ·s-1 vs. 35,4 ± 8,8 nM ·s-1, p<0,05; 12. ábra E). Ugyanakkor nem találtunk jelentős különbséget a tranziensek időtartama között a két mérési adatsorban (20,6 ±3,1 s; p=0,29). A fent említett eredmények azt sugallják, hogy mind az ionotróp P2X, mind pedig a metabotróp P2Y purinerg receptorok és/vagy a SOCE hozzájárulnak a spontán Ca2+-oszcilláció kialakulásához. Azonban, amikor az IP3-receptor inhibítorát, a 2-APB-t az ATP-vel együtt adagoltuk a sejtekre, tranzienst csak néhány esetben sikerült detektálnunk (n=2 a 19 sejtből, 10%; 12. ábra C), ezért úgy gondoljuk, hogy a tranziensek létrejötte leginkább a metabotróp P2Y receptor aktivitásából adódik, vagy a 2-APB aspecifikusan gátolja a Ca2+-belépést. 49 12. ábra: A P2 purinerg receptorok funkcionális karakterizálása. (A) ATP adagolására bekövetkező Ca2+- tranziensek reprezentatív ábrája. (B) A P2 receptor nem-specifikus antagonistájának, a suraminnak (10 µM) hatása az ATP-vel kiváltott Ca2+-tranziensekre Ca2+-mentes Tyrode-oldatban. (C) Normál Tyrode-oldatban mért Ca2+-tranziens ATP és az aspecifikus IP3R blokkoló 2-APB jelenlétében. (D) Az ATP hatására kialakult Ca2+- tranziensek amplitúdóinak értéke normál és Ca2+-mentes Tyrode-oldatban. Kontrollnak a suramin adagolása előtti Ca2+-tranzienst tekintettük. (E) Az ATP-vel kiváltott Ca2+-tranziensek felszálló szárának meredeksége normál és Ca2+-mentes Tyrode-oldatban. Kontrollként a suramin adagolása előtti Ca2+-tranzienseket használtuk. A zárójelekben feltüntetett számok a vizsgált sejtek számát jelzik. A csillag (*) a normál és Ca2+-mentes Tyrodeoldatban regisztrált tranziensek közötti szignifikáns (p<0,05) különbséget mutatja. 0200 400 600 800 0 100 200 300 400 500 0200 400 600 800 0 100 200 300 400 500 0100 200 300 0 100 200 300 400 500 A ATP C B ATP ATP [Ca2+]i(nM) idő (s) ATP 2-APB ATP ATP ATP ATP suramin [Ca2+]i(nM) idő (s) [Ca2+]i(nM) idő (s) 1,8 mM [Ca2+]e0 mM [Ca2+]e 1,8 mM [Ca2+]e 0 100 200 300 400 500 600 D(9)(7) * ∆[Ca2+]i(nM) * (7) (9) 0 20 40 60 80 100 120 140 Felszálló szár meredeksége (nM .s–1) * (9)(7) E (7) (9) ATP (1.8 mM [Ca2+]e) suramin+ATP (1.8 mM [Ca2+]e) ATP (0 mM [Ca2+]e) suramin+ATP (0 mM [Ca2+]e) 50 A kondroprogenitor sejtek Ca2+-homeosztázisában kulcsszerepet játszó P2Y receptorok szerepének további, precízebb felderítésére a következő kísérleteket végeztük el. Különböző P2Y receptor agonistákat alkalmaztunk a Ca2+-mérések során (7. táblázat). Az UTP (P2Y2 és P2Y4 agonista, 100 μM; 13. ábra A) és az ADP (P2Y1, P2Y12 és P2Y13 agonista, 100 μM; 13. ábra B) adagolása nagy Ca2+-tranzienseket váltott ki (325 ±21 nM és 284 ±25 nM) a detektált sejtek többségében (n=13 a 15 sejtből és n=18 a 20 sejtből; 13. ábra E), míg az UDP (P2Y6 agonista, 100 μM) alkalmazása mellett semmilyen [Ca2+]i változást nem tudtunk detektálni (n=0 a 11 sejtből; 13. ábra C). A P1 adenozin receptorok funkcionális szerepét adenozin (100 μM) adagolásával vizsgáltuk meg. Eredményeink szerint a legtöbb sejtben létrejött Ca2+-tranziens (n=16 a 18 sejtből; 13. ábra D), melyek amplitúdójának átlagos értéke 259 ±27 nM volt. A P1 receptor blokkoló koffein (30 mM) adenozinnal történő egyidejű alkalmazása mellett azonban az intracelluláris kalciumkoncentrációra kifejtett hatás elmaradt (10 sejtből egy sem válaszolt). Ezekből az eredményekből arra következtettünk, hogy a P1 receptornak, valamint a P2Y receptoroknak kitüntetett szerepük van a Ca2+- tranziensek létrejöttében. A mérésekből született fontosabb adatokat a 7. táblázat foglalja össze. 7. táblázat: Nyugalmi ([Ca2+]i,min) és maximális ([Ca2+]i,max) Ca2+-koncentráció érték, amplitúdó és időbeli félértékszélesség értékek (FTHM) agonista stimuláció hatására (ATP, ADP, UDP, UTP, Adenozin). A p érték az ATP adagolása következtében kialakult, normál és Ca2+-mentes Tyrode-oldatban regisztrált tranziensek közti különbséget mutatja. Az adatok az átlagokat ± az átlagok standard hibáját (SEM) mutatják. [Ca2+]i,min (nM) [Ca2+]i,max (nM) Amplitúdó (nM) FTHM (s) ATP, 180 μM ([Ca2+]e=1,8 mM), n=44 121,19 ± 3,47 452,80 ± 28,93 338,19 ± 28,56 16,11 ± 2,63 ATP, 180 μM ([Ca2+]e=0 mM), n=35 97,02 ± 4,20 301,68 ± 27,03 204,65 ± 25,03 20,63 ± 3,09 p 2,8*10-7 0,0002 0,0009 0,29 ADP, 100 μM ([Ca2+]e=1,8 mM), n=18 112,04 ± 3,12 396,11 ± 24,85 284,07 ± 25,02 24,13 ± 2,47 UTP, 100 μM ([Ca2+]e=1,8 mM), n=13 98,24 ± 3,86 422,83 ± 23,19 324,58 ± 20,50 23,03 ± 2,59 Ade, 100 μM ([Ca2+]e=1,8 mM), n=16 119,56 ± 11,5 378,06 ± 34,60 258,49 ± 26,71 23,04 ± 3,15 51 13. ábra: P1 és P2Y receptorok funkcionális karakterizálása. (A) UTP adagolását követően kialakult Ca2+- tranziens reprezentatív ábrája. A méréseket minden esetben normál Tyrode-oldatban végeztük. (B) Ismételt ADP (100 µM) adagolására kialakult Ca2+-tranziensek reprezentatív ábrája. (C) 100 µM UDP hatása az intracelluláris Ca2+-szintre. (D) Adenozin hatására kialakult Ca2+-tranziens, amely bizonyítja az A1 receptorok funkcionális szerepét a porcsejtekben. (E) Átlagos amplitúdó értéket mutató összesített eredmények. Az adatok az átlagokat ± az átlagok standard hibáját (SEM) mutatják. A zárójelekben feltüntetett számok a vizsgált sejtek számát jelzik. 050 100 150 200 0 100 200 300 400 500 C [Ca2+]i(nM) idő (s) ADP 1,8 mM [Ca2+]e UDP 050 100 150 200 0 100 200 300 400 500 A1,8 mM [Ca2+]e UTP [Ca2+]i(nM) idő (s) 0100 200 300 400 500 0 100 200 300 400 500 B ADP ADP ADP [Ca2+]i(nM) idő (s) 1,8 mM [Ca2+]e 0 100 200 300 ADP UTP Adenozin ∆[Ca2+]i(nM) (18) (13) (16) E 050 100 150 200 0 100 200 300 400 500 D Adenozin 1,8 mM [Ca2+]e [Ca2+]i(nM) idő (s) 52 Az ATP szerepének vizsgálata a spontán Ca2+-oszcillációk kialakulásában Ahogy azt már korábban említettem, a humán MSC-kben az autokrin/parakrin purinerg szignalizációs hurok felelős a Ca2+-oszcillációk kialakulásáért, ezért szerettük volna megvizsgálni, hogy a purinerg receptorok miként játszanak szerepet az ismétlődő Ca2+- tranziensek kialakulásában. Ennek kiderítésére ekto-ATP-difoszfohidrolázt alkalmaztunk, amely ADP-áz vagy apiráz néven is ismert, egy plazmamembránhoz kötött enzim, mely defoszforilálja az extracelluláris adenozin 5’-trifoszfátot (ATP) és adenozin 5’-difoszfátot (ADP), adenozin 5-monofoszfáttá (AMP). Ezt az enzimet korábban CD39 néven azonosították, a B-limfocitákon található aktivációs marker alapján [95]. Magát az enzimet 5 U·mL-1 koncentrációban alkalmaztuk az egyedi sejten történő Ca2+-mérés ideje alatt. Apiráz jelenlétében nem alakult ki ismétlődő Ca2+-tranziens (n=5), amiből arra következtettünk, hogy az extracelluláris ATP jelenléte elengedhetetlen a spontán Ca2+-oszcillációk kialakulásában. 53 Eredmények II.-Vázizomszövet C2C12 sejttenyészetek, transzfekció Irodalmi adatokból ismert, hogy a SR Ca2+-pumpájának neonatális izoformája -a SERCA1bmeghatározó szerepet tölt be a miotubulusok és a fiatal állatok vázizmának Ca2+- homeosztázisában [96,97]. Kísérleteink ezen részében ezért célul tűztük ki, hogy megvizsgáljuk a SERCA1b pumpa géncsendesítésének esetleges hatásait. A kísérletek kivitelezéséhez C2C12 egér eredetű vázizomsejteket használtunk, és olyan expressziós vektort terveztünk, amely tartalmazza a SERCA1b elleni specifikus shRNS szekvenciát (pLKO.1-puro-CMV-tGFP). A sejttenyészeteken liposzóma mediált transzfekciót alkalmaztunk. A transzfekciós hatékonyságot a SERCA1b fehérjére specifikusan tervezett antitesttel ellenőriztük, Western-blot technika segítségével. A 14. ábra szemlélteti, hogy 6 klónból négyben sikerült a fehérje expresszióját csökkentenünk (C1, C3, C4 és C5 klón). 14. ábra: A csökkent SERCA1b fehérje expresszió vizsgálata C2C12 miotubulusokban. (A-B) A SERCA fehérje expressziójának vizsgálata SERCA1b-specifikus shRNS-el transzfektált sejtekben Western-blot technika segítségével. A stabil transzfekciót követően 6 klónt vizsgáltunk, valamint a scrambled és pool tenyészetet. A 115 kDa-os izoformát kétféle antitesttel detektáltuk: az egyik kizárólag csak a SERCA1b izoformát ismeri fel (A), a másik pedig mind a SERCA1a és mind az 1b izoformákat (B). Kontrollként aktint használtunk. Bár az irodalomból ismert, hogy C2C12 vázizomsejtekben csak a SERCA1b expresszálódik [97], ennek alátámasztása érdekében ugyanezen mintákban a SERCA fehérje kimutatását megismételtük olyan antitesttel, amely felismeri a SERCA1a (felnőtt szarkoplazmatikus retikulum Ca2+-ATP-áz izoforma) és 1b szekvenciákat is (14. ábra B). A két kísérletben hasonló eredményt kaptunk, azaz a 6 klónból négyben jelentősen csökkent a fehérje expressziója a géncsendesítést követően. A Western-blot eredmények kvantitatív elemzését követően olyan klónokat kerestünk, amelyekben a SERCA1b fehérje expressziója teljesen vagy csak részben csökkent. Így esett a választás az 1. klónra (C1), ahol szinte teljes mértékben csökkent az expresszió, és az 5. klónra (C5), ahol csak részben sikerült lecsökkentenünk a SERCA1b fehérje Std C1 C3 C4 C5 C6 C7 pool Scr Aktin SERCA1b 115 kDa 130 kDa 100 kDa 70 kDa 55 kDa 35 kDa Aktin SERCA1ab 115 kDa 130 kDa 100 kDa 70 kDa 55 kDa 35 kDa Std C1 C3 C4 C5 C6 C7 pool Scr B A 54 expresszióját (14. ábra A). A scrambled sejtekhez viszonyított optikai denzitás mértéke az 1. klónban 6,6±0,8%, az 5. klónban pedig 14,7±1,9% volt (15. ábra). Ezeken a klónokon puromycines szelekciót hajtottunk végre és az így létrejött stabil klónokat használtuk a scrambled és kontroll sejtek mellett a további kísérletekhez. Minden kísérlethez kizárólag csak terminálisan differenciálódott miotubulusokat használtunk fel. 15. ábra: A stabilan transzfektált klónok denzitometriás analízise. Az optikai denzitás mértékét a scrambled sejtekhez viszonyítottuk. A hét klónból kettő került kiválasztásra (C1, C5). Ahogy az az ábrán is jól látható, a C1 sejtekben szinte teljes mértékben csökkent a SERCA1b expresszió, míg a C5 sejtekben csak részben. A vázizom Ca2+-homeosztázisában és differenciálódásában résztvevő fehérjék expressziós mintázatainak alakulása a csökkent SERCA1b fehérjeszint hatására Következő kísérletsorozatunkban megvizsgáltuk azon fehérjék expressziós szintjének a változását, amelyek fontos szerepet játszanak a vázizom Ca2+-homeosztázisában és differenciálódásban. Vizsgáltuk a kalszekvesztrin (CSQ), a sztrómális interakciós molekula1 (STIM1), a miogenikus transzkripciós faktor (MyoD), a kalcineurin (CaN), a dihidropiridin receptor (DHPR), valamint a SERCA2a expressziós szintjének alakulását a SERCA1b géncsendesítést követően. A CSQ a legfontosabb Ca2+-kötő fehérje a SR-ban, a STIM1 fehérje pedig a SOCE kalcium szenzora a SR-ban. Eredményeink azt mutatják, hogy a CSQ expressziós szintje az 1. klónban csökkent az 5. klón, a scrambled és kontroll mintákhoz viszonyítva (16. ábra A). A STIM1 expressziós szintje hasonlóan alakult a CSQ-hez, az 1. klónban csökkent expressziót figyelhetünk meg, míg a Scr és C5 sejtekben csak nagyon kis mértékű a csökkenés (16. ábra A). 0 10 20 30 40 50 60 70 Intenzitás (Scrambledhez viszonyított %) C1 C3 C4 C5 C6 C7 pool SERCA1b 55 16. ábra: A Ca2+-homeosztázisban és differenciálódásban résztvevő fehérjék expressziós mintázata és denzitometriás analízisük. (A) A SR Ca2+-kötő fehérje (CSQ) expressziós vizsgálata a C1, C5, Scr és kontroll sejtekben. A SOCE mechanizmusában fontos szerepet játszó STIM1 molekula expressziós mintázata. A differenciálódás fontos szereplőinek expressziós mintázata: MyoD és CaN, valamint a belső kontrollként használt aktin fehérje expressziója. A Western-blot analízis során minden minta esetében 30 µg fehérjét, valamint kizárólag terminálisan differenciálódott miotubulusokat használtunk. Az ábrák 3 független kísérlet eredményeit reprezentálják. (B) Az (A) panelen bemutatott fehérjék denzitometriás analízise. A MyoD expressziós szintje nem változott a transzfekciót követően, míg a CaN expressziója az 1. és 5. klónban is jelentős csökkenést mutatott (16. ábra A). Az eredmények kvantitatív analízisét követően megállapítottuk, hogy a SERCA1b géncsendesítés hatására a kontrollhoz viszonyítva szignifikánsan csökkent a CSQ, a STIM1 és a CaN expressziós szintje a C1 sejtekben (16. ábra B). Sikerült kimutatnunk a SERCA2a izoformát is, ami leginkább a lassú típusú harántcsíkolt izomban és a szívizomban fordul elő. Pozitív kontrollként egér szívizom mintát használtunk. Az egyes minták SERCA2a expressziós szintje között sincs különbség (16. ábra A, B). Kísérleteink további részében a mRNS-szintű változásokat követtük nyomon. Ehhez specifikus primer párokat terveztünk. Vizsgáltuk a vázizom differenciálódás negatív regulátorát a miosztatint, valamint a CaN aktivitását jelző modulatory calcineurin interacting protein-t, az MCIP1.4-t. A PCR reakcióval felerősített amplimerek detektálása során azt tapasztaltuk, hogy mind a miosztatin, mind a MCIP1.4 szintje csökkenést mutatott a C1 sejtekben a kontrollhoz viszonyítva. A denzitometriás kiértékelés során a kapott eredményeket mindig a GAPDH expressziós szintjére normalizáltuk (18. ábra). C1 C5 Scr K STIM1 90 kDa CSQ 60 kDa Aktin 45 kDa MyoD 55 kDa CaN 59 kDa SERCA2a 115 kDa CSQ STIM1 MyoD CaN SERCA2a 020 40 60 80 100 120 AU C1 C5 Scr AB 56 18. ábra: mRNS-szintű vizsgálat RT-PCR technika segítségével. (A-B) A MSTN (A) és a kalcineurin aktivitását jelző MCIP1.4 fehérje (B) mRNS-szintű vizsgálata C1, C5 és Scr sejteken. Kontrollként GAPDH-t használtunk. A csökkent SERCA expresszió hatása a Ca2+-homeosztázisra Következő kísérleteinkben a SERCA1b fehérje expresszió csökkentésének hatását vizsgáltuk az elektromechanikai csatolásra és a depolarizáció által történő Ca2+- felszabadulásra a C1 és Scr sejtekben. A tranzienseket 120 mM KCl extracelluláris térbe történő adagolásával váltottuk ki (19. ábra A, B). A mérések kiértékelése során azt az eredményt kaptuk, hogy sem a tranziensek amplitúdóiban (681±105, n=10 vs. 668±128 nM, n=10; kontroll és C1 sejtek esetében), sem pedig a felszálló szár meredekségében (606±108 µM/s vs. 489±149 µM/s) nincs szignifikáns különbség (p>0,05) a C1 és a scrambled sejtek között (Scr tenyészet; 19. ábra C, D). 233 bp C1 C5 Scr MSTN ABC1 C5 Scr 160 bp MCIP 1.4 322 bp GAPDH 57 19. ábra: A csökkent SERCA1b fehérje expresszió hatása a depolarizáció következtében kialakult Ca2+- tranziensekre. (A-B) Repetitív Ca2+-tranziensek 120 mM KCl adagolása mellett scrambled és C1 miotubulusok esetén. A méréseket normál Tyrode-oldatban végeztük. (C) A Ca2+-tranziensek amplitúdó értékei. (D) A felszálló szár meredekségének értéke a Scr és C1 sejtek esetében. Az adatok az átlagokat ± az átlagok standard hibáját (SEM) mutatják. A zárójelekben feltüntetett számok a vizsgált sejtek számát jelzik. További vizsgálatainkban a pumpa működésében esetlegesen bekövetkezett változások hatásait kívántuk feltárni (PVmax) a Scr, C1 és C5 sejtekben. A nyugalmi [Ca2+]i értékei között a tranziensek kialakulása előtt (108±4 nM a Scr sejtek esetében, 109±4 nM a C1 sejtek esetében) nem találtunk szignifikáns különbséget. A KCl által kiváltott tranziensek azonban a C1 miotubulusokban lassabban tértek vissza a nyugalmi [Ca2+]i szintre, ahogy azt a 20. ábra A és B panelje is mutatja. A KCl adagolását követő 20. és 40. másodpercben a [Ca2+]i értékét meghatároztuk, s míg a kontroll sejtekben ezek az értékek 112±3 nM-nak (20. s-ban) és 110±3 nM-nak (40. s-ban) adódtak, addig a C1 sejtek esetén 150±7 nM (20. s-ban) és 135±5 nM (40. s-ban) volt. Ezek az értékek a SERCA1b géncsendesített sejteken található pumpák aktivitására utalnak (20. ábra C). Ennek további bizonyítására meghatároztuk a PVmax értékeket is, az „Anyagok és módszerek” fejezetben leírtak alapján. Szignifikáns különbséget 050 100 150 200 250 0 200 400 600 800 0100 200 300 400 500 0 200 400 600 800 AB 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Amplitúdó (∆ [Ca2+]i) nM (10) (10) Scr C1 0 100 200 300 400 500 600 700 Scr C1 Felszálló szár meredeksége (nM/s) CD KCl KCl [Ca2+]i(nM) [Ca2+]i(nM) Idő (s) Idő (s) Scr C1 64 A kalcineurin (PP2B) fő targetjének a transzkripciós faktorok családjába tartozó NFAT-t (Nuclear Factor of Activated T-cell) tartják. Az NFAT foszforilált állapotban a citoplazmában van jelen, az intracelluláris Ca2+-koncentráció emelkedése a kalcineurin aktivitását fokozza, azaz a kalcineurin defoszforiláló hatására, az NFAT a sejtmagba juthat és transzkripciós folyamatokat indíthat be, amely a differenciálódás elősegítéséhez vezet. A PP2B leghatásosabb, legspecifikusabb és legismertebb inhibítorai immunoszupresszív anyagok, ilyen pl. a ciklosporin-A (CSA), amely a kalcineurint citoplazmatikus receptoraikkal a ciklofilinnel és FKBP-vel alkotott komplexek révén gátolja. Annak igazolására, hogy a SERCA1b gátlása a PP2B-n keresztül vezet a proliferáció csökkenéséhez, a C1, C5, Scr és kontroll sejtek proliferációját megvizsgáltuk ciklosporin (CSA) kezelés mellett is. A CSA oldatot 200 nM koncentrációban használtuk, és minden 2. nap kezeltük a sejteket. A tenyésztés minden napján képeket készítettünk minden egyes Petri-csésze (kezelt és kontroll) 5-5 véletlenszerűen kiválasztott látóteréről (24. ábra). A kísérletek elvégzését és kiértékelését követően azt tapasztaltuk, hogy a CSA csökkentette mind a kontroll, mind pedig a C5 és Scr sejtek proliferációs rátáját, azonban a C1 sejtek további proliferációjának csökkenését nem okozta. Az eredményeink alapján a kontroll sejtek relatív sejtmagszáma 9,1±0,7 és 5,6±0,6 volt kontroll és CSA-kezelt sejtek esetében (p<0,05), míg a C1 sejtek esetében ez az érték 3,6±0,5 és 3,7±1,1-nak adódott kezelt és kontroll esetben (p>0,4), amely összhangban van a CaN csökkent expressziós szintjével. 65 24. ábra: Proliferációs ráta vizsgálata CSA kezelés mellett C1, C5, Scr és kontroll miotubulusokban. A CSA oldatot 200 nM koncentrációban használva minden 2. nap kezeltük a sejteket, és a tenyésztés minden napján képeket készítettünk minden egyes Petri-csésze 5-5 random kiválasztott látóteréről. A sejtproliferációt a korábban leírt módszer alapján határoztuk meg. Ahogy az az ábrán is látható, a CSA csökkentette mind a kontroll, mind pedig a C5 és Scr sejtek proliferációs rátáját, azonban a C1 sejtek további proliferációjának csökkenését nem okozta. 24 48 72 96 120 0 2 4 6 8 10 12 kontroll Scr C1 C5 A sejtmagok relatív száma látóterenként Tenyésztés ideje (h) 66 Megbeszélés Porcszövet-kondroprogenitor sejttenyészetek A citoszólikus [Ca2+] dinamikus változása A Ca2+ a sejtek legtöbb életfolyamatában fontos szabályozó szerepet játszik, így a differenciálódásban is kitüntetett szereppel bír. Munkám egyik részében arra kerestük a választ, hogy humán eredetű CPC-kben milyen útvonalon keresztül valósul meg a repetitív Ca2+-oszcilláció, és milyen fehérjék vesznek részt a szabályozásban. A nem excitábilis sejtek kalciumhomeosztázisával kapcsolatban kiterjedt irodalommal rendelkezünk, így ismerjük a legtöbb transzkripciós faktor, az NFAT, az NF-κB vagy a CREB szignalizációs mechanizmusban betöltött szerepét [98], valamint a protein kinázok modulációjában játszott szerepüket is [99,100]. Mindezek mellett számos irodalmi adatot találunk arra vonatkozóan, hogy a Ca2+-oszcilláció hogyan valósul meg a hasnyálmirigyben található β-sejtekben [101], embrionális őssejtekben (ESC-k) [102], kondroblasztokban [48,82], kondrocitákban [103] vagy épp humán csontvelő-eredetű mezenhimális őssejtekben (MSCs) [50,104]. Munkánkban elsőként mutattuk be és térképeztük fel a CPC-k Ca2+-homeosztázisában szerepet játszó purinerg szignalizációs útvonalat, és az abban szerepet játszó fehérjék expressszióját. Ahhoz, hogy ezeket a humán eredetű oszteoartritiszes szövetből származó porcsejteket fel tudjuk használni vizsgálatainkhoz, elengedhetetlen volt a sejtek lentivirális transzfekcióval történő immortalizációja. Mindemellett fontos szempont volt az is, hogy ezek a sejtek a proliferáció ideje alatt monolayer kultúrát hozzanak létre. Koelling és munkatársai (2009) már korábban feltérképezték a CPC-k kologenitását, migratorikus aktivitását [21], ezért célul tűztük ki a CPC-k kondrogenikus markereinek mRNS-szintű detektálását. Ellentétben az embrionális csirke végtagtelepből izolált kondrogenikus sejtek magas frekvenciájú (8×10-2 Hz) Ca2+- oszcillációjával, a CPC-kben a Ca2+-oszcilláció frekvenciája jóval alacsonyabb (1.3×10-3 Hz), hasonlóan a MSC-kben leírtakhoz [104,105]. Különbség továbbá az is, hogy a CPC-k esetében a Ca2+-oszcillációt a belső Ca2+-raktárakból felszabaduló Ca2+ szabályozza, míg az embrionális csirke végtagtelepből izolált kondrogenikus sejtek gyors Ca2+-oszcillációjáért az extracelluláris térből bejutó Ca2+ tehető felelőssé, feltehetően a jóval kisebb Ca2+-raktár miatt [48,106]. 67 A kondroprogenitor sejtek belső Ca2+-raktárának funkcionális jellemzése és szerepe a Ca2+-oszcilláció kialakításában Ahhoz, hogy karakterizálni tudjuk a belső Ca2+-raktárat, meg kellett vizsgálnunk a szabályozásban érintett fehérjék expressziós mintázatát. Az endoplazmatikus retikulum (ER) két a Ca2+-felszabadításban fontos szerepet játszó csatornáját vizsgáltuk, az IP3R altípusait, valamint a RyR-t, melynek expresszióját nem sikerült kimutatnunk. Ezen megfigyelésünk megegyezik a MSC-kben leírt eredményekkel [104,105]. Kollaborációs partnereinknek korábban az embrionális csirke végtagtelepből izolált kondrogenikus sejtekben csak az IP3R1 izoformáját sikerült detektálni [15]. Az ESC-kben ezzel ellentétben mind a három IP3R altípus expresszálódik [107], valamint a RyR is [102]. A CPC-kben mind a három IP3R altípus detektálható. A Ca2+-oszcilláció kialakulása az IP3R altípusainak relatív expressziós szintjétől, illetve endogén modulátorok, mint az IP3, Ca2+ és ATP megjelenésétől függ. Irodalmi adatok alapján az IP3R2 erőteljes, hosszantartó, szabályosan ismétlődő Ca2+-oszcillációt okoz, az IP3R1 ezzel szemben kevésbé rendezett Ca2+-oszcillációt alakít ki, az IP3R3 pedig a legkevésbé érzékeny az IP3 jelenlétére, így ez az altípus monofázisos Ca2+-tranzienseket generál [108,109]. Az altípusok felosztásának ismerete elengedhetetlen a CPC-k Ca2+- oszcillációjának jellemzéséhez (frekvencia, amplitúdó). A belső Ca2+-raktárból történő IP3Rmediált Ca2+-felszabadulás nélkülözhetetlen a Ca2+-oszcilláció kialakulásához, ezért az egyedi sejten történő Ca2+-mérés során egy aspecifikus IP3R blokkolót, a 2-APB-t használtuk, melynek hatására a spontán bekövetkező Ca2+-események eltűntek. Ez az eredmény jó egyezést mutat a MSC-kben [104,107] és az ESC-kben [107] leírt eredményekkel, így joggal feltételezhetjük, hogy ez a mechanizmus egy univerzális módja a Ca2+-oszcilláció létrejöttének az őssejtekben. Megvizsgáltuk továbbá a SOCE mechanizmusát is, amely szintén esszenciális szerepet tölt be a CPC-k Ca2+-oszcillációjában. Feltételezésünk szerint, a CPC-kben kialakuló Ca2+- oszcilláció alappillére az IP3R-on keresztül történő Ca2+-felszabadulás, és a SOCE mechanizmus révén a raktár által vezérelt Ca2+-belépés. Ezt az elképzelésünket alátámasztják a CPA-val végzett kísérleteink eredményei is (9. ábra). Arra a kérdésre azonban, hogy a Ca2+- oszcilláció kialakulásának hátterében milyen fehérjék állnak, az irodalomban nem találtunk adatot, CPC-kben ilyet még nem vizsgáltak. A Ca2+-homeosztázis fenntartásában szerepet játszó SOCE kulcsfehérjéit, a STIM1-t és az Orai1-t MSC-kben már leírták [104,110], illetve a csirke kondroprogenitor sejtekben szintén detektálták már a STIM1, STIM2 és Orai1 fehérjék expresszióját [48]. A STIM2 fehérjéről irodalmi adatok alapján tudjuk, hogy az ER 68 Ca2+-tartalmának már egészen kicsi csökkenését is érzékeli, és a csökkenés következtében azonnal aktiválódik, míg a STIM1 csak a Ca2+-raktár teljes kiürülését követően válik aktívvá [111]. A CPC-k esetében csak a STIM1 expresszióját sikerült kimutatnunk. A spontán Ca2+- tranziensek kialakulásában a STIM1 fehérjének meghatározó szerepe van, és esszenciális szerepet tölt be az Orai1 fehérjék punktákba történő rendeződésénél is. Habár az Orai izoformáknak több típusa ismert, a CPC-k csak az Orai1-t expresszálják (10. ábra). Purinerg szignalizáció és a Ca2+-oszcilláció autokrin/parakrin szabályozása Humán MSC-kben a Ca2+-oszcilláció kialakulásáért egy autokrin/parakrin purinerg hurok tehető felelőssé, ahol ATP felszabadulását követően a P2Y1 metabotróp purinerg receptor stimulálódik, majd a PLC útvonal aktiválódik [50]. Kollaborációs partnereink korábbi közleményeikben hasonló autoregulatorikus útvonalat vizsgáltak csirke kondroprogenitor sejtekben, ahol a P2X4 ionotróp purinerg receptor játszott kitüntetett szerepet [17,48]. Ezen tények ismeretében kíváncsiak voltunk arra, hogy a humán CPC-kben, ahol az extracelluláris nukleotidok gyulladásos mediátorokkal együtt szabadulnak fel [112], milyen szerepet töltenek be a purinerg receptorok. Tekintettel arra, hogy a P1 receptor altípusok a kondrocitákban is expresszálódnak [113], először a P1 purinerg receptor profil megvizsgálását tűztük ki célul. Eredményeink szerint CPC-kben az A1 [114], A2A [115] és A2B [116] expressziója megfigyelhető, ugyanúgy, mint a MSC-kben, míg az A3 receptor expressziója nem volt detektálható. Ezen eredmények jó korrelációt mutatnak az irodalmi adatokkal. Irodalmi adatok alapján ugyancsak ismert, hogy az A1 és A2B receptor-mediált szignalizáció indítja el az MSC-k oszteogenikus differenciációját [114,117]. Míg az A2B receptorok aktivációja az oszteogenikus gének aktivációját indukálja az MSC-kben, addig az A1 és A2A receptorok expressziós szintjének a növekedése adipogenikus irányba tolja el a differenciációt [118]. Következő lépésben a P2 purinerg receptorokat tanulmányoztuk. Fluoreszcens Ca2+- mérés során, extracelluláris ATP adagolásával Ca2+-tranzienseket váltottunk ki normál és Ca2+-mentes Tyrode-oldatban, ahol a Ca2+-mentes körülmények között szignifikánsan kisebbnek bizonyult mind a nyugalmi, mind pedig a maximális [Ca2+]i érték, valamint az amplitúdó és az FTHM is (7. táblázat). Ezzel a kísérlettel mind a P2X, mind pedig a P2Y receptor izoformákat vizsgálni tudtuk. Ezzel ellentétben, amikor az ATP-t együtt alkalmaztuk 69 az IP3R nem specifikus inhibítorával, a 2-APB-vel [119], a vizsgált sejtek többsége nem válaszolt, bizonyítva ezzel, hogy az extracelluláris nukleotidok elsődleges kötődési célpontjaik a metabotróp P2Y receptorok. További vizsgálatainkban különböző P2 receptor agonistákat (ATP, ADP, UTP és UDP, 7. táblázat)[120], valamint egy nem specifikus antagonistát, a suramint alkalmaztuk, így sikerült igazolnunk a P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2X4 és P2X6 receptorok funkcionális aktivitását CPC-kben. Ezek az eredmények összhangban vannak a Zippel és munkatársai által publikált eredményekkel, ahol MSC-kben vizsgálták a P2 receptor altípusokat és a P2X6, P2Y4, P2Y14 jelenlétét igazolták [121]. Ezek a P2 receptor altípusok az adipogenikus és az oszteogenikus differenciáció során is reguláló szerepet töltenek be [121], így joggal feltételezhetjük, hogy a CPC-k differenciációjában is hasonló szerepük lehet. Ciciarello és munkatársai az MSC-k adipogenikus differenciációját vizsgálták, amit eredményük szerint a P2Y1 és P2Y4 receptorok mediáltak. Ugyanakkor, ha az A2B adenozin receptorokat stimulálták, a differenciáció oszteogenikus irányba tolódott el [122]. A CPC-k is képesek oszteogenikus, adipogenikus és kondrogenikus irányba is differenciálódni [21], valamint a P1 és P2 receptor profiljuk is jól korrelál az irodalomban talált adatokkal. 25. ábra: Összefoglaló ábra a kondroprogenitor porcsejteken végzett kísérletes eredményeinkről. Az ábrán jól látható a szabályozásban érintett fehérjék lokalizációja és szerepük a Ca2+-oszcilláció kialakításában. A SOCE mechanizmus mellett a purinerg szignalizáció is fontos szerepet tölt be a spontán Ca2+-oszcilláció létrejöttében. STIM1 Ca2+ Orai1 Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ IP3R1/2/3 P2X1 P2X4 P2X5 P2X6 P2X7ATP P2Y1 P2Y2 P2Y4 PLC IP3 ATP UTP ADP Gq Gi/o IP3R1/2/3 PLC IP3 2-APB koffein A1 A2A A2B La3+ YM58483 PMCA1 PMCA4 NCX1 NCX3 CPA SERCA1 SERCA2 SERCA3 2-APB Ca2+ ~ ~ Ca2+ Ca2+ Na+ Ca2+ Na+ Ade SOCE Ca2+ -oszcillációk IP3R1/2/3 Gs AC↑ cAMP 70 Jól ismert tény az is, hogy a purinerg receptorok aktivációja számos sejttípusban Ca2+- oszcillációt hoz létre [17,50,123,124]. Munkánk során arra törekedtünk, hogy felderítsük a CPC-kben kialakuló spontán Ca2+-oszcilláció hátterében álló folyamatokat (25. ábra). Megállapítottuk, hogy a spontán kialakuló Ca2+-oszcilláció hátterében purinerg szignalizáció áll. Ezek az eredmények jól illeszkednek a publikációs adatbázisban található eredményekkel [50,55]. A szignalizációban érintett fehérjéket mRNSés fehérjeszinten is megvizsgáltuk, valamint funkcionálisan is karakterizáltuk őket. Bízunk benne, hogy ezek az eredmények hozzájárulnak majd az oszteoartritisz során kialakuló porcszövet degeneráció celluláris folyamatainak jobb megértéséhez. Vázizomszövet-C2C12 sejttenyészetek A SERCA izoformák zavartalan működése elengedhetetlen a sejtek Ca2+- homeosztázisának fenntartásában. A SERCA két Ca2+-t transzportál egy ATP hidrolíziséből származó energiával a citoszólból a lumenbe. Jelen értekezés második felében a neonatalis SERCA izoforma, a SERCA1b szerepét és annak expressziójában bekövetkező csökkenés következményeinek hatását vizsgáltuk C2C12 vázizomsejteken. A SERCA1b fehérje domináns izoforma a neonatalis korban [125,126,127], amit vázizom esetén később a SERCA1a vált fel, ugyanakkor egyes irodalmi adatok arra utalnak, hogy izomregeneráció során újra megjelenik a SERCA1b izoforma [128]. A SERCA1b fehérje expresszió csökkenése és a Ca2+-homeosztázisban résztvevő fehérjék expressziójára gyakorolt hatása A C2C12 sejtek stabil transzfekcióját követően sikerült létrehoznunk olyan klónokat, amelyekben teljesen (C1 sejtek) vagy csak részben (C5 sejtek) csökkentettük a SERCA1b fehérje expresszióját. A vázizomra specifikus, SERCA1a/b antitesttel megvizsgálva a mintákat azt tapasztaltuk, hogy azokban a sejtekben, ahol csökkent a SERCA1b expresszió, a SERCA1a expressziós szintje nem növekedett, tehát nem kompenzálta a másik izoforma csökkenését. Ez az eredmény összhangban van az irodalomban talált azon eredménnyel, miszerint a SERCA1 izoformák közül a C2C12 sejtekben csak a SERCA1b expresszálódik [97]. Ugyanez a tanulmány rávilágít arra, hogy rágcsálók vázizmában a felnőtt és a neonatalis izoforma szigorú transzlációs kontroll alatt áll, a mioblasztokban és a miotubulusokban a SERCA1a izoforma nem detektálható, az intakt felnőtt izomban pedig a SERCA1b izoforma expressziója nem mutatható ki, annak ellenére, hogy mRNS szinten megtalálható a megfelelő transzkriptum [97]. Egy másik izomspecifikus SR kalciumpumpa, a SERCA2a expresszióját 71 megvizsgálva azt tapasztaltuk, hogy a SERCA1b expresszió csökkenés hatására a SERCA2a expressziója sem változott. In vivo körülmények között regenerálódó izomban, mind lassú (musculus soleus, SOL), mind pedig gyors (musculus extensor digitorum longus, EDL) típusú izomrostokban a miotubulusok fejlődése során a SERCA1b fehérje expressziója szignifikáns növekedést mutat [97,129]. A SERCA1b fehérje mioblasztokban csak kis mértékben expresszálódik, míg miotubulusokban ennél jóval nagyobb expressziót mutat, bizonyítva ezzel, hogy jelenléte elengedhetetlen a miotubulusok és a SR fejlődése során [97]. A mioblasztok, mint a legtöbb sejttípus, expresszálják a SERCA2b izoformát, mely alacsonyabb ATP-áz aktivitással, de magasabb Ca2+-iránti affinitással jellemezhető, összehasonlítva a lassú típusú izomra jellemző SERCA2a izoformával [130,131,132]. Western-blot analízis segítségével vizsgáltuk a SOCE-ban érintett fehérjék expressziós szintjét, így a STIM1-t, CSQ-t, DHPR-t, valamint kíváncsiak voltunk még a CaN és a MyoD expressziós szintjére is. A kísérleteink elvégzését követően azt találtuk, hogy a SERCA1b shRNS-el transzfektált sejtekben, mind a C1, mind pedig a C5 tenyészetekben csökkent a CaN expressziója, azonban a CaN aktivitását jelző marker, az MCIP1.4 mRNS szinten csak a C1 sejtekben mutatott csökkenést. Ugyanezen sejtek esetében expressziós szint csökkenést tapasztaltunk a CSQ fehérje esetében is, amely a SR legfontosabb Ca2+-kötő fehérjéje. Ez a csökkenés a SR alacsonyabb Ca2+-kötését okozhatja (16. ábra A). A STIM1 a SOCE mechanizmus egyik kulcsszereplője. Azok a miotubulusok, amelyekben a STIM1 molekula hiányzik, jóval alacsonyabb SR Ca2+-tartalommal bírnak és fáradékonyabbak is [133,134]. Leírták továbbá, hogy a SERCA1 endogén inhibítorának a szarkolipinnek az expressziós szintje a STIM1 hiányos miotubulusokban csökken, így a SOCE aktivitása kisebb lesz, valamint a miotubulusok fejlődése is zavart szenved [133]. A SERCA1b-hez hasonlóan a STIM1 molekulának is elengedhetetlen szerepe van az izomfejlődés során [97]. Ezt a szoros kapcsolatot megerősítik a mi eredményeink is, hiszen ott ahol a SERCA1b fehérje expressziója csökkent, a Ca2+-szenzorként is ismert STIM1 molekula expressziója is csökkent. Eredményeink alapján úgy gondoljuk, hogy a SERCA1b fehérje és a STIM1 molekula expressziós szintjének csökkenése a mioplazmából egy lassabb Ca2+-visszavételt eredményez. Ezzel összefüggésbe hozható továbbá a korábban említett CSQ expressziós szint csökkenése, ami a SR alacsonyabb Ca2+-szintjéért tehető felelőssé. Azonban a miogenikus transzkripciós faktor, a MyoD expressziós szintjében nem találtunk különbséget, így valószínűleg a SERCA1b nem a miogenikus differenciációban játszik szerepet, hanem a 72 differenciáció későbbi folyamataiban. Ugyanakkor a CaN expressziós szintje csökkent a C1 miotubulusokban, ami pedig a MCIP1.4 mRNS-szintű csökkenését okozta. PCR technika segítségével megvizsgáltuk még az izomdifferenciálódás negatív regulátorát is, a miosztatin fehérjét, és eredményeink arra utalnak, hogy a C1 sejtekben csökkent a miosztatin expressziója. Ezen fehérje ugyan nincs közvetlen kapcsolatban a SOCE-val, azonban munkacsoportunk korábban kimutatta, hogy a miosztatin hiányos egerekben a SOCE megváltozik [135]. Az elektromechanikai csatolás vizsgálata kontroll és SERCA1b specifikus shRNS-sel transzfektált sejtekben Kísérleteink során megvizsgáltuk a SERCA1b géncsendesítés hatását az elektromechanikai csatolásra. Ismételt Ca2+-tranziensek kiváltása során magas K+- koncentráció adagolása mellett, sem a tranziensek amplitúdóiban, sem a felszálló szár meredekségében nem tapasztaltunk eltérést a C1 sejtekben a Scr sejtekhez viszonyítva, így a RyR és a feszültség-vezérelt csatornák működése feltételezhetően nem módosult a géncsendesítés hatására. Ez arra enged következtetni, hogy a SR Ca2+-raktára még a SERCA1b hiánya esetén is bizonyos mértékben újratöltődik [136], valószínűleg egy másik SERCA izoforma közreműködésével (SERCA2a). A kiszámolt maximális pumpaaktivitás értékek azt mutatták, hogy a csökkent SERCA1b expressziót mutató miotubulusok nyugalmi Ca2+-szintje lassabban állt vissza a normál állapotra. Mivel a SERCA2a izoforma az egyetlen, amely intakt formában fordul elő a C1 sejtekben, és a nyugalmi Ca2+-szint csak lassan állt vissza az eredeti állapotba, ezért úgy gondoljuk, hogy a normális Ca2+-visszavételben ennek az izoformának nincs kitüntetett szerepe, míg a SERCA1b-nek annál inkább esszenciális a jelenléte. Ezt a hipotézist erősíti az a tény is, hogy a SERCA1 knock-out egerek, melyekben a SERCA1a mellett a SERCA1b is érintett, Ca2+-visszavétele jóval lassabban zajló folyamat [137]. A tanulmányból kiderül továbbá az is, hogy ezek az egerek a születésüket követő 1-5 órán belül meghalnak. A SERCA1b expressziót nem (C1) vagy csak részben csökkent expressziót mutató sejtek (C5) a kontroll sejtekhez képest csökkent proliferációt mutattak, a miotubulusok pedig kevesebb sejtmagot tartalmaztak. A sejtproliferáció során, a SERCA1b fehérje jelenlétének esszenciális szerepe van a kalcineurin regulált jelátviteli útvonalban, mert amikor a CaN gátlószerét, CSA-t adtunk a tápoldathoz, a kontroll és a Scr sejtek proliferációja lecsökkent, míg a C1 sejtek proliferációja nem mutatott további csökkenést. A CSA hatása sejtspecifikus, mert míg idegsejtekben segíti a sejtek túlélését [138], addig a vesesejtekben egy CaN független útvonalon keresztül toxikus hatást mutat [139]. Ezzel ellentétben az 73 oszteoblaszt sejtvonalakban, és a kondrogenikus sejtekben a CSA egy potenciális CaN inhibítor [16]. Irodalmi adatok alapján tudjuk, hogy a CSA-val történő gátlás a kondrogenikus sejtek proliferációs rátáját csökkenti [140]. Kísérleteink során a CSA-val történő kezelés hatására a teljes mértékben csökkent SERCA1b expressziót mutató sejtekben (C1) a proliferációs ráta nem csökkent tovább, ami arra enged következtetni, hogy a CaN aktivitás CSA-függő komponensét nagy mértékben befolyásolja a SERCA1b aktivitás (24. ábra). 26. ábra: Összefoglaló ábra a C2C12 miotubulusokon végzett kísérletes eredményeinkről. A SERCA1b fehérje jelenléte esszenciális szerepet tölt be a proliferáció és a differenciálódás ideje alatt a C2C12 sejtekben. A vázizom differenciálódás egyik feltétele az, hogy egy adott területen belül a mioblasztokból álló kultúra konfluenssé váljon. Ekkor kialakulnak a 4-6 sejtmagból álló primer miotubulusok, majd pedig a mioblasztok további fúziójával képződnek a szekunder miotubulusok, melyek több sejtmagot tartalmaznak [141]. A C1 és Scr miotubulusok sejtmagszáma között szignifikáns különbséget találtunk. Hasonló eredményre jutottak Porter és munkatársai is [142], akik a SERCA pumpa gátlására használt tapszigarginnal kezelték a C2C12 sejteket, és a miogenikus differenciáció zavarát tapasztalták. Megfigyeléseink szerint a SERCA1b géncsendesített C1 miotubulusok átlagosan kevesebb, mint 5 sejtmagot tartalmaztak. Feltételezhetően a primer miotubulus képződés szenvedett zavart, ezáltal a későbbi differenciálódás is gátlódott. Ez az eredmény hasonló egy, az irodalomban talált eredménnyel, miszerint BC3H1 miogenikus sejtekben a szekunder miotubulusok kialakulásáért a SERCA1a 80 16. Zákány R, Szíjgyártó Z, Matta C, Juhász T, Csortos C, et al. (2005) Hydrogen peroxide inhibits formation of cartilage in chicken micromass cultures and decreases the activity of calcineurin: implication of ERK1/2 and Sox9 pathways. Exp Cell Res 305: 190-199. 17. Fodor J, Matta C, Juhász T, Oláh T, Gönczi M, et al. (2009.) Ionotropic purinergic receptor P2X4 is involved in the regulation of chondrogenesis in chicken micromass cell cultures. Cell Calcium 45: 421-430. 18. Bradham D, Passaniti A, Horton WJ (1995) Mesenchymal cell chondrogenesis is stimulated by basement membrane matrix and inhibited by age-associated factors. Matrix Biol 14: 561-571. 19. Grigoriadis A, Heersche J, Aubin J (1988) Differentiation of muscle, fat, cartilage, and bone from progenitor cells present in a bone-derived clonal cell population: effect of dexamethasone. J Cell Biol 106: 2139-2151. 20. Shea C, Edgar C, Einhorn T, Gerstenfeld L (2003) BMP treatment of C3H10T1/2 mesenchymal stem cells induces both chondrogenesis and osteogenesis. J Cell Biochem 90: 1112-1127. 21. Koelling S, Kruegel J, Irmer M, Path J, Sadowski B, et al. (2009) Migratory chondrogenic progenitor cells from repair tissue during the later stages of human osteoarthritis. Cell Stem Cell 4: 324-335. 22. DeLise A, Fischer L, Tuan R (2000) Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage 8: 309-334. 23. DeLise A, Tuan R (2002) Analysis of N-cadherin function in limb mesenchymal chondrogenesis in vitro. Dev Dyn 225: 195-204. 24. San Antonio J, Tuan R (1986) Chondrogenesis of limb bud mesenchyme in vitro: stimulation by cations. Dev Biol 115: 313-324. 25. Kelley R, Fallon J (1978) Identification and distribution of gap junctions in the mesoderm of the developing chick limb bud. J Embryol Exp Morphol 46: 99-110. 26. Haas A, Tuan R (1999) Chondrogenic differentiation of murine C3H10T1/2 multipotential mesenchymal cells: II. Stimulation by bone morphogenetic protein-2 requires modulation of N-cadherin expression and function. Differentiation 64: 77-89. 27. Wali R, Bissonnette M, Jiang K, Niedziela S, Khare S, et al. (1995) 1,25Dihydroxyvitamin D3 stimulates the phosphorylation of two acidic membrane proteins of 42,000 and 48,000 daltons in rat colonocytes: an effect modulated by vitamin D status. J Cell Physiol 162: 172-180. 81 28. Tavella S, Bellese G, Castagnola P, Martin I, Piccini D, et al. (1997) Regulated expression of fibronectin, laminin and related integrin receptors during the early chondrocyte differentiation. J Cell Sci 1997 Sep;110 ( Pt 18):2261-70 110: 2261-2270. 29. Mackie E, Thesleff I, Chiquet-Ehrismann R (1987) Tenascin is associated with chondrogenic and osteogenic differentiation in vivo and promotes chondrogenesis in vitro. J Cell Biol 105: 2569-2579. 30. Dessau W, von der Mark H, von der Mark K, Fischer S (1980) Changes in the patterns of collagens and fibronectin during limb-bud chondrogenesis. J Embryol Exp Morphol 57: 51-60. 31. Lefebvre V, Behringer RR, Bi W, Murakami S, Huang W (2000) Transcriptional mechanisms of chondrocyte differentiation Matrix Biol 19: 389-394. 32. Zehentner B, Dony C, Burtscher H (1999) The transcription factor Sox9 is involved in BMP-2 signaling. J Bone Miner Res 14: 1734-1741. 33. Lee Y, Chuong C (1997) Activation of protein kinase A is a pivotal step involved in both BMP-2and cyclic AMP-induced chondrogenesis. J Cell Physiol 170: 153-165. 34. Newton A (1997) Regulation of protein kinase C. Curr Opin Cell Biol 9: 161-167. 35. Choi B, Chun J, Lee Y, Sonn J, Kang S (1995) Expression of protein kinase C isozymes that are required for chondrogenesis of chick limb bud mesenchymal cells. Biochem Biophys Res Commun 216: 1034-1040. 36. Zákány R, Szucs K, Bakó E, Felszeghy S, Czifra G, et al. (2002) Protein phosphatase 2A is involved in the regulation of protein kinase A signaling pathway during in vitro chondrogenesis. Exp Cell Res 275: 1-8. 37. Chang S, Oh C, Yang M, Kang S, Lee Y, et al. (1998) Protein kinase C regulates chondrogenesis of mesenchymes via mitogen-activated protein kinase signaling. J Biol Chem 273: 19213-19219. 38. Stanton L, Underhill T, Beier F (2003) MAP kinases in chondrocyte differentiation. Dev Biol 263: 165-175. 39. Rusnak F, Mertz P (2000) Calcineurin: form and function. Physiol Rev 80: 1483-1521. 40. Tomita M, Reinhold M, Molkentin J, Naski M (2002) Calcineurin and NFAT4 induce chondrogenesis. J Biol Chem 277: 42214-42218. 41. Szabó G (2009) Sejtbiológia. Medicina Könyvkiadó Zrt. 42. Jorgensen N, Geist S, Civitelli R, Steinberg T (1997) ATPand gap junction-dependent intercellular calcium signaling in osteoblastic cells. J Cell Biol 139: 497-506. 82 43. Bakondi E, Gönczi M, Szabó E, Bai P, Pacher P, et al. (2003) Role of intracellular calcium mobilization and cell-density-dependent signaling in oxidative-stress-induced cytotoxicity in HaCaT keratinocytes. J Invest Dermatol 121: 88-95. 44. Ramage L, Martel M, Hardingham G, Salter D (2008) NMDA receptor expression and activity in osteoarthritic human articular chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage 16: 1576-1584. 45. Soto F, Garcia-Guzman M, Stühmer W (1997) Cloned ligand-gated channels activated by extracellular ATP (P2X receptors). J Membr Biol 160: 91-100. 46. Tu P, Kunert-Keil C, Lucke S, Brinkmeier H, Bouron A (2009) Diacylglycerol analogues activate second messenger-operated calcium channels exhibiting TRPC-like properties in cortical neurons. J Neurochem 108: 126-138. 47. Oláh T, Fodor J, Ruzsnavszky O, Vincze J, Berbey C, et al. (2011) Overexpression of transient receptor potential canonical type 1 (TRPC1) alters both store operated calcium entry and depolarization-evoked calcium signals in C2C12 cells. Cell Calcium 49: 415-425 48. Fodor J, Matta C, Oláh T, Juhász T, Takács R, et al. (2013) Store-operated calcium entry and calcium influx via voltage-operated calcium channels regulate intracellular calcium oscillations in chondrogenic cells. Cell Calcium 54: 1-16. 49. Parker A, Gergely F, Taylor C (2004) Targeting of inositol 1,4,5-trisphosphate receptors to the endoplasmic reticulum by multiple signals within their transmembrane domains. J Biol Chem 279: 23797-23805. 50. Kawano S, Otsu K, Kuruma A, Shoji S, Yanagida E, et al. (2006) ATP autocrine/paracrine signaling induces calcium oscillations and NFAT activation in human mesenchymal stem cells. Cell Calcium 39: 313-324. 51. Herbert Z, Matthias Z, Norbert S (2012) Cellular function and molecular structure of ectonucleotidases. Purinergic Signal 8: 437-502. 52. Junger W (2011) Immune cell regulation by autocrine purinergic signalling. Nat Rev Immunol 11: 201-212. 53. Idzko M, Ferrari D, Eltzschig H (2014) Nucleotide signalling during inflammation. Nature 509: 310-317 54. Desai B, Leitinger N (2014) Purinergic and calcium signaling in macrophage function and plasticity. Front Immunol 5. 55. Zimmermann H, Zebisch M, Sträter N (2012) Cellular function and molecular structure of ecto-nucleotidases. Purinergic Signal 8: 437-502. 83 56. Ferrari D, Vitiello L, Idzko M, la Sala A (2015) Purinergic signaling in atherosclerosis. Trends Mol Med 21: 184-192. 57. North R (2002) Molecular physiology of P2X receptors. Physiol Rev 82: 1013-1067. 58. Ralevic V, Burnstock G (1998) Receptors for purines and pyrimidines. Pharmacol Rev 50: 413-492. 59. Ruzsnavszky O, Telek A, Gönczi M, Balogh A, Remenyik E, et al. (2011) UV-B induced alteration in purinergic receptors and signaling on HaCaT keratinocytes. J Photochem Photobiol B 105: 113-118. 60. Song X, Xu X, Zhu J, Guo Z, Li J, et al. (2015) Up-regulation of P2X7 receptors mediating proliferation of Schwann cells after sciatic nerve injury. Purinergic Signal 11: 203-213. 61. Santana P, Benjamim C, Martinez C, Kurtenbach E, Takiya C, et al. (2015) The P2X7 Receptor Contributes to the Development of the Exacerbated Inflammatory Response Associated with Sepsis. J Innate Immun 7(4):417-27. doi: 10.1159/000371388. 62. Burnstock G (2007.) Purine and pyrimidine receptors. Cell Mol Life Sci 64: 1471-1483. 63. Röhlich P (2006) Szövettan. Semmelweis Kiadó és Multimédia Stúdió Kft. 64. Meyer L, Wright N (2013) Structure of giant muscle proteins. Front Physiol 4. 65. Buckingham M, Bajard L, Chang T, Daubas P, Hadchouel J, et al. (2003) The formation of skeletal muscle: from somite to limb. J Anat 202: 59-68. 66. Muntoni F, Brown S, Sewry C, Patel K (2002) Muscle development genes: their relevance in neuromuscular disorders. Neuromuscul Disord 12: 438-446. 67. Péault B, Rudnicki M, Torrente Y, Cossu G, Tremblay J, et al. (2007) Stem and progenitor cells in skeletal muscle development, maintenance, and therapy. Mol Ther 15: 867-877. 68. Attila F, Erzsébet L (2008) Az orvosi élettan tankönyve. Medicina Könyvkiadó Zrt. 69. Fernando J A, Peter B S, Masahiro E, Mitsuhiko I (2013) Ryanodine receptor calcium release channels: lessons from structure–function studies. FEBS Journal 280. 70. Veronika Á, László D (2004) Orvosi biokémia. Medicina Könyvkiadó Zrt. 71. MacLennan D, Rice W, Green N (1997) The mechanism of Ca2+ transport by sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPases. J Biol Chem 272: 28815-28818 72. Lytton J, Westlin M, Burk S, Shull G, Maclennan D (1992) Functional comparisons between isoforms of the sarcoplasmic or endoplasmic reticulum family of calcium pumps. . J Biol Chem 267: 14483-14489. 84 73. Loukianov E, Ji Y, Baker D, Reed T, Babu J, et al. (1998) Sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+ ATPase isoforms and their role in musle physiology and pathology. Annals NY Acad Sci 853: 251-259. 74. Wuytack F, Raeymaekers L, Missiaen L (2002) Molecular physiology of the SERCA and SPCA pumps. Cell Calcium 32: 279-305 75. Stokes D, Zhang P, Toyoshima C, K. Y, H. O, et al. (1998) Cryoelectron microscopy of the calcium pump from sarcoplasmic reticulum: two crystal forms reveal two different conformations. . Acta Physiol Scand 163: 35-43. 76. Martonosi AN, Pikula S (2003) The network of calcium regulation in muscle. Acta Biochem 50: 1-30. 77. Thastrup O, Cullen P, Drobak B, Hanley M, Dawson A (1990) Thapsigargin,a tumor promotor,discharges intracellular calcium stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum calcium ATPase. Proc natn Acad Sci: 2466-2470. 78. Inesi G, Sagara Y (1994) Specific inhibitors of intracellular Ca2+ transport ATPases. J Memb Biol 141: 1-6. 79. Musumeci G, Castrogiovanni P, Coleman R, Szychlinska M, Salvatorelli L, et al. (2015) Somitogenesis: From somite to skeletal muscle. Acta Histochem 117: 313-328. 80. Conti F, Blumberg W, de Gier J, Pocchiari F (1982) Physical methods on biological membranes and their model systems. Life Sciences Vol. 71. 81. Murayama T, Ogawa Y (2002) Roles of two ryanodine recptor isoforms coexisting in skeletal muscle. Trends Cardiovasc Med: 305-311. 82. Matta C, Zakany R (2013) Calcium signalling in chondrogenesis: implications for cartilage repair. Front Biosci (Schol Ed) 5: 305-324. 83. Jaiswal R, Jaiswal N, Bruder S, Mbalaviele G, Marshak D, et al. (2000) Adult human mesenchymal stem cell differentiation to the osteogenic or adipogenic lineage is regulated by mitogen-activated protein kinase. J Biol Chem 275: 9645-9652. 84. Pittenger M, Mackay A, Beck S, Jaiswal R, Douglas R, et al. (1999) Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284: 143-147. 85. Uccelli A, Moretta L, Pistoia V (2008) Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol 8: 726-736. 86. Burt R, Loh Y, Pearce W, Beohar N, Barr W, et al. (2008) Clinical applications of bloodderived and marrow-derived stem cells for nonmalignant diseases. JAMA 299: 925936. . 85 87. Figueroa F, Carrión F, Villanueva S, Khoury M (2012) Mesenchymal stem cell treatment for autoimmune diseases: a critical review. Biol Res 45: 269-277. 88. Bertrand J, Cromme C, Umlauf D, Frank S, Pap T (2010) Molecular mechanisms of cartilage remodelling in osteoarthritis. Int J Biochem Cell Biol 42: 1594-1601. 89. Stammers A, Susser S, Hamm N, Hlynsky M, Kimber D, et al. (2015) The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA). Can J Physiol Pharmacol 19: 1-12. 90. Hovnanian A (2007) SERCA pumps and human diseases. Subcell Biochem 45: 337-363. 91. Erdei A (2012) Immunológia. Medicina Könyvkiadó Zrt. 92. Sztretye M, Deli T, Szentesi P, Szigeti G, Csernoch L (2007) Effect of TPEN on the calcium release of cultured C2C12 mouse myotubes. J Muscle Res Cell Motil 28: 421428. 93. Schuhmeier R, Dietze B, Ursu D, Lehmann-Horn F, Melzer W (2003) Voltage-activated calcium signals in myotubes loaded with high concentrations of EGTA. Biophys J: 1065-1078. 94. Carroll S, Ravid K (2013.) Differentiation of mesenchymal stem cells to osteoblasts and chondrocytes: a focus on adenosine receptors. Expert Rev Mol Med 15:e1. doi: 10.1017/erm.2013.2. 95. Goepfert C, Imai M, Brouard S, Csizmadia E, Kaczmarek E, et al. (2000) CD39 modulates endothelial cell activation and apoptosis. Mol Med 6: 591-603. 96. Zádor E, Mendler L, Ver Heyen M, Dux L, Wuytack F (1996) Changes in mRNA levels of the sarcoplasmic/endoplasmic-reticulum Ca(2+)-ATPase isoforms in the rat soleus muscle regenerating from notexin-induced necrosis. Biochem J 320 107-113. 97. Zádor E, Vangheluwe P, Wuytack F (2007) The expression of the neonatal sarcoplasmic reticulum Ca2+ pump (SERCA1b) hints to a role in muscle growth and development. Cell Calcium 41: 379-388 98. Dolmetsch R, Lewis R, Goodnow C, Healy J (1997.) Differential activation of transcription factors induced by Ca2+ response amplitude and duration. Nature 386: 855-858. 99. Kupzig S, Walker S, Cullen P (2005) The frequencies of calcium oscillations are optimized for efficient calcium-mediated activation of Ras and the ERK/MAPK cascade. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 7577-7582. 100. Matta C, Mobasheri A (2014) Regulation of chondrogenesis by protein kinase C: Emerging new roles in calcium signalling. Cell Signal 26: 979-1000. 86 101. Stout C, Costantin J, Naus C, Charles A (2002) Intercellular calcium signaling in astrocytes via ATP release through connexin hemichannels. J Biol Chem 277(12):10482-8.: 10482-10488. 102. Sauer H, Hofmann C, Wartenberg M, Wobus A, Hescheler J (1998) Spontaneous calcium oscillations in embryonic stem cell-derived primitive endodermal cells. Exp Cell Res 238: 13-22. 103. Nguyen C, Lieberherr M, Bordat C, Velard F, Côme D, et al. (2012) Intracellular calcium oscillations in articular chondrocytes induced by basic calcium phosphate crystals lead to cartilage degradation. Osteoarthritis Cartilage 20: 1399-1408. 104. Kawano S, Shoji S, Ichinose S, Yamagata K, Tagami M, et al. (2002) Characterization of Ca(2+) signaling pathways in human mesenchymal stem cells. Cell Calcium 32: 165174. 105. Tao R, Sun H, Lau C, Tse H, Lee H, et al. (2011) Cyclic ADP ribose is a novel regulator of intracellular Ca2+ oscillations in human bone marrow mesenchymal stem cells. J Cell Mol Med 15: 2684-2696. 106. Varga Z, Juhász T, Matta C, Fodor J, Katona É, et al. (2011) Switch of voltage-gated K+ channel expression in the plasma membrane of chondrogenic cells affects cytosolic Ca2+-oscillations and cartilage formation. PLoS One 6: 27957. 107. Kapur N, Mignery G, Banach K (2007) Cell cycle-dependent calcium oscillations in mouse embryonic stem cells. Am J Physiol Cell Physiol 292: 1510-1518. 108. Miyakawa T, Maeda A, Yamazawa T, Hirose K, Kurosaki T, et al. (1999) Encoding of Ca2+ signals by differential expression of IP3 receptor subtypes. EMBO J 18: 13031308. 109. Zhang S, Fritz N, Ibarra C, Uhlén P (2011) Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor subtypespecific regulation of calcium oscillations. Neurochem Res 36: 1175-1185. 110. Hu J, Qin K, Zhang Y, Gong J, Li N, et al. (2011) Downregulation of transcription factor Oct4 induces an epithelial-to-mesenchymal transition via enhancement of Ca2+ influx in breast cancer cells. Biochem Biophys Res Commun 411: 786-791. . 111. Hoth M, Niemeyer B (2013) The neglected CRAC proteins: Orai2, Orai3, and STIM2. Curr Top Membr 71: 237-271. 112. Picher M, Graff R, Lee G (2003) Extracellular nucleotide metabolism and signaling in the pathophysiology of articular cartilage. Arthritis Rheum 48: 2722-2736. 87 113. Rosenthal A, Hempel D, Kurup I, Masuda I, Ryan L (2010) Purine receptors modulate chondrocyte extracellular inorganic pyrophosphate production. Osteoarthritis Cartilage 18: 1496-1501. 114. D'Alimonte I, Nargi E, Lannutti A, Marchisio M, Pierdomenico L, et al. (2013.) Adenosine A1 receptor stimulation enhances osteogenic differentiation of human dental pulp-derived mesenchymal stem cells via WNT signaling. Stem Cell Res 11: 611-624. 115. Katebi M, Soleimani M, Cronstein B (2009) Adenosine A2A receptors play an active role in mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cell development. J Leukoc Biol 85: 438-444. 116. Ryzhov S, Goldstein A, Novitskiy S, Blackburn M, Biaggioni I, et al. (2012) Role of A2B adenosine receptors in regulation of paracrine functions of stem cell antigen 1positive cardiac stromal cells. J Pharmacol Exp Ther 341: 764-774. 117. Shih Y, Hwang Y, Phadke A, Kang H, Hwang N, et al. (2014) Calcium phosphatebearing matrices induce osteogenic differentiation of stem cells through adenosine signaling. Proc Natl Acad Sci U S A 111: 990-995. 118. Gharibi B, Abraham A, Ham J, Evans B (2011.) Adenosine receptor subtype expression and activation influence the differentiation of mesenchymal stem cells to osteoblasts and adipocytes. J Bone Miner Res 26: 2112-2124. 119. Bootman M, Collins T, Mackenzie L, Roderick H, Berridge M, et al. (2002.) 2aminoethoxydiphenyl borate (2-APB) is a reliable blocker of store-operated Ca2+ entry but an inconsistent inhibitor of InsP3-induced Ca2+ release. FASEB J 16: 11451150. 120. Jacobson K, Ivanov A, de Castro S, Harden T, Ko H (2009) Development of selective agonists and antagonists of P2Y receptors. Purinergic Signal 5: 75-89. 121. Zippel N, Limbach C, Ratajski N, Urban C, Luparello C, et al. (2012) Purinergic receptors influence the differentiation of human mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev 21: 884-900. 122. Ciciarello M, Zini R, Rossi L, Salvestrini V, Ferrari D, et al. (2013.) Extracellular purines promote the differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the osteogenic and adipogenic lineages. Stem Cells Dev 22: 1097-1111. 123. Grierson J, Meldolesi J (1995.) Shear stress-induced [Ca2+]i transients and oscillations in mouse fibroblasts are mediated by endogenously released ATP. J Biol Chem 270: 4451-4456. 88 124. Kwon H, Ohmiya Y, Honma K, Honma S, Nagai T, et al. (2012) Synchronized ATP oscillations have a critical role in prechondrogenic condensation during chondrogenesis. Cell Death Dis 278. 125. Kósa M, Zádor E (2013) Transfection efficiency along the regenerating soleus muscle of the rat. Mol Biotechnol 54: 220-227. 126. Brandl C, Green N, Korczak B, MacLennan D (1986) Two Ca2+ ATPase genes: homologies and mechanistic implications of deduced amino acid sequences. Cell 44: 597-607. 127. Zádor E, Kósa M (2014) The neonatal sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA1b): a neglected pump in scope. Pflugers Arch 467(7):1395-401. doi: 10.1007/s00424-014-1671-3. 128. Zádor E, Owsianik G, Wuytack F (2011) Silencing SERCA1b in a few fibers stimulates growth in the entire regenerating soleus muscle. Histochem Cell Biol 135: 11-20 129. Mendler L, Szakonyi G, Zádor E, Görbe A, Dux L, et al. (1998) Expression of sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+ ATPases in the rat extensor digitorum longus (EDL) muscle regenerating from notexin-induced necrosis. J Muscle Res Cell Motil 19: 777-785 130. Gunteski-Hamblin A, Greeb J, Shull G (1988) A novel Ca2+ pump expressed in brain, kidney, and stomach is encoded by an alternative transcript of the slow-twitch muscle sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase gene. Identification of cDNAs encoding Ca2+ and other cation-transporting ATPases using an oligonucleotide probe derived from the ATP-binding site. J Biol Chem 263: 15032-15040. 131. Burk S, Lytton J, MacLennan D, Shull G (1989) cDNA cloning, functional expression, and mRNA tissue distribution of a third organellar Ca2+ pump. J Biol Chem 264: 18561-18568. 132. Vangheluwe P, Sipido K, Raeymaekers L, Wuytack F (2006) New perspectives on the role of SERCA2's Ca2+ affinity in cardiac function. Biochim Biophys Acta 1763: 1216-1228. 133. Seth M, Li T, Graham V, Burch J, Finch E, et al. (2012) Dynamic regulation of sarcoplasmic reticulum Ca(2+) stores by stromal interaction molecule 1 and sarcolipin during muscle differentiation. Dev Dyn 241: 639-647 134. Stiber J, Hawkins A, Zhang Z, Wang S, Burch J, et al. (2008) STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle. Nat Cell Biol 10: 688-697. 89 135. Sztretye M, Geyer N, AlGhaadi D, Bodnár D, Oláh T, et al. (2014) Mstn-Cmpt Dl1AbcMice. A Mouse Model to Study Muscle Weakness, Fatigue and Soce. 58th Annual Meeting of the Biophysical Society Baltimore 661-Pos Board B416. 136. Collet C, Ma J (2004) Calcium-dependent facilitation and graded deactivation of storeoperated calcium entry in fetal skeletal muscle. Biophys J 87: 268-275 137. Pan Y, Zvaritch E, Tupling A, Rice W, de Leon S, et al. (2003) Targeted disruption of the ATP2A1 gene encoding the sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+ ATPase isoform 1 (SERCA1) impairs diaphragm function and is lethal in neonatal mice. J Biol Chem 278: 13367-13375 138. Sachewsky N, Hunt J, Cooke M, Azimi A, Zarin T, et al. (2014) Cyclosporin A enhances neural precursor cell survival in mice through a calcineurin-independent pathway. Dis Model Mech 7: 953-961. 139. Kim H, Choi S, Jeung E, Yoo Y (2014) Cyclosporine A induces apoptotic and autophagic cell death in rat pituitary GH3 cells. PLoS One 9. 140. Juhász T, Matta C, Katona É, Somogyi C, Takács R, et al. (2014) Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) signalling enhances osteogenesis in UMR106 cell line. J Mol Neurosci 54: 555-573. 141. Zhang M, McLennan I (1995) During secondary myotube formation, primary myotubes preferentially absorb new nuclei at their ends. Dev Dyn 204: 168-177. 142. Porter G, Makuck R, Rivkees S (2002) Reduction in intracellular calcium levels inhibits myoblast differentiation. J Biol Chem 277: 28942-28947. Elektronikus hivatkozás: 1. www.mkk.szie.hu 2. http://www.sigmaaldrich.com/life-science/functional-genomics-and-rnai/shrna/libraryinformation/vector-map.html 3. www.ncbi.nlm.nih.gov