Návrh variantných riešení orgánov na čipe

TRENDY BMI 2023 NÁVRH VARIANTNÝCH RIEŠENÍ ORGÁNOV NA ČIPE Petra Kolembusová1, Norbert Ferenčík1, Radovan Hudák1 1Technická univerzita v Košiciach, Košice ABSTRAKT Technológia organ-on-a-chip, tiež označovaná ako tkanivové čipy, obsahuje skonštruované alebo prirodzené miniatúrne tkanivá odvodené z rôznych orgánov, ktoré rastú v miniaturizovaných tekutinových kanáloch tvarovaných do skla alebo polyméru, a iných biokompatibilných materiálov. Táto technológia bola vyvinutá v priebehu niekoľkých posledných desaťročí interakciou niekoľkých vedeckých disciplín vrátane biológie a inžinierstva. Hlavným cieľom bolo urobiť stručný teoretický prehľad orgánov na čipe a následný návrh rôzných variant podľa teoretických podkladov a štúdií. KĽÚČOVÉ SLOVÁ mikrofluidika, 3D tlač, orgán na čipe, tkanivové inžinierstvo ÚVOD Orgán na čipe (organ-on-a-chip, ďalej „OoC“) je termín používaný na opis mikro-inžinierskeho biomimetického zariadenia, ktoré napodobňuje štruktúru a funkčnosť ľudského tkaniva. Spája inžinierstvo, bunkovú biológiu a biomateriálne technológie na miniatúrnej platforme. Úspešne bolo skonštruovaných niekoľko modelov využívajúcich rôzne orgány, ako je koža na čipe, črevo na čipe, srdce na čipe, pečeň na čipe a pľúca na čipe. Jemné vlasové mikrokanály vedú a manipulujú s médiom, aby vytvorili prostredie, ktoré rekapituluje jednu alebo viac tkanivovo špecifických funkcií. Sú účinnými modelmi ľudskej fyziológie a chorôb, hoci sú oveľa menej zložité ako ľudské orgány alebo tkanivá. Príspevok pozostáva z teoretického prehľadu, kde je popísané ako funguje prístroj organ-on-achip, materiálová analýza a existujúce orgány na čipe. Následne na základe teoretických poznatkov sme navrhli dve varianty orgánu na čipe – črevo na čipe a koža na čipe. MATERIÁLY A METÓDY Namiesto pokusov o znovuvytvorenie celých orgánov sa organ-on-a-chip zameriava na vytváranie malých funkčných modelov jednotlivých orgánov. Umožňuje výskumníkom simulovať fyziologické prostredie orgánu a študovať jeho funkciu a reakciu na rôzne podnety. Potom sa tieto modely môžu použiť na štúdium rôznych chorôb, reakcií na lieky a toxikológie v kontrolovanom prostredí bez potreby testovania na zvieratách alebo testov na ľuďoch. Štúdie na zvieratách sú často drahé, časovo náročné a nemusia presne odrážať ľudskú fyziológiu [1][2]. Hlavným cieľom technológie organ-on-a-chip je obnoviť tri kľúčové aspekty ľudskej fyziológie: • mnohobunkové vaskulárne alebo epiteliálne rozhrania orgánov, ktoré slúžia ako bariéry v tkanivách (napríklad siete krvných ciev, pľúca a črevá), • organizácia parenchýmových buniek na úrovni tkaniva, ktorá dohliada na kľúčové funkčné vlastnosti orgánu (napríklad pečeň, srdce, kostrové svalstvo a nádory) a 180 DOI: 10.13164/trendybmi.2023.180 TRENDY BMI 2023 • metodická interakcia mikrobiálnych spoločenstiev (napríklad absorpcia, distribúcia, metabolizmus a eliminácia liečiva zahŕňajúca črevo, obeh, pečeň a obličky) [1][2]. MATERIÁLOVÁ ANALÝZA Orgány na čipe presne reprezentujú ľudskú fyziológiu in vitro, avšak výber vhodných materiálov je kritický. Materiály hrajú hlavnú úlohu vo vývoji mikrofluidiky a OoC technológií. Vo všeobecnosti úvahy o materiáloch zahŕňajú netoxické pre bunky, priepustné pre plyny, opticky transparentné pre mikroskopické zobrazovanie, náklady na materiály a výrobný proces a schopnosť modelovať špecifické vlastnosti orgánov. Hoci polydimetylsiloxán (PDMS) je stále najbežnejším materiálom pre laboratórny výskum, vyvíjajú sa a používajú sa nové materiály, ako je hydrogél, papier a hybridné materiály. Rozdelenie materiálov môžeme vidieť na Obr. 1. Hodnotenie ľudského fyziologického stavu môže pomôcť preukázať použitie neinvazívnych OoC materiálov v postupoch v reálnom čase [3] – [15]. Obr. 1 Materiály používané na výrobu orgánov na čipe PREHĽAD ORGÁNOV NA ČIPE Orgány na čipe sú navrhnuté tak, aby napodobňovali štruktúru a funkciu ľudských orgánov v laboratórnom prostredí. V súčasnosti existuje niekoľko typov OoC zariadení, ktoré boli vyvinuté, pričom každé je zamerané na konkrétny orgán alebo tkanivo. Niektoré z najznámejších OoC zariadení zahŕňajú: črevo na čipe, srdce na čipe, koža na čipe, oblička na čipe, pľúca na čipe, hepar na čipe. Prebiehajú aj snahy o vývoj OoC zariadení pre iné orgány a tkanivá, napríklad lymfatické uzliny [16]. Výber buniek je obzvlášť dôležitý. Väčšina typov buniek používaných v moderných experimentálnych modeloch pochádza predovšetkým zo zvierat. Avšak avšak často sa stávajú primárnou príčinou zlyhania počas procesu vývoja liečiv, najmä v neskorších fázach, a nedostatočne zobrazujú ľudské poruchy. Embryonálne kmeňové bunky (ESC), indukované pluripotentné kmeňové bunky (iPSC) a dospelé kmeňové bunky (ASC) možno diferencovať a integrovať do mikrofluidných čipov. Bunkové línie a primárne bunky sú v OoC najviac používané, pretože typicky vykazujú dobré charakteristiky biologickej odozvy. Bunkové línie však nereprezentujú normálne fyziologické podmienky a čas primárnej bunkovej kultivácie je obmedzený a kvalita je nestabilná. Naproti tomu kmeňové bunky sú ľahko dostupné a sú nekonečným zdrojom buniek [16]. 181 TRENDY BMI 2023 NÁVRH VARIANTNÝCH RIEŠENÍ ORGÁNOV NA ČIPE Všetky diely boli navrhnuté v programe SolidWorks a upravené v Autodesk Fusion 360. Varianty sa budú líšiť počtom kanálov a typmi navrhovaných buniek a ich cieľom. Na štúdium orgánov existuje veľa návrhov čipov s variáciami vo veľkosti, priemere, počte kanálov, tvaru kanálov a iných geometrických vlastnostiach. ČREVO NA ČIPE Väčšina modelov čreva na čipe zahŕňa formu dvoch mikrokanálov, ktoré sú oddelené poréznou a flexibilnou membránou. Táto konfigurácia napodobňuje stenu (membránu) oddeľujúcu lúmen čreva od drenážnej vaskulatúry. Preto sme zvolili dizajn s dvoma kanálmi – viď. Obr. 2. Obr. 2 Črevo na čipe (Render – Autodesk Fusion 360) Spodný (väčší) kanál je široký jeden milimeter a jeden milimeter vysoký, horný kanál je široký jeden milimeter a štyri desatiny milimetra vysoký. Kanály sú oddelené tenkou poréznou roztiahnuteľnou membránou, ktorá umožňuje bunkovú komunikáciu medzi týmito dvoma kanálmi (Obr. 3). Obr. 3 Princíp návrhu čreva na čipe Aby sme študovali interakcie medzi kultivovaným mikrobiómom a ľudskými črevnými epiteliálnymi bunkami v orgánovom kontexte a napodobňovali ľudské črevné mikroprostredie, ktoré prechádza poranením a zápalom, navrhli sme mikrofluidné zariadenie črevo na čipe. Navrhujeme, aby toto zariadenie bolo vyrobené z opticky čistého, flexibilného polydimetylsiloxánového (PDMS) polyméru. KOŽA NA ČIPE Tento dizajn sme sa rozhodli použiť na testovanie liečiv. Ekvivalenty ľudskej kože (HSE – human skin equivalent) na testovanie liekov pomocou vyvinutých modelov kože in vitro sa považujú za cenné nástroje na štúdium molekulárneho základu bunkových reakcií vo fyziológii a patológii kože. Najmä pokiaľ ide o difúziu liekov, lieky v modeloch 3D kultúr musia difundovať cez viacero vrstiev buniek, aby dosiahli konečný cieľ. 182 TRENDY BMI 2023 Obr. 4 Prvý model kože na čipe Na Obr. 4 je primárny model pre skin-on-a-chip na testovanie životnosti buniek. Testovali by sme jeden druh buniek v každom čipe. Samostatne by sa testovali tri typy: epidermálne, dermálne, a endotelové. Po testovaní každej vrstvy oddelene sme pomocou mikrofluidnej technológie navrhli model ľudskej kože na čipe pozostávajúci z troch vrstiev, t.j. epidermálnej, dermálnej a vaskulárnej vrstvy. Obr. 5 Finálny model koži na čipe Všetky tri vrstvy mikrofluidného zariadenia (viditeľné na Obr. 5), ktoré je určené na dynamický rast buniek, sú rozdelené priehľadnými poréznymi membránami, ktoré umožňujú medzivrstvovú komunikáciu a simulujú biológiu kože. Mikrofluidný systém je navrhnutý na spoločnú kultiváciu ľudských kožných buniek. VÝSLEDKY Najlepšie uvádzané výsledky v oblasti orgánov na čipe sa dosahujú kombináciou klasických vakcinačných alebo injekčných techník s dynamickým kultivačným systémom. Na tieto účely už bolo vyvinutých niekoľko zariadení. Tento princíp je navrhnutý aj v tejto práci. Keďže cieľom tejto diplomovej práce bolo navrhnúť koncept orgánov na čipe, bolo treba urobiť prehľad materiálov, ktoré sú biokompatibilné a nízkonákladové [2] – [16]. Zatiaľ čo špecifická konštrukcia a komponenty zariadení s orgánom na čipe sa môžu líšiť v závislosti od skúmaného orgánu a konkrétnych výskumných otázok, ktoré sa riešia, existuje niekoľko spoločných častí, ktoré väčšina zariadení na čipe zdieľa. Tu sú niektoré z hlavných častí orgánu na čipe: mikrofluidné kanály, extracelulárna matrica (ECM), senzory a detektory, a mechanické pohony. V rámci analýzy štúdií sa podarilo zhrnúť všetky potrebné informácie pre návrh OoC pre dva rôzne orgány – črevo a kožu. V budúcnosti je študovaná problematika otvorená riešeniu ďalších problémov. Prvým veľkým krokom by bola výroba a testovanie všetkých variantov [2] – [16]. 183 TRENDY BMI 2023 ZÁVER Orgány na čipoch ponúkajú novú a výraznú platformu pre výskum rôznych chorôb pokrokovými metódami diagnostiky aj liečby, čo sú kľúčové oblasti štúdia pre zlepšenie globálneho zdravia. Hlavnými hnacími silami tejto technológie je eliminácia testovania na zvieratách in vivo a úspora času a peňazí pri vývoji liekov. Má niekoľko jedinečných vlastností, ktoré by z neho mohli urobiť alternatívny nástroj, ktorý mení hru v tomto odvetví. Medzi ne patrí aj schopnosť uplatniť sa mechanobiologické stimuly, 3D kultúra a interakcie medzi bunkami, online monitorovanie testovania a cenovo dostupné testovanie. Táto práca bola vypracovaná za podpory projektu VEGA 1/0387/22 Vývoj a testovanie systémov pre riadenú stimuláciu rastu buniek v prostredí bioreaktora s využitím počítačového videnia a práca bola podporená Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy č. APVV-20-0068. LITERATÚRA [1] CECEN, Berivan, KARAVASILI, Christina, NAZIR, Mubashir, BHUSAL, Anant, DOGAN, Elvan et al. 2021. Multi-Organs-on-Chips for Testing Small-Molecule Drugs: Challenges and Perspectives. Pharmaceutics https://doi.org/10.3390/pharmaceutics13101657 [2] AZIZIPOUR, Neda, AVAZPOUR, Rahi, ROSENZWEIG, Derek H., SAWAN, Mohamad and AJJI, Abdellah, 2020. Evolution of Biochip Technology: A Review from Lab-on-a-Chip to Organon-a-Chip. Micromachines (Vol. 11, Issue 6, p. 599). MDPI AG. https://doi.org/10.3390/mi11060599 [3] KULTHONG, Kornphimol, DUIVENVOORDE, Loes, MIZERA, Barbara Z., RIJKERS, Deborah, DAM, Guillaume ten et al. 2018. Implementation of a dynamic intestinal gut-on-a-chip barrier model for transport studies of lipophilic dioxin congeners. RSC Advances https://doi.org/10.1039/C8RA05430D [4] LI, Xiang, GEORGE, Subin M., VERNETTI, Lawrence, GOUGH, Albert H. and TAYLOR, D. Lansing, 2018. A glass-based, continuously zonated and vascularized human liver acinus microphysiological system (vLAMPS) designed for experimental modeling of diseases and ADME/TOX. Lab on a Chip https://doi.org/10.1039/C8LC00418H [5] KIM, Hyun Jung, HUH, Dongeun, HAMILTON, Geraldine and INGBER, Donald E., 2012. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip https://doi.org/10.1039/C2LC40074J [6] MILLER, Paula G. and SHULER, Michael L., 2016. Design and demonstration of a pumpless 14 compartment microphysiological system. Biotechnology and Bioengineering https://doi.org/10.1002/bit.25989 [7] POCOCK, Kyall, DELON, Ludivine, BALA, Vaskor, RAO, Shasha, PRIEST, Craig et al. 2017. Intestine-on-a-Chip Microfluidic Model for Efficient in Vitro Screening of Oral Chemotherapeutic Uptake. ACS Biomaterials Science & Engineering https://doi.org/10.1021/acsbiomaterials.7b00023 [8] YOUNG, Miki, RODENHIZER, Darren, DEAN, Teresa, D’ARCANGELO, Elisa, XU, Bin et al. 2018. A TRACER 3D Co-Culture tumour model for head and neck cancer. Biomaterials https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2018.01.038 184 TRENDY BMI 2023 [9] RAHIMI, Rahim, HTWE, Su Su, OCHOA, Manuel, DONALDSON, Amy, ZIEGER, Michael, SOOD, Rajiv et al. 2016. A paper-based in vitro model for on-chip investigation of the human respiratory system. Lab on a Chip https://doi.org/10.1039/C6LC00866F [10] ZHENG, Ying, CHEN, Junmei, CRAVEN, Michael, CHOI, Nak Won, TOTORICA, Samuel et al. 2012. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences https://doi.org/10.1073/pnas.1201240109 [11] LI, Ronald A., KEUNG, Wendy, CASHMAN, Timothy J., BACKERIS, Peter C., JOHNSON, Bryce V. et al. 2018. Bioengineering an electro-mechanically functional miniature ventricular heart chamber from human pluripotent stem cells. Biomaterials Vol. 163, 116–127, https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2018.02.024 [12] YAMADA, Masumi, HORI, Ayaka, SUGAYA, Sari, YAJIMA, Yuya, UTOH, Rie et al. 2015. Cell-sized condensed collagen microparticles for preparing microengineered composite spheroids of primary hepatocytes. Lab on a Chip Vol. 15, 3941–3951, https://doi.org/10.1039/C5LC00785B [13] ZHAO, Xin, LANG, Qi, YILDIRIMER, Lara, LIN, Zhi Yuan, CUI, Wenguo et al. 2015. Photocrosslinkable Gelatin Hydrogel for Epidermal Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials Vol. 5, 108–118, https://doi.org/10.1002/adhm.201500005 [14] CHAN, Hon Fai, ZHANG, Ying and LEONG, Kam W., 2016. Efficient One-Step Production of Microencapsulated Hepatocyte Spheroids with Enhanced Functions. https://doi.org/10.1002/smll.201502932 [15] CRUZ-ACUÑA, Ricardo, QUIRÓS, Miguel, FARKAS, Attila E., DEDHIA, Priya H., HUANG, Sha et al. 2017. Synthetic hydrogels for human intestinal organoid generation and colonic wound repair. Nature Cell Biology Vol. 19, 1326–1335, https://doi.org/10.1038/ncb3632 [16] CHEN, Hanxu, LUO, Zhiqiang, LIN, Xiang, ZHU, Yujuan and ZHAO, Yuanjin, 2023. Sensorsintegrated organ-on-a-chip for biomedical applications. Nano Research http://dx.doi.org/10.1007/s12274-023-5651-9 185