Formulation of Novel Liquid Crystal (LC) Formulations with Skin-Permeation-Enhancing Abilities of Plantago lanceolata (PL) Extract and Their Assessment on HaCaT Cells

2323 Egészségügyi Innovációs Szemle 2022;1(1):23-34Új gyógyszertechnológiai eljárások Új típusú Plantago lanceolata (PL) tartalmú folyadékkristályos rendszerek (LC) formulálása és jellemzése HaCaT sejtvonalon Kósa Dóra1,3,4, Pető Ágota1,3,4, Fenyvesi Ferenc1,3, Váradi Judit1,3, Vecsernyés Miklós1,3, Gonda Sándor2, Vasas Gábor2, Fehér Pálma1,3, Bácskay Ildikó1,3,4, Ujhelyi Zoltán1,3* 1 Debreceni Egyetem, Gyógyszerésztudományi Kar, Gyógyszertechnológiai Tanszék 2 Debreceni Egyetem, Természettudományi Kar, Növénytani Tanszék 3 Debreceni Egyetem, Gyógyszerészeti Tudományok Doktori Iskola 4 Debreceni Egyetem, Egészségipari Intézet Absztrakt A szervezetünket érő reaktív oxigén gyökök olyan súlyos betegségek kiváltói lehetnek, mint például különböző hiperproliferatív bőrbetegségek vagy akár a bőr daganatos elváltozása. Néhány gyógynövény kivonat széles körben elterjedt antioxidáns forrásként több készítményben is megtalálható. Az antioxidáns terápia szerepe egyre jelentősebb a különböző gyulladással járó folyamatokban. Különböző innovatív formulációk lehetőséget biztosítanak a fitofarmakonok hatásának növelésére. A Plantago lanceolata bioaktív vegyületeinek gyulladáscsökkentő, antioxidáns és baktericid hatása egyaránt jól ismert. Az alábbi kísérletsorozat célja egy olyan új típusú folyadékkristály rendszer formulálása volt, amely amellett, hogy megvédi a Plantago lanceolata kivonatot annak hidrolítikus bomlásától, növeli az extractum biohasznosulását is. Tekintettel arra, hogy a gyógyszerkészítmények biztonságossága kiemelkedően fontos szempont a gyógyszerformulálás során, az alkalmazott segédanyagokat és öszszetételeket, azok biokompatibilitását, különböző in vitro módszerekkel vizsgáltuk humán keratinocita (HaCaT) sejtvonalon. Az előzetes citotoxicitás vizsgálatok alapján a kiválasztott felületaktív anyagaink a Labrasol, Lauroglycol 90, és Gelucire 44/14 voltak. A P. lanceolata kivonat kioldódási sebességét Franz diffúziós cella segítségével határoztuk meg. A gyógyszerhordozó rendszerek antioxidáns tulajdonságait MDA (malonaldehid), valamint DPPH (2,2-difenil-1-pikril-hidrazil) antioxidáns tesztekkel vizsgáltuk. Eredményeink alapján a formulált készítmények a hatóanyag gyors felszívódását biztosítják azáltal, hogy az alkalmazott penetrációfokozó segédanyagok reverzibilisen módosítják a stratum corneum barrier tulajdonságait. Ezek a segédanyagok nem csak biztonságosan alkalmazhatók és jól tolerálhatók, de előnyös tulajdonságaik révén képesek a hatóanyag jobb biohasznosulása által javítani a készítmények használhatóságát. Kulcsszavak: Folyadékkristályos rendszerek, Plantago lanceolata, Penetrációfokozók, antioxidáns, DPPH teszt, Sejtéletképességi vizsgálatok, MTT teszt, ROS; MDA; RTCA; TEER; HaCaT sejtvonal Formulation of Novel Liquid Crystal (LC) Formulations with Skin-Permeation-Enhancing Abilities of Plantago lanceolata (PL) Extract and Their Assessment on HaCaT Cells Abstract Exposure to reactive oxygen species can easily result in serious diseases, such as hyperproliferative skin disorders or skin cancer. Herbal extracts are widely used as antioxidant sources in different compositions. The importance of antioxidant therapy in inflammatory conditions has increased. Innovative * A levelező szerző elérhetősége: Debreceni Egyetem, Gyógyszerésztudományi Kar, Gyógyszertechnológiai Tanszék, 4032 Debrecen, Nagyerdei krt. 98; [email protected] Új gyógyszertechnológiai eljárások 2424 Egészségügyi Innovációs Szemle 2022;1(1):23-34 Bevezetés A cuAz emberi bőr, mint elsődleges védelmi vonal számos környezeti hatástól, többek közt a reaktív oxigén gyökök (ROS) káros következményeitől védi szervezetünket.1 Bár a reaktív oxigéngyökök patogén hatásának pontos mechanizmusa jelenleg még nem teljesen ismert, szerepük bizonyos súlyos kórképek, mint hiperproliferatív bőrbetegségek vagy bőrrák kialakulásában már egyértelműen bizonyított.2 Az elmúlt évtizedekben számos erőfeszítés irányult a ROS behatás csökkentésére és/vagy semlegesítésére.3 A 200-280 nm hullámhosszú UV-C sugárzás gyakran eredményezheti a reaktív gyökök kialakulását.4 Mivel az UV-C olyan ionizáló sugárzás, amely erős mutagénként a fent említett immunmediált betegségeket, vagy akár bőrrákot is okozhat. A jellemzően gyakori UV-C expozíció miatt a sugárzás csökkentése azonban jelenleg sajnos lehetetlennek tűnő feladat. Mindezek alapján innovatív fejlesztésű antioxidáns terápia hatékony megoldásnak bizonyulhat. A gyógynövények a bennük található hasznos kémiai anyagoknak köszönhetően alapvető szerepet töltenek be az egészség megőrzésében.5 A Plantago nemzetségbe tartozó közel 275 faj közül az egyik legfontosabb a Plantago lanceolata (PL), magyar nevén lándzsás útifű.6 A P. lanceolata bioaktív komponensei különféle farmakológiai tulajdonságokkal rendelkeznek, beleértve a gyulladáscsökkentő, vizelethajtó, antibakteriális,7 hepatoprotektív8 és antioxidáns9 hatásokat. A gyógyászatban napjainkban leginkább légzőrendszeri betegségek, továbbá bőrsérülések kezelésére alkalmazzák.10 A népgyógyászat évszázadokon keresztül használta sebek, égések kezelésére, vérzéscsillapításra is.11 A P. lanceolata fő aktív komponense a feniletanoidglikozidok közé tartozó verbaszkozid (akteozid).12 Bár közismerten kiváló biztonsági profillal rendelkezik, a hidrolízisre való hajlamból adódó gyenge kémiai stabilitása korlátozza a gyógyszertechnológiai felhasználhatóságát.13 Számos előnyös hatásának ellenére az akteozid magas hidrofil jellege miatt limitáltak a lehetséges alkalmazási módszerek.14 A fent említett korlátok kiküszöbölésének érdekében folyadékkristály rendszereket formuláltunk, melyek amellett, hogy védik a P. lanceolata kivonatot a hidrolízistől, fokozzák annak hatásait is. A folyadékkristályok nem kovalens kötéssel kapcsolódó molekulák különböző molekuláris orientációjú fázisokkal (mezofázis).15 Anizotróp jellegükből adódóan részben folyadékokra, részben pedig kristályokra jellemző tulajdonságokat mutatnak, továbbá képesek szolubilizálni az olajés vízoldható vegyületeket egyaránt.16 A folyadékkristályok általában vízből vagy esetleg olajból, illetve egy, vagy több tenzidből képződnek meghatározott koncentráció és hőmérséklet-tartományban.17 Mivel a felületaktív anyagok egy megformulations can be used to improve the effects of these phytopharmacons. The bioactive compounds of Plantago lanceolata (PL) possess different effects, such as anti-inflammatory, antioxidant, and bactericidal pharmacological effects. The objective of this study was to formulate novel liquid crystal (LC) compositions to protect Plantago lanceolata extract from hydrolysis and to improve its effect. Since safety is an important aspect of pharmaceutical formulations, the biological properties of applied excipients and blends were evaluated using assorted in vitro methods on HaCaT cells. According to the antecedent toxicity screening evaluation, three surfactants were selected (Gelucire 44/14, Labrasol, and Lauroglycol 90) for the formulation. The dissolution rate of PL from the PL-LC systems was evaluated using a Franz diffusion chamber apparatus. The antioxidant properties of the PL-LC systems were evaluated with 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and malondialdehyde (MDA) assessments. Our results suggest that these compositions use a nontraditional, rapid-permeation pathway for the delivery of drugs, as the applied penetration enhancers reversibly alter the barrier properties of the outer stratum corneum. These excipients can be safe and highly tolerable thus, they could improve the patient’s experience and promote adherence. Keywords: liquid crystals; Plantago lanceolata; penetration enhancers; antioxidant and anti-inflammatory effects; DPPH test; cytotoxicity investigation; MTT test; ROS; MDA; RTCA; TEER; HaCaT cells 2525 Egészségügyi Innovációs Szemle 2022;1(1):23-34Új gyógyszertechnológiai eljárások határozott csoportjának egyértelmű penetrációfokozó hatása van, ezen segédanyagok körültekintő megválasztása ellensúlyozhatja az észter típusú vegyületek káros hatását. A kémiailag indukált sejtműködés megváltoztatása előnyös lehet. A penetrációfokozó segédanyagok sejtéletképességre és celluláris transzportra gyakorolt hatása egyaránt meghatározható in vitro körülmények között. A vegyületek, sejt-sejt közötti szoros kapcsolatának kialakításában résztvevő junkciós fehérjékre (ZO-1, claudin-1, béta-catenin stb.), és ezáltal a paracelluláris integritás növelésére gyakorolt hatását már korábban leírták.18 Hatékonyságuk mértéke a segédanyagok és összetételek fizikai tulajdonságaitól és kémiai szerkezetétől egyaránt függ.19 Hasonló szerkezetek esetén, ha a hidrofil fejet polietilénről propilén-glikolra cseréljük, a citotoxicitás fő meghatározó tényezője a monoészter tartalom és a szénlánc hossza lesz.20 Azonban nem csak a szénlánc hossza befolyásolja a bélből történő felszívódás mértékét, hanem számos más szerkezeti paraméter is, mint például az észtereződés mértéke, a telítetlenség helyzete, vagy a szubsztituensek típusa, melyek egyaránt befolyásolhatják a felületaktív anyagok penetrációfokozó hatását.21 Kísérletsorozatunk célja egy olyan biztonságos gyógyszerforma kialakítása volt, melyből a Plantago lanceolata kivonat bőrön keresztül történő felszívódása fokozott. A bőrön keresztül történő gyógyszerbevitel során két fő kihívással kell szembenéznünk. Tekintettel arra, hogy a helyi gyógyszeres terápiával szembeni beteg compliance alacsony, a hatóanyag szolubilizációja, valamint a szarurétegen keresztül történő megfelelő penetrációja mellett kiemelten fontos a kezeléssel szemben tanúsított beteg adherencia is. A különböző gyógyszertetchnológiai segédanyagok az előzőekben említett kihívások kiküszöbölésében is segíthetnek.22 Kutatásunk célja PL tartalmú folyadékkristály rendszerek formulálása és vizsgálata volt. Az LC rendszerek formulálásával a hatóanyag védelmén kívül növeltük annak biohasznosulását is. A preformulációs vizsgálatok alapján három különböző penetrációfokozó segédanyagot (Labrasol, Lauroglycol 90, és Gelucire 44/14) tartalmazó összetételből választottunk ki négyet.23 Mivel a gyógyszerkészítmények biztonságossága elengedhetetlen szempont, az alkalmazott segédanyagok és összetételek biológiai tulajdonságait RTCA (Real-Time Cell Electric Sensing), illetve MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliumbromid) sejtéletképességi teszttel vizsgáltuk humán keratinocita (HaCaT) sejtvonalon.24 A sejtvonalat széles körben alkalmazzák helyileg alkalmazott gyógyszerkészítmények citotoxicitásának in vitro modellezésére.25 A hiperproliferatív bőrbetegségek in vitro modelljeként IL-1 és TNF-alfa indukált keratinocitákat használtunk.26 A formulált PL-LC rendszerek hatásának vizsgálatához a keratinocita sejtekben UV-C sugárzással indukált oxidatív stresszt váltottunk ki. A gyógyszerhordozó rendszerek antioxidáns tulajdonságait MDA (malonaldehid), valamint DPPH (2,2-difenil-1pikril-hidrazil) antioxidáns tesztekkel vizsgáltuk. Kísérleteink eredményei nem csak a különböző penetrációfokozó segédanyagokat tartalmazó formulációk hatékonyságbeli különbségét, de azok hiperproliferatív bőrbetegségek kezelésében történő alkalmazásának előnyeit is bizonyították. Eredmények Folyadékkristály rendszerek formulálása A folyadékkristályok kialakulásának paramétereit pszeudoterner fázisdiagram segítségével határoztuk meg. A Labrasol/Lauroglycol 90 (6:1)/Gelucire 44/14/víz pszeudoterner diagram az 1. ábrán látható. Annak érdekében, hogy a víztartalomnak a folyadékkristályos szerkezetre gyakorolt hatását tanulmányozzuk, különböző víztartalmú (10% - 90%) mintákat készítettünk. A titrálás során főként mikroemulziók képződtek. Amikor a víz aránya 90% fölé emelkedett makroemulziók alakultak ki, függetlenül a Labrasol/Lauroglycol 90 és Gelucire 44/14 felületaktív anyagok arányaitól. Ezzel szemben folyadékkristályos rendszerek csak az összetevők egy bizonyos, szűkebb tartományában keletkeztek, amikor a keverék Labrasol/Lauroglycol 90 tenzid párt 10% alatt tartalmazott. A diagram alapján négy különböző összetételt választottunk ki a Labrasol/Lauroglycol 90 állandó 6:1 arányával további vizsgálatokra. A formulációk tiszták és stabilok voltak 4,1–9,9%-os Labrasol/Lauroglycol 90, valamint 31,1% – 52%-os Gelucire 44/14 tartományokban. A kiválasztott PL kompozíciókat az 1. táblázat mutatja. Új gyógyszertechnológiai eljárások 2626 Egészségügyi Innovációs Szemle 2022;1(1):23-34 In vitro kioldódás vizsgálat A 2. ábra a szintetikus cellulóz-acetát membránon keresztül diffundált PL-kivonat százalékos arányát mutatja az idő függvényében. Az összetételekből felszabadult hatóanyag mennyisége alapján az alábbi csökkenő sorrendet állítottuk fel: PL-LC 2 > 1 > 4 > 3. Eredményeink alapján jobb hatóanyag kioldódás történt azokból a készítményekből, melyek a Labrasol/Lauroglycol 90 tenzid párból többet tartalmaztak. A legjobb diffúziót az I. és II. kompozíció esetében sikerült elérni, ahol a felületaktív anyagok tartománya 9,9% és 7,8% volt, a diffundált PL-kivonat mennyisége pedig meghaladta az 50% -ot. A III. és a IV. kompozíció esetében, amelyek kevesebb felületaktív anyagot tartalmaztak, rosszabb hatóanyag diffúziót tapasztaltunk, a felszabadult gyógyszer mennyisége 40% alatt volt. HaCaT sejtproliferációs vizsgálat A proliferációs vizsgálatokat 104/200 µL sűrűséggel szélesztett HaCaT sejteken végeztük az xCELLigence Real-Time Cell Analyzer (RTCA) segítségével. A 3. ábra szemlélteti a vizsgált minták között tapasztalt jelentős különbségeket. A HaCaT sejtproliferáció impedancia mérésen alapuló meghatározása azonban a sejtindex nyilvánvaló növekedését mutatta mindegyik esetben eltérő proliferációs kinetika mellett. Míg a kezeletlen HaCaT sejtek hét nap elteltével alakították ki a konfluens monolayer sejtréteget, az IL-1-béta - és a TNF-alfa stimulált keratinociták (PSmHaCaT) a gyors proliferáció következtében hamarabb elérték a platófázist. Ezen felül a PSmHaCaT keratinociták magasabb sejtindex értékeket mutattak ebben a szakaszban. Ennek megerősíté1. ábra. Labrasol/Lauroglycol 90 (6:1)/Gelucire 44/14/víz rendszer pszeudoterner fázisdiagramja; a sötétkék terület a folyadékkristályok képződésének tartományát jelöli (LC). A kiválasztott Plantago lanceolata (PL)-LC összetételek (I–IV) komponenseinek aránya 1. táblázat: A kiválasztott folyadékkristályos rendszerek összetételei a pszeudoterner fázisdiagramok alapján PL-LC Összetétel Plantago Extractum Gelucire 44/14 Labrasol/ Lauroglycol 90 Víz 11.25 mL (4.95%) 10 mL (39.60%) 2.5 mL (9.90%) 11,5 mL (45.55%) 21.6 mL (4.92%) 10 mL (31.15%) 2.5 mL (7.79%) 18 mL (56.08%) 31.1 mL (5.09%) 11.25 mL (52.08%) 1.25 mL (5.79%) 8 mL (37.04%) 41.5 mL (5.00%) 11.25 mL (37.50%) 1.25 mL (4.17%) 16 mL (53.33%) 2727 Egészségügyi Innovációs Szemle 2022;1(1):23-34Új gyógyszertechnológiai eljárások 3. ábra. HaCaT sejtproliferáció impedancia alapú méréseinek eredménye 4. ábra. Transepithelialis elektromos ellenállás (TEER) mérés eredményei 2. ábra. A kompozíciók kioldódás profiljai 0 10 20 30 40 50 60 70 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 Kioldódott PL extraktum (%) Idő (perc) PL-LC 1 PL-LC 2 PL-LC 3 PL-LC 4 3. ábra HaCaT sejtproliferáció impedancia alapú méréseinek eredménye. 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 Sejtindex Idő (óra) HaCaT PSmHaCaT 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 0 6 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 Transzepitheliális elektromos ellenállás (Ωxcm²) Idő (óra) HaCaT PSmHaCaT Új gyógyszertechnológiai eljárások 2828 Egészségügyi Innovációs Szemle 2022;1(1):23-34 sére a sejtek transzepithelialis elektromos ellenállását (TEER) is mértük, mely mérések eredménye összhangban van az RTCA tesztekkel. Amint az a 4. ábrán is látható, magasabb TEER értékeket figyeltünk meg a PSmHaCaT sejteknél, mint a kezeletlen keratinociták esetében. MTT sejtéletképesség vizsgálat A biztonságos alkalmazás biztosításának érdekében MTT citotoxicitás vizsgálatokat végeztünk HaCaT sejtvonalon. A formulációk citotoxicitását különböző koncentrációkban vizsgáltuk. Az egyes összetevőket szintén teszteltük külön-külön. Az 5. ábrán látható, hogy a készített LC rendszerek, illetve azok alkatrészei sem befolyásolták jelentősen a sejtéletképességet. A sejtéletképesség még magasabb koncentrációk esetében is 50% felett volt a negatív kontrollhoz képest (foszfát-puffer, PBS). Megállapítottuk, hogy az összes kompozíció jól tolerálható. Nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget az LC-rendszerekkel, illetve a negatív kontrollként alkalmazott PBS-sel kezelt csoportok esetében, bár mind közül a II. összetétel csökkentette legkevésbé a sejtéletképességet. DPPH gyökfogó aktivitás vizsgálat A vizsgálat alapja a DPPH szabadgyök antioxidáns jelenlétében történő színváltozása. A folyadékkristály rendszereket Plantago lanceolata kivonattal, illetve anélkül is vizsgáltuk. Kontrollként a megfelelő vak formulációkat és 5% Plantago lanceolata kivonat vizes diszperzióját (CE) alkalmaztuk. Mint azt már korábban leírtuk, a formulált LC minták szintén 5 v/v% PL kivonatot tartalmaztak. Az antioxidáns aktivitás százalékos arányát DPPH teszttel mértük. A DPPH gyökfogó aktivitást BrandWilliams és munkatársai által leírt módszer alapján mértük.27 Eredményeink alapján szignifikáns különbségeket tapasztaltunk a vizsgált csoportok között, melyet a 6. ábrán csillaggal jelöltünk. Az elvégzett vizsgálat megerősítette, hogy az összes kompozíció képes jelentősen gátolni a DPPH oxidációját. Megállapítottuk, hogy az I. és a II. összetételek a leghatékonyabbak, ezzel szemben a IV. összetétel mutatta a legkisebb aktivitás, bár antioxidáns kapacitása így is jelentősen magasabbnak bizonyult, mint a kontroll csoporté (CE). Lipidperoxidáció (MDA) vizsgálat A formulációk UV sugárzással szembeni védőhatását HaCaT, illetve PSmHaCaT sejteken vizsgáltuk. Az in vitro antioxidáns aktivitás mérések eredményeit a 7. ábra mutatja be. Az MDA szintjében mért különbségek megerősítették a P. lanceolata kivonat antioxidáns hatékonyságát, és a megfelelően kiválasztott komponensek fontosságát egyaránt. Amellett, hogy az összes formuláció csökkentette az MDA szintet a kontroll csoportokhoz képest, azt tapasztaltuk, hogy az I. összetétel (a legna5. ábra. A formulációk, illetve azok komponenseinek toxicitás vizsgálata HaCaT sejtvonalon. Pozitív kontrollként Triton-X-100at; negatív kontrollként foszfát-puffert (PBS) használtunk 5. ábra A formulációk, illetve azok komponenseinek toxicitás vizsgálata HaCaT sejtvonalon. Pozitív kontrollként 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 00,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 0,55 0,6 0,65 0,7 0,75 HaCaT sejtéletképesség (%) Koncentráció (m/m%) PL-LC I. PL-LC II. PL-LC III. PL-LC IV. Gelucire 44/14 Labrasol Lauroglycol 90 PBS Triton X-100 2929 Egészségügyi Innovációs Szemle 2022;1(1):23-34Új gyógyszertechnológiai eljárások gyobb penetrációfokozó segédanyag tartalommal) esetében jelentősebb ez a csökkenés. UV-C expozíció HaCaT sejteken Az LC-PL kompozíciók UV-C besugárzás elleni hatását HaCaT, illetve stimulált keratinocita (PSmHaCaT) sejtvonalakon vizsgáltuk. A formulációk összetételét annyiban módosítottuk (2. táblázat), hogy desztillált víz helyett azonos térfogatú DMEM sejtkultúrás médiumot használtunk a víz káros hatásainak elkerülése érdekében. A 8. ábra az UV-indukált oxidatív stresszt követő sejtéletképességet mutatja. Az első kísérletben nem alkalmaztunk PL-LC kezelést. Az eredmények alátámasztották az UV-C sugárzás különböző sejtvonalakra kifejtett káros hatását, továbbá megfigyeltük, hogy 6 perc UV-C expozíció a sejtéletképesség jelentős csökkenését eredményezte. A sugárzás által stimulált proliferációs változásokat MTT-teszttel vizsgáltuk az expozíciót követő 12., 24. és 48. órában. Azt tapasztaltuk, hogy 6 perc UV-C expozíció robusztus PSmHaCaT sejtproliferációt eredményezett. Két nap elteltével az UV-C-stimulált PSmHaCaT sejtek életképessége meghaladta a kezeletlen sejtek életképességét. A 9. ábra PL-LC-vel kezelt sejtek életképességét mutatja 6 perc UV-C expozíció okozta oxidatív stressz után. Az eredmények alapján a PL-LC kezelés részben gátolta az UV-C sugárzás káros hatásait. A Plantago kivonat antioxidáns hatása mellett a Labrasol/Lauroglycol 90 penetrációfokozó hatása is érvényesült, mivel az I. és III. kompozícióból, amelyek a tenzid párt nagyobb koncentrációban tartalmazzák, időegység alatt nagyobb menynyiségű hatóanyag került a sejtekbe, növelve ezzel a sejtéletképességet. Az átfogó elemzés kimutatta, hogy ugyan az LC-PL kezelés nem képes teljes mértékben megvédeni a keratinocitákat, a PSmHaCaT sejtek esetében megfigyelt UV-C expozíció okozta hiperproliferációt azonban megelőzte. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 MDA (%) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 MDA (%) 7. ábra. Az LC-PL rendszerek HaCaT (a) és PSmHaCaT (b) sejtek MDA szintjére gyakorolt hatása 6 perc UV expozíciót követően. Pozitív kontrollként PL kivonatot, negatív kontrollként pedig kezeletlen sejteket alkalmaztunk b) 6. ábra Az LC-PL összetételek által közömbösített reaktív oxigéngyökök százalékos aránya. Pozitív kontrollként 5 LC-PL 1; 41,019 LC-1; 1,652 LC-PL 2 ; 47,398 LC-2; 6,264 LC-PL 3 ; 34,245 LC-3; 5,785 LC-PL 4; 30,057 LC4; 1,964 CE (5 v/v%); 18,547 010 20 30 40 50 1 Az LC-PL rendeszerek által közömbösített ROS (%) * * * * v * v 6. ábra. Az LC-PL összetételek által közömbösített reaktív oxigéngyökök százalékos aránya. Pozitív kontrollként 5 v/v% P. lanceolata kivonat vizes diszperzióját választottuk, negatív kontrollként pedig hatóanyag nélküli folyadékkristályt. A szignifikanciát csillaggal jelöltük (*). * p < 0,05 a negatív kontrollhoz viszonyítva 2. táblázat: Módosított folyadékkristályos rendszerek összetételei PL-LC Összetétel Plantago Extractum Gelucire 44/14 Labrasol/ Lauroglycol 90 DMEM 11.25 mL (4.95%) 10 mL (39.60%) 2,5 mL (9.90%) 11,5 mL (45.55%) 21.6 mL (4.92%) 10 mL (31.15%) 2,5 mL (7.79%) 18 mL (56.08%) 31.1 mL (5.09%) 11,25 mL (52.08%) 1,25 mL (5.79%) 8 mL (37.04%) 41.5 mL (5%) 11,25 mL (37.50%) 1,25 mL (4.17%) 16 mL (53.33%) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 MDA (%) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 MDA (%) a) Új gyógyszertechnológiai eljárások 3030 Egészségügyi Innovációs Szemle 2022;1(1):23-34 Diszkusszió A fitofarmakonok antioxidáns terápiában betöltött szerepe folyamatosan növekszik.28 Annak ellenére azonban, hogy hatásuk bizonyítottan előnyös, a vegyületek hatékonyságának növelése különböző gyógyszertechnológiai formulációs módszerekkel elengedhetetlen.29 A folyadékkristályos rendszerek helyi terápiában elért hatékonyságát már korábban leírták.30 A folyadékkristályok nem kovalens kötéssel kapcsolódó molekulák különböző molekuláris orientációjú fázisokkal (mezofázis).15 Anizotróp jellegükből adódóan részben folyadékokra, részben pedig kristályokra jellemző tulajdonságokat mutatnak, továbbá képesek szolubilizálni az olajés vízoldható vegyületeket egyaránt.16 Mindezeken felül a folyadékkristályok képzéséhez olyan felületaktív anyagként használható speciális észtervegyületek is alkalmazhatóak melyek penetrációfokozó hatása bizonyított.31 Ezen tulajdonságaik miatt az LC rendszerek nemcsak gyógyszertechnológiai szempontjából, hanem a biohasznosulás és egész terápiás értéküket számítva is előnyösek. Kísérletsorozatunkban különböző Plantago lanceolata kivonatot tartalmazó készítményeket formuláltunk majd elvégeztük ezek részletes gyógyszertcehnológiai jellemzését is. Kísérleti eredményeink rámutattak, hogy a felhasználni kívánt segédanyagok és felületaktív anyagok megfelelő kiválasztása egyaránt rendkívül fontos tényező. Formuláció során a Labrasol/Lauroglycol 90 (6:1)/ Gelucire 44/14 tenzideket, valamint vizet számunkra megfelelő arányban tartalmazó összetételeket strukturált pszeudoterner fázisdiagram segítségével határoztuk meg, továbbá meghatároztuk a felszabadult hatóanyag mennyiségét is. Az előállított LC rendszerek biokompatibilitását különböző in vitro sejtkultúrás vizsgálatokkal elemeztük. Ezekhez a kísérletekhez humán keratinocita HaCaT sejtvonalon kívül TNF-alfa és IL-1 indukált humán PSmHaCaT sejteket használtunk. A sejtproliferáció impedancia mérésen alapuló meghatározása minden esetben a sejtindex egyértelmű növekedését mutatta. Ezenfelül, a proliferáció kinetikájában is különbséget tapasztaltunk: míg a natív HaCaT sejtek a konfluens sejtréteget 7 nap után érték el, az IL-1 és TNF-alfa stimulált keratinociták (PSmHaCaT) gyorsabb proliferáció következtében hamarabb elérték a platófázist. Mindezek mellett, a PSmHaCaT sejtek magasabb sejtindex értéket mutattak ebben a fázisban. Az elvégzett MTT tesztek megerősítették, hogy a formulált LC rendszerek, valamint azok összetevői sem befolyásolták jelentősen a sejtéletképességet. A készítmények tehát biztonságosnak bizonyultak. A gyökfogó aktivitás vizsgálat kimutatta, hogy a formulációk jelentős mértékben gátolták a DPPH oxidációját. A tesztelt LC-PL rendszerek közül az I. és II. bizonyult a leghatékonyabbnak, míg a IV. összetétel mutatta a legkisebb aktivitást. A PL-LC készítmények antioxidáns hatását MDA lipidperoxidációs vizsgálattal is ellenőriztük. A vizsgálat eredményeként megállapítottuk, hogy 8. ábra MTT citotoxicitás vizsgálat eredményei HaCaT, illetve PSmHaCaT sejteken UV expozíciót követő 12., 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 012 24 48 Sejtéletképesség (%) Idő (óra) HaCaT PSmHaCaT HaCaT (6 perc UV expozíció után) PSmHaCaT (6 perc UV expozíció után) * * * * * * 8. ábra. MTT citotoxicitás vizsgálat eredményei HaCaT, illetve PSmHaCaT sejteken UV expozíciót követő 12., 24., 48. órában. A szignifikanciát csilaggal jelöltük (*). * p < 0,05 a kezeletlen sejtek életképességéhez viszonyítva 9. ábra 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 012 24 48 Sejtéletképesség (%) Idő (óra) HaCaT PL-LC 1 HaCaT PL-LC 2 HaCaT PL-LC 3 HaCaT PL-LC 4 HaCaT PL-LC 1 (6 perc UV expozíció után) HaCaT PL-LC 2 (6 perc UV expozíció után) HaCaT PL-LC 3 (6 perc UV expozíció után) HaCaT PL-LC 4 (6 perc UV expozíció után) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 012 24 48 Sejtéletképesség (%) Idő (óra) PSmHaCaT PL-LC 1 PSmHaCaT PL-LC 2 PSmHaCaT PL-LC 3 PSmHaCaT PL-LC 4 PSmHaCaT PL-LC 1 (6 perc UV expozíció után) PSmHaCaT PL-LC 2 (6 perc UV expozíció után) PSmHaCaT PL-LC 3 (6 perc UV expozíció után) PSmHaCaT PL-LC 4 (6 perc UV expozíció után) 9. ábra. MTT citotoxicitás vizsgálat eredményei HaCaT (a), illetve PSmHaCaT (b) sejteken 6 perccel az UV expozíciót követően a) b) 3131 Egészségügyi Innovációs Szemle 2022;1(1):23-34Új gyógyszertechnológiai eljárások a kontroll csoportokhoz képest az összes formuláció képes volt csökkenteni a malondialdehid (MDA) szintet, továbbá azt láttuk, hogy az I. összetétel esetében ez a csökkenés szignifikáns. Eredményeink tehát alátámasztják a penetrációfokozó segédanyagok szerepét az antioxidáns hatás elérésében. Ezt a megfigyelést igazolták az UV-C besugárzás eredményei, mely szerint a sugárzás destruktívan hatott az egyes sejtvonalakra. Hat perc UV-C expozíciót követően ugyanis jelentős sejtéletképesség csökkenést tapasztaltunk. A sugárzást követően végzett MTT teszt alapján jelentős PSmHaCaT sejtproliferációt láttunk. Két nap elteltével a besugárzott PSmHaCaT sejtek életképessége meghaladta a kezeletlen sejtekét. A formulációkkal történő kezelés részben egyértelműen blokkolta az UV-C sugarak káros hatását. Mindezek mellett, a Plantago kivonat antioxidáns hatása, valamint a Labrasol/Lauroglycol 90 penetrációfokozó hatása is érvényesült, mivel az I. és III. összetételekből, melyek arányaiban többet tartalmaztak a tenzidpárból, nagyobb mennyiségű hatóanyag jutott a sejtekbe. Megfigyeléseink alapján ugyan a PL-LC kezelés nem tudta megvédeni a keratinocitákat, a PSmHaCaT sejtek UV-C sugárzás okozta hiperproliferációját képes volt csökkenteni. Kísérletsorozatunk eredményei tehát igazolják az antioxidáns terápia fontosságát, különösen gyulladással járó állapotok esetén. Összességében elmondható, hogy kutatásunk hasznos adatokat szolgáltathat egy innovatív, biztonságos és hatékony helyi készítmény kifejlesztéséhez. Anyagok, módszerek Anyagok A Plantago lanceolata kivonatot Vasas Gábor és munkatársai biztosították számunkra. A Gelucire 44/14, Labrasol, illetve Lauroglycol 90 tenzidek kedves ajándék volt a Gattefossétől (Lyon, Franciaország). A 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium-bromid MTT-festéket, DMEM sejttenyésztő médiumot, a foszfát-puffert (PBS), a tripszin-etilén-diamin-tetraecetsavat (EDTA), a hőinaktivált fötális szarvasmarha szérumot (FBS), az L-glutamint, a nem esszenciális aminosav-oldatot és a penicillin–sztreptomicint a Sigma-Aldrichtől (St. Louis, MO, USA) szereztük be. A 96 lyukú plateket és sejttenyésztő flaskákat a VWR International-től (Debrecen, Magyarország) vásároltuk. A HaCaT sejtvonalat (humán keratinocita sejtek) a Cell Lines Service-től (CLS, Heidelberg, Németország) szereztük be. A TBARS Assay készletet a Cayman Chemical-tól (Ann Arbor, MI, USA) vásároltuk. A 2,2-difenil-1-pikril-hidrazilt (DPPH), az abszolút etanolt, az IL-1-et és a TNF-alfát a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA) szereztük be. Száraz Plantago lanceolata levél metanolos kivonata A gyógyszerkönyvi standard minőségű P. lanceolata leveleket kereskedelmi forgalomból vásároltuk. A leveleket ledaráltuk, majd finom eloszlású porrá redukáltuk a további alkalmazás céljából. A port 30 percig visszafolyatás közben extraháltuk metanollal, szűrtük, majd rotációs vákuum bepárlóban szárítottuk. A kivonatot hexánnal zsírmentesítettük (3x50 mL). Az eljárás végén 100 g növényi kiindulási anyag 25,2 g Plantago kivonatot eredményezett. Az extraktumot hiteles standardokkal végzett kalibrálás után LC-ESI-MS módszerrel19 jellemeztük. A kivonat 5,99% acteozidot, 2,34% aucubint, valamint 1,21% katalpolt tartalmazott, amely 1.51%, 0.59%, valamint 0.31% szárított növényi droggal ekvivalens. Folyadékkristályok formulálása Ahhoz, hogy meghatározzuk a folyadékkristályok komponenseinek optimális koncentráció tartományát, titrálásos módszer segítségével pszeudoterner fázis diagramot szerkesztettünk.15 A citotoxicitási vizsgálatok alapján a Labrasolt, Lauroglycol 90-et és Gelucire 44/14-et választottuk felületaktív anyagokként. Első lépésben a szükséges mennyiségű Plantago lanceolata extraktumot (minden összetétel esetében 5%-nak megfelelő mennyiséget) a felületaktív anyagok keverékében oldottuk. Ezt követően folyamatos keverés közben vizet adtunk a rendszerhez. A víztartalom a különböző összetételek esetében 37% és 56% között változott állandó 6:1 Labrasol/ Lauroglycol 90 arány mellett. A pszeudoterner diagram alapján munkánkat a továbbiakban négy különböző összetételű minta vizsgálatával folytattuk, melyek összetételét az 1. táblázat mutatja.