Biomaterial combinado con rhBMP-2: Valoración de la regeneración ósea

GRADO EN MEDICINA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE CIRUGÍA TRABAJO FIN DE GRADO Biomaterial combinado con rhBMP-2: Valoración de la regeneración ósea Alumno: Javier López-Andaluz Mangas Directora: M.ª Begoña García Cenador Salamanca Mayo 2024 Javier López-Andaluz Mangas Trabajo Fin de Grado “Biomaterial combinado con rhBMP-2: Valoración de la regeneración ósea” DECLARACIÓN DE AUTORÍA Declaro que he redactado el trabajo “Biomaterial combinado con rhBMP-2: Valoración de la regeneración ósea” para la asignatura Trabajo Fin de Grado en el curso académico 2023-2024 y asumo la originalidad de dicho trabajo, no utilizando fuentes de información sin mencionar de forma clara su origen, tanto en el texto como en la bibliografía. En Salamanca, a 14 Mayo de 2024 Fdo: Javier López-Andaluz Mangas LOPEZANDALUZ MANGAS JAVIER - 70885311R Firmado digitalmente por LOPEZ-ANDALUZ MANGAS JAVIER - 70885311R Fecha: 2024.05.13 22:08:28 +02'00' Javier López-Andaluz Mangas Trabajo Fin de Grado “Biomaterial combinado con rhBMP-2: Valoración de la regeneración ósea” I ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 1 1.1. ESTADO ACTUAL DEL PROBLEMA ....................................................... 1 1.2. REMODELACIÓN ÓSEA: FISIOLOGÍA .................................................. 2 1.2.1. CICLO DE REMODELACIÓN ÓSEA .................................................... 3 1.2.2. HOMEOSTASIS ÓSEA ........................................................................... 5 1.2.2.1. Vía BMP ................................................................................................... 5 1.3. TRATAMIENTO DE LAS ALTERACIONES DE LA REMODELACIÓN ÓSEA............................................................................................................................ 6 1.3.1. INJERTOS ÓSEOS .................................................................................. 6 1.3.2. BIOMATERIALES .................................................................................. 7 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ............................................................................... 11 3. MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................................. 13 4. RESULTADOS ..................................................................................................... 19 4.1 RESULTADOS MACROSCÓPICOS ........................................................ 19 4.2 RESULTADOS DE MICRO-CT ................................................................. 19 4.3. RESULTADOS HISTOLÓGICOS ............................................................. 22 4.4. RESULTADOS INMUNOHISTOQUÍMICA ............................................ 27 4.5. RESULTADOS DE BMP-2.......................................................................... 30 4.6. RESULTADOS TGF-ß................................................................................. 32 5. DISCUSIÓN .......................................................................................................... 35 6. CONCLUSIONES ................................................................................................ 39 7. BIBLIOGRAFIA .................................................................................................. 41 ANEXO .......................................................................................................................... 47 Anexo 1: Índice de abreviaturas .............................................................................. 47 Javier López-Andaluz Mangas II Trabajo Fin de Grado “Biomaterial combinado con rhBMP-2: Valoración de la regeneración ósea” III ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Factores favorecedores reabsorción ................................................................. 2 Figura 2. Factores desfavorables reabsorción .................................................................. 3 Figura 3. Ciclo de remodelación ósea .............................................................................. 4 Figura 4. Vía canónica de señalización de BMP-2 y TGF-ß ........................................... 5 Figura 5. Acceso a la cresta de inserción. Imagen intraoperatoria de la Ostectomía circular con fresa trefina. ................................................................................................ 15 Figura 6. Cierre del abordaje quirúrgico por planos ...................................................... 15 Figura 7. Biomaterial regenerativo rellenando el defecto óseo. Aislamiento mediante membrana de colágeno. .................................................................................................. 16 Figura 8. Evaluación tomográfica de la mineralización para el GC del defecto óseo mandibular con membrana Evolution (GC) .................................................................... 20 Figura 9. Evaluación tomográfica de la mineralización para el GIB del defecto óseo mandibular con armazón óseo experimental IB. ............................................................ 20 Figura 10. Evaluación tomográfica de la mineralización para el grupo de estudio del defecto óseo mandibular (GPG), con armazón óseo experimental PG 0,8 μg. .............. 21 Figura 11. Imágenes teñidas con H&E para el grupo de control de defectos óseos mandibulares de tamaño crítico con membrana Evolution (GC) a los tres (GC3) y seis meses (GC6) ................................................................................................................... 23 Figura 12. Imágenes teñidas con H&E y MT para el grupo de estudio de defectos óseos mandibulares de tamaño crítico con IB a los tres meses (GIB3) .................................... 24 Figura 13. Imágenes teñidas con H&E y MT para el grupo de estudio de defectos óseos mandibulares de tamaño crítico con IB a los seis meses (GIB6).................................... 24 Figura 14. Imágenes teñidas con H&E y MT para el grupo de estudio de defectos óseos mandibulares de tamaño crítico con PG (0,8 μg) a los tres meses (GPG3).. .................. 25 Figura 15. Imágenes teñidas con H&E y MT para el grupo de estudio de defectos óseos mandibulares de tamaño crítico con PG (0,8 μg) a los seis meses (GPG6).................... 26 Javier López-Andaluz Mangas IV Figura 16. Tinción inmunohistoquímica de marcadores osteogénicos en el grupo control de defecto óseo mandibular de rata con membrana Evolution. (GC) a los tres (GC3) y seis meses (GC6) ................................................................................................................... 28 Figura 17. Tinción inmunohistoquímica de marcadores osteogénicos en el grupo de defecto óseo mandibular de rata con Iso-Bone® (GIB) a los tres (GIB3) y seis meses (GIB6).. ........................................................................................................................... 29 Figura 18. Tinción inmunohistoquímica de marcadores osteogénicos en el grupo de estudio de defectos óseos mandibulares en ratas con PG (0,8 μg) a los tres (GPG3) y seis meses (GPG6). ................................................................................................................ 29 Figura 19. Resultados BMP-2........................................................................................ 31 Figura 20. Resultados TGF-ß ........................................................................................ 33 Trabajo Fin de Grado “Biomaterial combinado con rhBMP-2: Valoración de la regeneración ósea” V ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Principales tipos y características de Biomateriales: Cerámicas y cementos .... 8 Tabla 2. Principales tipos y características de Biomateriales: Polímeros ........................ 9 Tabla 3. Distribución de materiales en cada grupo ........................................................ 16 Tabla 4. Evidencias radiológicas a los 3 y 6 meses ....................................................... 19 Tabla 5. Evidencias histológicas a los 3 y 6 meses........................................................ 22 Tabla 6. Evidencias inmunohistoquímica a los 3 y 6 meses. ......................................... 27 Tabla 7. Resultados de BMP-2 ...................................................................................... 31 Tabla 8. Resultados de TGF-ß ....................................................................................... 33 Javier López-Andaluz Mangas Página 4 de 48 Figura 3. Ciclo de remodelación ósea. (Imagen propia) A: Activación - B: Reabsorción - C: Reversión - D: Formación - E: Terminación. Activación: El osteoblasto, que inicialmente se encuentra en reposo tapizando la superficie ósea, comienza a retraerse, favoreciendo la activación osteoclástica que será el primer paso para la creación de la URO. La activación se produce mediante la interacción OPG-RANKL-RANK y actuarán sobre el espacio generado por los osteoblastos comenzando la reabsorción del hueso dañado. En esta fase de activación prevalece la unión RANKL-RANK frente a la OPG. Reabsorción: Favorecido por la unión RANKL-RANK y la activación del osteoclasto, se produce la reabsorción ósea. Reversión: Finalizada la reabsorción, el osteoclasto sufre apoptosis y es eliminado por los macrófagos. Formación: Los osteoblastos comienzan a depositarse en la cavidad generada por los osteoclastos y comienzan a liberar sustancia osteoide. Terminación: La sustancia osteoide será mineralizada por el depósito de calcio y fosforo, finalizando de este modo la remodelación ósea. Trabajo Fin de Grado “Biomaterial combinado con rhBMP-2: Valoración de la regeneración ósea” Página 5 de 48 1.2.2. HOMEOSTASIS ÓSEA 1.2.2.1. Vía BMP BMP son factores de crecimiento, que pertenecen a la superfamilia de TGF-ß, implicados en la regulación de la remodelación ósea, particularmente en la correcta regulación entre reabsorción y formación ósea, entre otras funciones. (12) Las vías de señalización de BMP-2 y TGF-ß aparecen recogidas en la Figura 4. Figura 4. Vía canónica de señalización de BMP-2 y TGF-ß. (Imagen propia). TGF-ß, a través de su vía canónica, forma el complejo Smad 2/3/4 que se traslocará al núcleo e interviene en las células óseas, regulando su supervivencia y, por tanto, la remodelación ósea. Por su parte, Smad7 regula negativamente la señalización Smad al impedir la formación del Complejo Smad 2/3/4, llevándolo a la degradación por medio del complejo ubiquitina-proteosoma. (13) . Por su parte, BMP, formará el complejo Smad 1-5-8 que tras la unión a Smad 4 se traslocará al núcleo y regulará la expresión de genes, en el caso la proteína BMP2, inductores de la osteogénesis (Runx2 y Osx1). Todo esto puede ser inhibido por Smad 6 y 7 y la ubiquitina E3. (13–15) BMP-2, es uno de los componentes utilizado en nuestro estudio, ya que se ha demostrado que su incorporación en biomateriales puede inducir la diferenciación osteogénica y la mejora de formación de hueso, a través del reclutamiento de osteoblastos mediante la diferenciación de MSC en osteoblastos a través de vías de señalización que finalizan con la activación de genes osteogénicos como Runx2 y Osx1. Además, mejora la integración Javier López-Andaluz Mangas Página 6 de 48 entre angiogénesis y osteogénesis, esencial para una adecuada remodelación ósea, al facilitar la formación de vasos tipo H, que permiten una mayor infiltración de las células osteoprogenitoras. (16–18) La FDA aprobó el uso de rhBMP-2 en odontología para potenciar la regeneración ósea. El principal inconveniente es que las BMP son proteínas pleiotrópicas, es decir, influyen en varias vías implicadas en la regeneración ósea por lo que, a dosis elevadas, pueden difundir a tejidos cercanos generando efectos adversos, entre ellos, el más frecuente es la formación de hueso ectópico. Por esto suele usarse en combinación con biomateriales (como polímeros) que permitan una liberación sostenida de BMP-2. (19–21) 1.3. TRATAMIENTO DE LAS ALTERACIONES DE LA REMODELACIÓN ÓSEA 1.3.1. INJERTOS ÓSEOS Ante la dificultad de curación espontánea del hueso en determinadas situaciones, se están buscando alternativas, basadas fundamentalmente en injertos óseos naturales o sintéticos (biomateriales), para acelerar la regeneración ósea. El autoinjerto es la técnica de elección. Está libre de rechazo autoinmune y favorece la remodelación ósea gracias a sus propiedades osteogénicas, osteoinductivas y osteoconductivas. Sin embargo, la limitada disponibilidad ósea, así como las posibles comorbilidades asociadas a su extracción, hace que se reserve su utilización para casos limitados. (22–24) Como principal alternativa está el aloinjerto, obtenido de un donante vivo o cadáver, genéticamente distintos pero pertenecientes a la misma especie. Destaca la capacidad de obtener mayores cantidades de tejido, sin embargo, no están exentos de posibles inmunorreacciones y transmisión de enfermedades. La liofilización, para atenuar estos riesgos, disminuye su potencial osteoinductivo y dificultan su osteointegración. (22,25) Por último, están los xenoinjertos, obtenidos a partir de especies no humanas, generalmente animales. Su obtención es prácticamente ilimitada, promueve eficazmente la curación de defectos óseos, sin embargo, los procesos para disminuir el rechazo Trabajo Fin de Grado “Biomaterial combinado con rhBMP-2: Valoración de la regeneración ósea” Página 7 de 48 suponen una disminución de la osteoinducción, haciendo que no haya alcanzado aún los niveles de regeneración ósea que el autoinjerto y el xenoinjerto. (26) 1.3.2. BIOMATERIALES La ingeniería de tejidos, basada en los biomateriales, surge para aportar una alternativa biológica a la recuperación de las fracturas mediante la creación de un entorno ideal que estimule la regeneración y proliferación celular. (27) Para su aplicación, los biomateriales deben cumplir: (22,27–29) - Osteoinducción, osteoconducción y osteointegración: Esto implica ser capaz de inducir la diferenciación osteogénica, proporcionando un ambiente adecuado para permitir el crecimiento óseo, evitando la formación de tejido fibroso. - Biocompatible y biodegradable: Debe ejercer su función sin generar respuesta inmune en el huésped y, además, una vez ha favorecido la formación de hueso nuevo, debe descomponerse. - Poroso y angiogénico: A mayor porosidad, mayor infiltración de células osteogénicas y de nuevos vasos sanguíneos. La angiogénesis es esencial para una buena osteoinducción, permitiendo el crecimiento de MSC que posteriormente se diferenciarán en osteoblastos, además de favorecer el transporte de nutrientes y oxígeno necesario para el crecimiento del hueso. Sin embargo, es complicado desarrollar un biomaterial que cumpla todas estas características. La incongruencia mecánica entre el hueso y el andamio puede generar un estrés que dificulte la posterior reabsorción del biomaterial, además, la inadecuada interacción también puede estar favorecida por una mala porosidad, que dificulta la comunicación celular y el crecimiento del tejido, al dificultar la angiogénesis y la migración celular y de factores osteoinductivos. (30) En función del origen del biomaterial podemos distinguir dos grupos: Naturales, donde destacan los derivados de origen coralino que poseen un exoesqueleto de carbonato cálcico, poroso, con gran potencial osteoconductor que favorece el depósito rápido de nuevo hueso tras su implantación, y sintéticos, siendo los más ampliamente utilizados estos últimos. (31) Javier López-Andaluz Mangas Página 8 de 48 Dentro de los biomateriales sintéticos, las principales características de las cerámicas y cementos aparecen recogidas en la siguiente tabla (Tabla 1). (25,31–36) Tabla 1. Principales tipos y características de Biomateriales: Cerámicas y cementos Biomaterial Características Tipos Cerámicas Solas no tienen actividad osteogénica, pero al entrar en contacto con el hueso, favorecen la formación de ósea. Podemos distinguir dos tipos: - Bioactivas: Buena osteoconductividad, pero su fragilidad y baja resistencia a la carga son sus principales limitaciones. - Bioinertes: Albumina y Zirconia. No recomendables Cerámica Bioactiva: - Hidroxiapatita: Buena osteoconducción y osteoinducción, sin embargo, se suele usar asociada a otros biomateriales por su reducida capacidad de degradación (reabsorción) y baja resistencia a la carga. - Fosfato Tricálcico: Reabsorbible y poroso, acelerando la remodelación ósea, pero es frágil, por lo que se suele asociar a otros biomateriales. - Fosfato Bifásico: Al ser una mezcla de los dos anteriores, combina la osteoconductividad y osteoinducción de ambos con la biodegradabilidad de Fosfato Tricálcico. - Vidrio Bioactivo: Hecha a base de silicio, su buena porosidad y rápida reabsorción, lo hacen un biomaterial interesante pero su pobre osteoconducción y osteoinducción limitan su utilidad. - Vitrocerámica: Mejora las propiedades del vidrio bioactivo y además posee más resistencia. Cemento Se obtienen de mezclar fosfato cálcico con una solución acuosa, permitiendo ser inyectados directamente en la zona lesionada al adoptar la forma del defecto. Cemento de Fosfato Cálcico: Destaca su buena adaptación en la zona del defecto, no dejando espacios entre hueso e implante, además de poseer buenas propiedades osteogénicas y alta biocompatibilidad. Sin embargo, su fragilidad, riesgo de reacción inflamatoria y su escasa porosidad, que retrasa su adhesión celular, hace que deban ser utilizados de manera selectiva. Dos subtipos: - Cementos de apatita - Cementos de Brushita Trabajo Fin de Grado “Biomaterial combinado con rhBMP-2: Valoración de la regeneración ósea” Página 9 de 48 Los polímeros, otro grupo de biomateriales sintéticos, son muy utilizados por su facilidad para ser fabricados en forma y tamaño deseado. Sus principales características y tipos vienen recogidos en la siguiente tabla (Tabla 2). (34,37–45) Tabla 2. Principales tipos y características de Biomateriales: Polímeros Biomaterial Origen Características Tipos Polímeros Natural/ Sintético Baja inmunogenicidad y buena reabsorbilidad y porosidad. Sin embargo, escasa adhesión celular y osteoconductividad Naturales: Ampliamente usados por ser biodegradables y biocompatibles. - Colágeno: Muy utilizado por ser fácil de obtener y su baja inmunogenicidad, pero sus pobres propiedades mecánicas hacen que se use en combinación con otros biomateriales - Quitosano: Usado fundamentalmente para cicatrización de heridas gracias a la estimulación de citocinas y factores de crecimiento - Alginato: Se suele usar combinado con otros polímeros, pero sobre todo con cerámicas para aumentar sus propiedades osteogénicas y resistencia - Seda: Usada de forma aislada por sus bajas propiedades osteogénicas, que aumentarán al combinarla con otros biomateriales. Sintéticos: Mayor longevidad y posibilidad de fabricarse en características específicas: - Poli Ácido Láctico: Baja toxicidad, buena biocompatibilidad y biodegradabilidad. Asociado a hidroxiapatita da buenos resultados. Su principal limitación es su baja resistencia que limita su uso en las zonas de carga. - Poli Ácido Glicólico: No suele usarse de forma aislada por su baja resistencia y riesgo de. Respuesta inflamatoria. - Poli Ácido Láctico-Glicólico: Buena biodegradabilidad, biocompatibilidad y características osteogénicas. Su baja resistencia hace que se asocie a cerámicas e Hidroxiapatita. Javier López-Andaluz Mangas Página 10 de 48 Trabajo Fin de Grado “Biomaterial combinado con rhBMP-2: Valoración de la regeneración ósea” Página 11 de 48 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Hipótesis La utilización de un biomaterial constituido por un armazón de HA bovina recubierta de quitosano y trehalosa con rhBMP-2 añadido, favorecerá e incrementará el proceso de regeneración ósea, consiguiendo su restitución, en un modelo experimental de lesión crítica ósea en el que la capacidad de autoregeneración es incompetente. Objetivos - Desarrollar un modelo experimental de lesión crítica ósea, en la rata, que dejado a su libre evolución no tenga capacidad de regenerarse. - Valorar que los tiempos de estudio, posteriores a la lesión ósea, son adecuados - Determinar las variables a estudiar que justifiquen el éxito/fracaso de los tratamientos y los posibles mecanismos de acción. Javier López-Andaluz Mangas Página 12 de 48 Trabajo Fin de Grado “Biomaterial combinado con rhBMP-2: Valoración de la regeneración ósea” Página 13 de 48 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1. MATERIALES 3.1.1. BIOMATERIALES EMPLEADOS Membrana Evolution® (OsteoBiol - Tecnoss, Turin, Italy) Su porosidad y contenido en colágeno hacen de ella un biomaterial válido para el anclaje y proliferación de osteoblastos y la regeneración ósea. Es una réplica natural del hueso autólogo, que conserva la misma estructura y se caracteriza por una elevada osteoconductividad. Se reabsorbe gradualmente y asegura una acción de soporte para la formación ósea, contribuyendo a preservar la forma y el volumen del injerto original (propiedad osteoconductiva). Facilita la formación del coágulo hemático y la consiguiente invasión de las células reparadoras y regeneradoras, favoreciendo la completa "restitutio ad integrum" del déficit óseo. Iso-bone® (Noricum S.L) Constituido por gránulos irregulares de bordes redondeados y microestructura, macro y microporosa, compuesto por mineral óseo purificado obtenido del hueso bovino mediante la eliminación de los componentes orgánicos, preservando la cristalinidad y la estructura porosa (macro y micro) del hueso nativo. Desde el punto de vista químico se puede identificar como carbonato-apatita biológica, capaz de exhibir propiedades bioactivas y osteoconductoras, es decir, permite y estimula el crecimiento de hueso nuevo en contacto íntimo con su superficie. Las especificaciones de calidad física y química del producto determinan una composición de: calcio entre el 36-45% - fósforo 14-18% - ratio molar calcio/fósforo 2-1,5 – metales pesados 0,1% máximo – carbonato 2-10% - proteínas residuales 0,05% máximo – tamaño de los cristales 50 nm máximo. Proteo-Graft® (Noricum S.L) Está constituido por una base de Iso-Bone® combinado con Quitosano, Trehalosa y rhBMP-2. El Quitosano es un polisacárido natural de origen animal, que imita a la matriz extracelular y promueve la diferenciación de células madre para facilitar la adhesión, proliferación y diferenciación osteogénica. BMP son factores de crecimiento que pertenecen a la superfamilia de TGF-ß, no todas las BMP son osteogénicas, BMP-2 y Javier López-Andaluz Mangas Página 20 de 48 Observamos una mejor evolución y regeneración del defecto en GPG (Figura 10), donde se termina produciendo una integración del biomaterial y curación del defecto, respecto al GC (Figura 8) y GIB (Figura 9), donde no llega a observarse en ningún momento regeneración. Además, dentro del mismo GPG, apreciamos que en GPG3 (Figura 10 E) el defecto sigue siendo identificable, relleno por biomaterial sin integración completa, mientras que en GPG6 (Figura 10F) el biomaterial está completamente integrado y el defecto apenas es apreciable. Figura 8. Evaluación tomográfica de la mineralización para el GC del defecto óseo mandibular con membrana Evolution (GC). Las imágenes muestran la mineralización para los GC por microCT a los tres y seis meses tras la cirugía (GC3 y GC6). (A. Defecto crítico en CG3. B. Defecto crítico en GC6). Figura 9. Evaluación tomográfica de la mineralización para el GIB del defecto óseo mandibular con armazón óseo experimental IB. Las imágenes muestran la mineralización para los GIB por microCT, a los tres y seis meses tras la cirugía (GIB3 y GIB6). (C. Defecto crítico en GIB3. D. Defecto crítico en GIB6). La imagen C y D muestran el defecto óseo sin regenerar y el biomaterial disperso en la zona lesionada sin integrarse. A B C D Trabajo Fin de Grado “Biomaterial combinado con rhBMP-2: Valoración de la regeneración ósea” Página 21 de 48 Figura 10. Evaluación tomográfica de la mineralización para el grupo de estudio del defecto óseo mandibular (GPG), con armazón óseo experimental PG 0,8 μg. Las imágenes presentan la mineralización para los grupos de estudio por microCT, a los tres y seis meses tras la cirugía (GPG3 y GPG6). (E. Defecto crítico en GPG3. F. Defecto crítico en GPG6). La imagen E muestra que el defecto óseo está cubierto en su totalidad por biomaterial, apreciándose como este aún no está completamente integrado, comenzando a regenerarse los bordes de la lesión. Por su parte, en la imagen F se observa una mejor regeneración e integración del biomaterial, siendo difícil diferenciar entre el tejido óseo próximo a la lesión y el tejido lesionado que contiene el biomaterial. E F Javier López-Andaluz Mangas Página 22 de 48 4.3. RESULTADOS HISTOLÓGICOS Los resultados obtenidos en la Histología se muestran en la Tabla 5. Tabla 5. Evidencias histológicas a los 3 y 6 meses 3 MESES 6 MESES Grupo GC Ausencia de regeneración ósea. (Figura 11 A) Ausencia de regeneración ósea. (Figura 11 B) Grupo GIB Alrededor de los defectos óseos hay tejido conjuntivo con fibroblastos, escaso colágeno y neoformaciones vasculares de diversos tamaños. (Figura 12) Los defectos críticos están delimitados por mayor cantidad de colágeno apareciendo además linfocitos entremezclados y vasos en este caso menor cantidad de vasos. (Figura 13) Grupo GPG Se aprecia gran cantidad de gránulos del biomaterial distribuidos en los defectos críticos, comenzando a formarse tejido óseo inmaduro en el defecto crítico y existiendo una gran cantidad de tejido conjuntivo alrededor de los mismos, formado por fibroblastos. (Figura 14) El tejido conjuntivo está constituido por colágeno y se aprecia mayor neoformación ósea, rellenando el defecto quedando poco espacio entre los gránulos del biomaterial. (Figura 15) Trabajo Fin de Grado “Biomaterial combinado con rhBMP-2: Valoración de la regeneración ósea” Página 23 de 48 Observamos como en el GC (Figura 11), no se aprecia regeneración ósea, corroborando los resultados obtenidos en las pruebas radiológicas. En el GIB, a los 3 meses (Figura 12) existe una mayor cantidad de fibroblastos, iniciadores de la regeneración, que serán sustituidos a los 6 meses (Figura 13) por tejido colágeno, que aportará resistencia al hueso, existiendo además en este grupo una importante reacción inflamatoria con abundantes linfocitos. En el GPG, a los 3 meses (Figura 14) el defecto y el biomaterial sigue siendo claramente apreciable, aunque existen signos de comienzo de regeneración ósea, mientras que a los 6 meses (Figura 15) resulta difícil diferenciar el defecto, el tejido óseo previo y el tejido neoformado, existiendo así mismo una reabsorción casi total del biomaterial. Figura 11. Imágenes teñidas con H&E para el grupo de control de defectos óseos mandibulares de tamaño crítico con membrana Evolution (GC) a los tres (GC3) y seis meses (GC6). A. Hematoxilina-eosina en GC3. B. Hematoxilina-eosina en GC6. Solo se incrustó una leve formación de hueso nuevo en el tejido conectivo que se extendía por el borde del defecto, como se ve en la imagen B. Javier López-Andaluz Mangas Página 24 de 48 Figura 12. Imágenes teñidas con H&E y MT para el grupo de estudio de defectos óseos mandibulares de tamaño crítico con IB a los tres meses (GIB3). Biomaterial ∗; Tejido conjuntivo reactivo (colágeno y fibroblastos) #. Tinción MT. Tejido conjuntivo reactivo (colágeno y fibroblastos) #. Se observan vasos de diferentes calibres (marrón). Figura 13. Imágenes teñidas con H&E y MT para el grupo de estudio de defectos óseos mandibulares de tamaño crítico con IB a los seis meses (GIB6). Biomaterial ∗; Tejido conjuntivo reactivo (colágeno y fibroblastos) #. Linfocitos que indican una reacción inflamatoria (flechas amarillas). Tinción MT. Proliferación más evidente de tejido conjuntivo reactivo (colágeno y fibroblastos) #. También se aprecian linfocitos maduros (flechas amarillas) en el tejido conjuntivo. En la pared del defecto además de observar tejido colágeno y fibroblastos se observa la existencia de escasos vasos neoformados (que no están en GIB3) Trabajo Fin de Grado “Biomaterial combinado con rhBMP-2: Valoración de la regeneración ósea” Página 25 de 48 Figura 14. Imágenes teñidas con H&E y MT para el grupo de estudio de defectos óseos mandibulares de tamaño crítico con PG (0,8 μg) a los tres meses (GPG3). Biomaterial ∗; Tejido óseo neoformado que rellena el defecto y los espacios entre los gránulos de biomaterial (osteocitos y vasos) +; Tejido conjuntivo reactivo (colágeno y fibroblastos) #; Hueso (osteoblastos y vasos) ˆ; Tinción MT. Tejido conjuntivo reactivo (colágeno y fibroblastos) #; Matriz ósea (osteoblastos y vasos) ˆ; Hueso en verde oscuro. Tejido óseo inmaduro neoformado en rojo (flecha negra); Tejido óseo neoformado en contacto con el biomaterial (flechas rojas). Javier López-Andaluz Mangas Página 26 de 48 Figura 15. Imágenes teñidas con H&E y MT para el grupo de estudio de defectos óseos mandibulares de tamaño crítico con PG (0,8 μg) a los seis meses (GPG6). Biomaterial ∗; Tejido óseo neoformado que rellena el defecto y los pocos espacios entre los gránulos de biomaterial; borde del defecto (flecha negra). Tinción MT. Hueso en verde oscuro. Tejido óseo neoformado inmaduro en rojo; Tejido óseo neoformado en contacto con la escasa cantidad de biomaterial Trabajo Fin de Grado “Biomaterial combinado con rhBMP-2: Valoración de la regeneración ósea” Página 27 de 48 4.4. RESULTADOS INMUNOHISTOQUÍMICA Se realizó tinción inmunohistoquímica de mandíbulas descalcificadas para analizar los marcadores osteogénicos Runx2 y OCN y ALP. Las tinciones positivas en los cortes de tejido se tiñeron de marrón. Los resultados obtenidos en la inmunohistoquímica se muestran en la Tabla 6. Tabla 6. Evidencias inmunohistoquímica a los 3 y 6 meses. 3 MESES 6 MESES Grupo GC Al no existir formación ósea, ausencia de inmunorreactividad. (Figura 16 A, B, C) Al no existir formación ósea, ausencia de inmunorreactividad (Figura 16 D, E, F) Grupo GIB La expresión de los marcadores osteogénicos no es destacable al no existir evidente formación ósea. (Figura 17 A, B, C) La expresión de los marcadores osteogénicos no es destacable al no existir evidente formación ósea. (Figura 17 D, E, F) Grupo GPG La ALP y RUNX2 se expresan en el citoplasma de los osteoblastos, mientras que OCN aparece adherida a la HA del biomaterial. (Figura 18 A, B, C) Al estar el defecto óseo cubierto por hueso nuevo, la inmunorreactividad de los biomarcadores será nuevamente negativa. (Figura 18 D, E, F) Javier López-Andaluz Mangas Página 28 de 48 En las imágenes inmunohistoquímicas del grupo GC (Figura 16) y el GIB (Figura 17), al carecer de formación de tejido óseo, no existe expresión, ni a los 3 ni a los 6 meses, de ALP, OCN, y Runx2. No obstante, los resultados de tinción para GPG3 (Figura 18 A, B, C) son más altos que para GPG6 (Figura 18 D, E, F), al existir en este último tejido óseo neoformado. Figura 16. Tinción inmunohistoquímica de marcadores osteogénicos en el grupo control de defecto óseo mandibular de rata con membrana Evolution (GC) a los tres (GC3) y seis meses (GC6). Los resultados de inmunohistoquímica para la expresión proteica de osteogénesis en hueso a los tres y seis meses, (A y D, ALP. B y E, OCN. C y F, RUNX2). No se detectó expresión de ALP a los tres meses A, ni a los seis meses D, ni de OCN y RUNX2 a los tres meses, B y C, ni a los seis meses E y F. La ausencia de inmunorreactividad para las proteínas ALP, OCN y RUNX2 fue evidente en los grupos control dada la ausencia de formación de tejido óseo. Trabajo Fin de Grado “Biomaterial combinado con rhBMP-2: Valoración de la regeneración ósea” Página 29 de 48 Figura 17. Tinción inmunohistoquímica de marcadores osteogénicos en el grupo de defecto óseo mandibular de rata con Iso-Bone® (GIB) a los tres (GIB3) y seis meses (GIB6). Los resultados de inmunohistoquímica para la expresión proteica de osteogénesis en hueso a los tres y seis meses, (A y D, ALP. B y E, OCN. C y F, RUNX2), no detectaron expresión a los tres meses (A) de OCN, siendo un poco mayor a los seis meses (D) y prácticamente nula a los tres meses, B y C, y seis meses E y F, de OCN y RUNX2, respectivamente. Esta ausencia de inmunorreactividad es debida a la ausencia de formación de tejido óseo. Figura 18. Tinción inmunohistoquímica de marcadores osteogénicos en el grupo de estudio de defectos óseos mandibulares en ratas con PG (0,8 μg) a los tres (GPG3) y seis meses (GPG6). Los resultados de inmunohistoquímica para la expresión proteica de osteogénesis en hueso a los tres meses: A, Expresión de ALP localizada en el citoplasma de los osteoblastos, B, OCN adherida a la hidroxiapatita del biomaterial y C, RUNX2 en el citoplasma de los preosteoblastos. A los seis meses: D, Sin expresión detectable de ALP, ni de OCN, E y RUNX2, F. Por el contrario, la ausencia de inmunorreactividad para las proteínas ALP, OCN y RUNX2 a los seis meses puede deberse a que los defectos estaban cubiertos por hueso nuevo. AB C D E F Javier López-Andaluz Mangas Página 36 de 48 Además de su poder estabilizador, Xingguan Xu et al (50), informan de su capacidad antiinflamatoria, suprimiendo la liberación citocinas proinflamatorias como IL-6, al mejorar la polarización de los macrófagos a M2, que mejoraba la formación ósea. Los resultados por micro-CT nos han permitido valorar como en el GPG (Figura 10 E, F, página 21) se va desintegrando de manera progresiva el biomaterial, siendo acompañado esto de la formación de nuevo tejido óseo, y como en el GC (Figura 8 A, B página 20) y GIB (Figura 9, C, D página 20) no se observa regeneración ósea. La regeneración del defecto está íntimamente relacionada, además de por la utilización o no de biomateriales en la zona lesionada, por el tiempo que permanece este en la lesión, así, a más tiempo implantado, mejor regeneración. Esto es demostrado por Celine Stuz et al (51), que utilizaron tiempos de evolución similares a los nuestros, 90,120,150 días, valorando mediante micro-CT la regeneración ósea y observando que a más tiempo de implantación del biomaterial, mejor regeneración. Su biomaterial estaba constituido por una membrana de PCL sobre la cual añadieron BMP-2 y MSC, obteniendo mejores resultados en el grupo tratado con este armazón. Para evaluar la degradación del biomaterial y la neoformación ósea de manera más exacta, realizamos el estudio microscópico mediante análisis histológico. Observamos en nuestro estudio como el GPG muestra evidentes signos de regeneración ósea. En GPG3 (Figura 14, página 25) existe una mayor cantidad de tejido conjuntivo a expensas de fibroblastos, iniciadores de la regeneración, mientras que en GPG6 (Figura 15, página 26) hay dos zonas diferenciadas, separadas por el defecto óseo, y gran cantidad de tejido conjuntivo con colágeno. En GC (Figura 11, página 23) y GIB no se aprecian signos de regeneración ósea, apreciándose en GIB6 (Figura 13, página 24) una importante reacción inflamatoria con abundantes linfocitos. Tian Ding et al (52)valoraron la regeneración ósea utilizando un biomaterial que incluía en el grupo estudio BMP-2 y FGF cubiertos por dos polímeros, PLGA y PLLA, que poseen buenas propiedades osteogénicas. Sin embargo, como principal limitación en este estudio, encontramos su duración, ya que valoran los resultados en 1 y 2 semanas, lo cual en base a nuestra evidencia nos resulta difícil de justificar, puesto que nosotros a los 3 meses es cuando comenzamos a observar signos de regeneración. Trabajo Fin de Grado “Biomaterial combinado con rhBMP-2: Valoración de la regeneración ósea” Página 37 de 48 Los marcadores osteoblásticos utilizados fueron Runx2, ALP y OCN. Runx2 es un factor de transcripción clave en la diferenciación de osteoblastos, al regular genes osteogénicos, ALP desempeña un papel importante en la mineralización ósea y es el marcador bioquímico, de expresión temprana, más relacionado con la actividad de los osteoblastos. OCN es una proteína fijadora de calcio que se deposita en la matriz ósea e informa sobre la mineralización ósea. (53–55) La inmunohistoquimica será positiva, es decir, se teñirá de marrón, cuando exista formación ósea. En el GC (Figura 16, página 28) y en el GIB (Figura 17, página 29), al no existir una regeneración ósea evidente, no hay expresión de los marcadores osteoblásticos. En GPG3 (Figura 18 A, B, C, página 29) al estar produciéndose la formación de hueso, si hay un incremento de los marcadores osteoblásticos, mientras que en GPG6 (Figura 18 D, E, F, página 29) al haberse producido ya la formación de hueso, la inmunoreactividad es menor. Hongwei Xu et al (56) elaboraron un andamio para valorar la regeneración ósea con minerales, quitosano y polietilenglicol, sobre el que añadieron BMP-2. Generaron un defecto calvarial y valoraron los resultados a las 4 y 8 semanas, obteniendo mejores resultados en el grupo que incorporaba este armazón, con una mayor expresión de los marcadores osteogénicos. BMP-2 favorece la osteogénesis, al indicar la diferenciación de osteoblastos y activar Runx2, factor de transcripción que favorece de la diferenciación de osteoblastos. Sin embargo, al ser una proteína pleiotrópica y activar diversas vías implicadas en la regeneración ósea, es importante el control de su concentración. Así Jim Min Seok et al (57), para conseguir una liberación sostenida de BMP-2 y evitar los efectos adversos derivados de su rápida liberación, crearon un andamio compuesto de microparticulas biactivas. Mediante análisis in vitro demostraron que BMP-2 con su armazón seguía liberándose durante >4 semanas, sin embargo, no valoraron sus resultados in vivo. Si valoraron in vivo Rui Ma et al (58) la regeneración ósea al combinar un biomaterial de PLGA/ MBG con nanopartículas de ZIF-8 cargado todo con BMP-2. Observaron que este andamio, además de favorecer una liberación lenta y continuada de BMP-2, mejoraba la diferenciación de los osteoblastos y la formación y reparación de hueso. Obtuvieron sus Javier López-Andaluz Mangas Página 38 de 48 resultados a las 12 semanas, frente a nuestro estudio donde nuestros resultados los valoramos a los 3 y 6 meses. Observamos como (Figura 19 y Tabla 7, página 31) la lesión ósea estimula la liberación de BMP-2, manifestado por la mayor producción de BMP-2 en GC y GIB respecto a GS, no obstante, la producción en GC y GIB respecto a GPG es menor, ya que el biomaterial lleva añadido BMP-2, excepto en GIB3 cuya liberación de BMP-2 es mayor que en GPG6. Dentro de la superfamilia TFG-ß, TGF-ß1 es la isoforma más abundante e implicada en la regeneración ósea. Al igual que sucedía con BMP-2, es fundamental el control de su concentración y liberación para evitar efectos adversos. Así, Yongxin Tan et al (59) realizaron un estudio in vitro, con un armazón de AL/ AH/ Col donde incorporaron TGFß1 y BMP-2, todo recubierto de una microesfera de quitosano, para valorar su toxicidad y su posible uso en estudios in vivo de regeneración ósea. En nuestro estudio (Figura 20 y Tabla 8, página 32), observamos que en los GC y GIB la producción de TFG-ß es menor respecto a GPG, donde en este, además, la producción es mayor en GPG3 respecto a GPG6, lo cual podría estar debido a que nuestro armazón contiene BMP-2 y a que su liberación es mayor en las fases iniciales de la remodelación ósea, en parte porque es cuando BMP-2 ejerce su mayor efecto. Trabajo Fin de Grado “Biomaterial combinado con rhBMP-2: Valoración de la regeneración ósea” Página 39 de 48 6. CONCLUSIONES 1. La lesión ósea generada cumple los criterios de lesión crítica y, sin intervención, el organismo no es capaz de autoregenerarla. 2. Los tiempos de evolución y las variables que han sido estudiadas en nuestro modelo experimental, han sido adecuadas. 3. El tratamiento de la lesión, con biomaterial compuesto con carbonato-apatita, no tiene capacidad de regeneración del defecto óseo. 4. El biomaterial Proteo-Graft  (Noricum S.L) constituido por Iso-Bone y combinado con Quitosano, Trehalosa y rhBMP-2, ha conseguido una mejor regeneración ósea, consiguiendo la restitución del defecto óseo planteado en el modelo experimental. Javier López-Andaluz Mangas Página 40 de 48 Trabajo Fin de Grado “Biomaterial combinado con rhBMP-2: Valoración de la regeneración ósea” Página 41 de 48 7. BIBLIOGRAFIA 1. Ho-Shui-Ling A, Bolander J, Rustom LE, Johnson AW, Luyten FP, Picart C. 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