Perceptual interactions between aroma vectors and wine sensory properties. Consequences for aroma modeling

2019 144 Arancha de la Fuente Blanco Perceptual interactions between aroma vectors and wine sensory properties. Consequences for aroma modeling Departamento Director/es Química Analítica Sáenz Navajas, María Pilar Ferreira González, Vicente © Universidad de Zaragoza Servicio de Publicaciones ISSN 2254-7606 Reconocimiento – NoComercial – SinObraDerivada (by-nc-nd): No se permite un uso comercial de la obra original ni la generación de obras derivadas. Arancha de la Fuente Blanco PERCEPTUAL INTERACTIONS BETWEEN AROMA VECTORS AND WINE SENSORY PROPERTIES. CONSEQUENCES FOR AROMA MODELING Director/es Química Analítica Sáenz Navajas, María Pilar Ferreira González, Vicente Tesis Doctoral Autor 2019 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA TESIS DOCTORAL PERCEPTUAL INTERACTIONS BETWEEN AROMA VECTORS AND WINE SENSORY PROPERTIES. CONSEQUENCES FOR AROMA MODELING Autor/a Arancha de la Fuente Blanco Para optar al Grado de Doctora Director/es María Pilar Sáenz Navajas Vicente Ferreira González Mayo 2019 UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Química Analítica A mi familia, porque sin su apoyo no sería lo mismo Porque lo que está escrito, escrito está, y no se borra nunca. Las mil y una noches Índice 4. LIMITACIONES DE LOS OAV .......................................................................... 38 5. ¿SE PUEDE EXPLICAR EL AROMA DEL VINO A PARTIR DE SU COMPOSICIÓN QUÍMICA? ............................................................................... 43 6. LA LÓGICA INTERNA DEL AROMA DEL VINO: EL BÚFER DEL VINO Y LOS VECTORES DE AROMA ........................................................................ 45 6.1. El búfer de aroma ........................................................................................... 46 6.2. Vectores de aroma .......................................................................................... 50 7. INTERACCIÓN ENTRE LOS VECTORES DE AROMA Y LA PERCEPCIÓN GENERAL DEL AROMA ......................................................... 52 8. OBSERVACIONES FINALES ............................................................................. 56 9. REFERENCIAS .................................................................................................... 56 OBJETIVOS ................................................................................................. 65 SECCIÓN I Interacciones sensoriales entre seis vectores de aroma capaces de explicar cuatro atributos de aroma en vinos tintos ................................................. 69 1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 69 2. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................. 74 2.1. Estándares ........................................................................................................ 74 2.1.1. Reactivos y compuestos ................................................................ 74 2.1.2. Extractos no volátiles ................................................................... 74 2.2. Vinos modelo ................................................................................................... 75 2.2.1. Selección de los modelos por diseño factorial ........................... 75 2.2.2. Composición química de los vinos modelo ................................ 75 2.3. Evaluación sensorial ...................................................................................... 76 2.3.1. Expertos (estudio piloto) .............................................................. 76 2.3.2. Panel entrenado 1 (test descriptivo 1) ......................................... 78 Índice 2.3.3. Panel entrenado 2 (test descriptivo 2) ......................................... 79 2.4. Análisis de datos ............................................................................................. 80 2.4.1. Evaluación del rendimiento del panel ........................................ 80 2.4.2. Análisis de factores (CA y PCA) ................................................. 80 2.4.3. Análisis de la varianza (ANOVA) ............................................... 81 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. Vinos modelo y espacios sensoriales de los vinos ......................................... 81 3.2. Caracterización aromática de los vinos modelo .......................................... 85 3.3. Relación entre los vectores y los atributos de aroma .................................. 89 3.4. Cambios principales y asociaciones vectoriales clave ................................. 95 4. CONCLUSIONES ................................................................................................. 97 5. REFERENCIAS .................................................................................................... 98 SECCIÓN II. Estudio de la importancia sensorial de los alcoholes superiores en el aroma del vino Capítulo 1 Efecto de los alcoholes superiores en la percepción del aroma del vino tinto ................................................................................................... 105 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 105 2. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................ 108 2.1. Compuestos y estándares .............................................................................. 108 2.2. Preparación de los vinos modelos ............................................................... 108 2.2.1. Aislamiento y purificación de los alcoholes superiores .......... 108 2.2.2. Preparación de los vinos modelo (WM) .................................... 110 2.3. Análisis sensorial .......................................................................................... 112 2.3.1. Detección del umbral sensorial de las muestras de β-feniletanol ..................................................................................... 112 2.3.2. Test triangulares ........................................................................ 113 Índice 2.3.3. Análisis descriptivo .................................................................... 116 2.4. Análisis de datos ........................................................................................... 118 2.4.1. Método GC-O: Confirmación de la pureza sensorial de los estándares ......................................................................................... 118 2.4.2. Umbral de detección sensorial .................................................. 118 2.4.3. Test triangulares ........................................................................ 119 2.4.4. Análisis descriptivo .................................................................... 119 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. Aislamiento y purificación de los alcoholes ............................................... 120 3.2. Análisis sensorial .......................................................................................... 122 3.2.1. Test triangulares (Test A) .......................................................... 122 3.2.2. Test triangulares (Test B) ......................................................... 124 3.2.3. Análisis descriptivo (DA) .......................................................... 125 4. CONCLUSIONES ............................................................................................... 130 5. REFERENCIAS .................................................................................................. 131 Capítulo 2 Niveles de alcoholes superiores capaces de inducir cambios aromáticos y modular la preferencia de un panel de expertos en vinos modelo ......... 135 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 135 2. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................ 137 2.1. Compuestos y estándares .............................................................................. 137 2.2. Preparación de los vinos modelos ............................................................... 137 2.2.1. Aislamiento y purificación de los alcoholes superiores .......... 137 2.2.2. Preparación de los vinos modelo (WM) .................................... 138 2.3. Análisis sensorial .......................................................................................... 140 2.3.1. Participantes .............................................................................. 140 2.3.2. Procedimiento ............................................................................. 140 Índice 2.4. Análisis de datos ........................................................................................... 143 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. Pureza de los estándares .............................................................................. 143 3.2. Análisis sensorial .......................................................................................... 144 3.2.1. Vino modelo con aromas frutales .............................................. 145 3.2.2. Vino modelo con aromas a madera ........................................... 147 3.2.3. Vino modelo con aromas animales ............................................ 152 4. CONCLUSIONES ............................................................................................... 155 5. REFERENCIAS .................................................................................................. 156 SECCIÓN III. Estudio de la importancia sensorial de los ésteres etílicos en el aroma del vino Capítulo 1 Variabilidad sensorial inducida por los ésteres etílicos en vino tinto ... 163 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 163 2. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................ 166 2.1. Compuestos y estándares .............................................................................. 166 2.2. Preparación de los vinos modelos ............................................................... 167 2.2.1. Purificación de los esteres ......................................................... 167 2.2.2. Preparación de vectores isointensos con diferente número de ésteres ................................................................................................ 167 2.2.3. Preparación del vino modelo (WM) .......................................... 170 2.3. Evaluación sensorial ..................................................................................... 172 2.3.1. Participantes .............................................................................. 172 2.3.2. Evaluación de la intensidad del olor y la calidad de los vectores ............................................................................................. 172 2.3.2.1. Evaluación de la intensidad del olor de los vectores .............. 172 Índice 2.3.2.2. Evaluación de diferencias sensoriales de vectores aislados mediante test triangulares ............................................................... 174 2.3.3. Evaluación de diferencias sensoriales inducidas por los vectores en vinos tinto modelo mediante test triangulares ......................... 175 3. RESULTADOS .................................................................................................... 178 3.1. Validación de la pureza de los ésteres ........................................................ 178 3.2. Desarrollo de los vectores de ésteres etílicos y estudio de los efectos en vinos tintos modelo ....................................................................................... 178 3.2.1. Simplificación de V1 a V2 y V2´ ................................................ 178 3.2.2. Simplificación de V1 a V3 .......................................................... 180 3.2.3. Simplificación de V1 a V4 .......................................................... 182 3.2.4. Simplificación de V1 a V5 y V6 ................................................. 183 3.2.5. Simplificación de V1 a V7 .......................................................... 184 4. DISCUSIÓN .......................................................................................................... 185 4.1. Efecto de la diversidad de los ésteres etílicos sobre la cualidad del aroma general del vino ............................................................................................. 185 4.2. Efecto de la diversidad de los ésteres etílicos sobre la intensidad del aroma global del vino ............................................................................................... 189 5. CONCLUSIONES ............................................................................................... 192 6. REFERENCIAS .................................................................................................. 194 Capítulo 2 Interacciones entre el vector de ésteres etílicos y el vector madera. Efectos en la percepción. ...................................................................................... 199 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 199 2. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................ 202 2.1. Compuestos y estándares .............................................................................. 202 2.2. Preparación de los vinos modelos ............................................................... 202 Índice 2.2.1. Purificación de los ésteres ......................................................... 202 2.2.2. Preparación de los vinos modelo (WM). ................................... 202 2.3. Análisis sensorial .......................................................................................... 205 2.3.1. Prueba de categorización libre ................................................. 205 2.3.2. Análisis descriptivo .................................................................... 205 2.4. Tratamiento de datos ................................................................................... 207 2.4.1. Prueba de categorización libre ................................................. 207 2.4.2. Análisis descriptivo .................................................................... 208 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................... 209 3.1. Tarea de agrupación libre ........................................................................... 209 3.2. Análisis descriptivo ....................................................................................... 212 4. CONCLUSIONES ............................................................................................... 219 5. REFERENCIAS .................................................................................................. 220 SECCIÓN IV Interacciones sensoriales del tipo aroma-amargor y aroma-astringencia en vinos tintos. Efecto del nivel de experiencia del consumidor .......... 225 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 225 2. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................ 229 2.1. Reactivos y estándares .................................................................................. 229 2.2. Preparación de los vinos modelos ............................................................... 229 2.2.1. Preparación de la fracción astringente .................................... 229 2.2.2. Muestras de vino ......................................................................... 230 2.2.3. Propiedades sensoriales de los vectores de aroma y los estímulos en boca .............................................................................. 233 2.3. Estudio de las interacciones sensoriales por análisis descriptivo ............. 235 2.3.1. Participantes .............................................................................. 235 2.3.2. Procedimiento ............................................................................ 236 Índice 2.4. Análisis de datos ........................................................................................... 238 2.4.1. Propiedades sensoriales de los vectores de aroma y de los estímulos en boca ............................................................................. 238 2.4.2. Estudio de las interacciones sensoriales por análisis descriptivo ........................................................................................ 239 3. RESULTADOS .................................................................................................... 239 3.1. Propiedades sensoriales de los vectores de aroma y los estímulos en boca ........................................................................................................... 239 3.2. Estudio de las interacciones por análisis descriptivo ................................ 241 4. DISCUSIÓN .......................................................................................................... 244 5. CONCLUSIONES ............................................................................................... 248 6. REFERENCIAS .................................................................................................. 248 CONCLUSIONES FINALES/ FINAL CONCLUSIONS ...................... 251 ANEXOS ..................................................................................................... 259 ANEXO 1 ................................................................................................................. 261 ANEXO 2 ................................................................................................................. 263 ANEXO 3 ................................................................................................................. 267 ANEXO 4 ................................................................................................................. 271 ANEXO 5 ................................................................................................................. 277 ANEXO 6 ................................................................................................................. 285 Estructura de la tesis ESTRUCTURA DE LA TESIS Esta tesis está formada por una serie de trabajos enfocados a integrar de manera pionera el conocimiento químico acerca de los compuestos sensorialmente activos con conocimientos procedentes de áreas relacionadas con el análisis sensorial y la psicología cognitiva. La estructura que posee es la siguiente: ∗ RESUMEN DE LA TESIS ∗ INTRODUCCIÓN: Incluye una introducción general en la que se hace un repaso al estado del arte en lo referente a la formación del aroma y se desarrolla una teoría sobre la lógica interna del aroma, en la que se describen herramientas conceptuales útiles para modelizar el aroma percibido a partir de su composición química, poniendo el foco en el vino como producto. ∗ SECCIONES: Está dividido en cuatro secciones con varios capítulos por sección según el tema a tratar: o SECCIÓN I: Estudio de las interacciones sensoriales entre seis vectores de aroma y la formación del aroma en modelos de vino tinto (1 capítulo). o SECCIÓN II: Estudio de la importancia sensorial de los alcoholes superiores en la formación del aroma búfer del vino (2 capítulos). o SECCIÓN III: Estudio de la importancia sensorial de los ésteres etílicos en la formación del vector frutal y como parte del aroma búfer del vino (2 capítulos). o SECCIÓN IV: Estudio de las interacciones sensoriales entre el amargor, astringencia y diferentes vectores de aroma (1 capítulo). 1 Summary in English OBJECTIVES The general objective of this thesis is to understand how some of the main aroma vectors of wine interact between them to form the overall wine aroma nuances, with the ultimate goal to develop concepts of general interest for dealing with the interpretation of complex aroma mixtures. The specific objectives are: 1. To investigate the sensory space associated to the perceptual interactions between six of the most common wine aroma vectors. 2. To investigate the aroma suppression effects associated to higher alcohols. 3. To investigate whether the 14 ethyl esters naturally found in red wine, can be adequately represented by simple mixtures without altering wine aroma. 4. To investigate the quantitative and qualitative consequences of the interactions between the ethyl ester vector and the three different vectors linked to wood extractables. 5. To evaluate, the cross-modal effects of aroma vectors on bitterness and astringency of red wines. SECCTION I. Sensory interactions between six common aroma vectors explain four main red wine aroma nuances. 1. Introduction One of the major challenges of today’s aroma research is to understand the rationale determining the qualitative and quantitative characteristics of the sensory perception elicited by complex mixtures of odorants. Wine aroma, as a complex matrix, is not just the sum of individual constituents, but the result of complex interactions between a large 8 Summary in English number of chemical compounds (Francis & Newton, 2005). Odorants can interact, showing either additive or competitive effects, which may turn even into synergistic or antagonistic effects (Ferreira, 2012a). Some studies highlight important sensory effects linked to perceptual interactions between odorants. For example, Margaux Cameleyre, Lytra, Tempere, and Barbe (2015) have shown that the solvent-like aroma of isoamyl alcohol partially suppresses the fruity aroma caused by branched ethyl esters. Atanasova et al. (Atanasova, Thomas-Danguin, Chabanet, Langlois, Nicklaus, & Etievant, 2005; Atanasova, Thomas-Danguin, Langlois, Nicklaus, & Etievant, 2004) have equally shown that woody notes tend to dominate over fruity notes in wine. Lytra, Tempere, Zhang, Marchand, de Revel, and Barbe (2014) have also reported, in agreement with previous results from Segurel, Razungles, Riou, Salles, and Baumes (2004) and Escudero, Campo, Farina, Cacho, and Ferreira (2007) that blackcurrant odour can be produced by the interaction between dimethyl sulphide and the ester pool. As can be seen, in most of these previous reports, researchers have studied the interaction between just two odours, often in very simple aroma mixtures, when the fact is that in wine there are many odorants creating different odours and competing simultaneously and contained in a powerful hydroalcoholic matrix with numerous non-volatile compounds which can exert additional chemo-physical interactions. Additionally, and to the best of our knowledge, at the time at which this study was launched there was no study in which major wine odour components have been systematically assessed for their contribution and interactions. This work aims at assessing the aromatic sensory dimensions linked to 6 common wine aroma vectors (N, norisoprenoids; A, branched acids; F, enolones; E, branched ethyl esters; L, fusel alcohols, M, wood compounds) varying in their natural range of occurrence in wine models resembling as much as possible to real wines. 9 Summary in English 2. Methods Wine models (WMs) were built by adding the six aroma vectors at two levels of concentration (fractional factorial design 2VI) to a de-aromatised aged red wine. The 32 WMs derived from such fractional factorial design were first subjected to a pilot sensory test with the aim of reducing the number of samples for the subsequent descriptive study. From this pilot analysis, twenty-one wine models including the base aroma model (formed by the pool of base aromas and all vectors at low levels) were selected for further sensory characterisation with a trained panel. Finally, four of the samples were submitted to quantitative descriptive analysis (QDA) with the main aim of confirming the role of alcohols in the fruity and woody character of WMs. 3. Results and discussion Individual vectors explained just 15% of the sensory space, which therefore mostly depended on perceptual interactions. Red, black and dried fruits and woody notes were satisfactorily reproduced. Norisoprenoids (N), which are formed by β-damascenone and βionone, influences dried and black fruits and suppresses red fruits. Branched acids (A) could be implicated in the type of fruit perceived, enhancing red fruit and dried fruits and depressing black fruit notes. Enolones (F), which are formed by furaneol and homofuraneol, contribute concertedly to red fruit notes in red wines. Branched ethyl esters (E) suppresses dried fruits and modulates black fruits. Whiskylactones, which are the strongest oak-wood aroma components with a very characteristic coconut odour, together with wood volatile phenols (eugenol) are responsible for the woody aroma note. Higher alcohols (L) are revealed as a strong suppressor of red fruits and particularly of woody notes. 10 Summary in English For more information, see article: Ferreira, Sáenz-Navajas, Campo, Herrero, de la Fuente, and Fernández-Zurbano (2016) SECCTION II: Study of the sensory importance of higher alcohols in wine aroma CHAPTER 1. On the effects of higher alcohols on red wine aroma. 1. Introduction Higher alcohols, also known as fusel alcohols, refer to a fraction obtained during the distillation of fermented products smelling very strong and bad. It was said that higher alcohols could contribute positively to the aromatic profile of wines, increasing fruity and flowery notes and aroma complexity, while at levels above 400 mg/L a negative effect caused by the apparition of pungent and unpleasant notes would be noted (Rapp & Versini, 1991) quoting previous work. Also, Aznar, Lopez, Cacho, and Ferreira (2003) by means of PLS models, have suggested that isoamyl alcohol and isobutanol were positively related to the vegetal/pepper note of aged red wines and negatively related to the intensity of the toasted and woody-old attributes. Other authors (Saenz-Navajas, Avizcuri, Ballester, Fernandez-Zurbano, Ferreira, Peyron, et al., 2015; San-Juan, Ferreira, Cacho, & Escudero, 2011) have observed that higher alcohols seemed to be negatively related to wine quality. Notwithstanding, the scientific literature is not unanimous about the role played by higher alcohols on wine aroma. For these reasons, the purpose of this work is to assess the contribution of the four most relevant wine higher alcohols (isobutanol/isoamyl alcohol (I), methionol (T) and β-phenylethanol (B)) to the aromatic sensory characteristics of red wines by means of a reconstitution strategy that comprises wine models with sensory properties similar to real wines. 11 Summary in English 2. Methods High purity commercial standards are further purified by reactive SPE to remove traces of aldehydes. The four purified alcohols were added at two levels of concentration (I, i, B, b, T, t), within the natural range of occurrence, to eight different wine models (WM) differing in levels of fruity (F), woody (W), animal (A) or humidity (H) notes. Samples were submitted to discriminant and descriptive sensory analysis. Generated data were submitted to multivariate statistical analysis (two-way ANOVA and a PCA). 3. Results and discussion The increase of the I vector (isobutanol/isoamyl alcohol) caused in all cases a displacement of the samples towards spirit/alcoholic/solvent notes. Also, a clear opposition between pleasant (strawberry, coconut) and unpleasant attributes (leather, humidity) is noted. Higher alcohols suppress strawberry/lactic/red fruit, coconut/wood/vanilla and humidity/TCA notes, and enhance animal/leather/ink. The spirit/alcoholic/solvent character generated by these compounds has shown to be wine dependent. The present work confirms the sensory importance of the pair isobutanol/isoamyl alcohol on wine aroma perception, while demonstrates that the contributions of methionol and β-phenylethanol are negligible. The effects of the alcohols are extremely dependent on the aromatic context. Only in contexts in which aroma notes are clearly perceived the effects become clearly noticeable, mainly by suppressing the intensity of positive/negative odour notes (fruity, woody and humidity) but also by enhancing the negative animal/leather/ink note with which shares some similarity. Only secondarily, the alcohols are able to communicate to the wine their particular spirit/alcoholic/solvent notes. Because of those effects, aliphatic higher alcohols play a negative role on wine aroma quality. 12 Summary in English For more information, see article: de-la-Fuente-Blanco, Sáenz-Navajas, and Ferreira (2016). CHAPTER 2. Levels of higher alcohols inducing aroma changes and modulating experts’ preferences in wine model solutions. 1. Introduction The role played by higher alcohols, the major constituents of the wine volatile fraction, has been not much studied. Nevertheless, previous studies (de-la-Fuente-Blanco, Sáenz-Navajas, & Ferreira, 2016) found that the pair of higher alcohols (isoamyl alcohol/isobutanol) produces a suppression of odor notes with either positive (fruity, woody) or negative hedonic tone (humidity), while specifically enhancing the animal aroma. In addition, we observed that the contribution of methionol and β-phenylethanol to wine aroma was negligible. Even if these compounds are usually considered important factors influencing wine flavour, there is a lack of empirical evidence, illustrating how the level of HA causes a readily discernible change in wine sensory properties or wine preference. For these reason, this study aimed to identify the minimal concentration of higher alcohols -HA- (isoamyl alcohol/isobutanol) which causes readily clear changes in aroma properties and preferences on three wine models (WMs) (fruity, woody and animallike) according to a group of Spanish wine experts. 2. Methods Sixteen Spanish wine experts carried out several series of 2alternative forcedchoice (2-AFC) sensory tests in three different aroma contexts (fruity-like, woody-like and animal-like aromas) generated in wine models. Panellists performed two tasks and were asked to orthonasally evaluate each pair of samples (Control and spiked) and indicate which 13 Summary in English sample of the pair was 1) more intense (1st task) in two attributes: spirit-like aroma and in the predominant attribute corresponding to each WM (red fruity, woody or animal) or 2) preferred (2nd task). Control wine models (with a basal concentration of HA of 130 mg/L) were contrasted to the same wines containing increasing concentrations of HA. For each concentration of the HA vector (F1–F8), the number of times that the Control was considered more intense than (1st task) or preferred over (2nd task) spiked sample was counted. 3. Results and discussion As aforementioned, the minimal concentration which causes readily discernible sensory changes can be defined as the point that represents the quantity of additional stimulus necessary for perceiving a difference. According to this criterion, it was observed that levels of 299 and 288 mg L-1 of HA conferred their spirit-like characteristic aroma to fruity and woody-like wine models and diminished red fruit (299 mg/L) and woody (281 mg/L) attributes, respectively. In animal-like wine models, the animal aroma generated by ethyl phenols and the spirit-like nuances of HA increased at concentrations of 365 and 375 mg/L of HA, respectively. Nevertheless, a decrease of preference was observed by the presence of HA at concentrations ranging from 284 to 358 mg/L. In a fruity context, Control (containing 130 mg/L of HA) was significantly (P < 0.05) preferred over samples containing at least 326 mg/L of HA. Thus, the addition of at least 196 mg/L of HA to the Control fruity WM caused a decrease in preference. For woody context, samples containing 147 and 152 mg/L of HA were able to significantly decrease woody and increase spirit-like aromas, respectively. The minimal concentration, which causes sensory changes, can therefore be estimated as little as 17 and 22 mg/L for the less sensitive participants. With regards to animal WM preference, samples containing at least 358 mg/L of HA were significantly less preferred than the Control. 14 Summary in English This is the first work estimating the concentration of HA able to affect aroma properties and hedonic character of red wines, demonstrating that isobutanol and isoamyl alcohol are essentially detrimental to wine quality according to the panel of wine experts that carried out the present work. For more information, see article: de-la-Fuente-Blanco, Sáenz-Navajas, and Ferreira (2017) SECCTION III: Study of the sensory importance of ethyl esters in wine aroma CHAPTER 1. Sensory variability induced by ethyl esters in red wine. 1. Introduction Ethyl esters are a group of volatile compounds that impart fruity notes to wine (Etievant, 1991). Leaving aside ethyl esters of major acids, such as ethyl lactate or diethyl succinate, wines contain around 14 different ethyl esters bearing slightly different aroma descriptors. These ethyl esters include ethyl esters of linear and branched fatty acids and also of some hydroxy acids (Escudero, Campo, Farina, Cacho, & Ferreira, 2007). Interestingly, only some of them (ethyl isobutyrate, ethyl 2and 3-methylbutyrates, ethyl butyrate, ethyl hexanoate and ethyl 2-hydroxy-4-methylpentanoate) have been found to be at concentrations above or close to their sensory thresholds (San Juan, Cacho, Ferreira, & Escudero, 2012). Some authors have suggested that individual components have crucial relevance in defining the fruity notes finally perceived in red wines (Falcao, Lytra, Darriet, & Barbe, 2012; Lytra, Cameleyre, Tempere, & Barbe, 2015; Lytra, Tempere, de Revel, & Barbe, 2012a, 2012b, 2014, 2015; Lytra, Tempere, Le Floch, de Revel, & Barbe, 2013; Pineau, Barbe, Van Leeuwen, & Dubourdieu, 2009). We, however, hypothesise that such sensory differences perceived in simple solutions cannot be perceived in a complex mixture 15 Summary in English such as red wine. The main goal of the present work is to demonstrate that the specific sensory nuances of minor esters have, if any, small relevance on the overall wine aroma perception and that for modelling purposes, ethyl esters constitute a single aroma vector conveying a generic fruity-estery note well represented by a simple mixture of odorants or even by a single odorant. Regarding aroma intensity, the goal is to assess how the progressive simplification of the aroma vector affects to the intensity of the mixture, and to verify whether minor esters have a relevant impact on the overall aroma intensity. 2. Methods In this work, a mixture of 14 esters (V1), formed by 5 lineal and 9 branched esters, was prepared in buffered solution (pH 6 and 1% ethanol) at concentrations found in wines (San Juan, Cacho, Ferreira, & Escudero, 2012). In parallel, other simpler and isointense vectors with 6 (V2´), 4 (V3), 3 (V4), 2 (V5-V6) or 1 (V7) individual esters were generated. The isointensity of the seven vectors was evaluated using a 1-butanol reference scale (Atanasova, Langlois, Nicklaus, Chabanet, & Etievant, 2004). In addition, the sensory differences of vectors in isolation was evaluated by triangle test. Then, ten different reconstituted wines were prepared mixing the volatile composition of a young red wine or an aged oaked red wine, the non-volatile matrix corresponding to each one and the selected ester vector. 3. Results and discussion Results show that differences between the aroma vector containing 14 ethyl esters at maximum red wine levels and other isointense aroma vectors containing a reduced number of esters can be perceived just in some aromatic contexts. When the vectors are smelled in isolation, sensory differences are barely perceived. However, when the vectors are smelled in a young red wine context, vectors with just 1 or 2 components are easily 16 Summary in English identified; but in an oaky red wine context, differences are not noticeable perceived. In practical terms, this implies that the mixture of 14 ethyl esters can be satisfactorily replaced by just 3 ethyl esters in a young red wine, or by just 1 –the most intense in the original vectorif woody notes are present. This result questions the alleged importance of some minor esters or specific enantiomeric forms on the specific odour descriptors of wine and confirms the need to work with complex mixtures similar to the target product in suprathreshold areas. Notwithstanding this, results confirm that subthreshold or peri-threshold odorants play an outstanding role on the overall odour intensity of the mixture. Besides, it has been found that the process of aroma simplification concomitantly implies an increase in the amount of odorant (in OAV terms) required to keep the intensity of the aroma vector. It is suggested that such effects are the simple consequence of the power nature of psychophysical functions, evidencing the limited value of OAV for predicting importance or combining aroma vectors. A full version of this chapter has been submitted to publication to Food Chemistry: “Fourteen ethyl esters of wine can be replaced by simpler ester vectors without compromising quality but at the expense of increasing aroma concentration”. de-la-FuenteBlanco, Sáenz-Navajas, Valentin and Ferreira. 17 Summary in English (cognitive) could be related with the inability of consumers to direct their attention to a specific attribute such as bitter when other sensory property such as sourness is perceived at higher intensity. Also, the confusion between sour and bitter tastes could be the cause of this suppresion . On the other hand, sodium and potassium tartrates could compete with quinine receptors (affinity of both for the same receptor), and the occupation of this receptor by the first could generate the bitterness supression. Results demonstrate the presence of taste-taste (bitterness-sourness) and tastearoma (bitterness-aroma) interactions in a complex matrix such as wine. For more information, see article: de-la-Fuente-Blanco, Fernández-Zurbano, Valentin, Ferreira, and Sáenz-Navajas (2017). 24 Summary in English CONCLUSIONS One of the main conclusions of this doctoral thesis is that most wine aromatic notes are due to the existence of perceptual interactions between different aroma vectors. In fact, reconstitution works revealed that only 28% of the variance of the aromatic-sensory space can be explained by individual vectors and that the remaining 72% should be attributed to perceptual interactions. The vector formed by isoamyl and isobutyl alcohols is one of the fundamental pieces of the so-called aromatic buffer and is capable of suppressing the notes of wood, fruit and humidity at levels of concentration at which their own aromatic notes are not perceived, which is an example of a perceptual destructive interaction. However, the animal / leather notes caused by ethyl phenols are enhanced by the isoamyl alcohol vector, which can be attributed to the congruence in both, negative hedonic tones and in the aromatic notes (alcohol/solvent and leather/animal/ink), which is an example of a perceptual enhancement interaction. On the other hand, it has been demonstrated that odorants sharing common descriptors, such as ethyl esters, act in a concerted and integrated way, since in some aromatic contexts, the original 14 components in the mixture can be replaced by the single most intense (or even by one similar to it) without any loss of qualitative information. This integration allows simplifying the number of odorants taking part in reconstituted models or the number of variables taking part in mathematical models build to predict the aroma properties of complex mixtures. This interaction is an example of a perceptual cooperative interaction. From the quantitative point of view, some odorants present at sub-threshold levels exert a strong synergistic effect, while odorants present a supra-threshold concentrations interact mainly via hypo-addition. Even in the hypo-addition case, the 25 Summary in English amount of aroma - in terms of OAV - necessary to keep the intensity of the simplified vectors at the same level than that of the original vector, is much increased (a factor >4 for the whole simplification process, close to 3 for the elimination of suprathreshold odorants). This demonstrates that OAVs are quite limited measures to predict not only the actual importance of an odorant in a mixture but also as criteria for combining odorants into vectors. Rather, results suggest that for modeling purposes, concentrations of individual odorants should be first translated into aromatic intensities and that then, those aromatic intensities should be added by using different approximations, such as the vector model first proposed by Berglund. Interactions between the different components of woody aroma vectors and the fruity vector have been studied in detail. While results confirm the already observed tendency of the woody vector to dominate the aroma of the mixture, also reveal the existence of perceptual interactions leading to the creation of a new aroma concept (which can be defined as perceptual creative interaction), in the case of blackcurrant notes arising from the interaction between the vanilla-rich woody vector and the fruit vector. Finally, a preliminary and simple study directed to assess the existence of crossmodal interactions (odor x taste or odor x astringency) has revealed that these effects are present but do not seem to be essential for the sensory attributes considered. In fact, no effect of aroma on astringency was observed, confirming previous results, and only one taste-aroma interaction (bitterness-animal aroma for naïve consumers) could be demonstrated. Such interaction was dependent on the level of expertise of consumers and thus on their holistic approach when evaluating wine. As a final conclusion, this work suggests that studies seeking to interpret the aroma properties of a complex mixture of odorants, should approach the following working 26 Summary in English scheme: First, identify the odorants present in the mixture; second, integrate in single aroma vectors those groups of odorants likely interacting cooperatively, not forgetting perithreshold odorants; third, study the different perceptual interactions existing between the vectors in the mixture, and carrying the studies in systems as similar and complex as possible as the product object of study. REFERENCES Atanasova, B., Langlois, D., Nicklaus, S., Chabanet, C., & Etievant, P. (2004). Evaluation of olfactory intensity: Comparative study of two methods. Journal of Sensory Studies, 19(4), 307-326. Atanasova, B., Thomas-Danguin, T., Chabanet, C., Langlois, D., Nicklaus, S., & Etievant, P. (2005). 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Experimental Brain Research, 166(3), 345-357. 30 Introducción Introducción INTRODUCCIÓN Vectores de aroma y atributos sensoriales 1. Atributos sensoriales y estímulos químicos La percepción de calidad de los alimentos en general y del vino en particular está relacionada tanto con sus dimensiones extrínsecas, que son las propiedades del producto que se perciben sin llegar a evaluarlo organolépticamente (por ejemplo: precio, origen, diseño del envase, información en la etiqueta), como con las dimensiones intrínsecas, relacionadas con las propiedades organolépticas (apariencia, olor, sabor, gusto, sensaciones quemestésicas…) (Jover, Montes, & Fuentes, 2004; Veale & Quester, 2009). Las primeras han sido ampliamente estudiadas y aplicadas en el área del marketing con el objetivo de aumentar la percepción de calidad del producto, sin embargo, la formación de las propiedades intrínsecas se conoce relativamente poco, muy probablemente por la complejidad a la hora de abordar su estudio. En lo que se refiere a estas últimas, y según los expertos, los grandes vinos son aquellos capaces de inducir una amplia gama de percepciones sensoriales, y por lo tanto una mayor complejidad. Un requisito esencial para la calidad intrínseca y complejidad organoléptica de estos vinos es que esas percepciones no sean incompatibles o incongruentes entre sí, y que ninguna de ellas sea dominante, de modo que la percepción general sea “equilibrada” y “armónica” (Spence & Wang, 2018). En cualquier caso, la percepción de las propiedades intrínsecas del vino es el resultado de la integración en diferentes áreas del cerebro de la información visual, olfativa, gustativa y quemestésica (son aquellas capaces de activar el nervio trigémino y están relacionadas con las sensaciones táctiles, térmicas y de dolor), generando lo que 33 Introducción Figura INTRO.1. a) Dos distribuciones extremadamente diferentes de umbrales de olor individuales entre personas para odorantes con el mismo umbral medio (40 µg/L). En el mejor de los casos, las sensibilidades para el 95% de la población central difieren solo en un factor 4. En el peor de los casos, las diferencias son de dos órdenes de magnitud, b) Se encuentra una distribución diferente de los umbrales en el caso de que una fracción de la población sea anósmica al odorante. En el ejemplo, los individuos anósmicos son en promedio 100 veces menos sensibles al odorante. la intensidad de un olor y su concentración (típicamente en escala logarítmica) es una característica de cada odorante y se conoce por su curva psicofísica. Algunas de estas gráficas están representadas en la Figura INTRO.2 para diferentes odorantes (Ferreira, Pet'ka, Aznar, & Cacho, 2003). Todas las gráficas tienen una estructura sigmoidea común y se pueden dividir aproximadamente en tres regiones: el área del umbral, el área lineal I/log C y el área de saturación. La parte más importante de la gráfica es la primera mitad 40 Introducción Figura INTRO.2. Gráficas que representan log C frente intensidad de olor para cuatro odorantes diferentes: β-damascenona (β-DM), 4-metil-4-mercapto-2-pentanona (4M4M2P), 2-metilbutirato de etilo (E2MB) y benzoato de metilo (MBz). Las gráficas difieren no solo en la posición del umbral, sino también en la inclinación de las curvas. En casos normales (4M4M2P y E2MB) la saturación se alcanza después de 4 órdenes de magnitud. β-DM y MBz representan casos extremos. También se puede observar que los puntos de isointensidad del olor pueden tener OAV muy diferentes (en la gráfica para el punto I = 50%) que está representada con mayor frecuencia por una ley potente, conocida como la ley de Steven en la ecuación 1 (Stevens, 1957, 1961): 𝐼𝐼𝑖𝑖=𝑘𝑘𝐶𝐶𝑖𝑖𝑛𝑛𝑠𝑠 Donde 𝐼𝐼𝑖𝑖 es la intensidad de olor del odorante i, 𝐶𝐶𝐶𝐶 es su concentración y 𝑘𝑘 y 𝑛𝑛𝑠𝑠 son dos coeficientes específicos para el odorante. En esta ley, 𝐶𝐶𝐶𝐶 podría ser reemplazado por el OAV. La cuestión es que hay grandes diferencias entre las pendientes de estas gráficas entre compuestos, al estar determinadas por el exponente 𝑛𝑛𝑠𝑠. Este exponente (𝑛𝑛𝑠𝑠) es un número positivo conocido como coeficiente de Steven, que toma valores frecuentemente entre 0,2 y 0,7, y que determina finalmente cuál es la intensidad del olor asociada a un OAV determinado. Se puede demostrar que un odorante con OAV = 10 y 𝑛𝑛𝑠𝑠 = 0,2, tendrá 3,3 veces menos intensidad de olor que un segundo odorante con el mismo OAV y 𝑛𝑛𝑠𝑠 = 0,7. 41 Introducción Para un OAV de 100, las diferencias de intensidad entre ambos compuestos estarán por encima de un factor 10. Lo contrario también es cierto, si ambos odorantes están presentes en el producto a la misma intensidad de olor, el OAV del odorante con 𝑛𝑛𝑠𝑠 = 0,2 será mucho más alto que el OAV para el odorante con 𝑛𝑛𝑠𝑠 = 0,7. Las razones tercera y cuarta afectan no solo a los OAV, sino también a las intensidades de olor. La tercera razón tiene que ver con el hecho de que las propiedades de olor de los odorantes en aislamiento a veces son pobres predictoras del papel real del odorante en mezclas de olores complejas. Por ejemplo, algunos odorantes a bajas intensidades (u OAVs) pueden ejercer un efecto más importante en el aroma global, como se demostró para 4-metil-4-mercapto-2-pentanona (4M4M2P) en vinos blancos (Escudero, Gogorza, Melus, Ortin, Cacho, & Ferreira, 2004), mientras que, por el contrario, se pueden añadir odorantes a intensidades de olor relativamente altas, como los ésteres etílicos, a mezclas de vino con efectos sensoriales nulos o muy bajos (Escudero, Campo, Farina, Cacho, & Ferreira, 2007). Estos efectos no son fáciles de predecir, pero están relacionados con la existencia de interacciones perceptuales entre los odorantes. En el primer caso, se puede decir que el carácter verde del aroma de 4M4M2P es necesario para que la mezcla de fruta dulce de los ésteres y alcoholes adquiera un carácter de fruta fresca. La presencia de cantidades tan pequeñas como 1 ng/L (1 ppt) de 4M4M2P con un OAV de solo 1,2 hace que el aroma global se identifique más claramente como fruta real, lo que aumenta la intensidad de percepción de la mezcla (Mateo-Vivaracho, Zapata, Cacho, & Ferreira, 2010). Es decir, el carácter verde-fresco de la 4M4M2P “completa” las características de aroma de la mezcla para que se identifiquen más claramente como un “objeto de olor” específico. Para una discusión más detallada sobre los objetos de olor, consulte las referencias (Ferreira, 2012b; Gottfried, 2010; Yeshurun & Sobel, 2010). El efecto opuesto, es decir, la incapacidad de los ésteres etílicos frutales para ser percibidos en una mezcla de 42 Introducción aroma similar al vino, se atribuyó al “efecto de amortiguación del aroma” causado por el etanol y otros volátiles principales del vino (Escudero, Gogorza, Melus, Ortin, Cacho, & Ferreira, 2004), como algunos alcoholes (propanol, isobutanol, butanol, y 2y 3metilbutanol). Estos compuestos se han identificado como fuertes supresores del aroma frutal (Margaux Cameleyre, Lytra, Tempere, & Barbe, 2015). Finalmente, también se debe señalar que algunos odorantes pueden estar implicados en fuertes interacciones físico-químicas con los componentes de la matriz. Si esos componentes de la matriz no están presentes en el modelo para determinar los umbrales, y la mayoría de las veces nunca lo están, los umbrales se subestimarán y los OAV se sobreestimarán. Estas interacciones son particularmente intensas para el caso de odorantes que pueden formar complejos estables con diferentes componentes del vino. Los ejemplos más notables son los mercaptanos y los aldehídos y las dicetonas vecinales. Los primeros forman complejos fuertes con cationes metálicos (Cu2+, Cu+, Fe2+ y, en menor medida, Zn2+) (Franco-Luesma & Ferreira, 2014) y los últimos con dióxido de azufre (Bueno, Zapata, & Ferreira, 2014). Se han medido recientemente sus efectos en las concentraciones del espacio de cabeza, y por lo tanto en las propiedades aromáticas (Wen, Lopez, & Ferreira, 2018). 5. ¿Se puede explicar el aroma del vino a partir de su composición química? La revisión de la literatura y su discusión en los apartados anteriores sugieren que ésta es una pregunta muy oportuna. Algunos autores simplemente no tienen en cuenta todas las consideraciones previas y tienden a simplificar demasiado. Otros, por el contrario, apuntan a la existencia de una red tan compleja de interacciones entre los compuestos de aroma que da la impresión de que entender la base química del aroma de vino es simplemente una ilusión. 43 Introducción Con respecto a la primera observación, a menudo los investigadores intentan deducir las propiedades sensoriales aromáticas de los vinos a partir de un set bastante limitado de datos cuantitativos de algunos compuestos aromáticos. Un primer problema es que los componentes del aroma que se cuantifican son, en la mayor parte de los casos, los que son más accesibles desde el punto de vista analítico, y no necesariamente los que tienen mayor relevancia en las propiedades sensoriales específicas del vino seleccionado. De manera que, los compuestos aromáticos del vino se pueden clasificar en función de su facilidad de ser analizados (Cullere, Lopez, & Ferreira, 2019) y la lista de compuestos de aroma que se puede determinar siguiendo los procedimientos estándar de GC o GC-MS incluye hasta 47 de los 76 principales aromas impacto que constituyen el vino. Desafortunadamente, los compuestos más importantes y que presentan mayor implicación en la formación del aroma de muchos tipos de vinos, como compuestos volátiles de azufre (VSC), mercaptanos polifuncionales, alquilmetoxipirazinas, rotundona, aldehídos de Strecker, furaneol y algunos otros compuestos polares u odorantes extremadamente diluídos, requieren estrategias analíticas específicas. Como se discutirá más adelante, se puede estimar que solo la mitad de compuestos requeridos para comprender las propiedades sensoriales de cualquier vino (no contaminado) se pueden determinar mediante procedimientos estándar de GC o GC-MS. Esto puede ser suficiente en algunos casos, pero, aun así, deberán procesarse primero los datos cuantitativos individuales teniendo en cuenta el concepto o vector de aroma, que se presentará en la siguiente sección. Lo que no se debe hacer es deducir las propiedades frutales o florales de un vino midiendo solo un componente secundario de cualquiera de esos vectores. Con respecto a la segunda observación, algunos investigadores, incluyéndonos a nosotros mismos, hemos intentado en algún momento evaluar los efectos sensoriales de algunos odorantes o grupos de odorantes estimando sus efectos en los valores umbrales de 44 Introducción una mezcla (Margaux Cameleyre, Lytra, Tempere, & Barbe, 2015; Cullere, Cacho, & Ferreira, 2007; Lytra, Tempere, Le Floch, de Revel, & Barbe, 2013). Algunos de estos resultados sugieren que algunos compuestos presentes en el vino a niveles inferiores al umbral pueden ejercer un impacto significativo en las propiedades sensoriales del vino, dando la impresión de que es casi imposible adquirir una comprensión completa de las propiedades del aroma del vino. La verdad es que las propiedades sensoriales a niveles umbrales no se pueden usar para estimar las propiedades sensoriales a niveles supraumbrales, donde el grado de cooperación o aditividad entre los odorantes es mucho menor (Ferreira, 2012a). Esto no significa que, eventualmente, algunos odorantes presentes en niveles cercanos al umbral puedan desempeñar un papel importante, pero, como se mencionó anteriormente, esto seguramente ocurrirá solo si dichos olores tienen una característica de olor que falta en el resto de componentes de la mezcla y que se requiere para completar un concepto de olor. 6. La lógica interna del aroma del vino: el búfer del vino y los vectores de aroma. Se requieren dos elementos principalmente para comprender la relación entre los espacios químico y sensorial del aroma del vino: el búfer de aroma y los vectores de aroma. El búfer de aroma se refiere a las propiedades sensoriales específicas del grupo de moléculas de aroma derivadas de la fermentación alcohólica. Dicho búfer es común en todas las bebidas fermentadas naturalmente, como el vino, el vino de frutas, la cerveza o la sidra. El nombre de búfer proviene del hecho de que esta mezcla tiene un poder de supresión notable sobre muchas notas sensoriales (Escudero, Campo, Farina, Cacho, & Ferreira, 2007; Escudero, Gogorza, Melus, Ortin, Cacho, & Ferreira, 2004). Los vectores de aroma, por su parte, se refieren a las propiedades sensoriales vinculadas a moléculas o grupos de moléculas que pueden considerarse como las "unidades de aroma" básicas. Estos vectores 45 Introducción de aroma explicarán la diversidad de notas sensoriales que pueden percibirse por encima del búfer de aroma. 6.1. El búfer de aroma El búfer de aroma está compuesto por los 27 componentes que se encuentran en la Tabla INTRO.1. Todas esas moléculas son subproductos de fermentación característicos y muchas de ellas están presentes en niveles por encima del umbral. Forman una mezcla aromática que puede definirse como vinosa. Es ligeramente dulce y frutal, alcohólica y picante. Una mezcla de este tipo en la que cada compuesto está presente a niveles normales en vino, proporciona la firma aromática que hace que una bebida fermentada se reconozca como vino, como se demostró recientemente (Fairbairn, 2018). Seguramente, mezclas similares con sus perfiles de concentración específicos hacen también las firmas aromáticas de la cerveza y la sidra. Tabla INTRO.1. Compuestos químicos aromáticos que integran el tampón aromático del vino. Diversos Alcoholes de fusel Ácidos Orgánicos Isoácidos Esteres etílicos de ácidos orgánicos Acetatos de alcoholes fusel Esteres etílicos de isoácidos Etanol Isobutanol Ácido acético Ácido isobutírico Acetato de etilo Acetato de isobutilo Isobutirato de etilo Diacetilo Alcohol Isoamilico Ácido butirico Ácido 2metilbutírico Butirato de etilo Acetato de isoamilo 2-metil butirato de etilo Acetaldehído Hexanol Ácido hexanoico Ácido isovalérico Hexanoato de etilo Acetato de feniletilo Isovalerato de etilo β-feniletanol Ácido octanoico Octanoato de etilo Metionol Ácido decanoico Decanoato de etilo Como son subproductos metabólicos primarios o secundarios, su variabilidad no es tan grande como la observada en otros componentes del aroma del vino, derivados de la 46 Introducción uva, la madera u otras fuentes. A pesar de eso, existen importantes diferencias cuantitativas relacionadas con el tipo de vinificación, la variedad de uva (Ferreira, Fernandez, & Cacho, 1996) y, por supuesto, la cepa de la levadura (Swiegers, Bartowsky, Henschke, & Pretorius, 2005). La composición del búfer cambia durante el envejecimiento del vino debido a la evolución de los diferentes equilibrios de esterificación/hidrólisis. Los niveles de algunos ésteres aumentan con el tiempo, en particular los ésteres etílicos de los ácidos ramificados, mientras que los acetatos de los alcoholes de fusel/superiores prácticamente desaparecen. Los niveles de ésteres etílicos de ácidos grasos cambian en menor medida ya que durante la fermentación se producen en niveles cercanos a los del equilibrio. Algunos componentes del búfer aromático pueden alcanzar concentraciones lo suficientemente altas como para ser percibidas específicamente, una de las razones por las que los componentes del búfer también se organizan en vectores de aroma, como se explica en la siguiente sección. Este es el caso de vinos demasiado alcohólicos, o con demasiado acetato de etilo o con grandes cantidades de ésteres etílicos o de acetatos de alcoholes superiores. Las propiedades específicas que explican por qué el búfer se nombra como tal son: 1. El escaso impacto sensorial relacionado con la omisión de uno de sus componentes en las pruebas de omisión aromática (Ferreira, Ortin, Escudero, Lopez, & Cacho, 2002). 2. La capacidad de suprimir la intensidad aromática de un grupo de compuestos agregados a la mezcla (Escudero, Campo, Farina, Cacho, & Ferreira, 2007; Escudero, Gogorza, Melus, Ortin, Cacho, & Ferreira, 2004). Estudios más recientes han demostrado que los efectos de supresión se pueden asociar a algunos componentes específicos del búfer. El efecto de supresión ejercido por el 47 Introducción etanol en las notas frutales del vino ya se describió en 2007 (Escudero, Campo, Farina, Cacho, & Ferreira, 2007). En dicho trabajo, los autores demostraron que la intensidad frutal de los vinos modelo que contenían una cantidad fija de ésteres frutales disminuyó considerablemente cuando se aumentó el contenido alcohólico, convirtiéndose en no perceptible a 14,5 % (v/v). Este efecto ha sido confirmado por otros autores (Goldner, Zamora, Di Leo Lira, Gianninoto, & Bandoni, 2009; Villamor, Evans, & Ross, 2013) que también encontraron una disminución en los matices de caramelo y un aumento en las notas herbáceas, químicas y a madera. No cabe duda de que una parte del efecto está relacionado con el complejo papel del etanol como disolvente. Un aumento en el nivel de etanol aumenta la solubilidad de los compuestos del aroma, disminuyendo la concentración en el espacio de cabeza en el equilibrio. Sin embargo, el etanol mejora las propiedades de transferencia de masa desde el líquido, mejorando la transferencia de compuestos volátiles en sistemas dinámicos (Ickes & Cadwallader, 2017). Dado que los sistemas dinámicos están más cerca de las condiciones de la degustación y del consumo de vino (Escudero, San-Juan, Franco-Luesma, Cacho, & Ferreira, 2014), parece razonable pensar que una gran parte de los efectos de supresión del etanol tienen un auténtico origen perceptual. El ácido acético también tiene un efecto supresor. A niveles tan bajos como 0,4 g/L, es capaz de disminuir fuertemente la intensidad de las notas florales en vinos blancos (Campo, Ferreira, Escudero, & Cacho, 2005) y la intensidad de la nota frutal en los vinos tintos (San-Juan, Ferreira, Cacho, & Escudero, 2011). Pero los componentes más activos en el búfer parecen ser los alcoholes superiores, (isobutanol, alcohol isoamílico, β-feniletanol y metionol). Su papel no se ha abordado adecuadamente hasta el momento, a pesar del hecho de que fueron los primeros compuestos de aroma citados en el vino. Durante años, se afirmó que por debajo de 300 mg/L eran contribuyentes positivos al aroma del vino (Rapp & Versini, 1991), aunque esta afirmación 48 Introducción no parecía estar respaldada por resultados experimentales sólidos. Cameleyre y colaboradores (2015) demostraron recientemente que la mezcla de propanol, isobutanol, butanol y 2y 3-metilbutanol añadidos a una disolución hidoralcohólica que contiene 13 ésteres frutales induce notas sensoriales que recuerdan a disolvente y butírico y disminuyen la intensidad de la nota frutal. Los efectos bastante negativos del ácido acético, el alcohol y los alcoholes superiores son contrarrestados parcialmente por los efectos sorprendentemente positivos de los ácidos grasos, también componentes del búfer, que pueden potenciar las notas frutales (San-Juan, Ferreira, Cacho, & Escudero, 2011). Incluso los ácidos ramificados, como los ácidos isobutírico y 2y 3-metilbutírico, a pesar de sus olores fuertes y desagradables, no suprimen las notas frutales, sino que suprimen o enmascaran específicamente los matices aromáticos de los etilfenoles (Romano, Perello, Lonvaud-Funel, Sicard, & de Revel, 2009). El fuerte efecto de supresión causado por el búfer en muchos matices de aroma contrasta fuertemente con la facilidad con la cual algunos odorantes con descriptores frescos y verdes, como 4-metil-4-mercapto-2-pentanona (4M4M2P) o acetato de 3mercaptohexilo (3MHA), introducen cambios en el búfer aromático (Escudero, Gogorza, Melus, Ortin, Cacho, & Ferreira, 2004; Mateo-Vivaracho, Zapata, Cacho, & Ferreira, 2010). Como se mencionó anteriormente, este comportamiento variable se puede atribuir al hecho de que los descriptores frescos y verdes son parte de nuestros conceptos y objetos frutales. Estas observaciones son cruciales para comprender el concepto de vector de aroma y la importancia de los objetos de aroma en el estudio de las interacciones perceptuales entre vectores. 49 Introducción 8. Observaciones finales En general, parece que modelar la percepción del aroma del vino no está tan lejos. Es cierto que aún existen algunos desafíos notables, en particular los derivados del esfuerzo analítico excesivo que se requiere hoy para recopilar información de todos los vectores de aroma relevantes presentes en un vino. También es cierto que la “teoría” aquí esbozada se encuentra en estado germinal y requiere pruebas exhaustivas y una definición mucho más clara de sus diferentes componentes conceptuales. Pero, sin embargo, también está claro que existen razones sólidas para pedir a los investigadores algo más que tratar de predecir las propiedades del aroma del vino a partir de los descriptores sensoriales de los odorantes secundarios. 9. Referencias Atanasova, B., Thomas-Danguin, T., Chabanet, C., Langlois, D., Nicklaus, S., & Etievant, P. (2005). Perceptual interactions in odour mixtures: odour quality in binary mixtures of woody and fruity wine odorants. Chemical Senses, 30(3), 209-217. Atanasova, B., Thomas-Danguin, T., Langlois, D., Nicklaus, S., & Etievant, P. (2004). 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Investigar las consecuencias cualitativas y cuantitativas de la interacción entre el vector de ésteres etílicos y los tres vectores diferentes unidos a los extraíbles de la madera. 5. Evaluar el efecto de las interacciones cruzadas de los vectores de aroma con el amargor y la astringencia de los vinos tintos. 65 Interacciones sensoriales entre seis vectores de aroma capaces de explicar cuatro atributos de aroma en vinos tintos Boidron, & Dubourdieu, 1995; Mateo-Vivaracho, Zapata, Cacho, & Ferreira, 2010). Sin embargo, en los productos más complejos y más valorados, el perfil aromático se crea por acción concertada de muchas moléculas. El vino tinto es un buen ejemplo de matriz compleja: hay una rica matriz no-volátil, hay una gran cantidad de odorantes activos diferentes, y no hay a menudo compuestos impacto claros. En este contexto químico la percepción de las diferentes notas es extremadamente compleja. Recientes investigaciones llevadas a cabo en nuestro grupo de investigación (SaenzNavajas, Gonzalez-Hernandez, Campo, Fernandez-Zurbano, & Ferreira, 2012) han subrayado que la percepción de la calidad por parte de un grupo de expertos españoles de un grupo de vinos premium españoles (muestras del segmento de precio alto en el mercado) no está necesariamente ligada a intensos matices de olor explícitos, sino más bien a una gran paleta de muchos olores sutiles. Esto sugiere que la complejidad y la armonía son dimensiones esenciales relacionadas positivamente con la percepción de calidad tal y como mostró Charters y colaboradores (2007). El estudio de la composición analítica del mencionado grupo de vinos Premium españoles junto con otras dos categorías de vino pertenecientes a segmentos de precio más bajo: precio bajo y medio (San Juan, Cacho, Ferreira, & Escudero, 2012), han proporcionado una base de datos cuantitativa extensa, que ha permitido identificar algunas pistas importantes relacionadas con la calidad del vino, los atributos del aroma y la composición en odorantes. Dos observaciones importantes de este estudio son el objetivo del presente trabajo. En primer lugar, los modelos de calidad tienen una estructura común basada en la oposición de compuestos de aroma positivos y defectos en todas las categorías de vino, pero los compuestos clave capaces de explicar la calidad son característicos del segmento de precio. Por ejemplo, los ácidos ramificados están positivamente relacionados con la calidad de los vinos Premium, mientras que están relacionados negativamente con los vinos de categoría de precio medio. Esto podría deberse 72 SECCIÓN I a la existencia de interacciones perceptuales entre los componentes de aroma específicos de la categoría del vino. En segundo lugar, dejando a un lado algunos atributos del aroma del segmento Premium (San-Juan, Ferreira, Cacho, & Escudero, 2011), no fue posible encontrar modelos predictivos satisfactorios para la mayoría de los atributos aromáticos en las otras categorías de vino (segmentos de precio medio y bajo). El fallo en la modelización puede tener múltiples causas, entre ellas los efectos de la matriz no volátil en la volatilidad de los compuestos del aroma (Sáenz-Navajas, Campo, Culleré, Fernández-Zurbano, Valentin, & Ferreira, 2010) o la limitación de los modelos lineales usados en estos trabajos. En cualquier caso, esto implica que controlar perfectamente las variables composicionales sería esencial para aumentar el conocimiento sobre la percepción del aroma y por tanto, sobre la calidad del vino. De ahí que trabajar con mezclas complejas como los vinos modelos parece ser una herramienta interesante capaz de superar las principales limitaciones relacionadas con la comprensión de la formación del aroma. El presente trabajo tiene como objetivo evaluar las dimensiones sensoriales aromáticas relacionadas con seis vectores de aroma del vino comunes que varían en un rango de concentraciones naturales en el vino y estudiar las interacciones sensoriales entre ellos. Los seis vectores de aroma estudiados fueron los norisoprenoides (N), los ácidos ramificados (A), los ésteres etílicos ramificados (E), alcoholes superiores (L), enolonas (F) y compuestos relacionados con la madera (M); todos ellos fueron elementos básicos esenciales de los modelos PLS que explican la calidad de los vinos tintos (San Juan, Cacho, Ferreira, & Escudero, 2012). Una de los principales retos del estudio fue llevar a cabo el estudio con muestras “similares a vino”, de modo que pudieran identificarse interacciones realistas entre los componentes. Se prepararon diferentes vinos modelo (WM) mediante un protocolo basado en la reconstitución que proporciona muestras de vino casi reales (Saenz73 Interacciones sensoriales entre seis vectores de aroma capaces de explicar cuatro atributos de aroma en vinos tintos Navajas, Campo, Fernandez-Zurbano, Valentin, & Ferreira, 2010), los cuales fueron posteriormente evaluados sensorialmente. 2. Materiales y métodos 2.1. Estándares 2.1.1. Reactivos y compuestos Los estándares químicos fueron suministrados por Fluka (Buchs, Suiza), Lancaster (Estraburgo, Francia), Panreac (Barcelona, España) y Firmenich (Ginebra, Suiza). El diclorometano y el etanol de calidad Lichrosolv fueron suministrados por Merck (Dramstadt, Alemania). El agua pura se obtuvo de un sistema de purificación Milli-Q (Millipore, Bedford, MA). 2.1.2. Extractos no volátiles Se liofilizaron cincuenta mililitros de muestra de vino (Muga reserva 2004, D.O. Rioja, España) en matraces redondos de 250 mL, las muestras se extrajeron después con 3 fracciones de 10 mL de diclorometano para eliminar los compuestos volátiles restantes. El diclorometano se eliminó posteriormente por el paso a través de la muestra de una corriente de nitrógeno puro (50 mL/min) durante 20 minutos. Se comprobó la ausencia total de diclorometano por microextracción en fase sólida de espacio de cabeza (Carboxen/PDMS 75 µm a 30 ºC durante 10 min) y GC con detector de captura de electrones (límite de detección del sistema de 1 ng/muestra). Este extracto se disolvió posteriormente en agua de baja mineralización (Evian, Evian-les Bains, Francia) y se llevó a un volumen de 10 mL (5 veces concentrada). Estas muestras se colocaron en viales y se hizo pasar por el espacio de cabeza un flujo de nitrógeno para evitar el contacto de la muestra con oxígeno y se almacenó a 5 ºC hasta la preparación de la muestra. 74 SECCIÓN I 2.2. Vinos modelo (WM) 2.2.1. Selección de los modelos por diseño factorial Se tuvieron en cuenta seis variables cuantitativas controladas (llamadas vectores de aroma) a dos niveles de concentración (bajo y alto) en el test de prueba preliminar siguiendo un diseño factorial. Las concentraciones alta y baja corresponden a los valores de concentración máxima y mínima encontrados en un grupo de 25 muestras de vinos Premium analizados en el laboratorio (San Juan, Cacho, Ferreira, & Escudero, 2012). Los experimentos se plantearon siguiendo un diseño 2 6-1 donde se estimaron los principales factores y pares de interacciones de dos factores, asumiendo que los efectos de las interacciones de alto orden eran limitados (Bisgaard, 1988). Se obtuvieron un total de 32 formulaciones diferentes de los vinos modelo según este diseño factorial. 2.2.2. Composición química de los vinos modelo Los vinos modelo se prepararon mezclando un grupo de compuestos de aroma comunes del vino (búfer aromático) con las seis familias objeto de estudio (norisoprenoides (N), ácidos ramificados (A), ésteres etílicos ramificados (E), alcoholes mayoritarios (L), enolonas (F) y compuestos relacionados con la madera (M)), a dos posibles niveles de concentración (alto y bajo) (Tabla 1.1). En términos de codificación de las muestras, las letras mayúsculas (ej. NAEM) se establecen para un vino modelo en el que esos vectores (N, A, E y M) están presentes en alta concentración y los vectores faltantes (F y L en este caso) están presentes a bajas concentraciones. Se adicionó esta mezcla sobre el extracto no volátil correspondiente a 375 mL de vino tinto envejecido (Saenz-Navajas, Gonzalez-Hernandez, Campo, Fernandez-Zurbano, & Ferreira, 2012) junto con el etanol y el agua mineral embotellada hasta completar el volumen final de 375 mL con un contenido en etanol del 12 % (v/v). Las concentraciones 75 Interacciones sensoriales entre seis vectores de aroma capaces de explicar cuatro atributos de aroma en vinos tintos del grupo de compuestos comunes del aroma base eran la media de los valores del mismo grupo de 25 vinos tintos Premium españoles citado anteriormente. Los niveles alto y bajo de los vectores correspondían a la concentración máxima y mínima encontradas en el mismo grupo de muestras. Estos vinos estaban elaborados con diferentes variedades y mediante diferentes procedimientos, de manera que cubriesen la mayor variabilidad en la composición del aroma y por tanto de los perfiles de aroma. El mismo grupo de muestras fue analizado en nuestro laboratorio en el marco de un estudio a gran escala durante el año anterior al presente trabajo (San-Juan, Ferreira, Cacho, & Escudero, 2011). Se preparó una disolución única en etanol, que contenía un grupo de 19 compuestos de fermentación, mientras que el resto de familias de aroma (vectores) se prepararon separadamente. Estas disoluciones se prepararon un día antes de la sesión formal de análisis sensorial y se almacenaron a - 20 ºC. Los vinos modelo se prepararon al comienzo del día de las sesiones descriptivas y se almacenaron en botellas ámbar de 500 mL con cierre y en una vinoteca con temperatura controlada a 5 ºC hasta su servicio. 2.3. Evaluación sensorial En este estudio participaron tres tipos de paneles sensoriales: 2.3.1. Expertos (estudio piloto) Este grupo estaba formado por 5 investigadores del mundo del vino (4 mujeres y 1 hombre, de edades comprendidas entre los 29 y 55 años de edad, media 41 años y desviación estándar de 10) regularmente implicados en la evaluación del vino y con una larga experiencia (> 10 años) en la cata de vinos. Ellos se ajustaban a la categoría de expertos en vino según Parr y colaboradores (2002). Pertenecían al personal del laboratorio y eran conscientes de la naturaleza de las muestras y del objetivo del estudio. Este panel llevó a cabo un experimento piloto en el cual evaluaron 32 vinos modelo del diseño factorial 76 SECCIÓN I fraccionado. Durante esta única sesión, los expertos evaluaron ortonasalmente los vinos modelo y se les pidió que proporcionaran descripciones abiertas de cada vino. Se llevó a Tabla 1.1. Concentraciones (µg/L) de los compuestos usados para preparar los vinos modelo (WM). Las concentraciones de los compuestos que constituyen el aroma base común son la media de los valores encontrados en vinos Premium y los niveles bajo y alto de los vectores de aroma son las concentraciones máximas y mínimas encontradas en el artículo de San Juan y colaboradores (2011). Compuesto Descriptor Concentración Grupo de compuestos que conforman el aroma base 2,3-butanodiona Crema 200 Acetaldehido Manzana 10000 Propanoato de etilo Frutal 140 Butirato de etilo Frutal, fresa 140 Hexanoato de etilo Frutal, fresa 120 Octanoato de etilo Jabón 90 Decanoato de etilo 60 Lactato de etilo 125000 Cinamato de etilo Floral, polen 0,8 Acetato de feniletilo Rosa 30 Acetato de isoamilo Plátano 200 1-hexanol Césped, verde 1000 (Z)-3-Hexenol Césped, verde 100 Guaiacol Ahumado 13 Ácido butírico Queso 580 Ácido hexanoico Queso 1100 Ácido octanoico Queso 440 Ácido decanoico Queso 160 Ácido acético Vinagre 300000 Vector de aroma Compuesto Nivel bajo Nivel alto Norisoprenoides (N) β-damascenona Manzana 0,8 3,2 β-ionona Violeta 0,12 0,48 Ácidos ramificados (A) Ácido 2metilpropanoico Queso 236 944 Ácido 2-metilbutírico Queso 120 480 Ácido 3-metilbutirico Queso 80 320 Enolonas (F) Furaneol Caramelo 10 40 Homofuraneol Caramelo 150 600 Esteres etílicos ramificados (E) Isobutirato de etilo Frutal, fresa 100 400 2-metilbutirato de etilo Frutal, fresa 15 60 3-metilbutirato de etilo Frutal, fresa 25 100 Alcoholes superiores (L) 2-metilpropanol Fusel 22000 66000 Alcohol isoamílico Fusel 120000 360000 β-feniletanol Rosa 25000 75000 Compuestos de la madera (M) Whiskylactona Coco 100 500 Eugenol Clavo 10 50 77 Interacciones sensoriales entre seis vectores de aroma capaces de explicar cuatro atributos de aroma en vinos tintos cabo una discusión entre los 5 expertos con el objetivo final de seleccionar un total de 20 vinos modelo (de los 32 preparados) que presentaron mayor variabilidad en sus perfiles de aroma. Las muestras que poseían unos perfiles de aroma muy similares se excluyeron del estudio posterior. 2.3.2. Panel entrenado 1 (test descriptivo 1) Se reclutó a un grupo de 26 consumidores regulares de vino después de la distribución de un e-mail a través de la lista de la Universidad de Zaragoza. Se seleccionó a los participantes solo si bebían vino blanco y/o tinto al menos una vez a la semana. El grupo estaba compuesto de 16 mujeres y 19 hombres de edades comprendidas entre los 24 y 69 años de edad (media 36 años y desviación estándar de 9). Antes de las sesiones formales, los panelistas llevaron a cabo 12 sesiones de entrenamiento (60 minutos cada una, durante un periodo de cuatro meses) en el análisis sensorial descriptivo de vino siguiendo la metodología de frecuencia de citación, como describe Langlois y colaboradores (2010). Durante el entrenamiento, se presentaron diferentes estándares de referencia representativos del aroma y se discutieron con los panelistas. Los estándares eran odorantes disponibles comercialmente de International Flavour and Fragances (Dijon, Francia), Sentosphère (Paris, Francia), Le Nez du Vin (Jean Lenoir, Provence, Francia), Firmenich (Ginebra, Suiza) o productos frescos (frutas, zumos, especias, verduras, etcétera) preparados al inicio de cada sesión como se describe en el artículo de Saenz-Navajas y colaboradores (2011). Este panel evaluó ortonasalmente los 20 vinos modelo seleccionados por el panel de expertos en la primera etapa. Para ello, los panelistas tenían que elegir un máximo de cinco términos de una lista propuesta que contenía 85 términos agrupados en familias de olor (ver Figura 1.1 del Anexo 1). La selección de los términos discriminantes 78 SECCIÓN I se realizó según explica Saenz-Navajas y colaboradores (2012). Para controlar el rendimiento global del panel, uno de los vinos modelo se evaluó por duplicado (21 vinos a partir de ahora). Las medidas se llevaron a cabo en dos sesiones formales de 60 minutos y las respuestas se recogieron en formato papel. 2.3.3. Panel entrenado 2 (test descriptivo 2) Este panel estaba formado por 15 participantes (6 hombres y 9 mujeres, de edad media 28 años y desviación estándar de 6) que ya habían participado en sesiones sensoriales en el pasado. El panel se entrenó en análisis descriptivo cuantitativo (QDA). Los panelistas recibieron siete sesiones de entrenamiento de 60 minutos antes de las sesiones formales. Este panel evaluó ortonasalmente cuatro vinos modelo (NAFM, NAFML, NAF, NAFL) por duplicado. Estas muestras se seleccionaron en base a los resultados descriptivos generados con los dos paneles anteriores (expertos y panel entrenado 1), con el objetivo principal de confirmar el papel de los alcoholes en el carácter frutal (por comparación de NAF con NAFL) y de madera (por comparación de NAFM con NAFML) de los vinos modelo. Durante las sesiones formales, a los panelistas se les pidió que olieran ortonasalmente cada muestra y que evaluaran la intensidad de los siete atributos de aroma (fruta fresca, fruta pasa, madera/tostado, especiado, vegetal, animal y sotobosque) en una escala estructurada de 11 puntos (0 = baja; 5 = intermedia y 10 = alta) (ver Figura 1.2 del Anexo 1). Las medidas de las ocho muestras se llevaron a cabo durante dos sesiones formales de 60 minutos. Ambos tests, descriptivos 1 y 2, se llevaron a cabo en una sala de catas ventilada y acondicionada (temperatura de la sala de 20 ºC), donde cada panelista se situó en una cabina individual. En los tres casos, quince minutos antes de la sesión formal, se sirvieron 15 mL de los vinos modelo (18 ± 1 ºC) en una sala a temperatura ambiente, en copas negras ISO 79 Interacciones sensoriales entre seis vectores de aroma capaces de explicar cuatro atributos de aroma en vinos tintos codificadas con un número de tres cifras y cubiertas con una placa Petri, según un orden aleatorio monádico secuencial y diferente para cada juez. No se informó a los panelistas sobre la naturaleza de las muestras. Los datos se recogieron manualmente por medio de fichas de cata en formato papel. 2.4. Análisis de datos 2.4.1. Evaluación del rendimiento del panel Panel entrenado 1 (test descriptivo 1): Se calculó la media de los índices de reproducibilidad (Ri) para cada panelista en las sesiones duplicadas, como define (Campo, Do, Ferreira, & Valentin, 2008). Los 26 panelistas presentaron un Ri > 0,3, por lo que se tuvieron en cuenta los resultados de todos los participantes. Los vinos modelo presentados por duplicado se agruparon juntos en el mapa CA, lo cual confirma la repetibilidad global del panel. Panel entrenado 2 (test descriptivo 2): Se realizó un ANOVA de tres factores con los datos de intensidad de los atributos evaluados mediante QDA, en el que el modelo tenía en cuenta los vinos (W), jueces (J) y repeticiones (R) como factores fijos y todas las interacciones de primer orden. Se confirmó la ausencia de efectos significativos para ambas repeticiones (no se observó efecto significativo para R y R*W) y para la interacción vino x juez (W*J) en todos los atributos evaluados, confirmando el rendimiento del panel. 2.4.2. Análisis factorial multidimensional (CA y PCA) Para los datos derivados del análisis descriptivo realizado por el panel entrenado 1, se realizó un análisis de correspondencias (CA) con la tabla de contingencia formada por la tabla vino x atributo de aroma, en la cual cada celda representa la frecuencia de citación (FC) de un término en un vino. 80 SECCIÓN I Se realizó un análisis de componentes principales normalizada (PCA) con las puntuaciones de intensidad media de los panelistas del panel entrenado 2 para los siguientes atributos significativos: fruta fresca, tostado/madera y vegetal. Según el ANOVA de dos factores (muestras y jueces como factores), el efecto del vino fue significativo (nivel del 5%) solo para esos tres atributos. El software estadístico empleado para estos análisis fue SPSS 19.0 (SPSS INC., Chicago, IL) y SPAD (versión 5.5, CISIA-CESRESTA, Montreuil, Francia). 2.4.3. Análisis de la varianza (ANOVA) Se llevaron a cabo dos estudios ANOVA para identificar los vectores de aroma que influyen en la percepción de los descriptores en los vinos modelo con los datos derivados del panel entrenado 1: el primero, un ANOVA de un factor en el cual los vectores de aroma fueron los factores principales y los descriptores fueron las variables, el segundo considerando modelos factoriales más complejos. En este caso, para cada descriptor se testearon todas las posibles combinaciones de los seis factores principales y sus interacciones de segundo orden, eligiendo el mejor modelo en términos de significatividad y varianza explicada. Los análisis se realizaron con SPSS 19 (SPSS INC., Chicago, IL). En ambos casos, para aquellos descriptores que influyen significativamente en cualquier vector de aroma se calcularon las frecuencias medias del descriptor en el vino modelo que contenía el nivel bajo o el alto de ese vector. 3. Resultados y discusión 3.1. Vinos modelo y espacios sensoriales de los vinos El primer objetivo del presente estudio fue evaluar las dimensiones de los espacios sensoriales generados por los vinos modelo en los cuales se hicieron variar seis vectores de aroma en los rangos de concentración encontrados en vinos tintos comerciales siguiendo 81 Interacciones sensoriales entre seis vectores de aroma capaces de explicar cuatro atributos de aroma en vinos tintos Figura 1.3. Perfil sensorial (expresado como frecuencia de citación de los atributos) de los vinos con propiedades sensoriales extremas. De esta manera, las puntuaciones representadas por la suma de las puntuaciones individuales de esos descriptores individuales para cada vino deberían estar relacionadas con la intensidad global de aroma positivo percibido en un vino dado. Esas puntuaciones se pueden observar en la Tabla 1.3 y proporcionan algunas pistas interesantes. La primera es que 7 de los 8 primeros modelos contienen la pareja NA, y 5 el trio NAM, con la mayor puntuación. Remarcablemente, y dejando a un lado el modelo binario NA y el modelo completo NAFELM, estas combinaciones no se encuentran en cualquier otra posición de la lista, apuntando la relevancia de la presencia simultánea de norisoprenoides y ácidos en la percepción de las notas relacionadas con la fruta y la madera. Una segunda pista importante es que L y notablemente las combinaciones con LM están presentes en la parte baja de la lista. De hecho, 6 de los 8 cuartetos que contienen los alcoholes fusel (L) se encuentran en posiciones por debajo de la base en la tabla, y 5 de ellos ocupan las últimas 5 posiciones. Estos aspectos se discutirán a continuación. 88 SECCIÓN I Tabla 1.3. Clasificación de los vinos modelos según la FC de los términos combinados: frutal-madera y la suma de las frecuencias de citación de todos los descriptores para un vino modelo. Suma de los descriptores frutal y madera NALM 44 NFLM 41 NAFM 40 NAEM 39 NAFE 39 NAFM 39 NAEL 39 NAFELM 38 base 35 AELM 35 NE 33 AFEM 33 AE 33 NFEL 32 AFEL 31 FE 30 NA 29 AF 29 AFLM 29 FELM 26 NELM 24 *Termino combinado calculado como la suma de la FC de los atributos siguientes: fruta roja, negra y pasa, tostado y madera. 3.3. Relación entre los vectores y los atributos de aroma Se llevaron a cabo dos estudios diferentes ANOVA para estimar la significatividad de los vectores individuales y de sus interacciones para formar las notas sensoriales. Los resultados de esos análisis están resumidos en la Tabla 1.4. El ANOVA de un factor revela que en solo tres de los atributos (fruta pasa, madera y floral) hay un vector de aroma que presenta un efecto positivo significativo (P < 0,05). Se debe indicar que, en los tres casos, incluso si se alcanza la significatividad, el efecto del vector en el atributo del aroma no es muy grande, explicando en todos los casos menos de un tercio de la intensidad del atributo (dado en la tabla 1.2). En lo referente al vector, N (norisoprenoides), éste tiene un efecto positivo en la intensidad de los atributos “fruta pasa” y “tostado” (no alcanza la significatividad), confirmando aún más el complejo papel de la β-ionona y la βdamascenona en el aroma del vino (Pineau, Barbe, Van Leeuwen, & Dubourdieu, 2007). Como se esperaba, el vector madera M (whiskylactona y eugenol) influye en el término 89 Interacciones sensoriales entre seis vectores de aroma capaces de explicar cuatro atributos de aroma en vinos tintos “madera”; sin embargo, explica un escaso 25 % del rango de aparición de la nota “madera”, sugiriendo la participación activa de otros vectores en dicho atributo. Finalmente, el vector alcoholes L, que contiene isobutanol, alcohol isoamílico y β-feniletanol, está relacionado de manera significativa con la percepción de la nota floral (P < 0,001). En general, esto significa que tres atributos completos (fruta negra, fruta roja y oliva) y más de dos tercios de otros tres (fruta pasa, madera y floral) no pueden explicarse con los modelos univariantes. Esta falta de capacidad explicativa resalta la pobre capacidad de los vectores individuales para dar lugar a un olor emergente en la mezcla, y sugiere que la mayoría de los cambios en el aroma son causados por fuertes interacciones perceptuales entre los vectores. Estas interacciones se han descrito en mezclas binarias de odorantes del vino (Atanasova, Thomas-Danguin, Chabanet, Langlois, Nicklaus, & Etievant, 2005; Atanasova, Thomas-Danguin, Langlois, Nicklaus, Chabanet, & Etievant, 2005; Atanasova, Thomas-Danguin, Langlois, Nicklaus, & Etievant, 2004), dejando patente el enmascaramiento de los esteres frutales del vino (acetato de isoamilo y butirato de etilo) por parte de los odorantes de la madera (como whiskilactona y guaiacol) o el alcohol isoamílico (Margaux Cameleyre, Lytra, Tempere, & Barbe, 2015). Estos autores ya habían sugerido que las interacciones perceptuales que tienen lugar en medios complejos tales como el vino serían determinantes en la formación del sabor/flavor del producto final. El ANOVA multifactorial consideró los factores principales y las interacciones de segundo orden (binarias) entre ellos. Las interacciones de nivel superior no se pudieron analizar con el presente enfoque experimental. Los resultados mostraron que dejando de lado el atributo “floral”, cuyo modelo no alcanza la significatividad, y “vegetal”, que ni siquiera está presente en la tabla, es posible encontrar modelos estadísticamente significativos que expliquen una fracción importante de la varianza para el resto de términos. Los modelos para los cinco atributos principales (fruta roja, fruta negra, frutas 90 SECCIÓN I pasas, tostado y madera) muestran una gran complejidad, revelada por el alto número de factores principales (13) y las interacciones significativas (21), que muestran una pobre aditividad de los efectos y confirmando un papel relevante de las interacciones. El modelo para el aroma a fruta roja revela que este atributo está vinculado positivamente a la presencia de enolonas (F), lo que concuerda con trabajos anteriores que sugieren que las enolonas estaban involucrados en el carácter a fruta fresca de los vinos tintos (San-Juan, Ferreira, Cacho, & Escudero, 2011). Por otro lado, la fruta roja parece sufrir una supresión a causa de los alcoholes (L) y los norisoprenoides (N). Esto está de acuerdo con literatura reciente que sugiere un efecto enmascarante de los ésteres frutales del vino debido al alcohol isoamílico (Margaux Cameleyre, Lytra, Tempere, & Barbe, 2015). Además, se ha citado que los norisoprenoides inducen la formación de un aroma dulce, similar a las pasas, cuando se encuentran en altas concentraciones, por lo que estos compuestos podrían ser los responsables del efecto de enmascaramiento sobre el vector de las enolonas observado para el atributo fruta roja fresca (San-Juan, Ferreira, Cacho, & Escudero, 2011). Adicionalmente, se han encontrado cinco interacciones binarias significativas, particularmente para los vectores de ácidos ramificados (A) y compuestos de la madera (M), revelando que la percepción de la fruta roja está impulsada principalmente por las enolonas (F), pero está de hecho fuertemente influenciado por casi todos los vectores. Por ejemplo, la interacción F x M revela que altos niveles de compuestos relacionados con la madera pueden suprimir la nota de fruta roja generada por altos niveles de enolonas. Este resultado está de acuerdo con el efecto de enmascaramiento atribuido al aroma de la madera sobre el carácter frutal en mezclas binarias (Atanasova, ThomasDanguin, Langlois, Nicklaus, & Etievant, 2004). Del mismo modo, la interacción L x M revela que altos niveles de compuestos de la madera (M) potencian el efecto de supresión del aroma de los alcoholes de fusel (L). Al contrario, las interacciones N x A, A x L y 91 Interacciones sensoriales entre seis vectores de aroma capaces de explicar cuatro atributos de aroma en vinos tintos 92 SECCIÓN I A x M revelan que altos niveles de ácidos (A) disminuyen los efectos de supresión de los compuestos de la madera (M), norisoprenoides. (N) y alcoholes de fusel (L). El modelo para el aroma de fruta negra muestra que el vector norisoprenoide (N) ejerce un efecto positivo significativo en la percepción de esta nota, mientras que el vector de los ácidos (A) actúa como supresor. Se observan seis interacciones significativas en este caso, particularmente notables para los norisoprenoides (N) y los ésteres etílicos ramificados (E). Las interacciones N x A y A x E revelan que los vectores de los norisoprenoides (N) y de los ésteres etílicos ramificados (E) son capaces de mitigar el efecto supresor de los ácidos (A), mientras que la interacción N x E sugiere que los ésteres (E) pueden disminuir el efecto positivo de los norisoprenoides (N). Cabe destacar que las interacciones N x L y F x L indican que altos niveles de alcoholes (L) pueden ser positivos en la percepción de las frutas negras, pero solo si hay altos niveles de norisoprenoides (N) o enolonas (F). Finalmente, la interacción F x E sugiere que altos niveles de ambos vectores (enolonas y ésteres) van en detrimento de esta nota. El modelo para el aroma de frutas pasas es relativamente simple, ya que el vector norisoprenoides (N) está vinculado positivamente a esta nota, mientras que el vector ésteres (E) actúa como supresor principal. Esto está de acuerdo con trabajos anteriores (San-Juan, Ferreira, Cacho, & Escudero, 2011). Las interacciones A x E y E x L son dignas de mencionar ya que revelan que la percepción de las frutas pasas es máxima cuando ambos pares de vectores se encuentran en niveles bajos (% FC = 45 para A x E y 46 % para E x L), como se muestra en la Tabla 1.4. Esto indica que tanto los ácidos (A) como los alcoholes (L) mitigan el efecto supresor de los ésteres etílicos (los propios alcoholes inducen la supresión). Finalmente, las interacciones A x M y L x M revelan que los ácidos (A) y los compuestos de la madera (M) contribuyen a esta nota a frutas pasas, pero solo cuando M es alto y L es bajo (Tabla 1.4). 93 Interacciones sensoriales entre seis vectores de aroma capaces de explicar cuatro atributos de aroma en vinos tintos El modelo de aroma tostado muestra que esta nota está vinculada positivamente a los norisoprenoides (N) y a los compuestos de la madera (M). Sin embargo, hay 5 interacciones significativas que afectan notablemente a estos dos vectores. Esto indica que, en particular, el vector de los norisoprenoides parece ser un modulador clave del papel desempeñado por diferentes vectores en esta nota tostada. Las interacciones N x A, N x E y N x M revelan que los ácidos (A), los ésteres etílicos ramificados (E) y los compuestos de la madera (M) pueden potenciar el atributo tostado, pero solo en bajos niveles de norisoprenoides (N), al mismo tiempo que lo suprimen en altos niveles de N (ver Tabla 1.4). La interacción E x M revela un efecto modulador similar de los ésteres (E) en el papel de los compuestos de madera (M) y viceversa. El término “madera” se ajusta al modelo más simple, ya que este término está significativamente relacionado con la presencia de compuestos de la madera (M) y negativamente con el de los alcoholes de fusel (L). La interacción A x E simplemente revela que los ésteres (E) ejercen un papel supresor a bajos niveles de ácidos. Finalmente, el término “oliva” tiene muchos componentes, pero tiene una estructura sorprendentemente simple. Como se puede ver, esta nota de olor está relacionada negativamente con cuatro de los vectores (N, A, F y L) y todos los términos de interacción tienen en común que el modelo que contiene los dos vectores adicionados en niveles mínimos es siempre el que tiene la más alta FC, confirmando que el olor no está vinculado a ningún vector particular, sino más bien a la ausencia de odorantes concentrados en la mezcla. En un intento de resumir y clasificar los roles específicos desempeñados por cada vector de aroma podemos concluir que, el vector norisoprenoide (N) tiende a mostrar la influencia más fuerte, ya que determina directamente las “frutas pasas”, ejerce un efecto positivo significativo también sobre “frutas negras” y “tostado” y un efecto negativo interesante sobre “frutas rojas”. El vector de alcoholes de fusel (L) es el segundo más 94 SECCIÓN I influyente, ya que desempeña un papel directo en “floral” y también un efecto negativo significativo en las notas a “frutas rojas”, “tostado” y en particular en las notas a “madera”. El tercero en esta jerarquía es el vector madera (M), que es responsable directo del descriptor “madera” y también ejerce una influencia significativa sobre “tostado”. El vector enolonas (F) está significativamente relacionado con “frutas rojas” y ligera pero significativamente con “frutas negras”. Por lo que sabemos, es la primera vez que se establece un vínculo directo entre el furaneol y el homofuraneol y la percepción de las notas a fruta roja en el vino. Finalmente, el papel de los ácidos ramificados (A) y los ésteres etílicos ramificados (E) es menos obvio, lo que podría deberse en parte al hecho de que la base aromática del vino ya contenía ácidos grasos y ésteres etílicos en su composición. A pesar de esto, el vector de ácidos ramificados (A) tiene una influencia negativa significativa sobre las “frutas negras” y los ésteres etílicos (E) en “frutas pasas”, y ambos participan en numerosas interacciones con otros vectores que ocultan, por ejemplo, un papel esencial de los ácidos ramificados (A) en la percepción de “frutas rojas” y “frutas pasas”. 3.4. Cambios principales y asociaciones vectoriales clave A pesar del papel limitado que desempeñan los vectores individuales, algunos pequeños cambios en la composición dan como resultado cambios sensoriales dramáticos. Como era de esperar, los más fuertes se observan en mezclas binarias, como NE y FE, para las cuales el reemplazo del vector norisoprenoides (N) por enolonas (F) modifica completamente la calidad del olor de la mezcla, pasando de “frutas pasas” a “frutas rojas” (Figura 1.2). También se registran cambios dramáticos en modelos de cuatro componentes. A veces, este cambio está directamente relacionado con las características del aroma del vector reemplazado, como sucede cuando el vector de madera (M) en los modelos NAEM y AFEM (arriba a la izquierda en la Figura 1.2) se reemplaza por alcoholes de fusel (L), que forman modelos (NAEL y AFEL, abajo a la izquierda) sin carácter a madera. Más 95 Interacciones sensoriales entre seis vectores de aroma capaces de explicar cuatro atributos de aroma en vinos tintos sorprendente es el hecho de que algunas muestras perdieron su carácter a madera, incluso si se mantenía el vector M en la formulación. Esto es lo que sucede cuando los ácidos (A) o los ésteres etílicos (E) en NAEM, AFEM o NAFM se reemplazan con alcoholes fusel (L). En los cuatro casos probados (NELM, AFLM, FELM y NFLM) hay una pérdida manifiesta del aroma a madera, llevando las nuevas muestras al área inferior de la figura (Figura 1.2). Además, los tres modelos NELM, AFLM y FELM son ejemplos interesantes de “perfiles de aroma neutros”, donde parece ocurrir un fenómeno de supresión generalizada, como se revela en la Tabla 1.3. El efecto de supresión potencial del vector alcohol (L) ya ha sido puesto de manifiesto en párrafos anteriores. Para confirmar este efecto de supresión, se ha llevado a cabo un experimento independiente. Se seleccionaron los modelos NAFM (madera y frutal) y NAF (frutal), ambos ricos en notas a madera y frutales, y se enriquecieron con el vector L. Las muestras se evaluaron por duplicado por el panel entrenado 2. Los resultados de esta prueba adicional se presentan en la Figura 1.4 y confirman que la adición de alcoholes de fusel (L) cambia dramáticamente los perfiles de aroma de los modelos, lo que induce a una clara pérdida de su carácter a fruta y a madera. Solo algunos perfiles específicos, como NFLM y NAEL, parecen ser capaces de superar dicha supresión, lo cual debería abordarse en futuras investigaciones. Un aspecto final que debe mencionarse es la existencia de “perfiles estables”, como las combinaciones NAM o AEM; como se muestra en la Figura 1.2, la adición del cuarto vector no tiene un efecto dramático, ya que todos los modelos derivados (NAEM, NAFM, AFEM y AELM) mantienen un carácter de madera y a frutas pasas y se proyectan juntos en la gráfica de CA de la Figura 1.2 (área superior central). Se puede suponer que en las mezclas que contienen tripletes estables, el triplete ya tiene un aroma característico y que la adición del cuarto vector tiene un papel secundario. 96 SECCIÓN I Figura 1.4. Proyecciones de los descriptores de aroma y los vinos modelo para las dos primeras componentes del espacio del PCA obtenido con los descriptores dados por el panel 2 para evaluar el efecto del vector de alcoholes (L) en los vinos modelos con carácter frutal (NAF vs NAFL) y con madera (NAFM vs NAFML). 4. Conclusiones 1. La estrategia de reconstitución con modelos de vino desaromatizados se confirma como una herramienta adecuada para la investigación del aroma del vino. 2. Los seis vectores de aroma considerados son capaces de reproducir satisfactoriamente cuatro notas sensoriales principales del vino tinto (“frutas rojas”, “frutas negras”, “frutas pasas” y “madera”), lo que demuestra la implicación de los 15 componentes del aroma incluidos en los vectores que explican estas notas. 3. Los vectores individuales que actúan de manera unívoca pueden explicar una fracción reducida del espacio sensorial (alrededor del 15 %), lo que demuestra que la mayor parte de las propiedades del aroma son en realidad causadas por interacciones perceptuales entre los vectores. 4. La β-damascenona y β-ionona (vector N) y los alcoholes de fusel (vector L) son las piezas clave. El primero tiene una influencia positiva en las “frutas pasas”, “frutas 97 SECCIÓN II.- Capítulo 1 SECCIÓN II.- Capítulo 1 Efecto de los alcoholes superiores en la percepción del aroma del vino tinto 1. Introducción La fracción volátil del vino, como cualquier producto procedente de la fermentación alcohólica, contiene no solo alcohol, sino también los principales metabolitos de la fermentación alcohólica, tales como alcoholes superiores y sus acetatos, ácidos grasos volátiles y sus ésteres etílicos, ácidos grasos ramificados y sus ésteres etílicos, acetoína, diacetilo o acetaldehído. Esta compleja mezcla de compuestos volátiles, la mayoría de los cuales se encuentran naturalmente presentes en concentraciones muy por encima de su umbral sensorial, exhibe un aroma específico definido con términos como “vinoso” o “fermentado”. En esta mezcla, los atributos del aroma de los componentes individuales suelen ser difícilmente reconocibles, por ello puede asegurarse que esto constituye un objeto de olor, como fue definido por Yeshurun y Sobel (2010). Esta mezcla posee las propiedades de un búfer aromático (Escudero, Gogorza, Melus, Ortin, Cacho, & Ferreira, 2004), ya que la omisión de alguno de los componentes de la mezcla puede ser difícilmente detectable (Ferreira, Ortin, Escudero, Lopez, & Cacho, 2002; Guth, 1997), y la adición de varios compuestos de aroma puede producir un efecto mucho menos intenso de lo que a priori se espera. A pesar de este hecho, las diferentes familias de compuestos de aroma que componen esta mezcla juegan papeles específicos diferentes en la precepción del aroma del vino, así como en su calidad. Por ejemplo, se ha demostrado que los ácidos grasos son esenciales para la percepción del aroma a fruta fresca (San-Juan, Ferreira, Cacho, & Escudero, 2011), se ha encontrado también que los ácidos ramificados suprimen el carácter 105 Efecto de los alcoholes superiores en la percepción del aroma de vino tinto animal de los etilfenoles (Romano, Perello, Lonvaud-Funel, Sicard, & de Revel, 2009), mientras que los acetatos y los ésteres etílicos de los alcoholes fusel son esenciales para proporcionar el aroma frutal al vino (Ferreira, Fernandez, Pena, Escudero, & Cacho, 1995; Lytra, Tempere, Le Floch, de Revel, & Barbe, 2013; Pineau, Barbe, Van Leeuwen, & Dubourdieu, 2009). Sin embargo, no se ha estudiado sistemáticamente el papel jugado por los alcoholes superiores, uno de los principales constituyentes de la fracción volátil del vino. Solo algunos artículos recientes, posteriores a la realización del presente trabajo, abordan parte de esta cuestión (Margaux Cameleyre, Lytra, Tempere, & Barbe, 2015). Los alcoholes superiores son también conocidos como alcoholes de fusel. La palabra fusel hace referencia a la fracción obtenida durante la destilación de productos fermentados y cuyo olor es muy fuerte y desagradable. Fusel, de hecho, es el término alemán que se refiere al licor malo (Hazelwood, Daran, van Maris, Pronk, & Dickinson, 2008). Ésta puede ser la razón por la que no hay estudios específicos dirigidos a su estudio. Muchos investigadores citan un artículo publicado por Rapp y Versini (1991), anteriormente propuesto por Etievant, que subraya que una concentración total inferior a 300 mg/L de alcoholes superiores puede contribuir positivamente al perfil aromático de los vinos, aumentando las notas frutales y florales y la complejidad aromática, mientras que niveles superiores a 400 mg/L tienen un efecto negativo causado por la aparición de notas punzantes y desagradables (Etievant, 1991). Hasta lo que nosotros conocemos, estos supuestos no han sido respaldados por ningún estudio de investigación. Posteriormente, por medio de modelos PLS, Aznar, Lopez, Cacho y Ferreira (2003) sugirieron que el alcohol isoamílico y el isobutanol estaban positivamente relacionados con las notas a vegetal o pimiento en vinos tintos envejecidos, y negativamente relacionado con la intensidad de los atributos tostado y madera. Usando una estrategia similar, San Juan y colaboradores (2011) observaron que los alcoholes superiores parecían estar negativamente 106 SECCIÓN II.- Capítulo 1 relacionados con la calidad de vinos jóvenes o de bajo precio, pero no en vinos premium, incluso si éstos se encontraban en niveles similares en ambos grupos de datos. Un estudio posterior de Sáenz-Navajas y colaboradores (2015) concordaba parcialmente con estos resultados. Ellos observaron que los vinos con altos niveles de isobutanol y alcohol isoamílico fueron puntuados con menor puntuación de calidad evaluada por un panel de expertos. Ninguna de todas estas hipótesis y observaciones ha sido comprobada con posterioridad. Recientemente, un estudio de Cameleyre y colaboradores (2015) ha demostrado que la adición de propanol, isobutanol, butanol, y 2y 3-metilbutanol sobre una disolución alcohólica que contenía 13 esteres frutales generaba un descriptor a disolvente o butírico asociado a la presencia de tales alcoholes. Sugirieron que este aroma competía con las notas a fruta fresca de la mezcla de ésteres, cuyo resultado fue un descenso de la intensidad del carácter a fruta fresca. Por otro lado, algunos autores han sugerido además que el alcohol isoamílico y el β-feniletanol eran compuestos impacto en los vinos Negroamaro (Capone, Tufariello, & Siciliano, 2013), mientras Gomez-Miguez y colaboradores (2007) observaron que el alcohol isoamílico era uno de los compuestos con un impacto sensorial más potente en los vinos de Zalema. Por lo tanto, la literatura científica no tiene una conclusión unánime sobre el papel que juegan los alcoholes superiores en el aroma del vino. Aunque las evidencias parecen estar a favor del papel negativo de éstos, hay muchas cuestiones abiertas sobre la naturaleza sensorial de dicho papel, así como sobre el papel que juega cada uno de los alcoholes encontrados en la fracción volátil del vino y a que niveles de concentración. Este trabajo, por lo tanto, tiene como objetivo la caracterización sensorial de los efectos jugados por los alcoholes superiores más potentes aromáticamente en el vino (isobutanol, alcohol isoamílico, β-feniletanol y metionol), así como entender su relevancia en diferentes 107 Efecto de los alcoholes superiores en la percepción del aroma de vino tinto contextos aromáticos para conocer el papel jugado por los diferentes alcoholes superiores en contextos de vinos tintos. 2. Materiales y métodos 2.1. Compuestos y estándares Disolventes: Se adquirieron etanol de calidad LiChrosolv, éter dietílico y n-pentano en Merck (Darmstadt, Alemania), el isooctano fue adquirido en Panreac (Barcelona, España). El agua pura fue obtenida de un sistema de purificación Milli-Q (Millipore, Bedford, MA). Estándares: Los estándares químicos de la mayor pureza posible fueron suministrados por Sigma-Aldrich (Madrid, España) y Firmenich (Ginebra, Suiza). Reactivos: El ácido tartárico y el hidróxido de sodio fueron suministrados por Panreac (Barcelona, España). 2.2. Preparación de los vinos modelos 2.2.1. Aislamiento y purificación de los alcoholes superiores Paso 1. Extracción reactiva sólido-líquido: Cada estándar comercial fue mezclado con la mínima cantidad necesaria de un polímero que contenía unidos grupos Sulfonyl hidracina (Sigma-Aldrich). Las cantidades fueron: 2 g/10 mL para el alcohol isoamílico, el isobutanol y el β-feniletanol, y 0,5 g/2 mL para el metionol. Esta mezcla fue agitada durante 4 h y posteriormente filtrada a través de un filtro de jeringa de nylon de 0,45 µm. El percolado fue analizado por Cromatografía de gases acoplada a un detector de masas de captura de iones para confirmar la ausencia de aldehídos. Paso 2. Cromatografía líquida semi-preparativa: El aislamiento del metionol final fue llevado a cabo mediante una cromatografía líquida semi-preparativa (HPLC) con Silica gel 108 SECCIÓN II.- Capítulo 1 60, adquirido a Merck (Damstadt, Alemania), de un tamaño de partícula de 40-63 µm y empaquetado en una columna Omnifit (25 mm d.i. x 450 mm), operando a una temperatura de 20 ºC con una velocidad de flujo de 8 mL/min y una fase móvil formada por n-pentano (A), dietil éter (B) e isooctano (C). El perfil de gradientes de la fase móvil se puede encontrar en la Tabla 2.1. El volumen de inyección de metionol fue de 2 mL. Se recogió la fracción pura de metionol (eluída a las 3 h y 42 min hasta las 4 h 26 min) y se eliminó el disolvente. Tabla 2.1. Perfil de gradientes de la fase móvil en la metodología HPLC aplicada en la purificación del metionol Tiempo (min) Gradiente (%) A B C 0-29 100 0 0 29-57 99 1 0 57-85 98 2 0 85-114 95 5 0 114-142 90 10 0 145-173 80 20 0 178-206 50 50 0 211-239 0 100 0 239-249 0 0 100 Paso 3. Método de cromatografía de gases acoplado a olfatometría. Confirmación de la pureza sensorial de los estándares: Se inyectó 1 µL de estándar diluido al 1% en diclorometano en modo splitless (tiempo de splitless de 60 segundos) en un cromatógrafo de gases Trace GC (ThermoQuest, Milán, Italia) con un detector de ionización a la llama (FID) y un puerto olfatométrico ODO-I de SGE (Ringwood, Australia). Se empleó una columna capilar polar DB-WAX (polietilenglicol) suministrada por J&W (Folsom, CA, Estados Unidos), de dimensiones 30 m x 0,32 mm d.i. x 0,5 mm de espesor de fase, a la que estaba unida una precolumna desactivada de dimensiones 3 m x 0,32 mm d.i. suministrada por Supelco (Bellefonte, PA). El gas portador empleado fue el hidrógeno, con 109 Efecto de los alcoholes superiores en la percepción del aroma de vino tinto un flujo constante de 3,5 mL/min. Las temperaturas del inyector y del detector se mantuvieron constantes a 250 ºC. La rampa de temperatura del horno empleada en el análisis fue como sigue: 40 ºC durante 5 min, aumentando a 4 ºC/min hasta 100 ºC y luego un incremento de 6 ºC/min hasta 220 ºC, manteniéndolo a esa temperatura durante 10 min. Se empleó un panel de jueces entrenados (2 hombres y cuatro mujeres, de edades comprendidas entre los 26 y los 29 años, y con una media de 26 años) que llevaron a cabo la olfacción de los extractos. A los participantes se les pidió que proporcionaran un descriptor que caracterizara al olor que eluía y que anotaran la intensidad de éste usando una escala de intensidad de siete puntos (0 = no hay olor; 1 = olor débil o baja intensidad; 2 = percepción clara del olor u olor fuerte; 3 = olor extremadamente intenso; se permitió el uso de los valores intermedios con un intervalo de 0,5 puntos). 2.2.2. Preparación de los vinos modelo (WM) Se prepararon vinos modelo mediante la mezcla de un conjunto de compuestos comúnmente presentes en el vino (volátiles y no volátiles). Esta mezcla, con aroma frutal, se mezcló posteriormente con unos de los siguientes vectores de aroma: frutal (F), madera (M), animal (A) o humedad/corcho (H). Estos últimos vectores se añadieron a dos posibles niveles de concentración (alto o bajo) tal y como se puede ver en la Tabla 2.2. En total, se prepararon ocho vinos modelo: F (vector frutal a alta concentración), f (sin adición de un vector adicional), M (vector madera a alta concentración), m (vector madera a baja concentración), A (vector animal a alta concentración), a (vector animal a baja concentración), H (vector humedad/corcho a alta concentración), h (vector humedad/corcho a baja concentración). Para estudiar el efecto de los alcoholes en cada uno de los ocho vinos modelos, se generaron tres vectores de alcoholes (alcohol isoamílico/isobutanol: I; β-feniletanol: B; y metionol: T) que fueron añadidos a altos (I, B, 110 SECCIÓN II.- Capítulo 1 Tabla 2.2. Composición de los vinos modelo (mg/L) y la codificación para cada vector Compuesto Concentración Mezcla de compuestos que conforman el aroma base común Ácido acético 150 Acetato de etilo 50 Ácido hexanoico 2,0 Ácido 3-metilbutírico 0,30 2,3-butanodiona 0,40 Hexanoato de etilo 1,0 Acetato de isoamilo 1,0 2-metilbutanoato de etilo 0,12 Vanillato de etilo 0,25 vanillina 0,070 γ-nonalactona 0,020 guaiacol 0,010 β-damascenona 0,0040 β-ionona 0,00030 No volatil Ácido tartárico 5000 Glicerol 10000 Ácido tánico 50 Quinina 7,0 Goma arábiga 75 VECTOR Compuesto Baja concentración Alta concentración FRUTAL (f) (F) 2,3-butanodiona - 14 Acetato de isoamilo - 5,5 Acetato de etilo - 50 Cinamato de etilo - 0,12 β-damascenona - 0,0030 MADERA (m) (M) Whiskylactona 0,15 0,30 Vanillina 0,050 0,10 Eugenol 0,0075 0,015 Guaiacol 0,0075 0,015 4-Hidroxi-2,5-dimetil-3(2H)- furanona 0,050 0,10 HUMEDAD/ CORCHO (h) (H) 2,4,6-tricloroanisol 4,0 11 ANIMAL (a) (A) 4-etilfenol 35 100 4-etilguaiacol 4,5 13 ALCOHOL ISOAMÍLICO/ ISOBUTANOL (i) (I) Alcohol isoamílico 110 360 Isobutanol 20 70 β-FENILETANOL (b) (B) β-feniletanol 15 80 METIONOL (t) (T) Metionol - 1,5 111 Efecto de los alcoholes superiores en la percepción del aroma de vino tinto T) o a bajos (i, b, t) niveles de concentración. El alcohol isoamílico y el isobutanol formaron parte del mismo vector (I) ya que ellos comparten un descriptor similar (notas alcohólicas), además, ellos siempre aparecen juntos en vinos reales y se han encontrado repetidamente en una ratio 5:1 en vinos comerciales inoculados con levaduras Saccharomyces (Amerine & Joslyn, 1970; Lee & Cooley, 1981; Yoshizaw.K, 1966). En términos de codificación de las muestras, la primera letra establece el nivel de concentración del vector añadido al vino modelo siendo las letras minúsculas (f, m, a, h) cuando se adiciona a baja concentración, o las mayúsculas (F, M, A, H) cuando es añadido a alta concentración. Las siguientes tres letras indican el nivel de concentración de cada uno de los vectores de alcoholes siguiendo el mismo patrón de codificación (minúsculas para el nivel bajo y mayúsculas para el alto). Por ejemplo, M_Ibt significa que este es el vino modelo formado por el vector madera a alta concentración (M), el vector alcohol isoamílico/isobutanol a alta concentración (I) y una baja concentración de los vectores βfeniletanol (b) y metionol (t). El contenido final de etanol de los WM se ajustó al 12 % (v/v) y se estableció un pH = 3,5. La concentración de los compuestos presentes en el vino modelo (Tabla 2.2) varían dentro del rango natural presente en vinos tintos comerciales, siendo éstas las concentraciones medias encontradas en muestras comerciales (San Juan, Cacho, Ferreira, & Escudero, 2012). 2.3. Análisis sensorial 2.3.1. Determinación del umbral sensorial de las muestras de β-feniletanol Muestras: Se prepararon doce series de tres muestras conteniendo dos muestras sin dopar (control, formada por vino sintético al 12 % de etanol, 5 g/L de ácido tartárico y con un pH = 3,5) y una muestra dopada con el estándar de β-feniletanol antes y después de su 112 SECCIÓN II.- Capítulo 1 purificación. Las concentraciones de este alcohol se encontraban en el rango desde los 0,9 a los 51,2 mg/L, preparando diluciones 1:1,5 entre estos dos extremos. Participantes: Esta tarea fue llevada a cabo por un total de doce participantes (4 hombres y 8 mujeres, con edades comprendidas entre los 23 y los 38 años, media de 28 años de edad), pertenecientes al personal del laboratorio y con una larga experiencia en la descripción del aroma del vino. Procedimiento: El umbral de detección sensorial de los estándares de β-feniletanol antes y después de la purificación se calculó siguiendo una tarea de elección forzada o threealternative forced choice (3-AFC) (ASTM E-679) como la descrita por Lawless y Heymann (2010). Según esta tarea, a los panelistas se les presentaron un total de 12 series de tres muestras conteniendo dos muestras control y una muestra dopada, presentadas en orden ascendente de concentración. Para cada serie se les pidió a los panelistas que olieran las tres muestras de manera ortonasal y de izquierda a derecha e indicaran cuál de ellas era diferente de las otras tres (ver consignas en Figura 2.1 del Anexo 2). Para todos los tests se estableció un volumen de muestra de 15 mL (20 ± 1 ºC) y se les presentó en copa negra según la normativa ISO, codificadas con un código de tres cifras y cubiertas con una placa Petri según un orden aleatorio y diferente para cada juez. El orden de presentación de las muestras dentro de cada serie también fue aleatorio. 2.3.2. Test triangulares Se llevaron a cabo dos series de test triangulares (Tests A y B) con dos objetivos diferentes. En los tests A se evaluó el efecto conjunto de los tres vectores de alcoholes en cada uno de los ocho vinos modelo (F_ibt vs F_IBT; M_ibt vs M_IBT; A_ibt vs A_IBT; H_ibt vs H_IBT). En los tests B se llevó a cabo el estudio del efecto individual de cada vector de alcoholes. 113 Efecto de los alcoholes superiores en la percepción del aroma de vino tinto habilidad de discriminación, reproducibilidad y consistencia del panel, fue confirmado para los cinco atributos evaluados. Tabla 2.4. Modelo ANOVA fijado para la evaluación de los atributos (15 jueces) para los cinco atributos (gl, grados de libertad; F, valor F; P, valor de significatividad P) Juez (J) (gl=14) Muestra (S) (gl= 7) Réplica (R) (gl= 1) S*J (gl= 98) S*R (gl = 7) J*R (gl = 14) F P F P F P F P F P F P Fresa/Láctico/Fruta roja 4,7 <0,001 39 <0,001 0,00 0,95 1,4 0,037 0,85 0,55 0,76 0,71 Coco/Madera/Vainilla 4,4 <0,001 32 <0,001 0,06 0,81 1,1 0,29 0,66 0,70 0,69 0,78 Cuero/Animal/Tinta 1,8 0,090 29 <0,001 4,0 0,058 1,9 0,001 0,73 0,65 2,0 0,024 Humedad/TCA 2,4 0,031 20 <0,001 5,6 0,030 1,7 0,007 0,60 0,76 1,1 0,36 Alcohol/Disolvente 0,65 0,81 2,1 0,050 8,5 0,005 3,4 <0,001 0,61 0,74 1,3 0,22 *Efectos significativos marcados en negrita Caracterización del producto: las puntuaciones obtenidas para cada atributo fueron sometidas a un análisis de la varianza de dos factores (jueces como factor aleatorio y vino como factor fijo). Se realizó posteriormente un análisis de componentes principales (PCA) con las puntuaciones de intensidad medias sobre los panelistas para los cinco atributos significativos. Todos los análisis estadísticos fueron realizados usando XLSTAT (Addinsoft, versión 2015) y Panelcheck (versión 1.4.2, Matforsk). 3. Resultados y discusión 3.1. Aislamiento y purificación de los alcoholes Uno de los requisitos más importantes para preparar modelos de aroma es poseer estándares de aroma puros de los compuestos a estudiar, libres de cualquier impureza olfativa que pueda desviar las conclusiones. Una impureza puede tener un gran efecto si están presentes a concentraciones muy bajas (Pybus, Sell, & Chemistry, 1999) e incluso el 120 SECCIÓN II.- Capítulo 1 revisar la pureza del estándar no te garantiza la pureza olfativa de éste. Esta puede ser evaluada mediante GC-O y por medio de análisis cuantitativo de las impurezas esperadas. A través de ambas estrategias fue posible verificar que, en el caso de los alcoholes superiores, incluso en patrones comerciales de la máxima pureza disponible recientemente abiertos, pudieron encontrarse niveles significativos de aroma de los correspondientes aldehídos. Los aldehídos son los productos de oxidación de los alcoholes y se encontraron presentes a niveles muy por debajo del 0,05 % en todos los casos (128 ng/L de isobutiraldehido, en 1 mg/L de isobutanol - 0,0128 % -, 20 ng/L de isovaleraldehido en 1 mg/L de alcohol isoamílico - 0,0020 % -, 12 ng/L de metional en 1 mg/L de metionol - 0,0012 % - y 69 ng/L de benzaldehído y 324 ng/L de fenilacetaldehido en 1 mg/L de βfeniletanol - 0,0324 % -). Sin embargo, alguno de estos aldehídos tiene umbrales de olor entre 3 y 4 órdenes de magnitud por debajo de sus correspondientes alcoholes (Van Gemert, 2003), y de hecho pueden estar presentes a niveles en los que su potencia olfativa es comparable o incluso mayor que la del correspondiente alcohol puro. Esto es particularmente evidente en el caso del β-feniletanol y el fenilacetaldehído. En este caso, el panel encontró un umbral de detección de 4 mg/L en un vino sintético para el supuesto patrón comercial de β-feniletanol. Sin embargo, según el análisis de aldehídos del compuesto en cuestión, se observó que este patrón comercial contenía 1,2 µg/L de fenilacetaldehído, cuyo umbral sensorial encontrado en la bibliografía corresponde a 1 µg/L (Gomez-Miguez, Cacho, Ferreira, Vicario, & Heredia, 2007), sugiriendo que el olor del vino sintético no era el del alcohol, sino también el del aldehído presente como impureza minoritaria. Confirmado esto, el umbral sensorial para el estándar de β-feniletanol después de la rigurosa eliminación del fenilacetaldehído fue de 11 mg/L, el cual fue significativamente mayor que los 4 mg/L obtenidos con el supuesto estándar comercial puro. Este resultado confirma que la presencia de impurezas en las disoluciones de 121 Efecto de los alcoholes superiores en la percepción del aroma de vino tinto estándares de alcoholes superiores, particularmente la presencia de sus correspondientes aldehídos, es capaz de incrementar falsamente su impacto sensorial. De ahí que todos los alcoholes superiores usados en el presente estudio fueron purificados por una extracción en fase sólida reactiva y una cromatografía rápida con sílica gel. 3.2. Análisis sensorial 3.2.1. Test triangulares (Test A) Para obtener una primera valoración sobre la relevante importancia de los alcoholes superiores en el aroma del vino, se prepararon ocho vinos modelos diferentes que contenían un aroma base formado por 14 compuestos de aroma (Tabla 2.2), al que se le adicionaron uno de los cuatro vectores de aroma (madera - M -, frutal - F -, humedad/corcho - H -, o animal - A -) a dos niveles de concentración diferente y que contenía también un bajo nivel del vector de alcoholes (ibt), el cual se dopó posteriormente con una mezcla que contenía los cuatro alcoholes estudiados. La adición de esta última mezcla llevó el nivel de alcoholes superiores desde bajos hasta altos niveles de alcoholes en las muestras, tal y como se había encontrado en vinos tintos comerciales (San Juan, Cacho, Ferreira, & Escudero, 2012). Todos los modelos recreaban satisfactoriamente el aroma de diferentes tipos de vinos tintos. Los modelos que contenían los vectores aromáticos a bajos niveles (m, f, h, a) se caracterizaban por sus aromas débiles definidos como vinosos y ligeramente frutales. Además, el modelo que contenía el vector madera a bajos niveles (m) se definió también como dulce, y el vino modelo que contenía el vector animal a bajos niveles (a) se caracterizó también por sus matices sucios y a animal. Sin embargo, los vinos modelo que contenían los vectores aromáticos a altos niveles (M, F, H, A) tenían unos aromas más definidos a madera, vainilla o coco para el vino M, fresa o fruta roja para el F, humedad o mohoso para el vino H y animal o cuero para el A. 122 SECCIÓN II.- Capítulo 1 Los resultados del test triangular se pueden ver en la parte superior de la Tabla 2.3 y muestran que el efecto de los alcoholes superiores es extremadamente dependiente de la intensidad de aroma del vino modelo, así como de sus características aromáticas. Como se puede observar en la tabla, las cuatro adiciones llevadas a cabo en modelos que contienen los altos niveles (M, F, H, A) de los cuatro vectores de aroma testados (test A.1, A.3, A.5 y A.7) se detectaron significativamente, mientras que la adición a los modelos que contenían los vectores de aroma a bajos niveles (m, f, h, a) se detectaron de manera significativa solo en el caso del vector A (test A.8), el cual se expresó como el atributo de aroma más claro e intenso (descrito como sucio/animal) de entre los cuatro vectores de aroma. Este resultado es interesante ya que es normal considerar que la presencia de un aroma en un fondo constituido por un aroma diferente es más fácilmente identificada cuanto más baja sea la intensidad del aroma base, como demostraron Kurtz y colaboradores (2009). Según esto, la presencia de altos niveles de alcoholes superiores debería haber sido detectada más fácilmente en los vinos modelo que contenían los vectores aromáticos a bajas intensidades. Sin embargo, tal incapacidad de producir cualquier cambio al adicionar los alcoholes a los vinos modelos con baja intensidad es consistente con la idea anteriormente expuesta del búfer aromático (Escudero, Gogorza, Melus, Ortin, Cacho, & Ferreira, 2004) y confirma que el aroma del vino base, esencialmente representado por los modelos con bajos niveles de los vectores estudiados, tiene propiedades perceptuales que pueden estar relacionadas con el concepto del búfer aromático. Como primera aproximación, esas propiedades podrían consistir en una completa anulación del olor de un segundo componente, de algún modo relacionado con los componentes de olor del propio búfer, añadido a la mezcla. Los vinos modelos que contienen altas cantidades de un vector aromático, ya no mostrarían tales propiedades del búfer, ya que estos tendrían unos matices 123 Efecto de los alcoholes superiores en la percepción del aroma de vino tinto de aroma por sí mismos. El efecto del búfer podría ser compatible con la señal de saturación pero su naturaleza tendrá que ser abordada específicamente en otras investigaciones. 3.2.2. Test triangulares (Test B) Atendiendo a sus similitudes químicas, bioquímicas y de olor, el alcohol isoamílico y el isobutanol se agruparon en el mismo vector de aroma. Por ello, se estudiaron los efectos de la adición de uno (I, B o T) o dos (solo BT) vectores de alcoholes superiores en modelos que contenían el aroma base además de altos niveles de uno de los vectores de aroma (M, F, H o A) y diferentes combinaciones de los alcoholes superiores (ibt, Ibt, iBt, ibT o IbT) en 28 test triangulares, cuyos resultados están resumidos en la Tabla 2.3 (test B.1 a B.28). Los resultados muestran que solo el vector formado por el alcohol isoamílico y el isobutanol (I) inducía un efecto sensorial significativo (P < 0,001) en los cuatro vinos modelo estudiados. Sorprendentemente, la adición de metionol o β-feniletanol no genera ningún cambio sensorial en el perfil de aroma de las muestras estudiadas. Esto ocurre incluso si estos compuestos son adicionados en casi todas las combinaciones posibles, a pesar de su distintivo y especifico aroma y a pesar de que los niveles de adición fueran por encima de su umbral sensorial (1 mg/L y 11 mg/L, respectivamente). Es de destacar que el βfeniletanol se había descrito como un contribuyente importante en el carácter frutal de los vinos (Clemente-Jimenez, Mingorance-Cazorla, Martinez-Rodriguez, Heras-Vazquez, & Rodriguez-Vico, 2004; Katarina, Katarina, Katarina, Ivan, & Fedor, 2014) atribuyéndolo a su distintivo olor similar a las rosas. Sin embargo, los presentes resultados confirman que su impacto sensorial real en niveles de concentración normalmente presentes en vino es insignificante. Esto refuerza la importancia de llevar a cabo estrategias de reconstitución (omisión o adición) con estándares purificados para confirmar el impacto sensorial real de compuestos potencialmente activos desde el punto de vista sensorial. 124 SECCIÓN II.- Capítulo 1 3.2.3. Análisis descriptivo (DA) Se utilizó análisis sensorial descriptivo para estudiar el efecto sensorial específico del vector isobutanol/alcohol isoamílico (I) en las propiedades aromáticas de los vinos modelo. Se caracterizaron ocho vinos modelo diferentes que contenían altos niveles de un vector de aroma (M, F, H o A) y bajos o altos niveles del vector I usando 5 descriptores sensoriales diferentes. Los resultados están resumidos en la Figura 2.2, la cual muestra el grafico PCA bidimensional con las proyecciones de los 5 descriptores y las 8 muestras. Los dos primeros PCs explican al menos el 90 % de la varianza original. El primer PC explica el 57 % de la varianza original y muestra una clara oposición entre los atributos agradables (fresa/láctico/fruta roja y coco/madera/vainilla) y desagradables (cuero/animal/tinta y humedad/TCA). Tal oposición ya había sido observada de manera repetida en la descripción del vino (Saenz-Navajas, Ballester, Pecher, Peyron, & Valentin, 2013; Saenz-Navajas, Gonzalez-Hernandez, Campo, Fernandez-Zurbano, & Ferreira, 2012) y puede ser el resultado de la integración hedónica de las percepciones durante el proceso de olfacción del vino. Según esto, los panelistas pueden tender a clasificar simultáneamente los descriptores en aromas agradables y desagradables (basándose en sus experiencias previas) y a describir las muestras. Prescott (2015) sugirió que la percepción del sabor/flavor parece ser principalmente el resultado de la integración de distintas señales sensoriales a través de la acción del aprendizaje asociativo. 125 Efecto de los alcoholes superiores en la percepción del aroma de vino tinto Figura 2.2. Biplot con las proyecciones de los descriptores de aroma y los vinos modelo en las dos primeras componentes del espacio del PCA. Ocho vinos modelo conteniendo altos niveles del vector de aroma (M: madera, F: frutal, H: humedad/corcho o A: animal) y al que se le adicionó bajo nivel (ibt) o alto nivel (Ibt) del par alcohol isoamílico/isobutanol. Como se observa en la Figura 2.2, el aumento del vector I provoca en todos los casos un desplazamiento de las muestras hacia la parte superior del biplot (altos valores del PC2). Este desplazamiento es menos importante en el vector M. En este caso, y también para el caso del vector F, el aumento de I también implica un desplazamiento de las muestras hacia la izquierda del plano (bajos valores del PC1). El gráfico mostrado en la Figura 2.3 puede ayudar a comprender estos efectos. F_Ibt F_ibt W_Ibt W_ibt A_Ibt A_ibt H_Ibt H_ibt Fresa/láctico/fruta roja Coco/madera/ vainilla Cuero/animal/tinta Humedad/TCA alcoholico/disolvente -2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 00,5 11,5 22,5 F2 (31,39 %) F1 (57,73 %) Biplot (ejes F1 y F2: 89,12 %) 126 SECCIÓN II.- Capítulo 1 Figura 2.3. Comparación de las intensidades medias (para los descriptores principales) de los vinos modelos con alta (Ibt) vs baja (ibt) concentración del vector I en los cuatro vinos modelo: a) frutal, b) madera, c) animal y d) humedad. Las barras de error son los errores estándar medios. Las diferencias han sido calculadas según un ANOVA de dos factores (vino modelo como factor fijo y panelistas como aleatorio); * y ** indican el nivel de significatividad estadística con P < 0,05 y 0,01, respectivamente. El aumento de I trae consigo un descenso significativo (P < 0,05) de los atributos fresa/láctico/fruta roja, coco/madera/vainilla y humedad/TCA al aumentar la concentración del vector alcohol isoamílico/isobutanol desde 130 mg/L a 430 mg/L (Figura 2.3. a, b y d). Contrariamente, en el vino modelo con el vector animal (A) hay un incremento no significativo (P > 0,05) de la intensidad de la nota cuero/animal/tinta (Figura 2.3.c) al adicionar el vector alcohol isoamílico/isobutanol. El descenso observado en fresa/láctico/fruta roja está de acuerdo con los resultados encontrados en estudios de mezclas de aroma menos complejos, en los cuales se observó un descenso en la intensidad 127 Efecto de los alcoholes superiores en la percepción del aroma de vino tinto de las notas frescas y a mermelada (atribuida a la mezcla de ésteres y acetatos) en presencia de 131 (88 y 43 mg/L de isobutanol y alcohol isoamílico, respectivamente) y 226 mg/L (148 y 78 mg/L de isobutanol y alcohol isoamílico, respectivamente) del vector I (Margaux Cameleyre, Lytra, Tempere, & Barbe, 2015). El descenso en coco/madera/vainilla y humedad/TCA no se había observado con anterioridad, y parece indicar que los alcoholes superiores son capaces de suprimir parcialmente la intensidad de muchos matices de olor diferentes de acuerdo con la tendencia general de la supresión señalada por Kurtz y colaboradores (2009). Es de destacar que el vector I parece afectar de una manera similar a las percepciones causadas por compuestos de aroma normales, tales como los integrados en la fruta o el vector de la madera y el vector humedad, integrado por un compuesto recientemente descrito por ser un potente supresor de la transducción de la señal olfativa (Takeuchi, Kato, & Kurahashi, 2013). Debido a esto, la falta de efecto observada para la nota cuero/animal/tinta resulta más sorprendente, particularmente teniendo en cuenta que se observa un aumento de ésta, incluso si no alcanza el nivel significancia estadística del 0,05. Las razones por las cuales esta nota se comporta de manera diferente no están claras y comprenderlas podría seguramente requerir un trabajo sensorial específico. Se puede hipotetizar, sin embargo, que las características del olor a alcohol y a disolvente proporcionadas por los alcoholes superiores complementan las características de cuero/animal/tinta generadas por los etilfenoles, haciendo más explícito el concepto aromático completo. Esto implica que la mezcla experimenta un procesado configuracional fuerte (Zou & Buck, 2006) que puede ser explicado en términos de categorización de olores. Por ello, e incluso aunque los etilfenoles (vector A) y el par isobutanol/alcohol isoamílico son estímulos diferentes, ellos comparten una característica, que puede permitir a los panelistas el categorizar ambas notas de aroma juntas (Prescott, 2015). Esta categorización podría tener como resultado una integración de las respuestas de ambos aromas y por ello 128 SECCIÓN II.- Capítulo 1 conllevar un aumento de la intensidad evaluada para la nota animal de los etilfenoles y la nota alcohólica de los alcoholes a través de interacciones perceptuales (Laing, Eddy, & Best, 1994) o mecanismos sinérgicos (Gottfried, 2010). El segundo factor del PCA (31 % de la varianza explicada) está principalmente explicado por el atributo alcohol/disolvente (Figura 2.2). Se observó un claro desplazamiento hacia arriba (altas puntuaciones del PC2) para todas las muestras, que puede ser atribuida a un incremento de las notas a alcohol/disolvente en presencia de 430 mg/L del vector de alcoholes. La Figura 2.3 confirma que el aumento en este vector de aroma fue significativo (P < 0,05) para el vino modelo frutal (Figura 2.3a) y animal (Figura 2.3c), pero no para el vino modelo con madera ni el vino modelo con humedad. Este resultado confirma en parte la premisa de que los alcoholes superiores le proporcionan al vino un aroma punzante (Rapp & Versini, 1991) o un matiz de aroma a disolvente (Margaux Cameleyre, Lytra, Tempere, & Barbe, 2015), pero sugiere que tal contribución se vuelve significativa solo en algunos contextos aromáticos. Se ha identificado con anterioridad que los aromas a fruta y a madera están relacionados con la preferencia y con la calidad percibida por consumidores y expertos en vino de diferentes países (Hopfer & Heymann, 2014; Saenz-Navajas, Ballester, Pecher, Peyron, & Valentin, 2013). Por otro lado, el carácter cuero/animal/tinta generado por los etilfenoles presenta una correlación negativa con la preferencia y la calidad percibida por los expertos en vino (Frøst & Noble, 2002; Saenz-Navajas, et al., 2015; Torri, Noble, & Heymann, 2013). Como consecuencia, los resultados observados en este capítulo de tesis destacan que el alcohol isoamílico y el isobutanol son esencialmente perjudiciales para la calidad del vino. 129 Interacciones sensoriales del tipo aroma-amargor y aroma-astringencia en vinos tintos. Efecto del nivel de experiencia del consumidor posibles de los vectores se recogen en la Tabla 6.1. Estas concentraciones aseguran que los panelistas son capaces de reconocerlas fácilmente. Los vectores de aroma concentrados se prepararon en etanol y se añadieron al vino hasta alcanzar la concentración deseada (Tabla 6.1). El sulfato de quinina, el ácido tartárico y la fracción de proantocianidinas se disolvieron directamente sobre el vino base. Se ajustó la concentración final de etanol en los vinos al 13 %. Muestras del entrenamiento: Se prepararon diferentes vinos modelo para el entrenamiento: 1) 27 muestras de vino tinto comercial dopadas con uno de los vectores a los tres niveles de concentración (Tabla 6.1); y 2) muestras con diferentes combinaciones de los vectores aroma-gustoMuestras de evaluación: Se prepararon un total de 38 vinos para la tarea de evaluación. La concentración de los vectores empleada para dopar los vinos está marcada en negrita en la Tabla 6.1. Se prepararon 16 muestras para evaluar el efecto del aroma y la acidez sobre la percepción del amargor (experimento 1). Para ello, se mezclaron 12 botellas de 750 mL de vino tinto comercial y el volumen total resultante (9 L) se dividió en dos partes de 4,5 L. Una parte se dopó con 10 mg/L de quinina (etiquetada como Bi – alto nivel de amargor) y la otra parte no se dopó (etiquetada como B – bajo nivel de amargor). Cada vino (Bi y B) se dividió en nueve muestras de 500 mL. Siete de estas muestras se doparon con uno de los vectores de aroma (animal – An, especiado – Sp, vegetal – Ve, tostado – Ro, herbal – He, fruta pasa –Df) o gusto (acidez – So). Las muestras octava y novena se consideraron como las muestras de control (Bi – alto amargor y Bbajo amargor por duplicado) y no se doparon con ningún otro vector. Se prepararon un total de dieciséis vinos diferentes: ocho vinos con alto amargor (Bi, AnBi, SpBi, VeBi, RoBi, HeBi, DfBi y SoBi) y ocho vinos con bajo amargor (B, An, Sp, Ve, Ro, He, Df, So). 232 SECCIÓN IV Se prepararon dieciocho muestras diferentes para evaluar el efecto del aroma, la acidez o el amargor (Bi) sobre la percepción de la astringencia (experimento 2). El mismo procedimiento descrito para el amargor se siguió para obtener las muestras con alto (As, AnAs, SpAs, VeAs, RoAs, HeAs, DfAs, SoAs, BiAs) y bajo (B, An, Sp, Ve, Ro, He, Df, So, Bi) nivel de astringencia. 2.2.3. Propiedades sensoriales de los vectores de aroma y los estímulos en boca individuales Se llevó a cabo un análisis sensorial descriptivo específico e independiente para confirmar que los vectores de aroma, así como el gusto (amargor y acidez) y el estímulo astringente, generaban diferencias específicas aroma/gusto y no inducían otras. Participantes: Un total de 17 participantes (60 % mujeres, de edades comprendidas entre los 22 y los 54 años, con una media de 39 años de edad) llevaron a cabo la tarea de descripción sensorial. Todos ellos formaban parte de un panel sensorial del Instituto de Ciencias de la Vid y del Vino (ICVV), Logroño (La Rioja, España). Los panelistas participaron en al menos 17 sesiones de entrenamiento durante un periodo de tres meses, en las cuales se les presentaron un amplio rango de estándares de gusto, astringencia y aroma. Durante una sesión de entrenamiento típica, los panelistas se familiarizaron con el vocabulario específico de una lista de 110 descriptores de aroma (Saenz-Navajas, MartinLopez, Ferreira, & Fernandez-Zurbano, 2011) y con cuatro atributos evaluados en boca: dulzor, acidez, amargor y astringencia. En cada sesión, las referencias se presentaron como describe Saenz-Navajas y colaboradores (2011) para ilustrar los atributos de aroma y en boca. Los panelistas se cualificaron cuando fueron capaces de identificar correctamente al menos el 85 % de las referencias. 233 Interacciones sensoriales del tipo aroma-amargor y aroma-astringencia en vinos tintos. Efecto del nivel de experiencia del consumidor Muestras: Se describieron diez muestras exclusivamente para aroma y cuatro para propiedades en boca. Los vinos descritos para aroma fueron: 1) B (vino base), 2) Bi (vino base dopado con quinina), 3) As (vino base dopado con la fracción de proantocianidinas), 4) So (vino base dopado con el vector acido), 5) Ro (vino base dopado con el vector tostado), 6) An (vino dopado con el vector animal, 7) Ve (vino dopado con el vector vegetal), 8) He (vino dopado con el vector herbal), 9) Sp (vino dopado con el vector especiado) y 10) Df (vino base dopado con el vector fruta pasa). Los vinos descritos para las propiedades en boca fueron: 1) B, 2) Bi, 3) As, y 4) So. Procedimiento: Los panelistas entrenados describieron los vinos siguiendo el procedimiento descrito en Saenz-Navajas y colaboradores (2011). Se presentaron 20 mL de las muestras de vino en copa negra ISO etiquetada con un número de tres cifras aleatorio y cubierto con una placa Petri según una disposición aleatoria y un orden de presentación monádico secuencial. Cada participante completó una sesión que comprendía dos partes (de 30 y 10 min cada una, respectivamente) para el análisis de 10 y 4 muestras en la parte 1 y 2, respectivamente. En la primera parte, se les pidió a los panelistas que olieran ortonasalmente cada vino, describieran su olor eligiendo un máximo de cinco atributos de la lista de 113 (ver consignas en Figura 6.1 del Anexo 6) según la metodología check-allthat-apply (CATA). Posteriormente, en la segunda parte de la sesión, se les pidió que probaran las 4 muestras y evaluaran la acidez, amargor y astringencia en una escala estructurada de 10 cm (ver consignas en Figura 6.2 del Anexo 6). Los panelistas entrenados evaluaron las muestras siguiendo el protocolo de enjuague definido por Colonna y colaboradores (2004). Todos los vinos se sirvieron a temperatura ambiente y se evaluaron en cabinas individuales según un orden de presentación monádico secuencial. Los panelistas no fueron informados sobre la naturaleza de las muestras empleadas para la evaluación. 234 SECCIÓN IV 2.3. Estudio de las interacciones sensoriales mediante análisis descriptivo 2.3.1. Participantes En el estudio participaron tres paneles diferentes con diferentes niveles de experiencia en el mundo del vino: i) Novicios: consumidores regulares de vino tinto (consumo de vino tinto de al menos una vez cada dos semanas), nunca han participado en estudios sensoriales y no tienen experiencia en la industria del vino. ii) Panelistas entrenados: personal del Instituto de Ciencias de la Vid y del Vino (ICVV) y estudiantes de la Universidad de La Rioja. Se reclutaron en base a su interés y su disponibilidad durante 6 semanas (dos sesiones de 60 min cada semana) y se entrenaron específicamente para este estudio para evaluar la intensidad del aroma y el gusto del vino. iii) Expertos: grupo de profesionales del vino o enólogos, con formación técnica en elaboración de vinos y participación de manera regular a degustaciones de vino (Parr, Heatherbell, & White, 2002). Los experimentos 1 y 2 se llevaron a cabo por un total de cuarenta y nueve participantes (18 novicios, 15 panelistas entrenados y 16 expertos). En el experimento 1, en base a los resultados de sensibilidad a la percepción del amargor (ver sección 2.3.2), se tuvieron en cuenta las respuestas de treinta y nueve participantes (51 % mujeres, de edades comprendidas entre los 22 y 62 años, con una edad media de 37 años): 16 novicios, 9 entrenados y 14 expertos. En el experimento 2, se consideraron las respuestas de cuarenta y nueve participantes (59 % mujeres, de edades comprendidas entre los 22 y 62 años, con una edad media de 37 años). El proceso de screening y la selección de los tres paneles 235 Interacciones sensoriales del tipo aroma-amargor y aroma-astringencia en vinos tintos. Efecto del nivel de experiencia del consumidor aseguraba una distribución de edades y géneros similar entre novicios, panel entrenado y expertos. Los panelistas se reclutaron en base a su interés y su disponibilidad, y no fueron remunerados por su actividad. 2.3.2. Procedimiento El análisis sensorial descriptivo consistía en tres etapas: 1) entrenamiento (solo para el panel entrenado) o sesión de familiarización (solo para novicios y expertos); 2) sesión de evaluación (para los tres paneles) y 3) evaluación de la sensibilidad al amargor (para los tres paneles). Paso 1: Entrenamiento o familiarización Sesión de entrenamiento: quince participantes acudieron a seis sesiones de entrenamiento descriptivo de 60 min durante un periodo de tres semanas (ver consignas en Figura 6.3 del Anexo 6). Los panelistas trabajaron en subgrupos de 7-9 personas y se entrenaron en la evaluación de las propiedades en boca (acidez, amargor, astringencia) y vectores de aroma (animal, especiado, vegetal, herbal, tostado y fruta pasa) en vino. Se presentaron diferentes niveles de los vinos de referencia dopados con aroma o gusto (ver rangos de concentración en Tabla 6.1) para ayudar a los panelistas con la identificación y la evaluación de la intensidad de los atributos. Solo llevaron a cabo las sesiones de evaluación finales aquellos panelistas que fueran capaces de identificar y ordenar por intensidad correctamente los atributos. Sesión de familiarización: Los expertos y novicios participaron en una sesión de familiarización (15 min) antes de las sesiones de evaluación, en la cual se les presentaron 236 SECCIÓN IV referencias de aroma (animal, especiado, vegetal, herbal, tostado, y fruta pasa), gusto (acidez y amargor) y astringencia. Paso 2: Sesión de evaluación Experimento 1: Los participantes acudieron a dos sesiones formales para la caracterización de las 18 muestras de vino. En la sesión 1, evaluaron B, Bi, An, AnBi, He, HeBi, Df, DfBi, So y SoBi, y en la sesión 2, evaluaron B, Bi, Sp, SpBi, Ve, VeBi, Ro, RoBi. Se les pidió que puntuaran la intensidad de ocho atributos: amargor, acidez, animal, herbal, fruta pasa, especiado, vegetal y tostado en una escala no estructurada de 10 cm (0 = “ausencia”; 5 = “media”; y 10 = “muy intenso”) (ver consignas en Figura 6.4 y 6.5 del Anexo 6). Experimento 2: Los participantes acudieron a dos sesiones formales para la caracterización de 20 muestras de vino. En la primera sesión evaluaron los vinos siguientes: B, As, An, AnAs, So, SoAs, Am, AmAs, Df, DfAs, y en la segunda sesión evaluaron B, As, Sp, SpAs, Ve, VeAs, Ro, RoAs, He, HeAs. Se les pidió que evaluaran la intensidad de nueve atributos: amargor, acidez, astringencia, animal, herbal, fruta pasa, especiado, vegetal y tostado en una escala no estructurada de 10 cm (0 = “ausencia”; 5 = “media”; y 10 = “muy intensa”) (ver consignas en Figura 6.4 y 6.6 del Anexo 6). Las muestras se prepararon tres horas antes de la sesión sensorial, y se almacenaron a 10 ºC y se sirvieron 15 min antes de la sesión de evaluación. En ambos experimentos, se presentaron diez mililitros de muestra (20 ± 1 ºC) en copa negra ISO etiquetada con un código de tres cifras, cubierta con una placa Petri según un orden aleatorio y diferente para cada juez. A los panelistas se les pidió que expectoraran las muestras y se enjaguaran con manzana fresca (experimento 1), disolución de pectina de manzana y agua mineral (experimento 1 y 2). Las muestras se presentaron monádicamente y se impuso un descanso de 15 min en cada sesión con el objetivo de evitar el efecto arrastre. Por ello, evaluaron un 237 Interacciones sensoriales del tipo aroma-amargor y aroma-astringencia en vinos tintos. Efecto del nivel de experiencia del consumidor máximo de 5 muestras en cada parte de la sesión. Todos los vinos se presentaron a temperatura ambiente y fueron evaluados en cabinas individuales. A los panelistas no se les informó de la naturaleza de las muestras. Todas las respuestas se recogieron en formato papel. Paso 3: Evaluación de la sensibilidad al amargor Esta tarea se llevó a cabo una vez que el experimento 2 había terminado para evitar que los participantes se centraran en el amargor durante la sesión de evaluación. Se presentaron 9 series de tres muestras que contenían dos muestras sin dopar (control, agua mineral) y una muestra dopada con concentraciones crecientes de quinina (1,56 – 400 mg/L en series de dilución 1:2). En cada serie, los panelistas debían probar las tres muestras, de izquierda a derecha e indicar la muestra que era diferente a las otras dos (ver consignas en Figura 6.7 del Anexo 6). Para todos los test, se presentaron 10 mL de muestra (20 ± 1 ºC) en vaso de plástico etiquetados con códigos de tres cifras aleatorios. El orden de presentación de las muestras dentro de cada serie se aleatorizó. Solo se analizaron los datos dados por los participantes que identificaron correctamente todas las muestras dopadas desde la serie 2 (3,3 mg/L de quinina) hasta la serie 9 (400 mg/L). Esto aseguró que los participantes eran capaces de detectar el amargor en los vinos. 2.4. Análisis de datos 2.4.1. Propiedades sensoriales de los vectores de aroma y de los estímulos en boca Se consideraron solo los términos de aroma citados por al menos el 40 % del panel en los diez vinos (B, Bi, As, So, Ro, An, Ve, He, Sp, y Df). La tabla de contingencia, en la 238 SECCIÓN IV cual los vinos eran las filas y las columnas los términos, se sometió a un Análisis de Correspondencias (CA). Se calcularon tres ANOVAs de dos factores (juez como factor aleatorio y vino como factor fijo), con las intensidades de acidez, amargor y astringencia puntuadas en los cuatro vinos (B, Bi, As, So). 2.4.2. Estudio de las interacciones sensoriales por análisis descriptivo Se evaluaron los efectos del aroma y la acidez sobre la intensidad de amargor y los efectos del aroma, la acidez y el amargor sobre la intensidad de astringencia mediante ANOVA de tres factores (participantes como factor aleatorio y vino (V) y nivel de experiencia (NE) como factores fijos) considerando los efectos principales (V y NE) y sus interacciones (V x NE). En cada ANOVA, la muestra dopada se comparó con la muestra de control (B para bajo amargor y astringencia, Bi para alto amargor o As para alta astringencia) presentada en la misma sesión. Por ejemplo, para evaluar el efecto del aroma vegetal (Ve) sobre la percepción del amargor en los vinos con bajo nivel de amargor (B), se calculó un ANOVA de tres factores con las puntuaciones de amargor para las muestras Ve (vino sin adición de quinina o bajo nivel de amargor y dopada con el vector vegetal) y su correspondiente muestra de control (B: vino sin adición de quinina y sin dopar con ningún vector). 3. Resultados 3.1. Propiedades sensoriales de los vectores de aroma y los estímulos en boca La Figura 6.1 muestra que la adición de ácido tartárico, sulfato de quinina o la fracción de proantocianidinas no generó ningún cambio aromático en los vinos, ya que se encuentran proyectados próximos al vino base en el mapa CA. Además, las muestras de 239 Interacciones sensoriales del tipo aroma-amargor y aroma-astringencia en vinos tintos. Efecto del nivel de experiencia del consumidor vino dopadas con vectores de aroma presentan propiedades de aroma distintivas. Los vinos dopados con: el vector tostado (Ro) se describen con términos como pan tostado, caramelo o café; el vector animal (An) con descriptores de animal y cuero; el vector vegetal (Ve) con pimiento verde; el vector herbal (He) con hoja de tomatera o herbal; el vector especiado (Sp) con especias; y el vector fruta pasa (Df) con fruta pasa, ciruela, caramelo y tofe. Figura 6.1. Proyección de los descriptores de aroma y los vinos modelo en los dos primeros factores del espacio del Análisis de Correspondencias basado en la percepción de aroma ortonasal de un panel entrenado. 240 SECCIÓN IV En cuanto a los atributos en boca, la Figura 6.2 muestra que las muestras dopadas con ácido tartárico, sulfato de quinina o la fracción de proantocianidinas (So, Bi y As, respectivamente) generan propiedades en boca únicas correspondientes a acidez, amargor y astringencia, respectivamente. Figura 6.2. Comparación de las puntuaciones de las intensidades medias (para un panel externo) de los vinos: B (vino base), Bi (vino base dopado con sulfato de quinina), As (vino base dopado con la fracción de proantocianidinas) y So (vino base dopado con el vector acidez). Cada figura explica la intensidad media de (a) amargor, (b) acidez y (c) astringencia. Las diferentes letras indican diferencias significativas (P<0,05) entre los vinos B, Bi, So y As; ns: diferencias no significativas. Las barras de error son los errores estándar de la media. 3.2. Estudio de las interacciones por análisis descriptivo Los ANOVAs muestran que no hay efecto significativo para ningún vector de aroma (animal, herbal, fruta pasa, especiado, vegetal y tostado) o gusto (amargor o acidez) 241 Interacciones sensoriales del tipo aroma-amargor y aroma-astringencia en vinos tintos. Efecto del nivel de experiencia del consumidor trabajo realizado por Saenz-Navajas y colaboradores (2012) se observó solo el efecto de la astringencia en vino tinto cuando se añadía la fracción de aroma frutal, extraída de un vino blanco Chardonnay, sobre las matrices no volátiles de un vino tinto. Por lo tanto, los resultados obtenidos en el presente trabajo confirman que las interacciones del aroma o del gusto con la astringencia no son importantes cuantitativamente en la determinación de los niveles de astringencia en vinos tintos normales. 5. Conclusiones El presente trabajo incrementa el conocimiento sobre las interacciones sensoriales en matrices complejas y es valioso para los investigadores en el campo sensorial, así como para la industria alimentaria. Se podrían llevar a cabo investigaciones posteriores con vinos con diferentes niveles de complejidad en términos de composición volátil y no volátil. Una limitación aparente, pero importante del presente estudio puede ser el empleo de sulfato de quinina para inducir diferentes niveles de amargor, la cual no está naturalmente presente en el vino. Sin embargo, la falta de conocimiento sobre los compuestos que generan exclusivamente el amargor en vinos tintos hace esencial el uso de este compuesto para comprender las interacciones del amargor en el vino. 6. Referencias Arvisenet, G., Guichard, E., & Ballester, J. (2016). Taste-aroma interaction in model wines: Effect of training and expertise. Food Quality and Preference, 52, 211-221. Ballester, J., Patris, B., Symoneaux, R., & Valentin, D. (2008). Conceptual vs. perceptual wine spaces: Does expertise matter? Food Quality and Preference, 19(3), 267-276. Caporale, G., Policastro, S., & Monteleone, E. (2004). Bitterness enhancement induced by cut grass odorant (cis-3-hexen-l-ol) in a model olive oil. Food Quality and Preference, 15(3), 219-227. Castriota-Scanderbeg, A., Hagberg, G. 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De hecho, gracias a los trabajos de reconstitución realizados en esta tesis se ha observado que tan solo el 28 % de la varianza del espacio sensorial aromático puede ser explicada por vectores individuales y que el 72 % restante pude ser atribuido a interacciones perceptuales entre los mismos. El vector formado por el alcohol isoamílico y el isobutanol es una de las piezas fundamentales del denominado búfer aromático y es capaz de suprimir las notas a madera, frutal y a humedad a niveles de concentración a los cuales no se perciben sus propias notas aromáticas, lo que es un ejemplo de interacción destructiva. Sin embargo, el alcohol isoamílico y el isobutanol potencian las notas de animal/cuero causadas por los etilfenoles, lo que puede atribuirse tanto a la congruencia hedónica negativa como a la congruencia en las notas aromáticas de ambos vectores (alcohol/disolvente y cuero/animal/tinta), lo que es un ejemplo de interacciones de potenciación. Por otro lado, se ha demostrado que puede tener lugar la integración de los odorantes que comparten descriptores comunes, como es el caso de los ésteres etílicos, que actúan de una manera concertada. Esta conclusión se basa en el hecho de que en algunos contextos aromáticos, se ha podido simplificar la mezcla original de 14 componentes por el compuesto más intenso (o incluso el más similar a él) sin pérdida de información cualitativa. Esta integración permite simplificar el número de odorantes que constituyen los modelos reconstituidos o el número de variables a tener en cuenta a la hora de generar modelos que predigan las propiedades aromáticas de mezclas complejas. Esta interacción 253 Conclusiones finales/Final conclusions es un ejemplo de interacción cooperativa. Desde el punto de vista cuantitativo, se ha podido observar un fuerte efecto sinérgico de los odorantes en concentraciones subumbrales, mientras los odorantes presentes en concentraciones supra-umbrales interactúan principalmente vía hipoadición. Incluso en el caso de la hipoadición, la cantidad de aroma – en términos de OAV – necesaria para mantener la intensidad de los vectores simplificados al mismo nivel que el vector original, aumenta de manera muy importante (factor > 4 para el proceso de simplificación completo, cercano a 3 para la eliminación de odorantes a niveles supra-umbrales). Esto demuestra que los OAVs son medidas bastante limitadas en la predicción no solo de la importancia de un odorante en una mezcla sino también como criterio para combinar odorantes en vectores. En este sentido, los resultados sugieren que, para fines de modelización de las propiedades sensoriales a partir de la composición química, las concentraciones de los odorantes individuales se deben traducir primero en intensidades aromáticas y que, entonces, esas intensidades aromáticas se deben combinar utilizando diferentes aproximaciones, como por ejemplo el modelo vectorial propuesto por primera vez por Berglund. En la presente tesis doctoral, se han estudiado en mayor detalle las interacciones entre el vector madera y el vector frutal. Mientras que los resultados confirman la ya observada tendencia del vector madera a dominar el aroma de la mezcla, también revelan la existencia de interacciones perceptuales que han dado lugar a la creación de un nuevo concepto aromático (que podría denominarse interacción creativa), como es el caso de la nota a grosella negra. La formación de esta nota aromática ha surgido por interacción entre el vector madera rico en vainillas y el frutal. Por último, el estudio de la existencia de interacciones sensoriales del aroma con el gusto (amargor) o la astringencia ha revelado que estos efectos o no parecen ser esenciales en la modulación de los atributos sensoriales considerados. De hecho, no se observó ningún 254 Conclusiones finales/Final conclusions efecto del aroma sobre la astringencia, confirmando resultados previos, y solo se pudo demostrar una interacción del tipo aroma-gusto (amargor-animal para consumidores novicios o naïve), la cual era dependiente del nivel de experiencia de los consumidores y por tanto de su aproximación holística cuando evaluaban un vino. Como conclusión final, este trabajo sugiere que los estudios que buscan interpretar las propiedades de aroma de una mezcla compleja de odorantes deben abordar el siguiente esquema de trabajo. Primero, identificar los odorantes presentes en la mezcla; segundo, integrar en los vectores de aroma individuales aquellos grupos de odorantes que interactúan de manera cooperativa, sin olvidar los odorantes a niveles cercanos al umbral; tercero, estudiar las diferentes interacciones perceptuales que existen entre los vectores en la mezcla y llevar a cabo los estudios en matrices similares y tan complejos como el producto objeto de estudio. 255 Conclusiones finales/Final conclusions FINAL CONCLUSIONS One of the main conclusions of this doctoral thesis is that most wine aromatic notes are due to the existence of perceptual interactions between different aroma vectors. In fact, reconstitution works revealed that only 28 % of the variance of the aromatic-sensory space can be explained by individual vectors and that the remaining 72 % should be attributed to perceptual interactions. The vector formed by isoamyl and isobutyl alcohols is one of the fundamental pieces of the so-called aromatic buffer and is capable of suppressing the notes of wood, fruit and humidity at levels of concentration at which their own aromatic notes are not perceived, which is an example of a perceptual destructive interaction. However, the animal / leather notes caused by ethyl phenols are enhanced by the isoamyl alcohol vector, which can be attributed to the congruence in both, negative hedonic tones and in the aromatic notes (alcohol/solvent and leather/animal/ink), which is an example of a perceptual enhancement interaction. On the other hand, it has been demonstrated that odorants sharing common descriptors, such as ethyl esters, act in a concerted and integrated way, since in some aromatic contexts, the original 14 components in the mixture can be replaced by the single most intense (or even by one similar to it) without any loss of qualitative information. This integration allows simplifying the number of odorants taking part in reconstituted models or the number of variables taking part in mathematical models build to predict the aroma properties of complex mixtures. This interaction is an example of a perceptual cooperative interaction. From the quantitative point of view, some odorants present at sub-threshold levels exert a strong synergistic effect, while odorants present a supra-threshold 256 Conclusiones finales/Final conclusions concentrations interact mainly via hypo-addition. Even in the hypo-addition case, the amount of aroma - in terms of OAV - necessary to keep the intensity of the simplified vectors at the same level than that of the original vector, is much increased (a factor > 4 for the whole simplification process, close to 3 for the elimination of suprathreshold odorants). This demonstrates that OAVs are quite limited measures to predict not only the actual importance of an odorant in a mixture but also as criteria for combining odorants into vectors. Rather, results suggest that for modeling purposes, concentrations of individual odorants should be first translated into aromatic intensities and that then, those aromatic intensities should be added by using different approximations, such as the vector model first proposed by Berglund. Interactions between the different components of woody aroma vectors and the fruity vector have been studied in detail. While results confirm the already observed tendency of the woody vector to dominate the aroma of the mixture, also reveal the existence of perceptual interactions leading to the creation of a new aroma concept (which can be defined as perceptual creative interaction), in the case of blackcurrant notes arising from the interaction between the vanilla-rich woody vector and the fruit vector. Finally, a study directed to assess the existence of cross-modal interactions (odor x taste or odor x astringency) has revealed that these effects do not seem to be essential for the sensory attributes considered. In fact, no effect of aroma on astringency was observed, confirming previous results, and only one taste-aroma interaction (bitterness-animal aroma for naïve consumers) could be demonstrated. Such interaction was dependent on the level of expertise of consumers and thus on their holistic approach when evaluating wine. As a final conclusion, this work suggests that studies seeking to interpret the aroma properties of a complex mixture of odorants, should approach the following working 257 Efecto de los alcoholes superiores en la percepción del aroma de vino tinto Figura 2.2. Instrucciones empleadas en el test triangular. 264 ANEXO 2 Figura 2.3. Instrucciones empleadas en la elección de atributos del procedimiento de Perfil Descriptivo Optimizado u Optimized Descriptive Profile. 265 Efecto de los alcoholes superiores en la percepción del aroma de vino tinto Figura 2.4. Instrucciones para la evaluación de los atributos sobre la escala siguiendo el procedimiento de Perfil Descriptivo Optimizado u Optimized Descriptive Profile. 266 ANEXO 3 ANEXO 3 Figura 3.1. Instrucciones de la sesión 1, presentación de aromas individuales. Sobre la mesa se les presentan 4 copas de vino etiquetadas con los cuatro descriptores a los que hace referencia. Le pedimos que huela cada copa, exclusivamente por vía ortonasal, y que memorice los descriptores de cada una de ellas: • FRESA/LÁCTICO/FRUTA ROJA • MADERA/COCO/VAINILLA • CUERO/ANIMAL/TINTA • LICOROSO/ALCOHÓLICO 267 Niveles de alcoholes superiores capaces de inducir cambios aromáticos y modular la preferencia de un panel de expertos en vinos modelo Figura 3.2. Instrucciones para la ordenación. A continuación se le presentan 3 copas etiquetadas un número de tres cifras. Le pedimos que huela cada copa, exclusivamente por vía ortonasal, y que ordene las muestras por orden de intensidad. • Le recomendamos que comience de izquierda a derecha • Deje un espacio de tiempo de al menos 20 segundos entre cada olfacción Muchas gracias por su participación. Menos intensa Más intensa 268 ANEXO 3 Figura 3.3. Ejemplo de instrucciones para los tests de comparación según la técnica de elección forzada 2AFC. JUEZ__________________ Fecha: En la mesa se presentan 9 test, formado cada uno por dos copas. Cada copa de vino, está codificada con un número de tres cifras. • Le pedimos que en primer lugar HUELA LAS REFERENCIAS para los descriptores madera/coco/vainilla y licoroso/alcohólico • Le pedimos que HUELA cada PAR DE MUESTRAS DE VINO (exclusivamente por vía ortonasal y de izquierda a derecha). • Para cada test, anote el número del vino que posea MAYOR INTENSIDAD EN LAS NOTAS MADERA/COCO/VAINILLA Y LICOROSO/ALCOHÓLICO • Pase al siguiente test. Código test Más intensa en MADERA/COCO/VAINILLA Más intensa en LICOROSO/ALCOHÓLICO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 269 Niveles de alcoholes superiores capaces de inducir cambios aromáticos y modular la preferencia de un panel de expertos en vinos modelo Figura 3.4. Instrucciones para la evaluación de la preferencia JUEZ__________________ Fecha: En la mesa se presentan 9 test, formado cada uno por dos copas. Cada copa de vino, está codificada con un número de tres cifras. • Le pedimos que HUELA cada PAR DE MUESTRAS DE VINO (exclusivamente por vía ortonasal) de izquierda a derecha. • Para cada test, anote el código del vino que posee el aroma que más le gusta • Pase al siguiente test. Código test Muestra que más le gusta 1 2 3 4 5 6 7 8 9 270 ANEXO 4 ANEXO 4 Figura 4.1. Instrucciones para la elección de la escala de 1-butanol cuando se compara cada una de las 13 diluciones de 1-butanol con el vector de referencia de intensidad V1. En la mesa se presentan 13 series con 2 copas/serie. Le pedimos que huela cada serie de izquierda a derecha y evalúe si la muestra codificada es similar o diferente en función de la intensidad a la referencia. Serie 1: ______ Serie 2: ______ Serie 3: ______ Serie 4: ______ Serie 5: _______ Serie 6: _______ Serie 7: _______ Serie 8: _______ Serie 9: _______ Totalmente similar Totalmente diferente Totalmente similar Totalmente diferente Totalmente similar Totalmente diferente Totalmente similar Totalmente diferente Totalmente similar Totalmente diferente Totalmente similar Totalmente diferente Totalmente similar Totalmente diferente Totalmente similar Totalmente diferente Totalmente similar Totalmente diferente 271 Variabilidad sensorial inducida por los ésteres etílicos en vino tinto Figura 4.2. Instrucciones empleadas en la fase de entrenamiento de los 20 panelistas en los 5 niveles de intensidad de la escala de 1-butanol. A continuación se le presentan 6 copas etiquetadas con nivel 0, nivel 1, nivel 2, nivel 3, nivel 4 y nivel 5. Cada copa corresponde a un punto de anclaje de la siguiente escala de intensidad: De manera que la copa numerada con el nivel 0 corresponderá con el número 0 de la escala, y así sucesivamente. Le pedimos que huela cada copa, exclusivamente por vía ortonasal, y que memorice la intensidad que corresponde con cada punto de la escala. • Le recomendamos que comience de izquierda a derecha • Deje un espacio de tiempo de al menos 20 segundos entre cada olfacción • Una vez haya realizado la tarea, puede volver a olerlas tantas veces como necesite para memorizar las referencias así como las diferencias entre ellas Muchas gracias por su participación. 5 4 3 2 1 0 272 ANEXO 4 Figura 4.3. Instrucciones empleadas en la fase de entrenamiento de los 20 panelistas en los 5 niveles de intensidad de la escala de 1-butanol., en la que debían ser capaces de ordenar por intensidad las 6 disoluciones de 1-butanol. A continuación se le presentan 6 copas etiquetadas un número de tres cifras. Le pedimos que huela cada copa, exclusivamente por vía ortonasal, y que ordene las muestras por orden de intensidad. • Le recomendamos que comience de izquierda a derecha • Deje un espacio de tiempo de al menos 20 segundos entre cada olfacción Muchas gracias por su participación. Menos intensa Más intensa 273 Interacciones entre el vector de ésteres etílicos y el vector madera. Efectos en la percepción Figura 5.4. Instrucciones empleadas en la fase de entrenamiento para la identificación de los descriptores de la madera sobre vino y la ordenación sobre escala para los atributos propuestos. Partie A : Sur la table vous pouvez trouver 5 verres de vin codés avec un code à trois chiffres. Vous devez les sentir et écrire, dans le carré correspondant, le CODE d´échantillon qui correspond à chaque descripteur aromatique. Partie B : Sur le tableau, il y a 5 séries de 4 codés à lettre. Pour chaque série, vous devez classer les échantillons par intensité croissante du descripteur de la série. Pour cela, notez les codes dans les cases cidessous. Après finir avec chaque série, lavez les verres à vin avec l´eau pour servir la prochaine série. Moins (-) Plus (+) Cassis Noix de coco Vanille Pomme Fraise Descripteur CODE Noix de coco Vanille Clou de girofle Boisé Caramel 280 ANEXO 5 Figura 5.5. Instrucciones empleadas en la fase de entrenamiento para la evaluación sobre escala para todos los atributos propuestos. Sur la table vous allez trouver 3 verres de vin. Chacun est codé avec une lettre. Vous devez noter le CODE et indiquer sur l´échelle (avec un X) le niveau d´intensité du descripteur indiqué dans chaque échantillon. 0 1 2 3 4 5 6 7 CODE : _______ 0 1 2 3 4 5 6 7 CODE : _______ 0 1 2 3 4 5 6 7 CODE : _______ 0 1 2 3 4 5 6 7 CODE : _______ 0 1 2 3 4 5 6 7 CODE : _______ 0 1 2 3 4 5 6 7 CODE : _______ 0 1 2 3 4 5 6 7 CODE : _______ 0 1 2 3 4 5 6 7 CODE : _______ 0 1 2 3 4 5 6 7 CODE : _______ 0 1 2 3 4 5 6 7 CODE : _______ 0 1 2 3 4 5 6 7 CODE : _______ 0 1 2 3 4 5 6 7 CODE : _______ DESCRIPTEUR: FRAISE DESCRIPTEUR: CASSIS DESCRIPTEUR: POMME DESCRIPTEUR: FRUIT CUIT/RAISINS SECS 281 Interacciones entre el vector de ésteres etílicos y el vector madera. Efectos en la percepción Figura 5.6. Instrucciones empleadas en la sesión de selección, familiarización y evaluación para todos los atributos propuestos. Sur la table vous allez trouver 9 verres de vin. Chacun est codé avec un chiffre. Vous devez noter le CODE et indiquer sur l´échelle (avec un X) le niveau d´intensité de TOUS LES DESCRIPTEURS indiqués dans chaque échantillon. 0 1 2 3 4 5 6 7 FRUITÉ 0 1 2 3 4 5 6 7 FRAISE 0 1 2 3 4 5 6 7 CASSIS 0 1 2 3 4 5 6 7 POMME 0 1 2 3 4 5 6 7 FRUIT CUIT 0 1 2 3 4 5 6 7 BOISÉ 0 1 2 3 4 5 6 7 CLOU DE GIROFLE 0 1 2 3 4 5 6 7 VANILLE 0 1 2 3 4 5 6 7 CARAMEL 0 1 2 3 4 5 6 7 NOIX DE COCO CODE: ________ 282 ANEXO 5 Tabla 5.1. Referencias de olor presentadas durante el entrenamiento del panel para el análisis descriptivo. Estándar comercial Cantidad o concentración Cantidad o concentración Disolvente - 10 mL agua 500 mL vino Nivel - - Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Descriptor FRUTAL Mezcla de siropes de frutas + 4,2 µL fresa + 4,36 µL manzana + 3,02 µL casis + 8,4 µL macerado pasa - 2,25 mL frutal 5,625 mL frutal FRESA Sirope de fresa (La Pateliere) + 60 µL - 2 mL 5 mL CASIS Sirope de casis (Teisseire) + 60 µL - 1,875 mL 3,75 mL MANZANA Sirope de manzana verde (Vedrenne) + 40 µL - 3,75 mL 9,375 mL FRUTA PASA Macerado de uvas pasas (Carrefour) 10 mL macerado - 29,87 mL macerado 59,75 mL macerado MADERA Chips + 1 mL Macerado de Chips de madera - dilucion ½ del nivel 3 2 g chips en 500 mL COCO Sirope de Coco (Vedrenne) + 40 µL 1,5 mL 3,75 mL 6 mL VAINILLA Aroma de vainilla (La Pateliere) + 120 µL - 2,25 mL 5,625 mL n CARAMELO Furaneol 4,21 mg/L furaneol - 2,5 mg/L furaneol 5 mg/L furaneol CLAVO Eugenol 1,5 mg/L Eugenol - 1,5 mg/L Eugenol 3 mg/L Eugenol 283 ANEXO 6 ANEXO 6 Figura 6.1. Lista de 113 atributos empleada para la descripción sensorial mediante la metodología check-allthat-apply (CATA) para la tarea de confirmación de los descriptores que generaban los vectores de aroma empleados en el estudio. Lista de descriptores aromáticos FRUTAL FLORAL ESPECIAS TORREFACTO / MADERA LÁCTEO FRUTAS BLANCAS FRUTAS PASAS/COMPOTADAS Acacia Anis/Regaliz TORREFACTO Levadura Azahar Canela Leche Manzana Ciruela pasa Geranio Clavo Caramelo/Tofe Mantequilla Membrillo Dátil Jazmin Curry Café torrefacto Yogur/cuajada Pera Higo seco Lila Enebro Pan tostado Orejón/melocotón seco Manzanilla Laurel FRUTAS AMARILLAS Uva pasa Miel/polen Mentol/eucalipto MADERA OTROS Melocotón en almíbar Rosa Nuez moscada albaricoque / melocotòn / Nectarina Guindas en alcohol/Kirsch Tilo Pimienta Madera nueva Alcohol Melón Fruta escarchada/mermelada Violeta Tomillo Madera tostada Vainilla Humo de madera Pegamento CíTRICOS FRUTAS TROPICALES Vinagre Limón VEGETAL ANIMAL SOTOBOSQUE Naranja Coco Alquitrán / Asfalto Pomelo Lichi VERDURAS COCIDAS Cuero Champiñon Mango Fumé/ "Avecream" Humus/Tierra Caucho Maracuyá/fruta de la pasión Agua de espárragos Pelo mojado Moho Piña Agua de olivas Transpiración/Sudor Humedad/Trapo mojado Cartón / Polvo FRUTAS ROJOS Plátano Alcachofa Agua estancada/alcantarilla Alubia verde Trufa Chocolate Cereza FRUTAS NEGRAS Patata cocida Fresa Frambuesa Arándano VEGETALES FRESCOS REDUCCIÓN Grosella Casis/Grosella negra Mora Pimiento verde Huevo podrido Coliflor HERBAL Azufre Silex/Pedernal Hierba/Césped Cerilla quemada Hoja de tomatera Bujo/boj Pino/resina término 1er nivel-genérico término 2º nivel LAAE 2017 ©término 3 er nivel 285 Interacciones sensoriales del tipo aroma-amargor y aroma-astringencia en vinos tintos. Efecto del nivel de experiencia del consumidor Figura 6.2. Instrucciones empleadas en la fase de evaluación de los atributos en boca en una escala estructurada de 10 cm evaluada por el panel entrenado independiente para confirmar que los atributos en boca generaban los atributos correspondientes. 2ª Sesión CÓDIGO JUEZ: Marca la intensidad de las muestras en las escalas para los 3 atributos: Muestra: AMARGOR ACIDEZ ASTRINGENCIA Ausencia Muy intenso Medio 012345678910 Ausencia Muy intenso Medio 012345678910 Ausencia Muy intenso Medio 012345678910 286 ANEXO 6 Figura 6.3. Instrucciones empleadas en las 6 sesiones de entrenamiento (de 60 min cada una) del panel sensorial, entrenado específicamente para la evaluación delas muestras de este estudio. 2ª Sesión CÓDIGO JUEZ: A: Anota el número de la muestra que corresponde a cada gusto ACIDEZ AMARGOR B: Anota el número de muestra que corresponde a cada atributo aromático ANIMAL (Cuero, establo) ESPECIADO (pimienta, nuez moscada, clavo) HERBAL (Hoja tomate, Hierba cortada, aceite) VEGETAL (pimiento verde, terroso) TOSTADO (café, pan tostado, tofe, caramelo) FRUTA PASA (uva pasa, ciruela pasa, orejón) C: Anota el número de muestra que corresponde a cada gusto ACIDEZ AMARGOR D: Anota el número de muestra que corresponde a cada atributo aromático ANIMAL (Cuero, establo) ESPECIADO (pimienta, nuez moscada, clavo) HERBAL (Hoja tomate, Hierba cortada, aceite) VEGETAL (pimiento verde, terroso) TOSTADO (café, pan tostado, tofe, caramelo) FRUTA PASA (uva pasa, ciruela pasa, orejón) E: Anota el número de muestra que corresponde a cada gusto ACIDEZ AMARGOR 287 Interacciones sensoriales del tipo aroma-amargor y aroma-astringencia en vinos tintos. Efecto del nivel de experiencia del consumidor 3ª Sesión CÓDIGO JUEZ: A: En primer lugar ordena por intensidad de aroma las 6 series de AROMA A continuación anota el descriptor en base al que has ordenado las muestras: • Animal (Cuero, establo) • Vegetal (pimiento verde, terroso) • Herbal (Hoja tomate, Hierba cortada, aceite) • Fruta pasa (uva pasa, ciruela pasa, orejón) • Tostado (café, pan tostado, tofe, caramelo) • Especiado (pimienta, nuez moscada, clavo) MUY ALTA ALTA MEDIA BAJA DESCRIPTOR SERIE 1 SERIE 2 SERIE 3 SERIE 4 SERIE 5 SERIE 6 B: En primer lugar ordena por intensidad de aroma las 2 series de GUSTO A continuación anota el descriptor en base al que has ordenado las muestras: • Acidez • Amargor MUY ALTA ALTA MEDIA BAJA DESCRIPTOR SERIE 1 SERIE 2 288 ANEXO 6 4ª Sesión CÓDIGO JUEZ: A: En primer lugar identifica en cada una de las 6 series de vinos el atributo que comparten, a continuación, marca en la escala el nivel de intensidad de dicho atributo en cada muestra A continuación anota el descriptor en base al que has ordenado las muestras: • Animal (Cuero, establo) • Vegetal (pimiento verde, terroso) • Herbal (Hoja tomate, Hierba cortada, aceite) • Fruta pasa (uva pasa, ciruela pasa, orejón) • Tostado (café, pan tostado, tofe, caramelo) • Especiado (pimienta, nuez moscada, clavo) SERIE 1 SERIE 2 SERIE 3 SERIE 4 SERIE 5 SERIE 6 Ausencia Muy intenso ATRIBUTO: Medio 012345678910 Ausencia Muy intenso ATRIBUTO: Medio 012345678910 Ausencia Muy intenso ATRIBUTO: Medio 012345678910 Ausencia Muy intenso ATRIBUTO: Medio 012345678910 Ausencia Muy intenso ATRIBUTO: Medio 012345678910 Ausencia Muy intenso ATRIBUTO: Medio 012345678910 289