Estudio sobre las características de la formación de turbidez proteica en vinos y nuevas alternativas para su estabilización

TRABAJO FIN DE ESTUDIOS Título Estudio sobre las características de la formación de turbidez proteica en vinos y nuevas alternativas para su estabilización. Autor/es ELBA BONILLA EGUIZABAL Director/es MARTA Mª INÉS DIZY SOTO Facultad Facultad de Ciencia y Tecnología Titulación Grado en Enología Departamento AGRICULTURA Y ALIMENTACIÓN Curso académico 2020-21 © El autor, 2021 © Universidad de La Rioja, 2021 publicaciones.unirioja.es E-mail: [email protected] Estudio sobre las características de la formación de turbidez proteica en vinos y nuevas alternativas para su estabilización., de ELBA BONILLA EGUIZABAL (publicada por la Universidad de La Rioja) se difunde bajo una Licencia Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported. Permisos que vayan más allá de lo cubierto por esta licencia pueden solicitarse a los titulares del copyright. Facultad de Ciencia y Tecnología TRABAJO FIN DE GRADO Grado en Enología Estudio sobre las características de la formación de turbidez proteica en vinos y nuevas alternativas para su estabilización. Realizado por: Elba Bonilla Eguizábal Tutelado por: Marta Mª Inés Dizy Soto Logroño, julio, 2021 Página | 1 RESUMEN Los vinos contienen cantidades variables de sustancias nitrogenadas, siendo las proteínas las más relevantes a pesar de estar presentes en una baja concentración. La importancia de las proteínas en el vino radica en su capacidad para producir turbidez, generalmente una vez ha sido el vino embotellado, produciendo una depreciación del producto por parte del consumidor . Durante muchos años la generación de turbidez proteica solo se relacionaba con la cantidad de proteínas y a pesar de que es dependiente de estas, existen una serie de factores no proteicos que influyen significativamente en la generación de este tipo de turbidez. Además, son muchas las investigaciones que tratan de encontrar una alternativa eficaz a la bentonita, ya que, a pesar de ser el tratamiento más común para evitar la generación de la turbidez proteica, presenta una serie de desventajas relacionadas con la cantidad de sedimento que genera y las pérdidas económicas que esto conlleva. Para llevar a cabo la investigación, se ha realizado una revisión sistemática de artículos científicos consultando las bases de datos Elsevier, GoogleAcademy, Pumbed y Scopus, teniendo en cuenta el año de publicación y el número de citas. Siendo seleccionados 34 artículos. Se ha observado que la turbidez proteica presente en los vinos todavía no ha sido descrita claramente y que existen factores que actualmente se desconocen, pero son relevantes para la formación de turbidez, además se han encontrado numerosas alternativas eficaces a la bentonita, aunque la bentonita sigue siendo la técnica más utilizada actualmente. PALABRAS CLAVE: Proteínas, Turbidez, Inestabilidad proteica, Bentonita. Página | 2 ABSTRACT Wine contains variable amounts of nitrogenous substances, with proteins being the most relevant despite being present in low concentration. The importance of proteins in wine lies in their capacity to produce turbidity, generally once the wine has been bottled, producing a depreciation of the product by the consumer. For many years, the generation of protein turbidity was only related to the amount of proteins and although it is dependent on these, there are a series of nonprotein factors that significantly influence the generation of this type of turbidity. In addition, there are many investigations that try to find an effective alternative to bentonite, since, in spite of being the most common treatment to avoid the generation of protein turbidity, it presents a series of disadvantages related to the amount of sediment that it generates and the economic losses that this entails. In order to carry out the research, a systematic review of scientific articles was carried out by consulting the Elsevier, GoogleAcademy, Pumbed and Scopus databases, taking into account the year of publication and the number of citations. Thirty-four articles were selected. It has been observed that the protein turbidity present in wines have not yet been clearly described and there are factors that are currently unknown, but are relevant to the formation of turbidity. Besides many effective alternatives to bentonite have been found, although bentonite still the most widely used technique at present. KEY WORDS: Proteins, Turbidity, Protein instability, Bentonite. Página | 3 ÍNDICE RESUMEN ..........................................................................................................................1 1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................5 2. MATERIALES Y MÉTODOS.......................................................................................7 2.1. DISEÑO ...............................................................................................................7 2.2. ESTRATEGIAS DE BÚSQUEDA .........................................................................7 2.3. CRITERIOS DE INCLUSIÓN Y EXTRACCIÓN DE DATOS ................................7 2.4. ANÁLISIS DE DATOS .........................................................................................7 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................................8 3.1. PROTEÍNAS DEL VINO ......................................................................................8 3.2. ORIGEN DE LAS PROTEÍNAS DEL VINO ........................................................ 10 3.2.1. Uva ............................................................................................................. 10 3.2.2. Levaduras .................................................................................................... 11 3.4. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS .................................................................. 13 3.5. PRUEBAS PARA LA PREDICCIÓN DE LA ESTABILIDAD PROTEICA ........... 15 3.5.1. Prueba de estabilidad por calor ...................................................................... 15 3.5.2. Prueba TCA ................................................................................................. 16 3.5.3. Prueba de etanol ........................................................................................... 17 3.5.4. Bentotest...................................................................................................... 17 3.5.5. Prueba con taninos ....................................................................................... 17 3.5.6. Electroneutralización .................................................................................... 17 3.5.7. Infrarrojo ..................................................................................................... 18 3.5.8. Método inmunológico de inmunoimpresión ................................................... 18 3.6. FACTORES NO PROTEICOS INFLUYENTES EN LA INESTABILIDAD .......... 19 3.6.1. pH ............................................................................................................... 19 3.6.2. Compuestos fenólicos ................................................................................... 20 3.6.3. Sulfuroso ..................................................................................................... 20 3.7. CLARIFICACIÓN CON BENTONITA................................................................ 21 3.8. ALTERNATIVAS A LA BENTONITA ............................................................... 24 3.8.1. Ácidos orgánicos .......................................................................................... 24 3.8.2. Enzimas proteolíticas.................................................................................... 24 3.8.3. Manoproteínas ............................................................................................. 25 3.8.4. Alta presión hidrostática ............................................................................... 26 Página | 4 3.8.5. Nanotecnología ............................................................................................ 26 3.8.6. Quitosano .................................................................................................... 28 3.8.7. Semillas de uva ............................................................................................ 28 4. CONCLUSIONES ...................................................................................................... 30 5. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................ 31 6. ANEXO I ................................................................................................................... 32 Página | 5 1. INTRODUCCIÓN La turbidez causada por proteínas insolubles en vinos blancos, embotellados en condiciones normales de almacenamiento, ha sido y sigue siendo actualmente un problema para los enólogos, ya que la limpidez en este tipo de vinos es requerida por el consumidor, en la Figura 1 se muestra esa falta de limpidez, a la izquierda se observa un vino con turbidez proteica y a la derecha un vino clarificado y estabilizado. Figura 1. Ejemplo de enturbiamiento proteico en vino blanco. Tomado de White wine continuous protein stabilization. por Salazar Gonzalez F. N. (2007). El proceso de enturbiamiento proteico se produce por la desnaturalización, agregación y posterior floculación de las proteínas con otros compuestos del vino en suspensión, llevando finalmente a la precipitación en vinos embotellados (Waters et al. 2005). Estas proteínas formadoras de turbidez son principalmente proteínas relacionadas con la patogénesis de la uva y son muy estables durante el proceso de vinificación, pero algunas de ellas pueden precipitar con el paso del tiempo y con unas condiciones favorables como el aumento de temperatura, la presencia de taninos…etc. Actualmente la práctica más extendida para la estabilización de las proteínas consiste en la adición de un clarificante, generalmente se emplea bentonita que es un clarificante mineral que procede de la descomposición de cenizas volcánicas. Página | 6 La importancia de este estudio se debe a que la precipitación de proteínas insolubles produce consecuencias considerables, en primer lugar, la utilización de bentonita para la estabilización genera cuantiosas pérdidas económicas a nivel global llegando a los mil millones de dólares anuales (Majewski et al., 2011), otro inconveniente de la utilización de bentonita es que no es realmente específica, de manera que con la eliminación de proteínas también se produce la eliminación de otros compuestos beneficiosos y compuestos aromáticos, reduciendo por tanto la calidad del vino (Esteruelas et al., 2009; Jaeckels et al., 2017; Lambri, et al. 2013). Además, esta preocupación por la inestabilidad de las proteínas se va a ver incrementada en los últimos años con la presencia del cambio climático, ya que el aumento de las temperaturas y disminución de las precipitaciones potencia el riesgo de inestabilización de las proteínas presentes en el vino (Pasquier et al. 2021). La estabilización proteica ha sido un tema de gran interés para numerosos investigadores, el mecanismo de formación de turbidez (Van Sluyter et al., 2015), así como la identificación de las proteínas que intervienen en ella ha sido durante décadas objeto de estudio, además durante los últimos años también se han desarrollado estudios para encontrar una alternativa eficaz a la bentonita (Batista et al,. 2010; Ribeiro et al., 2014; Colangelo, et al., 2018; Dumitriu, et al., 2018), por los problemas que genera comentados anteriormente, al igual que estudios que evidencian la presencia de factores no proteicos que influyen de manera considerable en la formación de turbidez proteica y que hasta ahora no habían sido tenidos en cuenta (Ferreira et al. 2002; Batista et al,. 2010; TabiloMunizaga et al., 2014. De manera que mediante esta revisión bibliográfica se ha recogido información sobre la turbidez proteica de los vinos blancos, todos los factores influyentes en su aparición, los métodos existentes para la cuantificación de proteínas y determinación de la dosis de bentonita, así como nuevas alternativas a la bentonita. El objetivo de esta investigación es, por tanto, analizar aquellos factores influyentes en la formación de turbidez proteica de vinos, así como nuevas tecnologías que permiten una mejora de la estabilidad proteica. Página | 13 3.4. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS El aislamiento, separación y caracterización de las proteínas de mostos y vinos resulta una tarea difícil debido a su baja concentración y a su fuerte interacción con polifenoles endógenos y otros compuestos no proteicos. El primer paso para la caracterización de proteínas es la purificación por diálisis o por columnas, en la mayoría de las técnicas. Las técnicas utilizadas son: la Cromatografía líquida de la proteína rápida (FPLC) de intercambio iónico, cromatoenfoque en FPLC, Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) ( MierczynskaVasilev, et al., 2017; Marangon et al., 2012; Romanini et al., 2021; Di Gaspero et al., 2017), cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de afinidad, electroforesis capilar (Dizy, M., y Bisson, L. F. 1999), enfoque isoeléctrico, transferencia de proteínas y métodos inmunológicos. Además, las proteínas del vino se pueden caracterizar aún más utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida nativa (PAGE) y PAGE en condiciones desnaturalizantes SDS-PAGE (Jaeckels et al., 2017; Lambri et al. 2013), electroforesis en gel bidimensional (2D-GE), nanocromatografía líquida de alta resolución o nanoHPLC y cromatografía liquida a nanoescala acoplada a espectrometría de masas en tándem o nano-LCMS/MS (Colangelo, et al., 2018). En el siguiente esquema se observa un flujo de trabajo habitual para la caracterización de las proteínas, en el que están incluidos las distintas técnicas comentadas. Página | 14 Figura 4. Flujo de trabajo típico para la caracterización de las proteínas del vino . Tomado de White Wine Protein Instability: Mechanism, Quality Control and Technological Alternatives for Wine Stabilisation (p. 3), por Cosme et al., 2020. Con los métodos citados anteriormente se ha llegado a la conclusión de que las clases más abundantes de proteínas causantes de turbidez son quitinasas y las proteínas similares a la taumatina (TLP), estas presentan un tamaño pequeño (< 35 kDa), son compactas, y están cargadas positivamente al pH del vino (Van Sluyter et al.,2015). También se han identificado como formadoras de turbidez las proteínas de tipo βglucanasas, aunque son mucho menos abundantes que las quitinasas y las TLP y no se ha investigado su función ampliamente todavía. La presencia de estas proteínas de forma mayoritaria lo podemos observar en la siguiente figura, además de sus pesos moleculares (Figura 5). Página | 15 Figura 5. Perfil electroforético típico de dos mostos de uva (CHA, chardonnay;SAB, Sauvignon blanc). Tomado de Wine Protein Haze: Mechanisms of Formation and Advances in Prevention (p. 4021), por Van Sluyter et al., 2015. 3.5. PRUEBAS PARA LA PREDICCIÓN DE LA ESTABILIDAD PROTEICA Para disminuir el riesgo de turbidez proteica una vez el vino ha sido embotellado, se han desarrollado una serie de pruebas que permiten identificar el potencial de formación de turbidez que presenta el vino, además conocer este potencial permitirá un correcto ajuste en la dosis del tratamiento que evitará que se produzca la posterior precipitación de proteínas. Existen varios tipos de pruebas que nos permiten evaluar la inestabilidad proteica del vino, además de periódicas investigaciones que aportan nuevas metodologías de evaluación. Para todos los casos el vino se considera estable si el incremento de la turbidez tras la realización de la prueba es inferior a 2 NTU. 3.5.1. Prueba de estabilidad por calor Es el método más utilizado en la industria vitivinícola para evaluar la inestabilidad proteica, por ser considerado el más fiable. No existe un método exacto de realización, son diferentes los tiempos y temperaturas empleados para cada investigación. Página | 16 El método se basa en el calentamiento del vino a una alta temperatura, produciendo una desnaturalización de las proteínas y provocando por tanto su precipitación, formándose un precipitado con una composición similar al precipitado natural. La técnica más utilizada es la descrita por Pocock y Rankine (1973), que consiste en calentar la muestra de vino durante 6 horas a 80ºC, después enfriarlo durante 16 horas a 4ºC y posteriormente dejarlo a temperatura ambiente, necesitando un tiempo total para la interpretación de los resultados cercano a las 24 horas. Aunque también existen otras técnicas como la del calentamiento durante 2 horas a 80ºC y posterior enfriamiento en hielo durante otras 2 horas (Marangon et al., 2012). Además, el tiempo de enfriamiento es también un factor clave para la formación de la turbidez, ya que cuanto mayor sea el tiempo de enfriamiento, mayor será la turbidez formada (McRae et al., 2018). Los ensayos comparativos indican que una prueba con dos horas de calentamiento y tres horas de enfriamiento produce una turbidez similar o mayor que la prueba de calor comúnmente utilizada en la industria. (McRae et al., 2018). Existe una variabilidad significativa en cómo se realiza la prueba y cómo se interpretan los resultados, que afecta la confiabilidad de los resultados, por lo que a pesar de ser una de las pruebas más utilizadas en la industria del vino y ser considerada una de las más fiables, no es realmente específica y requiere de una generalización de los tiempos. 3.5.2. Prueba TCA La prueba del ácido tricloroácetico (TCA) se basa en la capacidad de este ácido para producir una precipitación de las proteínas, consiste en la adición de 1mL de una solución de TCA al 55% a 10 Ml de vino, y a continuación calentar la muestra a 100ºC durante 5 minutos y dejar reposar durante 15 minutos antes de la medición de turbidez. (Hidalgo, J., 2010). Esta prueba no permite una interpretación de los resultados de forma satisfactoria, ya que produce una sobreestimación de la dosis de clarificante necesario, puesto que no sólo las proteínas inestables precipitan. Página | 17 3.5.3. Prueba de etanol Esta prueba está basada en la reducción de la constante dieléctrica, lo que provoca una reducción de la solubilidad de las proteínas. Consiste en la adición del mismo volumen de etanol absoluto a un vino, pudiéndose formar turbidez, que será medida por nefelometría. Esta prueba, está influenciada por la concentración de proteínas, pH, ácido tartárico, y contenido en calcio, lo que puede provocar diferencias en la formación de turbidez en el vino (Esteruelas et al., 2009; Cosme et al., 2020). Por lo tanto, se vuelve a sobreestimar el clarificante necesario para la estabilización de las proteínas. 3.5.4. Bentotest Se utiliza una solución de ácido fosfomolíbdico en HCL que precipita la proteína del vino al neutralizar la carga, lo que lleva a la agregación con el ion molibdeno. Se produce una precipitación de la totalidad de las proteínas del vino, de manera que al igual que las dos pruebas comentadas anteriormente, se sobrevalora la cantidad de clarificante a utilizar. 3.5.5. Prueba con taninos Consiste en la adición de 1 mL de una solución de taninos al 10% a 10 mL de vino, la mezcla se calentará al baño maría a 100 ºC durante 2 minutos, observándose o no turbidez al permanecer 15 minutos a temperatura ambiente. Esta prueba se ve influenciada por otros factores como el pH, presencia de cobre, hierro y potasio (Esteruelas et al., 2009). Por lo tanto, se trata de una prueba bastante imprecisa y no permite una buena interpretación de la dosis de clarificante a utilizar. 3.5.6. Electroneutralización Los métodos tradicionales para evaluar la estabilidad proteica comentados anteriormente, en su mayoría presentan tiempos de análisis muy largos, además de presentar cierta imprecisión puesto que en algunos no solo se provoca la precipitación de Página | 18 proteínas, sino también de otros compuestos, produciéndose una sobreestimación del problema. De manera que las desventajas que presentan los métodos tradicionales han impulsado la búsqueda de nuevos métodos de estabilización. Uno de estos nuevos métodos está basado en el análisis de la inestabilidad proteica utilizando las características de electro positividad de las proteínas al pH del vino. El test (ProtoCheck) realiza la electroneutralización de las proteínas, una vez llegadas al punto isoeléctrico se vuelven insolubles y determinan una turbidez medible. La muestra no necesita ser filtrada ya que solo se evalúa la turbidez antes y después de añadir el reactivo que provoca la electroneutralización (Celotti, 2005). Así pues, esta prueba presenta unos tiempos de análisis más cortos, pero a pesar de presentar una mayor especificidad, también existen interferencias que provocarían una sobreestimación de la dosis de clarificante. 3.5.7. Infrarrojo Otra nueva metodología para la medición de inestabilidad proteica es la espectroscopía infrarroja (Versari, et al., 2011). Para el desarrollo de este método se utilizaron ciento once vinos blancos, a los que se les midieron los espectros del infrarrojo cercano(NIR) y medio y se les realizaron pruebas de estabilidad térmica y coloidal (adición de etanol). Este estudio demostró que la turbidez de los vinos resultante de la adición de etanol podía predecirse a partir de los espectros de infrarrojo cercano de onda corta. 3.5.8. Método inmunológico de inmunoimpresión Las pruebas que se utilizan generalmente para la detección de las proteínas inestables están basadas en la aplicación de calor o en la utilización de precipitantes, como ya se ha comentado anteriormente muchas de estas pruebas aportan resultados poco fiables. La Organización Internacional de la Viña y el Vino en el año 2017 (OIV-OENO 529-2017) aprobó la utilización de un método de inmunopresión que permite la detección Página | 19 de las proteínas inestables del vino, concretamente las proteínas como la taumatina y la quitinasa en el vino a partir de una concentración global de 1 mg/L. La técnica consiste en la introducción de la muestra de vino en una membrana de nitrocelulosa, tras esta etapa se produce la detección de las proteínas inestables y por último el revelado de la presencia de proteínas inestables, la intensidad de las manchas coloreadas observadas en la membrana es proporcional a la cantidad de proteínas inestables y al riesgo de quiebra proteica del vino. 3.6. FACTORES NO PROTEICOS INFLUYENTES EN LA INESTABILIDAD Aunque existe una gran diversidad la mayoría de las proteínas del vino están relacionadas estructuralmente y han sido identificadas como proteínas relacionadas con la patogénesis (PR), estas derivan de la uva como se ha comentado anteriormente y son capaces de resistir a los procesos de vinificación, debido a si resistencia a la proteólisis y al pH de los vinos. A pesar de esto, y aunque es dependiente de las proteínas, la formación de turbidez en el vino también depende de una serie de factores no proteicos, que a menudo son considerados como “Factor X” (Ferreira et al. 2002; Batista et al. 2010; TabiloMunizaga et al., 2014), algunos de los más relevantes son definidos a continuación. 3.6.1. pH Varias investigaciones que han utilizado tanto vinos naturales, como soluciones modelo sugieren que el pH del vino juega un papel fundamental en la formación de neblina del vino dependiente de las proteínas ( Batista et al., 2009; Lambri et al. 2013). Lambri et al., (2013) estudiaron la tendencia a la formación de turbidez en un vino blanco afectado por un pH que oscilaba entre 3,00 y 3,6 y se concluyó que los vinos con un pH más bajo presentan una mayor estabilidad térmica, ya que no se produjo formación de turbidez aun superando los 70ºC. Además, el aumento de pH se caracterizó por un cambio progresivo en la temperatura de formación de turbidez de 50-60 ºC a 70-80 ºC. De manera que se demostró que el valor del pH juega un papel fundamental en la formación o no de turbidez proteica. Página | 20 Se observó también que la mayoría de las proteínas estaban glicosiladas, una característica que se ha especulado que tiene una influencia en la solubilidad diferencial de las proteínas del vino en respuesta al pH (Lambri et al. 2013). 3.6.2. Compuestos fenólicos Los compuestos fenólicos son considerados otro de los factores no proteicos potencialmente implicados en la formación de turbidez. El objetivo de alguna investigación ha sido el de la identificación y cuantificación de polifenoles presentes en el precipitado natural de un vino blanco. (Esteruelas et al., 2011). En la investigación de Esteruelas y colaboradores (2011) se utilizaron tanto la cromatografía de alta resolución (HPLC) como cromatografía de gases(CG) para la identificación y cuantificación de compuestos fenólicos, y se concluyó que a pesar la difícil identificación de estos compuestos sí que están presentes en una concentración bastante significativa en el precipitado natural de un vino, por lo que se sugiere que estén involucrados en el mecanismo de aparición de la turbidez proteica. 3.6.3. Sulfuroso La utilización de dióxido de azufre ha sido también relacionada con la formación de turbidez proteica. Diferentes investigaciones han comprobado esta relación (Chagas et al. 2016; Chagas, et al., 2018). En ambos casos los resultados indican un papel modulador del SO2 en la formación de la precipitación proteica del vino blanco. Dado su rango de concentraciones efectivas, muy por debajo de la concentración máxima permitida en los vinos, el SO2 puede considerarse como un candidato para el factor no proteico que induce la agregación proteica del vino blanco. De manera que se demuestra la existencia de factores no proteicos influyentes en la formación de turbidez, algunos de ellos ya han sido claramente identificados, como los comentados anteriormente. Página | 21 3.7.CLARIFICACIÓN CON BENTONITA El tratamiento más utilizado en la industria vitivinícola para conseguir la estabilización del vino y prevenir la formación de turbidez proteica después del embotellado es el tratamiento con bentonita. La bentonita es un clarificante mineral que procede de la descomposición de cenizas volcánicas, fue descubierta en el año 1888 en el estado de Wyoming (U.S.A). Se trata de una arcilla perteneciente a la familia de las montmorillonitas. Las arcillas presentan la siguiente fórmula: Al2O3 · SiO2 · nH2O, aunque las montmorillonitas presentan la siguiente: Na,Ca)0,3(Al,Mg)2Si4O10(OH)2 ·nH2O1, donde se observa la presencia de magnesio. La bentonita se compone de al menos un 75 % de montmorillonita (Jaeckels et al., 2017) y presenta estructura dioctaedrica, presentando cada hoja dos series de tetraedros, donde se intercalan octaedros, como podemos observar en la Figura 6. Presenta una carga negativa en toda su superficie, excepto en el borde que es positiva. Figura 6. Estructura laminar de la bentonita. Adaptado de Tratado de Enología Tomo II (p.1312), Hidalgo, J. (2010) Editorial Mundi-Prensa. Página | 22 Existen diferentes tipos de bentonita: ácidas, sódicas, cálcicas y magnésicas. Todas ellas presentan la capacidad de expandirse en ambientes húmedos y disminuir por tanto la permeabilidad de la superficie. La clarificación de bentonita implica la dispersión del adsorbente y la adsorción de los solutos y la sedimentación del complejo formado entre el adsorbente y el adsorbato. La bentonita elimina las proteínas por interacción electrostática, formando complejos que pueden eliminarse por filtración. La adsorción de las proteínas por la bentonita es dependiente del punto isoeléctrico(pI) de las proteínas y del pH del vino. Generalmente el pH del vino está cerca del punto isoeléctrico de la mayoría de las proteínas, pero si el pH del vino está por encima del punto isoeléctrico, la carga neta de la fracción será negativa por lo que las proteínas se unirán electrostáticamente a aquellos clarificantes que estén cargados positivamente; de la misma forma cuando el pH del vino es más bajo que el pI, la carga neta de la fracción será postiva, y las proteínas reaccionaran con los clarificantes cargados negativamente como la bentonita. Esta relación explica el por qué algunos vinos se estabilizan fácilmente con una dosis especifica de bentonita, mientras que otros vinos no.( Zoecklein et al.,2005) Generalmente en la industria vitivinícola se utiliza bentonita sódica con mayor frecuencia que la cálcica, por su mayor potencial de hinchazón. El tratamiento en bodegas con bentonita para prevenir la precipitación de proteínas es el más extendido, las dosis son variables, pero para aquellas proteínas que presenten un eso de entre 15000 y 35000 Dalton (principales causantes de la turbidez en vino), la adición de 40-60 gramos/Hl sería suficiente, y para eliminar aquellas proteínas que presenten un peso molecular de entre 40000 y 100000 Dalton, las dosis de bentonita deberían ser superiores a 80 g/Hl. (Hidalgo, J., 2010). La aplicación de la bentonita es sencilla, el primer paso es la hidratación de la bentonita en diez veces su volumen en agua, se deja reposar de doce a veinticuatro horas y tras una agitación previa se introduce al mosto o vino a tratar y se deja asentar. (Blouin, J., y Peynaud, E. 2004). El asentamiento es lento pudiendo ser superior a una semana, por lo que es considerado un tratamiento largo, suponiendo esto uno de los principales inconvenientes de su utilización, además otro inconveniente de la bentonita es que su sedimento o “lías” Página | 29 Fueron cuantificadas las proteínas formadoras de turbidez mediante UHPLC, además de la composición y el color del vino utilizando un analizador infrarrojo (FOSS), polisacáridos y ácidos orgánicos mediante HPLC, además de una evaluación sensorial por expertos. Los resultados demostraron una eficacia de los tratamiento con GSP para reducir las proteínas relacionadas con la patogénesis del vino hasta en un 57 %, además de una reducción de la inestabilidad térmica de hasta un 80%, a pesar de esto la concentración de proteínas para ambos casos fue la suficiente para la generación de turbidez, también se vieron incrementados aspectos sensoriales negativos como un aumento de viscosidad, astringencia, amargor e intensidad de color amarillento, aunque favorablemente se vieron incrementados los aromas tropicales. De manera que esta alternativa requiere más ensayos para posicionarla como una buena alternativa a la bentonita, o para poder utilizarlo simultáneamente y poder obtener los beneficios de ambos tratamientos. Actualmente la OIV aprueba la utilización de los siguientes tratamientos para la estabilización proteica: bentonita, quitosano, utilización glucano-quitina. (Resolución OENO 06/2016). Página | 30 4. CONCLUSIONES En definitiva, la revisión sistemática pone de manifiesto que la turbidez proteica presente en los vinos, a pesar de haber sido uno de los mayores problemas en la industria vitivinícola durante muchos años, sigue siéndolo al no determinarse con claridad los factores y mecanismos de su origen. La presencia del denominado “Factor X” o factores no proteicos influyentes ha sido demostrada en numerosos estudios, aunque requiere de una mayor investigación para definir con exactitud todos los parámetros que contribuyen a la precipitación proteica y así poder evitar que esto suceda. Actualmente no existe una alternativa a la bentonita que sea igual de eficaz y barata, sin embargo, el uso de taninos, manoproteínas y enzimas combinados con bentonita puede ayudar a reducir su dosis y minimizar los efectos negativos relacionados con su aplicación. Se siguen realizando investigaciones para descubrir una alternativa a la bentonita que sin duda son prometedoras, como la nanotecnología, las manoproteínas, la alta presión hidrostática o la utilización de semillas de uva, por lo que en un futuro cercano la reducción de uso de bentonita será una realidad. Página | 31 5. BIBLIOGRAFÍA Batista, L., Monteiro, S., Loureiro, V. B., Teixeira, A. R., & Ferreira, R. B. (2010). Protein haze formation in wines revisited. The stabilising effect of organic acids. Food Chemistry, 122, 1067–1075. Batista, L., Monteiro, S., Loureiro, V. B., Teixeira, A. R., & Ferreira, R. B. (2009). The complexity of protein haze fromation in wine. Food Chemistry, 112, 169–177. Blouin, J., & Peynaud, E. (2004). Enología práctica: Conocimiento y elaboración del vino: conocimiento y elaboración del vino. Mundi-Prensa Libros. Celotti, E. (2005). Nuevo método para la evaluación de la inestabilidad proteica potencial de los vinos. Revista Internet De Viticultura Y enología, (11/2). Chagas, R., Ferreira, L. M., Laia, C., Monteiro, S., & Ferreira, R. B. (2016). The challenging SO2-mediated chemical build-up of protein aggregates in wines. Food Chemistry, 192, 460–469. Chagas, R., Laia, C. A., Ferreira, R. B., & Ferreira, L. M. (2018). Sulfur dioxide induced aggregation of wine thaumatin-like proteins: Role of disulfide bonds. Food Chemistry, 259, 166–174. Colangelo, D., Torchio, F., Marco de Faveri, D., & Lambri, M. (2018). The use of chitosan as alternative to bentonite for wine fining: Effects on heat-stability, proteins, organic acids, colour, and volatile compounds in an aromatic white wine. Food Chemistry, 264, 301–309. Cosme, F., Fernandes, C., Ribeiro, T., Filipe-Ribeiro, L., & Nunes, F. M. (2020). White Wine Protein Instability: Mechanism, Quality Control and Technological Alternatives for Wine Stabilisation, 6,1-19. Di Gaspero, M., Ruzza, P., Hussain, R., Vincenzi, S., Biondi, B., Gazzola, D., Siligardi, G., & Curioni, A. (2017). Spectroscopy reveals that ethyl esters interact with proteins in wine. Food Chemistry, 217, 373–378. Dizy, M., & Bisson, L. F. (1999). White Wine Protein Analysis by Capillary Zone Electrophoresis. American Journal Enology and Viticulture, 50, 120–127. Página | 32 Dumitriu, G.-D., López de Lerma, N., Luchian, C. E., Cotea, V. V., & Peinado, R. A. (2018). Study of the potential use of mesoporous nanomaterials as fining agent to prevent protein haze in white wines and its impact in major volatile aroma compounds and polyols. Food Chemistry, 240, 751–758. Esteruelas, M., Kontoudakis, N., Gil, M., Fort, M. F., Canals, J. M., & Zamora, F. (2011). Phenolic compounds present in natural haze protein of Sauvignon white wine. Food Research International, 44, 77–83. Esteruelas, M., Poinsaut, P., Sieczkowski, N., Manteau, S., Fort, M., Canals, J., & Zamora, F. (2009). Characterization of natural haze protein in sauvignon white wine. Food Chemistry, 113, 28–35. Ferreira, R. B., Picarra-Pereira, M. A., Monteiro, S., Loureiro, V. B., & Teixeira, A. R. (2002). The wine proteins. Trends in Food Science & Technology, 12, 230–239. FLANZY, C. (2000) Enología: Fundamentos científicos y tecnológicos. AMV ediciones. Ediciones Mundi-Prensa. Fusi, M., Mainente, F., Rizzi, C., Zoccatelli, C., & Simonato, B. (2010). Wine hazing: A predictive assay based on protein and glycoprotein independent recovery and quantification. Food Control, 21, 830–834. Hidalgo Togorés, J. (2003). Tratado de Enología Tomos I y II. Ediciones MundiPrensa: Madrid, España. Jaeckels, N., Tenzer, S., Meier, M., Will, F., Dietrich, H., Decker, H., & Fronk, P. 2017). Influence of bentonite fining on protein composition in wine. LWT-Food Science and Technology, 75, 335–343. Lambri, M., Dordoni, R., Giribaldi, M., Violetta, M. R., & Giuffrida, M. G. (2013). Effect of pH on the protein profile and heat stability of an Italian white wine. Food Research International, 54, 1781–1786. Marangon, M., Van Sluyter, S. C., Robinson, E. M., Muhlack, R. A., Holt, H. E., Haynes, P. A., Godden, P. W., Smith, P. A., & Waters, E. J. (2012). Degradation of white wine haze proteins by Aspergillopepsin I and II during juice flash pasteurization. Food Chemistry, 135, 1157–1165. Página | 33 Marangon, M., Vincenzi, S., Lucchetta, M., & Curioni, A. (2010). Heating and reduction affect the reaction with tannins of wine protein fractions differing in hydrophobicity. Analytica Chimica Acta, 660, 110–118. Majewski, P., Barbalet, A., & Waters, E. (2011). $1 billion hidden cost of bentonite fining. Australian and New Zealand grapegrower and winemaker, 569, 58-62. McRae, J., Barricklow, V., Pocock, K., & Smith, P. (2018). A new heat test for more accurate prediction of bentonite additions to avoid protein haze. Technical Review, 235, 10–18. Mierczynska-Vasilev, A., Boyer, P., Vasilev, K., & Smith, P. A. (2017). A novel technology for the rapid, selective, magnetic removal of pathogenesis-related proteins from wines. Food Chemistry, 232, 508–514. Pasquier, G., Feilhes, C., Dufourcq, T., & Geffroy, O. (2021). Potential Contribution of Climate Change to the Protein Haze of White Wines from the French Southwest Region. Foods, 10, 1–14. Resolución OIVOENO 06/2016 Resolución OIV-OENO 529-2017 Ribereau-Gayon, J., Peynaud, E., Sudraud, P., & Ribéreau-Gayon, P. (2003). Tratado de enologia: química del vino estabilización y tratamientos. Ediciones Mundi-prensa. Ribeiro, T., Fernandes, C., Nunes, F., Filipe-Ribeiro, L., & Cosme, F. (2014). Influence of the structural features of commercial mannoproteins in white wine protein stabilization and chemical and sensory properties. Food Chemistry, 159, 47–54. Romanini, E., McRae, J. M., Bilogrevic, E., Colangelo, D., Gabrielli, M., & Lambri, M. (2021). Use of grape seeds to reduce haze formation in white wines. Food Chemistry, 341. Salazar Gonzalez, F. N. (2007). White wine continuous protein stabilization. Industrial viavility. Tesis doctoral, Universitat of Rovira I Virgili. Taragona, España. Página | 34 Tabilo-Munizaga, G., Gordon, T. A., Villalobos-Carvajal, R., Moreno-Osorio, L., Salazar, F. N., Pérez-Won, M., & Acuña, S. (2014). Effects of high hydrostatic pressure (HHP) on the protein structure and thermal stability of Sauvignon blanc wine. Food Chemistry, 155, 214–220 . Teijón, J. M. (2006). Fundamentos de bioquímica estructural. Editorial Tébar. Van Sluyter, S. C., McRae, J. M., Falconer, R. J., Smith, P. A., Bacic, A., Waters, E. J., & Marangon, M. (2015). Wine Protein Haze: Mechanisms of Formation and Advances in Prevention. Agricultural and Food Chemistry, 63, 4020–4030. Versari, A., Laghi, L., Thorngate, J. H., & Boulton, R. B. (2011). Prediction of colloidal stability in white wines using infrared spectroscopy. Journal of Food Engineering, 104, 239–245. Waters, E.J., Alexander, G., Muhlack, R., Pocock, K.F., Colby, C., O'neill, B.K., Hoj, P.B. & Jones, P. (2005) Preventing protein haze in bottled white wine. Australian Journal of Grape and Wine Research 11, 215-225. Zoecklein, B. W., & Latorre Macarrón, E. (2000). Análisis y producción de vino. Zoecklein, B.W., K.C. Fugelsang, B.H. Gump, and F.S. Nury. (2005). Wine analysis and production. Kluwer Academic/Plenum Publishers, TÍTULO AUTORES AÑO CITA PALABRAS CLAVE RESUMEN REVISTA White Wine Protein Analysis by Capillary Zone Electrophoresis Dizy, M., & Bisson, L. F 1999 46 Protein análisis Haze Capillary electrophoresis In this study, capillary zone electrophoresis was evaluated as a method for the analysis of wine proteins. Protein peaks were found to be sensitive to proteases, suggesting that wine proteins are not intrinsically resistant to degradation by proteases. Staining induced by heat/cooling treatment stripped the wines of their protein content. Capillary zone electrophoresis represents an excellent tool in the analysis of wine proteins and has the potential to differentiate wine varietals. American Journal Enology and Viticulture The wine proteins Ferreira, R. B., PicarraPereira, M. A., Monteiro, S., Loureiro, V. B., & Teixeira, A. R. 2002 261 Proteins Turbidity Factors of nonprotein origin Bentonite Wine proteins are structurally related and have been identified as pathogenesis-related proteins (PR), which are derived from the pulp and survive after vinification due to their resistance to low pH and proteolysis. Wine turbidity is protein-dependent, but is also related to factors of non-protein origin such as polyphenols, pH and polysaccharides. Food Science & Technology 6. ANEXO I En la siguiente tabla están recogidos por orden cronológico los artículos más relevantes utilizaos la realización de la revisión bibliográfica Tabla 1. Resumen bibliográfico por orden cronológico. Página | 36 Characterization of natural haze protein in sauvignon white wine. Esteruelas, M., Poinsaut, P., Sieczkowski, N., Manteau, S., Fort, M., Canals, J., & Zamora, F. 2009 87 Haze proteins Electrophoresis FPLC MALDI-TOF/TOF In a study where the natural precipitate of a Sauvignon Blanc was analyzed by FPLC, electrophoresis and MALDI TOF/TOF, the thaumatin-like protein and two new proteins that had not been described before as components of haze were described: b-(1-3)-glucanase and ripening-related protein grip22 precursor. Food Chemistry The complexity of protein haze formation in wine. Batista, L., Monteiro, S., Loureiro, V. B., Teixeira, A. R., & Ferreira, R. B. 2009 74 Wine proteins Haze Turbidity pH Factor X Using an Arinto wine with a natural composition of 280 mg/L of proteins, several heat stability tests were performed at pH 2.8 to 3.6. The presence of factor X (one or more low molecular weight components that sensitize proteins to heat-induced denaturation) was observed. Minimal turbidity was also observed at pH 7, but this increases at higher and lower pHs. Food Chemistry Wine hazing: A predictive assay based on protein and glycoprotein independent recovery and quantification. Fusi, M., Mainente, F., Rizzi, C., Zoccatelli, C., & Simonato, B. 2010 27 Wine proteins and glycoproteins KDS Electrophoresis Protein quantification Wine haziness This study presented a two-step method for separate recovery of proteins and glycoproteins from wine, useful for their quantification and analysis, and showed a direct correlation between turbidity and protein concentration and protein/glycoprotein relation. Food Control Página | 37 Protein haze formation in wines revisited. The stabilising effect of organic acids Batista, L., Monteiro, S., Loureiro, V. B., Teixeira, A. R., & Ferreira, R. B. 2010 45 Organic acids Haze X factor Wine proteins Tartaric acid In this study, the effect of five common organic acids in wine on protein turbidity potential was evaluated. The acids used for the study were tartaric, malic, citric, succinic and gluconic acids. Overall, the results obtained indicated that organic acids exhibit a stabilizing effect on the turbidity potential of wine proteins. Food Chemistry Heating and reduction affect the reaction with tannins of wine protein fractions differing in hydrophobicity Marangon, M., Vincenzi, S., Lucchetta, M., & Curioni, A. 2010 56 Protein Tannin Hydrophobicity Thaumatin-like proteins Chitinases In this study, proteins and tannins were separated from the same unrefined Pinot grigio wine. The wine proteins were fractionated by hydrophobic interaction chromatography (HIC). A significant correlation was observed between the hydrophobicity of the wine protein fractions and the turbidity formed after reacting with the wine tannins. Analytica Chimica Acta Phenolic compounds present in natural haze protein of Sauvignon white wine Esteruelas, M., Kontoudakis, N., Gil, M., Fort, M. F., Canals, J. M., & Zamora, F. 2011 40 Phenolic compounds Haze protein Natural precipitation White wine Phenolic compounds may be one of the nonprotein factors involved in the formation of protein turbidity. The objective of this study was to identify and quantify the polyphenols present in the natural precipitate of a Sauvignon wine, before and after natural precipitation. The results indicated that several phenolic compounds were present in the protein haze. Food Research International Degradation of white wine haze proteins by Aspergillopepsin I and II during juice flash pasteurization. Marangon, M., Van Sluyter, S. C., Robinson, E. M., Muhlack, R. 2012 80 Protein stability Wine Proteasas AGP Heat treatment Proteases are an alternative to bentonite, but until now they were not effective in winemaking. AGP is a mixture of Aspergillopepsin I and II, an inexpensive protease that is active at wine pH and at high temperatures. Food Chemistry Página | 38 A., Holt, H. E., Haynes, P. A., Godden, P. W., Smith, P. A., & Waters, E. J. Aspergillopepsin In this study, AGP was added to clarified grape must prior to fermentation. At common fermentation temperature there was a 20% decrease in protein, and a 90% decrease on heating. There were no significant sensory changes. Effect of pH on the protein profile and heat stability of an Italian white wine Lambri, M., Dordoni, R., Giribaldi, M., Violetta, M. R., & Giuffrida, M. G. 2013 18 pH Proteins Stability White wine Haze Glycoproteins In this study, an Italian white wine with a pH ranging from 3 to 3.6 was analyzed. The results indicate a higher thermal stability of the wine with lower pH, since turbidity did not occur even above 70º. Electrophoresis was performed, most of the proteins involved in turbidity were glycosylated (influence on protein solubility in response to pH changes). Food Research International Effects of high hydrostatic pressure (HHP) on the protein structure and thermal stability of Sauvignon blanc wine TabiloMunizaga, G., Gordon, T. A., VillalobosCarvajal, R., MorenoOsorio, L., Salazar, F. N., Pérez-Won, M., & Acuña, S. 2014 49 Protein Stability High hydrostatic pressure Secundary structure protein In this study, the effects of high hydrostatic pressure on wine stability were evaluated, and an improvement in the thermal stability of proteins was observed, delaying turbidity during bottling. Food Chemistry