Etablierung eines 3D-Ovarialkarzinommodells zur Untersuchung der ADAM17-Inhibition in Kombination mit dem Chemotherapeutikum Paclitaxel

Aus der Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfe (Direktor: Prof. Dr. Nicolai Maass) im Universitätsklinikum Schleswig-Holstei n, Campus Kiel an der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel Etablierung eines 3D-Ovarialkarzinommodells zur Untersuchung der ADAM17Inhibition in Kombination mit dem Chemotherapeutikum Paclitaxel Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwü rde der Medizin der Medizinischen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel vorgelegt von Andreas Manfred Herz aus Witzenhausen Kiel 2023 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Dirk O. Bauerschlag, Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfe 2. Berichterstatterin: Priv.-Doz. Dr. Renate Burger, Sektion für Stammzelltransplantation und Immuntherapie Tag der mündlichen Prüfung: 28.10.2024 Zum Druck genehmigt, Kiel, den 19.07.2024 gez.: Prof. Dr. Dirk O. Bauerschlag Vorsitzender der Prüfungskommission Meinen Kindheitshelden Hermine und Ludwig Kosch I Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis .................................................................................................................. III Abbildungsund Tabellenverzeichnis.............................................................................................V 1 Einleitung .............................................................................................................................. 1 Ovarialkarzinom ................................................................................................................... 1 1.1.1 Epidemiologie, Risikofaktoren und Protektivfaktoren ....................................................... 1 1.1.2 Anatomie und physiologische Funktion des Ovars ............................................................ 2 1.1.3 Pathologie ........................................................................................................................... 2 1.1.4 Therapie und Prognose ....................................................................................................... 4 A Disintegrin And Metalloprotease 17 (ADAM17) ............................................................ 5 1.2.1 Physiologische Rolle von ADAM17 .................................................................................. 5 1.2.2 Expression von ADAM17 im Tumorgewebe ..................................................................... 5 1.2.3 ADAM17-vermittelte Ligandenfreisetzung des Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) ............................................................................................................................... 6 1.2.4 Rolle von ADAM17 bei der Entstehung von Chemotherapieresistenz .............................. 6 1.2.5 ADAM17 als Angriffspunkt für zielgerichtete Therapieansätze ........................................ 7 Zweidimensionale und dreidimensionale Tumormodelle zur Testung onkologischer Therapieansätze .................................................................................................................... 8 1.3.1 Zweidimensionale Zellkultivierung als in vitro-Tumormodell .......................................... 8 1.3.2 Dreidimensionales Multizelluläres Tumorspheroidmodell (MTM) ................................... 8 Zielsetzung der Arbeit ........................................................................................................ 12 2 Material und Methoden ..................................................................................................... 13 2.1 Material ....................................................................................................................................... 13 2.1.1 Chemotherapeutika ............................................................................................................. 13 2.1.2 Inhibitoren und deren Lösungsmittel .................................................................................. 13 2.1.3 Antibiotika .......................................................................................................................... 13 2.1.4 Fluoreszenzfarbstoffe ......................................................................................................... 13 2.1.5 Pipetten ............................................................................................................................... 14 2.1.6 Verbrauchsmaterialien ........................................................................................................ 14 2.1.7 Chemikalien und Reagenzien ............................................................................................. 14 2.1.8 Kulturmedium ..................................................................................................................... 15 2.1.9 Kits ...................................................................................................................................... 15 2.1.10 Geräte .................................................................................................................................. 15 2.1.11 Computerprogramme .......................................................................................................... 16 2.1.12 Zelllinien ............................................................................................................................. 16 2.1.13 Primäre Zellen.................................................................................................................... 16 2.2 Methoden.................................................................................................................................... 17 2.2.1 Zellkultivierung.................................................................................................................... 17 2.2.2 Versuchsaufbau der zweidimensionalen Zellkulturexperimente......................................... 17 2.2.3 Versuchsaufbau der dreidimensionalen Zellkulturexperimente.......................................... 19 2.2.4 ELISA.................................................................................................................................. 22 3 Ergebnisse ........................................................................................................................... 22 3.1 Zweidimensionale Untersuchungen .......................................................................................... 23 3.1.1 Das Chemotherapeutikum Paclitaxel führt zur Induktion der ADAM17-Aktivität ......... 23 3.1.2 Eine ADAM17-Inhibition sensitiviert BG-1-Ovarialkarzinomzellen gegenüber ............... Paclitaxel ......................................................................................................................... 24 3.2 Etablierung eines 3D-Ovarialkarzinommodells ...................................................................... 27 3.2.1 BG-1-Ovarialkarzinomzellen können Multizelluläre Tumorspheroide ausbilden ........... 27 II 3.2.2 Zellzahltestung zur Herstellung Multizellulärer Tumorspheroide definierter Zielgröße . 28 3.2.3 Testung zur Ermittlung einer angemessenen Kultivierungszeit der Multizellulären Tumorspheroide bis zur Durchführung eines Mediumwechsels ...................................... 29 3.2.4 Testung der Spheroiduniformität ...................................................................................... 30 3.2.5 Ovarialkarzinomzellen bilden im Multizellulären Tumorspheroid Zell-Zell-Kontakte und einen Proliferationsgradienten aus .................................................................................... 31 3.2.6 Charakterisierung von Multizellulären Tumorspheroiden mittels Fluoreszenzfarbstoffen .. .......................................................................................................................................... 32 3.2.7 Testung des Behandlungseffekts über die Spheroidfläche im 3D-Ovarialkarzinommodell .......................................................................................................................................... 33 3.2.8 Translationaler Ansatz: Spheroidbildung von Asziteszellen im 3D-Kulturansatz ........... 35 3.3 Validierung der 2D-Ergebnisse im 3D-Ovarialkarzinommodell ........................................... 36 3.3.1 Das Chemotherapeutikum Paclitaxel führt zur Induktion der ADAM17-Aktivierung im Multizellulären Tumorspheroid ........................................................................................ 36 3.3.2 Die Kombinationsbehandlung aus Paclitaxel und ADAM17-Inhibition bewirkt einen stärkeren Behandlungseffekt auch im 3D-Kulturansatz ................................................... 37 4 Diskussion ........................................................................................................................... 40 4.1 Einfluss des Chemotherapeutikums Paclitaxel auf die ADAM17-Aktivität .................. 41 4.2 Untersuchung des Einflusses einer zusätzlichen ADAM17-Inhibition zur konventionellen Chemotherapie ........................................................................................ 42 4.3 Etablierung des 3D-Ovarialkarzinommodells ......................................................................... 44 4.3.1 BG-1-Ovarialkarzinomzellen können Multizelluläre Tumorspheroide ausbilden ........... 44 4.3.2 Testung zur Ermittlung einer angemessenen Kultivierungszeit bis zur Durchführung eines Mediumwechsels ..................................................................................................... 45 4.3.3 Testung der Spheroiduniformität ...................................................................................... 45 4.3.4 Ovarialkarzinomzellen bilden im Multizellulären Tumorspheroid Zell-Zell-Kontakte und eine Proliferationszone aus ............................................................................................... 46 4.3.5 Charakterisierung von Multizellulären Tumorspheroiden mittels Fluoreszenzfarbstoffen .. .......................................................................................................................................... 47 4.3.6 Testung des Behandlungseffekts über die Spheroidfläche im 3D-Ovarialkarzinommodell .......................................................................................................................................... 48 4.3.7 Translationaler Ansatz: Spheroidbildung von Asziteszellen im 3DOvarialkarzinommodell .................................................................................................... 48 4.4 Validierung der 2D-Ergebnisse im 3D-Ovarialkarzinommodell ........................................... 48 4.4.1 Einfluss des Chemotherapeutikums Paclitaxel auf die ADAM17-Aktivität .................... 48 4.4.2 Untersuchung des Einflusses einer zusätzlichen ADAM17-Inhibition zur konventionellen Chemotherapie ....................................................................................... 49 5 Zusammenfassung...............................................................................................................51 6 Literaturverzeichnis ........................................................................................................... 52 7 Anhänge ............................................................................................................................... 59 7.1 Publikationsverzeichnis ............................................................................................................. 59 7.2 Danksagung ................................................................................................................................ 60 7.3 Akademischer Lebenslauf ......................................................................................................... 61 III Abkürzungsverzeichnis 2D zweidimensional 3D dreidimensional ADAM A Disintegrin And Metalloprotease AREG Amphiregulin AT Österreich BCT Betacellulin BG-1 Bowman Gray-1 BRCA1 BReast CAncer 1 BRCA2 BReast CAncer 1 bzw. beziehungsweise CH Schweiz cm Zentimeter D Deutschland DNK Dänemark EdU 5-ethynyl-2´-deoxyuridine EGFR Epidermal Growth Factor Receptor EREG Epiregulin ERKs Extracellular Signal-Regulated Kinases FCS Fetal Calf Serum (Fötales Kälberserum) FIGO Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique GF-AFC Gly-Phe-7-Amino-4-trifluormethylcumarin GI GI254023X GW GW280264X HB-EGF Heparin-binding EGF-like growth factor HER Human Epidermal Growth Factor Receptor HRP Horseradish Peroxidase K Kelvin MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase ml Milliliter IV MT Multizelluläres Tumorspheroid MTM Multizelluläres Tumorspheroidmodell NL Niederlande nm Nanometer L Liter OvCa Ovarialkarzinom PARP Poly(ADP-ribose)-Polymerase Pen.-Str. Penicillin-Streptomycin PI Propidiumiodid PI3K Phosphatidylinositol 3-Kinase PKC Proteinkinase C PLCγ Phospholipase Cγ Raf Rapidly accelerated fibrosarcom Ras Rat sarcoma RLU Relative Light Units s. siehe SD Standard Deviation (Standardabweichung) STAT Signal Transducers and Activators of Transcription Std. Stunden TACE Tumor Necrosis Factor (TNF)-α-Converting Enzyme TNF Tumor Necrosis Factor TNM Tumor-Nodus-Metastasen U Units UK Vereinigtes Königreich ULA Ultra Low Attachment USA Vereinigte Staaten von Amerika VEGF Vascular Endothelial Growth Factor µg Mikrogramm µm Mikrometer µM Mikromolar µl Mikroliter °C Grad Celsius V Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Aufbau des Multizellulären Tumorspheroid-Modells……………………9 Abbildung 2: Dynamik der Wachstumsfaktorfreisetzung von AREG in Abhängigkeit der Paclitaxelkonzentration……………………………………………...24 Abbildung 3: Die zusätzliche Inhibition von ADAM17 führt zu einer reduzierten Zellviabilität und einer erhöhten Caspaseaktivität…………………………..26 Abbildung 4: Parentale und resistente BG-1-Ovarialkarzinomzellen bilden unterschiedlich konfigurierte Tumorspheroide aus……………………………..27 - 28 Abbildung 5: Einfluss der Zellzahl auf den Spheroiddurchmesser…………………….29 ……………………………… Abbildung 6: Veränderung der Fluoreszenzintensität über die Zeit ohne Mediumwechsel…………………………………………………………30 Abbildung 7: Testung der Spheroiduniformität………………………………………..31 Abbildung 8: Nachweis von Zell-Zell-Kontakten und eines Proliferationsgradienten..32 Abbildung 9: Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung von Zellviabilität und Zelltod …………………………………………………………………………..33 Abbildung 10: Quantifizierung des Behandlungseffekts über die Spheroidfläche und Darstellung der veränderten Zellarchitektur nach Paclitaxelbehandlung…...34 Abbildung 11: Asziteszellen sind zur Ausbildung von Multizellulären Tumorspheroiden befähigt………………………………………………………………….35 Abbildung 12: Einfluss der Paclitaxelbehandlung auf die AREG-Freisetzung im Multizellulären Tumorspheroid.……………………………………………....37 Abbildung 13: Visualisierung und Quantifizierung von Behandlungseffekten der Kombinationsbehandlung……………………………………………….39 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Stadieneinteilung des OvCa nach FIGO und TNM……………………………3 - 4 1 1 Einleitung 1.1 Ovarialkarzinom 1.1.1 Epidemiologie, Risikofaktoren und Protektivfaktoren Im Jahr 2016 wurden 7350 Neuerkrankungen des Ovarialkarzinoms (OvCa) in Deutschland verzeichnet [1]. Die Inzidenz dieser Tumorentität beläuft sich auf etwa 8-10 Neuerkrankungen pro 100.000 Frauen jährlich [2]. Damit ist das OvCa das dritthäufigste gynäkologische Karzinom hinter dem Mammaund Endometriumkarzinom sowie das achthäufigste Karzinom der Frau. Unter den gynäkologischen Tumoren weist das OvCa mit einer relativen 5-Jahres-Überlebensrate von 43 % die höchste Letalität auf. Diese Tatsache ist neben einer unspezifischen klinischen Symptomatik [3] insbesondere auf den Mangel an effektiven Screeningmethoden [2] sowie dem häufig fortgeschrittenen Stadium bei Diagnosestellung (bei 76 % aller Patientinnen liegt das Stadium Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique (FIGO) III oder IV vor) zurückzuführen [1]. Die Erkrankung tritt am häufigsten postmenopausal auf, wobei das mittlere Erkrankungsalter 68 Jahre beträgt [1]. Als protektive Faktoren werden eine hohe Geburtenzahl, längere Stillzeiten, die Einnahme von Ovulationshemmern sowie der chirurgische Verschluss der Eileiter zur Sterilisation angesehen [3]. Zu den erwiesenen Risikofaktoren gehören demgegenüber neben zunehmendem Alter, Übergewicht, Kinderlosigkeit beziehungsweise Unfruchtbarkeit und Hormonersatztherapien nach der Menopause, insbesondere der Einsatz von Östrogenmonopräparaten. Darüber hinaus spielt auch die genetische Prädisposition eine bedeutsame Rolle. Insbesondere Frauen, deren Verwandte ersten Grades Brustoder Eierstockkrebs in ihrer Vorgeschichte aufweisen oder welche bereits in der Vergangenheit an Brust-, Gebärmutterkörperoder Darmkrebs erkrankt sind, haben ein gesteigertes Risiko am OvCa zu erkranken [3]. In etwa 10 – 15 % aller Fälle liegt ein hereditäres OvCa, bei dem die häufigsten genetischen Veränderungen in den Genen BReast CAncer 1 (BRCA1) sowie BReast Cancer 2 (BRCA2) auftreten. Entsprechend treten die meisten OvCa spontan ohne das Vorhandensein einer Keimbahnmutation auf [2]. Die Gene BRCA1 sowie BRCA2 sind funktionell bei der DNA-Reparatur bedeutsam und erhöhen bei Vorliegen einer Keimbahnmutation das Risiko bestimmter Tumorentitäten wie zum Beispiel des Ovarial-, Mammaund Prostatakarzinoms. Das Risiko bis zu einem Alter von 70 Jahren an einem OvCa zu erkranken liegt beim Nachweis einer BRCA1-Keimbahnmutation bei 40 – 50 % beziehungsweise bei BRCA2-Trägerinnen bei 10 – 20 % [4]. Typischerweise 8 anderen Studienarmen mit geringerer Dosis hingegen nicht auf. Der Inhibitor INCB7839 wird gegenwärtig im Rahmen der Phase 1 Studie NCT04295759 bei hochgradigen Gliomen untersucht. 1.3 Zweidimensionale und dreidimensionale Tumormodelle zur Testung onkologischer Therapieansätze 1.3.1 Zweidimensionale Zellkultivierung als in vitro-Tumormodell Die Entwicklung von zweidimensionalen (2D) Zellkulturen begann durch Pionierarbeiten von Roux im Jahre 1885 sowie von Harrison im Jahre 1907, welche die ersten in vitroKultivierungen von Zellen erfolgreich durchführten [42, 43]. Eine mögliche Anwendung ist die zwei-dimensionale Kultivierung von Tumorzellen als simplifiziertes Tumormodell. Zu den Vorteilen von zweidimensionalen Tumorzellkultivierungen zählen die leichte Durchführbarkeit, eine hohe Durchsatzgeschwindigkeit, ein geringer Kostenaufwand sowie die Kontrolle über verschiedene Faktoren der Tumormikroumgebung [44]. Demgegenüber stehen einige Nachteile, die besonders bei der Erforschung sowie Testung onkologischer Therapien von Bedeutung sind. Die dreidimensionale (3D) Tumorarchitektur, die in unserem menschlichen Organismus vorzufinden ist, findet in zweidimensionalen Zellkulturen keine Berücksichtigung. Aufgrund der flachen Beschaffenheit der Zellkulturflaschen zur Kultivierung von Tumorzellen ist die Ausbildung von interzellulären Kontakten sowie die Kommunikation unter den Zellen limitiert [44]. Darüber hinaus ist ein permanenter Zugang der Zellen zu Nährstoffen und Sauerstoff ermöglicht, welcher bei Tumoren in vivo durch eine insuffiziente Blutversorgung häufig eingeschränkt ist [44]. 1.3.2 Dreidimensionales Multizelluläres Tumorspheroidmodell (MTM) 1.3.2.1 Definition Unter Multizellulären Tumorspheroiden (MT) versteht man runde, dreidimensionale, aus Tumorzellen bestehende Aggregate, welche verschiedene Zonen bilden und tumorähnliche Eigenschaften aufweisen [45]. Die MT können aus einzelnen oder mehreren Zellarten aufgebaut sein. Unterschiedliche Begrifflichkeiten wie Sphären, Oncosphären, Spheroide, gemischte Spheroide, Heterospheroide, Tumoroide, Knoten und Organoide werden in Bezug auf die Kultivierung von runden, tumorähnlichen Strukturen verwendet. Eine allgemeingültige Definition respektive Nomenklatur hat sich in der Wissenschaft, ähnlich wie bei Organoiden 9 [46], bis dato nicht durchsetzen können [47]. Da es in der Literatur keine einheitliche Definition eines runden Aggregates von Tumorzellen gibt [48], werden in der vorliegenden Arbeit folgende Begriffe verwendet: Multizelluläres Tumorspheroid (MT) beziehungsweise Multizelluläres Tumorspheroid-Modell (MTM). 1.3.2.2 Eigenschaften des Multizellulären Tumorspheroidmodells Die Entwicklung des Multizellulären Tumorspheroid-Modells begann Anfang der 1970er Jahre durch eine Gruppe von Radiobiologen [49, 50]. In den äußeren drei bis fünf Zelllagen (75 µm) des MTM befindet sich eine Zone mit proliferierenden Zellen, welche an eine weiter zentral gelegene Zone angrenzt, in der sich vorwiegend ruhende Zellen befinden. Durch einen zum Zentrum hin fortschreitenden Mangel an Sauerstoff [51, 52], Nährstoffen sowie einer Akkumulation von Stoffwechselmetaboliten mit Bildung eines pH-Gradienten kommt es 50 bis 300 µm unterhalb der Oberfläche der Spheroids zu einer zentralen Nekrose (s. Abbildung 1) [44, 53]. 0₂, Nährstoffe, ATP C0₂, Azidose, Katabolite Proliferationszone Ruhende Zone Nekrotisches Zentrum 10 Abbildung 1: Aufbau des Multizellulären Tumorspheroid-Modells Die schematische Darstellung zeigt den aus mehreren Zonen bestehenden charakteristischen Aufbau eines MTM und die entstehenden Gradienten vom Zentrum bis zur Peripherie. Durch den Zugang zu Nährstoffen und Sauerstoff sind die Zellen der äußeren Zone durch Proliferation gekennzeichnet. Durch die abfallende Verfügbarkeit von Sauerstoff und Nährstoffen in Richtung des Zentrums kommt es erst zum Wachstumsarrest und einer Zone aus ruhenden Zellen, gefolgt von Zellnekrose (modifiziert nach Verjans et al. [54] sowie Lin und Chang [55]). Friedrich et al. erläuterten, dass die meisten Spheroide ab einer Größe von 500-600 µm eine zentrale sekundäre Nekrose ausbilden, dieses Phänomen aber nicht bei allen Zelllinien auftritt [48]. Die Ausbildung verschiedener Gradienten ist in ähnlicher Weise in Mikrometastasen, avaskulären Tumoren oder interkapillären Tumorregionen nachweisbar [48]. In einer 1988 veröffentlichten Arbeit beschrieben Sutherland et al. das multizelluläre Spheroidmodell, welches Mikrometastasen oder intervaskuläre Bereiche eines größeren Tumors in vitro imitieren könne und von der Komplexität zwischen der herkömmlichen 2D-Kultur und einem in vivoTumor einzuordnen sei [53]. Da Metastasen in mehr als 60 % aller Krebspatienten die Todesursache sind [56], könnte das MTM ein geeignetes Modell zur Evaluierung von onkologischen Therapien besonders fortgeschrittener Tumorerkrankungen darstellen. Des Weiteren eignet sich das MTM zur Erforschung von Tumorzellfunktionen sowie durch Ergänzung weiterer Zellarten der Angiogenese [57] und der Tumor-Immunzell-Interaktion [58]. Zusätzlich findet das MTM Anwendung in der Untersuchung von Chemotherapieresistenzen [59] sowie von strahlentherapeutischen Effekten [44]. 1.3.2.3 Unterschiede des Multizellulären Tumorspheroidmodells gegenüber 2D-Tumormodellen Obwohl nicht alle Zelllinien zur Ausbildung von 3D-Tumorspheroiden geeignet sind [59, 60] und das MTM im Vergleich zum zweidimensionalen Tumormodell verschiedene Nachteile wie höhere Kosten und einen erhöhten Zeitaufwand aufweisen [58], gibt es demgegenüber auch einige Vorteile. MT ermöglichen im Vergleich zu 2D-Tumormodellen die Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten im dreidimensionalen Raum und einer interzellulären, räumlichen Kommunikation. Deutliche Unterschiede zeigen sich durch den Einfluss der dreidimensionalen Architektur beispielsweise neben des morphologischen Phänotyps [61] in der Genexpression [62, 63]. Einige Studien konnten belegen, dass die Genexpression im MTM eher jener aus humanen Tumorgeweben als zweidimensional kultivierten Tumorzellen entspricht [60]. Außerdem konnte in einer Studie von Breslin und Kollegen gezeigt werden, dass 11 Brusttumorzellen in der 2D-Kultur einen veränderten morphologischen Phänotyp, ein verändertes Wachstumsverhalten, ein stärkeres Ansprechen auf eine antitumoröse Behandlung durch den Tyrosinkinaseinhibitor Neratinib und das Chemotherapeutikum Docetaxel verglichen mit den dreidimensionalen Tumorspheroiden aufweisen. Darüber hinaus konnte demonstriert werden, dass die Expression des EGFR, HER2 und HER3 in Spheroiden deutlich, des HER4 dagegen leicht erhöht ist. Darüber hinaus wurde eine erhöhte Expression des Effluxtransporters P-Glycoprotein festgestellt [64], welche zu einer erhöhten Resistenz gegenüber dem Chemotherapeutikum Paclitaxel führen kann [65]. Da beim OvCa die Entwicklung von Chemotherapieresistenz charakteristisch ist, ist die Eigenschaft einer erhöhten Resistenzbildung in MT gegenüber Chemotherapeutika vorteilhaft. Eine Studie von Loessner und Kollegen unterstreicht, dass MT im Vergleich zu zweidimensional kultivierten Tumorzellen resistenter gegenüber Chemotherapeutika sind. Die Zellviabilität von 3D-Ovarialkarzinom-Tumorspheroiden nach einer Behandlung mit Paclitaxel lag zwischen 40 - 60 %. Im Vergleich dazu führte die Behandlung von Tumorzellen im zweidimensionalen Monolayer zu einer Zellviabilität von 20 % [66]. 1.3.2.4 Methoden zur Herstellung von Multizellulären Tumorspheroiden Zur Herstellung von MT aus einer Einzelzellsuspension einer oder mehrerer Zelllinien beziehungsweise primärer Tumorzellen eignen sich unterschiedliche Methoden, welche dadurch gekennzeichnet sind, dass die Tumorzellen nicht an den Oberflächen des Zellkulturgefäßes adhärieren können. Durch die Zusammenlagerung der Zellen sowie der Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten prägt sich in der Regel nach einer Kultivierungszeit von ein bis sieben Tagen eine kugelförmige Struktur aus [47]. Diese Methoden zur Bildung von MT lassen sich in zwei Hauptgruppen einteilen: Scaffold-based MT und Scaffold-free MT [67]. Scaffold-based MT basieren auf einer Kultivierung in einer definierten Gerüststruktur aus biologischen oder synthetischen Polymeren. Zur Gruppe der biologischen Polymere gehören Agarose, Laminin, Kollagen, Vitronectin, Fibronectin und Gelatine [67]. Zudem gibt es auch Hydrogele wie Matrigel, das aus sekretierten Extrazellulärmatrixproteinen von Engelbreth-Holm-Swarm Sarkomzellen besteht. Demgegenüber stehen Gerüste aus synthetischen Polymeren, zu denen das synthetische Hydrogel Polyethylenglycol gehört [68]. Auf Grundlage dieser Polymere können MT unter Verwendung der Matrix-on-top-Methode, der Matrix-embedded-Methode, der Matrix-encapsulation-Methode, der Spinner flask-Methode oder unter Zuhilfenahme von Micropatterned plates kultiviert werden [67]. 12 Unter den Scaffold-free-Methoden zur Herstellung von MT lassen sich die Verwendung von Mikrotiterplatten mit ultraniedriger Anhaftung [69], die Hanging drop-Methode [70], die Liquid overlay-Methode unter Verwendung von Agar [71], Agarose [72] oder Polyhydroxyethylmethacrylate [73], die Magnetic levitationund 3D bioprinting-Methode einordnen [67]. 1.4 Zielsetzung der Arbeit Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss des Chemotherapeutikums Paclitaxel auf die Aktivität von ADAM17 zu untersuchen. Dies erfolgte über eine Quantifizierung des freigesetzten ADAM17-Substrates AREG. Folgende Fragestellung sollte in den Fokus der Untersuchungen gestellt werden: 1) Führt eine Behandlung mit Paclitaxel zu einer ADAM17-Aktivierung? Im zweiten Teil der Arbeit sollte darüber hinaus die Wirksamkeit einer Kombinationsbehandlung aus dem Chemotherapeutikum Paclitaxel sowie einer ADAM17-Inhibition analysiert werden. In diesem Kontext sollte folgende Fragestellung untersucht werden: 2) Ist eine Kombinationsbehandlung aus Paclitaxel und einer ADAM17-Inhibition einer Einzelbehandlung aus Paclitaxel bezüglich der Zellviabilität und Caspaseaktivität überlegen? Zweidimensionale Tumormodelle können bei der Testung onkologischer Therapieansätze zwar eine erste Evaluierung der Wirksamkeit ermöglichen, bilden aber die Komplexität von in vivo-Tumoren nur eingeschränkt ab. Aus diesem Grund wurde im dritten Teil dieser Arbeit zur Validierung der Ergebnisse aus der zweidimensionalen Kultur ein 3D-OvarialkarzinomTumorspheroidmodell etabliert. Dazu wurden aus der Gruppe der Scaffold-free-Methoden Mikrotiterplatten mit ultraniedriger Anhaftung ausgewählt. Im Anschluss an die Etablierung des 3D-Ovarialkarzinommodells wurden folgende Fragestellungen untersucht: 3) Kann durch die dreidimensionale Architektur der Zellen der Einfluss von Paclitaxel auf die ADAM17-Aktivität gegenüber der 2D-Kultur verändert werden? 4) Ist eine Kombinationsbehandlung aus Paclitaxel und einer ADAM17-Inhibition einer Einzelbehandlung aus Paclitaxel hinsichtlich der Zellviabilität und Caspaseaktivität auch im MT überlegen? In einem translationalen Ansatz sollte zudem untersucht werden, ob die Kultivierung primärer Ovarialkarzinom-Tumorzellen im MTM möglich ist. 13 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Chemotherapeutika Chemotherapeutikum Hersteller Konzentration Paclitaxel UKSH Apotheke, Kiel, Deutschland (D) 1,71 mg ad 20 ml NaCl 0,9 %, 5 mg ad 5 ml NaCl 0,9 %, 4,25 mg ad 5 ml NaCl 0,9 % 2.1.2 Inhibitoren und deren Lösungsmittel Bezeichnung Hersteller GI254023X (GI) Aobious, Gloucester, Vereinigte Staaten von Amerika (USA) GW280264X (GW) Aobious, Gloucester, USA DMSO SIGMA-Aldrich Chemie, Steinheim, D 2.1.3 Antibiotika Bezeichnung Hersteller Konzentration Penicillin PAA Laboratories, Pasching, Österreich (AT) 30.000 U ad 500 ml RPMI-1640 Streptomycin PAA Laboratories, Pasching, AT 30.000 µg ad 500 ml RPMI-1640 2.1.4 Fluoreszenzfarbstoffe Bezeichnung Hersteller Calcein-AM 50 µg BioLegend, San Diego, USA Propidiumiodid 0,5 mg/ml BioLegend, San Diego, USA Hoechst 33342 100 mg (5 mg/ml in H2O) Invitrogen, Waltham, USA 14 2.1.5 Pipetten Bezeichnung Hersteller Eppendorf Research 0.1-10 μl Eppendorf, Hamburg, D Eppendorf Research 10-200 μl Eppendorf, Hamburg, D Eppendorf Research 100-1000 μl Eppendorf, Hamburg, D Multikanal Eppendorf Research plus 100 µl Eppendorf, Hamburg, D Multikanal Finnpipette 200 µl Thermo Fischer Scientific, Waltham, USA Pipetboy Hirschmann, Eberstadt, D 2.1.6 Verbrauchsmaterialien Bezeichnung Hersteller NUNC-IMMUNO Platten (442404) Thermo Scientific, Rochester, USA Serologische Pipetten 5 ml / 10 ml / 25 ml / 50 ml Sarstedt, Nümbrecht, D BiosphereⓇ Filter Tips Pipettenspitzen 0,1 – 20 µl / 2 – 100 µl / 100 – 1000 µl Sarstedt, Nümbrecht, D Röhrchen 15 ml / 50 ml Sarstedt, Nümbrecht, D SafeSeal Reagiergefäße 2 ml Sarstedt, Nümbrecht, D Reagiergefäße 1,5 ml Sarstedt, Nümbrecht, D RotilaboⓇ-Reaktionsgefäße schwarz Carl Roth, Karlsruhe, D Pasteurpipetten 230 mm (No. 40567002) Glaswarenfabrik Karl Hecht, Sondheim vor der Rhön, D Zellkulturflasche T75 Sarstedt, Nümbrecht, D Filtropur V50 500 ml, 0,2 µm Vakuumfiltrationseinheit Sarstedt, Newton, USA FinntipTM Pipettenspitzen 1000 µl Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA Simport Cryovial Biozym, Oldendorf, D 4515, 96 Well Black, Ultra Low Attachment (ULA) Corning, Kennebunk, USA 7007 Clear, ULA Corning, Kennebunk, USA Cellstar® 6 Well Multiwell Platten Th. Geyer, Hamburg, D 96 Well Zellkulturplatte (83.3924.500) Sarstedt, Nümbrecht, D 2.1.7 Chemikalien und Reagenzien Bezeichnung Hersteller Phosphate buffer solution (PBS (14190094)) Life Technologies, Darmstadt, D VLE-RPMI 1640 Medium 500 ml (F 1415) Biochrom, Berlin, D Trypsin EDTA Solution 100 ml (R001100) Life Technologies, Darmstadt, D 15 Bovine serum albumin (BSA) fraction V Carl Roth, Karlsruhe, D Isotone Natriumchlorid-Lösung 0,9 % BC Berlin Chemie, Berlin, D OmniPur® WFI Quality Water Sterile Filtered 1L EMD Millipore, Billerica, USA Fötales Kälberserum (FCS) Gibco, Brasilien 2.1.8 Kulturmedium Bezeichnung Bestandteile BG-1-Kulturmedium + RPMI 1640 mit L-Glutamin + 10 % FCS + 30.000 U Penicillin + 30.000 µg Streptomycin BG-1 Paclitaxel res.-Kulturmedium + RPMI 1640 mit L-Glutamin + 10 % FCS + 30.000 U Penicillin + 30.000 µg Streptomycin + 40 ng/ml Paclitaxel 2.1.9 Kits Bezeichnung Hersteller ApoLive-Glo™ Multiplex Assay Promega, Madison, USA Humaner Amphiregulin DuoSet ELISA R&D Systems, Minneapolis, USA CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay Promega, Madison, USA CellTiter-Glo® 2.0 Cell Viability Assay Promega, Madison, USA CellToxTM Green Cytotoxicity Assay Promega, Madison, USA RealTime-GloTM MT Cell Viability Assay Promega, Madison, USA 2.1.10 Geräte Bezeichnung Hersteller Typ 1003 Wasserbad GFL, Burgwedel, D HERAcell 150i CO2-Inkubator Thermo Scientific, Schwerte, D Forma Scientific 3121 Thermo Scientific, Pinneberg, D Type TC48 Sterilbank GELAIRE, Meckenheim, D NuAire Class II Sterilbank NuAire Laboratory Equipment Supply, Plymouth, USA Öko super glass line (4 °C und - 20 °C) Liebherr, Ochsenhausen, D 16 SCANLAF Mars safety Class2 Sterilbank LaboGene, Allerød, Dänemark (DNK) Vakuumpumpe KNF Neuberger, Freiburg, D Stuart SRT9 Gefäßroller Cole-Parmer, Staffordshire, Vereinigtes Königreich (UK) Vortex Genie 2 Scientific Industries, New York, USA VIP5 Tissue Tek P3624 Sakura Finetek Europe, Alphen aan den Rijn, NL Axiovert 25 Zeiss, Schönkirchen, D NYONE® Scientific SYNENTEC GmbH, Elmshorn, D Heraeus Multifuge 3 Thermo Scientific, Schwerte, D Heraeus Fresco 17 Thermo Scientific, Schwerte, D Rotina 420R Hettich, Tuttlingen, D Infinite M200 PRO microplate reader TECAN, Männedorf, Schweiz (CH) Neubauerzählkammer (MA/0640030+) Geyer, Hamburg, D 2.1.11 Computerprogramme Bezeichnung Hersteller Excel für Mac Version 16.3 Microsoft, Redmond, USA i-control Version 2.0 TECAN, Männedorf, CH YT®-Software Version 3.0.13495 SYNENTEC, Elmshorn, D 2.1.12 Zelllinien Bezeichnung Hersteller BG-1 American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia, USA BG-1 Paclitaxel resistent In unserem Labor hergestellte Paclitaxelresistente Subpopulation der BG-1-Zelllinie 2.1.13 Primäre Zellen Bezeichnung Herkunft UF-164 Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfe des Universitätsklinikums Schleswig-Holstein, Campus Kiel 17 2.2 Methoden 2.2.1 Zellkultivierung Zur Kultivierung von Tumorzelllinien wurde ein Kryoröhrchen der jeweiligen Zelllinie aus einem Stickstoffbehälter entnommen, der flüssigen Stickstoff bei -196 °C (77 K) beinhaltete. Die Zellsuspension in Kryomedium aus 10 % DMSO und 90 % RPMI-1640-Medium wurde nach zügigem Auftauen im Wasserbad in ein Schraubröhrchen mit 10 ml vorgewärmten Bowman Gray (BG)-1 Kulturmedium aus RPMI-1640-Medium, 10 % fetalen Kälberserum und Penicillin-Streptomycin (Pen.-Str.) (30.000 U Pen. /30.000 mg Str. je 500 ml RPMI-1640) transferiert. Zur Entfernung des zytotoxischen DMSO wurde nach fünfminütiger Zentrifugation bei 1250 Umdrehungen pro Minute der Überstand abgesaugt und 3 ml vorgewärmtes BG-1 Zellkulturmedium hinzugefügt. Nach dem Resuspendieren erfolgte die Überführung der Zellen in eine Zellkulturflasche, die 10 ml vorgewärmtes BG-1-Kulturmedium enthielt. Die Zellen wurden nun in einer Zellkulturflasche in einem Brutschrank bei 37 °C Umgebungstemperatur und 5 % CO2 kultiviert. Zweimal wöchentlich wurde eine Passagierung der Zellen bei einer Konfluenz von etwa 80 % durchgeführt. Dazu wurden zunächst der Überstand mittels einer Vakuumpumpe und anschließend nicht-adhärente Zellen nach einem Spülvorgang durch Zugabe von 5 ml PBS abgesaugt. Um adhärente Zellen zu lösen, wurden 4 ml der Proteaselösung Trypsin-EDTA in PBS hinzugegeben und für 5 Minuten im Brutschrank inkubiert. Die eingeleitete Reaktion wurde durch Zugabe von 6 ml BG-1 Zellkulturmedium gestoppt. Zur Entfernung der Trypsin-Lösung wurden die Zellen in ein 50 ml-Röhrchen überführt, bei 1250 Umdrehungen pro Minute für 5 Minuten zentrifugiert und nach Abnahme des Überstandes 10 ml vorgewärmtes BG-1-Kulturmedium hinzugefügt. Nach dem Resuspendieren der Zellen wurden diese im Verhältnis 1:5 in zwei neue Kulturflaschen mit einem Gesamtvolumen von jeweils 10 ml durch Zufügen von BG-1-Kulturmedium aufgeteilt. Die gesamte Zellkultivierung erfolgte an einer Sterilbank. 2.2.2 Versuchsaufbau der zweidimensionalen Zellkulturexperimente 750.000 parentale BG-1-Zellen oder 1,5 Mio. Paclitaxel-resistente BG-1-Zellen wurden nach einer automatisierten Zellzahlbestimmung mittels des NYONE® Scientific in 2 ml BG-1Kulturmedium respektive 2 ml BG-1-Kulturmedium mit einer Paclitaxelkonzentration von 40 ng/ml in einer 6-Well-Platte ausgesät und bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Nach der Aussaat wurde das Zellwachstum jede 24 Stunden durch Aufnahmen mittels des automatisierten 24 ADAM17-Aktivität mit steigenden Paclitaxelkonzentrationen nicht nachzuweisen, jedoch kann eine zusätzliche Inhibierung von ADAM17 die basale Freisetzung von AREG reduzieren. Abbildung 2: Dynamik der Wachstumsfaktorfreisetzung von AREG in Abhängigkeit der Paclitaxelkonzentration (A) Parentale BG-1-Ovarialkarzinomzellen wurden nach einer Kultivierungszeit von 24 Stunden für insgesamt 48 Stunden mit Paclitaxel und dem ADAM10-Inhibitor GI oder dem kombinierten ADAM10und ADAM17-Inhibitor GW beziehungsweise einer Lösungsmittelkontrolle aus DMSO behandelt. Die AREG-Konzentration im Überstand wurde im Anschluss an die Behandlung mittels ELISA quantifiziert. (B) Das Experiment wurde analog zu (A) mit Paclitaxel-resistenten BG-1-Ovarialkarzinomzellen durchgeführt und die AREG-Konzentration nach der Behandlung entsprechend ermittelt. Die Abbildungen zeigen jeweils die Mittelwerte drei voneinander unabhängiger Experimente ± SD. 3.1.2 Eine ADAM17-Inhibition sensitiviert BG-1-Ovarialkarzinomzellen gegenüber Paclitaxel Um den Effekt einer Kombinationsbehandlung aus einer ADAM17-Inhibition sowie Paclitaxel vergleichend mit einer Einzelbehandlung aus Paclitaxel zu untersuchen, wurden parentale und resistente Ovarialkarzinomzellen neben unterschiedlichen Konzentrationen Paclitaxel zusätzlich mit dem ADAM10-Inhibitor GI oder dem kombinierten ADAM10und ADAM17Inhibitor GW beziehungsweise einer Lösungsmittelkontrolle aus DMSO für insgesamt 48 Stunden behandelt. Der Behandlungseffekt wurde über die Zellviabilität sowie die Caspaseaktivität quantifiziert. Bei den parentalen Zellen zeigte sich ein deutlich stärkerer Behandlungseffekt der Kombinationsbehandlung aus GW und Paclitaxel gegenüber der Behandlung mit GI und BG-1 (parental) BG-1 (Paclitaxel-resistent) BG-1 (parental) BG-1 (Paclitaxel-resistent) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 00,025 0,05 0,1 0,5 1 5 10 AREG-Konzentration [pg/ml] Paclitaxel-Konzentration [µM] DMSO GI GW 0 50 100 150 200 250 300 350 400 00,025 0,05 0,1 0,5 1 5 10 AREG-Konzentration [pg/ml] Paclitaxel-Konzentration [µM] DMSO GI GW A BG-1 (parental) BG-1 (Paclitaxel-resistent) B 25 Paclitaxel sowie der Kontrolle. Dieser Effekt war hinsichtlich der Zellviabilität als auch der Caspaseaktivität messbar. Die Kombinationsbehandlung aus Paclitaxel und GW führte zu einer etwa durchschnittlich zweifachen Erhöhung der Caspaseaktivität sowie einer Reduktion der Zellviabilität um den Faktor 0,5 im Vergleich zur Kontrollbehandlung. Die Paclitaxel-resistenten BG-1-Zellen zeigten innerhalb jedes Behandlungsansatzes trotz steigender Paclitaxelkonzentrationen bis zu 0,5 µM kaum eine Verminderung der Zellviabilität sowie Erhöhung der Caspaseaktivität. Außerdem konnte bei den Paclitaxel-resistenten BG-1Zellen beobachtet werden, dass erst Paclitaxelkonzentrationen größer gleich 5 µM eine deutliche Abnahme der Zellviabilität respektive Erhöhung der Caspaseaktivität induzieren. Die Zellviabilität konnte durch die zusätzliche Behandlung mit GW um durchschnittlich etwa 20 % reduziert werden, die Caspaseaktivität im Vergleich zur Kontrollbehandlung um durchschnittlich 34 % gesteigert werden. Bei der höchsten Paclitaxelkonzentrationen von 10 µM war der stärkere Behandlungseffekt der Kombinationsbehandlung aus einer ADAM17Inhibition und Paclitaxel mit einer Steigerung der Caspaseaktivität um 63 % im Vergleich zur Kontrolle besonders stark ausgeprägt. Bemerkenswert ist auch das Resultat, dass bereits eine Einzelbehandlung mit GW ohne Paclitaxel bei parentalen und resistenten BG-1-Zellen zu einer deutlichen Abnahme der Zellviabilität (Abnahme bei parentalen Zellen um 30 %, bei resistenten Zellen um 23 %) sowie einer Zunahme der Caspaseaktivität (Zunahme bei parentalen Zellen um 50 %, bei resistenten Zellen um 31 %) im Vergleich zur Kontrollbehandlung aus DMSO und NaCl führte. Zusammenfassend unterstreichen diese Ergebnisse, dass eine Kombinationsbehandlung aus Paclitaxel und einer ADAM17-Inhibition eine vergleichsweise stärker verminderte Zellviabilität sowie erhöhte Apoptoserate und damit einen stärkeren Behandlungseffekt im Vergleich zur Einzelbehandlung mit Paclitaxel bewirkt. Die Ergebnisse bestätigen dies sowohl für parentale als auch resistente BG-1-Tumorzellen. 26 Abbildung 3: Die zusätzliche Inhibition von ADAM17 führt zu einer reduzierten Zellviabilität und einer erhöhten Caspaseaktivität Parentale (A, B) sowie Paclitaxel-resistente (C, D) BG-1-Ovarialkarzinomzellen wurden nach einer 24-stündigen Kultivierungszeit mit Paclitaxel und dem ADAM10-Inhibitor GI oder dem kombinierten ADAM10und ADAM17-Inhibitor GW oder einer Lösungsmittelkontrolle mit DMSO für insgesamt 48 Stunden behandelt. Der Behandlungseffekt wurde über die Zellviabilität sowie die Caspaseaktivität anschließend quantifiziert. Die Abbildungen zeigen jeweils die Mittelwerte drei voneinander unabhängiger Experimente ± SD. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 00,025 0,05 0,1 0,5 1 5 10 AREG-Konzentration [pg/ml] Paclitaxel-Konzentration [µM] DMSO GI GW 0 50 100 150 200 250 300 350 400 00,025 0,05 0,1 0,5 1 5 10 AREG-Konzentration [pg/ml] Paclitaxel-Konzentration [µM] DMSO GI GW A B B C D A 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000 1600000 00,025 0,05 0,1 0,5 1 5 10 Normalisierte Caspaseaktivität Paclitaxelkonzentration [µM] DMSO GI GW 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 800000 900000 00,025 0,05 0,1 0,5 1 5 10 Normalisierte Caspaseaktivität Paclitaxelkonzentration [µM] DMSO GI GW 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 00,025 0,05 0,1 0,5 1 5 10 Zellviabilität [Relative Light Units (RLU)] Paclitaxelkonzentration [µM] DMSO GI GW 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 00,025 0,05 0,1 0,5 1 5 10 Zellviabilität [RLU] Paclitaxelkonzentration [µM] DMSO GI GW BG-1 (parental) BG-1 (parental) BG-1 (Paclitaxel-resistent) BG-1 (Paclitaxel-resistent) C D A B 27 3.2 Etablierung eines 3D-Ovarialkarzinommodells 3.2.1 BG-1-Ovarialkarzinomzellen können Multizelluläre Tumorspheroide ausbilden Ziel der Untersuchung war es zu überprüfen, ob parentale und resistente BG-1-Ovarialkarzinomzellen zur Ausbildung von MT befähigt sind. Hierzu wurden parentale oder resistente BG-1-Zellen in ULA-Platten für 144 Stunden kultiviert und im Anschluss daran erfolgte eine Aufnahme im Hellfeld durch das automatisierte Mikroskop NYONEⓇ Scientific. Dabei zeigte sich, dass sowohl parentale als auch resistente BG-1-Zellen MT ausbilden können (s. Abbildung 4). Unterschiede lassen sich insbesondere hinsichtlich des Kompaktheitsgrades der Tumorzellen feststellen. Interessanterweise waren parentale BG-1 Zellen dazu fähig, kompakte MT auszubilden, während resistente BG-1-Zellen ein lockeres morphologisches Erscheinungsbild aufwiesen. Da eine lockere Struktur möglicherweise mit einer verminderten Ausprägung der charakteristischen Eigenschaften eines MT wie der Ausbildung diverser Gradienten von der Oberfläche zum Zentrum hin und mit einer erhöhten Penetration von Wirkstoffen assoziiert ist, wurden die Experimente der vorliegenden Arbeit mit parentalen BG-1-Zellen durchgeführt. B A B A C C 28 Abbildung 4: Parentale und resistente BG-1-Ovarialkarzinomzellen bilden unterschiedlich konfigurierte Tumorspheroide aus 4000 parentale (A) und resistente (B) BG-1-Zellen wurden jeweils in einer ULA-Platte ausgesät. Nach 96 Stunden erfolgte ein Mediumwechsel und nach weiteren 48 Stunden diese repräsentative Aufnahme bei 10-facher Vergrößerung. Der Maßstab zeigt eine Länge von 500 µm. Zur Beobachtung des Größenwachstums der MT über die Zeit wurden 350 parentale BG-1-Zellen ausgesät. Das Spheroidwachstum eines repräsentativen Spheroids wurde fortlaufend 24-stündlich mittels des NYONEⓇ Scientific bei 10-facher Vergrößerung aufgenommen (C). Der Maßstab zeigt hier eine Länge von 200 µm. Abbildung (D) zeigt korrespondierend zum Versuch in (C) eine repräsentative Auswertung des durchschnittlichen Spheroiddurchmessers im zeitlichen Verlauf von 24 bis 144 Stunden nach Zellaussaat. 3.2.2 Zellzahltestung zur Herstellung Multizellulärer Tumorspheroide definierter Zielgröße Ab einer Größe von 500 µm können MT neben einem nekrotischen Zentrum verschiedene Zonen (s. Abbildung 1) und charakteristische Gradienten ausbilden [47]. Das Ziel dieser Untersuchung war es, MT zu erzeugen, die nach 144 Stunden Kultivierungszeit ohne Durchführung einer Behandlung einen Durchmesser zwischen 500 und 650 µm aufweisen. Um eine geeignete Zellzahl zum Erreichen dieser vordefinierten Zielgröße zu ermitteln, wurden zwischen 100 und 2250 parentale BG-1-Zellen (s. Abbildung 5) ausgesät. Diese Spannweite wurde basierend auf dem Versuch unter 3.2.1 festgelegt. Wie Abbildung 5 zu entnehmen ist, eignet sich eine Zellzahl von 100 BG-1-Ovarialkarzinomzellen, um die vordefinierte Spheroidgröße zu erreichen. Bei dieser Zellzahl wurde auf Basis technischer Triplikate ein Mittelwert des Durchmessers von 548,15 µm erzielt. Bei Verwendung der Mikrotiterplatte mit ultraniedriger Anhaftung des Herstellers Corning (Produktnummer 4515) hingegen ist zum Erreichen der vordefinierten Spheroidgröße eine Zellzahl von 350 BG-1-Zellen nötig (s. Abbildung 4). 0 100 200 300 400 500 600 700 24 48 72 96 120 144 Durchschnittlicher Spheroiddurchmesser [µm] Kultivierungszeit [Stunden] Spheroidentwicklung D 29 Abbildung 5: Einfluss der Zellzahl auf den Spheroiddurchmesser Zur Ermittlung einer geeigneten Zellzahl, um MT einer definierten Zielgröße zu kultivieren, wurden die angegebenen Zellzahlen (100, 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250) ausgesät. Nach einer Kultivierungszeit von 144 Stunden wurden mikroskopische Aufnahmen mittels des NYONEⓇ Scientific generiert und der durchschnittliche Durchmesser der MT wurde über die YT®-Software ermittelt. Die Abbildung zeigt jeweils die Mittelwerte des Spheroiddurchmessers drei technischer Replikate ± SD. 3.2.3 Testung zur Ermittlung einer angemessenen Kultivierungszeit der Multizellulären Tumorspheroide bis zur Durchführung eines Mediumwechsels Um eine angemessene Kultivierungszeit für Tumorspheroide bis zum Zeitpunkt des Mediumwechsels zu ermitteln, wurden 350 BG-1-Ovarialkarzinomzellen ausgesät und für insgesamt 216 Stunden ohne Mediumwechsel kultiviert. Neben der Quantifizierung des Zelltods durch den CellToxTM Green Cytotoxicity Assay wurde das Spheroidwachstum mikroskopisch im zeitlichen Verlauf analysiert. Dabei zeigte sich wie Abbildung 6 zu entnehmen ist, dass die Zytotoxizität bis zu einer Kultivierungszeit von 144 Stunden auf einem nahezu konstanten Level verblieb und erst ab diesem Zeitpunkt begann anzusteigen. Nach 216 Stunden zeigte das Spheroid bereits ein lockeres morphologisches Erscheinungsbild, sodass die automatisierte Erkennung der Spheroidgrenze mittels der YT®-Software nicht mehr möglich war und infolgedessen keine Fluoreszenzintensitätszunahme analog zu den mikroskopischen Aufnahmen gemessen wurde. Morphologische Einzelzellveränderungen, die möglicherweise durch den Mangel an Nährstoffen im Medium über die Zeit auftreten könnten, waren mikroskopisch nicht erkennbar. Zudem erbrachten auch die Veränderungen des Spheroidwachstums über die Zeit keinen Hinweis auf einen optimalen Zeitpunkt des Mediumwechsels. Zusammenfassend lässt sich durch dieses Ergebnis feststellen, dass zur Spheroidbildung aus 350 BG-1-Zellen ein Mediumwechsel nach spätestens 144 Stunden erfolgen sollte. 0 500 1000 1500 2000 2500 100 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 Spheroiddurchmesser [µm] Zellzahl Zellzahltest 30 Abbildung 6: Veränderung der Fluoreszenzintensität über die Zeit ohne Mediumwechsel Um einen möglichst optimalen Zeitpunkt des ersten Mediumwechsels zu ermitteln, wurden 350 parentale BG-1-Zellen je Well in ULA-Platten ausgesät. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurde die Spheroidentwicklung repräsentativ im Hellfeld bei 10-facher Vergrößerung mikroskopisch aufgenommen. Nach 24-stündiger Kultivierungszeit wurde der CellToxTM Green Cytotoxicity Assay zur Quantifizierung des Zelltods über die Zeit angewendet, wodurch fortlaufend parallel Fluoreszenzaufnahmen mittels des NYONEⓇ Scientific erzeugt werden konnten (A: A: Hellfeld, B: Fluoreszenzaufnahmen, C: Überlagerung). Zudem wurde die durchschnittliche Fluoreszenzintensität eines Spheroids über die Zeit korrespondierend zu dem Versuch in (A) mittels der YT®-Software bestimmt (B). 3.2.4 Testung der Spheroiduniformität Zur Quantifizierung von Behandlungseffekten ist es erforderlich, dass Spheroide am Tag der Behandlung eine möglichst hohe Uniformität hinsichtlich des Durchmessers aufweisen. In dieser Untersuchung wurden 350 parentale BG-1-Zellen je Well ausgesät und nach einer 96-stündigen Kultivierungszeit wurde der Spheroiddurchmesser gemessen. Wie die Ergebnisse in Abbildung 7 zeigen, ist es unter diesen Versuchsbedingungen möglich, uniforme Spheroide mit einem Mittelwert des Spheroiddurchmessers von 395,9 µm und einer Standardabweichung von 22,7 µm zu bilden. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 24 48 72 96 120 144 168 192 216 Normalisierte durchschnittliche Fluoreszenzintensität Kultivierungszeit [Stunden] Fluoreszenzintensitätsentwicklung B A 31 Abbildung 7: Testung der Spheroiduniformität Zur Testung der Uniformität von Spheroiden wurden 350 parentale BG-1-Zellen je Well ausgesät und nach 96 Stunden Kultivierungszeit der jeweils durchschnittliche Spheroiddurchmesser von n=96 Spheroiden durch die YT® -Software gemessen. Im Diagramm ist eine Punktwolke abgebildet, in der jeder Punkt einen Messwert darstellt. Der Mittelwert ist über die breitere mittlere Linie innerhalb der Punktwolke, die Standardabweichung ist über die beiden außen liegenden Linien dargestellt. 3.2.5 Ovarialkarzinomzellen bilden im Multizellulären Tumorspheroid Zell-ZellKontakte und einen Proliferationsgradienten aus Zur Darstellung und zum Nachweis von Zell-Zell-Kontakten sowie eines Proliferationsgradienten innerhalb von MT wurde zunächst ein Versuchsprotokoll etabliert. Es wurden 4000 parentale BG-1-Ovarialkarzinomzellen in einer ULA-Platte ausgesät und nach einer Zellkultivierungszeit von insgesamt 144 Stunden erfolgte die histologische Aufarbeitung. Im Anschluss daran wurde eine Färbung mit Hämatoxylin-Eosin sowie eine immunhistochemische Färbung des epithelialen Markers E-Cadherin und des Proliferationsmarkers Ki-67 durchgeführt. Diese Untersuchung zeigte, dass die epithelialen Ovarialkarzinomzellen innerhalb eines MTs in einem dichten Zellverband angeordnet sind (Abbildung 8A). Der Pfeil in Abbildung 8A zeigt einen vermutlich artifiziellen Bereich, in dem Zellkontakte durch die histologische Aufarbeitung gelöst wurden. Darüber hinaus konnte eine starke membranständige E-CadherinExpression nachgewiesen werden. Der epitheliale Phänotyp blieb auch in Bereichen erhalten, die deutlich über 50 µm unter der Oberfläche des MT liegen (Abbildung 8B). Zusätzlich konnte über die Expression des Proliferationsmarkers Ki-67 gezeigt werden, dass sich innerhalb der Tumorspheroide ein abnehmender Proliferationsgradient von der Zelloberfläche hin zum Inneren des MT ausbildet. Zusammenfassend zeigen diese Untersuchungen, dass parentale BG-1-Ovarialkarzinomzellen nach einer Kultivierungszeit von 144 Stunden dichte Zell-Zell-Kontakte innerhalb des MT n=96 Durchschnittlicher Spheroiddurchmesser [µm] 500 450 400 300 250 350 Uniformitätstestung 32 ausbilden. Zudem lässt sich in diesen eine charakteristische Ausbildung eines Proliferationsgradienten nachweisen. Abbildung 8: Nachweis von Zell-Zell-Kontakten und eines Proliferationsgradienten Insgesamt wurden 4000 parentale BG-1-Zellen nach einer Kultivierungszeit von 144 Stunden in einer ULA-Platte in Agarose und anschließend in Paraffin eingebettet. Daraufhin wurden Paraffinschnitte der MT angerfertigt und es erfolgte eine Färbung mit Hämatoxylin-Eosin (A) oder eine immunhistochemische Färbung des epithelialen Markers E-Cadherin (B) oder des Proliferationsmarkers Ki-67. Die mikroskopischen Aufnahmen wurden bei einer 20-fachen Vergrößerung aufgenommen und zeigen repräsentative MT-Anschnitte ohne Behandlung. Der Maßstab zeigt jeweils eine Länge von 50 µm. 3.2.6 Charakterisierung von Multizellulären Tumorspheroiden mittels Fluoreszenzfarbstoffen In dieser Untersuchung sollte mithilfe von Fluoreszenzfarbstoffen überprüft werden, ob MT aus parentalen BG-1-Ovarialkarzinomzellen ein charakteristisches Verteilungsmuster von vitalen und toten Zellen durch die entstehenden Gradienten vom Zentrum bis zur Peripherie aufweisen. Dazu wurden parentale BG-1-Zellen zunächst für insgesamt 144 Stunden kultiviert. Im Anschluss daran wurden die Fluoreszenzfarbstoffe Calcein-AM (grün fluoreszierender Farbstoff zur Anfärbung vitaler Zellen), PI (rot fluoreszierender Farbstoff zur Anfärbung toter Zellen) sowie Hoechst 33342 (blau fluoreszierender DNA-Farbstoff zur Kerngegenfärbung) hinzugefügt und es wurden fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen bei einer 10-fachen Vergrößerung mittels des automatisierten Mikroskops NYONEⓇ Scientific erstellt. Eine hohe Fluoreszenzintensität von Hoechst 33342 sowie Calcein-AM war insbesondere im Randbereich der MT festzustellen. Im zentralen Bereich hingegen war eine leicht verstärkte Fluoreszenzintensität von PI zu verzeichnen. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse auf einen charakteristischen Aufbau der MT hin A B C 33 (s. Abbildung 1). In der äußeren Zone zeigte sich erwartungsgemäß eine erhöhte Zellviabilität, im Zentrum war eine erhöhte Akkumulation von toten Zellen nachzuweisen. Abbildung 9: Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung von Zellviabilität und Zelltod 350 parentalen BG-1-Zellen wurden je Well in einer ULA-Platte ausgesät und nach einer 96-stündigen Kultivierungszeit erfolgte ein Mediumwechsel. Nach weiteren 48 Stunden wurden Tumorspheroide für insgesamt 180 Minuten mit den Flureszenzfarbstoffen Calcein-AM, PI sowie Hoechst 33342 inkubiert. Im Anschluss daran erfolgten Aufnahmen bei 10-facher Vergrößerung im Hellfeld sowie fluoreszenzmikroskopisch mittels des NYONEⓇ Scientific. Der Maßstab der repräsentativen Aufnahmen zeigt eine Länge von 200 µm. 3.2.7 Testung des Behandlungseffekts über die Spheroidfläche im 3D-Ovarialkarzinommodell In dieser Untersuchung sollte analysiert werden, ob die Spheroidfläche ein geeignetes Maß zur Quantifizierung von Behandlungseffekten sein könnte. Dazu wurden 350 BG-1-Zellen ausgesät und mit steigenden Paclitaxelkonzentrationen sowie zur Vergleichbarkeit mit der Lösungsmittelkontrolle DMSO behandelt. Die Ergebnisse zeigen, dass steigende Paclitaxelkonzentrationen zu einer Abnahme der Spheroidfläche führten. Dieser Effekt kehrte sich allerdings bei sehr hohen Paclitaxelkonzentrationen von 50 µM um und es war dann eine Zunahme der Spheroidfläche nachzuweisen. Die mikroskopischen Aufnahmen zeigen, dass eine Konzentration von 50 µM Paclitaxel eine Veränderung des Kompaktheitgrades zu einem lockeren Zellverband bewirkte und damit eine Größenzunahme des MT resultierte. Darüber hinaus konnte eine Veränderung des Spheroidkompaktheitgrades durch eine Paclitaxelbehandlung mittels histologischer Untersuchungen bestätigt werden (s. Abbildung 10). 40 ADAM10und ADAM17-Inhibitor GW oder der Lösungsmittelkontrolle DMSO. 3 Stunden vor Ablauf der Gesamtbehandlungszeit von 48 Stunden wurde der Fluoreszenzfarbstoff Calcein-AM und PI hinzugefügt, sodass nach insgesamt 48-stündiger Behandlung fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen bei 10-facher Vergrößerung mittels des NYONEⓇ Scientific generiert werden konnten (A: Obere Reihe mit zusätzlicher DMSO-Behandlung; untere Reihe mit zusätzlicher GW-Behandlung). Der Maßstab der repräsentativen Aufnahmen zeigt eine Länge von 250 µm. Zusätzlich wurden die durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten nach Färbung mit PI durch Einsatz der YT®-Software bestimmt (B). In Versuchsansatz B wurden parentale BG-1-Ovarialkarzinomzellen nach initialer 96-stündiger Spheroidformation für insgesamt 48 Stunden mit Paclitaxel behandelt. Diese Behandlung wurde durch die Zugabe des ADAM10-Inhibitors GI oder des kombinierten ADAM10und ADAM17-Inhibitors GW beziehungsweise der Lösungsmittelkontrolle DMSO ergänzt. Anschließend wurde der CellToxTM Green Cytotoxicity Assay hinzugefügt und zur Quantifizierung der Zytotoxizität wurde eine Fluoreszenzintensitätsbestimmung durch Einsatz der YT®-Software auf Grundlage von fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen durchgeführt (C). Nachgeschaltet erfolgte die Zellviabilitätsbestimmung (lumineszenzbasiert) der Tumorzellen durch den CellTiter-Glo® Cell Viability Assay (D). Die Diagramme C und D zeigen jeweils die Mittelwerte drei voneinander unabhängiger Experimente ± SD. 4 Diskussion Das Ovarialkarzinom weist unter den gynäkologischen Tumoren die höchste Letalität mit einem relativen 5-Jahres-Überleben von 43 % Prozent auf. Die Hälfte aller Todesfälle unter den Tumorerkrankungen des weiblichen Genitals ist auf das Ovarialkarzinom zurückzuführen [1]. Ein wesentlicher Faktor für die schlechte Prognose der Patientinnen ist die sich häufig entwickelnde Chemotherapieresistenz, die bei nahezu 75 % aller Patientinnen während der Therapie auftritt. Dabei unterscheidet man zwischen zwei Formen: 1) Es wurde eine intrinsische Chemoresistenz beschrieben, bei der Tumorzellen bereits eine Resistenz gegenüber des medikamentösen Therapeutikums aufweisen. 2) Außerdem wurde eine erworbene Chemoresistenz nachgewiesen, die sich erst während einer medikamentösen Therapie entwickelt [76]. Die zugrunde liegenden Mechanismen der Chemotherapieresistenz sind zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch nicht vollständig verstanden. So spielen beispielsweise ein veränderter Metabolismus von Medikamenten über eine Dysregulation von metabolisierenden Enzymen wie der Cytochrom P450-Enzyme, Glutathion-S-Transferasen und Uridin Diphospho (UDP)- Glucuronosyltransferasen, ein verminderter Influx beziehungsweise gesteigerter Efflux von Medikamenten durch Membrantransporter oder eine Dysregulation des zellulären Metabolismus von Tumorzellen eine bedeutsame Rolle [27]. Demzufolge ist neben der Untersuchung der molekularen Mechanismen der Chemotherapieresistenz die Identifizierung und therapeutische Testung neuer Zielstrukturen zur Umgehung von Chemotherapieresistenz von hoher Relevanz hinsichtlich einer erfolgreichen Therapie des Ovarialkarzinoms. Die Metalloprotease ADAM17 41 stand als mögliche Zielstruktur zur Umgehung von Chemotherapieresistenz im Fokus der Untersuchungen. Eine Überexpression von ADAM17 konnte sowohl durchflusszytometrisch in verschiedenen Tumorzelllinien solider Tumoren wie dem Ovarial-, Mamma-, Prostataund Kolonkarzinom als auch in einer immunhistochemischen Analyse von Ovarialkarzinom-, Mammakarzinom und Prostatakarzinomgewebe gezeigt werden [18]. In einer Metaanalyse konnte zudem festgestellt werden, dass eine Überexpression von ADAM17 im Tumorgewebe mit einer schlechten klinischen Prognose und einem erhöhten Metastasierungsrisiko in unterschiedlichen soliden Tumorentitäten korreliert [22]. Untersuchungen konnten außerdem zeigen, dass eine Aktivierung von ADAM17 eine konsekutive Freisetzung von verschiedenen Liganden des Tyrosinkinaserezeptors EGFR wie zum Beispiel des Wachstumsfaktors AREG zur Folge hat. AREG, das zu einem der am häufigsten vorkommenden ADAM17-Substrate beim fortgeschrittenen Ovarialkarzinom zählt [29], ist über die Bindung an den EGFR dazu befähigt, eine Aktivierung des EGFR-Signalwegs auszulösen. Dessen gesteigerte Aktivierung ist mit der Entstehung von erworbener Chemotherapieresistenz assoziiert [28, 30]. Wang et al. konnten in diesem Zusammenhang am hepatozellulären Karzinom eine durch ADAM17Überexpression vermittelte Aktivierung des EGFR-Signalwegs zeigen, die zu einer verstärkten Resistenz gegenüber dem Chemotherapeutikum Cisplatin führte [77]. Darüber hinaus konnte eine Studie aus unserer Arbeitsgruppe an Ovarialkarzinomzellen zeigen, dass das Chemotherapeutikum Cisplatin zu einem konzentrationsabhängigen Anstieg der ADAM17-Aktivität führen kann [30]. Da bislang fraglich war, ob auch das beim Ovarialkarzinom häufig eingesetzte Chemotherapeutikum Paclitaxel einen Einfluss auf die ADAM17-Aktivität haben könnte, wurde diese Fragestellung im Zellkulturmodell näher untersucht. 4.1 Einfluss des Chemotherapeutikums Paclitaxel auf die ADAM17-Aktivität In einem ersten Schritt wurde in einem 2D-Zellkultursystem der Einfluss des Chemotherapeutikums Paclitaxel auf die ADAM17-Aktivität analysiert. Dazu wurde die Konzentration des transmembranären Glykoproteins AREG, ein häufig vorkommendes ADAM17-Substrat in Aszites beim fortgeschrittenen Ovarialkarzinom, quantifiziert [29]. Es konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit Paclitaxel zu einem konzentrationsabhängigen Anstieg der AREGFreisetzung und damit gesteigerten ADAM17-Aktivität führt. Einen Erklärungsansatz für die verstärkte AREG-Freisetzung bei steigenden respektive hohen Paclitaxelkonzentrationen geben die Studienergebnisse von Sommer et al., die demonstrieren konnten, dass eine ADAM17-Aktiverung über die Oberflächenexpression von Phosphatidylserin im Rahmen der 42 Apoptose erfolgt. Dabei konnte eine erhöhte Shedding-Aktivität von ADAM17 über eine gesteigerte Freisetzung des ADAM17-Substrates TGF α nachgewiesen werden [78]. Über diesen Mechanismus könnte die erhöhte ADAM17-vermittelte AREG-Freisetzung bei erhöhten Paclitaxel-induzierten Apoptoseraten erklärt werden. Darüber hinaus geben diese Ergebnisse einen indirekten Hinweis darauf, dass die Metalloprotease ADAM17 über die Chemotherapieinduzierte Freisetzung des Wachstumsfaktors AREG eine Rolle bei der Vermittlung von Chemotherapieresistenz spielen könnte und damit eine vielversprechende Zielstruktur darstellt. Diese These wird gestützt von unserem Resultat, dass die AREG-Konzentration im Überstand des Kontrollbehandlungsansatzes bei den Paclitaxel-resistenten BG-1-Zellen im Vergleich zu den parentalen Paclitaxel-sensiblen BG-1-Zellen bei gleichen Behandlungsbedingungen erhöht war, was ebenfalls auf eine ADAM17-vermittelte Resistenzbildung hindeuten könnte. Dieses Ergebnis wird von Huang et al. gestützt, die an humanen Chondrosarkomzellen zeigen konnten, dass durch Ausprägung einer Cisplatinresistenz eine Zunahme der Amphiregulin-mRNAExpression um nahezu 100 % zu beobachten ist im Vergleich zu Cisplatin-sensitiven Parentalzellen [79]. Interessanterweise lässt sich in der Zusammenschau der Ergebnisse eine Chemotherapie-induzierte ADAM17-Aktivierung unabhängig vom Mechanismus des Chemotherapeutikums erkennen. Während Paclitaxel eine Abbauhemmung von Mikrotubuli in der Mitosephase bewirkt, entfaltet das Chemotherapeutikum Cisplatin die antitumoröse Wirkung über die Inhibition der DNA-Replikation durch Quervernetzung. 4.2 Untersuchung des Einflusses einer zusätzlichen ADAM17-Inhibition zur konventionellen Chemotherapie Zuerst wurde die Fragestellung untersucht, ob durch die Ergänzung eines ADAM17-Inhibitors zur Paclitaxelbehandlung die Freisetzung von AREG moduliert werden kann. Es konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit Paclitaxel kombiniert mit dem ADAM10und ADAM17Inhibitor GW bei parentalen und Paclitaxel-resistenten Zellen zu einer signifikant verminderten Freisetzung des Wachstumsfaktors AREG führte. Die Kombinationsbehandlung aus Paclitaxel und dem ADAM10-Inhibitor GI zeigte im direkten Vergleich zur Einzelbehandlung aus Paclitaxel bei parentalen BG-1-Zellen nahezu keinen Unterschied bezüglich der AREG-Freisetzung. Bei Paclitaxel-resistenten BG-1-Zellen hatte dieser Kombinationsbehandlungsansatz eine vergleichsweise geringfügig verminderte AREG-Freisetzung zur Folge. Diese Befunde deuten darauf hin, dass die AREG-Freisetzung vorwiegend durch ADAM17-vermittelt wird, eine beteiligende Rolle von ADAM10 an der AREG-Freisetzung insbesondere bei Paclitaxel- 43 resistenten BG-1-Zellen jedoch nicht auszuschließen ist. Eine ADAM10-vermittelte Freisetzung von AREG ist in der Literatur bislang nicht beschrieben worden. Es wurde neben der ADAM17-vermittelten Freisetzung allerdings nachgewiesen, dass AREG auch ein Substrat der Metalloprotease ADAM15 ist [80]. Dieser Beleg könnte eine Erklärung dafür sein, dass die AREG-Freisetzung in keinem der Behandlungsansätze vollständig blockiert werden konnte. Darüber hinaus wurde untersucht, ob die Kombinationsbehandlung aus Paclitaxel und einer ADAM17-Inhibition einen stärkeren Behandlungseffekt unter Umgehung des möglichen ADAM17-vermittelten Chemotherapieresistenzmechanismus im Vergleich zur Einzelbehandlung aus Paclitaxel zur Folge hat. Die Versuche an parentalen BG-1-Zellen ergaben, dass die Kombinationsbehandlung aus Paclitaxel und GW zu einem stärkeren Behandlungseffekt bezüglich der Zellviabilität und Caspaseaktivität im Vergleich zur Einzelbehandlung mit Paclitaxel führt. Die resistenten BG-1-Zellen zeigten erwartungsgemäß hingegen im niedrigen Konzentrationsbereich bis 0,5 µM kaum ein Ansprechen auf das Chemotherapeutikum Paclitaxel. Trotz des geringen Ansprechens wurde in diesem niedrigen Konzentrationsbereich durch die Ergänzung von GW eine konstant erhöhte Caspaseaktivität sowie verminderte Viabilität und damit ein verbessertes Ansprechen erzielt. Darüber hinaus konnte mit diesem Behandlungsansatz in den höheren Konzentrationsbereichen a b einer Paclitaxelkonzentration von 1 µM eine geringe Steigerung der Caspaseaktivität sowie Senkung der Zellviabilität gemessen werden. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass bei den Paclitaxel-resistenten BG-1Zellen durch die Hinzunahme von GW ein geringfügig stärkerer Behandlungseffekt im Vergleich zur Einzelbehandlung mit Paclitaxel erreicht werden kann. Damit konnte ein möglicher Ansatz zur Umgehung der Paclitaxelresistenz demonstriert werden. Die kombinierte Behandlung aus Paclitaxel und dem selektiven ADAM10-Inhibitor GI führte sowohl bei den parentalen als auch den resistenten BG-1-Zellen zu einer geringfügigen Zunahme der Caspaseaktivität sowie verminderten Zellviabilität verglichen mit der Kontrollbehandlung. Dieses Resultat deutet darauf hin, dass der stärkere Behandlungseffekt einer Kombinationsbehandlung mit Paclitaxel und GW vorwiegend über die Inhibition von ADAM17 und nur in sehr geringem Maße über ADAM10 vermittelt wird. Diese Ergebnisse legen nahe, dass unter Hinzunahme einer ADAM17-Inhibition eine Sensitivierung der Ovarialkarzinomzellen gegenüber Paclitaxel und demzufolge eine verbesserte Wirkung des Chemotherapeutikums erzielt werden kann. Diese Befunde werden untermauert von einer vorausgehenden Studie unserer Arbeitsgruppe, in der ebenfalls ein stärkerer Behandlungseffekt an Ovarialkarzinomzellen durch die Kombinationsbehandlung unter Einsatz des Chemotherapeutikums Cisplatin in Kombination mit dem ADAM10und ADAM17-Inhibitor GW gezeigt werden konnte [30]. 44 Ein Erklärungsansatz für die verbesserte Wirkung der Kombinationsbehandlung ist dabei die gezielte Suppression des ADAM17-vermittelten Chemotherapieresistenzmechanismus über eine Inhibierung der Freisetzung des Wachstumsfaktors Amphiregulin. 4.3 Etablierung des 3D-Ovarialkarzinommodells Zur Validierung der Ergebnisse aus der zweidimensionalen Kultur war ein Hauptziel dieser Arbeit, ein dreidimensionales in vitro-Ovarialkarzinommodell zu etablieren, dass die Komplexität eines in vivo-Tumors stärker als herkömmliche zweidimensionale Zellkulturmodelle berücksichtigt. Dies ist insbesondere vor dem Hintergrund bedeutsam, dass im Jahre 2000 lediglich 5 % aller in präklinischen Studien getesteten Wirkstoffe eine AntitumorAktivität in klinischen Studien gezeigt haben [81]. Durch die intensivere Nutzung dreidimensionaler Zellkulturansätze könnten unpräzise und fehlerhafte Resultate der primären Testung onkologischer Wirkstoffe verringert werden. 4.3.1 BG-1-Ovarialkarzinomzellen können Multizelluläre Tumorspheroide ausbilden Eine Untersuchung konnte in einer zweidimensionalen Zellkultivierung zeigen, dass BG-1Ovarialkarzinomzellen im Vergleich zu den Ovarialkarzinomzelllinien A2780, SKOV3, HEY und OVCA420 keine spontane Spheroidbildung zeigen [82]. Paullin et al. konnten mittels der Hanging drop-Methode demonstrieren, dass BG-1-Ovarialkarzinomzellen kompakte Multizelluläre Tumorspheroide ausbilden können [83]. Des Weiteren konnte der Hersteller InSphero (Schlieren, Schweiz) nachweisen, dass BG-1-Zellen in der Mikrotiterplatte mit ultraniedriger Anhaftung GravityTRAPTM zur Formation von MT befähigt sind [84]. Für die Mikrotiterplatten mit ultraniedriger Anhaftung (Produktnummer 7007 und 4515) vom Hersteller Corning (Tewksbury, USA) fehlen diese Untersuchungen bislang. Unsere Ergebnisse zeigen, dass parentale und resistente BG-1-Zellen MT in der Mikrotiterplatte (Produktnummer 7007) ausbilden können. Für parentale BG-1-Zellen konnte dieses Resultat auch in der Mikrotiterplatte mit mit der Produktnummer 4515 erzielt werden. Bei näherer Betrachtung der mikroskopischen Aufnahmen konnten bei parentalen und resistenten BG-1-MT deutliche Unterschiede hinsichtlich der Morphologie beobachtet werden. Ivascu et al. unterteilten mikrotumorähnliche Strukturen bezüglich der Morphologie in kompakte Spheroide, feste und lockere Aggregate [85]. Die parentalen BG-1-Zellen bildeten in Bezug auf die Ivascu-Klassifikation feste Aggregate aus, wohingegen resistente BG-1-Zellen lockere Aggregate ausbildeten. Da die charakteristische Ausbildung diverser Gradienten wie zum Beispiel eines Sauerstoffgradienten 45 in festeren Aggregaten eher nachzuweisen sein könnte und die Versuche mit einer möglichst tumorähnlichen 3D-Kultur durchgeführt werden sollten, wurden die 3D-Zellkulturversuche mit parentalen BG-1-Zellen durchgeführt. Leung et al. konnten anhand eines Rechenmodells zeigen, dass kompakte Spheroide verglichen mit locker konfigurierten Spheroiden einen steileren Sauerstoffgradient ausbilden [86]. Aufgrund der fehlenden einheitlichen Klassifizierung von Tumorzellaggregaten beschrieben wir die BG-1-Aggregate als MT, auch wenn dies nicht die morphologische Klassifizierung nach Ivascu berücksichtigt. 4.3.2 Testung zur Ermittlung einer angemessenen Kultivierungszeit bis zur Durchführung eines Mediumwechsels Ein wesentlicher Faktor bei der Herstellung von MT spielt der Zeitpunkt des Mediumwechsels. Unsere Ergebnisse zeigten, dass ein Teilmediumwechsel bei 350 ausgesäten BG-1-Zellen je Well spätestens nach 144 Stunden erfolgen sollte. Nach dieser Kultivierungszeit war ein deutlicher Anstieg des Zelltods zu verzeichnen. Bemerkenswerterweise zeigten sich im Verlauf der Kultivierung weder starke Veränderungen der Spheroidfläche, noch zeigten sich mikroskopisch morphologische Zellveränderungen, anhand derer ein angemessener Zeitpunkt des Mediumwechsels abzuleiten wäre. Der Zeitpunkt des Mediumwechsels ist nicht eindeutig definiert und individuell auf die jeweilige Zelllinie anzupassen. Friedrich und Kollegen beschrieben beispielsweise in einer Arbeit, dass eine Kultivierungszeit von insgesamt 96 Stunden vor der Behandlung eine reproduzierbare Formierung von Spheroiden unterschiedlicher Zelltypen ermögliche. Sie entwickelten ein Protokoll zur Kultivierung und Behandlung von Tumorspheroiden, in dem ein Teilmediumwechsel von 50 % am Behandlungstag nach 96-stündiger Kultivierung empfohlen wird [60]. Rodríguez-Dorantes et al. etablierten ein Protokoll zur Bildung von Prostatakarzinom-Spheroiden und definierten hingegen einen Teilmediumwechsel von 50 % alle 7 Tage [87]. 4.3.3 Testung der Spheroiduniformität Ein Versuchsziel zur möglichst exakten Quantifizierung von Behandlungseffekten war es, dass Spheroide am Tag der Behandlung eine geringe Variabilität des Durchmessers aufweisen. Zu diesem Ziel wurde eine Testung der Spheroiduniformität vor Behandlungsbeginn in unserem Protokoll zur Herstellung von dreidimensionalen MT etabliert. Dazu wurden die Durchmesser für jedes MT auf der Grundlage der mikroskopischen Aufnahmen berechnet und zur Analyse der Spheroiduniformität wurden aus diesen Messwerten dann deskriptive Parameter wie der 46 Mittelwert und die Standardabweichung ermittelt. Konstante Versuchsbedingungen konnten somit aufgezeichnet und nachgewiesen werden. Einen weiteren Weg zur Uniformitätskontrolle stellten Zanoni et al. durch den Einsatz softwaregestützter Selektion nach einer Analyse des Spheroidvolumens und der Spheroidsphärizität dar. Zudem konnten sie demonstrieren, dass bei dem Versuchsziel einer hohen Uniformität neben des Spheroidvolumens auch die Berücksichtigung der Spheroidform (rund oder nicht-rund) als Parameter von Bedeutung sein kann. In deren Untersuchungen wiesen Spheroide mit gleichem Volumen, aber unterschiedlicher Form eine signifikant unterschiedliche Zellviabilität auf [74]. Dieser Parameter wurde in der vorliegenden Arbeit nicht gemessen, könnte aber bei zukünftigen Arbeiten einen weiteren Vorteil bezüglich der Uniformität bedeuten. 4.3.4 Ovarialkarzinomzellen bilden im Multizellulären Tumorspheroid Zell-ZellKontakte und eine Proliferationszone aus Ein weiterer bedeutsamer Faktor zur Herstellung von MT ist der Nachweis charakteristischer Spheroideigenschaften. Aufgrund der bis dato fehlenden einheitlichen Definition von runden Tumorzellaggregaten sind diese nicht eindeutig definiert. In zahlreichen wissenschaftlichen Arbeiten wurden als Charakteristika von Tumorzellaggregaten die Ausbildung von Zell-ZellKontakten, ein zonaler Aufbau (Proliferationszone, Ruhende Zone, Nekrotisches Zentrum) und die Ausbildung verschiedener Gradienten wie zum Beispiel eines Sauerstoffgradienten beschrieben [88, 74, 48]. In dieser Arbeit wurden zwei Eigenschaften näher untersucht: 1) Zell-Zell-Kontakte 2) Proliferationszone. Zur Darstellung der Spheroidarchitektur im Überblick wurde eine HE-Färbung durchgeführt und zum Nachweis von Zell-Zell-Kontakten wurde über eine immunhistochemische Färbung die Expression von E-Cadherin analysiert. Die Untersuchung zeigte, dass parentale BG-1 Ovarialkarzinomzellen innerhalb eines dichten Zellverbandes eine starke E-Cadherin-Expression aufweisen. E-Cadherin ist als transmembranöses Protein an der Ausbildung von Zellkontakten wie der Adherens Junctions als auch der Desmosomen beteiligt [89]. Dass E-Cadherin nicht nur eine bedeutsame Rolle bei Zell-ZellVerbindungen spielt, sondern auch die Form von MT und deren Chemosensitivität von E-Cadherin abhängig ist, konnten wissenschaftliche Untersuchungen unterstreichen. Lin et al. konnten an Leberkarzinomzellen demonstrieren, dass der Kompaktheitsgrad von Spheroiden mit der E-Cadherin-Expression korrelierte. Unsere Ergebnisse aus der 3D-Zellkultur mit parentalen BG-1-Ovarialkarzinomzellen können diesen Befund untermauern. Interessanterweise konnte auch der Kompaktierungsprozess des Spheroids durch die Zugabe eines E-CadherinAntikörpers inhibiert werden [90]. Ferner konnten Nakamura et al. an MT aus 47 Mammakarzinomzellen nachweisen, dass E-Cadherin einen Einfluss auf die Chemosensitivität haben kann. Die Chemosensititvität konnte in der 3D-Kultur durch Zugabe eines E-CadherinAntikörpers signifikant gesteigert werden und entsprach einer nahezu vergleichbaren Chemosensitivität wie die der zweidimensionalen Kultur, welche im Vergleich zur 3D-Kultur signifikant erhöht war [91]. Des Weiteren konnten unsere Untersuchungen einen Nachweis darüber erbringen, dass MT aus parentalen BG-1-Zellen eine charakteristische äußere Proliferationszone ausprägen (vgl. Abbildung 1). Die Ki-67-Expression war im Bereich der Spheroidoberfläche am höchsten ausgeprägt und es konnte eine Abnahme korrelierend mit der Spheroidtiefe beobachtet werden. Laurent et al. konnten an MT aus Pankreaskarzinomzellen zeigen, dass die Ausbildung einer äußeren Proliferationszone größenabhängig ist. Während kleinere Spheroide mit einem Durchmesser von etwa 300 µm ein homogen verteiltes Ki-67-Proliferationsmuster zeigten, konnte bei größeren Spheroiden mit einem Durchmesser von etwa 500 µm eine klar abgrenzbare Proliferationszone nachgewiesen werden. Dieses Resultat konnte mit dem Thymidin-Analogon 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), einem weiteren Proliferationsmarker neben Ki-67, untermauert werden [92]. 4.3.5 Charakterisierung von Multizellulären Tumorspheroiden mittels Fluoreszenzfarbstoffen Zur Untersuchung des zonalen Aufbaus eines MT (s. Abbildung 1) wurde das Verteilungsmuster von vitalen und toten Zellen analysiert. Unsere Arbeitsgruppe charakterisierte die Daten von BG-1-Zellen dieser Arbeit vergleichend mit vier weiteren Ovarialkarzinomzelllinien OVCAR-8, SKOV-3, Igrov-1 und A2780 bezüglich dieses Verteilungsmusters und konnte zeigen, dass neben der Zelllinie BG-1 auch SKOV-3 und OVCAR-8 eine Proliferationszone und eine zentrale Zone von toten Tumorzellen aufwiesen. Dieses Muster konnte auch bei drei von vier primären Ovarialkarzinompopulationen nachgewiesen werden [88]. Indirekt könnte die hohe Dichte von toten Zellen im Zentrum des MT auf einen zentralen Nekrosebereich hinweisen. Die Untersuchung der Nekrosezone durch immunhistochemische Färbungen könnte Gegenstand weiterführender Studien sein. Unsere Untersuchung zeigte zudem eine peripher erhöhte Fluoreszenzintensität des Fluoreszenzfarbstoffs Hoechst 33342. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit unserer publizierten Studie, in der gezeigt werden konnte, dass dichtere Tumoraggregate respektive MT aus den Ovarialkarzinomzelllinien BG-1, SKOV-3 und OVCAR-8 eine erhöhte Fluoreszenzintensität von Hoechst 33342 im Bereich der äußersten Zellschichten aufweisen. Bei lockeren Tumoraggregaten der Ovarialkarzinomzellinien A2780 48 und Igrov-1 konnte hingegen eine hohe Fluoreszenzintensität im Zentrum detektiert werden. Diese Ergebnisse konnten wir an primären Ovarialkarzinomzellen bestätigen [88]. 4.3.6 Testung des Behandlungseffekts über die Spheroidfläche im 3D-Ovarialkarzinommodell Ein möglicher Messparameter zur Quantifizierung von Behandlungseffekten ist die Spheroidgröße. Hirschhaeuser et al. zeigten die Wirksamkeit eines bispezifischen Antikörpers anhand des Spheroidvolumens, das sie aus zwei Orthogonalen berechneten [93]. Unsere Ergebnisse weisen hingegen darauf hin, dass die Spheroidfäche bei MT aus BG-1-Zellen kein geeigneter Parameter zur Quantifizierung des Behandlungseffekts darstellt. Wir konnten beobachten, dass steigende Paclitaxelkonzentrationen zunächst zu einer Abnahme der Spheroidfläche führten. Dieser Effekt kehrte sich allerdings bei einer sehr hohen Paclitaxelkonzentration von 50 µM um und es war folglich eine Zunahme der Spheroidfläche zu messen. Bei genauerer mikroskopischer Betrachtung der Morphologie des MT konnte eine Auflösung des Kompaktheitgrades festgestellt werden. Dieses Resultat könnte auf eine verstärkte Lösung der Zell-Zell-Kontakte zurückzuführen sein. 4.3.7 Translationaler Ansatz: Spheroidbildung von Asziteszellen im 3D-Ovarialkarzinommodell Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Kultivierung von Asziteszellen einer Patientin nach unserem etablierten Protokoll zur Ausbildung von MT führten. Darüber hinaus konnte über die histologische Aufarbeitung eine kompakte Spheroidarchitektur nachgewiesen werden. Dass sich dieses 3D-Ovarialkarzinommodell für translationale Ansätze nutzen lässt, konnten wir in einer weiterführenden Studie demonstrieren. Neben Zellen aus Aszites waren auch isolierte Zellen aus Tumorgewebe von Ovarialkarzinompatientinnen zur Ausbildung von MT befähigt [88]. 4.4 Validierung der 2D-Ergebnisse im 3D-Ovarialkarzinommodell 4.4.1 Einfluss des Chemotherapeutikums Paclitaxel auf die ADAM17-Aktivität Zur weiteren Validierung der Ergebnisse aus der zweidimensionalen Kultur wurde der Einfluss von Paclitaxel auf die ADAM17-Aktivität in einem 3D-Ovarialkarzinommodell analysiert. 49 Hier zeigte sich, dass zwar steigende Paclitaxelkonzentrationen zu einem Anstieg der ADAM17-Aktivität führen, dieser sich aber im Vergleich zu den analogen Versuchen im zweidimensionalen Zellkulturansatz deutlich moderater ausprägte. Ein Erklärungsansatz dafür stellt die dichte Spheroidarchitektur einhergehend mit einer möglichen Einschränkung des Transports von Wachstumsfaktoren innerhalb des MT dar. Zudem unterstreicht die vergleichsweise moderat ausfallende Steigerung der ADAM17-Aktivität durch steigende Paclitaxelkonzentrationen die charakteristischen Resistenzeigenschaften des MT gegenüber Chemotherapeutika, da durch den zonalen Aufbau des MT eine Barriere gegenüber Chemotherapeutika errichtet wird und folglich eine verminderte Penetration des Pharmakons resultiert. Zusammenfassend konnte in der dreidimensionalen Zellkultur eine geringfügig ausgeprägte Steigerung der ADAM17-Aktivität durch das Chemotherapeutikum Paclitaxel gezeigt werden. Die Induktion der ADAM17-Aktivität durch steigende Paclitaxelkonzentrationen ist vergleichend zur zweidimensionalen Zellkultur deutlich geringer ausgeprägt, wodurch auch eine mögliche ADAM17-vermittelte Resistenzbildung schwächer ausfällt. 4.4.2 Untersuchung des Einflusses einer zusätzlichen ADAM17-Inhibition zur konventionellen Chemotherapie Ein weiteres Versuchsziel war es, die Ergebnisse aus der zweidimensionalen Kultur zur Untersuchung des Einflusses einer zusätzlichen ADAM17-Inhibition in der 3D-Kultur zu validieren. Die Kombinationsbehandlung aus Paclitaxel und dem ADAM10und ADAM17-Inhibitor GW erzielte bei parentalen 3D-konfigurierten BG-1-Tumorzellen eine vergleichsweise moderatere Reduktion der AREG-Konzentration respektive ADAM17-Aktivität. Dass eine ADAM17Inhibierung auch in einem komplexeren in vivo-Ovarialkarzinom-Xenograft wirksam ist, konnten Richards et al. mit dem gegen ADAM17 gerichteten Antikörper D1 (A12) zeigen, dessen Einsatz zu einer fünffachen Reduktion der AREG-Asziteskonzentration führte [38]. Der Behandlungsansatz aus Paclitaxel und dem ADAM10und ADAM17-Inhibitor GW führte zu einem stärkeren Behandlungseffekt hinsichtlich der Zytotoxizität im Vergleich zur Einzelbehandlung aus Paclitaxel. Darüber hinaus erzielte der Behandlungsansatz aus Paclitaxel und GW auch eine geringfügige Reduktion der Zellviabilität, die im Vergleich zu dem analogen Versuch in der 2D-Kultur erst bei Paclitaxelkonzentrationen ab 0,01 µM beobachtet werden konnte. Eine Erklärung dafür könnte die dichte Spheroidarchitektur und die damit einhergehende verminderte Penetration des Therapeutikums in Richtung des Spheroidzentrums sein, wodurch die Sensitivierung der Ovarialkarzinomzellen gegenüber Paclitaxel durch die 56 57. 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Cancer Immunol Immunother 59:1675–1684 59 7 Anhänge 7.1 Publikationsverzeichnis Teile dieser Arbeit sind bereits an folgenden Stellen veröffentlicht worden: Originalarbeiten: Nina Hedemann, Andreas Herz, Jan Hendrik Schiepanski, Jan Dittrich, Susanne Sebens, Astrid Dempfle, Julia Feuerborn, Christoph Rogmans, Nils Tribian, Inken Flörkemeier, Jörg Weimer, Sandra Krüger, Nicolai Maass, Dirk O. Bauerschlag „ADAM17 Inhibition Increases the Impact of Cisplatin Treatment in Ovarian Cancer Spheroids” Cancers 2021, 13, 2039. Tagungsbeiträge: Andreas M. Herz, Nina Hedemann, Reinhild Geisen, Nils Tribian, Jörg Weimer, Norbert Arnold, Nicolai Maass, Dirk O. Bauerschlag „Das Chemotherapeutikum Paclitaxel induziert die Aktivierung von A Disintegrin And Metalloprotease 17 (ADAM17) von Ovarialkarzionomzellen“ Vorgestellt auf dem 1. Deutscher Krebsforschungskongress (DKFK) 2019 in Heidelberg. Andreas M. Herz, Nina Hedemann, Reinhild Geisen, Nils Tribian, Jörg Weimer, Norbert Arnold, Nicolai Maass, Dirk O. Bauerschlag „Paclitaxel in Kombination mit einer Inhibition der Metalloprotease A Disintegrin And Metalloprotease 17 (ADAM17) steigert Apoptose in Ovarialkarzinomzellen“ Vorgestellt auf der 133. Tagung der Norddeutschen Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe (NGGG) in Lüneburg. 60 7.2 Danksagung An erster Stelle gilt ein großer Dank meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Dirk Bauerschlag für die Überlassung des Themas und der Möglichkeit, diese Arbeit in einer exzellent vernetzten Forschungsumgebung durchzuführen. Für die stetige Unterstützung, die von einer fachlich hohen Expertise geprägten Impulse und die Förderung meines wissenschaftlichen Interesses bin ich sehr dankbar. Ganz besonders möchte ich Frau Dr. Nina Hedemann für die hervorragende Betreuung danken. Die stets präsente fachliche Unterstützung und außergewöhnliche Hilfsbereitschaft verbunden mit unzähligen konstruktiven und motivierenden Gesprächen zur Planung und Evaluierung der Versuche haben die Arbeit in einem außerordentlichen Maß bereichert. Darüber hinaus danke ich dem Direktor der Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfe Herrn Prof. Dr. Maass für die Möglichkeit, dass ich in seiner Klinik promovieren durfte. Ein weiterer Dank gilt Prof. Dr. Norbert Arnold und Dr. Jörg Weimer, die meine Arbeit mit ihrer langjährigen Expertise im Bereich der gynäkologischen Onkologie begleitet haben und mir bei zahlreichen inhaltlichen und technischen Fragen immer zur Seite standen. Dankbar bin ich auch den ehemaligen und aktuellen Doktoranden des Onkologischen Labors Nils Tribian, Dr. Christoph Rogmans, Julia Feuerborn, Leonie Treeck, Dr. Inken Flörkemeier, Jan Schiepanski, Jan Dittrich und Gerrit Hugendieck, die mir den Einstieg ins experimentelle Arbeiten enorm erleichtert haben und durch den freundschaftlichen Austausch viel Freude bereitet haben. Zudem möchte ich an dieser Stelle den Mitarbeitern des onkologischen Labors Sigrid Hamann, Doris Karow, Catharina Verkooyen und Frank Rösel danken, die mit viel Geduld und großer Hilfsbereitschaft zum Gelingen der Arbeit beigetragen haben. Dem Institut für experimentelle Tumorforschung unter der Leitung von Frau Prof. Susanne Sebens bin ich dankbar für die Mitbenutzung der Räumlichkeiten und Geräte des Instituts, aber vor allem für die wissenschaftliche Förderung auch im Rahmen des Zertifikatsstudiengangs Onkologie und das großartige Engagement bezüglich der Vernetzung onkologischer Wissenschaftler. Zahlreiche Gespräche auf fachlicher und persönlicher Ebene werden mir in guter Erinnerung verbleiben. Dem Institut für Pathologie am Campus Kiel unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. Christoph Röcken, insbesondere Frau Sandra Krüger möchte ich für die Unterstützung bei der immunhistochemischen Aufarbeitung der Tumrospheroide danken. Ein weiter Dank gilt Frau Prof. Dr. Daniela Wesch und Herrn PD Hans-Heinrich Oberg aus dem Institut für Immunologie für die räumliche und fachliche Unterstützung zu Beginn meiner Arbeit. Abschließend gilt ein ganz besonderer Dank meinen Eltern Annemarie und Dieter Herz, meiner Freundin Anna Bergjan, auf deren Unterstützung ich mich jederzeit verlassen konnte.