Tumorbiologische Bedeutung von SMARCA4 und SMARCE1 im Magenkarzinom, Korrelation mit ARID1A, Mikrosatellitenstatus sowie SMARCE1/ERBB2 Ko-Amplifikation

Aus dem Institut für Pathologie (Direktor: Prof. Dr. med. C. Röcken) im Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Kiel an der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel Tumorbiologische Bedeutung von SMARCA4 und SMARCE1 im Magenkarzinom, Korrelation mit ARID1A, Mikrosatellitenstatus sowie SMARCE1/ERBB2 Ko-Amplifikation Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizin der Medizinischen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel vorgelegt von KATHARINA PRIES aus Hamburg Kiel 2023 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Christoph Röcken, Institut für Pathologie 2. Berichterstatter/in: Prof. Dr. Dr. Janka Held-Feindt, Klinik für Neurochirurgie Tag der mündlichen Prüfung: 20.11.2024 Zum Druck genehmigt, Kiel, den 30.08.2024 gez.: Prof. Dr. Christoph Röcken, Institut für Pathologie I Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................... III Tabellenverzeichnis ................................................................................................ VI Abbildungsverzeichnis ........................................................................................... VII 1 Einleitung ............................................................................................................ 1 1.1 Das Magenkarzinom ...................................................................................... 1 1.1.1 Epidemiologie ......................................................................................... 1 1.1.2 Ätiopathogenese ..................................................................................... 1 1.1.3 Pathologie ............................................................................................... 4 1.1.4 TNM-Klassifikation und UICC-Stadien .................................................... 5 1.1.5 Prognose ................................................................................................ 7 1.1.6 Therapie .................................................................................................. 7 1.2 Der SWI-/SNF-Komplex ................................................................................ 9 1.2.1 Funktion und Aufbau ............................................................................... 9 1.2.2 Tumorbiologische Bedeutung von SMARCA4 und SMARCE1 ............. 10 1.3 Fragestellung ............................................................................................... 11 2 Material ............................................................................................................. 13 2.1 Studienkollektiv ........................................................................................... 13 2.2 Geräte ......................................................................................................... 13 2.3 Software ...................................................................................................... 14 2.4 Chemikalien ................................................................................................. 14 2.5 Kitsysteme ................................................................................................... 15 2.6 Antikörper .................................................................................................... 15 2.7 Oligonukleotide ............................................................................................ 15 2.8 Verbrauchsmaterial ..................................................................................... 15 3 Methoden .......................................................................................................... 16 3.1 Immunhistochemie ...................................................................................... 16 3.1.1 Auswertung ........................................................................................... 17 3.2 Vergleich von SMARCE1 und HER2 ........................................................... 18 3.3 Droplet Digital PCR ..................................................................................... 19 3.3.1 Durchführung ........................................................................................ 19 3.3.2 Auswertung ........................................................................................... 21 3.4 Herkunft weiterer klinisch-pathologischer Daten ......................................... 21 3.5 Statistische Auswertung .............................................................................. 21 II 4 Ergebnisse ........................................................................................................ 24 4.1 Expression von SMARCA4 und SMARCE1 ................................................ 24 4.2 Korrelation mit Patientencharakteristika ...................................................... 26 4.3 SMARCE1 und HER2 in Immunhistochemie und CISH .............................. 38 4.4 Amplifikation von SMARCE1 in der ddPCR ................................................. 40 4.5 Amplifikation von SMARCE1 und ERBB2 ................................................... 40 5 Diskussion ........................................................................................................ 43 5.1 Methodische Diskussion .............................................................................. 43 5.2 Expression von SMARCA4 und SMARCE1 ................................................ 45 5.3 SMARCA4, SMARCE1 und andere tumorbiologische Eigenschaften ......... 46 5.4 Amplifikation von SMARCE1 ....................................................................... 49 5.5 SMARCE1 und HER2 .................................................................................. 49 6 Zusammenfassung .......................................................................................... 51 7 Literaturverzeichnis ......................................................................................... 53 A Anhang .............................................................................................................. 58 A.1 Ethikvotum ................................................................................................... 58 B Publikationen ................................................................................................... 60 C Danksagung ..................................................................................................... 61 D Erklärung .......................................................................................................... 62 III Abkürzungsverzeichnis bzw. beziehungsweise ca. circa CIN chromosomal instabil CISH Chromogene in situ Hybridisierung CNV Copy Number Variation DAB Diaminbenzidin ddPCR Droplet Digital PCR DNA desoxyribonucleid acid (engl.), Desoxyribonukleinsäure EBV Epstein-Barr Virus EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EGFR epidermal growth factor receptor (engl.), epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor engl. Englisch ESD endoskopische Submukosadissektion et al. et alii (lat.), und andere FFPE Formalin-fixed paraffin embedded tissue g Gramm GTP Guanosintriphosphat GTPase GTP-bindendes Protein, G-Protein H. pylori Helicobacter Pylori HE Hematoxylin und Eosin HER2 Human epidermal growth factor receptor 2 (engl.), Humaner epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor 2 IHC Immunhistochemie lat. lateinisch l Liter li. links mg Milligramm Min Minute IV ml Milliliter mm Millimeter MSI Mikrosatteliten instabil µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer n Anzahl nm Nanometer OS Overall Survival (engl.), Gesamtüberleben PIK3CA Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphonat 3-Kinase katalytische Untereinheit Alpha PCR polymerase chain reaction (engl.), Polymerasekettenreaktion re. rechts RNA ribonucleic acid (engl.), Ribonukleinsäure Sek Sekunde SMARCA4 SWI-/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily a, member 4 (engl.), SWI- /SNF bezogener, Matrix assoziierter, Actin abhängiger Chromatinregulator, Unterfamilie A, Mitglied 4 SMARCE1 SWI-/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily e, member 1 (engl.), SWI- /SNF bezogener, Matrix assoziierter, Actin abhängiger Chromatinregulator, Unterfamilie E, Mitglied 1 SWI-/SNF-Komplex Switch-/Sucrose-non-fermenting-Komplex TMA Tissue Micro Array TSS Tumor specific survival (enlg.), Tumorspezifisches Überleben TNM Tumor-Nodus-Metastasen u.a. unter anderem UKSH Universitätsklinikum Schleswig-Holstein UICC Union for International Cancer Control (engl.) v.a. vor allem vs. versus (lat.), gegen V WHO Weltgesundheitsorganisation z.B. zum Beispiel °C Grad Celsius z.T. zum Teil VI Tabellenverzeichnis Tabelle 1: TNM-Klassifikation von 2017. Quelle: Wittekind, 2017 [33] ............................................... 5 Tabelle 2 UICC-Stadien des Magenkarzinoms. Quelle: Wittekind, 2017 [33] ..................................... 6 Tabelle 3: Cyling Phasen bei der ddPCR Hier aufgeführt sind die Cycling Phasen des gewählten Protokolls, welche der Thermocycler für die ddPCR durchlief. Dabei wurde die Proben-DNA 40 Mal denaturiert und durch DNA-Synthese in jedem Zyklus verdoppelt, sodass die Ausgangsmenge der Proben-DNA um 240 vermehrt werden konnte....................................................................................... 20 Tabelle 4: Kombinationen der bei SMARCA4 nachgewiesenen Färbeintensitäten [56] ............... 25 Tabelle 5: Kombination der bei SMARCE1 nachgewiesenen Färbeintensitäten [56] ................... 25 Tabelle 6: Statistische Auswertung Expression von SMARCE1 und klinisch-pathologische Patientencharakteristika (1) Fisher's exact Test, (2) Kendall's tau Test, (3) log-rank Test, die nach angewandter Multiple-Testing-Korrektur signifikant verbliebenen Werte wurden mit * markiert. Teile dieser Tabelle wurden bereits publiziert © Pries et al. Cancer Medicine published by John Wiley & Sons Ltd. [56]. ........................... 28 Tabelle 7: Statistische Auswertung der Expression von SMARCA4 und der Dysregulation des SWI-/SNF-Komplexes (1) Fisher's exact Test, (2) Kendall's tau Test, (3) log-rank Test, die nach angewandter Multiple-Testing-Korrektur signifikant verbliebenen Werte wurden mit * markiert. Teile dieser Tabelle wurden bereits publiziert © Pries et al. Cancer Medicine published by John Wiley & Sons Ltd. [56]. ............................ 32 Tabelle 8: Vergleich SMARCE1 und HER2 IHC und CISH Aufgeführt ist der jeweilige Histoscore des untersuchten Falls, welcher die Ausprägung der Expression von SMARCE1 wiedergeben soll. Sowie die Ausprägung der Expression von HER2 in der Immunhistochemie, und die Amplifikation von HER2 in der CISH, welche in einer vorangegangenen Studie des Instituts für Pathologie am UKSH Kiel untersucht wurden [57].Teile dieser Tabelle wurden bereits publiziert © Pries et al. Cancer Medicine published by John Wiley & Sons Ltd. [56] ................................................................................................................................................. 39 Tabelle 9: Amplifikationsanalyse von SMARCE1 durch ddPCR Angegeben sind die Größe der Tumorareale in der jeweiligen in der Immunhistochemie nachgewiesene Expressionsintensität von SMARCE1, die Werte der CNV aus der ersten und zweiten ddPCR mit der zugehörigen abschließenden Bewertung sowie die Daten des Studienkollektivs zum Amplifikationsstatus von HER2 aus CISH-Untersuchungen vorangegangener Studien des Instituts für Pathologie am UKSH Kiel [57]. In 3 Fällen lag kein Material für eine zweite ddPCR vor: n.a. = nicht anwendbar. Teile dieser Tabelle wurden bereits publiziert © Pries et al. Cancer Medicine published by John Wiley & Sons Ltd. [56] ...... 41 VII Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Referenzfälle für die Intensitäten des Histoscores bei der IHC-Analyse Dargestellt sind die Intensitäten 0 bis 3+ (von links nach rechts). Obere Reihe: Anti-SMARCA4 IHC (400-fache Vergrößerung). Untere Reihe: Anti-SMARCE1 IHC (400-fache Vergrößerung) © Pries et al. Cancer Medicine published by John Wiley & Sons Ltd. [56] ............................................................................ 18 Abbildung 2: Heterogenes Expressionsmuster in SMARCA4 und SMARCE1 links: AntiSMARCA4 IHC (400-fach vergrößert) rechts: Anti-SMARCE1 IHC (400fach-vergrößert) © Pries et al. Cancer Medicine published by John Wiley & Sons Ltd. [56] ................................................................ 26 Abbildung 3: Kaplan-Meier Kurve zum OS von SMARCA4 und SMARCE1 Dargestellt sind die Gesamtüberlebenskurven (OS) von SMARCA4 und SMARCE1 dichotomisiert am Median und kategorisiert in „hohe“ und „niedrige“ Expression. ................................................................................ 36 Abbildung 4: Kaplan-Meier Kurven zum TSS von SMARCA4 und SMARCE1 Dargestellt sind die Kurven zum tumorspezifischen Überleben (TSS) von SMARCA4 und SMARCE1 dichotomisiert am Median und kategorisiert in „hohe“ und „niedrige“ Expression. © Pries et al. Cancer Medicine published by John Wiley & Sons Ltd. [56]. ........................................................................................... 36 Abbildung 5: Kaplan-Meier Kurven zum OS und TSS von SMARCE1 Intensität 3+ vorhanden Dargestellt sind die Kurven zum Gesamtüberleben (OS) und tumorspezifischen Überleben (TSS) zum Vorhandensein der Intensität 3+ in der IHC von SMARCE1 ................................................................. 37 Abbildung 6: Kaplan-Meier Kurven OS und TSS der Dysregulation des SWI-/SNF-Komplexes Dargestellt sind die Kurven zum Gesamtüberleben (OS) und tumorspezifischen Überleben (TSS) zur Dysregulation des SWI-/SNF-Komplexes, welche als vorhandene Expression von SMARCA4 und SMARCE1 „beide hoch“ und „beide niedrig“ definiert wurde. ............................................................... 37 Abbildung 7: Vergleich der Expression und Amplifikation von SMARCE1 und HER2 Obere Reihe: übereinstimmend keine Expression von SMARCE1 (links) und HER2 (Mitte), sowie keine Amplifikation von HER2 (rechts) im gleichen Tumorareal. Untere Reihe: übereinstimmend starke Expression von SMARCE1 (links) und HER2 (Mitte) sowie Amplifikation von HER2 (rechts) in einem anderen Tumorareal desselben Falls. Links Anti-SMARCE1 Antikörper (400-fach vergrößert), Mitte Anit-HER2 Antikörper (400-fach vergrößert), rechts HER2 CISH (400-fach vergrößert). © Pries et al. Cancer Medicine published by John Wiley & Sons Ltd. [56] ................................................................ 38 Einleitung 7 1.1.5 Prognose Neben dem TNM-Status beeinflussen weitere Tumoreigenschaften die Prognose. Diese lassen sich in essenzielle und zusätzliche Faktoren unterscheiden, die wiederum in tumor-, wirtund umweltbezogene Faktoren unterteilt werden können. Der TNM-Status stellt als einer der wichtigsten Prognosefaktoren einen essenziellen, tumorbezogenen Faktor dar. Auch der HER2-Status zählt in diese Kategorie. Ein weiterer essenzieller, jedoch umweltbezogener Faktor ist der Residualtumorstatus. So macht es einen Unterschied, ob der Tumor R0, also im gesunden Gewebe, entfernt wurde oder, ob der Tumor in die R2-Kategorie zählt, bei der bereits makroskopisch sichtbar Teile des Tumors nach der Resektion im Körper verblieben sind. Zusätzliche tumorbezogene Faktoren sind die Tumorlokalisation (Kardia vs. distaler Magen), der Histologische Typ (diffus vs. intestinal) und die Gefäßinvasion. Auch das Alter und die damit verbundenen häufigeren Komorbiditäten nehmen als wirtbezogener Faktor einen Einfluss auf die Prognose des Patienten [33, 35]. Dennoch ist man auf der Suche nach weiteren, neuen Faktoren. Als vielversprechend haben sich dabei das molekulare Profil des Tumors (Mikrosatelliteninstabilität) und die Ethnie (Asiatisch vs. Nicht-Asiatisch) herausgestellt. Allerdings sind nicht alle üblicherweise für maligne Tumoren angewandten Prognosemarker auch sinnvoll beim Magenkarzinom anzuwenden. Dies gilt z. B. für den Ki67-Proliferationsindex, der zu den am häufigsten angewandten Prognosemarkern für maligne Tumoren zählt. Es zeigte sich kein Zusammenhang zwischen dem immunhistologisch bestimmten Ki67-Index und dem Patientenüberleben [36]. Neben potenziellen prognostischen Markern hat die Art der Therapie einen entscheidenden Einfluss auf das Patientenüberleben. 1.1.6 Therapie Das Ziel der Behandlung ist grundsätzlich davon abhängig, wie weit die Erkrankung bereits fortgeschritten ist. Ebenfalls davon abhängig sind außerdem die therapeutischen Möglichkeiten. Während im Frühstadium noch eine endoskopische Resektion in Form einer endoskopische Submukosadissektion (ESD) durchgeführt werden kann, ist für fortgeschrittenere Stadien oder auch schlecht differenzierte Tumore ein radikaleres Vorgehen, beispielsweise durch eine Teilresektion bis hin zur totalen Resektion des Magens, notwendig [37]. Einleitung 8 Bisher gilt der chirurgische Ansatz als einzige kurative Behandlung für Magenkarzinome und stellt damit die Standardtherapie resektabler Tumore dar. Neben der chirurgischen Therapie wird in einigen Fällen auch die perioperative Chemotherapie empfohlen. Sie kann nachgewiesenermaßen das Gesamtüberleben verbessern. Von einer präoperativen Radiochemotherapie oder Antikörpertherapie wird jedoch abgeraten [37]. Da ca. jedes dritte diagnostizierte Magenkarzinom bereits metastasiert ist, sind die Therapiemöglichkeiten oft begrenzt [2]. Die palliative Therapie hat dann das Ziel, das Überleben zu verbessern und die Lebensqualität zu erhalten. An dieser Stelle kann eine systemische Chemotherapie eingesetzt werden. Vor Beginn einer palliativen Therapie sollte außerdem der HER2-Status bestimmt werden. Dieser gilt als ein positiver prädiktiver Faktor für eine Antikörpertherapie mit Trastuzumab, die im Falle eines Her2/neu-überexprimierenden Tumors zusätzlich zu einer Chemotherapie angewandt wird [37]. Zusätzlich dazu kann eine Misteltherapie die Lebensqualität des Patienten verbessern, auch wenn sie nicht zur Verbesserung des Überlebens beitragen kann [38]. Die Verbesserung der Behandlung durch gezielte Tumortherapien („Targeted-Therapies“) ist Gegenstand aktueller Forschungsarbeiten. Dabei kommen Medikamente zum Einsatz die gegen vorher im Tumor untersuchte Zielstrukturen gerichtet sind, wie z.B. Trastuzumab bei HER2-positiven Magenkarzinomen. Besonders die genauen Mechanismen, die zu Tumorwachstum, Metastasierung aber auch zur Medikamentenresistenz führen sind hier von Interesse. Die beteiligten Rezeptoren, signalvermittelnden Proteine und andere für den Tumor spezifische Eigenschaften werden gegen den Tumor genutzt. Hierfür gibt es bereits unterschiedliche Methoden. Beispielsweise können Antikörper wahlweise direkt ihre Wirkung an Rezeptoren entfalten oder aber dafür genutzt werden, gekoppelte Chemotherapeutika spezifisch an ihren Wirkungsort zu bringen. Auch das körpereigene Immunsystem kann gezielt stimuliert und zur Bekämpfung von Tumorzellen eingesetzt werden. Durch das zunehmende Verständnis der Tumorbiologie können Therapeutika also immer präziser gegen Tumore eingesetzt werden. Herkömmliche Chemotherapeutika wirken an allen sich schnell vermehrenden Zellen gleichermaßen und führen dadurch zu Nebenwirkungen wie Haarverlust, Beeinträchtigung des Knochenmarks oder des Gastrointestinaltrakts [39]. Der Untergang des Knochenmarks kann jedoch nicht nur zu einer Anämie führen, sondern auch die Einleitung 9 Funktion des Immunsystems von Patienten deutlich einschränken. Patienten sind dann nicht nur anfälliger für Infekte, sie sind auch gefährdeter für das Auftreten einer febrilen Neutropenie [40], welche als schwere Nebenwirkung als lebensbedrohlich gilt [41]„Targeted Therapies“ sollen den Tumor im Vergleich zu herkömmlichen Chemotherapeutika damit nicht nur wirkungsvoller sondern auch nebenwirkungsärmer für gesunde Zellen bekämpfen [39]. 1.2 Der SWI-/SNF-Komplex 1.2.1 Funktion und Aufbau Beim Switch-/Sucrose-non-fermenting-Komplex (SWI-/SNF-Komplex) handelt es sich um einen ATP-abhängigen Chromatin-Remodeller. Er ist in der Lage, die Transkription zu regulieren, indem er die Chromatinstruktur verändert. Dabei führt die ATPase Aktivität des Komplexes zu einer Unterbrechung des Histon-DNA-Kontaktes. Es kommt zu einer DNA-Translokation, indem eine Loop-Formation gebildet wird, welche sich um das Nukleosom ausbreitet und die DNA anschließend mit Abstand zur vorherigen Nukleosom-Position neu positioniert. Dieser Ablauf wird auch als „Sliding“ bezeichnet und kann außerdem zu einer Ejektion eines benachbarten Nukleosomen führen. Durch diesen Vorgang wird die Zugänglichkeit für Transkriptionsfaktoren erhöht und damit die Transkription reguliert [42]. Der SWI-/SNF-Komplex besteht aus 9 bis 12 Untereinheiten. Man unterscheidet hauptsächlich zwei Arten von SWI-/SNF-Komplexen: BRG1-assoziierter Faktor (BAF, auch bekannt und im Folgenden bezeichnet als SWI-/SNF-A) und polybromo BRG1assoziierter Faktor (PBAF, auch bekannt und im Folgenden bezeichnet als SWI-/SNFB). Die Kernuntereinheiten finden sich dabei sowohl im SWI-/SNF-A-Komplex, als auch im SWI-/SNF-B-Komplex. Zu diesen Untereinheiten gehören BRG1 (im Folgenden als SMARCA4 bezeichnet), BAF155 (SMARCC1), BAF170 (SMARCC2) und SNF5 (SMARCB1). Außer den Kernuntereinheiten gibt es weitere variierende Untereinheiten, die sich ebenfalls in beiden Komplexen finden lassen. Hierzu zählen ßActin, BAF53 (SMARCA2), BAF60 (SMARCD3), BAF45 sowie BAF57 (SMARCE1) [42]. Einleitung 10 Der SWI-/SNF-A-Komplex unterscheidet sich vom SWI-/SNF-B-Komplex durch für ihn spezifische Untereinheiten. Eine spezifische Untereinheit des SWI-/SNF-A-Komplexes ist das AT-reiche-interaktive-Domain-Protein 1A und 1B (ARID1A/ ARID1B), für das bereits ein Zusammenhang mit dem TNM-Status und der Invasionstiefe des Magenkarzinoms nachgewiesen werden konnte [42, 43]. Zu den spezifischen Untereinheiten des SWI-SNF-B-Komplexes gehören BAF200 (ARID2), BAF180 (PBRM1) und BRD7. Der SWI-/SNF-A-Komplex kann dabei sowohl SMARCA4 als auch BRM als katalytische ATPase Untereinheit beinhalten, während allein SMARCA4 als katalytische ATPase Untereinheit des SWI-/SNF-B-Komplexes dient [42]. 1.2.2 Tumorbiologische Bedeutung von SMARCA4 und SMARCE1 SWI-/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily a, member 4 (SMARCA4) ist eine der katalytischen ATPase Untereinheiten des SWI-/SNF-Komplexes, dessen Gen auf Chromosom 19 lokalisiert ist (19p 13.2) [42, 44]. Obwohl häufiger von Mutationen in SMARCA4 berichtet wird, die über einen Funktionsverlust der Untereinheit zu einem aggressiveren Tumorwachstums führen und damit auf eine Rolle als Tumorsuppressor schließen lassen, wurde auch schon Gegenteiliges beobachtet [45–47]. Somit ist die tumorbiologische Bedeutung von SMARCA4 bis heute nicht nur für das Magenkarzinom unklar. SWI-/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily e, member 1 (SMARCE1) ist eine der variablen Untereinheiten des SWI-/SNFKomplexes, dessen Gen sich auf Chromosom 17 befindet (17q21.2) und damit eng mit ERBB2 benachbart ist, welches für H2/neu kodiert (17q12-21) [48]. Der humane epidermale Wachstumsfaktorrezeptor 2 (Her2/neu) ist v. a. für seine Relevanz beim Brustkrebs bekannt und wird dort bereits als ein wichtiger Biomarker zur Therapieplanung eingesetzt [49, 50]. Eine Überexpression von Her2/neu vermittelt eine Zunahme der Zellproliferation und erleichtert dadurch ein unkontrolliertes (Tumor-) Zellwachstum. Die Überexpression von Her2/neu gilt des Weiteren bei Brustkrebspatienten als ein Indikator für eine schlechte Prognose [51, 52]. Beim Magenkarzinom wird Her2/neu als Angriffspunkt einer der zielgerichteten Therapien („targeted therapies“,Antikörpertherapie) genutzt, um die Überlebenszeit der palliativen Patienten zu verlängern [37]. Für SMARCE1 wurde in einer Studie aus Asien beobachtet, dass eine hohe Einleitung 11 Expression einen signifikanten Zusammenhang mit einer schlechten Prognose sowie fortgeschrittener Tumorgröße, Invasionstiefe und höherem UICC-Stadium beim Magenkarzinom aufwies [53]. Andere Studien bestätigten außerdem, dass eine erhöhte Expression von SMARCE1 mit Metastasierung des Tumors in Zusammenhang gebracht werden kann [54, 55]. Diese Eigenschaft scheint SMARCE1 über den ERK/MAPK-Signalweg zu vermitteln, welcher ebenfalls durch die Aktivierung von Her2/neu in Gang gesetzt werden kann [51, 53]. 1.3 Fragestellung Die Funktionsweise des SWI/SNF-Komplexes sowie die bisher dazu vorliegenden Studien geben Hinweise auf eine Relevanz in der Tumorbiologie des Magenkarzinoms eben dieses Komplexes oder seiner Untereinheiten [45–47, 53–55]. Ebenso wirft die räumliche Nähe von SMARCE1 zu ERBB2 auf Chromosom 17 [48] die Frage auf, ob hier eine Ko-Amplifikation vorliegt. Eine derartige Ko-Amplifikation könnte möglicherweise in der Entstehung von Resistenzen gegen Therapeutika wie Trastuzumab, welches als Antikörper in der palliativen Therapie HER2-positiver Magenkarzinome eingesetzt wird, beteiligt sein. Daher sollen in dieser Dissertation die hier genannten Hypothesen überprüft werden: (1) SMARCA4 und SMARCE1 zeigen unterschiedlichen Arten der Expression sowie intratumorale Heterogenität beim Magenkarzinom. (2) Die Expression von SMARCA4 und SMARCE1 korreliert mit klinisch-pathologischen Patientencharakteristika. (3) Es liegt eine Ko-Amplifikation von SMARCE1 und ERBB2 vor. Um diese Thesen zu prüfen, wurde zunächst jeweils ein Antikörper für die immunhistochemische Färbung von SMARCA4 und SMARCE1 etabliert. Diese wurden einzeln zur immunhistochemischen Färbung von Ganzgewebeschnitten einer gut charakterisierten Kohorte von über 400 Magenkarzinompatienten genutzt. Die gefärbten Gewebeschnitte wurden im Anschluss mikroskopiert und anhand einer optischen Skala (Histo-Score) bewertet, um die Ausprägung sowie die Art der Expression zu ermitteln. Die so erhobenen Daten wurden in einer Datenbank eingetragen, in der bereits viele weitere klinisch-pathologische Patientencharakteristika zu den Fällen des Einleitung 12 Studienkollektivs untersucht wurden. Die in vorangegangen Untersuchungen bereits als HER2 positiv bewerteten Fälle wurden speziell in der Expression von Her2/neu und SMARCE1 verglichen, um zunächst festzustellen, ob SMARCE1 und Her2/neu an den gleichen Stellen innerhalb der Karzinome exprimiert wurden. Zusätzlich wurde chromogene in situ Hybridisierung (CISH) von HER2, welche einen Hinweis auf die zugrunde liegende Amplifikation von ERBB2 liefern, in den Vergleich mit einbezogen. Zuletzt wurden ausgewählte Fälle, unter denen sich auch ERBB2-amplifizierte befanden, mittels ddPCR auf die Amplifikation von SMARCE1 untersucht. Im Anschluss wurde eine statistische Auswertung der erhobenen Daten durchgeführt und die Expression von SMARCA4 und SMARCE1 mit vorliegenden klinisch-pathologischen Patientencharakteristika korreliert. Methoden 13 2 Material 2.1 Studienkollektiv Das Studienkollektivumschließt 468 therapienaive Adenokarzinome des Magens oder gastroösophagealen Übergangs aus dem Archiv des Instituts für Pathologie des Universitätsklinikums Schleswig-Holstein (UKSH), welche zwischen 1997 und 2009 diagnostiziert und operiert worden sind. Eingeschlossen wurden Patienten im Alter von 28 bis 92 Jahren. Das Durchschnittsalter des Kollektivs liegt bei 67 Jahren. Fälle, für die nicht mehr ausreichend Gewebe zur Untersuchung vorhanden war, wurden ausgeschlossen. Die nachstehend aufgeführten Patientencharakteristika wurden durch das Institut für Pathologie des UKSH bereits vor Beginn dieser Studie erfasst: Geschlecht, Alter, Tumorlokalisation, Tumortyp nach Laurén, Grading, TNM-Status und UICC-Stadium. Follow-up-Daten über den Patiententod wurden vom Krebsregister SchleswigHolstein bezogen. Die vollständigen Patientencharakteristika sind zudem in den Tabellen 6 und 7 dargestellt 2.2 Geräte Das verwendete Gewebe wurde in der Kühl-Gefrierkombination Liebherr premium nofrost (Liebherr, Bulle, Schweiz) gelagert. Zum Pipettieren wurden Eppendorf Research plus Pipetten (Eppendorf AG, Hamburg) in den Größen 10µl, 20µl, 100µl und 200µl sowie der Vortex Schüttler Vf2 (IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen) genutzt. Der Leica BOND-MAX (Leica Biosystems, Wetzlar) wurde zur Färbung eingesetzt. Mit dem Cognitive Cxi Laber Printer (Leica Biosystems, Wetzlar) wurden Etiketten gedruckt. Deckgläsern wurden mit der Promounter RCM 2000 Coverslipping Machine (MEDITE Medical GmbH, Burgdorf) aufgebracht. Einzelne gefärbte Gewebeschnitte wurden mit dem Leica Scanner SCN 400 (Leica Microsystems, Wetzlar) eingescannt und digitalisiert. Des Weiteren wurde der Vortex Schüttler Vf2 (IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen) und die Thermo Scientific™ Pico™ 17 Mikrozentrifuge (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) verwendet. Es wurde Eis aus dem Eisbereiter Scotsman AF130 (Scotsman Ice Systems, Vernon Hills, USA) eingesetzt. Gearbeitet wurde an mit Ultraviolet Sterilizing PCR Workstation (Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen) ausgestatteten Arbeitsplätzen. Für die Durchführung der ddPCR kamen ein DG8™ Cartidge Holder #1863051 (Bio-Rad Laboratories, Kalifornien, USA), ein QX200 Droplet Methoden 14 Generator #1864002 (Bio-Rad Laboratories, Kalifornien, USA), der PX1 Heat Sealer #1864000 (Bio-Rad Laboratories, Kalifornien, USA), ein C1000 Touch Thermocycler mit Deep Well Reaction Module #1851197 (Bio-Rad Laboratories, Kalifornien, USA) sowie der QX200 Droplet Reader #1864003 (Bio-Rad Laboratories, Kalifornien, USA) und ein Lenovo ThinkPad L540 (Lenovo, Quarry Bay, Hongkong) zum Einsatz. 2.3 Software Zur Erfassung und statistischen Auswertung der gewonnenen Daten wurde an Computern mit dem Betriebssystem Microsoft® Windows 10 (Microsoft Deutschland GmbH, Schwabing) gearbeitet. Die Erfassung der Daten erfolgte mit Microsoft Office 365® ProPlus (Microsoft Deutschland GmbH, Schwabing sowie speziell für die ddPCR mit QuantaSoft™ Version 1.7 #1864011 (Bio-Rad Laboratories, Kalifornien, USA). Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe von SPSS 27.0 (IBM Corporation, New York, USA) 2.4 Chemikalien Für die immunhistochemische Färbung am Leica BOND-MAX (s. 2.2 Geräte) wurden die Bond Dewax Solution (Leica Biosystems, Wetzlar), die Bond Epitope Rertieval Solution 2 (Leica Biosystems, Wetzlar), Bond Primary Antibody Diluent (Leica Biosystems, Wetzlar) und BOND Wash Solution 10X Concentrate (Leica Biosystems, Wetzlar) genutzt. Nach der Färbung wurden die Objektträger in 70% Ethanol (Th. Geyer GmbH & Co. KG, Renningen) getaucht und mit dH2O (Th. Geyer GmbH & Co. KG, Renningen) abgewaschen. Für das Waschen der Schnitte in der aufsteigenden Alkoholreihe wurde Xylol (Th. Geyer GmbH & Co. KG, Renningen) verwendet. Für den Probenansatz der ddPCR wurde mit Nuclease freiem Wasser (Qiagen, Hilden) und ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) (Bio-Rad, Kalifornien, USA) gearbeitet. Außerdem wurde Droplet Generator Oil for Probes #1863005 (Bio-Rad Laboratories, Kalifornien, USA) und Droplet Reader Oil #1863004 eingesetzt (Bio-Rad Laboratories, Kalifornien, USA). Methoden 15 2.5 Kitsysteme Zur immunhistochemischen Färbung wurde das BOND Polymer Refine Detection Kit (Leica Biosystems, Wetzlar) eingesetzt. 2.6 Antikörper In der immunhistochemischen Färbung von SMARCA4 kam der monoklonale Maus Antikörper Anti-SMARCA4/-BRG1, Klon E8V5B von Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) in der Verdünnung 1 : 400 zum Einsatz. Zur immunhistochemischen Färbung von SMARCE1 wurde der monoklonale Hasen Antikörper, Anti-SMARCE1/- BAF57, Klon E6H5J von Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) in der Verdünnung 1 : 300 eingesetzt. 2.7 Oligonukleotide Für die Durchführung der ddPCR wurden für SMARCE1 die im Folgenden genannten Primer eingesetzt. Selbst designter Primer (Biomers.net GmbH, Ulm) SMARCE1 forward: 5’-ACACTCCTTTTTATGGTTACTGGT-3’ und selbst designter Primer (Biomers.net GmbH, Ulm) SMARCE1 reverse: 5’-TTCTCTGGAAACGGGCGGT-3’. Die Sonde für SMARCE1 war ebenfalls selbst designed (Biomers.net GmbH, Ulm) und hatte die Sequenz 5’-6-FAM-TGTTCACTCCAGATTATGATGATGGC-BMN-Q530-3’. Für EFTUD2 wurden Primer nach dem Design von Liu et al. [53] verwendet. Primer EFTUD2 forward (Biomers.net GmbH, Ulm): 5’-GGTCTTGCCAGACACCAAAG-3’ und Primer EFTUD2 reverse (Biomers.net GmbH, Ulm): 5’-TGAGAGGACACACGCAAAAC-3’. Die Sonde für EFTUD2 wurde selbst designed (Biomers.net GmbH, Ulm) und hat die Sequenz 5’-6-HEX-GGACATCCTTTGGCTTTTGA-BMNQ530-3’. 2.8 Verbrauchsmaterial Als Verbrauchsmaterial für die Immunhistochemie kamen Objektträger der Sorte Surgipath® Apex BOND Superior Adhesive Slides von Leica Biosystems (Wetzlar) zum Einsatz. Dazu wurden Deckgläser Nr.1 von Th. Geyer GmbH & Co. KG (Renningen) verwendet. Zum Pipettieren des Antikörper-Ansatzes wurden Biosphere® gestopfte Filter-Tips von SARSTEDT AG & Co. KG (Nümbrecht) genutzt. Methoden 16 Die Proben der ddPCR wurden in das DG8™ Cartridge #1864008 (Bio-Rad Laboratories, Kalifornien, USA) pipettiert und mit einem DG8™ Gasket #1863009 (Bio-Rad Laboratories, Kalifornien, USA) verschlossen. Die fertigen Droplets werden in ddPCR™ 96 well plates #12001925 (Bio-Rad Laboratories, Kalifornien, USA) überführt und mit einer Piercable Foil Heat Seal #1814040 (Bio-Rad Laboratories, Kalifornien, USA) versiegelt. Zum Pipettieren wurden Biosphere® gestopfte Filter-Tips von SARSTEDT AG & Co. KG (Nümbrecht) verwendet. 3 Methoden 3.1 Immunhistochemie Zur Untersuchung der Expression von SMARCA4 und SMARCE1 in Magenkarzinomgewebe wurden immunhistochemische Färbungen mit dafür spezifischen Antikörpern durchgeführt. Die für die hier durchgeführte immunhistochemische Untersuchung verwendeten Gewebeproben waren alle in Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet worden (FFPE: Formalin-fixed paraffin-embedded tissue). Aus diesen Paraffin-Blöcken wurden 2 µm dicke Schnitte hergestellt, welche auf Objektträgern aufgebracht und zur Färbung genutzt wurden. Die immunhistochemische Färbung der FFPE-Gewebeschnitte wurde am Bond-Max automatisiert durchgeführt. Sowohl für SMARCA4 als auch SMARCE1 beinhaltete das Färbeprotokoll eine Vorbehandlung mit der Bond Epitope Retrieval Solution 2 (ER2) über 20 Minuten. Für die Färbung zur Darstellung der Expression von SMARCA4 wurde ein monoklonaler Maus-Antikörper gegen SMARCA4 in der Konzentration 1:400, mit Bond Primary Antibody Diluent verdünnt, angewendet. Für die Färbung zur Darstellung der Expression von SMARCE1 wurde ein monoklonaler Hasen-Antikörper gegen SMARCE1 in der Konzentration 1:300, mit Bond Primary Antibody Diluent verdünnt, angewendet. Zur Detektion der Antikörperbindung wurde das Polymer Refine Detection Kit von Leica Biosystems verwendet, in welchem als Substrat DAB enthalten war. Als Gegenfärbung wurde Hämatoxylin eingesetzt. Nach der immunhistochemischen Färbung wurden die Gewebeschnitte für 20 Minuten in 70%igen Alkohol gelegt, mit Leitungswasser und destilliertem Wasser (dH2O) gespült und anschließend in einer aufsteigenden Alkoholreihe dehydriert. Zuletzt wurden Methoden 23 Kaplan-Meier-Methode bestimmt. Um hier die Signifikanz der Unterschiede zu bestimmen, wurde der log-rank Test angewandt [56]. Ergebnisse 24 4 Ergebnisse 4.1 Expression von SMARCA4 und SMARCE1 SMARCA4 und SMARCE1 werden nukleär exprimiert. Die Expression von SMARCA4 konnte immunhistochemisch sowohl in Tumorzellen als auch in nicht neoplastischem und metaplastischem Epithel nachgewiesen werden. Ebendies galt auch für die Expression von SMARCE1. Hier konnte jedoch auch eine konsequente und starke Expression in Lymphozyten nachgewiesen werden, welche als interne Kontrolle genutzt wurde. Die Färbeintensitäten der Immunhistochemie reichten von 0 bis 3+ (s. Abbildung 1). Dabei zeigten 50,1 % der für SMARCA4 untersuchten Fälle anteilig keine Expression (0) im Tumorareal. In 87,8 % kam anteilig eine schwache (1+), in 89,3 % eine mäßige (2+) und in 53,1 % der Fälle eine starke (3+) Expression vor. 66,9 % der für SMARCE1 untersuchten Fälle zeigten anteilig keine (0) Expression im Tumorareal. In 97,2 % kam anteilig eine schwache (1+), in 76,9 % eine mäßige (2+) und in 17,9 % der Fälle eine starke (3+) Expression vor. Die Spanne der Größe der Fläche, die eine Expression von SMARCA4 im Tumorareal aufwies, reichte für die Kategorie „keine Expression“ (0) von 0 % bis 100 % des gesamten Tumorareals. Für die Kategorien „schwache Expression“ (1+), „mäßige Expression“ (2+) und „starke Expression“ (3+) reichte die Spanne von 0 % bis 95 % des gesamten Tumorareals. Für SMARCE1 reichte die Spanne der Größe der Fläche, die keine Expression (0) im Tumorareal aufwies von 0 % bis 100 % des gesamten Tumorareals. Für die Kategorie „schwache Expression“ (1+) reichte die Spanne von 0 % bis 99 %, für „mäßige Expression“ (2+) von 0 % bis 95 % und für „starke Expression“ (3+) von 0 % bis 90 % des gesamten Tumorareals. Sowohl für SMARCA4 als auch für SMARCE1 zeigte jeweils ein Fall keinen Nachweis der Expression in Tumorzellen (0 x 100 % = Histoscore 0) [56]. Insgesamt zeigten 466 Fälle, die mit dem Antikörper zum Nachweis der Expression von SMARCA4 gefärbt wurden, unterschiedliche Kombinationen von zwei oder mehr Färbeintensitäten. Ein Fall wies im gesamten Tumorbereich keine Expression von SMARCA4 auf und damit auch keine Kombination von unterschiedlichen Färbeintensitäten. Die für SMARCA4 nachgewiesenen Kombinationen der Färbeintensitäten sind die in Tabelle 4 aufgeführten. Ergebnisse 25 Tabelle 4: Kombinationen der bei SMARCA4 nachgewiesenen Färbeintensitäten [56] Kombination der Färbeintensitäten Anzahl der Fälle Anteil am gesamten Kollektiv 0/ 1+ 43 9,2 % 0/ 2+ 4 0,9 % 1+/ 2+ 66 14,1 % 2+/ 3+ 38 8,1 % 0/ 1+/ 2+ 101 21,6 % 0/ 1+/ 3+ 2 0,4 % 0/ 2+/ 3+ 10 2,1 % 1/ 2+/ 3+ 129 27,6 % 0/ 1+/ 2+ / 3+ 69 14,7 % 467 Fälle, die mit dem Antikörper zum Nachweis der Expression von SMARCE1 gefärbt wurden, wiesen ebenfalls unterschiedliche Kombinationen von zwei oder mehr Färbeintensitäten auf. Ein Fall wies im gesamten Tumorbereich keine Expression von SMARCE1 auf und damit auch keine Kombination von unterschiedlichen Färbeintensitäten. Die für SMARCE1 nachgewiesenen Kombinationen der Färbeintensitäten sind die in Tabelle 5 aufgeführten. Tabelle 5: Kombination der bei SMARCE1 nachgewiesenen Färbeintensitäten [56] Kombination der Färbeintensitäten Anzahl der Fälle Anteil am gesamten Kollektiv 0/ 1+ 106 22.6 % 0/ 2+ 1 0.2 % 1+/ 2+ 95 20.3 % 1+/ 3+ 1 0.2 % 2+/ 3+ 9 1.9 % 0/ 1+/ 2+ 181 38.7 % 0/ 2+/ 3+ 2 0.4 % 1+/ 2+/ 3+ 50 10.7 % 0/ 1+/ 2+/ 3+ 22 4.7 % Ergebnisse 26 Wie hier dargestellt werden konnte, gibt es eine Vielzahl an Kombinationen der Färbeintensitäten in unterschiedlich großen Flächenanteilen der für SMARCA4 und SMARCE1 gefärbten Tumorareale. Diese Daten belegen eine heterogene Expression von SMARCA4 und SMARCE1 im Magenkarzinom, sowohl als „grey-scale“ (Graustufen, ineinander übergehende Änderung der Färbeintensitäten) als auch als „black-andwhite“- Muster (Schwarz-Weiß, starke Färbeintensität trifft auf direkt angrenzende Tumorareale ohne Expression). Dabei lag sowohl für SMARCA4 als auch für SMARCE1 in der Mehrheit der Fälle ein „grey-scale“-Muster vor. Die nachfolgende Abbildung 2 zeigt jeweils einen exemplarischen Fall für die zuvor erwähnten Expressionsmuster [56]. Abbildung 2: Heterogenes Expressionsmuster in SMARCA4 und SMARCE1 links: Anti-SMARCA4 IHC (400-fach vergrößert) rechts: Anti-SMARCE1 IHC (400fach-vergrößert) © Pries et al. Cancer Medicine published by John Wiley & Sons Ltd. [56] 4.2 Korrelation mit Patientencharakteristika Sämtliche im Folgenden erwähnten Ergebnisse sind in Tabelle 6 und Tabelle 7 am Ende von Kapitel 4.2 zusammengefasst. Nachdem die Expression von SMARCA4 und SMARCE1 am Median dichotomisiert und mit den klinisch-pathologischen Patientencharakteristika des Studienkollektivs korreliert wurde, fanden sich bereits erste auffällige Werte in der Statistik. Es zeigte sich eine Korrelation für SMARCA4 mit Mikrosatteliteninstabilität und der Expression Ergebnisse 27 von ARID1A. Für SMARCE1 konnte ebenfalls eine Korrelation mit Mikrosatteliteninstabilität, der Expression von ARID1A sowie der Expression von TP53 nachgewiesen werden. Ansonsten konnten weder für die Expression von SMARCA4 noch von SMARCE1 weitere Korrelationen festgestellt werden (Tabelle 6 und 7). Im zweiten Schritt wurden die Fälle des Studienkollektivs sowohl für die Expression von SMARCA4 als auch für die Expression von SMARCE1 in Quartile unterteilt. Dazu wurde für SMARCA4 das 1. Quartil (Histoscore <111) gegen die restlichen drei Quartile (Histoscore ≥111) verglichen. Für SMARCE1 wurde das 4. Quartil (Histoscore >170) gegen die ersten drei Quartile (Histoscore ≤170) verglichen. Bei Anwendung dieser Kategorisierung konnten die folgenden Korrelationen festgestellt werden. SMARCA4 korrelierte weiterhin mit Mikrosatteliteninstabilität, der Expression von SMARCA4 und zusätzlich der Expression von TP53, während sich für SMARCE1 nur noch eine Korrelation mit Mikrosatteliteninstabilität und der Expression von ARID1A zeigte [56]. Beim Vergleich der Expression von SMARCA4 mit der Expression von SMARCE1, um die Art des Verhaltens beider Untereinheiten des SWI-/SNF-Komplexes zueinander zu ermitteln, konnte nachgewiesen werden, dass eine niedrige Expression von SMARCA4 mit einer niedrigen Expression SMARCE1 korrelierte. Ebenfalls fand sich eine Korrelation zwischen einer hohen Expression von SMARCA4 und einer hohen Expression von SMARCE1 [56]. Die Überprüfung der Dysregulation des SWI-/SNF-Komplexes ergab einen signifikanten Zusammenhang mit der Expression von ARID1A. Diese wurden kategorisiert in „jede Expression“ versus „kompletter Verlust der Expression“ sowie in „kompletter Verlust der Expression oder schwarz-weiß Muster“ versus „jede andere Expression von ARID1A“. Weiterhin korrelierte die Dysregulation des SWI-/SNF-Komplexes mit der Expression von TP53 sowie Mikrosatteliteninstabilität [56]. Das Gesamtüberleben und das tumorspezifische Überleben hängen insbesondere von unterschiedlichen klinisch-pathologischen Patienteneigenschaften ab. Diese sind beispielsweiser der Phänotyp nach Laurén, der TNM-Status, das UICC-Stadium, aber auch das Grading, der Mikrosattelitenstatus und das Vorhandensein oder Fehlen von anderen Biomarkern. Dennoch konnte in der gesamten statistischen Auswertung kein Ergebnisse 28 Zusammenhang zwischen der Expression von SMARCA4 oder SMARCE1 und dem Patientenüberleben nachgewiesen werden (siehe Abb. 3 - 6) [56]. Tabelle 6: Statistische Auswertung Expression von SMARCE1 und klinisch-pathologische Patientencharakteristika (1) Fisher's exact Test, (2) Kendall's tau Test, (3) log-rank Test, die nach angewandter Multiple-Testing-Korrektur signifikant verbliebenen Werte wurden mit * markiert. Teile dieser Tabelle wurden bereits publiziert © Pries et al. Cancer Medicine published by John Wiley & Sons Ltd. [56]. SMARCE1 Expression im Zellkern SMARCE1 Expression im Zellkern SMARCE1 Intensität 3+ präsent Total Histoscore niedrig (< 120) Histoscore hoch (≥ 120) Q123 Q4 fehlt präsent n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) Total 232 236 358 110 384 (82,1) 84 (17,9) Geschlecht n p(1 468 0,704 468 0,824 468 0,265 Weiblich 179 (38,2) 91 (50,8) 88 (49,2) 138 (77,1) 41 (22,9) 142 (79,3) 37 (20,7) Männlich 289 (61,8) 141 (48,8) 148 (51,2) 220 (76,1) 69 (23,9) 242 (83,7) 47 (16,3) Alter n p(1 468 0,355 468 0,514 468 1,000 < 68 Jahre 237 (50,6) 112 (47,3) 125 (52,7) 178 (75,1) 59 (24,9) 194 (81,9) 43 (18,1) >= 68 Jahre 231 (49,4) 120 (51,9) 111 (48,1) 180 (77,9) 51 (22,1) 190 (82,3) 41 (17,7) Lokalisation n p(1 466 0,046 466 0,077 466 0,026 Proximal 146 (31,3) 62 (42,5) 84 (57,5) 104 (71,2) 42 (28,8) 111 (76,0) 35 (24,0) Distal 320 (68,7) 169 (52,8) 151 (47,2) 253 (79,1) 67 (20,9) 272 (85,0) 48 (15,0) Laurén Phänotyp n p(1 468 0,884 468 0,408 468 0,023 Intestinal 240 (51,3) 118 (49,2) 122 (50,8) 178 (74,2) 62 (25,8) 190 (79,2) 50 (20,8) Diffus 148 (31,6) 72 (48,6) 76 (51,4) 116 (78,4) 32 (21,6) 127 (85,8) 21 (14,2) Gemischt 31 (6,6) 15 (48,4) 16 (51,6) 27 (87,1) 4 (12,9) 30 (96,8) 1 (3,2) Unklassifizierbar 49 (10,5) 27 (55,1) 22 (44,9) 37 (75,5) 12 (23,5) 37 (75,5) 12 (24,5) Grading n p(1 468 0,588 468 0,305 468 0,570 G1 / G2 110 (23,5) 52 (47,3) 58 (52,7) 80 (72,7) 30 (27,3) 88 (80,0) 22 (20,0) G3 / G4 358 (76,5) 180 (50,3) 178 (49,7) 278 (77,7) 80 (22,3) 296 (82,7) 62 (17,3) T n p(1 468 0,522 468 0,626 468 0,208 T1a / T1b 58 (12,4) 27 (46,6) 31 (53,4) 45 (77,6) 13 (22,4) 48 (82,8) 10 (17,2) T2 53 (11,3) 30 (56,6) 23 (43,4) 46 (86,8) 7 (13,2) 42 (79,2) 11 (20,8) T3 185 (39,5) 84 (45,4) 101 (54,6) 128 (69,2) 57 (30,8) 146 (78,9) 39 (21,1) T4a / T4b 172 (36,8) 91 (52,9) 81 (47,1) 139 (80,8) 33 (19,2) 148 (86,0) 24 (14,0) N n p(1 467 0,949 467 0,742 467 0,528 N0 134 (28,6) 68 (50,7) 66 (49,3) 106 (79,1) 28 (20,9) 109 (81,3) 25 (18,7) N1 64 (13,7) 28 (43,8) 36 (56,3) 40 (62,5) 24 (37,5) 46 (71,9) 18 (28,1) N2 84 (18,0) 45 (53,6) 39 (46,4) 67 (79,8) 17 (20,2) 76 (90,5) 8 (9,5) N3a/b 185 (39,6) 91 (49,2) 94 (80,8) 144 (77,8) 41 (22,2) 152 (82,2) 33 (17,8) Ergebnisse 29 SMARCE1 Expression im Zellkern SMARCE1 Expression im Zellkern SMARCE1 Intensität 3+ präsent Total Histoscore niedrig (< 120) Histoscore hoch (≥ 120) Q123 Q4 fehlt präsent n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) M n p(1 468 0,241 468 0,098 468 0,647 M0 378 (80,8) 182 (48,1) 196 (51,9) 283 (74,9) 95 (25,1) 308 (81,5) 70 (18,5) M1 90 (19,2) 50 (55,6) 40 (44,4) 75 (83,3) 15 (16,7) 76 (84,4) 14 (15,6) UICC-Stadium n p(1 467 0,450 467 0,441 467 0,638 IA / IB 81 (17,3) 41 (50,6) 40 (49,4) 66 (81,5) 15 (18,5) 67 (82,7) 14 (17,3) IIA / IIB 99 (21,2) 46 (46,5) 53 (53,5) 69 (69,7) 30 (30,3) 79 (79,8) 20 (20,2) IIIA / IIIB / IIIC 197 (42,2) 95 (48,2) 102 (51,8) 147 (74,6) 50 (25,4) 161 (81,7) 36 (18,3) IV 90 (19,3) 50 (55,6) 40 (44,4) 75 (83,3) 15 (16,7) 76 (84,4) 14 (15.6) LN Ratio n p(1 467 0,926 467 0,329 467 0,336 niedrig (<0.189) 227 (48,6) 112 (49,3) 115 (50,7) 169 (74,4) 58 (25,6) 182 (80,2) 45 (19,8) hoch (≥0.189) 240 (51,4) 120 (50,0) 10 (50,0) 188 (78,3) 52 (21,7) 201 (83,8) 39 (16,3) L n p(1 449 0,131 449 0,377 449 0,271 L0 219 (48,8) 115 (52,5) 104 (47,5) 171 (78,1) 48 (21,9) 184 (84,0) 35 (16,0) L1 230 (51,2) 104 (45,2) 126 (54,8) 171 (74,3) 59 (25,7) 183 (79,6) 47 (20,4) V n p(1 448 0,290 448 0,154 448 0,170 V0 399 (89,1) 198 (49,6) 201 (50,4) 308 (77,2) 91 (22,8) 329 (82,5) 70 (17,5) V1 49 (10,9) 20 (40,8) 29 (59,2) 33 (67,3) 16 (32,7) 36 (73,5) 13 (26,5) R n p(1 464 0,575 464 1,000 464 1,000 R0 406 (87,5) 198 (48,8) 208 (51,2) 310 (76,4) 96 (23,6) 333 (82,0) 73 (18,0) R1 / R2 58 (12,5) 31 (53,4) 27 (46,6) 45 (77,6) 13 (22,4) 48 (82,8) 10 (17,2) HER2 n p(1 437 0,223 437 0,305 437 0,038 Negativ 401 (91,8) 204 (50,9) 197 (49,1) 310 (77,3) 91 (22,7) 336 (83,8) 65 (16,2) Positiv 36 (8,2) 14 (38,9) 22 (61,1) 25 (69,4) 11 (30,6) 25 (69,4) 11 (30,6) MET n p(1 456 0,147 456 1,000 456 0,635 Negativ 423 (92,8) 216 (51,1) 207 (48,9) 325 (76,8) 98 (23,2) 349 (82,5) 74 (17,5) Positiv 33 (6,9) 12 (36,4) 21 (63,6) 26 (78,8) 7 (21,2) 26 (78,8) 7 (21,2) ARID1A jede Expression vs. kompletter Verlust n p(1 415 0,000* 415 0,000 415 0,165 Histoscore = 0 (Verlust) 45 (10,8) 38 (84,4) 7 (15,6) 43 (95,6) 2 (4,4) 40 (88,9) 5 (11,1) Histoscore > 0 370 (89,2) 157 (42,4) 213 (57,6) 268 (72,4) 102 (27,6) 295 (79,7) 75 (20,3) ARID1A B/W vs. non-B/W n p(1 392 0,075 392 0,215 392 0,093 non-B/W 370 (94,4) 157 (42,4) 213 (57,6) 268 (72,4) 102 (27,6) 295 (79,7) 75 (20,3) B/W 22 (5,6) 14 (63,6) 8 (36,4) 19 (86,4) 3 (13,6) 21 (95,5) 1 (4,5) ARID1A Verlust o. B/W vs. Rest n p(1 437 0,000* 437 0,000 437 0,027 Ergebnisse 30 SMARCE1 Expression im Zellkern SMARCE1 Expression im Zellkern SMARCE1 Intensität 3+ präsent Total Histoscore niedrig (< 120) Histoscore hoch (≥ 120) Q123 Q4 fehlt präsent n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) Rest 370 (84,7) 157 (42,4) 213 (57,6) 268 (72,4) 102 (27,6) 295 (79,7) 75 (20,3) Verlust o. B/W 67 (15,3) 52 (77,6) 15 (22,4) 62 (92,5) 5 (7,5) 61 (91,0) 6 (9,0) TP53 Histoscore Median n p(1 459 0,007 459 0,743 459 0,116 niedrig (Histoscore ≤ 91.5) 230 (50,1) 128 (55,7) 102 (44,3) 177 (77,0) 53 (23,0) 195 (84,8) 35 (15,2) hoch (Histoscore > 91.5) 229 (49,9) 98 (42,8) 131 (57,2) 173 (75,5) 56 (24,5) 181 (79,0) 48 (21,0) TP53 Histoscore Quartile n p(1 459 0,020 459 0,038 459 0,398 Q1/Q4 229 (49,9) 100 (43,7) 129 (56,3) 165 (72,1) 64 (27,9) 184 (80,3) 45 (19,7) Q2/Q3 230 (50,1) 126 (54,8) 104 (45,2) 185 (80,4) 45 (19,6) 192 (83,5) 38 (16,5) TP53 IHC Group n p(1 459 0,448 459 0,075 459 1,000 Normal (IHC0 < 90% and IHC3 < 50%) 274 (59,7) 139 (50,7) 135 (49,3) 217 (79,2) 57 (20,8) 224 (81,8) 50 (18,2) Extrem (IHC0 ≥ 90% o. IHC3 ≥ 50%) 185 (40,3) 87 (47,0) 98 (53,0) 133 (71,9) 52 (28,1) 152 (82,2) 33 (17,8) TP53 Mutation n p(1 107 0,153 107 0,240 107 0,445 wt o. silent Mutation 72 (67,3) 40 (55,6) 32 (44,4) 57 (79,2) 15 (20,8) 59 (81,9) 13 (18,1) Mutation 35 (32,7) 14 (40,0) 21 (60,0) 24 (68,6) 11 (31,4) 26 (74,3) 9 (25,7) SMAD4 Cyt Histoscore Q123/Q4 n p(1 458 0,050 458 0,220 458 0,128 Q123 364 (79,5) 189 (51,9) 175 (48,1) 283 (77,7) 81 (22,3) 305 (83,8) 59 (16,2) Q4 94 (20,5) 38 (40,4) 56 (59,6) 67 (71,3) 27 (28,7) 72 (76,6) 22 (23,4) SMAD4 Nuc HScore0 n p(1 458 0,707 458 0,824 458 0,220 präsent 260 (56,8) 131 (50,4) 129 (49,6) 200 (76,9) 60 (23,1) 219 (84,2) 41 (15,8) fehlt 198 (43,2) 96 (48,5) 102 (51,5) 150 (75,8) 48 (24,2) 158 (79,8) 40 (20,2) H. pylori n p(1 396 0,674 396 1,000 396 0,267 Negativ 336 (84,8) 170 (50,6) 166 (49,4) 259 (77,1) 77 (22,9) 275 (81,8) 61 (18,2) Positiv 60 (15,2) 28 (46,7) 32 (53,3) 46 (76,7) 14 (23,3) 53 (88,3) 7 (11,7) EBV-Status n p(1 453 0,036 453 0,583 453 1,000 Negativ 434 (95,8) 210 (48,4) 224 (51,6) 330 (76,0) 104 (24,0) 356 (82,0) 78 (18,0) Positiv 19 (4,2) 14 (73,7) 5 (26,3) 16 (84,2) 3 (15,8) 16 (84,2) 3 (15,8) MSI Status n p(1 452 0,000* 452 0,001 452 0,170 MSS 417 (92,3) 194 (46,5) 223 (53,5) 311 (74,6) 106 (25,4) 339 (81,3) 78 (18,7) MSI 35 (7,7) 30 (85,7) 5 (14,3) 34 (97,1) 1 (2,9) 32 (91,4) 3 (8,6) PIK3CA n p(1 461 1,000 461 0,806 461 1,000 Wildtyp 437 (94,8) 219 (50,1) 218 (49,9) 336 (76,9) 101 (23,1) 359 (82,2) 78 (17,8) Ergebnisse 31 SMARCE1 Expression im Zellkern SMARCE1 Expression im Zellkern SMARCE1 Intensität 3+ präsent Total Histoscore niedrig (< 120) Histoscore hoch (≥ 120) Q123 Q4 fehlt präsent n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) mutiert 24 (5,2) 12 (50,0) 12 (50,0) 18 (75,0) 6 (25,0) 20 (83,3) 4 (16,7) KRAS n p(1 461 0,323 461 0,382 461 1,000 Wildtyp 444 (96,3) 220 (49,5) 224 (50,5) 339 (76,4) 105 (23,6) 365 (82,2) 79 (17,8) mutiert 17 (3,7) 11 (64,7) 6 (35,3) 15 (88,2) 2 (11,8) 14 (82,4) 3 (17,6) RHOA n p(1 400 0,803 400 0,245 400 0,200 Wildtyp 384 (96,0) 178 (46,4) 206 (53,6) 290 (75,5) 94 (24,5) 313 (81,5) 71 (18,5) mutiert 16 (4,0) 8 (50,0) 8 (50,0) 10 (62,5) 6 (37,5) 11 (68,8) 5 (31,3) Jede Mutation n p(1 37 0,515 37 1,000 37 0,713 Wildtyp 23 (62,2) 11 (47,8) 12 (52,2) 15 (65,2) 8 (34,8) 17 (73,9) 6 (26,1) Mind. 1 Mutation 14 (37,8) 5 (35,7) 9 (64,3) 10 (71,4) 4 (28,6) 9 (64,3) 5 (35,7) E-Cadherin n p(1 431 0,127 431 0,197 431 0,062 negativ 317 (73,5) 166 (52,4) 151 (47,6) 248 (78,2) 69 (21,8) 268 (84,5) 49 (15,5) positiv 114 (26,5) 50 (43,9) 64 (56,1) 82 (71,9) 32 (28,1) 87 (76,3) 27 (23,7) ß-Catenin n p(1 433 0,122 433 0,451 negativ 245 (56,6) 128 (52,2) 117 (47,8) 204 (83,3) 41 (16,7) positiv 188 (43,4) 84 (44,7) 104 (55,3) 151 (80,3) 37 (19,7) Overall Survival [Monate] p(3) 456 0,931 456 0,498 456 0,913 Total / Events / zensiert 224/173/51 232/181/51 347/269/78 109/85/24 374/288/86 82/66/16 Median Survival 14,0 ± 1,8 15,6 ± 1,4 14,1 ± 1,2 16,7 ± 2,6 14,6 ± 1,1 16,0 ± 4,0 95% C.I. 10,5 – 17,5 12,9 – 18,3 11,7 – 16,4 11,7 – 21,7 12,6 – 16,7 8,2 -23,8 Tumor Specific Survival [Monate] p(3) 427 0,610 427 0,320 427 0,471 Total / Events / zensiert 207/142/65 220/147/73 323/221/102 104/68/36 349/238/111 78/51/27 Median Survival 14,7 ± 1,9 17.1 ± 1,9 15,5 ± 1,5 19,5 ± 3,3 15,5 ± 1,4 22,2 ± 2,7 95% C.I. 11,0 – 18,3 13,3 – 20,8 12,6 – 18,3 13,1 – 25,9 12,8 – 18,2 16,9 - 27,5 Ergebnisse 32 Tabelle 7: Statistische Auswertung der Expression von SMARCA4 und der Dysregulation des SWI-/SNF-Komplexes (1) Fisher's exact Test, (2) Kendall's tau Test, (3) log-rank Test, die nach angewandter Multiple-Testing-Korrektur signifikant verbliebenen Werte wurden mit * markiert. Teile dieser Tabelle wurden bereits publiziert © Pries et al. Cancer Medicine published by John Wiley & Sons Ltd. [56]. SMARCA4 Expression im Zellkern SMARCA4 Expression im Zellkern Dysregulation von SMARCE1 und SMARCA4 Total Histoscore niedrig (≤ 175) Histoscore hoch (> 175) Q1 Q234 Beide Histoscore niedrig Beide Histoscore hoch n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) Total 236 231 117 350 148 (31,6) 147 (31,4) Geschlecht n p(1 467 0,128 467 0,443 295 0,476 Weiblich 179 (38,2) 82 (45,8) 97 (54,2) 41 (22,9) 138 (77,1) 55 (47,4) 61 (52,6) Männlich 289 (61,8) 154 (53,5) 134 (46,5) 76 (26,4) 212 (73,6) 93 (52,0) 86 (48,0) Alter n p(1 467 0,267 467 0,749 295 0,201 < 68 Jahre 237 (50,6) 113 (47,9) 123 (52,1) 61 (25,8) 175 (74,2) 68 (46,3) 79 (53,7) >= 68 Jahre 231 (49,4) 123 (53,2) 108 (46,8) 56 (24,2) 175 (75,8) 80 (54,1) 68 (45,9) Lokalisation n p(1 465 0,369 465 0,731 294 0,526 Proximal 146 (31,3) 79 (54,1) 67 (45,9) 35 (24,0) 111 (76,0) 42 (47,2) 47 (52,8) Distal 320 (68,7) 157 (49,2) 162 (50,8) 82 (25,7) 237 (74,3) 106 (51,7) 99 (48,3) Laurén Phänotyp n p(1 467 0,031 467 0,179 295 0,210 Intestinal 240 (51,3) 134 (56,1) 105 (43,9) 69 (28,9) 170 (71,1) 82 (54,3) 69 (45,7) Diffus 148 (31,6) 63 (42,6) 85 (57,4) 30 (20,3) 118 (79,7) 39 (42,9) 52 (57,1) Gemischt 31 (6,6) 12 (38,7) 19 (61,3) 5 (16,1) 26 (83,9) 8 (40,0) 12 (60,0) Unklassifizierbar 49 (10,5) 27 (55,1) 22 (44,9) 13 (26,5) 36 (73,5) 19 (57,6) 14 (42,4) Grading n p(1 467 0,021 467 0,377 295 0,266 G1 / G2 110 (23,5) 66 (60,6) 43 (39,4) 31 (28,4) 78 (71,6) 38 (56,7) 29 (43,3) G3 / G4 358 (76,5) 170 (47,5) 188 (52,5) 86 (24,0) 272 (76,0) 110 (48,2) 118 (51,8) T n p(1 467 0,434 467 0,592 295 0,878 T1a / T1b 58 (12,4) 25 (43,9) 32 (56,1) 15 (26,3) 42 (73,7) 14 (42,4) 19 (57,6) T2 53 (11,3) 34 (64,2) 19 (35,8) 13 (24,5) 40 (75,5) 21 (67,7) 10 (32,3) T3 185 (39,5) 95 (51,4) 90 (48,6) 49 (26,5) 136 (73,5) 59 (47,6) 65 (52,4) T4a / T4b 172 (36,8) 82 (47,7) 90 (52,3) 40 (23,3) 132 (76,7) 54 (50,5) 53 (49,5) N n p(1 466 0,153 466 0,144 294 0,349 N0 134 (28,6) 76 (56,7) 58 (43,3) 38 (28,4) 96 (71,6) 46 (56,1) 36 (43,9) N1 64 (13,7) 28 (43,8) 36 (56,3) 18 (28,1) 46 (71,9) 17 (40,5) 25 (59,5) N2 84 (18,0) 45 (54,2) 38 (45,8) 21 (25,3) 62 (74,7) 31 (56,4) 24 (43,6) N3a/b 185 (39,6) 87 (47,0) 98 (53,0) 40 (21,6) 145 (78,4) 54 (47,0) 61 (53,0) M n p(1 467 0,348 467 0,417 295 1,000 M0 378 (80,8) 195 (51,7) 182 (48,3) 98 (26,0) 279 (74,0) 118 (50,0) 118 (50,0) M1 90 (19,2) 41 (45,6) 49 (54,4) 19 (21,1) 71 (78,9) 30 (50,8) 29 (49,2) UICC-Stadium n p(1 466 0,208 466 0,173 294 0,731 Ergebnisse 39 Tabelle 8: Vergleich SMARCE1 und HER2 IHC und CISH Aufgeführt ist der jeweilige Histoscore des untersuchten Falls, welcher die Ausprägung der Expression von SMARCE1 wiedergeben soll. Sowie die Ausprägung der Expression von HER2 in der Immunhistochemie, und die Amplifikation von HER2 in der CISH, welche in einer vorangegangenen Studie des Instituts für Pathologie am UKSH Kiel untersucht wurden [57].Teile dieser Tabelle wurden bereits publiziert © Pries et al. Cancer Medicine published by John Wiley & Sons Ltd. [56] Nr. SMARCE1 Histoscore HER2 Immunhistochemie HER2 Amplifikation Bemerkung Komplette Übereinstimmung 31 280 2+ + 25 255 3+ X HER2 Amplifikation nicht bewertbar. 26 250 3+ + 17 230 3+ + 18 220 3+ + 34 215 3+ + 30 185 3+ + 32 185 2+ + 8 175 3+ + 4 165 3+ + 5 160 3+ + 13 160 2+ + 9 140 3+ + 24 140 3+ X HER2 Amplifikation nicht bewertbar. 1 130 3+ + 6 110 2+ + 27 105 3+ + 14 95 3+ + 15 85 3+ + 2 50 3+ + Partielle Übereinstimmung 11 230 3+ + Partielle Übereinstimmung. SMARCE1 und HER2 positive Tumorareale stimmen überein. Es zeigt sich jedoch ein stark positives Areal für SMARCE1, welches HER2 negativ ist. 12 190 3+ + Die Expression von HER2 ist heterogen. HER2 positive Areale sind stark SMARCE1 positiv. 33 180 3+ + Die Expression von HER2 ist heterogen. Die Expression von SMARCE1 ist weit verbreitet, zeigt jedoch keine Variation. 7 170 3+ + Der Großteil des Tumors ist muzinös. Übereinstimmung nur im nicht muzinösen Tumoranteil. Der muzinöse Tumoranteil ist komplett HER2 negativ aber SMARCE1 positiv. 19 115 3+ + Die Expression von HER2 ist heterogen. HER2 positive Areale sind stark SMARCE1 positiv. 28 110 2+ + Partielle Übereinstimmung. SMARCE1 und HER2 positive Tumorareale stimmen überein. Es zeigt sich jedoch ein stark positives Areal für SMARCE1, welches HER2 negativ ist. 29 85 3+ X HER2 negative Tumorareale sind teilweise SMARCE1 positiv. HER2 Amplifikation nicht bewertbar. Ergebnisse 40 Nr. SMARCE1 Histoscore HER2 Immunhistochemie HER2 Amplifikation Bemerkung 21 75 3+ + Die Expression von HER2 ist heterogen. HER2 positive Areale sind stark SMARCE1 positiv. Keine Übereinstimmung 35 170 3+ X HER2 positive und SMARCE1 positive Areale sind unterschiedlich verteilt. HER2 Amplifikation nicht bewertbar. 16 165 3+ X Großflächig HER2 positive Areale sind SMARCE1 negativ. HER2 Amplifikation nicht bewertbar. 23 120 2+ + Das kleine HER2 positive Areal ist komplett SMARCE1 negativ. Große SMARCE1 positive Areale sind HER2 negativ. 22 105 3+ + Der große HER2 positive Bereich ist in der SMARCE1 Färbung nicht vorhanden. Der kleine HER2 positive Bereich, welcher in der SMARCE1 Färbung enthalten ist, ist SMARCE1 negativ. Große SMARCE1 positive Areale sind HER2 negativ. 20 70 3+ X Die HER2 positiven Areale sind zum Teil SMARCE1 positiv und negativ. HER2 Amplifikation nicht bewertbar. 36 50 3+ + SMARCE1 ist größtenteils negativ (Histoscore 50!). Die positiven Areale für HER2 und SMARCE1 sind unterschiedlich verteilt. 3 1 3+ + Das kleine HER2 positive Areal ist komplett SMARCE1 negativ (Histoscore 1!). 10 / Kein Gewebe für SMARCE1 Immunhistochemie vorhanden. 37 100 Das HER2 positive Areal ist in der Färbung für SMARCE1 auf Grund einer anderen Tumorebene nicht vorhanden. 4.4 Amplifikation von SMARCE1 in der ddPCR Die Analyse der Amplifikation mit Hilfe der ddPCR ergab eine Amplifikation von SMARCE1 in 4 von 34 Fällen. Dabei wurden Fälle mit einer CNV (Copy-Number-Variation) > 3 als amplifiziert gewertet. Die Größe der CNV reichte dabei von 3,99 (erste ddPCR) /3,81(zweite ddPCR) bis 20/19,3 (siehe Tabelle 9). In 3 Fällen lag nicht ausreichend Material für eine zweite ddPCR vor [56]. 4.5 Amplifikation von SMARCE1 und ERBB2 Die durchgeführte ddPCR zeigte in 4 von 34 untersuchten Fällen eine Amplifikation von SMARCE1. Bei drei von diesen Fällen war zuvor schon auf eine Amplifikation von ERBB2 untersucht und als amplifiziert klassifiziert worden [57]. Damit konnte in 3 von 4 (75%) Fällen eine Ko-Amplifikation von SMARCE1 und ERBB2 nachgewiesen werden. In einem Fall lag zwar eine Amplifikation von ERBB2 vor, es konnte jedoch keine Ergebnisse 41 Amplifikation von SMARCE1 gefunden werden. Die folgende Tabelle 3.6 stellt die Ergebnisse der Amplifikationsanalyse von SMARCE1 in Gänze dar [56]. Tabelle 9: Amplifikationsanalyse von SMARCE1 durch ddPCR Angegeben sind die Größe der Tumorareale in der jeweiligen in der Immunhistochemie nachgewiesene Expressionsintensität von SMARCE1, die Werte der CNV aus der ersten und zweiten ddPCR mit der zugehörigen abschließenden Bewertung sowie die Daten des Studienkollektivs zum Amplifikationsstatus von HER2 aus CISH-Untersuchungen vorangegangener Studien des Instituts für Pathologie am UKSH Kiel [57]. In 3 Fällen lag kein Material für eine zweite ddPCR vor: n.a. = nicht anwendbar. Teile dieser Tabelle wurden bereits publiziert © Pries et al. Cancer Medicine published by John Wiley & Sons Ltd. [56] Nr. SMARCE1 Intensität 0 %-Areal SMARCE1 Intensität 1+ %-Areal SMARCE1 Intensität 2+ %-Areal SMARCE1 Intensität 3+ %-Area SMARCE1 Histoscore CNV SMARCE1 erste ddPCR CNV SMARCE1 zweite ddPCR SMARCE1 Amplifikation ERBB2 Amplifikation Potentiell amplifizierte Fälle mit hoher SMARCE1 Expression 1 0 30 10 60 230 2,33 2,48 - - 2 0 10 10 80 270 3,99 3,81 + - 3 0 10 0 90 280 2,08 2,39 - - 4 0 0 70 30 230 2,08 2,08 - - 5 0 10 50 40 230 20,00 19,30 + + 6 0 15 65 20 205 2,56 2,59 - - 7 0 20 10 70 250 10,4 11,40 + + 8 0 0 80 20 220 2,29 2,36 - - 9 0 5 35 60 255 2,29 2,51 - - 10 5 40 35 20 170 2,77 2,85 - - 11 10 0 70 20 200 2,19 2,20 - - 12 0 5 10 85 280 8,82 9,6 + + 13 0 5 70 25 220 2,31 2,21 - - 14 0 0 30 70 270 1,89 1,94 - - 15 0 0 60 40 240 2,06 n.a. - - 16 0 20 50 30 210 2,03 2,27 - - Potentiell nicht amplifizierte Fälle mit niedriger SMARCE1 Expression 17 95 5 0 0 5 2,42 2,59 - - 18 95 5 0 0 5 2,24 2,90 - - 19 95 5 0 0 5 2,01 2,37 - - 20 95 5 0 0 5 2,23 2,53 - - Ergebnisse 42 21 0 10 90 0 190 2,83 2,83 - - 22 5 0 95 0 190 2,21 n.a. - + 23 0 5 90 5 200 2,28 2,44 - - 24 1 5 90 4 197 2,3 2,38 - - 25 0 10 90 0 190 2,84 3,14 - - 26 0 0 90 10 210 2,35 2,48 - - 27 0 10 89 1 191 2,55 2,31 - - 28 0 0 95 5 205 2,31 2,24 - - 29 0 5 93 2 197 2,26 n.a. - - 30 0 5 95 0 195 2,6 2,57 - - 31 0 0 95 5 205 1,91 1,95 - - 32 0 10 85 5 195 3 3,30 - - 33 5 5 80 10 195 2,55 2,42 - - 34 0 10 85 5 195 2,59 2,42 - - Diskussion 43 5 Diskussion Der SWI-/SNF-Komplex ist als Chromatin-Remodeller in der Lage, epigenetische Veränderungen zu vermitteln. Dies bietet Raum für neue Möglichkeiten in der zukünftigen Medizin, speziell in der Diagnostik und Therapie von Krebspatienten. Dennoch ist der potentielle Einfluss einer Dysregulation dieses Komplexes weitestgehend unbekannt, so auch in Bezug auf das Magenkarzinom. Zu einigen Untereinheiten des SWI-/SNFKomplexes gab es in der Vergangenheit bereits einzelne Studien, welche jedoch hauptsächlich aus dem asiatischen Raum stammten. Dies ist zunächst nachvollziehbar, ist hier doch die Inzidenz für Magenkarzinome im weltweiten Vergleich am höchsten [1]. Dennoch ist nicht klar, ob sich die Ergebnisse auch auf die Weltbevölkerung übertragen lassen. So gibt es doch zahlreiche Umwelteinflüsse, die zur Entstehung eines Magenkarzinoms beitragen können. Unter anderem gelten die Ernährungsgewohnheiten, welche sich abhängig von der jeweiligen Kultur stark unterscheiden können, als Einflussfaktor in der Ätiopathogenese (siehe Kapitel 1.1.2 „Ätiopathogenese“)[14, 15, 18–20, 22, 23]. Eine kürzlich erschienene Studie konnte zeigen, dass eine hohe Expression von SMARCE1 zu einer schlechteren Prognose führte und die Metastasierung vorantrieb [53]. Die aktuelle Studienlage zum Einfluss der Untereinheit SMARCA4 auf die Tumorbiologie ist ambivalent. Einige kommen zu dem Ergebnis, eine hohe Expression sei mit einem vorangeschrittenen Tumorstadium und einer schlechteren Prognose assoziiert [45, 67], andere weisen auf eine Funktion als Tumorsuppressor hin [42, 47]. In dieser Studie wurde eine unabhängige Kohorte von westlichen Magenkarzinomen auf den potenziellen tumorbiologischen Einfluss bezüglich der Expression von SMARCA4 und SMARCE1 sowie die Expressionsmuster selbst und Zusammenhänge mit wichtigen genetischen Charakteristika wie Mikrosattelitenstabilität, untersucht [56]. 5.1 Methodische Diskussion Zum Nachweis von SMARCA4 und SMARCE1 auf Proteinebene wurde die Immunhistochemie gewählt. Die Immunhistochemie gilt als gängiges und verlässliches Verfahren zur Darstellung der Expression spezifischer Genprodukte. Nach wiederholten Färbungen zur Etablierung der Antikörper ergab der Antikörper zur SMARCA4-Färbung die besten Ergebnisse in der Verdünnung 1:400 mit EDTA als Puffer. Für SMARCE1 Diskussion 44 wurde die Färbung mit einer Verdünnung des Antikörpers in 1:300 mit EDTA als Puffer etabliert. Die Färbungen mit Citrat ergaben zwar ebenfalls gute Ergebnisse, jedoch musste dazu eine geringere Verdünnung der Antikörper genutzt werden, welches einen höheren Verbrauch an Antikörper insgesamt bedeutet hätte. Aus diesen Gründen entschied ich mich, bei gleichwertigem Ergebnis für eine Färbung mit EDTA als Puffer. Als interne Kontrolle des Färbeerfolgs von SMARCA4 und SMARCE1 wurden das nicht neoplastische Epithel sowie Lymphozyten für SMARCE1 genutzt. Die Färbung selbst erfolgte automatisiert, sodass Schwankungen in der Durchführung durch die durchführende Person auszuschließen sind. Die Verdünnung des jeweilig genutzten Antikörpers erfolgte jedoch händisch, hier sind geringe Inkonsistenzen denkbar. Zur Auswertung der immunhistochemischen Färbung von SMARCA4 und SMARCE1 wurde der Histoscore genutzt, welcher auf einer individuellen Einschätzung des Untersuchers zur Intensität und anteiliger Größe der Tumorareale beruht. Um eine Beständigkeit in der Einschätzung der Intensitäten zu gewährleisten, wurden vorab Vergleichsfälle ausgewählt und während der Auswertung hinzugezogen. Dennoch beruht die Angabe des Anteils einer Intensität innerhalb des abgebildeten Tumorgewebes auf Schätzungen und kann von der exakten, nicht bestimmbaren Prozentzahl abweichen. Es wird davon ausgegangen, dass sich Ungenauigkeiten beim Schätzen durch ebenso oft vorkommendes Überwie Unterschätzen desselben Untersuchers ausgleichen. Die Auswertung der immunhistochemischen Färbungen mit Hilfe des Histoscores wurden daher nur durch einen Untersucher durchgeführt. Die so untersuchten Fälle wurden erst nach Abschluss der Auswertung anhand des Medians dichotomiert und in Quartile eingeteilt, um eine Beeinflussung der Ergebnisse durch die Auswertung der IHC selbst zu verhindern. Zur Auswertung einer potentiellen Ko-Expression von SMARCE1 und Her2/neu wurde beim immunhistochemischen Vergleich sowie beim Vergleich mit der CISH darauf geachtet, dass die jeweilige genutzte Tumorebene innerhalb eines Falls dieselbe war oder zumindest anteilig miterfasst, um falsch negative Ergebnisse durch intratumorale Heterogenität und Stichprobenfehler auszuschließen oder wenigstens zu reduzieren. Für die Analyse der Amplifikation von SMARCE1 kam die ddPCR zur Anwendung, da es keine kommerziellen Sonden für eine in situ-Hybridisierung gab. Die ddPCR bietet im Vergleich zu herkömmlichen PCR-Verfahren wie der qPCR (Real-Time PCR) viele Diskussion 45 Vorteile. Dazu zählt die größere Toleranz gegenüber mit der DNA ko-isolierten Inhibitoren, welche besonders großen Einfluss bei der Amplifikationsanalyse hat. Die koisolierten Inhibitoren führen bei einer qPCR zu einer Verringerung der Effizienz der PCR und einem erhöhten Cq-Wert (Schwellenwert, ab wie viel Zyklen in der PCR eine Probe ein positives Signal ergibt). Infolgedessen wird eine geringere Kopienzahl gemessen als die eigentliche durch die Ausgangsmenge erreichte. Bei der ddPCR greifen gleich zwei Mechanismen, welche diesem Effekt entgegenwirken. Zum einen werden bei der ddPCR positive und negative Signale im Verhältnis zueinander ausgewertet, sodass der Einfluss der Inhibitoren erst dann sichtbar wird, wenn durch die Inhibitoren ein positives Signal als negatives Signal gewertet wird. Zum anderen werden die Proben zur Durchführung der ddPCR stark verdünnt, sodass auch die Inhibitoren stark verdünnt werden [68]. Dadurch gelingt mit Hilfe der ddPCR eine wesentlich sensitivere und genauere Analyse der Kopienzahl des gesuchten DNA-Abschnitts und damit eine bessere Amplifikationsanalyse. 5.2 Expression von SMARCA4 und SMARCE1 Intratumorale Heterogenität konnte bereits für viele Biomarkern nachgewiesen werden [36, 57, 61, 69]. Die meisten der in dieser Studie eingeschlossenen Fälle zeigten ein diffus verteiltes Expressionsmuster unterschiedlicher Färbeintensitäten innerhalb eines Tumors für sowohl SMARCA4 als auch SMARCE1. Dieses Muster, welches als „grey-scale“ bezeichnet wird und sich auf ineinander übergehende Färbeintensitäten bezieht (siehe Abb. 2), wurde in 95,2 % (446 Fälle) aller für SMARCA4 gefärbten Fälle gefunden. 98,9 % (463 Fälle) der für SMARCE1 gefärbten Magenkarzinome zeigten ebenfalls ein Expressionsmuster in Graustufen. In 5 (1 %) Fällen konnte ein kompletter Verlust der Expression von SMARCA4 nachgewiesen werden. Ein kompletter Verlust der Expression von SMARCE1 wurde nur in einem Fall beobachtet (0,2 %). Ein partieller Verlust der Expression, welcher sich als „black-and-white“ Muster in der Färbung zeigte (siehe Abb. 2), konnte für SMARCA4 in 16 (3 %) Fällen nachgewiesen werden, für SMARCE1 in 3 (0,6 %) Fällen. Diese Ergebnisse führen zu dem Schluss, dass die Einschätzung des Verlusts der Expression von SMARCA4 und SMARCE1 in kleinen Gewebeproben wie z. B. Biopsien (Tumorstanzen) oder Tissue Micro Array Untersuchungen (TMA) anfällig für Stichprobenfehler ist [56]. Diskussion 46 Damit konnte die Hypothese, dass SMARCA4 und SMARCE1 im Magenkarzinom unterschiedliche Arten der Expression sowie intratumorale Heterogenität zeigen, bestätigt werden. SMARCA4 und SMARCE1 zählen zu den Untereinheiten des SWI-/SNF-Komplexes [42]. Die erhobenen Daten weisen auf eine Korrelation der Expression von SMARCA4 mit SMARCE1 und umgekehrt hin. Eine niedrige Expression von SMARCA4 korrelierte signifikant mit einer niedrigen Expression von SMARCE1 (p <0,001, siehe Tabelle 7). Dies allein erlaubt jedoch noch keinen Schluss zur Dysregulation der Untereinheiten. Schließlich wird für SMARCE1 eine hohe Expression als dysreguliert angenommen, während für SMARCA4 ein Verlust der Expression von Relevanz zu sein scheint [53, 70, 71]. Es veranschaulicht jedoch, dass die Dysregulation des SWI-/SNF-Komplexes komplex ist und vermutlich mehr als eine einzelne Untereinheit daran beteiligt ist. Diese Annahme wird durch zusätzliche Daten der Untersuchung gestützt, so konnte ein signifikanter Zusammenhang zwischen der Expression von sowohl SMARCA4 als auch SMARCE1 mit ARID1A festgestellt werden, welches eine weitere Untereinheit des SWI/SNF-Komplexes darstellt [42]. In früheren Studien des Instituts für Pathologie des UKSH Kiel wurde bereits der Nachweis intratumoraler Heterogenität von ARID1A erbracht. Des Weiteren wurde in der Studie zu ARID1A ein Zusammenhang zwischen dem Verlust von ARID1A mit einer erhöhten Expression von PD-L1 sowie mit dem EBVund Mikrosattelitenstatus festgestellt, welcher unabhängig von der prozentual vom Verlust betroffenen Tumorfläche bestand [65, 72]. Schließlich könnten einzelne Bereiche eines Tumors von einer biologisch relevanten Dysregulation des SWI-SNFKomplexes betroffen sein, welche z.B. durch inaktivierende Mutationen von ARID1A [43] vermittelt wird und weitere Untereinheiten des SWI-SNF-Komplexes betreffen kann. Dies kompliziert das Verständnis des Zusammenhangs mit dem Patientenüberleben. So konnte, einzeln für SMARCA4 und SMARCE1 betrachtet, kein Zusammenhang mit dem Patientenüberleben nachgewiesen werden (siehe Abb. 3 - 6) [56]. 5.3 SMARCA4, SMARCE1 und andere tumorbiologische Eigenschaften In dieser Studie wurde der Zusammenhang von SMARCA4 und SMARCE1 mit klinisch-pathologischen Patientencharakteristika untersucht. Ein bekannter Biomarker Diskussion 47 bei Tumoren ist TP53, welcher als Tumorsuppressor häufig in verschiedenen Karzinomen mutiert vorliegt. Zu diesen Karzinomen zählt auch das Magenkarzinom [32, 73]. Dabei ist TP53 nicht in allen Magenkarzinomen gleich häufig mutiert. Es konnte in der Vergangenheit gezeigt werden, dass Mutationen von TP53 zwar nur selten bei EBVpositiven Magenkarzinomen vorkommen, jedoch oft bei chromosomal instabilen (CIN) Magenkarzinomen nachgewiesen werden können [32, 73]. Vergleichbar mit dem SWISNF-Komplex verhält sich p53 als Transkriptions-Aktivator in einem komplexen Netzwerk aus Genen, dessen Produkte eine Rolle in verschiedenen Signal-Transduktionswegen einnehmen [74]. Ich konnte zeigen, dass eine niedrige Expression von SMARCA4 mit einer niedrigen Expression von p53 im Magenkarzinom assoziiert ist. Diesen Zusammenhang konnte ich ebenfalls für SMARCE1 und p53 nachweisen. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, dass die Dysregulation des SWI-/SNFKomplexes v. a. in CIN-Magenkarzinomen auftritt [56]. Eine integrative, genomische Analyse des Cancer Genome Atlas Research Netzwerks schlägt zur Einteilung von Patienten und Versuchen zu „targeted therapies“ die Unterscheidung von Magenkarzinomen in vier Subtypen vor: EBV-, MSI- (Mikrosatteliteninstabil), CINund genomisch stabilen Magenkarzinomen vor [32]. „Targeted therapies“ sind moderne und zielgerichtete Therapien in der Behandlung von Krebs. Dabei werden gezielt Eigenschaften des jeweiligen Karzinoms als Angriffspunkte in der Therapie genutzt [75]. Ergänzend zudem genannten Zusammenhang von SMARCA4 und SMARCE1 mit TP53 konnte außerdem eine inverse Korrelation der Expression von SMARCA4 und SMARCE1 mit MSI nachgewiesen werden. Ebenfalls zeichnete sich eine Tendenz eines inversen Zusammenhangs der Expression von SMARCE1 und einem positivem EBV-Status bei Magenkarzinomen ab. Dies unterstützt die zuvor gemachte Annahme, dass eine Dysregulation des SWI-/SNF-Komplexes v. a. CIN-Magenkarzinome betrifft und weniger MSIoder EBV-positive Magenkarzinome [56]. Die Ergebnisse bisher durchgeführter Studien zu SMARCA4 und SMARCE1 ließen einen Einfluss beider auf den TNM-Status sowie das Patientenüberleben auch beim Magenkarzinom vermuten [53, 67]. Dennoch konnten wir keinen Zusammenhang zwischen der Expression von SMARCA4 und SMARCE1 mit dem TNM-Status oder dem Patientenüberleben, weder im Gesamtüberleben noch im tumorspezifischen Überleben, finden. SMARCA4 scheint in bisherigen Studien als möglicher Tumorsuppressor in Erscheinung zu treten [70, 71], trotz dessen konnte in dieser Untersuchung keine Diskussion 48 Korrelation zwischen einer niedrigen Expression oder dem kompletten Verlust der Expression und dem TNM-Status, dem Gesamtoder tumorspezifischen Überleben nachgewiesen werden. In den vorausgegangenen Studien, welche zu dem Schluss kamen, dass die Dysregulation der Untereinheiten einen Einfluss auf die Prognose von Patienten habe, wurden hauptsächlich Patientenkohorten asiatischer Herkunft als Grundlage genommen [53, 67]. Im Gegensatz dazu, wurde als Grundlage dieser Studie ein Patientenkollektiv kaukasischer Herkunft genutzt. Daraus lässt sich ableiten, dass ein Unterschied zwischen Patienten kaukasischer und asiatischer Herkunft bestehen könnte. Dies unterstützt den Ansatz einer Unterscheidung zwischen asiatischen und nicht asiatischen Magenkarzinomen in der Therapieplanung, da sich zunehmend der Verdacht erhärtet, dass die ethnische Herkunft des Patienten einen Einfluss auf die Prognose hat [33, 56]. Zusätzlich zu dem Einfluss der einzelnen Untereinheiten SMARCA4 und SMARCE1 auf die Tumorbiologie des Magenkarzinoms wurde in dieser Studie der Zusammenhang einer Dysregulation des SWI-/SNF-Komplexes mit den klinisch-pathologischen Patientencharakteristika untersucht. Die Dysregulation wurde dabei als hohe Expression von sowohl SMARCA4 und SMARCE1 oder niedrige Expression dieser beiden Untereinheiten definiert. Ähnlich zu den bisherigen Ergebnissen konnte auch hier ein Zusammenhang mit dem p53und Mikrosattelitenstatus sowie dem ARID1A-Status beobachtet werden. Wie zuvor erwähnt, handelt es sich bei ARID1A um eine weitere Untereinheit des SWI-/SNF-Komplexes [42], welche den gleichen Zusammenhang mit dem Mikrosattelitenstatus zeigt [65, 70], wie in dieser Studie für SMARCA4 und SMARCE1 belegt. Dies zeigt erneut wie komplex sich die Dysregulation des SWI- /SNF-Komplexes gestaltet [56]. Kürzlich erschienene Studien zu SMARCA4 ergaben eine Beteiligung von SMARCA4 in der E-Cadherin abhängigen Induktion der Epithelial-Mesenchymalen Transition (EMT), welche zu einer fortschreitenden Metastasierung führt [76, 77]. Die Ergebnisse dieser Untersuchung konnten keinen Zusammenhang zwischen der Expression von SMARCA4 und dem E-Cadherin Status bestätigen sowie zuvor bereits genannt auch keinen Zusammenhang zum TNM-Status, welcher die Ausbreitung der Metastasierung abbildet [56]. Literaturverzeichnis 55 32. The Cancer Genome Atlas Research Network (2014) Comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma. Nature 513(7517):202–209. doi: 10.1038/nature13480 33. Wittekind C (2017) Tnm: Klassifikation Maligner Tumoren. John Wiley & Sons, Incorporated, Weinheim, GERMANY 34. Brierley JD, Gospodarowicz MK, Wittekind C (2017) TNM Classification of Malignant Tumours. John Wiley & Sons, Incorporated, Chicester, UNITED KINGDOM 35. Piccirillo JF, Vlahiotis A, Barrett LB et al. (2008) The changing prevalence of comorbidity across the age spectrum. Crit Rev Oncol Hematol 67(2):124–132. doi: 10.1016/j.critrevonc.2008.01.013 36. Böger C, Behrens H-M, Röcken C (2016) Ki67--An unsuitable marker of gastric cancer prognosis unmasks intratumoral heterogeneity. J Surg Oncol 113(1):46– 54. doi: 10.1002/jso.24104 37. Leitlinienprogramm Onkologie (2019) S3 Leitlinie Magenkarzinom, Langversion 2.0 38. Kim K-C, Yook J-H, Eisenbraun J et al. (2012) Quality of life, immunomodulation and safety of adjuvant mistletoe treatment in patients with gastric carcinoma - a randomized, controlled pilot study. BMC Complement Altern Med 12:172. doi: 10.1186/1472-6882-12-172 39. Pérez-Herrero E, Fernández-Medarde A (2015) Advanced targeted therapies in cancer: Drug nanocarriers, the future of chemotherapy 40. Lyman GH, Abella E, Pettengell R (2014) Risk factors for febrile neutropenia among patients with cancer receiving chemotherapy: A systematic review 41. Escrihuela-Vidal F, Laporte J, Albasanz-Puig A et al. (2019) Update on the management of febrile neutropenia in hematologic patients 42. Wilson BG, Roberts CWM (2011) SWI/SNF nucleosome remodellers and cancer. Nat Rev Cancer 11(7):481–492. doi: 10.1038/nrc3068 43. Ashizawa M, Saito M, Min AKT et al. (2019) Prognostic role of ARID1A negative expression in gastric cancer. Sci Rep 9(1):6769. doi: 10.1038/s41598-01943293-5 44. NCBI Gene (2020) SMARCA4 SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily a, member 4 [Homo sapiens (human)]: Gene ID: 6597. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6597. Accessed 13 Aug 2020 45. Sentani K, Oue N, Kondo H et al. (2001) Increased expression but not genetic alteration of BRG1, a component of the SWI/SNF complex, is associated with the advanced stage of human gastric carcinomas. Pathobiology 69(6):315–320. doi: 10.1159/000064638 46. Bi R, Yu L, Tu XY et al. (2019) Expression of SMARCA4(BRG1) and SMARCB1(INI1) in dedifferentiated and undifferentiated endometrial carcinomas and their correlations with clinicopathological features. Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi 48(8):590–595. doi: 10.3760/cma.j.issn.0529-5807.2019.08.002 47. Longo DL, Bates SE (2020) Epigenetic Therapies for Cancer. N Engl J Med 383(7):650–663. doi: 10.1056/NEJMra1805035 48. NCBI Gene (2020) SMARCE1 SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily e, member 1 [Homo sapiens (human)]: Gene ID: 6605. Accessed 13 Aug 2020 Literaturverzeichnis 56 49. Slamon DJ, Clark GM, Wong SG et al. (1987) Human breast cancer: Correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science 235(4785):177–182. doi: 10.1126/science.3798106 50. Maximiano S, Magalhães P, Guerreiro MP et al. (2016) Trastuzumab in the Treatment of Breast Cancer. BioDrugs 30(2):75–86. doi: 10.1007/s40259-016-0162-9 51. Neve RM, Lane HA, Hynes NE (2001) The role of overexpressed HER2 in transformation. Ann Oncol 12 Suppl 1:S9-13. doi: 10.1093/annonc/12.suppl_1.s9 52. Boku N (2014) HER2-positive gastric cancer. Gastric Cancer 17(1):1–12. doi: 10.1007/s10120-013-0252-z 53. Liu H, Zhao Y-R, Chen B et al. (2019) High expression of SMARCE1 predicts poor prognosis and promotes cell growth and metastasis in gastric cancer. Cancer Manag Res 11:3493–3509. doi: 10.2147/CMAR.S195137 54. Balasubramaniam S, Comstock CES, Ertel A et al. (2013) Aberrant BAF57 signaling facilitates prometastatic phenotypes. Clin Cancer Res 19(10):2657–2667. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-12-3049 55. Sethuraman A, Brown M, Seagroves TN et al. (2016) SMARCE1 regulates metastatic potential of breast cancer cells through the HIF1A/PTK2 pathway. Breast Cancer Research 18(1):81. doi: 10.1186/s13058-016-0738-9 56. Pries K, Krüger S, Heckl S et al. (2023) SMARCA4 and SMARCE1 in gastric cancer: Correlation with ARID1A, and microsatellite stability, and SMARCE1/ERBB2 co-amplification 57. Warneke VS, Behrens H-M, Böger C et al. (2013) Her2/neu testing in gastric cancer: Evaluating the risk of sampling errors. Ann Oncol 24(3):725–733. doi: 10.1093/annonc/mds528 58. Ding Z, Shi H, Zhang H et al. (2019) Gastroenterologist-Level Identification of Small-Bowel Diseases and Normal Variants by Capsule Endoscopy Using a Deep-Learning Model. Gastroenterology 157(4):1044-1054.e5. doi: 10.1053/j.gastro.2019.06.025 59. Walz K, Young JI (eds) (2019) Cellular and Animal Models in Human Genomics Research : Translational and Applied Genomics. Academic Press 60. Canales CP, Walz K (2019) Chapter 6 - The Mouse, a Model Organism for Biomedical Research. In: Walz K, Young JI (eds) Cellular and Animal Models in Human Genomics Research : Translational and Applied Genomics. Academic Press, pp 119–140 61. Böger C, Krüger S, Behrens HM et al. (2017) Epstein-Barr virus-associated gastric cancer reveals intratumoral heterogeneity of PIK3CA mutations. Ann Oncol 28(5):1005–1014. doi: 10.1093/annonc/mdx047 62. Warneke VS, Behrens H-M, Haag J et al. (2013) Prognostic and putative predictive biomarkers of gastric cancer for personalized medicine. Diagn Mol Pathol 22(3):127–137. doi: 10.1097/PDM.0b013e318284188e 63. Mathiak M, Warneke VS, Behrens H-M et al. (2017) Clinicopathologic Characteristics of Microsatellite Instable Gastric Carcinomas Revisited: Urgent Need for Standardization. Appl Immunohistochem Mol Morphol 25(1):12–24. doi: 10.1097/PAI.0000000000000264 64. Metzger M-L, Behrens H-M, Böger C et al. (2016) MET in gastric cancer--discarding a 10% cutoff rule. Histopathology 68(2):241–253. doi: 10.1111/his.12745 Literaturverzeichnis 57 65. Tober JM, Halske C, Behrens H-M et al. (2019) Intratumoral heterogeneity and loss of ARID1A expression in gastric cancer correlates with increased PD-L1 expression in Western patients. Hum Pathol 94:98–109. doi: 10.1016/j.humpath.2019.09.016 66. Schoop I, Maleki SS, Behrens H-M et al. (2020) p53 immunostaining cannot be used to predict TP53 mutations in gastric cancer: Results from a large Central European cohort. Hum Pathol 105:53–66. doi: 10.1016/j.humpath.2020.09.006 67. Guerrero-Martínez JA, Reyes JC (2018) High expression of SMARCA4 or SMARCA2 is frequently associated with an opposite prognosis in cancer. Scientific Reports 8(1):2043. doi: 10.1038/s41598-018-20217-3 68. Gürtler P, Gerdes L (2014) Digitale Polymerasekettenreaktion (dPCR) 69. Stahl P, Seeschaaf C, Lebok P et al. (2015) Heterogeneity of amplification of HER2, EGFR, CCND1 and MYC in gastric cancer. BMC Gastroenterol 15:7. doi: 10.1186/s12876-015-0231-4 70. Sauter JL, Graham RP, Larsen BT et al. (2017) SMARCA4-deficient thoracic sarcoma: A distinctive clinicopathological entity with undifferentiated rhabdoid morphology and aggressive behavior. Mod Pathol 30(10):1422–1432. doi: 10.1038/modpathol.2017.61 71. Naito T, Udagawa H, Umemura S et al. (2019) Non-small cell lung cancer with loss of expression of the SWI/SNF complex is associated with aggressive clinicopathological features, PD-L1-positive status, and high tumor mutation burden. Lung Cancer 138:35–42. doi: 10.1016/j.lungcan.2019.10.009 72. Kim Y-B, Ahn JM, Bae WJ et al. (2019) Functional loss of ARID1A is tightly associated with high PD-L1 expression in gastric cancer. Int J Cancer 145(4):916–926. doi: 10.1002/ijc.32140 73. Bieging KT, Mello SS, Attardi LD (2014) Unravelling mechanisms of p53-mediated tumour suppression. Nat Rev Cancer 14(5):359–370. doi: 10.1038/nrc3711 74. Harris SL, Levine AJ (2005) The p53 pathway: Positive and negative feedback loops. Oncogene 24(17):2899–2908. doi: 10.1038/sj.onc.1208615 75. Smith CEP, Prasad V (2021) Targeted Cancer Therapies. Am Fam Physician 103(3):155–163 76. Huang L-Y, Zhao J, Chen H et al. (2018) SCF(FBW7)-mediated degradation of Brg1 suppresses gastric cancer metastasis. Nat Commun 9(1):3569. doi: 10.1038/s41467-018-06038-y 77. Sampera A, Sánchez-Martín FJ, Arpí O et al. (2019) HER-Family Ligands Promote Acquired Resistance to Trastuzumab in Gastric Cancer. Mol Cancer Ther 18(11):2135–2145. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-19-0455 78. Sahlberg KK, Hongisto V, Edgren H et al. (2013) The HER2 amplicon includes several genes required for the growth and survival of HER2 positive breast cancer cells. Molecular Oncology 7(3):392–401. doi: 10.1016/j.molonc.2012.10.012 79. Arriola E, Marchio C, Tan DSP et al. (2008) Genomic analysis of the HER2/TOP2A amplicon in breast cancer and breast cancer cell lines. Laboratory Investigation 88(5):491–503. doi: 10.1038/labinvest.2008.19 Anhang 58 A Anhang A.1 Ethikvotum Anhang 59 Publikationen 60 B Publikationen Pries K, Krüger S, Heckl S, Behrens H-M, Röcken C. SMARCA4 and SMARCE1 in gastric cancer: Correlation with ARID1A, and microsatellite stability, and SMARCE1/ERBB2 co-amplification. Cancer Med. 2023;00:1-15. doi:10.1002/cam4.5776 Danksagung 61 C Danksagung Ich möchte zunächst meinem Doktorvater, Herrn Professor Dr. med. Christoph Röcken, Direktor des Institutes für Pathologie des Universitätsklinikums Schleswig-Holstein, am Campus Kiel danken. Professor Röcken bot mir die Möglichkeit, mich an der Themenfindung zu beteiligen und ermöglichte mir Zugang zu allen Räumlichkeiten und Materialen, die für die Umsetzung dieser Arbeit von Nöten waren. Sein enormes Engagement sowie die ausgezeichnete Betreuung halfen mir während des gesamten Prozesses. Besonderer Dank gilt außerdem den Mitarbeitern und Mitarbeiterinnen des Immunlabors und des molekularpathologischen Labors. Das Team unterstütze mich in der praktischen Umsetzung aller Gewebefärbungen und der Bereitstellung, der dafür benötigten Materialien. Insbesondere während des eingeschränkten Zugangs zu den Laboren auf Grund der Coronapandemie war das Team mir eine große Hilfe, dafür bin ich außerordentlich dankbar. Gerne möchte ich mich auch herzlich bei Herrn Dr. med. Steffen Heckl bedanken, welcher mich spontan in der Durchführung der ddPCR unterstützte. Ebenfalls bedanke ich mich bei Herrn Dipl.-Phys. Hans-Michael Behrens und Frau Sandra Krüger. Ich danke Frau Fee Anscheit, die mich seit Kindheitstagen als enge Freundin und Schwester, die ich nie hatte, begleitet. Mein Dank gebührt außerdem Frau Lea Klie, für die fachlichen und motivierende Gespräche während der Arbeit an unseren Doktorarbeiten. Schließlich möchte ich mich bei meiner Familie bedanken. Ich danke meiner Schwägerin Lisa Pries, die diese Dissertation so oft Korrektur las, bis sie sie auswendig konnte. Aber vor allem danke ich meinem Ehemann Eike Pries, der mir jeden Tag zur Seite stand, alle meine Launen aushielt und mir immer wieder die Kraft zum Weitermachen gab. Erklärung 62 D Erklärung Hiermit erkläre ich, Katharina Pries, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig angefertigt habe. Es wurden nur die in der Arbeit ausdrücklich benannten Quellen und Hilfsmittel benutzt. Wörtlich oder sinngemäß übernommenes Gedankengut habe ich als solches kenntlich gemacht.