Efectos nutricionales sobre los flujos glucolítico y gluconeogénico en túbulos renales de rata

DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA y BIOLOGIA MOLECULAR. UNIVERSIDAD DE GRANADA. "EFECTOS NUTRICIONALES SOBRE LOS FLUJOS GLUCOLITICO y GLUCONEOGENICO EN TUBULOS RENALES DE RATA". García-Salguero, L., Martínez-López, M. y Lupiáñez, J .A. RESUMEN Se han estudiado las capacidades gluconeogénica y glucolítica, así como los principales enzimas implicados en estos procesos bajo diferentes condicio nes nutricionales, en túbulos renales. Existe un claro paralelismo entre los cambios que ocurren en los procesos gluconeogénico y glucolítico y los enzi mas responsables de ambos procesos durante la ingestión de una dieta alta en glúcidos. Con una dieta alta en proteínas el comportamiento glucolítico indica claramente un elevado flujo del metabolismo mitocondrial. Por último, du rante el ayuno, el aumento en la formación de glucosa y la disminución de la capacidad glucolítica, parece depender además de la actividad de otros enzi mas implicados en estos procesos. SUMMARY Gluconeogenic and glycolytic capacities as well as the most important enzymes of these processes have been studied in isolated renal tubules under different nutritional conditions. During a high-carbohydrate diet there is a pa rallelism between the changes in gluconeogenic and glycolytic processes and the enzymes involved in these processes. Whereas with a high-protein diet the glycolytic behaviour clearly indicate a high flux of the mitochondrial metabo lism. Finally, during starvation, besides the activity of the enzyme assayed, the opposite effect in renal glucose synthesis and oxidation appears to be rela ted to other molecular aspects involve in these processes. Ars Pharmaceutica. Tomo XXVIII. Núm. 3, 1987 284 ARS PHARMACEUTICA INTROOUCCION Tradicionalmente se ha considerado al tejido hepático como el principal responsable del mantenimiento de los niveles de glucosa sanguíneos, tanto por su papel de almacenador de glucógeno, destinado no para su consumo sino para su distribución como glucosa al resto del organismo, como el ser el tejido encargado de llevar a cabo todos aquellos cambios adaptativos necesarios pa ra suplir la falta de este combustible mediante su síntesis de novo (1). De la misma manera, y de forma generalizada, se ha considerado a la cor teza renal como el tejido capaz de aportar glucosa al organismo entero de una forma constante y fundamentalmente reducida (2), salvo en aquellos casos que se requiera para llevar a cabo el específico metabolismo renal. Sin embar go existen varias razones que permiten pensar que esto no es así, y que por tanto la corteza renal juega un papel importante en el mantemiento de la ho meostasis glucémica, y los últímos trabajos así lo demuestran (3-6). Por ello, se ha querido estudiar de forma global y sistemática, los posi bles cambios adaptativos que experimenta el riñón, y concretamente la corteza renal, frente a un grupo de situaciones caracterizadas por el aporte exógeno de diferentes macronutrientes, a fin de comprobar si este tejido es capaz de co nectar el metabolismo de los mismos con el proceso gluconeogénico, y si es así, cuales son los principales mecanismos responsables para llevarlo a cabo, siendo éste el principal objetivo de este trabajo. MATERIAL Y METOOOS. Se han utilizado ratas machos de raza Wistar, con un peso entre 200 y 250 gramos. Se mantuvieron con luz artificial que se encendía a las 8 horas y se apagaba a las 20 horas, en habitación termostizada a 22±2°C. Fueron ali mentadas con una dieta estándar (Sandermus O. O.P.A. 14685: 54.5 010 carbo hidratos, 18 % proteínas, 4,5 % aceite de oliva) al menos durante 10 días para su adaptación. Tras este período y siempre a las 8 horas (inicio del ciclo de luz), eran separados en diferentes jaulas 5 ó 6 animales para ser alimentados con una dieta alta en carbohidratos (80 % carbohidratos, 6 % proteínas, 8 % aceite de oliva), dieta alta en proteínas (78 % proteínas, 5 % carbohidratos, 10.5 % aceite de oliva) o bien ser sometidos a ayuno durante 24 ó 48 horas, en todos los casos con libre acceso al agua. Para la preparación de túbulos renales se ha seguido el método de Vinay et al. (7) que consiste en la digestión del tejido de corteza renal durante 30 mino ya 37°C en un medio que contiene lmg/ml de colagenasa y 5mg/ml de albúmina bovina. El material utilizado en cada momento fue de plástico o de vidrio previamente siliconado con una mezcla de diclorometano trimetilclorosilano (100:2), para evitar la adherencia del tejido a las paredes del vidrio. ARS PHARMACEUTICA 285 La determinación de las capacidades gluconeogénica y glucolítica renales así como los ensayos de actividades enzimáticas se han llevado a cabo median te los métodos descritos previamente (5, 6). RESULTADOS y DISCUSION Para cada situación nutricional (dieta alta en carbohidratos, alta en pro teínas y ayuno) se han analizado conjuntamente las capacidades gluconeogé nica y glucolítica y las actividades enzimáticas de cada uno de estos procesos. En la tabla 1 se muestran los resultados obtenidos con una dieta rica en carbo hidratos, indicando el porcentaje de activación ( + ) o inhibición (-), según el caso. Se puede observar un total paralelismo entre la formación de glucosa y la actividad del enzima gluconeogénico, fructosa 1,6-bisfosfatasa, presentan do una inhibición aproximadamente del mismo orden. Esto parece indicar que la disminución que existe en la formación de la glucosa con una dieta alta en carbohidratos es debida a la disminución en la actividad de la fructosa 1,6-bisfosfatasa. Esta disminución sólo tiene lugar a concentración subsatu rante de sustrato (tabla 1), sin cambios a velocidad máxima (tabla 4), por lo que se descartan cambios en el proceso de síntesis / degradación protéica. Tabla 1.-Efecto de una dieta alta en carbohidratos sobre la gluconeogénesis y glucolisis, y actividades enzimáticas en túbulos renales. Parámetro metabólico O horas 24 horas 48 horas % Gluconeogénesis 84.15±4.75 71.14±5.54 65.35±4.93 -22.4 (9) (6 ) (6) FBPasa 33.00±2.36 26.77±2.53 24.04±2.13 -27.1 (9 ) (6 ) (6) Glucolisis 16.07±1.16 23.63±2.10 32.09±3.06 +99.7 (8 ) (7) (6) PFK 1.17±0.05 1. 48±0. 07 1.59±0.1l +35.9 (9) (7 ) (6) PK 20.03±1.03 27.60±2.07 31.00±::'.86 +54.8 (9) (6) (6) Las capacidades gluconeogénica (formación de glucosa) y glucolítica (fo.j:mación de ¡iruvato + lactato) se expresan en nrnoles/hora de incubación/mg de tejido seco. El -representa el S.E.M. y entre paréntesis se indica el n. o de experimentos. Las actividades enzimáticas que se indican en la tabla corresponden a la concentración subsaturante de sutrato, y se expresan en nmoles de sustrato transformado/min/mg de proteína. Se indican los porcentajes de activación (+) o de inhibición (-) con respecto a las O horas. 286 ARS PHARMACEUTICA Tabla 2.-Efecto de una dieta alta en proteínas sobre la gluconeogénesis y glucolisis, y actividades enzimáticas en tú bulos renales. Parámetro metabólico O horas 24 horas 48 horas % Gluconeogénesis 84.15±4.75 93.55±6.20 103.62±5.04 +23.2 (9) (7 ) (8 ) FBPasa 33.00±2.36 38.01±2.33 39.42±2.08 +19.5 (9) (8 ) (6) Glucolisis 16.07±1.16 15.27±1.49 16.30±1.08 +1. 4 (8 ) (7) (6) PFK 1.17±0.05 1. 40±0. 09 1.53±0.09 +30.8 (9) (8 ) (7) PK 20.03±1.03 26.70±1.71 29.48±2.23 +47.2 (9) (7 ) (8 ) Las condiciones experimentales son idénticas a las de la tabla l. Tabla 3.- Efecto del ayuno sobre la gluconeogénesis y glucolisis, y actividades enzimáticas en túbulos renales. Parámetro metabólico O horas 24 horas 48 horas % Gluconeogénesis 84.15±4.75 103.44±8.43 144.14±9.63 +71.3 (9) (7 ) (8 ) FBPasa 33.00±2.36 41.63±2.76 44.31±1.75 +34.3 (9) (8 ) (8 ) Glucolisis 16.07±1.16 9.42±O.98 8.48±O.85 -47.3 (8 ) (7) (6) PFK 1.17±O.O5 O.99±O.O3 0.88±O.O5 -24.8 (9) (7) (8 ) PK 20.03±1.03 19.86±1.28 19.81±1.53 -1. 2 (9) (7 ) (8 ) Las condiciones experimentales son idénticas a las de la tabla l. ARS PHARMACEUTICA 287 La glucolisis por el contrario se ve activada fuertemente con esta dieta, coincidiendo prácticamente los valores de incremento en la capacidad glucolí tica (99.7) con la suma de las actividades de los dos enzimas claves del proce so, fosfofructoquinasa y piruvato quinasa (35.9 + 54.8), lo que demuestra un acusado paralelismo entre el comportamiento metabólico y las actividades en zimáticas claves de dicho proceso. Una de las principales características que presentan los animales someti dos a una dieta rica en carbohidratos, consiste en un aumento de hasta 10 ve ces en la relación insulina / glucagon (8,9). Este aumento en el nivel de insuli na y disminución de glucagon podría explicar los cambios obtenidos en ambos procesos. Los resultados están de acuerdo con Krebs et al. (lO) que muestran una respuesta adaptativa del riñón aunque ellos someten a los animales a una die ta baja en carbohidratos. Actualmente se considera al ciclo catalizado por la fosfofructoquinasa y fructosa 1,6-bisfosfatasa como el punto principal de re gulación del proceso glucolítico / gluconeogénico, en donde juega un impor tante papel regulador la presencia o ausencia de fructosa 2,6-bisfosfato, prin cipal activador de la fosfofructoquinasa (11) e inhibidor de la fructosa 1,6-bisfosfatasa (12). En este sentido, Sommercorn y Freedland (13) muestran que las dietas al tas en carbohidratos incrementan considerablemente las concentraciones de fructosa 2,6-bisfosfato en la corteza renal, las cuales podrían aumentar el pro ceso glucolítico por activación de la fosfofructoquinasa e inhibición de la fructosa 1,6-bisfosfatasa. Tabla 4.-Efecto del ayuno, dieta alta en carbohidratos y dieta alta en proteí nas sobre los enzimas gluconeogénicos y glucolíticos en túbulos re nales. Control 48h Ayuno 48h CH 48h Prot FBPasa 158.86±10.23 161.85±10.47 147 .13±8. 86 155.16±23.31 (9 ) (8 ) (6 ) (7) PFK 14.76±O.71 13.95±O.70 14.61±O.84 14.78±O.62 PK (9 ) (8 ) (6 ) (7 ) 144.39±6.09 134.63±6.30 147.24±6.33 173.06±6.22" (9) (8 ) (6) (7 ) Las actividades enzimáticas que se indican en la tabla corresponden a la concentración satu rante de sustrato. La actividad €f'pecífica va expresada en nmoles de sustrato transformados/min/mg de proteína. El -representa el error estándar de la media y entre parén tesis se indica el número de experimentos. El grado de significancia con respecto al control;. • P«O,OO5. 288 ARS PHARMACEUTICA En la tabla 2 se muestra el efecto de una dieta alta en proteínas sobre los diferentes aspectos estudiados del metabolismo glucídico en túbulos renales a las 24 y 48 horas, expresándose los cambios que tienen lugar a las 48 horas co mo porcentajes de activación o inhibición. En el caso de la gluconeogénesis, se observa la existencia de un paralelismo entre el proceso gluconeogénico y la actividad fructosa 1 ,6-bisfosfatasa, indicando, al igual que con la dieta alta en carbohidratos, que el incremento producido en la formación de glucosa es de bido a la activación (únicamente a concentración subsaturante de sustrato) de este enzima. Por lo que respecta a la glucolisis, el comportamiento es diferente. A lo largo del tiempo no se modifican los valores de glucolisis, medidos como la su ma de lactato y piruvato producidos, mientras que aparecen cambios muy sig nificativos en la actividad total de los dos enzimas glucolíticos ensayados, fos fofructoquinasa y piruvato quinasa, con diferencias al final de las 48 horas del orden del 30 y 50 OJo respectivamente. Esta aparente contradicción podría ser explicada por un flujo acelerado del ciclo de los ácidos tricarboxílicos en estas condiciones, que tiene lugar al incremento de intermediarios de esta ruta que proporciona la degradación del exceso de aminoácidos. Debido a esto, la ma yor parte del piruvato y lactato producidos serían utilizados mitocondrialmen te. La actividad fosfofructoquinasa sólo se modifica a concentración subsa turante de sustrato, mientras que la piruvato quinas a a las 48 horas presenta también un incremento de su velocidad máxima (tabla 4), lo que pone de ma nifiesto una mayor síntesis de enzima. Las variaciones en los niveles hormonales bajo estas condiciones parecen explicar los cambios que ocurren a nivel enzimático y del proceso gluconeogé nico. La concentración de glucagon aumenta en ratas alimentadas con dietas altas en proteínas (9). Fafournoux et al. (14) sugieren asimismo que por medio de estos cambios hormonales, la dieta alta en proteínas estimula el sistema de transporte A de aminoácidos. Consecuentemente, la relación insulina / gluca gon es inferior bajo esta situación, aunque Dernigné et al. (15) encuentran un incremento de insulina, durante las primeras horas, necesaria en el período de máxima absorción de nutrientes. Por último en la tabla 3 se muestran los resultados obtenidos al haber so metido a los animales a ayuno de 24 ó 48 horas. Hay que destacar la fuerte ac tivación producida en la formación de glucosa que no se corresponde total mente con el aumento en la actividad fructosa 1,6-bisfosfatasa. Esto se explica porque durante el ayuno se produce un aumento muy significativo en otro en zima gluconeogénico, la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (16). Por otra par te la actividad glucosa 6-fosfatasa hepática se incrementa también durante el ayuno (1). A la vez que existe un incremento en la gluconeogénesis, tiene lugar una inhibición en la capacidad glucolítica y en uno de los dos enzimas glucolíticos, la fosfofructoquinasa; en cambio no existe ninguna modificación en la activi- ARS PHARMACEUTICA 289 dad piruvato quinasa. Tampoco en este caso la inhibición producida en la ca pacidad glucolítica se corresponde totalmente con la producida en la actividad fosfofructoquinasa, lo que indica que otros enzimas deben estar implicados. Los cambios producidos en la actividad de los dos enzimas modificados durante el ayuno, fructosa 1,6-bisfosfatasa y fosfofructoquinasa, sólo ocu rren a concentración subsaturante de sustrato sin ningún cambio a concentra ción saturante de sustrato (tabla 4). Es bien conocido que durante el ayuno, los principales factores responsa bles de los cambios metabólicos que en él tienen lugar, están asociados a un aumento en la concentración de glucagon y una disminución de insulina en plasma (17), lo que explicaría el aumento de la gluconeogénesis y la disminu ción de la glucolisis renal. Los efectos que producen los glucocorticoides son también esenciales en la adaptación metabólica al ayuno (18). Los niveles de fructosa 2,6-bisfosfato disminuyen mucho, incluso des pués de 24 horas de ayuno, como consecuencia del aumento de glucagon cir culante, activando la fructosa 1 ,6-bisfosfatasa e inhibiendo la fosfofructoqui nasa (19). AGRADECIMIENTOS Este trabajo ha sido subvencionado por la CAICYT (proyecto 1139/81). L. García-Salguero ha sido becaria del P.F.P.1. del Ministerio de Educación y Ciencia. BIBLIOGRAFIA (1) HERS, H.G. y HUE, L. (1983), Ann. Rev. Biochem. 52, 617-653. ( 2) KIDA, K., NAKAJO, S., KAMIYA, F., TOYAMA, Y., NISHIO, T. y NAKAGAWA, H. (1978). J. Clin. Invest. 62, 721-726. ( 3) LUPIAÑEZ, J.A. FAUS, M.J., MUÑOZ-CLARES, R. y SANCHEZ-MEDINA, F. (1976). FEBS Let!. 61, 277-281. ( 4) SANCHEZ-POZO, A., LUPIAÑEZ, J.A., CORNO, A., PITA, M.L. Y SANCHEZ MEDINA, F. (1983). Molecular Physiology, 3: 143-150. ( 5) GARClA-SALGUERO, L., PERAGON, J. y LUPIAÑEZ, J.A. (1987). Ars Pharmaceutica XXVIII: 195-201. ( 6) GARCIA-SALGUERO, L., CORPAS, J., BARROSO, J.B. Y LUPIAÑEZ, J.A. (1987). Ars. Pharm. En prensa. ( 7) VINAY, P., GOUGOUX, A. y LEMIEUX, G. (1981). Am. J. Physiol., 341, F403-F411. ( 8) TIEDGEN, M. Y STEITZ, H.G. (1980). J. Nutr. 1 lO, 876-882. ( 9) PERET, J., FOUSTOCK, S., CHANEZ, M., BOIS-JOYEUX, B. y ASSAN, R. (1981). J. Nutr. 111, 1173-1184. (10) KREBS, H. A., BENNETT, D.A.H., DE GASQUET, P., GASCOYNE, T. y YOSHIDA, T. (1963). Biochem. J. 86,22-27. (11) HUE, L., BLACKMORE, P. y EXTON, J.H. (1981). J. Biol. Chem. 256, 8900-8903. (12) VAN-SCHAFTINGEN, E., JET, M.F., HUE, L. y HERS, H.G. (1981). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78, 3483-3486. (13) SOMMERCORN, J. y FREEDLAND, R.A. (1984). J. Nutr. 114, 1462-1469. (14) FAFOURNOUX, P. REMESY, C. y DEMIGNE, C. (1982). Biochem. J., 206, 13-18. 290 ARS PHARMACEUTICA (15) DEMIGNE, C., FAFOURNOUX, P. y REMESY, C. (1985). J. Nutr. 115, 1065-1072. (16) CIMBALA, M.A., LAMERS, W.H., NELSON, K., MONAHAN, J.E., YOO-WARREN, H. y HANSON, R.W. (1982). J. Bio\. Chem. 257, 7629-7636. (17) MARLISS, E.B., AOKI, T.T., POZEFSKY, T., MOST, A.S. y CAHILL, G.F. Jr. (1971). J. Clin. Inves!. 50, 814-817. (18) EXTON, J.H., MILLER, T.B. Jr., HARPER, S.C. y PARK, C.R. Am. J. Physio\. 230, EI63-E179. (19) PILKIS, S.J., CHRISMAN, T.D., BURGRESS, B., MCGRANE, M., COLOSIA, A., PILKIS, 1., CLAUS, T.H. y EL-MAGHRABI, M.R. (1983). Adv. Enzyme. Regul. 21, 147173.