Dosage de língenol dans les teintures meres homeopathiques de diverses especes d’euphorbia par la chromatographie liquide haute performance

DOSAGE DE L'INGENOL DANS LES TEINTURES MERES HOMEOPATHIQUES DE DIVERSES ESPECES D' EUPHORBIA PAR LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE S. PAPHASSARANG"M.A. GIRIN', Ch. OAVID-ETEVE', A. CHABOU02, J. RAYNAU02 1. Labo a oi es BOIRON, 20 ue de la Libé a ion 69110 SAINTE-FOY LES-LYON (FRANCE) 2. 0épa emen de bo anique e biologie cellulai e, Pha macognosie (Ma ie e médicale). Facul é de Pha macie, 8 a enue Rocke elle 69373 LYON CEOEX 08 (FRANCE) MOTS CLES: Eupho bia amygdaloi"des L. Eupho bia esula L. ; Eupho bia helioscopia L. ; Eupho bia la hy is L. ; Eupho bia palus is L. ; Eupho bia pilosa L. ; Eupho bia piluli e a L. Eupho bia esini e a Be g. ; Ingenol ; Ingenol es e s ; HPLC. ABSTRACT High pe o mance liquid ch oma og aphy has been de eloped o he iden i ica ion and quan i a ion o ingenol in homoeopa hic mo he inc u es o 8 Eupho bia species. The ingenol es e s we e hyd olyzed wi h KOH in me hanol and he ee ingenol was analyzed by C18 RP column using me hanol-wa e (60 : 40 V/V) as he mobile phase. The ingenol con en anged om 0. 5 �g/ml o 16. 7 �g/ml. Eupho bia esini e a Be g. mo he inc u e was ound o be he iches in ingenol. On �he o he hand, ingenol con en was no signi ican in E. amygdaloi"des L. o E. piluli e a L. mo he inc u es. 333 l. INTRODUCTION No e a ail po e su 8 ein u es me es homéopa hiques ab iquées a pa i des di é en es especes du gen e Eupho bia: Eupho bia amygdaloi"des L. , Eupho bia esula L. , 'Eupho bia helioscopia L. , Eupho bia la hy is L., Eupho bia palus is L., Eupho bia pilosa L. , Eupho bia piluli e a L. e Eupho bia esini e a Be g. Malg é l'hé é ogénéi é mo phologique, on cons a e chez le gen e Eupho bia la p ésence su le plan his ologique de la ici e es (1). Le la ex con e e a ces plan es une ce aine oxici é, due su ou aux dé i és e péniques en pa iculie aux es e s des di e penes dé i és du pho bol e de l'ingénol (2)(3). Les es e s d'ingénol son les plus éque nmen encon ées dans ou es les especes é udiées (4) . Le dosage di ec d'ingénol sous o me d'es e�s dans les ein u es me es n'es pas possible. Cela es du d'une pa a la di e si é s uc u ale de ces cons i uan s e d'au e pa a la non disponibili é des émoins es e s d'ingénol dans le co nme ce. Pa con e, il es possible de se p ocu e de l'ingénol e de le dose dans nos ein u es me es ap es sa libé a ion. Pa mi les echniques ch oma og aphiques u ilisées pou le con ole, la ch oma og aphie liquide hau e pe o mance es sans dou e la echnique la plus adap ée. Elle pe me l'é ude quan i a i e de ce ype de cons i uan di ec emen sans dé i a isa ion. 11. PARTIE EXPERlMENTALE -MATERIEL ET CONDITIONS CHROMATOGRAPHIQUES * Appa eillage Les analyses on é é e ec uées su un ch oma og aphe liquide Hewle -Packa d, sé ie 1050, équipé d'un injec eu au oma ique e d' un dé ec eu mul ilongueu d' onde. Ce sys eme es pilo é pa HP ChemS a ion de Hewle Packa d (Hewle -Packa d, Palo-Al o, Cali o nie, E a s-Unis) * Condi ions ch oma og aphiques Colonne Sphé iso b OOS 2, 5�, 250 x 4mm Hewle -Packa d, Palo Al o, Cali o nie, E a s-Unis) Sol an : mé hanol-eau (60:40; V/V) oébi : 1 ml/min Oé ec ion: 204 nm Tempé a u e de la colonne: 30°C Volume d'injec ion: 20 �l 334 -SOLUT10NS A ANALYSER * Solu ion émoin: L' ingénol sous o me lib e es eomme eialisé pa les Labo a oi es Sigma (s Louis, MO. , E a s- Unis). 11 es eondi ionné dans des ampoules en e e seellées sous azo e e se p ésen e sous o me d'un ilm solide in isible adhé an aux pa ois. L'ingénol es solubilisé dans le mé hanol e conse é ¡ moins de oOe e ¡ l'ab i de la lumie e. * p épa a ion de l'éehan illon L'ingénol es en géné al dans la plan e sous o me de mono ou de dies e s. Pou sa oi la quan i é d'es e s d'ingénol dans les ein u es me es, on peu dose l' ingénol lib e ap es saponi iea ion. La eehnique de saponi iea ion des ein u es me es u ilisées lo s de ce a ail dé i e de eelle dée i e pa UPADHAY e eoll. (1980) (5): 5 ml de ein u e me e son la és pa 3 ois 5 ml d'hexane pou se déba asse des ae ions lipidiques e i e péniques. La phase es an e es é apo ée ¡ see sous p ession édui e. Le ésidu es saponi ié pa 5 ml de po as se mé hanolique O, 5M pendan 45mn ¡ la empé a u e ambian e. L'exees de KOH es neu alisé pa Hel lN. Ap es adjone ion de 5 ml d'eau dis illée, la solu ion ob enue es ex ai e pa 3 ois 5 ml de diehlo omé hane. La solu ion ex ae i e ob enue es é apo ée ¡ see sous p ession édui e e le ésidu es ep is pa 100 �l de mé hanol. La solu ion mé hanolique ob enue on é é eonse ée ¡ une empé a u e in é ieu e ¡ oOe e ¡ l'ab i de la lumie e. 111- RESULTATS ET D1SeUSS10N Dans les eondi ions dée i es, l'ingénol donne un pie au emps de é en ion oisin de 7.23 mino Le pie de l'ingénol dans la ein u e me e a é é iden i ié pa son emps de é en ion. La eon i ma ion a é é e ee uée pa la mé hode d'ajou . La quan i iea ion d'ingénol dan s les ein u es me es es ai e pa la mé hode d'é alonnage ex e ne. Di é en s essais on é é e ee ués pou la alida ion du dosage. -E ude de la épé abili é Nous a ons injee é 10 ois de sui e un olume de 20 �l d'une solu ion é alon d'ingénol ¡ 50 �g/ml. L'ai e du pie d'ingénol a é é en egis é. La moyenne de l'ai e des pies e le eoe ieien de la a ia ion (eV) de la épé abili é son ensui e ealeulés. Le e es de 0. 51 %. La mé hode de dosage es eonsidé ée eomme épé able ea le e de la épé abili é es in é ieu ¡ 1 %. 335 -E ude de la ep oduc ibili é Nous a ons éalisé une sé ie de 9 dosages su 3 jou s d' une solu ion é alon d' ingénol el. 50 lJ.g/ml. L' ai e co espondan au pic d'ingénol a é é en egis é. Nous calculons ensui e la moyenne e le CV de la ep oduc ibili é des éponse. Le CV ou é es de 0.88 %. La mé hode de dosage peu e e considé ée comme ep oduc ible ca le coe icien de a ia ion de la ep oduc ibili é es in é ieu el. 2 %. -é ude de la linéa i é Elle a é é ai e a ec une gamme d' é alonnage de 6 solu ions émoins allan de 50 el. 670 lJ.g/ml. Chaque solu ion es injec ée 3 ois e l'ai e des pics men ionnée es la moyenne des 3 ai es en egis ées. La d oi e d'é alonnage es linéai e dans la gamme de concen a ion essayée. L' équa ion de la d oi e es de la o me: Y = aX+b a = 31.356; b = 121.399. Le coe icien de co éla ion ou é es de 0.99. La concen a ion en ingénol dan 5 les ein u es me es es la sui an e ·(pa o d e déc oissan l: E. esini e a Be g. ) E. pilosa L.) E. la hy is L. ) E. helioscopa L. ) E. palus is L. ) E. esula L. ) E. amygdaloi"des L. e E. piluli e a L. Le dosage d'ingénol dans les ein u es me es mon e que la eneu en ingénol es es a iable sui an les ein u es me es. Ainsi, l'ingénol n'es p ésen qu'el. l'é a de aces dan 5 les ein u es me es d' E. amygdaloi·des L. e d' E. piluli e a L. alo s qu' il es p ésen en g ande quan i é dans les échan illons p épa és el. pa i de la ein u e me e d'E. esini e a Be g. Ce e ichesse peu s'explique pa le ai que la TM d'E. esini e a Be g es p épa ée el. pa i du la ex. IV. CONCLUSION L'ingénol es un aceu in é essan pou le con ole des ein u es me es d'Eupho be en aison de son appo a ec leu oxici é. La ch oma og aphie liquide,hau e pe o mance s'a e e e e une echnique bien adap ée a l'é ude quali a i e e quan i a i e de ce compasé. Elle es apide, iable e pe me le dosage de l'ingénol di ec emen sans ai e des dé i a isa ions. 336 V. BIBLIOGRAPHIE 1. G. DEYSSON: Elémen s d'ana omie des plan es asculai es Edi . Sedes, Pa is, 1965,266 pages 2. A. D. KINGHORN, F. J. EVANS, Plan a Med. , 28 (1975), 324-335 3. E. H. SEIP, E. HECKER, Plan a Med. , 46 (1982), 215-218 4. F. J. EVANS, C. J. SOPER, Lloydia. , 41 (1978) 193-233 5. R.R. UPADHYAY, F. BAKHTARAR, H. MOHSENI, A. M. SATER, N. SALEH, A. TAFAZULI, F. N. DIZAJI, G. MOHADDES, Plan a Med. , 38 (1980), 151-154 337 U Sig�204,4 Re �450,80 2400� j 2200� 2000� 1800� ! 1600� 1 1400� ! 1200� ¡ 1000� . < 800� 60J 1 40� 200J ime -> 2.000 4.000 6.000 8.000 10.'000 CP.ROMATOGRAMME DE IA SOLUTION TEMOIN D' INGENOL 338 nAU j J 700 .. J 600-1 1 J 500-1 j 400-1 j 300 .. 1 200-1 "j 1m. -> S ,;;; on <:: ,.... ':'� l'- 'cd 5.000 10.'000 15.000 i 20.000 25.000 30.000 I CHROMATOGRAMME D' UN EXTRAIT DE IA TEINTORE MERE D' EQPHORBIA PILOSA L 339 w � TENEUR EN INGENOL DANS LES TEINTURES MERES HOMEOPATHIQUES lmu!q! nl) TENEUR NOMS DE LA TEINTURE MERE PARTIE DE PLANTES UTILISEE , EN DILUTION TENEUR EN INGENOL ETHANOL en l1g/ml Eupho bia amygdaloides L. Plan e en ie e aiche 65 % 1/10 T aces Eupho bia esula L. Plan e en ie e aiche 65 % 1/10 0,51 Eupho bia helioscopia L. Plan e en ie e aiche 65 % 1/10 1,54 Eupho bia la hy is L. Plan e en ie e aiche 65 % .1/10 3,02 Eupho bia palus is L. Plan e en ie e aiche 65 % 1/10 1,27 Eupho bia pilosa L. Plan e en ie e aiche 65 % 1/10 9,47 I Eupho bia piluli e a L. Plan e en ie e desséchée 65 % 1/10 T aces Eupho bia esini e a Be g. Résine desséchée 90 % 1/10 16,71 -