Estudio mediante cromatografía en capa fina de la esencia de Thymus Longiflorus Boiss

DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGIA ESTUDIO MEDIANTE CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA DE LA ESENCIA DE THYMUS LONGIFLORUS BOISS J. Cabo Torres, M. M. Cabo Cires, T. Cruz García y J. Jiménez Martín RESUMEN Basándonos en la técnica de Cromatografía en Capa Fina, se ha conseguido la detección y posterior identificación de varios de los componentes de la esencia de Thymus Longiflorus Boiss. Asimismo se ha llevado a cabo la cuantificación de aquellos componentes que se presentaban en mayor proporción. SUMMARY Fine Layer Chromatrography was used to achieve the separation and subsequent identification of a series of components of the essential oil of Thymus Longiflorus Boiss. Those components obtained in largest amounts were al so quantified by photodensitometry. INTRODUCCION Este trabajo se engloba en una de las líneas de investigación del Departamento: Plantas aromáticas (1,2,3). Nos centramos en el estudio del Thymus longiflorus Boiss, por tratarse de una especie escasamente estudiada y que además es endémica de ciertas zonas del Levante y del Sureste español. Empleamos la técnica de Cromatografía en Capa Fina por ser un método clásico de detección, tanto de componentes esenciales, como de otro tipo de principios (4). Resulta una técnica muy válida dada su reproductibilidad, rapidez y sencillo utillaje. Además la Cromatografía en Capa Fina nos resulta particularmente útil porque servirá como base para la cuantificación de aquellos componentes de la esencia que Ars Pharmaceutica. Tomo XXIX. Núm. 1, 1988 78 ARS PHARMACEUTlCA resulten más interesantes por su mayor abundancia en la misma. La cuantificación se realizó por fotodensitometría (5,6,7,8), técnica muy interesante y sin embargo aún poco utilizada en el campo concreto de las esencias. MATERIAL Y METO DOS Muestra.- Thymus longiflorus Boiss, recolectado en época de floración Uunio), en la Subestación de Tablate (Granada). La extracción de la esencia se realizó por el método de elevenger (9), obteniéndose un rendimiento medio de 0,72 %. Análisis cualitativo por Cromatología en capa Fina. -Extensor: Desaga (manual). -Placas: 20 x 20 cm, capa de 250 Ínicras de espesor de Silicagel G Merck. -Activación: a 110· e durante 30 minutos, previa desecación a temperatura ambiente y enfriadas en desecador sobre Silicagel con indicador de humedad. -Fase móvil: . Benceno / Eter 85/15 ·N-heptano N-hexano / Eter 85/15 -Desarrollo: 10 cm unidimensional ascendente en cubetas "Desaga" a satura ción. -Revelador: solución etanólica de vainilla al 3%. A 100 mI de esta solución se le adicionan 4 mI de ácido sulfúrico concentrado en el momento de su empleo. -Visualización: mediante nebulizador fino de vidrio, controlando la cantidad de reactivo (aproximadamente 25 mI por placa). Posterior calentamiento en estufa a 110· e durante unos 7 minutos. Análisis cuantitativo por Fotodensitometría Utilizamos un fotodensitómetro Shimadzu High-speed thin-Iayer ehromato Scanner (model eS-920). Las lecturas se realizaron a 520 nm, sobre placas de Silicagel G Mere, con 25 0 micras de espesor. La fase móvil seleccionada fue Benceno/ Eter 85/15. El revelado se realizó con vainillina alcohólica adicionada de ácido sulfúrico al 4% y posterior calentamiento en estufa a 110· e, durante 7 minutos. RESULTADOS Y DISeUSION Fase móvil.-En el apartado "Material y Métodos", citábamos las fases móviles que habían resultado más idóneas como resultado de una serie de ensayos previos. Tras el estudio crítico comparati vo de estas fases, adoptamos Benceno/Eter 85/15 como fase única por estimar que se aprecia en ella: a) Mayor número de componetes detectados y mejor separación de los mismos. b) Mejor resolución de los principios utilizados. Identificación de componentes.- Los valores absolutos de Rf de las manchas cromatográfica� que por su intensidad parecían corresponder a los principales componentes de la esencia de Thymus longiflorus Boiss, no tienen, por supuesto más valor que el meramente orientativo, aunque se basa en una aceptable coincidencia con ARS PHARMACEUTICA 79 los obtenidos anterionnente en condiciones similares. Tal orientación, es sin embargo útil, para buscar una ratificación más sólida seleccionando los posibles componentes, al estado puro, que es aconsejable contrastar con los de la esencia. Dichos componen tes son: borneol, cineol, terpinen-4-01, acetato de terpenilo y a-terpineol. La pauta seguida para su ratificación previa identificación ha sido: -Esencia -Esencia enriquecida en un detenninado componente !: -Componente !: Los resultados obtenidos mediante la metodología detallada anterionnente, que dan reflejados en las fotografías 1,2 Y 3. Su estudio minucioso y razonado, adecuada mente discutido en pro y en contra, nos lleva a sugerir que en la esencia de Thymus longiflorus Boiss están presentes: Cineol (Tabla 1), Borneol (Tabla 1), Terpinen-4-01 (Tabla 11), Acetato de terpenilo (Tabla 11) y a-terpineol (Tabla I1I). De los cinco componentes identificados en principio por Cromatografía en Capa Fina, y dado que tres de ellos (a-terpineol, borneol y terpinen-4-01) son los que presentan manchas cromatográficas de mayor superficie, nos centramos en el estudio de los mismos mediante la técnica fotodensitométrica. Las muestras utilizadas para esta técnica fueron: -Dilución al 5% de esencia de Thymus longiflorus Boiss -Dilución de cineol al 1,7% y 2% -Dilución de a-terpineol al 0,06% y 0, 3% -Dilución de terpinen-4-01 al 0,05% y 0,2% En todos los casos los depósitos fueron de 2 111. En primer lugar se procedió a la construcción de las curvas patrón correspondien tes a cineol, a-terpineol y terpinen-4-01; para ello se emplearon concentraciones muy próximas entre sí y perfectamente conocidas de cada uno de estos componentes, representándose posterionnente concentración frente a número de cuentas absolutas que proporcionaba el fotodensitómetro para cada una de las concentraciones, así pudimos llegar al conocimiento de cuál era el margen de concentración con el cual debíamos trabajar para la cuantificación de la muestra problema. Una vez conocidos los márgenes de concentración adecuados, se llevaron a cabo numerosas lecturas de la muestra en estudio. Los resultados obtenidos en fonna de "cuentas absolutas" se reflejan en las Tablas IV, V Y VI. Por último y aplicando un método de interpolación (5 ), se llegó a la detenninación de los porcentajes absolutos de los tres componentes estudiados en la esencia de Thymus longijlorus Boiss: -Cineol: 37,2% ± 0,043 -a-terpineol: 3,44% ± 0,0265 -terpinen-4-01: 2,62% ± 0,00216 Aplicando esta metodología hemos obtenido resultados concordantes, incluso comparando los obtenidos con placas diferentes, como lo revelan los cálculos estadísticos. Ello pennite concluir que instrumental y técnica empleados son adecua dos para este tipo de análisis cuantitativo de compuestos presentes en esencias. 80 ARS PHARMACEUTICA Tabla 1 Rf x 100 1.- Esencia 28 33 39 52 61 70 2.- Esencia + Terpinen-4-o1 28 33 39 52 61 70 3.- Terpinen-4-o1 39 4.- Esencia 28 33 39 52 61 70 5.- Esencia + Terpinen-4-o1 28 33 39 52 61 70 6.- Terpinen-4-o1 39 7.- Esencia 28 J3 39 52 61 70 8.- Esencia + Acet. terpenilo 28 33 39 52 61 70 9.-Acet. terpenilo 61 10.- Esencia 28 33 39 52 61 70 1 1.- Esencia+Acet. terpenilo 28 33 39 52 61 70 12.- Acet. terpenilo 61 . .. • • ARS PHARMACEUTICA 81 Tabla II Rf x 100 1.-Esencia 28 33 39 53 61 70 2.- Esencia + Cineol 28 33 39 52 61 70 3.- Cineol 39 4.- Esencia 28 33 39 52 61 70 5.- Esencia + Cineol 28 33 39 52 61 70 6.- Cineo) 39 7.- Esencia 28 33 39 52 61 70 8.-E encia + Borneo) 28 33 39 52 61 70 9.- Borneol 61 10.-Esencia 28 33 39 52 61 70 11.-Esencia + Borneol 28 33 39 52 61 70 12.- Borneol 33 82 ARS PHARMACEUTICA Tabla III Rf x 100 1.-Esencia 29 33 40 53 61 69 2.-Esencia + (X-Terpineol 29 33 40 53 61 69 3.- (X-Terpineol 29 4.- Esencia 29 33 40 53 6\ 69 5.- Esencia + (X-Terpineol 29 33 40 53 61 69 6.-(X-Terpineol 29 ARS PHARMACEUTICA 83 Tabla IV Esencia Thyrnus longiflorus al 5 % (lOO Y /2111). Cineol al 1,7 % (34 Y /2111). Cineol al 2 % (40 Y /2111) Lectura fotodensitornétricas ("cuentas absolutas") PLACA Cin(34y) Es (100 y) Cin(40y) Cin(34y) Es (100 y) Cin(40y) nº I 20034 23241 25324 20322 23060 25498 20370 23018 25427 20374 22983 25279 20349 22597 25028 20213 22937 25164 20318 22829 25138 20319 22852 25137 nº 2 20389 22938 25158 20374 22888 25135 20095 22869 25122 20122 22773 25301 20312 22773 25264 19967 22886 25104 20365 22893 25129 20085 22796 25304 Tabla V Esencia Thyrnus longiflorus al 5 % (100 Y /2111). a-terpineol al 0,06 % (1,2 Y /2111). a-terpineol al 0,3 % (6 Y /2111) Lecturas fotodensitornétricas ("cuentas absolutas") I PLACA a-ter (1,2 y) Es(lOOy) a-ter(6y) a-ter( I ,2y) Es(lOOy) a-ter(6y) nº 3 1384 2859 4331 1329 2716 4330 1345 2718 4322 1317 2711 4315 1317 2720 4408 1323 2741 4367 1293 2742 4323 1292 2704 4336 nº 4 1300 2273 3640 1337 2697 4330 1299 2703 4343 1304 2737 4344 1297 2716 4348 1311 2722 4361 1315 2716 4365 1306 2748 4364 84 ARS PHARMACEUTICA Tabla VI Esencia Thyrnus longiflorus al 5 % (100 Y /2 111). Terpinen-4-ol al 0,05 % (Iy /211 1). Terpinen-4-ol al 0,2 % (4 Y /2111) Lecturas fotodensitornétricas ("cuentas absolutas") PLACA Ter (Iy) Es (lOOy) Ter (4y) Ter (ly) Es (lOOy) Ter (4y) nQ 5 1275 2585 3692 1239 2568 3696 1262 2586 3715 • 1265 2577 3713 1246 2588 3728 1264 2592 3735 1266 2592 3735 1266 2610 3741 nQ 6 1288 2614 3764 1300 2642 3807 1288 2629 3776 1295 2630 3772 1261 2631 3772 1276 2635 3791 1273 2637 3811 1289 2647 38l·8 BIBLIOGRAFIA (1) CABO TORRES, J.; CABO ClRES, M. M.; CRESPO GIL, M. E.; JIMENEZ MARTIN, J.; NA VARRO MOLL, C. "Thymus granatensis Boiss. 1.-Etude qualitative et quantitative de son huile essentielle". Plantes medo et phytother. 20 (1), 18-24, (1986). (2) CABO TORRES, J.; BRAVO DIAZ, L; JIMENEZ MARTIN, J; NAVARRO MOLL, C. "Thymus hiemalis Lange. Etude quali et quantitative de son huile essentielle par C. G.". Planta méd. 39, 270 (1980). (3) GOMIS HURTADO, E. "Thymus serpylloides subesp. Gadorensis: Estudios farmacognósticos". Tesina, Granada, (1987). 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