Mise en evidence d’une 5-lipoxygenase dans les graines de cicer arietinum

.MISE EN EVIDENCE D 'UNE S-LIPOXYGENASE DANS LES GRAINES DE CICER ARIETINUM" HAFIDI Naima, BENEYTOUT J.L. et TIXIER Marie Faculté de Pharmacie de LIMOGES 2, Rue du Docteur Marcland 87025 LIMOGES CEDEX FRANCE Les lipoxygénases sont des dioxygénases a fer non héminique qui catalysent l'oxygénation des acides gras polyinsaturés contenant au moins un systeme 1-4cis, cis pentadiene, en produisant un hydroperoxyde conjugué cis-trans. Ces enzymes sont abond8llllllent présents dans le monde vivant végétal et animal (1,9) . Mais, si leur intervention dans.le métabolisme cellulaire animal est assez bien connu, aucun rOle physiologique précis n'a pu etre attribué aux lipoxygénases végétales. La plupart des travaux effectués sur les lipoxygénases végétales ont tenté d' expliquer les mécanismes d' action de ces enzymes et de connai tre les effets biologiques des métabolites dont ils catalysent la formation ; ceci dans le but de transposer éventuellement les résultats obtenus aux lipoxygénases animales, plus difficiles d' acces. Il faut di re que les enzymes végétaux se sont avérés �tre d'excellents modeles d'étude pour les enzymes animaux. Quelques travaux ont montré, d'autre part, une évolution de l'activité lipoxygénasique au cours de la germination de graines (2,6-11) d'ou un rOle possible des lipoxygénases dans les processus germinatifs (5) . Dans ce travail, a été étudiée l'activité lipoxygénasique des graines de Cicer ArietilJUID (Pois Chiche -Chiclt pea -Bengale bean) et ses modifications au cours de la germination 1 -ExtractiolJ de l'elJzyme Des essais préliminaires ayant montré la tres grande solubilité dans l'eau de la lipoxygénase de Pois Chiche, l' extraction a été réalisée de fa�on tres simple par de l'eau distillée en présence de Brij 99. 2 -Activité lipoxygénasique L'extrait brut ainsi obtenu possede déja une activité lipoxygénasique tres importante (3500 U/mg de protéine) et permet d'étudier res propriétés de l'enzf1De : pH optimum, effet de la température, conservation, action des inhib1teurs spécifiques . a Au pH optimum de 6 O, l'acide linoléique et l'acide arachidon!que sont transformés en hydroperoxydes. Le spectre d'absorption montre un pic a 234 nm, corres�ondant aux di enes conjugués et un autre p1C, vers 280 nm qui correspond aux cétodienes ou aux cétotrienes et disparait apres réduction par le NaBH. (Fig. 1). Figure 1. Spectre U.V. des diénes conjugués (234 nm) et cétodiénes (280nm) formé s par action de la LOX de Cicer arietinum , a pH 6,0 ,sur l'acide linoléique. 428 ¡, I 1.' o .• o., o., . .. L'analyse par HPLC-PI des produits de la réaetion montre la présenee de 2 hydroperoxydes : 13-LOOH et 9-LOOH a partir de l'aeide linoléique, 1S-HPETE et S-HPETE a partir de l'aeide arachidonique, témoignant de 1'existenee simultanée de deux isoenzymes, une 1S-Lipoxy�énase (1S-LOX) et une S-Lipoxygénase (S-LOX). Au 9H optimum de 6,0 ,1'aet1vité 5-LOX est prépondérante (65l) alors qu' a pH aleahn, eette aetinté ne représente plus que 18l de l' aetivité tota1e ( Fig. 2) ==s;- -- '5 Figure 2Chromatographie HPLC-PI des produits d'oxygénation de l'acide arac fi idonique par l'extrait de graines totales de Cicer arietinum á pH=6,0 (a) et á pH=B, O (b); ClS phase reverse; 235 nm; solvant : Methanol / H20 / acide trifluoroacétique ( BO/20/0.1 , v/v/v) BORTHAKUR (3 4) avait déja déerit dans les graines de Cicer arietinum, une aetivité lipoxyg é nase due a la présenee de 2 isoformes, eonduisant a des produits différents ( 9 et 13 LOOH a partir d'aeide lino1éique). Nous avons vou1u voir si les 2 isoenzymes étaient présents dans des par ti es différentes de1a graine. L'extrait obtenu a �artir de la farine de Pois chiche privée de la cutieu1e présente une aetivité hpoxygénase plus faible ( 900 U/mg de protéine) au pH optimum de 8,0 et fournit surtout du 15-HPETE a partir d'aeide arachidonique. A pH 6,0, eet extrait de farine est peu aetif et fournit principalement du 5-HPETE (Fig. 3) L . == - ti • §§§j! §§fí . �!�� ." ES ____ 'a�·���� - - - - - _ . - =. l. .E :r= Figure 3Chromato g ra � hie HPLC-PI des produits d'oxygénation de l'aclde arachidonique par la f arlne de graines privées de leur cuticule, á pH=6,0 (a) et á pH=8,0 (b) ; 235nm;C18 phase reverse;solvant: CH30H / H20 / CF3COOH ( 80/20/0.1, v/v/v). L'aetivité 5-LOX semb1e done étre surtout loea1isée dans la zone externe de la graine et dan s la eutieu1e. 429 3 -EvolutiolJ au cours de la germilJStion Les graines, apres trempage dans l'eau distillée A + 4"C pendant 2 heures, ont été mises en germer. Des prélevements ont permis de suivre l' activité lipoxygénasique. Cette activité augmente pendant les premieres heures de germination pour atteindre un maximum entre 24 et 32 heures) et décroit tres rapidement ensuite pour ne représenter a 50 heures que 20� de l'activité maximum.(Fig. 4). Figure 4Activités lipoxygénasiques au cours de la germination des graines de Cicer arietinUII1 .L_____ ----= ====--- - o .. L'analyse par HPLC-PI des produits formé s montre une modification �ortante des pourcentages d'activité efes deux isoenzymes. Au cours de la gerDl1nation, l'activité de la l5-LOX s'effondre tres rapidement et apres 24 heures de germination ,il se forme, aussi bien a pH 6,0 qu'a pH 8,0 presque exclusivement du s-HPETE, traduisant une augmentation tres importante de l'activité de la 5LOX des les premieres de germination (Fig. 5) c 1) '� , I L 1 lile -r�: " -, I ' � ! , I , � -¿ � I ,� l�: ,', ;jii - . : 8 ;:1 i:: - �r- � ¡i � + H -/,--I-'-c- � #� -+ -Ft- " ' -¡- ' - ' : t- - �r- � �� Figure 5Chromatographie HPLC-PI des produits d'oxygénation de l'acide aracfiidonique par l' extrait' de graines de Cicer arietinuII1 á 24 heures de germination et á pH=6,O (a) et pH=8,O lb) Cette modification de l'activité des lipoxygénases au cours de la germination conduit a s'interroger sur la signification de ce double phénomene. 430 1. Evolution en fonction du temps de germination de l' activité lipoxygénasique totale. Cette variation a déja été observée pour d'autres graines g ermées (2,3,4,5) . En effet, au cours de la germination des g raines de Lupin (2J, l'act1v1té enzymatique augmente pour atteindre un maximum (+ 50 'J a 48 heures. Cette activité diminue rapidement ensuite pour étre a peine décelable A 72 heures de germination. 2. Modification dans l' acti vi té des isoenzymes, avec disparition progressive de la l5-lipoxygénase et augmentation de la 5-lipoxygénase a 24 heures puis le phénoméne s' inverse. Des variations dans les acti vités respective s des isoenzymes de lipoxygénase ont été décrites au cours de la germination des graines d'orge, de mais, de soja, de 1upin (2,6,8) . Se10n GAILLIARD (5), la 1ipoxygénase pourrait jouer un rOle important dan s la ré�ulation de la p02 dans certaines graines en germination. C'est ainsi que 1 augmentation de l'activité de la 5-LOX pourrait, en captant l'oxygéne, maintenir une p02 basse et assurer les conditions d'anoxie nécessaires pendant les premdéres heures de germination. Mais devant la chute bruta1e de l'activité enzymatique tota1e de la graine de pois Chiche germée, la présence des molécules inhibitrices des lipoxygénases ( chélateurs du fer, antioxydants, scayengers de radicaux ... ) a été envisagée. Que1ques résultats préliminaires récents semblent conforter cette hypothése : en effet l' extrai t aqueux brut de graines de poi s chiche germées inhibe, in vitro, la lipoxygénase de soja et la lipoxygénase de graines non germées a leur pH optimum (Fig. 6) . ABSORBAN CE (23" nm) 1 "- 0.8 - 0.8 0.4 0.2 l ,0.;--�� 4 V /' . Q _ A - o � � I.� __ '--'--" o 20 .. O 80 80 '100 120 Temps (see) Figure 6Inhibition de l' aetivité lipoxygénasique par un extrait de graines germées de Cieer arietinum 1 - Témoin: lipoxygénase de soja + aeide linoléique + tampon pH 6,0 2 -Lipoxygénase de soja + extrait de graines germées(lOO h)+aeide linoléique + tampon pH 6", O 3 - Lipoxygénase de graines seehes de Cieer arietinum + acide linoléique + tampon pH 6,0 4 -Lipoxygénase de graines seehes + extrait de graines germées (100 h) + aeide linoléique + tampon pH 6,0 L'isolement et l'identification des molécules responsables de ee phénoméne aont en cours. BIBLIOGRAPHIE l. ANDRIANARISON R.H., BENEYTOUT J.L. and TIXIER M. Données réeentes sur les systemes d'oxydation des aeides gras polyinsaturés ehez les végétaux. Regard sur la biochimie, 1991, 4, 44-49 431 2. BENEYTOUT J.L., NAJID A. and TIXIER M. Changes in lipoxygenase Activity During Seedling Development of Lupinus Albus. P1ant Science, 1988, 58, 35-41 3. BORTHAKUR A ' rRAMADOSS C.S. and RAO A.G.A. 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