Medios de cultivo sólidos para el estudio de la formación de cristales por los microorganismos

TRABAJOS ORIGINALES DE LA FACULTAD --- .�. --- DEPARTAMENTO DE MIOROBIOLOGIA MEDIOS DE CULTIVO SOLIDOS PARA EL ESTUDIO DE LA FORMACION DE CRISTALES POR LOS MICROORGANISMOS' por A. RAMOS-CORMENZANA, M.a CARMEN PERE,z-MIRANDA y E. BOQUET * RESUMEN En el presente trabajo se ensayan dieciseis medios de cultivo p�ra determinar la formación de cristales. Ee describe ¡:or primera vez el que la estroncianita, pueda ser originada biológicamente. Entre los medios descritos hasta el momento ·para la formación de COsCa se considera como más idóneo un medio sencillo (BRC) a base de extracto de levadura y cloruro cált:!ico. RESUME Dans le présent travail on essayent seize milieus de culture' pour de terminer la formation de cristals. On décrire pour la premiere fois, qui la 'Istroncianite" elle peut etre motivée biologiquement. Entre les milieus décrits encore le momen-t pour la formatibn' de C03Ca on considérc comme le plus apte, un milieu (BRe) conposé pour Extrait de levure et chlorure de ca}.cium. SUMMARY Sixteen culture media were used to determine cristal formation. Amóng the culture media used to study calGium carbonate formation, it was concluded that a medium (BRC) with yeastextract and calcium chloride was better and with satisfactory results. . It was first time reported that "stroncianite" casld be formed biologi,cally. ... Cátedra de Microbiologia. Fa·cnltad de Farmacia. Univ. de 'Barcelona. Ars Pharmaceutiva. Tomo XVI. Núm. 3, 1975. 336 ARS PHARMACEUTICA INTRODUCCION La existencia de microorganismos capaces de formar cristales en su ambiente ecológico, es un hecho conocido; en alguno de cu yos procesos pueden llegar a originarse grandes acumula'ciones en la naturaleza como las de C03Ca descritas en la Gran Bahama (1). Recientemente se ha incrementado el estudio de la formación de cristales de C03Ca por los microorganismos (2,3). La formación de cristales en los medios de cultivo sólidos ha demostrado ser una buena técnica de estudio (2). En el presente trabajo, se pretende es tudiar comparativamente alguno de los medios hasta el momento elaborados, y otros no descritos en la bibliografía científica, 'con la finalidad de poder determinar la influencia de determinados nu trientes en la formación de cristales y seleccionar aquellos medios que puedan servir en posteriores investigaciones. MATERIAL Y METODOS a) Medios de cultivo Los medios utilizados se encuentran detallados en la talla 1, a todos ellos se les adicionaba agar purificado al 1.6%. Cuando el medio de cultivo llevaba glucosa esta se esterilizaba por separado. El pH final ante.s de la esterilización, se ajustaba a 8.0; aunque se ensayaron algunos medios a pH 7.0, y 6.0. b) Microorganismos: Como cepas bases para una investigación elemental de rutina se utilizaron el Micrococcus luteus y el Serratia marcescens micro organismos fácilmente formadores de cristales. Para estudios numéricos se ensayaron diferentes especies bac terianas aisladas del suelo, y otras correspondientes a la colección de cultivos existentes en nuestro laboratorio. c) Obtención de cristales: La separación y purificación de cristales se practicó en la for ma descrita en anteriores trabajos (2,4). RESULTADOS En las tablas n y In van indicados los resultados obtenidos respecto a la formación de cristales. En la tabla n se exponen los cristales que han sido determinados por difracción de rayos X y la Tabla I.- Composición de los distíntos medios de cultivo ensayados ( cantidades expresadas en g/mI). I ngredlentes tll tl3 tl4 tl_ tl7 tlE tl12 tl15 tl16 tl17 tl18 tl19 tl20 tlK5 " Glucosa 6.0 1.0 10.0 5.0 Extracto levadura 2.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 1.0 Glicrofofato Ca 4.0 1. O 10.0 Acetato de Na 2.5 2.5 2.5 2.5 Acetato Ca 2.5 2.5 2.0 1. 45 Acetato Mg 2.4 1.3 NO,K 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 N03NII4 2.0 C12Ca. 1/2 H 20 0.1 1.8 1.8 1.8 Citrato Na 2.0 Lactato Na 2.0 S04Ng 0.2 C12Sr 2.0 Cl3Fe 0.01 Cl2Ba 1.9 CI Na ,0.1 -- - - tlKe tlKl 4.0 4.0 2.0 1.8 I Si fJl � � O I C..:> C..:> -.:1 ,338 ARS PHARMACEUTICA TABLA H.-CRISTALES ENCONTRADOS EN LOS DIFERENTES MEDIOS �NSAYADOS POR DIFRACCION DE RAYOS X MEDIO B - 1 B4 B - 8 B -18 B -19 BRC BR5 TIPO DE CRISTALES Tartrato cálcico hidratado Carbonato cálcico (tipo calcita) Carbonato cálcico (tipo calcita) Sulfato de bario Carbonato de estroncio (tipo extrün,�ionlto) Carbonato Cálcico (tipo calcita) Carbonato Cálcico (tipo calcita) TABLA HI.-COMP ARACION DE LA FORMACION DE CRISTALES EN B-4 Y BRC A DISTINTOS TIPOS DE INCUBACION Núm. de microorganismos que forman cristales (de 75 ensayados) a las: Medio 24 h. 2 días 3 días 4 días 5 días 7 días 10 días 21 días B - 4 BRC 34 52 42 54 48 56 48 57 50 57 52 57 55 58 59 64 tabla III se corresponde con un estudio comparativo de la forma ción de cristales de COaCa en dos de los medios descritos hasta el , momento en la bibliografía el B-4 (3) Y el BRC (4). DISCUSION De acuerdo Con los resultados obtenidos con M. luteus y S. mar cescens en los medios B-3 y B-5 puede deducirse que la presencia de NOaK que era utilizada en los trabajos de Me Callum y Guha thakurta (1) no, es imprescindible para la formación de cristales. A diferencia de los resultados obtenidos anteriormente por Boquet (2) nosotros también obtuvimos cristales en medios a pH ácido. La mayor parte de los medios ensayados iban dirigidos a la búsqueda de C03Ca, por €�tar mejor descrito en la bibliografía científica y ser relativamente fácil su formación; sin embargo al modificar los componentes metálicos del medio de cultivo se han obtenido datos dignos de señalar como la formación de carbonato de estroncio en el medio de cultivo BJ9 lo que sugiere, dentro del campo especulativo que una adecuada modificación de los consti- ARS PHARMACEUTICA 339 tuyentes del medio de cultivo podría dar lugar a la formación mi crobiana de otros minerales, cuyo origen biológico aún ni ha sido considerado. Como se observa en las figuras 1, 2 Y 3 la formación de cristales puede ser perfectamente detectada por métodos de observación ma croscópica; aunque para efectuar una lectura rápida se deba acu dir a la observación microscópica (figuras 4, 5, 6 Y 7). Fig. 1 Aislamiento de bacterias formadoras de cristales en el medio B-4. En apariencia los cristales obtenidos al modificar parcialmen te la composición del medio de cultivo son distintos como, fádlmen te puede apreciarse de la observación de las figuras 4, 5 Y 6; sin embargo al efectuar la determinación por difratometrÍa de rayos X se aprecia que se corresponden con C03Ca. En algunos casos esta formación de cristales es intensa (fig. 6) y en otros son menos nu merosas, quedando como superficies cristalinas sobre la colonia (fig. 5). Como hecho, verdaderamente curioso puede destacarse el que se obtuvieran cristales de sulfato de bario, en un medio en el que esperábamos obttner cristales del tipo de los carbonatos. 340 ARS PHARMACEUTICA Fig. 2 Colonia formadora de cristales en el medio B-lo Fig. 3 Colonia formadora de cristales sobre el medio de cultivo B-4. ARS PHARMACEUTICA 341 Fig. 4 Observación de cristales microscópicamente en B-4. Fig. 5 Observación de cristales microscópicamente en BRC (escasos). 342 ARS PHARMACEUTICA Fig. 6 Observación de cristales mi,croscópicamente en BRC (numerosas). Fig. 7 Detalle de los cristales formados intracolonialmente en BRC. ARS PHARMACEUTICA 343 BIBLIOGRAFIA 1. Mc CALLUM, M. F. and GUHATHAKURTA, K-The precipitation of calcium carbonate from sea water by bacteria isolated from Bahama Bank sediments. J. Appl. Bact. 33, 649 (1970). 2. BOQUET, E.-La formación de cristales por las bacterias en medios só lidos. Tesis doctoral. Univ. Barcelona (1973). 3. BOQUET, E., BORONAT, A, and RAMOS-CORMENZANA, A.-Production of cal cita (Calcium Carbonate) crystals by soil Bacteria is a General Pheno menon. Nature 246, 527 (1973). 4. RAMOS-CORMENFANA, A.-Formation of Calcite crystals by Bacteria of the genus Bacillus. Microbios (pendiente de publicación, 1975).