Establecimiento de índices para el estudio de la solubilización de fosfatos por bacterias del suelo

ARS PHARMACEUTICA REVISTA DE LA FACULTAD DE FARMACIA UNIVERSIDAD DE GRANADA Tomo XVII -Núm. 4 Consejo de Redacción Director: Prof. Dr. D. Jesús Cabo Torres Director Ejecutivo: Prof. Dr. D. José Luis Valverde Vocales: Prof. Dr. D. Alber,to Ramos Cormenzana Prof. Dr. D. Fermín Sánchez de Medina Con treras Prof. Dr. D. Antonio Cerezo Galán Pro!. Dra. María A. López Secretario de Redacción: Prof. Dr. D. Luis Bravo Díaz Redacción y Administración: Facultad de Farmacia. Granada -España. Dep. Legal. GR: núm. 17-1960 Imprime: Gráficas del Sur, S. A. Boquerón, 6 Granada 1976. 1.000 ejemplares 1976 PAG. TRABAJOS ORIGINALES DE LA FACULTAD • Establecimiento de índices para el estudio de la solubilización de fosfatos por bacterias del suelo. Por F. Ruiz Berraquero, Ana M.a Baya y A. Ramos Cormenzana ... ... ... ... ... 399 • Potencial Redox en suelos de la zona de Cabo de Gata (AlmeríaJ. Por García Trenado, J. G.; Aguilar, J.; García Navarro, A. y Delgado M. oo. 407 • Disgregación/disolución de compri midos como factores condicionan tes de su actividad terapéutica. 11. Comprimidos de Prednisolona. Por J. Sánchez-Morcillo, A. Cerezo y J. M.a Suñé oo. oo. oo. oo. oo. oo. oo. oo. 437 • Bibliografía ... ... ......... ...... ... 455 TRABAJOS ORIGINALES DE LA FACULTAD --- .�. --- Departamento de Microbiología. Facultad de Farmacia. Universidad de Granada ESTABLECIMIENTO DE INDICES PARA EL ES.TUDIO DE LA SOLUBILIZACION DE FOSFATOS POR BACTERIAS DEL SUELO F. RUIZ BERRAQUERO, ANA M.a BAYA * Y A. RAMOS CORMENZANA Desde las primeras inv-estigaciones de SACKETT y c.ol. (9), se de mostró que determinadas bacterías del suelo tenían actividad solu bilizadora de fosfatos y son numerosísimos los trabajos encamina dos a la búsqueda de microorganismos con esta actividad y a la utilización de los mismos para mejorar la fertilidad de los suelos. Según ALEXANDER (1), de un 10 a un 50 por ciento de las bacte rias aisladas del suel.o son capaces de solubilizar fosfatos cálcicos. Son eficaces en la transf.ormación, diferentes géneros y especies de bacterias gram negativas y Gram pos:itivas , SPERBER (lO), TARDIEux ROCHE (11), y también muchos-hongos, RAMOS, CALLAO, CARVALHO (8). Estas bacterias y hongos crecen en medios con fosfatos bi y tricál cicos, apatito .o materiales insolubles parecidos, como única fuente de fosfato. Los microorganismos, nC) solamente asimilan el elemen to, sino que también hacen soluble una parte importante, liberando cantidades en exceso de su propia demanda nutricional. El uso de los inóculos de fosfobacterias ha sido muy discutido por los divers.os investigadores y en numerosos trabajos se exponen las ventajas y desventajas de su aplicación, YUNG (14), MENKINA (6), PrSEMSKAYA y KOCHUNOVA (7), AzcoN (2). Parece ser que se obtenían grandes ventajas si los microorga nismos adicionados fueran autóctonos. De ahí, el resultado tan dife rente a que d-an lugar la aplicación de idénticos fertilizantes a dis tintos tipos de suelo. Mientras que la utilización de un fertilizante * Actualmente en el Instituto de Ciencias Biológicas, Universidad Cató lica de Valparaíso (Chile). Ars Pharmacéutica. Tomo XVII. Núm. 4, 1976. 400 ARS PHARMACEUTICA obtenido a partir de cepas mÍcrobianas locales no daría lugar a Un des€quilibrio tan drástico. En este sentido parece interesante establecer criterios de selec ción, así como técnicas sencillas que permitan elegir con facilidad aquellas bacterias que en un determinado suelo reunan las condi ciones más adecuadas para formar parte del fertilizante. En el presente trabajo pretendemos establecer unos índices de solubilización y así poder estudiar las relaciones existentes entre la intensidad y el tiempo en que el efecto solubilizador se hace pre sente con microorganismos Gram negativos y Gram positivos aisla dos de diferentes suelos. MATERIAL Y METODOS Se han utilizado muestras de suelos naturales y cultivados de las provincias de Barcelona y Alicante. El medio empleado para el aislamiento de solubilizadores es un medio empobrecido al que se añade como fuente de fosfato, fosfato bicálcico insoluble: glucosa 20 g.; c1oruro amónico 7 g.; sulfato magnésico 0,5 g.; fosfato bicálcico 2 g.; agar 11 g.; H20 C.s.p. 1.000 mI.; pH 7,5. En €ste medio, las colonias constituidas por bacterias solubili zadoras de fosfato bicálcico determinan Ja formación de un halo transparente fá,cilmente observ¡¡.ble al contrastar con la opacidad del medio. Se realizó un primer aislamiento de solubilizadores al final del tercer día de incubación. A estos microorganismos se les ha deno minado solubílizador,es precoces (SP). Vueltas a incubar las placas, se realizaron observaciones diarias hasta un plazo de 15 días. Las colonias que presentan halo de solubilización a partir del tercer día son consideradas como solubilizadores tardíos (ST). Los microorga nismos pertenecientes a colonias que pasados quince días no pre s€ntan halo de solubilización visible se estiman como no solubili zadores (NS). La elección del tercer día para separar dos categorías de solu bilizadores obedece a que en las experiencias realizadas, la mayoría de los microorganismos que pasados los tr€s primeros días no pré sentan halo visible, tardan varios días más en presentarlo. Para estimar la capacidad de solubilización de los microorganis mos aislados se procede a sembrarlos en el mismo medio mediante ARS PHARMACEUTICA 401 asa y masivamente en series de 5 a 6 por placa y dispuestos circu larmente. Se incuban a 30°C. A los tres días de sembrados se determina la capacidad de 50lubilización de los SP que son los correspondientes a las colonias que presentan halo visible ,en este período de incubación (i.s.) que viene dado por la relacíón entre el diámetro del halo producido al tercer día yel de la colonia correspondiente medido en milímetros: o del halo (mm) i.s. o de la colonia (mm) De acuerdo con los índices de solubilización, se han establecido tres categorías de S.P. para estimar su poder solubilizador: a) SP con índice de solubilización bajo (i.s.b.) i.s. < 2. b) SP con índice de solubilización medio (Ls.m.) 2¿ i.s. < 4. c) SP con índice de solubilización elevado (i.s.e.) i.s. :::::,.. 4. Para los ST (solubilizadores tardíos) se determina el i.s. a,l terC'er día de la apa,rición del halo de' S'Ü'lubiliiación y de acuerdo a los mismos valores. El valor del i.s. para este grupo es más limi tado, ya que la aparíción de la solubilizació� .puede acontecer en tiempos d¡ferentes para los distintos solubilizadores. En un intento de garantizar la diversidad de las cepas utilizadas se aislaron solo aquellos microorganismos que aparecían con dis tinta morfología en cada muestra de suelo. (Se realizaron pruebas morfológicas y bioquímicas). En la elección de métodos estadísticos adecuados se han utili zado los tratados de DOWNIE (4) Y VIEDMA (12). RESULTADOS En la Tabla 1 y gráficas se exponen los resultados obtenidos tras realizar las determinaciones de la capacidad de solubilización si guiendo los criterios anteriormente expuestos. En cada uno de los grupos se indican los porcentajes de Gram positivos y Gram ne gativos. 402 ARS PHARMACEUTICA TABLA l.-Disti'ibtlc�ón de los microorgr..nisrnos de acuerdo con la intensidad de la solubl!1zación y tiempo empleado en producirla N.O de microorl.s.b. l.s.m. l.s.e. ganismos n.O % n.O °k n.O % Solubillzadores Gram ( +) 23 22 53,65 1 4,34 O 0,00 precoces (SP) Gram (-) 50 19 46,34 22 95,65 9 100,00 Total 73 41 56,16 23 31,50 9 12,312 Solubillzadores Gram (+ ) 18 12 80,00 6 54,54 O� tardíos (ST) Gram (-) 16 3 20,00 5 45,45 8 100,00 Total 34 15 44,11 11 32,35 8 23,52 Total 107 56 52,33 34 31,77 17 15.88 Claves utilizadas en tablas y gráficas: ST; Solubilizadores tardíos SP; Solubilizadores precoces 1 � " " l.s.b.: indlce de solubillzación bajo l.s.m.: índice de solubilización medio l.s.e.: indice de solubilización elevado . i5 1 ¡; � .. ;0;. ª � � � ,. !: � !l o o C! ¡; � 1 � + � � ::; < = = o " o 1 t'{ 11 l! � < .= o � ARS PHARMACEUTICA 1 :; < " o 1 -' :; � ª ::; < � = ¡:: o o � I � :1 :; ::; < = o ! .� = o ,,':'. <\. ; G " ;¡; � � � < " o 1 l! < = o 1 � = o � � - �IIIIIIIIIII�--------�I � 403 404 ARS PHARMACEUTICA DISCUSION La técnica en placa para detectar y aislar microorganismos so lubilizadores ha sido utilizada con éxito por diversos autores, WE BLEY (13). La medida de los halos de solubilización ha sido igualmente empleada para estimar la capacidad de solubilización de una cepa bacteriana de esta condición, JOHNSTON (1952). l.-Los resultados de solubilización (tabla 10 gráfi·ca 1), nos mues tran, de acuerdo a lo observado, un mayor porcentaje de solubili zadores Gram negativos (61,68 por ciento) que de Gram positivos (38,3,1 por ciento). Igualmente resulta ser superior el porcentaje de solubilizadores precoces (68,22 por ciento) que el de solubilizadores tardíos (31,77 por ciento). Hemos calculado el intervalo de estimación del parámetro de cada población binomial con un nivel de confianza del 95 por ciento, de acuerrlo con la fórmula basada en el teorema de Moivre para muestras grandes y parámetro no próximos ni a cero ni a uno que es el caso que nos ocupa. Estos intervalos resultan ser por la frac ción de Gram negativos (0,59-0,77), lo que confirma los resultados con el nivel de confianza del 95 por ciento empleado. 2.-Los datos confirman igualmente el hecho observado de que el número de bacterias Gram positivas decrece, aumentando el de Gram negativas a medida que cqnsideramos niveles de solubiliza ción más elevados. %G+ %G Ls.b. 53.,65 46,34 Ls.m. 4,34 95,65 Ls.e. ° 100 Para valorar estadísticamente el crecimiento del porcentaje de Gram negativos en las diferentes fracciones y la consiguiente dis minución del correspondiente a los Gram positivos, .se han calculado igualmente los límites de confianza de los parámetros normales. Co mo en este caso, el tamaño de la muestra no es grande y los valores de p se aproximan a ° y 1, no se puede utilizar la misma fórmula que en el caso anterior. Para resolver este problema hay deducidas expresiones analíticas exactas de los límites de confianza de P a partir de la distribución F de Snedecor. Puesto que el número de microroganismos correspondiente a los solubilizadores de índice ele- ARS PHARMACEUTICA 405 vado es muy bajo, los asimilamos a los de índice medio considerando únicamente dos niveles de solubilización. Los intervalor resultan ser para los solubilizadores precoces Gram negativos de índice de solubilización bajo (0,30-0,62) y para los de índice medio y elevado (0,79-0,99). Se observa el desplaza miento de los límites de confianza de las bacterias Gram negativas al pasar de la primera fracción (Ls.b.) a la segunda (Ls.m. o i.s.e.), lo que nos indica que con un nivel de confianza del 95 por dent'O la primera fracción es menor que la segunda. Aplicados idénticos cálculos a los Gram positivos los valores son: (0,35-0,69) y (0,001�0,16). El desplazamiento de los límites de confianza en este caso es decreciente, lo que nos indica que con el nivel de confianza del 95 por ciento la fracción de microorganismos de índices medio y elevado es menor que la de índice bajo. A resultados semejantes se llega si se realizan las mismas com probaciones en los solubilizadores tardíos. 3.-El porcentaje de bacterias Gram negativas que son solubi lízadores precoces (68,49 por ciento), es menor que el correspondien te a los solubilízadores tardíos (57,04 por ciento), al contrario que ocurre en los Gram positivos (31,50-52,94 por ciento). Para contrastar si estas diferencias de porcentajes observadas (creciente en un caso y decreciente en otro) son significativas a un nivel de significación a, siendo los tamaños de la muestra pequeños y distintos, y por tanto 02 I :J 2 existe un método en el que se calp, P2 cula un estadígrafo de prueba que sigue la distribución de la "t" de Stuclent con 1I gradoS' de lihertad. En este caso se ha realizado el cálculo para las bacterias Gram negativas. Si la diferencia de porcentajes de este grupo es signifi cativa, también lo será para las Gram positivas. Los valores obtenidos son t=2,122 y t=1,670; como quiera que 2,122>1,670 la diferencia resulta significativa al nivel de significa ción empleado 0,05 (95 por ciento de confianza). RESUMEN Se ha determinado la capacidad de solubilización de fosfato inorgá nico de bacterias del suelo que poseen esta condición. Se establecen dife rentes grupos atendiendo de una parte a la intensidad solubilizadora de las baGterias (mediante unos in dices de solubilización) y de otra al tiempo empleado en producirla. Posteriormente se estudian las relaciones exis tentes entre ambos aspectos: capacidad solubilizadora y tiempo de solu bilización y -entre éstos y la Gram positividad y negatividad de las bac- 406 ARS PHARMACEUTICA terias. El obj·eto de estas relaciones 'es contribuir a establecer criterios de selección que pueden ayudar en la elección de cepas solubilizadoras. Se ha realizado igualmente un cuidadoso análisis estadístico de los resultados. SUMMARY The ability to dissolve inorganic phosphate by soil bacteria was deter mined in these kind of organisms. Different groups were established according to the intensity of the solving action using a proposed solu bilization parameters, and with time required to produce it. A study of the posible correction among the ability to dissolve phosphate, the time used and the Gram stain was made. The purpose of the work was to contribute in the critería of selection oí the dissolving phosphate strains. A carefully statistical analysis oI the results was also made. RESUME On a determiné la capacité de solubilization du phosphate inorgani que des bacteries du sol qui posectent cette condition. On peut etablir des différent groupes ayant ·compte d'un coté l'intensité solubilizatrice des bacteries (avec d.es indixes de solubilization) et d'autre le temps employé en la produire. Postérieurement s'estudient les rélations qui exis tent ·entre les deux et la Gram positivité et negativité des bacteries. L'objet de ces relations c'est de contrlbuer a stabl1r des criteriums de select10n qui nous aident a l'election de souches solubilizatrices. On a re alisé également un ·complet analyse statist1que des résultats. BIBLIOGRAFIA 1. ALEXANDER, M. "Introduction to soU microbiology". Willey and Son s Inc. London (1967). 2. AZCON, R. Tesis Doctoral. Universidad de Granada (1972). 3. AZCON, R., BAREA, J. M., CALLAO, V. Cuad. C. Biol. 2, 23-30 (19712). 4. DOWNIE, N. M. Y HEATH, R. W. "Métodos estadísticos aplicados". Ediciones del Castillo. Madrid (1971). 5. JOHNSTON, H. New Zeeland J. ScL and Tech. B-33, 436-46 (952). 6. MENKINA, R. A. Udobrenik-i-Urozhal, 1, 25-28 (956). 7. PISEMsKAYA, V. A. Y KOOHONOVA, T. A. Bull. nauch Tekh. Inform. Sta provol, nauch-islled. Inst. Sel. Khoz. 1, 52-4 (1956). 8. RAMOS, A., CALLAO, V. Y CARVALHO de P.C.T. Microbiol. 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