Efecto de la temperatura de incubación en la susceptibilidad del género Bacillus frente a antibióticos

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA EFECTO DE LA TEMPERATURA DE INCUBACION EN LA SUSCEPTIBILIDAD DEL GENERO BACILLUS FRENTE A ANTIBIOTICOS M. Jiménez-Valera; A. Ruiz-Bravo y A. Ramos.(;ormenzana RESUMEN Se ha estudiado la susceptibilidad de 54 cepas de Bacillus, incluídas en 23 espe cies, frente a 17 antibióticos pertenecientes a diversos grupos, mediante la técnica clásica de antibiograma por difusión en agar, incubando las placas a 37°C y a 22° C respectivamente. En el 86 %de los casos estudiados, la susceptibilidad fue mayor a 22°C que a 37°C, y solamente en el l % ocurrió lo contrario. La influencia de la temperatura fue similar sobre cepas mesófIlas, psicrófIlas y termófIlas. SUMMARY The classical agar diffusion method was applie� to study the sensitivity of 54 strains included in 23 species of genus Bacillus, against 17 antibiotics different groups. Sensitivity test were belonging to performed at 22°C and at 37°C. B�cte rial sensitivity at 22°C was larger than at 37°C in most of the cases (86 %), where as the contrary was infrequent (l % ). Sensitivity of mesophile, thermophile, and psychrophile strains were equalIy influenced. INTRODUCCION La temperatura es uno de los factores físicos ambientales que ejercen una in fluencia decisiva sobre el crecimiento bacteriano (l). El efecto de la temperatura sobre el tiempo de generación de los microorganismos ha sido extensamente estu diado; ya es clásica en microbiología la agrupación de las bacterias en psicrófIlas, mesó fIlas y termófIlas, de acuerdo con sus rangos de temperatura para un creci miento optimo (2)" La temperatura influye no sólo en la velocidad de crecimiento, sino también en la composición de algunas estructuras celulares. Uno de los ejem plos mejor conocidos de esta influencia es el de los cambios en la proporción de ácidos grasos saturados e insaturados en la membrana cito plasmática de bacterias mesófIlas como Escherichia coli, dependiendo de la temperatura de crecimiento (3). Recientemente se ha comunicado que la expresión de proteinas de la mem brana externa de Yersinia enterocolitica es termodependiente (4). Ars Pharmaceutica. Tomo XXVI. Núm. 2, 1985. 82 ARS PHARMACEUTlCA La susceptibilidad bacteriana frente a los agentes antimicrobianos viene deter minada por mecanismos complejos, entre los que cabe señalar algunos que a su vez pueden resultar notablemente influenciados por la temperatura: Tales serían la permeabilidad de las cubiertas celulares, la expresión de enzimas inactivantes, la expresión de proteinas con afInidad para antibióticos, etc. Por tanto, la tempe ratura de crecimiento puede influir de forma importante en la sensibilidad a anti bióticos, como ha sido demostrado para Y. enterocolitica en nuestro Laboratorio (5). En el presente trabajo pretendemos extender el estudio de la influencia de la temperatura en la susceptibilidad frente a antibióticos a especies del género Baci llus, incluyendo cepas mesófIlas, termófIlas y psicrófIlas. MATERIAL Y METODOS Bacterias Las cepas incluídas en este estudio, su procedencia y las especies a que perte necen se muestran en la Tabla 1. Antibióticos Se utilizaron discos comerciales de antibiograma, cuyo origen y concentración se relacionan en la Tabla 11. Preparación de inóculos Las cepas se cultivaron en tubos con Tripticase soy agar (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) inclinado, para obtención de masa bacteriana, incubándose a 370C durant� 18 h. Las bacterias se recogieron en solución salina al 0,85 %, ajustándose la concentración por nefelometría hasta un' valor equivalente al estandar de BaS04 propuesto por Bauer y col. en 1974 (6). Susceptibilidad frente a antibióticos Los inóculos se diseminaron en la superfIcie de placas de Múeller-Hinton (Institut Pasteur Production, París), siguiendo la técnica clásica de antibiograma en medio sólido (7). Una vez colocados los discos, las placas se mantuvieron 15 minutos a 40C para la predifusión de los antibióticos (8) tras lo cual se incubaron a 220C o a 370C durante 24 h, procediéndose entonces a medir los diámetros de los halos de inhibición del crecimiento sobre fondo oscuro y con luz lateral. ARS PHARMACEUTICA 83 Tabla 1. Cepas de Bacillus. Especie Cepa a Especie Cepa Ji. alvei ATCC 6344 B. macerans CCM 2012 CCM 2051 !!.. megaterium ATCC 25848 PCM 481 CCM 2007 �. aminovorans ATCC 7046 PCM 1855 �. � ATCC 14574 �. mycoides PCM 1401 CCM 2113 B. pantothenicus ATCC 14576 B. brevis ATCC 8246 CCM 2049 CCM 2050 PCM 454 �. � ATCC 11778 B. polymyxa ATCC 842 ATCC 14579 CCM 459 CCM 1992 FG 29 PCM 482 PCM 451 li· circulan¡¡ ATCC 4513 B. I2slchrophilus PCM 1850 ATCC 9966 B. pulvifaciens CCM 39 CCM 2048 B. pumilus ATCC 7061 PCM 1398 ATCC 14884 B. coagulans ATCC 7050 CCM 2144 ATCC 10545 PCM 1852 PCM 1843 B. sphaericus ATCC 14577 B. � CCM 2213 CCM 2120 �. laterosIlODJ.¡¡ CCM 2116 PCM 485 �. lentus ATCC 10840 B. stearothermol2hilus FG 47 CCM 2014 PCM 453 PCM 450 li· subtilis ATCC 6051 li· licheniformis ATCC 14580 CCM 2216 PCM 1847 PCM 1903 B. macerans ATCC 8244 B. thuringiensis FG 45 a ATCC, Colección Americ·ana de Cultivos Tipo; CCM,. Colección Checos lovaca de Microorganismos; FG, Colección Facultad de Farmacia de Granada; PCM, ·Colección Polaca de Microorganismos. 84 ARS PHARMACEUTICA Tabla 11. Discos comerciales de antibióticos. Antibiótico Penicilina G (P) Ampicilina (AM) earbenicilina (CE) eefaloridina (CD) eefazolina (CZ) eloranfenicol (e) Tetracicl�na (TE) Bacitracina (B) Eritromicina (E) Amicacina (AN) Estreptomicina (S) Gentamicina (GM) Kanamicina (K) Tobramicina (TM) Rifampicina (RA) Acido Fusídico (FA) Novobiocina (NE) RESULTADOS Procedencia B-D.Merieux B-D.Merieux B-D.Merieux B-D.Mérieux B-D.Merieux B-D.Merieax B-D.Merieux B-D.Merieux B-D.Merieux BBL Difco B-D.Merieux B-D.Merieux Difco B-D.Merieux B-D.Merieux Difco Concentración 10 U 10 )lg 100 p.g 30 p.g 30 p.g 30 pg 30 p.g 10 pg 15 pg 30 p.g 10 pg 30 pg 30 pg 10 pg 30 pg 10 pg 30 pg En la Tabla 111 se resumen las comparaciones de sensibilidad a 220C y a 370C para cada una de las 23 especies estudiadas. Cuando se estudiaron varias cepas de una misma especie la comparación se realizó entre las medias aritméticas. De un total de 391 pares especie/antibiótico comparados, en 337 (86 %) la sensibilidad fue mayor a 220C; en 50 (13 % ), no hubo diferencias apreciables entre ambas temperaturas, y sólo en 4 (1 %) la sensibilidad fue ligeramente mayor a 370C. Dos antibióticos, bacitracina y estreptomicina, destacaron por su relativa in diferencia a los efectos de la temperatura. Por el contrario, el comportamiento de B. circulans frente a los () -lactámicos resultó engañoso, ya que una de las cuatro cepas ensayadas mostró variaciones im portantes y en sentido opuesto a las observadas en las otras tres (Tabla IV). Salvo esta única excepción, en las otras especies que agrupaban más de una cepa la in fluencia de la temperatura fue homogénea, aún en el caso de que algunas cepas fueran más sensibles que otras; un ejemplo típico se expone en la Tabla V. Fi nalmente, señalaremos que la influencia de la temperatura en las sensibilidades de B. psychrophilus y B. stearothermophilus frente a los antibióticos estudiados fue similar para ambas especies. ARS PHARMACEUTICA 85 Tabla 111. Influencia de la temperatura en la susceptibilidad del género � a antibióticos. Especie B. alvei !L. aminovorans B. badius B. brevía ª.� B. circulans 1!..: coagulana ª-. firmus B. laterosporus B. lentus B. 11cheniformis B. macerans B. megaterium -ª, mYcoides !. pantothenlcua �� B. psychrophilus �. pulvifaciens �. pumilus .!L. sphaerlcus !. stearothermophilu8 ª-.� B. thuringiensia Antibióticos P A.II CB CD CZ C TE B E AlI S GM K TM RA PI. !lB 22a 22 22 37b 22 22 22 OC 22 22 O 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 O 22 22 37 22 22-22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 O .22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 O 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 O 22 22 O 22 22 22 22 22 22 O O O O O 22 22 O 22 22 O 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 O 22 O 22 22 O 22 22 22 22 -22 22 22 22 22 22 22 22 22 O 22 22 O 22 22 22 22 22 22 O 22 22 22 22 22 22 37 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 O 22 22 22 22 O 22 22 22 22 22 22 O 22 O 22 22 O 22 22 22 22 22 22 22 22 22 O 22 22 22 O 22 22 22 22 O O 22 22 O 22 22 22 22 O 22 22 22 22 22 22 22 O 22 22 O 22 22 22 22 22 22 22 22 22 O 22 22 22 O 22 22 22 22 22 22 22 22 O 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 O 22 22 O 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 O 22 22 37 22 22 22 O 22 22 O 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 O 22 O O 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 O 22 22 O 22 O 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 22 O 22 22 O 22 22 22 22 O 22 a Susceptibilidad mayor a 22�C. Susceptibilidad mayor a 370C. Susceptibilidad indiferente a la temperatura. 86 ARS PHARMACEUTICA Tabla IV. Sensibilidad de cepas de �. circulans frente a p-lactámicos. Cepas Temperatura (QC) P AM CB CD CZ ATCC 4513 22 20,5a 29 19 22 17,5 37 40 44 47 42 42 ATCC 9966 22 39,5 37 55 41 34 37 31,5" 30,5 40 35 32,5 CCM 2048 22 33 42 45 45 44 37 26,5 33 35,5 39 32 PCM 1398 22 15 17 30 25,5 29 37 11 19 19,5 22 21,5 a Diámetro del halo de inhibición (mm) • Tabla V. Sensibilidad de tres cepas de �. co�lans frente a . p-lactámicos. Cepas Temperatura (QC) P AM CB CD CZ a ATCC 7050 22 41 41 50 50 37 37 29,2 31 37,5 34 33,7 ATCC 10545 22 42 41 48 52 45 37 JI 30,5 41 34 35 PCM 1843 22 19 22 27 15,5 25 37 17 21 25 14,5 17,5 a Diámetro del halo de inhibición (mm) • DISCUSION Los resultados de nuestro estudio resaltan la influencia de la temperatura de in cubación en la susceptibilidad del género Bacillus a los antibióticos. Puede genera lizarse que la sensibilidad frente a antibióticos de diferentes grupos farmacológicos y con distintos mecanismos de acción, es mayor a 22°C que a 37°C. Resulta aven turado buscar hipótesis que expliquen este hecho. Podría pensarse que, al tratarse ARS PHARMACEUTICA 87 de especies en su mayoría mesófIlas, el crecimiento más lento a temperaturas cla ramente inferiores al optimo se asocia con un incremento de susceptibilidad. No obstante, dos hechos debilitan esta hipótesis. En efecto, la cepa psicrófIla de B. psychrophilus está más alejada de su optimo a 37°C que a 22°C; sin embargo, la influencia de la temperatura en la susceptibilidad de esta cepa es esencialmente idéntica a la registrada en otras especies. Otro tanto ocurre con la cepa de B. stearothermophilus, siendo así que en ella el crecimiento muy lento a 22°C debe ría exaltar las diferencias de susceptibilidad. En la bibliografía no existen precedentes que pennitan establecer paralelos con nuestros resultados. Un estudio sobre 13 cepas de la especie mesófIla Y. enteroco litica, realizado en nuestro Laboratorio, demostró en general mayor sensibilidad a 22°C que a 37°C frente a antibióticos como gentamicina, kanarnicina yrifampici na; sin embargo, la presencia de f3-lactamasas cuya actividad es mucho mayor a 22°C invierte la situación en lo que se refiere a los f3 -lactámicos (5). BffiUOGRAFIA 1. COSTILOW, R.N. En Gerhardt, P. (Ed.), Manual of methods for general bacteriology. American Society for Microbiology, Washington (1981), p. 66-78. 2. STANIER, R., DOUDOROFF, M., y ADELBERG, E. A. Microbiología. Aguilar, Madrid (1977), p. 337-340. 3. MARR, A.G., e INGRAHAM, J.L.J. Bacteriol. 84: 1260-1267 (1962). 4. MARTINEZ, R. Infect. Immun. 41: 921-930 (1983). 5. KOUWATLI, K., BEJAR, V., RUIZ-BRAVO, A., y RAMOS-CORMENZANA, A. Micro bios Letters 11: 137-142 (1979). 6. BAUER, J.D., ACKERMANN, D.G., y TORO, G. Clinicallaboratory methods. C.V. 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