Investigación de la secreción de aminoácidos por especies del genero Bacillus

CATEDRA DE MICROBIOLOGIA INVESTIGACION DE LA SECRECION DE AMINOACIDOS POR ESPECIES DEL GENERO BACILLUS P. ROMERO, A. RAMOS-CORMENZANA INTRODUCCION La producción y secreClOn extracelular de compuestos orgá nicos nitrogenados por levaduras fue descubierta por Thenard, Pateur y Duclaux a principios del siglo XIX (1) . Muy posterior mente con el desarrollo de técnicas analíticas de tipo cromato gráfico, se indentificaron como péptidos o aminoácidos. Datos en este sentido obtuvo 'en Escherichia coli y Enterobacter aero genes, Dagley (2); en levaduras, Reindel y Hoppe (3) ; en hongos, Morton y Broadbent (4) ; en Streptomyces, P.erlman y O'Brien (5) . A estos compuestos orgánicos nitrogenados se les dio el nombre de ENC (extracellular nitrogen compounds) . A partir de este momento son numerosas las investigaciones realizadas. Así Guinea (6) , Clotet, Guinea y Pares Farras (7), Hernández (8), estudian los problemas genético relacionados con la producción de aminoácidos; Kinoshita y col. (9), encuentran bacterias Corynebacterium glutamicum capaces de producir en cantidades apreciables ácido L-glutámico, propiedad que se uti liza con fines industriales; Vagnerova y Vancura (10) , y Becker y Schmidt (11), 'estudian la producción deaminoácidos por micro organismos del suelo, encontrando 'estos últimos, que todas las bacterias aisladas son Gram positivas, siendo la mitad de ellas especies del género Bacillus. También Ruiz Berraquero (1) en cuentra que 'especies de Bacillus, aisladas del suelo, producen diferentes aminoácidos. Ars Pharmaceutica. Tomo XIX. Núm. 4. 1978. 362 ARS PHARMACEUTICA MATERIAL Y METODOS MATERIAL Se han empleado 38 estirpes del género Bacillus correspon dientes 15 a la colección Española de cultivo -tipo (CECT) -, 18 a Poland Collection of Microorganisms (PCM) y 5 a Czeches lovak Collection of Microorganisms (CCM) . Tabla 1. l.-Determinación de la producción de aminoácidos. Se sigue la técnica de Udaka (12) basada en el método de revelado en placa, modificado por Ruiz-Berraquero (1) . Como cepas para el revelado se utilizan Leuconostoc mesen teroides ATCC 8042, cepa auxotrófica para arginina, lisina, leu cina, aspártico y glutámico y Pediococcus cerevisiae ATCC 8081 cepa auxotrófica para alanina (13). Medio de conservación para las cepas auxotróficas MRS agar (14). Medio inóculo para revelado: Bacto lactobacillibroth AOAC deshidrated (13). Veinticuatro horas antes de cada determina ción se realiza una siembra de las cepas auxotróficas del medio MRS en el medio de inóculo. Medio de cultivo. -Se emplea un medio exento de aminoáci dos y proteínas con el medio .empobrecido de Ruiz Berraque ro (1) en el que se sustituye el fosfato bicálcico por fosfato mo nopotásico. Composición: Glucosa ... Cloruro amónico ... '" ... Fosfa to monopotásico . . . . .. Sulfato monopotásico ... ... ... Agar purificado ... .. . .. . .. . .. . Agua destilada ... ... ... ... .. . pH ... ... ... ... ... ... ... .. . 20 g 7 g 1 g 0,5 g 18 g 1.000 mI. 7,5 g se esteriliza a 1200 C, durante 15 minutos. Las placas se siembran en masa en cuatro puntos equidis tantes. Se incuban a la temperatura óptima para cada -estirpe durante 72 horas, realizándose a continuación el revelado (1). ARS PHARMACEUTICA 363 TABLA I ACUMULACION DE AMINOACIDOS POR DISTINTAS ESPECIES DEL GENERO Estirpe, colección, núm. catálogo Bacillus alvei CECT 2 ... ... ... ... .. . B. badius CECT 17 ... ... ... ... ... ... ... B. brevis CECT 5 ... o', o •• o •• o., •.• B. circulans CECT 10 ... o" o •• ••• O" B. ciI1culans CECT 375 ... ... B. cereus CECT 193 ... ... ... B. dextrolactius CECT 13 ... B. laterasporus CECT 15 .. , B. licheniformis CECT 20 ... B. megaterium CECT 44 ... ... .. . ... ... B. pumilus CECT 29 ... ... ... ... ... B. pumilus CECT 152 ... ... .. , ... ... B. polymyxa CECT 155 B. sphaericus CECT 33 ... ... B. alvei PCM 481 ... ... ... ... B. circulans PCM 1398 ... ... B. cereus PCM 1482 ... B. coagulans PCM 1843 ... ... B. firmus PCM 1844 ... ... ... B. globisporus PCM 1845 ... .. , .. , B. laterosporus PCM 1848 ... ... ... B. len tus PCM 450 ... ... ... ... ... ... B. mycoides PCM 1401 ... ... B. megaterium PCM 1855 ... ... ... B. macerans PCM 1399 ... ... ... .. , B. pumilus PCM 1852 ... ... ... ... ... B. pantothenticus PCM 454 ... ... ... B. polymyxa PCM 451 ... ... ... ... B. psychrophilus PCM 1850 ... ... ... B. sphaericus PCM 485 ... ... ... ... B. staerotermophilus PCM 453 ... ... B. sub bilis PCM 1903 ... ... ... ... B. badius CCM 2113 ... ... B. coagulans CCM 2013 B. firmus CCM 2213 ... ... B. macerans CCM 2012 ... B. subtilis CCM 2216 .. , ...... .. , ... BACILLUS Tipo de aminoácido Arg. Li. Leu. As. Glut. Al. 1 1 1 2 O 1 OM 1 1 O O OM OM OM OM O O +m 1 1 O O O OM 1 1 O O O OM O 1 1 OM O OM 1 O O O O O OM 1 O O O 1 1 1 1 O O 1 1 2 1 1 O OM O O O O O OM OM O O O O O O 3h O O O OM O 2h O O O 1 1 1 1 3 O 2 1 O 1 O O 1 OM 1 1 1 O 1 1 OM 1 1 O 1 1 1 O 1 O 1 O 1 2 2 O 1 1 OM 1 1 O 1 1 1 1 OM O O 1 1 1 2 O 3 2 1 2 1 O 1 1 OM 2 2 O OM 2 1 2 1 O OM 1 2 1 OM O OM 1h 1 1 OM O OM 2 1h 2 1 O 2 1 1 1 1 O 2 1 2 1 OM O 2 2h 1h 2 1 O 2 1 OM OM 1 O O 1 O 1 1 O O 1 O 2 2 O O O O O 1 O O OM 1 OM 1 O 1 364 ARS PHARMACEUTICA TABLA 11 RELACION DE ESTIRPES MAS PRODUCTORAS DE LOS AMINOACIDOS QUE SE INDICAN Estirpe B. polymyxa (ATCC 842) .. . B. sphaericus (ATCC 14577) B. alvei (PCM 481) ... ... ... ... B. globisporus (PCM 1845) ... ... ... ... ... B. mycoides (PCM 1401) ... B. megaterium (PCM 1855) B. pumilus (PCM 1852) ... ... B. pantothenticus (PCM 454) B. psycrofilus (PCM 1850) ... B. sphaericus (PCM 485) ... B. subtilis (PCM 1903) ... ... B. firmus (CCM 2213) ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... . .. . .. . .. TABLA 111 Arg. Li. Leu. As. 3h 2h 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 RESUMEN DE ESTIRPES DE BACILLUS PRODUCTORAS DE AMINOACIDOS N.o de estirpes 5 2 7 7 17 O 38 N.o aminoácidos producidos 1 2 3 4 5 6 TABLA IV NUMERO DE ESTIRPES QUE HAN PRODUCIDO . ESPECIFICAMENTE AMINOACIDOS Arginina ... ... ...... ...... ... ... .. . Lisina ... ...... ... ......... ... ... .. . Leucina .. .... ...... ...... ... .' .. .. . Ac. aspárt<ico ... ... ... ... ... ... . .. Ac. glutámico ...... ...... ... ... .. . Alanina ... ... ... ... ...... ... ... .. . 31 estirpes (81 %) 30 » (78%) 26 » (68 %) 26 » (68 %) O » (O %) 30 » (78 %) Al. 2 3 2 2 2 ARS PHARMACEUTICA 365 Como medios de ensayo para revelado de aminoácidos se uti lizan Bacto Assay Medium Deshidrated de Difco, para los amino ácidos arginina, lisina, leucina, ácido aspártico, ácido glutámico y alanina, cuya sensibilidad es de 1 a 5 microgramos de amino ácido (13) . Lectura.-Los resultados positivos dan lugar a zonas de creci miento de la cepa auxotrófica --observables macroscópicamente o microscópicamente mediante lupa de 40 aumentosde dife rente extensión y densidad. Es más precisa y exacta la lectura microscópica ya que aprecia la densidad y amplitud de la zona de crecimiento. Los resultados (1) se expresan atendiendo a los siguientes criterios: (O): negativo; (OM) : positivo microscópico; (1): 0,5 a 2 mm; (2) : de 2 a mm; (3): más de 4 mm; (h) : producción de halo de inhibición de crecimiento y secr,eción de aminoácido. RESULTADOS Y DISCUSION Los resultados obtenidos se indican en las tablas adjuntas. De las 38 estirpes investigadas, 31 han producido arginina, 30 li sina, 26 leucina, 26 ácido aspártico, 30 alanina y ninguna ha producido ácido glutámico (tabla IV) . El número de estirpes que ha segregado cinco aminoácidos de los seis investigados ha sido diecisiete; siete estirpes han pro ducido cuatro aminoácidos; siete han producido tres; dos han producido dos y cinco han producido uno de los seis aminoáci dos (tabla III). Los aminoácidos segregados en mayor cantidad, dentro de una determinada estirpe productora, han sido alanina, leucina y lisina, y el mayor número de estirpes que ha sintetizado un determinado aminoácido ha sido para arginina -31 estirpes-o Si se realiza un estudio comparativo de la producción de un determinado aminoácido por distintas estirpes de una misma especie de Bacill'Us, ya pertenezcan a idéntica o distinta colección y a pesar de que por el número de experiencias realizadas, para una determinada especie, los resultados no poseen valor estadís tico, se encuentra (tabla I) que generalmente no hay concor dancia entre los resultados para las distintas estirpes de una misma especie y cuando se presenta no posee valor taxonómico 366 ARS PHARMACEUTICA ya que distintas especies se comportan de modo análogo. En al gunos casos se observan diferencias entre especie (tabla 1). Así B. subtilis Y B. licheniformis se diferencian en la producción de ácido aspártico, que es positiva en B. subtilis y negativa en B. li cheniformis. Este dato es interesante ya que ambas especies sólo se diferencian según el Bergey (15) -por su capacidadde cre cimiento en agar anaerobio, que es negativo para B. subtilis y positivo para B. licheniformis. Si consideramos la no segregación de un determinado amino ácido -glutámicose encuentra una concordancia absoluta en tre todas las estirpes ensayadas, por lo que en principio dicho carácter puede utilizarse con fines taxonómicos e incluirse como carácter del género Bacillus. Respecto a las estirpes más productoras, destacan B. alvei PCM 481 para ácido aspártico y B. myxoides PCM 1401 para alanina. Todas las estirpes ensayadas han producido por lo menos un aminoácido y la mayoría más de uno -33 estirpes de las 38 es tudiadashecho que puede indicar la importancia de estas bac terias en el suelo como creadoras de circunstancias favorables para el desarrollo de otros seres vivos. RESUMEN Se investiga la secreción de los aminoácidos argmma, lisina, leucina, ácido aspártico, ácido glutámico y alanina por especies del género Baci Bus empleando una técnica de revelado en medio sólido con cepas auxo tróficas. De las 38 estirpes ensayadas, 31 producen arginina, 30 lisina, 26 leucina, 26 aspártico, 30 alanina y IlIinguna ácido glutámico. Es muy significativo este último resultado por lo que se sugiere puede ser un carácter de in terés en la taxonomia del género Bacillus . . Se señala que la producción de ácido aspártico por B. subtilis y la no producción por B. licheniformis puede emplearse como prueba diferenoial entre ambas especies. También se indican las estirpes que se han mostrado con mayor capa cidad productoras de los aminoácidos investigados. SUMMARY The secretior.. of the argiIlline, lisine, leucine, aspartic acid, glutamic acid and alanine aminoalcids, for species of the Bacillus was studied using a detected technic in salid medium with auxotrofic strains. ARS PHARMACEUTICA 367 From the 38 essayed Bacillus strains, 31 produce argmme, 30 lisine, 26 leucine, 26 aspartic, 30 alanine and no glutamic acid was produced. It is very important this result because it can mean an interest character in the taxonomy of the genus Bacillus. It is pointed out that the aspartic acid production by B. subtilis and the no production by B. licheniformis can also be used as differential purpose between both species. The strains that have shown the best production ability are also in· dicated. RESUME On recherche la sécrétion des aminoacides, argmme, lisine, leucine, acide aspartique, acide glutamique et alanine par especes du genre Bacillus en employant une technique de révelé au milieu soLide avec des soU'ches auxotrofiques. Des 38 souches essayées, 31 produissent d'arginine, 30 de lisine, 26 de leucine, 26 d'aspartique, 30 d'alanine; mais aucune ne produits d'acide glutamique. C'est tres significatif ce dernier résultat; c'est pour c;a qu'on suggére qu'il peut etre intéressant a la taxonomie du genre Bacillus. On remarque que la production d'acide aspartique par B. subtilis et la non-production par B. licheniformis peut s'employer comme preuve différentielle entre toutes les deux especes. On ,indique aussi les souches qui ont montré la majeure capacité pro ductrice des aminoacides recherchés. BIBLIOGRAFIA O) RUIZ BERRQUERO, F. (974): «Tesis Doctoral». Arch. F. Farmacia. Gra nada. (2) DAGLEY, S.; DAvIs, E. A., and MORRISON, G. A. 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