Desarrollo y estudio fotofísico de nuevas sondas fluorescentes y su empleo en la detección de miRNAs como biomarcadores

Facultad de Farmacia Departamento de Fisicoquímica Programa de Doctorado e n Farmaci a TESIS DOCTORAL CON MENCIÓN INTE RNACIONAL Desarrollo y estudi o fotofísico de nuevas so ndas fluoresce ntes y su em pleo en la detección de miRNA s como bioma rcadores María d el Carmen González García Directores de Tesis: Emilio García Fernández Ángel Orte Gutiérrez Granada, 2022 Editor: Univ ersidad de Granada. Tesis Doc torales Autor: M aría del Carmen Gonz ález Garcí a ISBN: 978- 84 - 1117 - 50 7-4 URI https:// hdl.handle.ne t/1048 1/7713 7 Agradeci mientos Esta memoria es a la vez el final de un a gran aventura y el inicio de muchas otras. Un a aventura en la que he reído y he llorad o, y en la que m ás allá de los contenidos acad émicos he aprendido innumera bles cosas gracias a tod as aquellas per sonas que han compartid o conm igo al menos una p arte de este camino . En primer lug ar, me gustaría agradecer al Ministe rio de Ciencia la beca FPI de la que he disfrutado durante el desar rollo d e esta Tesis Doctoral, así com o al grupo d e investigación “Fotoquímica y Fotobiolog ía” p or la fina nciación recibida d urante m i pr imer a ño de doctorado, ya que sin estos fondos la realiza ción de es ta Tesis Doctoral hubiera sido bastante más compli- cad a . De una forma más e special me gustaría darl e las gracias a mi familia. A m is p adres, José María y Carmen, por vuestro apoyo constant e e incondicional . Me faltan pág inas en este libro para poder expresar tod o lo que habéis h echo y seguís haciendo por mí . A mis abue los , José María, Francisco y C arm en , sé que no podréis leer estas palabras, pero estáis presentes en cada una d e estas páginas. Gr acias por haber sido u n ejemp lo y una inspiración cad a día. A mis tíos, R amón y Caco, a mi tía Conchita y a mi madrina, C armencita por todo vuestro ap oyo y tod o lo que me ha béis enseñad o. Gracias a la fam ilia del q uidditch , a H ipogrifos Murc ia, a mis co mpañeros de la J unta de la AQE y, so bre todo , a Malaka Viking s. Gracias por tant as aventuras y por enseñarm e a no rendirme nu nca y darlo siem pre todo h asta el final. Sois, sin duda alguna, unos a uténti cos cam peones. Gracias al Colegio de Fomento Nelva (Murcia) , especialmente a dos grandes profesoras: Antonia Corvalán y Ana Santa Cruz. Gracias p or v uestra ded icación y por v uestra voc ación . Gracias por e nse ñarme a que (en la ciencia) “No crea nada que no pueda demostrar” y que “lo difícil es lo que realm ente mer ece la pena ” . Gracias a todos mis am igos, especialment e a Chipi, Pila r Mañas, Águeda, Isa, Inma, Ángela, Jenn y, Xenita y Sole; a mis compañeros y amigos de la promoción de Farmacia con los que tantas horas he comparti do: Iñaki, Antonio, Dani, Carmen, María, Patr i, Ma be, Ju lia, Clara, Luz y so bre todo a Lor ena que es la auté ntica culpable de que me metiera en t odo esto de la fluoresce ncia . El título más valioso que se puede conseguir en e sta vida no lo concede ninguna Uni- versidad, es el d e Buena Perso na. Un título que sólo co ncede n los v alores y que sin dud a po seen los miemb ros de l grupo de inv estigación “ Fotoquímica y F otobiología” del que he te nido la inmensa sue rte de forma parte. Gracias a tod os: Eva , Luis, José Manuel, Delia, M.ª José, Óscar , Teresa, M.ª Eugenia, Indaleci o, Esther, Maribel, José María y, en especial, gracias a Ángel Pérez por brindarme una mano durante mi estancia en Göttingen y hacer que me sintiera c ómo en ca sa; y a Nono, por escucharme siempre, p or ense ña rme que la ciencia puede ser un mod o de vida y, sobre todo , por ser u n amigo co n quien p uedo contar. Gracias a mis com pañeros Consuelo, Javier, Álvaro, La ura, Fe rnando, Irene , Anabel y, sobre tod o a María, a Carmen y a Pili p or todo lo que me habéis ayudad o, por formar parte de mi gabinete psicológico y todas las h oras que hemos comp artido. Y, por últim o (pero no me nos im portante), g racias a las dos personas s in las c uales nada de esto hubiera sid o posibl e, mis d irectores Á ngel y Emilio. Gracias por d arme una oportu ni- dad. Gracias por habe r v isto al go en aquella chica q ue hizo u n TFG ex perimental en el depar- tamento y que no sabía que hacer despu és. Grac ias por todo el apoyo que me habéis dado du- rante estos años, p or escuchar me cuando sólo necesita ba a alguien con quien h ablar , p or todos los consejos que me habéis dado y por todos los que e stoy segura que me seguiréis dando en los años venideros. Gracias por todo esto y p or todo lo que segu ro me dejo en el tintero. Gracias, de verdad, por arriesgaro s conm igo. Carmen G. A la memoria de mi abuela, Carmen y a mi madre “Lo que sabemos es una gota de a gua, lo que ignoramos es el océano” (Isaac Newto n) CAPÍTULO V: In strum entación y metodolog ía 1. - Dispersión de luz d inámica ( Dynamic Ligh t Scattering , DLS ) 3 05 2. - Microscopía electrón ica .............................................................. 3 06 2.1. -Microscopía electr ónica de barr ido (SEM) ……………… .30 6 2.2. - Microscopía electró nica de transmisión (TEM) ............... 3 07 3. Microscopía de fuer za atómica ( Atomic Force Micro scop y , AFM ) ........................................................................................................................ 3 08 CAPÍTULO VI : Síntes is y cara cterización de nanop artículas plasmónica s . 1. -Antecede ntes ................................................................................ 3 15 1.1. - Principales metodologías de sín tesis de nanopa rtículas plasmónicas .............................................................................................. 3 15 1.1.1 .- Métodos d e arriba a aba jo ( Top -down ) ……………… 316 1.1.2 .- Métodos de abajo a arriba (B ottom- Up ) ..................... 3 17 1.1.2 .1.- Síntesis biológica ....................................................... 3 18 1.1.2 .2.- Síntesis intracelula r o in viv o ................................... 3 18 1.1.2 .3.- Síntesis en disolució n (wet synthesis) ....................... 3 19 1.1.2 .3.1.- Crecimiento media do por semilla ....................... 32 0 1.1.2 .3.2.- Síntesis por poliole s ................................ ............ 32 0 1.1.2 .3.3.- Síntesis fotoinduci da. ......................................... 32 1 1.1.2 .3.4.- Espejo d e plata. ................................................... 32 2 1.1.3 .- Métodos mixt os o híbridos ......................................... 324 2. - Hipóte sis y objetivos ................................................................ . 324 3. - Resultados y d iscusión .............................................................. 325 3.1. - Síntesis de nanopartíc ulas plasm ónicas de plata ............ 326 3.1.1 .- Protocolo empleado para la síntesis de nanobarras de plata por poli oles ................................................................................ 327 3.1.2 .- Protocolo emplead o para la síntesis de semillas esféricas d e plata. ................................................................................ 336 3.1.3 .- Síntesis de na noba rras de pla ta por crecimiento mediado por se milla. .......................................................................... 337 3.2. - Purificación de na nobarra s de plata . ................................ . 342 3.3. - Caracteriza ción morfológica y dete rminación de concentración de na nopartí culas de plata ............................................ 350 3.4. - Síntesis de nanopartíc ulas plasm ónicas de oro ................ 358 3.4.1 .- Síntesis de n anobarra s de oro. .............................. ........358 3.4.2 .- Síntesis de nanobipir ámides de oro. .......................... 362 3.5. - Estabilidad y recubrimiento de nanopartículas plasmónicas. ................................................................ ............................. 368 3.5.1 .- Recubrimiento de na nopartícu las de plata con oro. 370 3.5.2 .- Recubrimiento de na nopartícu las de oro co n plata . 374 3.5.3 .- Recubrimiento de nanopartículas de oro y p lata con síli ce. ...................................................................................................... 385 4. - Conclusi ones ............................................................................... 394 5. - Conclusi ons ................................................................................. 395 6. - Mate riales y métodos ................................................................ . 397 6.1. - Reactivos. .............................................................................. 397 6.2. - Instrumentación ................................................................... 398 CAPÍTULO VII : Modi ficacion de la señ al lumini scente po r nanopartícul as plasmón icas. 1. -Antecede ntes ................................................................................ 403 1.1. - Modificación de la señ al luminisce nte .............................. 403 2. - Hipóte sis y objetivos ................................................................ . 409 3. - Resultados y d iscusión .............................................................. 409 3.1. - Preparación de super ficies .................................................. 409 3.1.1 .- Fotodeposición selec tiva. ............................................. 410 3.2. - Interacciones nanopart ícula – luminóforo … ……… …… ..437 3.2.1 .- Acridonas con NP s ....................................................... 438 3.2.1 .1.- Estud io en disolución. ............................................... 440 3.2.2 .- SeTa u-425 con NPs ....................................................... 44 9 3.2.2 .1.- Estud io en disolución ................................ ................ 451 3.2.3 .- Complejos de europio con NPs ................................ .. 454 3.2.3 .1.- Estud io en disolución ................................ ................ 456 3.2.3 .2.- Estud io en superficie ................................................. 479 3.2.3 .3.- Funcionalización con B iotina – Estreptavidina -DTBTA- Eu 3+ ................................................................................................ ..... 486 3.2.3 .4.- Estud io “in cellulo” .................................................. 5 04 4. - Conclusi ones ............................................................................... 509 5. - Conclusi ons ................................................................................. 510 6. - Mate riales y métodos ................................................................ 512 6.1. - Reactivos ............................................................................... 512 6.2. - Instrumentación ................................................................... 513 6.3. - Metodología .......................................................................... 515 6.3.1 .- Cultivos celula res ......................................................... 517 Bibliografía del bloque B …… …………… ………… ……… … …… ... 517 Glosario de acrónimos B l o q u e A : F l uo ró f o r o s co n t i em po d e v id a l ar g o s . Es tu di o fo t o f í si co y a p l i c a c io ne s . AIE Em is ió n i nd uc id a po r a gre gac i ón ( A ggr e ga ti on i ndu ced e mi ss io n ) BSA Al bú mi na de s ue ro bo v ino ( Bov in e ser um a lbu m in ) DDS Se c uen ci a d el g rad o de di sta nc i a ( D i st a nce D egr e e e qu en ce , ) DGL So nd a com p lem ent ari a a un mi RN A e spec í fic o co n una am in a reac ti v a en un a d et erm in ad a p os ic ió n en l ug ar de u n nu cl eó tid o. DILI Da ño he pá tic o in du ci do p or f árm ac os ( D r ug- I ndu ced Li ve r In jury ) DMABN 4,4 ’– d im et il ami no be nz on itr ilo DS Su m a d e di sta nc ias ESPT Tr ans fe ren c ia pr otó ni ca en e l es ta do ex ci tad o ( Ex cit e d-s t at e Pr o ton Tr a ns fer ) ESIPT Tr ans fe ren c ia pro tón ic a intr am o le cu la r en el e sta do exc i tado ( Exci te d- st at e In tr am ol ec ul ar Pr oto n Tra n sf er ) FLIM Mi cr os co pí a de Im ag en de Ti emp o de Vi da de Flu o resc en c ia ( Flu or es ce nce Li fe ti me Im a gin g Mic ro s co py) FRET Tr ans fe ren c ia de ene rgí a de re so nan ci a de Förs ter ( Fö r st er Reso na nt Ene r gy Tr a ns fer ) GCA An ál isi s gl oba l c o mp art im en tal ( Gl o ba l Com par t men ta l A na ly si s ,) HOMO Or bit al m ol ec u lar oc up ad o d e m ayo r en er gía ( H ig h Oc c upe d Mol ec ul ar Or bi- ta l ) ICT Tr ans fe ren c ia de c arg a i n tram o l ec ul ar ( I nt ra mo le cul ar C har ge T ra ns fe r ) IRF Fu nc ió n de re sp ue sta i nst ru me nta l ( In st r um en t R es po ns e Fuc ti on ) LE Es pe ci e ex ci tad a l oc al me nte ( Loc al ly Ex cit ed ) LMP Pe rm ea bil iza ci ón de la me mbr ana liso so m al ( Ly so s om e Mem bra n e Pe rmea b i- li za t ion) LSD De so rd en de A lm ac en am ie nto en lo s li sos om as ( L ys os om e St ora ge D iso r de r) LUMO Or bit al m ol ec u lar no o cu pad o de me no s e ner gía ( Lo w Uno cu ppe d Mo l ecu la r Or b ita l) MCA An al iza do r m u lti ca nal ( M ul ic ha nn el A na ly zer ) miRNA mi c ro – ARN OLEDs Di od os o rgá nic o s e m iso re s de lu z ( O rg an ic Li ght -E mi tt in g D io de s ) PET Tr ans fe ren c ia el ec tró ni ca fo to in d uc id a ( Ph ot oi nd uce d Ele ct ro n Tra ns fer ) PICT Tr ans fe ren c ia de ca rga intr am o le cu la r pl an a ( Pl an ar Int ra m ole cul a r Cha rg e Tr a ns fer ) PLIM Mi cr os co pí a d e ti em p o d e v id a d e f oto lu m ini sc en ci a ( Photoluminis c ence Lifetime Imaging Micro scopy ) PNA Ác i do nuc l eic o pe ptí di co ( Pe pt idic , n ucl ei c ac i d ) RICT Re hi bri dac ió n po r Tr a nsf er enc ia In tr am ol ec u lar de Car ga ( Re hyb ri diz a ti on In tr am ol ec ul ar Ch ar ge Tr an sfe r) SAEMS Es pe ct ros de em is sio n de las es p ec ie s aso ci ad as ( Sp eci e s As so cia t ed Em is s ion Spe ct ra ) SB Nu c leo bas e rea ct iv a m ar ca da . Sm a rt ba se SPC Co nt aje de f ot one s in div i du ale s ( Si ng le P hot on C ou nti ng ) TAC Co nv er tid or ti em p o – a mp li tu d (T i m e to Am pl it ud Co nver t er ) TADF Fl uo re sc enc i a ret ard ada de ac ti v ac ió n tér mi ca ( The r ma ll y Ac ti va te d De la yed Fl uo re s cen ce ) TCSPC Co nt aje de fo to nes indi v idu al es co rre la ci on ado s en el tiem po ( tim e – co rr el a- te d si ngl e pho t on co un ti ng ) TICT Tr ans fe ren c ia de c arg a i ntr am o le cu la r g ira da ( T wi st e d I ntr am ole cu la r Ch arg e Tr a ns fer ) TRES Es pe ct ros d e em is ió n e n tie mpo r es ue lto ( Ti me -r eso l ved E mi ssi on Spe ct r a ) TTTR Ti em po e su el to co n e ti qu eta do te m po ral ( T im e – t agg ed T im e-r eso lve d) WICT Tr ans fe ren c ia de ca rga in tra m ol ec ul ar osc il ant e ( W ag gin g In tr am ol ec ula r Ch ar ge T ra ns fe r) Bloque B : Desarrollo de nu evas nanoplatafor mas con aplicación en b ioimagen AFM Microscopía de fuerza atómica ( Atomic Force Microscopy ) AgNR Nanobarra de plata AgNS Nanoesfera de plata Ag@AuNBP Nanobipirámide de oro recubierta de plata Ag@AuNR Nanobarra de oro recubierta de plata AuNBP Nanobipirámide de oro AuNR Nanobarra de oro Au@AgNR Nanobarra de plata recubierta de oro CTAB Bromuro de hexadeciltrimetilamonio CTAC Cloruro de hexadeciltrimetilamonio DDA Aproximaciones de Dipolo Discreto ( Discrete Dipole Approximation) FLIM Microscopía de Imagen de Tiempo de Vida de Fluorescencia ( Flu ores- cence Lifetime Imaging Microscopy) LSP Plasmón de Superficie Localizado ( Loc alize d Su rface Plasm on ) LSPR Resonancia de los Plasmones de Sup erficie Localizados ( Lo calized Surface Plasmon Resonance ) MEF Amplificación de fluorescencia por metales ( Metal Enhanced Fluores- cence ) MPTMS 2-mercaptopropiltrimetoxisilano NP Nanopartícula PLIM Microscopía de tiempo de vida de fotoluminiscencia ( Photol uminiscenc e Lifetime Imaging Microscopy) SEM Microscopía electrónica de barrido ( Scanning Electronic Microscopy ) TEM Microscopia electrónica de transmisión ( Transmisión Electronic Micros- copy ) 2 Developing and ph otophysical s tudy of new flu orescent probes and the ir employ on miRNAs de tection as biomarkers Summary Fluorometric tech niques ar e currently be ing widely e mployed i n biosensor developing owing to their great accuracy and sensi tivity. However, accurate quantificatio n i n bi ological samples c an be quite challe nging due to some inter- ferences such a s heterogeneity of samples, localized accumulation of f luorophore or autofluore scence. Theref ore, there is an urgent nee d f or finding ne w fluores- cent molecules and method ologies that are capable of overcoming such d ifficul- ties . To meet this objective, this PhD The sis pr opose s the development of new methodologies and na nopla tforms based on time -resolved fluorescence micros- copy tec hniques and time- gated analysis that allow improving specificity by eliminating u nwanted contributions through the use of fluor ophores with lo ng luminescence lifetimes . The first pa rt of this PhD T hesis ( Block A ) is oriented to the in-dept h study of the photophysical pro perties of fluorop hores wit h long lifetimes and their ap- plications bot h as intracellular sensors and in other types of biological sample s. On the other hand, in Block B , the development of new nanoplatforms that allow to increase the sensitivity of these sensors by us i ng the excellent optical proper- ties of metallic na noparticle s will be delved into. Si nce t he use of a dequate instru- mentation and met hodologies is esse ntial to ach ieve these o bjectives, th e first chapter of ea ch block i s de dicated to the main method ologies, i nstrumen ts and techniques empl oyed. Block A , titled “ New fluorophores with long lifetimes. Ph otophysical study and applicatio ns” , is divided into an introductory chapter, the chapter ded- icated to in strumentati on (chapte r I) a nd three m ore chapters (chapters II - IV) containing the resul ts and discussion . Chapter I explains the main i nstrumenta- tion employed in the exper iments performed on this block, such as absorp tion spectrophotome te rs , steady-state and time -resolved spectrofluori meters, and FLIM-PLIM microscopy . Chapte r II introduces the m ain family of compou nds with lon g lifetime s that will be studied throughout the PhD Thes is. They be long to the family of acridone dyes, which exhibit ex cellent pho tophysical properties such a s lifetimes gre ater than 8 n s and hi gh quantum yields, among others . Summary 9 Figure S – 6. A) Im age and intens ity prof ile of the Airy’s disk of a 3 75 nm pulsed laser B) AFM images of an Ai ry’s Catle cre ated by s ilver nanop articles aggregation. C) Inte nsity im ages of a dye (DTBTA– Eu 3+ ), Airy’s castles and the dye + Airy’s castles and D) Bars graphs of the intensity of these images showing an increment of 20 times the intensity of the DTB TA – Eu 3+ . BLOQUE A: FLUORÓFOR OS CON T IEMPOS DE VIDA LAR GOS . ESTU DIO FOTOF ÍSICO Y APLICAC IONES 13 Objetivos y j ustificació n del blo que A Las técnicas fluorimétricas s on amplia mente e mpleadas en el desarr ollo de sen- sores bio médicos debido a su gra n sens ibilidad y preci sión. Sin e mbargo, para po der emplear estas técn icas en muestras b iológicas e s necesario solventa r algunas d e las dificultades que presentan esta s muestras, com o la autofluorescencia o la distribución heterogénea del fluoróforo. Por ello es necesario encontra r nuevas moléculas fluo r es- centes y metodologías que sean capa ces de superar estas dificultades. Con este obje- tivo, en este bloque se plantea el desarrollo nuevas aplicaciones basada s en el análisi s de imágenes con ventanas temporales mediante microscopía de fluorescencia en tiempo resuelto, para mejora r la especificidad elimina ndo contribuciones no desea - das, como la autofluorescencia celular, a tra vés del empleo de fluoróforos con tiempos de vida de luminiscencia la rgos. Este bloque está dividid o en un capítulo introductorio y otros cuatr o capítu los. En l a introducción se hará un pequeñ o re sumen sobre los pri ncipales fenó menos lu- miniscentes como la desactiva ción d e la flu orescencia ( quenching) , tra nsfere ncia de energía de res onancia de Fö rster (FRET), reaccione s e n el es tado exc itado, efect os de la polaridad del d isolvente y fenómenos luminiscentes con tiemp os de vida largos, en los cuales se ba sa el desarrollo de biosens ores fluore scentes. El capítu lo I del bloq ue está dedica do a la in strumentació n y a las metodologías empleadas en el desa rrollo de esta Tesis Doctoral . En el capít ulo II se introducirán las acridonas, unos fluoróf oros con excelen tes propieda des fotofísicas, entre las que se incluyen tie mpos de vida su- periores a 1 0 ns y se llevará a cabo un profundo estu dio fotofís ico en medio a cuoso de a lgunos deriva dos de acridona , confirmand o los r esultados obtenidos media nte cálculos teóric os como la Teoría de Grafos y cálculos computaci onales . El capítulo I II está dedicado al estudio de la polaridad intracelular a tra vés de acridonas. Ofr ece una revisión actual acerca de senso res so lva tocrómicos de polaridad intracelular e incluye los res ultados obtenid os d el estudio s olvatocr ómico de las acridonas selecciona d as, así como las metodología s desarrolladas para su empleo como sondas intracelula res de polaridad, concluyend o con su emp leo en diferente s líneas celulare s y su posible empleo con fines diagnósticos. Por último, en el ca pítulo IV se emplearán estrate gia s de dete cción basada s en té cnicas fluorimétrica s c on venta na temp oral a plicadas a la detección de miRNAs como bio marcadores y a sus posibles a plicaciones con fi nes diagnósticos. INTRODUCCI ÓN Introducción 17 1. -L uminiscenci a. El término luminiscencia, introducido p or Eilhard t W i ed emann en 1 888, pro- viene del latín lumen , que significa luz. La IUPAC define este fenó meno fisico quí mico cómo la “ emisión espontánea de radiación produc ida por especies que presentan electrone s en niveles electrónicos o vibracionales excitados y que no se encuentra n en equilibrio térmico con el entor no que los rodea ”. La lumi niscencia es, por tanto, un tér mino muy amplio q ue engloba a fenómenos com o fluorescencia , fosforescencia, q uimioluminiscencia o bio- luminiscencia entre otros. A sí, la fluorescencia es un f enómeno luminiscente e n el que se pr oduce una emisión espontánea d e radia ció n ele ctromagnética de u na enti- dad mo lecular excitada que mantiene la mult iplicidad de spin, mientras q ue en la fosforescencia esta multiplicidad de spin no se mantiene, producié ndose cambios ge- neralmente de singlete a triplete . E n los fenómen os de fluorescenc ia y fosforescencia la excita ción de los ele ctro nes del estado f undamenta l a l estad o excitado tiene lu gar tras la absorción de u n fot ón pr oveniente d e una f uent e d e excita ción , mientras que en la q uimioluminisce ncia la energía necesa ria para promover la transición electró- nica al estado exc itado es aportada por una reacción q uímica , si dicha reacci ón ti ene lugar en lo s seres vivos, generalmente cataliza da por un a enzima, se tr ata de biolumi- niscencia [1] ( Figura A – I ) . Figura A – 1 . A) Diso luciones de quinina ( azul), rodamina 6G (r ojo) y fluoresceína (verde) bajo luz UV e mi- tiendo su fluores cencia car acterística. B) Fosf orescencia p resente en la señ alización de emergen cia. C) Qui- mioluminisce ncia p roducid a por la o xidación con H2O2 del luminol cataliz ada po r el F e3+. D) Bi oluminis- cencia de l alga Noctiluc a scintillans . Bloque A. Fluo róforos con t iemp os de vida largos. Estudio fot ofísico y aplicac iones. 18 Los fenó menos lumin iscentes son ampl iamente utiliz ados d ebido a la gran es- pecificidad y sensibilidad q ue poseen las técn icas flu orimétrica s en aplicacio nes ta n diversas como química forense, técnica s antifra ude o se nsores biomédic os. Destaca el empleo de sus tancias lumi niscentes como sensores, ya que al ser algunas de ellas sen- sibles al medio q ue les rode a o a la interacción con determinada s sustancias, n os per - miten detectar y cuantificar de forma rápida y precisa una gran cantidad de infor ma- ción del med io en el q ue se encuentran a pa rtir d e diferentes parámetros com o los espectros d e a bsorción y e misión, el tie mpo d e vida, el rendimiento cuántico o la po- larización de la lu z. 2. -Pri ncipales p rocesos foto físicos En el fenómeno luminiscen te se encuentra n inv olucra dos difere ntes pr ocesos tanto radiativ os c omo n o r adiativos q ue a fectan a las transici ones electr ónicas d e los luminóforos, modificand o, por tanto, algunos parámet r os de la emisión luminisce nte. Entre los principale s proce sos fotofís icos se encuen tran el qu enching o desacti vación de fluorescencia, la tra nsferencia de energía de re sonancia de Förster ( Förster Resonant Energy Transf er , FRET), las re acciones en esta do e xc itado, los ef ectos de la polarid ad y los proceso s luminiscen tes con tiemp os de vida la rgos. 2.1. - Fenómen os de quenching o de sactivación d e fluorescencia El térmi no quenching hace refer encia a cua lquier fenó meno en el que tenga l u- gar una disminuc ión de la intensida d de fluorescenc ia d el fluoróforo, la cual tiene lugar en presencia de otra sustanc ia, denominada quencher . Tra dicionalmente po de- mos dife renciar dos tipo s de quenching : el quenching dinámico o colisi onal y el quen- ching estático, en función d e l mec anismo p or el cual tenga lugar la intera cción ent re el f luoróforo y el quenche r . Ambos mecanismos n o s on excluyentes, pudiendo tener lugar una co mbinación de ambos de forma si multáne a. 2.1.1 .- Quenching di námico o coli siona l El que nching dinám ico t iene lugar debido a choques o colisio nes entre molécu- las d e quencher y el flu oróforo dura nte el t iempo que és te permanece en e l esta do e x- citado. La colisión genera una desactivación no radiativa del fluoróforo que vuelve al estado fundamental, quedando el quencher en el esta do ex citado y desactivá ndose posteriorme nte de forma n o radiativa ( Figura A – 2 ) [1 , 2] . El f luoróforo e n ausenc ia de quencher pr esenta u na desa ctivación ra diativa de- terminada por una constant e cinética k r . Es ta constante, junto con la constante c inéti ca de d esactivación no ra diativa del f luoróforo, k nr , determinan el tiempo de vida del Introducción 25 Figura A – 4. Supe rior: Esquema d e FRET y espect ros de absorción y emisión del flu oróforo d ador (az u l) y el fluorófo ro aceptor (naranja). El solapamiento entre la emisión del dador y la absorción del aceptor apa- rece marcado en amarillo. Inferio r: diagrama de Jab lonski simplifica do del fenómeno FRET con las transi- ciones reson antes ent re el dado r y el aceptor [1] . Bloque A. Fluo róforos con t iemp os de vida largos. Estudio fot ofísico y aplicac iones. 26 La depende ncia de la ef icacia de FRET con la d istancia f ue comprobada d e forma experimental por S tryer y Ha ugland en 19 67 empleando una estruc tura rígida de oligopéptidos de L – prolina de un númer o total de unidades crec ientes (1- 12), cu- yas dimensio nes era n conocid as, etiq uetada en un extremo por naftalen o, que actúa como dador y en el otro ex tremo por el a ceptor, dansilo [5] . Debido a la dependencia con la distancia, en la esca la nanométrica, al fenómeno FRET se le con oce como “re gla molecular” [2 , 5] , siendo mu y emplea ndo e n s istemas biológic os para estud iar estr uc- turas e interacc iones de pro teínas, enzimas, membrana s, ácid os nucleicos, etc [6 , 7] . Figura A – 5 . Dependenci a del factor de orienta ción κ 2 con el dipolo de transición de em isión del dador D (flecha azu l) y el dipo lo de trans ición de abs orción de l acepto r A (flecha na ranja) [2] . 2. 3- Rea cciones en el esta do excitad o . Las características de lo s flu orófor os son difere ntes en los estados fundamenta l y excitado debido a que los orbitales HOMO (del inglés, Orbital molecular ocupa do de ma yor energía) y LUM O ( d el inglés, Orbital molecula r libre de menor energ ía,) son también diferentes entre sí, así como las transiciones electrónicas entre estos esta- do s, que dan lug ar a cambios en la densida d electrónic a, y especialmente el momento dipolar molecu lar [1] . Los c ambios que producen e n la molécula pueden dar lu gar a que algunos procesos sean más favorables cinéticamente en el estado excitado que en el estado fundamental, oca sionando cam bios en la em isión luminisce nte de la molé- cula. La formación de nueva s e species en el estado ex citado puede dar lugar a cam- bios en los tiempos de vida de los fluoróforos, presentando dec aimientos de Introducción 27 fluorescencia con má s de u na componente, y, en ocasi ones, pr eexponenc iales negati- vos, lo cual las p one de ma nifiesto de forma ine quív oca. Algunas de las reacc iones en el esta do excitad o más frecuentes son la transfe- rencia protónica, la formaci ón de excímeros y l os cam bios c onformacionales. Aunque también pode mos enco ntrar otra s reacc iones como la formación de complej os no fluo- rescentes en el es tado ex citad o que da luga r al fenómeno de quenching está tico. 2.3. 1.- Transferencia protónica en el estado e xcitado ( Exci ted-state Prot on Trans fer, ESPT) La transferencia protónica en el estado excitado (ES PT) consiste en la protona- ción o desprotonaci ón del fluorófor o en el estado excitado esta bleciendo un equilibrio ácido-base difere nte del que el fluoróforo posee en el estado fundamental. Una de las observaciones más te mpranas de este fenóme no se le debemos a Weber, que en 1 931 observó que l os va lores de pK a de a lgunas moléculas era n difere ntes si se calculab an a partir de datos de absorción o de e misión [8-10] . Sin embargo, Förster fue el primer o en describir la tra nsferencia protónica en e l estado excit ado en 19 49 [11] , ex poniendo a través de principios termodinámicos el deno minado “ciclo de Förster” en 1950 un método pa ra estim ar el pK a * (pK a del fluoróforo en el estad o excitado) [2 , 9 , 12] . El estudio de la ESPT tuvo un gran avance en la década de lo s 70s, dónde diversos autores estu- diaron este fenóme no c on profundidad [13-17] , lo que d io lugar al empleo d e so ndas basadas en ESPT con a plicaciones biológicas. L os fluoróforos co n este meca nismo pre- sentan una buena fotoestabilidad , elevados rendimientos cuántic os y desplaz amie n- tos de Stokes largos, lo que permite evitar efectos de a utoabsorción y filtr o interno [ 10 , 18 , 19] . Por este motivo la ES PT ha sido a mpliamen te ut ilizada en biosen sores de dife- rentes analitos como ione s fosfato [20-23] , agua [24] , albúmina [14] , Ca 2+ [25] o de algunos parámetros fisic oquímicos como el pH [26] o la temperatura [ 24] entre otros. Las rea cciones de tra nsfere ncia protón ica se puede n di vidir principa lmente e n do s gru pos: inter molecular e intram olecular, en función de si la transfere ncia prot ó- nica tiene lugar dentr o de la propia molécula (intra molecular) o entre d os molécu las diferentes (inter molecular) 2.3.1 .1.- Transferencia protónica inter molecular En las tran sferencias protón icas intermoleculare s en el estad o ex citado tiene lu- gar el intercamb io de un protón entre el fluor óforo y otra molécula (bimolecular) o entre el fluorófor o y el d isolvente (pseud ounimolecula r) [9 , 27] . Dado que las especies Bloque A. Fluo róforos con t iemp os de vida largos. Estudio fot ofísico y aplicac iones. 28 ácida y básica del fluoróforo pr esenta n diferentes long itudes de onda de emisión se producen camb ios en la em isión lumi niscente [ 27] . Generalmente las ESPT tienen lugar debido a las diferencias entre las constan- tes de d isociaci ón ácida d e los e stad os fundame ntal y excita do, la s cua les puede n a l- canzar va rios órdenes de magnitud, ya que si pK a < pK a * en el estado excitado la mo- lécula se protonará a valores más altos de pH (fotobase ), mientras que si pK a > pK a * la protonación tendrá l ugar a pH más ba jo e n el es tado exc itado ( fotoácido) ( Figura A – 6 ). Por lo general l os grupos func ionales R – OH, R – NH 2 y R – NH 3 + se co nviert en en ácidos más fuertes en el esta do excitado, mientras q ue los gr upo s R 2 C = OH + , R – CO 2 H, R – CO 2 H 2 , R – SO 3 H 2 + , R – PO 3 H 3 + y R – NO 2 H d an lugar a bases más fu ertes [10] . Si los valores de p K a y pK a * son muy dife rentes la transferencia pro tónica pue de tener lugar d e forma esp ontánea, mie ntras que s i, por el co ntrario, los valores so n similares es necesaria la presencia de un da dor/aceptor de protones a una concentra- ción ad ecuada. Por e jemplo, el Orego n Green 488 es un derivado de la fluoresceína en el que tiene lugar una ESP T entre las especies mon oaniónica y diani ónica, pero re- quiere la presencia de iones fosfato [28 , 29] . Figura A – 6 . Esquem a de ESPT en un fluoróf oro fotoác ido (izqu ierda) y en una fotobase (derecha) donde pK a es la constante de dis ociación ácida e n el es tado fund amental y pK a * la del es tado excitado. Abs repre- senta l a absorción y F A - y F AH son la s desactiv aciones ra diat ivas de las especies A - y AH respectivame nte. (La altura de la líneas del estado fundamenta l no indica necesariam ente q ue ambas especies presenten la misma ene rgía, pudien do presentarse dife rencias par a cada fluo róforo c oncreto). Las reacciones ESPT están sumamen te influenciada s po r lo s efect os del diso l- vente en el que se encuentren. Estas re acciones se ven fa cilitadas en disolventes p ró- ticos, mientras que los diso lventes apr óticos pueden inhibir la ESPT. Los ca mbios de viscosidad también p ueden re percutir en este f enóme no fotoqu ímico ya que alter an Introducción 29 los proceso s co ntrolados p or d ifusión. Ad emás, a ltas concentra ciones d e electr olitos reducen la cantidad de agua libre al reducir la fra cción de a gua involucrada en los procesos de hidra tación [ 27 , 28] , red uciendo, por tanto, la ESPT. 2.3.1 .2.- Transfere ncia protónica i ntram olecular (Excit ed -state Intramolecular Pr oton Transfer, E SIPT) La E SIPT, en la que generalmente están implicad os gr upos ca rboxílicos o ca r- bonilos, involucra una tautomerización ceto – en ólica en el estado excitado debido a la transferencia pr otónica entr e un gr upo hidroxilo y u n grupo ami no [18] o carbonil o [30] perteneciente s a la propia mo lécu la (aunque también puede pr oducirse en otras es- tructuras, có mo p or eje mplo entre dos gr upos amino de tautómeros zw iteriónic os [31] ). Está facilitada por la f ormación de un pue nte de hidró geno entre el grup o da dor y el grupo a ceptor. Tra s la ex citación de la for ma en ol tie nen lugar la taut omeriz ación en las formas ceto en el estado excitado. Una ve z formada la fo rma ceto, ésta se desacti va de f orma ra diativa, regresando al esta do funda mental , dónde tiene lugar de f orma instantánea la re cuperación de la forma enol mediante una transfere ncia protónica inversa, cerrándose el cic lo ( Figura A – 7 ) [18 , 19 , 32- 34] . Debido a la rapidez con la que tiene lugar la fototautomerización ( subpicosegundos) la absorción tiene lugar predomi nan- temente por la forma enólica y la emisión por la forma ceto (la emisión de la f orma enol se suele reducir a un hombro débil del espectro d e emisión) [ 32] , generando de esta forma grandes desp laz amientos de Stokes. Las ES IPT son, en gener al, más rá pi- das que las transferencias protó nicas intermoleculare s, no están tan influenciad as como éstas por el disolvente, presentan buena fotoesta bilidad [35 , 36] y, al tr atarse de proceso intra moleculares son, por definición, indepen dientes de la concentración [37- 39] . En la Figura A – 8 se m uestran algunos ejemplo s de fluoróforos en los que tiene lugar una ESIPT. Se han descr ito fl uoróforo s basa dos en ESIPT para diversa s a plicaciones como generación de luz blanca [ 32 , 40 , 41] , colorantes laser (em isión espo ntánea amplifica da, Amplified Spontaneous Emiss ion ) [35 , 42] , a plicaciones optoelectrónica s [43] , sensores de pa- rámetros fisicoquímic os c o mo p olaridad [44] y visco sida d [45 , 46] , senso res para membr a- nas biológicas [ 47-49] o biose nsores de difere ntes analit os como tioles [30] , aceta to [ 50 , 51] , fosfato [50] , F – [50 , 52] o iones metálicos como Ca 2+ [ 53] , Na + [53] , Zn 2+ [54 , 55] , Cd 2+ [54] o Hg 2+ [54 ] entre otras [38 , 56] . Bloque A. Fluo róforos con t iemp os de vida largos. Estudio fot ofísico y aplicac iones. 30 Figura A – 7. Esquema de reacc ión de transferenc ia protón ica intram olecular (ESIPT) me diante una tauto- merización ceto – enó lica, dónde la forma enol es tá r epresentada por E y la f orma ce to por C. Abs represent a la absorción de rad iación ele ctromagnét ica y FE y FC la e misión de las formas en ol y ceto, respectivame nte. Las flech as con líneas discontinu as indic an que el p roceso es m inoritari o. 2.3.2 .- Formación de excímeros La primera referencia acerca d el fenóme no de f ormación de excí mero s data de 1954 . El fenómeno fue descrito por T. F örster y K. Kasper [57] , que a signaron una banda de emisión del pireno desp laza da hacia el rojo ( λ=1667 nm), que aparecía en d isolu- ciones de concentra ciones ele vadas, a un dímero for mado por la asociació n de una molécula de pireno en el estado excita do con u na molécula de pireno en el estado fundamental. M ás ta rde, en 19 60, B. Stevens y E. Hut ton intr odujeron el término de excímero para diferenciar un dímero formado en e l estad o excitado (excímero) d e un dímero formad o en el estad o fundamenta l [58] . J. B. Birks matizó esta def inición, re de- finiendo u n ex címero como “ un dím ero que e stá asociado en e l e stado excitado y qu e se disocia (en au sencia d e restric ciones externa s) en el estad o fundamental ” [59] . De esta forma, el fenóme no de f ormación de excímeros hace ref erencia al fenómeno fot ofísico e n el cual un fluoróforo en el esta do excitado reacciona con otra molécula idéntica que se encuentre en el estado fundamenta l, dando lugar a la fo rmación de un dímero estable en el estado excitado ( Figura A – 9 ) [1] . S in emba rgo, difer enciar entre excí meros y dí- meros no es una tare a sencilla. Por este motiv o Birks dif erenció dos circunstancias en función de si es posible o n o asegura r la formación del dímero en el estado excitad o. De este modo, si, mediante espectroscopía en tiemp o resuelto, se puede d emostra r que la formación del excí mero tie ne lugar en el estad o e xcitado y que en el es t ado fundamental el fluoróforo se encuentra fundamenta lmente en for ma monomér ica el excímero se denomina excímero dinámico. M ientras que si, por el con trario, n o se puede probar de f orma inequívoca que la formación del dím ero tenga lu gar en el Introducción 31 estado excitado, sino que pued e formarse en el estado fundamental previ o a la exci- tación, se denom ina excímero e stático [60] . Figura A- 9 Diagrama simp lificad o de la formac ión de e xcímeros dónde M y M* son las form as monom éri- cas de l fluo róforo e n e l est ado fu ndamental y exc itado respectiv amente, E* es el excímer o y D e l díme ro e n el estado fundame ntal. Abs repres enta la a bs orción y F M y F E son las emisi ones del monómer o y e l excímero. Generalmente la formación de excímeros tiene lugar en e structuras aromáticas planas que prese ntan eleva d a densidad de orbitales π . Por lo que la ge ometr ía más habitual en los excímeros es una disposic ión tip o “ sándwich” formada por apila - miento π ( π – stacking) en la que un monómero se sitúa paralelamente sobre el o tr o con una separación apr oximad amente de 3 – 4 Å. El pireno y el perile no así co mo sus derivados han sido la s estructura s má s emplea das, aun que también se han descrito excímeros forma dos por otras estructuras como el nafta leno, el dibenzofura no [59] o la acridina [61] ( Figura A – 10 ). Bloque A. Fluo róforos con t iemp os de vida largos. Estudio fot ofísico y aplicac iones. 32 Figura A – 10 . Estructur as para las que se h a reportad o forma ción de exc ímeros [ 59 , 61] . La f ormación del excímero es un proceso general mente control ado por difusión (aunque hay excepciones [ 62] ) en el que todas las colisio nes entre un m onómero en el estado excitado y un monómero del fluoróforo en el estado fundamental dan lug a r al ensamblaje del excímero [63] . Po r lo tanto, este proceso se ve severamente afecta do por la concentració n del fluoróforo y por algunos pa rámetros f isicoquímicos del disol- vente como la temperatura y la viscosidad . Cua nto m ayor sea la concentración y la temperatura, más fre cuente s serán las colisi ones entre l as moléculas, fa vorecie ndo la formación del excí mero. Si n embarg o, un aume nto de la viscosidad dificulta la difu- sión de las molécu las reduciendo las colisi ones y la formación de excímeros [59 , 60 , 63 , 64] . La evolución temporal de l a intensidad de fluoresce ncia tra s la ex citación del flu oró- foro está def inida por la s Ecu acione s diferencias A – 13 y A – 14 dónde [M] y [M*] son la concentra ción d el mon ómero en el estado fundame ntal y excita do respectivam ente, [E*] es la concentración del excímero, k M es la constante de desactiva ción del mo nó- mero, k E la contante de desactivación del ex címero y k E,M y k M,E son ,re spectivame nte, la contante del proceso de formación de excímer o a partir del monómero y del pro c eso inverso en el estad o excitad o [1] . 𝑑 [ 𝑀 ∗ ] 𝑑𝑡 = −𝑘 𝑀 [ 𝑀 ∗ ] − 𝑘 𝐸 ,𝑀 [ 𝑀 ] [ 𝑀 ∗ ] + 𝑘 𝑀 ,𝐸 [ 𝐸 ∗ ] (A – 13) 𝑑 [ 𝐸 ∗ ] 𝑑𝑡 = 𝑘 𝐸 ,𝑀 [ 𝑀 ] [ 𝑀 ∗ ] − (𝑘 𝐸 + 𝑘 𝑀,𝐸 ) [ 𝐸 ∗ ] (A – 14) Esta evolución tem poral da lugar a decaimientos de fluorescenc ia multiexp o- nenciales dónde, además de la desactiva ción del mo nómero tiene lugar un incre- mento en la concentra ción del excímero seguida de su desactiva ción. En un siste ma Introducción 33 fotofísico sencill o dónde só lo tiene lugar la f ormación de excímeros y la diso ciaci ón del excímero no tiene lugar dura nte el tiempo que el fluorófor o permanece en el es- tado excitado, el monómer o presentará un dec amimie nto monoexp onencial dete rmi- nado por la Ecuación A – 17 mientras que el excímero presentará un d ecaimiento bi- exponencial definido por la Ecua ción A – 18 , d ónde t es el tiemp o tran scurrido de s de el pulso de excitació n, I M e I E representan la in tensidad del monómero y del excímero , k r,M y k r,E son sus con tantes de desactiva ción radiativa s, k nr.M y k nr,E las contantes de desactivación n o rad iativas y τ M y τ E son sus re spectivo s tiempos de vida . El signo “ – “ marca do en rojo en la Ec uaci ón A – 18 hace re ferencia al increment o d e intens idad del excímero debido a su formación y es una prueba irrefutable de la formación de una especie fluoresce nte en el estado excita do ( Figura A – 11) [1] . 𝑘 𝑀 = 𝑘 𝑟 ,𝑀 + 𝑘 𝑛𝑟 ,𝑀 = 1 𝜏 𝑀 ⁄ (A – 15) 𝑘 𝐸 = 𝑘 𝑟 ,𝐸 + 𝑘 𝑛𝑟 ,𝐸 = 1 𝜏 𝐸 ⁄ (A – 16) 𝐼 𝑀 (𝑡 ) = 𝑘 𝑟 ,𝑀 [ 𝑀 ∗ ] 0 𝑒 −(𝑘 𝑀 +𝑘 𝐸,𝑀 [ 𝑀 ] )𝑡 (A – 17) 𝐼 𝐸 ( 𝑡 ) = 𝑘 𝑟,𝐸 𝑘 𝐸,𝑀 [ 𝑀 ][ 𝑀 ∗ ] 0 𝑘 𝑀 +𝑘 𝐸,𝑀 [ 𝑀 ] −𝑘 𝐸 [𝑒 −𝑘 𝐸 𝑡 − 𝑒 − (𝑘 𝑀 +𝑘 𝐸,𝑀 [ 𝑀 ] )𝑡 ] (A – 18) Figura A – 11 . Esquema de l a evolución temp oral de la intens idad de fluorescenc ia (I) del monóme ro (M) y del excíme ro (E) tr as un pulso de excit ación [1 , 59 ] . Bloque A. Fluo róforos con t iemp os de vida largos. Estudio fot ofísico y aplicac iones. 34 La m ayoría de sensores basados en ex címero s e mplean técnicas de esta do esta- cionario como medidas ra tiométricas e ntre la banda de emisión de l excímer o y la del monómero [65-70] o se tratan de sondas ON- OFF [71-74] , por lo que n o son capa ces en la mayoría de casos de diferencia r entre excímeros dinám icos y estáticos. Estos sensores han sido empleados para estudiar la actividad d e algun as enzimas [71 , 73] o la detección de a nalitos como H 2 O 2 [67] , cisteína [75] , fosfa to [75] , polia minas [ 74] , pH [68] , iones metáli cos como Al 3+ [ 66] ,Cu 2+ [70] , Hg 2+ [72] , Zn 2+ [75] , Ag + [69 , 76] o algunas biomoléculas como heparina [65] , glucosa [ 77] o ácidos nucleicos [78-80] entre otras a plicaciones. 2.3.3 .- Cambi os conformaciona les Los cambios en la densida d electrónica de los fluoróf oros en el estado excitado debido a las tra nsiciones elec trónicas puede n dar lugar a camb ios conformaciones en la molécula, presentando una disposición geométr ica difere nte en el estado funda- mental de la que prese nta en el estado excitado. Estos cambios conformaci onales pue- den altera r la emisión lu miniscente. Algunos de los ca mbios conf ormaci onales más frecuentes son la formación de excímeros intra molecul ares y los rotore s molecula res. 2.3.3 .1.-Excímeros intramolec ulares Algunos f luoróf oros e stán constituidos por do s su bu nidades cromofóricas unidas por una cad ena de lon gitud y rigidez variable. En estos fluoróf oros puede darse un ca mbio c onforma cional e n el esta do excitad o de forma que se pr oduzca un apilamiento π de las sub unidades del fluoróf oro en el e stado excita do, dand o lugar a la formació n de un excímer o q ue se disocia en el estad o fundame ntal ( Figu ra A – 12 ). La formación del dímero intramolecular requiere de rotaciones internas, que tienen lugar dura nte el tiempo qu e el fluoróforo pe rmanece e n el estado excita do. Est os ex- címeros in tra moleculare s son muy semejantes a los excímeros entre dos moléculas de fluoróforo que describíamos en el apartado 2. 3.2 . Sin embargo, la principal diferencia radica en q ue en los excí meros in tramolec ulares la rea cción no se ve a fectada por la concentración, ya que se trata de una reacc ión intramolecular. No es un fenómeno colisional com o la formación clá sica d e excímeros, per o se encuentra de igual modo determinada por la difusión [1] . Existen en bibliografía sen sores basados en este meca - nismo para la detecci ón de pH intracel ular [ 81] o algunos iones c omo el Cl – [82] , Ni 2+ [ 83] , Cd 2+ [84] , A g + [85] , Hg 2+ [86 , 87] o Cu 2+ [86-88] entre otros [89] . Introducción 41 Figura A – 17 . Supe rior: diagram a de Jablonsk i de las princ ipales transiciones e n ICT donde EF es el estad o fundamenta l de la especie i nicial, LE la especie excitada localmente, ICT la espec ie donde ha tenido l ugar la transferencia de carga girad a y EF’ el estado fund amental de esta última. Abs repres enta l a absorció n y F LE l a fluoresce ncia em itida medi ante la t ransición LE – EF. TE es la transferenc ia electrón ica, F ICT l a desac- tivación radiactiv a de la especie ICT y N R su des activación no radiati va. Infe rior: es quema de las d os prin- cipales ban das de emisión de los fl uoróforos I CT en diso lventes po lares. La mayoría de fluoróforos ICT presentan un rendimiento cuántico bajo en me- dios polares prótic os debid o a que la f ormación de puentes de hidrógeno entre el so- luto y el di solvente fa vorece la desactiva ci ón no radiativa del fluo róforo [104] . Estos fluoróforos se conocen como fluoróforo s ICT “ tipo cuesta aba jo” ( d ownhill type ) [111] . Sin embargo, algunos f luor óforos c omo la acridina [112-114] , el pire no-3-carb oxialdehido (PCA) [115] y la 7 -metoxi-4-metilcuma rina [116] presentan el efecto contrario, a umen- tando su re ndimiento cuántico al aumentar la polaridad del disolvente (“ tipo cu esta arriba” ( uphill type )) debido a que los puentes de hidrógeno d ificultan las interacci o- nes vibracionales en la s transicione s n →π * y π→π * reduciendo de este modo la desac- tivación no radiativa por entrecruzamiento de sistemas y conversión interna [111-114 , 117- 119] . Bloque A. Fluo róforos con t iemp os de vida largos. Estudio fot ofísico y aplicac iones. 42 Se han esta blecid o cuatro modelos s obre el estad o IC T: Transfere ncia d e carga intramolecular gira da ( Twisted I ntramolecular Charge Transfe r, TICT ), Transferencia de carga intra molecular oscila nte ( Wagging Intramolecular Charge Trans fer, WICT), Re hi- bridación por Tra nsferencia Intramolecular de Carga ( Rehybridizat ion Intram olecu lar Charge T ransfer, RICT ) y la Transferencia de carga intr amolecular p lana ( Planar I nt ra- molecular Charg e Transfer, PI CT ) . 2.4.2 .1.-Transferencia de ca rga intramolecular g irada (TICT) Este mecanismo de transfe rencia de carga intramolecular fue propuesto en 1973 por Grabowski et al . para dar una respuesta a la fluorescencia dual del 4 ,4’ – di- metilaminobenzo nitrilo (DMABN) [120] Se caracteriz a p orque la transferencia de carga tiene lu gar gracia s a u n ca mbio conformaci onal, el cu al se produce media nte un giro de 90° entre el dador y el a ceptor [109] . La f orma m ás fr ecuente de obtener es te giro es empleando co mo grupo d ador una amina alifática ( – NR 1 R 2 ), ya q ue el N de este grupo presenta una hibridaci ón pira midal tipo sp 3 , mie ntras que la pérdida de un ele ctrón produce un cambi o a una hibridació n plana tipo sp 2 ( Figura A- 18 ) . Este cambio de hibridación tie ne lugar en la escala d e picosegundos [ 121] . En el estado funda mental la molécula se encuentra en la configuración plana, tras la absorció n d e un fotón la es- pecie LE todavía mantiene esta con figuraci ón, de acuerd o con el principio de Franck - Condon. Sin embargo, la relajación del disolvente pued e inducir la rotación del fluoróforo dando luga r a la configuración TICT en la habrá un á ngulo de 90° entre el dador y el a ceptor. ( Figura A - 19 ). [1 , 94 , 108 , 122-127] Figura A- 18 . Esquema de una amin a con hibridación sp 3 con geometría piramida l e n equilibrio co n su hibridación sp 2 de geomet ría plan a. Introducción 43 Figura A – 19 . Diagrama de Jablonski de las princip ales transici ones en TICT donde EF es el estado fun da- mental de la especie inicial, LE la especie excitada l ocalmen te, TICT l a especie donde ha tenido lugar el cambio de configuración geomét rica y EF’ el estado fundament al de esta últim a. Abs r epresent a la absor- ción y F la f luorescen cia em itida m ediante la t ransición LE – EF, F’ l a des activación radiac tiva de l a espe cie TICT y NR su desactiva ción no ra diativa. En la Figu ra A – 20 se re cogen alg unos fluoróf oros que prese ntan u n meca- nismo TICT apareciendo marcado en rojo el grupo dador, en azul el aceptor y en gris el puente π . Figura A – 20 Ejempl os de flu orófo ros con mecanismo TICT. En rojo aparece resaltad o el grup o dador , en azul el g rupo acepto r y en gris el p uente π. La flecha i ndica e l lugar dónde se p roduce el giro [ 121 , 122 , 127 , 128 ] . Los f luorófor os T ICT son, en general, muy sensibles al microambiente que les rodea, dependiendo la emis ión luminiscente de factore s como la flexibilidad molecu- lar, la simetría de las estructuras rotatorias, el volu men de las moléculas desplaza das durante la rotación o el ángulo del giro inicial para la relajación en el estado excita do. En los disolventes más p ola res se favorece, generalmente, la for mación de la especie TICT, de meno r e nergía, lo que da lugar a desplaza mientos batocrómic os, así co mo un menor rendimiento cuá ntico. Recienteme nte Z. Zhang et al. han introducid o el Bloque A. Fluo róforos con t iemp os de vida largos. Estudio fot ofísico y aplicac iones. 44 concepto de polaridad crítica de un fluorófor o TICT, tomand o ésta el valor de polari- dad del disolvente de tal fo rma que disolventes con va lores superiores a la polaridad crítica del fluoróforo favorec en en la formaci ón de la especie TICT del fluoróforo, mientras que el fluoróforo se encuentra mayor itariam ente en la conformaci ón pl ana LE en disolventes con valo res de polaridad infer iores a la polaridad crítica [124] . S in embargo, no sólo les influye la polaridad del microambiente, sino que también se ven afectad os por otros parámetr os com o la visc osidad o la polarizabilidad , por lo que son frecuenteme nte utiliza dos como sens ores de micr oambie nte [108 , 125 , 128 , 129] . Dado q ue la conformación en la que el dador y el aceptor se encuentran en una disposició n ortogonal es, generalmente, m uy reactiva y con un rendimiento cuá n- tico muy baj o, se ha n diseñado fluoróforo s en los q ue se ha inhibido la formación de esta especie al conferirle rigidez a la estructura mediante distintos métodos, co mo por ejemplo, la inclusión del grupo a mino en u n heteroát omo ( Figura A – 21 ) [126] . Esta es- trategia de impedir la rotación para favorec er la desactivación radiativa de la molé- cula ha sido emp leada en el desa rrollo d e difere ntes s ensores (p or ejemplo: HS A [ 56] , Hg 2+ [130] , Al 3+ [ 131] ) en los que la uni ón del a nalito al fl uoróforo TI CT prod uce un incre- me nto de su rendimiento c uántico al impedir la co nformación ortog onal en tre dador y aceptor. Figura A – 21 Ejemplos de f luoróforos d ónde se ha impedido el me canismo TI CT mediante la inc lusión del grupo amino en hetero átomos. En rojo aparece resaltado el g rupo d ador, en azul el grup o aceptor y en gris el puente π. La flecha indic a el l ugar dónde se produce el giro. La estructura heterocíclica añadida para impedir la rotación ap arece marc ada en verde [126] . Introducción 45 2.4.2 .2.- Transferencia d e carga intramolecula r oscila nte (WICT) Este mecanismo de carga intramolecula r, al igual que TICT, tambié n nació de los esfuer zos por explicar la fluorescencia dual del DMABN. Schuddeb oom et al . [132] propusieron que la transfe rencia de carga , al producir un ca mbio en la hibr idación del N del grupo dador, gener a un ca mbio d e conformación de sus su stituyente s en un ángulo determinad o (( -9 0°) – (+90°)). Este ángulo se genera entre los sustituyentes de la amina alifática , al contrario q ue en TICT dónde el g iro de 90° entre el aceptor y el dador se pr oducía p or una torsión sobre el enlace del N co n el an illo aro mático d el puente π ( Figura A – 22 ) [ 110 , 132-134] . Ambos mecanismos no son excluyentes y pueden coexistir de for ma simultán ea en una mis ma molécula. Figura A – 22 . Es quema dónde s e r epresent a e l g iro pro ducido por TICT y por WICT en un fluo róforo dónde A represent a un grupo electrón – aceptor [133] . 2.4.2 .3.- Rehibridación por T ransfere ncia de carga intramolecular ( RICT) Este mecanis mo de ICT fue propuesto em 199 6 por Sobolewski et al. [ 135] , los cuales proponen que se produce un aumento del moment o dipolar de la molécula debido al cambio de hibridación del átom o de carbon o del gru po a ceptor como c on- secuencia del cambio de densidad electrónica pr oducido por la transferencia de carga a través del puente π . De esta forma en el grupo aceptor ciano ( – C ≡ N) tiene lugar un cambio de hibridación del á tomo de carbono de sp a sp 2 , mientras que en el caso del grupo carboxí lico el cambi o de hibridació n tendría lugar de sp 2 a sp 3 . A l producirse un cambi o en la hibr idació n tendría lugar un ca mbio conformacional, dando lug ar a una torsión e ntre el grup o aceptor y la estructura plana del pue n te π ( Figu ra A – 23 ) [ 135 -137] . En aquell os flu orófo ros, como el DMABN, q ue prese nten tanto un C el gru po aceptor co mo un N en e l grupo da dor, l os mecani smos TICT, WICT y RICT c ompeti- rían entre sí. Bloque A. Fluo róforos con t iemp os de vida largos. Estudio fot ofísico y aplicac iones. 46 Figura A – 23. Esquema del mecan ismo RICT en un f luoróforo c on un grup o aceptor ciano (en azul) y un grupo dado r D. El ángul o de g iro aparece rep resentado con una fle cha [136] . 2.4.2 .4.- Transferencia d e carga intramolecula r plana (P ICT) Este mec anismo de tra nsfere ncia de carga intramolecu lar es antagónico al me- canismo TICT, generalmente más aceptado. En el mecanismo PICT propuesto por Za- chariasse et al. la tra nsferencia de carga d a lugar a la formación de un doble enlace entre el N del grupo dador y un át omo de carb ono de l puente π , genera ndo de e sta forma una estructura plana , y qued ando el N ca rgado positiva mente [ 121] . La estruc- tura pla na se forma por medio de la formación de un d oble enlace, mientra s que en TICT se propo ne que esta estructura pla na se for ma deb ido a un giro e n los sustitu- yentes del N debid o a un ca mbio de hibridació n. Figura A – 24 . Esquema del mecan ismo PICT en un fluorófo ro con un grupo aceptor (en azul) y una am ina alifática c omo grupo d ador [121] 2.4.3 . Transferenci a electrónica fotoinducida ( Photoinduced Electron Transfer, PET ) Aunque este fenómeno foto físico no se debe estricta mente al efecto de la pola- ridad de los disolvente s se ha incluido en este apa rtado ya que se trata de un fenó- meno altamente dep endien te del microa mbiente. Algunos fluoróforos presentan en su estruc tura grupos electrón – donantes o elec trón aceptores que, a diferenc ia del fe- nómeno ICT, no se encuentran directame nte unidos a la estructura cromofórica Introducción 47 compuesta por anillos aromá ticos, l o que puede dar lugar a un quenching produc ido una transferencia electrónica tra s la excitación de la molécula, en la que tiene lugar la transferencia de u n electrón desde el orbital HOM O del dador al orbi tal HOMO del fluoróforo, impid iendo de este modo el re torno al orb ital HOMO del f luoróforo del electrón que se encuentra en el orbita l LUMO tras la excitación, y por tanto inhib iendo la desactiva ción radiativa d e la molécula ( Figura A – 25 ). Est a transferencia electrónica se debe al cambio en el potencia l redox (reducción - ox idación) de la molécula en el estado excitado. La PET más f r ecuente es en la que el fluoróforo actúa como aceptor de electrones, reduciéndos e tras acepta r un electrón d el dador, pero, también puede tener lugar en sentido co ntrario, con la oxidación del f luoróforo tras la transfe rencia de un electr ón del fluoróforo a un grupo aceptor de electrones (por e jemplo: a crila- mida, p- be nzoquinona, piri dinio, …) [1 , 2] . Figura A – 2 5. Esquem a de las t ransiciones electrónic as en la P ET (flecha negra disc ontinua). L os electr ones que ocup an los orbitales HOMO y LUMO de la estructura cr omofórica excitada est án marcados en azul, mientras que los electr ones perten ecientes al grupo dado r aparecen marcados en rojo. La línea verde dis- continua indica la desactiv ación radiativa (F), la cual se encuentra inhibid a debido a l a PET, mient ras q ue la inhibici ón de la PET da lugar a la react ivación de l a fluorescenc ia. La PET puede inhibirse, con la consiguie nte recuperación de la fluorescenc ia mediante la interacción de los grupos ricos en ele ctr ones co n d iferentes analitos, dando lugar a sondas OFF - ON. Los analitos más empleados con este tipo de sonda s son H+ (sensores de pH) [138-141] e iones metá licos [139-142] . Por este motiv o, esto s f luoró- foros son mu y sensibles al disolvente en el q ue se encuentren, presen tando eleva dos rendimientos cuá nticos e n medios polares prótic os [105] , mientras q ue en d isolvent es apróticos pued e tener lugar la PET, produciéndose q uenching. 2.5. - Fenómen os luminiscentes con tiempos de vida largos. Un grupo de fenómenos lu miniscentes muy relevante para el desarrollo de sen- sores biológicos son aquellos que dan lugar a tiempos d e vida largos. La población de Bloque A. Fluo róforos con t iemp os de vida largos. Estudio fot ofísico y aplicac iones. 48 moléculas de fluoróforo en el estado excitado disminuye con el tiempo si guiend o un a cinética ex ponencial. Se denomina tiemp o de vida a l “ tiemp o necesario para que la con- centración d e entid ades molec ulares excitad as descie nda 1/ e de su valo r original ” [1] . Este pa- rámetro fotofísico es muy importan te, ya que es un pará metro cinético espec ífico de cada especie molecular. Los luminófor os con tie mpo de vida la rgos ( > 1 0 ns) se han convertido en un punto de interés debido a que esta característica hace que pueda diferenciarse su señal luminiscen te d e a quella debida a interferencias biológ icas, con tiempos de cortos (< 10 ns) empleando ventanas temporales ( time-g ates ) mediante téc- nicas avanzadas de espectroscopía en tiempo resuelto , como Microscopía de Imagen Tiempo de Vida de Fluore scencia ( Fluo rescenc e Lif etime Imaging Microscopy , FLIM) o Microscopía de Imagen d e Tiempo de Vida de Fotoluminiscenc ia ( Photolum iniscence Lifetime Imaging Micro scopy , PLIM) [ 143 , 144 ] . Debido a e stas ven tajas se han desa rrollado d istintos ti pos de lum inóforos co n tiempos de vida largos, desde moléculas orgánicas como la acridona (14.2 ns), el DBO (13 – 38 5 ns) o el SeTau -425 (2 6.2 ns), a complejo s de metales de transición como el Ru(bpy) 3 [PF 6 ] 2 ( 600 ns), complejos de lantá nidos como el DTBTA (1 ms) o, incluso, nanopartículas f luorescente s como los Qua ntum Dot s (CdSe/ Zn/S) (28.4 ns) [143] . 2.5.1- Fosforescencia. En 1867 la fosforescencia y la fluorescencia fueron consi derada s por Becquerel un m ismo f enómeno, sólo c on la difere ncia de que la f luorescenci a posee tiemp os de vida más cortos que la fosforescencia, llegando a referirse a la fluorescencia con el término “fosforescencia de vida corta” ( short-liv ed phosphorescence) [1 , 145] . Sin embargo, esta única disti nción no e s suficie nte ya que pre senta n m á s difere ncias entre ell os, permitiendo q ue n os refira mos a ellos c omo d os fen ómeno s, en los que, si bien ti ene lugar una e misión luminiscente, ésta se l leva a ca bo por dife rentes mecanismos . La primera distinción teórica entre ambos fenómenos fue ex puesta por F. Perrin en su tesis doctoral [1 , 146] , estableciendo que la molécula debía pasar por un estado interme- dio entre la excitación y la emisión luminiscente para que tuviera lugar la fosfores- cencia [1] . Este “esta do intermedio” al que se ref ería F. Pe rrin se tra ta del esta do tri- plete. Cuando la m olécula se excita , el ele ctrón que pa sa al estad o excita do mantie ne la orientación del espín, por lo q ue presenta un espí n contrario al electrón que perma - nece en el orbital del estado fundamental del q ue proce d e. Tras la excitación tiene lugar un e ntrecruz amiento de sistemas, de for ma que el electrón del e stado excitado cambia la orientación de su espín dando lugar al estado triplete en el que ambos elec- trones presenta n la misma orientación de espín ( Figu ra A – 26 ) [1] . Por este motivo, la transición entre el estado triplete y el estado fundamenta l es una transición prohibida Introducción 49 según la teoría de la perturbación [147] , que d a lugar a con stantes de desactivación muy lentas y por lo tanto, tiempos d e vida muy largo s, gen era lmente en el orden de mili- segundos – segu ndos [2] . Figura A – 26 Esquema de Jablonsk i simp lificad o dónde s e represent an l as trans iciones debidas a abs orción (negro), fluorescenc ia (v erde), e ntrec ruzamiento de s istemas (naranja) y fosforescenc ia ( rojo). En la iz- quierda aparecen represent ados con una flecha la ori ent ación de los espines de l os electrones en el estado fundamenta l (negro) y exc itado (v erde) que dan lug ar a la fluoresce ncia. A la derec ha los espines e xcitado (rojo) y fun dament al (neg ro) en el f enómeno de f osforescen cia. La fosforescencia es muy sensible a la tempera tura, agrega c ión molec ular y la presencia d e oxígeno, dand o lugar fácilmen te a procesos de qu enching . Se encue ntra favorecida a bajas temperatura s, siendo más fácil e ncontrarla en susta ncias en esta do sólido que en disolución, d ónde las moléculas en las que tiene lugar este fenó meno presentan, p or lo genera l, r endimient os cuá ntico s bajos [147- 149] . Un ejemplo de molé- cula fosforescente son la s sales del ión ura nilo (UO 2 2+ ), q ue presentan un tiemp o de vida de fosforescencia de 3 µs en agua [150] . 2.5.2 .-Fluorescenci a retardada. La fluorescencia retard ada tiene lugar en moléculas en las q ue la diferencia de energía entre el esta do singlete ex citado S 1 y el esta do triplete T 1 es muy pequeña, de modo que puede tener l ugar un entrecruz amiento de sistemas i nvers o T 1 → S 1 , se- guido de la posterior desactiva ción ra diativa S 1 → S 0 ( Figura A – 27 ). La emisión ten drá el mismo espectro que la fluorescenc ia, pero con un tie mpo de vida much o mayor, ya que la molécula debe pasar por el esta do triplete a ntes de emitir luminiscencia . P ara que pue da tener lugar este fenóme no, además de una pequeña difere ncia de energía entre los esta dos s inglete y triplete, se req uiere que la molécu la prese nte u n tiem po de vida del estado triplete ele vado [1] . Bloque A. Fluo róforos con t iemp os de vida largos. Estudio fot ofísico y aplicac iones. 50 Figura A – 27 . Es quema de J ablonsk i simp lificad o dónde se representa n las tr ansiciones debid as a a bsorci ón (negro), fluores cencia (verde), ent recruzamient o de s ist emas ( Intersystems Crossing , ISC) y fosforescenci a (rojo). Para que tenga lugar la fluorescen cia retard ada (morado) debe tener l ug ar un entrecru zamiento de sistemas inve rso (ISC I ) Podemos distingu ir funda mentalmente e ntre d os ti p os d e fluorescenc ia retar- da da: tipo E y tipo P. 2.5.2 .1.-Fluorescencia retarda da tipo E. La fluorescencia re tardad a tipo E recibe este nombre de la eosina ( Figura A – 28 ), ya que fue el primer compuesto en el que se observó [1 , 151] . La fluorescencia retar- dada tipo E tamb ién se denom ina Fluore scencia ret arda da de a ctivación térmica ( Thermally Activated Delayed Fluorescence, TADF) ya que, al contrario que lo q ue suce de con la fo sforescencia , su efi ciencia se increme nta con e l aumento de te mperatura [ 152] . Un ejemplo de fluoróforos repr esentativos d e este fenómeno f otofísico son los fu lle- renos, es tructuras esférica s formadas por un deter minado número de carbonos (Figura ). Los fullerenos de 60 (C 60 ) y 70 (C 70 ) átomos d e carbonos presentan rendi- mientos cuá nticos de form ación del estado triplete cerca nos a 1, y, rendimientos d e fluorescencia bajos. Sin embargo, si se disuelve n en alcanos visco sos o polímeros pre - sentan una gra n i ntensidad de emis ión debida a TA DF . [152 , 153] . Esta s moléculas d an lugar a fenómenos de f osforescencia si se e ncuentra n a temperatura s muy bajas , mien- tras, que el aumento d e te mpera tura da lugar a la disminución de fosfore scencia y el aumento de TA DF [152- 154] . Introducción 57 Figura A – 34 . Est ructura de los complej os de lantán idos comerci ales ATBTA – Eu 3+ y Lum i4 – Tb. 2.6. - Otros fenóme nos fotofísicos En los aparta dos anter iores hemo s hablad o de l os pri ncipa les fenó menos foto- físicos que p ueden experi mentar la s moléc ulas lumi niscentes. Est os fenóme nos , si bien son los más co munes, no s on los únicos que pued en exp erimentar estar molé cu- las. Otros fenó menos que merecen u na menció n espe cial son la flu orescencia d ual, la formación de agregados en el estado funda mental, co nocidos como agre gados J y H, y la fluorescenc ia amplifica da por agregación. 2.6.1 .- Fluorescenci a dual. En 1950 M. Kasha esta bleció que la emisión luminiscente tiene lugar d esde el nivel electró nico excita do de menor energ ía pa ra una determinada multiplicidad d e espín [181] . Sin emba rgo, est a famosa regla, con ocida com o “ regla de Kasha ” prese nta algunas excepci ones. Una de las exce pciones más conocidas es la molécula de az u- leno, descrita ta mbién p or M. Kasha [ 182] . E n esta molécula tiene lu gar la emisió n lu- miniscente desde el nivel S 2 en lugar del nivel S 1 . Sin embargo, en a lgunos de sus derivados la emisión radia tiva desde el nivel S 2 compite con la conversión in terna S 2 → S 1 , dando lugar a la emis ión dual de fluorescenc ia desde el nivel S 2 y desde el nivel S 1 ( Figura A – 35 ) [183] . Ademá s de los der ivados d el azuleno se ha descr ito emi- sión de fluorescencia dual en numerosos comp uestos como el ovaleno, α – carote no, β– caroteno, azabe nceno o e l 3,4 -benz opireno entre otr os [184 , 185] . También se ha n d es- crito moléculas que presentan emisió n l uminiscente d ebido a transiciones desde ni- veles superiores c omo el caso del pire no en el que tien en lugar simultánea mente la s transiciones S 3 — S 0 , S 2 – S 0 y S 1 – S 0 [184] , así como compue stos que ex hiben f osforesce ncia Bloque A. Fluo róforos con t iemp os de vida largos. Estudio fot ofísico y aplicac iones. 58 dual con transiciones desde dife rentes estados triplete como el furulleno C 70 o la p- benzoquinona [ 184] entre otr os [164 , 184] . Cuanto mayor s ea el nivel desde el q ue ti ene lugar la transició n, mayor será la ener gía de la misma y, por tanto, la banda aparecerá a una longitud de onda infer ior que la de las transiciones que tienen luga r desde ni- veles energétic os más ba jos. Figura A – 35 . Diagrama de Jablon ski del fenómeno de fluo rescencia dual donde tiene lug ar la emisi ón desde el n ivel S 2 y desde e l nivel S 1 . La des activaci ón radiativa S 2 → S 0 compite c on la conve rsión intern a. En la Figura A – 36 pode mos observar como eje mplo l a fluorescencia d ual de una metalop orfirina de Zn 2+ (ZnTTP). Los espectros mu estran la s bandas de absorción correspondiente s a las transiciones S 0 → S 1 (≈ 550 nm ) y S 0 → S 2 (≈ 475 n m), así como las dos bandas de emisió n de fluorescencia, la debida a la transici ón S 2 → S 0 (≈ 450 nm) y la debida a la transición habitual S 1 → S 0 (≈ 600). Figura A – 36 . Estructu ra del ZnTTP y esp ectros de abso rción (líneas sólidas) y fluorescenc ia ( líneas pu ntea- das). Repr oducido y ad aptado con permiso de T. Itoh [184] Copyright © 2012, Ame rican Chemical Socie ty y N. Mataga et al . [186] Copyright © 2000, Ame rican Chem ical Society. Introducción 59 2.6.2 . Formación de agrega dos en e l estado fun damental Algunos fluor óforos pueden formar estructuras supramoleculares por conju- gación de los orbitales π . En el apartado 2.3 .2 se describió la formación de dímeros en el estado exci tado (excí meros). S in embarg o, tamb ién pue de tener l ugar la f orma ción de estructuras por apilamie nto π en el estado fundame ntal. Los dos tipos pri ncipales de este tipo de estructuras fo rmadas en el estado f undamental se conocen como agre- gados J y H. Aunq ue ambas estructura s son difere ntes, puede tener lugar la transfor- mación de un tipo de agregad o en otro debido a las fue rzas de Coulomb y a las inter- acciones de corto alcance que tienen lugar por el solapamie nt o de los monómer os. Además, una misma molécula puede presentar los dos tipos de agrega dos a la vez o sólo uno de ellos [187] . 2.6.2 .1. Agregados H Los agregados H producen un desplaza miento del máximo de a bsorción hacia menores longit udes de ond a del a gregado con respect o a la a bsorción del monóm ero [187 , 188] , hecho del cual r ecibe n su nombre (H, hipsocróm ico) [189] . Los agrega dos H son estructuras formada s por el apilamiento en di sposición paralela o “tipo sándwich” de monómeros ( Figura A – 37 ) [190] . En este tipo de agregados la emisión luminiscente es una tra nsición prohib ida, por lo q ue la fluorescenc ia se ve suprimida [190] , mien tras que se f avorece el entrecruzamiento d e sistemas y la fosforesce ncia [ 189] . Algunos d e los fluor óforos en los que se observan agrega dos H son la acridina nara nja [ 190 , 191] , los oligotiofenos y l os caroteno ides [189] . Figura A – 37 . D iagrama de J ablons ki simplificad o del monóme ro y lo s agr egad os J y H. Bloque A. Fluo róforos con t iemp os de vida largos. Estudio fot ofísico y aplicac iones. 60 2.6.2 .2 Agregados J Al contrario que l os agreg ados H, los agregad os J da n lugar a un despla za- miento hacia el r ojo con re spec to a la long itud de ond a de a bsorción del monóm ero [187 , 188] , este ef ecto fue descrito por E. Jelley al estudiar la a gregación de la pseudoiso- cianina [192] , motivo por el cual los a gregados J reciben este nombre [189] . El apilamiento en este tip o de a gregados es tipo “c ola - cabez a” o “ en escalera”. En los agrega dos J la emisión d e fluoresce ncia está permitida, por lo que no se ve su primida como en los agregados H [ 189 , 190] . Las cianinas y las porfirinas pr esentan agregados J, mientras q ue las perilendiimida s puede n prese ntar tanto agregado s H como agre gados J [189] . 2.6.3 . Fluorescen cia amplificada por agregaci ón ( Agg regated Induce d Emissio n E n- hancement , AI E) .La fluorescencia amplificad a por a gregación (Aggreg ated Induced Emission Enhace - ment, AIE) fue descrita por primera vez a principios de los 2000 s [193 , 194] . Algunas mo- léculas presentan un rendimiento cuántico bajo en disoluci ón. Sin embargo, al produ- cirse la a gregación de va rios monómero s d e la molécula , éste se ve incrementado [ 195] siendo, p or tanto fluore scentes en el estado agre gado y en estado só lido [196] . Este au- mento se debe fundamen talmente a la agre gación del fluoróforo da lugar a una re- ducción de la pérdida de energía ra diativa como c ons ecuencia de la restricción de la rotación intramolecular de la molécula [39 , 197] . Debido a la orientación de los monóme- ros que forman el agregad o se impide la formació n de interacciones π – π y co mo consecuencia no se produce el quenching que esta interacc ión provoca en otras molé- culas, com o por e jemplo en la fluoresceína [196] . Generalmente las m oléculas q ue p re- sentan AIE cont ienen en su estructura distintos anillos aromá ticos con cier ta liberta d de rotación, la cual, al restringirse por la agre gació n reduce la desactivación no radia- tiva del flu oróforo. E n la Fi gura A – 38 se muestra n al gunos e jemplos de fluor óforos que dan lugar a AIE. Figura A – 38 . Ejemp lo de fluo róforos que p resentan AIE . Las flechas azules señal an las posib les rotacio nes internas de la molécul a [196] CAPÍTULO I INSTRUME NTACIÓN Y METODOLO GÍA Capítulo I. Ins trumen tación y metodología 63 El conocimiento de la instrumentación y la metodología es esencial para poder llevar a cabo el desarrollo d e los ob jetivos q ue se pla ntea n. En el desarrollo del es tudio fotofísico d e fluoróforos con tiemp o de vida largos y sus a plicaciones se re quirió el empleo de diversa s técnica s espectroscópicas y d e mic roscopía de fluorescencia. 1. - Es pectrosco pía UV – Visible Los espectro s de absorción se recogieron mediante un espectrofot ómetro de ab- sorción UV -Visible Perkin- Elmer La mbda 650 (Perkin Elmer, E E. U U.) , cuya re solu- ción es de 0.17 nm. Permite realizar medida s de absorbancia y tanto por ciento de transmitancia entre 190 y 900 nm a sí como calcula r h asta la cuarta derivada d e los datos obtenidos. Está equipado con u n sistema Peltier (ETC -273T) que permite el con- trol de la tempera tura en los compartimentos pa ra las cubetas. El e squema óptico del equipo se refleja en la Figura I – 1. Figura I. – 1 . Esquema óptico del es pectrofotómet ro de absorci ón UV – visible, cuyos principales elemen tos son 1) Fuente de exc itación, 2) monocrom adores , 3 ) Rendij as 4 ) Depolarizador, 5 ) Hélice para dirigir el haz de lu z, 6 y 7) C ompartimentos pa ra cubetas y 8) detecto r. Los principales e lementos del eq uipo son: 1. Fuente de excita ción . El equipo presenta como fuente de excita ción contínua dos lámparas: una de tungsteno y otra de deuterio para cubrir todo el espectro UV – visible. En la configura ción del eq uipo emp leada el cambio de lámpara se realiza a 3 19.2 nm, esta ndo activa la l ámpara de tungsteno a longitudes d e onda superiores a la indi cada y la de deuterio pa ra longitudes de onda inferiores. Bloque A. Fluo róforos con t iemp os de vida largos . Estudio fot ofísico y aplicac iones. 64 2. Monocromadores d e rejill a holográfica dobl e. El ha z de luz emit ido por la fuente de excitación pasa por un sistema de monocromadores, permitiendo así seleccionar la longitud de onda (λ) a la que se llevará a cabo la medida. 3. Rendija . Permite el a juste preciso de la altura del haz de luz para que coincida en el centro de la muestra. 4. Depolariz ador. Corrige la polarización i nherente al instrume nto, per mitiendo así obtener una mayor prec isión en los resu ltados. 5. Hélice. La hélice gira prese ntando un ciclo co n la secu encia cerrado/ muestra/ cerrado/ referencia , dirigiendo el haz de luz hacia un comparti mento o hacia otro. 6. Compartime nto pa ra l a cubeta de referencia. Dado que se trata de un equipo de doble haz posee un compartimento para la referencia y otro para la muestra. El eq uipo c ompara la se ñal obtenida de la re ferencia y se la resta a la m uestra, obteniendo así uno s resulta dos libres de la in terferenci a del disolvente. 7. Compartime nto para la cubeta de la muest ra. 8. Detector. El equipo posee u n fotomultiplicad or R95 5 como dete ctor. 2. - Es pectrosco pía de emisión en estado e stacionario Los espectr os de emisión en estado e stacionario se recogieron empleando un fluorímetro Jasco FP – 830 0 (Jasco, Japón) cuya fuente de excita ción es una lámpara de descarga de Xenón de 150 W. Presenta dos dete ctores para emisión : u n fotomult ipli- cador ,modificado S5 para las medidas hasta 65 0 nm y un fotom ultiplicador R928, rojo-sensible, para medidas sobre los 900 nm. Además, está eq uipado con u n co ntro- lador de temperatura Pelt ie r (ETC – 27 3T). La a pertura de las re ndijas tanto de exci ta- ción como de emisión se pued e ajust ar a 1, 2.5 , 5, 10 o 20 nm. El so ft ware nos permite operar con un a velocidad de escaneo ajust able entre 20 y 20 000 nm / min. El compar- timento de la cubeta se encuentra situado de for ma que se genere un ángulo de 90 ° entre la excita ción y la emis ión de la mue stra, para evitar a sí posibles interferencia s. Los espectros obte nidos se encuentran ligera mente distorsionados ya que la eficiencia del monocromador de emisión y la re spuesta del fotomultiplica dor d epen- den de la longitud de onda. Ademá s, esta situación p uede d ar lugar a dife rencias en- tre espectr os de emisión de una misma muestra medi dos en diferentes eq uipos. Por este motivo, es necesari o llevar a cabo la corrección de los espectros obtenidos me- diante f luoróforos de referencia que absorba n y emitan en la m isma re gión que la muestra. Los espectros de emisión recogidos en es ta Tesis Doctoral se c orrigieron em- pleando Cuma rina 153 como referencia. Capítulo I. Ins trumen tación y metodología 65 3. - Es pectrosco pía de emisión en tiem po resu elto La espe ctroscopía en esta do estaci onario nos permi te conocer el c omporta- miento promedi o de un det erminado siste ma en el estado excitado, pero, est o no basta para con ocer con pr ofundida d las dinámicas q ue suced en en este esta do, requir ién- dose para ello información resuelta en e l tiempo. Las técnicas más emp leada s, desa rrollada s principal mente a pa rtir de los años 60s – 70s, so n la fluori metría de pulsos y la de modulación de f ase. La primera emplea un pulso ultrac orto de luz (pulso δ) pa ra excita r la m uestra y es tudia su evo lución temporal. La f luorimetría de modulación d e fase emplea, por el contrario, una fuente de emisión continúa de luz mo dulada sinusoida lmente y estudia la diferencia de f ase y desmod ulación de la rad iación em itida respecto a la de ex citación para calcular los tiempos de decaimient o de fluorescencia. Estas técni cas se denominan respectiva- mente de dominio de tiem po o de do minio de frecue ncia. Siendo las técnicas de do- minio de tiemp o las más e mpleada s en la actua lidad y las que se empleará n en el desarrollo de esta Tesis Do ctoral. De entre las técnicas de dominio d e tiempo la más extendida en la actualida d es la técnica de contaje de f otones i ndividuales c orrelacio- nados en el tiemp o ( time – correlat ed single photon counting , TCSPC) 3.1. - Fundamentos de la téc nica TCS PC . La téc nica se base en la excitació n de la muestra p or u na fuente de exc itación pulsada con una determina da frecuencia. E l esquema y los princ ipales elementos de un sistema TCSPC se reco gen en la Figura I – 2 , siendo el convertid or tiempo – a mplitud (TAC) el elemento principal. En primer luga r, se produce la excita ción de la muestra por pulsos rápid os d e luz con una determinada frecuencia. Cada pulso de la fuente de ex citación es monitoriza do produciendo u na señal de inicio (STA RT), que genera en el TAC una subida d e voltaje de forma lineal con el tiempo. El volta je se detiene cuando es detec tado el primer fot ón de la muestra , que genera u na señal de pa ra da (STOP). En el caso de que no se detecte ningún fotón, cuando e l vo ltaje alcanza un nivel máximo se reinicia. D e esta forma el TAC actúa c omo un “cr onómetro” siendo capaz de detectar el tiempo de llega da de los fotones d e la muestra. Bloque A. Fluo róforos con t iemp os de vida largos . Estudio fot ofísico y aplicac iones. 66 Figura I – 2 . Diagram a esquemát ico de un f luorímet ro basado en TCSPC. Otro de los element os más importan tes es el analiza dor multicanal (Multichan- nel analyz er , MCA ), el cual dependiendo del vol taje d etectado por el TAC añade una cuenta al canal de tiemp o correspo ndiente a la llegada del fotón, generando así un histograma de pr obabilidad de cuentas frente a canales d e tiempo. El experimento continúa hasta que se haya re cogido un número sufici ente de cuentas, normalmente unas 20 0 00. Para tra bajar adecuada mente con esta técnica la emisión de la muestra debe estar atenua da de f orma que sólo el 3% de la emisión produzca una re spuesta en el detector, ya que bajo están condiciones se puede asegura r que la señal detectada p ro- viene d e un único fot ón (apr oximadamente se detecta 1 f otón cada 1 00 pulsos) y que el hist ograma que genera el MCA se corresponde con el deca imiento de intensidad de fluorescencia d e la mues tra [1 , 2] . En el desarrollo de esta Tesi s Doctoral se empleó un fluorímetro con resol ución temporal FluoTime 200 (Picoquant G mbH, Alemania) basado en la técnica TCSPC. El instrumento e stá equipado con varia so láseres d e dio do pul sados de alta potencia : 375 nm (LDH – 375) , 400 nm (LDH – 40 0), 4 40 nm (LD H – 440 ), 470 nm (L DH – 470) 485 nm (LDH – 485, ), 530 nm (LDH – 530 ) y 635 nm (L DH – 63 5) ( Picoquant GbH, A lemania). Capítulo I. Ins trumen tación y metodología 73 El eq uipo emplea do pa ra llevar a cabo microscopía FL IM se empleó principal- mente el M icroTime 2 00 (Pi coQuant, G mbH, Ale mania ). (Figura I – 7A ), a unque algu- nos experime ntos fueron llevados a cabo en el Microscopio Abberior E xpert Line ( Ab- berior GmbH, Alemania) ( F igura I – 7B ). El MicroTime 2 00 no só lo es capaz de realizar imágenes FLIM, también p uede rea lizar experimentos de espectrosc opía de c orrela- ción de fluorescenc ia ( Fluorescence correlation sp ectroscp y , FCS) , espectroscopía de co- rrelación de tiemp o de vid a de fluorescenc ia ( Fluorescence lifetime correlation spect ros- copy , FLCS). Por lado el Microscopio Abberior Expert Line, permite emplear otra s t é c- nicas de microscopía en tie mpo re suelto como la microscopía d e imagen de tiempo de vida de f otoluminiscencia (Photolumi niscence Life time Imaging Micr osco py, PLIM) en la que se pueden llegar a dete ctar tiempos de vida del orden del ms, así como técnicas d e microsc opía de fluorescencia d e super resolución c omo STED. Figura I – 7. Fotog rafía de A) Micros copio MicroTime 200 y B) Micros copio Abbe rior Exper t Line. El MicroTi me 2 00 consta de cuatro parte s principales: microscopi o óptico Olympus IX71 , un si stema de excitación , la n idad ópti ca principal y u n sistema el ec- trónico de detecc ión y análi sis. El microsc opio Olympus IC71 es un microscop io ópti co invertido con un sis- tema óptico con corrección infinita. Está equipado con un sistema de lentes WHN 10x y un o bjetivo de inmersió n de aceite U – Plan – S – Apo – 100x con u na apertura n umérica de 1.4 . El sistema de excita ción lo compone n los mismos láser es pulsados de diodo descritos en el aparta do 3 , conectándose mediante una fibra al FluoTime 200 o al M i- croTime 200 en función de l as necesidad es experimen tales. El esquema de la unidad óptica principal se encuentra recogido en la Figura I – 8. La radiación procedente de la fuente de excitación ( flecha magenta) entra a tra vés Bloque A. Fluo róforos con t iemp os de vida largos . Estudio fot ofísico y aplicac iones. 74 de una f ibra a través de un conect or FC/ APC, atravies a un shutter de excitaci ón q ue se puede controlar de forma manual o desde el software y un p olarizador λ /4. Des- pués la ra diación alcanza u n espe jo dicro ico, coloca do con una geom etría d e 45 ° y seleccionado específica men te para ca da uno de los láseres empleados, de ta l forma que refleja hacia al microscopio la señal del láser, mientra s que deja pasar la ra diación procedente de la muestra. La radiación de la muestra se bifurca llegando a una cáma ra CCD que permi te m onitoriza r la imagen ge nerada por las lente s. La ra diación proce- dente de la emisión de la muestra (flecha amarilla ) atraviesa el dicroico y una rueda en la que se pueden instalar d iversos filtros para llegar a una lente. Tanto esta lenta como el desplaz ador situad o delante del dicorico se en carga n de enfocar la radiación para que atra viese el pinhole . Tr as el pinhole la ra diación pa sa por 2 torres cuyo o bje- tico es dirigir la excitación hacia el detector 1 o el 2 o h acia la entrada al espectrógrafo acoplado al micros copio y q ue permite obtener los espe ctr os de emis ión de la muestra localizada en el punto focal. Estas to rres también permi ten dividir la radiación al 50% hacia cada detector o hacia el espectrógra fo. Antes de los detectores se coloca n unos filtros para filtrar la re gión del espectro dónde queremos recoger la emisi ón. Final- me nte la señal a lcanza un os dete ctores de fotod iodos d e avala ncha (SPAD) Cómo podemos observar esta unidad óptica es muy versátil y nos permite dis- poner de con figura ciones personalizad as en función del experiment o que se va a rea- lizar. Figura I – 8 . Fot ografía y es quem a d e la unid ad ó ptica p rincipal. La f lecha magenta r epresent a a la radiac ión de la excit ación y l a amarilla la de la emisi ón. Finalmente, la obtención de lo s tiempos de vida y el análisis de la señal se lleva a ca bo mediante la unidad electró nica de detecc ión y análisis. E sta unidad utiliza un Capítulo I. Ins trumen tación y metodología 75 sistema de tiempo resuelto con etiquetado temporal ( Time – tagged Time-resolve d , TTTR), que se basa en los principios de TCSPC. La idea principal del siste ma TTTR es agregar un se gundo t iemp o de informaci ó n a cada tiempo TCS PC medido. Esta eti- queta se mide en una escala absoluta y represen ta el tiempo de llegada de cada fotón en relación al comie nzo del experiment o. De esta for ma el reloj mide el tiempo to tal del experime nto y se pe rmi te el co ntaje individu al de los fo tones ( Single phot on coun- ting , SPC) ( Figura I – 9 ). Este sistema permite adquirir cuentas más rá pidamente q ue con el siste ma TCSPC, lo que resulta indispen sab le pa ra poder implentarlo en técnica s de microscopía d e fluroesc encia. La resolución de este sistema es de 50 – 100 ns [198] . Una vez obten idos l os dato s el análisis de l os tiemp os de vida se lleva a ca bo de una forma similar al análisis de los decaimientos mediante la integral de deconvo- lución que se explic ó en el aparta do 3.2 . El MicroTime 200 permite obtener imáge nes de hasta 512 x 512 píxeles de resolución y pa ra obtener la imagen FLIM es necesario ajustar el dec aimiento de c ada uno de los píxele s. Par ello debem os tener en c uenta en primer lu gar, que el n úmer o d e foton e s recogidos en cada píxel es bastante inferior a las 20 000 cuentas que se r ecogían para una muestra en las técnicas espectroscópi cas en tiempo res uelt o, por lo q u e para obtener u n mayor número de fotones q ue per mi- tan un mejor aj uste de los decaimientos de fluoresce ncia se suelen aplicar agrupa- mientos tempora les y espa ciales. Figura I – 9 . Esquema del funcion amiento del s istema TTT R [198] . Bloque A. Fluo róforos con t iemp os de vida largos . Estudio fot ofísico y aplicac iones. 76 El agrupamien to temporal une varios ca nales del sistema TCSPC en un único canal,aumentan o a sí el número de fotones, mientras que el agrupamiento espacial une entre sí físicamente varios píxeles. En la Figura I – 1 0 podemos obseva r cómo al ir realizando agrupamie ntos de un mayor número de pí xeles se obtiene una me jor re - solución en la tra za de de caimiento d e fluorescenc ia, pero se va comprometiendo la resolución de la imagen. Al final, este ajuste se trata de encontrar un balance en el que se logre un ajuste fiable de los deca imientos sin que se comprometa en gran medida la resolución. Tras rea lizar el agrupamien to temporal y espacia l se re aliza un a juste del de- caimiento global de la ima gen y u na vez ajustado se r ealiz a este mismo anáisis para cada uno de los píxeles de la imagen, obteniend o finalmente la imagen FLIM . Figura I – 10. A) Agrupam iento espac ial r ealizad o sobre una imagen B) y C ) traza del decaimient o de fluo- rescencia de un pixel de la imagen , Capítulo I. Ins trumen tación y metodología 77 El tiempo de vida es un parámetr o cinético que no se ve mo dificad o por la acu- mulación prefer ente del fluorófor o en una determinada estructura, ni por la potencia de la fuente de excitaci ón, lo que nos permite solventar algunos de los proble mas q ue presentan las muestra s biológicas. Además, la microscopía FLIM no s permi te emplea r el filtrado m ediante ventana s temporales. Est as ventanas nos per mit en filtrar las imá- genes obteniendo sól o la i nf ormación de los fot ones q ue llegan a partid de un de ter- minado tie mpo. Esta técnic a resulta de especia l interés, ya que nos permite filtrar los tiempos de vida más bajos procedentes de interferencias biológicas como la autoflu- roescencia celular. Por lo que su empleo junto al de fluorófor os c on largo t iempo de vida pe rmite llevar a ca bo medida s en medi os bi ológicos libres de in terferencias ( Fi- gura I – 11 ) [143 , 144] . Figura I – 11 . Im ágenes de intens idad de flu roscencia de autofluro rescencia (sup erior) y de un a célula mar- cada con un fluorófo ro de tiempo de vida largo en l as que se muestra la ventana comple ta de detecci ón y con una vent ana dón de se ha aplic ado un filtr o temporal de 10 ns co mo se indic a en la gr áfica. CAPÍTULO II ESTUDIO FO TOFÍSICO D E ACRIDONAS EN MEDIO ACUO SO La gran variedad de fenómenos fotofísicos existente s dota a las técnicas fluorimétr icas de una gra n multidimen sional idad que nos perm ite conoc er co n gran s ensibilidad y p recisión el medio en el que se encuentr an los luminófo ros med iant e la m edida de d iferentes paráme tros fotofísicos. Entr e todos los lu minóforos existent es, aquello s con t iempos de v ida superiores a 5 ns d espiertan un gran inter és d ebido a la p osibilidad de ap licarlos en técnica s fluorimétri cas con v entana temp oral. U na de e stas fam ilias de luminóforos es la familia de las acridonas, cuyas excel entes p ropiedades f otofísicas la s convi erten en buenas candidatas para su aplicac ión como sondas intracel ulares de gran precisió n y sensi bilidad. 1. - An tecedentes. 1.1. - Acridonas Las acridonas son un tipo de alca loide derivado de la acridina, descubierta por C. Gra ebe y H. Ca ro e n 1 870 [205 , 206] . Fueron descritas por primera vez en 1948 tra s aislarse de la corteza de tres espe cies vege tales del gé nero Rutaceou s d e la flora aus- traliana: Melicope farea na, Evod ia xanth oxyloides y Acroni chia baueri [207] . Desde ento nces se han d escrito aproximad amente 270 alcaloides de la familia de las acridonas y de- bido a sus excele ntes pr opied ades fotofísicas se han si ntetizado un gran n úmero de derivados co n aplica ciones muy diversas [208] . Su estru ctura química está compue sta por una estruct ura cromofórica plana formada por 2 anillos bencén icos unidos por un heterociclo con un átomo d e nitrógeno en posici ón 1 0 y un gru po carbonilo en posi- ción 9 ( Figura I I – 1). Figura II – 1. Est ructura química gener al de la fam ilia de las acridonas . Las acridonas pr esentan un a emisión de f luorescencia genera lmente co mpren- dida entre 400 y 50 0 nm, lo q ue puede solapar co n la autofluorescencia pr esente en células y muestra s biológica s. Sin embargo, poseen tie mpos de vida superiore s a 10 ns, de hecho, la acridona t iene un tie mpo de vida de 1 4 ns en etanol, lo que permite su empleo med iante técnicas de fluorescencia de tiempo resuelto en las que tiene lu- gar un filtrad o temp oral de los fotone s. Además, poseen elevados rendimientos c u án- ticos (>0.5) y buena fotoestabilidad [209 , 210] ,lo que ha d ado lugar a que sean ampliamente utilizadas tanto en fluorimetría de estado estacionario como con resolu- ción temporal. Las acridonas pr esentan un a emisión de f luorescencia genera lmente co mpren- dida entre 400 y 50 0 nm, lo q ue puede solapar co n la autofluorescencia pr esente en células y muestra s biológica s. Sin embargo, poseen tie mpos de vida superiore s a 10 ns, de hecho, la acridona ti ene un tiempo de v ida de 14 ns en etano l, lo que permite su empleo med iante técnicas de fluorescencia de tiempo resuelto en las que tiene lu- gar un filtrad o temp oral de los fotone s. Además, poseen elevados rendimientos c u án- ticos (>0 .5) y b uena fotoest abilidad [209 , 210] , lo que ha d ado lugar a q ue sean amplia- mente utilizadas tanto en fluori metría de estado estacio nario como con re solución temporal. 1.2. - Principales a plicaciones de las acridona s. Los com puestos de la familia de las acridonas presentan aplicaciones muy d i- versas, debido tanto a sus magnífica s prop iedades fotofísicas como a su gran activi- dad biológica ( Figura II – 2 ). Figura II – 2. Es quema de l as principales p ropiedades de las a cridona s. 1.2.1 .- Aplica ciones mediante técnicas fluorimétrica s y microscopí a de fluorescen- cia. La estructura cromofórica tricíclica plana de las acridonas presenta un nitró- geno q ue actúa co mo ele ctrón d onan te y un grupo ca rbonilo c on ca rácter aceptor de electrones en el anillo centra l. De esta forma los electrones puede n deslocalizars e a En un sistema más co mple jo, con dos pK a s y tres especies prototrópica s estas ecuaciones queda n definida s por las Ecuaci ones II – 6 a II – 8: 𝛼 𝐴𝐻 2 = [𝐻 + ] 2 [ 𝐻 + ] 2 +𝐾 1 · [ 𝐻 + ] +𝐾 1 ·𝐾 2 (II – 6) 𝛼 𝐴𝐻 = 𝐾 1 ·[𝐻 + ] [ 𝐻 + ] 2 +𝐾 1 · [ 𝐻 + ] +𝐾 1 · 𝐾 2 (II – 7) 𝛼 𝐴 − = 𝐾 1 ·𝐾 2 [ 𝐻 + ] 2 +𝐾 1 · [ 𝐻 + ] +𝐾 1 · 𝐾 2 (II – 8) Por lo tant o, la absorbancia total a una determ inada lon gitud de onda ( A λ ) estará definida por la Ecuación II – 9 o la Ecuación II – 10 para aquellos sistemas con dos o tres especies prot otrópicas respectiva mente. 𝐴 𝜆 = 𝐶 𝑇 𝑏 (𝜀 𝐴𝐻 𝜆 10 − 𝑝𝐻 10 − 𝑝𝐻 + 10 − 𝑝𝐾 1 + 𝜀 𝐴 – 𝜆 10 −𝑝𝐾 1 10 − 𝑝𝐻 + 10 − 𝑝𝐾 1 ) (II – 9) 𝐴 𝜆 = 𝐶 𝑇 𝑏 (𝜀 𝐴𝐻 2 𝜆 10 −2· 𝑝𝐻 10 −2· 𝑝𝐻 + 10 − 𝑝𝐻 − 𝑝𝐾 1 + 10 − 𝑝𝐾 1 − 𝑝𝐾 2 + 𝜀 𝐴𝐻 𝜆 10 − 𝑝𝐻 −𝑝𝐾 1 10 −2· 𝑝𝐻 + 10 − 𝑝𝐻 − 𝑝𝐾 1 + 10 − 𝑝𝐾 1 − 𝑝𝐾 2 + 𝜀 𝐴 – 𝜆 10 −𝑝𝐾 1 − 𝑝𝐾 2 10 −2· 𝑝𝐻 + 10 − 𝑝𝐻 − 𝑝𝐾 1 + 10 − 𝑝𝐾 1 − 𝑝𝐾 2 ) (II – 10) De esta forma, qued an definidas las ecuaci ones que re lacionan la absorba ncia con los pK a s en el estado fu ndamental. La acridona 1 presenta dos grupos protonables: el ácido carboxílico del anillo y el N del heterociclo ce ntral. Ambos grupos se encuentran situados en la estruct ura plana de la acridona, por lo q ue su protonación o desprotonaci ón podría dar lugar a cambios en los espec tros de a bsorción y e misión de la molécul a. Por tanto, 1 podría prese ntar un equilibrio entre tres es pec ies prototrópica s ( Figu ra II – 7 ). La primera de ella s, la forma ácida, presentaría ambos grupos protonados, prese ntando el N una carg a po- sitiva a l esta r unido a do s á tomos de H. La f orma neut ra sería un z witerión dónd e el N permanecería protonado, pero el ácido carboxílico perdería un H, a dquiriendo carga negativa. Por últi mo, en medi o básico se produ ciría la desprotonación del N, quedando la molécula co n una c arga negativa debida a la carga nega tiva del ión car- boxilo. Otra posible opción podr ía ser la pr otonación e n el oxíge no del grup o ca rbo- nilo, aunque debido al d oble enlace de este grup o con la estructura plana de la acri- dona, pa rece más pr obable la protonación en el N, ya q ue posee un carácter menos ácido que el carbonilo . Figura II – 7 . Esquema del equi librio ácido-base en tre las d istintas fo rmas protot rópicas de 1. Para calcula r los pK a de 1 d e forma experimental, se pr epararon 26 disoluciones con va lores de pH compre ndidos entre – 0.22 y 13 .82, obteniéndose los espectros re- presentados en la Figu ra II – 8A . Como podemos observa r, debido a los cambios de pH se prod ucen cam bios significa tivos e n la for ma de los es pectros de absorción, de- bido a las dife rentes e species prototrópicas. A p H ácido pode mos ver u n má ximo a 403 nm muy estre cho, m ostra ndo el espectr o una serie de hombros e strechos corres- pondientes a la estructura fina vibra cional. El espec t ro se va ensa nchando confor me aumenta el pH como p odemos ver en el espectro de pH = 5.96 en el que el máximo se ha desplazad o hacia el azul y se encuentra a 395 nm. A pH básico se pr oduce otro cambio en la forma del espectro, como ya empeza mos a percibir a pH = 12.65, dicho cambio culmi na a pH = 13.82 dónde el máxi mo se ha de splazado a 415 nm y a parecen hombros a 39 8 y 44 0 nm. Para obtener l os pK a s se seleccionaron c inco l ongitud es de o nda en aq uellas re- giones donde los espectr os sufrían ca mbios más significativos con el pH y se re pre- sentaron los valores de absorba ncia f rente al pH ( Figura II – 8B ). Las curva s se ajusta- ron poster iormente de forma global mediante ajuste no lineal por mínimos cuadrad os a la Ecuaci ón II – 10 . De esta forma se obtuvieron d os pK a s para 1 en estado funda- mental: pK 1 = 3.74 ± 0. 10 y pK 2 = 12.30 ± 0.07. Como podemo s observar, debido a los valores de los pK a s, el compue sto 1 perma nece invari able en su forma neutra en un amplio in terval o de pH alrededor del pH fisiológ ico, lo que dificulta su empleo como sensor intracelu lar de pH. Figura II – 8 A) Espectros de absorción d e 1 a diferentes valores de pH y B) valores de absorbancia a 420 nm (morado), 4 25 nm (azul), 430 nm (ve rde), 435 nm (naranja) y 440 nm (r ojo) frente a pH y a juste por mínimos cu adrados emp leando l a Ec uación II – 10 (línea sólid a). La acridona 2 posee dos grupos protonables, al igual que la acridona 1 posee el N en posición 1 0 y, a demás, pr esenta un grupo amina en posici ón 1. Sin embargo, la cercanía del grupo amina con el grup o metoxilo result a en un impedime nto estérico que evita la formaci ón de p uentes de hidrógen o, hacie ndo a la molécula insoluble en agua. Las acridonas 3 , 4 y 5 únicamente difieren en el grupo R de la cadena sustituid a en el nitrógen o. La acr idona 5 , con un grupo fenil o presentaba una ba ja solubilida d en agua, por lo q ue no se re alizó con este compue sto el estudio en medio acu oso. Por tanto, se rea lizaron medidas de absorción de las acridonas 3 y 4 en medio acuoso con valores de pH comprend idos entre – 1 y 13.5, obteniéndose resultados pr ácticame nte idénticos para ambas a cridonas ( Figura II – 9 ). En el rango de pH compre ndidos entre 2 y 12 los espe ctros de a bsorción per- manecen práctica mente inv ariables observá ndose cambios única mente en v alores in- feriores a 0. A un valor de pH de aproximadamen te – 1 , la transición S 0 → S 1 prese nta un máxim o de a bsorción a 418 nm con va rios hombros deb idos a la estructura vibra- cional. Al aumentar el pH y alcanza r va lores positivo s apa rece una banda con dos máximos de absorción en 407 y 426 nm, manteniéndose constante la forma del espec- tro incluso a l alcanza valores elevados de pH. Estos cambios en la morfología de los espectros a pH ácido se deben a la protonación de la estructura cromofórica. El grupo hidroxilo de la acridona 3 también es un grupo proton able, pero se encuentra alej ado de la estructura cromofórica por lo q ue su proto nación no causa cambios en la absorbancia de la molécu la, observándose a todos l os valores de pH el mismo co m- portamiento que en 4 , que no presenta este grupo en su estructura. El valor de pK a de ambas acridonas se obtuvo representando los valores de absorbancia a las lo ngitudes de onda de 350,400, 4 05, 410, 42 0, 4 25, 440 y 450 nm y a justando los dat os gl obalmente a la Ecua ción II – 9 , obteniéndose u n va lor d e pK a de – 0.94 ± 0 .15 para 3 y de – 0.75 ± 0.08 para 4 . Figura II – 9 . Espectros de a bsor ción a diferentes valores de pH de l as a cridonas 3 (A) y 4 (B) y valores de absorbanc ia a 405 nm (morad o), 4 15 nm (azul), 420 nm (verde) , y 450 nm (rojo) frente a p H de 3 (C) y 4 (D) y ajuste por mínimos cuadr ados e mpleando la Ecuación II – 9 (línea sólida). Reproducido y adapt ado con permiso de M. C. Gonz alez – Garcia et al. [256] Copyright © 2 019 CC – BY. 3.1.2 .- Cálculo de los pK a s e n e stado excitado (pKa*) media nte esp ectroscopía de fluorescenci a. Los pK a s de un fluoróforo en el estado ex citado ( pK a s*) pueden diferir d e los que posee en el estado fundamental (pK a s) debido a los cambios pr oducidos por la s transiciones electró nicas entre los orbitales HOMO y L UMO, hecho que fue expuesto por Weber en 19 31 [8 , 9] . En 1950 Förster d escribió en el “ciclo de F örster” un méto do que permitía estimar el pK a * a partir del pK a y de los espectr os de emisi ón de la s es- pecies ácida y básica [ 2 , 9 , 12] . Este mét odo se descr ibe me diante la Ecuación II – 11, dónde T es la te mperatura expres ada en Kel vi n y 𝜈 𝐴 − y 𝜈 𝐴𝐻 son los números de onda de las especies bá sica y á cida respectiva mente. E l ciclo d e Förster a sume un eq uilibri o ter- modinámico entre los estados fundamental y excitado cara cteriza do por sus constan- tes de eq uilibrio K a y K a * respectiva mente, y asume e l mismo cambio de entr opía pa ra ambos equilibr ios ácido -ba se [9] . Por lo ta nto, este mét odo sólo obte nía los va lores de pK a * c orrectos en dete rmi nad as circ unstancias. Otr o método para obtener aproxi ma- ciones del pK a * fue el pr opuesto por Wel ler en 19 52 [257] . Sin embargo, el principa l problema que prese nta este método es que asume q ue el equilibrio se alcanz a en el estado excita do y que re qui ere q ue los tiempos de vida de las do s especie s pr ototró- picas sean idéntic os . 𝑝𝐾 𝑎 ∗ = 𝑝𝐾 𝑎 + 0. 625 𝑇 · ( 𝜈 𝐴 − − 𝜈 𝐴𝐻 ) ( II – 11) Los valores d e pK a * pueden depender del equilibrio ácido – base tanto en el es- tado fundamenta l c omo en el estado ex citado, por lo q ue pueden presentar difere n- cias cuantitativas significativas con respecto a los pK a , incluso de cuatro o cinco órde- nes de ma gnitud, [ 3 , 254] especialmente para fluoróforos con ca rácter de súper -f otoácido. Pa ra el cálculo de los pK a s* se empleó la Ecuaci ón II – 12 , que relaciona la intensidad de fluorescencia normaliza da por la a bsorbancia de la muestra a la longitud de onda de ex citación con las f racci ones molares de ca da una de las componentes ( α i ), sie ndo K una c onstante que depen de de las condiciones instr umentales y 𝜙 i el rend imiento cuántico d e cada una de las especies. Al normaliz ar la in tensida d de fluorescencia con la absorba ncia de la muestra no se tiene en cue nta el efecto del equilibrio ácido – base de la molécula en el estado fundamental, siend o el res ultado únicam ente debido al equilibrio en el estad o excita do. S ustituyendo α i por las ecuaciones corre spondientes ( Ecuacione s II – 4 a II – 8 ) se obtienen las e cua ciones cor respondientes para un sistema de dos especies ( Ecua ción I I – 13 ) y tres especies ( Ecuación II – 14 ), don de f i son factores proporcionales al r endimie nto cuántico de ca da especie. 𝐼 𝐴 𝜆 = 𝐾 · ∑ ( 𝜙 𝑖 · 𝛼 𝑖 ) 𝑖 (II – 12) 𝐼 𝐴 𝜆 = 𝑓 𝐴𝐻 10 − 𝑝𝐻 10 − 𝑝𝐻 + 10 − 𝑝𝐾 1 ∗ + 𝑓 𝐴 – 10 − 𝑝𝐾 1 ∗ 10 − 𝑝𝐻 + 10 − 𝑝𝐾 1 ∗ (II – 13) 𝐼 𝐴 𝜆 = 𝑓 𝐴𝐻 2 10 −2· 𝑝𝐻 10 −2· 𝑝𝐻 + 10 − 𝑝𝐻 − 𝑝𝐾 1 ∗ + 10 − 𝑝𝐾 1 ∗ − 𝑝𝐾 2 ∗ + 𝑓 𝐴𝐻 10 − 𝑝𝐻 − 𝑝𝐾 1 ∗ 10 −2· 𝑝𝐻 + 10 − 𝑝𝐻 − 𝑝𝐾 1 ∗ + 10 − 𝑝𝐾 1 ∗ − 𝑝𝐾 2 ∗ + 𝑓 𝐴 – 10 − 𝑝𝐾 1 ∗ − 𝑝𝐾 2 ∗ 10 −2· 𝑝𝐻 + 10 − 𝑝𝐻 − 𝑝𝐾 1 ∗ + 10 − 𝑝𝐾 1 ∗ − 𝑝𝐾 2 ∗ (II – 14) Se calcula ron los val ores de los pK a s * de 1 , 3 y 4 , para lo cua l, se obtuvieron en primer lugar los espectr os de emisión. L os espe ctros de emisión de 1 obtenidos a l a longitud de onda de exci tación de 400 nm se encuentran recogidos en la Figura II – 10 . En la f otografía de la Figura II – 10A pode mos observar una fluorescencia de color azul a pH = 0.58, la cual a umenta de intensidad a pH = 4 .65 y, a pH = 13.6 5, la fluorescencia que presenta ha cambiado a color verde y es la más intensa. Estos cambios que po de- mos observar de forma vis ual son el re sultado de cam b ios e n su espe ctro de em isión con el p H. Como pode mos observar en la Figura II – 10 B a pH = – 0.22 el espectro de emisión d e 1 pr esenta una intensida d muy baja, la cual va aumentando progres iva - mente (ha sta 1 6 veces más) da ndo lugar a un espectro con un máximo de emisión en 431 nm con un pequeñ o h ombro. Este espectr o se ma ntiene co nstante e n el rango d e pH fisiológic o llegando a observarse a pH = 11.48 la transición entre este espectro y el que la transición S 1 → S 0 presenta a va lores de pH superiores a 1 2 con una longitud de onda de emisión del máximo de 475 nm. Además, la especie básica que se forma pre- senta una intensida d de fluorescenc ia ba stante más eleva da (25 veces más con r es- pecto a la emisión a pH = 12.65 ) como podemos ob servar en los espe ctros recog idos en la Figura II – C. Tras la normaliza ción de los datos o btenidos con la absorbanc ia a la longitud de o nda de ex citación (400 nm) se ajustaro n a la Ecua ción II – 14 med iante ajuste no lineal p or mínim os cuadra dos, obteniénd ose unos valore s de pK 1 * = 1.70 ± 1.05 y de pK 2 * = 1 3.38 ± 0 .08. La compara ción de estos v alores con l os p K a s obtenid os para el estado f undamental, muestran que para el co mpuesto 1 a umenta el cará cter ácido de la especie protonada y a umenta el carácter básico de la especie básica en el estado excitad o. Empleando la Ecua ción II – 11 , del ciclo de Förster, los valores de pK 1 * y pK 2 * obtenidos f ueron de 2.7 8 y 1 3.86 respectivamente. Aun que las tendencias so n las mi- mas (aume ntan o dis minuyen c on respe cto a los del esta do fundame ntal) discrepa n lig eramen te en los valores obtenidos, ya que éstos se tratan de una mera aproximaci ón obtenida en fu nción de los re sultados espec trales del esta do fundame ntal. Figura II – 10 . A) Fotografía de 1 bajo luz ult ravioleta con valores de pH de 0.58, 4.65 y 13.65. Espectros de emisión (λ exc = 40 0 nm) de 1 con valores de p H comp rendid os entre – 0.22 y 12.65 (B) y entre 12.65 y 13.82 (C). Va lores de intens idad no rmalizados p or la abs orban cia a 400 nm frente a pH en las s iguientes longit u- des de ond a: 430 nm (m orado) y 440 nm (azul) (D) y 450 nm (verde) y 460 nm (rojo) ( D) y ajustes por mínimos cu adrados emp leando l a Ec uación II – 12 (líneas sól idas) El comp ortamiento espectr al de 3 y 4 en el esta do ex citado es muy si milar al del estado funda mental, en contránd ose un espectro d e emisi ón i nvariable a va lores de pH super iores a 2 en ambas acridonas, con un máximo de emisión centrado en 465 nm. A medida q ue el pH dismin uye, s urge u na nueva forma espectra l co n un máximo de emisión centrado en 490 nm y con un a banda secu ndaria de emisión a 530 nm ( Figura II – 11 ). Este cambio espectral se ve reflejado en el cambio de color de la acri- dona que pasa d e exh ibir u na lum iniscencia de c olor a zul a pH neutro y básic o a un color verde a pH ácido, al contrario q ue 1 . Figura II – 11 . A) Fotografí a de 3 baj o l uz ultravioleta con valores de pH comprend idos entre 1.15 y 13.39. Espectros de emisió n ( λ exc = 375 nm) de 3 (B) y 4 ( C) a difere ntes valores de pH. Valores de i ntensid ad normalizad os po r la abs orbancia a 375 nm f rente a pH de 3 ( D) y 4 (E ) a diferentes longitudes de onda: 460 nm (morad o), 470 nm (azul), 480 nm (cian), 500 nm (verde), 520 nm (naranja) y 550 nm (rojo) y ajuste por mínimos cuad rados empleand o la Ecuación II – 12 (líneas sólidas). Reproducido y adaptado co n permiso de M. C. Go nzalez – G arcia et al. [256] Copyright © 20 19 CC – BY Además, se calculó el pK 1 * para 3 y 4 ajustando la Ecuación II – 14 por mínimos cuadrad os, obtenié ndose v alores de 0.91 ± 0.08 y de 1.04 ± 0.04, respectiva mente, por lo q ue aumentan con respec to a los pK a obtenidos en el estado fundamental, s ugi- riendo que la forma básic a es más f uerte e n el esta do ex citado, dejand o un á ci do conjugado co n un cará cter más débil que en el estado fundamental y, siend o, por lo tanto unos de los p ocos ejemplo s de compuesto s fotobá sicos, los cua les han sid o re- cientemente propuesto s como candida tos potenciales de expe rimentos de salto de pH impulsados p or la luz [258] . Los valores de los p K a y pK a * obtenidos para 1 , 3 y 4 se recogen a continuaci ón en la Tabla II – 1 . La s dife rencias en los valores de pK a entre los estado s fundamen tal y excitado que presentan e stas acridonas abr en la posibilidad de q ue tengan lugar dinámicas en el estado excitado, en concreto, reacciones de transferencia protó nica en estado excitado (E SPT, por excit ed-state p roton transfer ). Tabla II – 1. Valores d e los p K a y pK a * calculados p ara las d iferentes acridonas estud iadas en e l estado fundamenta l y excitad o Acridona Estado fundamental Estado excitado pK 1 pK 2 pK 1 * pK 2 * 1 3.75 ± 0.10 12.30 ± 0.07 1.70 ± 1.05 13.38 ± 0.08 3 – 0.94 ± 0.15 – 0.91 ± 0.08 – 4 – 0.75 ± 0.08 – 1.04 ± 0.04 – 3.2. -Dinámica s del estado excitado: ESPT y fo rmación de excíme ros La fluorimetría con re solución temporal es una de las téc nicas más a decuada s para estudia r y caracteriz ar dinámicas en el es tado exc itado, ya que las trazas de in- tensidad de fluorescenc ia c ontienen implícita mente la i nformación cinét ica de los pro- cesos de desactiva ción tanto ra diativos como no radiativos, as í como de re accion es que af ectan a la población de moléculas l uminiscentes en el estado excita do. La a cridona 1 , si bien puede presentar ESPT, no se inc luyó en este es tudio de- bido fu ndamental mente a que se trata de u na mez cla d e dos c ompuesto s, u no con el ácido ca rboxílico en posició n 1 y otr o en posición 3. P or lo ta nto, este estudio s ólo se aplicó a las a cridonas N – su stituidas 3 y 4 . En primer lugar, nos enfocamos en el ra ngo de pH en los que pue de tener luga r la rea cción (en torn o a los v alores de los p K a y pK a *) y se recogieron las tra zas de los decaimientos de fluorescen cia a varias longitudes de onda a lo largo del espectro de emisión para obte ner un a juste global de los d ecai mientos c on más precisión p ara cada va lor de pH. Una rea cción ES PT si mple inv olucra únicamen te a dos es pec ies prototrópicas e n eq uilibrio con un decaim iento d e flu oresce ncia biexp onencial corres- pondiente a dos tiempos de vida de fluorescencia [259] . Sin embargo, a valores de pH inferiores a 2.5 se obtuv ieron tre s co mponentes tanto para 3 como para 4 ( Figura II – 12 ). En este ra ngo el tiempo de vida más corto varía entre 0.27 y 0.68 ns y presen ta una componen te negativa a largas longitudes de o nda tal y cómo podemos observ ar en la Figura II – 13 . La pres encia de preexponenciales negativos es una ca racterística única d e las dinámicas en estado excitado, que indican que en el estado excita do la reacción que tiene lugar da como resultado un producto con una mayor intensid ad de emisión que la especie inicial a determinadas longitudes de on da. Por otro lado, el tiempo de vida intermedi o disminuye d esde 1.75 a 0 .83 ns en el rango de pH en tre – 1 y 2 .5, mientras que el tiempo de vida la rgo varía entr e 22.3 6 a 17.41 ns con una transición cercana al valor del pK a * , tal y c ómo se espe ra de una rea cción ESPT. Figura II – 12 . T iempos de vi da obtenid os a diferentes va lores d e pH d e 3 (A) y 4 (B) . R epr oducido y a datad o con permiso de M. C. Gonzalez – G arcia et al . [2 56] Copy right © 20 19 CC – BY A continuación, se realizaron espectro s de emisión en tiempo resuelto ( Time- resolved emiss ion espectra , T RES) de 3 a tre s valores diferentes de pH: 0.82 , 6.15 y 13.45 y se obtuvieron tamb ién l os espe ctros de e misión d e s us especie s a sociada s ( Sp ecies – associated Emission Sp ectra , SA EMS). Los TRES muestran la transfor mación de las es- pecies emisiva s inic iales en otras c on un hombro centr ado a ma yores long itudes de onda ( Figura II – 14A ). A demás, el análisis de lo s SA EMS cuando hay inv olucrad as reacciones e n el estado excit ado no s puede propor cionar información a cerca de cuáles son las espec ies iniciales y cua les las que se forman d espués, así como obtener el es- pectro d e emisión d e ca da una de ellas. E n es te caso, los tres SAEM S obtenidos mos- traron una dinámica co mpleja ( Figura I I – 14B ). A pH = 0 .82 la especie excita da inicial emite en la región azul del espectro, con un máxi mo centrado en 440 nm, y m uestra una transfor mación a una segunda especie con una em isión desplaz ada hacia el rojo (sección negativa de las especies en descomposició n). La es pecie asociada con el tiempo de vida i ntermedio también exhi be una re gión negativa despla zada al rojo, indicando la formación de nuevas especies emis ivas con una mayor inte nsidad de fluorescencia en esa región d el espectro q ue la especie inicial. Este homb ro de emisión Estos graf os p odemos transformarlos en gra fos ve rdadero s in tr oduciendo un vértice en el ce ntro d e ca da arista [ 261] ( vértices de color amarillo d e la Figura II – 19 ). En estos gra fos verd aderos com pletos, los gra dos de los vértices coi nciden co n las valencias de los át omos a l os que representan. Así, l os vértices q ue re presentan áto- mos de ca rbono (negros) presentan grado 4, los vértices correspondientes al nitrógeno (rojo) tienen grado 3, los vértices azules correspo ndientes a átomos de oxígeno 2 y los vértices que representan los hidrógenos tienen grado 1. Po r otro lado, todos los vér ti- ces q ue hemos introd ucido pa ra convertir un mu ltigraf o en un gra fo (vértices ama ri- llos de la Figura II – 19 ) tienen grado 2. Sin emba rgo, en este tipo de grafos encontra- mos un problema, el gran núm er o de vértices que presentan. Los com puestos A cr – OMe , 3 , 4 y 5 presentan 65, 85 , 91 y 111 vértices respectivamente. Debido a este e le- vado número de vé rtices resulta muy difícil trabajar con las matrice s completa s de estos gra fos. Sin embarg o, existen progra mas de química computacio nal capa ces de trabajar con moléculas de este tamaño e incluso de tamaños mucho mayores para rea- lizar cá lculos teóricos a partir de sus estructuras. Figura II – 19 . G rafos verdader os completos de los compues tos estudiados. En neg ro s e representan los á to- mos de cabono, en azul l os de oxígeno, en rojo los de n itrógeno y en verde los de hid rógeno. En amarill o los vértices i ntroducidos p ara con vertir los multigrafos e n graf os. Con el fin de facili tar el tra bajo con estos graf os pued en rea lizarse sobre el los distintas simplificaciones. La más empleada es la supre sión de los átomos de H, o bte- niéndose así l os gra fos H- suprimid os al elimi nar los vértices corresp ondientes a los átomos de H correspondientes a lo s átomos d e H y las aristas que los une n co n los demás vértices [263] ( Figura II – 20 ) Figura II – 20 . Grafos H – sup rimidos de las acridonas estudiadas. En negro se representan los á tom os de cabono, e n azul los d e oxígeno y e n rojo los de nitróge no. Los gra fos H-supr imidos se tra tan de un subgra fo de los m ultigrafos de la Fi- gura II – 18 . Al igual que h icimos previamen te para obtener lo s grafos de la Figura II – 19 , también podem os conv ertir estos multigra fos en gra fos añadiendo un vértice en medio de cada una de las aristas. Emplea ndo estos subgraf os ya hemos obtenid o una notable red ucción en el nú mero de vér tices, siendo en el caso de los subgrafos H - suprimidos que se puede n obterner a partir de la Figura II – 19 de 43, 51, 53 y 67 vérti- ces pa ra los co mpuestos A cr – OMe , 3 , 4 y 5 re spectivamente y de 1 7, 21, 2 2 y 2 8 en el caso de los grafos H- suprimidos obte nidos a partir de la Figura II – 20 . Otra simplifica ción es la eliminaci ón de la s aristas que re presentan los enlaces dobles en la m olécula, ya que se encuentra n desl ocaliz ados en la estruc tura pla na de la molécula y, por lo tanto, simplemente representan arist as con propied ades diferen- tes. De esta forma los multigrafos de la Figura II – 20 se tra nsformarían en grafos al perder las a ristas correspondiente s a los dobles enlac es. En la Figura II – 21 se mues- tran los sub grafos resul tantes d e la elim inación de l os d oble s e nlaces y l os hidró ge- nos. Además de esta s dos simplificacione s que hemos real izad o, existen otras con las que a ún se pue de reducir más el número de vértices. Una de ellas son los gra fos de Kekulé. Los grafos de Kekulé se pue den realizar con hidrocarburos conju gados insaturados en los q ue tod os l os carb onos t ienen h ibr idación sp 2 , un ejempl o es el naftaleno, cuyas tres estructuras resonantes son estruct uras de Kekulé ( Figu ra II – 22 ). L os gr a fo s d e K e k ul é s e o bt ie n en r ep res e n t an do ú ni cam e n t e l o s do b l es en l a ce s d e l a s e s - t r uc tu r as , t ra t án dos e d e g r a fo s d es c on ex os co m p u es t o s p o r c om po n en te s K 2 [ 263 ] . Figura II – 21 . Subgrafos obtenidos me diante la eliminación de átomos de H y dobles enlaces para las acri- donas estudiadas. En negro se represent an los átomos de carbono, en azul los de oxígeno y en rojo los de nitrógeno. Figura II – 22 . Est ructuras resonant es y grafos de Kekulé de l naftalen o [263] En las 2 -met oxiacridonas e ncontramo s u na estruc t ura similar en los tre s cicl os aromáticos q ue presenta. A unque no se tra ta de una estructura de Kekulé con exa cti- tud, ya que presenta un heteroá tomo en el anillo centra l y pr esenta distintos sust itu- yentes. Sin e mbargo, debid o a la aromaticidad del co mpues to pode mos represe ntar los tres anillos aromáticos com o grafos de Kekulé. En la Figura II – 23 podemos obser- var las estructuras de K ekulé y lo s correspondientes gra fos de las cuatro formas re so- nantes de los a nillos aromáticos de las 2 -metox iacrido nas. Figura II – 23 . Estructuras resonan tes y g rafos de Kekulé de los anillos aromát icos de las ac ridonas estu dia- das. En neg ro se represen tan los át omos de ca rbono y en rojo los de n itrógeno. El mayor númer o de vértice s de los grafos de las acridonas se encuentr an con- tenidos en sus anillos aromáticos, por lo que otra sim plifica ción que podemos rea lizar y que dis minuye e n gran medida el númer o de vértices es la de re prese ntar po r un único vértice cad a uno de los anillos a romáticos [ 262 , 274] . E ste tipo de simplificación se realiza normalmente co n estructura s f ormadas por an illos d e benceno condensa dos como es el caso del nafta le no y otras estructura s simil ares con un mayor número de ciclos. En las acridonas se puede realizar también esta simplificación, aunque la natu- raleza química del anillo aromátic o central sea d iferente por la presencia del nitró- geno. Aplicando esta reducci ón además de la supresión de hidrógenos y dobles enla- ces obtendríamos los grafos de la Figura II – 24 . Como podemos ob servar, el número de vértices disminuye en gr an medida , siendo de 6 , 10, 11 y 12 para los Acr – OMe , 3 , 4 y 5 respectivamente, quedando, por tanto, m uy lej os del número de vértices d el grafo completo, que alcanz aba n la cifra de 111 en el compuesto estudiado de mayor tamaño. Figura II – 24 . Grafos de las acridonas estudiad as o btenidos mediante la r edu cción de anillos aromáticos y la supresión de dobles en laces y át omos de H. Estos último s grafos d e la Fi gura II – 24 se den ominan á rboles, ya q ue cada dos vértices distintos se con ecta n por un único camino sim ple. Además, son grafos bipar- titos ya que pue den dividir se en dos grupos de forma que vértices del mismo grupo no estén relacio nados entre sí [ 261] . Aunque con estas técnica s se logró reducir en g ran medida el númer o de vértic es de un grafo químico n o deb emos olvidar q ue con ca da una de ellas perdemos información estructura l de la misma, por lo que debe tenerse en cuenta a la hora de ca lcular los índices top ológicos a pa rtir de estos graf os. 3 .3.1.2. - Matrices y cálculo d e índices topológ icos de 2 - metoxi- 9-acridonas N – sustituidas A continuación, se desarroll aron las matrices y se llevó a cabo el cá lculo de dis - tintos índices to p ológicos, para lo cua l emplearemos los grafos indicados en la Figu ra II – 24 . La num eraci ón de los vértices se indica en la Figu ra II – 25 para el compuesto 5 , ya que los demás co mpuest os p ueden e ntenderse co mo subgrafo s de éste. Figura II – 25 . Graf o simplifi cado de 5 con los vért ices numerados. En negro se representan los átomos de cabono, e n azul los d e oxígeno y e n magenta los anillos aromáticos. La presencia de heteroátom os y enlaces aromáticos requiere un tratam iento es- pecial. Ca da vértice estará dete rminado por un pa rám etro (peso) que dependerá de su naturaleza química, V w , del mismo modo las aristas también tendrán asociados un parámetro, E w , en funci ón de los vé rtices de sus extre mos y del tipo de enlace. E stos parámetros están def inidos por las Ecuaciones II – 15 y II – 16 donde Z w es el nú mero atómico y b es el orde n de enlace, que toma el valor 1 pa ra enlaces simples, 2 para enlaces dobles, 3 pa ra los triples y 1 .5 en e l caso de enl aces a romáticos [263 , 275] 𝑉 𝑤 = 1 − 6 𝑍 𝑤 ⁄ (II – 15) 𝐸 𝑤 = 36 𝑏𝑍 𝑖 𝑍 𝑗 ⁄ (II – 16) Estos pará metros tiene n en cuenta el númer o atómico y el tip o de en lace, pero también pueden calcula rse V w y E w en función de o tros parámetros como la electrone- gatividad o el ra dio. E n la Tabla II – 2 apa recen reflejados lo s va lores de V w para cada vértice del grafo. Para los v értices 1, 2, 3 y 12 se ha calculado como 𝑉 𝑤 = ∑ 𝑉 𝑖 𝑖 es decir, como la sum a de todos los V w de lo s vértices que com ponen el anillo aromático al que representan est os vértices. La m atriz de adyacencia es una de las matrice s asoci ada a un grafo. Es una matriz cuad rada q ue representa los nod os del graf o. El element o A i,j de la matriz es 0 si el vértice i no está conectado con el vértice j o si i = j , y el elemento A i,j toma el valor 1 si existe un a arista que conecte el vértice i con el vérti ce j . Esta matriz ( Expresión II – 17) definiría la matriz de adyacencia de este gra fo si todo s sus vértices fuesen ig uales o no tuviéra mos en c uenta las difere ncias entre ell os. Sin embarg o, al tratarse de una molécula con heteroátomos, la ma triz de adya cencia estaría compuesta por los ele- mentos descr itos en la Expr esión II – 18 [263] , de tal forma que si i es igual a j e ntonces el va lor d el ele mento A i ,j será V w , si i y j no son i guales y existe una arista que conecte ambos vértice s tomará el valor de E w y si n o son iguales y no existe u na a rista que los conecte tomará el valor 0. Tabla II – 2. Valo res de V x pa ra cada vért ice del g rafo Número de vértice V w 1 6 2 5.14 3 6 4 0.25 5 1 6 0.25 7 1 8 1 9 1 10 0.25 11 1 12 6 (II – 17) (II – 18) De este modo, en la Figura II – 26 se d escribe n las matri ces de adyacencia A(G ) de Acr – OMe , 3 , 4 y 5. Figura II – 26 . Ma trices de adyacencia de Acr – OMe, 3 , 4 y 5 De la matriz de adyacencia se deriva la matriz χ ( G) que se ob tiene asigna ndo el va lor ( 𝑑𝑒𝑔 𝑖 𝑑𝑒𝑔 𝑗 ) −1/2 a l elemento de la ma triz corr espondiente a la a rista e ij y el valor 0 al resto de elementos de la matriz, siendo deg i y deg j el grado de los vértices i y j [263] . Por lo tanto, la matriz correspondiente a 5 estaría definida por la matriz χ 5 de la Figura II – 27. Ademá s de estas matrices, otra matriz que podemos establecer es la matriz Lapla ciana, L(G ) , en la que el element o e ij d onde i=j está definido p or el gr ado del vértice correspondiente y el elemento e ij con i≠j o btiene el valor -1 si pertenece a G y 0 si no pertenece a G [263] . La ma triz L 5 correspondiente a la a cridona 5 se re coge en la Figura II – 27. Figura II – 27 . Ma trices χ 5 y L 5 descrit as para la acr idona 5. La ma triz de distancia, D(G), es una matriz simétrica , y está def inida por d ij si i≠j y por 0 si i=j, siendo d ij la distancia d el vértice i al vé rtice j . En la Figura II – 28 se recoge la matriz D 5 . A pa rtir de la ma triz de distancia p o demos esta blecer la sec uencia del gra do de distancia ( distance degree sequence , D DS) y la suma de las distancias del vértice i (DS). La DDS es una secuencia h i0 , h i1, …, h ik donde h ij es el número de vértices que se encuentran a la dista ncia j del vértice i . E n esta secuencia h i0 = 1 y h i1 es el grado del vértice. A continuació n, se describen la DDS de cada vértice de 5 ( Tabla II – 3 ). Por otro lado, la DS es la suma de la distancia de ca da uno de los vértices al vértice i ( Tabl a II – 3 ) Figura II – 28 . Ma triz distanc ia D 5 de la acridona 5 Otra matriz que podemos def inir es la matriz de adyacencia de aristas E(G) . Se trata de una matriz de adyacencia formada a partir de las arista s del grafo [263 , 267] . A partir de ellas se puede construir un grafo donde cada vértice es una de las aristas del grafo inicial y, a partir de é ste, se construye E( G), ta l y como se muestra en la Fig ura II – 29 . Sin embargo, en esta matriz só lo tenemos en cue nta la estructura de lo s enlaces moleculares, no su naturale za química. Tabla II – 3. DDS y DS de los vér tices correspondientes a la mat riz D5 Número de vértice DDS DS 1 (1, 1, 3, 2, 2, 1, 1, 1) 39 2 (1, 4, 2, 2, 1, 1, 1) 29 3 (1, 2, 4, 1, 1, 1, 1, 1) 35 4 (1, 2, 1, 3, 1, 1, 1, 1, 1) 43 5 (1, 1, 1. 1, 3, 1, 1, 1, 1, 1) 53 6 (1, 1, 3, 2, 2, 1, 1, 1) 39 7 (1, 2, 4, 2, 2, 1) 29 8 (1, 2, 2, 4, 2, 1) 31 9 (1, 2, 2, 2, 3, 1, 1) 35 10 (1, 2, 2, 1, 1, 3, 1, 1) 41 11 (1, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 1, 1) 47 12 (1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 1, 1) 59 Figura II – 29 . C onstrucci ón del gra fo E(G) 5 de 5 . La m atriz E(G) nos permite calcular lo s momentos espectrales ( µ k ) a partir de la Ecuación II – 20 , donde el mo mento espectral está d ef inido p or la tra za de la matriz E(G) elevada a k , donde k es el orden del momento espectral y tr la traza de la m atriz, que se ca lcula con la suma de los eleme ntos de la diagonal principal . 𝜇 𝑘 = 𝑡𝑟 ( 𝐸 𝑘 ) (II – 19) Para tener en cuenta la nat uralez a química de los enl aces una a proximación que se puede realizar es la introducció n de las d istanci as de enlace de cada arista en la diagonal principa l de la matriz [276] . En la Figura II – 30 podemos observa r las matri- ces E (G) d e los compuestos estudia dos. En las aristas a y b se consideró 0 la distancia de enlace a l trat arse de anillos aromáticos fu sionados. Figura II – 30 . Ma trices E(G) de Acr – OM e , 3 , 4 y 5 dónde se t ienen en cuenta las d istancias de los enl aces. A continuación, en la Tabl a II – 4 se encuentran calculados los tres primeros momentos espectra les de cada uno de los compuestos estudia dos. Los cálculos de las matrices E(G) elevadas al c uadra do y al cubo se han realiza do a tra vés de Mathcad 14 . Tabla II – 4 . Resultad o del cálcu lo de los tres p rimeros mome ntos es pectrales de las acridon as estud iadas. Momento espectral Acr – OMe 3 4 5 µ 1 4.01 9.99 11.42 12.78 µ 2 15.383 34.33 36.38 42.23 µ 3 33.02 88.43 91.02 110.82 Asociado a ca da una de las matrices descr itas previamente se encuentran sus polinomios cara cterísticos, que se describen mediante la Ecua ción II – 20 , donde p x es el polinomio ca racte rístico de la matriz A y don de I es la matriz de identidad d el mismo orden que la matriz A [262 , 263 , 266] . A modo de ejemplo, la Ecuación II – 21 es el polinomio caracte rístico de la matriz de adyacencia A 5 del compuesto 5 d escrita en la Figura II – 26 calculado emp leando WMáxim a . 𝑝 𝑥 = | 𝐴 − 𝑥𝐼 | (II – 20) 𝑝 4 = 𝑥 12 − 28 . 89 𝑥 11 + 343 . 73 𝑥 10 − 2162 . 59 𝑥 9 + 7652 . 88 𝑥 8 − 14730 . 45 𝑥 7 + 12404 . 02 𝑥 6 + 2264 . 41 𝑥 5 − 10247 .7𝑥 4 + 3831 . 84 𝑥 3 + 967 .2𝑥 2 − 209 . 54 𝑥 − 27 . 38 (II – 21) Como podemos observar el grado del polinomio es el mismo que el número de filas y columnas de la matriz y n úmero de vértices de G, por lo que cuanto mayor sea el número de vértices del gra fo mayor será la compleji dad de los polinomios caracte- rísticos de sus matrices. El cálculo de los pol inomios car acterísticos permite establecer una re lación con algunos pará metros fisicoquímicos. Por ejemplo, se emplea n en el cálculo de orbitale s molecu lares de Hückel [270] . Para poder comparar las propiedades de distintos compue stos en búsq ueda de candidatos con propiedad es similares o actividades farmacológicas parecidas es muy útil el empleo de los índice s topológicos [262 , 263 , 266] . Hay muchos ín dices topol ógicos descritos que aportan informacione s diferentes de forma n umérica, pero en esta Tesis Doctoral nos centramos en los más empleados. Uno de ellos, el momento espectral ya se ca lculó previame nte. E l moment o espectra l más emplea do es el que se ca lcula a partir de la matriz de ad yacencia de aristas, E( G). En cuanto al calculad o a partir d e la matriz de adyace ncia d e vértice s pa rece haber más c ontroversia en tre los distint os autores [276] . 𝜎 2 = 𝑆 2 · ( 𝑆 3 + 𝑘 01 ) + 𝑘 21 · ( 𝑆 3 + 𝑘 02 ) + 𝑘 32 · [ 𝐻 + ] · ( 𝑆 1 + 𝑘 03 ) (II – 39) 𝜎 3 = −𝑘 01 · 𝑆 2 · 𝑆 3 − 𝑘 21 · 𝑘 02 · 𝑆 3 − 𝑘 03 · 𝑆 1 · 𝑘 32 · [ 𝐻 + ] (II – 40) 𝐾 1 ∗ = 𝑘 23 𝑘 32 ⁄ (II – 41) El primer paso fue analizar el sistema a n iveles muy bajos de pH. En este límite, empleando varios valores d e tiempos de vida a diferentes pH y co mbinando las Ec ua- ciones II – 32 a II – 41 se obtuvo un sis tema compues to p or d os ecua ciones ( II – 42 y II – 43 ) con dos incógni tas (S 1 y k 03 ) dónde σ 1, a , σ 2,a y σ 3,a son los valores de los factores σ 1 , σ 2 y σ 3 cua ndo el pH = a y σ 1, b , σ 2,b y σ 3,b son los respectivos va lores al valor b de pH 𝑆 1 + 𝑘 03 = 𝜎 2,𝑎 −𝜎 2,𝑏 𝜎 1 ,𝑏 −𝜎 1,𝑎 (II – 42) 𝑆 1 · 𝑘 03 = 𝜎 3,𝑎 −𝜎 3,𝑏 𝜎 1,𝑎 −𝜎 1,𝑏 (II – 43) Por tant o, d espejando S 1 en la Ecuaci ón II – 42 se obtiene la Ecuación II – 44 , la cual podem os sustituir e n la Ecuaci ón II – 43 obte niendo la Ecuación I I – 4 5, Por lo tanto, k 03 será so lución de l a Expresión II – 46 . 𝑆 1 = 𝜎 2,𝑎 −𝜎 2,𝑏 𝜎 1,𝑏 −𝜎 1,𝑎 − 𝑘 03 (II – 44) 𝑘 03 · ( 𝜎 2,𝑎 −𝜎 2 ,𝑏 𝜎 1,𝑏 −𝜎 1,𝑎 − 𝑘 03 ) = 𝜎 3,𝑎 −𝜎 3,𝑏 𝜎 1,𝑎 −𝜎 1,𝑏 ⇒ ⇒ 𝑘 03 2 − 𝑘 03 · ( 𝜎 2,𝑎 −𝜎 2,𝑏 𝜎 1,𝑏 −𝜎 1,𝑎 ) + 𝜎 3,𝑎 −𝜎 3,𝑏 𝜎 1,𝑎 −𝜎 1,𝑏 = 0 (II – 45) 𝑘 03 = 𝜎 2,𝑎 −𝜎 2 ,𝑏 𝜎 1,𝑏 −𝜎 1,𝑎 ± √ ( 𝜎 2,𝑎 −𝜎 2,𝑏 𝜎 1,𝑏 −𝜎 1,𝑎 ) 2 − 4 ·( 𝜎 3,𝑎 −𝜎 3 ,𝑏 𝜎 1,𝑎 −𝜎 1 ,𝑏 ) 2 (II – 46) De esta forma, mediante la Ecuación II – 46 y empleando los factores σ i corres- pondientes a los tiempos de vida de la acridona 3 con valores de pH inferiores a 2. Se obtuvo un valor de k 03 = 0 .044 ns – 1 , correspondie nte a un a de las soluciones de la Ecua- ción II – 46 (la otra solución obtenida para k 03 se descart ó por genera r valores de cons- tantes cinéticas negativas , lo cual carece de sentido f otofísic o) y tambié n se obtuv o un valor de S 1 = 0 .570 ns – 1 . Después, nos centra mos en la re gión de pH con valores entre 3 y 11 . En este rango el sistema sólo pre senta dos espec ies: la especie neutra y el excí- mero; pasa ndo de un sistema tricompartime ntal a un sistema bicompartime ntal más sencillo descrito por el esquema fotocinético de la Figura II – 34 , ya que en este ra ngo el pH es lo suficienteme nte alto como pa ra que la acridona no se e ncuentre en su forma ácida y lo suficie ntemente ba jo com o para que no se produzca el quenching por iones OH – . Figura II – 34 . S istema ci nético bic ompartime ntal de l as 2 – metoxi – 9 – acrid onas N – sus tituidas estu diadas en medio a cuoso, a va lores de pH entre 3 y 11. Las diferentes esp ecies presentes son ex címero (1) y fo rma neutra (2). El sistema cinético conside ra los procesos de formación y disociación del excíme ro (k 12 y k 21 ) y las c onstantes de des activación radiativa k 01 y k 02 . N o se encontraron evidencias experiment ales para l a formación del dí mer o en el estad o fund amental, por lo que la línea correspon diente se represent a en azul y con líne a discontinu a. En el ca so del sistema bico mpartimental descrit o en l a Figura II – 34 , la matriz A estará definida por la Expresión I I – 47 , por lo que su polinomio característico estará definido p or la Ecuación II – 48 quedando los fa ctores σ i def inidos p or la s Ecuaciones II – 49 y II – 50, dónde S 1 y S 2 estarán, al igual que en sistema tricompartimenta l, def ini- das por las Ecuacione s II – 51 y II – 52 . 𝐴 = ( − ( 𝑘 01 + 𝑘 21 ) 𝑘 12 𝑘 21 − ( 𝑘 02 + 𝑘 12 ) ) = ( −𝑆 1 𝑘 12 𝑘 21 −𝑆 2 ) (II – 47) 𝛾 2 + ( 𝑆 2 + 𝑆 1 ) · 𝛾 + 𝑆 2 · 𝑆 1 − 𝑘 12 · 𝑘 21 = 0 (II – 48) 𝜎 1 = 𝛾 1 + 𝛾 2 = − 𝑆 1 − 𝑆 2 (II – 49) 𝜎 2 = 𝛾 1 · 𝛾 2 = 𝑆 1 · 𝑆 2 − 𝑘 12 · 𝑘 21 (II – 50) 𝑆 1 = 𝑘 01 + 𝑘 21 (II – 51) 𝑆 2 = 𝑘 02 + 𝑘 12 (II – 52) Este model o bicompartime ntal pr edice los dos val ores de tiempos d e vida in- dependiente del pH observados experimentalmente. Sin embargo, ha y cuatro co ns- tantes difere ntes y s olo d os a utovalores por l o que el sistema no puede ser determi- nado inequívocame nte. Se procedió es tablec iendo un supuesto valor inicial, de modo que k 21 se d efinió automátic amente a tra vés de S 1 y se emplearon los tiempo s de vida obtenidos experimentalme nte para determinar k 02 y k 12 . Con estas con jeturas sobre las constantes de velocida d nos desplaz amos d e nuev o al modelo tric ompartimen tal de la región ácida y se emplear on los valores obtenidos para estimar k 23 y k 32 empleando las Ecuacione s II – 38 y II – 41 . Con los nuev os valores de k 02 , k 12 , k 23 y k 32 se obtuvo una nueva conj etura a cerca del valor de k 01 (y por t anto, de la k 21 linealmente depen diente) repitiéndose el proceso de forma itera tiva hasta obt ener va lores con sistentes para todas las co nsta ntes de ve- locidad tal y como se muest ra en el esq uema de la Fi gura II – 35 . Figura II – 35 . Proceso de ajuste iter ativo realizado p ara obtener to das las constant es cinétic as de velocid ad del comportamien to dinámico de 3 en el estado excita do en diso lución acuosa. Rep roducido y adapta do con permiso de M. C. Gonzalez – Ga rcia et al. [256] Copyright © 2019 CC – BY. Por último, no s despla zam os a la reg ión con val ores de pH super iores a 1 1, dónde se pr oduce el proceso de quenching por iones O H – pa ra obtener el va lor de k q . Para esta región de pH la matriz del sistema bicompartimental está definida por la Expresión II – 53 y, por tant o, estando los aut ovalores def inidos por la Expresión II – 54 [29] . 𝐴 = ( − ( 𝑘 01 + 𝑘 21 ) 𝑘 12 𝑘 21 −(𝑘 02 + 𝑘 12 + 𝑘 𝑞 · [ 𝑂𝐻 − ] ) ) (II – 53) 𝛾 = −𝑆 1 −𝑆 2 − 𝑘 𝑞 [ 𝑂𝐻 – ] ±√ 𝑘 𝑞 [ 𝑂𝐻 – ] [𝑘 𝑞 [ 𝑂𝐻 – ] −2 ( 𝑆 1 +𝑆 2 ) ]+ ( 𝑆 1 +𝑆 2 ) 2 −4 ( 𝑘 02 𝑆 1 + 𝑘 01 𝑆 2 −𝑘 01 𝑘 02 ) 2 (II – 54) Se ajustaron globalmente los d os tiempos de vida obtenidos experimental- mente en el rango de pH entre 6 .3 y 13.5, manteniend o fijos lo s valores de la s cons - tantes ci néticas calculada s previa mente y a justando gl obalme nte el valor de k q , o bte- niéndose para esta constant e un valor de 0 .035 M – 1 ns – 1 . Los va lores de todas las constantes obtenidas se encue ntran recogidos en la Ta- bla II – 6 . Emplea ndo estos va lores se realizó la simula ción de los tie mpos de vida del sistema a lo largo de todo el ra ngo de pH, obte niénd ose los resultado s de la Figura II – 36 dónde, como podemos observar, la simulación teórica se ajusta perfecta mente a los resultados obte nidos ex perimentalmente. Tabla II – 6 . Const antes de equi librio y const antes cinéti cas de vel ocidad c alculadas de 3 en diso lución acuosa de acuerdo c on las dinám icas en estad o excitad o de la Figura II – 33 . Constante Valor k 01 / ns – 1 (a) 0.01 5 ± 0.070 k 02 / ns – 1 0.11 3 ± 0.004 k 03 / ns – 1 0.04 4 ± 0.002 k 12 / ns – 1 (b ) 0.62 4 ± 0.021 k 21 / ns – 1 0.55 5 ± 0.025 k 23 / ns – 1 1.17 8 ± 0.023 k 32 / M – 1 ns – 1 9.57 1 ± 1.870 k q / M – 1 ns – 1 0.03 5 ± 0.003 pK 1 – 0.94 ± 0.15 pK 1 * 0.91 ± 0.08 (a) El erro r asociado a k 01 es muy grande , por lo que no queda bie n definida. Sin emba rgo, si qued a bien definida la sum a S 1 = k 01 + k 21 = 0.57 ± 0.03. (b) La const ante k 12 es un a constan te de pseu do – primer o rden para la formación de excímeros a una con - centración constante. De esta forma, se analizó en profundidad el equilibrio ácid o – base de las 2 – me- toxi – 9 – acridonas N – sustituida s re solviendo su s intrin cada s dinámicas en el esta do excitado asignándose a una reacción ESPT, a la reacci ón de formación de un excímero y a un proceso d e desactivación mediado por iones OH – . En un tra bajo previo de Z. Fröhlichová et al. [287] establecieron como mecanism o estabilizador de dímeros de imi- nas d e 4 – acridincarboxamida la formación d e puentes de hidrógeno a través del átomo de N del anillo cen tral. Sin embargo, en nuestro caso la sustitución en esa po- sición impide que tenga luga r este mecanismo. También se descartó la posibilidad de que tuviera lugar una reacción de tra nsferencia protónica intramolecular (ES IPT) del grupo h idroxilo del radical N – hidroxipr opilo d e 3 con el N del anillo ce ntral, debido principalmente a d os argumentos: (1 ) no se lograron optimizar cálculos te ór icos computacio nales para puentes de hidrógeno intra molecula res y (2) los resultados de 4 , que ca rece del OH terminal e ran idéntic os. Figura II – 36 . Ti empos de v ida de 3 en medio acuos o frente al pH (diamantes ) y simulación de los tiem pos de vida emple ando las constantes calculadas (líne as sólidas). En azu l se mues tra el tiempo largo, en verde el inte rmedio y en rojo e l tiemp o c orto. Rep roducido y ad aptado con permiso de M . C. Gon zalez – Ga rcia e t al. [256] Copy right © 2 019 CC – BY. 4. - Co nclusion es • De la serie de acridonas prep arada s, 1 - 5 , se estudió en profundidad las cara c- terísticas espectrales y el comporta miento f otofísico de las a cridonas 3 y 4 en disolución acuosa, ya que 1 er a una mezcla de dos isómeros, y 2 y 5 presenta n una solubilidad en a gua muy ba ja. • Las caracte rísticas ácido ba se de las acridonas 1 , 3 y 4 , en dis olución acuo sa, acreditan que éstas sean prácticamente invariables en un rango amplio de pH, alrededor d el pH fisiológico. • Las acridonas 3 y 4 exhiben el mism o comp ortamient o fotofísico e n disoluc ión acuosa debido a que la diferencia en el sus tituyente R de s u estruc tura n o se encuentra conju gada con la parte cromofórica de las m oléculas. • La Teoría de grafos y los cálculos co mputacionale s corroboraron el idéntico compartamient o fotofísic o de 3 y 4 y respa ldaro n la forma ción de un ex címero de 3 mediante interaccione s π – π , así como el hecho de q ue la protonación se produce sobre el gr upo car bonilo del ani llo. • Las acridonas 3 y 4 presentan un rico si stema fotociné tico que incluye el a co- plamiento en el estado excitado de una re acción ESPT, un compor tamiento de fotobase, la formación de un excímero y un fenómeno de quench ing de la forma neutra mediado por i ones OH – . • Empleando GCA se cons iguió resolver en su t otalidad el sistema fotocinét ico, calculando t odas la s consta ntes ci n éticas y las c onstantes de eq uilibrio de 3 en medio acuoso. Este sistema fotocinético, resuelt o media nte un model o trico m- partimental global, que pu do reducirse a u n modelo bicompartimental para valores de pH superiores a 2.5 , constituye uno d e los más d esa fiantes y c om- plejos publicado s hasta la fec ha. 5. - Co nclusion s • From the series of prep ared acridones, 1-5 , the spectral characteristics a nd pho- tophysical behavi or of acridones 3 and 4 in aqueous solution were studied in depth, since 1 wa s a mixture of two isomers, a nd 2 and 5 have a solubility in very low water . • The acid base characteristic s of acridones 1 , 3 a nd 4, in aqueous solution, prove that they a re pr actically in variable in a wide ra nge of pH, around the physio- logical pH. • Acridones 3 and 4 exhibit the same photophysica l behavior in aq ueous solu- tion due to t he difference in the R subs tituent of their structure is not conju- gated with the chr omoph oric pa rt of the molecules. • Graph theory a nd computa tional calculati ons c orrobo rated the identical pho- tophysical behavior of 3 and 4 and supported the formation of a n excimer of 3 through π–π interactions, as well as the fact that protonatio n occurs on the car- bonyl group of the ring. • Acridones 3 and 4 prese nt a rich photokinetic syste m that include s the cou- pling in the excited state o f an ESPT reaction, a phot obase beha vior, the for- mation of an excimer a nd q uenching of the neutra l form mediated by O H – . • Employing GCA, it was possible to fully resolve the photoki netic system, c al- culating all the kinetic co nstants and the eq uilibrium constants of 3 in aqueous medium. T his photokinetic system, so lved using a globa l three - compartment model, which could be reduced to a two -compartme nt model for pH values greater than 2 .5, is one of the most challengin g and complex published t o date 6.- Materi ales y métodos 6.1. - Reactivos Todos los reactiv os fuero n suminis trados por Sig ma – A ldrich (Alemania). Fue- ron adquirid os con la máxima pureza disponible (cali dad de b iología molecular) . Los disolventes emp leados se a dquirieron con grado esp ectroscóp ico. La s disoluci ones acuosas se prepararon con agua mil i – Q ultrapura (18.2 M Ω . c m @ 2 5 ° C ) y s u p H s e a j u s t o c o n l a s c o n c e n t r a c i o n e s a p r o p i a d a s d e á c i d o a c é t i c o g l ac i a l , a c e t a t o s ó d i c o , á c i d o n í t r i c o y h i - d r ó x i d o s ó d i c o . 6.2. - Instrume ntación Los espectros de absorción se recogieron mediante un espectofot ómetro de ab- sorción UV – Visible de dobl e ha z Lambda 650 (PerkinElmer, EE. UU .) y los espectros de fluorescencia en estado esta c ionario se obtuvieron mediante un espe ctofot ómetro FP -830 0 (Jasco, Japón), empleándose pa ra todas las muestras cubeta s de cuarzo de 10 mm x 10 mm . Los decaimie ntos de fluorescencia se obtu viero n media nte un espe ctofotóme- tro de tiempo resuelto FluoTime200 (PicoQ uant G mbH, Alemania) con un a tarjeta TimeHarp 200 en mo do de temporiz ación de foton e s individuales. Se empleó un láser pulsado d e diodo de 375 nm (LDH – 375 , PicoQuant GmbH, Ale mania) con una f re- cuencia de repe tición de 10 M Hz controlado por u n operado r PDL – 800 (PicoQuant GmbH, Alemania) . 6.3. - Metodología La sí ntesis de las acridonas fue llevada a cabo por el grupo de investigación del Prof. Juan M. Cuerva del D epartamento de Química Orgánica de la Facultad de Cien- cias de la Universidad de Granada ( v er A nexos) Los TRES y SA EMS se obtuvieron cada uno con dec aimientos recogidos entre 425 y 5 72 nm con ∆λ = 3 nm calculándose para tiempos totales de 0, 0.5, 0.8, 1, 1.2 1. 5, 3, 5, 8, 10 y 15 ns empleando la Ecuaci ón I – 6 para los TRES y la Ecuaci ón I – 7 para los SAEMS. CAPÍTULO III ACRIDONAS COMO S ONDAS INTRACELU LARES DE POLAR IDAD E IMAGEN DI NÁMICA DE EXCÍMERO S (DYNEX) Capítulo IV . Fluoróforos con tiempo d e v ida largo y su empleo en técnicas con ventana temporal para la detección de m iRNAs como biomarcad ores. 233 Los resulta dos obte nidos se recogen en la F igura IV- 18 , d ónde podem os observar una intensidad casi nula de las diferentes muestra s de Q-se pharosa con los diferentes ele- mentos empleados, observ ándose cambios muy significa tivos entre la reacción com- pleta y el b lanco, por lo que se pudo co ncluir q ue n o se producían interferenc ias de- bido a la pr esencia de a lbúmina en el suero san guíneo . A continuació n, se co nfirmó q ue el límite de detección q ue se había obtenido para esta metolodología se mantenía a l emplear muestras de suero sa nguíneo hu- mano. Para ello se empleó s uero human o comercial a l q ue se añad ió miRNA - 122 100 pM (2 fmo les de miR NA en 20 μ L de suero sanguíneo humano) y se comparó la señal obtenida de la re acción co mpleta de esta mue stra con otras mue stras d e Q -sepharosa en una disoluci ón de suero ( blanco), con SB – C* y suer o, con SB-C* y DGL-12 2 en suero a las que no se les añadió miRNA -1 22 ( Figura IV – 19 ) . Figura IV- 18 . Efect o de la BSA e n la met odología de h ibridación po r química din ámica med iante DGL -122. Imágenes de intensidad con la ventana temp oral de detec ción complet a y c on una ventana temporal de filtrado de 55 ns de A) Q -sepharo sa, B) Q-seph arosa + SB-C* 5 μ M, C ) Q-sepharosa + SB-C* 5 μ M + D GL – 122 1 μ M, D) Q-sep harosa + S B-C* 5 μ M + mi RNA – 122 1 μ M y E) reacción completa. Todas ellas en prese ncia de BSA al 0 .4 % m/v. Ba rras de esc ala de 20 μ m. Repr oducido y adaptado con pe rmiso d e E. Garci a -Fernan- dez et al. [386] Copyright © 2019 C C – BY. Bloque A. Fluo róforos con t iemp os de vida largos. Estudio fot ofísico y aplicac iones. 234 Figura IV- 19 . Intensid ad por área de m icroesf eras de Q -sep harosa o btenidas de imágenes de intensidad con ventana temporal de detecció n comple ta (azul) y con una ventana tempor al de filtrado de 55 ns (rojo) en presenc ia de su ero sangu íneo h umano, sue ro + SB – C* 5 μ M, suer o + SB-C* 5 μ M + DGL- 122 1 μ M y su ero con SB- C*5 μ M + DGL-122 1 μ M + miRNA-12 2 100pM. Reproducido y adapt ado c on perm iso de E. Garcia- Fernande z et al . [386] Copy right © 2 019 CC – B Y. Como podemos o bservar en la Figura IV- 19 se observ a un a señal de ruido de fondo en to dos estos experiment os de control que se atenúa al realizar un filtrado por venta temporal. Sin emba rgo, a pesar de esta señal inespecíf ica es posible difere nciar con cla ridad la muestra a la que se añad ió miRNA – 12 2 de las muestra s sin miRN A - 122 estableciéndose un lími te de dete cción de 100 pM. Por último, se analizaro n 12 re plicados de suero sanguíneo de un pa ciente co n DILI con va lores de alanina aminotransfera sa (ALT) > 1000 U/L debi do a sobredosis de paracetamol. Los re sultados obtenidos permitieron diferenciar entre las concen tra- ciones an ómalas ele vadas de miRNA – 12 2 del suero del paciente con DILI [388] del suero de un paciente sano ( Figura IV - 20 ), demos trand o la eficie ncia de esta met odo- logía y abriendo la puerta a su futuro empleo en diagnóstico así como al futuro desa - rrollo de kits que pe rmitan la detecc ión in situ de miR NAs en biopsias l íquidas. Ade- más, esta metodología puede optim izarse para la detección de otras secuencias d e miRNAs que sean indicado res de otros proce sos patoló gicos, incluso de forma simul- tánea. Capítulo IV . Fluoróforos con tiempo d e v ida largo y su empleo en técnicas con ventana temporal para la detección de m iRNAs como biomarcad ores. 235 Figura IV – 20 . Imágenes de i ntens idad a las que se a plicó una ventana temporal de filtrado de 5 5 ns par a muestras serológ icas de A) un paciente san o y B) un pa ciente con DIL I. En e l g ráfico de cajas se rec ogen l os valores de l a in tensidad de flu orescencia de l a im agen con ventana te mporal del pa ciente sa no (v erde) ( n = 12) y del paciente con DILI (rojo) (n = 12). La s cajas y bi gotes rep resentan el error estándar y la desviaci ón estándar, r espe ctivamente , el sím bolo cuad rado representa la media y la línea horizontal la m ediana. El test estadístico no paramétr ico de Mann-Whitney confirmó que las dos poblaciones son dife rentes con un nivel de confianza de 0.95 (p = 0.033). Reproducido y adapt ado con permiso de E . Garci a -Fernande z et al. [386] Copy right © 2 019 CC – BY. 4. - Co nclusion es • La mayoría de las interfer encias lu miniscentes proced entes de la a utofluores- cencia del medio se pueden elimi nar en la detección de la seña l de SeTa u -425 en tampón fosfa to mediant e una ventana temp oral d e filtrado de 55 ns. • Por ello, se imple mentó la tecnología d e química diná mica Chem iRNA™ Tech para su empleo con la sonda fluorescente de tiempo de vida largo S eTau - 425 (25ns), etiq uetando la sonda de reconocimient o SB -C con SeT au- 425, SB -C*, y se caracte rizándola espectral y fotofísicamente. Se comprobó que dichas pro- piedades no se ven significa tivamente alteradas ni por e l proceso de etiquetado ni en las condici ones de la reacción de química dinámica, con DGL122 , miRNA - 122 y agente reductor en ta mpón fosfato (pH 6). • La metodol ogía emplea da para la detección de miRN A media nte filtrado co n ventana temporal y la f ormación del dúplex PNA -122 */miR NA-1 22 posee me- nor especificida d q ue la hibridación por química dinámica emplea ndo DGL - 122 y SB – C*, ya q ue sólo ésta última pres enta una reso lución de una única nu- cleobase, siend o capa z de discriminar secue ncias d e miRNA - 122 análogas como miRNA12 2- 18A. Bloque A. Fluo róforos con t iemp os de vida largos. Estudio fot ofísico y aplicac iones. 236 • Se lo gró realizar un a recta de calibrado con diferentes concentracione s de miR- NAs detectad as mediante e sta metodología establecién dose un lím ite de detec- ción de 100 pM de miRNA -1 22. • Los experimento s de contro l muestran u na elevada selectividad q uímica e ins- trumental in vitro . De e sta forma, la SB -C* no da lugar a uniones inespecíf icas con el resto de los reactivo s empleados (Q- Sepharo se, DGL-122 , mi RNA-1 22, etc.) y sól o se acop la irreversibleme nte al dúplex dia na cuando se dan las con- diciones apropiadas. Además, tampoco se producen interfer encias inespecífi- cas de cier tos componente s d el suero, como la B SA. Sin embargo, el suer o san- gu íneo humano real aumenta la señ al de fo ndo, que se minimiza considerable- mente con el filtrado tempora l y, por lo tanto, no se ve comprometida la detec- ción de miRNA – 122 para c oncentraciones que permite n distinguir condicione s patológicas. • Siguiendo la metodol ogía d esarrollada en este capítulo se logró dife renciar de forma exito sa entre una muestra serológica proced ente de un pacie nte co n DILI, con una mayor conce ntració n de miRNA -12 2 en suero sanguíneo, de una muestra de un paciente sano, demostrando la efi ciencia de esta metod ología y abriendo la p uerta a su fut uro empleo e n diag nóstico, así co mo al f uturo desa - rrollo de kits que permitan la detección in situ de miRNAs en biopsias líquidas. Además, esta metodología puede optimizarse para la detección de o tra s se- cuencias de miRNAs que s ean indicadores de otros p rocesos patológic os, in- cluso de forma simultánea. 5. - Co nclusion s • Most of the lumi nescent int erference s from the autofluorescence of the medium can be eliminated in the de tection of the SeTa u -4 25 signal in phosp hate buf fer by means of a filtering time window of 55 ns. • For t his reason, the ChemiRNA™ Tech d ynam ic chemistry technology was im- plemented for u se with the long -lived fluoresce nt pr o be SeT au -4 25 (25ns), la- beling the recognition prob e SB- C with SeTau- 425, SB-C*, and characte rizing it spectrally and photophysica lly. It wa s found that these pr operties are not sig- nificantly altere d by the la beling pr ocess or in t he dyna mic chemical re action conditions, with DGL122, miRNA -1 22 and reducing agent in phosp hate buffer (pH 6). • The methodolog y used for the detection of miRNA by f iltering with a time win- dow a nd the formati on of the PNA-12 2*/miRNA-1 22 duplex has less specificity than hybridiz ation by dyna mic c hemistry using DGL-1 22 and SB-C*, sin ce only Capítulo IV . Fluoróforos con tiempo d e v ida largo y su empleo en técnicas con ventana temporal para la detección de m iRNAs como biomarcad ores. 237 the latter it present s a reso lution of a single nucleobase , being able to di scrimi- nate analogous miRNA -12 2 sequences such a s miRNA 122 - 18A. • It was possible t o perform a calibra tion line with diff erent co ncentrati ons of miRNAs detecte d by this m ethodology, esta blis hing a detection limit of 100 pM of miRNA- 122. • Control experiments show high chemical and instrum ental selectivity in vitro . In this way, SB -C* does no t give rise to u nspecific u nions wit h the rest of t he reagents used (Q -Sepharos e, DGL-1 22, miRNA-1 22, etc.) a nd only irrever sibly couples to the target duplex when the appropriate condi tions. In addition, there is also no non-specific inte rference from certain serum comp onents, such a s BSA. However, real human bloo d serum i ncreases th e backgroun d signal, which is greatly minimize d by te mporal filter ing, an d therefore detecti on of miRNA-1 22 at concentrations that disti nguish pathological c onditio ns is not compromised. • Following t he met hodolog y developed in this cha pter , it was possible to suc- cessfully differentiate bet wee n a serological sample fr om a pat ient with DILI, with a higher concentration of miRNA -12 2 in blood serum, from a sample f rom a healthy patien t, demonstrating the efficiency of this methodology. and open- ing the door to its future use in diagnosis, as well as to the future developmen t of kits that allow in situ of miRNAs i n l iquid bi opsies. In additi on, thi s met h- odology can be optimized for th e detection of other miRNA sequences that are indicators of ot her patholo gical processes, eve n si multaneously. 6. Materi ales y métodos . 6.1. - Reactivos Los pr oductos químicos comercialme nte disponibles se compraron a Sigma Al- drich y se u saron tal co mo se recibieron. La s soluciones de tra bajo se pr epararon re- cientemente, utiliza ndo agua milliQ de baja conduct ividad, antes de cada experi- mento a partir de solucion e s madre preparadas y mantenidas ref rigeradas a 4 °C. El tampón fosfato 1 0 mM se pr eparó mezclando las ca ntidades apropiadas de Na 2HPO4 y Na H2PO4 con el pH ajustad o a 6.0 utilizando HCl o N aOH 1 M. Para la lisis de las muestras de pla sma se uti lizó el tampón Stabiltec h de DestiNA Genomica S. L. El ta m- pón es ba sado en c ombinac iones pa tentadas de age ntes amort iguadore s, detergen tes suaves, protei nasa K y varia s sales que mejoran la extra cción d e miRNAs y mantien en la esta bilidad d el miRNA -122 lisado. La albúmina de suero bovino (BS A) utilizada para los ex perimentos de control era un polvo comercia l de Sigma - Aldrich. Las perlas Bloque A. Fluo róforos con t iemp os de vida largos. Estudio fot ofísico y aplicac iones. 238 de Q-Sep harose (Q- Sph) son perla s de matriz de a garosa re ticuladas cu biertas e n la superficie con aminas cuat ernarias y se adquirieron d e GE Healthcare Life Sciences. El diámetro de la s perlas osciló entre 4 5 y 165 m, según deta lló el proveedor. Antes del uso, se equilibr ó Q -Sph . Bre vemente, se centrifug ó 1 ml y se elimi nó el sobre na- dante. Posteriormente, la resina se lavó por centrifugac ión con H2O (1 mL) un a vez y dos veces con ta mpón f osfato 10 mM pH 6 (1 mL), antes de resuspender e n el mis mo tampón (0,5 mL). Inmediat amente antes del us o, la suspensión de Q -S ph pr eequi li- brada se agitó para volver a suspender las perlas de resina. SeTau425 se adquirió como éster NHS de SETA BioMedica ls (EE. UU.). Como agente reductor en la reacci ón de química dinámica1 , se empleó cia noboro hidruro de sodio (NaBH 3 CN). Las sondas PNA (PNA122* y DGL12 2), así como el SMA RT -C-SETa u425 (SB- C*), fueron dise ñadas, sintetiza das y cara cterizadas por Dest iNA Genomica SL (E s- paña), ver más a bajo. Todos los oligómeros d e ADN sintético se a dquirier on en forma desalada de Integrated DNA Technologies ( IDT). 5.1.1 .-Sondas de hi bridación PNA1 22* y DGL12 2 Dos sondas de ácido nucle ico pe ptídico (PNA) (PNA1 22 y DGL122) usando química de fase sólida estándar en un s intetiz ador INTAVIS MultiPep (IntavisA G GmH, Alemania) (consulte la Ta bla S1). El PNA122 modificado con SETa u425 N -ter- minal ( PNA122 *) se diseñó para permitir la hibridación a ntiparalela con el ADN del oligómero mimético sintético miR-12 2 (consul te la Ta bla S2). Por el contrario, la se- cuencia DG L12 2 se diseñó inclu yendo y terminó con un grupo a cetil -pegilado y un sitio "en blanco" abásic o coloca do en + 13 desde su extremo C -termi nal para q ue des- pués de la hibrida ción, c on el ADN del olig ómero m imético miR -1 22 presente un g ua- nina en esa posició n (+13/ +15 desde el extremo 5′ del h sa -miR- 122 -5p ma duro) lo que permite la i ncorporación de una cito sina en el si tio o b olsillo en b lanco (Tabla S2, nu- cleobases ba jo interro gación a travé s del etiquetado químico din ám ico, DCL, mos- trado en rojo). 6.1.2 .- Suero sa nguíneo LAnalizamos mues tras proveniente s de un solo pacie nte que padecía daño he- pático induc ido por f ármac os (DILI). Estas mues tras f ueron proporci onadas por una colaboración con el Centr o de Ciencia Cardiovascu la r de la Universidad de Edim- burgo, The Quee n's Medica l Resear ch Instit ute (Edimb urgo, Reino U nido). El paciente adult o fue rec lutado en un estudi o globa l llamado Markers and Paraceta mol Pois oning (MAPP)3, cumpliendo los crit erios de inclusión de l estudio: Capítulo IV . Fluoróforos con tiempo d e v ida largo y su empleo en técnicas con ventana temporal para la detección de m iRNAs como biomarcad ores. 239 antecedentes de sobredosis de para cetamol, que resultaron en tratamie nto con acet il- cisteína intraven osa después de la evalua ción del mé dico tratante. Se obtuvo el con- sentimiento inf ormado co mplet o del participa nte y la aproba ción ética f ue otorgada por el Comité de Ética de Investigación d el Sudeste de Escocia y el Comité de Ética de Investigación del Este de Escocia a través d el Biorecurso Hu mano del Sudeste de Escocia. La muestra de sangre se to mó en la prese ntación al h ospital y se almacenó a -80°C como plas ma. El paci ente esta ba a fectado por u na lesión hepática aguda, p re- definida como un pico de actividad de alanina transaminasa sérica (ALT) en la e stan- cia hospitalaria superior a 1 00U/ L4. La m uestra de suero humano utilizada como control n egativo d e miR -122 y para los experimento s de adición se adquirió de Sigma A ldrich (H6914: suero humano de sangre entera coagulada A B masculina; origen d e EE. U U., filtrado estéril). 6.2. - Instrume ntación Las imágenes de tiempo de vida de fluo rescenc ia (FLIM) y las imágenes filtra- das por TGI se obtuvieron en un sistema de microscopio MicroTi me 200 (PicoQuant GmbH). La fuente de excita ción fue u n láser pulsad o de 440 nm (LDH - PC - 440, Pico- Quant) co ntrolado por u n contr olador "Sep ia" ( PicoQua nt) para ajustar la potenci a y la tasa de repetición a 5 MHz, dando una venta na de tiempo total de 20 0 ns. Las po- tencias de láser típica ment e emplea das fuer on 0,7, 5,3 y 81,1 W en el f otodiodo. L os pulsos de excitación se dirigieron al espécimen a través de un objetivo de inmersi ón en aceite 1,4 NA, 100x de un microscopio conf ocal invertido IX -71 (Oly mpus), des- pués de reflejarse en un espejo dicroic o 440 DCXR (Chroma). La emisión de fluore s- cencia se filtró con un filtro d e cort e de 460 LP (AHF/Chroma) y se enfocó en un agu- jero de alfiler de 75 μm. La emisión de fluoresce ncia se dirigió a través de un filtro de paso de banda 550/50 (Filtros Omega) a un diodo de avalancha de fotón único SPCM - AQR 14 (Perkin E lmer) capaz de detectar foto nes indiv iduales y envió la señal corres- pondiente a un te mporiza dor de fotón único (SPT) TimeHarp 200 módulo (Pi co- Quant). La a dquisición de imáge ne s FLIM y TGI se realizó to mando 10 - 20 μL de solu- ción que contenía perla s y c olocándola sobre el porta ob jetos del microsc opio. En pr i- mer lugar, se l ocalizaron y seleccionaron las perlas co n el campo br illante en l os o cu- lares del microscopi o, y lue go se realizó un pre -escane o inicial, a muy baja poten cia láser para evitar efectos de fotoblanqueo, de un áre a d e 80×80 μm2 para probar la intensidad de la fluorescencia . de la cuenta Luego, se registró otro escaneo de la misma área a la intensidad de láser adecuada con una resolución de 256 x256 píxeles. Bloque A. Fluo róforos con t iemp os de vida largos. Estudio fot ofísico y aplicac iones. 240 El láser se enfocó en diferen tes partículas y se recogiero n imáge nes de diferentes par- tículas. Las imágenes FLIM se analizaron y procesaron u tilizand o el software SymphoTime 32 (PicoQuant). La descomposició n de la imagen del conjunto se a justó para detectar la presencia de la vida útil de la so nda fluorescente SeTau4 2 5. E l filtrado con puerta de tiemp o se aplicó selecci onando solo lo s fotones de cier ta ventana de tiempo, generalme nte 2 niveles de filtra do: puerta completa o de 55 ns en adelante (con puerta de tiempo). Se utilizó un bin ning espaci al prev io de 5x5 píxel es y un prehistograma de 8 c anales tempo rales (para un a res olución final de 464 ps/can al) para lograr un m ayor número de conteos en cada píxel. Posteriormente, las im áge nes de intensidad se exportaro n a l soft ware ImageJ 1.5 2b5 para su procesamiento. En re - sumen, primer o se aplicó u n u mbral para elim inar los recue ntos d e fondo y lue go se aplicó una escala de pseud ocolor para la intensidad 6.3. - Metodología Las muestra s de suero se es tudiaron ut ilizando el ensa yo DCL -TGI, como se menciona en la sección E2.2 y el Cua dro 1 en el texto principal del manuscrito, p ero con algu nas modificaci ones debido a la na turaleza de las muestras de suero humano real. En un primer pa so (a) , se trataron 10 μL de muestra de suero con 25 μL de tam - pón de lisis, 7,5 μL de DGL122 (13 μ M) y agua hasta un vol umen f inal de 45 μ L. Est a se ma ntuvo reaccionando durante 6 0 min utos a 3 0°C y agitación a 1200 rpm En un segundo pa so (b), esta muestra se mezcló durante 30 minutos a 41 °C con 1μL de S B - C* (500 μM), 3μL de NaBH 3CN (5mM) y tampón f osfa to pH 6 para un volume n final de 10 0 μ L. Posteriormente, la soluci ón se sepa ró c on l a mínima cantidad posible d e Q-Sph (15-20 perlas) y se llevó al microscopio. Para los ex perimentos de a dición de miR-122, se agre garon las concentra ciones deseada s de miR -1 22 al pa so (a) en lugar de agua y se siguieron al pa so (b) como se descr ibió ant eriormente. Capítulo II. Estu dio fotofí sico de acrido nas en medio acuoso 241 Bibliografí a del Bloque A. 1. B. Va leur y M. N. Berberan -Santos, Molecular Fluorescence: Prin ciples a nd Applications. 2nd ed. 2012 ISB N: 978-3 -527-32837- 6. 2. J.R. 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DOI: 10.1021/acsnano.5b03364. Capítulo II. Estu dio fotofí sico de acrido nas en medio acuoso 271 379. X. Qiu, J. Guo, Z. Jin, A. Petreto, I.L. Medintz y N. Hildebrandt; Mu ltiplexed Nucleic Acid Hybr idization Assays Using Single -FRET-Pair Distance-Tuning ; Small, 2017 , 13 , (25), 1700332. DOI: 10.1002/smll.20170 0332. 380. D. Geißler, S. Stufler, H. -G. Lö hmannsröben y N. Hildebrandt; Six -Color Time - Resolved Förster Resonance En ergy Transfer for Ultrasensitive Multiplexe d Biosensing ; J. Am. Chem. Soc., 2013 , 135 , (3), 1102-1109. DOI: 10.1021/ja310317n. 381. L. Jiang, D. Duan, Y. Shen y J. Li; Dir ect microRNA detection w ith universal tagged probe and time-resolved fluorescence tec hnology ; Biosens. Bioelectron., 2012 , 34 , (1), 291 -2 95. DOI: 10.1016/j.bios.2012.01.035. 382. L. Lu, D. Tu, Y. Liu, S. Zhou, W. Zheng y X. 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Sautier, P. Carmona-Saez, J. Ma rtorell- Marugan, R.J. Mella nby, S. P erna gallo, H. I lyine, D.M. Ris sin, D.C. Du ffy, J.W. Dear y J.J. Díaz -Mochón; Direct Detection of miR-122 in Hepatotoxicity Using Dynamic Chemical Labeling Overcomes S tability and is omiR Challeng es ; Anal. C hem., 2020 , 9 2 , (4), 3388-3395. DOI: 10.1021/acs.analchem.9b05449. BLOQUE B: DESARROLL O DE NUEV AS NANOPLAT AFORMAS C ON APLICACI ÓN EN BIOI MAGEN Bloque B. De sarrollo de nu evas nanoplataform as con aplica ci ón en bioim agen 278 iglesias medievales , siend o las nanopartículas las resp onsables de sus llamativos y brillantes colores. Estas propied ades también fueron empleadas en la cerámica is- lámica y la cerámica renacentista entre los siglos IX y XVII. La nanotecnología tam- bién fue empleada en la producción de sables de “acero de Damasco” en los que se emplearon nanocables de c imentit a y nanotub os de ca rbono para conferirle a la s cuchillas fuerza , resiliencia y mantener el fil o de la ho ja [1] . Sin embargo, todos est os artistas de la antigüeda d de sconocían la causa de estas espectaculare s propieda des. Figura B – 1 . Copa de Licurgo 1958,120 2.1 iluminad a desde el exterior (izqu ierda) y desde el inter ior (derecha). C ortesía del M useo Brit ánico © The T rustees of the British Museu m. La primera vez que se re portó la síntesis de nanopartícula s de forma inten- cionada fue en 1857 cuando M. Faraday si ntetizó coloid es de oro, pero no f ue hasta el siglo XX, cuand o fueron cobra ndo un papel más re leva nte. En 19 08 G. Mie en- contró una respuesta para describir la interacción de la luz con esfer as de compo- sición y radio arb itrarios mediante una deriv ación analítica de la s ecuaciones de Maxwell. Su inve stigación reveló estruc tura s res onantes en el e spectro de d isper- sión, q ue más tarde se conocerían co mo plas mones d e resonancia. A finales del siglo XX Rayleigh llev ó a cabo un estudi o teórico s obre la d i spersión de la luz por nanopartículas, las cuales prese ntaban un ta maño menor que la longitud d e onda incidente. Su teoría di o respuesta a fenó menos físicos como el color azul del cielo y el color ama rillo c on el q ue vemos e l sol. Basándose en los re sulta dos de G. Mi e Introducción 279 y R ay leigh, R. Gans consideró distintas geometrías demostrando que la interacción de la luz con la s nanopartículas dependía fuer temente de su forma y su com posi- ción [ 4 , 7] y explicó el origen de los distintos colores q ue se ll evaba n observando desde l a a ntigüedad en las disoluc iones co loidales de nano partíc ula s [4] . En la dé- cada de lo s 70 s tuvo lug ar e l descubrimiento del fenómeno de amplificación super- ficial de la dispersión Rama n (Surface - Enhanced Raman scattering, S ERS) por M . Fleischmann y R. van Duyne mediante el cual se increm entaba la dispersi ón Raman de moléculas que se encon tra ban en la proximidad de nanopartículas metálicas [8] . De esta f orma se abri ó la p uerta a la posibil idad de incr ementar señales rela ciona - das con la intera cción de la luz con las nan opartícula s da ndo l ugar a que e n es ta misma déc ada se reportara por primera vez el efecto de amplificación de fluores - cencia por nan opartículas metálicas por K.H. Drexha ge [9] . La gra n velocidad con la q ue se ha desa rrollado la na notecnol ogía en el pa - sado sig lo se debe princ ipalmente a la apa rición de nuev os instru mentos y meto- dologías capace s de visualizar la escala nanométrica. Uno de los principale s a van- ces instrumentales tuvo lugar e n los años 30s con el desarrollo d el microsc opio electrónico de transmisión ( Transmision Electron Microscope , TEM) por E. Ruska y el microscopio electr ónico de barrido ( Scanning El ectron Microscope , SEM) por M. von Ardenne. Empleand o un h az de electr ones e n lugar de la luz se c onsiguió supera r el límite de difracción de 0.2 μ m que E. Abbe había est ablecido para la microscopí a óptica. Más tarde, en 1981 , G. Binnig y H. Ro hrer desa rrollaron e l microscopio de efecto túnel ( Sca nning Tunneling Microscope , STM) , mediante el cual fue posible ob- tener imágenes de superficies co nductoras y semic onductora s incluso a nivel ató- mico midie ndo la corriente elé ctrica a tra vés de una punta muy f ina . Por es te avance tecnológico se les otorgó el Premi o Nobel de Física de 19 86 jun to a E. Rusk a. El STM f ue el precursor de la microscopía de fuerza a tómica ( Atomic Force Micros- copy , AFM), que permitió obtener i mágenes de la supe rficie de una m uestra, no necesariamente co n propiedad es conductoras, con gran resolución. El desarrollo de estos eq uipos ha lograd o a ctualme nte a lcanzar res olución a nivel a tómico, ha - ciendo posible el empleo d e AFM y STM incluso para la comprobación de estruc - turas moleculare s ( Figura B – 2 ) [10] . Bloque B. De sarrollo de nu evas nanoplataform as con aplica ci ón en bioim agen 280 Figura B – 2 A) Estructura molecular B) imagen de AFM y C) image n de los orbita les molecula res me- diante STM . Reprodu cido y adaptado con permis o de L . Gross et al. [ 10 ] © 2018 Wiley‐VCH Verlag Gmb H & Co. KG aA, Weinhe im. 2. - C lasificación de los p rincip ales tip os de nano p latafor - mas . La nanotecnología es, a día de hoy, un campo en expansió n p or lo que cons- tantemente surgen diferent es tipos de nan oplataforma s así como noved osas apli- caciones de las mi smas. Podemos establec er diferente s clasificacio nes en función de su orige n, composició n o el nú mero de dime nsiones nanométrica s [6] . En función de su origen p od emos clasifica rlas en: • Naturales : se encuentran en el med io a mbiente y provienen d e fuentes na- turales. Son produc idas por especies bio lógicas o por la activida d humana. • Sintéticas : son fabr icadas por medios mecánicos, físico s, químicos, bio lógi- cos o combinaci ones de est os con el fin de emplea rlas en posteriores a plica- ciones biológica s o tecnológ icas. Otra clasificación q ue podemos es tablec er de las nanop lataformas ra dica en su composició n. Podemos d istinguir varios tip os: • Inorgánicas: están com puesta s por meta les (Ag, Au, Cu , Cd , Co, Pb, Al, etc .), óxidos d e metales (TiO 2 , ZnO, Fe 2 O 3 , Al 2 O 3 , SiO 2 , etc .) o semiconductores (CdS, Cd Se, etc.) , a sí como otros materiales co mo silico nas o cerámicas. Introducción 281 • Orgánicas : Están formadas por uniones n o covale ntes e stablecida s entre mo- léculas orgánicas autoemsa mbladas . Forman parte de este grupo los lipos o- mas, dendrí meros, micelas y na nopartículas compuest as por p olímeros. Se excluyen en e ste grupo lo s nanomateriales d e carb ono. • Nanomate riales de carbono : están for mados principa lmente p or uniones entre átom os de carbo no. A lgunas de las formas más empela das son nano- tubos, nanofibra s , nanoesfer as o nanoespumas. También forman parte de este grupo el graf eno y los fulleren os. • Nanomate riales mul tifase ( Composite-based nanom aterials ) : Se trata n de estructuras mu ltifásicas q ue presentan al menos un a fa se nanométrica, la cual puede estar combina da con otros nanomateriales o estructuras más complejas. Puede n estar formad os por cua lquier c omposición de nanopartí- culas ino rgá nicas, orgánicas o de carbono asociadas a otras n anopartíc ulas o a otros materiales. Por último, también podemos clasificarlas en función del número de dimen- siones que posean e n el rango nan ométrico [11] ( Figura B – 3 ) . • Una di mensión nanomé trica : principalmente se trata n de films y monoca- pas. Presentan únicamente una dime nsión con un tam año in feri or a 100 nm . En esta categoría se encua d ran, entre otros, el grafeno y la s nanoesp umas de carbono. • Dos dime nsione s na nométricas : estructuras q ue pr esenta n dos de su s di- mensiones en escala nanom étrica, formando estructura s como tubos, hilos o cables. Algunos e jemplos s on nanocables de plata (“ Ag nanowires ” ) o nano- tubos de carbo no. Bloque B. De sarrollo de nu evas nanoplataform as con aplica ci ón en bioim agen 282 Figura B – 3 . E jemplos de nan oplataform as clasif icadas en funci ón del número de dime nsiones nanomé- tricas . Una d imensión nanomét rica: estructu ra de un a lámin a de g rafeno y n anoláminas; dos d imens io- nes na nomét ricas : imagen de SEM de na noc ables de plata a daptado y reproduc ido con permiso de B. Wiley et al. [12] Copy right © 2007 Americ an Chem ical Society y est ructu ra de n anotubos de carbono; tres dimensiones nanométric as: imagen de SEM de nano cubos de plata adapt ado y reprodu cido con permis o de B. Wiley et al. [13] Copy right © 2005 WILEY‐V CH Verlag G mbH & Co. KGaA, Wei nheim, imagen de TEM de na nobarras de plata, imagen de SEM de nan oestrellas de oro adapt ado y reproduc ido con per- miso d e Y. G ao et al. [14] Copyright © 2021, Am erican Chemica l Soc iety e im agen T EM de nanob ipirámi- des de oro adaptad o y reproduc ido con permiso de X. Zhu et al. [15] © 2015 WILEY‐V CH Verlag Gmb H & Co. KG aA, Weinhe i m. • Tres dime nsi ones nanométricas : prese ntan todas sus dimens iones en na- noescala. Podem os e ncon trar innumerables morfologías: nano prismas, Introducción 283 nanobipirámides, nanocubos, nan oestrella s, etc. Aunq ue las más a bundan- tes son las morfol ogías esfé ricas. Pertenec en a esta ca tegoría las nanopartí- culas plasmónicas, carbon dots (CDs), quantum dots (QDs), fulleren os, lipo- somas y dendrímer os entre otros. 3. - Pri ncipales n anoplatafo rmas Hasta la fecha se han diseñ ado innumera bles nanop lata formas para un sin- fín de aplicaciones, incluy endo aplicaci ones como bi osensores y en técnicas de bioimagen. Algu nas de las nanop lataformas más rele va ntes en esta área son nano- partículas lu miniscentes, n anopartículas p lasmón icas , nanopartíc ulas poli méricas , nanopartículas lipíd icas, nanopartícu las mag néticas y nanopartículas d e sílic e . 3.1. - Nanopa rtículas luminiscente s . Algunas nanopartícula s presentan per se propieda des luminiscentes que pueden modifica rse con re lativa facilidad, lo que las co nvierte en exce lentes plata- formas para el desarrollo de sensores fluoresce ntes y s u empleo en bioimagen. En - tre las nanopartículas luminiscentes má s empleadas se encuentran los q uantum dots , los carbon dots y los nan oclusters metálic os. 3.1. 1. - Quant um do ts (QDs ) Los quantum dot s (QDs) son nanopartículas esféricas con un tama ño inferi or a 10 n m compuestas por elementos metálicos semiconductore s de los grupos II – VI, III – V o IV -VI de la tabla periódica. Estas nanopartículas presentan interesantes pro- piedades como la emisi ón de fluorescencia con elevado re ndimiento cuántico , ele - vada absortividad m olar, elevado desplazamiento de S tokes y gran fotoestabilidad [16 , 17] . Estas propiedades l uminisce ntes d erivan fund amentalmente del confina- miento cuántico que tiene l ugar en los QDs de 1 -1 0 nm de diá metro . El confin a miento cuántico se produce por la restricción de mo vimientos que presentan los electrones en aquellas dimensiones de los nanomateriales y las nano- partículas inferiores a 100 nm. Como c onsec uencia, su estructura electrónica se en- cuentra modificada y los electrones pasan a ocupa r niveles discretos de energía). También se pr oduce la cuantizació n d e la densidad electrónica y la carga. En los metales y semimetales esto s niveles de energía se encuentran contenidos en las de- nominadas ba ndas de valencia y d e conducci ón, las cua les se encuentran s olapadas Bloque B. De sarrollo de nu evas nanoplataform as con aplica ci ón en bioim agen 284 en los metales y separa das por una peq ueña difere ncia de ener gía en el caso de los semimetales. Al disminuir e l tamaño de las nanopartícu las e irse distanciando unas de otra s, la diferencia de en ergía entre ambas bandas se incrementa [ 18] ( Figura B – 4 ). Fi gura B – 4 Esquem a de los efectos del confinamient o cuánt ico en las bandas de valencia y conduc ción de los semiconduc tores con relaci ón al tam año de las nan opartícu las e imágenes de QDs de CdSe con diámetros ent re 6 y 2 nm. Adaptad o y reproducido con permiso de A.C. Berens et al. [19] © 2017 A merican Chemical So ciety. Cuando u n haz de luz de una longi tud d e onda a decuada incide sobre u n QD puede excitar algunos e lectrones de la banda de valencia, que pasan a la banda de conducción. L os ele ctro nes que han sido excitad o s deja n huecos en los lugare s que ocupa ban en la ba nda de va lencia, genera ndo una ca rga positiva. Esta pareja Introducción 285 electrón-hueco se denomina excitón, con pr opiedades semej a ntes a l á tom o de H. Cuando l os electr ones r egr esan a la banda de va lencia transcurridos u nos nanose- gundos, pueden rea lizarlo a través de un pr oceso que implica la disipaci ón de la energía mediante emisión lumi niscente. Por ta nto, cua nto me nor es el tamaño de las nanopartículas , may or es la distanci a ener gética entre las bandas d e valencia y de conducción y por tant o la luz necesa ria para formar el excitón tendrá menor longitud de onda ( Figura B – 4 ) Las exce lentes propiedad es luminiscentes de los QDs as í como la posibilidad de funcio nalizar su superfi cie con diferente s grup os f uncionales han da do lu gar a numerosas a plicaci ones [16-18 , 20] , siendo empleados como sen sores de pH [17 , 21] , bio- moléculas com o glucosa [22] o ácidos nucleicos [17] y algunos iones como Cu 2+ [23 , 24] , Zn 2+ [25] , Cl – [ 26-28] , CN – [29 , 30] o CO 3 2 – [31] entre otros [17] . 3.1.2. - Carbon dots (CDs) Los ca rbon dots (C Ds) son na nopartícula s cuasi esféricas con un ta maño entre 1-10 nm compuestas princ ipa lmente por áto mos d e ca rbono [ 32] . Fueron ai slado s por serendipia en 2004 durante el proceso de purificaci ón de nanotubos de carbono , en el que se observó la apa rición de dos tipos de imp ureza s: unos nanotubos de carbono cort os y unas nanopartícula s de ca rbono capa ces de absorber en la región ultravioleta y emitir radiación electromag nética de diferentes colore s (en tre el azul y el rojo) ( Figura B – 5 ) [33] . Los CDs han desperta do u n gran interés debid o a sus pr opiedades luminis- centes, las c uales puede n modificarse para adaptar estas nanopartículas en función de la aplica ción en las que se requiera n. La lu miniscencia de los C Ds se debe al confinamiento cuántic o que se produce en la superficie de las nano partículas, esta- bleciéndose bandas discretas de energía, desd e las cuales se pue de producir la emi- sión luminisce nte tras su estabilización media nte la pasivación de la superficie ( sur- face p assivation ) [34-36] . Por este m otivo, sus pr opieda des luminiscentes depe nden tanto del tamaño del núcle o de carbono como de los ligandos que tengan en su superficie. Al igual que ocurre en los QDs, el i ncremento d e tama ño de l os CDs implica u n desplaz amiento de su emisió n lumin iscent e hacia mayores l ongitude s de onda. Sin embargo, la introducción de heteroátomos o grupos hidroxilo, epó- xido y carbonilo en l os ligandos de superficie también producen modificacio nes en Bloque B. De sarrollo de nu evas nanoplataform as con aplica ci ón en bioim agen 286 sus propiedad es fotofísica s, por lo q ue a menudo es frecuente tra tar de modificar las propiedades lumini scentes de los CDs mediante la modificación de sus ligand os de superficie en luga r de la modificación de su ta maño [32 , 36] . Figura B – 5. Electrofo resis e n gel de aga rosa 1% b ajo luz ultraviole ta ( λ = 365 n m) de A) mues tra s in purificar de nanotubos de carbono, B) carbon dots ( “ impu reza fluorescente ” ) C, D y E) nanotubos de carbono cortos y D) nan otubos de c arbon o de pared simp le. Ad aptado y repr oducido con perm iso de X. Xu et al . [33] Copyr ight © 2004, Americ an Chemical Society. Sus propiedades luminisce ntes, junto co n su solubilid ad en agua, la posibi- lidad de funcionalizarlos con distintos ligandos, su baja toxicidad y su bioco mpa- tibilidad l os ha n conve r tid o en excelentes biosensores [36-38] . Algunos ejemplos s on su empleo como sensores de pH [39] , biotioles [40] o algunos iones metálicos como Cu 2+ [24] , Fe 3+ [ 39 , 41] o Hg 2+ [42] entre otro s [37 , 38] . Introducción 287 Figura B – 6 . Supe rior: esquema de carbon dots (CDs) y la pasiv ación de la superfic ie e inferior: Emisión luminiscen te de C Ds con PEG 1500N en la supe rficie . La long itud de onda de excitación se indica en la figura. Reproducid o y adaptado con permiso de Y.P. Sun et al. [35] Copyright © 2 006, Amer ican Chemical Society. 3.1.3 .- Nanoclusters me tálicos Son nanopartículas cuasi es féricas constituidas por agr upacione s de unas de- cenas de átomos metálic os, pr incipalmente plata , oro, platino o cobre. Debido al pequeño númer o de á tomos que las forman, s u tamaño se aproxima al de la longi- tud d e onda d e Ferm i en el electrón (genera lmente infe rior a 1 nm) [43] . E sta condi- ción tiene como resultad o la aparición de niveles discretos de energía entre las que tienen lugar transiciones HOMO – LUMO, asemejánd ose de esta fo rma a las mo lé- culas orgán icas [44] . Cuanto menor sea el númer o de átomos que formen pa rte del clúster más simi lares serán sus niveles de energ ía a los de los fluor óforos c onve n- cionales, mientras que si el número de átomos es elevado, con un tamaño de nano- partícula superi or a 2 nm, l o s niveles discretos de ener gía se irán aproxima ndo cada vez más entre ellos, dando lugar a las banda s de valencia y conducción ( Figu ra B – 7 ) [45] . Por lo tanto, la s longitudes de onda de absorción y e misión de los nanocl ú s- ters dependerán del número de átomos que los forman, así como del metal del que estén for mados e i ncluso d e su ensa mblaje. Además, t ambién influye n en sus pr o- piedades luminiscentes los ligandos que se une n a su s uperficie , los cuales, ademá s Bloque B. De sarrollo de nu evas nanoplataform as con aplica ci ón en bioim agen 294 ve fuertemente a mplificad o por la s nanoestruct uras plasmónicas debid o al co nfi- namiento en escala nanométrica de la luz. Estas áre as se conocen como “pun tos calientes” o hot spots y se localiz an generalmente en las puntas o picos de las nano- partículas, siendo más inte nsos cua nto men or es la simetría de la nanopartícula y cuanto más abrupt os so n e stos pico s. E n la Figura B – 11 se muestran las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TE M) de cu atro tipos de nanopartícula s de o ro: n a nobarra, nanobipir ámide, nanoprisma y nanoestrella así como el cálculo teórico de la va riación del ca mpo local prod ucida por sus LSPR. Tal y cóm o pode- mos observa r, los hot s pots se van haciendo más intensos al aumentar el número de picos y volverse más a filados, presenta nd o, de este m odo, las nanoestrellas l os hot spots más inte nsos [14] . Figura B – 11 . Superior: imagen TEM de a) n anob arra, b) nanob ipirámide, c) nanop risma y d) n anoestr e- lla. I nfer ior: s imulación de diferencia finita e n e l do min io de tiemp o ( Finite-d ifference time-domain , FDTD) de la variación del campo loca l i nducid a po r una radiación incident e de 700 nm de longitud de onda. Reproducid o y adaptado con permiso de Y. Gao et al . [14] Copyr ight © 2021, Amer ican Chemi cal Societ y. Otra forma de lograr hot spots m uy intensos es m ediant e dím ero s u oligóme- ros com p uestos por n anopa rtículas plasmónicas. De esta forma, en la región si- tuada entre ambas nanopartículas se generaría un hot spot mucho más inte nso q ue el q ue se pr oduciría en u na nanopartícu la individua l i déntica [ 66-70] . Los LSPR ta m- bién difiere n en los dímer os de nanopartículas, a pareciendo modos pla smónic os Introducción 295 adicionales cuya longitud de onda de resonancia aumenta al disminuir la distancia existente e ntre las nanopart ículas q ue constit uyen el d ímero produciend o hot spots más intensos [66-69] . En la Figura B – 12 se muestra una si mulación de la variación del campo local dónde observ amos un hot spot muy in tenso en el espacio entre dos nanoesferas, que es mucho más intenso conforme disminuye la dista ncia entre am- bas [68] . Figura B – 12 . M apas de campo cercano calculados a través de simul ación por aproxim ación de dipolo discreto ( Dipole Discrete Ap proximations , DDA) de un dímero consti tuido por esferas de oro de 80 nm con un espacio e ntre el las de 10 nm par a una l ongitud de ond a incidente de 63 9 nm po larizada a través del eje interp artícula. Escala de 20 nm. Ad aptado y rep roducido con permis o de P. M. R. Paulo et al. [ 68 ] Copyright © 2018, Amer ican Chemic al Society . Por otro lado, los LSPRs también son muy sensibles al ambiente que rodea a las nanopartícula s, por lo que un aume nto en el índice de refracción de la nano par- tícula tie ne co mo re sultado, generalmente, un despla zamient o hacia mayores lon- gitudes de onda d e los LS PRs. La sensibilida d al índice de refracción es ma yor en la plata , seguida del oro y del cobre. Ademá s, u n au mento e n el radio de la nano- partícula en el cociente entre el largo y el ancho de la nanopartícula ( relación de aspectos, asp ect ratio ) conlle va habitualmente u n aumen to de la sen sibilidad al ín- dice de refracción [64 , 71] . Debido a la sensi bilida d de las nanopartíc ulas plasmónicas por el índice de refracción, la unión a la superf icie de la nano partíc ula de diferentes ligandos pue de da r lugar a d esplazamientos en la longitud de onda de los LS PRs , lo que ha perm itido inclus o llegar a monitoriza r evento s de unión molecular a tra- vés del seguimien to de la lo ngitud d e onda de los LSP Rs [72] . Bloque B. De sarrollo de nu evas nanoplataform as con aplica ci ón en bioim agen 296 3. 4.- Nan opartícula s poliméricas Las nanopart ículas polimér icas suele n ser de morf ología esférica con un ta- maño comprendido entre 5 y 100 nm de diámetro compuestas por polímeros orgá- nicos co mo pol i(metil meta crilato) (PMMA) [ 73] , poliestireno (PS) [74 , 75] o polímer os biodegradables com o el ácido poli (láctic o – co – glicólico ) (PLGA) o la policaprolac- tona ( PCL), entre otros [76- 78] . Debido a su gran super ficie específica resultan exce- lentes plata formas de soporte [74] . Una de las principales ventajas que presen tan estas nanopartícu las es la posibilidad de enca psular sustancias en su interior ( Fi - gura B – 13 ), lo que junto con su capacida d para disponer de ligandos de superf icie específicos las convierte en una herramienta muy versá til co n un gran p otenc ial. Es de especial interés la e ncapsulació n de fluoróf oros en el interior de las nanopartí- culas polimér icas, lo que mejora en gra n medida su fotoestabilidad y hac e posible el empleo de esta s nanopa rtículas en aplicacio nes flu orimétrica s y de bioimage n mediante las diferentes téc nicas de microscopía de fluorescenc ia, siendo posible incluso llegar a detectar nano partícu las individuales sin que se requiera n fluorófo- ros con tant o brillo com o l os que se req uieren pa ra aplicaciones fluorimétricas d e molécula única ( single m olecule ) [77] . S in embargo, en ocasiones la encapsula ción de un alto nú mero de m olécul as de fluoróforo en el i nterior de las nanopartícula s po - liméricas pue de dar lugar a fenó menos de quenching por a gregación (ACQ) , por lo tanto, resultan especia lme nte relevantes los fluor ofóros capaces de aumentar su emisión c uando están muy próximos e ntre sí, com o aq uellos que dan luga r a emi- sión inducida por a gregación ( AIE), agre gados J, o FRET y los complejos luminis- centes de lantánidos, permit iendo obtener n an opartícula s poliméricas con una ma- yor concentra ción de fluor óforo e ncapsulado y con un brill o much o may or [ 76 , 77 , 79 , 80] . Algunos eje mplos del e mpleo de nanopartículas poli méricas en aplicacio nes fluorimétricas son s u emp leo como na notransportad ore s [75 , 81] , como bi osensores de miRNAs [74 , 82 , 83] , Cu 2+ , Hg 2+ , pH o tempera tura en tre otros [78 , 84] , así com o s u empleo en bioi magen [75 , 77 , 79 ] . Introducción 297 Figura B – 13 . Esquem a de la estructura de la s nanop artíc ulas polim éricas carg adas con fluor óforos en su interior (estrellas). El polímero q ue forma la nanopartícul a está representado por una espiral azul. Inferior: est ructuras d e algunos de los polímer os emplea dos en las n anopartículas p olimé ricas. 3. 5.- Nan opartículas dendríticas Las nanopartículas dendrít icas son macrom oléculas p olimérica s de forma globular compues tas por dendrímeros, los cuales pres entan una estructura a rbo- rescente comp uestas por subunidades m onoméricas, denominadas dendrones, que se repiten en el espa cio a med ida que se separan del núcleo centra l [85] . Cada capa estructural del dendrón constituye una generaci ón ( Figura B – 14 ) por lo que las na- nopartículas dendrít icas se suelen nombrar seg ún el número de ge neraciones d e dendrímeros que compone n cada dendrón (DnG con n = 0, 1 , 2 , …) [86] . Aunque las nanopartículas dendríticas están formadas por pol ímeros al igual que las nanopar- tículas polímer icas la princi pal diferencia entre ambas es que en las na nopartículas poliméricas los m onómero s se disponen de f orma ale atoria, mientras que e n las nanopartículas dendrítica s es posible c onocer con exac titud la posición relativa de Bloque B. De sarrollo de nu evas nanoplataform as con aplica ci ón en bioim agen 298 cada mo nómero. Los princi pales polímeros q ue han dado lugar a este tipo de es- tructuras s on la poli(amido amina) ( PANAM) [86-88] y la poli(pr opilenoimi na) (PPI) [88] . Figura B – 14 . Es tructu ra esquem ática de u n den dríme ro, dendrón y n anopartícula dend rítica. Reprodu- cido y adapt ado con permiso de D. As truc et al. [85] Copyrig ht © 2010, American Che mical Soc iety. Los dendrí meros presenta n u n dete rminado número de bolsillos inter nos, determinados por el tipo d e polímero y el número d e gener aciones q ue presente, por este motivo, junto c on su gran u niformidad de f orma y tamaño, alta dens idad y la posibilidad de poseer difere ntes grupo s f uncionales en su super ficie, han sido empleados como transport adores de fárma cos [88 , 89] . Al gunos dendrímeros pueden presentar una débil flu oresc encia generalmente en t orno a 450 – 500 nm y con tiem- pos de vida inferiores a 10 n s [90] , lo que hay que tener en cuenta en el caso de aque- llos dendrímeros que alberguen fluor óforos en su inter ior o en la periferia , pu- diendo tener lugar diferencias en sus propiedades fluoresc entes deb ido a la inter- acción del fluorófor o con los dendr ímeros o a las dife rencias en el ambiente e n e l Introducción 299 que se encuentran los fluoróforos situa dos en el interior con respecto a los d e la periferia de la estructura [86 , 87 , 91] . 3. 6.- Nan opartículas lipídicas Los lip osomas so n nanopar tículas esfér icas constit uidas por una bicapa fos- fo lipídica artificia l con un ta maño que pue de va riar entre 50 y 1000 nm. Los lipo- somas pueden alojar e n su interior moléculas h idr ófilas, así como moléculas lipófi- las en el comparti mento hidrofóbico formad o por la bic apa lipídica [92 , 93 ] ( ¡Error! N o se e ncuentra el origen de la referenci a. ). La gran ventaja de estas nanopartícula s es su gran biocompatibi lidad y biodegradación, debid o a su sim ilitud con otras es- tructuras natura les [94] . Debido a su capa cidad de a loja r moléculas en su interi or , han sido muy emplead as como nanotran sportadore s de fármacos o fluorófor os , dando luga r a liposo mas f luor escen tes con un brillo elevado debido a la elevad a concentración de fluor óforo en su i nterior [94] . Este hecho, j unto con la posibili dad de funcionalizarlos externa mente con fluor óforos [95] o moléculas específica s , ha permitido su emp leo en b ioimagen mediante m icrosco pía de fluorescencia [93 , 96 , 97] . Otras na nopartículas li pídica s están for madas ún icamente por una ca pa li- pídica . Presentan, a l contrario que los lipo somas , un núcleo interior lipófilo q ue permite la acumu lación de sustancias hidrófobas en su int er ior ( Figu ra B – 15 ) , siendo c omplicado carga r estas nanopartíc ulas co n moléculas hidrófilas . Esta s mi- celas presentan un tamañ o ligeramente i nferior a los li posomas (entre 5 y 1 00 nm) lo que favorec e su solub ilidad y la internalizació n celul ar [ 98] . Algunos ejempl os de este tipo de nanogotas o m icela s, al igual q ue los lip osomas, tambié n han sido e m- pleadas e n bioimagen [ 99-101] . Bloque B. De sarrollo de nu evas nanoplataform as con aplica ci ón en bioim agen 300 Figura B – 15 . Estructura de n anop artículas lipóf ilas capaces de alojar mo léculas en su interior. 3. 7.- Nan opartículas magné ticas Son generalmente nanopartículas esféricas superpara magnéticas que pre- sentan u n único d ominio magnético constante y son ca pa ces de re sponder a la apli - cación de un campo magnético con un magnetismo residua l y coercitividad prácti- camente despreciables [102] . Están compuestas habitua lmente por hierro, cobalt o, óxidos de hierro (FeO, Fe 2 O 3 , Fe 3 O 4 ), ferritas de manga neso, cobalto, níquel o mag- nesio , FeCo, FePt o CoPt, entre otros [ 103] . La gran superficie específica que presentan las nanopartículas junto con sus propiedades magnéticas las ha convertid o en exce lentes nan oplataformas para aplicaciones biológicas y biomédica s ya que facilitan los pro cesos de lavado, preci- pitación y conce ntración de las nanopartículas al aplica r un ca mpo mag nético ex- terno. A lgunas de estas nanoplataformas han sid o emplea das p a ra la dete cción de miRNAs [104] , á cido úrico [ 105] , glutatión [ 106] o glu cosa [107 , 108] , así como en el desarrollo de otros bi osensores [103 , 109] , o incluso para aplicacio nes medioamb ientales como la purificación de agua [ 110 , 111] . Introducción 301 3.8. - Nanopa rtículas de sílice ( SiO 2 ) Se trata de nanopartículas c ompuestas por una matriz hidrófoba de sílice (SiO 2 ) que pue den ser dispersadas en soluciones acuosas. Pre sentan una elevada porosidad y son bi ocompat ibles y biodegrad ables [112 , 113] . Pueden ser funcionaliza - das en su superficie por dife rentes gru pos [114] y p ueden albergar algunas moléc ulas como f luoróforos o fármacos en el interior de la matri z de sílice. La sílice es fotofí- sicamente inerte, por lo que las propiedades fotofísicas d e estas nanopartículas de- penderán exclusivamente de los fluorófor os que se encuentre n embeb idos e n s u matriz o adheridos a su superficie [ 113] . Además, la matriz de sílice es capaz de pro- teger a las moléculas embeb idas en su matriz de agentes extern os [113] . Estas propie- dades de la s nanopartículas de sílice han potenciado su empleo c omo nanotrans - portadores y en el desa rrollo de biosensore s [112-116] entre los que se encuentran bio- sensores para la dete cción de pH [117] , α – trombina [118] , Zn 2+ [119] , Cu 2+ [120] o H 2 O 2 [121] . Así pues, como he mos v isto, existe una gran cantidad de NPs con difere nte composición, estructura y ta maño, confiriéndoles una gran versatilidad para actuar como nanoplata formas q ue se ajuste n de for ma precisa a las funcionalida des y ne- cesidades q ue se requier an, lo que ha dado lugar a nu merosas apl icaciones en una gran varieda d de á mbitos difere ntes CAPÍTULO V INSTRUME NTACIÓN Y METODOLO GÍA Bloque B. De sarrollo de nu evas nanoplataform as con aplica ción en bioim agen 310 Figura V – 2 . Esquena de i nterfere ncias q ue se pueden generar en la determinac ión de l a forma de una nanopartícu la debido a la tensión superficial del agu a entre la superf ici e y la nan opartícula (izquie rda) y entre la supe rficie y l a punta (de recha). • Modo dinámi co o modo no contacto : El cantiléver oscila a una determinada frecuencia (10 0 -400 kHz) y amplitud (1 0 -1 00 Å) sobre la muestra a una dis- tancia de 10-100 Å. Las fuer zas que la muestra ejer ce sobre la punt a provocan una variación de estos parámetros permitiendo así realiza r el m apa topográ- fico. Estas muestras pue den ser atra ctivas o repulsivas. L as fuerzas atra ctivas dan lugar a una disminuci ón de la frecue ncia de vibración d el ca ntiléver, mientras que las repulsivas genera n un a umen to de su frecuencia de vibra - ción. Con este mod o no se daña la punta ni la muestra, pero las ca pas de agua pueden generar interferencias por o casionar el frenado de la oscilación de la punta. Además, para obtener resoluciones eleva das se necesita un es- caneo más lento y las gotas d e a gua pue den confu ndirse top ológicamente con la muestra dando lugar a interferencia s. • Modo de golpeo (“tapp ing mode ”). Es una combinaci ón d e los dos modos anteriores, ya q ue la punta está en contacto inter mitente con la superficie de la muestra con una f uerza de presión déb il, disminuy endo de esta forma el daño que se genera d ebido al a rrastre conti nuo de la p unta sobre la superfi- cie. Este modo prese nta me jores prestaciones para la alta resolución y evita la presencia de artefactos en las imágenes obtenida s. Sin emba rgo, requiere un tiemp o de escaneo alto, no permi te el empleo de muestras líquidas y no permite alcanza r la re solución atómica. Debido a la intera cción de la punta con la muestra, la AFM también permite medir algunas propiedad es mecá nicas de la como defo rmación mecánica, elástica Capítulo V . Instrume ntación y metodolog ía 311 y fuer zas de adhesión [122-124] . A sí como otras propied ades com o el cambio d e la distribución de la ca rga eléctr ica en una superf icie o fuer zas magnética s [124] . Figura Figura V – 3. Esquem a del funcionam iento de AFM en modo c ontact o ( izquierda) y di nám ico (derecha). Reproducido y adaptado co n permiso de Y.F. Dufrêne et al. [123] Copy right © 2017, Natur e Publishing G roup . CAPÍTULO VI SÍNTESIS Y CARACTERI ZACIÓN DE NANOPARTÍ CULAS PL ASMÓNICAS Capítulo V I. Síntesis y caracterización de nanop artículas p lasmónicas 315 La nanotec nología es un cam p o en aug e en el que su rgen ca da día nuevas na nopla- taformas, así como nu evas aplicaciones de las ya conocidas. De entre todas estas nanoplata- formas, prese ntan un especial interés las nanop artículas plasmónicas debido a su capacid ad de producir el confinamiento de la luz en regiones cercana s a su superficie gracias a los plasmones sup erficiales de resonancia, los cuales pueden d iseñarse en función de la aplica- ción para la que se requie ran. Esta propiedad de las nanopartículas plasm ónicas de interac- cionar con la luz en la e scala nanométrica las sitúa en el pun to de mira para e l desarrollo de biosensores luminiscentes ya que, además de s er una excelente plat aforma d e soporte, pue- den p roducir cam bios en la s p ropiedades fotofísicas de l os fluoróforos que se encue ntren próximos a su supe rficie. 1. -A ntecedentes La primera síntesis de coloi des de oro f ue re alizada por M. Farada y en 1 857 [125] , lo q ue sembró el precedente para que unos a ños después, en 19 25, R. A. Zsig- mondy ganara el premio Nobel de Química por su demostración de la naturaleza heterogénea de la s disoluci ones coloidales. U na de la s primeras ref erencias a las NPs de plata fuer on los tr abajos de M. C. Lea en 1889 [126 , 127] en los que o btuvo disoluciones coloidales de NPs de plata estabilizada s con citrato a las que se refería como plata alotrópica, con pro piedad es diferentes a la plata metálica. Casi un siglo más tarde, en 19 79, J. A. Creighton llevó a ca bo la síntesis de col oides de plat a mediante la reducción de nitrato d e plata (AgNO 3 ) con borohidruro sódic o (NaBH 4 ) [ 128] , la cual ha sido hasta hoy una más d e las metodologías más emplea das, estableciéndose numero sas estrategia s de síntesis derivada s de este método. El he- cho de que haya tanta diferencia entre la sín tesis de coloides de or o y plata se debe, sin duda , a la mayor reactivida d de la plat a, que d ificulta en gra n med ida el control de la forma y tamaño de las nanoestructuras. Es esta dificultad la que ha da do lugar a que, desde finales del siglo XX, se hayan descrito multitud de m etodol ogías para la síntesis de nan opartícula s de plata con morfologías diversa s. 1.1. - Principales me todologías de sí ntesis de na nopartículas plasm ónicas Podemos dividir las e strategias de síntesis de nanopart ículas (NP s) pla smó- nicas en dos grandes grupo s atendiendo al tamaño y morfología del iniciador de la síntesis: métodos de arriba aba jo (t op – d own ) y los méto dos de abajo a arriba ( bottom – up ) ( Figura VI – 1 ). Bloque B. De sarrollo de nu evas nanoplataform as con aplica ción en bioim agen 316 Figura VI – 1 . Esquema de los mec anismos de s íntesis de n anoestru cturas plasmónic as. 1.1.1 .- Métodos d e arriba a abaj o ( Top- down ) En lo s métodos top-d own la sín te sis de nan oestructura s tiene lugar a partir de un materia l macr oscópico, el cual se va fra gment ando progre sivamente me- diante un pa trón predefinido hasta dar lugar a las nano estr ucturas deseada s. Me- diante estos métodos pued en obtenerse nanoestruc tur as con gra n monodisper si- dad. Sin embargo, estos m ét odos re quieren h abitualme nte de téc nicas e instrume n- tación avanzada s para pod er llevarlos a cabo [8] , por l o que no es tán tan ampl ia- mente extendida s co mo las técnica s bottom – up . Además, las téc nicas top – down no resultan rea lmente efectiva s pa ra la sínte sis de m orfologías irregulares [ 129] y pue- den generar imperf ecciones en la superf icie de las NPs [130] . Un ejempl o de método top-down relativamente senc illo es la obtenci ón de coloides de oro y pla ta me diante la abla ción de estos materiales en un l íquido p or un láser p ulsado [131 , 132] . Sin embargo, esta técnica no tiene un control precis o sobre la morfo logía obtenida, req uiere el empleo de in strum entación espe cializada y es necesario suministra r gran cantidad de energía mediante el láser para producir las NPs [129] . Uno de lo s mét odos top – down más exte ndido es la lit ograf ía. Consiste e n pro- ducir un patró n predefinid o, el cual se sitúa en la superficie de un f ilm contin uo de metal. Posteriormen te el metal se elimina de las zonas que no están protegidas por la plantilla [8] . S e han desa rrollado diferentes m étod os c omo la litogra fía óptica, haz de electron es, sonda de exploración, impresión o pluma de inm ersión entre otros [8 , Capítulo V I. Síntesis y caracterización de nanop artículas p lasmónicas 317 132 , 133] . Ademá s de la ablación y la litogra fía pode mos encontra r muc hos otros mé - todos top – down , como la evaporación térmica , m olienda de bolas o chispo rrote o ( sputtering ). 1.1.2 .- Métodos d e abajo a arriba (Bottom- Up ) Las estra tegias de síntesis bottom – up parten por lo genera l de la red ucción de los át omos metálic os q ue se encue ntran formando parte d e sales y de su p oste- rior a sociación con otr os át omos metá licos para ir cre ciendo p oco a p oco hasta ge - nerar las nanoestruc turas d eseadas. S on ge neralmente métodos mucho más se nci- llos y económico s que los métodos top – down , a unque en ocasiones p ueden pre sen- tar dificultad es para lograr homogeneida d en las nanoestruct uras obtenidas, ya que, a pesa r del gran avance que ha tenid o la nanotecnología en el último siglo, aún no se conoce n con ex actitud todos los mecanismos implicad os y el control de la síntesis de nanopartículas se encuentra aún en una eta pa temprana. Hasta la fecha, el mec anismo más ace ptad o pa ra la síntesis de NPs se ba sa principalmente en tres etapas: reducción , d e los iones metálicos que forman parte de una sal a átomos me- tálicos; n ucleació n , en la q ue se va n f ormando unas pe q ueñas a grupacio nes de á to- mos q ue han sid o previa mente reducidos; y crecimient o , por la cual se van aña- diendo sucesiva mente át omos a los núcleo s formado s en la etapa de nucleació n hasta da r lugar a la NP ( Figura VI – 2 ). Por l o tan to, para la síntesis de NPs metálicas se req uieren tres elementos f undame ntales: u na sa l me tálica a partir de la cual los átomos metálic os pueda n reducirse, un agente red uctor y un lim itante de forma ( capping agent ) que favorezca la formación de NPs de una dete rminada forma y tamaño. Figura VI – 2. Esquem a de la sí ntesis de NPs de plat a a partir de u na sal [134] . Bloque B. De sarrollo de nu evas nanoplataform as con aplica ción en bioim agen 318 Se han diseñado multitud de metodologías dife rentes para sintetizar NPs plasmónicas ( Tabla VI – 1 ). En función d e las condiciones en las que tenga lugar la síntesis y de la elección de ca d a uno de los elementos necesa rios p odremos clasifi - carlos en tres gra ndes grup os en f unción de la matriz donde se desarrolla la síntesis: síntesis biológ ica en las que se emp lean moléculas o extractos procedentes de seres vivos; síntesis intra celulare s o in vivo en las cuales la síntesis tiene luga r directa- mente en el interior celular ; y síntesis en d isolución ( wet synth esis ). Para cada uno de estos grandes tipos de síntesis se ha n descrito múlti ples métodos de diver sa di- ficultad y rendim iento, si bi en la sí ntesis en di solución ha sido uno de los más em- pleados por ser lo s método s más aseq uibles tanto eco nómica com o in strumental - mente y habe rse obtenido c on el los bue nos rendi mientos. A demás, la elecció n del método debe hacerse en fu nción de la a plica ción que s e le vaya a dar a las NP s, ya que el empleo de a lgunos compuestos en la síntesis po dría dificulta r su aplica ción al no poder ser eli minados posteriorme nte. 1.1.2 .1.- Síntesis biológica Esta metodología de sínte sis también recibe el nombre de síntesis ver de. Trata de sintetizar NPs de pla ta empleando el me nor número de a gentes químic os posible, ya que su finalidad es funda mentalme nte la aplicación e n huma nos u otros seres vivos y algun os co mpuesto s pued en re sultar tóxicos o perjudicia les pa ra la salud [135] . Este método de síntesis emplea como agente s reductores y limitantes de forma molécu las orgánicas procedentes de seres vivos com o bacteria s, hongos, a l- gas o plantas, aunque la síntesis no se lleva a cabo en el interior de los organismo s [136 , 137] . Se han sintetizado n anopartículas de pla ta emp leando como agen tes reduc - tores extractos vegetales de Alhagi m aurorum [137] , Magnolia kobus [138] o moléculas obtenidas de espec ies vegeta les como la lignina [139] . También se han sintetizado NPs de plata emplea ndo hongos com o Geotricum sp . [ 140] o Trich oderma viride [ 141] ya que las proteínas secretadas por estos hongos son capaces de producir la reducción de los á tomos de pla ta d e la sal emplea da como prec ursor. Por otro lado un ejempl o de ba cteria empleada para la síntesis extracelular de NPs de plata es Sh ewanella oneidensis [142] 1.1.2 .2.- Síntesis intracelula r o in viv o Estos métod os llevan a ca bo la síntesis de NPs d irecta mente en el i nterior celular. Fue llevada a cabo por pr imera vez en 199 9 por T. Klaus et al ., lo s cuales Capítulo V I. Síntesis y caracterización de nanop artículas p lasmónicas 319 indujeron la formación d e nanoestruc turas de apr oximadamente 200 nm en el in- terior de bacteria s P seudomonas stutz eri ( Figura V I – 3 ) [143] . Otros micr oorganis mos empleados han sido B acillus sp . [144] La síntesis se lleva a ca bo generalmente me- diante la adición de sal de pla ta al medio de cultivo s, la cua l se introduce en el interior de los microorganismos con facilidad debido a que poseen péptidos que favorecen la adhesión de pla ta y NPs de plata a su superficie y que poseen la capa- cidad de reducirla [136 , 145] . Figura VI – 3 Imagen de TEM de Pseudomonas stutzer i con NPs de plata en su interior. Rep roduc ido con permiso de T. Klaus et al. [143] Copy right © 1999, The Nation al Acade my of Scien ces. 1.1.2 .3.- Síntesis en disol ución ( wet synthesis) Son los método s más empleados debido a su sencillez y a tratarse de méto- dos má s econó micos que o tros, que no suelen prec isar una instru mentación costosa y so fistica da. La sín tesis se lleva a c abo mediante uno o varios pasos en dis olución. En funció n de las condiciones emplea das, el meca nis mo de síntesis y los agentes reductores y limitantes de f orma empleado s se ha n descrito mult itud de métodos de síntesis de NPs. Algunos de los más empleados son el crecimiento mediado por semilla, la síntesi s por poli oles o la síntesis fotoinduci da. Otros mét odos incluye n el empleo d e N,N -dimet ilformamida (DMF) [146] , peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ) [147- 149] o a zúcare s [150] como a gentes reductore s, a sí como co mbinacione s de los método s mencionados anteriormente [151] . Al f inal de la sección, en la ¡Error! No se encuentra Bloque B. De sarrollo de nu evas nanoplataform as con aplica ción en bioim agen 326 aleatorio, por lo que obtene r NPs de pla ta monodispersas puede convertirse en u n auténtico reto. De hecho, i ncluso hay q uien c onsider a que “ en el estado actual de desarrollo, no es una exag eración d ecir que la síntesis química de nanocristales metálicos (así como p ara otros materiale s sólidos) es m ás un arte qu e una ciencia” [194] 3.1. - Síntesis de nanopa rtícula s plasmónicas de plata Como ya hemos vi sto, hay numer osas metodolog ías de síntesis de abajo a arriba por lo que puede resultar comp licado selecci onar la que mejor se a dapte a las condiciones de trabajo disponibles. Tras haber rea lizado numeros os ex perimen- tos con diferen tes metodologías los me jores r esultados en la sí ntesis AgN Rs se ob- tuvieron media nte síntesi s en d isolución por el métod o de polioles descrit o por J. Patarroyo et al. [157] . En este método se e mplea como d isolvente eti lenglico l (EG), e l cual, ademá s de cómo disolvente, puede actuar como reductor a tempera turas ele- vadas (> 1 52°C) [159] ; ta mbién se a ñade á cido tánico en baja s concentraciones como agente co-reductor. El ácido tánico inicia la reducción de lo s átomos de plata facili- tando la nucleació n masiva en semillas decahédricas mono disper sas, las cua les posteriorme nte crecen dan do lugar a las AgNRs des eada s. Como limitante de forma se emplea poli(vin ilpirrolidona) (PVP) de elevada masa molar (M = 1,300 ,000 g mol – 1 ). Este pol ímero se une preferentemente a las cara s (100) de las semillas de maclado m últiple, permitie ndo el cr ecimie nto en form a d e nanobarra median te la deposición de átomos de pl ata en las caras (111) ( Figura VI – 6 ) [ 159 , 187 ] . L a sal de plata empleada en este protoc olo es el trifluoroacetato de plata (AgCOOF 3 ), ya que, aun- que el nitrato de pla ta (AgNO 3 ) es ampliame nte empl eado, el AgCOOF 3 es much o más estable e insensible a impurezas del diso lvente, ademá s el AgNO 3 genera NO 2 a pa rtir de la descomposición d el ion nitrato , el cual puede interferir en la síntesi s de las NP s [62 , 157] . También se incorpora en la reacción HCl como fuente de iones Cl – . A día de hoy, su fu nción en la síntesis de NPs de pl ata no está to talmente clara . La teoría más aceptad a afirma q ue f avorece su crecim iento aniso trópico hacia una determinada estruc tura cristalográfica mediante la esta bilización de las ca ras (100) de las NPs, resultando, por lo tanto, crucial para la obte nción de NPs de una deter- minada morfología [12 , 157 , 158 , 162] . Por otro la do, otros autores plantean la formación de cloruro de plata (AgCl) el cual actuaría como núcleo heterogéne o sobre el que se produciría el creci mient o de las NPs [186] o a ctuaría como agente de pasivaci ón, recubriendo las NPs de una f ina capa de AgCl que fa vorecería su estabiliza ción [174] . Capítulo V I. Síntesis y caracterización de nanop artículas p lasmónicas 327 Figura VI – 6 . Esquema del crecim iento de Ag NRs a partir de las semillas decaédric as mediado po r la adhesión de l PVP a las c aras (1 00) de la NP. El crecimiento se produ ce en la di rección indi cada por l as flechas azu les [159] . 3.1.1 .- Protocolo emp leado para l a síntesi s de nanobarras de plata por poliole s La síntesis se realiza en un matraz esférico en un baño de glicerina a 170 °C empleando agitaci ón magnética a 300 rpm. Como se ha mencionado anteriorme nte la síntesis de M NPs comprende va rias eta pas q ue dependen de d iversos factores, muchos de e llos, por ser ext remadamente sensib les o desconodidos, se h acen a me- nudo i ncontrola bles. Por el lo es nece sario extremar el control del material y pará- metros involucra dos en la mis ma. Todo el mater ial de be estar completamente li m- pio, empleando, siempre que sea posible, mat eria l de estéril de un solo uso. E n el caso de q ue sea necesa rio, limpiar el mater ial de vidr io con HNO 3 y mucha a gua mili-Q pa ra eliminar cualquier traza de impurezas. La sín tesis de NPs y, en especial la de AgNPs, es muy sensi ble a impurezas, empleá ndolas como nuevo punto de nucleación inc ontrolado de las NPs y producir a lteraciones e n el resultado de la síntesis. En este protocolo de síntesis se emplea co mo disolvente EG a nhidr o d e alta purez a y recién pr eparad os En ocasiones, el pr opio EG pued e iniciar la red uc- ción del AgC OOF 3 a dquiriendo la disolución una tona lidad rosa salmón que deb e evitarse, siendo és te un primer punto de control de la rea cción, ya q ue los á tomos de Ag metá licos produc ido s por la reducción de la sal pueden interferir durante las Bloque B. De sarrollo de nu evas nanoplataform as con aplica ción en bioim agen 328 fa ses de n ucleación y crecimiento. Esta diferencia de colo r con respecto a una diso- lución de AgCO OF 3 re cién prep arada se puede aprec iar en la Figura VI – 7 . Figura VI – 7 . Fot ografía de un a dis olución de AgC OOF 3 282 mM en EG re cién prepar ada (izquie rda) y una disoluc ión de AgC OOF 3 redu cido en EG (dere cha). En resume n, el protocolo sistemático empleado para la síntesis de A gNRs consiste en: 1. En primer lugar, se añaden 2.5 mL d e EG y dejamos qu e se termost atice esperando aproximadamente 10 m inutos hasta que se alcance la tempe- ratura d e la reacción (170 °C). 2. Añadimos 30 μ L de á cido tánico de co ncetración va riable ( 3 – 3 0 mM) dependiendo de las condic iones ambie ntales del lab or atorio ( tempera - tura, humedad e iluminación) en el transcurs o d e la reacc ión. La elec- ción c orrecta solo se pued e cono cer a p osteriro ri d el desarrollo de la reac- ción, siendo por ta nto neces ario adapta rla en f unción de los resulta dos. 3. Añadimos 25 0 μ L de HCl 3 mM. 4. Añadimos 750 μ L de PVP (M = 1 300 000 ) con una co ncentración de 20 mg/ml. Diso lver el PVP en EG se puede f acilitar ca lentando a 40 °C en un bañ o de agua. Sin emba rgo, no se reco mienda e mp lear baño de ul- trasonidos para facilitar la disolución del pol ímero, ya que éste puede provocar la fra gmentación del polímer o y a lterar los resultado s de la síntesis. Capítulo V I. Síntesis y caracterización de nanop artículas p lasmónicas 329 5. Añadimos 2 00 μ L de AgCOOF 3 282 mM, l o que tendrá como resultad o inmediato el inicio de la nuclea ción. 6. Trascurrido el tiempo de rea cción, que depende rá del tamaño de Ag- NRs final desea do, la detenemos i ntroduciend o el matr az en hielo. La adición de agua , así co mo su co nservación a bajas tempera turas, impide la tra nsformación del EG en glicoalde hído ( Ecua ción V I – 1 ) y, por tanto, inhibe l a reducción de ca tiones de pl ata que no hayan reacciona do todavía y pe rmanezcan en la disolución. Además el PVP emplead o durante la sín tesis puede ejercer un papel pr otector de las AgNRs evitand o su d egradació n [195] . Por ello, una vez fina- lizada la síntesis añad imos a gua Mili -Q hasta alcanza r un volu men f inal de 50 mL y las conserva mos en frío ( 4 °C) y en oscuridad . De esta forma las AgNRs puede n permanecer muc ho tiempo (meses o incluso año s) mantenie ndo la forma si n de- gradarse. Debido a la s fuertes re sonancias que presentan las NP s de pla ta el proceso de la síntesis puede segu irse fá cilmente mediante los cambios de col or de la diso- lución co n el tiemp o. Nada más añadir la sal de plata, comienza la nucleación, pa- sando la disolución de color transparente a ama rillo. A continuación, las AgNRs irán aumentando de tamaño y de relación de a specto (RA) lo que producirá el cam- bio de color de la disolución de amarillo a rojo, marrón y, finalmente verde ( Figura VI – 8A ). Una vez q ue la disolución haya alcanz ado el color deseado, la detenemos sacando el matraz del baño de glicerina e introduciéndolo en hielo hasta que se enfríe ( Figura VI – 8B ). Cuanto má s tiempo dure la rea cción, mayor será la RA de las nanopartículas que se obtendrán. Sin embargo, est ablecer el tiempo exacto ne- cesario para obtener NP s con una dete rminada relaci ón de aspecto es u na tarea realmente co mplicada , ya que la sínte sis es alta mente dep endiente de t odo tipo de factores externos e impureza s, por lo que la velo cida d a la que transcurre la reac- ción puede va riar de un día a otro o en diferentes época s del año, en gran medida debido a la s condiciones ambienta les, lo que supone un gran pr oblema de repro- ducibilidad. H. J. Ha n et a l . reportan u n problema similar duran te la síntes is de nanocubos de plata en la que obtenían d iferentes res ultados si la rea cción se rea li- zaba un día nublado, soleado o por la n oche debido a las diferencias en la ilumina- ción a mbiental, l o cual solventaron realiza ndo la síntesis siempre en tot al oscuridad Bloque B. De sarrollo de nu evas nanoplataform as con aplica ción en bioim agen 330 [156] . En nuestr o caso, la va riación de los factores a mbientales en la sí ntesis de Ag- NRs se re alizó a justando l a concentración de ácido tánico. Cua nto mayor sea l a concentración de ácido tánico mayor será la velocidad d e formación de las semilla s, si ocurre demasiado depri s a será difícil controlar el cre cimiento de las A gNRs y se obtendrán disolucio nes de color grisáceo, mientra s que si la velocidad es dema- siado len ta solamente se pr oducirá la f orma ci ón de las semillas, sin que haya un crecimiento poster ior en for ma de barra s. Figura VI – 8 . A) Camb io en el color de la diso lución de Ag NRs en función del tiempo de reacción. Imágenes ex traídas del video al q ue se puede acce der med iante el código QR incluid o en la figur a. B) Fotografí a de la reacc ión una vez detenida mediante e l baño de h ielo C) Fotog rafía de l os AgNRs obte- nidos y D) Fotograf ía de una diso lución dilu ida de los Ag NRs obten idos. Con esta met odología se sin tetizaron AgN Rs d e diferentes tamaños. Las pro- piedades de estas AgNRs se ca racterizaron mediante la obtención de los espectro s de absorción UV-Vis así como imágenes de TEM que se muestran en la Figu ra VI – 9 . Capítulo V I. Síntesis y caracterización de nanop artículas p lasmónicas 331 Figura VI – 9 Espectr os de abs orción (su perior) e imágen es de TEM (inferio r) de AgNRs de diferentes tamaños s intetizados por el métod o de polio les. En rojo y en la esqu ina inferior derecha de c ada ima- gen, barr as de escala de 500 nm y 100nm pen las imágenes superi ores e inferio res, respectiv amente. En la Figura VI – 9 se muestran los espectros de a bsorción n ormalizados de AgNRs de cuatro ta maños difere ntes. Todo s ello s presenta n dos bandas bie n dife - renciadas, una con un pico más intenso en torno a 400 nm, que se corr esponde con la re sonancia de su plasmón tra nsversal, y ot ra men or y más a ncha, correspon- diente a la resonancia de su plasmón longitudinal, cuya posición espe ctral dep ende de la RA, obteniéndose val ores de 55 9 nm, 597 nm, 729 nm y 8 18 nm para RA d e Bloque B. De sarrollo de nu evas nanoplataform as con aplica ción en bioim agen 332 2.12 , 2.20, 3.02 y 4.00, respectivamente. Tal y como se puede observa r en las imáge- nes de microsc opía ele ctrónica de esta figura las AgNRs de menor RA son las má s pequeñas y presentan una morfología mucho más redondeada que las otras barras con mayores R A, si e ndo las AgNRs co n un valor de RA de 4. 00 las barras más alar- gadas que se consiguier on. Cada uno de est os t ipos de AgNRs proviene de una reacción difere nte, ya que la introducción d e cua lquier tipo de material pa ra extraer alícuotas durante la síntesi s genera puntos a dicionales de nucleación que provocan cambios en la reacción. Figura VI – 10 Rep resentac ión del l ogaritmo nepe riano de la RA de A gNRs con respec to a los LS PRs (símbolos). La línea ro ja representa e l ajuste linea l de los dat os a la Ecuación ( VI – 3) ( r 2 =0 .92). Las ba- rras represen tan el e rror estándar de entre 10 -15 Ag NRs diferentes. La RA de las AgNRs está relacionado, con la longitud de onda de resonancia del plasmón lon gitudinal mediante una función exp onencial. En la Figu ra VI – 10 se realizó un ajuste li neal ( Ecuación VI – 3) entre el logaritmo neperia no de los va - lores de RA promedio obte nidos a pa rtir de i mágenes de TEM midie ndo 10 – 15 AgNRs y la longitud de onda del LSPR longitudinal de las NPs. Al presentar un crecimiento exponencial, el valor de la LSPR aumenta mucho más rápido cuanto mayor es la RA ., no siguien do en todo el rang o de LSP Rs obtenidos una te ndencia exclusivamente li neal como presentan otr os autores co mo B. Wile y et al. [12] . Capítulo V I. Síntesis y caracterización de nanop artículas p lasmónicas 333 ln ( 𝑅𝐴 ) = 0. 00213 ∙ 𝐿𝑆𝑃𝑅 − 0. 42 (VI – 3) Las AgNRs obtenidas pueden someter se tras la síntesis a un proceso de so- brecrecimiento con el fin de genera r AgNRs co n diferentes RAs. Con este propó sito se añad ieron 5 ml de EG e n un matraz esférico a 17 0 °C en u n baño de g licerina y se adicionaron (en este orden) 1 mL de PVP (20 mg/mL) y 1 mL de las AgNRs sobre las que se vaya a realizar el crecimiento. En este caso se emplearon AgN Rs previa- mente sintetizados con un LSPRs longitudi nal en 559 nm y una RA de 2.12 ( Figura VI – 9) . Añadimos 100 μ L de AgCOOF 3 28 2 mM y lo dejamos rea ccionar d urante 10 minutos con agitación ma gnética a 300 rpm. No es necesaria la a dición de á cido tánico, ya que éste se emple a para generar la nucleació n y al tratarse de un proces o de crecimiento n o es preciso generar nuevos núc leos, sino q ue los átomos d e plata se vaya n incorp orando a la s NPs existe ntes. M ediante este procedimien to se pro- dujo el crecimiento de las NPs, dando lugar a AgNRs con un LSPR de 666 nm. Para tratar de controlar el desplaz amiento que experimen taba el LSPR se repitió de nuevo el protoc olo de sobrecrecimient o con otra alícuota de AgNRs con un LS PR de 55 9 nm, pero añadiendo en e sta ocasión u na menor cantida d de sal d e plata ( 50 μ L de A gCOOF 3 282 mM), obteniéndose AgNRs con u n LSPR de 5 88 nm ( Figura VI – 11 ). Sin embargo, en o tra s repeticione s de este experimento realizadas el mismo día y bajo las mismas condiciones se produjo el crecim iento e n forma de estr uctura s con otras morfologías como octaedros y AgNRs con RA superiores a 6 ( Figura VI – 12 ). El proceso de sobrecre cimiento de las Ag NRs es aún más difícil de co ntrolar de f orma prec isa que la metodología de s íntesis e mp leada anteriormente, por l o que, en el caso de haber obten ido AgNRs más cortas de lo pr evisto, es má s eficiente repetir la síntesis de nuevo antes que realiza r una reacción de sobrecrecimient o so- bre esas AgNRs. Los experimentos de sobrecre cimiento descritos fueron realizados durante una estancia breve en el grupo “Nanopartícu las Inorgánicas” del Institut o Catalán de Nanociencia y Nanotec nología (ICN2) en Barcelona (España) dirigido por el Prof. Víctor F. Pu ntes, autores del protoc olo em plead o en la sí ntesis de Ag- NRs [157] . Bloque B. De sarrollo de nu evas nanoplataform as con aplica ción en bioim agen 334 Figura VI – 11 . Esp ectros de absorc ión (superio r) e imágenes de TEM (inferior) de AgN Rs sobre los que se realizó un sobrecrec imiento me diante la ad i ción de dife rentes can tidades d e AgCOOF 3 . En l a es- quina infe rior derecha, en rojo, b arra de es cala de 100 nm. Capítulo V I. Síntesis y caracterización de nanop artículas p lasmónicas 335 Figura VI – 12. Espectr os de abs orción (s uperior) e imágenes de TEM (inferio r) de AgNRs s obre los que se realizó un sobrecrec imiento obt eniéndose un a mezcl a de AgNRs de elevada RA y nan ooctaedros. Barra de esc ala de 200 nm. Aunque los mej ores resulta dos se obt uvieron co n e l m étodo de lo s polioles que se ha descrito, tambié n se probaro n otras metod ologías, hacie ndo énfasis e n los métodos de crecimiento mediado por se milla, ya que son de l os mét odos más empleados habitualmente en la literatura especia liza da. Como pri mer ac er ca- miento se probaro n métodos de crecimiento m ediado por semilla en lo s que se em- plea como disolvente agu a mili -Q, AgNO 3 como sal de pla ta, citrato sódico (Na 3 C 6 H 5 O 7 ) como limitan te de forma y borohidruro de sodio (NaBH 4 ) com o agente re ductor para la primera eta pa de formación de la semilla si guiend o lo s pro- tocolos propues tos por var ios autores [152 , 178 , 196] . Aunque el reductor pr incipal de esta reacción es e l NaBH 4 , t al y co mo se expresa en la Ecuaci ón VI – 4 que ref leja el Bloque B. De sarrollo de nu evas nanoplataform as con aplica ción en bioim agen 342 3.2. - Purificación d e nanobarras de pl ata. Mediante el método de polioles se logra ron obtener AgNRs de diferente s tamaños. Sin e mbargo, no t odas las NPs ob tenidas pre sentan est a morfología, ob- servándose en todas las mu estras NPs esfé ricas u otras e structuras. Para aumentar el porcentaje de AgNR s se llevaron a cabo diferentes té cnicas de purificación basa- das en separa ción por centr ifugació n. Los métod os de centrifugación permit en separar na nopartículas de distinta forma y tamaño. Est os mét odos s on ampliame nte utiliza dos debido a su f ácil em- pleo y a que pueden obten erse muy buenos res ultados, sobre tod o si se combinan con gradientes d e densidad o de viscos idad. Sobre las nanopartíc ulas so metidas a la ce ntrifugaci ón a ctúan tres tipos d e fuerza s: la fuerz a centrífuga ( F c ), la f uerza de empuje ( F e ) y las fuerza s de fricción ( F f ) ( Ecuacione s VI – 5 a VI – 7) , d onde ρ p es la densidad de las nanopartículas , ρ f la densidad del fluid o, V es e l volumen de la NP, ω es l a velocidad a ngular, r es la distancia de la NP al eje de ro tación, f es el coeficiente de fricción y υ es la velocidad de NP. 𝐹 𝑐 = 𝜌 𝑃 ∙ 𝑉 ∙ 𝜔 2 ∙ 𝑟 ( VI – 5) 𝐹 𝑒 = −𝜌 𝑓 ∙ 𝑉 ∙ 𝜔 2 ∙ 𝑟 ( VI – 6) 𝐹 𝑓 = −𝑓 ∙ 𝑣 ( VI – 7) Las nanopartículas se a celeran con un eq uilibrio de fuerzas donde la suma de las fuerzas centrífuga y boyante eq uivalen a la fuerza de fricción (F c =F e + F f ) y sedimentan co n una veloci dad constante υ ( Ecuación VI – 8 ) [200] . 𝑣 = 𝑉∙ ( 𝜌 𝑝 − 𝜌 𝑓 ) ∙𝜔 2 ∙ 𝑟 𝑓 ( VI – 1) NPs con la m isma composición y d istinta forma tendrá n la misma densidad, pero su coeficiente de fricción será diferente y, como consecue ncia se moverán a diferentes velocidades. Cabe mencionar que, aunque las nanopartículas posean di- ferentes coef icientes de f ricción si el valor del cociente V/f es similar se moverán a velocidades parecidas y por tanto la separació n n o será eficaz. Por este motivo, em- pleando ce ntrifugación c on un fluido ho mogéneo ( eta nol, agua Mili - Q o etanol- Capítulo V I. Síntesis y caracterización de nanop artículas p lasmónicas 343 agua 2 :1) no se logró una separació n ef ectiva de las AgNRs, motivo por el cual se decidieron estud iar técnicas de centrifugación en gradiente, de forma que la f uerza boyante va ríe a lo largo del tubo [200] . La ce ntrifugación por gradie nte prese nta dos variantes: la centrifugaci ón isopícnica y la centrifuga ción z onal ( Rate Zonal Centri- fugation , RZC). En la centrifugación i sopícnica las NPs tienen u na densidad que está com- prendida entre la más alta y la más baja del gradiente, por lo que al ll evar a cabo la centrifugaci ón se si tuarán en aquella región del tub o que tenga la misma densidad . En este tipo de ce ntrifugaci ón el exceso de tie mpo que estemo s centrifuga ndo n o tendrá ninguna influe ncia sobre la posición de la s partículas [200] . Sin embargo, las NPs metálicas poseen ge nera lmente densidad es may ores q ue las de las mezclas empleadas usualmente para generar gradientes de densidades, por lo q ue este tipo de ce ntrifugación en gra diente no resulta eficaz. Por ejempl o, la densidad de la plata es de 1.05 x 10 – 20 g/ nm 3 , más de 10 veces superi or a la de una di solución de sacarosa a l 80 % a 20 ° C [ 201] . Por otro la do, en la RZC las NPs presen tan u na den sida d mayor que la re - gión de m ayor densidad del tubo. Durante la centrifugación se irán separándo a lo largo del tubo en fu nción d e su forma, ta maño y densi dad [200] . En este tipo de ce n- trifugación es muy importa nte el tiempo que estamos centrifugando, ya que si éste es demasiado largo todas la s partículas se a cumularán en la parte inferior del tubo y la separación no será efica z, por lo que la ce ntrifuga ción debe termi nar a ntes de que todas las pa rtículas alc ancen la z ona inferior. En pri mer lu gar, para la purifica ción de AgN Rs se t uvieron en cue nta los gradientes de sacarosa y Tween® 20, ya que son los má s emplea dos. S in embar go, no se logró u na separa ción ef ectiva con est os grad ientes. El mejor resu ltado se ob- tuvo tras una optimización de gradientes de glicerina. Tras probar diferentes tiem- pos, velocidades de centrifugación y combi naciones c on diver sos porcenta jes de glicerina se es tablecier on las condiciones ópti mas para la purifica ción. En un tubo de 15 ml se a ñaden 8 fracciones de 1 mL con un 80%, 70%, 60%, 50%, 4 0%, 30 %, 20% y 10% de glicerina en agua Milli -Q y 1 mL d e las AgNRs que queremo s puri - ficar ( Figura VI – 17 A ) Después centrifu gamos lo s tubo s durante 2 0 minutos a 7 870 g ma nteniendo la tempe rat ura a 4 °C para obtener 4 fracciones difere ntes ( Figu ras Bloque B. De sarrollo de nu evas nanoplataform as con aplica ción en bioim agen 344 VI – 17 B y C ). En la parte superior obtenemos una primer a fracción de color verde (F1), seguida de la fracc ión 2 ( F2) d e col or ama rill o an aranjado. En la pa red de la parte inferior del tubo obtenemos dos fracciones más: una tercera fracción verde (F3) y una fracción marró n (F4) ( Figuras V I-17 C y D ). Posteriorme nte se realizaron espectros de absorción tanto de la disolució n original com o de las distintas fracc io- nes, observándose camb ios notables en los espectros, particularmen te en el cociente entre las bandas plasmónicas de las AgNRs. La F1 fue la fra cción para la que se obtuvo un valor d el cociente entre la absorbancia a 600 nm y l a absorbancia a 400 nm más elevado, lo que po dría d eberse a que la F1 es la que posee un mayor por- centaje de AgNR s, ya que e ste plasmón a parece en es tr ucturas en f orma de ba rra, pero no en las esfera s, en las que sólo aparece el plasm ón de 400 nm. Por el c ontra - rio, la fra cción F4 que se localiza en la parte inferior del tubo ca rece de plasmón en 600 nm y sólo posee el pri mer plasmón, lo que pare ce indicar que es una fracción rica en AgNS s ( Figura V I – 17E ). Para confirmar la efectividad de la separa ción se t omaron entre 5 y 10 im á- genes de TE M de cada diso lución y mediante tra tamiento de dic has i mágenes con Image J , se realizó un conta je manual de todas las partí culas observadas obtenié n- dose entre 250 y 1800 partículas totales para cada una de las muestras. T ras e l con- taje se obtuvo que la fracción original obte nida direct amente de la síntesis de Ag- NRs posee un 3 2.8 % de AgNR s, mie ntras que el 50 % está compuesto por esf eras y el 16 .5 % está constituido por estructuras con otras morfologías. Tra s la ce ntrifu- ga ción con el gradie nte de glicerina, F1 es la fracció n con mayor porce ntaje de Ag- NRs, el 49.7 % de la muestra, super ior al porcentaje que presentaba la muestra ori- ginal. En la fracción F2 el porcentaje de esfera s es de 6 3.4 % y en la F3 del 60 % . Además, en la F3 encontramos cristales de sales junto a las NPs, mientras que en la F4 el 85% de las NPs son esferas grandes rodeadas de esferas m uy pequeñas, gene- rando estructuras c on una estruc tura similar a “huevo s fritos”. Capítulo V I. Síntesis y caracterización de nanop artículas p lasmónicas 345 Figura VI – 17 . A) Es quema de la prepar ación de un tubo con g radiente de g licerina p ara la sep aración de AgNPs. B) Imágenes tomadas antes y despu és de la cent rifugació n. C) Fotog rafía dónde se indican las distint as fracciones obtenidas. D) Fotogr afía de la d isolución o r iginal y de l as fracciones obtenidas, F1 -F4. E) Espec tros de abs orción d e las disoluci ones de la f otografía D. F) Imágenes de TEM de las Ag- NPs origin ales y de l as fracciones F1 – F4. En ro jo, barras de es cala d e 200 nm. Bloque B. De sarrollo de nu evas nanoplataform as con aplica ción en bioim agen 346 Figura VI – 1 8. Imágenes de TEM de la disoluc ión origina l y las fracci ones obten idas y gráf icos circula- res indic ando la propo rción de c ada morfo logía -tip o de AgNPs, dónde la reg ión verde rep resenta el porcentaje de AgNRs, la naranja e l de Ag NSs, el rojo el de agrega dos y el a zul estructur as de o tras morfolog ías. De esta forma, tras la centr ifugación, en la zona supe rior d el tubo ( F1) se sitúan preferente mente AgNRs, en la segunda fracción (F2) principalmente AgNSs de ta maño ligeramente infe rior a las AgNRs y en la región inferior del tubo (F3 y F4) podemos e ncontrar las esferas más pequeñas, así c omo cristales de sales. Esta Capítulo V I. Síntesis y caracterización de nanop artículas p lasmónicas 347 distribución se debe al gradiente de viscos idad gener ado por la s fra cci ones de gli- cerina/agua . L as esferas se mueven con may or facilidad y son capace s de a lcanzar las fra cciones d ónde la viscosidad es mayor, mientra s que el medio ofrece may or resistencia al m ovimient o d e las AgN Rs, que perma necen prefer entemente en las regiones con menor visco sidad ( Figura VI – 18 ). Ad emás, la fra cción F1 , que es la más rica en AgNRs, es la q ue presenta una mayor absorbancia normaliza da en torno a 600 nm ( Figura VI – 17E ), mientras que F4, que n o presenta banda de absor- ción a 600 nm es la que pre senta u n menor porce ntaje de A gNRs. Mediante la re- presentación del porcentaje d e AgNRs ( obtenidos por conteo media nte i mágenes TEM) frente al cociente ent re la absorbancia a 600 nm y 400 nm se logró establec er una rela ción lineal entre ambos, definida por la Ecuación VI – 9 para la que se ob- tuvo un valor ace ptable pa ra su coeficiente d e regresi ón lineal (Figura VI – 19 ). % 𝐴𝑔𝑁𝑅𝑠 = 156 . 07 𝐴𝑏𝑠 600 𝐴𝑏𝑠 400 ⁄ − 2. 32 ( VI – 9) Figura VI – 19 . Rep resentación de l porcent aje de AgN Ps de cada fr acción (Or iginal y F1 -F4) f rente al cociente ent re la abso rción a 600 nm y a 40 0 nm y el ajuste lineal obtenido. Dado que tanto e n la mues tra original c omo en las c ua tro fra cciones obte- nidas se enc ontraron AgNRs en ma yor o menor porce ntaje, éstos se contaron/clas i- ficaron a pa rtir de las imág enes TEM, (con excepci ón de la F4 debido a la baja can- tidad de AgNRs), obtenién dose los histogra mas de la ¡Error! No se encuentra el Bloque B. De sarrollo de nu evas nanoplataform as con aplica ción en bioim agen 348 origen de la re ferencia . . Como p odemos observar la fracción original es la que pre- senta una may or dispersión. Si bien los tamaños de las AgNRs de cada fracción so n muy similare s, en la s de la F3 son li geramente más la rgos que los de la s fra cciones de la parte super ior del t ubo. Además, las AgNRs de la fracción F1 s on ligeramente más estrechas que las de otras fracciones y, poseen, un a relación d e aspectos lige- ramente superi or. La composición de cada una de las fra cciones, a sí como las di- mensiones d e las AgNRs de ca da una d e ellas apa recen recogidas en la Tabl a V I – 2 . Este estudio se realizó emplea ndo unas AgN Rs d e tamaño i ntermedio a todas las obtenidas mediante el método de polioles con un plasmón en torno a 600 nm, aun- que esta sepa ración tambié n ha resultado efec tiva con A gNRs de otros tama ños, si bien no resulta totalmente eficaz con los AgNRs más grandes (LSPR longitudinal > 800 nm), para los q ue deberían emplearse otros porcenta jes de glicerina difere ntes en la prepa ración del gradiente. T ab la VI – 2 C o m p o s i c i ó n d e ca d a un a de la s fr a c c i o n e s (F 1-F 4) ob t e n ida s m ed i a n t e c e n t r if u g a c ió n en gr a - d i e n t e d e g l i c e ri n a : a g u a ( 1 0 - 8 0% ) y d im e n s io n e s de l a s A g NRs o b t e n i d a s e n c a d a fr a c c i ón . Fracción Original F1 F2 F3 F4 Esquema % AgNRs 32.8 % 49.7 % 23.8 % 37.2 % 15% % AgNSs 50% 44.3 % 63% 60.4% 85% % agregados 0.7 % 1 % 5.8 % 0.3 % 0 % % otras estructuras 16.5 % 5 % 7.4 % 2.1 % 0 % Longitud AgNRs / nm 67.13 ± 13.9 68.7 ± 10.6 68.08 ± 11.9 71.06 ± 17.4 - Anchura AgNRs / nm 32.4 ± 7 .1 28.4 ± 5 31.2 ± 5.2 32.8 ± 7.4 - Ratio AgNRs 2.01 ± 0.8 2.5 ± 0.6 2.2 ± 0.5 2.2 ± 0.6 - Capítulo V I. Síntesis y caracterización de nanop artículas p lasmónicas 349 Figura VI – 20 H istogramas de la distribución de tamaños y relac ión de aspectos de las Ag NRs de la muestra or iginal y las f racciones F 1 – F3. Bloque B. De sarrollo de nu evas nanoplataform as con aplica ción en bioim agen 350 3.3. - Caract erización morfológica y determina ción de concentra ción de na nopar- tícula s de plata En este aparta do, se analiz arán diversas imágenes de TEM y se ajusta rán a diversos modelos geométri cos con el obj et o de c onocer la concentración de una di- solución media nte medidas espe ctrofotometría de a bsorción UV -visible. Para ello estimaremos la masa d e dichas NPs mediante ICP-M S, su volumen, densidad y concenctración a pa rtir de la aplica ción de los diferentes modelos morfo -geomé tri- cos y buscare mos una relación lineal entre absorbancia y concentración para esta- blecer los valore s de a bsortividad molar de las A gNPs. Según el m odelo pr opues to para la síntesis de A gNRs por el método de po- lioles en la Figura VI – 6 las AgNRs o btenidas tendrían una estr uctura co mpue sta por un pri sma pe ntagona l en la pa rte ce ntral y d os pir ámides pentagonales e n la s puntas ( modelo prismátic o). Esta estructura pare ce a preciarse a tra vés de algunas imágenes de TEM, mientras que n o es visible en otras AgNRs, en los que se aprecia una morf ología c ompuesta por u n cilindro y dos semie sfera s en las puntas (modelo cilíndrico). En la Figura VI – 21 podemos observar algunos ejemplos de AgNRs con estructuras prismática s y c i líndricas. En algunas AgN Rs también p odemos obser- var patrones de l íneas en diferentes tonos de gris. Estas líneas re ciben el nombre de líneas de Moiré (o Muaré) y se trata n de patrones de interf erencias producidos por el haz d e electrones emple ado en TE M para obtener l as imágenes. Otras AgNRs presentan d iferentes tonalid ades sin formar un patrón de ba ndas, lo que se debe a las d iferentes posiciones re lativas de las AgNRs co n respecto a l pla no. Por tanto, dado que se observan AgNRs con morfologías prismát ica y cilín drica, no podemos afirmar que ninguno de los dos modelos sea preferente, por l o que para su cara cte- rización empleare mos amb os. Siguiendo el modelo pris má tico, el v olumen de una AgNR ( V NR ) es la suma del volumen de un pr isma ( V prisma ) y dos pirámides pentagonales ( V pirámide ) ( Ecuación VI – 10 . El volum en d el pr isma es el pr oducto d el área d e su base ( un pen tágono) por su a ltura (h prisma ). Hemos de tener en cuenta que l a a ltura del prisma no coincide con la longitud de la AgNR, ya que deb emos restarle las a lturas de la s dos pirámi- des que presenta en los extre mos ( Fi gura VI – 22 ). Puesto que la base del pris ma es un pe ntágono regular, su á rea será 5 veces el área d el tri áng ulo formado por el lado del pentágono (l) y e l radi o (r) que une ca da vértice de este con el ce ntro, siend o la Capítulo V I. Síntesis y caracterización de nanop artículas p lasmónicas 351 apotema (ap) la altura de dicho triángul o ( Figura VI – 22 )( Ecuación VI – 11 . Por otro lado, el vol umen de cada pirámide se define com o un t ercio del producto del áre a de la base pentagonal por l a altura de la pirá mide ( Ecu ación VI – 12 ). Por tanto, e l volumen de la Ag NRs se d efine com o el pr oduct o del áre a de la ba se por la suma de la a ltura del prisma y d os tercios de la altura de la pirámide ( Ecuación VI – 13 ). Figura VI – 21 . Imágenes de TEM de AgN Rs obtenidas en est a Tesis D octoral me diante síntes is por XX y YY que se ajustan a l os modelos prismático (s uperior) y cilíndrico (inferior). En rojo, las barras de escala de XX nm. 𝑉 𝑁𝑅 = 𝑉 𝑝 𝑟𝑖𝑠𝑚𝑎 + 2 𝑉 𝑝𝑖𝑟á𝑚𝑖𝑑𝑒 ( VI – 10 ) 𝑉 𝑝𝑟𝑖𝑠𝑚𝑎 = á𝑟𝑒𝑎 𝑏𝑎𝑠𝑒 · ℎ 𝑝𝑟𝑖𝑠𝑚𝑎 = 5𝑙 · 𝑎𝑝 2 · ℎ 𝑝𝑟𝑖𝑠𝑚𝑎 ( VI – 11 ) 𝑉 𝑝𝑖𝑟á𝑚𝑖𝑑𝑒 = 1 3 á𝑟𝑒𝑎 𝑏𝑎𝑠𝑒 · ℎ 𝑝𝑖𝑟á𝑚𝑖𝑑𝑒 = 1 3 · 5𝑙 · 𝑎𝑝 2 · ℎ 𝑝𝑖𝑟á𝑚𝑖𝑑𝑒 ( Vi – 12 ) 𝑉 𝑁𝑅 = 5𝑙 · 𝑎𝑝 2 · (ℎ 𝑝𝑟𝑖𝑠𝑚𝑎 + 2 3 ℎ 𝑝𝑖𝑟á𝑚𝑖𝑑𝑒 ) ( VI – 13 ) Bloque B. De sarrollo de nu evas nanoplataform as con aplica ción en bioim agen 358 ajuste linea l de su abso rbancia frente a la concentr ación de AgN Rs calcul ada mediante el modelo p ris- mático (roj o) y el mod elo cilíndr ico (azul). T ab la VI - 5 . A b s o rt iv i d a d e s m o l ar e s e st i m a d a s p a r a A g N Ss ( a 4 0 0 n m ) y A g N R s ( a 6 00 n m ), e r r o r y v a l o r de r 2 d e l aj u s te . N an o p a r t í c u l a A b s o r ti v i d a d m ol a r / c m - 1 · M -1 E r r o r / M - 1 r 2 A g N S s 7 .8 8 x 1 0 8 0 .1 6 x 1 0 8 0 .9 9 8 A g N R s (p r i s m a ) 1 .0 8 x 1 0 9 0 .0 4 x 1 0 9 0 .9 8 8 A g N R s (c il i nd r o ) 1 .2 2 x 1 0 9 0 .0 6 x 1 0 9 0 .9 7 5 3.4. - Síntesis de nanopa rtículas plasmóni cas de oro Como se mencionó e n apar tad os anteriores, el oro es u n metal bastante más caro q ue la plata y q ue pose e un f actor Q más baj o en la región UV -v isib le. Ademá s, es mucho más estable q uímicamen te que muc has AgNPs, p or lo que sirve co mo modelo de comportamien to estable frente a éstas. Por este motivo, también se sin- tetizaron nanoestructura s p lasmónicas d e oro. E n co ncre to, las morfo logías selec- cionadas fuero n nanobarra s de oro (AuNR s) y, nanobi pirámides de oro (AuNB Ps) compuestas por do s pirá mides pentagonales unidas por la ba se, que d an luga r a puntos calient es en los extre mos con alta intensifica ción del campo eléctr ico local. 3.4.1 .- Síntesis de nanobarras de oro. Obtener coloides de oro es relativamente sencillo. P or ejemplo, calenta ndo hasta ebull ición 2 5 m l de cloruro á urico (HAuCl 4 ) al 0 .001 % m/m y aña dirles 0. 25 mL de citrato sódico al 1% m/m se puede obtener una disolución de NPs de oro con un color morado. Sin embargo, controlar la for ma y ta maño sólo con estas con- diciones n o es senc illo y la disolució n obtenida será u na mez cla de NPs de oro de diferentes morfologías y tamaños, tal y como pode mos observar en las imágenes de TEM de la ¡Er ror! No se encue ntra e l or igen de la re ferencia. , en la s que, si bien predomina la morfolog ía triangular, hay NPs de una gran varied ad de tamaños, así como de otra s morfolog ías como esfer as o NPs dec aédrica s. [Document text truncated for crawler view.]