Les ascopyrones P et T: deux nouveaux composés issus du métabolisme d’ascomycétes “activés”

LES ASCOPYRONES P ET T : DEUX NOUVEAUX COMPOSÉS ISSUS DU MÉT ABOLISME D'ASCOMYCETES ¡'ACTIVÉS" Marie-Antoinette HAUTE, Gérard DEFFIE X, Robert HAUTE et Joseph VERCAUTEREN* Lahoratoire de Mycologie et Biologie végétale *Lahoratoire de Pharmacognosie Faculté de Pharmacie (Université de Bordeaux 11) Place de la Victoire, 33000 BORDEAUX (FRANCE) Plusieurs Ascomycetes appartenant aux Pezizales et aux Tubérales exprimen/, apres rraitemenr plasmolytique "activateur", une activité enzymatique qui dégraile les glucanes a-D-I,4 (glycogene, amidon. .. ) en 1,5-o-anhydrofruclOse, puis rransf01me ce sucre en ascopyrone P (chez les Pezizales) ou en ascopyrone T (chez les Tubérales). Les implicarions biogénériques, mycologiques et pratiques de ces bioconversions sont envisagées. INTRODUCTION Nos recherches antérieures ont montré que divers Ascomycetes, soumis él un traitement plasmolytique "activateurn, expriment une activité enzymatique originale qui dégrade leur glycogene cellulaire en un sucre inhabituel, le 1,5-o-anhydrofructose (AF). Chez certaines especes ou souches, le phénomene s'arrete él ce stade, mais, dans la plupart des cas, les réactions se poursuivent par le jeu de déshydratations enzymatiques, conduisant alors él un composé pyronique antibiotique, la microthécine [1], ou, chez certaines Pezizes -dont Peziza echinospora -, él un antibiotique du groupe des penténomycines, l'échinosporine ou 5-épipenténomycine 1 [2]1 . Au gré des récoltes de nouvelles especes, nous poufsuivons la recherche systématique d' AF, de microthécine et d'échinosporine par la technique indiquée antérieurement 12,41) : macération de quelques fragments du "champignonn (c'est-él-dire ici de l'ascocarpe), préalablement congelé, dans une solution aqueuse de maltodextrines2 (ami don partiellement hydrolysé), puis recherche par chromatographie en couche mince, dans ce macérat, de la présence éventuelle des substances précitées. En outre, tout spot différent3 est pris en compte et 1 'identification du composé correspondant est entreprise. Cette démarche, qlli nOlls avait déjél permis d'identifier l'échinosporine [2], nous a mis sur la voie de deux nouveaux composés pyroiliques qui font l'objet de cet artic1e. 1 Lors de la publicalion de nos résultats sur la 5-épipenténomycine l de Peziza ecilinospora, DOUS ignorions que ce composé venait d'etre isolé d'une Pezize DOD identifiée par une équipe de mycochimistes Iyonnais, sans d'ailleurs de précisions quanl a sa biogenese 131. 2 En Ibéorie, I'addilinn de maltndextrines n'e.<t pa< indispensable, mais elle peut pallier UDe insuftisance en glycogeDe du champigDoD testé et, de loute fayoD, elle améliore la seDsiblité du test. 3 Par un ou plusieurs des caracteres suivants : R¡. forme du spol, ahsorption ou non a 254 nm, couleur apres action du réactif a l'anisaldéhyde ,ulfurique. 440 RÉSULTATS L'un des deux nouveaux composés, noté 1, a été détecté chez Plicaria anthracina, P. leiocarpa, Peziza petersi et Anthracobia melaloma, I'autre, 2, chez plusieurs especes de Truffes (au sens large) : trois Tuber (T. melanosporum, T. brumale, T. uncinatum) et deux Terfezia non identifiés. ·s· R� "�O Ha a 1,5-D-anhydrofructose (AF) 1, ascopyrone P 3, "cétoénol transitoire" forme carbonylée ~ ~ - & '" ---- Q) 'Q) � .... Q) OH OH a OH OH OH '" .Q o 2a 2c 2d forme dihydratée formes monohydratées tautomeres ~ OH OH ~ OH OH 2b 2e 2f forme dicarbonylée hémiacétals intramoléculaires 2, ascopyrone T Etude structurale Pour les deux composés, et plus particulierement pour 2, les spectres de RMN réalisés dans I'acétone deutériée sont complexes et suggerent l 'existence de plusieurs formes en équilibre. En solution aqueuse, au contraire, les spectres, réalisés apres présaturation du signal de l 'eau a 4,8 ppm, sont plus simples et semblent correspondre a une forme majoritaire. Composé 1 Parmi les signaux des six atomes de carbone que révele le spectre de RMN du l3C, ceux a b 187,0, 147,0 et 130,5 ppm indiquent I'existence d'une forme carbonylée a,¡¡-insaturée. La présence d'une fonction énolisable sur ce meme motif est mise en évidence par un déplacement réversible du maximum d'absorption UV de 292 nm en milieu neutre a 339 nm en milieu alcalin (pH > 10), ainsi que par I'acidité de la solution. Les deux bandes observées en IR a 1660 et 1615 cm-¡ sont conformes a I'enchainement o=c-c=c-o. Les spectres de RMN 2D (HMQC et HMBC) sont en accord avec la structure 1, qui est celle du 1,5-anhydro-4-désoxy-D-glycéro-hex-l-ene-3-ulose (numérotation 441 C-4 C·6 biochimique); les couplages HI-C-3 el Hl-C-5 apparaissenl nellemenl dans le spectre HM BC (fiRure 1). La masse moléculaire de 144, déterminée par speclrométrie de masse, el les données de l'analyse élémentaire correspondent bien a la formule brule C6Hg04. Ces divers résultats montrenl que la structure 1 est observée a l'état solide comme en solution aqueuse. C-2 C-3 H-1 r S Olvan ,\ H-4a H-6 H-6' ) ¡' • C-6,H-5 résiduel C-6,H-40 H-4P ........................................................................................................................ résiduel (-6. H-4P e-s . CS. Ua 6 C5,H - 4 1. ... ·····l�:·;:�·��····································· ............ ;::���:; ....... � � � ... ��.�� ......... .. ... -) O C-5.H·4� H . � � OH H;L) 1 6 ( ' O OH ........ ......................... _ ..................... _ ................................................................. .¡. C-1 C-2,H-1 C-l,H-5 C-2.H-4P ...... . + ............................................................... . résiduel liO 100 150 ..... .... ·t .... · ........ · .............. · .......... _ .. · ............ �·��:·��· .... · ................ · .. ��·�:�:i .... i·· C-3,H-1 C-3,H-4P 111111 � �. , ! � Fig. J : Spectre HMBC du composé 1 Ce composé avait déja été identifié parmi les produits de la pyrolyse de la ceJlulose el d'autres polyholosides [5]; sa structure cristalJine a été décrite [6]. Nos résultats sonl d'ailleurs en accord avec ceux de la littérature. Une caractéristique de ce composé esl la stabilité de sa fonction énol. Etanl donné qu'i1 est observé pour la premiere fois dan s des conditions biologiques, en tant que produit d'une aclivilé enzymatique qui parait etre spécifique des Ascomycetes du groupe des Pezizales, nous proposons de le nommer ascopyrone P. Composé 2 a ) En milieu aqueux, l'existence de la forme dicarbonylée dihydratée 2a de la forme a-dicarbonylée 2b est suggérée par la présence, daos le spectre de RMN, de deux signaux (a 1) 96,1 et 95,1 ppm) correspondant a deux carbones acétaliques, ainsi que par l'obtention aisée d'une dioxime qui traduit la présence, au moins potentielle , de deux c=o. Ceci est confirmé par l'analyse des spectres de RMN 2D, qui permet de proposer la structure 2a; le spectre HMBC ne montrant aucun couplage entre H-6 et C-2 ou C-3, on peut exclure l'existence d'hémiacétals intramoléculaires tels que 2e ou 2f. En outre, 442 cette strllctllre diacétalique est en accord avec I 'absence d'absorption UV du composé en solution aqueuse. b) A l'état solide. apres évaporation de l'eau sous pression réduite. le composé apparaít comme étant un mélange de deux formes. 2e et 2d. responsables respective ment des bandes a 1735 et 1645 cm-I observées dans le spectre IR en pastille de KBr. Le pic de base du spectre de masse, a miz = 131, correspond a [M -CH20HI+, ce qui est habituel chez de tels composés. L 'analyse élémentaire est en accord avec la formule brute C6H¡OOS. Contrairement al, le composé 2 n 'est pas mentionné dans la littérature. Etant donné qu'on peut le considérer, d'apres ce qui précede, comme une pyrone potentielle, nous proposons de le nommer ascopyrone T (T pour Tubérales). Quelques propriétés des aseopyrones P et T 1 ° En solution aqueuse acidifiée et a chaud, l'ascopyrone P se transforme, comme la microthécine, en furylhydroxyméthy\cétone Lll; en revanche, I'ascopyrone T ne donne pas.cette réaction. 2° La formation des deux ascopyrones présente plusieurs analogies avec celle des composés précédemment identifiés chez d'autres Ascomycetes (microthécine, échinospo rine) [2,7,8] : elle a pour origine le glycogene endogene, elle passe par l' AF et elle est subordonnée au démasquage, par un traitement plasmolytique "activateur" (dessiccation, congélation-décongélation, broyage ... ), des enzymes impliquées dans la biosynthese. En effet, l'addition de maltodextrines ou d'AF au macérat d'ascocarpe augmente la production par rapport a un macérat témoin, tandis qu'une macération (ou un broyage) en présence d'EDTA ne produit que de l' AF: les ascopyrones ne préexistent pas dans les cellules intactes. Par ailleurs, une certaine quantité de microthécine, variable selon les champignons (et peut-etre selon leur age), accompagne l'ascopyrone P, mais jamais l'ascopyrone T. 3° La mesure des concentrations minimales inhibitrices vis-a-vis de quelques bactéries [2] indique pour I 'ascopyrone P une tres légere activité antibiotique a 1 'égard de deux Staphylocoques et d'un Colibacille (CMI de 250 ¡lg/ml et 500 ¡lg/mI respective ment); quant a l'ascopyrone T, elle s'est montrée inactive sur tous les germes testés (des concentrations supérieures al mg/mI n'ont pas été essayées). DISCUSSION ET CONCLUSIONS L'ascopyrone P, les différentes formes de I'ascopyrone T et d'autres formes non représentées sont vraisemblablement interconvertibles par des équilibres d'hydratation déshydratation et de tautomérie cétoénolique. L' une de ces formes est le cétoénol instable 3 dont nous avions invoqué la formation transitoire -sur la base d'une absorption transitoire a 265 nm -pour expliquer le passage de l'AF a la microthécine (ou a l'échinosporine) [2,9]; ceci pourrait rendre compte de la coexistence, signalée plus haut, de l'ascopyrone P et de la microthécine. Mais, curieusement, la microthécine n'accompagne jamais l'ascopyrone. T; de plus, les deux ascopyrones ne semblent pas coexister chez une meme espece: ceci suggere I'existence, entre ces deux composés, d'une barriere thermodynarnique trop élevée. La production majoritaire, voire exclusive, de tel composé par tel groupe taxonomique suggere done que, parmi les équilibres chimiques évoqués ci-dessus, certains sont "orientés" par I'intervention d'enzymes spécifiques; une meilleure connaissance de ces réactions nous conduira sans doute a corriger le schéma biogéné tique que nous avions proposé antérieurement. L'étude par RMN de I'anhydrofructose en solution aqueuse devrait etre un point de départ intéressant, puisque ce sucre est le précurseur de tous ces composés. Quoi qu'il en soit, l'anhydrofructose apparaít désormais, sur le plan biochirnique, comme une plaque tournante da{ls le métabolisme glucidique de nombreux Ascomycetes. Sur un plan pratique, la facilité de son obtention a partir de 1 'ami don [8] fait de lui la source potentielle de plusieurs pyrones chirales qui pourraient se révéler utiles comme 443 précurseurs dans des syntheses stéréospécifiques. Quelle peut etre la signification biologique des ascopyrones P et T ? Pour la microthécine et l 'échinosporine, douées d'activité antibiotique, on pouvait imaginer une fonction de défense du champignon soumis a des agressions (la cortalcérone jouerait un role semblable chez les Basidiomycetes) [2]; mais un tel role ne peut plus etre invoqué ici, puisque l'ascopyrone P n'est que tres faiblement antibiotique et I'ascopyrone T pratiquement paso Notons, dans un tout autre ordre d'idées, que celle-ci n'a rien a voir non plus avec I 'arome des Truffes, dont le support chimique est tres différent. Pour le moment, la signification biologique éventuelle de ces composés reste obscure. Toutefois, si l'on se rappelle que le froid compte parmi les agents d'''activation", on peut imaginer que la production de ces "petites" molécules a partir du glycogene serait, pour le champi gnon, un moyen de protéger son mycélium contre le gel en augmentant la molarité intracellulaire. PARTIE EXPÉRIMENT ALE Les Champignons.- Les Pezizes proviennent de la région bordelaise; elles ont été récoltées et identifiées par nous-memes. Les échantillons de Tuber nous ont été fournis par la s�tion de I'INRA de Bordeaux et ceux de Terfezia ont été achetés sur des marchés marocams. Mise en évidence de la production d'ascopyrones P ou T par des ascocarpes "activés".- Un fragment du champignon congelé est mis a décongeler dans quelques mI d'une solution aqueuse de Glucidex® [8] a 5% préalablement agitée avec 1% de toluene qui paracheve I 'action plasmolytique de la congélation-décongélation et protege contre les contaminations bactériennes. On laisse macérer quelques heures a 30°, puis on pratique une CCM (silice Macherey-Nagel Sil G/UV254, développement par le mélange chloroforme-méthanol 85 : 15); les plaques sont examinées sous UV de 254 nm, puis les spots sont révélés par le réactif a I'anisaldéhyde sulfurique. Ascopyrone P : spot de RfO,48, absorbant a 254 nm, révélation en vert foncé virant au violacé avec le temps; ascopyrone T : tache n'absorbant pas, centrée sur RfO,45, révélation en bleu. N. 8.- Caractéristiques des autres composés susceptibles d'etre présents (dans I'ordre : Rfabsorption a 254 nm-couleur de révélation) : O,oo-pas d'absorption-vert : maltose et maltodextrines en exces; 0,05-pas d'absorption-vert : glucose; 0,13-pas d'absorption-bleu : anhydrofructose; 0,28-pas d'absorption-brun : dérivé non identifié de la microthécine; 0,30-absorption-bleu : échinosporine; 0,50-absorption-bleu : microthécine; 0,70-absorption-bleu : furylhydroxyméthylcétone, produit dérivant de la microthécine 11l Ascopyrone P a) IsoLemellt.- JI a été réalisé a partir d'ascocarpes de Plicaria leiocarpa récoltés en abondance en janvier-février 1990 sur des bríllés de foret de Pins mari ti mes dans la région du Porge (Gironde). Les ascocarpes ont été utilisés sous forme d'exsiccata (la dessiccation, qui n 'affecte apparemment pas I 'activité enzymatique, réalise 1 '''activation" nécessaire a son expression). On pratique 3 macérations successives de 24 h a 30° de 1 g d'exsiccata dans 10 mI d'une solution de Glucidex® a 50 mg/ml, préalablement agitée avec 1 % de toluene. Les macérats, réunis, sont additionnés de 3 vol de MeOH et le précipité apparu est éliminé par une centrifugation de 10 min a 4 000 tlmin. Le surnageant est concentré a environ 2 mI. Le liquide sirupeux ainsi obten u est chromatographié sur résine Dowex 50WX4 (200-400 mesh) (colonne de 2,6 x 70 cm; élution par l'eau au débit de 30 mllh; détection par les UV et par CCM); le produit s'élue dans la fraction 450-490 mI, que I 'on concentre a I mi environ. Ce liquide est alors soumis a une gel-filtration sur Fractogel TSK HW 40 (Merck) (colonne de 2,6 x 70 cm réfrigérée a 12°; eau; débit de 50 ml/h); le produit s'élue entre 300 et 350 mI. L'évaporation sous pression réduite donne 30 a 40 mg d'un solide 444 blanc microcristallin. F = 92° (litt.: 91 °_96°); [a]D22 = + 134° (H20; e 0,55) [litt: + 155° (H20; e 1,1)]; AmaxH20 nm (log E) : 292 (3,80) (litt.: 293). b) Analyse stTucturale Analyse. élémentaire.- Trouvé : C : 48,25; H : 5,44; O : 44,78. Calculé pour C6Hg04: C: 50,00; H: 5,55; O: 44,44%. Spectre lR.- vrnaxKBr cm-I: 1660 et 1615 (O=C-C=C-O), 1430, 1310, 1170, 1130, 1055, 1035, 1015,905, 890, 825, 760. Spectre de RMN de [H (500,13 MHz, H20, présaturation ti 4,8 ppm pendant 2 sec.).-li (TMS) (multiplicité) : 7,50 (l H, s, H-l); 4,53 (1 H, m, H-S); 3,80 (2 H, m, H-6 et H-6'); 2,82 (1 H, dd, J4a,5 = 14,7 Hz, J4a,413 = 17,4 Hz, H-4a); 2,50 (1 H, dd, J413,5 = 3,6 Hz, H-4J}), Spectre de RMN de l3C (/25,77 MHz, H20).-li : 187,0 (C-3); 147,0 (C-l); 130,5 (C-2); 75,3 (C-S); 58,2 (C-6); 32,0 (C-4). Spectre de masse en.ionisation électronique (70 eV).- miz (int. rel.) : 144 [M]+ (100), 126 [M -H20]+ (22), 115 (25), 113 [M -CH20H]+ (28), 98 (29), 97 (67), 87 (88). Ascopyrone T a) Isolement.- Il a été effectué el partir de 10 g d'un broyat grossier d'ascocarpe de Terfezia sp. d'origine marocaine. Le protocole est le meme que poUT I'ascopyrone P. Le produit s'élue el partir de la résine Dowex dans la fraction 250-290 mI, et el partir du Fractogel dans la fraction 200-250 mI. La lyophilisation donne 500 mg d'un solide blanc amorphe. F = 65°; [a)D22 = + 110° (H20; el); pas d'absorption significative dans I'UV. b) Analyse structurale Analyse élémentaire.- Trouvé : C : 44,9; H : 6,3; O : 47,S. Calculé pour C6HIOOS: C: 44,44; H : 6,17; O: 49,38%. Spectre lR.- vrnaxKBr cm-1: 3380 (O-H), 2930 et 2880 (C-H), 1735 (C=O), 1638 (C=C), 1090 et 1050 (C-O), 14S0, 1370, 1270, 1050, 920, 825, 700. Spectre de RMN de [H (500,13 MHz, H20).-li (TMS) (multiplicité ) : 3,82 (1 H, m, WII2 = 24 Hz, H-S); 3,67 (2 H, m, W1/2 = 35 Hz, H-1 et H-l '); 3,65 (2 H, m, WI12 = 51 Hz, H-6 et H-6'); 1,85 (2 H, m, WII2 = 58 Hz, H-4 et H-4'). Spectre de RMN de [3C (500,13 MHz, H20).-li : 96,1 (C-2); 95,1 (C-3); 78,S (C-S); 72,9 (C-l); 66,4 (C-6); 39,6 (C-4). Spectre de masse en ionisation électronique (70 eV).- miz (int. rel.): 162 IMI+ (8,6), 144 [M -H20]+ (7,3), 131 [M -CH20H]+ (l OO). Oxime de I'ascopyrone T Préparation.- Elle a été préparée selon le protocole utilisé poUT I 'oxime de I'anhydrofructose [7]; la bande correspondant el I'oxime sur les chromatoplaques a un R f de 0,26 avec le systeme CHC13-MeOH 85 : 15. F = 175°; AmaxH20 nm (log E) : 24 0 (3,87). Analyse élémentaire.- Trouvé : C: 41,16; H : 6,01; O: 35,76; N: 15,95%. Calculé pour �HIO04 N2: C: 41,38; H: 5,75; O: 36,78; N: 16,09%. Spectre lR.- vmaxKBr cm-I: 3540, 3245, 3040, 2910, 1465, 1410, 1390, 1350, 1310,1260, 1215,1190, 1165, 1115,1100, 1070, 1050, 1015,990, 940, 835, 770, 710,640. Spectre de ·RMN de IH f500,13 MHz, (CD3hSO).- li (signal résiduel du DMSO el 2,6 ppm) (multiplicité) : 11,55 et 11,51 (2 H, s, N-OH); 4,88 (lH, s, OH-6); 4,84 (IH, d, JI,I' = 17 Hz , H1); 4,39 (IH, d, H-l '); 3,61 (lH, m, H-S); 3,52 (2H, m, H-6 et H-6'); 2,75 (IH, dd, J4,5 = 3,7 Hz J4,4' = 18,1 Hz, H-4); 2,46 (IH, dd, J4',5 = 11,4 Hz, H-4 '). Spectre de RMNde l3C f/25, 77 MHz, (CD3hCOICD30D/.-b (signal résiduel de I'acétone el 30,2 ppm): 153,6 (C-2); 152,0 (C-3); 78,8 (C-S); 68,4 (C-l); 67,6 (C-6); 31,6 (C-4). Spectre de masse en ionisation chimique (M/j).- miz (int. rel.): 175 [M + H]+ 445 (18), 159 (100), 157 [M + H -H20] + (15), 14 3 (72),141 (18). Les auteurs remercient MM. SORIANO et FONDEVILLE pour leur assistanee teehnique effieaee. lis exprimenl. leur reeonnaissanee ii MM. OLIVIER el GUINBERTEAU, de la station de I'INRA de Bordeaux, pour le don de plusieurs échantillons de Tuber, et ii M. HIMMI pour l'envoi de Terfezia du Maroe. RÉFÉRENCES 1. Baute (M.-A.), Deffieux (G.) and Baute (R.). Bioconversion of carbohydrates to unusual pyrone cornpounds in fungi : occurrence of rnicrothecin in rnorels. Phytochemistry, 1986,25, 1472-1473. 2. Baute (M.-A.), Deffieux (G.), Baute (R.), Badoe (A.), Vercauteren (J.), Léger (J.-M.) and Neveu (A.). Fungal enzyrnic activity degrading 1,4-a-D-glucans to echinosporin (5-epipentenornycin I). Phytochemistry, 1991,30, 1419-1423. 3. Bemillon (J.), Favre-Bonvin (J.), Pornrnier (M.-T.) and Arpin (N.). First isolation of (+)-epipentenornycin I frorn Peziza sp. carpophores. J. Antibiot., 1989, 42, 1430-1432. 4. Baute (M.-A.), Baute (R) et Deffieux (G.). Bioeonversions fongiques produisant, a partir de sucres, des cornposés pyroniques inhabituels a activité antibiotique. 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Proposed pathway to the pyrones cortalcerone and rnicrothecin in fungi. Phytochemistry, 1987,26, 1395-1397. ABSTRACT Fungal bioconversions yielding unusual pyrones frorn carbohydrates XVII.- Enzyrnic production of ascopyrones P and T frorn 1,4-a-D-glucans by Ascornycetes belonging to Pezizales and Tuberales When subjected to 'activating' plasrnolytic treatrnents, several Ascornycetes exhibit an enzyrnic activity which degrades 1,4-a-D-glucans to 1,5-D-anhydrofructose, then converts this sugar to ascopyrone P (in Pezizales) or ascopyrone T (in TuberaJes). Biogenetical, rnycological and practical implications of these bioconversions are discussed. Key-words: Fungi, Ascornycetes, Discornycetes, Pezizales, Tuberales, ascopyrone P, ascopyrone T, rnicrothecin, carbohydrates, 1,5-D-anhydrofructose, 1,4-a-D-glucans, bioconversion, enzyrnic activity. 446