Regulation der Aktivität des Anti-Sigmafaktors RsiX aus Bacillus subtilis

Regulation der Aktivität des Anti-Sigmafaktors RsiX aus Bacillus subtilis DISSERTATION zur Erlangung des Grades Doktor der Naturwissenschaften - Dr. rer. nat. - der Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften der Universität Bayreuth vorgelegt von Diplom-Biochemikerin Katharina Schäfer Bayreuth, 2011 Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Juni 2007 bis November 2011 am Lehrstuhl für Genetik der Universität Bayreuth unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. Thomas Wiegert (Hochschule Zittau/Görlitz) angefertigt. Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften der Universität Bayreuth genehmigten Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.). Dissertation eingereicht am: 04.11.2011 Zulassung durch die Promotionskommission: 16.11.2011 Wissenschaftliches Kolloquium am: 30.03.2012 Amtierende Dekanin: Prof. Dr. Beate Lohnert Prüfungsausschuss: Prof. Dr. Thomas Wiegert (Erstgutachter) Prof. Dr. Birgitta Wöhrl (Zweitgutachterin) Prof. Dr. Ortwin Meyer (Vorsitzender) Prof. Dr. Franz X. Schmid PD Dr. Steffen Kolb „Das Leben wird vorwärts gelebt und rückwärts verstanden!“ Søren Kierkegaard (1813 – 1855) Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ...................................................................................................................... I Zusammenfassung .................................................................................................................... 1 Summary ................................................................................................................................... 3 1 Einleitung .......................................................................................................................... 5 1.1 Bakterien im Allgemeinen und B. subtilis im Speziellen ........................................... 5 1.2 Regulation der Genexpression in Bakterien ............................................................... 6 1.3 Regulation der Transkription ..................................................................................... 6 1.4 Initiation der Transkription durch Sigmafaktoren ...................................................... 7 1.5 Primäre und sekundäre Sigmafaktoren ...................................................................... 7 1.6 ECF-Sigmafaktoren .................................................................................................... 8 1.6.1 Regulation von ECF-Sigmafaktoren ...................................................................... 9 1.6.1.1 Regulation des ECF-Sigmafaktors E aus E. coli ....................................... 11 1.6.1.2 Regulation des ECF-Sigmafaktors W aus B. subtilis ................................ 12 1.6.2 Der ECF-Sigmafaktor X aus B. subtilis .............................................................. 13 1.6.2.1 Das X-Regulon .......................................................................................... 14 1.6.2.2 Physiologische Rolle von X ...................................................................... 16 1.6.2.3 X-Regulation durch einen Anti-Sigmafaktor ............................................ 17 1.7 Termination der Transkription ................................................................................. 19 1.7.1 Faktorunabhängige Termination .......................................................................... 19 1.7.2 Faktorabhängige Termination .............................................................................. 20 1.7.2.1 Der Faktor Rho ........................................................................................... 21 1.7.2.2 Mechanismus der faktorabhängigen Termination....................................... 22 1.7.2.3 Die Nus-Faktoren ........................................................................................ 24 1.8 Zielsetzung dieser Arbeit ......................................................................................... 25 Inhaltsverzeichnis II 2 Material und Methoden ................................................................................................. 26 2.1 Bakterienstämme, Plasmide und Oligonukleotide ................................................... 26 2.2 Verwendete Puffer und Lösungen ............................................................................ 33 2.3 Antibiotika-Lösungen ............................................................................................... 43 2.4 Antikörper ................................................................................................................ 43 2.5 Längenstandards ....................................................................................................... 44 2.6 Mikrobiologische Methoden .................................................................................... 45 2.6.1 Nährmedien .......................................................................................................... 45 2.6.2 Kulturverfahren .................................................................................................... 46 2.6.2.1 Aufnehmen von Wachstumskurven ............................................................ 46 2.6.2.2 Anlegen von Glycerin-Dauerkulturen ......................................................... 47 2.6.3 Fluoreszenzmikroskopie ....................................................................................... 47 2.6.3.1 Fluoreszenzmikroskopie und -quantifizierung von GFP-Fusionen ............ 47 2.6.3.2 Fluoreszenzmikroskopie zur Bestimmung der Zellmorphologie ................ 48 2.6.4 Herstellung kompetenter Zellen und Transformation .......................................... 48 2.6.4.1 Genetische Manipulation von E. coli-Zellen .............................................. 48 2.6.4.1.1 Herstellung chemisch kompetenter E. coli-Zellen ................................. 48 2.6.4.1.2 Transformation von Plasmid-DNA in chemisch kompetente E. coli-Zellen .......................................................................................... 49 2.6.4.1.3 Herstellung von elektrokompetenten E. coli-Zellen für die Elektroporation ....................................................................................... 49 2.6.4.1.4 Elektroporation von E. coli-Zellen ......................................................... 50 2.6.4.2 Genetische Manipulation von B. subtilis-Zellen ......................................... 50 2.6.4.2.1 Herstellung kompetenter B. subtilis-Zellen ............................................ 50 2.6.4.2.2 Transformation von Plasmidoder chromosomaler DNA in kompetente B. subtilis-Zellen ..................................................................................... 51 2.6.4.2.3 SPP1-Phagen Transduktion in B. subtilis ............................................... 52 2.6.4.2.4 Transposonmutagenese ........................................................................... 52 Inhaltsverzeichnis III 2.7 Molekularbiologische und genetische Methoden ..................................................... 52 2.7.1 Isolierung von Nukleinsäuren .............................................................................. 52 2.7.1.1 Isolierung von Gesamt-DNA aus B. subtilis ............................................... 52 2.7.1.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli .................................................... 53 2.7.1.2.1 Isolierung von Plasmid-DNA durch Mini-Präparation (Boiling Präparation) ............................................................................................ 53 2.7.1.2.2 Isolierung von Plasmid-DNA durch Midi-Präparation .......................... 54 2.7.1.3 Isolierung von Gesamt-RNA aus B. subtilis ............................................... 54 2.7.2 Photometrische Bestimmung der DNAund RNA-Konzentration ...................... 55 2.7.3 Amplifikation von DNA mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion (PCR) ......... 56 2.7.3.1 Standard-PCR ............................................................................................. 56 2.7.3.2 Kolonie-PCR ............................................................................................... 57 2.7.4 Enzymatische Modifikation von Nukleinsäuren .................................................. 58 2.7.4.1 Enzymatische Hydrolyse von Nukleinsäuren ............................................. 58 2.7.4.2 Ligation von Nukleinsäuren ........................................................................ 59 2.7.5 Reinigung von DNA-Fragmenten nach der PCR bzw. nach anderen enzymatischen Reaktionen ................................................................................... 60 2.7.6 Agarose-Gelelektrophorese .................................................................................. 61 2.7.6.1 DNA-Agarose-Gelelektrophorese ............................................................... 61 2.7.6.2 RNA-Agarose-Gelelektrophorese ............................................................... 61 2.7.7 Isolierung von Nukleinsäuren aus Agarosegelen (Gelextraktion) ....................... 62 2.7.8 Sequenzierung ...................................................................................................... 62 2.7.9 Herstellung einer DIG-markierten DNA-Sonde................................................... 62 2.7.10 Reinigung von DNA-/RNA-Sonden durch Präadsorption ................................. 62 2.7.11 Southern Blot ...................................................................................................... 63 2.7.12 Hybridisierung und Nachweis DIG-markierter Nukleinsäure-Sonden durch Chemolumineszenz ............................................................................................ 63 2.7.13 RNA-Analytik .................................................................................................... 64 Einleitung 5 1 Einleitung 1.1 Bakterien im Allgemeinen und B. subtilis im Speziellen Das Vorkommen von Bakterien kann als ubiquitär bezeichnet werden. Dies liegt auch in ihrer enormen Anpassungsfähigkeit begründet. Extreme Werte der Temperatur, des pH-Wertes oder auch des Salzgehaltes stellen bei der Besiedelung eines Habitats durch Bakterien kein Problem dar. Obwohl Bakterien Eigenschaften besitzen, die sie auch für den Menschen zum Pathogen werden lassen, gibt es sehr viel mehr nützliche Funktionen, wodurch Bakterien sowohl im Haushalt als auch in der Industrie zum Einsatz kommen (Schlegel 1992). Daneben werden Bakterien auch in der Grundlagenforschung als Modellorganismen verwendet. Zwei der häufigsten Vertreter sind hier Escherichia coli, ein Gram-negatives Bakterium, und B. subtilis, ein Gram-positiver Organismus. Im Fokus dieser Arbeit steht das Bodenbakterium B. subtilis, welches auch unter dem Namen „Heubacillus“ bekannt geworden ist, da man es leicht aus einem Heuaufguss isolieren kann. Erstmals wurde dieses Bakterium 1838 von Ehrenberg als Vibrio subtilis beschrieben und wenig später von Cohn in Bacillus subtilis umbenannt. Dieses stäbchenförmige Bakterium kann eine Größe von etwa 2-3 µm erreichen. B. subtilis wurde aber nicht nur im Boden oder Heuaufgüssen gefunden, sondern auch in Milch (Lawrence & Ford 1916). Das zeigt, dass B. subtilis als nicht-pathogen gilt. Es wurde dem Bakterium sogar der Status eines GRASOrganismus (generally recognized as safe) verliehen (Kayser 2002). Eigenschaften wie die Apathogenität, die leichte Kultivierbarkeit und auch die kurze Generationszeit von nur 26 min bei 40 °C begründen u. a. die Verwendung von B. subtilis als Modellorganismus (Schlegel 1992). Ferner gehört B. subtilis mit zu den ersten Bakterien, deren Genom vollständig sequenziert wurde. Bereits 2 Jahre nachdem das erste vollständig sequenzierte Genom eines Bakteriums veröffentlicht wurde (Fleischmann et al. 1995), publizierten Kunst et al. die Ergebnisse der Sequenzierung des B. subtilis Genoms. Demnach kodiert dieses Bakterium für ca. 4100 Proteine (Kunst et al. 1997). In der Verfügbarkeit der gesamten Sequenz des Genoms liegt ein weiterer wichtiger Grund für den Einsatz von B. subtilis in der Grundlagenforschung über Genregulation. Wichtige regulatorische Grundprinzipien, z. B. die Entdeckung des ersten alternativen Sigmafaktors (Fox & Pero 1974; Haldenwang & Losick 1980), sind an B. subtilis aufgeklärt worden. Einleitung 6 Zusätzlich zur Verwendung von B. subtilis in der biologischen und medizinischen Forschung kommt das Gram-positive Bakterium auch in der Industrie zum Einsatz. So benutzt die Waschmittelindustrie den Vorteil, dass extrazelluläre Enzyme wie z. B. Subtilisin E (Wong et al. 1984) von B. subtilis in das umgebende Medium sekretiert werden (Simonen & Palva 1993; Antelmann et al. 2001). Des Weiteren wird B. subtilis in der Landwirtschaft als natürliches Fungizid verwendet (Leibinger et al. 1997). 1.2 Regulation der Genexpression in Bakterien In jeder Zelle muss die Expression der Gene in einer geregelten Art und Weise erfolgen. Dies gilt in besonderer Weise für Bakterien. Aufgrund ihrer sehr geringen Größe von nur wenigen Mikrometern können nicht zu jeder Zeit alle kodierten Proteine in großer Menge in einer bakteriellen Zelle vorrätig sein. In Abhängigkeit der äußeren Bedingungen muss die Zelle entscheiden, welche Proteine benötigt werden und die entsprechende Genexpression regeln. Eine Vielzahl verschiedener Regulationsmechanismen steht dafür zur Verfügung (Schlegel 1992). Eine Regulation kann dabei schon auf dem Level der Transkription erfolgen oder erst später während der Translation, sowie z. T. auch posttranslational. Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit liegt jedoch auf der Regulation der Transkription. 1.3 Regulation der Transkription Die Transkription bezeichnet den Prozess der RNA-Synthese anhand einer DNA-Matrize (Jacob & Monod 1961). Essentiell für diesen Prozess ist das Vorhandensein einer RNAPolymerase (Weiss 1960; Hurwitz et al. 1961; Chamberlin & Berg 1962). Im Gegensatz zu den Eukaryoten verfügen die Bakterien nur über eine RNA-Polymerase, welche für die Synthese der mRNA, rRNA und auch der tRNA (Hoagland 1960; Brenner et al. 1961) verantwortlich ist. Es wird dabei zwischen zwei verschiedenen Formen der RNA-Polymerase unterschieden, dem Core-Enzym und dem Holo-Enzym (Burgess et al. 1969). Welche Form vorliegt, wird dabei von den einzelnen Untereinheiten bestimmt, aus denen die RNAPolymerase zusammengesetzt ist. Das RNA-Polymerase Core-Enzym wird von fünf Untereinheiten gebildet, welche die Bezeichnung ´ und  tragen und zusammen das katalytische Zentrum bilden (Haldenwang 1995; Mathew & Chatterji 2006). Sobald sich eine Einleitung 7 weitere Untereinheit, der Sigmafaktor (), mit dem Core-Enzym verbindet, spricht man von dem RNA-Polymerase Holo-Enzym. 1.4 Initiation der Transkription durch Sigmafaktoren Die Promotor-Spezifität, durch welche das RNA-Polymerase Holo-Enzym die Transkription von Genen spezifisch initiiert, wird allein durch die -Untereinheit hervorgerufen (Dunn & Bautz 1969; Travers & Burgess 1969; Burgess & Travers 1970). Das Core-Enzym weist im Gegensatz dazu eine sehr unspezifische Bindung der DNA auf. Die -Untereinheit ist in der Lage, gezielt zwischen einzelnen DNA-Sequenzen zu unterscheiden und erkennt somit eine spezifische Promotorregion (Dombroski et al. 1992; Borukhov & Severinov 2002). Sequenzanalysen unter vielen Sigmafaktoren haben gezeigt, dass man diese in zwei große Gruppen einteilen kann: erstens in die Gruppe mit Sequenzhomologien zu 70, dem primären Sigmafaktor aus E. coli, und zweitens in die Gruppe mit Sequenzhomologien zu 54, dem für die Transkription von Stickstoff-regulierten Genen benötigten Sigmafaktor aus E. coli (Gross et al. 1992). Beide Gruppen zeigen zudem noch Unterschiede in der Erkennung von Promotorregionen auf. Sigmafaktoren aus der 70-Familie erkennen DNA-Sequenzen, welche ungefähr 10 bp und 35 bp stromaufwärts von dem ersten Nukleotid des zu transkribierenden Genes liegen. Man spricht auch von der -35 und der -10 Region (Reznikoff et al. 1985; Doi & Wang 1986). Die Promotorregionen, die von der 54-Familie erkannt werden, liegen hingegen 12 bp und 24 bp (-24 und -12 Region) stromaufwärts vom Transkriptionsstartpunkt (Gussin et al. 1986). Die Stärke eines Promotors hängt aber allein von der Länge der Sequenz zwischen den zwei Regionen ab und nicht von der Nukleotidzusammensetzung (Stefano & Gralla 1982). Für 70 aus E. coli wurde gezeigt, dass dieser Sigmafaktor an die -35 und die -10 Region bindet und dabei den Abstand zwischen beiden Regionen erkennt (Dombroski et al. 1996). 1.5 Primäre und sekundäre Sigmafaktoren Neben der beschriebenen Unterscheidung von Sigmafaktoren anhand von Sequenzhomologien kann man diese auch in primäre und sekundäre Sigmafaktoren einteilen. Gene, die z. B. für essentielle Biosynthesen exprimiert werden müssen, werden mit Hilfe der Einleitung 8 primären Sigmafaktoren transkribiert (Hughes & Mathee 1998). In B. subtilis ist der essentielle, primäre Sigmafaktor A (Price et al. 1983) und in E. coli ist es 70 (Berg et al. 1971). Alternative (sekundäre) Sigmafaktoren sind für die Transkription von speziellen Regulons nötig. Sie dienen der Expression von bestimmten Genen als Anpassung auf veränderte Umweltbedingungen und Nährstoffvorkommen oder auch unter Stressbedingungen (Helmann 2002). Der erste alternative Sigmafaktor überhaupt wurde in B. subtilis durch Studien mit dem Bakteriophagen SPO1 entdeckt. Hierbei handelt es sich um B, welcher für die allgemeine Stressantwort in B. subtilis benötigt wird (Fox & Pero 1974; Haldenwang & Losick 1980). Aufgrund der Vielzahl an identifizierten Sigmafaktoren wurden die Sigmafaktoren mit Sequenzhomologien zu 70 von Lonetto et al. in drei Gruppen eingeteilt und später von Helmann um zwei weitere Gruppen ergänzt (Lonetto et al. 1992; Helmann 2002). In einer dieser Gruppen, Gruppe 4, werden die ECF-Sigmafaktoren zusammengefasst, welche im Folgenden näher betrachtet werden sollen. 1.6 ECF-Sigmafaktoren Die ECF-Sigmafaktoren wurden so benannt, weil diese Sigmafaktoren im Allgemeinen an der Regulation von Genen beteiligt sind, die für Proteine mit extracytoplasmatischer Funktion (extra-cytoplasmic function) kodieren. Die ECF-Sigmafaktoren fungieren dabei als Effektoren nach extracytoplasmatischem Stimulus (Lonetto et al. 1994). Beispielhaft für die Vielzahl der mit ECF-Sigmafaktoren verbundenen Prozesse sollen hier der Eisen-Transport (FecI aus E. coli) (Braun 1997), die Alginat-Sekretion (AlgU/T in P. aeruginosa) (Hershberger et al. 1995) und die Hitze-Schock-Antwort (E aus E. coli) (De Las Penas et al. 1997b) genannt werden. Allgemein können diese Prozesse als Transport, Sekretion und extracytoplasmatischer Stress zusammengefasst werden (Helmann 2002). Wie bereits im Kapitel 1.5 erwähnt, zeigen alle ECF-Sigmafaktoren Sequenzhomologien zu 70 aus E. coli. Allerdings unterscheiden sie sich von den Sequenzen der meisten anderen Sigmafaktoren dieser Gruppe und bilden auch kleinere Proteine. Man hat festgestellt, dass die Sigmafaktoren, welche zur 70-Familie gehören, vier konservierte Regionen in ihrer Aminosäuresequenz besitzen. Lonetto et al. zeigten anhand von sieben Beispielen für ECFSigmafaktoren aus verschiedenen Organismen, darunter auch X aus B. subtilis, dass sich die ECF-Sigmafaktoren von anderen 70-Sigmafaktoren darin unterscheiden, dass sie kürzere Einleitung 9 Peptide bilden, da ihnen der größte Teil der konservierten Region 3 fehlt (Lonetto et al. 1994). Auch phylogenetische Untersuchungen wurden von Lonetto et al. durchgeführt. Sie führten zu dem Schluss, dass man die ECF-Sigmafaktoren zusätzlich in zwei Untergruppen aufteilen kann (Lonetto et al. 1994). Spätere phylogenetische Untersuchungen deckten sogar eine viel größere Diversität unter den ECF-Sigmafaktoren auf (Paget & Helmann 2003; Staron et al. 2009). Wie schon im Kapitel 1.4 erläutert, wird die Promotorspezifität der RNA-Polymerase allein durch die Sigmafaktoren vermittelt. Dabei haben besonders die -35 und die -10 Region des Promotors eine große Bedeutung für die 70-Familie. Für ECF-Sigmafaktoren wurden Konsensussequenzen für diese Regionen gefunden. Es handelt sich um das AAC-Motiv für die -35 Region und das CGT-Motiv für die -10 Region (Helmann 2002). Die ECF-Sigmafaktoren findet man nicht nur bei E. coli. Sie sind, oft in großer Anzahl, bei vielen weiteren Organismen vertreten. So besitzt z. B. Mycobacterium tuberculosis gleich 10 (Cole et al. 1998) der ECF-Sigmafaktoren und Streptomyces coelicolor sogar 49 (Bentley et al. 2002; Helmann 2002). Der erste ECF-Sigmafaktor überhaupt wurde ebenfalls in S. coelicolor entdeckt (Lonetto et al. 1994). Von den 17 alternativen Sigmafaktoren, die das Genom von B. subtilis kodiert, konnten ebenso sieben in die Gruppe der ECF-Sigmafaktoren eingeordnet werden (Kunst et al. 1997; Helmann 2002; MacLellan et al. 2008). M, V, W, X, Y, Z und YlaC sind die ECFSigmafaktoren aus B. subtilis. 1.6.1 Regulation von ECF-Sigmafaktoren Die Regulation der Genexpression auf der Ebene der Transkriptionsinitiation erfolgt u. a. durch die Sigmafaktoren. Des Weiteren können auch Repressoren und Aktivatoren die Transkription beeinflussen. Zudem unterliegen die Sigmafaktoren selbst auch einer Regulation durch Antagonisten. Diese Antagonisten werden als Anti-Sigmafaktoren bezeichnet und fungieren als negative Regulatoren. Aufgrund ihrer Lokalisation, dem Cytoplasma, wird eine Gruppe von Anti-Sigmafaktoren als cytoplasmatische AntiSigmafaktoren bezeichnet (Hughes & Mathee 1998). Zu dieser Gruppe zählen z. B. FlgM, der negative Regulator von 28 (Chadsey et al. 1998) und DnaK, der negative Regulator von 32 (McCarty et al. 1996). Einleitung 10 Die in Kapitel 1.6 beschriebenen ECF-Sigmafaktoren werden im Gegensatz dazu oft von membrangebundenen Anti-Sigmafaktoren reguliert. Die Gene für diese Anti-Sigmafaktoren liegen zumeist im gleichen Operon wie die stromaufwärts gelegenen Gene für die entsprechenden ECF-Sigmafaktoren (Hughes & Mathee 1998). Die Anti-Sigmafaktoren sind meistens Transmembranproteine, deren N-terminale Domäne direkt mit den jeweiligen ECFSigmafaktoren interagiert. Der Umstand zeigt, dass sich diese Domäne im Cytoplasma befinden muss. Yoshimura et al. (2004) sprechen deshalb von einer intrazellulären inhibierenden Domäne und bezeichnen die C-terminale Domäne im Gegensatz dazu als extracytoplasmatische sensorische Domäne. Das direkte Zusammenspiel zwischen Sigmaund Anti-Sigmafaktor wurde u. a. in Yeast-Two-Hybrid-Experimenten gezeigt (Yoshimura et al. 2004). Die inhibierende Wirkung des Anti-Sigmafaktors gegenüber dem ECF-Sigmafaktor wird aufgehoben sobald dieser einen extracytoplasmatischen Stimulus erhält. Im Anschluss kann die spezifische Transkription erfolgen. Helmann vergleicht deshalb das System aus AntiSigmafaktor und Sigmafaktor sogar mit dem Zwei-Komponenten-System (Stock et al. 2000), bei welchem auch extrazelluläre Proteindomänen einer Histidin-Kinase Signale wahrnehmen und damit im Cytoplasma durch DNA-bindende Proteine zur Transkription führen (Helmann 2002). Bei einer allgemeinen Betrachtung der Regulation von Anti-Sigmafaktoren nach einem zellulären Stimulus kann diese beispielsweise durch ein weiteres Protein, dem Anti AntiSigmafaktor, oder durch den Transport des Anti-Sigmafaktors aus der Zelle erfolgen. Weiterhin spielt auch der proteolytische Abbau des Anti-Sigmafaktors eine Rolle (Brown & Hughes 1995). Der negative Regulator von 28, FlgM, wird z. B. aus der Zelle exportiert, wenn die 28–spezifische Transkription beginnen soll (Hughes et al. 1993). RsbW, der negative Regulator von B aus B. subtilis, wird durch den Anti Anti-Sigmafaktor RsbV von einer Interaktion mit dem Sigmafaktor abgehalten (Dufour & Haldenwang 1994). Die Regulation von ECF-Sigmafaktoren konnte bislang nur für sehr wenige Beispiele detailliert aufgeklärt werden. Dazu zählen E aus E. coli und W aus B. subtilis (Heinrich & Wiegert 2009). Es gibt jedoch viele Hinweise, dass bei der Regulation von ECFSigmafaktoren der Prozess der regulierten intramembranen Proteolyse (RIP) der jeweiligen Anti-Sigmafaktoren eine entscheidende Rolle spielt (Abbildung 1) (Brown et al. 2000). Exemplarisch sollen hier die Freisetzung von E aus E. coli (Kapitel 1.6.1.1) sowie von W aus B. subtilis (Kapitel 1.6.1.2) durch RIP erläutert werden. Einleitung 11 Zunehmende Bedeutung gewinnen die ECF-Sigmafaktoren und ihre Regulation auch bei der Untersuchung der pathogenen Wirkung von Mikroorganismen (Bashyam & Hasnain 2004; Urban 2009). Der ECF-Sigmafaktor E aus M. tuberculosis z. B. spielt auch eine Rolle beim Überleben von M. tuberculosis in Makrophagen vom Mensch und der Maus (Manganelli et al. 2001). Des Weiteren ist die site-2 Protease Rv2869c aus M. tuberculosis für die Persistenz von M. tuberculosis in Mäuse-Lungen verantwortlich (Makinoshima & Glickman 2005) und beeinflusst die Transkription z. B. von Genen, die in die Lipid-Biosynthese involviert sind, durch die Proteolyse der drei Anti-Sigmafaktoren Anti-SigK, Anti-SigL und Anti-SigM (Sklar et al. 2010). Site-2 Proteasen sind auch am Prozess der regulierten intramembranen Proteolyse von ECF-Sigmafaktoren beteiligt (Weihofen & Martoglio 2003). 1.6.1.1 Regulation des ECF-Sigmafaktors E aus E. coli E. coli reagiert auf extracytoplasmatischen Stress wie z. B. Hitze u. a. durch Aktivierung von E (Erickson & Gross 1989). Der ECF-Sigmafaktor E wird aber auch durch große Mengen falsch gefalteter Proteine der äußeren Membran (outer membrane proteins; OMPs) aktiviert (Mecsas et al. 1993) und ist zusätzlich schon bei normalen Temperaturen für E. coli essentiell (De Las Penas et al. 1997a). Das Gen, welches für E kodiert, ist mit drei weiteren Genen, Abbildung 1: Modell der Regulation von ECF-Sigmafaktoren durch regulierte intramembrane Proteolyse (RIP) der entsprechenden Anti-Sigmafaktoren. Der Anti-Sigmafaktor wird nach einem spezifischen Stress-Stimulus von einer site-1 Protease (site-1) und einer site-2 Protease (site-2) prozessiert, bevor er im Cytoplasma (CP) vollständig von einer cytoplasmatischen Protease abgebaut wird und den Sigmafaktor ( entlässt, welcher dann zusammen mit der RNA-Polymerase (RNAP) die Transkription spezifischer Gene initiieren kann. CM: cytoplasmatische Membran. Aus: Heinrich & Wiegert (2009). Einleitung 12 welche stromabwärts von diesem liegen, in einem Operon lokalisiert. Von diesen drei Genen werden die Proteine RseABC (regulator of sigma E, Protein A, B, C) kodiert (De Las Penas et al. 1997b). RseA ist der Anti-Sigmafaktor von E. Dieser ist in der inneren Membran lokalisiert und inhibiert E mit seiner N-terminalen cytoplasmatischen Domäne (Missiakas et al. 1997; De Las Penas et al. 1997b). Durch beispielsweise einen Hitzeschock denaturieren die Porine der äußeren Membran. Dadurch kommt es zur Bindung zwischen den C-terminalen Enden der Porinen und der periplasmatischen PDZ-Domäne der Membranprotease DegS, wodurch diese in einen aktiven Zustand übergeht und die site-1 Proteolyse des AntiSigmafaktors RseA katalysiert. Man kann diesen Prozess auch als allosterische Aktivierung der Protease DegS bezeichnen (Walsh et al. 2003; Sohn et al. 2007; Sohn & Sauer 2009). Durch die site-1 Proteolyse wird RseA in der periplasmatischen Domäne geschnitten und wird damit zum Substrat für RseP (regulator of sigma E Protease), einer intramembranschneidenden Zink-abhängigen Protease der site-2 Protease-Familie, welche den sogenannten iCliPs (intramembrane cleaving proteases) zugeordnet wird (Alba et al. 2002; Kanehara et al. 2002; Weihofen & Martoglio 2003). In einem letzten Schritt nach der site-2 Proteolyse wird nun RseA mit dem immer noch gebundenen E ins Cytoplasma entlassen, wo mit Hilfe des Adapters SspB und der cytoplasmatischen Protease ClpXP RseA vollständig prozessiert wird, was dann zur Freisetzung von E und damit zur Transkriptionsinitiation führt (Flynn et al. 2004; Chaba et al. 2007). 1.6.1.2 Regulation des ECF-Sigmafaktors W aus B. subtilis Neben E aus E. coli zählt auch der ECF-Sigmafaktor W aus B. subtilis zu den am besten untersuchten alternativen Sigmafaktoren der ECF-Familie. W wird von dem Gen sigW kodiert und ist zusammen mit rsiW in einem Operon lokalisiert. rsiW kodiert für den membrangebundenen Anti-Sigmafaktor RsiW (regulator of sigma W) (Huang et al. 1998). Außer seinem eigenen Operon kontrolliert W zusätzlich die Expression von ca. 60 Genen in 30 Operons (Helmann 2006). Helmann spricht in diesem Zusammenhang von einem „Antibiosis“-Regulon, da das W-Regulon zum einen durch Zellwandbiosyntheseinhibierende Antibiotika induziert wird, und zum anderen spielen viele Proteine, deren Gene von W kontrolliert werden, eine Rolle bei der Detoxifikation bzw. der Antibiotika-Synthese (Helmann 2002). So wird beispielsweise die Synthese eines Penicillin-bindenden Proteins, Einleitung 13 PbpE, von W ebenso kontrolliert wie die Bildung des Fosfomycin-Resistenz Proteins FosB (Huang et al. 1999; Cao et al. 2001). Sogar eine intrinsische Resistenz gegenüber antimikrobiellen Substanzen anderer Bacilli geht auf W zurück (Butcher & Helmann 2006). Das W-Regulon wird durch eine Vielzahl verschiedener Substanzen induziert. Es wurden bereits Alkali-Stress sowie die Infektion mit Phagen (Wiegert et al. 2001), Salz-Stress (Petersohn et al. 2001), antimikrobielle Peptide (Pietiainen et al. 2005) und zellwandspezifische Antibiotika wie Vancomycin (Cao et al. 2002) als spezifische Stimuli identifiziert, die zur Transkriptionsinitiation W-kontrollierter Gene führen. Bevor die Transkription eingeleitet werden kann, muss der ECF-Sigmafaktor W in ungebundener Form im Cytoplasma vorliegen, was nur durch Proteolyse seines AntiSigmafaktors RsiW erfolgen kann. RsiW ist in der Membran lokalisiert, nimmt die verschiedenen Stimuli mit der C-terminalen Domäne wahr und inhibiert mit der N-terminalen cytoplasmatischen Domäne W (Schöbel et al. 2004). Die Freisetzung des Sigmafaktors erfolgt durch den Prozess der regulierten intramembranen Proteolyse, wie er bereits für E aus E. coli (Kapitel 1.6.1.1) beschrieben wurde, wobei jedoch kleine Unterschiede vorhanden sind. Durch einen der oben genannten Stimuli wird die site-1 Proteolyse von RsiW eingeleitet. Die site-1 Protease PrsW (protease responsible for activating sigma W) schneidet RsiW in der extracytoplasmatischen Domäne (Heinrich & Wiegert 2006; Ellermeier & Losick 2006). Die nun verkürzte Form von RsiW wird nachfolgend von einer noch unbekannten weiteren Protease prozessiert, bevor RsiW zum Substrat für die site-2 Protease RasP werden kann (Heinrich et al. 2009). Die site-2 Protease RasP (regulating alternative sigma factor protease), welche auch zur Gruppe der iClip (intramembrane cleaving protease) gehört (Weihofen & Martoglio 2003), schneidet im Anschluss den weiter verkürzten Anti-Sigmafaktor RsiW innerhalb seiner Transmembrandomäne, sodass im Resultat der verkürzte Anti-Sigmafaktor mit gebundenem Sigmafaktor ins Cytoplasma übergehen kann (Schöbel et al. 2004). Hier wird schließlich der verbliebene Teil von RsiW vollständig durch die Clp-Protease prozessiert (Zellmeier et al. 2006) und W kann sich mit dem Core-Enzym der RNA-Polymerase verbinden und die Transkription einleiten. 1.6.2 Der ECF-Sigmafaktor X aus B. subtilis Der erste der sieben ECF-Sigmafaktoren aus B. subtilis, welcher als solcher identifiziert wurde, war X (Lonetto et al. 1994; Kunst et al. 1997). Das Gen des ECF-Sigmafaktors X, Einleitung 14 sigX, wurde ursprünglich als orfX20 in der chromosomalen Region von spoVA bis serA identifiziert. Es wurde dabei eine Sequenzübereinstimmung von 25 % mit dem Gen des ECFSigmafaktors FecI, fecI, aus E. coli gefunden (Sorokin et al. 1993). FecI ist an der EisencitratVerwertung in E. coli beteiligt. Als Sigmafaktor initiiert es die Transkription der Eisentransport-Gene fecABCDE (Van Hove et al. 1990). Brutsche & Braun vermuteten daher auch eine Beteiligung von X an der Eisencitrat-Verwertung in B. subtilis. In der Tat konnte eine Komplementation eines fecI-Knockouts durch sigX in E. coli gezeigt werden. Jedoch führten die Analysen in B. subtilis zu dem Ergebnis, dass X nicht an einer EisencitratVerwertung beteiligt ist, auch da Eisencitrat von B. subtilis nicht als Eisen-Quelle benutzt wird. Des Weiteren konnte eine Beteiligung von X an der Regulation des Transportsystems von Eisen-Siderophoren ausgeschlossen werden (Brutsche & Braun 1997). Demzufolge sind FecI und X keine Orthologe, sondern lediglich Homologe (Helmann 2002). 1.6.2.1 Das X-Regulon Für X wurde eine Zugehörigkeit zur Gruppe 4 der 70-Familie, den ECF-Sigmafaktoren, gezeigt (Lonetto et al. 1994; Helmann 2002). Als Sigmafaktor erkennt X ganz spezifische Promotorsequenzen und führt so zur Transkription des X-kontrollierten Regulons. Eine Promotor-Konsensus-Suche ermöglichte die Identifizierung von 15 mutmaßlichen Genen, die unter der Kontrolle von X stehen. Die hierfür verwendete Konsensussequenz für die -35 Region lautet tgtAACnww, die für die -10 Region lautet CGwCww. Dabei bedeuten große Buchstaben, dass diese Basen unverändert sind, w steht für entweder A oder T und n steht für eine beliebige Base (Huang & Helmann 1998). Als Ergebnis dieser Suche wurden als Mitglieder des X-Regulons u. a. csbB, das Gen für eine membrangebundene Glykosyltransferase (Akbar & Price 1996), lytR, das Gen für einen negativen Regulator der Autolysin-Expression (Lazarevic et al. 1992), das pss-Operon, welches in die Phosphatidylethanolamin-Synthese involviert ist (Okada et al. 1994; Matsumoto et al. 1998), und auch das dlt-Operon, welches an der D-Alanylierung von Teichonsäuren beteiligt ist (Perego et al. 1995), identifiziert (Huang & Helmann 1998; Helmann 2002). Daneben wurde von Huang & Helmann auch das sigX-Operon als X-kontrolliert gefunden. Allerdings wurde zuvor bereits von Brutsche & Braun die Autoregulation von sigX nachgewiesen (Brutsche & Braun 1997; Huang & Helmann 1998). Einleitung 21 Anders als intrinsische Terminationssignale sind die Signale der Rho-abhängigen Termination zweigeteilt und erstrecken sich über etwa 200 bp in der DNA (Nudler & Gottesman 2002). Der stromaufwärts liegende Teil wird von der oben beschriebenen rut-site gebildet. Der etwa 60-90 Nukleotide stromabwärts von der rut-site liegende Teil wird als Terminationszone bezeichnet. In dieser Zone findet die Termination an verschiedenen Stellen statt, welche als Terminationsstellen bezeichnet werden (Lau et al. 1982; Morgan et al. 1983b; Banerjee et al. 2006). Am häufigsten handelt es sich bei den Terminationsstellen um die Stellen, wo der Transkriptionselongation-Komplex pausiert (pause site), aber nicht jede pause site ist gleichzeitig eine Rho-Terminationsstelle (Kassavetis & Chamberlin 1981; Lau et al. 1983). 1.7.2.1 Der Faktor Rho Der für die faktorabhängige Termination zwingend nötige Faktor Rho wurde bereits 1969 entdeckt (Roberts 1969). Die meisten Prokaryoten besitzen ein homologes Protein zu Rho aus E. coli (Opperman & Richardson 1994; Fraser et al. 1995). In Abhängigkeit von der jeweiligen Spezies besitzt Rho ein Molekulargewicht von ca. 50 kDa (Quirk et al. 1993; Banerjee et al. 2006). In den Proteobakterien E. coli und Rhodobacter sphaeroides ist Rho ein essentielles Protein (Das et al. 1976; Gomelsky & Kaplan 1996). Dagegen stellt Rho in den Gram-positiven Organismen B. subtilis und Staphylococcus aureus kein essentielles Protein dar (Quirk et al. 1993; Washburn et al. 2001). In diesem Umstand liegt auch die Ursache für die Annahme, dass die faktorabhängige Termination in z. B. B. subtilis nur eine untergeordnete Rolle spielt, wohingegen in E. coli etwa die Hälfte der Terminationen vom Faktor Rho abhängen (de Hoon et al. 2005). Analysen haben gezeigt, dass Rho aus E. coli und aus B. subtilis trotzdem ähnliche Eigenschaften z. B. hinsichtlich der RNA-aktivierten ATPase-Aktivität besitzen (Ingham et al. 1999). Rho ist ein homohexameres Protein (Skordalakes & Berger 2003). Das Enzym besitzt sowohl eine ATPase-Aktivität als auch eine RNA/DNA-Helikase-Aktivität und bindet an naszierende mRNA (Ciampi 2006). Jedes Rho-Monomer besitzt eine N-terminale und eine C-terminale Domäne. Die kleinere, N-terminale Domäne bildet die primere RNA-bindende Stelle. Sie kann sowohl einzelsträngige DNA als auch einzelsträngige RNA binden und ist für die Bindung von Rho an die rut-site verantwortlich (Galluppi & Richardson 1980; Richardson 1982; Skordalakes & Berger 2003). In der größeren, C-terminalen Domäne befindet sich die sekundäre RNA-bindende Stelle. Sie wird für die Translokation von Rho entlang der mRNA Einleitung 22 benötigt. Innerhalb der C-terminalen Domäne wird sie von dem Qund dem R-Loop gebildet (Wei & Richardson 2001; Burgess & Richardson 2001; Skordalakes & Berger 2003). Ferner wird auch der P-Loop von der C-terminalen Domäne ausgebildet. Der P-Loop ist für die ATPBindung und die ATPase-Aktivität von Rho verantwortlich (Dombroski & Platt 1988; Dolan et al. 1990; Wei & Richardson 2001; Skordalakes & Berger 2003). 1.7.2.2 Mechanismus der faktorabhängigen Termination Der Mechanismus der Rho-abhängigen Termination wird auch gegenwärtig sehr intensiv untersucht. Bisher sind noch nicht alle involvierten Prozesse bis ins Detail aufgeklärt. An dieser Stelle sollen daher kurz die neuesten Erkenntnisse erwähnt werden. Kristallographische (Skordalakes & Berger 2003) und kinetische (Jeong et al. 2004) Untersuchungen konnten aufklären wie Rho die naszierende mRNA bindet. Das Modell von Jeong et al. (2004) weicht etwas von dem von Skordalakes & Berger (2003) ab. Während Skordalakes & Berger (2003) von einem an einer Stelle geöffnetem Rho-Hexamer ausgehen, welches sich nach der Bindung der mRNA schließt, halten Jeong et al. (2004) es für wahrscheinlicher, dass das Rho-Hexamer ohne eine mRNA eine geschlossene Konformation einnimmt, in welcher die ATP-bindenden Domänen eingeengt werden. Nach dem Modell von Jeong et al. (2004) bindet die primere RNA-bindende Stelle von Rho an die rut-site wodurch die ATP-bindenden Domänen frei nach außen exponiert werden können. Dadurch kann ATP sehr schnell binden und induziert so eine Änderung der Konformation des Hexamers. Infolgedessen befindet sich die mRNA, an die sekundäre RNA-bindende Stelle assoziiert, im Zentrum des Hexamers. Die ATP-bindenden Domänen sind weiter nach außen exponiert, so dass die Translokation des Rho-RNA-ATP-Komplexes beginnen kann. Für die Translokation des Rho-RNA-ATP-Komplexes entlang der mRNA ist die Energie aus der ATP-Hydrolyse notwendig. Für den Prozess der Translokation wurden zwei Modelle aufgestellt (Abbildung 2A). Das „pure tracking“-Modell besagt, dass sich die Bindung zwischen Rho und der rut-site löst. Rho bewegt sich dann in 5‘-3‘-Richtung an der naszierenden mRNA entlang bis zum Transkriptionselongations-Komplex. Dort angekommen, sorgt Rho durch seine 5‘-3‘-RNA-DNA-Helikase-Aktivität dafür, dass die mRNA den Komplex verlässt. Darauf folgt die Dissoziation des gesamten Transkriptionselongations-Komplexes (Geiselmann et al. 1993). Das zweite Modell ist das „tethered tracking“-Modell. In diesem Modell bleibt die Bindung zwischen Rho und der rut- Einleitung 23 site bestehen. Rho bewegt sich, an die rut-site gebunden, die mRNA in 5‘-3‘-Richtung entlang bis zum Transkriptionselongations-Komplex, um dort durch seine 5‘-3‘-RNA-DNA-HelikaseAktivität die Dissoziation des gesamten Transkriptionselongations-Komplexes einzuleiten (Steinmetz & Platt 1994). Allerdings ist für beide Modelle der genaue Mechanismus, nach welchem Rho die mRNA von der RNA-Polymerase trennt, noch nicht bekannt. Unabhängig von diesen beiden relativ ähnlichen Modellen schlagen Epshtein et al. einen ganz anderen Mechanismus vor (Abbildung 2B) (Epshtein et al. 2010). Demnach ist Rho mit Beginn der Initiation der Transkription mit der RNA-Polymerase in einem Komplex vereint. Sobald die naszierende mRNA lang genug ist, wird sie von Rho gebunden. Rho sorgt dann für eine schnelle Inaktivierung der RNA-Polymerase und eine vergleichsweise langsame Dissoziation des Transkriptionselongations-Komplexes. Hierbei spielen Veränderungen in der Konformation des katalytischen Zentrums der RNA-Polymerase durch einen allosterischen Mechanismus eine wichtige Rolle. A B Abbildung 2: Rho-abhängige Termination. A: Modelle der Translokation von Rho entlang der mRNA. Der Faktor Rho bindet an die rut-site. Die Translokation von Rho entlang der mRNA bis zum TranskriptionsElongationskomplex erfolgt nach dem „(pure) tracking“-Modell, nach welchem Rho die rut-site für die Translokation verlässt, oder nach dem „tethered tracking“-Modell, bei welchem Rho auch während der Translokation an die rut-site gebunden ist. Aus: Banerjee et al. (2006). B: allosterischer Mechanismus der Rho-abhängigen Termination. Rho ist mit Beginn der Transkriptionsinitiation mit der RNA-Polymerase assoziiert und bindet bei ausreichender Länge des Transkriptes an die rut-site. Es kommt folglich zur Inaktivierung der RNA-Polymerase durch einen allosterischen Mechanismus und damit zur Dissoziation des Transkriptions-Elongationskomplexes. Das Antibiotikum Tagetitoxin (Tgt) inhibiert die Termination durch Rho. Aus: Epshtein et al. ( 2010). Einleitung 24 1.7.2.3 Die Nus-Faktoren Weitere wichtige Faktoren für die faktorabhängige Termination der Transkription sind die Nus-Faktoren. NusA und NusG interagieren mit dem Faktor Rho und erhöhen so die Effizienz der Termination in vivo (Ciampi 2006; Burmann & Rösch 2011). Für NusG wurde gezeigt, dass das Protein direkt mit der RNA-Polymerase und dem Faktor Rho interagiert (Pasman & von Hippel 2000). So ist es möglich, dass NusG für eine höhere Rate beim Entlassen der naszierenden mRNA aus der RNA-Polymerase und damit für eine schnellere Dissoziation des Transkriptionselongations-Komplexes beim Erreichen einer Terminationsstelle sorgt (Burns et al. 1999). Des Weiteren wurde aber auch gezeigt, dass NusG für eine Erhöhung der Elongationsrate der RNA-Polymerase um 25 % verantwortlich ist (Burns et al. 1998). Das Protein NusA ist, wie auch NusG, in der Lage, den Faktor Rho mit der RNA-Polymerase zu verbinden (Schmidt & Chamberlin 1984). Außerdem ist NusA in der Lage, durch Förderung von Pausen der RNA-Polymerase den Prozess der Transkriptionselongation zu verlangsamen (Artsimovitch & Landick 2000). Dadurch gibt es eine enge Kopplung zwischen der Transkription und der Translation, was letztendlich zu einer Hemmung der vorzeitigen Termination der Transkription führt (Zheng & Friedman 1994). In E. coli sind die Proteine NusG und NusA essentiell (Sullivan & Gottesman 1992; Kainz & Gourse 1998; Ciampi 2006). Dagegen ist in B. subtilis der Faktor NusG nicht essentiell, aber NusA ist es auch für diesen Organismus (Ingham et al. 1999). Dies zeigt, dass der Prozess der Transkriptionstermination durch den Faktor Rho in beiden Organismen Unterschiede aufweisen muss (Ingham et al. 1999). Das Zusammenspiel zwischen den Faktoren Rho, NusA und NusG wurde auch schon in einer genomweiten Analyse in E. coli untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass Rho als globaler Regulator auftritt, dessen Einfluss auf das Transkriptom sehr viel größer ist als auf das Proteom. Diese Studie zeigte, dass besonders Prophagen und andere Gene, welche durch horizontalen Gentransfer erhalten wurden, einer Termination durch Rho unterliegen. In Stämmen, in welchen genau diese Gene deletiert waren, wurde beobachtet, dass die Faktoren NusA und NusG nicht mehr benötigt wurden. Des Weiteren wiesen diese Stämme mit einem nusAoder einem nusG-Knockout ähnliche Transkriptionsprofile auf. Das ist ein Hinweis, dass diese Proteine normalerweise zusammenarbeiten. Ein E. coli-Stamm, welcher nur den Knockout des rac-Prophagen enthielt, ermöglichte auch schon eine Deletion des essentiellen Einleitung 25 nusG. Das zeigt, dass die entscheidende Funktion von NusG in E. coli die Unterdrückung der rac-Expression ist (Cardinale et al. 2008). 1.8 Zielsetzung dieser Arbeit Der ECF-Sigmafaktor X aus B. subtilis wurde hinsichtlich seines Regulons schon intensiv analysiert. Dabei wurden einige Gene, einschließlich des sigX-rsiX-Operons, gefunden, die unter der Kontrolle dieses Sigmafaktors stehen (Kapitel 1.6.2.1). Zusammengefasst kann demnach X eine Funktion im Hinblick auf die Zusammensetzung und den Metabolismus der Zellhülle zugesprochen werden (Helmann 2002). Des Weiteren ist die Regulation von X durch den Anti-Sigmafaktor RsiX bekannt (Brutsche & Braun 1997). Jedoch sind noch keine Erkenntnisse über die Regulation von RsiX vorhanden. RsiX ist wie auch RsiW, der Anti-Sigmafaktor von dem ECF-Sigmafaktor W (Kapitel 1.6.1.2), ein Transmembran-Protein, welches extrazelluläre Signale über die Membran ins Cytoplasma leiten kann. Damit extrazelluläre Informationen den ECF-Sigmafaktor W erreichen, sind mehrere proteolytische Schritte nötig, die am Ende zum vollständigen Abbau von RsiW führen (Kapitel 1.6.1.2). Aufgrund von strukturellen Ähnlichkeiten zwischen den Anti-Sigmafaktoren RsiX und RsiW wird daher eine ähnliche Regulation vermutet, denn auch der Anti-Sigmafaktor RseA des ECF-Sigmafaktors E aus E. coli (Kapitel 1.6.1.1) wird vergleichbar wie RsiW prozessiert. Es könnte sich dabei um eine generelle Regulation für ECF-Sigmafaktoren handeln. Im Hinblick auf den Einfluss von ECF-Sigmafaktoren bei der Pathogenität einiger Mikroorganismen (Kapitel 1.6.1) könnte dies einen sehr wichtigen Ansatz für die Medikamentenentwicklung darstellen. Erste Experimente zur regulierten Proteolyse von RsiX zeigten allerdings keine eindeutigen Ergebnisse (Schäfer 2007). Das Ziel dieser Arbeit bestand deshalb darin, durch einen genomweiten Screen in B. subtilis Faktoren mit Einfluss auf die Stabilität des AntiSigmafaktors RsiX zu identifizieren und einen möglichen Mechanismus für die RsiXRegulation aufzustellen. Für diesen Screen sollte die Methode der Transposonmutagenese angewandt werden. Der eindeutige Einfluss von durch den Screen identifizierten Faktoren sollte im Anschluss durch die Konstruktion der entsprechenden Knockout-Stämme verifiziert werden. Schließlich sollte versucht werden, einen möglichen Mechanismus der RsiXRegulation zu postulieren. Zusätzlich sollte überprüft werden, inwieweit sich die gefundene Regulation von RsiX mit der von RsiW deckt. Material und Methoden 26 2 Material und Methoden 2.1 Bakterienstämme, Plasmide und Oligonukleotide Die in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme (Tabelle 1), Plasmide (Tabelle 2) und Oligonukleotide (Primer; Tabelle 3 und Tabelle 4) sind im Folgenden aufgeführt. Tabelle 1: Bakterienstämme Die in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme sind mit Bezeichnung, relevantem Genotyp sowie der Referenz angegeben. Wurde statt einer Referenz ein * angegeben, wurde der Stamm in dieser Arbeit konstruiert. Stammbezeichnung relevanter Genotyp Referenz E. coli DH10B F– mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80dlacZM15 lacX74 deoR recA1 endA1 araD139 (ara, leu) 7697 galU galK – rpsL nupG (Strr) Grant et al. 1990 XL1-Blue F’::Tn10 proA+B+ lacIq Δ(lacZ)M15/recA1 endA1 gyrA96(Nalr) thi hsdR17 (rK-mK+) glnV44 relA1 lac Stratagene B. subtilis 1012 leuA8 metB5 trpC2 hsrM1 Saito et al. 1979 NCIB 3610 wildtypischer B. subtilis-Stamm Branda et al. 2001 1012 amyE::cat 1012 amyE::cat (Cmr) Mogk et al. 1996 1012 lacA::spec 1012 lacA::spec (Specr) Härtl et al. 2001 1012 rsiX::spec 1012 rsiX::spec (Specr) Schäfer 2007 1012 rasP::tet 1012 yluC::tet (Tetr) Schöbel et al. 2004 1012 prsW::bleo 1012 ypdC::bleo (Bleor) Heinrich & Wiegert 2006 1012 clpX 1012 clpX::cat (Cmr) Wiegert & Schumann 2001 1012 rho::bleo 1012 rho::bleo (Bleor) T. Wiegert (unveröffentlicht) 1012 sigXrsiX::spec 1012 sigXrsiX::spec (Specr) * WB800 ΔtrpC ΔnprE ΔaprE Δepr Δvpr Δbpr Δmpr::bleo ΔnprB::bsr ΔwprA::hyg (Cmr) Murashima et al. 2002 KS4 1012 amyE::PdltA-lacZ (Neor) Schäfer 2007 KS18 KS4 rsiX::spec (Neor, Specr) Schäfer 2007 KS11 1012 rsiX::spec amyE::PdltA-lacZ lacA::pAL-FLAGrsiX 71-368 (Specr, Neor, Emr) Schäfer 2007 Material und Methoden 27 Stammbezeichnung relevanter Genotyp Referenz KS12 1012 rsiX::spec amyE::PdltA-lacZ lacA::pAL-FLAGrsiX (Specr, Neor, Emr) Schäfer 2007 KS41 1012 amyE::PgroE-gfp-rsiX (Cmr) Schäfer 2007 KS42 KS41 rasP::tet (Cmr, Tetr) Schäfer 2007 1012 pHTgfp-rsiW 1012 amyE::PyuaF-lacZ pHTgfp-rsiW (Neor, Cmr) T. Wiegert (unveröffentlicht) 1012 pHTgfp-rsiW rasP 1012 amyE::PyuaF-lacZ pHTgfp-rsiW rasP::tet (Neor, Cmr, Tetr) T. Wiegert (unveröffentlicht) 1012 pHTgfp-rsiW prsW 1012 amyE::PyuaF-lacZ pHTgfp-rsiW prsW::bleo (Neor, Cmr, Bleor) T. Wiegert (unveröffentlicht) KS82 1012 pHTgfp-rsiX (Cmr) * KS83 1012 pHTgfp-rsiX rasP::tet (Cmr, Tetr) * KS94 1012 pHTgfp-rsiX prsW::bleo (Cmr, Bleor) * KS115 1012 amyE::PgroE-gfp-bleo-rsiX (Cmr) * KS119 1012 amyE::PgroE-gfp-bleo-rsiX pIC333 (Cmr, Specr) * KS123 1012 amyE::PgroE-gfp-bleo-rsiX mini-Tn10 (Cmr, Specr, Bleor) * KS123a 1012 amyE::PdltA-lacZ mini-Tn10 (Neor, Specr) * KS149 1012 lacA::pALFsigX-rsiX (Emr) * KS155 1012 lacA::pALFsigX-rsiX rho::bleo (Emr, Bleor) * KS162 1012 lacA::pALFsigX-rsiX sigXrsiX::spec (Emr, Specr) * KS166 1012 lacA::pALFsigX-rsiX sigXrsiX::spec rho::bleo (Emr, Specr, Bleor) * KS148 1012 lacA::pALFsigX_stop-rsiX (Emr) * KS154 1012 lacA::pALFsigX_stop-rsiX rho::bleo (Emr, Bleor) * KS161 1012 lacA::pALFsigX_stop-rsiX sigXrsiX::spec (Emr, Specr) * KS165 1012 lacA::pALFsigX_stop-rsiX sigXrsiX::spec rho::bleo (Emr, Specr, Bleor) * 1012 rasP rho 1012 rho::bleo rasP::tet (Bleor, Tetr) * 1012-gfp 1012 amyE::PgroECIRCE-gfp+ (Neor) Zellmeier et al. 2006 1012-gfp rho 1012-gfp rho::bleo (Bleor, Neor) * 1012-gfp rasP 1012-gfp rasP::tet (Tetr, Neor) * 1012-gfp rasP rho 1012-gfp rho::bleo rasP::tet (Bleor, Tetr, Neor) * Material und Methoden 28 Stammbezeichnung relevanter Genotyp Referenz KS187 - KS190 1012 amyE::PgroE-gfp-rsiX (KS187; Cmr) verknüpft mit rasP::tet (KS188; Cmr, Tetr), rho::bleo (KS189; Cmr, Bleor) oder beiden (KS190; Cmr, Tetr, Bleor) * KS191 - KS194 1012 amyE::PgroE-gfp-rsiX 71-368 (KS191; Cmr) verknüpft mit rasP::tet (KS192; Cmr, Tetr), rho::bleo (KS193; Cmr, Bleor) oder beiden (KS194; Cmr, Tetr, Bleor) * KS195 - KS198 1012 amyE::PgroE-gfp-rsiX 146-368 (KS195; Cmr) verknüpft mit rasP::tet (KS196; Cmr, Tetr), rho::bleo (KS197; Cmr, Bleor) oder beiden (KS198; Cmr, Tetr, Bleor) * KS201/KS203/KS231/KS232 1012 amyE::PgroE-gfp-rsiX 1-21 (KS201; Cmr) verknüpft mit rasP::tet (KS231; Cmr, Tetr), rho::bleo (KS203; Cmr, Bleor) oder beiden (KS232; Cmr, Tetr, Bleor) * KS202/KS204/KS233/KS234 1012 amyE::PgroE-gfp-rsiX 1-43 (KS202; Cmr) verknüpft mit rasP::tet (KS233; Cmr, Tetr), rho::bleo (KS204; Cmr, Bleor) oder beiden (KS234; Cmr, Tetr, Bleor) * KS207/KS209/KS227/KS228 1012 amyE::PgroE-gfp-rsiX 1-70 (KS207; Cmr) verknüpft mit rasP::tet (KS228; Cmr, Tetr), rho::bleo (KS209; Cmr, Bleor) oder beiden (KS227; Cmr, Tetr, Bleor) * KS208/KS210/KS229/KS230 1012 amyE::PgroE-gfp-rsiX 1-99 (KS208; Cmr) verknüpft mit rasP::tet (KS230; Cmr, Tetr), rho::bleo (KS210; Cmr, Bleor) oder beiden (KS229; Cmr, Tetr, Bleor) * 1012 gfp-RBS_rsiX 1012 amyE::PgroE-gfp-RBS_rsiX (Cmr) T. Wiegert (unveröffentlicht) 1012 gfp-RBS_rsiX rasP 1012 amyE::PgroE-gfp-RBS_rsiX rasP::tet (Cmr, Tetr) T. Wiegert (unveröffentlicht) 1012 gfp-RBS_rsiX rho 1012 amyE::PgroE-gfp-RBS_rsiX rho::bleo (Cmr, Bleor) T. Wiegert (unveröffentlicht) KS235 1012 amyE::PgroE-gfp-RBS_rsiX rasP::tet rho::bleo (Cmr, Tetr, Bleor) * 1012 gfp-RBSmut_rsiX 1012 amyE::PgroE-gfp-RBSmut_rsiX (Cmr) T. Wiegert (unveröffentlicht) 1012 gfp-RBSmut_rsiX rasP 1012 amyE::PgroE-gfp-RBSmut_rsiX rasP::tet (Cmr, Tetr) T. Wiegert (unveröffentlicht) Material und Methoden 29 Stammbezeichnung relevanter Genotyp Referenz 1012 gfp-RBSmut_rsiX rho 1012 amyE::PgroE-gfp-RBSmut_rsiX rho::bleo (Cmr, Bleor) T. Wiegert (unveröffentlicht) KS236 1012 amyE::PgroE-gfp-RBSmut_rsiX rasP::tet rho::bleo (Cmr, Tetr, Bleor) * KS157/KS172/KS173/KS174 1012 amyE::PgroE-gfp_Stop-rsiX (KS157; Cmr) verknüpft mit rasP::tet (KS173; Cmr, Tetr), rho::bleo (KS172; Cmr, Bleor) oder beiden (KS174; Cmr, Tetr, Bleor) * 1012 gfp-rsiX 53-69 1012 amyE::PgroE-gfp-rsiX 53-69 (Cmr) T. Wiegert (unveröffentlicht) 1012 gfp-rsiX 53-69 rho 1012 amyE::PgroE-gfp-rsiX 53-69 rho::bleo (Cmr, Bleor) T. Wiegert (unveröffentlicht) 1012 gfp-rsiX wt* 1012 amyE::PgroE-gfp-rsiX_restauriert (Cmr) T. Wiegert (unveröffentlicht) 1012 gfp-rsiX wt* rho 1012 amyE::PgroE-gfp-rsiX_restauriert rho::bleo (Cmr, Bleor) T. Wiegert (unveröffentlicht) 1012 gfp-rsiX_rut 1012 amyE::PgroE-gfp-rsiX_rut (Cmr) T. Wiegert (unveröffentlicht) 1012 gfp-rsiX_rut rho 1012 amyE::PgroE-gfp-rsiX_rut rho::bleo (Cmr, Bleor) T. Wiegert (unveröffentlicht) KS245 1012 rsiX::spec amyE::PdltA-lacZ lacA::pALFrsiX wt* (Specr, Neor, Emr) T. Wiegert (unveröffentlicht) KS242/KS249/KS253/KS257 KS245 verknüpft mit rasP::tet (KS242; Tetr, Specr, Neor, Emr), clpX::cat (KS249; Cmr, Specr, Neor, Emr), prsW::bleo (KS253; Bleor, Specr, Neor, Emr) oder mit dem achtfach Proteasen-Knockout von WB800 (KS257; Cmr, Specr, Neor, Emr) * KS246 1012 rsiX::spec amyE::PdltA-lacZ lacA::pALFrsiX_rut (Specr, Neor, Emr) T. Wiegert (unveröffentlicht) KS243/KS250/KS254/KS258 KS246 verknüpft mit rasP::tet (KS243; Tetr, Specr, Neor, Emr), clpX::cat (KS250; Cmr, Specr, Neor, Emr), prsW::bleo (KS254; Bleor, Specr, Neor, Emr) oder mit dem achtfach Proteasen-Knockout von WB800 (KS258; Cmr, Specr, Neor, Emr) * DS3290 [PY79] amyE::Physpank-lytF (Specr) Chen et al. 2009 3610 rho::bleo 3610 rho::bleo (Bleor) T. Wiegert (unveröffentlicht) KS267 3610 rho::bleo amyE::Physpank-lytF (Bleor, Specr) * Material und Methoden 30 Tabelle 2: Plasmide Die in dieser Arbeit verwendeten Plasmide sind mit Bezeichnung, Beschreibung sowie der Referenz angegeben. Wurde statt einer Referenz ein * angegeben, wurde das Plasmid in dieser Arbeit konstruiert. Plasmidbezeichnung Beschreibung Referenz pIC333 Shuttle-Vektor für Transposonmutagenese in B. subtilis, kodiert das Transposon mini-Tn10 (Specr, Emr) Steinmetz & Richter 1994 pHTgfp in B. subtilis autonom replizierendes Plasmid für translationelle gfp-Fusionen, Promotor Pgrac ist IPTG induzierbar (Ampr, Cmr) Heinrich et al. 2009 pHTgfp-rsiX in B. subtilis autonom replizierendes Plasmid für translationelle gfp-rsiX-Fusion, Promotor Pgrac ist IPTG induzierbar (Ampr, Cmr) * pBRgfp-bleo Plasmid für translationelle gfp-bleo-Fusionen nach Integration in B. subtilis 1012-gfp, konstitutiver Promotor PgroE (Ampr, Cmr) T. Wiegert (unveröffentlicht) pBRgfp-bleo-rsiX Plasmid für translationelle gfp-bleo-rsiX-Fusion nach Integration in B. subtilis 1012-gfp, konstitutiver Promotor PgroE (Ampr, Cmr) * pBR322rsiX::spec Vektor für rsiX::spec Knockout (Ampr, Specr) Schäfer 2007 pBRsigXrsiX::spec Plasmid für Knockout des sigX-Operons (Ampr, Specr) * pAL-FLAGrsiW rsiW N-terminal fusioniert mit 3x FLAG-tag, IPTGinduzierbarer Promotor Pspac (Ampr, Emr) Schöbel et al. 2004 pALFsigX-rsiX Vektor für die Integration des IPTG-induzierbaren sigXOperons in den lacA-Locus von B. subtilis, dabei ist sigX Nterminal fusioniert mit einem 3x FLAG-tag (Ampr, Emr) * pALFsigX_stop-rsiX Vektor für die Integration des IPTG-induzierbaren sigX_stopOperons in den lacA-Locus von B. subtilis, dabei ist sigX_stop N-terminal fusioniert mit einem 3x FLAG-tag, sigX_stop bedeutet ein Stopp-Codon direkt nach dem Start-Codon von sigX (Ampr, Emr) * pBRgfp_amyE Plasmid für translationelle gfp-Fusionen nach Integration in B. subtilis 1012-gfp, konstitutiver Promotor PgroE (Ampr, Cmr) T. Wiegert (unveröffentlicht) pBRgfp-rsiX Plasmid für translationelle gfp-rsiX-Fusion nach Integration in B. subtilis 1012-gfp, konstitutiver Promotor PgroE (Ampr, Cmr) * pBRgfp-rsiX 71-368 Plasmid für translationelle gfp-rsiX 71-368-Fusion nach Integration in B. subtilis 1012-gfp, konstitutiver Promotor PgroE (Ampr, Cmr) * pBRgfp-rsiX 146-368 Plasmid für translationelle gfp-rsiX 146-368-Fusion nach Integration in B. subtilis 1012-gfp, konstitutiver Promotor PgroE (Ampr, Cmr) * Material und Methoden 37 TfB II: 10 mM MOPS 10 mM RbCl 75 mM CaCl2 15 % (w/v) Glycerin pH 7,0 mit 1 M NaOH einstellen sterilfiltrieren, lagern bei –20 °C Northern Blot: „Killing-Puffer“: 20 mM Tris/HCl, pH 7,5 5 mM MgCl2 20 mM NaN3 Lysislösung I: 25 % Saccharose 50 mM Tris/HCl, pH 8,0 0,25 mM EDTA Lysozymlösung: 20 mg Lysozym/ml bidest. H2O Lysislösung II: 3 mM EDTA 200 mM NaCl Saures Phenol: Aqua-Phenol, Chloroform, Isoamylalkohol (v/v/v; 25:24:1), zweimal ausgeschüttelt mit bidest. H2O Chloroform/Isoamylalkohol: Chloroform, Isoamylalkohol (v/v; 24:1), mit 100 mM Tris/HCl, pH 8,0 äquilibriert Natriumacetat 3M Material und Methoden 38 RNA-Probenpuffer (2x): 6,5 ml Formamid 1,2 ml Formaldehyd 2,0 ml 10x MOPS-Puffer 0,4 ml 50 % Saccharose 20 mg Bromphenolblau 20 mg Xylencyanol MOPS-Puffer (10x): 200 mM MOPS 50 mM Natriumacetat 10 mM EDTA pH mit NaOH auf 7,0 einstellen, ad 1 l bidest. H2O, autoklavieren Denaturierungslösung: 50 mM NaOH 10 mM NaCl Neutralisierungslösung: 100 mM Tris/HCl, pH 7,4 SSC-Puffer (20x): 3 M NaCl 0,3 M Natriumcitrat pH auf 7,0 einstellen, bei RT lagern Blocking Reagenz (10 %): 10 % Blocking Reagenz in Puffer P1 in Mikrowelle aufkochen lassen, autoklavieren, Lagerung bei 4 °C DEPC-H2O: 1 ml DEPC in 1 l bidest. H2O lösen (0,1 %), gut schütteln, ÜN bei RT lagern, am nächsten Tag autoklavieren Material und Methoden 39 Prähybridisierungslösung: 50 % (v/v) Formamid 5x SSC 2 % (w/v) Blocking Reagenz 0,1 % (w/v) N-Lauroylsarcosin 0,02 % (w/v) SDS unmittelbar vor Gebrauch ansetzen, 30 min bei 37 °C vorinkubieren Waschlösung I: 2x SSC 0,1 % SDS bei RT lagern Waschlösung II: 0,1x SSC 0,1 % SDS auf 68 °C vortemperieren Puffer P1: 100 mM Maleinsäure, pH 7,5 150 mM NaCl Puffer P2: 1 % (w/v) Blocking Reagenz in Puffer P1 unmittelbar vor Gebrauch ansetzen, 30 min bei 37 °C vorinkubieren Detektionslösung: 0,1 M Diethanolamin 1 mM MgCl2 pH auf 9,5 einstellen, bei RT lagern Waschpuffer: 0,3 % (v/v) Tween 20 in Puffer P1 Material und Methoden 40 Southern Blot: Depurinierungslösung: 0,25 M HCl Denaturierungslösung: 0,5 M NaOH 1,5 M NaCl Neutralisierungslösung: 1,5 M NaCl 0,5 M Tris/HCl, pH 7,4 SSC-Puffer (20x): 3 M NaCl 0,3 M Natriumcitrat pH auf 7,0 einstellen, bei RT lagern Blocking Reagenz (10 %): 10 % Blocking Reagenz in Puffer P1 in Mikrowelle aufkochen lassen, autoklavieren, Lagerung bei 4 °C Prähybridisierungslösung: 5x SSC 1 % (w/v) Blocking Reagenz 0,1 % (w/v) N-Lauroylsarcosin 0,02 % (w/v) SDS unmittelbar vor Gebrauch ansetzen, 30 min bei 37 °C vorinkubieren Waschlösung I: 2x SSC 0,1 % SDS bei RT lagern Material und Methoden 41 Waschlösung II: 0,1x SSC 0,1 % SDS auf 68 °C vortemperieren Puffer P1: 100 mM Maleinsäure, pH 7,5 150 mM NaCl Puffer P2: 1 % (w/v) Blocking Reagenz in Puffer P1 unmittelbar vor Gebrauch ansetzen, 30 min bei 37 °C vorinkubieren Detektionslösung: 0,1 M Diethanolamin 1 mM MgCl2 pH auf 9,5 einstellen, bei RT lagern Waschpuffer: 0,3 % (v/v) Tween 20 in Puffer P1 Western Blot: Aufschlusspuffer: 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 100 mM NaCl autoklavieren Material und Methoden 42 Auftragspuffer (3x Lämmli): 3 ml Glycerin 0,3 ml -Mercaptoethanol 3 ml 20 % SDS 0,3 mg Bromphenolblau (oder 60 µl einer 0,5%igen Lösung in bidest. H2O) 1,825 ml bidest. H2O (oder 1,765 ml bei Verwendung einer 0,5%igen Lösung Bromphenolblau) 1,875 ml 0,5 M Tris/HCl pH 6,8 lagern bei –20 °C Elektrophoresepuffer (10x): 30 g Tris 140 g Glycin 10 g SDS bidest. H2O ad 1 l, lagern bei RT AP-Puffer (10x): 1 M Tris/HCl pH 7,4 1 M NaCl 2,5 mM MgCl2 bidest. H2O ad 1 l, lagern bei RT AP-T-Puffer: 100 ml AP-Puffer (10x) 0,05 % v/v Tween 20 (500 µl) ad 1 l bidest. H2O, lagern bei RT Blotting-Puffer: 3 g Tris 14 g Glycin 1 g SDS 200 ml Methanol bidest. H2O ad 1 l, lagern bei RT Material und Methoden 43 2.3 Antibiotika-Lösungen Alle verwendeten Antibiotika-Lösungen sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Wasserlösliche Antibiotika wurden steril filtriert. Alle Lösungen wurden bei –20 °C gelagert. Tabelle 5: Zusammenfassung der verwendeten Antibiotika-Lösungen Angegeben sind jeweils Name, Konzentration der Stammlösung, Lösungsmittel sowie Endkonzentration des Antibiotikums in dem jeweils verwendeten Medium. Antibiotikum Konzentration der Stammlösung [mg/ml] Lösungsmittel Endkonzentration [μg/ml] Ampicillin (Amp) 100 70 % (v/v) EtOH 100 Bicyclomycin (BCM) 100 bidest. H2O 100 Chloramphenicol (Cm) 20 EtOH abs. 10 Erythromycin (Em) 1 bzw. 50 EtOH abs. 1 bzw. 100 Neomycin (Neo) 10 bidest. H2O 10 Bleomycin (Bleo) 1 bidest. H2O 1 Spectinomycin (Spec) 100 bidest. H2O 100 Tetracyclin (Tet) 2 50 % (v/v) EtOH 10 2.4 Antikörper Für die in dieser Arbeit durchgeführten Hybridisierungsexperimente sind die in Tabelle 6 und Tabelle 7 aufgelisteten primären und sekundären Antikörper verwendet worden. Tabelle 6: Primäre Antikörper Die Tabelle zeigt die in dieser Arbeit verwendeten primären Antikörper mit Verdünnung und Referenz auf. Name Verdünnung Referenz Anti-FLAG 1 : 1000 Sigma, F7425 Anti-GFP 1 : 5000 S. Heidmann, unveröffentlicht B. subtilis Anti-HtpG 1 : 10000 Zellmeier et al. 2003 B. subtilis Anti-FtsH 1 : 10000 Zellmeier et al. 2003 Material und Methoden 44 Tabelle 7: Sekundäre Antikörper Die Tabelle zeigt die in dieser Arbeit verwendeten sekundären Antikörper mit Verdünnung und Referenz auf. Name Verdünnung Referenz ECL™ Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase Conjugate 1 : 5000 GE Healthcare, NA934V Anti-Digoxygenin-AP, Fab fragments 1 : 10000 Roche, 11 093 274 910 2.5 Längenstandards Die für Agarose-Gelelektrophoresen benutzten Längenstandards sowie der Molekulargewichtsstandard für SDS-PAGEs, welche für Western Blot Analysen durchgeführt wurden, sind in Tabelle 8 aufgelistet. Tabelle 8: Längenstandards für Agarose-Gelelektrophoresen und Molekulargewichtsstandard für SDSPAGEs Angegeben sind zum einen der Name der Längenstandards für Agarose-Gelelektrophoresen mit Referenz sowie Größe der DNAbzw. RNA-Fragmente in bp bzw. Basen. Zum anderen ist der Name des Molekulargewichtsstandards für SDS-PAGEs mit Referenz und den Größen der Proteine in kDa angegeben. Standard für DNAAgarosegele Referenz Fragmentgrößen in bp Spp1 Roche 8576, 7425, 6106, 4899, 3639, 2799, 1953, 1882, 1515, 1482, 1164, 992, 710, 492, 359 O´RangeRulerTM 200 bp DNA Ladder, ready-to-use Fermentas 3000, 2800, 2600, 2400, 2200, 2000, 1800, 1600, 1400, 1200, 1000, 800, 600, 400, 200 O´RangeRulerTM 100+500 bp DNA Ladder, ready-to-use Fermentas 6000, 5500, 5000, 4500, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 Standard für RNAAgarosegele Referenz Fragmentgrößen in Basen RiboRuler™ RNA Ladder, High Range Fermentas 6000, 4000, 3000, 2000, 1500, 1000, 500, 200 Standard für SDS-PAGEs Referenz Molekulargewichte in kDa PageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder Fermentas 250, 130, 100, 70, 55, 35, 25, 15, 10 Material und Methoden 45 2.6 Mikrobiologische Methoden 2.6.1 Nährmedien Die verwendeten Nährmedien wurden wie bei Sambrook beschrieben hergestellt (Sambrook & Russell 2001). Die nachfolgend beschriebenen Zusammensetzungen der einzelnen Medien beziehen sich auf Flüssigkeiten. Wurde das LB-Medium als festes Nährmedium verwendet, wurden diesem 15 g/l Agar-Agar bzw. 7 g/l Agar-Agar für Weichagar vor dem Autoklavieren zugefügt. Für Selektionen nötige Antibiotika-Lösungen (Tabelle 5) wurden stets nach dem Autoklavieren zugegeben. Das LB-Medium diente zur Kultivierung von B. subtilisbzw. E. coli-Zellen, dagegen wurde das HSund LS-Medium zur Herstellung kompetenter B. subtilis-Zellen und der folgenden Transformation von DNA benötigt (2.6.4.2). LB-Medium 10 g Caseinhydrolysat (Trypton oder Pepton) 5 g Hefeextrakt 5 g NaCl bidest. H2O ad 1000 ml, autoklavieren LS-Medium 81,2 ml bidest. H2O 10 ml 10x S-Base mit Mg2+ 2,5 ml 20 % Glucose 0,5 ml 1 mg/ml (0,1%) DL-Tryptophan 0,5 ml 2 % Caseinhydrolysat 5 ml 2 % Hefeextrakt (Difco!) 0,25 ml 1 M MgCl2 0,05 ml 1 M CaCl2 Alle Komponenten werden nach dem Autoklavieren steril zusammengegeben. Die Tryptophanlösung wurde nur sterilfiltriert. Material und Methoden 46 HS-Medium 10 ml 10x S-Base mit Mg2+ 2,5 ml 20 % Glucose 5 ml 1 mg/ml (0,1%) DL-Tryptophan 1 ml 2 % Casein 5 ml 10 % Hefeextrakt 10 ml 8 % Arginin, 0,4 % Histidin 66,5 ml bidest. H2O Alle Komponenten werden nach dem Autoklavieren steril zusammengegeben. Die Tryptophanlösung wurde nur sterilfiltriert. 2.6.2 Kulturverfahren Um die Bakterienkulturen in ausreichender Menge zur Verfügung zu haben, wurden diese in flüssigem LB-Medium (gegebenenfalls mit dem entsprechenden Antibiotikum) bei 37 °C und 200 rpm unter ausreichender Luftzufuhr inkubiert. Bei der Verwendung von festem Medium wurden die Bakterienkulturen mithilfe eines Drygalski-Spatels oder einer Impföse auf LB-Platten (gegebenenfalls mit dem entsprechenden Antibiotikum) ausplattiert und bei 37 °C über Nacht im Brutschrank angezogen. 2.6.2.1 Aufnehmen von Wachstumskurven Für die Aufnahme von Wachstumskurven wurden 50 ml LB-Medium (gegebenenfalls mit dem entsprechenden Antibiotikum) mit einer Übernachtkultur des entsprechenden Bakterienstammes auf eine OD578 von 0,05 angeimpft. Die Kolben wurden im Wasserbad unter Schütteln und ausreichender Luftzufuhr bei 37 °C inkubiert. Das Bakterienwachstum wurde durch Messung der OD578 in definierten Zeitabständen verfolgt. Bei Bedarf wurden Proben der Bakteriensuspension entnommen. Material und Methoden 53 Es wurden 25 µl Lysozym-Lösung zugegeben. Anschließend wurde gründlich gemischt und für 30 min bei 37 °C inkubiert. Im Anschluss wurden 30 µl SDS-Lösung und 3 µl Proteinase K zugefügt und es wurde gründlich gemischt. Für 1 Stunde wurde nun bei 37 °C inkubiert. Als nächstes wurden 100 µl 5 M NaCl (nach Zugabe wurde gründlich gemischt) und 80 µl CTAB/NaCl zugegeben und durchmischt. Es folgte eine 10-minütige Inkubation bei 65 °C. Im Anschluss erfolgte die Extraktion mit 700 µl Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) und eine Zentrifugation für 5 min bei 12000 rpm. Es kam zur Phasentrennung. Für die folgende Phenolisierung wurde jeweils der wässrige, nukleinsäurehaltige viskose Überstand inklusive der weißlichen Interphase in ein neues 1,5 ml Sarstedt-Reaktionsgefäß überführt. Bei der Phenolisierung wurde mit je 600 µl der folgenden Reagenzien extrahiert: 1x Phenol, 1x Phenol/Chloroform (1:1) und am Ende 2x mit Chloroform/Isoamylalkohol (24:1). Nach jeder Extraktion wurde für 5 min bei 12000 rpm zentrifugiert. Nach der letzten Extraktion wurde nur der Überstand ohne die Interphase in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit 10 µl RNase versetzt. Es wurde für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Dann erfolgte die Zugabe von 0,6 Volumina Isopropanol, es wurde durchmischt und für ca. 2 Stunden bei -20 °C (oder über Nacht bei 4 °C) die DNA gefällt. Nun wurde für 15 min bei 4 °C und 12000 rpm zentrifugiert, um die DNA zu pelletieren. Das entstandene Pellet wurde mit 1 ml 70%igen Ethanol gewaschen und für 10 min bei 12000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde bei Raumtemperatur ca. 15 min getrocknet. Anschließend wurde die DNA in 100 µl TE-Puffer resuspendiert und zum Lösen ca. 1 Stunde bei 65 °C inkubiert. Danach wurde die DNA-Konzentration bestimmt (2.7.2). 2.7.1.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli 2.7.1.2.1 Isolierung von Plasmid-DNA durch Mini-Präparation (Boiling Präparation) Mit der Mini-Plasmid-Präparation nach der Boiling-Präp-Methode (Holmes & Quigley 1981) wurden geringe Mengen an Plasmid-DNA erhalten, wie sie z. B. für Kontrollverdaus nach einer Ligation benötigt wurden. Dabei ging man wie folgt vor: Es wurde eine Übernachtkultur aus 2 ml LB mit dem entsprechenden Antibiotikum angelegt und bei 37 °C inkubiert. 1,5 ml dieser Kultur wurden in ein 1,5 ml Sarstedt-Reaktionsgefäß überführt. Bei der anschließenden Zentrifugation (12000 rpm, 3 min) wurden die Bakterien pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in 110 µl STETL-Lösung Material und Methoden 54 resuspendiert. Es folgte eine 5-minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Anschließend wurde 30 sec bei 100 °C im Heizblock inkubiert und danach für 15 min bei 4 °C und 12000 rpm zentrifugiert. Das schleimige Sediment wurde mit einem sterilen Zahnstocher entfernt und zu dem Überstand wurden 110 µl Isopropanol gegeben. Es wurde kurz und gründlich per Hand gemischt und erneut für 15 min bei 12000 rpm und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das erhaltene DNA-Pellet wurde mit 1 ml 70%igen Ethanol gewaschen und eine Zentrifugation für 10 min und 12000 rpm folgte. Das Pellet wurde für ca. 5-10 min bei Raumtemperatur getrocknet und in 30 µl TE-Puffer (enthält 1 µl RNase) resuspendiert. Von dieser isolierten DNA wurden Testverdaus (2.7.4.1) durchgeführt. 2.7.1.2.2 Isolierung von Plasmid-DNA durch Midi-Präparation Die Midi-Plasmid-Präparation wurde verwendet, um größere Mengen an Plasmid-DNA von hoher Reinheit zu gewinnen. Dabei wurde zur Präparation der QIAGEN Plasmid Midi Kit 100 (Qiagen, Hilden) verwendet. Es wurde nach dem vom Hersteller angegebenen Protokoll vorgegangen. 2.7.1.3 Isolierung von Gesamt-RNA aus B. subtilis Für die Isolierung von Gesamt-RNA aus B. subtilis wurde die saure Phenol-Methode von Völker (Völker et al. 1994) in einer leicht modifizierten Weise (Homuth et al. 1997) angewandt. Es wurde dabei wie folgt verfahren: 10 ml der relevanten Bakterienkultur wurden sofort nach der Probenahme auf 5 ml gefrorenen zerstoßenen Killing-Puffer in Zentrifugenröhrchen gegeben. Es folgte eine Zentrifugation bei 4 °C und 3700 rpm für 30 min. Im Anschluss wurde das Pellet in 1 ml Killing-Puffer resuspendiert, in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und erneut zentrifugiert (4 °C, 8800 rpm, 5 min). Das erhaltene Pellet konnte ggf. bei -20 °C gelagert werden oder es wurde sofort weiter verwendet und in 1 ml Lysislösung I auf Eis resuspendiert. Es wurde anschließend mit 50 µl Lysozymlösung versetzt und für 5 min auf Eis inkubiert, damit sich Protoplasten ausbilden konnten. Gleichzeitig wurde die Lysislösung II vorbereitet: pro RNA-Probe wurden in ein 2 ml Reaktionsgefäß 270 µl Lysislösung II und 30 µl 10 % SDS gegeben. Nach dem Mischen wurde die Lösung bei 95 °C im Heizblock vorgewärmt. Die Suspension mit den Protoplasten wurde zentrifugiert (4 °C, 4000 rpm, 5 min). Das resultierende Pellet wurde in Material und Methoden 55 300 µl Lysislösung II resuspendiert und zu der vorgewärmten Lysislösung II/SDS-Mischung gegeben. Zusammen wurde alles für 5 min bei 95 °C inkubiert. Dabei wurden die Protoplasten lysiert. Danach wurden zu dieser Lösung 600 µl saure Phenol-Lösung gegeben. Es wurde für 5 min bei RT geschüttelt und danach 5 min bei 12000 rpm zentrifugiert. 500 µl der Oberphase wurden erneut mit saurem Phenol (500 µl) versetzt und das Schütteln bei RT sowie die Zentrifugation wurden wiederholt. Danach wurden 400 µl der Oberphase abgenommen, mit 400 µl Chloroform/Isoamylalkohol (1:1) versetzt, für 5 min bei RT geschüttelt und 5 min bei 12000 rpm zentrifugiert. Die gesamte wässrige Oberphase wurde danach in ein neues Reaktionsgefäß gegeben und für 10 min bei 65 °C inkubiert. Im Anschluss wurde für 30 min bei RT inkubiert. Zur RNA-Fällung wurden zuerst 40 µl 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und danach 1 ml 96%iger Ethanol zugefügt. Die Fällung erfolgte ÜN bei -20 °C. Anschließend wurde zentrifugiert (4 °C, 12000 rpm, 15 min), mit 1 ml 70%igem Ethanol gewaschen und erneut zentrifugiert (4 °C, 12000 rpm, 15 min). Das erhaltene Pellet wurde 30 min an der Brennerflamme getrocknet und in 100 µl DEPC-H2O gelöst (3 Stunden auf Eis und 30 min bei RT oder ÜN auf Eis). Mit dieser Methode waren Ausbeuten von 1-3 µg RNA/µl möglich (2.7.2). Die Lagerung der isolierten RNA erfolgte bei -20 °C. 2.7.2 Photometrische Bestimmung der DNAund RNA-Konzentration Die Konzentration von isolierter chromosomaler oder Plasmid-DNA sowie von RNA wurde mit dem Spektralphotometer (Pharmacia Biotech, Ultrospec 2000) in 1 ml Quarzküvetten bei entsprechender Verdünnung bestimmt. Es wurde folgende Definition zugrunde gelegt: 1 A260 = 50 µg dsDNA/ml 1 A260 = 40 µg ssRNA/ml Das Verhältnis A260/A280 gibt die Reinheit der DNA im Verhältnis zu Proteinverunreinigungen an. Von reiner DNA kann bei einem Wert von 1,8 bis 2,0 gesprochen werden. Material und Methoden 56 2.7.3 Amplifikation von DNA mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion (PCR) Die PCR ist eine Methode bei der bestimmte Bereiche einer Template DNA vervielfältigt werden können. Dazu werden spezifische Primer (Oligonukleotide), Desoxynukleosidtriphosphate, thermostabile Polymerasen sowie die Template DNA benötigt. Die Kettenreaktion beginnt mit der Erhöhung der Temperatur, so dass es zum Aufschmelzen der DNA kommt. Im Anschluss wird die Temperatur bis einige Grad Celsius (ca. 10 °C) unterhalb der Schmelztemperatur der Primer abgesenkt (Annealingtemperatur), so dass die Primer an das Template hybridisieren können. Danach wird die Temperatur wieder erhöht und zwar bis zu der Temperatur, bei welcher die verwendete Polymerase ihre höchste Aktivität besitzt, um einen neuen DNA-Strang zu synthetisieren. Wird dieser Zyklus mehrfach wiederholt, kommt es zu einem exponentiellen Anstieg der Menge des gewünschten DNAFragments. Die PCR-Reaktionen für diese Arbeit wurden mit dem Thermal Cycler der Firma Bio-Rad (MyCycler™) durchgeführt. 2.7.3.1 Standard-PCR Bei der für diese Arbeit durchgeführten Standard-PCR wurde die Taq-Polymerase (5 U/µl) verwendet. Wurden die amplifizierten Fragmente für eine Klonierung benötigt, wurde mit der Pfu-Polymerase (2,5 U/µl) gearbeitet, da diese im Gegensatz zur Taq-Polymerase eine proof reading-Funktion besitzt. Die benutzten Primer (2.1, Tabelle 3) besitzen meist zusätzlich zu den komplementären Sequenzen zu der Template-DNA noch Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme. Auf diese Art wurden in das zu amplifizierende DNA-Fragment noch Schnittstellen für Restriktionsenzyme eingeführt. Außerdem befinden sich jenseits der Schnittstellen in der Sequenz der Primer meist noch so genannte GC-Klammern. Dieses sind sechs Basen lange Sequenzen, so dass das DNA-Fragment jenseits der Schnittstelle verlängert wird, was die spätere Bindung der Restriktionsenzyme erleichtert. Material und Methoden 57 Reaktionsansatz (100 µl) für die Standard-PCR: ad 100 µl bidest. H2O 4 x 2 µl 10 mM dNTPs 10 µl 10x Thermo Pol Puffer (mit MgCl2) 5 µl Template DNA (30-100 ng) 1 µl Forward-Primer (100 pmol) 1 µl Reversed-Primer (100 pmol) 1 µl Taq-Polymerase bzw. 2 µl Pfu-Polymerase Reaktionsbedingungen der Standard-PCR: 8’ bei 95 °C 30 Zyklen: 1’ bei 95 °C 1’ bei Annealingtemperatur 1’-4’ bei 72 °C 10’ bei 72 °C Endtemperatur 18 °C Ein Aliquot (5 µl) des PCR-Produktes wurde zur Kontrolle auf Nebenprodukte und zur Ausbeuteabschätzung auf ein Agarosegel (2.7.6) aufgetragen. Falls erforderlich wurde nach der PCR die DNA mit den entsprechenden Enzymen verdaut (2.7.4.1) und gereinigt (2.7.5). Die amplifizierte DNA wurde bei -20 °C gelagert. 2.7.3.2 Kolonie-PCR Alternativ zur Mini-Plasmid-Präparation (2.7.1.2.1) konnte auch eine Kolonie-PCR durchgeführt werden. In diesem Fall wurde die Plasmid-DNA nicht direkt in den PCR-Ansatz gegeben, sondern es wurden mit sterilen Zahnstochern Zellen von Einzelkolonien auf Agarplatten direkt zum PCR-Ansatz gegeben. Durch die hohen Temperaturen bei der PCR wurden die Zellen lysiert und die DNA lag folglich als Template vor. Diese Methode brachte eine erhebliche Zeitersparnis. Die geringe Reinheit der gewonnenen Amplifikate reichte dabei aus, um Aussagen zu treffen, ob es sich bei dem jeweiligen Plasmid um das gewünschte Produkt handelte. Für die Durchführung wurden folgende Bedingungen gewählt: Material und Methoden 58 Mastermix-Ansatz für 48 Klone: 812 µl bidest. H2O 4 x 21 µl 10 mM dNTPs 104 µl 10x Puffer (mit MgCl2) 10 µl Forward-Primer (100 pmol) 10 µl Reversed-Primer (100 pmol) 20 µl Taq-Polymerase Für eine Kolonie/ein Klon wurden 20 µl Mastermix verwendet. PCR-Programm: 8’ bei 95 °C 30 Zyklen: 1’ bei 95 °C 1’ bei Annealingtemperatur 1’-4’ bei 72 °C 10’ bei 72 °C Endtemperatur 18 °C Eine sich anschließende Agarose-Gelelektrophorese (2.7.6) diente der Analyse der PCRProdukte und dem Screening nach positiven Klonen. 2.7.4 Enzymatische Modifikation von Nukleinsäuren 2.7.4.1 Enzymatische Hydrolyse von Nukleinsäuren Für die spezifische enzymatische Hydrolyse der DNA wurden Restriktionsendonukleasen des Typs II verwendet (Arber 1978; Arber 1993). Diese zeichnen sich dadurch aus, dass sie spezifische Nukleotidsequenzen (kurze palindromische Sequenzen [4-8 bp] (Pingoud 2004)) erkennen und innerhalb oder in unmittelbarer Nähe dieser Sequenzen die DNA spalten können. Die Restriktionsenzyme wurden dem Hydrolyseansatz im Überschuss zugegeben. Außerdem wurden Restriktionspuffer benötigt. Je nach verwendetem Enzym wurden allgemeine Puffer oder enzymspezifische Puffer verwendet. Aus diesem Grund wurde die Hydrolyse von DNA mit mehreren Enzymen mitunter nicht gleichzeitig durchgeführt. In diesem Fall wurde die Material und Methoden 59 DNA schrittweise mit jedem Enzym einzeln verdaut und zwischen den einzelnen Reaktionen gereinigt (2.7.5). Für das Verdauen großer Mengen an DNA (präparativer Verdau) wurden zum Hydrolyseansatz 10-15 µg dieser DNA zugegeben. Diente die Hydrolyse nur der Überprüfung der gewonnenen DNA (Testverdau), reichte eine DNA-Menge von 200-500 ng aus. Die Hydrolyseansätze wurden für einen Testverdau ca. 2 Stunden, für einen präparativen Verdau ca. 4 Stunden beim Temperaturoptimum des jeweiligen Enzyms, meist 37 °C, inkubiert. Nach erfolgter Hydrolyse wurde das Enzym durch starke Temperaturerhöhung (laut Herstellerangabe) inaktiviert. Präparative Verdaus wurden nach dem Reaktionsende gereinigt (2.7.5). Im Anschluss wurden die erhaltenen DNA-Fragmente mittels AgaroseGelelektrophorese aufgetrennt und identifiziert (2.7.6). Sollten die Hydrolyseansätze aufbewahrt werden, wurden sie bei -20 °C gelagert. Hydrolyseansätze für Testverdau präparativer Verdau 1,5 µl 10x Puffer 10 µl 10x Puffer 0,5 µl Restriktionsenzym 4 µl Restriktionsenzym 200-500 ng DNA 10-15 µg DNA bidest. H2O ad 15 µl bidest. H2O ad 100 µl 2.7.4.2 Ligation von Nukleinsäuren Zur Verknüpfung von DNA mit kompatiblen Schnittstellen wurde diese enzymatisch ligiert. Dazu wurde die T4-DNA-Ligase (Fermentas) verwendet. Dabei verknüpft das Enzym unter Verbrauch von ATP das freie 3’-Hydroxylund 5’-Phosphat-Ende der DNA-Fragmente zu einer Phosphodiesterbindung. Für die Ligation wurde folgender Ansatz pipettiert: 1 µl 10x Ligationspuffer mit ATP 1 µl T4-DNA-Ligase DNA-Fragmente im Verhältnis Vektor:Insert = 1:1 bis 1:5 HPLC-H2O ad 10 µl Material und Methoden 60 Die Abschätzung der Menge an Insert und Vektor erfolgte mittels einer AgaroseGelelektrophorese (2.7.6), bei der jeweils die gleichen Volumina an Vektor und Insert aufgetragen wurden. Der Ligationsansatz wurde 1 Stunde bei RT inkubiert. Anschließend wurde das Enzym für 10 min bei 65 °C inaktiviert. Zur Kontrolle wurde zu jedem Ligationsansatz auch eine Ligation ohne Insert durchgeführt. Die ligierte DNA wurde im Anschluss in E. coli-Zellen transformiert (2.6.4.1.2) oder bei Bedarf bei -20 °C gelagert. 2.7.5 Reinigung von DNA-Fragmenten nach der PCR bzw. nach anderen enzymatischen Reaktionen Die Reinigung von DNA-Fragmenten erfolgte nach dem QIAquick PCR Purification Kit Protokoll (bei Benutzung einer Mikrozentrifuge) der Firma Qiagen GmbH (Cat. No. 28106). Nach dieser Methode konnten Fragmente von 100 bp bis zu 10 kb von Primern, Nukleotiden, Enzymen und Salzen gereinigt werden. Bei dieser Methode wurden alle Zentrifugationsschritte mit der Tischzentrifuge Mikro 12-24 der Firma Hettich bei 13000 rpm durchgeführt. Dabei wurde wie folgt vorgegangen: Zu 1 Teil Probe wurden 5 Teile Bindungspuffer PB gegeben, und die Probe wurde gemischt. Danach wurde der gesamte Ansatz auf eine QIAquick spin Säule, welche sich auf einem 2 ml Sammelgefäß befand, aufgetragen und für 1 min zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Die Säule wurde dann zweimal (1. 700 µl, 2. 500 µl) mit dem Puffer PE gewaschen. Nach jedem Waschschritt wurde zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Nach dem letzten Waschschritt wurde zusätzlich noch einmal 1 min zentrifugiert, um das gesamte Ethanol aus dem Puffer PE zu entfernen. Anschließend wurde die Säule in ein 1,5 ml Sarstedt-Reaktionsgefäß gesetzt und in die Mitte der Membran der Säule wurden 50 µl Elutionspuffer EB (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) gegeben. Es wurde für 1 min zentrifugiert, um alle DNA zu eluieren. Dabei wurden durchschnittlich 46 µl DNA eluiert. Material und Methoden 61 2.7.6 Agarose-Gelelektrophorese 2.7.6.1 DNA-Agarose-Gelelektrophorese Um DNA-Moleküle nach ihrer Größe aufzutrennen, wurden 0,7%ige und 2,0%ige Agarosegele aus 0,7 % bzw. 2,0 % (w/v) Agarose in 1x TBE verwendet. Die Gelelektrophorese wurde in horizontalen Flachbettapparaturen durchgeführt (Hayward & Smith 1972). Dafür wurde das Gel mit 1x TBE überschichtet und anschließend mit einem Längenstandard und den DNA-Proben, welche zuvor mit 6x Loading Dye vermischt wurden, beladen. Die Elektrophorese wurde bei RT mit einer Spannung von 120 V durchgeführt. Die DNA ist aufgrund des Pentose-Phosphat-Rückgrades negativ geladen und wandert daher während der Elektrophorese zum Pluspol (Anode). Um die einzelnen DNA-Fragmente sichtbar zu machen, wurde das Gel nach der Elektrophorese in Ethidiumbromid-Lösung für ca. 10 min gefärbt und danach für ca. 10 min in bidest. H2O entfärbt. Dabei interkaliert EtBr zwischen die Basenpaare der DNA. Auf einer UV-Durchlichtbank konnten so die DNA-Moleküle sichtbar gemacht und fotografiert werden. Das Anregungsmaximum von DNA-gebundenem EtBr liegt bei 366 nm, das Emissionsmaximum liegt bei 605 nm (Carl Roth GmbH & Co. KG). Zur Abschätzung der Größe von DNA-Molekülen sowie der DNAMenge wurden verschiedene Längenstandards (Tabelle 8) herangezogen. 2.7.6.2 RNA-Agarose-Gelelektrophorese RNA-Moleküle wurden ähnlich wie DNA-Moleküle durch eine Gelelektrophorese in horizontalen Flachbettapparaturen nach ihrer Größe aufgetrennt. Hierfür wurden jedoch 1,2%ige denaturierende Agarosegele verwendet. Dazu wurden für die Herstellung von einem Gel 0,6 g Agarose in 37 ml DEPC-H2O sowie 5 ml 10x MOPS durch Aufkochen im Mikrowellenherd gelöst und danach für 30 min bei 65 °C inkubiert. Im Anschluss wurden 4,25 ml Formaldehyd zugefügt und erneut für 30 min bei 65 °C inkubiert. 40 ml dieses Ansatzes wurden zum Gießen eines Gels verwendet, welches eine Stunde zum Erstarren bei RT belassen wurde. Danach erfolgte die Elektrophorese mit vorgekühltem 1x MOPS als Laufpuffer (siehe auch 2.7.13.2). Material und Methoden 62 2.7.7 Isolierung von Nukleinsäuren aus Agarosegelen (Gelextraktion) Wurden DNA-Moleküle nach ihrer Auftrennung durch Agarose-Gelelektrophorese (2.7.6.1) weiter verwendet (z. B. nach einem präparativen Restriktionsverdau (2.7.4.1) oder einer PCR (2.7.3.1)), mussten die entsprechenden DNA-Moleküle aus dem Gel isoliert werden. Dazu wurde die jeweilige Bande des DNA-Moleküls mit einem Skalpell unter UV-Licht aus dem Agarose-Gel ausgeschnitten. Der Agarose-Block wurde im Anschluss entweder mit dem QIAEX II Gel Extraction Kit oder mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (jeweils von QIAGEN) nach den Anweisungen des Herstellers aufgearbeitet. 2.7.8 Sequenzierung Sequenzierungen von Plasmid-DNA wurden von der Firma Seqlab in Göttingen durchgeführt. Die Proben wurden folgendermaßen vorbereitet: Zu 0,6 µg Plasmid-DNA wurden 2 µl 10 pmol/µl Sequenzierprimer (Tabelle 4) zugegeben und auf ein Gesamtvolumen von 7 µl mit bidest. H2O aufgefüllt. 2.7.9 Herstellung einer DIG-markierten DNA-Sonde Die mit Digoxygenin markierte DNA wurde in den Hybridisierungsexperimenten (Southern Blot; 2.7.11) verwendet, um spezifisch DNA nachzuweisen. Die Markierung der Sonde erfolgte mit DIG-dUTP während einer PCR. Dafür wurde der PCR DIG Labeling Mix (Roche) benutzt. Es wurde laut Vorschrift des Herstellers verfahren. Im Anschluss wurde die DIG-markierte DNA-Sonde gereinigt (2.7.10). 2.7.10 Reinigung von DNA-/RNA-Sonden durch Präadsorption Bevor die hergestellten DIG-markierten DNA-/RNA-Sonden in den Hybridisierungsexperimenten eingesetzt werden konnten, wurden diese gereinigt. Dadurch wurden unspezifische Hintergrundsignale bei der Detektion entfernt (Sprenger et al. 1995). Für die Präadsorption wurde das Protokoll von Homuth (Homuth et al. 1997) angewandt. Material und Methoden 69 2.8.4 Aktivitätstests 2.8.4.1 Bestimmung der Proteinkonzentration mit dem Bradford Assay Für die Bestimmung der Proteinkonzentration wurde die Methode nach Bradford (Bradford 1976) verwendet. 2.8.4.2 Bestimmung der β-Galaktosidase-Aktivität Um β-Galaktosidase-Aktivitäten zu messen, wurden von der entsprechenden Kultur 50 ml LB-Medium mit einer Übernachtkultur auf eine OD578 von 0,05 angeimpft und bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Beim Übergang in die stationäre Wachstumsphase wurden 2 ml der Zellsuspension bei 12000 rpm und 4 °C für 10 min zentrifugiert und die OD578 der Kultur zum Zeitpunkt der Probenahme bestimmt. Die Bestimmung der β-Galaktosidase-Aktivität erfolgte dann wie bei Wiegert et al. beschrieben (Wiegert et al. 2001). Das Prinzip der Aktivitätsmessung beruhte auf dem Zellaufschluss durch Lysozym und dem anschließenden Umsatz des farblosen Substratanalogons ONPG zu dem gelblichen orthoNitrophenol durch die β-Galaktosidase. Dieser Umsatz wurde photometrisch bei 405 nm und 28 °C im VERSAmax™ (Molecular Devices, tunable microplate reader) verfolgt. Dabei wurde eine Einheit der β-Galaktosidase-Aktivität definiert als E405 * min-1 * OD578-1 * 10-3 (Wiegert et al. 2001). E405 bezeichnet die Änderung der Extinktion bei 405 nm. Die OD578 ist die optische Dichte der Kultur zum Zeitpunkt der Probenahme. Die β-Galaktosidase-Aktivität wurde auch grob direkt auf der Agar-Platte bestimmt. Dazu wurde das LB-Medium mit dem Substratanalogon X-Gal versetzt und die Bakterienkultur ÜN auf dieser Platte inkubiert. Durch Auftreten von blauen Kolonien wurde die β-GalaktosidaseAktivität nachgewiesen. Die Methode beruhte auf der Umsetzung des farblosen X-Gal zu dem blauen 5-Brom-4-chlor-indigo durch die β-Galaktosidase. Material und Methoden 70 2.9 Konstruktion von Plasmiden Die DNA-Fragmente, die in ein Plasmid kloniert werden sollten, wurden zunächst mittels PCR (Kapitel 2.7.3; die verwendeten Oligonukleotide sind in Tabelle 3 aufgeführt) amplifiziert, durch Agarose-Gelelektrophorese (Kapitel 2.7.6.1) überprüft und anschließend aufgereinigt (Kapitel 2.7.5). Es folgte ein präparativer Verdau mit den entsprechenden Restriktionsenzymen (Kapitel 2.7.4.1) und eine erneute Aufreinigung sowie gegebenenfalls eine präparative Agarose-Gelelektrophorese. Das Plasmid, in welches das DNA-Fragment kloniert werden sollte, wurde durch eine MidiPräparation aus E. coli isoliert (Kapitel 2.7.1.2.2) und durch geeignete Restriktionsenzyme mit anschließender Agarose-Gelelektrophorese auf seine Richtigkeit überprüft. Danach erfolgte auch für das Plasmid ein präparativer Verdau mit den entsprechenden Restriktionsenzymen sowie eine Aufreinigung. Anschließend wurden der geschnittene Vektor und das Insert, wie unter Kapitel 2.7.4.2 beschrieben, ligiert und in E. coli transformiert (Kapitel 2.6.4.1). Zur Selektion konnten die erhaltenen Transformanten zusätzlich auf LB-Selektiv-Platten überpickt werden. Um die konstruierten Plasmide auf ihre Richtigkeit zu kontrollieren, folgte von einigen Transformanten entweder eine Mini-Plasmid-Präparation (Kapitel 2.7.1.2.1) mit anschließendem Restriktionsverdau oder alternativ eine Kolonie-PCR und jeweils eine Agarose-Gelelektrophorese. Von ein bis zwei Klonen mit richtigem Plasmid wurde dieses im Midi-Maßstab isoliert. Um zu gewährleisten, dass ein richtig konstruiertes Plasmid isoliert wurde, verdaute man dieses noch einmal mit mehreren verschiedenen Restriktionsenzymen mit anschließender Agarose-Gelelektrophorese. Die konstruierten Plasmide konnten zusätzlich durch eine Sequenzierung (Kapitel 2.7.8) überprüft werden. In folgender Tabelle 10 sind die in dieser Arbeit konstruierten Plasmide zusammengefasst. Material und Methoden 71 Tabelle 10: Konstruktion der Plasmide Die in dieser Arbeit konstruierten Plasmide sind in folgender Tabelle zusammengefasst. Es sind auch die verwendeten Ausgangsplasmide und die Enzyme, mit denen diese verdaut wurden, angegeben. Außerdem sind die für die Konstruktion des Inserts nötigen Primer sowie die Restriktionsenzyme, mit denen das PCR-Produkt geschnitten wurde, aufgelistet. Nachdem Insert und Vektor präparativ verdaut wurden, folgten eine Ligation und die Transformation in E. coli. Die Zellen wurden auf Selektionsmedium ausplattiert. Es wurde auch jeweils eine Negativkontrolle, bei welcher nur der geschnittene Vektor ohne Insert zur Ligation benutzt und danach transformiert wurde, durchgeführt. konstruiertes Plasmid Ausgangsplasmid Restriktionsenzyme für Hydrolyse des Ausgangsplasmids Primer für PCRAmplifikation des Inserts Restriktionsenzyme für Hydrolyse des Inserts pHTgfp-rsiX pHTgfp BamHI / SmaI rsiX5´ FLAG / rsiX 3’ SmaI BamHI / SmaI pBRgfp-bleo-rsiX pBRgfp-bleo BglII / PaeI rsiX5´ FLAG / rsiX3´ FLAG BamHI / PaeI pBRsigXrsiX::spec pBR322rsiX::spec EcoRI / Eco81I sigX5K-EcoRI / sigX3K-Eco81I EcoRI / Eco81I pALFsigX-rsiX pAL-FLAGrsiW BamHI / PaeI sigX5’ -BamHI / sigX3’ -PaeI BamHI / PaeI pALFsigX_stoprsiX pAL-FLAGrsiW BamHI / PaeI sigX5’ -BamHI - Stop / sigX3’ - PaeI BamHI / PaeI pBRgfp-rsiX pBRgfp_amyE BglII / PaeI rsiX 5’ BglII / rsiX3´ FLAG BglII / PaeI pBRgfp-rsiX 71368 pBRgfp_amyE BglII / PaeI rsiX 5’ BglII / rsiX70_3 BglII / PaeI pBRgfp-rsiX 146368 pBRgfp_amyE BglII / PaeI rsiX 5’ BglII / rsiX 145 BglII / PaeI pBRgfp-rsiX 1-21 pBRgfp_amyE BglII / PaeI rsiX-C1 / rsiX3´ FLAG BglII / PaeI pBRgfp-rsiX 1-43 pBRgfp_amyE BglII / PaeI rsiX-C2 / rsiX3´ FLAG BglII / PaeI pBRgfp-rsiX 1-70 pBRgfp_amyE BglII / PaeI rsiX 5’ ∆70 BglII / rsiX3´ FLAG BglII / PaeI pBRgfp-rsiX 1-99 pBRgfp_amyE BglII / PaeI rsiX 5’ ∆99 BglII / rsiX3´ FLAG BglII / PaeI pBRgfp_Stop-rsiX pBRgfp_amyE BglII / PaeI rsiX 5’ BglII Stop / rsiX3´ FLAG BglII / PaeI Material und Methoden 72 2.10 Konstruktion von B. subtilis Stämmen Die konstruierten B. subtilis Stämme wurden durch Transformation von Plasmidoder chromosomaler DNA in kompetente Zellen, wie unter Kapitel 2.6.4.2 beschrieben, erhalten. Die Stämme wurden im Anschluss durch Überpicken von Transformanten auf Platten mit Selektivmedium überprüft. Des Weiteren wurde auch eine geeignete PCR (Kapitel 2.7.3) als Prüfung der Richtigkeit durchgeführt. Wurden Knockout-Stämme konstruiert, ist zudem eine Southern Blot Analyse (Kapitel 2.7.11) durchgeführt wurden. Von allen konstruierten Stämmen wurden Glycerin-Dauerkulturen angelegt. In Tabelle 11 sind die in dieser Arbeit konstruierten B. subtilis Stämme mit dem jeweiligen Ursprungsstamm sowie der transformierten DNA zusammengefasst. Tabelle 11: Konstruktion von B. subtilis Stämmen Angegeben sind jeweils der Name des konstruierten Stammes, der Ausgangsstamm sowie die in ihn transformierte Plasmid-DNA bzw. die transformierte chromosomale DNA. konstruierter B. subtilis Stamm B. subtilis Ausgangsstamm transformierte Plasmidbzw. chromosomale DNA KS82 1012 pHTgfp-rsiX KS83 KS82 rasP::tet KS94 KS82 prsW::bleo KS115 1012-gfp pBRgfp-bleo-rsiX KS119 KS115 pIC333 KS123 KS115 KS119 KS123a KS4 KS119 KS149 1012 lacA::spec pALFsigX-rsiX KS155 KS149 rho::bleo 1012 sigXrsiX::spec 1012 pBRsigXrsiX::spec KS162 KS149 sigXrsiX::spec KS166 KS155 sigXrsiX::spec KS148 1012 lacA::spec pALFsigX_stop-rsiX KS154 KS148 rho::bleo KS161 KS148 sigXrsiX::spec KS165 KS154 sigXrsiX::spec 1012 rasP rho 1012 rho::bleo rasP::tet 1012-gfp rho 1012-gfp rho::bleo Material und Methoden 73 konstruierter B. subtilis Stamm B. subtilis Ausgangsstamm transformierte Plasmidbzw. chromosomale DNA 1012-gfp rasP 1012-gfp rasP::tet 1012-gfp rasP rho 1012-gfp rho rasP::tet KS187 1012-gfp pBRgfp-rsiX KS188 KS187 rasP::tet KS189 KS187 rho::bleo KS190 KS187 rho::bleo rasP::tet KS191 1012-gfp pBRgfp-rsiX 71-368 KS192 KS191 rasP::tet KS193 KS191 rho::bleo KS194 KS191 rho::bleo rasP::tet KS195 1012-gfp pBRgfp-rsiX 146-368 KS196 KS195 rasP::tet KS197 KS195 rho::bleo KS198 KS195 rho::bleo rasP::tet KS201 1012-gfp pBRgfp-rsiX 1-21 KS203 KS201 rho::bleo KS231 KS201 rasP::tet KS232 KS201 rho::bleo rasP::tet KS202 1012-gfp pBRgfp-rsiX 1-43 KS204 KS202 rho::bleo KS233 KS202 rasP::tet KS234 KS202 rho::bleo rasP::tet KS207 1012-gfp pBRgfp-rsiX 1-70 KS209 KS207 rho::bleo KS227 KS207 rho::bleo rasP::tet KS228 KS207 rasP::tet KS208 1012-gfp pBRgfp-rsiX 1-99 KS210 KS208 rho::bleo KS229 KS208 rho::bleo rasP::tet KS230 KS208 rasP::tet KS235 1012 gfp-RBS_rsiX rho::bleo rasP::tet KS236 1012 gfp-RBSmut_rsiX rho::bleo rasP::tet KS157 1012-gfp pBRgfp_Stop-rsiX KS172 KS157 rho::bleo KS173 KS157 rasP::tet KS174 KS157 rho::bleo rasP::tet KS242 KS245 rasP::tet Material und Methoden 74 konstruierter B. subtilis Stamm B. subtilis Ausgangsstamm transformierte Plasmidbzw. chromosomale DNA KS249 KS245 clpX::cat KS253 KS245 prsW::bleo KS257 KS245 WB800 KS243 KS246 rasP::tet KS250 KS246 clpX::cat KS254 KS246 prsW::bleo KS258 KS246 WB800 KS267 3610 rho::bleo amyE::Physpank-lytF Ergebnisse 75 3 Ergebnisse 3.1 Das sigX-rsiX-Operon Das Gen des ECF-Sigmafaktors X, sigX, befindet sich zusammen mit dem Gen des entsprechenden Anti-Sigmafaktors RsiX, rsiX, in einem bicistronischen Operon (Huang et al. 1997; Brutsche & Braun 1997). Dabei kommt es zur Überlappung des 3´-Endes von sigX mit dem 5´-Ende von rsiX. Dieser Bereich hat eine Größe von 62 bp. Abbildung 3 zeigt schematisch die Situation im B. subtilis Chromosom. 3.2 RsiX fungiert als negativer Regulator von SigX In vorrangegangenen Experimenten konnte gezeigt werden, dass RsiX als negativer Regulator von X fungiert (Brutsche & Braun 1997). Um dies durch Messungen der -GalaktosidaseAktivität darzustellen, wurden geeignete Reporterstämme benötigt. Es wurde das gleiche Reportersystem verwendet, welches bereits während einer Diplomarbeit (Schäfer 2007) zur Anwendung kam. Dieses System beinhaltet eine dltA-lacZ-Fusion (Abbildung 4, oben). Der ECF-Sigmafaktor X kontrolliert die Transkription des dlt-Operons (Cao & Helmann 2004), daher erfolgt auch die Expression des lacZ-Gens, welches für die -Galaktosidase kodiert, sobald die Transkription durch X initiiert wird. Daneben ist eine Deletion des Anti-Sigmafaktor kodierenden Gens rsiX erforderlich (Abbildung 4, Mitte), so dass man unterschiedliche -Galaktosidase-Aktivitäten, in Abhängigkeit des Vorhandenseins der Deletion von rsiX, erwarten kann. Weiter war es nötig, eine regulierte Expression von rsiX zu ermöglichen. Dazu wurde eine Transkriptionsfusion aus dem IPTG-regulierbaren Promotor Pspac und rsiX Abbildung 3: Schematische Darstellung des sigX-rsiX-Operons aus B. subtilis. Es handelt sich hierbei um ein bicistronisches Operon, in dem beide Gene von zwei möglichen Promotoren aus exprimiert werden können ( PsigA, PsigX). Am Ende des Operons befindet sich ein intrinsischer Transkriptionsterminator ( ). Nach: http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/ und Helmann (2002). Ergebnisse 76 konstruiert (Abbildung 4, unten), so dass eine gezielte Expression von rsiX realisierbar sein sollte. Mit diesem Reportersystem wurden nun Messungen der -Galaktosidase-Aktivitäten vorgenommen. Zuerst wurden dabei die Stämme KS4 (rsiX wt; vgl. Abbildung 5, Mitte) und KS18 (rsiX; vgl. Abbildung 5, unten) betrachtet. Aufgrund der Deletion von rsiX wurde erwartet, dass die -Galaktosidase-Aktivität für den Stamm KS18 (rsiX) deutlich höher ausfällt. Das Ergebnis der Messungen ist in Abbildung 5 aufgezeigt. Wie zu erwarten, wurde für den wildtypischen Hintergrund eine sehr geringe -Galaktosidase-Aktivität ermittelt. Im Gegensatz dazu steht das etwa 10fach höhere Messergebnis für den Stamm mit dem Knockout von rsiX, welches so erwartet wurde. Aufgrund der rsiX-Deletion liegt der Sigmafaktor X in freier ungebundener Form vor und kann die Transkription der dltA-lacZ-Fusion einleiten. Dieses resultiert in einer hohen -Galaktosidase-Aktivität. Es konnte mit diesem Reportersystem das Ergebnis von Brutsche und Braun (Brutsche & Braun 1997) bestätigt werden. RsiX tritt als Anti-Sigmafaktor von X auf. Abbildung 4: Schematische Darstellung der relevanten chromosomalen Situation im verwendeten Reportersystem zum Nachweis, dass RsiX als negativer Regulator von X auftritt. Im amyE-Locus befindet sich die Transkriptionsfusion aus dem X-kontrollierten dltA-Promotor und lacZ (oben). rsiX ist durch eine specKassette deletiert (Mitte). Im lacA-Locus befindet sich das Gen rsiX, welches unter der Kontrolle des IPTGregulierbaren Promotors Pspac steht (unten). Ergebnisse 77 In den folgenden -Galaktosidase-Aktivitätsmessungen wurde der Einfluss der IPTGregulierbaren Transkriptionsfusion von rsiX (vgl. Abbildung 4, unten) in dem beschriebenen Reportersystem näher betrachtet. Durch Zugabe von IPTG sollte der Knockout von rsiX komplementiert werden. Es wurde erwartet, dass nach IPTG-Zugabe die -GalaktosidaseAktivität im Gegensatz zur Kultur ohne IPTG ähnlich niedrig ausfällt wie im wildtypischen Hintergrund. Entsprechend sollte die Enzymaktivität der Kultur ohne IPTG analog wie für die rsiX-Deletion relativ hoch ausfallen. Für die Aktivitätsmessungen wurden die Stämme KS11 (rsiX 71-368) und KS12 (Volllängen rsiX) betrachtet. Bei dem Stamm KS11 handelt es sich um ein artifizielles Konstrukt, bei dem der Teil des rsiX-Genes deletiert wurde, welcher für die extracytoplasmatische Region kodiert. Es werden nur die Aminosäuren 1 bis 70 exprimiert. Es konnte bereits gezeigt werden, dass die Freisetzung des Sigmafaktors W durch proteolytischen Abbau des Anti-Sigmafaktors RsiW erfolgt (Heinrich et al. 2009). Dabei entsteht eine intermediäre Form des Anti-Sigmafaktors, bei welcher RsiW keine 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 1 2 -Galaktosidase-Aktivität Abbildung 5: Ergebnis des -Galaktosidase-Aktivitätstests für die Stämme B. subtilis KS4 (rsiX wt) und KS18 (rsiX). Die Probenahme für die Messung der Aktivitäten erfolgte beim Übergang in die stationäre Wachstumsphase. Die Aktivitäten beziehen sich jeweils auf 1 OD578 zum Zeitpunkt der Probenahme. Die Bestimmung der β-Galaktosidase-Aktivität erfolgte wie bei Wiegert et al. (2001) beschrieben. Die Fehlerbalken geben die berechneten Werte der Standardabweichung an (oben). Schematische Darstellung der relevanten chromosomalen Situation in den Stämmen B. subtilis KS4 (Mitte) und B. subtilis KS18 (unten). KS18 (rsiX) KS4 (rsiX wt) Ergebnisse 78 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 1 2 3 4 IPTG 49,618 64,541 51,869 65,800 -Galaktosidase-Aktivität extracytoplasmatische Domäne mehr besitzt. Die hier verwendete verkürzte Form des rsiX wurde in Anlehnung an die intermediäre Form des RsiW gewählt, um mögliche Rückschlüsse auf einen ähnlichen proteolytischen Abbau von RsiX zu ziehen. Das Ergebnis für die Messungen dieser -Galaktosidase-Aktivitäten ist in Abbildung 6 dargestellt. Wie bereits oben erwähnt, wurden unterschiedliche Aktivitäten in Abhängigkeit des Vorhandenseins von IPTG erwartet. Aber wie in Abbildung 6 zu erkennen, gibt es nur geringe Unterschiede bei den Aktivitätsmessungen nach Inkubation mit bzw. ohne IPTG. Ferner sind keine Unterschiede zwischen dem Volllängen rsiX und seiner verkürzten Form feststellbar. Alle Messwerte liegen etwa in der Größenordnung für die Deletion von rsiX (vgl. Abbildung 5). Der rsiX-Knockout ist in diesen Reporterstämmen also nicht vollständig Abbildung 6: Ergebnis des -Galaktosidase-Aktivitätstests für die Stämme B. subtilis KS11 (rsiX 71-368) und B. subtilis KS12 (Volllängen rsiX) nach Inkubation bei 37 °C mit (+ IPTG; Endkonzentration: 1 mM) bzw. ohne IPTG (- IPTG). Die Probenahme für die Messung der Aktivitäten erfolgte beim Übergang in die stationäre Wachstumsphase. Die Aktivitäten beziehen sich jeweils auf 1 OD578 zum Zeitpunkt der Probenahme. Die Bestimmung der β-Galaktosidase-Aktivität erfolgte wie bei Wiegert et al. (2001) beschrieben. Die Fehlerbalken geben die berechneten Werte der Standardabweichung an (oben). Schematische Darstellung der relevanten chromosomalen Situation in den Stämmen B. subtilis KS11 (unten links) und B. subtilis KS12 (unten rechts). KS11 (rsiX 71-368) KS12 (rsiX) + - + - Ergebnisse 85 Alle Klone, die eine starke Fluoreszenz aufwiesen, wurden im Anschluss auf die Resistenz gegenüber bestimmter Antibiotika getestet. Jene Klone sollten sensitiv gegenüber Erythromycin sein. Eine Resistenz gegenüber diesem Antibiotikum würde die Integration des gesamten Plasmides ins Chromosom bedeuten (vgl. Abbildung 10; die ErythromycinResistenz wird außerhalb des Transposons im Plasmid pIC333 kodiert). Dies war nicht erwünscht. Auf der anderen Seite müssen all diese Klone resistent gegenüber Bleomycin (aufgrund der Selektion auf Vorhandensein der Reporterfusion, vgl. Abbildung 9), Spectinomycin (da das Transposon diese Resistenz kodiert, vgl. Abbildung 10) und auch Chloramphenicol (weil der verwendete Reporterstamm dies kodiert, vgl. Abbildung 9) sein. Nur von Klonen, welche Ems, Bleor, Specr, Cmr waren und zudem noch eine starke Fluoreszenz zeigten, wurde die chromosomale DNA für weitere Analysen isoliert. Dieser Phänotyp konnte bei insgesamt 11 Klonen nachgewiesen werden (mit KS119 Klon 9, 13, 14, 18, 19, 22, 24, 25, 29, 39 bzw. 43 bezeichnet). 3.4.3 Retransformation der chromosomalen DNA von scheinbar positiven Klonen nach der Transposonmutagenese Die isolierte chromosomale DNA von Klonen, welche Ems, Bleor, Specr, Cmr waren und eine starke Fluoreszenz zeigten, wurde im Anschluss in je zwei verschiedene Reporterstämme transformiert. Auf diese Art sollten falsch positive Klone identifiziert werden, um diese bereits vor den folgenden Analysen zu separieren und zu verwerfen. Zum einen war dies der Reporterstamm KS4, welcher für die Transkriptionsfusion aus dem X-kontrollierten dltA-Promotor und dem Gen lacZ kodiert (Abbildung 4, oben). Nach Retransformation der chromosomalen DNA eines Klons, bei welchem der Anti-Sigmafaktor RsiX durch die Integration des Transposons an einer beliebigen Stelle ins Chromosom stabilisiert wurde, erwartete man, dass der Reporter eine sehr geringe bis gar keine -Galaktosidase-Aktivität zeigte. Dies sollte durch weiße Kolonien auf einer LB-Platte, welcher X-Gal zugesetzt war, erkennbar sein. Wie bereits unter 3.2 erläutert, kontrolliert X die Transkription des dlt-Operons (Cao & Helmann 2004). Daher führt bei diesem Reporterstamm ein stabilisierter Anti-Sigmafaktor durch die anhaltende Inhibierung des Sigmafaktors nicht zur Expression des lacZ-Gens und somit zu keinem Umsatz des Substrates X-Gal zu einem blauen Indigofarbstoff durch die -Galaktosidase. In der Tat konnten so drei Klone identifiziert werden, welche nach Transformation ihrer chromosomalen DNA in den Ergebnisse 86 Reporter KS4 weiße Kolonien bildeten sowie Specr (durch Transposon kodiert) und Neor (kodiert von Reporterfusion) zeigten. Die verbleibenden acht Klone wurden aufgrund ihrer blauen Koloniefarbe auf X-Gal-Platten als falsch positiv identifiziert. Zum anderen erfolgte die Retransformation der isolierten chromosomalen DNA in den Ausgangsstamm für die Transposonmutagenese KS115 (Abbildung 9). Dieser Stamm wies vor der Mutagenese keine Fluoreszenz auf. Die Transformation diente dem Nachweis, dass das Transposon auch tatsächlich in einen für die Stabilität des Anti-Sigmafaktors RsiX relevanten Abschnitt des Genoms integrierte. Somit sollten die Kolonien nach der Retransformation im Gegensatz zum Ausgangsstamm KS115 eine intensive Fluoreszenz besitzen. Es wurden hier drei Klone gefunden, welche eine starke Fluoreszenz zeigten und welche eine Specr (durch Transposon kodiert), Cmr sowie Bleor (kodiert vom Reporterstamm KS115) vorwiesen. In Abbildung 12 ist zu erkennen, dass jene drei Klone im Unterschied zum Ausgangsstamm KS115 sowohl durch die Resistenz gegen Spectinomycin als auch durch eine ausgeprägte Fluoreszenz gekennzeichnet sind. Dabei handelte es sich um die gleichen Klone, welche auch schon nach Retransformation ihrer chromosomalen DNA in den Reporter KS4 weiße Kolonien bildeten. Von den anfänglich 11 Klonen, welche ein scheinbar positives Ergebnis nach der Transposonmutagenese zeigten, d. h. bei welchen das Transposon sehr wahrscheinlich in ein Abbildung 12: Fotografien von B. subtilis Kolonien des Stammes 1012 amyE::gfp-bleo-rsiX pIC333 (KS 123). Dargestellt sind Kolonien der Klone 9, 22 und 43 auf LBCm10-Platten (linke Grafik) bzw. LBSpec100-Platten (rechte Grafik) nach Integration des Transposons mini-Tn10 in deren Chromosom. Die starke Fluoreszenz dieser drei Klone beruht auf der Integration des Transposons in ein Gen mit Einfluss auf die zelluläre Konzentration des Anti-Sigmafaktors RsiX. Im Vergleich dazu zeigt KS 115 (Reporterstamm vor der Transposonmutagenese) keine Fluoreszenz. Die Kolonien wurden unter normalem weißem Licht (oberer Teil der Grafiken) und bei Anregung der GFP-Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von 480 nm (unterer Teil der Grafiken) fotografiert. Es wurden gleiche Auflösungen und Vergrößerungen verwendet. Ergebnisse 87 Gen integrierte, das für einen destabilisierenden Faktor hinsichtlich des Anti-Sigmafaktors RsiX kodiert, wurden acht Klone als falsch positiv aufgrund der Ergebnisse der Retransformationen ausgeschlossen. Sehr wahrscheinlich wurde die Fluoreszenzintensität bei verschieden großen Kolonien als ähnlich intensiv eingeschätzt, was dann zu einem falsch positiven Ergebnis führte. Lediglich für drei Klone zeigten die Ergebnisse eindeutige Hinweise, dass es zur Stabilisierung von RsiX kam, da mögliche destabilisierende Faktoren durch das Transposon deletiert wurden. Die entsprechenden drei Stämme wurden mit KS123 Klon 9, 22 bzw. 43 (B. subtilis 1012 amyE::gfp-bleo-rsiX mini-Tn10) bezeichnet. Die isolierte chromosomale DNA dieser drei Klone wurde im Weiteren verwendet, um einen Plasmid-rescue durchzuführen. Dieser Schritt wird im folgenden (3.4.4) erörtert. 3.4.4 Plasmid-rescue Die chromosomale DNA der drei Klone 9, 22 und 43 des Stammes KS123 (B. subtilis 1012 amyE::gfp-bleo-rsiX mini-Tn10) wurde in nachfolgenden Schritten verwendet, um die Genregion zu identifizieren, in welche das Transposon mini-Tn10 integriert hat. Dazu erfolgte ein präparativer Restriktionsverdau dieser DNA mit HindIII, da für dieses Enzym innerhalb der Sequenz des Transposons keine Schnittstelle vorliegt (Abbildung 10). Somit wurden durch den Verdau Fragmente erhalten, welche zum einen das Transposon enthielten und zum anderen auch Teilsequenzen (bis zu einer HindIII-Schnittstelle) des stromaufwärts und stromabwärts liegenden Genes, in welches das Transposon integrierte. Im Anschluss erfolgte eine Ligation der erhaltenen Fragmente der chromosomalen DNA, welche infolge der kompatiblen Enden der DNA nach dem HindIII-Verdau zu zirkulärer (Plasmid-) DNA führte. Durch die anschließende Transformation mittels Elektroporation in E. coli DH10B-Zellen und der Selektion bei 37 °C für 48 Stunden auf LBSpec100-Platten, konnten nur diejenigen Zellen wachsen, welche die Plasmid-DNA mit dem Transposon, welches für die Spectinomycin-Resistenz kodiert sowie den ori pUC für die Replikation in E. coli besitzt (Abbildung 10), enthielten. Für den Erhalt dieser Plasmid-DNA erfolgte nach der Transformation zunächst eine MiniPräparation. Zur Identifikation der Plasmide, welche das Transposon enthielten, wurde im Anschluss eine Restriktionsanalyse mit den Enzymen PstI und BamHI durchgeführt. Beide Enzyme haben innerhalb des Transposons Schnittstellen (Abbildung 10). Durch den BamHIVerdau sollte für jedes Plasmid ein 2,2 kb großes Fragment entstehen, welches fast Ergebnisse 88 ausschließlich das Transposon kodiert (Abbildung 10). Im Anschluss wurde von eindeutig identifizierter Mini-Plasmid-DNA mit Transposon eine Midi-Präparation durchgeführt. Die erhaltene Midi-Plasmid-DNA wurde erneut einer Restriktionsanalyse mit den Enzymen PstI und BamHI unterzogen. Die zu Beginn des Kapitels erwähnten Klone 9, 22 und 43 des Stammes KS123, von welchen der Plasmid-rescue durchgeführt wurde, zeigten dabei verschiedene Restriktionsmuster beim Verdau mit dem gleichen Enzym (Abbildung 13). Das deutet auf unterschiedliche Transpositionsereignisse hin. Von diesen Klonen wurde jeweils die Midi-Plasmid-DNA für eine erneute Retransformation sowie eine Sequenzanalyse verwendet. 3.4.5 Retransformation von Plasmid-DNA nach Plasmid-rescue Die nach dem Plasmid-rescue erhaltene Midi-Plasmid-DNA der entsprechenden Klone 9, 22 und 43 des Stammes KS123 wurde für eine erneute Retransformation in den Ausgangsstamm für die Transposonmutagenese KS115 (Abbildung 9) verwendet. Im Anschluss wurde wieder Abbildung 13: Fotografie eines EtBr-gefärbten Agarosegels zur Dokumentation der Restriktionsanalyse von Midi-Plasmid-DNA nach dem Plasmid-rescue der Klone 9, 22 und 43 des Stammes KS123 (B. subtilis 1012 amyE::gfp-bleo-rsiX mini-Tn10). Es wurde eine Restriktionsanalyse mit den Restriktionsenzymen BamHI (Spuren 1-3) und PstI (Spuren 5-7) durchgeführt. Als Längenstandard wurde der Marker Spp1 verwendet (Spuren 4 und 8). Die angegebenen Größen (links bzw. rechts neben der Fotographie) beziehen sich auf die entsprechenden Fragmente des Markers. Die Spuren 1-3 zeigen alle ein 2,2 kb großes Fragment, welches das Transposon mini-Tn10 enthält. Ergebnisse 89 die Fluoreszenz der Transformanten überprüft. Man erhielt das gleiche Ergebnis, welches man auch schon für die Retransformation von chromosomaler DNA (vgl. Kapitel 3.4.3) erhielt. Durch die Integration des Transposons in ein Gen mit Einfluss auf die Stabilität des AntiSigmafaktors RsiX konnte im Vergleich zum Reporterstamm KS115 eine intensive Fluoreszenz festgestellt werden. Das GFP-BRP-RsiX-Fusionsprotein lag in der Zelle stabil vor. Ebenso waren alle relevanten Antibiotika-Resistenzen vorhanden: eine Specr (durch das Transposon kodiert), eine Cmr sowie eine Bleor (kodiert vom Reporterstamm KS115). Durch die Retransformationen sowohl der Plasmid-DNA nach dem Plasmid-rescue als auch der chromosomalen DNA in die verschiedenen Reporterstämme und durch die Überprüfung aller relevanten Antibiotika-Resistenzen konnte das Vorliegen falsch positiver Klone nach der Transposonmutagenese ausgeschlossen werden. Es wurde davon ausgegangen, dass bei allen drei Klonen eine Integration des Transposons in Gene stattfand, welche eine Rolle bei der Destabilisierung des Anti-Sigmafaktors RsiX spielen. Daraufhin wurden genau diese drei Klone sequenziert. 3.4.6 Sequenzierung der Integrationsstelle des Transposons mini-Tn10 Zur genauen Identifizierung der Integrationsstelle des Transposons ins Chromosom des Stammes KS123 (B. subtilis 1012 amyE::gfp-bleo-rsiX mini-Tn10) erfolgte eine Sequenzierung der Midi-Plasmid-DNA der entsprechenden Klone 9, 22 und 43 (vgl. Kapitel 3.4.4). Diese wurde von der Firma Seqlab durchgeführt. Für die Sequenzierreaktion wurde der Sequenzierprimer pIC5 (Tabelle 4, Nummer 5) eingesetzt. Dieser Primer entspricht dem rechten Primer in Abbildung 10, d. h. es wurde die Genregion stromabwärts vom Transposon sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen wurden unter Zuhilfenahme von Datenbanken aus dem Internet (BSORF - Bacillus subtilis Genome Database; SubtiList - the GenoList World Wide Web Server; BLASTN-Programm des NCBI) analysiert und identifiziert. Die Auswertung der Sequenzierergebnisse zeigt für alle drei Klone ein eindeutiges Ergebnis. Das Transposon integrierte in allen drei Fällen in das Gen rho, welches für den Transkriptionsterminator Rho kodiert. Dabei fand das Transpositionsereignis für die drei Klone jeweils an verschiedenen Stellen in der Sequenz von rho statt (Abbildung 14). Ergebnisse 90 Die bereits oben beschriebenen Retransformationen von chromosomaler bzw. Plasmid-DNA der entsprechenden Klone 9, 22 und 43 zeigten eine stark erhöhte Fluoreszenz (vgl. Kapitel 3.4.3 und 3.4.5) bzw. weiße Kolonien (vgl. Kapitel 3.4.3), hervorgerufen durch das Vorhandensein des Anti-Sigmafaktors RsiX aufgrund des Funktionsverlustes von rho. In den folgenden Betrachtungen soll daher der mögliche direkte oder indirekte Einfluss von Rho auf RsiX näher geprüft werden. 3.5 Analyse des Einflusses von Rho bei der rsiX-Expression 3.5.1 Konstruktion eines rho-Deletionsstammes Zur Bestätigung der Ergebnisse der Sequenzanalyse nach der Transposonmutagenese musste als ein erster Schritt der Knockout von rho konstruiert werden. Das war möglich, weil rho in B. subtilis nicht essentiell ist (Quirk et al. 1993). Der Knockout erfolgte durch die Insertion einer Bleomycin-Resistenz-Kassette in die Sequenz von rho (Abbildung 15, rechts). Der resultierende Stamm wurde mit B. subtilis 1012 rho::bleo bezeichnet. Zur Überprüfung des Knockouts wurde eine Southern Blot Analyse durchgeführt. Dabei sollte nach der Restriktion der chromosomalen DNA von 1012 rho::bleo mit dem Abbildung 14: Vollständige Sequenz des Gens rho aus B. subtilis, welches für den Transkriptionsterminator Rho kodiert. Die roten Pfeile symbolisieren die Stellen im Chromosom, in welche das Transposon mini-Tn10 bei drei unterschiedlichen Klonen nach einer Transposonmutagenese mit dem Plasmid pIC333 integrierte. Ergebnisse 91 Restriktionsenzym EcoRV und der Hybridisierung mit einer DIG-markierten DNA-Sonde gegen rho in dem Luminogramm ein Fragment mit einer Größe von 1848 bp zu sehen sein. Als Kontrolle wurde mit der DNA des Ausgangsstammes B. subtilis 1012 genauso verfahren. Allerdings wurden für diesen Stamm Fragmente der Größen 1414 bp sowie 424 bp erwartet. Das Ergebnis der Southern Blot Analyse ist in Abbildung 15 (links) dargestellt. Man kann deutlich den Unterschied zwischen dem Ausgangsstamm und dem rho-Knockout erkennen. In beiden Fällen wurden die erwarteten Fragmentgrößen erhalten. Es kann daher von einem korrekt klonierten Knockout von rho ausgegangen werden. 3.5.2 Einfluss von rho auf die Konzentration des Anti-Sigmafaktors RsiX Der nächste Schritt in der Überprüfung des Ergebnisses der Sequenzanalyse nach der Transposonmutagenese war, die chromosomale DNA von 1012 rho::bleo in Stämme zu transformieren, welche GFP-RsiX-Fusionen exprimieren. Hierfür wurden Stämme Abbildung 15: Links: Luminogramm der Southern Blot Analyse zur Überprüfung des korrekten rho-Knockouts im Stamm B. subtilis 1012 rho::bleo (Spur 3). Als Referenz wurde der Ausgangsstamm B. subtilis 1012 verwendet (Spur 2). Die Restriktion der jeweiligen chromosomalen DNA erfolgte mit EcoRV. Für die Hybridisierung wurde eine DIG-markierte DNA-Sonde gegen rho verwendet. Als Marker wurde DIGmarkierter Spp1-Marker verwendet (Spur 1). Die Fragmentgrößen sind in bp angegeben (links neben dem Luminogramm). Rechts: Schematische Darstellung der relevanten chromosomalen Situation im Stamm B. subtilis 1012 rho::bleo. rho wurde durch eine Bleomycin-Resistenz-Kassette deletiert. Ergebnisse 92 ausgewählt, welche die GFP-RsiX-Fusionen durch den Promotor PgroE konstitutiv exprimieren sollten. Neben der Volllängenform von RsiX wurde auch wieder eine verkürzte Form von RsiX betrachtet. Diese verkürzte Form sollte nur die ersten 70 Aminosäuren, d. h. keine extracytoplasmatische Domäne, exprimieren (rsiX 71-368). Sowohl die Volllängenform als auch die verkürzte Form von RsiX als GFP-Fusion wurde neben dem Wildtyphintergrund (wt) und dem rho-Hintergrund auch für die Deletion der Site-2 Protease RasP (rasP) und für den Doppelknockout rho rasP betrachtet. Zuerst erfolgte die Überprüfung der Fluoreszenzintensitäten dieser Stämme mit dem GFPScope. Eine Fotografie der jeweiligen Kolonien ist in Abbildung 16 zu sehen. Hierbei ist erkennbar, dass man für die Volllängenform von RsiX (Spur 1) im rho-Hintergrund im Vergleich zum wt eine erhöhte Fluoreszenz feststellen kann. Wie auch schon in Abbildung 7 gezeigt, verhält sich der Stamm im rasP-Hintergrund wie im wt. Es ist keine Fluoreszenz der Kolonien sichtbar. Nur im Doppelknockout der Gene für den Transkriptionsterminator Rho und der Site-2 Protease RasP ist wieder eine Fluoreszenz nachweisbar. Die Ergebnisse für die verkürzte Form von RsiX ist in der zweiten Spur der Abbildung 16 dargestellt. Es ist zu erkennen, dass lediglich im rasP-Hintergrund sowie im Doppelknockout von rho und rasP eine Fluoreszenz vorhanden ist. Für den wt und den Knockout von rho lässt sich keine Fluoreszenz nachweisen. Abbildung 16: Fotografien von B. subtilis Kolonien, welche GFP-RsiX exprimieren. Spur 1 zeigt die Ergebnisse für die Volllängenform von RsiX (rsiX) und Spur 2 die für die verkürzte Form von RsiX ohne die extracytoplasmatische Domäne (rsiX 71-368). Die Expression der Fusionsproteine erfolgte im Wildtyphintergrund (wt), rho- (rho) und rasP- (rasP) Knockout sowie im Doppelknockout von rho und rasP (rho rasP). Durch den Promotor PgroE war eine konstitutive Expression der Fusionsproteine möglich. Dargestellt sind die Kolonien bei Anregung der GFP-Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von 480 nm. Ergebnisse 93 Danach wurden die gleichen Stämme Western Blot Analysen unterzogen. Das entsprechende Luminogramm zeigt Abbildung 17. In den Spuren 1 - 4 sollten die GFP-RsiX-Fusionen in den verschiedenen genetischen Hintergründen detektiert werden. Das Fusionsprotein hat eine erwartete Größe von 68 kDa. Das Resultat ist identisch mit Abbildung 16. Der AntiSigmafaktor RsiX ist weder im wt noch im rasP-Hintergrund detektierbar. Sowohl im rhoHintergrund als auch im Doppelknockout von rho und rasP konnte jedoch RsiX als Fusion mit GFP in der Membranfraktion mit der erwarteten Größe detektiert werden. Das Ergebnis der Western Blot Analyse für die verkürzte Form von RsiX ist in Abbildung 17 in den Spuren 5 – 6 dargestellt. Wie bereits für die Betrachtung der gleichen Stämme unter dem GFP-Scope (Abbildung 16) erläutert, kann nur im rasP-Hintergrund sowie im Doppelknockout von rho und rasP ein Signal für das Fusionsprotein mit GFP detektiert werden. Die Ladungskontrolle lieferte wie zu erwarten in allen 8 Spuren klare Signale bei 70 kDa für die Metalloprotease FtsH. Betrachtet man die Ergebnisse der Abbildung 16 und Abbildung 17 zusammen, kann eindeutig festgestellt werden, dass der Transkriptionsterminator Rho einen Einfluss auf die detektierbare Menge des Anti-Sigmafaktors RsiX hat. Sobald der Faktor Rho durch Deletion des entsprechenden Gens seine Funktion verloren hat, kann RsiX als Fusion mit GFP sowohl Abbildung 17: Luminogramm der Western Blot Analyse von B. subtilis Stämmen, welche GFP-RsiX zur Untersuchung der Konzentration des Anti-Sigmafaktors RsiX exprimieren. Die Spuren 1-4 zeigen die Ergebnisse für die Volllängenform von RsiX (rsiX) und die Spuren 5-8 die für die verkürzte Form von RsiX ohne die extracytoplasmatische Domäne (rsiX 71-368). Die Expression der Fusionsproteine erfolgte jeweils im Wildtyphintergrund (wt), rasP- (rasP) und rho- (rho) Knockout sowie im Doppelknockout von rho und rasP (rho rasP). Durch den Promotor PgroE erfolgte eine konstitutive Expression der Fusionsproteine. Die Proteine der Membranfraktionen (10 µg/Spur) wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend auf eine Nitrocellulosemembran geblottet. Der immunologische Nachweis der GFP-RsiX-Fusionen erfolgte mit Antikörpern gegen GFP. Mit der Ladungskontrolle (2 µg/Spur) wurde in gleicher Art verfahren, aber die Entwicklung des Blots erfolgte mit Antikörpern gegen die membrangebundene Protease FtsH. Die Größen der detektierten Proteine sind rechts neben dem Luminogramm aufgezeigt. Ergebnisse 94 im Immunoblot als auch anhand von starker Fluoreszenz unter dem GFP-Scope detektiert werden. Dagegen scheint die Site-2 Protease RasP ohne einen Einfluss auf die Menge von RsiX zu sein. Der Knockout von rasP führt zu keiner Detektion von RsiX. Der detektierbare Anti-Sigmafaktor im Doppelknockout von rho und rasP ist lediglich die Folge durch den Funktionsverlust von Rho. Anders verhält es sich bei der Analyse der Ergebnisse für die verkürzte Form von RsiX in Abbildung 16 und Abbildung 17. Hier scheint Rho ohne einen Einfluss auf die Konzentration des Anti-Sigmafaktors zu sein, denn weder mit dem Immunoblot noch durch die FluoreszenzAnalyse konnte der Anti-Sigmafaktor detektiert werden. Allerdings führt hier der Funktionsverlust von RasP zu einer Detektion von RsiX, sowohl im rasP-Hintergrund als auch im Doppelknockout von rho und rasP. Es muss jedoch beachtet werden, dass es sich hier um eine artifizielle Form des Anti-Sigmafaktors handelt, welche keine extracytoplasmatische Domäne exprimiert. Für den Anti-Sigmafaktor RsiW wurde bereits gezeigt, dass RasP an seiner Proteolyse beteiligt ist (Schöbel et al. 2004). Dabei ist das Substrat für RasP eine verkürzte Form von RsiW ohne die entsprechende extracytoplasmatische Domäne. Es wird daher vermutet, dass RsiX 71-368 nur aufgrund seiner strukturellen Ähnlichkeit mit der verkürzten Form von RsiW zum Substrat von RasP geworden ist. Warum Rho für die zelluläre Konzentration von RsiX 71-368 keine Rolle zu spielen scheint, kann an dieser Stelle noch nicht genau begründet werden. Sehr wahrscheinlich aber ist das im Zusammenhang mit dem Wirkmechanismus von Rho zu begründen (Morgan et al. 1985; Bear et al. 1988; Alifano et al. 1991). Möglich wäre, dass die für die Termination durch Rho notwendige rut-site in der Region von rsiX lokalisiert ist, welche die extracytoplasmatische Domäne kodiert. Da diese Region für rsiX 71-368 deletiert ist, könnte Rho aufgrund einer fehlenden rut-site die Transkription nicht terminieren. Im Kapitel 3.8 wird daher die Lage der rut-site im Gen rsiX bestimmt. 3.6 Das sigX-rsiX-Operon – reguliert durch Translationskopplung? Im Kapitel 3.1 wurde erwähnt, dass sich sigX und rsiX in einem bicistronischen Operon befinden und sich ihre Sequenzen zum Teil überlagern. Es liegen damit ähnliche Bedingungen wie für das trpEDCFBA-Operon in B. subtilis vor, in welchem sich die Sequenzen für trpE und trpD mit 29 Nukleotiden ebenfalls überlagern. Im trp-Operon erfolgt genauso wie für rsiX die Termination der Transkription durch den Faktor Rho. Außerdem konnte gezeigt Ergebnisse 101 Transkriptionstermination statt und GFP-RsiX wird exprimiert. Zusätzlich zeigt dieses Ergebnis, dass tatsächlich Rho der Angriffspunkt von BCM ist. Die Ladungskontrolle der Western Blot Experimente lieferte in allen 6 Spuren klare Signale bei 70 kDa für das cytoplasmatische Protein HtpG (Abbildung 21B). Als Ladungskontrolle für die Northern Blot Analyse in Abbildung 21C erfolgte die Hybridisierung mit einer DIGmarkierten RNA-Sonde gegen gyrA. Die Kontrolle lieferte für alle 6 Spuren klare Signale bei 2500 Basen. Damit konnte gezeigt werden, dass die Beeinflussung der rsiX-Expression direkt auf die Aktivität des Transkriptionsterminators Rho zurückzuführen ist. Es kam durch die Zugabe von BCM zu keiner Transkriptionstermination durch Rho und somit stieg die Menge an rsiXTranskript. 3.8 Kartierung der rut-site im Gen rsiX Die vorhergehenden Untersuchungen haben gezeigt, dass die Expression von rsiX durch den Transkriptionsterminator Rho negativ beeinflusst wird. Um diesen Effekt näher zu untersuchen, war es wichtig die Bindestelle von Rho im sigX-rsiX-Transkript zu kartieren. Die Rho-Bindestelle wird als rut-site (Rho utilization) bezeichnet und ist für die faktorabhängige Termination essentiell. Rho bindet dabei an diese spezifischen Sequenzen auf der mRNA und leitet so die Termination der Transkription ein. Es ist bereits bekannt, dass es sich dabei um etwa 70 bis 90 Basen lange Sequenzen mit einem relativ hohen Anteil an dem Nukleotid Cytidin handelt (Morgan et al. 1985; Bear et al. 1988; Alifano et al. 1991). Um die Region der rut-site für rsiX Schritt für Schritt einzugrenzen, wurden zahlreiche GFP-RsiX-Reporterfusionen konstruiert, bei welchen entweder N-terminal oder C-terminal Deletionen in der Aminosäuresequenz von RsiX eingeführt wurden. Diese Reporterfusionen standen alle unter der Kontrolle des Promotors PgroE, so dass eine konstitutive Expression möglich war. Die Zahlen in der Bezeichnung der GFP-RsiX-Reporterfusionen bezeichnen die Aminosäuren, welche deletiert wurden. Zusätzlich wurden die folgenden drei Reporterstämme untersucht: 1012 amyE::PgroE-gfp-RBS_rsiX (eine Ribosomenbindestelle wurde zwischen das Reportergen gfp und rsiX eingefügt), 1012 amyE::PgroE-gfp-RBSmut_rsiX (eine mutierte Ergebnisse 102 Ribosomenbindestelle wurde zwischen das Reportergen gfp und rsiX eingefügt) und 1012 amyE::PgroE-gfp_Stop-rsiX (durch ein eingefügtes Stopp-Codon nach der Sequenz des Reportergens gfp ist dieses nicht mehr translationell mit rsiX fusioniert). 3.8.1 Fluoreszenzmessungen der GFP-Reporterstämme Zuerst wurden die im Kapitel 3.8 beschriebenen Reportersysteme hinsichtlich ihrer Fluoreszenz analysiert. Neben dem Wildtyphintergrund wurde die Fluoreszenz für alle Fusionen auch im rhound im rasP-Hintergrund sowie im Doppelknockout von rho und rasP geprüft. Als Referenz für die Fluoreszenz wurde der Stamm 1012 amyE::PgroE-gfp (Zellmeier et al. 2006) verwendet, bei welchem der Reporter gfp nicht mit einem anderen Gen translationell fusioniert wurde. Das Ziel bei diesen Experimenten war es, solche Stämme zu identifizieren, welche bereits im Wildtyphintergrund eine starke Fluoreszenz zeigen. Daraus kann man auf das Vorhandensein großer Mengen des Anti-Sigmafaktors RsiX in Fusion mit GFP schließen, ohne dass das Gen des Transkriptionsterminators Rho deletiert wurde. Nur die fehlende rut-site wäre in diesem Fall für die hohe Konzentration des Fusionsproteins verantwortlich. Die Fluoreszenzintensitäten wurden, wie im Kapitel 2.6.3.1 beschrieben, mit dem LAS4000 bestimmt. Die relativen Intensitäten aller Reporterfusionen im Vergleich zum nicht fusionierten GFP (Zeile 11) sind im Diagramm in Abbildung 22 veranschaulicht. Die Fluoreszenz für den Referenzstamm in Zeile 11, welcher nur GFP exprimiert, wurde in den verschiedenen genetischen Hintergründen als 100 % festgesetzt. Dagegen wurde die Fluoreszenz für den Wildtypstamm 1012, in welchem keine gfp-rsiX-Fusion kodiert wird (Zeile 12), in den entsprechenden genetischen Hintergründen als 0 % definiert. Für alle anderen Reporterstämme (Zeilen 1 bis 10) wurden die Fluoreszenzintensitäten relativ zu GFP (Zeile 11) angegeben. In Abbildung 22 wird deutlich, dass für die meisten Stämme (Zeilen 3 bis 10) keine starke Fluoreszenz im Wildtyphintergrund und auch nicht in den anderen drei genetischen Hintergründen zu erkennen ist. Die meisten Messwerte liegen etwa im Bereich von 30 - 40 %. Die zusätzliche Ribosomenbindestelle in der Reporterfusion in Zeile 4 und auch die Einführung einer mutierten Ribosomenbindestelle in der Fusion in Zeile 3 führten zu keiner detektierbaren Menge des Anti-Sigmafaktors RsiX. Die negativen Fluoreszenzintensitäten kommen durch die Art der Berechnung der Werte zu Stande. Die Eigenfluoreszenz des Ergebnisse 103 Abbildung 22: Grafische Darstellung der relativen Fluoreszenzintensitäten verschiedener B. subtilis Stämme, welche GFP-RsiX in unterschiedlichen Varianten exprimieren, um die rut-site von rsiX zu kartieren. Die vertikale Achse gibt die relevanten chromosomalen Situationen der einzelnen Reporterstämme wieder. Auf der horizontalen Achse wurden die Fluoreszenzintensitäten in % abgebildet. Jede Zeile zeigt die Fluoreszenzintensität eines Reporters in den folgenden vier genetischen Hintergründen: Wildtyphintergrund (wt, blau), rasP-Hintergrund (rasP, rot), rho-Hintergrund (rho, grün) sowie Doppelknockout von rasP und rho (rasP / rho, violett). Die Fluoreszenzintensitäten des Wildtypoperons (Zeile 12) wurden als 0% gewertet und die Intensitäten für den Reporter, welcher nur GFP exprimiert (Zeile 11) wurde als 100% angenommen und für die Berechnung der relativen Fluoreszenzintensitäten aller anderen Stämme herangezogen. Die Fehlerbalken geben die berechneten Werte der Standardabweichung an. Ergebnisse 104 Wildtypstammes 1012 (Zeile 12) wurde vor der Berechnung der relativen Fluoreszenz von den Messwerten abgezogen. Das zusätzliche Stopp-Codon der Fusion in Zeile 5 macht lediglich deutlich, dass Rho sogar die Expression eines Gens beeinflusst, welches stromaufwärts von dem Gen mit einer rut-site liegt. In diesem Fall liegt keine translationelle Fusion vor und gfp sollte unabhängig von rsiX translatiert werden, was eine starke Fluoreszenz zur Folge hätte. Jedoch lässt nur die Deletion von rho bzw. von rho und rasP die Fluoreszenz dieses Reporters auf etwa den doppelten Wert ansteigen. Die N-terminale Deletion von 43 Aminosäuren (Zeile 6) sowie die C-terminalen Deletionen von 223 (Zeile 8) bzw. 298 Aminosäuren (Zeile 9) zeigen sogar, dass Rho hier offenbar keinen Einfluss hat. Beim Vergleich der wildtypischen Fluoreszenz mit der für den Knockout von rho ist die Fluoreszenz im Knockout sogar deutlich geringer. Die GFP-Fusion mit der Volllängenform von RsiX (Zeile 10) und die Fusion mit einer N-terminal verkürzten Form um 21 Aminosäuren (Zeile 7) zeigen ein ähnliches Ergebnis. Es ist im Wildtyphintergrund eine sehr geringe Fluoreszenz zu erkennen, welche im rho-Hintergrund deutlich höher ist. In Bezug auf die Lokalisation der rut-site hat dies aber nur insoweit eine Bedeutung, dass sie nicht in der Sequenz der ersten 21 Aminosäuren zu finden ist. Einen deutlichen Hinweis auf die Lokalisation der rut-site geben dagegen die Reporterfusionen in den Zeilen 1 und 2. Es ist ersichtlich, dass bei Deletion der ersten 70 (Zeile 2) bzw. 99 Aminosäuren (Zeile 1) die Werte für die Fluoreszenz im Wildtyphintergrund bereits höher sind als bei einigen anderen Reportern im rho-Hintergrund. Die Intensitäten der Fluoreszenz dieser beiden Stämme im rho-Hintergrund übersteigt sogar die des Referenzstammes in Zeile 11. Die Analyse der Fluoreszenz dieser Reporterstämme zeigte, dass die rut-site für rsiX in der Nukleotidsequenz für die Aminosäuren 44 bis 70 liegen muss. Die Deletion der ersten 43 Aminosäuren (Zeile 6) zeigte noch keine erhöhte Fluoreszenz im Wildtyphintergrund. Diese wurde erst mit der Deletion der ersten 70 Aminosäuren beobachtet. Damit konnte die rut-site einer bestimmten Region in der Sequenz von rsiX zugeordnet werden. Sie befindet sich ungefähr in dem Bereich, welcher für die Transmembrandomäne kodiert. Die Transmembrandomäne von RsiX wird von den Aminosäuren 48 bis 64 gebildet (Abbildung 23). Abbildung 23: Schematische Darstellung des Gens rsiX aus B. subtilis. Die Nummern im unteren Teil der Abbildung bezeichnen die entsprechenden Aminosäuren. Von den Aminosäuren 48 bis 64 wird die Transmembrandomäne (TM) gebildet. Ergebnisse 105 3.8.2 Western Blot Analysen zur Lokalisation der rut-site Im Folgenden wurden mit den Stämmen aus Abbildung 22 (Zeilen 1 – 2 und 6 – 10) Western Blot Analysen durchgeführt. Dabei wurden lediglich der Wildtyphintergrund und der rho-Hintergrund betrachtet. Das entsprechende Luminogramm ist in Abbildung 24 dargestellt. Der immunologische Nachweis der GFP-RsiX-Fusionen erfolgte mit Antikörpern gegen GFP. Dabei wurde zur Analyse stets das gesamte Zellextrakt verwendet. Für die Volllängenform von RsiX in Fusion mit GFP wurde eine Proteingröße von 68 kDa erwartet. Die durch Noder C-terminale Deletionen entstandenen verkürzten Formen des AntiSigmafaktors in Fusion mit GFP besitzen eine entsprechend geringere Proteingröße. Das Ergebnis der Western Blot Analyse sollte identisch mit den Messungen der Fluoreszenzintensitäten in Kapitel 3.8.1 sein. Es wird erwartet, dass für die Stämme gfp-rsiX 1-70 sowie gfp-rsiX 1-99 das Fusionsprotein aus GFP und dem Anti-Sigmafaktor sowohl im Wildtyphintergrund als im rho-Hintergrund nachweisbar ist. Betrachtet man die Spuren 11 und 12 sowie 13 und 14 in Abbildung 24 ist dies auch erkennbar. Das Fusionsprotein gibt in beiden Fällen ein klares Signal bei etwa 60 kDa. Dies bedeutet, dass durch die N-terminalen Deletionen die rut-site entfernt wurde und somit Rho keinen Einfluss mehr hat. Das wiederum führte zum Vorhandensein des Anti-Sigmafaktors RsiX in Fusion Abbildung 24: Luminogramm der Western Blot Analyse verschiedener B. subtilis Stämme zur Kartierung der rut-site in rsiX. Die Menge des Anti-Sigmafaktors RsiX in Fusion mit GFP wurde im Wildtyphintergrund (wt) und im rho-Hintergrund betrachtet. Es wurden sowohl die Volllängenform von RsiX (rsiX) als auch verschiedene Deletionen () analysiert. Die Zahlen bezeichnen dabei jeweils die deletierten Aminosäuren. Die Proteine des Gesamtzellextraktes (10 µg/Spur) wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend auf eine Nitrocellulosemembran geblottet. Der immunologische Nachweis von GFP-RsiX erfolgte mit Antikörpern gegen GFP. Mit der Ladungskontrolle (2 µg/Spur) wurde in gleicher Art verfahren, aber die Entwicklung des Blots erfolgte mit Antikörpern gegen das cytoplasmatische Protein HtpG. Die Größen der detektierten Proteine sind links neben dem Luminogramm aufgezeigt. Ergebnisse 106 mit GFP. Bei den Signalen für die Proteine, deren ungefähre Größe zwischen 35 und 50 kDa liegt, handelt es sich um Proteolyseprodukte, welche beim Abbau der Reporterfusion entstehen. Das Ergebnis für die Volllängenform von RsiX (Spuren 1 und 2) in Abbildung 24 zeigt das bereits bekannte Ergebnis. Der Anti-Sigmafaktor ist im Wildtyphintergrund nicht nachweisbar. Man erhält kein Signal für das Protein. Nur im rho-Hintergrund konnte RsiX mit der erwarteten Größe von 68 kDa detektiert werden. Zusätzlich sind auch hier Proteolyseprodukte verschiedener Größen nachweisbar. Für die N-terminalen Deletionen von 21 (Spuren 7 und 8) bzw. 43 Aminosäuren (Spuren 9 und 10) erhielt man im Wildtyphintergrund ein nur sehr schwaches Signal für das Fusionsprotein. Doch auch hier zeigen deutliche Signale im rho-Hintergrund das Fusionsprotein an, ähnlich wie es auch schon für die Volllängenform von RsiX zu beobachten war (Spuren 1 und 2). Das Signal bei ca. 33 kDa in Spur 8 zeigt wieder ein Proteolyseprodukt an. Die rut-site ist also nicht in der Sequenz der ersten 43 Aminosäuren lokalisiert. Für die C-terminale Deletion ab Aminosäure 146 (Spuren 5 und 6) konnte weder im Wildtyphintergrund noch im rho-Hintergrund ein Signal detektiert werden. Dies deutet daraufhin, dass der Anti-Sigmafaktor unabhängig von Rho kein detektierbares Fusionsprotein bildet. Obwohl der Transmembrandomäne-kodierende Bereich (und damit vermutlich auch die rut-site) noch vorhanden ist (vgl. Abbildung 23), scheinen die noch folgenden etwa 225 Nukleotide nicht auszureichen, um die Transkription durch die Aktivität von Rho zu terminieren. Das bestätigen auch die Ergebnisse der Northern Blot Experimente in Abbildung 25. Die verkürzte Form des Anti-Sigmafaktors unterliegt wahrscheinlich sowohl im Wildtyphintergrund als auch im rho-Hintergrund einer Proteolyse, denn kein Fusionsprotein ist nachweisbar. Die Ergebnisse der Fluoreszenzmessungen in Abbildung 22 weisen ebenfalls darauf hin. Bei Betrachtung der Resultate für die C-terminale Deletion ab Aminosäure 71 (Spuren 3 und 4) erkennt man erneut keinen Einfluss von Rho, denn im Wildtyphintergrund und auch im rho-Hintergrund konnte das Fusionsprotein aus GFP und RsiX detektiert werden. Allerdings steht dies im Widerspruch zu den Ergebnissen der Fluoreszenzmessungen in Abbildung 22. Hier wurde zwar auch kein Einfluss von Rho festgestellt, aber das Fusionsprotein war aufgrund der fehlenden Fluoreszenz nicht nachweisbar. Da aber auch in Kapitel 3.5.2 kein Anti-Sigmafaktor als verkürzte Form in den gleichen genetischen Hintergründen bestimmbar war, muss man in Abbildung 24 in den Spuren 3 und 4 von einem Fehler (z. B. einer zu langen Belichtungszeit) ausgehen. Der fehlende Einfluss von Rho wird auch in den folgenden Northern Blot Analysen bestätigt (Abbildung 25). Ergebnisse 107 Fasst man die Ergebnisse aus Abbildung 24 zusammen, erhält man das gleiche Ergebnis, welches schon die Messungen der Fluoreszenzintensitäten in Abbildung 22 zeigten. Die rut-site von rsiX muss sich innerhalb der Nukleotidsequenz befinden, welche für die Aminosäuren 44 bis 70 kodiert, also in der Region, welche für die Transmembrandomäne kodiert. Die Ladungskontrolle dieser Western Blot Experimente lieferte in allen 14 Spuren eindeutige Signale bei 70 kDa für das cytoplasmatische Protein HtpG. 3.8.3 Northern Blot Analysen und die Einführung von Punktmutationen zur genauen Bestimmung der rut-site in rsiX Im Anschluss sollten die bisherigen Ergebnisse zur Lokalisation der rut-site zusätzlich in Northern Blot Analysen bestätigt werden. Dazu wurden zunächst die gleichen Stämme untersucht, welche auch schon für die Western Blot Experimente in Abbildung 24 verwendet wurden. Das gfp-rsiX-Transkript wurde durch Verwendung einer DIG-markierten RNASonde gegen gfp detektiert. Für diese Experimente sollten die gfp-rsiX-Transkripte wiederum im Wildtyphintergrund und auch im rho-Hintergrund betrachtet werden. Das Luminogramm dieser Analyse ist in Abbildung 25 zu sehen. Dabei wurde für die Volllängenform von rsiX in Fusion mit gfp eine Transkriptgröße von ca. 2200 Basen wie erwartet erhalten. Die durch Deletionen am 5´- bzw. 3´-Ende verkürzten Formen von rsiX (Abbildung 25, Spuren 3 bis 14 sowie 17 und 18) zeigten ein entsprechend kürzeres Transkript auf. Das Resultat dieser Untersuchung stimmt sowohl mit den Ergebnissen für die Western Blot Experimente als auch für die Messungen der Fluoreszenzintensitäten überein. Die Detektion des gfp-rsiX-Transkriptes im Wildtyphintergrund und im rho-Hintergrund für die beiden N-terminalen Deletionen von 70 bzw. 99 Aminosäuren (Abbildung 25, Spuren 11 bis 14) bestätigt das zuvor erhaltene Ergebnis, dass sich die rut-site im Bereich der Transmembrandomäne-kodierenden Sequenz befindet. Wäre das nicht der Fall, würde man im Wildtyphintergrund in beiden Fällen keine Signale erhalten. Nur durch das Fehlen der rut-site konnte in den Spuren 11 und 13 trotz des Vorhandenseins von Rho nicht terminiert werden. Das Ergebnis für die N-terminalen Deletionen von 21 bzw. 43 Aminosäuren in den Spuren 7 bis 10 zeigt hingegen, dass in diesen Fällen die rut-site noch vorhanden ist. Im Wildtyphintergrund konnte Rho die Transkription noch terminieren, was im Fall des Knockouts von rho nicht mehr erfolgte, weshalb die Transkripte detektiert werden konnten. Ergebnisse 108 So kann auch anhand der Ergebnisse der Northern Blot Experimente der Bereich der rut-site auf die Nukleotidsequenz festgelegt werden, welche für die Aminosäuren 44 bis 70 kodiert. Für die Volllängenform von rsiX (Spuren 1 und 2 sowie 15 und 16 in Abbildung 25) wurde das bekannte Ergebnis erhalten. Da die rut-site vorhanden ist, erfolgte die Transkriptionstermination durch Rho im Wildtyphintergrund und kein Transkript war nachweisbar. Sobald Rho nicht mehr funktionell war, fand auch keine Termination statt und das Transkript wurde im rho-Hintergrund detektiert. Für die C-terminalen Deletionen ab der 71. bzw. 146. Aminosäure in den Spuren 3 bis 6 fällt das Ergebnis wie erwartet aus. Obwohl hier die rut-site den vorgenannten Ergebnissen entsprechend noch in der Sequenz von rsiX vorhanden ist, kann kein Einfluss des Transkriptionsterminators Rho festgestellt werden. Für den rho-Hintergrund und auch für den Wildtyphintergrund, obgleich etwas schwächer, konnte das gfp-rsiX-Transkript detektiert werden. Wie bereits im vorangegangenen Kapitel erläutert, scheint die Transkription der verkürzten Formen von rsiX, auch wenn die rut-site nicht deletiert wurde, nicht durch Rho Abbildung 25: Luminogramm der Northern Blot Analyse verschiedener B. subtilis Stämme zur Kartierung der rut-site in rsiX. Die Stämme wurden im Wildtyphintergrund (rho+) und im rho-Hintergrund (rho-) betrachtet. Es wurden sowohl die Volllängenform von rsiX (wt) als auch verschiedene Deletionen () analysiert. Die Zahlen bezeichnen dabei jeweils die deletierten Aminosäuren. wt* bezeichnet eine restaurierte Form von rsiX mit zwei stillen Mutationen. Mit der Bezeichnung rut wurde der Stamm benannt, bei welchem durch Punktmutationen die rut-site zerstört wurde. Die elektrophoretische Auftrennung der Gesamt-RNA erfolgte im 1,2%igen denaturierenden Agarosegel bei 80 V. Danach wurden die Ribonukleinsäuren auf eine Nylonmembran geblottet. Die Hybridisierung erfolgte mit einer DIG-markierten RNA-Sonde gegen gfp. Die Größen der detektierten RNA-Moleküle sind rechts neben dem Luminogramm aufgezeigt. Ergebnisse 109 terminiert zu werden. Die verbleibenden wenigen Nukleotide nach der rut-site in der Sequenz des am 3´-Ende verkürzten rsiX scheinen dafür nicht auszureichen. Der Faktor Rho benötigt für seine Aktivität als Transkriptionsterminator demnach noch weitere Sequenzen von rsiX. Die rut-site ist eine Region, welche reich an Cytidin und arm an Guanosin ist (Bear et al. 1988; Alifano et al. 1991). Innerhalb der Nukleotidsequenz, welche für die Aminosäuren 44 bis 70 kodiert und wo die rut-site für rsiX lokalisiert ist, gibt es eine Region, auf die diese Eigenschaften zutrifft. In der Nukleotidsequenz für die Aminosäuren 53 bis 69 existiert eine 26 bp lange Sequenz, die gar kein Guanosin enthält, dafür aber acht Cytidin (Abbildung 26, gelber Rahmen). In nachfolgenden Analysen wurde diese Sequenz genauer untersucht. Die Spuren 17 und 18 der Abbildung 25 zeigen das Resultat der Northern Blot Experimente für einen Reporterstamm, in welchem Teile der Transmembrandomäne von RsiX (die Aminosäuren 53 bis 69) deletiert wurden. Es ist zu erkennen, dass man sowohl im Wildtyphintergrund als auch für den Knockout von rho ein klares Signal für das gfp-rsiX-Transkript in der erwarteten Größe erhielt. Dies bestätigt die vorherigen Erkenntnisse, dass sich die rut-site innerhalb der Sequenz für die Aminosäuren 44 bis 70 befindet. Das Fehlen der rut-site führt hier dazu, dass der Faktor Rho im Wildtyphintergrund nicht terminieren kann und somit das Transkript detektierbar ist. In den Spuren 19 und 20 der Abbildung 25 ist das Ergebnis der Northern Blot Analyse für eine Volllängenform von rsiX zu sehen. Sie unterscheidet sich vom wildtypischen rsiX lediglich in zwei Basen, welche durch Klonierungsschritte ausgetauscht wurden und dann als stille Mutationen auftraten. Bei diesem restaurierten Wildtyp (wt*) wurde die wildtypische Nukleotidsequenz für die Aminosäuren 53 bis 69 wieder in den Reporterstamm gfp-rsiX 53-69 (Spuren 17 und 18) eingefügt. Diese zwei stillen Mutationen wirkten sich allerdings auf den Einfluss der Aktivität des Transkriptionsterminators Rho nicht aus. Es ist zu erkennen, dass das Transkript wie für den Wildtyp (Spuren 1 und 2 sowie 15 und 16) nur bei einem Knockout von rho nachweisbar ist. Aus diesem Grund konnte der Reporterstamm gfp-rsiX 53-69 (Spuren 17 und 18) auch verwendet werden, um eine durch Punktmutationen leicht veränderte Nukleotidsequenz für die Aminosäuren 53 bis 69 einzufügen. Die Sequenz wurde so geändert, dass im Bereich der Aminosäuren 61 bis 68 fünf Nukleotide ausgetauscht wurden ohne die Aminosäuresequenz zu ändern (Abbildung 26). Durch diese stillen Mutationen wurden drei Guanosin eingeführt und die markierten Cytidin in Abbildung 26 sind verloren gegangen. Auf diese Art wurden die Merkmale einer rut-site zerstört. Für diesen Bereich der rut-site von rsiX hat man so einen Ergebnisse 110 Überschuss an Guanosin erzeugt. Die Sequenz mit dieser mutierten rut-site wurde anschließend in den Reporterstamm gfp-rsiX 53-69 eingeführt. Der resultierende Stamm gfp-rsiX_rut (Abbildung 25, Spuren 21 und 22) zeigt in den Northern Blot Experimenten das erwartete Ergebnis. Die durch stille Mutationen leicht veränderte Sequenz der rut-site führte zu einer ähnlich starken Detektion des gfp-rsiX-Transkriptes sowohl im Wildtyphintergrund als auch im rho-Hintergrund. Die fünf Punktmutationen zerstörten die Funktionalität der rut-site. Es kann daher festgelegt werden, dass sich ein funktioneller Teil der rut-site innerhalb der Nukleotidsequenz für die Aminosäuren 44 bis 70 befindet. Dabei scheint insbesondere die Nukleotidsequenz für die Aminosäuren 61 bis 69 eine wichtige Funktion einzunehmen, da die Einführung von stillen Mutationen in diese Sequenz die Wirkungsweise der rut-site zerstörte. Zudem findet man in dieser Sequenz fast kein Guanosin, aber dafür vermehrt Cytidin, womit die Erkenntnisse von Bear et al. sowie Alifano et al. bestätigt werden können. 3.9 Proteolyse von RsiX Für den Anti-Sigmafaktor RsiW aus B. subtilis konnte bereits gezeigt werden, dass RIP, die regulierte intramembrane Proteolyse, stattfindet, um RsiW bei bestimmten Stressbedingungen abzubauen, damit der Sigmafaktor W nicht länger inhibiert wird (Heinrich & Wiegert 2009). Bei diesem Prozess sind mehrere Proteasen beteiligt, u. a. PrsW (Heinrich & Wiegert 2006), RasP (Schöbel et al. 2004) und auch die cytoplasmatische Protease ClpXP (Heinrich et al. 2009). In Kapitel 3.3 wurde zuvor gezeigt, dass die beiden Proteasen PrsW und RasP im Wildtyphintergrund auf die Konzentration von RsiX keinen Einfluss haben. Mit den neu Abbildung 26: Auszug aus der Sequenz für das wildtypische Gen rsiX aus B. subtilis. Oben: Nukleotidsequenz der dsDNA. Der gelbe Rahmen kennzeichnet den Bereich der rut-site, bei welchem in dem Reporterstamm 1012 amyE::PgroE-gfp-rsiX rut durch fünf Punktmutationen (rote Pfeile) stille Mutationen als Nachweis der rut-site eingefügt wurden. Unten: Die entsprechende Aminosäuresequenz des AntiSigmafaktors RsiX. Der schwarze Rahmen kennzeichnet den Bereich der Transmembrandomäne von RsiX, die Zahlen bezeichnen die Position der jeweiligen Aminosäure in der Proteinsequenz. Ergebnisse 117 dem Ergebnis der Western Blots keine Beteiligung an der Proteolyse von RsiX nachgewiesen werden. In dem Luminogramm von Abbildung 30 sind für diese Fälle keine Signale für Proteolyseprodukte von RsiX zu erkennen. Die fehlenden Signale für die Volllängenform von RsiX bei 60 kDa im clpXund prsW-Hintergrund nach IPTG-Zugabe sind vermutlich die Folge eines Fehlers beim Übertragen der Proteine vom Polyacrylamidgel auf die Nitrocellulosemembran. Vermutlich war an dieser Stelle das Blotten nicht effizient genug. Die Ladungskontrolle für diese Western Blot Analyse lieferte wie zu erwarten in allen 20 Spuren klare Signale bei 70 kDa für die membranassoziierte Metalloprotease FtsH. Neben den Western Blot Analysen wurden für die oben beschriebenen Stämme, bei welchen die rut-site von rsiX mutiert wurde, auch Messungen der -Galaktosidase-Aktivitäten vorgenommen. Wie im Kapitel 3.9.1 bereits angewandt, wurden an dieser Stelle die Aktivitäten auch über einen Zeitraum von 5 Stunden bei einer IPTG-Konzentration von 250 µM gemessen. Abbildung 31 zeigt das Ergebnis dieser Aktivitätsmessungen. Die Werte für die -Galaktosidase-Aktivitäten ohne Induktion von rsiX durch IPTG verhalten sich genauso wie es schon für Abbildung 29 (oben) beschrieben wurde - sie sind alle relativ hoch. Nur die Aktivitäten für den Knockout von clpX weichen mit Beginn der stationären Phase von den anderen Aktivitäten ab. Sie sind geringer als für die anderen vier Stämme ermittelt, aber immer noch deutlich höher als die entsprechenden Aktivitäten nach Induktion mit IPTG. Sobald die Transkription von rsiX mit IPTG induziert wurde, verhalten sich der Wildtypstamm und der rasP-Stamm wie bereits zuvor beschrieben (Kapitel 3.9.1). Abbildung 31 (unten) zeigt, dass sich der Stamm mit dem Knockout für prsW und auch der Stamm mit dem achtfach Proteasen-Knockout (WB800) ähnlich dem Wildtyp verhalten. Dieses Ergebnis bedeutet, dass diese Proteasen nicht an der Proteolyse von RsiX beteiligt sind. Das entspricht dem Ergebnis der Western Blot Analysen in Abbildung 30. An dieser Stelle kann man außerdem wieder die verstärkte Aktivierung von X mit Beginn der stationären Phase erkennen. Allerdings zeigt der clpX-Stamm genauso geringe Messwerte für die -Galaktosidase-Aktivität wie der rasP-Stamm und die Messwerte sind deutlich geringer als die Werte, die für den Wildtypstamm ermittelt wurden. Dieser Umstand ist nur durch eine Stabilisierung des Anti-Sigmafaktors aufgrund des Knockouts von clpX und der damit verbundenen Inhibierung von X zu erklären. Dieses Ergebnis lässt auf eine Beteiligung von ClpX an der RsiX Proteolyse schließen, obwohl die Resultate der Western Blot Analysen in Abbildung 30 einen anderen Schluss zuließen. Eindeutige Aussagen bzgl. der Beteiligung Ergebnisse 118 von ClpX an der RsiX Proteolyse können an dieser Stelle daher nicht getroffen werden. Es 0 2 4 6 8 10 12 14 0,5 5,0 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 -Galaktosidase-Aktivität OD578 Zeit [min] 250 µM IPTG OD wt OD rasP OD prsW OD clpX OD WB800 wt rasP prsW clpX WB800 Abbildung 31: -Galaktosidase-Aktivitäten der B. subtilis Stämme KS246 (pALFrsiX rut; wt), KS243 (rasP), KS254 (prsW), KS250 (clpX) und KS258 (WB800) zur Untersuchung der Proteolyse von RsiX. Sekundärachse: Die -Galaktosidase-Aktivitäten wurden im Wildtyphintergrund (wt), im rasP-, prsWund clpX-Hintergrund betrachtet sowie für den achtfach Proteasen-Knockout, welcher im Stamm B. subtilis WB800 (Wu et al. 2002) vorliegt (WB800). Durch Verwendung des Plasmides pAL-FLAG konnte die Transkription von rsiX mit IPTG induziert werden (pALFrsiX). Die Bezeichnung rut wurde gewählt, weil durch Punktmutationen die rut-site von rsiX zerstört wurde. Die dltA-lacZ-Reporterfusion wird durch X-Aktivität induziert. Dargestellt sind jeweils die Ergebnisse ohne IPTG (0 µM; oben) und mit IPTG (250 µM; unten) -Zugabe. Der verwendete Promotor Pspac ist durch IPTG regulierbar. Die Probenahme für die Messung der Aktivitäten erfolgte kontinuierlich alle 30 min. Die Aktivitäten beziehen sich jeweils auf 1 OD578 zum Zeitpunkt der Probenahme. Die Bestimmung der β-Galaktosidase-Aktivität erfolgte wie bei Wiegert et al. (2001) beschrieben. Die Fehlerbalken geben die berechneten Werte der Standardabweichung an. Primärachse: Wachstumskurve der entsprechenden Stämme. Die OD578 wurde alle 30 min gemessen. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0,5 5,0 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 -Galaktosidase-Aktivität OD578 Zeit [min] 0 µM IPTG OD wt OD rasP OD prsW OD clpX OD WB800 wt rasP prsW clpX WB800 Ergebnisse 119 müssten zusätzliche Western Blot Analysen mit der cytoplasmatischen Fraktion sowie ggf. der Gesamtzellfraktion durchgeführt werden. Bei einer Beteiligung von ClpX an der RsiX Proteolyse sollten die sehr kleinen Abbauprodukte von RsiX im Cytoplasma detektiert werden. Betrachtet man die Ergebnisse zur Analyse der Proteolyse des Anti-Sigmafaktors RsiX zusammen, ist festzustellen, dass die site-2 Protease RasP an der Proteolyse von RsiX beteiligt ist. Des Weiteren ist sehr wahrscheinlich auch die cytoplasmatische Protease ClpX involviert. Da aber die site-1 Protease PrsW nicht an der Prozessierung beteiligt ist, muss man davon ausgehen, dass die Proteolyse von RsiX anders als für RsiW bereits bekannt (Heinrich et al. 2009) verläuft. 3.10 Der Einfluss von rho in vivo Das Gen für den Transkriptionsterminator Rho ist in B. subtilis nicht essentiell (Quirk et al. 1993). Wurde das Wachstum einer B. subtilis rhoKultur durch Messung der OD578 verfolgt, konnte festgestellt werden, dass das Wachstum ähnlich dem für eine rho+ Kultur verlief. Zwischen beiden Kulturen waren keine signifikanten Unterschiede im Wachstumsverhalten erkennbar. Bei näherer Betrachtung einzelner Zellen unter dem Mikroskop wurden jedoch Unterschiede zwischen den Stämmen festgestellt. Der wildtypische Stamm besitzt Zellen in Stäbchenform (Abbildung 32, Bilder 1 bis 3). Dagegen wachsen die Zellen in der rhoKultur in langen Ketten (Abbildung 32, Bilder 4 bis 6). Diese Beobachtung wurde als Anlass für weitere Untersuchungen genommen. In einer ausführlichen Transkriptom-Analyse wurde das Transkriptom von B. subtilis 1012 mit dem Transkriptom von B. subtilis 1012 rho verglichen (U. Mäder, G. Homuth, unveröffentlicht). Dabei wurde ein großer Unterschied zwischen beiden Transkriptomen festgestellt. Eine Vielzahl verschiedener Gene wurde im rho-Knockout entweder hochoder herunterreguliert. An dieser Stelle soll ein Beispiel kurz erwähnt werden. Es wurde gefunden, dass Gene, welche durch den alternativen Sigmafaktor D reguliert werden, im rhoHintergrund eine deutlich geringere Expression erfahren als im Wildtyphintergrund. Außerdem ist bereits bekannt, dass B. subtilis sigD Zellen ähnlich wie B. subtilis rho Zellen auch in langen, unbeweglichen Ketten wachsen (Marquez et al. 1990). Chen et al. zeigten zudem, dass das Autolysin LytF, welches durch das Gen lytF kodiert wird und auch Ergebnisse 120 D-reguliert ist, für die Trennung der Zellen im Wesentlichen verantwortlich ist (Chen et al. 2009). Die Ursache, dass Zellen im rho-Knockout in Ketten wachsen, liegt also vermutlich darin, dass der Sigmafaktor D und damit auch die Gene des D-Regulons stark vermindert exprimiert werden. Daher wurde in dieser Arbeit lytF im Stamm B. subtilis 3610 rho ektopisch unter IPTG-Kontrolle gestellt und erneut die Morphologie der Zellen untersucht. Zur genaueren Beurteilung wurden außerdem die Zellmembranen mit dem Fluoreszenzfarbstoff FM4-64 angefärbt. Mittels Durchlichtmikroskopie und zusätzlich durch Fluoreszenzmikroskopie konnte die Wirkung von LytF auf die Zellmorphologie bestätigt werden. In Abbildung 32, Bilder 7 bis 12, sieht man eindeutig, dass die Zellen im rhoKnockout nur durch Inkubation mit lediglich 30 µM IPTG ihre Fähigkeit, sich in einzelne bewegliche Zellen zu teilen, zurückerlangten. Der Transkriptionsterminator Rho hat also nicht nur Auswirkung auf das sigX-rsiX-Operon. Auch der alternative Sigmafaktor D und sein Regulon werden durch den Faktor Rho in der Art beeinflusst, dass sich bei Deletion des Faktors Rho sogar die Zellmorphologie verändert. Abbildung 32: Mikroskopie von B. subtilis 3610 Zellen zur Beurteilung der Zellmorphologie im Wildtyphintergrund (wt), im rho-Hintergrund (rho) bzw. im rho-Hintergrund mit IPTGinduzierbarem lytF (rho Physpank-lytF). Die Analyse erfolgte anhand Durchlichtmikroskopie (oben) und Fluoreszenzmikroskopie (Mitte). Die Überlagerung der entsprechenden Durchlichtund Fluoreszenzaufnahmen ist unten dargestellt. Die Zellen wurden für diese Aufnahmen bei Erreichen einer OD578 von 0,5 mittels Agarose fixiert. Das Anfärben der Membranen erfolgte mit FM4-64 (Molecular Probes). Diskussion 121 4 Diskussion Die Expression von Genen in Prokaryoten ist streng reguliert. Besonders unter Stressbedingungen muss eine solche Regulation stattfinden. Für eine geregelte Genexpression bei bestimmten Stressfaktoren sorgen die sogenannten alternativen Sigmafaktoren. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit dem ECF-Sigmafaktor X aus B. subtilis sowie seinem entsprechenden Anti-Sigmafaktor RsiX (Huang et al. 1997; Brutsche & Braun 1997; Helmann 2002). Die Anti-Sigmafaktoren RsiX und RsiW sind beides Transmembranproteine, die strukturelle Ähnlichkeiten erkennen lassen (Yoshimura et al. 2004). Daher wurde in dieser Arbeit der Frage nachgegangen, ob auch RsiX durch eine regulierte intramembrane Proteolyse prozessiert werden muss, damit X die Transkription seines Regulons initiieren kann. 4.1 RsiX ist der negative Regulator von X Um die X-Aktivität in verschiedenen Reporterstämmen zu veranschaulichen, wurde eine Reporterfusion verwendet, bei welcher der Promotor von dltA mit lacZ fusioniert ist (Abbildung 4, oben). Sobald der Sigmafaktor aktiviert wird, sollte es zur Transkription der Reporterfusion kommen und dies kann durch Messung einer entsprechenden -GalaktosidaseAktivität gezeigt werden. Die hier durchgeführten Messungen der -Galaktosidase-Aktivität für den wildtypischen Hintergrund und für den Knockout von rsiX zeigen deutlich, dass RsiX als Anti-Sigmafaktor fungiert, so dass in dessen Gegenwart X zu keiner Interaktion mit der RNA-Polymerase fähig ist. Erst die Deletion von RsiX führt zur Aktivierung von X. Die Ergebnisse von Brutsche und Braun sowie von Huang et al. sind reproduzierbar. Dementsprechend müsste eine ektopische Insertion eines IPTG-induzierbaren rsiX zur Komplementation des Knockouts von rsiX führen. Ein ähnliches Reportersystem wurde bereits mit Erfolg verwendet, um den Einfluss von RsiW auf die W-Aktivität zu untersuchen (Schöbel et al. 2004). Das Reportersystem bei Schöbel et al. bestand aus dem rsiW-Knockout und einem IPTGinduzierbaren rsiW sowie aus einer Fusion zwischen dem Promotor des W-regulierten yuaF und lacZ. Allerdings konnte in der vorliegenden Arbeit eine Komplementation des rsiXKnockouts nicht erreicht werden. In einer früheren Arbeit wurde bereits die korrekte Diskussion 122 Konstruktion der Reporterstämme festgestellt (Schäfer 2007), so dass Klonierungsfehler als mögliche Fehlerquelle für die fehlende Komplementation ausgeschlossen werden konnten. Neben der Volllängenform für rsiX wurde auch versucht, mit einer verkürzten Form von rsiX eine Komplementation des rsiX-Knockouts zu erreichen. Doch auch für dieses Konstrukt konnte die Komplementation nicht erzielt werden. Die Ursache dafür liegt aber wahrscheinlich genau in dieser verkürzten Form von rsiX, denn rsiX 71-368 exprimiert den Anti-Sigmafaktor ohne die extracytoplasmatische Domäne. Schöbel et al. haben eine ähnlich verkürzte Form für RsiW (RsiW1) bereits verwendet (Schöbel et al. 2004). Dabei wurde festgestellt, dass diese verkürzte Form von RsiW immer ein Substrat für die Protease RasP darstellt. Es liegt daher nahe, dass auch hier RsiX 71-368 durch RasP prozessiert wird, was die Transkription des X-Regulons zur Folge hätte. Bestätigt wird dieser Zusammenhang durch die Betrachtung von GFP-RsiX 71-368 im rasP-Hintergrund (Abbildung 16). Der in dieser Arbeit gefundene Einfluss des Transkriptionsterminators Rho auf die rsiXTranskription kann jedoch die fehlende Komplementation des rsiX-Knockouts erklären. Die ektopische rsiX-Transkription wird demnach initiiert, führt aber durch die vorzeitige Termination nur zu einer unzureichenden Translation von rsiX. Damit kann der Knockout nicht komplementiert werden und es wurde weiterhin das X-Regulon transkribiert. Sobald aber die für die Termination wichtige rut-site von rsiX durch Mutationen zerstört wurde, konnte rsiX auch translatiert und somit der Knockout komplementiert werden (Abbildung 28). 4.2 Der Transkriptionsterminator Rho beeinflusst die Transkription des sigX-rsiX-Operons Für den genomweiten Screen nach Faktoren, welche den Anti-Sigmafaktor RsiX in irgendeiner Weise beeinflussen, wurde die Methode der Transposonmutagenese mit dem Plasmid pIC333 verwendet (Steinmetz & Richter 1994). Das Ergebnis der Transposonmutagenese zeigte, dass der Transkriptionsterminator Rho die zelluläre Konzentration des rsiX-Transkriptes bestimmt. Der Umstand, dass die unterschiedlichen Transpositionsereignisse in allen drei Fällen zum gleichen Ergebnis führten, sprach für einen sicheren Einfluss des Faktors Rho auf das rsiX-Transkript. Dieses Resultat war aber sehr unerwartet, denn man hatte mit der Identifizierung einer oder mehrerer Proteasen gerechnet. Genauso wie es für RsiW bekannt ist (Heinrich et al. 2009), wurde für RsiX angenommen, dass eine regulierte Proteolyse stattfindet, um die X-regulierte Transkription zu aktivieren. Diskussion 123 Ein sehr ähnlicher Screen mit dem Plasmid pIC333 wurde verwendet, um nach Faktoren zu suchen, die den Anti-Sigmafaktor RsiW regulieren (Heinrich & Wiegert 2006). Allerdings wurden bei diesem Screen deutlich mehr Transpositionsereignisse mit Einfluss auf den dort verwendeten GFP-RsiW-Reporter gefunden als in der hier vorliegenden Arbeit. Die Effizienz des gewählten Mutageneseverfahrens ist also in Abhängigkeit des Reporters sehr unterschiedlich. Als Konsequenz des Ergebnisses der Transposonmutagenese wurde der Deletionsstamm für rho konstruiert. Das war nur möglich, weil rho in B. subtilis, im Gegensatz zu E. coli, nicht essentiell ist (Quirk et al. 1993). Die Konstruktion des rho-Knockouts erfolgte durch Insertion einer Bleomycin-Resistenz-Kassette in die Sequenz für rho. Auf ähnliche Weise wurden auch schon Knockouts für die Proteasen RasP (Schöbel et al. 2004) oder PrsW (Heinrich & Wiegert 2006) erhalten. Den Einfluss des Transkriptionsterminators Rho auf die Transkription und damit auch auf die Translation von rsiX zeigten die Ergebnisse der Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 16) und auch der Western Blot Analysen (Abbildung 17) mit einem GFP-RsiX-Reporter. Sobald die translationelle Fusion von gfp und rsiX transkribiert wurde, terminierte Rho im Wildtyphintergrund, anders als im rho-Knockout, die Transkription. Die Folge war, dass die Kolonien keine Fluoreszenz zeigten und auch in Western Blot Analysen konnte das Fusionsprotein nicht detektiert werden. Die in dieser Arbeit gefundene Termination der sigX-rsiX-Transkription durch den Faktor Rho wurde nicht erwartet. Zum einen, weil, wie in Abbildung 3 zu sehen, das sigX-rsiX-Operon zusätzlich am Ende des Operons einen intrinsischen Terminator für eine Faktor-unabhängige Termination der sigX-rsiX-Transkription besitzt (Huang et al. 1997). Zum anderen, weil die Regulation der Transkription durch den Terminator Rho in B. subtilis an sich ungewöhnlich ist. Das sigX-rsiX-Operon ist erst das dritte bekannte Beispiel in B. subtilis für die Termination durch den Faktor Rho. Zuvor wurde bereits gezeigt, dass das Gen des Transkriptionsterminators Rho selbst einer Autoregulation durch Rho unterliegt (Ingham et al. 1999). Weiter ist bekannt, dass auch das trp-Operon vom Transkriptionsterminator Rho beeinflusst wird (Yakhnin et al. 2001). Ähnlich wie im sigX-rsiX-Operon gibt es im trpEDCFBA-Operon auch überlappende Bereiche in der Nukleotidsequenz. Yakhnin et al. konnten ebenfalls zeigen, dass im rho-Hintergrund mehr Transkript für trpE und trpD vorhanden war als im Wildtyphintergrund. Diskussion 124 Die Rho-abhängige Termination scheint aufgrund der Tatsache, dass bisher nur diese drei Beispiele für eine Faktor-abhängige Termination gefunden wurden, in B. subtilis nicht weit verbreitet zu sein. Dieser Umstand passt auch zu den Resultaten von Ingham et al., die weniger als 5 % der Menge des Proteins Rho, im Vergleich zu E. coli, in B. subtilis gefunden haben. Der Grund für eine derartige Regulation für einen Sigmafaktor und seinen entsprechenden Anti-Sigmafaktor bleibt aber mit den Ergebnissen dieser Arbeit ungeklärt. Es können daher hier nur Hypothesen aufgestellt werden. Ein mutmaßlicher Grund für diese Art der Regulation könnte die stöchiometrische Proteinexpression sein, damit der Sigmafaktor X und sein entsprechender Anti-Sigmafaktor RsiX immer in gleichen Mengen vorliegen. Oppenheim & Yanofsky postulierten schon, dass die Translationskopplung im trp-Operon aus E. coli auch nur der Sicherstellung einer äquimolaren Produktion von Polypeptiden dient (Oppenheim & Yanofsky 1980). Allerdings wirft das eine andere Frage auf: Wann wird die Transkription des Operons terminiert? Wenn man von einer permanenten Termination ausgeht, würde das bedeuten, dass X und RsiX nie translatiert würden. Es muss also auch Bedingungen geben, bei denen Rho nicht terminiert. Möglich wären dabei ähnliche Bedingungen wie sie für das trp-Operon aus B. subtilis gefunden wurden. Hier reguliert ein weiteres Protein, TRAP (Babitzke & Yanofsky 1993), in Abhängigkeit von der Tryptophan-Konzentration in der Zelle sowohl die Translation als auch die Transkription des trp-Operons (Merino et al. 1995). Dabei bindet Tryptophan bei einer hohen intrazellulären Konzentration an das Protein TRAP, welches wiederum an das trp-Transkript bindet, was zur Bildung von Sekundärstrukturen führt, die schließlich dem Faktor Rho die Transkriptionstermination ermöglichen (Yakhnin et al. 2001). Bei Übertragung dieses Szenarios auf das sigX-rsiX-Operon könnte nachfolgend beschriebene Regulation möglich sein. Durch die schon bekannte Autoregulation von sigX (Brutsche & Braun 1997) könnte erst bei einer zu hohen intrazellulären X-Konzentration der Zugang für Rho zum sigX-rsiX-Transkript für die faktorabhängige Termination ermöglicht werden. Aber an dieser Stelle sind noch sehr viel weitere Analysen nötig. Das Antibiotikum Bicyclomycin (BCM) (Nishida et al. 1972) ist ein spezifischer Inhibitor des Transkriptionsterminators Rho (Zwiefka et al. 1993). Biochemische Analysen und auch Untersuchungen der Struktur des Faktors Rho im Zusammenspiel mit BCM haben gezeigt, dass BCM direkt die ATPase-Aktivität von Rho beeinflusst, indem die ATP-Hydrolyse unterbunden wird, sodass Rho nicht mehr terminieren kann (Park et al. 1995; Magyar et al. Diskussion 125 1996; Carrano et al. 1998; Skordalakes et al. 2005). Damit ist die Zugabe von BCM in ein Medium eine effektive Maßnahme, um den Einfluss von Rho zu untersuchen, ohne eine Deletion des Faktors Rho zu benötigen. Dies setzt aber voraus, dass rho in dem jeweiligen Organismus nicht essentiell ist. Für Analysen in E. coli kann diese Methode daher nicht verwendet werden, denn für dieses Bakterium ist rho essentiell (Das et al. 1976; Bubunenko et al. 2007). Allerdings wurden schon subletale Konzentrationen von 20 µg/ml BCM benutzt, um Experimente mit BCM in E. coli erfolgreich durchzuführen (Peters et al. 2009). In dieser Arbeit wurde ebenfalls BCM verwendet, um die Funktion des Transkriptionsterminators Rho zu inhibieren, ohne dass ein rho-Knockout nötig war, denn in B. subtilis ist rho nicht essentiell (Quirk et al. 1993). Die hier durchgeführten Analysen dienten lediglich dazu, den direkten Einfluss von Rho auf das rsiX-Transkript noch einmal darzulegen. Die erzielten Ergebnisse verdeutlichen, wie schon an anderer Stelle beschrieben (Zwiefka et al. 1993; Ingham et al. 1999), dass die Verwendung von BCM auch in B. subtilis eine effektive Methode darstellt, um den Einfluss des Faktors Rho zu analysieren, ohne Rho zu deletieren. 4.3 Mögliche Translationskopplung im sigX-rsiX-Operon Das Phänomen der Translationskopplung und ihre Bedeutung für die stöchiometrische Produktion von Enzymen für die Biosynthesen sind schon seit langem bekannt (Oppenheim & Yanofsky 1980; McCarthy & Gualerzi 1990). Schon 1980 wurde für das trp-Operon aus E. coli nachgewiesen, dass das Stopp-Codon von trpE und das Start-Codon von trpD überlappen und die Translation von trpD direkt von der trpE-Translation abhängt. Damit wurde der Begriff der Translationskopplung geprägt (Oppenheim & Yanofsky 1980). Es wurde bereits erwähnt, dass es im trp-Operon von B. subtilis auch zu Überlagerungen der Nukleotidsequenzen für die einzelnen Gene kommt und dass dieses Operon ebenfalls durch den Faktor Rho reguliert wird (Yakhnin et al. 2001). Es stellt sich daher die Frage, ob auch das sigX-rsiX-Operon aufgrund seiner Regulation durch Rho und der überlappenden Bereiche wie das trp-Operon aus B. subtilis (Yakhnin et al. 2001) durch Translationskopplung reguliert wird. Wenn im sigX-rsiX-Operon Translationskopplung vorliegt, hätte man im Northern Blot (Abbildung 20) für das mutierte Operon schwächere Signale erhalten müssen als für das wildtypische Operon, denn im Allgemeinen wird davon ausgegangen, dass bei Inhibierung Diskussion 126 der Translation die mRNA an Stabilität verliert (Kushner 1996). Allerdings zeigen die Ergebnisse der Northern Blot Analyse (Abbildung 20), dass die Menge an sigX-rsiX-Transkript nicht reduziert wurde. Im Gegenteil, es scheint, als ob die Menge an Transkript sogar etwas angestiegen ist. Bei näherer Betrachtung der Ergebnisse für das trp-Operon wurde festgestellt, dass sich hier trotz Vorliegen einer Translationskopplung die Stabilität der mRNA nicht verändert hat, wenn die Translation inhibiert war (Yakhnin et al. 2001). Dieser Umstand lässt daher Zweifel aufkommen, ob tatsächlich keine Translationskopplung zwischen sigX und rsiX herrscht. Aber auch Kushner räumte ein, dass es manchmal bei einer gestörten Translation zu keiner Veränderung der mRNA Halbwertszeit kommt und die Stabilität der mRNA sogar zunehmen kann (Kushner 1996). Für eindeutige Aussagen bzgl. der Translationskopplung im sigX-rsiX-Operon müssen noch weitere Analysen folgen. Hilfreich wäre an dieser Stelle das Vorhandensein von Antikörpern gegen den Anti-Sigmafaktor RsiX. Damit wären mit dem bereits verwendeten Reporter in weiteren Western Blot Analysen schnelle Aussagen zur Translation von rsiX bei nicht stattfindender Translation von sigX möglich. Auch Fusionen mit dem lacZ-Gen als Reporter, wie sie bei Yakhnin et al. verwendet wurden, wären möglich. Zusätzlich könnten auch noch Rifampicin-Experimente durchgeführt werden, um die Stabilität der entsprechenden mRNA besser zu beurteilen, da Rifampicin die Transkription schon auf der Ebene der Initiation blockiert (Hartmann et al. 1967; Campbell et al. 2001). Eine Sache, die aber eindeutig festgestellt werden konnte, ist, dass trotz der fehlenden sigX-Translation weiterhin eine Termination der Transkription durch den Faktor Rho stattfindet. Das ist an deutlich stärkeren Signalen für das sigX-rsiX-Transkript im rho-Hintergrund für die mutierte Form des Operons in Abbildung 20 zu erkennen. Ein anderes Phänomen, das noch nicht geklärt werden konnte, ist, warum man im Western Blot in Abbildung 19 für FLAG-SigX ungefähr gleich viel Protein im Wildtypund rho-Hintergrund ausmachen kann. Wohingegen man im Northern Blot in Abbildung 20 einen klaren Unterschied in der Transkriptmenge sieht. Es stellt sich daher die Frage, ob immer nur eine bestimmte Menge an sigX translatiert wird, obwohl es klare Unterschiede in der Transkriptmenge gibt. Sollte tatsächlich keine effiziente Translation von sigX erfolgen, würde die Termination durch Rho einen Weg darstellen, damit in der Zelle stets äquimolare Mengen an X und RsiX vorliegen. Durch den polaren Effekt der Termination würde folglich die untranslatierte naszierende sigX-rsiX-mRNA terminiert und abgebaut werden, damit nicht mehr rsiX als sigX translatiert werden kann. Das würde aber auch bedeuten, dass man im Knockout von rho mehr RsiX als X detektieren müsste, was dann zu keiner bzw. einer Diskussion 133 Zudem erkennt man in Abbildung 29, dass die X bedingte Induktion des lacZ-Reporters in Abhängigkeit von der Wachstumsphase erfolgte. Das Maximum der X-Aktivität ist zu Beginn der stationären Phase registriert worden. Diese Erkenntnis deckt sich jedoch nicht mit den Ergebnissen von Huang et al., die das Maximum der sigX-Expression sowie der Expression von X-kontrollierten Genen in der späten logarithmischen Wachstumsphase beobachteten (Huang et al. 1997; Huang & Helmann 1998). Abschließend kann trotz der Ähnlichkeiten in der Struktur der Anti-Sigmafaktoren RsiX und RsiW (Yoshimura et al. 2004) festgestellt werden, dass die regulierte intramembrane Proteolyse von RsiX einem etwas anderem Mechanismus, als dem für RsiW bekannten (Heinrich et al. 2009), folgt. 4.6 Der Einfluss von Rho auf die Zellmorphologie Das Wachstum von Zellen im rho-Knockout in langen Ketten ähnelt dem bereits bekannten für Zellen im clpP-Knockout (Msadek et al. 1998) bzw. im sigD-Knockout (Marquez et al. 1990). In der Tat wurde in einer genomweiten Transkriptom-Analyse (U. Mäder, G. Homuth, unveröffentlicht) gefunden, dass im Knockout von rho die Transkription des D-Regulons stark vermindert war. Das auch zum D-Regulon gehörende lytF kodiert für das Autolysin LytF und ist auch für die Teilung der Zellen und damit für das Wachstum in Stäbchen verantwortlich (Margot et al. 1999). Sobald eine ektopische lytF-Expression in einer rho-- Kultur erfolgte, konnte das Wachstum in Stäbchen wieder hergestellt werden (Abbildung 32), vergleichbar mit Chen et al. (2009), die zeigten, dass ein sigD-Knockout-Stamm nach ektopischer lytF-Expression seine Fähigkeit, in Stäbchen zu wachsen, zurückerlangte. Die Ursache für das filamentöse Wachstum der Zellen im rho-Knockout scheint also vielmehr an der verringerten sigD-Expression als am Knockout von rho selbst zu liegen. Das bestätigt noch einmal den Einfluss von Rho auch auf das D-Regulon. Ob es sich dabei um einen direkten Einfluss von Rho auf das D-Regulon handelt, müssen weitere Experimente zeigen. Abschließend kann festgehalten werden, dass der Transkriptionsterminator Rho in B. subtilis an zahlreichen Prozessen beteiligt zu sein scheint, obwohl mit den Erkenntnissen dieser Arbeit erst drei Fälle identifiziert werden konnten, bei welchen Rho direkt an der Transkriptionstermination beteiligt ist (Ingham et al. 1999; Yakhnin et al. 2001). Ausblick 134 5 Ausblick Die Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass das sigX-rsiX-Operon, welches für den ECFSigmafaktor X und seinen entsprechenden Anti-Sigmafaktor RsiX kodiert, durch den Transkriptionsterminator Rho bereits auf der Transkriptionsebene reguliert wird (Kapitel 3.5.2). Ein entscheidendes Element bei einer faktorabhängigen Termination ist dabei die rut-site, die Rho-Bindestelle in der naszierenden mRNA (Salstrom et al. 1979). Obwohl in dieser Arbeit die rut-site im Gen rsiX bereits auf die Größe von 81 Nukleotiden eingegrenzt werden konnte (Kapitel 3.8.3), könnte in weiterführenden Analysen versucht werden, die Bindestelle für den Faktor Rho auf das Nukleotid genau zu bestimmen. Des Weiteren haben die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass sehr wahrscheinlich eine zweite Region in der Sequenz von rsiX entscheidend zu einer faktorabhängigen Termination beiträgt (Kapitel 4.4). In folgenden Experimenten sollte daher auch die These über das Vorhandensein einer Terminationszone (Lau et al. 1982; Morgan et al. 1983b; Banerjee et al. 2006) untersucht werden. Bei dem Prozess der Transkriptionstermination spielen die Transkriptions-ElongationsFaktoren NusA und NusG in E. coli eine wichtige Rolle. Erste Analysen in B. subtilis bzgl. dieser beiden Faktoren und ihrer Rolle bei der Transkriptionstermination von rho und im trp-Operon haben aber gezeigt, dass NusA und NusG über unterschiedliche Eigenschaften in E. coli und B. subtilis verfügen (Ingham et al. 1999; Yakhnin et al. 2008). Eine interessante Fragestellung wäre daher, welchen Einfluss diese Faktoren auf die Rho-abhängige Termination von rsiX haben. Im Kapitel 4.2 wurde bereits die Frage diskutiert, warum die Transkription des sigX-rsiX-Operons durch den Faktor Rho terminiert werden muss. Es wurde festgestellt, dass es zwingend Bedingungen geben muss, unter denen keine Termination stattfindet, damit sigX und rsiX auch exprimiert werden können. Daher müssen auch Analysen erfolgen, die der Frage nachgehen, unter welchen Voraussetzungen die Transkription faktorabhängig terminiert wird. Es muss untersucht werden, ob die Konzentration von X in der Zelle, ähnlich wie es für das trp-Operon gefunden wurde (Merino et al. 1995; Yakhnin et al. 2001), dabei eine Rolle spielt. Ferner wurde festgestellt, dass es aufgrund der Termination durch Rho im sigX-rsiX-Operon zum Phänomen der Transkriptions-Polarität kommt (Kapitel 4.4). Das bedeutet, dass nicht nur die Transkription von rsiX, sondern auch die Expression des stromaufwärts liegenden sigX beeinflusst wird. Die bisher einzige Erklärung dafür ist die Ausblick 135 äquimolare Expression beider Gene. Allerdings fehlen an dieser Stelle für diese Erklärung auch noch fundierte Nachweise. Im Kapitel 3.9 dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die site-2 Protease RasP an der Proteolyse von RsiX beteiligt ist. Es wurde aber auch deutlich, dass der Prozess der regulierten intramembranen Proteolyse, wie er für den Anti-Sigmafaktor RsiW nachgewiesen werden konnte (Heinrich et al. 2009), nicht so einfach auf den Anti-Sigmafaktor RsiX übertragen werden kann. Hinsichtlich der Proteolyse von RsiX sind noch viele Fragen ungeklärt, die in weiteren Experimenten beantwortet werden müssen. So fehlt z. B. ein Hinweis auf die site-1 Protease, und man kennt auch nicht die exakten Stellen in der Aminosäuresequenz, an denen z. B. RasP angreift. Der Einfluss der cytoplasmatischen Protease ClpX bei der RsiX-Proteolyse muss auch noch abschließend geklärt werden. Möglich wären an dieser Stelle auch Analysen mit dem GFP-RsiX-Reportersystem in E. coli, um z. B. einen möglichen Einfluss der Protease Tsp an dem Prozess der RsiX-Proteolyse zu untersuchen (Heinrich et al. 2009). Zudem hat man bisher auch keinen eindeutigen Stressfaktor gefunden, aufgrund dessen die Proteolyse von RsiX eingeleitet wird, damit der Sigmafaktor X mit der RNA-Polymerase interagieren kann. Erste Untersuchungen dazu brachten keine eindeutigen Ergebnisse hervor (Schäfer 2007). Abkürzungsverzeichnis 136 Abkürzungsverzeichnis  Deletion/Knockout eines Gens µl Mikroliter µg Mikrogramm abs. absolut APS Ammoniumperoxodisulfat ATP Adenosin-5’-Triphosphat B. subtilis Bacillus subtilis bidest. H2O zweifach destilliertes Wasser bp Basenpaar(e) bzgl. bezüglich bzw. beziehungsweise ˚C Grad Celsius ca. circa cat Gen der Chloramphenicol-Acetyltransferase CDP-Star Dinatrium-2-chloro-5-(4-methoxyspiro[1,2-dioxethan-3,2’-(5’-chloro) tricyclo[3.3.1.13,7]decan]-4-yl)-1-phenylphosphat cfu colony forming unit (koloniebildende Einheit) CTAB Hexadecyltrimethylammoniumbromid DEPC Diethylpyrocarbonat d. h. das heißt DIG Digoxigenin DMF Dimethylformamid DNA Desoxyribonukleinsäure dNTPs Desoxynukleosidtriphosphate dUTP Desoxyuridintriphosphat dsDNA doppelsträngige DNA ECF extra-cytoplasmic function (extracytoplasmatische Funktion) E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraacetat EGTA Ethylenglycol-bis-(b-amino-ethylether)-N, N, N, N-tetraacetat et al. et alteri EtBr Ethidiumbromid Abkürzungsverzeichnis 137 EtOH Ethanol GFP green fluorescent protein (Grün-fluoreszierendes Protein) ggf. gegebenenfalls H2O Wasser Hg Quecksilber HPLC high performance liquid chromatography HS high salt IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid kb Kilobase(n) kDa Kilodalton l Liter LB-Medium Luria-Bertani-Medium oder Luria Broth LBX LB-Medium mit dem Antibiotikum X LS low salt M molar min Minute mm Millimeter MOPS Morpholinopropansulfonsäure mRNA messenger RNA nm Nanometer ODXXX Optische Dichte bei einer Wellenlänge von λ= XXX nm ONPG o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranose PCR Polymerase-Kettenreaktion RNA Ribonukleinsäure RNase Ribonuklease RP Ribo probe (RNA-Sonde) rpm Umdrehungen pro Minute rRNA ribosomale RNA RT Raumtemperatur S Svedberg-Einheiten SDS Natriumdodecylsulfat SDS-PAGE SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese sec Sekunde ssRNA einzelsträngige RNA Abkürzungsverzeichnis 138 TBE-Puffer Tris-Borsäure-EDTA-Puffer TE-Puffer Tris-EDTA-Puffer TEMED N, N, N’, N’-Tetramethylethylendiamin Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Triton-X-100 Polyoxymethylenether U Units ÜN über Nacht UV Ultraviolett V Volt vgl. vergleiche v/v Volumen pro Volumen wt Wildtyp w/v weight per volume (Gewicht pro Volumen) z. B. zum Beispiel X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid Xr Resistenz gegen das Antibiotikum X Xs Sensitivität gegen das Antibiotikum X Xy Antibiotikum X mit der Konzentration von y µg/ml z. T. zum Teil Literaturverzeichnis 139 Literaturverzeichnis Abe, H., T. Abo, and H. Aiba, 1999 Regulation of intrinsic terminator by translation in Escherichia coli: transcription termination at a distance downstream. Genes Cells 4: 87-97. Akbar, S., and C. W. Price, 1996 Isolation and characterization of csbB, a gene controlled by Bacillus subtilis general stress transcription factor sigma B. Gene 177: 123-128. Alba, B. M., J. A. Leeds, C. Onufryk, C. Z. Lu, and C. A. Gross, 2002 DegS and YaeL participate sequentially in the cleavage of RseA to activate the sigma(E)-dependent extracytoplasmic stress response. Genes Dev. 16: 2156-2168. Alifano, P., F. Rivellini, D. Limauro, C. B. Bruni, and M. S. 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