Charakterisierung und Funktionalisierung von Filmen aus rekombinanten Spinnenseidenproteinen

CHARAKTERISIERUNG UND FUNKTIONALISIERUNG VON FILMEN AUS REKOMBINANTEN SPINNENSEIDENPROTEINEN DISSERTATION zur Erlangung des Grades - Doktor der Naturwissenschaften - der Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften der Universität Bayreuth vorgelegt von Diplom-Biologin Kristina Spieß Bayreuth 2012 Die vorliegende Arbeit wurde von Oktober 2005 bis Dezember 2007 am Lehrstuhl für Biotechnologie der TU München in der Arbeitsgruppe von Dr. Thomas Scheibel begonnen und von Januar 2008 bis April 2011 am Lehrstuhl für Biomaterialien der Universität Bayreuth unter der Leitung von Prof. Dr. Thomas Scheibel fortgeführt. Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften der Universität Bayreuth genehmigten Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. Nat.). Dissertation eingereicht am: 10. April 2012 Zulassung durch die Prüfungskommission: 18. April 2012 Tag des wissenschaftlichen Kolloquiums: 15. Juni 2012 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Beate Lohnert Prüfungsausschuss: Prof. Dr. Thomas Scheibel (Gutachter) Prof. Dr. Franz X. Schmid (Gutachter) Prof. Dr. Andreas Fery (Vorsitz) Prof. Dr. Jürgen Senker . Inhaltsverzeichnis i Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ..................................................................................................... 1 1.1 Protein-basierte Materialien .......................................................................................... 1 1.1.1 Anwendungsbeispiele und Forschungsaktivitäten ..................................................... 2 1.1.2 Strukturelle Grundlagen mechanischer Eigenschaften .............................................. 2 1.1.2.1 β-Schleifen: elastische Struktur gezeigt am Beispiel Elastin .............................................. 4 1.1.2.2 Coiled-coil Struktur: Enthalpie-elastisches Verhalten gezeigt an Intermediärfilamenten .. 5 1.1.2.3 β-Faltblatt-reiche Proteine .................................................................................................. 6 1.2 Spinnenseide .................................................................................................................... 7 1.2.1 Aufbau und Struktur von dragline Seide ................................................................... 8 1.2.2 Hierarchischer Aufbau als Grundlage mechanischer Eigenschaften ....................... 10 1.2.3 Fadenassemblierung – der natürliche Spinnprozess ................................................ 11 1.3 Rekombinante Spinnenseidenproteine ........................................................................ 14 1.3.1 Assemblierung des rekombinanten Spinnenseidenproteins eADF4(C16) in verschiedene Morphologien ..................................................................................... 16 1.3.2 Seidenfilme .............................................................................................................. 17 1.4 Zielsetzung ..................................................................................................................... 20 2 Material und Methoden ............................................................................ 23 2.1 Material .......................................................................................................................... 23 2.1.1 Oligonukleotide, Peptide und Linker ....................................................................... 23 2.1.1.1 Oligonukleotide ................................................................................................................ 23 2.1.1.2 Peptide und Linker ............................................................................................................ 23 2.1.2 Plasmide ................................................................................................................... 23 2.1.3 Organismen .............................................................................................................. 24 2.1.3.1 Bakterien ........................................................................................................................... 24 2.1.3.2 eukaryotische Zelllinie...................................................................................................... 24 2.1.4 Enzyme und Antikörper ........................................................................................... 24 2.1.5 Größenstandards und Kits ........................................................................................ 24 2.1.6 Chemikalien und Biochemikalien ............................................................................ 25 2.1.7 Sonstige Materialien/Verbrauchsmaterialien ........................................................... 26 2.1.8 Geräte und technische Hilfsmittel ............................................................................ 26 2.1.9 Computerprogramme ............................................................................................... 28 2.2 Molekularbiologische Methoden.................................................................................. 28 2.2.1 Anzucht von Eschericia coli .................................................................................... 28 Inhaltsverzeichnis ii 2.2.2 Präparation, Reinigung und Sequenzierung von Plasmid-DNA ............................. 28 2.2.3 Transformation chemisch kompetenter E. coli ........................................................ 29 2.2.4 Agarose-Gelelektrophorese ..................................................................................... 29 2.2.5 Hybridisierung synthetischer Oligonukleotide ........................................................ 30 2.2.6 Amplifikation von DNA mittels PCR ..................................................................... 30 2.2.7 Enzymatische Modifikation von DNA .................................................................... 31 2.2.7.1 Spaltung mittels Restriktionsendonukleasen..................................................................... 31 2.2.7.2 Dephosphorylierung der 5`-Enden der Vektoren .............................................................. 31 2.2.7.3 Ligation ............................................................................................................................. 31 2.2.7.4 Klonierung rekombinanter Spinnenseidenproteine ........................................................... 32 2.2.8 Expression synthetischer Spinnenseidengene in E. coli und Reinigung rekombinanter Spinnenseidenproteine .................................................................................. 33 2.2.8.1 Expressionskinetik und Löslichkeitsbestimmung ............................................................. 33 2.2.8.2 Fed batch-Fermentation .................................................................................................... 33 2.2.8.3 Reinigung rekombinanter Spinnenseidenproteine ............................................................ 34 2.3 Proteinanalytische Methoden ...................................................................................... 35 2.3.1 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) ............................................................. 35 2.3.1.1 SDS-PAGE ....................................................................................................................... 35 2.3.1.2 Nativ-PAGE ...................................................................................................................... 35 2.3.1.3 Silberfärbung ..................................................................................................................... 36 2.3.1.4 Fluoreszenz-Imaging ......................................................................................................... 36 2.3.2 Immunoblot (Western Blot) .................................................................................... 36 2.3.3 Größenausschlusschromatographie (SEC) .............................................................. 37 2.3.4 Lichtstreuung ........................................................................................................... 37 2.3.4.1 Statische Lichtstreuung ..................................................................................................... 38 2.3.4.2 Dynamische Lichtstreuung ............................................................................................... 39 2.3.5 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ............................................... 39 2.3.6 MALDI-TOF Massenspektrometrie ........................................................................ 40 2.4 Proteinpräparative Methoden ..................................................................................... 40 2.4.1 Dialyse ..................................................................................................................... 40 2.4.2 Reduktion und Carboxymethylierung ..................................................................... 40 2.4.3 Bestimmung freier Thiolgruppen mit Ellmans Reagens (DTNB) ........................... 41 2.4.4 Redoxtitration .......................................................................................................... 41 2.4.5 Filmpräparation ....................................................................................................... 42 2.4.6 Kopplung an Thiole der Cys-Varianten von eADF4(C16) ..................................... 43 2.4.6.1 Kopplung in Lösung ......................................................................................................... 44 Inhaltsverzeichnis iii 2.4.6.2 Kopplung an assemblierte Filme ...................................................................................... 45 2.5 Spektroskopische Methoden ........................................................................................ 46 2.5.1 UV-Vis Absorptionsspektroskopie .......................................................................... 46 2.5.2 Fluoreszenzspektroskopie ........................................................................................ 47 2.5.3 Zirkulardichroismus (CD)-Spektroskopie ............................................................... 48 2.5.4 Fouriertransformierte Infrarot- (FTIR-) Spektroskopie ........................................... 48 2.5.4.1 Fourier-Selbstdekonvolution (FSD) ................................................................................. 49 2.5.4.2 Polarisierte FTIR-Spektroskopie ...................................................................................... 50 2.5.4.3 Auswertung ....................................................................................................................... 51 2.5.4.4 Temperaturabhängige FTIR-Messungen .......................................................................... 52 2.6 Mikroskopische Methoden ........................................................................................... 53 2.6.1 Lichtmikroskopie ..................................................................................................... 53 2.6.2 Rasterkraftmikroskopie (AFM) ............................................................................... 53 2.6.3 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ......................................................... 54 2.6.4 Rasterelektronenmikroskopie (REM) ...................................................................... 54 2.7 Materialanalytische Methoden .................................................................................... 55 2.7.1 Thermogravimetrische Analyse (TGA) ................................................................... 55 2.7.2 Dynamische Differenzkalorimetrie (DSC) .............................................................. 56 2.7.3 Zugmessung ............................................................................................................. 56 2.7.4 Dynamisch mechanische Analyse (DMA) ............................................................... 58 2.7.5 Kontaktwinkelanalyse .............................................................................................. 59 2.8 Zellkulturtechniken ...................................................................................................... 60 2.8.1 Auftauen, Kultivierung und Einfrieren von Zellen .................................................. 60 2.8.2 Vitalitäts-Test WST (water soluble tetrazonium)-1 ................................................ 61 2.8.2.1 Filmpräparation ................................................................................................................ 61 2.8.2.2 Adhäsionstest .................................................................................................................... 62 2.8.2.3 Proliferationstest ............................................................................................................... 62 3 Ergebnisse .................................................................................................. 63 3.1 Charakterisierung von eADF4(C16) Filmen .............................................................. 63 3.1.1 Analyse der Sekundärstruktur .................................................................................. 64 3.1.1.1 Einfluss verschiedener Lösungsmittel .............................................................................. 64 3.1.1.2 Einfluss verschiedener Nachbehandlungsmethoden ......................................................... 68 3.1.1.3 Einfluss der relativen Luftfeuchtigkeit ............................................................................. 71 3.1.2 Thermische Stabilität ............................................................................................... 74 3.1.2.1 Thermogravimetrische Analyse ........................................................................................ 74 Inhaltsverzeichnis iv 3.1.2.2 Analyse mittels dynamischer Differenzkalorimetrie ........................................................ 76 3.1.2.3 Einfluss der Temperatur auf die Sekundärstruktur ........................................................... 78 3.1.3 Mechanische Charakterisierung .............................................................................. 80 3.1.3.1 Zugbelastung ..................................................................................................................... 80 3.1.3.2 Dynamisch mechanisches Verhalten................................................................................. 82 3.1.3.3 Orientierung der Moleküle unter Zugbelastung ................................................................ 84 3.1.4 Charakterisierung der Filmoberfläche ..................................................................... 88 3.1.4.1 Topographie ...................................................................................................................... 88 3.1.4.2 Benetzbarkeit/Hydrophobizität ......................................................................................... 92 3.2 Modifizierung und Funktionalisierung von eADF4(C16) ......................................... 93 3.2.1 Herstellung und Charakterisierung von Cystein-Varianten von eADF4(C16) ....... 93 3.2.1.1 Design, Expression und Reinigung ................................................................................... 93 3.2.1.2 Analyse der Sekundärstruktur ........................................................................................... 96 3.2.1.3 Charakterisierung des Dimerisierungsverhaltens .............................................................. 96 3.2.2 Kopplung in Lösung ................................................................................................ 99 3.2.2.1 Kopplung von Fluorescein-Maleimid ............................................................................... 99 3.2.2.2 Modifikation mit zyklischem RGD-Peptid c(RGDfK) ................................................... 100 3.2.3 Modifikation und Funktionalisierung von Filmen aus Cystein-Varianten von eADF4(C16) .......................................................................................................... 102 3.2.3.1 Strukturelle Charakterisierung der Filme ........................................................................ 102 3.2.3.2 Filmmodifikation ............................................................................................................ 103 3.3 Untersuchung potentieller Anwendungen von (modifizierten) eADF4(C16)- Filmen .......................................................................................................................... 107 3.3.1 Analyse der Biokompatibilität in Zellkultur-Untersuchungen .............................. 107 3.3.1.1 Generelle Parameter der Filmpräparation und Zellkultivierung ..................................... 108 3.3.1.2 Einfluss des Lösungsmittels ............................................................................................ 108 3.3.1.3 Einfluss der Nachbehandlung ......................................................................................... 110 3.3.1.4 Modifikation mit c(RGDfK)-Maleimid .......................................................................... 113 3.3.2 eADF4(C16) Filme als Oberflächenbeschichtung – Einfluss des Substrats auf die Oberflächeneigenschaften ............................................................................... 115 3.3.2.1 Hydrophobizität .............................................................................................................. 115 3.3.2.2 Topographie .................................................................................................................... 116 3.3.2.3 Sekundärstruktur ............................................................................................................. 117 4 Diskussion ................................................................................................. 119 4.1 Einfluss verschiedener Parameter auf die eADF4(C16) Sekundärstruktur in Filmen .......................................................................................................................... 120 4.1.1 Einfluss des Lösungsmittels .................................................................................. 120 Inhaltsverzeichnis v 4.1.2 Einfluss chemischer und physikalischer Nachbehandlungsmethoden ................... 121 4.2 Beeinflussung makroskopischer Eigenschaften ....................................................... 124 4.2.1 Chemische und thermische Beständigkeit ............................................................. 124 4.2.2 Topographie ........................................................................................................... 124 4.2.3 Mechanische Eigenschaften und Rückschlüsse auf molekulare Anordnung ......... 125 4.3 Modifizierung und Funktionalisierung von Spinnenseidenfilmen ......................... 129 4.4 Einstellen definierter Oberflächeneigenschaften ..................................................... 133 4.5 Biokompatibilität von eADF4(C16) Filmen – in vitro Zellkulturexperimente ...... 136 4.6 Eigenschaften und Potential der untersuchten Spinnenseidenfilme im Vergleich zu B. mori Seidenfibroin-Filmen bzw. anderen Materialien ................................... 140 5 Zusammenfassung ................................................................................... 145 6 Summary .................................................................................................. 149 7 Literatur ................................................................................................... 151 8 Abkürzungen ........................................................................................... 169 9 Publikationen ........................................................................................... 171 10 Anhang ..................................................................................................... 173 10.1 Spannung bei schrittweiser Dehnung von eADF4(C16)-Filmen ............................. 173 10.2 REM Aufnahmen der Filmoberfläche ...................................................................... 174 10.3 Massenspektren ........................................................................................................... 176 10.4 Vektorkarten ............................................................................................................... 178 10.5 Proteinsequenzen ........................................................................................................ 180 10.6 Hydropathizitätsblot ................................................................................................... 181 Einleitung 6 MD Simulationen des mechanischen Verhaltens von Vimentin unter Zugbelastung zeigen in Übereinstimmung mit experimentellen Daten drei Abschnitte (Kreplak et al., 2008; Qin et al., 2009a; Qin et al., 2009b). Extern angelegte Zugkraft führt zunächst zur Ausrichtung und Dehnung der coiled-coil Segmente, wobei ein linearer Kraftanstieg beobachtet wird. Die superhelikale Quartärstruktur ermöglicht dabei eine Dehnung um fast das doppelte als bei einer einzelnen α-Helix (Qin et al., 2009a). Anschließend erfolgt durch Aufbrechen von intrahelikalen Wasserstoffbrücken (meist in Clustern von 3-4) eine schrittweise Entfaltung der α-helikalen Segmente, wodurch Energie dissipiert wird (Ackbarow et al., 2007). Die Streckung der Helixwindungen ist hierbei die Grundlage für die beobachtete Dehnbarkeit auf über 100 %. Im Fall von Vimentin und Keratin konnte gezeigt werden, dass die mechanisch induzierte Entfaltung superhelikaler Bereiche zur anschließenden Ausbildung von intermolekularen β-Faltblättern führt, was einen entscheidenden Gewinn an Festigkeit im Vergleich zu isolierten α-Helices darstellt (Qin et al., 2009a; Fudge et al., 2003; Kreplak et al., 2004). Bei weiterer Dehnung schließlich gleiten die zu Tetrameren angeordneten Dimere aneinander bevor das Material versagt (Qin et al., 2009a). 1.1.2.3 β-Faltblatt-reiche Proteine Fasern aus Strukturproteinen mit hohem β-Faltblatt-Anteil zeichnen sich durch außergewöhnlich hohe Zugfestigkeit und einen hohen E-Modul sowie Stabilität gegenüber Umweltfaktoren aus, besitzen dafür aber nur begrenzte Dehnbarkeit (Smith et al., 2006; Smith, 2010; Keten & Buehler, 2008a). Beispiele hierfür sind Amyloid(-ähnliche) Proteinfasern, im Muskel vorkommende Titinfasern oder Seidenfäden. Bemerkenswert ist dabei, dass die Festigkeit dieser Fasern die von Stahl erreichen kann (Smith et al., 2006), obwohl die Molekülinteraktion auf Wasserstoffbrücken beruht, einer mit etwa 8-20 kJ/mol (Sheu et al., 2003; Xu & Buehler, 2010) per se schwachen, nicht-kovalenten Bindung. Einen wichtigen Beitrag liefert allerdings die Anisotropie des Materials (Brockwell et al., 2003): Die zur Entfaltung eines antiparallelen Faltblatts aus zehn Alaninresten benötigte Kraft variiert um eine Zehnerpotenz zwischen longitudinaler und orthogonaler Belastung (Rohs et al., 1999). Die außergewöhnlichste Kombination von mechanischen Eigenschaften weisen Seidenfasern, und insbesondere der von einigen Spinnen produzierte Abseilfaden (dragline Seide), auf (Tabelle 1.2). Die Fäden sind einerseits sehr zugfest, dabei jedoch noch bis zu etwa 30 % dehnbar, wodurch eine Zähigkeit erreicht wird, welche die von technischen Hochleistungsfasern wie Kevlar sogar übertrifft (Gosline et al., 1999). Einleitung 7 Tabelle 1.2: Vergleich mechanischer Eigenschaften ausgewählter Materialien (nach Gosline et al., 1999). LF: relative Luftfeuchtigkeit Material Dichte Zugfestigkeit E-Modul (Steifigkeit) Dehnbarkeit Zähigkeit g/cm3 GPa GPa % MJ/m3 Abseilfaden (A. diadematus) 1,3 1,1 10 27 160 Kokon-Seide (B. mori) 1,3 0,6 7 18 70 Elastin 1,3 0,002 0,001 150 1,6 Wolle (bei 100 % LF) 1,3 0,2 0,5 50 60 Kollagen 1,3 0,15 1,5 12 7,5 Kevlar 49 1,4 3,6 130 2,7 50 Hochfester Stahl 7,8 1,5 200 0,8 6 Carbonfaser 1,8 4 300 1,3 25 Im Vergleich zu anderen β-Faltblatt-reichen Proteinfasern weisen Seiden einige Besonderheiten auf. Zum einen sind die β-Faltblatt-Bereiche hier in eine flexiblere „amorphe“ Matrix eingebettet (s. Kapitel 1.2.1, Abb. 1.3), zum anderen unterliegt ihre Assemblierung einem komplexen Spinnvorgang. 1.2 Spinnenseide Als Seiden werden generell Proteine mit hochrepetitiver Aminosäuresequenz (reich an Glycin, Alanin und Serin) bezeichnet, welche in flüssiger Form gespeichert werden und durch Extrudieren oder Verspinnen, d. h. unter Aufwenden von Scherkräften, zu Fasern assemblieren (Craig, 1997). Seidenproteine werden von verschiedenen Klassen der Arthropoda (Gliederfüßer) produziert (Craig, 1997). Am umfassendsten charakterisiert wurden bisher zwei Seidenarten: 1. Die Seide des Maulbeerspinners B. mori, welche aus einer schweren (Mw ~390 kDa) und einer leichten Kette (Mw ~26 kDa) des Seidenfibroins sowie dem Protein P25 (Mw 25 kDa) zusammengesetzt ist (Vepari, 2007; Inoue et al., 2000). Der daraus gebildete Doppelfaden ist zudem von einer Hülle aus Serin-reichen Proteinen, den Sericinen, umgeben (Inoue et al., 2000; Shao & Vollrath, 2002; Takasu et al., 2002). 2. Der Abseilfaden (dragline Seide) von Radnetz-bildenden Spinnen. Neben seiner Rolle als Abseilund Rettungsfaden dient er zur Fertigung der Rahmenkonstruktion sowie der Speichen eines Radnetzes (Vollrath, 2000). Entsprechend seiner Funktion weist er die größte mechanische Belastbarkeit (Zähigkeit) unter den bekannten Seidentypen auf. Einleitung 8 1.2.1 Aufbau und Struktur von dragline Seide Ein dragline-Seidenfaden zeigt einen hierarchischen Aufbau (Abb. 1.3) (Heim et al., 2010). Makroskopisch lässt sich eine Hülle und ein Kernbereich unterscheiden (Frische et al., 1998; Li et al., 1994), wobei die Hülle aus einer Lipidschicht, Glykoproteinen sowie der in der kleinen Ampullendrüse (minor ampullate) gebildeten Seide besteht. Diese Hülle bietet Schutz gegen Austrocknung sowie gegen Befall mit Mikroorganismen (Liu et al., 2005; Sponner et al., 2007). Im Kernbereich finden sich – vergleichbar zu anderen Strukturproteinen – Fibrillen, die entlang der Faserrichtung ausgerichtet sind und aus mindestens zwei Proteinen bestehen (Augsten et al., 2000; van Beek et al., 2002). Typischerweise werden Spinnenseidenproteine als Spidroine (abgekürzt durch Sp) bezeichnet, wobei sich der Name von der Drüse ableitet, in der sie gebildet werden. Die beiden Proteine der dragline Seide, welche in der großen Ampullendrüse (major ampullate gland) gebildet werden, werden daher MaSp1 und MaSp2 genannt. Beide Proteinklassen unterscheiden sich in ihrer Hydrophobizität sowie ihrem Prolin-Gehalt. Gemäß der Einteilung bezüglich des Prolin-Gehalts stellen die entsprechenden Proteine der Europäischen Gartenkreuzspinne Araneus diadematus (hier ADF3 und ADF4 genannt, entsprechend A. diadematus Fibroin) mit etwa 16 % Prolin beide MaSp-2 ähnliche Vertreter dar (Gatesy et al., 2001; Guerette et al., 1996). Allerdings weisen sie Unterschiede in ihrer Hydrophobizität auf (Huemmerich et al., 2004b). Möglicherweise stellen weitere Proteine, wie etwa das bislang der Kokonseide von A. diadematus zugeordnete ADF2, ein MaSp1-Homolog dar (Hayashi et al., 1999). Neben diesen Unterschieden weisen MaSp1 und MaSp2 charakteristische Gemeinsamkeiten auf. Ihr Molekulargewicht liegt bei etwa 250-350 kDa (Hinman & Lewis, 1992; Ayoub et al., 2007), sie bestehen zu über 50 % aus den Aminosäuren Glycin und Alanin und sie zeigen den Aufbau eines Multiblock-Copolymers (Heim et al., 2009; Humenik et al., 2011; Hayashi et al., 1999). Dabei wird eine hochrepetitive Kernregion von kurzen, 100-140 Aminosäuren umfassenden, nicht-repetitiven Termini flankiert, welche hochkonserviert sind (Rising et al., 2006; Eisoldt et al., 2011; Challis et al., 2006; Motriuk-Smith et al., 2005). Die 3D-Struktur dieser Termini wurde kürzlich aufgeklärt (Hagn et al., 2010; Askarieh et al., 2010; Hagn et al., 2011). Bei beiden Termini handelt es sich um globuläre Domänen, bestehend aus fünf α-Helices. Beide terminalen Domänen können dimerisieren, wobei die carboxyterminale Domäne zusätzlich durch Ausbildung einer intermolekularen Disulfidbrücke stabilisiert wird (Eisoldt et al., 2011; Huemmerich et al., 2004a). Die repetitive Kerndomäne setzt sich aus kurzen Modulen von etwa 20-40 Aminosäuren zusammen, welche sich bis zu hundert Mal wiederholen können (Ayoub et al., 2007; Hinman Einleitung 9 & Lewis, 1992; Guerette et al., 1996). Die darin wiederkehrenden Konsensusmotive umfassen Alanin-reiche Regionen (meist Polyalanin (An mit n=4-12), seltener in Kombination mit Glycin (GA)n), sowie die Motive GGX (mit X=Y,L,Q) und GPGXX (mit X=Q,G,Y) (Hayashi et al., 1999; Gosline et al., 1999). NMRund Röntgenbeugungsanalysen ergaben, dass die Polyalanin-Sequenzen bevorzugt β-Faltblatt-Struktur bilden, die sich teilweise zu hochgeordneten Nanokristallen aus antiparallel angeordneten β-Strängen zusammenlagern (Riekel et al., 1999; Parkhe et al., 1997; Simmons et al., 1994; Simmons et al., 1996; Kummerlen et al., 1996; Grubb & Jelinski, 1997). Das GPGXX-Motiv hingegen bildet vermutlich β-Schleifen, welche sich – ähnlich wie für Elastin angenommen – zu Spiralen anordnen (Hayashi & Lewis, 2001; Hayashi et al., 1999). Die Struktur des Motivs GGX ist nicht eindeutig geklärt. Aufgrund von NMR-Studien wird jedoch von weniger geordneten, helikalen Strukturen ausgegangen, wie etwa 31-Helices (Strukturen mit drei Aminosäuren pro Windung, welche keine intra-molekularen H-Brücken ausbilden, wie etwa Polyprolin IIoder Polyglycin II-Helices) (Jenkins et al., 2010; Holland et al., 2008a; van Beek et al., 2002). Abb. 1.3: Hierarchischer Aufbau eines dragline Seidenfadens. (a) Dragline Seide dient als Abseilfaden sowie zur Konstruktion von Rahmen und Speichen eines Radnetzes. Makroskopisch gliedert sie sich in eine Hülle, bestehend aus Lipiden, Glykoproteinen und Seidenproteinen der kleinen Ampullendrüse (minor ampullate Spidroin, MiSp), sowie den Kernbereich. Dieser zeigt Fibrillen, welche aus (mindestens) zwei Proteinen der großen Ampullendrüse (MaSp1 und MaSp2) aufgebaut sind. Auf mikroskopischer Ebene finden sich Nanokristalle aus dicht gepackten β-Faltblättern, die in einer Matrix aus flexibleren Strukturen eingebettet sind. (b) Schematische Darstellung des modularen Aufbaus von MaSp1 bzw. MaSp2. Eine hochrepetitive Kerndomäne wird an beiden Termini von nicht-repetitiven Domänen (NRN und NRC) flankiert. Die Kerndomäne umfasst bis zu 100-fach auftretende Wiederholungseinheiten, welche wiederum aus kurzen Aminosäurenmotiven zusammengesetzt sind. Einzelnen Motiven konnten bestimmte Sekundärstrukuren zugeordnet werden (s. Text). Einleitung 10 1.2.2 Hierarchischer Aufbau als Grundlage mechanischer Eigenschaften Im Seidenfaden liegen die hochgeordneten, kristallinen Bereiche aus dicht gepackten βFaltblatt-Strukturen in einer Matrix aus weniger orientierten, lose verschränkten/verwobenen Proteinketten vor (Abb. 1.3) (van Beek et al., 2002; Termonia, 1994). Diese Anordnung liefert einen wichtigen Beitrag zum außergewöhnlichen mechanischen Verhalten der Seidenfasern. Röntgenbeugungsanalysen ergaben eine Größe der Kristalle von etwa 2 x 5 x 7 nm (Riekel et al., 1999; Grubb & Jelinski, 1997). Ihr Anteil am Gesamtvolumen des Fadens beträgt 15-35 % (Grubb & Jelinski, 1997; Jenkins et al., 2010; Lefevre et al., 2007b). Wie bei anderen semikristallinen Materialien wirken die starren Kristalle als physikalische Quervernetzung, was dem Faden mechanische Stabilität verleiht (Xiao et al., 2009; Rief et al., 1997; Eom et al., 2003; Buehler & Yung, 2009). Der Grad der Steifigkeit (E-Modul) variiert dabei in Abhängigkeit des Anteils kristalliner Strukturen sowie deren Ausrichtung (Du et al., 2006; Rousseau et al., 2007; Sinsawat et al., 2002; Teulé et al., 2011). Auch für andere βFaltblatt-reiche Proteine (z. B. Titin) wurde beschrieben, dass intermolekulare β-FaltblattRegionen den Zusammenhalt zwischen verschiedenen Molekülketten vermitteln, diese verstärken und bei Beanspruchung zur Verteilung der Kraft führen (Keten et al., 2010; Rief et al., 1997). Der Zusammenhalt innerhalb der Faltblätter ist dabei durch Wasserstoffbrücken gegeben. MD Simulationen ergaben, dass unter homogener Scherbelastung bis zu vier Wasserstoffbrücken kooperativ aufbrechen, was zu dem Schluss führte, dass dies der maximalen Stabilität eines β-Faltblatts entspricht und ein Zugewinn an (Zug-)Festigkeit nicht durch längere β-Stränge, sondern eher durch Kombination vieler kurzer β-Faltblatt-Bereiche erreicht werden kann (Keten et al., 2010; Keten & Buehler, 2008a). Somit bietet die Anordnung vieler räumlich begrenzter β-Faltblatt-Strukturen innerhalb des Seidenfadens die Voraussetzung für hohe Reißfestigkeit. Zudem erlaubt die dreidimensionale Anordnung der Kristalle eine wesentlich bessere Dissipation von Energie als beispielsweise amyloide Strukturen, da die Ableitung in den Kristallen in transversaler Richtung erfolgen kann (Xu & Buehler, 2010). Einen weiteren entscheidenden Beitrag zu den mechanischen Eigenschaften, welche neben einer hohen Festigkeit auch eine gute Dehnbarkeit beinhalten (Tabelle 1.2), liefert die Matrix aus ungeordneten Strukturen, Helices und β-Spiralen. Wie bereits für Elastin beschrieben, verleihen letztere hohe Elastizität (Hayashi & Lewis, 2001). Auch 31-Helices gelten als flexible Strukturen, die jedoch gleichzeitig eine vergleichsweise höhere Stabilität als rein amorphe Ketten bieten (Jelinski et al., 1999; Kushner & Guan, 2011). Zum Verständnis der Eigenschaften der amorphen Matrix wurden basierend auf dem sog. worm-like chain-Modell, Einleitung 11 welches zur Beschreibung isotroper, flexibler Moleküle angewendet wird, Simulationen durchgeführt. Mit diesem Modell konnte teilweise gute Übereinstimmung des mechanischen Verhaltens mit experimentellen Daten erreicht werden, jedoch nur in einem begrenzten Kraftbereich. Dies wurde dadurch erklärt, dass bei höherer angelegter Kraft H-Brücken aufbrechen, was in dem verwendeten Modell nicht berücksichtigt wird (Keten & Buehler, 2008b). Verschiedene Studien zeigten, dass die Matrix Bereiche unterschiedlicher Orientierung aufweist und teilweise über H-Brücken quervernetzt ist (van Beek et al., 2002; Jelinski et al., 1999). Daraus leitet sich ein Dreiphasen-Modell der hierarchischen Zusammensetzung von dragline Seide ab, welches neben den hoch-orientierten β-Faltblatt-Kristallen eine relativ ungeordnete Matrix sowie teilweise orientierte Polypeptidketten umfasst (van Beek et al., 2002; Simmons et al., 1996; Papadopoulos et al., 2009b). Aus detaillierten, zeitaufgelösten FTIR-Analysen wurde zudem abgeleitet, dass einige der Ketten (entsprechend einer Gauss-Verteilung) unter Vorspannung stehen (Papadopoulos et al., 2009b; Ene et al., 2009). 1.2.3 Fadenassemblierung – der natürliche Spinnprozess Die Proteine der dragline Seide (MaSp) werden in der großen Ampullendrüse von hochspezialisierten Epithelzellen gebildet und mit Hilfe von Vesikeln in das Lumen der Drüse sekretiert (Plazaola & Candelas, 1991). Eine entsprechende Sekretionssequenz konnte in den aminoterminalen nicht-repetitiven Domänen nachgewiesen werden (Rising et al., 2006). Im Lumen werden die Proteine als hoch viskose Spinnlösung mit Proteinkonzentrationen von bis zu 50 % (w/v) gespeichert, bevor sie bei Bedarf durch einen S-förmigen Spinnkanal zum Ausgang des Spinnapparates, der Spinnwarze, gelangen (Hijirida et al., 1996; Vollrath & Knight, 2001). Im Verlauf der drei Abschnitte des Kanals erfolgt durch Zusammenwirken verschiedener physikalischer und chemischer Trigger der Übergang von einer hoch konzentrierten Lösung in einen festen Faden (Abb. 1.4) (zusammengefasst in Heim et al., 2009; Humenik et al., 2011). Untersuchungen der Sekundärstruktur der MaSp in der Drüse ergaben random coilsowie dynamische helikale Konformationen, darunter Polyprolin II-Helix-ähnliche Strukturen (Lefevre et al., 2007a). Letztere zeigen die Eigenschaft, dass sie die Löslichkeit der Proteine durch extensive Ausbildung von Wasserstoffbrücken zu umgebenden Lösungsmittelmolekülen erhöhen (Hijirida et al., 1996). Zum anderen ermöglichen die dabei eingenommenen Diederwinkel eine energetisch günsti ge Umlagerung in β-Faltblatt-Strukturen (Blanch et al., 2004), welche einen großen Anteil der Struktur (etwa 50 %) im fertigen Faden darstellen (Simmons et al., 1996) . Einleitung 12 Es wird vermutet, dass sich die MaSp aufgrund ihrer amphiphilen Eigenschaften in der Drüse Mizellen-artig arrangieren (Jin & Kaplan, 2003). Dies wird gestützt durch die Beobachtung tröpfchenförmiger Strukturen in der Drüse (Knight & Vollrath, 1999) sowie durch in vitro Untersuchungen an rekombinanten, von MaSp abgeleiteten Proteinen (Rammensee et al., 2008; Exler et al., 2007; Hagn et al., 2010). Wie auch für andere Biopolymere bei entsprechend hohen Konzentrationen wurden der Spinnlösung Eigenschaften flüssig-kristalliner Systeme zugeschrieben (Vollrath & Knight, 2001; Willcox et al., 1996; Knight & Vollrath, 2002). Dazu gehört die Fließfähigkeit der Lösung, welche durch erleichterten Transport entlang der Fließrichtung innerhalb des Spinnkanals gekennzeichnet ist. Gleichzeitig weist der Flüssigkeitsfilm eine erhöhte Stabilität auf, die ein Reißen des Stromes verhindert. Durch die Geometrie des sich stetig verjüngenden Spinnapparats wird bis zum Erreichen des letzten Abschnitts ein gleichmäßiger Elongationsfluss erzeugt, welcher die Ausrichtung der Moleküle unterstützt (Knight et al., 2000; Lefevre et al., 2008; Knight & Vollrath, 1999). Abb. 1.4: Schematische Darstellung des Spinnprozesses zur Herstellung eines Spinnenseidenfadens (Abseilfaden). Die Spidroine werden in das Lumen der großen Ampullendrüse sezerniert und dort als hochkonzentrierte Spinnlösung gespeichert. Durch verschiedene physiko-chemische Parameter entsteht innerhalb des Spinnkanals bis zum Austritt an der Spinnwarze ein fester Faden. (nach Spiess et al., 2010a, mit Genehmigung des Verlags John Wiley & Sons) Im Verlauf des Kanals wird durch verschiedene Faktoren eine Phasenseparation induziert, welche schlussendlich zur Bildung eines festen Fadens führt. Ein Faktor ist dabei der kontrollierte Austausch von Natriumund Chlorid-Ionen gegen kosmotropere Kaliumund Phosphat-Ionen, wodurch hydrophobe Wechselwirkungen verstärkt werden können (Knight & Vollrath, 2001). Einen weiteren Beitrag stellt die Ansäuerung des Milieus mit Hilfe von Protonenpumpen dar, was vermutlich intermolekulare Interaktionen durch Protonierung negativ geladener Aminosäure-Seitenketten erleichtert (Chen et al., 2002; Dicko et al., 2004). Zusätzlich treten durch eine veränderte Geometrie des Spinnkanals (Knight & Vollrath, 1999) Scherkräfte auf, welche die Ausbildung von Protein-Protein-Kontakten und intermolekularen, dicht gepackten β-Faltblatt-Bereichen fördern (Chen et al., 2002; Knight et al., 2000). Einleitung 13 Vervollständigt wird der Spinnprozess durch Wasserentzug. Dieser erfolgt aktiv durch Epithelzellen im finalen Teil des Spinnkanals, sowie passiv durch Abstreifen am Ausgang und letztendlich Trocknung des Fadens an Luft (Vollrath & Knight, 2001). Eine wichtige Rolle bei der gerichteten Assemblierung fällt dabei den nicht-repetitiven Termini zu. Dies wurde vorab vermutet (Ittah et al., 2007), jedoch erst kürzlich anhand verkürzter, rekombinant hergestellter Proteine sowohl für den Aminoals auch für den Carboxyterminus gezeigt (Askarieh et al., 2010; Landreh et al., 2010; Eisoldt et al., 2010; Hagn et al., 2010; Hagn et al., 2011). Die lange repetitive Sequenz der Proteine erschwert deren Sequenzierung, so dass die komplette Sequenz der Aminotermini nur für einige Spinnenarten bekannt ist. Aufgrund der beobachteten hohen Konservierung der bisher bekannten Sequenzen zwischen verschiedenen Spinnenund Seidenarten ist es jedoch wahrscheinlich, dass sich die Funktionen bei unterschiedlichen Arten entsprechen (Rising et al., 2006). Einerseits stabilisieren beide Termini die Proteine bei den in der Drüse vorliegenden Bedingungen in Lösung und verhindern so unerwünschte Aggregation. Andererseits ermöglichen sie durch definierte Dimerisierungsoberflächen die gerichtete Anordnung der Proteine (Hagn et al., 2010). Aggregationsanalyse rekombinanter Seidenproteine mit bzw. ohne den Carboxy-Terminus ergab, dass nur bei Anwesenheit des Terminus Fibrillen gebildet werden, während sonst amorphe Aggregate auftraten (Hagn et al., 2010). Beide Termini reagierten zudem sensitiv auf die physiko-chemischen Änderungen während des Spinnprozesses. So wird der Carboxy-Terminus unter Scherkräften und bei sinkender Salzkonzentration (NaCl) destabilisiert (Eisoldt et al., 2010; Hagn et al., 2010). Vermutlich werden dadurch hydrophobe Aminosäureseitenketten exponiert und molekulare Umlagerungen erleichtert, wodurch innerhalb der repetitiven Kerndomäne β-Faltblätter ausgebildet werden können. Zudem führt das Absenken des pH-Wertes (auf den beobachteten Wert von 6,3) zur Dimerisierung der aminoterminalen Domäne, welche bei dem neutralen pH (6,9) im Lumen der Spinndrüse monomer vorliegt (Askarieh et al., 2010; Hagn et al., 2011). Während für den Carboxy-Terminus eine parallele Ausrichtung des Dimers beschrieben wurde (Hagn et al., 2010), erfolgt die Dimerisierung der aminoterminalen Domäne in antiparalleler Ausrichtung (Askarieh et al., 2010). Dies gilt als Voraussetzung zur Ausbildung gerichteter, höhermolekularer Oligomere. Der Spinnprozess stellt einen entscheidenden Faktor für die Eigenschaften des gebildeten Fadens dar. So variieren die mechanischen Eigenschaften beispielsweise mit der Geschwindigkeit, mit der der Faden gezogen wird (Rousseau et al., 2007). Ein als Rettungsleine im Einleitung 14 freien Fall oder bei vertikalem Abstieg gebildeter Faden ist zugfester als ein zum Netzbau verwendeter Faden (Perez-Rigueiro et al., 2005). Auf molekularer Ebene wurden Unterschiede in der Größe und Ausdehnung der vorhandenen kristallinen β-Faltblätter sowie in deren Ausrichtung entlang der Fadenachse beobachtet (Riekel et al., 2000). Zusätzlich beeinflussen passive Parameter, wie die Umgebungstemperatur, Luftfeuchtigkeit oder Ernährung, die Qualität des Fadens (Madsen et al., 1999; Vollrath & Porter, 2006). Ausreichend hohe Luftfeuchtigkeit oder der Kontakt des Fadens mit Wasser führt zu einer für Seiden typischen Reaktion, der Superkontraktion (Perez-Rigueiro et al., 2003; Shao et al., 1999; Liu et al., 2005). Hierbei kommt es zu einer deutlichen Verkürzung des Fadens, die bei dragline Seide am stärksten ausgeprägt ist und bis zu 50 % erreichen kann. Gleichzeitig steigt der Fadendurchmesser. Der zugrundeliegende Mechanismus beruht auf Wechselwirkung der Wassermoleküle mit der intermolekularen Vernetzung der Seidenproteine in den amorphen Bereichen, wodurch deren Vernetzung und Vorspannung gelöst wird und so entropisch getriebene Umlagerungen ermöglicht werden (Ene et al., 2009; Ene et al., 2011; Liu et al., 2005). Dies wurde v. a. auf Prolin-reiche Kettenabschnitte zurückgeführt, da eine direkte Korrelation zwischen Prolin-Gehalt und Superkontraktionsverhalten bei unterschiedlichen Spinnen-und Seidentypen festgestellt wurde (Liu et al., 2008; Savage & Gosline, 2008b; Savage & Gosline, 2008a). Diese Bereiche würden von einem metastabilen, teilweise geordneten Zustand in ungeordnetere Konformationen übergehen. Als weiterer Faktor wurden kürzlich molekulare Relaxationsvorgänge beschrieben, welche durch erhöhten Wassergehalt induziert wurden und einem Glasübergang entsprechen (Guan et al., 2011). Molekulare Grundlage sind hier vermutlich GGX-reiche Motive. Die dicht gepackten β-Faltblatt-Kristalle hingegen werden von den eingetretenen Wassermolekülen weitestgehend nicht beeinflusst (Holland et al., 2008b; Ene et al., 2010; Holland et al., 2004). 1.3 Rekombinante Spinnenseidenproteine Im Gegensatz zur Seide des Maulbeerspinners B. mori, dessen Kokonseide durch Haltung der Raupen auf riesigen Farmen gewonnen wird, gestaltet sich die Gewinnung von Spinnenseiden in großem Maßstab schwierig. Die meisten Spinnen sind aufgrund ihres territorialen und kannibalischen Verhaltens nicht zur Züchtung geeignet (Fox, 1975). Zudem müsste der Faden entweder aus Netzen gesammelt werden, die aber unterschiedlichste Zusammensetzung an Seiden aufweisen, oder durch direktes Melken der Spinnen gewonnen werden, was in großem Maßstab nicht zu realisieren ist. Einleitung 15 Daher wurden verschiedene Ansätze entwickelt, um die gewünschten Spinnenseidenproteine rekombinant herzustellen (Vendrely & Scheibel, 2007; Heim et al., 2009; Rising et al., 2010). Die natürlichen Gene – oder Teile davon – wurden in unterschiedlichen Wirtsorganismen, wie E. coli, Tabakpflanzen, Insektenzellen oder Säugetier-Zelllinien exprimiert. Eukaryotische Systeme galten aufgrund der anspruchsvollen Molekülgröße, der repetitiven Zusammensetzung sowie der verwendeten Codons der kodierenden Gene als vielversprechender (Rising et al., 2010). Als dem natürlichen System ähnlichste Variante wurden transgene B. mori hergestellt, deren Kokons neben Seidenfibroin auch Spinnenseidenproteine (MaSp1) enthielten (Wen et al., 2010). Eine erfolgreiche Produktion in einem prokaryotischen System (E. coli) gelang vor kurzem durch Co-Expression bestimmter tRNAs, welche aufgrund des ungewöhnlich hohen Glycinund Alanin-Anteils einen limitierenden Faktor darstellen (Xia et al., 2010). Weitaus mehr Strategien befassen sich jedoch mit der Herstellung neuer, von den bekannten Proteinen abgeleiteter Proteine. Aufgrund des repetitiven Aufbaus aus kurzen, sich wiederholenden Aminosäuremotiven kann dafür ein modularer Ansatz verfolgt werden (Rising et al., 2010; Vendrely & Scheibel, 2007; Teule et al., 2009). Durch reverse Translation wird das gewünschte Motiv unter Berücksichtigung der codon usage des jeweiligen Expressionssystems in eine Oligonukleotidsequenz übersetzt, welche synthetisch hergestellt wird. Durch Kombination unterschiedlicher Sequenzmotive und gezielte Multimerisierung können hierdurch unterschiedliche Gene und somit Proteine generiert werden, die entweder direkt bestimmten Abschnitten der natürlichen Proteine entsprechen oder aber völlig neue Kombinationen enthalten. Das in dieser Arbeit verwendete Spinnenseidenprotein eADF4(C16) (engineered ADF4) wurde mittels solcher Strategie entwickelt und kann in E. coli in hoher Ausbeute produziert und anschließend daraus gereinigt werden (Huemmerich et al., 2004a). Es stellt eine rekombinante Variante der repetitiven Konsensussequenz des dragline Seidenproteins ADF4 dar. Das 35 Aminosäuren umfassende Konsensusmotiv wurde als Modul C bezeichnet, welches in eADF4(C16) 16-fach wiederholt wird. Somit entspricht es einer verkürzten Variante (Mw 47,7 kDa) von ADF4 ohne nicht-repetitive Termini (Abb. 1.5) (Huemmerich et al., 2004a). Material und Methoden 23 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Oligonukleotide, Peptide und Linker 2.1.1.1 Oligonukleotide In dieser Arbeit wurden synthetische Oligonukleotide (hergestellt von MWG-Biotech AG, Ebersberg) verwendet, die sowohl als Matrizen zum Assemblieren eines DNA-Doppelstrangs (ntagCys-fwd, ntagCys-rev) als auch in der Polymerasekettenreaktion (pCSmut-fwd, pCS-CS25Crev) eingesetzt wurden. Für die Sequenzierung wurden Standardprimer eingesetzt (GATC, Konstanz). Oligonukleotid Basensequenz (5`→3`) Bemerkung ntagCys-fwd GATC CATG GGT TGC GGT GGC TCT GGT GGT GGC GGG TCC GGA GGC GGT GGC TAA TGA A codiert für AS-Sequenz MGCGGSGGGGSGGGG (ntagCys): ntagCys-rev AGCTT TCA TTA GCC ACC GCC TCC GGA CCC GCC ACC ACC AGA GCC ACC GCA ACC CATG pCSmut-fwd CACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGA erzeugt Modul C* (mit S25C) pCS-CS25C-rev CTCTTAAGCTTTCATTAGCCTGGACCACCTGGACCG TAGCCGCCCGGGCCGCAAGGACCCTGG 2.1.1.2 Peptide und Linker Name Beschreibung Quelle c(RGDfK) (s. Abb. 3.23) Die Aminosäurereste sind durch den Einbuchstabencode dargestellt, wobei Großbuchstaben Lund Kleinbuchstaben D-Aminosäuren kennzeichnen (Kantlehner, Schaffner et al., 2000). Zusätzlich wurde über den Linker SMCC eine Maleimid-Funktionalität angebracht. Zur Detektion wurde zusätzlich Fluorescein angefügt. AG Prof. Kessler, TU München (Dr. Monica Lopez) SMCC Succinimidyl trans-4-(maleimidylmethyl)cyclohexan-1-carboxylat Invitrogen GmbH, Darmstadt, Deutschland NHS-PEO12Maleimide Heterobiunktioneller Crosslinker, Spacer-Länge: 5,34 nm Pierce, IL, USA 2.1.2 Plasmide Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Vektor pAZL in Kombination mit dem von D. Hümmerich etablierten Klonierungssystem verwendet (Huemmerich et al., 2004a). Als Ausgangsvektor wurde dabei pAZL-C eingesetzt, welcher bereits die für ein C-Modul kodierende Gensequenz enthält. Zur Genexpression wurden die Vektoren pET21a sowie pET29a verwendet, je nach gewünschter Resistenz gegenüber Ampicillin (AmpR) bzw. Material und Methoden 24 Kanamycin (KanR). Eine Subklonierung in pET29a erfolgte ausgehend von pET21a, so dass alle in dieser Arbeit erzeugten Konstrukte einen aminoterminalen T7-tag trugen. pAZL-C pFastbac1 mit zusätzlicher Klonierungskassette und einem C-Modul (Huemmerich et al., 2004a) pET21a AmpR, T7, His-Tag (N), T7-Tag (N), f1 ori, lacI Novagen, Madison, WI, USA pET29a KanR, T7, His-Tag (C), S·Tag (N), f1 ori, lacI Novagen, Madison, WI, USA 2.1.3 Organismen 2.1.3.1 Bakterien Zur Klonierung und Vermehrung von Plasmid-DNA wurde der Bakterienstamm Escherichia coli DH10B verwendet, zur Proteinproduktion der Stamm HMS174(DE3). E. coli DH10B FmcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZΔM15 lacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(araleu) 7697 galU galK rpsL nupG λtonA Invitrogen GmbH, Darmstadt, Deutschland E. coli HMS174(DE3) FrecA1 hsdR(rK12mK12+) (DE3) (Rif R) Novagen, Madison, WI, USA 2.1.3.2 eukaryotische Zelllinie MC3T3-E1 (DSMZ: ACC 210) Murine fibroblastenartige Zellen (aus der Calvaria einer C57BL/6 Maus (Embryo)) Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Deutschland 2.1.4 Enzyme und Antikörper Restriktionsenzyme NEB, Frankfurt a. M., Deutschland T4 DNA Ligase Promega, Madison, WI, USA Lysozym AppliChem, Darmstadt, Deutschland SAM (S-Adenosylmethionin) NEB, Frankfurt a. M., Deutschland Humanes Serum Albumin (HSA) Sigma-Aldrich, Seelze, Deutschland shrimp alkaline phosphatase, SAP Roche, Mannheim, Deutschland α-T7-tag Antikörper (monoklonal, Maus) Novagen, Madison, WI, USA α-Maus-IgG-HRP (horseradish peroxidase) Konjugat (Ziege) Sigma, St. Louis, MO, USA Streptavidin-AP (Alkalische Phosphatase) Konjugat Sigma, St. Louis, MO, USA 2.1.5 Größenstandards und Kits Precision Plus Protein Standards Dual Color BioRad, München, Deutschland ColorPlus Prestained Protein Marker (7-175 kDa) NEB, Frankfurt a. M., Deutschland DNA-Längenstandard (1 kb Ladder) NEB, Frankfurt a. M., Deutschland DNA-Längenstandard (100 bp Ladder) NEB, Frankfurt a. M., Deutschland Material und Methoden 25 Wizard Plus SV Miniprep DNA Purification System Promega, Madison, WI, USA Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Promega, Madison, WI, USA ECL-Western Blot Detektionssystem Amersham Biosciences,Piscataway, NJ, USA 2.1.6 Chemikalien und Biochemikalien Substanz Firma 1,1,1,3,3,3 Hexafluor-2-Propanol (HFIP) Merck, Darmstadt, Deutschland 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol (TRIS) Roth, Karlsruhe,Deutschland 2-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt, Deutschland Acrylamidlösung Rothiphorese Gel 40 Roth, Karlsruhe, Deutschland Ammoniumperoxodisulfat (APS), p. a Roth, Karlsruhe, Deutschland Ampicillin Natriumsalz, >99 % Roth, Karlsruhe, Deutschland Brillant Blau G 250 Roth, Karlsruhe, Deutschland di-Kaliumhydrogenphosphat Roth, Karlsruhe, Deutschland Dulbecco’s Modified Eagle Medium Biochrom, Berlin, Deutschland Dulbecco’s Phosphate Buf fered Saline Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Einfriermedium Gibco/Invitrogen, Darmstadt, Deutschland Ethanol VWR, Darmstadt, Deutschland Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Merck, Darmstadt, Deutschland Fötales Kälberserum Biochrom, Berlin, Deutschland Fluorescein 5-Maleimid Pierce/Thermo Scientific, Rockford, IL, USA Formaldehyd, 37 %, p. a. Roth, Karlsruhe, Deutschland Glycin Roth, Karlsruhe, Deutschland Glyzerin Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland GoldenhanceTM-EM Nanoprobes, Yaphank, NY, USA Guanidiniumthiocyanat Merck, Darmstadt, Deutschland HCl Roth, Karlsruhe, Deutschland Humanes Serum Albumin (HSA) Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Kanamycinsulfat Roth, Karlsruhe, Deutschland Kaliumdihydrogenphosphat Roth, Karlsruhe, Deutschland L-Lysin Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Maleimid PEO2-Biotin Pierce/Thermo Scientific, Rockford, IL, USA Methanol Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Monomaleimido Nanogold Nanoprobes, Yaphank, NY, USA N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N'-2ethansulfonsäure (HEPES) Roth, Karlsruhe, Deutschland N,N,N´,N´- Tetramethylethylendiamin (TEMED) Roth, Karlsruhe, Deutschland Natriumchlorid Merck, Darmstadt, Deutschland Natriumdodecylsulfat (SDS), > 85 % Merck, Darmstadt, Deutschland Penicillin (10000 U/ml) /Streptomycin (10 mg/ml)–Lösung Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Trifluoressigsäure (TFA) Roth, Karlsruhe, Deutschland Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochlorid (TCEP-HCl) Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Trypsin-EDTA (0,05 %) Invitrogen, Darmstadt, Deutschland Tween 20, molecular biology grade Merck, Darmstadt, Deutschland WST-1 (water soluble tetrazonium) Roche, Mannheim, Deutschland Material und Methoden 26 Weitere verwendete Chemikalien stammen, falls nicht anders vermerkt, von der Firma Merck in Darmstadt oder Firma Roth in Karlsruhe und hatten den Reinheitsgrad p.a.. Alle Lösungen und Puffer wurden mit ultrareinem Wasser aus einer Milli-Q-Anlage von Millipore (Billerica, MA, USA), hergestellt. 2.1.7 Sonstige Materialien/Verbrauchsmaterialien Aluminiumoxid-Tiegelchen für TGA Mettler Toledo, Gießen, Deutschland Aluminiumtiegel für DSC Mettler Toledo, Gießen, Deutschland Neubauer Zählkammer Lo Laboroptik, Friedrichsdorf, Deutschland Petrischalen Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Multiwell-Platten (96-well, 24-well) - NunclonTM Nunc, Roskilde, Dänemark Multiwell-Platten (96-well, 24-well) – für Suspensionszellen Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Zellkulturflaschen Corning Lifesciences, NY, USA Quarzglas Suparasil Küvetten (unterschiedliche Ausführungen) Hellma, Mühlheim, Deutschland Gelfiltrationssäule Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare, München, Deutschland Membranfilter (0, 22 μm und 0,45 μm) Roth, Karlsruhe, Deutschland Membranfilter (0,1 µm) Millipore, Billerica, MA, USA Micro Cantilever OMCL – AC 160 TS-W2 Olympus, Tokyo, Japan Leitsilber Plano, Wetzlar, Deutschland Plastik Modellbaukleber UHU GmbH & Co. KG, Bühl, Deutschland REM-Probenhalter Agar Scientific Ltd., Essex, UK TEM-Netzchen (grids, vergoldet, 400 mesh) Plano, Wetzlar, Deutschland Thermanox® plastic cover slips Nalge Nunc Int., Rochester, NY, USA SERVAGel™ T G 4-20 SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland 2.1.8 Geräte und technische Hilfsmittel Gerät Modell Firma Absorptionsspektrophotometer Cary 50 Bio Varian, Darmstadt, Deutschland Blotapparatur Fastblot B44 Biometra, Göttingen, Deutschland Brechungsindexdetektor RI-71 Shodex, Tokyo, Japan Brutschrank Heracell 150i Thermo Scientific, Waltham, MA, USA WB 560 K mytron Biound Solartechnik GmbH, Heilbad Heiligenstadt, Deutschland CD-Spektrometer J-715 Jasco, Tokyo, Japan Dynamisch mechanische Analyse TA DMA 2980 TA Instruments, Newcastle, DE, USA Fed-Batch Reaktor Minifors Infors HT, Bottmingen, Schweiz Fluoreszenz-Imager Ettan DIGE GE Healthcare, München, Deutschland Fluoreszenzspektrometer FP-6500 Jasco, Essex, UK FTIR-Spektrometer FTS6000 Detektor: MCT Mikroskop: UMA 500 Filter: ZnSe-Polarisationsfilter (motorbetrieben) Klimakammer: ZnSe-Fenster, Temperaturund RF-Kontrolle Kraftsensor: Burster 8411-10 Varian, Darmstadt, Deutschland Burster, Gernsbach, Deutschland Material und Methoden 27 FTIR-Spektrometer Tensor 27 IR-Spektrometer Detektor: MCT Messeinheit: MIRacle Germanium-ATR-Kristall Bruker, Rheinstetten, Deutschland Geldokumentation GelDoc XR‐System BioRad, München, Deutschland Hochdruckhomogenisator M‐110S Niro Soavi, Lübeck, Deutschland HPLC System Series 1100 (Pumpe, Entgaser, UV-Detektor, Probengeber, Temperiereinheit) Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA HPLC System PU 2080Plus UV 2075Plus FP 2020Plus Jasco, Tokyo, Japan Kalorimeter (DSC) SDTA 821e System Mettler Toledo, Gießen, Deutschland Klimakammer Eigenbau (Gregor Lang) Luftbefeuchter Modell 5462 Universität Bayreuth, Deutschland ets®, Glenside, PA, USA Konfokales Laser-ScanningMikroskop LSM 710 Zeiss, Jena, Dutschland Kontaktwinkelmessung OCA System Dataphysics Intruments GmbH, Filderstadt Deutschland Lichtmikroskop DMIL LED mit DFC 295 Farbkamera Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland Lichtstreudetektor DAWN EOS (statische LS) QELS (dynamische LS) Wyatt Technology Europe, Dernbach, Deutschland Lyophylle Alpha 1-2 LD plus Christ, Osterode, Deutschland Massenspektrometer Bruker Reflex III Bruker, Bremen, Deutschland Ofen Heraeus Function Line UT 20 Thermo Scientific Inc., Waltham, MA, USA pH Meter Lab 860 Schott AG, Mainz, Deutschland Platereader Mithras LB 940 Berthold Technologies, Sprendlingen, Deutschland Rasterelektronenmikroskop 1540EsB Cross Beam Zeiss, Oberkochen, Deutschland Rasterkraftmikroskop DimensionTM 3100 ausgestattet mit Nanoscope IV SPM Controller Veeco Instruments Inc., Plainview, NY, USA Sterilwerkbank HERAsafe KS Thermo Scientific, Waltham, MA, USA Thermocycler Primus MWG Biotech AG, Ebersberg, Deutschland Thermogravimeter (TGA) SDTA 861e Mettler Toledo, Gießen, Deutschland Thermomixer Thermo Compact/comfort Eppendorf, Hamburg, Deutschland Transmissionselektronenmikroskop 100 CX Jeol, Tokyo, Japan Überkopfschüttler Heidolph, Schwabach, Deutschland Ultrzentrifuge Optima MAX-XP Rotor: TLA-55 Beckmann Coulter Inc., Brea, CA, USA Waagen CPA 225D (Feinwaage) Acculab ALC‐3100.2 Acculab ALC-4100.1 Sartorius, Göttingen, Deutschland Zentrifugen Heraeus primo R Heraeus Fresco 17 Heraeus Pico 17 Sorvall RC 6 plus Optima MAX-XP Thermo Scientific, Waltham, MA, USA Beckman-Coulter, Brea, CA, USA Zugmaschine Universal Tester 5565 Instron, Norwood, MA, USA Material und Methoden 28 2.1.9 Computerprogramme Astra 5.3.4.14 Wyatt Technology Europe, Dernbach, Deutschland ExPASy - SIB Bioinformatics Resource Portal http://expasy.org/ GENtle Magnus Manske, Köln, Deutschland Nanoscope 6.14r1 Veeco Instruments Inc. N.Y., USA Opus 6.5 Bruker Optics Corp., Billerica, MA, USA OriginPro 8.1G OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA Swiss-PdB-Viewer Deep View v 4.0.4 Swiss institute of bioinformatics, http://www.expasy.org/spdbv, (Guex & Peitsch, 1997) Advantage Universal Analysis v5.4 TA Instruments, Newcastle, DE, USA Vector NTI Advance 10 Invitrogen, Carlsbad, CA, USA 2.2 Molekularbiologische Methoden 2.2.1 Anzucht von Eschericia coli Ausstrichkulturen von E. coli auf LB-Agarplatten wurden über Nacht (ÜN) bei 37 °C oder 2-3 Tage bei RT inkubiert. Zum Animpfen von Flüssigkulturen wurden Einzelkolonien verwendet, bei Volumina größer als 50 ml dienten entsprechende Vorkulturen zur Inokulation. Sowohl den Agarplatten als auch dem Flüssigmedium wurden entsprechende Antibiotika zur Selektion des jeweiligen Plasmids zugesetzt. Volumina bis zu 4 ml wurden im Reagenzglasroller inkubiert, Kulturen über 10 ml im Umluftschüttelinkubator. Das Wachstum der Bakterien wurde photometrisch über die optische Dichte der Kultur bei 600 nm (OD600) verfolgt. Nach (Sambrook & Russell, 2001) ergeben etwa 8 x 108 Zellen pro ml eine OD600 von 1. Zur langfristigen Lagerung von Bakterienstämmen wurden 700 µl einer sich in der exponentiellen Wachstumsphase befindlichen Bakterienkultur mit 300 µl Glycerin (50 %) versetzt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert. LB0‐Medium: 10 5 5 g/l g/l g/l Bacto Trypton Hefeextrakt NaCl für LB0‐Platten: Zugabe von 15 g/l Bacto‐Agar Antibiotikum: 100 35 μg/ml μg/ml Ampicillin (Amp) Kanamycin (Kana) 2.2.2 Präparation, Reinigung und Sequenzierung von Plasmid-DNA Zur Isolierung und Reinigung von Plasmid-DNA aus E. coli wurde der Wizard Plus SV Miniprep Kit laut Herstellerangaben verwendet, welcher auf dem Prinzip der alkalischen Lyse und selektiver Adsorption von DNA verschiedener Größe beruht. Die Reinigung von DNAFragmenten aus Agarosegelen sowie die Reinigung von PCR-Amplifikaten erfolgte mittels Wizard SV Gel and PCR clean-up System nach Angaben des Herstellers. Material und Methoden 29 Die Sequenzierung der erhaltenen Plasmide wurde durch die Firma GATC Biotech (Konstanz, Deutschland) durchgeführt. Wenn möglich, wurden dazu Standardprimer von GATC Biotech verwendet, sonst wurden entsprechende Primer bereitgestellt. 2.2.3 Transformation chemisch kompetenter E. coli Zur Transformation wurden 50-100 µl chemisch kompetenter Zellen (nach Maniatis et al., 1982) mit 1 µl Plasmid-DNA bzw. 20 µl Ligationsansatz vermischt. Nach 15-minütiger Inkubation auf Eis folgte ein einminütiger Hitzeschritt bei 42 °C. Anschließend wurde der Ansatz kurz auf Eis abgekühlt, mit 200-500 µl LB0 versetzt, und 1 h bei 37 °C inkubiert. Im Anschluss wurde die Bakteriensuspension auf entsprechenden Selektionsplatten ausgestrichen und ÜN bei 37 °C kultiviert. Die Transformation erfolgte dabei für die Vervielfältigung von Plasmid-DNA in den Klonierungsstamm DH10B bzw. zur Expression in HMS174(DE3). 2.2.4 Agarose-Gelelektrophorese Zur Analyse bzw. anschließender Präparation wurden DNA-Proben einer AgaroseGelelektrophorese unterzogen. Die Auftrennung verschiedener Fragmente erfolgt dabei in Abhängigkeit der Länge des Fragments, der Form der DNA, der Porengröße des Gels, sowie der angelegten Spannung. Ein gleichzeitig aufgetragener DNA-Größenstandard, bestehend aus doppelsträngigen linearen DNA-Fragmenten definierter Länge, ermöglicht die Abschätzung der Größe der untersuchten Probe. Zur Herstellung 1-2 %-iger (w/v) Agarosegele wurde die entsprechende Menge Agarose in TAE-Puffer durch Aufkochen gelöst. Vor dem Gießen des Gels wurde der auf etwa 60 °C abgekühlten Agaroselösung 0,04 % (v/v) Ethidiumbromid bzw. 0,01 % (v/v) SybrSafe zugesetzt. Beide Agenzien ermöglichen eine Detektion der aufgetrennten DNA-Banden mittels Anregung mit UV-Licht (Anregung: 302 nm, Emmission: > 500 nm). Die DNA-Proben wurden vor dem Auftrag mit 10x Auftragspuffer versetzt, die Auftrennung erfolgte bei 120 V für 30-45 min. Für präparative Ansätze erfolgte eine anschließende Reinigung des DNA-Fragments mittels Wizard SV Gel and PCR clean-up System (s. 2.2.2) 50 x TAE: 2 M 50 mM Tris/Acetat, pH 8,0 EDTA 10 x Auftragspuffer: 50 % (v/v) 10 mM 0,2 % (w/v) 0,2 % (w/v) Glycerin EDTA Bromphenolblau Xylencyanol Material und Methoden 30 2.2.5 Hybridisierung synthetischer Oligonukleotide Um kurze, doppelsträngige DNA-Fragmente zu erhalten, wurden zwei komplementäre, synthetisch hergestellte Oligonukleotide hybridisiert. Eine Lösung mit 50 pmol/µl je Oligonukleotid in 10 mM Tris pH 8,5 wurde 5 min bei 95 °C inkubiert. Anschließend wurde mit einer Rate von 0,1 °C/s auf 20 °C abgekühlt. Zur Optimierung der Hybridisierung wurden eventuell fehlgepaarte Doppelstränge für 1 min bei 70 °C denaturiert. Die Lösung wurde wie oben beschrieben abgekühlt. Dieser Zyklus erfolgte je zehnmal bei einer Temperatur von 70 °C, 65 °C sowie 60 °C. 2.2.6 Amplifikation von DNA mittels PCR Die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) ermöglicht die Amplifikation einer doppelsträngigen DNA-Matrize durch eine thermostabile DNAPolymerase. Ein zugegebenes spezifisches Primerpaar definiert dabei den zu amplifizierenden Abschnitt und stellt mit den 3`OH-Enden die Startpunkte für die Anheftung der Desoxynukleotide dar. In dieser Arbeit wurde durch Verwendung des Primerpaares pCSCS25C-rev (63 Basen) und pCSmut-fwd (28 Basen) die Mutation S25C in der für das Modul C kodierenden Sequenz erzeugt. Als Matrize diente das Plasmid pAZL-C, welches die für ein C-Modul kodierende DNA-Sequenz trägt. Um die Ausbildung stabiler Sekundärstrukturen des langen Primers pCS-CS25C-rev zu minimieren, wurden zudem einige stille Mutationen im Bereich der Primersequenz erzeugt. Der verwendete Reaktionsansatz sowie das Denaturierung, Primer-Anlagerung sowie DNA-Synthese umfassende Amplifikationsprogramm sind im Folgenden zusammengefasst. Reaktionsansatz: template DNA 100 ng dNTP-Mix (10 mM/Base) 2 µl Vorwärtsprimer (100 pmol/µl) 1 µl Rückwärtsprimer (100 pmol/µl) 1 µl Reaktionspuffer (10 x, inkl. 2 mM MgCl2) 5 µl Pwo-Polymerase (2,5 U/µl) 0,5 µl H2O ad 50 µl Material und Methoden 31 Temperaturprogramm: Temperatur Zeit Zyklen Vorgang 95 °C 5 min 1 initiale Denaturierung 95 °C 30 s Denaturierung 65 °C 45 s 35 Primer-Anlagerung 72 °C 70 s Elongation 72 °C 7 min 1 verlängerte Extension 4 °C gehalten Lagerung 2.2.7 Enzymatische Modifikation von DNA 2.2.7.1 Spaltung mittels Restriktionsendonukleasen Mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen kann DNA sequenzspezifisch an Restriktionsschnittstellen gespalten werden. Der Verdau erfolgte mit vom Enzymhersteller angegebenen Reaktionspuffer und Enzymkonzentration standardmäßig in einem 50 µl-Ansatz. Die Inkubationsdauer richtete sich dabei nach dem jeweiligen Enzym bzw. Ansatz und variierte von 1 h bis ÜN. Verdau-Ansätze mit mehreren Enzymen wurden bei gleichen Reaktionsbedingungen simultan durchgeführt, ansonsten erfolgten sie sequentiell. 2.2.7.2 Dephosphorylierung der 5`-Enden der Vektoren Um während der sich anschließenden Ligation eine Religation der Vektorenden nach einem Restriktionsverdau zu verhindern, wurden die freien 5`-Enden mittels alkalischen Phosphatase aus Garnelen (shrimp alkaline phosphatase, SAP) nach Herstellerangaben dephosphoryliert. 2.2.7.3 Ligation Ligation von DNA-Fragmenten ermöglicht die kovalente Verknüpfung freier 5`-Phosphatenden mit 3`OH-Enden. Dazu wurden ca. 100 ng Vektor-DNA in einem 20 µlAnsatz eingesetzt. Die Menge des zugegebenen Inserts variierte je nach Größe von 1-10 x molarem Überschuss. Standardmäßig wurden Ligationen mit der T4-Ligase für 15 min bei RT in Quick Ligation Buffer durchgeführt. Anschließend erfolgte die Transformation chemisch kompetenter E. coli-Zellen (DH10B). Quick Ligation Buffer (2x) 132 mM Tris-HCl, pH 7,6 20 mM MgCl2 2 mM DTT 15 % PEG 6000 2 mM ATP (frisch zusetzen) Material und Methoden 38 2.3.4.1 Statische Lichtstreuung Statische Lichtstreuung ermöglicht die Bestimmung der absoluten molaren Masse und des absoluten mittleren quadratischen Radius (Trägheitsradius) ohne den Einsatz von Standards (Zimm, 1948a). Die Menge des Streulichtes, oder genauer das Rayleigh-Verhältnis Rθ (für θ → 0) ist dabei proportional dem Produkt aus molarer Masse und Konzentration. (Gl. 2-1) mit Iθ: Streulichtintensität bei Winkel θ IθLS: Streulichtintensität des Lösungsmittels bei Winkel θ I0: Intensität des eingestrahlten Lichts r: Abstand zwischen Streuzentrum und Detektor V: Volumen der Messzelle MW: molare Masse Die Bestimmung der molaren Masse erfolgt nach der Zimm-Gleichung des Rayleigh-DebeyeGans-Modells der Lichtstreuung verdünnter Polymerlösungen (Zimm, 1948b): (Gl. 2-2) mit K = 4π2(dn/dc)2n02NA-1λ0-4 (n0: Brechungsindex des Lösungsmittels, NA: Avogadro-Konstante, λ: Wellenlänge des eingestrahlten Lichts) c: Konzentration des Polymers (g/ml) : Rayleigh-Verhältnis MW: molare Masse A2: zweiter Virialkoeffizient : Formfaktor (s. unten) Aus der Winkelabhängigkeit der Lichtstreuung lässt sich zudem ein Formfaktor oder Streufunktion P(θ) bestimmen (Abb. 2.1). Aus dieser wird der mittlere quadratische Radius berechnet, welcher durch Gleichung (2-3) beschrieben wird. Eine Winkelabhängigkeit der Streuung tritt allerdings nur bei sog. anisotropen Streuern, d. h. erst ab einer bestimmten Partikelgröße, auf. Die Grenze ist dabei abhängig von der verwendeten Wellenlänge und liegt bei dem hier verwendeten Laser (λ = 690 nm) bei etwa 10 nm. Abb. 2.1: Streufunktion P(θ) der Winkelabhängigkeit der Streulichtintensität von dem absoluten mittleren quadratischen Radius <rg2>. ∑ (Gl. 2-3) Material und Methoden 39 Die benötigte Proteinkonzentration wurde mit Hilfe des angeschlossenen UV-Detektors bzw. Refraktometers unter Verwendung der jeweiligen theoretischen molaren Extinktionskoeffizienten (s. 2.5.1) bzw. des Brechungsindex-Inkrements (dn/dc) ermittelt. Als üblicher Wert von Proteinen in wässriger Lösung wurde ein dn/dc von 0,185 angenommen. 2.3.4.2 Dynamische Lichtstreuung Im Gegensatz zur statischen Lichtstreuung wird durch dynamische oder quasi-elastische Lichtstreuung der hydrodynamische Radius von Molekülen ermittelt. Dies beruht auf der Messung der Bewegung der Teilchen im Rahmen der Braunschen Molekularbewegung. Abhängig von der Diffusionsgeschwindigkeit der Teilchen werden Interferenzen, und damit Unterschiede in der Intensität des Streulichts, erzeugt. Daraus lässt sich unter Kenntnis der Viskosität des Lösungsmittels der hydrodynamische Radius bestimmen (Stokes-EinsteinGleichung). (Gl. 2-4) mit k: Boltzmann-Konstante T: absolute Temperatur η: Viskosität der Lösung D: Diffusionskoeffizient 2.3.5 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist ein FlüssigchromatographieVerfahren, bei der eine mobile Phase unter hohem Druck über die stationäre Phase transportiert wird. Die Trennung erfolgt durch die Verteilung der Analyten zwischen mobiler und stationärer Phase. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Umkehrphasenchromatographie durchgeführt, d. h. es wurde eine unpolare Säulenmatrix, sowie eine polare mobile Phase verwendet. Durch Gradientenelution mit steigendem Gehalt an organischem Lösungsmittel werden die Wechselwirkungen der Probe mit dem Säulenmaterial geschwächt und die Probe bei Überschreiten einer kritischen Konzentration von der Matrix abgelöst. Die Messung erfolgte an einem JASCO HPLC System (PU 2080Plus, UV Detektor UV 2075Plus und Fluoreszenzdetektor FP 2020Plus) mit einer Phenomenex Säule (Jupiter 5u C-4 300A, 250x4.6 mm). Eluiert wurde mit einer Flussrate von 1 ml/min für 5min mit 2 % Puffer B, gefolgt von einem linearen Gradienten von 2-50 % Puffer B über 20 min. Die Detektion erfolgte mittels Absorptionsmessung bei 280 nm, sowie Messung der Fluoreszenz (Fluorescein-markierter Proteine) bei einer Anregungswellenlänge von 490 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 nm. PufferA: 0,1 % (v/v) Trifluoressigsäure in H2O Puffer B: 0,1 % (v/v) Trifluoressigsäure in 90 % Acetonitril Material und Methoden 40 2.3.6 MALDI-TOF Massenspektrometrie Zur massenspektroskopischen Analyse von Proteinen eignet sich das MALDI-TOF Verfahren. Es setzt sich zusammen aus der Ionisierungart MALDI (matrix-assisted laser desorption and ionization) und der Massenanalyse mittels time-of-flight (TOF). Die Proteine werden dabei in eine Matrix eingebettet. Durch Anregung mit Laserstrahlung (verwendet wurde ein Stickstoff-Laser mit einer Wellenlänge von 337 nm, Beschleunigungsspannung 20 kV) erfolgt ein Phasenübergang, bei dem Moleküle der Matrix, sowie des darin eingebetteten Proteins explosionsartig herausgelöst werden (Lottspeich & Zorbas, 1998). Durch die in der Matrix vorhandene Säure werden Proteinionen gebildet, welche nach der initialen Beschleunigung in einem elektrischen Feld ohne Anlegen weiterer Kräfte driften. Die Flugzeit der Ionen ist proportional zu dem Quotienten aus Masse/Ladung, was die Bestimmung der Masse der Ionen ermöglicht. Für die Analyse mittels MALDI-TOF wurden die rekombinanten Spinnenseidenproteine gegen 5 mM Tris-HCl pH 8 dialysiert und mit der Matrixlösung (20 mg/ml Sinapinsäure, 50 % Acetonitril, 0,1 % Trifluoressigsäure) vermischt (Endkonzentration des Proteins: 20 µM). 2.4 Proteinpräparative Methoden 2.4.1 Dialyse Da die in dieser Arbeit hergestellten Proteine nach Reinigung und Gefriertrocknung nicht direkt in wässrigen Puffern löslich sind, wurden die Proteine in 6 M Guanidinuimthiocyanat denaturiert und anschließend durch Dialyse in den gewünschten Puffer überführt. Die dazu verwendeten Dialyseschläuche (Spectra/Por, MWCO 6000-8000 Da) wurden in Wasser aufgekocht, in 20 % Ethanol aufbewahrt und vor Benutzung mehrmals mit H2OMQ gespült. Dialysiert wurde gegen 1000-3000-faches Volumen des gewünschten Puffers für 3 h bei RT (wobei der Puffer dreimal erneuert wurde), bzw. ÜN (mit zweimaligem Pufferwechsel). Der letzte Dialyseschritt wurde hier bei 4 °C durchgeführt. Je nach Anwendung wurden verschiedene Puffer verwendet, z. B. 10 mM Tris/HCl pH 8 (für Analysen), 10 mM HEPES pH 7 für Thiol-Kopplung bzw. 5 mM NH4HCO3 zum Gießen von Filmen aus wässriger Lösung. 2.4.2 Reduktion und Carboxymethylierung Zur Reduktion der teilweise Disulfid-verbrückt vorliegenden Cys-Proteine (ntagCysC16, C*C16 und C16C*) wurde sowohl DTT als auch TCEP verwendet. Die optimalen Reaktionsbedingungen wurden empirisch ermittelt, wobei jeweils 10-facher bzw. 100-facher Material und Methoden 41 molaren Überschuss an Reduktionsmittel (in Puffer mit pH 7-8) zugesetzt und für verschiedene Zeit bei RT inkubiert wurde. Der Erfolg der Reduktion wurde mittels SDSPAGE ohne Zusatz von β-Mercaptoethanol überprüft. Um das (Wieder-)Ausbilden von Disulfidbrücken unabhängig vom Redoxpotential der Umgebung zu verhindern, wurden freie Thiolgruppen carboxymethyliert. Hierzu wurde Iodacetamid verwendet (Gurd, 1972). Durch nukleophile Substitution des Iod durch ein Thiolation wird dabei ein Thioether ausgebildet, welcher unter neutralen Bedingungen stabil ist. Nach erfolgter Reduktion (meist für 1 h mit 10x Überschuss an TCEP bzw. 20x Überschuss DTT) wurden 100 mM Iodacetamid zugegeben. Die Reaktion erfolgte für 1 h bei RT. Je nach sich anschließender Anwendung bzw. Analyse wurden die zugesetzten Agenzien gegebenenfalls durch Dialyse entfernt. 2.4.3 Bestimmung freier Thiolgruppen mit Ellmans Reagens (DTNB) Zur Bestimmung freier Thiolgruppen nach Reduktion der Cys-Proteine wurde das Reduktionsmittel durch eine Entsalzungssäule (PD-10, GE Healthcare) entfernt. 750 µl der erhaltenen Proteinlösung (0,75-1 mg/ml in 20 mM HEPES, pH 7) wurden mit 30 µl DTNBLösung (4 mg/ml DTNB (5,5`-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure)) in 100 mM Tris/HCl pH 8, 1 mM EDTA) versetzt und 15 min bei RT inkubiert. Anschließend wurde die Absorption bei 412 nm bestimmt und um den Absorptionswert des Kontrollansatzes ohne Protein (10 mM HEPES pH 7 mit DTNB-Lösung) korrigiert. Die Anzahl freier Thiolgruppen pro Proteinmolekül ergab sich aus Gl. 2-5: (Gl. 2-5) mit c: Proteinkonzentration (mol/l) ε412nm (DTNB-SH): 13 600 M-1 cm-1; ε276nm (ntagCysC16): 47 680 M-1 cm-1 2.4.4 Redoxtitration Mit Hilfe einer Redoxtitration wurde das Redoxpotential der Cystine der Cys-Varianten von eADF4(C16) abgeschätzt. In Anlehnung an das für die Cystine der NR-Regionen von ADF3 und ADF4 entwickelte Protokoll (Huemmerich, 2004) wurde dazu ein auf DTT basierendes Redox-Puffersystem verwendet. Das Standardpotential bei pH 7 (E0‘) lie gt dabei bei -332 mV (Cleland, 1964). In einer zweistufigen Reaktion wird das Cystin (über die Zwischenstufe eines gemischten Disulfids) durch DTT zu 2 Cysteinen reduziert, wobei der zweite Reaktionsschritt mit einer um den Faktor 104 höheren Gleichgewichtskonstante abläuft (Cleland, 1964). Dadurch verläuft die Reduktion quantitativ, was die Auswertung der Redoxtitration erleichtert, da mögliche Zwischenprodukte vernachlässigt werden können. Material und Methoden 42 Die Proteine wurden in einer Konzentration von 0,5 mg/ml in entgasten Lösungen mit verschiedenen Redoxpotentialen für 1 h bei RT inkubiert. Das Potential der Lösung berechnete sich dabei aus dem Mischungsverhältnis von DTTox (trans-4,5-Dihydroxy-1,2dithian) und DTTred (Dithiothreitol) nach der Nernstschen Gleichung (s. unten). Anschließend wurden freie Thiole carboxymethyliert, die Proben mit Hilfe eines 4-20 %-igen Tricine Gels (ServaGelTM) aufgetrennt und die Proteinbanden durch Silberfärbung sichtbar gemacht. Aus der Nernst-Gleichung abgeleitet entspricht das Potential derjenigen Lösung, in der die Proteine zu gleichen Teilen als Monomer und Dimer vorlagen, dem Standard-Redoxpotential ihres Cystins. Nernst-Gleichung: (Gl. 2-6) mit E’: Redoxpotential bei pH 7 E0’: Standardpotential bei pH 7 R: Gaskonstante T: absolute Temperatur n: Anzahl der Elektronen F: Faradaykonstante [red], [ox]: Konz. der reduzierten bzw. oxidierten Spezies Titrierlösung (entgast): 0,5 mg/ml 100 mM 1 mM 20 mM Protein MOPS pH 7 EDTA DTT (oxidiert bzw. reduziert) Tabelle 2.1: Mischungsverhältnisse von von DTTox (trans-4,5-Dihydroxy-1,2-dithian) und DTTred (Dithiothreitol) sowie das daraus resultierende Redoxpotential DTTred DTTox Redoxpotential [V] 0.18 99.82 -0.25 0.39 99.61 -0.26 0.86 99.14 -0.27 1.87 98.13 -0.28 4.04 95.96 -0.29 8.51 91.49 -0.30 17.03 82.97 -0.31 31.18 68.82 -0.32 50.00 50.00 -0.33 68.82 31.18 -0.34 2.4.5 Filmpräparation Proteinfilme wurden durch Gießen einer Proteinlösung auf ein Substrat und anschließendes Abdampfen des Lösungsmittels hergestellt. Bei Wahl geeigneter Parameter entsteht dabei aus rekombinanten Spinnenseidenproteinen ein stabiler, transparenter Film, der, je nach verwendetem Substrat und Filmdicke, von dem Substrat abgezogen werden kann. Die Dicke Material und Methoden 43 des entstehenden Films kann dabei über die verwendete Proteinkonzentration bzw. die Proteinmenge pro Fläche eingestellt werden. In dieser Arbeit wurden Filme aus eADF4(C16) sowie der Cys-Proteine ntagCysC16, C16C* und C*C16 aus Lösungen in HFIP, Ameisensäure und Puffer hergestellt. Die Proteinkonzentration betrug dabei in Puffer 3 mg/ml (0,3 % (w/v)), in den organischen Lösungsmitteln wurde sie je nach Verwendungszweck und Substrat variiert. Zur Herstellung dicker Filme (≥ 1 mg/cm2) wurden 3-4 %-ige (w/v) Lösungen verwendet, für dünne Filme (z. B. 0,15 mg/cm2) 0,3-1 %-ige (w/v) Lösungen. Um eventuell während der Dialyse in wässrigen Puffer entstandene Aggregate aus der Lösung zu entfernen, wurden wässrige Proteinlösungen direkt vor Gießen des Filmes für 1 h bei 10 °C mit 55.000 rpm zentrifugiert. In den organischen Lösungsmitteln waren alle Proteine direkt löslich. Als Substrate kamen Polystyrol – in Form von Petrischalen und Zellkulturplatten – sowie Teflon und Glas zum Einsatz. Um die Bedingungen der Filmherstellung, -trocknung sowie -lagerung möglichst konstant und reproduzierbar zu halten, wurden die Filme in einer Kammer mit kontrollierbarer Luftfeuchtigkeit hergestellt. Soweit nicht anders angegeben, wurde die relative Luftfeuchtigkeit (LF) bei 30 % gehalten. Die Trocknung der Filme erfolgte für mindestens 4 h, meist ÜN. Zur (optionalen) Nachbehandlung wurden die Filme ÜN mit der entsprechenden Lösung (Methanol oder Ethanol abs. bzw. 70 % oder 1 M Kaliumphosphat pH 8) überschichtet und ÜN bei kontrollierter LF inkubiert. Um ein vorzeitiges Verdampfen des Alkohols zu vermeiden, wurden die überschichteten Filme leicht abgedeckt. 2.4.6 Kopplung an Thiole der Cys-Varianten von eADF4(C16) Zur Modifizierung der Cysteine in ntagCysC16, C16C* sowie C*C16 wurden Maleimidfunktionalisierte Agenzien verwendet. Die Reaktion von Maleimid mit Thiolen ist sowohl spezifisch als auch effektiv (Heitz et al., 1968; Partis et al., 1983), wobei die Spezifität der Reaktion pH-Wert abhängig ist. Bei pH 7 beispielsweise ist die Reaktivität gegenüber Thiolen etwa 1000-fach höher als gegenüber primären Aminen (Brewer & Riehm, 1967). Bei Erhöhung des pH-Werts steigt die Nukleophilie des Amins, und die Spezifität der Reaktion für Thiole sinkt dementsprechend. Der Reaktionsmechanismus besteht in einer Addition des Thiols an das α,β-ungesättigte System des Maleimids unter Ausbildung eines stabilen Thioethers (Michael-analoge Addition), wie im Folgenden für die Reaktion von ntagCysC16 mit Fluorescein-5-Maleimid gezeigt ist. Material und Methoden 44 Abb. 2.2: Reaktion von Fluorescein-5-Maleimid mit ntagCysC16 Rekombinante Cys-Proteine wurden sowohl in Lösung als auch nach Assemblierung zu Filmen mittels Reaktion mit Maleimid-Gruppen modifiziert. 2.4.6.1 Kopplung in Lösung In Lösung wurde Fluorescein-5-Maleimid sowie mit SMCC (Succinimidyl trans-4- (maleimidylmethyl)cyclohexan-1-carboxylat und Fluorescein modifiziertes RGD-Peptid c(RGDfK) (Abb. 3.23 a und 2.1.1.2) an ntagCysC16 angefügt. Analog dazu erfolgte die Kopplung des analogen, Fluorescein-freien, zyklischen RGD-Peptids. Nach Dialyse und Reduktion des Proteins (2 mg/ml in 10 mM HEPES pH 7) mit 10-fachem molarem Überschuss an TCEP für 1 h wurde das zu koppelnde Maleimid aus einer 20 mM Stammlösung in DMF in 10-15-fachem molaren Überschuss zugegeben und unter Lichtausschluss für 2 h bei RT inkubiert. Um das (modifizierte) Protein von überschüssigem Maleimid zu trennen, wurde es durch Zugabe von Kaliumphosphat pH 8 (Endkonzentration 1 M) gefällt. Bei dieser quantitativen Fällung bilden eADF4(C16), sowie seine Cys-Varianten β-Faltblatt-reiche, wasserunlösliche Mikrokugeln (Slotta et al., 2008). Diese wurden durch dreimaliges Waschen (Zentrifugation jeweils 15 min bei 13300 rpm) mit H2OMQ von restlichem Reagens abgetrennt. Anschließend konnte das Protein lyophilisiert und gelagert werden oder wurde zur weiteren Analyse in 6 M Guanidinumthiocyanat gelöst und gegen 10 mM Tris/HCl pH 8 dialysiert. Die Kopplungseffizienz wurde aus der Absorption bei 280 nm und 493 nm nach Gleichung 2-7 berechnet: (Gl. 2-7) mit Proteinkonzentration ; Korrekturfaktor ε276nm (ntagCysC16): 47 680 M-1 cm-1; ε493nm (Fluorescein-Maleimid): 70 000 M-1 cm-1 ntagCysC16 Material und Methoden 45 2.4.6.2 Kopplung an assemblierte Filme Zur Modifikation bereits zu Filmen assemblierter Cys-eADF4(C16)-Proteine wurden die Filme standardmäßig aus einer 1 % (w/v) Proteinlösung in HFIP hergestellt. Je nach weiterer Verwendung wurden sie in 24-well Platten (Fläche der Kavität 1,1 cm2, Material: Polystyrol) bzw. 96-well Platten (Fläche 0,33 cm2, Material: Polystyrol) gegossen. Durch Methanol abs.- Behandlung wurden die Filme wasserunlöslich gemacht. Zur Reduktion der Disulfide wurde TCEP-Lösung (4 mM in 100 mM HEPES pH 7) zugegeben. Nach 1,5 h bei RT wurde das zu koppelnde Maleimid-Konjugat aus einer Stammlösung (bei Fluorescein in DMF, ansonsten im jeweiligen Puffer) in die TCEP-Lösung pipettiert (10 x molarer Überschuss) und 2-4 h bei RT oder ÜN bei 4 °C auf einer Schwenkplatte inkubiert. Um ungebundene Agenzien zu entfernen, wurden mehrere Waschschritte durchgeführt (2 x 0,1 M HEPES pH 7, 0,1 % (v/v) Tween 20; 1 x 0,1 M HEPES pH 7; 1 x 0,1 M HEPES pH 7, 1 M NaCl; 2 x 0,1 M HEPES pH 7; 2 x H2OMQ). Durch Tween 20 werden hierbei hydrophobe und durch Natriumchlorid elektrostatische Wechselwirkungen unterbunden. Zur Analyse wurde die erfolgte Kopplung entweder direkt auf den Filmen oder nach Lösen in 6 M Guanidiniumthiocyanat und anschließender Dialyse untersucht. Fluorescein (FloresceinX5-Maleimid sowie Fluorescein-markiertes c(RGDfK)) wurde mittels eines FluoreszenzImagers (Ettan DIGE, GE Healthcare; Anregung: 480 nm, Emission: 530 nm) oder im Fluoreszenzspektrometer (Jasco FP-6500; s. 2.5.2) detektiert. Gebundenes Maleimid-PEO2Biotin wurde sowohl auf dem Film als auch nach Auflösen des Films und Durchführen eines Westernblots über die spezifische Reaktion mit Streptavidin-AP nachgewiesen. Nach Waschen (s. oben) wurde gebundene alkalische Phosphatase (AP) durch Zugabe einer BCIP/NBT-Substratlösung visualisiert, wobei ein bläulich-lila Niederschlag gebildet wird. Kopplung von Nanogold Zur Kopplung von Goldpartikeln (Monomaleimido-Nanogold, Nanoprobes) wurden dünnere Filme aus 5 µl 0,1 % (w/v) Proteinlösung in HFIP direkt auf unbeschichtete TEM-Netzchen (400 mesh, vergoldet, Plano) gegossen. Bei dickerer Proteinschicht konnten die Goldpartikel im TEM aufgrund der hohen Absorption des Proteins nicht selektiv detektiert werden. Die Kopplung erfolgte direkt auf den Netzchen, wobei diese auf Gefäße mit der jeweiligen Inkubationslösung mit der Oberfläche nach unten aufgelegt wurden. Nach Vorbehandlung der Filme wie oben beschrieben erfolgte die Kopplungsreaktion in 2 mM Natriumphosphat pH 6,5, 0,1 mM EDTA, 15 mM NaCl, 1 mM TCEP bei 4 °C. Wiederum wurde gründlich gewaschen, um ungebundenes Nanogold zu entfernen. Immobilisierte Partikel wurden durch Inkubation mit GoldenhanceTM (Nanoprobes) nach Herstellerangaben verstärkt. Je nach Material und Methoden 46 Inkubationsdauer lagert sich dabei eine unterschiedlich dicke Goldschicht spezifisch an den Goldpartikeln ab. Verstärkung für 2 min lieferte beispielsweise Partikel mit 2-5 nm Durchmesser. Die Analyse der modifizierten Filme erfolgte mittels Transmissionselektronenmikroskopie (s. 2.6.3). Kopplung von β-Galaktosidase Das Enzym β-Galaktosidase wurde über einen heterobifunktionellen Crosslinker (NHSPEO12-Maleimid, s. 2.1.1.2) an Spinnenseidenfilme gebunden. N-Hydroxysuccinimid-Ester reagieren unter Freisetzung von N-Hydroxysuccinimid hauptsächlich mit primären Aminen. Dabei bilden sich stabile Amidbindungen aus. Um sterische Hinderungen bei der Kopplung zu minimieren, wurde mit PEO12 ein langer Spacer gewählt. In einem ersten Reaktionsschritt wurde β-Galaktosidase (10 mg/ml in PBS pH 7,5) für 2 h bei 4 °C unter Rotieren mit 2 µl Crosslinker inkubiert. Überschüssiger Linker wurde anschließend mittels einer Entsalzungssäule (Sephadex G25, GE Healthcare) entfernt. Zur Elution des Enzyms wurde 100 mM HEPES pH 7 verwendet. Diese Lösung wurde auf bereits reduzierte Filme gegeben und unter Zusatz von 2 mM TCEP ÜN bei 4 °C geschwenkt. Die nachfolgenden Waschschritte erfolgten analog zu den oben beschriebenen. Um die Enzymaktivität der β-Galaktosidase nachzuweisen, wurde X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indoxylβ-D-galacto-pyranosid) in Inkubationspuffer (s. unten) als Substrat zugegeben. Durch enzymatische Spaltung wird daraus das tiefblaue 5,5‘-Dibrom-4,4‘-dichlor-indigo gebildet. Inkubationspuffer für X-Gal: 100 mM 10 mM 1 mM 50 mM 0,2 mg/ml Natriumphosphat pH 7 KCl MgSO4 β-Mercaptoethanol X-Gal (aus Stammlösung in DMSO) 2.5 Spektroskopische Methoden 2.5.1 UV-Vis Absorptionsspektroskopie Die Methode der UV-Vis-Absorptionsspektroskopie wurde zur Konzentrationsbestimmung der Proteine in Lösung sowie von Fluorescein verwendet. Der Zusammenhang zwischen Konzentration, wellenlängenabhängigem Extinktionskoeffizienten und gemessener Extinktion ist im Lambert-Beerschen Gesetz beschrieben: (Gl. 2-8) mit Eλ: Extinktion bei der Wellenlänge λ ελ: molarer Extinktionskoeffizient bei Wellenlänge λ c: (Protein)-Konzentration (mol/l) d: Schichtdicke der Küvette (cm) Material und Methoden 47 Der Extinktionskoeffizient lässt sich für Proteine aus deren Primärstruktur ermitteln. Den Hauptbeitrag zur Absorption im Proteinspektrum liefern dabei Tryptophan und Tyrosin, sowie in geringerem Ausmaß auch Phenylalanin und Cystin (Cantor & Schimmel, 1980; Pace & Schmid, 1997). Für die verwendeten rekombinanten Spinnenseidenproteine wurde der Extinktionskoeffizient basierend auf der Methode nach Gill und Hippel bzw. Pace et al. mit Hilfe des Programms ProtParam (http://www.expasy.org/tools/protparam.html) nach folgender Formel bestimmt (Gill & von Hippel, 1989) (Pace et al., 1995): (Gl. 2-9) Tabelle 2.2: Extinktionskoeffizienten der in der Arbeit verwendeten rekombinanten Spinnenseidenproteine Protein Molarer Extinktionskoeffizient (M-1 cm-1) eADF4(C16) ε276nm = 46400 ntagCysC16 ε276nm = 47680 C*C16, C16C* ε276nm = 50680 2.5.2 Fluoreszenzspektroskopie Die Fluoreszenzspektroskopie basiert auf der Anregung von Elektronen eines Fluorophors durch Licht bestimmter Wellenlänge und anschließender Emission elektromagnetischer Strahlung bei Rückkehr der angeregten Elektronen in ihren Grundzustand. Dabei ist die emittierte Strahlung energieärmer, d. h. langwelliger, als die des Anregungslichts (StokesVerschiebung). In dieser Arbeit wurde einerseits die auf den aromatischen Aminosäuren Tryptophan und Tyrosin beruhende intrinsische Fluoreszenz von Proteinen zur Abschätzung der Reinheit der rekombinanten Proteine verwendet, da diese kein Tryptophan besitzen. Andererseits wurde die spezifische Fluoreszenz des Farbstoffs Fluorescein eingesetzt, um anhand einer aufgenommenen Standardgeraden die Menge an Fluorescein in einer Probe, und damit die Kopplungseffizienz bei Markierung der Cys-Proteine, zu bestimmen. Die Parameter der Anregung und Emissionsaufnahme wurden wie folgt gewählt: Detektion von Anregungswellenlänge Aufnahme der Emission Tyr/Trp 275 nm 290-400 nm Trp 295 nm 310-400 nm Fluorescein 492 nm 500-550 nm Die Anregungsbandbreite betrug 3 nm, die Emissionsbandbreite 5 nm, und die Dämpfung 0,5 s. Alle Spektren wurden um die Pufferfluoreszenz korrigiert. Material und Methoden 54 Zur 3D-Darstellung der Aufnahmen sowie zur Ermittlung der mittleren Rauheit Ra und der Rautiefe wurde die Software Nanoscope 6.14r1 (Veeco Instruments Inc.) verwendet. Pro Film wurden mehrere Scans mit Flächen zwischen 1 µm2 und 1600 µm2 an 3-5 zufällig gewählten, unterschiedlichen Stellen aufgenommen. Zur Bestimmung der Rauheitswerte wurden mehrere Ausschnitte (mit 1 bzw. 25 µm2) gemittelt. Die mittlere Rauheit Ra entspricht dabei dem arithmetischen Mittel der Abweichung jedes einzelnen Messpunktes von der Mittellinie, während die Rautiefe den maximalen Abstand zwischen höchsten und niedrigsten Punkt der untersuchten Fläche angibt. 2.6.3 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Zur Detektion gekoppelter Nanogold-Partikel auf Spinnenseidenfilmen wurden diese wie unter 2.4.6.2 beschrieben auf Goldnetzchen („grids“, 400 mesh, Plano) präpariert und mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) analysiert. Dabei wird die Probe von Elektronen durchstrahlt und auf einem Leuchtschirm bzw. Film abgebildet. Die Messungen erfolgten an einem 100 CX Transmissionselektronenmikroskop (Jeol) bei einer Anodenspannung von 100 kV und wurden freundlicherweise von Bettina Richter (AG Prof. Johannes Buchner, Lehrstuhl für Biotechnologie, TU München) durchgeführt. 2.6.4 Rasterelektronenmikroskopie (REM) Mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) kann ein plastisches Abbild einer Probenoberfläche über einen weiten Vergrößerungsbereich mit hoher Tiefenschärfe und erhalten werden. Das Messprinzip beruht auf einem fein gebündelten Elektronenstrahl, der Zeile für Zeile über die Oberfläche einer Probe geführt wird und im Hochvakuum mit dieser wechselwirkt. Dabei können verschiedene Signale mit unterschiedlichem Informationsgehalt detektiert werden. So liefern Sekundärelektronen, welche durch den auftreffenden Elektronenstrahl aus der Probenoberfläche herausgeschlagen werden, Informationen über die Topographie der untersuchten Oberfläche. Zurückgestreute Elektronen hingegen haben höhere Energie und bilden hauptsächlich Unterschiede der Materialzusammensetzung (hinsichtlich der Ordnungszahlen) ab. Zur Analyse biologischer Proben werden diese durch Aufdampfen (sputtern) einer Schicht aus typischerweise Kohlenstoff, Gold oder Platin leitfähig gemacht. Rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen von mit Gold bedampften Spinnenseidenfilmen (gegossen auf Polystyrol) wurden am Lehrstuhl Metallische Werkstoffe der Universität Bayreuth an einem 1540EsB Cross Beam Rasterelektronenmikroskop (Zeiss) von Claudia Blüm sowie Hendrik Material und Methoden 55 Bargel, beide Lehrstuhl Biomaterialien, Universität Bayreuth, angefertigt. Die Beschleunigungsspannung betrug typischerweise 3-5 kV bei einem Arbeitsabstand von 4-5 mm. Um die Adhäsion und Morphologie von Zellen auf Spinnenseidenfilmen zu untersuchen, mussten die Zellen zunächst fixiert werden. Die Probenpräparation erfolgte in Zusammenarbeit mit Dr. Rainer Detsch am Friedrich-Baur-Forschungsinstitut (FBI) für Biomaterialien der Universität Bayreuth. REM-Aufnahmen wurden freundlicherweise von Dr. Rainer Detsch sowie Andreas Schmidt (Lehrstuhl Biomaterialien, Universität Bayreuth) angefertigt. Nach zweimaligem Waschen in PBS wurden die Proben zunächst in 2,5 % GlutaraldehydLösung in PBS (mehrere Stunden) und anschließend für 1 h in 0,3 % Glutaraldehyd, 0,2 M Natriumcacodylat, 3% Paraformaldehyd fixiert. Nach Dehydrierung der Proben in einer aufsteigenden Aceton-Reihe (30-100 % Aceton) wurden die Proben Kritisch-Punktgetrocknet. Hierbei wird das Aceton schonend durch überkritisches CO2 substituiert (Bozzola & Russell, 1999). Anschließend konnten die Proben mit Kohlenstoff und Gold bedampft und rasterelektronenmikroskopisch (bei Beschleunigungsspannung zwischen 10-15 kV) untersucht werden. 2.7 Materialanalytische Methoden 2.7.1 Thermogravimetrische Analyse (TGA) Um die thermische Beständigkeit der Spinnenseidenfilme zu untersuchen, wurden sie einer thermogravimetrischen Analyse (TGA) unterzogen. Bei dieser Methode wird als Messgröße die Masseänderung der Probe in Abhängigkeit der Temperatur und der Zeit bestimmt (Ehrenstein et al., 1998). Vorgänge wie Verdampfen, Sublimation oder Zersetzung der Probe führen dabei zu einem Gewichtsverlust, wohingegen aus chemischen Reaktionen (Oxidation) oder Adsorption eine Massezunahme resultieren kann. Die Messungen wurden am Lehrstuhl für Polymere Werkstoffe der Universität Bayreuth von Ute Kuhn an einem TGA/SDTA 861e Thermogravimeter (Mettler Toledo) durchgeführt. Die Messgenauigkeit der Mikrowaage liegt hier bei 1 µg. 3-5 mg des jeweiligen unter kontrollierter Luftfeuchtigkeit hergestellten Films wurden in einen Aluminiumoxid-Tiegel eingewogen und anschließend mit einer konstanten Heizrate von 10 °C/min auf 800 °C erhitzt. Um Oxidationsvorgänge zu verhindern und die Vergleichbarkeit der Messung mit DSC-Untersuchungen zu gewährleisten, wurde der Ofen mit Stickstoff gespült (50 ml/min). Das gemessene Gewicht der Proben wurde jeweils relativ zum Ausgangsgewicht in % angegeben. Der Beginn einer Temperaturabnahme wurde durch den Schnittpunkt der jeweiligen Material und Methoden 56 Tangenten bestimmt. Als Temperatur Tm einer Masseabnahme wurde diejenige Temperatur angegeben, bei der 50 % des jeweiligen Gewichtsverlusts auftreten. Die Messungen aller Filme wurden als Duplikat (teilweise als Triplikat) durchgeführt. 2.7.2 Dynamische Differenzkalorimetrie (DSC) Die dynamische Differenzkalorimetrie (differential scanning calorimetry, DSC) dient der Bestimmung der bei Umwandlungsprozessen freiwerdenden oder verbrauchten Energie. Gemessen wird der Wär mestrom , d. h. die Wärmemenge pro Zeiteinheit und Masse, in Abhängigkeit der Temperatur und Zeit (Ehrenstein et al., 1998). Hierzu werden die Probe und eine Referenz auf einer wärmeleitenden Trägerscheibe in einem Ofen erhitzt. Finden in der Probe endotherme bzw. exotherme Prozesse statt, so resultiert dies in einer Differenz der Temperatur bzw. des Wärmestroms gegenüber der Referenz. Zu den endothermen Vorgängen zählen Schmelzund Verdampfungsprozesse sowie Glasübergänge. Letztere erzeugen typischerweise einen endothermen Versatz in der Messkurve. Exotherme Signale hingegen werden beispielsweise durch Kristallisation oder Zersetzung hervorgerufen. Die Messungen wurden an einem DSC/SDTA 821e System (Mettler Toledo), ausgestattet mit einer keramischen Sensorplatte mit 56-fachem Au-AuPd Temperaturfühler, am Lehrstuhl für Polymere Werkstoffe (Universität Bayreuth) von Ute Kuhn durchgeführt. Die Proben wurden in verschließbare Aluminium-Tiegel eingewogen (3-4 mg) und unter Stickstoffatmosphäre (20 ml/min) mit einer Rate von 5 °C/min aufgeheizt. Als Referenz diente ein entsprechender leerer Tiegel. Die Proben wurden entweder kontinuierlich von 20 °C auf 400 °C oder zyklisch erhitzt, um bestimmte Prozesse besser aufzulösen. So wurde zunächst auf 110 °C erhitzt, um freies Lösungsmittel zu verdampfen, und nach 10-minütiger Isotherme auf -40 °C gekühlt. Optional schloss sich daran ein weiterer Heizschritt bis 220 °C an, bevor nach erneutem Abkühlen der Probe auf +20 °C bis auf 400 °C geheizt wurde. Für jede untersuchte Filmvariante wurden 2-3 unabhängige Messungen durchgeführt. Zur Auswertung der erhaltenen Messkurven wurde eine Basislinie subtrahiert. 2.7.3 Zugmessung Zur Bestimmung mechanischer Eigenschaften der Filme wurde Zugversuche durchgeführt. Die Messung erfolgte an Luft, d. h. mit trockenen Filmen, welche unter kontrollierten Bedingungen (30 % relative Luftfeuchtigkeit) hergestellt wurden, bei einer Luftfeuchtigkeit von 41±1 % und 20±1 °C. Die Filme wurden mit einem Skalpell oder einer scharfen Rasierklinge in Streifen von 1,5-2 mm x 20 mm geschnitten. Um Verletzungen der Probe Material und Methoden 57 durch das Einspannen in die Klemmbacken der Zugmaschine zu vermeiden, wurden die Filmstreifen mit Hilfe eines Zweikomponenten-Epoxy-Klebers auf Probenträger aus stabilem Papier befestigt (Abb. 2.4 a). Die Aussparung des Probenträgers betrug 10 mm, was der Anfangsmesslänge entspricht. Für die Messung wurde der Probenhalter in den Klemmbacken eines Universal Tester 5565 (Instron) befestigt, der Papiersteg vorsichtig durchtrennt und anschließend die Probe durch einen Motor mit einer konstanten Geschwindigkeit von 0,2 mm/min auseinander gezogen. Die dabei aufgewendete Kraft wurde mit einer Kraftmessdose mit einer Maximalbelastung von 10 N gemessen, deren Abweichung im relevanten Kraftbereich ≤ 0,2 % betrug. Die gemessene Kraft wurde auf den Querschnitt der jeweiligen Probe bezogen und somit als Spannung gegen die Dehnung (Längenänderung relativ zur Anfangslänge) aufgetragen. Um die dafür benötigte Dicke der Filme zu bestimmen, wurde diese – wie auch die genaue Breite des Streifens – für jede Probe lichtmikroskopisch bestimmt. Die Dicke der Filme variierte v. a. bei Streifen, welche aus dem Randbereich des ursprünglich gegossenen Films stammten, während sie in den übrigen Streifen nur geringe Abweichung zeigte und bei dem Großteil der untersuchten Proben zwischen 10-12 µm lag. Abb. 2.4: Probenpräparation (a) und typisches Spannungs-Dehnungs-Diagramm (b) des Zugversuchs an rekombinanten Spinnenseidenfilmen. E: E-Modul (Steigung im linear-elastischen Bereich). Spannung: Kraft/Querschnittsfläche; Dehnung: Längenänderung/Anfangslänge x 100 Aus den typischerweise erhaltenen Spannungs-Dehnungs-Diagrammen (Abb. 2.4 b) wurde die Zugfestigkeit, d. h. die maximal erreichte Spannung σ, sowie die Bruchdehnung ermittelt. Aus der Steigung im linear-elastischen Bereich wurde der Elastizitätsmodul E=Δσ/Δε berechnet, welcher ein Maß für die Steifigkeit der Probe darstellt. Filme, die bei mikroskopischer Betrachtung vor der Messung Verletzungen aufwiesen oder die während der Messung z. B. an der Klemmbacke rissen, wurden aus der Auswertung ausgenommen, so dass pro Filmtyp (Lösungsmittel, Nachbehandlungsmethode) die Werte aus 10 mm Material und Methoden 58 8-14 Einzelmessungen gemittelt wurden. Im Fall Methanol-behandelter HFIP-Filme lag die Zahl aufgrund der hohen Brüchigkeit nur bei 5 Proben. Die Messungen wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Rainer Giesa (Labor für Polymerverarbeitung, Makromolekulare Chemie I, Universität Bayreuth) durchgeführt. 2.7.4 Dynamisch mechanische Analyse (DMA) Bei der dynamisch mechanischen Analyse (DMA) wird die Probe einer sinusförmigen dynamischen Belastung ausgesetzt, welche in Abhängigkeit der Temperatur, Frequenz und/oder der Zeit beobachtet wird (Ehrenstein et al., 1998). Messgrößen sind dabei die Amplitude der auf gewendeten Kraft und der Verformung sowie die Phasenverschiebung δ beider Schwingungen (Abb. 2.5). Rein elastisches Verhalten, d. h. keine Verschiebung, tritt in der Regel bei Festkörpern auf. Ein Phasenwinkel von π/2 = 90° kennzeichnet rein viskoses Verhalten. Visko-elastische Materialien schließlich zeigen Winkel zwischen beiden Extremen. Aus den Messungen lässt sich der komplexe Modul – bei Zugbelastung der Elastizitätsmodul – bestimmen. Er setzt sich zusammen aus dem Realteil, dem Speichermodul E`, und dem Imaginärteil, dem Verlustmodul E``. Der Speichermodul ist ein Maß für die Steifigkeit bzw. Festigkeit des Materials und entspricht der elastisch gespeicherten Energie. Der Verlustmodul hingegen spiegelt die unwiederbringlich in anderer Form abgegebene Energie, wie z. B. Wärme oder plastische Verformung, wider. Als Maß für das Verhältnis beider Komponenten dient der Verlustfaktor tan δ. Messtechnische Voraussetzung ist dabei, dass die Probe im linear-elastischen Bereich beansprucht wird. Abb. 2.5: (a) Sinusförmige Schwingung (Spannung) und Antwortsignal (Verformung) eines rein elastischen (grau), rein viskosen (rot) bzw. visko-elastischen (grün) Materials. δ: Phasenwinkel. (b) Schematischer Messaufbau der DMA. Filmstreifen wurden in eine Filmzugklammer eingespannt, wobei der untere, bewegliche Teil die Probe mit einer konstanten Amplitude bei vorgegebener Frequenz beansprucht. Der Messaufbau befindet sich in einem Ofen, die Heizrate betrug 2 °C/min. Material und Methoden 59 Zur Analyse wurden die Filme in Streifen mit 1-2 mm Breite geschnitten und in die FilmzugKlammer einer DMA 2980 (TA Instruments) eingespannt (Abb. 2.5 b). Zunächst wurde ein Frequenzdurchlauf (frequency sweep) durchgeführt. Bei Frequenzen < 0,5-1 Hz wurde ein Fließverhalten beobachtet, während sich ab etwa 5 Hz keine signifikanten Änderungen mehr ergaben. Dementsprechend wurden die folgenden temperaturabhängigen Messungen bei 1 und 5 Hz durchgeführt. Um die Filme zu strecken und in geringe Vorspannung zu bringen, wurde eine statische Anfangskraft von 0,5 N angelegt. Die Amplitude der Auslenkung wurde auf 0,08-0,1 % der bestimmten Anfangslänge festgesetzt. Mit Hilfe eines Ofens, welcher den Messaufbau umgab, wurde mit einer konstanten Heizrate von 2 °C/min auf 300 °C geheizt. Für alle Filme erfolgte eine Zwei-bzw. Dreifachbestimmung. Die zur Auswertung benötigte Filmdicke wurde für jeden Streifen individuell bestimmt. Die Messungen erfolgten am Lehrstuhl für Werkstoffverarbeitung der Universität Bayreuth. 2.7.5 Kontaktwinkelanalyse Die Methode der Kontaktwinkelanalyse ermöglicht die Bestimmung der Oberflächenenergie fester Materialien. Um Aussagen über die Hydrophobizität der Filmoberflächen zu treffen, wurde in dieser Arbeit der Benetzungswinkel mit Wasser (liegender Tropfen) gemessen. Hierzu wurde am Ende einer Kanüle, welche senkrecht über der zu untersuchenden Probe angebracht war, ein Tropfen erzeugt. Die Probe wurde mit Hilfe eines Trägertisches nach oben gefahren, um den Tropfen von der Kanüle abzunehmen. Mit einer Kamera wurde das Bild des Tropfens sofort nach dessen Absetzen auf der Oberfläche festgehalten. Die Auswertung des Kontaktwinkels erfolgte nach Setzen einer Basislinie an der Grenzfläche zwischen Tropfen und Oberfläche mittels Laplace-Young-Fit. Als Kontaktwinkel θ wird der Winkel zwischen dem Rand des Meniskus des Tropfens und der Grenzfläche fest-flüssig bezeichnet. Betrachtet wird dabei der Dreiphasenpunkt, in welchem die Phasen gas/flüssig/fest aneinandergrenzen und im Gleichgewicht stehen (Kwok & Neumann, 1999). Die Summe aller angreifenden Kräfte muss an diesem Punkt gleich Null sein und es ergibt sich die Young-Gleichung: (Gl. 2-13) mit σs,g: Oberflächenspannung der festen Phase σl,s: Oberflächenspannung der flüssigen Phase σl,g: Grenzflächenspannung zwischen beiden Phasen Die Messungen erfolgten am Lehrstuhl Physikalische Chemie II der Universität Bayreuth. Material und Methoden 60 Abb. 2.6: Kontaktwinkelanalyse. Foto eines Tropfens H2OMQ auf einem Methanol-behandelten eADF4(C16) Film aus wässriger Lösung gegossen auf verschiedenen Substraten: (a) Glas, (b) Polystyrol. (c) Kontaktwinkel θ und zugehörige Grenzflächenspannungen (s. Gl. 2-13) nach Young (modifiziert nach Velzenberger et al., 2009). 2.8 Zellkulturtechniken Im Rahmen dieser Arbeit wurden Zellen der Linie MC3T3-E1 (s. 2.1.3.2) verwendet. Dabei handelt es sich um murine embryonale Zellen der Schädeldecke, welche fibroblastenartig sind, aber auch zu Osteoblasten differenzieren können. Das Wachstum erfolgt adhärent als Monolage. Alle Zellkulturarbeiten wurden an einer Sicherheitswerkbank (Klasse 2, HeraSafe KS, Thermo Scientific) unter sterilen Bedingungen ausgeführt. Zentrifugationsschritte wurden bei ≤ 1000 rpm und RT durchgeführt, alle verwendeten Lösungen auf 37 °C vorgewärmt. 2.8.1 Auftauen, Kultivierung und Einfrieren von Zellen Die Lagerung der Zellen erfolgte bei -196°C in flüssigem Stickstoff. Aus Kultur kommend, wurden sie nach Zentrifugieren für 5 min zu einer Dichte von 1 x 107/ml in Einfriermedium resuspendiert. Hierzu wurde dem Medium DMEM (Dulbecco’s Minimal Essential Medium) 20 % fötales Kälberserum (FKS) sowie 10 % DMSO zugesetzt, um intrazellulärer Eiskristallbildung entgegenzuwirken. Alternativ wurde ein Fertigprodukt mit ähnlicher Zusammensetzung (Gibco) verwendet. Nach Überführen der resuspendierten Zellen in ein steriles Kryogefäß wurden sie ÜN in einem mit Isopropanol gefüllten Einfriergefäß bei -80 °C gelagert. Der Alkohol gewährleistet dabei eine langsame Abkühlung um 1 °C/min. Anschließend wurden sie in flüssigen Stickstoff überführt. Um bei -196 °C gelagerte Zellen in Kultur zu nehmen, wurden sie im Wasserbad (bei 37 °C) aufgetaut und zügig mit PBS verdünnt, um im Einfriermedium enthaltenes DMSO zu verdünnen. Nach Pelletieren durch 5-10-minütige Zentrifugation wurden die Zellen im Kulturmedium resuspendiert und in Zellkulturflaschen ausgesät (Inhalt eines 1 ml Kryogefäß pro 25 cm2 Wachstumsfläche). Material und Methoden 61 Die Kultivierung der Zellen erfolgte bei 37 °C und 5 % CO2 in gesättigter Wasserdampfatmosphäre. Da es sich um adhärent und in Monolage wachsende Zellen handelt, wurden sie bei Erreichen von 70-90 % Konfluenz passagiert. Nach Entfernen von Serumrückständen durch Waschen mit PBS wurden die Zellen mit einer 0,05 %-igen Trypsin/EDTA-Lösung (Invitrogen) für 2-5 min bei 37 °C abgelöst, die Reaktion durch Zugabe von Kulturmedium (3-5-facher Überschuss) gestoppt, die Zellen nach Zentrifugation auf neue Zellkulturflaschen verteilt und mit frischem Medium aufgefüllt. Gesplittet wurde dabei im Verhältnis 1:3 bis 1:5. Zur Bestimmung der Zellzahl wurde ein Aliquot Zellen mit Trypanblau-Lösung (0,5 % in PBS) versetzt und mit Hilfe einer Neubauer Zählkammer ausgezählt. Kulturmedium: DMEM (Dulbecco’s Minimal Essential Medium) 10 % FKS (fötales Kälberserum) 1 % Penicillin/Streptomycin-Lösung (Endkonzentration 100 U/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin) PBS: DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline) ohne Kalzium und Magnesium 2.8.2 Vitalitäts-Test WST (water soluble tetrazonium)-1 Zur Bestimmung der Vitalität der Zellen nach Aussäen und Kultivierung auf Spinnenseidenfilmen wurde der Vitalitätstest WST-1 (Roche) verwendet. Das Prinzip dabei ist die Umsetzung des Tetrazoniumsalzes WST-1 (4-[3-(4-Iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H5-tetrazolio]-1,3-Benzol-Disulfonat) durch das Enzym mitochondriale Succinat-Tetrazolium Dehydrogenase zu wasserlöslichem Formazan. Dies geht mit einem Farbumschlag der Lösung einher (von rötlich nach orange), der photometrisch durch Messung der Absorption bei 450 nm quantifiziert werden kann. Da das Enzym aus der mitochondrialen Atmungskette stammt, gibt der Test Auskunft über die Mitochondrienaktivität der Zellen, was als ein Maß für deren Vitalität verwendet wird. Die Messung erfolgte in 96-well-Zellkulturplatten. Vor der Analyse wurde das alte Medium vorsichtig abgenommen, 100 µl frisches Medium und 10 µl WST-1 Lösung zugegeben. Nach 3-4 h Inkubation bei 37 °C erfolgte die Absorptionsmessung bei 450 nm mit einem Mithras LB 940 Platereader (Berthold Technologies). Als Referenz wurde der Absorptionswert bei 630 nm abgezogen und alle Werte um die Absorption einer Negativkontrolle korrigiert, welche einen entsprechenden Film, Medium und WST-1 enthielt, jedoch keine Zellen. Alle Messungen wurden in Vierfachbestimmung durchgeführt. 2.8.2.1 Filmpräparation Die zu untersuchenden Filme wurden direkt aus der jeweiligen Lösung (Proteinkonzentration 3 mg/ml; Filme 0,15 mg/cm2) in unbehandelte Zellkulturplatten (für Suspensionszellen, Material und Methoden 62 Sarstedt, Material: Polystyrol) gegossen und nach Trocknung ÜN mit der jeweiligen Lösung nachbehandelt. Bei nachträglicher Kopplung des zyklischen RGD-Peptids c(RGDfK) wurde die Reaktion wie unter 2.4.6.2 beschrieben durchgeführt. Vor Aussäen der Zellen wurden die Filme zweimal mit PBS und einmal mit Zellkulturmedium gewaschen, um Rückstände der Lösungsmittel zu entfernen. 2.8.2.2 Adhäsionstest Zur Bestimmung der Zelladhäsion, welche in den ersten Stunden nach Aussäen stattfindet, wurden 4 x 104 Zellen pro well in 96-well Zellkulturplatten mit dem jeweiligen Film gegeben. Da im Serum enthaltene Komponenten die Adhäsion beeinflussen und so die Aussage über die direkte Interaktion der Zellen mit den Seidenfilmen verfälschen können, wurde der Test in Medium mit bzw. ohne Zusatz von FKS durchgeführt. In diesem Fall wurde dem Medium 1 % HSA (humanes Serumalbumin) zugesetzt. Die Anzahl der fest adhärierten Zellen wurde nach vierstündiger Inkubation bei 37 °C bestimmt. Hierzu wurde der Überstand abgenommen und zweimal mit PBS (je 200 µl) gewaschen, um lose Zellen zu entfernen. Anschließend wurden 100 µl frisches Medium zugesetzt und der Vitalitätstest WST-1 durchgeführt. 2.8.2.3 Proliferationstest Die Proliferation der Zellen auf verschiedenen Filmen wurde über mehrere Tage verfolgt. Die Anfangszellzahl betrug 5 x 103 Zellen pro well. Nach jeweils 48 h wurde das Medium gewechselt, wobei aufgrund der langen Inkubationsdauer nur das unter 2.8.1 angegebene Zellkulturmedium mit FKS verwendet wurde. Nach verschiedenen Inkubationszeiten wurde die Zellvitalität mittels WST-1 Assay bestimmt. Als Kontrollen für den Adhäsionssowie Proliferationstest dienten unbeschichtete Zellkulturplatten in welche die Filme gegossen wurden (s. o.) als Negativkontrolle sowie für gute Zelladhäsion optimierte Zellkulturplatten (NunclonTM, Nunc) als Positivkontrolle. Ergebnisse 63 3 Ergebnisse 3.1 Charakterisierung von eADF4(C16) Filmen Um Spinnenseidenfilme als Materialien für konkrete Anwendungen einsetzen zu können, ist zunächst ihre Charakterisierung notwendig. Für Seidenfolien aus Fibroin, dem Seidenprotein des Maulbeerspinners Bombyx mori, wurde bereits beschrieben, dass verschiedene Parameter bei der Filmherstellung die Eigenschaften des daraus resultierenden Films beeinflussen können (Murphy & Kaplan, 2009; Jin et al., 2005; Lawrence et al., 2010; Lu, 2009; Hardy et al., 2008; Vasconcelos et al., 2008). Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Filme aus dem rekombinanten Spinnenseidenprotein eADF4(C16) wurden durch Gießen einer Proteinlösung auf unterschiedliche Substrate hergestellt. Durch Abdampfen des Lösungsmittels entsteht dabei ein in sich stabiler, transparenter und (abhängig von der Dicke) selbsttragender Film, der bei Bedarf vom jeweiligen Substrat abgezogen werden kann. Die Dicke des entstehenden Films kann dabei über die verwendete Proteinkonzentration bzw. die Proteinmenge pro Fläche eingestellt werden. Optional kann der Film einer nachfolgenden Behandlung unterzogen werden sowie mit weiteren Molekülen funktionalisiert werden, um bestimmte Eigenschaften anzupassen oder neue zu erzeugen (Schema 3.1). Schema 3.1: (a) Herstellung rekombinanter Spinnenseidenfilme. Das gelöste Protein eADF4(C16) wurde auf ein Substrat (standardmäßig Polystyrol-Petrischalen) gegossen. Nach Abdampfen des Lösungsmittels bleibt ein Proteinfilm zurück, der optional nachbehandelt und/oder mit externen Effektormolekülen weiter funktionalisiert und schließlich abgezogen werden kann. Angegeben sind die bei dem jeweiligen Schritt untersuchten Parameter. (b) Fotographie (links) bzw. rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen (Mitte und rechts) von eADF4(C16) Filmen. Ergebnisse 70 Betrachtet man das Verhältnis der Absorptionswerte bei 1625 cm-1 und 1657 cm-1, so ergeben sich für die unterschiedlich nachbehandelten Filme aus allen zum Gießen verwendeten Lösungsmitteln ähnliche Werte (Abb. 3.4 d). Da dies den tatsächlichen Kurvenverlauf der Amid I-Bande gut widerspiegelt, wird dieser Quotient im Folgenden als qualitativer Indikator für die Verschiebung von α-helikaler zu β-Faltblatt-Struktur verwendet, wobei höhere Quotienten einem höheren β-Faltblatt-Anteil entsprechen. Da nur minimale Unterschiede zwischen den verschiedenen Nachbehandlungsarten auftraten, sind die Ergebnisse der mittels FSD analysierten Verteilung von Sekundärstruktur-Elementen in Tabelle 3.2 stellvertretend für mit reinem Methanol nachbehandelte Filme zusammengefasst. Hier bestätigt sich, dass Filme gegossen aus den verschiedenen Lösungsmitteln keine signifikanten Unterschiede aufweisen. Trotz unterschiedlicher Zusammensetzung in den unbehandelten Filmen nimmt der β-Faltblatt-Anteil der Proteine in allen Filmen nach Behandlung auf etwa 42 % zu. Dies geht mit einer Abnahme von random coil und β-turnStrukturen einher. Der Anteil an α-Helices verringert sich in Ameisensäureund PufferFilmen leicht, in HFIP-Filmen dagegen mit 10 % am stärksten. Typ I Puffer-Filme stellen eine Ausnahme dar, mit einem geringeren Anteil an β-Faltblatt-Struktur (37 %) und der größten verbleibenden Fraktion an α-Helices. Bei allen Filmen nimmt unabhängig von dem ursprünglichen Lösungsmittel und der Nachbehandlungsmethode mit steigendem β-Faltblatt Gehalt der für β-Polyalanin spezifische Peak zu bzw. wird im Fall von HFIP-Filmen induziert (Abb. 3.4 c). Die relative Peakhöhe der individuellen Nachbehandlungen weisen leichte Schwankungen auf. Da die Werte jedoch bei wiederholten Messungen ebenfalls leicht schwanken, spiegelt dies vermutlich experimentelle Variationen wider. Tabelle 3.2: Sekundärstrukturanteile in mit Methanol abs. behandelten, aus verschiedenen Lösungsmitteln gegossenen eADF4(C16) Filmen. Die prozentualen Anteile wurden durch FSD bestimmt (s. 2.5.4.1). Die angegebenen Werte wurden jeweils aus mindestens drei FTIR-Spektren gemittelt. Sekundärstruktur HFIP Ameisensäure wäss. Lösung Typ I Typ II β-Faltblatt [%] (1616-1637 cm-1 und 1697-1703 cm-1) 42,3 ± 2% 42,5 ± 2% 37,0 ± 3% 42,0 ± 2% α-Helix [%] (1653-1662 cm-1) 7,7 ± 1% 9,4 ± 2% 12,1 ± 2% 8,4 ± 2% random coil [%] (1637-1652 cm-1) 17 ± 2% 21,1 ± 2% 21,4 ± 3% 23,6 ± 3% β-turns [%] (1663-1696 cm-1) 21,9 ± 2% 22,0 ± 1% 23,3 ± 3% 22,0 ± 2% andere [%] (1595-1615 cm-1) 4,7 ± 2% 4,6 ± 2% 4,7 ± 2% 4,8 ± 2% Ergebnisse 71 Die Zunahme der β-Faltblatt-Struktur korreliert dabei mit der Stabilität der Filme gegenüber Wasser und Denaturierungsmitteln. Während HFIP-Filme ohne Nachbehandlung wasserlöslich sind, sind alle nachbehandelten Filme beständig (> 24 h) gegenüber Wasser, 8 M Harnstoff und 6 M GdmHCl und lösen sich nur noch in 6 M GdmSCN (Tabelle 3.3). Ameisensäure-Filme mit einem mittleren β-Faltblatt Anteil hingegen sind unlöslich in Wasser und 8 M Harnstoff, jedoch löslich in 6 M GdmHCl. Unbehandelte Filme aus Pufferlösung zeigten kein eindeutiges Ergebnis, was vermutlich auf die heterogene strukturelle Zusammensetzung zurückzuführen ist. Tabelle 3.3: Löslichkeit von aus verschiedenen Lösungsmitteln gegossenen eADF4(C16) Filmen vor und nach Behandlung mit Methanol abs. Die Filme wurden in das jeweiligen Denaturierungsmittel bzw. Wasser überführt und nach 24 h Inkubation makroskopisch beurteilt sowie der Überstand UV-spektroskopisch untersucht, um gelöstes Protein nachzuweisen. +: löslich, -: unlöslich, n. b.: die Werte konnten nicht bestimmt werden, unb.: unbehandelt Inkubation in HFIP AS wäss. Lösung unb. Methanol unb. Methanol unb. Methanol Wasser + - - - n.b - 8 M Urea + - - - n.b - 6 M GdmHCl + - + - n.b - 6 M GdmSCN + + + + + + 3.1.1.3 Einfluss der relativen Luftfeuchtigkeit Bei der Filmherstellung können auch Umgebungsparameter wie Temperatur, Druck oder Luftfeuchtigkeit eine Rolle bei der Ausbildung von Sekundärstruktur spielen, sei es durch Beeinflussung der Abdampfund Trocknungsgeschwindigkeit oder durch die Menge an vorhandenem Wasser als potentiellem Interaktionspartner. Um den Einfluss der relativen Luftfeuchtigkeit (LF) zu untersuchen, erfolgte die Herstellung/Trocknung und Lagerung der Filme in einer Kammer mit kontrollierbarem Feuchtigkeitsgehalt bei 30 %, 50 % sowie 75 % LF. Wassergehalt Zunächst wurde überprüft, wie viel Wasser die unterschiedlichen Filme enthalten. Dazu wurden die Proben (je ca. 10 mg) in einem Ofen auf 140 °C erhitzt und das dabei austretende Wasser mittels Karl-Fischer-Titration quantifiziert. Tabelle 3.4 gibt einen Überblick über die erhaltenen Werte (wobei es sich meist nur um Einfachbestimmungen handelt). Es wurden jeweils aus HFIP, Ameisensäure oder wL gegossene Filme in unbehandelter sowie nachbehandelter Form getestet. Stellvertretend wurde als Nachbehandlungsmethode Methanol abs. sowie im Fall von HFIP-Filmen zusätzlich Kaliumphosphat-Lösung gewählt. Ergebnisse 72 Tabelle 3.4: Wassergehalt von eADF4(C16) Filmen, die bei verschiedener relativer Luftfeuchtigkeit (LF) hergestellt und gelagert wurden. Unbehandelte (unb.) sowie mit Methanol abs. oder Kaliumphosphat nachbehandelte Filme wurden auf 140 °C erhitzt und ihr Wassergehalt (angegeben in % (w/w)) mittels KarlFischer-Titration bestimmt. (n. b.: die Werte wurden nicht bestimmt) Die Werte repräsentieren größtenteils Einfachbestimmungen. LF [%] HFIP AS wäss. Lösung unb. Methanol Phosphat unb. Methanol unb. Methanol 30 4,6 8,5 8,3 6,1 7,3 8,4 8,3 50 7,9 9,8 11,5 n.b. n.b. 10,3 n.b. 75 10,8 9,7 12,7 9,1 9,8 10,2 n.b. Mit einem prozentualen Anteil von 4,6 % bzw. 6,1 % bei 30 % LF weisen unbehandelte Filme aus organischen Lösungsmitteln den niedrigsten Wassergehalt auf, während der Vergleichswert von wL-Filmen bei 8,4 % liegt. Durch Nachbehandlung mit Methanol erhöht sich der Wassergehalt, was möglicherweise auf eine Verdrängung des organischen Lösungsmittels sowie im Methanol enthaltenes Wasser zurückzuführen ist (es wurde kein getrocknetes Methanol verwendet). Der Wassergehalt erreicht bei allen Methanol-behandelten Filmen Werte, die im Bereich des unbehandelten Filmes aus wässriger Lösung liegen. Mit steigender LF steigt auch der Gehalt an Wasser von 8,3-8,5 % bei 30 % LF auf 10-12 % bei 75 % LF. HFIP-Filme wurden zudem nach Kaliumphosphat-Behandlung untersucht. Dies ergab in Abhängigkeit von der LF ähnliche oder etwas erhöhte Werte im Vergleich zu Methanol-behandelten Filmen. Sekundärstruktur Des Weiteren wurden die entsprechenden Filme mittels FTIR-Spektroskopie untersucht. Während die Luftfeuchtigkeit nur einen geringen Einfluss auf die Sekundärstruktur in Filmen aus HFIP zu haben scheint, weisen Filme aus Ameisensäure und Puffer (wL) eine deutliche Abhängigkeit auf. Mit steigender LF steigt dabei der Anteil an β-Faltblatt-Struktur, zu sehen an der deutlichen Verschiebung des Maximums von >1650 cm-1 zu 1625 cm-1 (Abb. 3.5 a). Als Vergleich ist zudem das entsprechende Spektrum nach Methanol-Behandlung gezeigt. Differenzspektren von Ameisensäureund wL-Filmen zeigen dabei eine Zunahme der Absorption bei 1625 cm-1 (β-Faltblatt-Struktur) sowie eine deutliche Abnahme bei 1657 cm-1 (α-Helices/ungeordnet) im Vergleich zu den bei LF 30 % gegossenen Filmen (Abb. 3.5 b). Der Effekt nimmt dabei mit steigender LF zu, bei 75 % LF unterscheiden sich die Spektren dieser Filme kaum von mit Methanol nachbehandelten. Im Gegensatz dazu tritt bei HFIPFilmen mit zunehmender LF lediglich eine leichte Verschiebung des Maximums hin zu ~1637 cm-1 auf. Entsprechend zeigt das Verhältnis der Absorptionswerte bei 1625 cm-1 und Ergebnisse 73 1657 cm-1 hier nur eine leichte Zunahme, während bei Filmen aus Ameisensäure und wL ein deutlicher Anstieg zu erkennen ist (Abb. 3.5 c). Ein ähnliches Muster ist bei der für β-Polyalanin spezifischen Absorption um 965 cm-1 zu sehen. Mit zunehmendem Anteil an β-Faltblättern steigt diese an, während in HFIP-Filmen durch erhöhte LF im Gegensatz zu Alkoholen keine Induktion dieser speziellen β-FaltblattStruktur zu sehen ist (Abb. 3.5 c). Abb. 3.5: Einfluss der Luftfeuchtigkeit (LF) auf die Sekundärstruktur von eADF4(C16) Filmen. Die Filme wurden bei der jeweils angegebenen LF gegossen, getrocknet und bis zur Analyse mittels FTIR-Spektroskopie gelagert. (a) Amid I Bande der jeweiligen Filme gegossen aus AS. (b) Differenzspektren im Vergleich zu bei LF 30 % gegossenen Filmen. (c) Quotient der Absorption bei 1625 cm-1 und 1657 cm-1 (oben) und Zunahme der für β-Polyalanin spezifischen Absorptionsbande (unten). Zur Auswertung der β-Polyalanin-Bande wurden die Spektren vektornormiert und die erhaltenen Absorptionswerte bei 965 cm-1 anschließend auf den Wert des jeweiligen Methanol abs.-behandelten Films normiert. Da sich die relative Luftfeuchtigkeit als ein kritischer Parameter zur Herstellung reproduzierbarer Filme erwiesen hat, wurden die Filme in allen folgenden Untersuchungen – soweit nicht anders vermerkt – bei einer LF von 30 % hergestellt und gegebenenfalls gelagert. Zusammenfassend ist zu erkennen, dass das verwendete Lösungsmittel sowohl in Lösung als auch im assemblierten Film Einfluss auf die Sekundärstruktur von eADF4(C16) nimmt. HFIP induziert/stabilisiert dabei die Ausbildung von α-Helices und die resultierenden Filme weisen den geringsten β-Faltblatt-Anteil auf. Bei Filmen aus Ameisensäure und Puffer (wL Typ II) liegt dieser deutlich (ca. 10 %) höher. Die IR-Absorptionssignale der beiden organischen Lösungsmittel interferieren dabei nicht mit den Protein-spezifischen Amid I und II-Banden. Das FTIR-Spektrum von HFIP zeigt mehrere charakteristische Absorptionsbanden (s. Abb. 3.8), während Ameisensäure ein Signal bei etwa 1710 cm-1 erzeugt (s. Abb. 3.3). Ergebnisse 74 β-Faltblatt-Struktur wird zudem in Filmen aller Lösungsmittel durch Nachbehandlung mit Alkoholen, Kaliumphosphat und – mit Ausnahme von HFIP-Filmen – durch erhöhte Luftfeuchtigkeit induziert. Gleichzeitig wurde dabei in allen Fällen eine Zunahme der für β-Polyalanin spezifischen Signale beobachtet, so dass an der Strukturumlagerung (zumindest teilweise) Alaninreste beteiligt sind. Mit dem Gehalt an β-Faltblättern korreliert die Beständigkeit der Filme gegenüber Wasser, so dass alle nachbehandelten Filme wasserunlöslich sind. 3.1.2 Thermische Stabilität Temperaturabhängige Änderungen in eADF4(C16) Filmen wurden mittels Thermogravimetrie (TGA) und dynamischer Differenzkalorimetrie (DSC) untersucht. Neben Informationen über Vorgänge auf molekularer Ebene ist die thermische Beständigkeit der Filme auch für technische Anwendungen sowie ihre Sterilisierbarkeit von Interesse. Zum direkten Nachweis struktureller Änderungen wurden zusätzlich temperaturabhängige FTIRAnalysen durchgeführt. 3.1.2.1 Thermogravimetrische Analyse Mittels TGA wird die Massenänderung einer Probe in Abhängigkeit der Temperatur gemessen. Es wurden sowohl unbehandelte als auch mit Methanol abs. nachbehandelte Filme aus HFIP, Ameisensäure und Puffer untersucht. Die erhaltenen Messkurven sind in Abb. 3.6 gezeigt. Die daraus bestimmten prozentualen Änderungen in der Masse sind in Tabelle 3.5 zusammengefasst. Abb. 3.6: Thermogravimetrische Analyse (TGA) von unbehandelten (unb.) sowie mit Methanol abs. (MeOH) behandelten Filmen aus HFIP, Ameisensäure (AS), und Puffer (wL). Geheizt wurde dabei von Raumtemperatur bis 800 °C mit einer Rate von 10 °C/min unter Stickstoffatmosphäre. Der Temperaturbereich bis 250 °C ist zusätzlich vergrößert dargestellt. Gezeigt sind repräsentative Spektren von jeweils 3 individuellen Messungen. 1, 2, 3 bezieht sich auf die im Text und Tabelle 3.5 zugeordneten Prozesse. Pfeil: Erklärung s. Text (nach Spiess et al., 2011 mit freundlicher Genehmigung des Verlags Royal Society of Chemistry) Ergebnisse 75 In allen Filmen kann im Temperaturbereich zwischen 30 °C und 100 °C eine Abnahme der Masse um 4,9-7,0 % beobachtet werden (Tabelle 3.5, Prozess 1). Die Mittentemperatur Tm (bei der 50 % des beobachteten Masseverlusts eines Prozesses erreicht sind) variiert von 53 °C bis 69 °C. Bei diesem Masseverlust handelt es sich vermutlich um freigesetztes Wasser, eventuell in Kombination mit Resten von organischen Lösungsmitteln. Die Werte liegen dabei im selben Größenbereich wie der mittels Karl-Fischer-Titration ermittelte Wassergehalt. Ab etwa 280 °C tritt ein Masseverlust von 59-68 % auf, der auf thermische Zersetzung des Materials zurückzuführen ist. Tm liegt dabei bei allen Filmen im gleichen Bereich um 335 °C, die Masseabnahme setzt sich jedoch in verminderter Form bis ≥800 °C fort. In unbehandelten Filmen aus HFIP tritt zwischen 140 °C und 226 °C ein weiterer Masseverlust von 16,8 % auf (Prozess 2, Tabelle 3.5), was auf Freisetzung gebundenen bzw. eingeschlossenen Lösungsmittels hindeutet (s. 3.1.2.3). Auch Ameisensäure-Filme zeigen eine zusätzlich Abnahme um 5 % im Bereich von 170-280 °C. Dahingegen tritt bei Methanol-behandelten Filmen kein entsprechender Massenverlust auf. Im Fall des behandelten AS-Films beginnt die Massenabnahme (Prozess 3, Tabelle 3.5) allerdings schon bei etwas niedrigerer Temperatur verglichen zu den anderen Filmen (s. Pfeil in Abb. 3.6), was auf zwei sich überlagernde Effekte hindeuten könnte. Möglicherweise handelt es sich hierbei um verbleibendes Lösungsmittel, das, anders als bei HFIP, durch die nachfolgende Methanol-Behandlung nicht komplett verdrängt wurde. Tabelle 3.5: Überblick über die mittels TGA bestimmte Masseabnahme (∆m) von eADF4(C16) Filmen bei bestimmten Temperaturen. Angegeben sind jeweils die Temperatur des halben Masseverlusts Tm sowie (in Klammern) der relevante Temperaturbereich des jeweiligen Prozesses. (unb.: unbehandelt, Methanol: abs.) Lösungsmittel Nachbehandlung Prozess 1 Prozess 2 Prozess 3 übrige Masse bei 800 °C [%] Tm [°C] ∆m [%] T [°C] ∆m [%] T [°C] ∆m [%] HFIP unb 57 (32-82) 4,9 183 (141-226) 16,8 332 (282-381) 59,8 18,5 Methanol 53 (32-77) 6,7 335 (284-382) 67,5 25,8 AS unb 64 (32-97) 7,0 197 (169-282) 5,0 334 (282-388) 65,0 23,0 Methanol 69 (37-105) 6,6 334 (281-388) 66,9 26,5 wL unb 68 (41-97) 5,9 336 (286-387) 65,3 28,8 Methanol 56 (30-80) 7,1 334 (287-387) 68,0 24,9 Ergebnisse 76 3.1.2.2 Analyse mittels dynamischer Differenzkalorimetrie Eine Analyse der Filme mittels dynamischer Differenzkalorimetrie (DSC) zeigte bei allen Proben überlagernde Effekte. Um diese Überlagerungen zu minimieren und zusätzliche Informationen über den jeweilig stattfindenden Prozess zu erhalten, wurden die Proben zyklisch geheizt. Nach Aufheizen auf 110 °C in einem ersten Schritt wurden die Proben bis zu einer Temperatur von -40 °C abgekühlt und anschließend in einem zweiten Schritt auf 400 °C geheizt. Die dabei erhaltenen Spektren sind in Abb. 3.7 b für den zweiten Heizschritt gezeigt. In einem weiteren Experiment wurde ein zusätzlicher Heizzyklus bis 220 °C eingeführt und nach erneutem Abkühlen der Probe erst in einem dritten Schritt auf 400 °C geheizt. Die dabei erhaltenen Kurven sind in Abb. 3.7 a exemplarisch für unbehandelte HFIP-Filme dargestellt. Alle Proben zeigen ein endothermes Signal unterhalb von 100 °C (Abb. 3.7 a). Der in der TGA beobachtete gleichzeitige Masseverlust deutet darauf hin, dass hier freies Wasser bzw. Lösungsmittel verdampft. Zudem weisen alle Filme einen dominanten endothermen Peak bei etwa 320 °C mit einer unterschiedlich stark ausgeprägten Schulter bei ca. 265-280 °C auf (Abb. 3.7 b, grauer Rahmen). Dies ist charakteristisch für einen zweistufigen Schmelzbzw. Zersetzungsvorgang (Vasconcelos et al., 2008; Gotoh et al., 1997). Unbehandelte Filme aus den organischen Lösungsmitteln zeigen zusätzlich wesentlich kleinere und verbreiterte endotherme Signale im Bereich zwischen 130 °C und 185 °C (HFIP) sowie 135-195 °C (AS) (Abb. 3.7 b, blauer Rahmen). Zusammen mit der auftretenden Masseabnahme (s. o.) ist dies ein Hinweis auf Verdampfen von gebundenem oder eingeschlossenem Lösungsmittel. Einführen eines weiteren Heizzyklus (bis 220 °C) bekräftigte diese Vermutung, da dieses Signal nicht reproduzierbar war (Abb. 3.7 a, graue und blaue Kurve). Im Fall von HFIP kann das Austreten des Lösungsmittels zudem mittels FTIR-Spektroskopie verfolgt werden (s. Kapitel 3.1.2.3.). In guter Übereinstimmung mit dieser Erklärung zeigen Puffer-Filme und Methanol-behandelte Filme keine oder nur sehr geringe vergleichbare Signale. Durch die Nachbehandlung wird das ursprüngliche Lösungsmittel größtenteils (oder komplett) aus dem Film verdrängt. Ergebnisse 77 Abb. 3.7: Untersuchung thermischer Eigenschaften von eADF4(C16) Filmen mittels DSC. Filme aus HFIP, Ameisensäure (AS) sowie Puffer (wL) wurden vor (unb.) bzw. nach (MeOH) Methanol abs.-Behandlung in Stickstoff-Atmosphäre analysiert. Die Proben wurden in Zyklen geheizt, die Heizrate betrug dabei 5 °C/min. In (a) sind die individuellen Zyklen exemplarisch für unbehandelte HFIP-Filme gezeigt. Im 3. Heizzyklus tritt anstelle eines endothermen Peaks ein endothermer Kurvenversatz auf (Pfeil). (b) Zusammenfassung der DSCKurven aller Filme, wobei der 1. Zyklus dem in (a) entsprach und in einem 2. Zyklus direkt bis 400 °C geheizt wurde. Der Übersichtlichkeit halber ist nur der 2. Heizschritt dargestellt. (LM: Lösungsmittel, Tg: Glasübergangstemperatur) (nach Spiess et al., 2011 mit freundlicher Genehmigung des Verlags Royal Society of Chemistry) In allen unbehandelten Filmen treten exotherme Signale auf, bei Filmen aus HFIP bei 200210 °C, aus AS bei etwa 215 °C und aus Puffer bei 221 °C (Abb. 3.7 b, grüner Rahmen). Wiederum zeigte wiederholtes Aufheizen, dass es sich um einen nicht-reversiblen Prozess handelt. Für regeneriertes B. mori Seidenfibroin wurden entsprechende Signale Übergängen in der Sekundärstruktur zugeschrieben (Hu et al., 2006; Motta et al., 2002). Ungeordnete Strukturen oder α-Helices werden dabei in β-Faltblatt-Struktur umgelagert. Diese Interpretation stimmt gut mit dem Fehlen solcher exothermer Signale in nachbehandelten Filmen überein. Da diese bereits durch die Nachbehandlung in eine β-Faltblatt-reiche Struktur überführt worden sind, ist hier keine weitere Strukturumlagerung zu beobachten. Weiterhin ist in den DSC-Kurven der Methanol-behandelten Filme ein Versatz im Bereich von 195 °C bis 210 °C zu sehen (Abb. 3.7 b, roter Rahmen). In Anlehnung an Studien mit B. mori Seide kann dies als eine Art Glasübergang interpretiert werden (Motta et al., 2002; Vasconcelos et al., 2008; Hu et al., 2006), bei dem sich die Beweglichkeit/Freiheitsgrade der Moleküle erhöht. Die entsprechenden Messkurven von Filmen ohne Nachbehandlung zeigen keinen deutlichen Versatz (Abb. 3.7 b). Bei Heizen in mehreren individuellen Zyklen tritt jedoch auch hier ein Übergang auf (Pfeil in Abb. 3.7 a), so dass vermutlich die Evaporation von Lösungsmittel sowie die stattfindende strukturelle Umlagerung diesen Effekt in Abb. 3.7 b überlagern. Ergebnisse 78 3.1.2.3 Einfluss der Temperatur auf die Sekundärstruktur Da die Untersuchung mittels DSC auf temperaturabhängige Änderungen in der Sekundärstruktur hindeutete, wurden FTIR-Spektren der Filme bei verschiedenen Temperaturen aufgenommen. Die jeweilige Probe wurde dazu in einer verschlossenen heizbaren Apparatur (welche mit N2 gespült wurde) direkt in dem Strahl des Spektrometers platziert. Dabei zeigt sich bei allen unbehandelten Filmen eine Verschiebung des Maximums der Amid I-Bande hin zu Wellenzahlen spezifisch für β-Faltblatt-Strukturen (1625 cm-1) bzw. eine Zunahme des Quotienten 1625 cm-1/1657 cm-1 (Abb. 3.8). Diese Zunahme an β-FaltblattStruktur beginnt bei Filmen aus HFIP bei etwa 210 °C. Bei Filmen aus Ameisensäure und wL tritt eine entsprechende Zunahme ab 220 °C bzw. 230 °C auf. An Spektren von unbehandelten HFIP-Filmen können zudem weitere Effekte beobachtet werden (Abb. 3.8 a). Zum einen ist im Temperaturbereich der Verschiebung der Amid I-Bande eine Induktion des β-PolyalaninPeaks zu erkennen. Zum anderen kann ein Rückgang der für HFIP spezifischen Absorptionsbanden beobachtet werden. Dieser korreliert dabei gut mit den beiden genannten Strukturänderungen. In durch Methanol-Behandlung bereits β-Faltblatt-reichen Filmen hingegen war kein signifikanter Einfluss erhöhter Temperatur zu erkennen (Abb. 3.8 c). Die Temperatur-induzierte Strukturänderung ist dabei irreversibel und bleibt nach Abkühlen der Probe erhalten. Das Maximum bei 1625 cm-1 war sogar nach Abkühlen stärker ausgeprägt (Abb. 3.8 b). Vermutlich ist dies allerdings auf kinetische Effekte zurückzuführen. Die oben gezeigten Messungen wurden in Schritten von 10 °C durchgeführt, wobei die Spektren innerhalb 2-5 min nach Erreichen der Temperatur aufgenommen wurden. Um kinetische Einflüsse aufzuklären, wurden Filme zudem bei verschiedenen Temperaturen (100 °C, 150 °C, 200 °C, 240 °C) in einem Ofen 20-60 min inkubiert. Hierbei trat unterhalb 200 °C auch nach 60 min keine Strukturänderung auf. Bei Inkubation ≥ 200 °C hingegen zeigte sich eine zeitund temperaturabhängige Verschiebung des Maximums im FTIR-Signal. Die Verschiebung war jeweils etwas ausgeprägter als bei der Vergleichsmessung bei kontinuierlichem Heizen und erreichte ihr Maximum nach Inkubation der Filme bei 240 °C. Ergebnisse 79 Abb. 3.8: Änderung der Sekundärstruktur von eADF4(C16) Filmen in Abhängigkeit der Temperatur. Die Filme wurden in einer verschließbaren Heizapparatur in dem Strahlengang des FTIR-Spektrometers platziert und während des Aufheizens analysiert. Gezeigt sind die Spektren unbehandelter HFIP-Filme im Bereich 1780800 cm-1 (a), die Amid I-Bande unbehandelter wL-Filme (b) sowie der Quotient der Absorptionswerte bei 1625 cm-1/ 1657 cm-1(c). Stellvertretend für Methanol-behandelte Filme ist ein wL-Film gezeigt. (MeOH: Methanol abs.; c-30 °C: FTIR-Spektren nach anschließendem Abkühlen der Probe) (nach Spiess et al., 2011 mit freundlicher Genehmigung des Verlags Royal Society of Chemistry) Insgesamt erwiesen sich alle eADF4(C16)-Filme bis zu Temperaturen ≥ 280 °C als stabil. Die erhaltenen FTIR-Spektren deuten auf strukturelle Integrität der Filme hin, wobei allerdings in unbehandelten Filmen eine Strukturänderung hin zu erhöhtem β-Faltblatt-Anteil auftritt. Auch TGAund DSC-Messungen zeigen ab 285 °C den Beginn thermischer Zersetzung, die bei 330 °C zu einem erheblichen Masseverlust führt. Ergebnisse 86 Abb. 3.12: Auftretende Spannung bei schrittweiser Dehnung von eADF4(C16)-Filmen im zeitlichen Verlauf. Die jeweils aufgebrachte Dehnung (in % der ursprünglichen Filmlänge) ist ebenfalls angegeben. Exemplarisch ist die Messung eines unbehandelten (a) sowie eines Methanol-behandelten (b) Ameisensäure-Films gezeigt. Das Experiment wurde wie folgt durchgeführt: Die Probe wurde mittels Mikrometerschraube um eine definierte Länge gedehnt (0,3-0,5 % der ursprünglichen Filmlänge), was zu einem steilen Signal im Kraftsensor führt (1). Nach anschließender Relaxation der Probe (2) wurden polarisierte FTIR-Messungen durchgeführt (3). Die Spannung entspricht der gemessenen Kraft pro Querschnittsfläche des Filmes, welche für jeden Film individuell bestimmt wurde. (nach Spiess et al. 2011 mit freundlicher Genehmigung des Verlags Royal Society of Chemistry) Da die erhaltenen FTIR-Spektren im Bereich der Amid Iund II-Bande teilweise zu stark streuten und damit keine Analyse möglich war (s. Abb. 3.11 b), konzentrierte sich die Auswertung der polarisierten Spektren auf die für β-Polyalanin spezifische Absorptionsbande um 965 cm-1. Diese Auswertung bietet zudem einige Vorteile. Während bei der Amid I-Bande eine genaue Zuordnung beobachteter Effekte durch die Überlagerung mehrerer Schwingungen erschwert wird, ist die Zuordnung im Fall der β-Polyalanin Bande eindeutig. Des Weiteren gelten Polyalanin-Kristalle im natürlichen Spinnenseidenfaden als Ursache der hohen Festigkeit und Steifheit (Buehler & Yung, 2009). Dementsprechend zeigte diese Bande bei Untersuchungen an Spinnenseidenfäden die stärksten Änderungen bei mechanischer Beanspruchung. Mit Hilfe eines quantenmechanischen Modells konnte zudem gezeigt werden, dass eine Verschiebung dieser Bande direkt mit einer extern angelegten Kraft korreliert (Papadopoulos et al., 2007). Bei Betrachtung dieser Absorptionsbande zeigt sich in Filmen aus wässriger Lösung (ohne bzw. mit Nachbehandlung) und unbehandelten Ameisensäure-Filmen mit zunehmender Dehnung des Films eine leichte Verschiebung des Peakmaximums hin zu niedrigeren Wellenzahlen (Abb. 3.13 a). Im Falle des unbehandelten wL-Filmes tritt diese Verschiebung ab einer Dehnung von 4,5 % auf, in den beiden anderen Filmen bereits ab Überschreiten von 1 % Dehnung. In Anlehnung an Messungen an natürlichen Spinnenfäden kann dies als Übertragung der extern angelegten Kraft auf β-Polyalanin-Strukturen interpretiert werden, die bei den Filmen jedoch – anders als im Faden – nicht sofort, sondern erst nach einer gewissen Dehnung erfolgt (Papadopoulos et al., 2007; Papadopoulos et al., 2009b; Ene et al., 2009). Ergebnisse 87 Mit einer Verschiebung des Absorptionsmaximums um 0,2-0,4 cm-1 erscheint die Änderung zunächst klein; unter Einbeziehung der dabei aufgewendeten Kraft ergibt sich jedoch beispielsweise im Fall des AS-Films eine Änderung von 3-5 cm-1/GPa, und liegt damit in einem ähnlichen Größenordnungsbereich wie der am natürlichen Faden beobachtete Effekt (Ene et al., 2009; Papadopoulos et al., 2007). Allerdings muss dabei beachtet werden, dass das aufgestellte Modell der Kraftübertragung in der Molekülgeometrie limitiert ist. Da diese in den Filmen möglicherweise abweicht, kann an dieser Stelle nur ein qualitativer Vergleich zum Seidenfaden erfolgen. In den Methanol-behandelten Filmen aus HFIP und AS hingegen ist keine solche Verschiebung zu erkennen. Abb. 3.13: Analyse der für β-Polyalanin spezifischen IR-Absorptionsbande (965 cm-1) bei schrittweiser Dehnung von verschiedenen eADF4(C16) Filmen (wie angegeben). (a) Verschiebung des Peak-Maximums relativ zur Position im ungedehnten Film. (b) Aus polarisierten FTIR-Messungen berechneter Ordnungsparameter Smol in Abhängigkeit der Dehnung. (c) Originalspektren der IR-Absorption bei 0° und 90° Polarisation, jeweils vor bzw. nach Dehnung der Filme. Exemplarisch für Filme ohne signifikante Änderung ist ein Methanol-behandelter AS-Film (links) dargestellt, während bei unbehandelten Puffer-Filmen Änderungen auftreten (rechts). (nach Spiess et al. 2011 mit freundlicher Genehmigung des Verlags Royal Society of Chemistry) Aus der unter verschiedenen Polarisationswinkeln erhaltenen Fläche des Peaks kann eine Aussage über die Orientierung der angeregten Bindung getroffen werden (Kapitel 2.5.4.3). Der dabei berechnete molekulare Ordnungsparameter Smol ergab für alle Filme vor Streckung einen Wert ~0. Dies bedeutet keinerlei Orientierung der Bindung und bestätigt somit die oben für das gesamte Protein-IR-Spektrum getroffene Aussage. Mit zunehmender Dehnung der Filme erhöht sich Smol in den unbehandelten Filmen (aus Ameisensäure und wässriger Lösung Ergebnisse 88 wL) (Abb. 3.13 b). Der Effekt beginnt wiederum erst nach einer gewissen Dehnung, die mit der Verschiebung des Absorptionsmaximums übereinstimmt. Danach steigt Smol linear mit zunehmender Dehnung an und erreicht einen Endwert (vor dem Reißen des Filmes) von 0,18 bzw. 0,22. Da ein Wert von +1 bei einer vollständigen Ausrichtung aller Bindungen parallel zur Probenachse erreicht wird, deutet dieses Ergebnis auf eine teilweise Ausrichtung der N-Cα-Bindungen von β-Polyalanin-Strukturen in Richtung der Zugkraft hin. Der Vergleichswert der hoch ausgerichteten β-Polyalanine in natürlicher dragline Seide liegt bei 0,9 (Papadopoulos et al., 2007). Hingegen war bei keinem der Filme nach Behandlung mit Methanol eine Zunahme von Smol zu sehen, was darauf hindeutet, dass hier keine Ausrichtung/Umorientierung von β-Polyalaninen stattfindet. Da in HFIP Filmen ohne Behandlung keine entsprechende Absorptionsbande bei 965 cm-1 auftritt, konnten für diesen Film keine Aussagen getroffen werden. Im Fall des Filmes aus wässriger Lösung wurde hier nur an einer Stelle des Films gemessen, wodurch eventuelle regionale Unterschiede (wie oben beschrieben) nicht erfasst wurden. Die erhaltenen Ergebnisse deuten somit (in einigen Filmen) auf eine teilweise Ausrichtung der β-Polyalanine hin, nicht jedoch auf eine Zunahme an β-Faltblatt-Struktur. So trat in keinem der Filme eine Erhöhung der Absorption bei etwa 965 cm-1 auf, noch wurde eine Änderung der Amid I-Bande beobachtet, sofern es die Auflösung zuließ. 3.1.4 Charakterisierung der Filmoberfläche Die Natur der Filmoberfläche ist bei der Interaktion mit angrenzenden Phasen (biologisches oder anderes Material) von entscheidender Bedeutung. Wichtige Parameter sind dabei die Topographie sowie die Hydrophilie der Oberfläche. Wiederum wurden Filme gegossen aus den verschiedenen Lösungsmitteln mit bzw. ohne Nachbehandlung verglichen. Aufgrund der Relevanz hinsichtlich späterer Anwendung der Filme in der Kultivierung von Zellen wurde neben Methanol und Ethanol abs. auch der Effekt von Kaliumphosphat-Behandlung und 70 % Methanol bzw. Ethanol untersucht. 3.1.4.1 Topographie Untersuchung verschiedener Filme mittels REM gab einen ersten Überblick über die Filmoberfläche. Ausgewählte Beispiele sind in Abb. 3.14 gezeigt, die restlichen Aufnahmen sind in Kapitel 10.2 (Anhang) zu finden. Die untersuchten Filme besaßen eine Dicke von 1-2 µm (Abb. 3.14 A und E). Ergebnisse 89 Abb. 3.14: REM-Aufnahmen verschiedener eADF4(C16) Filme. A-C: HFIP-Filme nachbehandelt mit Methanol abs. (A), 1 M Kaliumphosphatlösung (B) oder 70 % Methanol (C); D: Methanol (abs.)-behandelter Ameisensäure-Film; E und F: unbehandelte Filme aus wässriger Lösung. Die Dicke der Filme betrug dabei 12 µm (s. A und E). Unbehandelte Filme aus HFIP stellen sich glatt und ohne erkennbare Oberflächenstruktur dar, was sich auch durch Behandlung mit Methanol nicht signifikant ändert. Im Querschnitt sind sowohl Blaseneinschlüsse als auch geschichtete Strukturen erkennbar (A). Nach Behandlung mit Kaliumphosphat (B) treten vermehrt Vertiefungen und Löcher mit Durchmessern bis zu 0,5-1 µm auf. 70 % Methanol (C) hingegen führt zu einer inhomogenen Strukturierung mit regionalen Unterschieden. Bei Filmen aus Ameisensäure hingegen sind sowohl vor also auch nach Methanol-Behandlung viele Löcher bzw. Vertiefungen zu sehen (D), welche möglicherweise durch Aufplatzen von eingeschlossenen Lösungsmittel-Blasen entstehen. REM-Aufnahmen von Filmen aus wässeriger Lösung (wL) zeigen eine teilweise glatte Oberfläche (E), aber auch unebene Bereiche (F). Die für HFIP-Filme beschriebenen Effekte unterschiedlicher Nachbehandlungen treffen qualitativ auch für aus Ameisensäure und wL gegossene Filme zu (s. Anhang, Kapitel 10.2). Zur detaillierteren Analyse der Oberflächentopographie wurden die Filme mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) untersucht (Abb. 3.15). Neben einer qualitativen Beurteilung der Topographie wurden die Aufnahmen zur Bestimmung der mittleren Rauheit Ra sowie der Rautiefe verwendet (Abb. 3.16). Ra entspricht dabei dem arithmetischen Mittel der Abweichung jedes einzelnen Messpunktes von der Mittellinie, wohingegen die Rautiefe ein Maß für die maximale Rauheit darstellt. Generell zeigen alle Filme in den gewählten Ausschnitten von 10 µm x 10 µm eine gewisse Strukturierung ihrer Oberfläche, welche sich aus homogeneren Flächen im nm-Bereich Ergebnisse 90 zusammensetzt (Abb. 3.15). Dementsprechend steigt die Rauheit mit der analysierten Fläche an (Abb. 3.16). Übereinstimmend mit den REM-Aufnahmen weisen auch hier unbehandelte Filme aus HFIP mit einer Mittelrauheit von 2 nm (bestimmt über 25 µm2) die glatteste Oberfläche auf, wobei die Rautiefe etwa 20 nm beträgt. Ihre leicht wellige Struktur geht durch Methanol abs.-Behandlung in eine homogenere Oberfläche mit ähnlicher oder leicht erhöhter Rauheit über (Abb. 3.15). Eine Behandlung mit Phosphatlösung oder 70 % Methanol führt, wie schon im REM beobachtet, auch auf dieser Größenskala zu einer Zunahme der Rauheit, die bei der Alkoholbehandlung besonders stark ausgeprägt ist und eine mittlere Rauheit Ra von 17 nm ergab. Damit einher geht ein Anstieg der Rautiefe auf das 15-fache des unbehandelten Films. In den ansonsten glatten Ameisensäure-Filmen (unbehandelt) mit Rauheitswerten vergleichbar zu unbehandelten HFIP-Filmen wurden Löcher bzw. Vertiefungen beobachtet. Mit Durchmessern von 0,2-1 µm entsprechen sie den bereits mittels REM detektierten Strukturen. Ihre Tiefe betrug etwa 50-70 nm. Durch Methanol-Behandlung nimmt Ra auf etwa 5 nm zu und die Oberfläche erscheint welliger. Um zu überprüfen, ob die starke Aufrauhung der Filmoberfläche bei Behandlung mit Kaliumphosphat und besonders 70 % Methanol (s. HFIP-Filme) auf das darin enthaltene Wasser zurückzuführen sein könnte, wurden Ameisensäure-Filme, die im Gegensatz zu HFIPFilmen per se unlöslich in Wasser sind, mit Wasser inkubiert und nach anschließender Trocknung analysiert. Auch hier zeigt sich eine starke Zunahme der Rauheit auf > 40 nm (Abb. 3.15, Abb. 3.16). Möglicherweise führt das Wasser zu ungleichmäßigem Quellen der Filme oder erlaubt lokale Umlagerungen der Moleküle. Überschichtung bereits Methanolbehandelter Filme mit Wasser resultierte dagegen nur in einer geringen Zunahme der Rauheit (Abb. 3.16). AFM-Aufnahmen von wL-Filmen weisen stark unterschiedliche Ergebnisse auf. Die Filme erscheinen teils ähnlich glatt wie die aus den organischen Lösungsmitteln, weisen an anderen Stellen aber eine stark gewellte Oberfläche mit der höchsten beobachteten Rauheit auf. Hierbei handelt es sich vermutlich um die ebenfalls im REM detektierten aufgerauten Bereiche. Auch nach Behandlung mit reinem Methanol bleiben Bereiche unterschiedlicher Rauheit detektierbar. Ergebnisse 91 Abb. 3.15: Einfluss verschiedener Lösungsmittel und Nachbehandlungsmethoden auf die Topographie von aus HFIP, Ameisensäure (AS) und wässriger Lösung (wL) gegossenen eADF4(C16) Filmen. Gezeigt sind repräsentative AFM-Aufnahmen mit 1 bzw. 10 µm Kantenlänge. Alle Messungen wurden an Filmen nach Trocknung und Lagerung bei 30 % LF im tapping mode durchgeführt. Ergebnisse 92 Die Rautiefe folgt insgesamt bei allen Proben den Trends der Mittelrauheit Ra und variiert zwischen ~ 20 nm bei unbehandelten HFIP-Filmen und 400-500 nm bei mit Wasser behandelten Ameisensäure-Filmen sowie Filmen aus wässriger Lösung. Abb. 3.16: Mittelrauheit Ra (a) und Rautiefe (b) von eADF4(C16) Filmen in Abhängigkeit des Lösungsmittels und der Nachbehandlung. Beide Parameter wurden aus AFM-Aufnahmen der jeweiligen Filme über eine Fläche von 1 µm2 (hellblau) bzw. 25 µm2 (dunkelblau) ermittelt, wobei die Werte aus stichprobenartig aufgenommenen Aufnahmen gemittelt wurden. (unb.: unbehandelt, MeOH: Methanol abs.; I und II: stark unterschiedliche Bereiche auf wL Filmen) 3.1.4.2 Benetzbarkeit/Hydrophobizität Die Hydrophobizität der Filmoberflächen wurde über Messung ihrer Benetzbarkeit mit Wasser bestimmt. Kontaktwinkel zwischen Oberfläche und Wassertropfen von ≥ 90° gelten dabei als hydrophob, während hydrophile Oberflächen durch kleinere Kontaktwinkel charakterisiert sind. Methanol-behandelte Filme variieren in ihrem Kontaktwinkel je nach verwendetem Lösungsmittel. Mit einem Messwert von 38,4° ± 6,9° (HFIP) bzw. 48,2° ± 5,8° (wL) sind HFIPund wL-Filme als hydrophil einzuordnen, während Ameisensäure-Filme mit 65,7° ± 2,0° etwas hydrophober sind (Tabelle 3.7). Vor der Behandlung ergaben Ameisensäure-Filme einen leicht geringeren Messwert (56° ± 3°), ebenso wie wL-Filme (43° ± 5°). Allerdings kann bei Filmen aus wässriger Lösung nicht ausgeschlossen werden, dass die Kontaktwinkel-Messung dadurch beeinträchtigt wird, dass sich die Filme teilweise in Wasser lösen. HFIP-Filme konnten dementsprechend gar nicht ohne Nachbehandlung untersucht werden. 70 % Methanol und Ethanol führten genau wie Kaliumphosphat bei allen Filmen zu einer starken Verringerung des Messwertes auf 11° bis 30°. Die Messwerte schwankten dabei allerdings stark, da der abgesetzte Tropfen meist nicht stabil war, sondern sich schnell auf dem Film verbreiterte. Daraus kann geschlossen werden, dass die Filmoberflächen stark hydrophil sind. Jedoch ist auch die Oberflächentopographie dieser Filme soweit verändert (s. o.), dass kein direkter Vergleich mit den anderen Filmen möglich Ergebnisse 93 ist. Insgesamt zeigten alle untersuchten Filme einen deutlich kleineren Kontaktwinkel als die Polystyrol-Oberfläche selbst (89,4° ± 1,1°). ~12 Tabelle 3.7: Kontaktwinkel von Wasser (H2OMQ) auf verschiedenen eADF4(C16)-Filmen (0,15 mg Protein/cm2, gegossen auf Polystyrol (Petrischale). 3.2 Modifizierung und Funktionalisierung von eADF4(C16) 3.2.1 Herstellung und Charakterisierung von Cystein-Varianten von eADF4(C16) Zur Erweiterung des Einsatzspektrums von auf eADF4(C16) basierenden Materialien ist eine Funktionalisierung mit externen Effektormolekülen von großem Interesse. Um einerseits eine schnelle und einfache Modifikation des Proteins mit unterschiedlichsten Molekülen zu ermöglichen, dabei aber andererseits die Position und Quantität der Modifikation genau kontrollieren zu können, wurde auf molekularbiologischem Weg ein Cystein in eADF4(C16) eingebracht. Da das Protein ursprünglich keine Thiole enthält, stellt die Thiolgruppe des eingebrachten Cysteins eine neue, spezifische Kopplungsstelle dar. 3.2.1.1 Design, Expression und Reinigung Konzeption und Klonierung Zwei Strategien wurden verfolgt, um jeweils ein Cystein in die Primärsequenz von eADF4(C16) zu integrieren. In dem ersten Ansatz wurde ein Cystein-haltiges Modul C* generiert, in dem das Serin des ursprünglichen C-Moduls an Position 25 durch Cystein ersetzt wurde (Abb. 3.17). Durch Anfügen dieses Moduls am Aminobzw. Carboxyterminus von eADF4(C16) ergaben sich die nun aus insgesamt 17 Modulen bestehenden Proteine C*C16 bzw. C16C* (s. Anhang, Kapitel 10.5). Der zweite Ansatz bestand darin, das Cystein außerhalb des C-Moduls zu platzieren. Dafür wurde es in eine 14 Aminosäuren umfassende Sequenz (tag) integriert (Abb. 3.17), welche im Folgenden als ntagCys bezeichnet wird, da sie am aminoterminalen Ende des Proteins angefügt wurde. Das daraus resultierende Protein wurde als ntagCysC16 bezeichnet. Nachbehandlung HFIP Ameisensäure wäss. Lösung unbehandelt n.b. 56,0° ± 3,0° (43,5° ± 4,6°) MeOH (abs.) 38,4° ± 6,9° 65,7° ± 2,0° 48,2° ± 5,8° MeOH (70%) ~ 11-20° Kaliumphosphat (1 M) ~ 12-30° Ergebnisse 94 Abb. 3.17: Cystein-haltige Varianten von eADF4(C16). Um jeweils ein Cystein in die Sequenz des Cysteinfreien eADF4(C16) einzubringen, wurden zwei Strategien verfolgt. Zum einen wurde das Modul C* generiert, in welchem Ser 25 in der ursprünglichen Sequenz zu Cys mutiert wurde. In einem zweiten Ansatz wurde ein Cystein in einer 14 Aminosäuren umfassenden Sequenz integriert („ntagCys“). Sowohl C* als auch ntagCys wurden als eigenständige Module entweder an das amino-oder carboxyteminale Ende der Sequenz von eADF4(C16) angebracht. (nach Spiess et al., 2010b mit freundlicher Genehmigung des Verlags Royal Society of Chemistry) Die für das Modul C* codierende DNA-Sequenz wurde mittels Mutagenese-PCR unter Verwendung der Primer pCSmut-fwd und pCS-CS25C-rev (s. Kapitel 2.1.1) hergestellt. Als Matrize diente das Plasmid pAZL(C), welches die für ein C-Modul codierende DNA-Sequenz enthält (Huemmerich et al., 2004a). Die für ntagCys codierenden DNA-Sequenz wurde durch Hybridisierung zweier komplementärer, synthetisierter Oligonukleotide (ntagCys-fwd und ntagCys-rev, s. Kapitel 2.1.1.1) erzeugt. Diese waren so konzipiert, dass an beiden Enden komplementäre Überhänge zum geschnittenen Zielvektor vorlagen. Nach Klonierung des jeweiligen Konstrukts in den Vektor pAZL standen somit für beide Strategien DNASequenzen zur Verfügung, die in einem etablieren Klonierungssystem zur nahtlosen Oligomerisierung (Huemmerich et al., 2004a) eingesetzt werden konnten. Hintergrund beider Strategien war, funktionelle Charakteristika von eADF4(C16), wie beispielsweise seine Assemblierungseigenschaften, möglichst nicht zu beeinträchtigen. So wurde für die erste Strategie der Austausch S25C aufgrund der chemischen und sterischen Ähnlichkeit beider Aminosäuren gewählt. Zudem zeigte ein Vergleich der Hydropathizitätsblots nach Kyte und Doolittle (Kyte & Doolittle, 1982) für die jeweiligen Proteine an dieser Stelle die geringsten Veränderungen (s. Anhang, Kapitel 10.5). Ergebnisse 95 Mittels Strategie 2 (ntagCys) sollte das Cystein als Kopplungsstelle an einer flexiblen und möglichst nicht mit der Ausbildung hydrophober (intermolekularer) Wechselwirkungen interferierenden Stelle bereitgestellt werden und ist daher durch einige Aminosäuren, bestehend aus Glycinund Serinresten, von der ursprünglichen Sequenz von eADF4(C16) getrennt. Proteinproduktion und -Reinigung Die Expression der mittels Sequenzierung verifizierten Konstrukte erfolgte in einem Bioreaktor im Expessionsstamm E. coli HMS174(DE3). Alle drei rekombinanten Proteine C*C16, C16C* sowie ntagCysC16 konnten weitgehend nach der für eADF4(C16) entwickelten Reinigungsstrategie gereinigt werden. Die Ausbeute betrug dabei 1,2-2,3 mg/g Biomasse, wobei von ntagCysC16 die höchsten Mengen erhalten wurden. Die Reinheit und Identität der Proteine konnte mittels SDS-PAGE, Westernblot (Abb. 3.18) und Massenspektrometrie (s. Kapitel 10.3, Abb. 10.5) überprüft und bestätigt werden. Abb. 3.18: Analyse der gereinigten Cys-Varianten von eADF4(C16) mittels SDS-PAGE (a) und WesternBlot (b). (a) Die Pro teine wurden mit bzw. ohne Zusatz von β-Mercaptoethanol inkubiert, mittels SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend einer Silberfärbung unterzogen. (b) Immunoblot der Proteine unter nichtreduzierenden Bedingungen. Die Detektion erfolgte über den auf dem Expressionsvektor pET21a kodierten T7tag, welcher am Aminoterminus der Proteine lokalisiert ist. M: Monomer, D: Dimer Beim Vergleich mit dem aufgetragenen Größenstandard in der SDS-PAGE fiel auf, dass die Laufstrecke der Proteine nicht ihrem theoretischen Molekulargewicht von 48,5 kDa (ntagCysC16) bzw. 50,6 kDa (C*C16 und C16C*) entspricht (s. Tabelle 3.8). Dieses Phänomen tritt jedoch auch bei eADF4(C16) auf, welches eine Molmasse von 47,7 kDa besitzt, und gründet sich vermutlich auf dessen spezielle Aminosäurezusammensetzung. Die massenspekrometrische Analyse bestätigte zudem in allen Fällen das erwartete Molekulargewicht (s. Anhang, Abb. 10.5). Bei Analyse unter nicht-reduzierenden Bedingungen zeigte sich bei allen drei Cystein-Varianten eine zusätzliche Proteinbande, die dem jeweiligen Dimer entspricht. Ergebnisse 102 3.2.3 Modifikation und Funktionalisierung von Filmen aus Cystein-Varianten von eADF4(C16) 3.2.3.1 Strukturelle Charakterisierung der Filme Im Folgenden wurde untersucht, ob die für eADF4(C16) bestimmten Charakteristika der Filmbildung sowie der Filme selbst bei Verwendung der Cys-Proteine erhalten bleiben. Es zeigte sich, dass alle drei Proteine zu Filmen prozessiert werden können. Dabei traten keine signifikanten Unterschiede zu eADF4(C16) auf, weder bei der Filmherstellung noch bei der strukturellen Untersuchung der Proteine in den Filmen. Exemplarisch sind FTIR-Spektren von aus HFIP gegossenen Filmen gezeigt (Abb. 3.24). Sie weisen sowohl vor als auch nach Behandlung mit Methanol abs. Charakteristika vergleichbar zu den entsprechenden eADF4(C16)-Filmen auf. Unbehandelte Filme zeigen FTIR-Maxima bei 1654 cm-1 und eine Schulter bei 1638 cm-1 und bestehen somit vornehmlich aus einer Mischung aus α-Helices und ungeordneten Strukturen. Eine für β-Polyalanin typische Absorption (um 964 cm-1) war nicht zu erkennen. Diese Absorption trat erst nach Methanol-Behandlung auf, welche auch in den Cys-Proteinen die Bildung von β-Faltblatt-Struktur induziert und zu einer Verschiebung des Absorptionsmaximums zu 1625 cm-1 führt (Abb. 3.24 b). Genauso glichen Filme gegossen aus AS und Puffer denen aus eADF4(C16) (Daten nicht gezeigt). Abb. 3.24: FTIR-Spektren Cys-haltiger Varianten im Vergleich zu eADF4(C16). Gezeigt sind aus HFIP gegossene Filme ohne (a) bzw. mit Methanol-Behandlung (b). ntagCysC16-FL: mit Fluorescein-Maleimid gekoppeltes ntagCysC16; RC: random coil. (nach Spiess et al., 2010b, mit freundlicher Genehmigung des Verlags Royal Society of Chemistry) Mit Fluorescein modifiziertes ntagCysC16 bildete Filme aus, die in ihrer Sekundärstruktur denen ohne Fluorescein gleichen (Abb. 3.24). Das kleine, hydrophobe Fluorophor-Molekül scheint daher nicht signifikant die Ausbildung der intraund intermolekularen Wechselwirkungen des Spinnenseidenproteins zu beeinträchtigen, welche bei Bildung der typischen Filmstruktur auftreten. Im Gegensatz dazu beeinflusst Fluorescein die Bildung von Ergebnisse 103 Hydrogelen aus eADF4(C16) bzw. die Anordnung der darin enthaltenen Nanofibrillen (Schacht & Scheibel, 2011). Filme aus den Cystein-Varianten entsprachen somit in ihrer Sekundärstruktur denen von eADF4(C16). Auch ihre chemische Beständigkeit gegenüber Wasser und Denaturierungsmitteln war identisch zu eADF4(C16)-Filmen (vgl. Kapitel 3.1.2). 3.2.3.2 Filmmodifikation Wie in Kapitel 3.2.3.1 beschrieben, können modifizierte Spinnenseiden-Filme prinzipiell durch Assemblierung von in Lösung modifiziertem Protein hergestellt werden. Diese Möglichkeit ist jedoch durch die Art des anzubringenden Moleküls limitiert. Abhängig von der chemischen Natur und der Größe ist eine Wechselwirkung bzw. Beeinträchtigung der natürlichen Proteinassemblierung zu erwarten. Daher wurde die nachträgliche Kopplung bereits gebildeter Filme untersucht. Zusätzlich bietet dies die Option, spezifisch die Filmoberfläche zu modifizieren (wiederum abhängig von den Eigenschaften des zu koppelnden Moleküls) sowie gegebenenfalls die Menge an eingesetzten Effektormolekülen zu minimieren. Die Dichte der funktionellen Gruppen kann zudem durch Herstellung von Blends gesteuert werden. Um Fragen der grundsätzlichen Reaktion, wie die Zugänglichkeit der Thiole im bereits assemblierten Film, zu klären, wurde zunächst Fluorescein für die Kopplungsreaktion verwendet. Anschließend wurden Filme mit verschiedenen Effektormolekülen modifiziert. Modifikation mit Fluorescein Zur Modifikation wurden Filme aus den Cystein-Varianten von eADF4(C16) aus Lösung in HFIP hergestellt und durch Methanol abs.-Behandlung wasserunlöslich gemacht. Die Kopplungsreaktion erfolgte analog zu der in Lösung mit Fluorescein-Maleimid in Anwesenheit von TCEP. Nach einer Inkubationszeit von 2 h wurde nicht gekoppeltes Fluorescein durch mehrmaliges Waschen entfernt. Eine erste qualitative Einschätzung der Kopplung konnte über Aufnahmen der Filme mittels Fluoreszenz-Imager erfolgen. Zur weiteren Analyse wurden die Filme jedoch in 6 M Guanidiniumthiocyanat (GdmSCN) gelöst und anschließend gegen Tris-Puffer (10 mM Tris/HCl, pH 8) dialysiert. SDS-PAGE zeigte bei allen drei Cys-Proteinen eine erfolgreiche kovalente Kopplung (Abb. 3.25). Durch spezifische Anregung von Fluorescein in einem Fluoreszenz-Imager zeigten die Cys-Proteine ein Signal auf Höhe des Protein-Monomers, während kein Signal bei der Kontrolle ohne Fluorescein zu sehen ist. Zudem wies eADF4(C16), welches zur Überprüfung der Kopplungsspezifiät genutzt wurde, keinerlei Signale auf. Nach anschließender Silberfärbung wurden neben Ergebnisse 104 Protein-Monomer auch Dimere sichtbar. Dies deutet darauf hin, dass ein Großteil der Proteine (vermutlich im Inneren der Filme) nicht für Reduktion bzw. Kopplung zugänglich sind. Da nach der Kopplungsreaktion keinerlei Reduktionsmittel mehr zugesetzt wurde, könnte es sich auch um Dimere handeln, die während der sich anschließenden Dialyse neu gebildet wurden. Abb. 3.25: Kopplung von Fluorescein-Maleimid an Filme aus Cystein-Varianten von eADF4(C16). Fluoresceinmodifizierte Filme wurden ÜN in 6 M GdmSCN gelöst, gegen 10 mM Tris/HCl pH 8 dialysiert und anschließend analysiert. (a) SDS-PAGE: Das Gel wurde im Fluoreszenz-Imager (Ex.: 480 nm, Em.: 530 nm) gescannt und nachfolgend einer Silberfärbung der Proteine unterzogen. (+) mit bzw. (-) ohne gekoppeltes Fluorescein (b) Mittels HPLC-Analyse der gelösten Filme bestimmte Menge an gebundenem Fluorescein pro Film, wobei die Filme aus unterschiedlichen Mischungsverhältnissen aus ntagCysC16 und eADF4(C16) gegossen waren. Die Stoffmenge an Fluorescein wurde durch Vergleich mit einer Standardgeraden ermittelt. (nach Spiess et al., 2010b, mit freundlicher Genehmigung des Verlags Royal Society of Chemistry) Eine quantitative Bestimmung des gebundenen Fluoresceins über UV-Absorption war aufgrund der geringen Konzentrationen nicht möglich. Daher wurde zur Quantifizierung Fluoreszenzspektroskopie in Kombination mit einer erstellten Standardgerade eingesetzt (s. Kapitel 2.5.2). Durch Analyse mittels HPLC konnte zudem ein Beitrag von eventuell noch vorhandenem freien Fluorescein ausgeschlossen werden. Für ntagCysC16 ergab sich ein Wert von 15,7 pmol Fluorescein pro cm2 Film (mit ca. 0,5 µm Dicke) (Abb. 3.25 b, 100 %). Bezogen auf die gesamte Proteinmenge im Film entspricht dies etwa 0,004 mol Fluorescein pro mol Protein. Modifizierung von Filmen mit variierendem Anteil an eADF4(C16) und eines Cys-Proteins (ntagCysC16) resultierte in steigender Fluorescein-Menge in Abhängigkeit des Anteils an CysProtein, wobei ein linearer Zusammenhang beobachtet wurde. Dies stellt einen weiteren Hinweis auf die Spezifität der Reaktion dar und ermöglicht das gezielte Einstellen eines gewünschten Modifikationsgrads (Abb. 3.25 b). Bei Betrachtung der gekoppelten Filme im konfokalen Fluoreszenzmikroskop zeigte sich diffuse Fluoreszenz im gesamten Film. Da dies auf Diffusion des Fluoresceins in den Film hindeutet, wurden zur weiteren Analyse Diffusionsexperimente an Methanol-behandelten HFIP-Filmen durchgeführt. Hierzu wurden Filme so befestigt, dass sie zwei Lumen einer Ergebnisse 105 Kammer voneinander trennten (Abb. 3.26 a). Eine stattfindende Diffusion konnte durch UVbzw. fluoreszenzspektroskopische Untersuchung festgestellt werden. Weitere Analyse mit Fluoreszenz-markierten Dextranen (FD) unterschiedlichen Molekulargewichts ergaben, dass 20 kDa FD scheinbar frei durch den Film diffundieren kann. Dextrane mit 40 kDa und 70 kDa ergaben einen Messwert von etwa 10 % des Wertes, der bei kompletter Durchmischung zu erwarten wäre (Abb. 3.26 b). Daher scheint die Ausschlussgröße der Filme zwischen 20 kDa und 40 kDa zu liegen. Dass Fluorescein-Maleimid einen geringeren Wert ergab, könnte möglicherweise darauf zurückzuführen sein, dass dieses kleine Molekül durch hydrophobe Wechselwirkungen im Film gebunden bleibt, was weitere Diffusion verhindert. Abb. 3.26: Diffusion von Fluorescein-Maleimid (Fl-Mal.) und Fluorescein-markierter Dextrane mit 20 kDa (FD20), 40 kDa (FD40) und 70 kDa (FD70) Molekulargewicht durch eADF4(C16) Filme. Die Filme (1 mg/cm2) wurden aus HFIP gegossen und mit Methanol abs. nachbehandelt. (a) Diffusion von FD20 (links) bzw. von FD40 (rechts) nach 2 h Inkubation. (b) Gemessene Konzentration an FD in der unteren Kammer, angegeben in % des Wertes, der bei optimaler Durchmischung erhalten würde. Funktionalisierung mit verschiedenen Effektormolekülen: RGD-Peptid, Nanogold, Biotin und β-Galactosidase Mit Fluorescein konnten alle drei Cys-Proteine erfolgreich modifiziert werden. Aufgrund der höheren Ausbeute bei der Reinigung wurde für die folgenden Versuche nur ntagCysC16 verwendet. Zudem zeigte es höhere Stabilität gegenüber Aggregation als C16C* und C*C16. Standardmäßig wurden für alle folgenden Modifikationen Methanol abs.-behandelte Filme aus HFIP eingesetzt. a) RGD-Peptid Das bereits in Lösung gekoppelte c(RGDfK)-Maleimid (Abb. 3.23 a) wurde alternativ auch an bereits assemblierte ntagCysC16 Filme gebunden (Abb. 3.27 a). Die Kopplung und Analyse erfolgte wie für Fluorescein-Maleimid beschrieben. Mit 15,3 pmol gebundenem Peptid pro cm2 Film ergab sich ein sehr ähnlicher Wert wie bei Fluorescein. Aufgrund der geringen Größe des Moleküls scheint eine teilweise Diffusion in den Film auch hier plausibel. Die über beide Strategien hergestellten Filme – einmal Kopplung vor und einmal nach Filmbildung – wurden im Weiteren in Zellkultur-Experimenten eingesetzt (Kapitel 3.3). Ergebnisse 106 Abb. 3.27: Funktionalisierung rekombinanter Spinnenseidenfilme aus ntagCysC16. (a) Kopplung von c(RGDfK)- Maleimid, detektiert über Fluoreszenz der mittels SDS-PAGE analysierten, gelösten Filme. (b) Gebundenes Biotin, detektiert mittels BCIP/NBT nach Inkubation mit Streptavidin-AP (blau-violettes Signal). Der Nachweis erfolgte direkt auf dem Film (rechts) sowie nach Auflösen des Films und anschließendem Western-Blot (links). (c) Die Aktivität immobilisierter β-Galaktosidase wurde durch Reaktion mit X-Gal visualisiert, wobei ein blauer Niederschlag entsteht. (d) TEM-Analyse von mit Nanogold gekoppelten Filmen nach Verstärkung (goldenhance) für 2 min. Als Kontrolle (-) ist ein eADF4(C16)-Film gezeigt, welcher derselben Kopplungsbehandlung unterzogen wurde (b und c) bzw. ein ntagCysC16-Film ohne Zusatz von Nanogold, jedoch mit Inkubation in Verstärkerlösung (d). Messbalken: b und c: 0,5 cm, d: 50 nm. (nach Spiess et al., 2010b, mit freundlicher Genehmigung des Verlags Royal Society of Chemistry) b) Biotin Biotin, ein kleines wasserlösliches Vitamin, ist bekannt für seine hohe Affinität zu Avidin und Streptavidin. Die dabei ausgebildete Bindung zählt zu den stärksten bekannten Interaktionen, welche rein auf nicht-kovalenten Interaktionen basieren. Das Molekül wurde als MaleimidKonjugat kovalent an Spinnenseidenfilme gebunden. Der Nachweis der erfolgreichen Immobilisierung von Biotin erfolgte mit Streptavidin, welches zur Detektion an Alkalische Phosphatase gekoppelt war (Abb. 3.27 b). Sowohl bei Durchführung der Nachweisreaktion direkt auf dem Film als auch nach SDS-PAGE und Westernblot des aufgelösten Films zeigte sich eine spezifische Reaktion bei ntagCysC16. eADF4(C16) als Negativkontrolle hingegen lieferte kein Signal. c) β-Galaktosidase Zusätzlich wurde ein Makromolekül auf den Filmen immobilisiert, was beispielsweise für die Entwicklung von Biosen soren einen wichtigen Schritt darstellt. Dafür wurde das Enzym βGalaktosidase gewählt (MW des aktiven Tetramers: ~465 kDa), welches glykosidische Bindungen spaltet. Die kovalente Anbindung an den Film wurde über einen heterobifunktionalen Linker in einer sequentiellen Kopplung erreicht (s. Kapitel 2.1.1.2 und 2.4.6.2). Dieser besaß einen NHS-Ester zur Reaktion mit primären Aminen des Enzyms sowie einen Maleimid-Gruppe zur Immobilisierung des Linker-Enzym-Komplexes auf dem Thiol- Ergebnisse 107 haltigen Film. Nach einigen Waschschritten zur Entfernung von nicht-gebundenem Enzym wurde dessen Anwesenheit sowie Aktivität durch Zugabe von X-Gal überprüft. Dieses wird durch aktives Enzym gespalten, wobei ein unlösliches blaues Produkt entsteht. eADF4(C16) Filme dienten als Kontrolle, ob die Waschschritte effektiv genug waren um unspezifische, nicht-kovalente Interaktionen zu verhindern. Abb. 3.27 c zeigt den positiven Nachweis von aktivem Enzym. d) Nanogold Eine Funktionalisierung mit Gold-Nanopartikeln bietet die Möglichkeit, durch anschließende Analyse im Transmissionselektronenmikroskop (TEM) Einblicke in die räumliche Anordnung der gekoppelten Moleküle zu erhalten. In der Anwendung ist Gold besonders hinsichtlich seiner spezifischen Chemie und katalytischen Aktivität sowie wegen der dadurch ermöglichten Leitfähigkeit von Interesse. Die Kopplung erfolgte in Form von Monomaleimido-Nanogold (mit einem Durchmesser von 1,4 nm) wie in Kapitel 2.4.6.2 beschrieben. Zur besseren Detektierbarkeit wurden die Goldpartikel anschließend einem Verstärkungsschritt unterzogen, bei dem spezifisch weiteres Gold angelagert wird. Über die Inkubationsdauer der Verstärkung wird die Größe der erhaltenen Goldpartikel beeinflusst. Nach zweiminütiger Inkubation waren Partikel von 2-5 nm Durchmesser im TEM zu erkennen (Abb. 3.27 d). Die Signale waren dabei mit 185 fmol/cm2 über die gesamte Filmoberfläche verteilt, ohne dass ein Muster zu erkennen war. Aus den erhaltenen Aufnahmen scheint eine zufällige Anordnung der Moleküle an der Filmoberfläche wahrscheinlich. 3.3 Untersuchung potentieller Anwendungen von (modifizierten) eADF4(C16)-Filmen Filme aus dem rekombinanten Spinnenseidenprotein eADF4(C16) bzw. seiner Cys-Varianten wurden im Hinblick auf zwei Anwendungsfelder analysiert. Eines zielt Richtung biomedizinischer Bereiche, wozu zunächst die grundsätzliche Verträglichkeit/Biokompatibilität der Filme getestet wurde (Kapitel 3.3.1). Als zweites standen Oberflächeneigenschaften der Filme bei Beschichtung technischer Materialien im Fokus (Kapitel 3.3.2). 3.3.1 Analyse der Biokompatibilität in Zellkultur-Untersuchungen Eine Anwendung von auf Spinnenseide basierenden Materialien ist besonders im medizinischen Bereich von großem Interesse. Während für natürliche Spinnenseide eine gute Verträglichkeit bekannt ist (Rising et al., 2010; Altman et al., 2003; Allmeling et al., 2006), lagen keine Daten zur Interaktion des rekombinant hergestellten Proteins eADF4(C16) mit Ergebnisse 108 biologischem Material vor. Erste Anhaltspunkte dafür lieferten in dieser Arbeit in vitro Zellkultur-Experimente. 3.3.1.1 Generelle Parameter der Filmpräparation und Zellkultivierung Im Folgenden wurde daher die Kultivierung von Zellen auf Filmen rekombinanter Spinnenseidenproteine untersucht. Als Zelllinie wurde MC3T3-E1 verwendet (ACC 210, DSZM). Dabei handelt es sich um murine embryonale Zellen der Schädeldecke. Sie sind fibroblastenartig, können sich jedoch bei entsprechender Stimulierung auch zu Osteoblasten differenzieren. Diese Zelllinie findet breite Verwendung in der Untersuchung von Zelladhäsion und -proliferation. Außerdem weist sie ein auf c(RGDfK) responsives IntegrinExpressionsmuster auf (Kantlehner et al., 2000). Die Zellkulturexperimente wurden zum einen auf eADF4(C16) Filmen durchgeführt, welche aus verschiedenen Lösungsmitteln gegossen waren. Als weiterer Punkt wurde der Einfluss verschiedener Nachbehandlungsmethoden untersucht. Zum anderen kamen mit RGD-Peptid modifizierte Filme zum Einsatz. Alle Filme wurden direkt aus der jeweiligen Proteinlösung (3 mg/ml) in Zellkulturplatten aus (unbehandeltem) Polystyrol gegossen. Die Proteinmenge betrug dabei 0,15 mg/cm2, was in Filmen von etwa 0,5-1 µm Dicke resultiert. Nach Nachbehandlung und Trocknung der Filme wurden sie jeweils zweimal mit PBS und dem verwendeten Zellkultur-Medium gewaschen, bevor die Zellen darauf ausgesät wurden. Als Kontrolle dienten jeweils Polystyrol-Platten ohne Film („unbeschichtet“) bzw. speziell für gute Zelladhäsion entwickelte, modifizierte Polystyrol-Platten („ Positivkontrolle“). Soweit nicht anders vermerkt, wurde immer Zellkulturmedium mit Zusatz von 10 % Kälberserum (FKS) verwendet. 3.3.1.2 Einfluss des Lösungsmittels Zur Untersuchung, ob die Wahl des Lösungsmittels die Interaktion der daraus gegossenen Filme mit den Zellen beeinflusst, kamen mit Methanol abs. nachbehandelte eADF4(C16) Filme aus HFIP, Ameisensäure und wässriger Pufferlösung (wL) zum Einsatz. Die Zellen wurden über einen Zeitraum von sieben Tagen auf den Filmen kultiviert und zu verschiedenen Zeitpunkten hinsichtlich ihrer Vitalität untersucht. Diese wurde mittels WST-Assay bestimmt (s. Kapitel 2.8.2), welcher die mitochondriale Enzymaktivität misst. Unter der Annahme, dass alle vitalen Zellen eine vergleichbare Enzymaktivität aufweisen, kann daraus auch indirekt auf die relative Zellzahl bzw. Zellvermehrung geschlossen werden. Die gemessenen Werte wurden jeweils auf die Positivkontrolle normiert. Ergebnisse 109 Abb. 3.28: Zellaktivität von MC3T3-Zellen auf eADF4(C16) Filmen in Abhängigkeit der Kultivierungsdauer. Die Filme wurden aus dem jeweils angegebenen Lösungsmittel gegossen und mit Methanol abs. behandelt. Nach 24 h, 48 h, 4 d sowie 7 d Kultivierung der Zellen auf den Filmen wurde ihre Viabilität mittels WST-Assay bestimmt und auf den erhaltenen Wert der Positivkontrolle (Kultivierung in optimierten Zellkulturplatten) normiert. Die Werte wurden jeweils aus Vierfachbestimmung erhalten (n=4). Für die Analyse nach 24 h, 48 h sowie 4 d wurden jeweils 5 x 103 Zellen pro well ausgesät, für den 7 d-Versuch 2,5 x 103 Zellen pro well. Auf Ameisensäure-Filmen liegt die Zellvitalität bereits nach 24 h etwas höher als bei der Positivkontrolle, während auf HFIPund wL-Filmen zunächst eine niedrigere Vitalität vergleichbar der auf unbeschichteten Platten ohne Film beobachtet wird (Abb. 3.28). Mit zunehmender Kultivierungsdauer steigt der Wert und beträgt nach 4 d 70 % (HFIP) bzw. 100 % (wL) im Vergleich zur Positivkontrolle. Nach 7 d weisen die Zellen auf allen Filmen Werte über 100 % auf. Somit wirkt eADF4(C16) in Form der hier untersuchten Filme nicht cytotoxisch, sondern ermöglicht eine Kultivierung und Vermehrung der Zellen. Auf Filmen aus HFIP und wL scheint die Proliferation etwas verzögert, auf Ameisensäure-Filmen hingegen vergleichbar der Positivkontrolle. Als weiteres wichtiges Kriterium wurde die Morphologie der Zellen auf den Spinnenseidenfilmen betrachtet. Lichtmikroskopische Aufnahmen (in Abb. 3.29 gezeigt nach 48 h Kultivierung auf Seidenfilmen) zeigen eine typisch flache, ausgebreitete Zellmorphologie auf allen Filmen, wobei keine signifikanten Unterschiede zu den Kontrollplatten zu erkennen sind. Ergebnisse 110 Abb. 3.29: Lichtmikroskopische Aufnahmen von MC3T3-Zellen nach 48-stündiger Kultivierung auf mit Methanol abs. nachbehandelten eADF4(C16) Filmen gegossen aus Ameisensäure (A), HFIP (B) oder wL (C). Als Vergleich dienten Zellen kultiviert in entsprechenden Platten ohne Film (unbeschichtet, E) sowie in speziell behandelten Zellkulturplatten (Positivkontrolle, D). Messbalken: 100 µm. Nach einer gewissen Inkubationszeit (meist ca. 4 d) lösten sich die Zellen auf allen Seidenfilmen im Gegensatz zu Zellkulturplatten ohne Film jedoch verstärkt als Zellverbund ab. Durch Aussäen einer geringeren Anfangszellzahl konnten die Zellen jedoch 7 d und länger auf den Filmen inkubiert werden, so dass der Grund für das Ablösen nicht die zeitliche Exposition, sondern die Konfluenz der Zellen zu sein scheint. Ab Erreichen einer gewissen Zelldichte sind anscheinend die Kräfte zwischen den Zellen stärker als die Adhäsion auf dem Proteinfilm. Um eine stärkere Adhäsion auf den Filmen zu erreichen, wurden diese mit dem bereits beschriebenen RGD-Peptid modifiziert (s. Kapitel 3.3.1.4). Um zu überprüfen, ob möglicherweise restliches organisches Lösungsmittel über die Zeit aus den Filmen abgegeben wird und das Zellverhalten bestimmt, wurden Filme in einem parallelen Ansatz 4 d mit Medium allein inkubiert (bei 37 °C) und die Zellen nach Medienwechsel ausgesät. Diese Behandlung führte jedoch zu keiner Veränderung des beobachteten Zellverhaltens. 3.3.1.3 Einfluss der Nachbehandlung Wie in Kapitel 3.1.1.2 gezeigt, führen die in dieser Arbeit getesteten Nachbehandlungsarten alle zu einer vermehrten Ausbildung von β-Faltblatt-Struktur, so dass sich die jeweiligen Filme kaum in ihrer Sekundärstruktur unterscheiden. Allerdings wurden in Abhängigkeit der Nachbehandlung Unterschiede in der Oberflächenbeschaffenheit der Filme festgestellt (s. 3.1.4). Daher wurde im Folgenden überprüft, ob sich dies auf die Interaktion mit Zellen auswirkt. Untersucht wurden Filme, die jeweils über Nacht mit Alkohol (70 % und abs.) bzw. Ergebnisse 111 mit 1 M Kaliumphosphat inkubiert worden waren. Aufgrund der Toxizität von Methanol sowie der weitverbreiteten Anwendung von Ethanol in Zellkulturarbeiten wurde neben Methanol auch Ethanol verwendet. Abb. 3.30: Zellaktivität von MC3T3-Zellen auf eADF4(C16) Filmen in Abhängigkeit der Nachbehandlungsmethode. Die Filme wurden aus dem jeweils angegebenen Lösungsmittel gegossen und ÜN mit Methanol (70 % und abs.) bzw. 1 M Kaliumphosphat (pH 8) behandelt. HFIP-Filme wurden zusätzlich mit Ethanol (EtOH, 70% und abs.) behandelt. Nach 48 h Inkubation wurde die Zellaktivität mittels WST-Assay bestimmt (n=4) und auf den erhaltenen Wert der Positivkontrolle (=100 %) normiert. Abb. 3.30 zeigt, dass eine Nachbehandlung mit Alkohol abs. oder Kaliumphosphat zu ähnlichen Ergebnissen führt, welche zwischen Filmen aus den verschiedenen Lösungsmitteln leicht variieren. Zwischen Methanol und Ethanol ist dabei kein signifikanter Unterschied festzustellen. Dies gilt auch bei Nachbehandlung mit 70 %-igem Alkohol, wobei hier bei allen Filmen die schlechtesten Werte erhalten wurden. Verglichen mit der Positivkontrolle erreicht die Mitochondrienaktivität auf diesen Filmen nur zwischen 35 % (HFIP) und 65 % (wL). Um zu überprüfen, ob diese niedrigen Werte bei Nachbehandlung mit 70 % Alkohol möglicherweise durch noch vorhandenen Alkohol verursacht werden, wurden die Filme zusätzlich zu den sonst angewendeten zwei Waschschritten für 4 d mit Medium inkubiert (37 °C) und die Zellen anschließend nach Medienwechsel ausgesät. Diese Behandlung führte jedoch zu keiner Veränderung des beobachteten Effekts. Lichtmikroskopische Untersuchungen der jeweiligen Probe bestätigt diese Beobachtung. Während die Zellen auf Filmen nachbehandelt mit Ethanol abs. und Kaliumphosphatlösung gut ausgebreitet sind und denen auf der Positivkontrolle entsprechen (Abb. 3.31 D-F), sind auf den Proben mit 70 % Ethanol bzw. Methanol nur wenig ausgebreitete Zellen zu erkennen. Der Großteil der Zellen liegt hier in abgerundeter Form und als Zellagglomerate vor, was auf schlechte Adhäsionsmöglichkeiten für die Zellen hindeutet (Abb. 3.31 A-C). Diskussion 119 4 Diskussion Seidenproteine stellen aufgrund ihrer mechanischen Eigenschaften, Biokompatibilität und Abbaubarkeit ein potentiell vielversprechendes Ausgangsmaterial für verschiedenste Materialien und Anwendungsbereiche dar. Eine für Beschichtungen oder (biokompatible) Trägersysteme interessante Anwendungsform stellen Filme dar, welche z. B. aus rekombinant hergestellten Spinnenseidenproteinen gebildet werden können. Die Eigenschaften von Seidenfilmen lassen sich auf zwei Aspekte zurückführen: ihre makroskopischen Eigenschaften, wie Oberflächenstrukturierung oder mechanische Stabilität, sowie ihre molekulare Struktur. Beides kann über geeignete Wahl des Proteins sowie der Parameter bei der Filmherstellung beeinflusst werden, was eine Feinabstimmung der Filmeigenschaften an die Anforderungen bestimmter Applikationen erlaubt (Schema 4.1). Die in dieser Arbeit analysierten Filme aus dem rekombinanten Spinnenseidenprotein eADF4(C16) wurden im Hinblick auf die Parameter Lösungsmittel, Nachbehandlungsmethode, Temperatur und Luftfeuchtigkeit untersucht. Zudem wurden die Filme mittels posttranslationaler chemischer Kopplung diverser Moleküle funktionalisiert. Schema 4.1: Einfluss verschiedener Parameter auf Materialeigenschaften von eADF4(C16)-Filmen. Schematisch dargestellt sind die einzelnen Schritte der Filmherstellung. Die Filmeigenschaften können dabei durch die Wahl einzelner oder kombinierter Faktoren kontrolliert werden. (nach Spiess et al., 2010a, mit freundlicher Genehmigung des Verlags John Wiley & Sons) Diskussion 120 4.1 Einfluss verschiedener Parameter auf die eADF4(C16) Sekundärstruktur in Filmen 4.1.1 Einfluss des Lösungsmittels In wässriger Pufferlösung (wL) zeigt eADF4(C16) CD-Spektren typisch für unstrukturierte Proteine bzw. Polyprolin II-Helices, mit einem kleinen Anteil anderer Strukturen. Damit ähnelt es der Struktur nativer MaSps (major ampullate Spidroine) in der Spinndrüse. Diese wurde als eine Mischung dynamischer helikaler Strukturen bzw. ungeordneter und Polyprolin II-helikaler Bereiche (Lefevre et al., 2007a; Hijirida et al., 1996) beschrieben. Zusätzlich wurden α-Helices beobachtet, welche jedoch den nicht-repetitiven Termini zugeordnet wurden und somit in eADF4(C16) – welches nur den repetitiven Sequenzteil enthält – nicht vorhanden sind. In Filmen hingegen war ein deutlicher Anteil an β-Faltblatt-Struktur zu sehen. Allerdings wiesen die aus Puffer gegossenen Filme strukturelle Inhomogenität auf, was sich auch in ihrem mechanischen Verhalten und ihrer Topologie manifestierte. Möglicherweise tritt bedingt durch Luftströmungen in der verwendeten Klimakammer eine inhomogene Trocknung der Filme auf, was zur Ausbildung lokaler Unterschiede in der Proteinkonzentration führen würde. Assemblierungsstudien von eADF4(C16) zeigten, dass die Kinetik der Ausbildung von β-Faltblättern – neben anderen Faktoren – direkt von der Proteinkonzentration abhängt (Slotta et al., 2008). Im Gegensatz dazu traten keine vergleichbaren Inhomogenitäten in Filmen aus den organischen Lösungsmitteln auf. Da Wasser im Vergleich zu HFIP und Ameisensäure den niedrigsten Dampfdruck besitzt, können hier die ausgeprägtesten Trocknungsartefakte auftreten. Zudem wurden mittels statischer Lichtstreuung auch nach Ultrazentrifugation der Probe geringe Mengen von eADF4(C16) Oligomeren in wässriger Lösung (nach Dialyse) detektiert (s. Abb. 3.20). Diese könnten als Aggregationskeime fungieren und so lokale Strukturunterschiede bedingen. Auch ein unterschiedlicher Wasseranteil könnte zu den beobachteten Unterschieden im Amid I-Bereich der FTIR-Spektren führen, da Wasser ein breites IR-Absorptionssignal bei etwa 1650 cm-1 erzeugt. Allerdings wäre dies zusätzlich an einer veränderten Absorption zwischen 3000 cm-1 und 3600 cm-1 zu erkennen, da sich in diesem Wellenzahlenbereich Valenz-schwingungen des Wassers und die Amid A-Bande von Proteinen überlagern. Entsprechende Spektren wurden jedoch nicht erhalten, so dass die veränderte Absorption der Amid I-Bande auf veränderte Sekundärstruktur der Proteine und nicht auf unterschiedlichen Wassergehalt in den jeweiligen Filmbereichen zurückzuführen ist. Diskussion 121 Lösungen von eADF4(C16) in HFIP weisen im Vergleich zu wässrigen Proteinlösungen einen deutlich erhöhten Anteil an α-Helices auf. Diese Helix-induzierende Wirkung ist für fluorierte Alkohole allgemein bekannt, wobei HFIP den stärksten Effekt bewirkt (Gast et al., 2001; Hirota et al., 1997). Es konnte gezeigt werden, dass dies auf bevorzugter Bindung des HFIP an das Polypeptid beruht, obwohl ein zusätzlicher Beitrag durch Modifizierung der Hydrat-/Solvathülle des Proteins nicht ausgeschlossen werden kann (Gast et al., 2001). Auch nach Abdampfen des Lösungsmittels weisen HFIP-Filme den höchsten Anteil α-helikaler Struktur aller untersuchten Filme auf. Zudem besitzen die Filme den geringsten Anteil an β-Faltblatt-Struktur und insbesondere keine für Seiden typische β-Polyalanin-Strukturen. Analyse mittels 13C-NMR bestätigte, dass die Alaninreste in Filmen aus HFIP vorwiegend in helikalen Strukturen (α-Helices und/oder 31-Helices) vorliegen (Spiess et al., 2011; durchgeführt von Dr. C. Keenan, AG Prof. J. Senker, Lehrstuhl für Anorganische Chemie III, Universität Bayreuth). Auch Glycin und Prolin waren teilweise in 31-Helices angeordnet, einer Struktur, welche auch im Seidenfaden vorliegt (Holland et al., 2008a). Signale für βFaltblatt-Konformation zeigte nur Glycin, wohingegen Prolin, Glutamin und Tyrosin random coil Konformationen zugeordnet wurden (Spiess et al., 2011). Die Sekundärstruktur von eADF4(C16) gelöst in Ameisensäure konnte nicht bestimmt werden. Im Film besaß das Protein aber mit etwa 30 % den höchsten β-Faltblatt-Anteil. Eine Induktion von β-Faltblatt-Struktur durch Ameisensäure wurde auch bei anderen Proteinen beobachtet (Vasconcelos et al., 2008; Ha et al., 2005; Um et al., 2001). Die Wirkung resultiert vermutlich aus Interaktion der stark polaren Säure mit polaren Aminosäureresten der Proteine. Untersuchungen mittels Trübheitsmessung, DLS und FTIR-Spektroskopie ergaben, dass Ameisensäure regeneriertes Fibroin einerseits in Lösung stabilisieren kann, das Protein aber eine kompakte Form annimmt, so dass die bereits in räumlicher Nähe liegenden hydrophoben Bereiche bei Entfernen des Lösungsmittels zu einer vermehrten Ausbildung geordneter β-Faltblätter führt (Vasconcelos et al., 2008; Um et al., 2003). 4.1.2 Einfluss chemischer und physikalischer Nachbehandlungsmethoden Eine Nachbehandlung von Seidenfilmen mit Alkoholen und Kaliumphosphat führt zu einer Zunahme an β-Faltblatt-Struktur der beteiligten Seidenproteine. Der Effekt beruht vermutlich auf der Beeinflussung der Hydrat-/Solvathülle der Proteine sowie der Stärkung hydrophober Interaktionen. Stark polare Alkohole, wie Methanol und Ethanol, beeinflussen die Dielektrizitätskonstanten des Lösungsmittels und führen zu Entzug der Hydrathülle des Proteins (Um et al., 2003). Kaliumsowie Phosphat-Ionen werden den kosmotropen Ionen der Hofmeisterserie zugeordnet (Baldwin, 1996; Hofmeister, 1888; Zhang & Cremer, 2006). Diskussion 122 Somit führen beide Nachbehandlungsmethoden zu einer Stärkung hydrophober Interaktionen und somit zur bevorzugten Ausbildung interund intramolekularer Wechselwirkungen der Polypeptide im Vergleich zu Interaktionen mit umgebenden Lösungsmittelmolekülen. Dieser Effekt spielt ebenfalls eine entscheidende Rolle bei der Strukturbildung von Seidenproteinen während des natürlichen Spinnprozesses, wo die Konzentration an Kaliumund PhosphatIonen im zweiten Abschnitt des Spinntrakts erhöht wird. Es wurde vermutet, dass dabei besonders Polyprolin II-Strukturen – welche in der Spinndrüse nachgewiesen wurden – aufgrund ihrer Geometrie thermodynamisch begünstigt in β-Faltblatt-Strukturen überführt werden können (Lefevre et al., 2007a). In den hier untersuchten Filmen gegossen aus HFIP ergab eine NMR-Analyse, dass sich nach Behandlung mit Methanol die Konformation von Alaninund Serinresten von Helices hin zu β-Faltblatt ändert, wobei nur etwa 10 % aller Alaninreste in helikaler Struktur verbleiben. Eine ähnliche Strukturänderung, wenn auch in geringerem Ausmaß, war für Glycin zu beobachten (Spiess et al., 2011; durchgeführt von Dr. C. Keenan, AG Prof. J. Senker, Lst. für Anorganische Chemie III, Universität Bayreuth). Eine Induktion von β-Faltblatt-Struktur war auch bei Filmen aus den anderen Lösungsmitteln zu beobachten. Mittels FSD von FTIR-Spektren ergaben sich gleiche prozentuale Anteile an β-Faltblatt-Struktur in behandelten Filmen, unabhängig vom Lösungsmittel und der verwendeten Nachbehandlungsmethode, was darauf hindeutet, dass damit die thermodynamisch günstigste Konformation erreicht ist. Aufgrund der Ausgangsstruktur in unbehandelten Filmen war die Strukturänderung bei HFIP-Filmen am stärksten ausgeprägt. Andere Arbeiten beschreiben eine Abhängigkeit der Menge an gebildeten β-Faltblättern von der Konzentration des Alkohols (Lammel, 2010; Kweon & Park, 1999). Dies konnte in der vorliegenden Arbeit nicht beobachtet werden. Allerdings traten die größten Unterschiede v. a. bei Konzentrationen unterhalb 60 % auf, welche hier nicht untersucht wurden. Ein weiterer Faktor ist zudem die Inkubationsdauer. Alle in dieser Arbeit verwendeten Filme wurden über Nacht (ca. 16 h) nachbehandelt. Zeitaufgelöste Messungen ergaben, dass bei den hier verwendeten Filmen (mit einer Dicke ≤ 15 µm) die größte Änderung in der Struktur innerhalb von 30-60 min auftrat, jedoch über einige Stunden weiterhin zunahm (Daten nicht gezeigt). Nach dieser Zeit war kein signifikanter Unterschied (bzgl. der Sekundärstruktur) zwischen mit 70 % bzw. 100 % Alkohol nachbehandelten Proben zu erkennen, was auf das Erreichen eines Gleichgewichts schließen lässt. Eine Zunahme an β-Faltblatt-Struktur konnte zudem – mit Ausnahme von HFIP Filmen – bei erhöhter Luftfeuchtigkeit festgestellt werden. Vermutlich ermöglicht die dadurch verzögerte Evaporation des Lösungsmittels und stärkere Hydratisierung der Proteine die Ausbildung Diskussion 123 möglichst stabiler interund intramolekularer Interaktionen. Da mit steigender Luftfeuchtigkeit ein erhöhter Wassergehalt in den Filmen festgestellt wurde, ist auch eine direkte Beteiligung des Wassers (über Ausbildungen temporärer H-Brücken) an molekularen Umlagerungsprozessen sehr wahrscheinlich. Bei Filmen aus HFIP nimmt der Wassergehalt mit steigender Luftfeuchtigkeit ebenfalls zu. Hier verhindert aber möglicherweise der starke Einfluss des Lösungsmittels eine Änderung der Sekundärstruktur. Zum einen besitzt dieses Lösungsmittel (mit einem Siedepunkt von 58,2 °C) den höchsten Dampfdruck (~159 hPa bei 20 °C) der verwendeten Lösungsmittel und führt somit zur schnellsten Trocknung. Zum anderen zeigten TGA-, DSCund FTIR-Messungen, dass HFIP bei RT in den Filmen gebunden bleibt (etwa 16 Gewichtsprozent). Auch Temperaturen oberhalb von etwa 180 °C führten zu einer Zunahme an β-Struktur, wobei bei HFIP-Filmen eine Korrelation mit dem Abdampfen des Lösungsmittels zu erkennen war. Eine vergleichbare Strukturänderung trat bei Ameisensäureund wL-Filmen bei etwas höheren Temperaturen auf. Zwei Effekte scheinen hierbei zusammen zu spielen: Einerseits das Abdampfen des Struktur-beeinflussenden Lösungsmittels und andererseits die Zuführung einer Energiemenge, welche molekulare Umlagerungen ermöglicht. Ein Vergleich mit DSC-Messungen an Methanol-behandelten Filmen zeigt, dass auch hier in einem ähnlichen Temperaturbereich (etwa 200 °C) Änderungen auftreten. Der Versatz in diesen Kurven kann in Anlehnung an Erfahrungen mit Polymeren als Glasübergang interpretiert werden (Ehrenstein et al., 1998; Magoshi et al., 1977; Magoshi & Nakamura, 1975). Im Fall von Proteinen wurde dies als Erhöhung der Beweglichkeit der Moleküle gedeutet, vermutlich durch Schwächung nicht-kovalenter Bindungen (Motta et al., 2002; Hu et al., 2008; Freddi et al., 1999). Von entscheidender Bedeutung ist dabei der Hydratisierungsgrad der Proteine, wobei ein höherer Wassergehalt mit einer niedrigeren Glasübergangstemperatur Tg korreliert wird (Agarwal et al., 1997; Motta et al., 2002; Hu et al., 2007). Auch dynamisch mechanische Analyse ergab Änderungen in dem mechanischen Verhalten der Filme in einem ähnlichen Temperaturbereich. Abhängig vom verwendeten Lösungsmittel und der Nachbehandlungsmethode verlieren sie ab 150-210 °C ihre Steifigkeit und zeigen plastische Verformung, was wiederum dem Auftreten eines Glasübergangs, und somit einer Erhöhung der molekularen Mobilität entspricht. Ohne mechanische Belastung führt dies zur vermehrten Ausbildung stabiler β-Faltblatt-Strukturen, wohingegen bei Anliegen externer Kräfte die mechanische Integrität zerstört wird. Diskussion 124 4.2 Beeinflussung makroskopischer Eigenschaften 4.2.1 Chemische und thermische Beständigkeit Neben einer Beeinflussung der Sekundärstruktur zeigen sich auch Effekte des verwendeten Lösungsmittels auf makroskopische Eigenschaften. So weisen die Filme je nach gewähltem Lösungsmittel unterschiedliche Beständigkeit gegenüber Wasser und Denaturierungsmitteln auf. Dies korreliert u. a. mit dem jeweiligen Gehalt an β-Faltblatt-Struktur. Während β-Faltblatt-reiche Filme (unbehandelte Ameisensäure-Filme sowie alle nachbehandelten Filme) eine chemische Stabilität vergleichbar der des natürlichen Seidenfadens aufweisen, nimmt mit abnehmendem β-Faltblatt-Anteil die Löslichkeit in schwächeren Denaturierungsmitteln (wie 8 M Harnstoff) zu. HFIP-Filme schließlich sind bereits in Wasser gut löslich. Im Gegensatz dazu zeigt sich kein auffälliger Unterschied der thermischen Beständigkeit von Filmen aus unterschiedlichen Lösungsmitteln. Bei den bereits erwähnten Vorgängen des Verdampfens von Lösungsmittel bzw. der Strukturumwandlung hin zu β-Faltblatt variieren sie nur leicht in den jeweiligen Temperaturen. Thermische Zersetzung der Filme beginnt sowohl bei unbehandelten als auch Methanol-behandelten Filmen aller Lösungsmittel bei etwa 280 °C und zeigt ihr Hauptsignal bei 330 °C. Diese hohe Temperaturbeständigkeit kann vermutlich auf den hohen Anteil an β-Strukturen zurückgeführt werden, welche auch nach Erhitzen auf 280 °C mittels FTIR-Spektroskopie nachzuweisen waren. Aufgrund der Temperatur-induzierten Bildung von β-Faltblättern unterscheiden sich unbehandelte Filme nicht in ihrer Stabilität von (ebenfalls β-Faltblatt-reichen) Methanol-behandelten Filmen. Zudem können durch Prozesse wie Pyrolyse aromatischer Aminosäuren oder Aufbrechen von Peptidbindungen Peptide unabhängig von ihrer Konformation zersetzt werden. 4.2.2 Topographie Sowohl die Wahl des Lösungsmittels als auch die Nachbehandlungsmethode führte zu einer unterschiedlichen Oberflächenbeschaffenheit der Filme. HFIP-Filme wiesen die glatteste Oberfläche auf, was vermutlich an der niedrigen Oberflächenspannung und damit einhergehend der guten Benetzbarkeit der Oberfläche sowie dem hohen Dampfdruck des HFIP liegt. Verzögerte Evaporation des Lösungsmittels könnte hingegen zu Aufplatzen der Filmoberfläche führen und somit die Ursache für die Löcher bzw. Dellen in AmeisensäureFilmen darstellen. Filme aus wässriger Lösung fielen v. a. durch eine heterogene und rauere Oberflächentopographie auf. Dies steht vermutlich in Zusammenhang mit der bereits beschriebenen ungleichmäßigen Trocknung der Filme oder der Anwesenheit von Aggregationskeimen, welche auch zur Ausbildung lokaler Unterschiede der Sekundärstruktur- Diskussion 125 Zusammensetzung führt. Ein ähnlicher Effekt auf die Topographie (heterogene und raue Oberfläche) wurde bei Nachbehandlung aller Filme mit Wasser, wasser-haltigen Alkoholen oder Phosphatpuffer beobachtet. Eine mögliche Ursache könnten Umlagerungen der Moleküle nach Hydratisierung in Zusammenspiel mit dynamischer Bildung/Aufbrechen von Wasserstoff-Brücken darstellen. Interessanterweise trat der Effekt nicht bzw. nur in sehr geringem Ausmaß auf, wenn Methanol-behandelte Filme mit Wasser inkubiert wurden. Die Methanol-induzierte, kompakte β-Faltblatt-Struktur scheint nicht mehr durch Wasser beeinflusst zu werden. Ähnliches gilt für den natürlichen Seidenfaden: Durch Benetzung mit Wasser kommt es zur Superkontraktion; hydratisiert und umgelagert werden allerdings nur die Bereiche mit weniger geordneter Struktur, wohingegen kristalline β-Faltblatt-Regionen unverändert bleiben (Holland et al., 2008b; Holland et al., 2004; Liu et al., 2005). Eine Nachbehandlung mit reinem Methanol verändert die Topographie der Filme nur geringfügig und resultiert in den glattesten und homogensten Oberflächen der nachbehandelten Filme. 4.2.3 Mechanische Eigenschaften und Rückschlüsse auf molekulare Anordnung Mechanisches Verhalten Die Wahl des Lösungsmittels zeigte einen deutlichen Effekt auf die mechanischen Eigenschaften der jeweiligen Filme, sowohl in unbehandelter als auch Methanol-behandelter Form. Wiederum lässt sich ein Zusammenhang mit der in den Filmen vorliegenden Sekundärstruktur erkennen. Eine generelle Korrelation bestimmter mechanischer Parameter mit dem Gehalt an β-Faltblatt-Struktur wurde bereits für Filme aus Seidenfibroin beschrieben (Vasconcelos et al., 2008; Jiang et al., 2007). Die Wirkung beruht vermutlich darauf, dass regelmäßig angeordnete β-Faltblatt-Bereiche als physikalische Quervernetzung fungieren und dem Molekülverbund so Festigkeit verleihen (Keten & Buehler, 2010). Dies manifestiert sich in einer Erhöhung der maximalen Zugspannung und der Steifigkeit (E-Modul), wohingegen die Dehnbarkeit abnimmt. Es wurde beschrieben, dass der linear-elastische Bereich am Beginn einer Spannungs-Dehnungs-Kurve durch das Zusammenspiel von β-Faltblättern und flexibleren Strukturen bestimmt wird (Termonia, 1994). Ein höherer Anteil an β-Strukturen führt zu steiferem Verhalten, da sie per se unflexibler sind und durch Ausbildung von „Knotenpunkten“ z usätzlich die Beweglichkeit der flexibleren Bereiche einschränken. Dieser generelle Zusammenhang trifft auch auf die hier untersuchten Filme zu: MethanolBehandlung führte bei allen Filmen zu einer Zunahme der Zugspannung und des E-Moduls. Auch per se β-Faltblatt-reichere Filme zeigten hier höhere Werte als jene mit niedrigerem Gehalt. Dies war auch an Filmen aus Pufferlösung zu sehen, die entsprechend ihrer Diskussion 126 strukturellen Inhomogenität unterschiedliche mechanische Kennwerte ergaben. Plastisches Verhalten, zu erkennen an einer Abflachung der Spannungs-Dehnungs-Kurve mit Dehnung bei reduziertem Kraftaufwand, trat nur bei Filmen mit niedrigem β-Faltblatt-Anteil (HFIP und wL Typ I) auf. Dies beruht vermutlich auf einer Streckung und/oder Entflechtung von Polypeptidketten, begleitet vom Aufbrechen einiger Wasserstoffbrücken in den flexibleren Regionen (Termonia, 1994; Keten & Buehler, 2010). Diese Vorgänge werden in den β-Faltblatt-reichen Filmen wohl durch dichtere Packung der Moleküle bzw. mehr Interaktionspunkte eingeschränkt. Zu mechanischem Versagen, d. h. dem Reißen der Filme, kommt es vermutlich durch Aufbrechen intermolekularer Wechselwirkungen. Besonders Wasserstoff-Brücken zwischen den einzelnen β-Faltblatt-Strängen, aber auch die Grenzfläche zwischen flex ibleren Ketten und starren β-Faltblatt-Kristallen sind dafür entscheidende Faktoren (Keten & Buehler, 2010). Die generelle Ko rrelation zwischen β-Faltblatt-Gehalt und mechanischen Parametern bestätigte sich jedoch nicht bei Methanol-behandelten Filmen. Vergleicht man deren Eigenschaften untereinander, zeigen sich Unterschiede trotz gleichen Anteils an β-Faltblättern. Beispielsweise sind Methanol-behandelte HFIP-Filme weniger zugfest und mit einer sehr geringen Dehnbarkeit die sprödesten der untersuchten Filme. Der Grund hierfür könnte in der Ausdehnung und Verknüpfung der β-Faltblatt-Strukturen liegen. MD-Simulationen zeigten, dass die mechanische Stabilität von β-Faltblättern zunächst mit zunehmender Anzahl an H-Brücken bzw. mit zunehmender Länge der Stränge und zunehmender Stapelgröße steigt (Keten & Buehler, 2008a; Keten et al., 2010). Ab Überschreiten einer kritischen Größe (Höhe und Länge) bzw. Geometrie von β-Faltblatt Strukturen nimmt die Stabilität jedoch rapide ab (Keten & Buehler, 2008a; Keten et al., 2010). Begründet wird dies damit, dass die Wirkung von Scherkräften ab einer gewissen Geometrie relevant wird und zum Aufbrechen der Struktur führt, wohingegen bei kleinerer Geometrie ein sog. slip-stick-Mechanismus postuliert wird. Dieser führt zum Lösen von H-Brücken und Gleiten eines β-Stranges parallel zu den anderen Strängen, was die Neuausbildung intermolekularer Interaktionen ermöglicht. Dieser wiederkehrende Zyklus von Lösen und Neuausbildung von Wasserstoff-Brücken führt schließlich zu einer höheren mechanischen Stabilität dieser β-Faltblatt-Strukturen. Aufgrund der starken und abrupten Strukturänderung, die in HFIP-Filmen nach Entfernen des Lösungsmittels durch Methanol-Behandlung auftritt, bilden sich möglicherweise β -FaltblattAnordnungen, welche sich ungünstig auf die mechanische Belastbarkeit auswirken (Abb. 4.1). Zudem fällt auf, dass in großem Ausmaß Helices der Strukturänderung unterliegen und die resultierenden Filme den gerin gsten α-Helix-Anteil aufweisen. In Filmen mit initial Diskussion 127 höherem Gehalt an β-Faltblättern sind die Veränderungen durch die Nachbehandlung weniger ausgeprägt und gleichmäßiger auf die Sekundärstrukturelemente verteilt. Zudem wurde für Filme aus regeneriertem B. mori Seidenfibroin, welche aus Ameisensäure gegossen wurden, postuliert, dass die bereits vorhandenen Strukturen einer Ausbildung von Kristallen mit großer Fernordnung (long-range order) entgegenwirken (Um et al., 2003). Abb. 4.1: Modell über verschiedene Anordnung von β-Faltblatt-Struktur in Methanol-behandelten Filmen gegossen aus HFIP oder Ameisensäure (AS) bzw. wässriger Pufferlösung (wL). Pfeile stelle n β-FaltblattBereiche dar, während graue Linien ungeordnete und flexible helikale Bereich repräsentieren. Auf eine unterschiedliche Anordnung/Verknüpfung von β-Faltblatt-Strukturen deuten auch die Ergebnisse der dynamisch mechanischen Analyse hin. Der Abfall des Speichermoduls kann als Änderung der Molekülverknüpfung bzw. Zunahme der Kettenbeweglichkeit interpretiert werden. Bei unbehandelten Filmen ist eine Korrelation der Temperatur dieses Abfalls T' mit dem Gehalt an β-Faltblatt zu beobachten. Mit zunehmendem Gehalt steigt T' in der Reihenfolge HFIP < wL I < Ameisensäure (AS) < wL II. In Methanol-behandelten Filmen variiert T' ebenfalls, allerdings zeigen HFIP-Filme hier die höchste Temperatur (Reihenfolge: wL I < AS < wL II < HFIP). Somit wird hier mehr Energie benötigt, um eine entsprechende Mobilität der Moleküle zu erreichen, was ausgedehntere β-Faltblatt-Regionen erklären würden. Orientierung Eine unterschiedliche strukturelle Zusammensetzung bzw. Verknüpfung der Moleküle in den verschiedenen Filmen spiegelt sich auch in der Ausrichtung der in β-Faltblatt-Struktur vorliegenden Polyalanin-Blöcke (β-Polyalanine) als Reaktion auf externe Zugbelastung Diskussion 134 Lösungsmittel-Gemisch könnte daher auch die Rauheit der Filmoberfläche eine Ursache für die beobachteten Unterschiede in der Benetzbarkeit darstellen, wobei Filme aus HFIP mit dem kleinsten Winkel am hydrophilsten und Ameisensäure-Filme am hydrophobsten waren. Zwischen den unterschiedlichen mit Seidenfilmen beschichteten Substraten hingegen variierte die Rauheit nur in wesentlich geringerem Maße als die Benetzbarkeit, so dass die veränderten Oberflächeneigenschaften vermutlich auf weitere Faktoren zurückzuführen sind. Eine Änderung des Benetzungsverhaltens kann beispielsweise durch strukturelle Unterschiede und Umlagerungen begründet sein, wenn dadurch andere funktionelle Gruppen exponiert werden bzw. andere Wechselwirkungen, beispielsweise vermittelt über Wasserstoffbrücken, auftreten (Tretinnikov & Tamada, 2001). Auch die hier untersuchten eADF4(C16)-Filme unterscheiden sich in ihrer Sekundärstruktur-Zusammensetzung je nach verwendetem Substrat, wobei alle Filme nach Methanol-Behandlung analysiert wurden. Die auf Glas gegossenen Filme weisen einen niedrigeren Anteil an β-Faltblatt und einen höheren Anteil an α-Helices und random coil-Konformation auf als die auf Teflon bzw. Polystyrol. Möglicherweise verhindern stabilisierende Wechselwirkungen zwischen hydrophilen Gruppen der Glasoberfläche und des Proteins eine effiziente (Methanol-induzierte) Umlagerung dieser Bereiche in β-Faltblatt-Strukturen, wohingegen hydrophobe Oberflächen deren Ausbildung fördern. Der dadurch höhere Anteil flexibler Strukturelemente könnte dazu führen, dass bevorzugt hydrophobe Seitengruppen an der Grenzfläche zur Luft exponiert und polare Gruppen davon abgewandt werden. Aufgrund fehlender Interaktionspartner (missing neighbour effects), welche bei ungesättigten polaren Gruppen einen größeren energetischen Einfluss haben als bei hydrophoben, würde diese Ausrichtung die freie Energie an der Grenzfläche Polymer-Luft minimieren (Tretinnikov & Tamada, 2001). Bei Filmen mit höherem β-Faltblatt-Anteil sind hingegen die Freiheitsgrade der Moleküle beschränkt, so dass hier vergleichsweise mehr hydrophile Seitenketten oberflächenexponiert vorliegen. Dementsprechend resultiert daraus ein kleinerer Benetzungswinkel bei Aufbringen auf hydrophobe Substrate und ein größerer Benetzungswinkel – entsprechend einer hydrophoberen Oberfläche – des Proteinfilms auf Glassubstrat. In Anlehnung an Polymerchemie kann eADF4(C16) aufgrund seiner amphiphilen Eigenschaften auch als Block-Copolymer betrachtet werden. Daher können die vorliegenden Ergebnisse auch unter diesem Gesichtspunkt interpretiert werden. Bei Systemen aus zwei chemisch verschiedenen Molekülklassen oder Phasen A und B erfolgt meist eine teilweise Entmischung und die Ausbildung von Mesophasen. Je nach Mischungsverhältnis bzw. Volumenanteil der Phasen A und B werden unterschiedliche Anordnungen Diskussion 135 eingenommen. Dazu gehören sphärische Strukturen (je nach Volumenverhältnis von A in einer Matrix aus B oder umgekehrt), zylindrische Strukturen oder bei annähernd gleicher Volumenverteilung von A und B Lamellen (Matsen & Bates, 1996; Rabotyagova et al., 2011). Betrachtet man β-Faltblatt-Strukturen, welche bei Seidenproteinen vorwiegend aus unpolaren bzw. hydrophoben Aminosäuren gebildet werden, als Phase A und helikale bzw. ungeordnete Strukturen, welche eher polare und geladene Aminosäuren enthalten, als Phase B, wären auch hier unterschiedliche Anordnungen denkbar. Bei hohem Anteil an βFaltblättern stellen diese die „Matrix“ dar, während sich hydrophilere Bereiche aufgrund besserer Interaktionsmöglichkeiten zusammenlagern. An der Grenzschicht zu Luft würden sich die Moleküle dann so ausrichten, dass die polaren, hydrophileren Bereiche der Luft zugewandt sind, da sie kaum über Wechselwirkungen mit den Molekülen der Filmmatrix stabilisiert werden. Umgekehrt würden sie sich bei einer Filmmatrix aus eher polaren Gruppen dem Film zuwenden, wohingegen hydrophobere Seitenketten an der Grenzfläche exponiert würden (Abb. 4.2). Hinzu kommt, dass bei einem niedrigerem β-Faltblatt-Anteil mehr unpolare Aminosäuren in flexibler Struktur vorliegen und somit oberflächenaktiv angeordnet werden können, wohingegen ein Großteil der hydrophoben Reste in unflexibleren β-Strukturen integriert sind. Ähnliche Strukturen wurden kürzlich in einem Modell zur Anordnung Spinnenseidenähnlicher Block-Copolymere in Langmuir-Blodgett Filmen mit einem hydrophoben Anteil von etwa 46 % vorgeschlagen. Auch hier wurde als Grundlage eine Phasenseparation der hydrophoben bzw. hydrophilen Blöcke vermutet (Krishnaji et al., 2011). Abb. 4.2: Modell zum Einfluss des Substrats auf die Oberflächeneigenschaften einer eADF4(C16)- Beschichtung. Abhängig von der Hydrophobizität des Untergrundes ordnen sich die Moleküle unterschiedlich an und präsentieren unterschiedliche Seitenketten und/oder Strukturen an der Grenzfläche zur Luft (Wohlrab, Spiess et al., in Vorbereitung) Diskussion 136 Micellen-artige Strukturen konnten bisher mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie in Filmen gegossen auf Teflon beobachtet werden (Wohlrab, 2010). Allerdings war hier Fluorescein an eADF4(C16) gekoppelt, so dass diese Strukturen auch durch den Farbstoff bedingt sein können. Andererseits stellt dies ein Beispiel für Mesostrukturierung, induziert durch die chemische Natur des Moleküls, dar. Um eine Aussage über die Anordnung der Proteine im Film treffen zu können, müssen weitere Untersuchungen durchgeführt werden. Des Weiteren wurde bei der hier angewendeten Messung der Sekundärstruktur nicht zwischen der Struktur in Grenzflächennähe bzw. im Filminneren unterschieden. Ein Verständnis des zugrunde liegenden Mechanismus des beobachteten Oberflächeneffekts könnte erlauben, bestimmte Oberflächeneigenschaften gezielt durch Beschichtung mit eADF4(C16)-Filmen einzustellen. 4.5 Biokompatibilität von eADF4(C16) Filmen – in vitro Zellkulturexperimente Ein vielversprechendes und breit diskutiertes Einsatzspektrum von Seidenmaterialien liegt im Bereich der Medizintechnik und des Tissue Engineering. Hier werden biokompatible, stabile, aber dennoch abbaubare Materialien als Gerüst gesucht, welche die Anheftung, Migration, Proliferation und Differenzierung der jeweiligen Zellen erlauben (Leal-Egana & Scheibel, 2010; Widhe et al., 2010). Die Biokompatibilität von Materialien wird hauptsächlich durch zwei Faktoren bestimmt. Diese sind eine potentiell schädliche oder toxische Wirkung des Materials bzw. daraus freigesetzter Komponenten sowie die Interaktion des Materials mit Zellen (Anselme, 2000; Ramsden, 2008). So ist die Möglichkeit der Adhäsion für die meisten Zellarten nötig zum Überleben, während bei fehlender Interaktion Apoptose eingeleitet wird (Leal-Egana & Scheibel, 2010). Eine erfolgreiche Adhäsion umfasst die Zellanhaftung, -ausbreitung, Organisation des Cytoskeletts und die Ausbildung von fokalen Adhäsionen (LeBaron & Athanasiou, 2000) und beeinflusst die Fähigkeit der Zellen zu proliferieren und sich zu differenzieren (Anselme, 2000). Sowohl B. mori-Seide als auch Spinnenseidenproteine gelten als vielversprechende Kandidaten, welche einen Großteil der Anforderungen erfüllen. So zeigen die natürlichen Proteine (bei B. mori-Seide nach Entfernen der Sericin-Hülle) keine bzw. geringe Toxizität und induzieren keine Immunantwort, werden langsam abgebaut und können funktionalisiert werden (Leal-Egana & Scheibel, 2010; Widhe et al., 2010; Rising et al., 2011; Murphy & Kaplan, 2009; Wang et al., 2006). Natürliche Spinnenseidenfäden konnten kürzlich erfolgreich zur Regeneration peripherer Nerven in Ratten eingesetzt werden (Allmeling et al., Diskussion 137 2008; Allmeling et al., 2006). Im Gegensatz zu dem natürlichen Faden lagen keine Daten über die Verträglichkeit des rekombinant hergestellten eADF4(C16) vor. Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmals Versuche zur Biokompatibilität von eADF4(C16) durchgeführt, welches dabei in Form von dünnen Filmen eingesetzt wurde. Generell zeigten die hier untersuchten eADF4(C16)-Filme gute Biokompatibilität, wobei die Vitalität der untersuchten Zellen (murine fibroblastenartige Prä-Osteoblasten der Zelllinie MC3T3-E1) nach 48 h Kultivierung auf den Filmen zwischen 70 % und 110-120 % (im Vergleich zu speziell behandelten Zellkulturplatten) lag, und es somit keine Hinweise auf Cytotoxizität der Proteinfilme gab. Für die ersten Versuche wurden Filme aus verschiedenen Lösungsmitteln sowie unterschiedliche Nachbehandlungsmethoden getestet, auch wenn für spätere Anwendungen ein wässriges System zu bevorzugen ist, bei dem keine potentiell gesundheitsschädlichen Substanzen involviert sind. Ein nachteiliger Einfluss der verwendeten Lösungsmittel konnte in dieser Arbeit nicht festgestellt werden. Jedoch unterschieden sich die Anheftung und die Proliferation der Zellen je nach gewählten Parametern. Auf Ameisensäure-Filmen war das beste Zellwachstum zu beobachten, während auf Filmen aus HFIP und Pufferlösung (wL) eine Art lag-Phase auftrat. Möglicherweise werden von anfangs schwach adhärierten Zellen Proteine der Extrazellulären Matrix (ECM) sezerniert, was im Folgenden die Adhäsion sowie das Wachstum weiterer Zellen fördert (Ramsden, 2008). Beispielsweise wurde die vermehrte Produktion und Ablagerung von Kollagen Typ I durch verschiedene humane Zelllinien beobachtet, welche auf Seidenmaterialien kultiviert wurden (Kasoju et al., 2009; Garcia, 2005). Denkbar wäre auch eine Umgestaltung (remodeling) der Filmoberfläche, beispielsweise durch Proteolyse, was die anschließende Anheftung weiterer Zellen erleichtert. Ein entsprechender Mechanismus wurde für die Bindung an Kollagen beschrieben (Schmidt & Friedl, 2010). Hinweise auf anfänglich zu wenige Adhäsionsmöglichkeiten geben die teilweise beobachteten extrem langen Zellfortsätze, welche eventuell ausgebildet werden, um große Distanzen zwischen guten Adhäsionsmöglichkeiten zu überbrücken. Verschiedene Nachbehandlungsmethoden beeinflussten die Anheftung der Zellen ebenfalls. Während Inkubation mit reinem Methanol bzw. Ethanol oder Kaliumphosphatlösung zu Filmen mit guten, vergleichbaren Ergebnissen führte, war auf Filmen, die mit 70 % Alkohol nachbehandelt wurden, eine wesentlich schlechtere und inkonsistente Adhäsion zu beobachten. Durch mehrtägige Vorinkubation der Filme mit Medium ohne Zellen konnte ein negativer Effekt durch eventuell austretendes Lösungsmittel weitgehend ausgeschlossen werden. Die jeweiligen Filme wiesen nach Behandlung mit allen Methoden eine Diskussion 138 vergleichbare Strukturzusammensetzung auf. Jedoch unterscheiden sie sich in ihrer Hydrophobizität (wobei der Benetzungswinkel an Luft bestimmt wurde) sowie ihrer Rauheit (Schema 4.3). Hierbei wiesen die mit 70 %-igem Alkohol nachbehandelten Filme die hydrophilste Oberfläche (im trockenen Zustand) und eine raue, inhomogene Topograhie auf. Schema 4.3: Vergleich der Hydrophobizität und Rauheit von verschieden nachbehandelten eADF4(C16) Filmen mit ihrer Eigenschaft, die Adhäsion bzw. Proliferation von MC3T3-E1 Zellen zu ermöglichen. Die angegebene Hydrophobizität bezieht sich auf Kontaktwinkelmessungen, welche an Luft durchgeführt wurden. In der oberen Zeile sind jeweils die Nachbehandlungsmethoden angegeben, in der unteren die Lösungsmittel. Beide Parameter sind entscheidende Kriterien für eine erfolgreiche Zelladhäsion. Diese erfolgt am jeweiligen Untergrund entweder über nicht-spezifische Interaktionen oder Proteinvermittelt (Campillo-Fernandez et al., 2009; Leal-Egana & Scheibel, 2010). Bei beiden Mechanismen spielt die Oberflächenchemie und die Hydophobizität des Substrats eine wichtige Rolle, wobei hydrophobere Matrices die Adsorption von Serumproteinen, und damit nachfolgend die Adhäsion der Zellen, erleichtern (Campillo-Fernandez et al., 2009). Die Aussagen über eine bevorzugte Hydrophobizität sind jedoch nicht eindeutig und unterscheiden sich je nach Zelltyp (Jeong et al., 2009). Zellen der Linie MC3T3-E1 adhärierten bevorzugt auf Peptid-beschichteten Mica-Oberflächen, welche Benetzungswinkel mit Wasser von etwa 60° aufwiesen (Qiu et al., 2010). Ein ähnlicher Wert wurde für Methanol-behandelte eADF4(C16) Filme aus Ameisensäure bestimmt, auf welchen die höchste Zellproliferation gemessen wurde. Auch die Topographie des Untergrundes beeinflusst die Adhäsion, Proliferation, Ausrichtung und Differenzierung von Zellen (Gil et al., 2010b; Min et al., 2004; Zhang et al., 2010). Auch hier fehlen jedoch allgemeingültige Aussagen. Generell gelten z. B. im Fall von Implantaten, welche intensiven Zellkontakt benötigen, rauere Oberflächen vorteilhafter als glatte. Hierbei wird eine Rauheit im Nanometer-Bereich (etwa 1 nm) genannt (Ramsden, 2008). In diesem Bereich liegen somit die glatteren der untersuchten eADF4(C16) Filme, wie etwa mit Methanol behandelte HFIPund Ameisensäure-Filme. Bei Kultivierung von Zellen auf Substraten mit heterogener Oberflächenstrukturierung wurde zudem eine verzögerte Ausbildung fokaler Adhäsionspunkte auf den raueren Bereichen beobachtet (Zinger et al., Diskussion 139 2004). Somit liegt eine mögliche Erklärung für die beobachteten Unterschiede der Zelladhäsion und -proliferation auf eADF4(C16) Filmen, welche verschiedenen Nachbehandlungsmethoden unterzogen wurden, in ihren jeweiligen Oberflächeneigenschaften. In vivo wird das Zellverhalten durch die Zusammensetzung der ECM bestimmt, wobei neben spezifischen Interaktionen die mechanischen Eigenschaften des Untergrundes eine weitere, entscheidende Rolle spielen (Janmey et al., 2009; Yeung et al., 2005). Diese können im Fall von Proteinfilmen u. a. durch den Wassergehalt und die Sekundärstruktur beeinflusst werden, wobei ein höherer β-Faltblatt-Anteil in steiferen Matrices resultiert (Minoura et al., 1990). Daher könnte eine unterschiedliche Elastizität der eADF4(C16) Filme ebenfalls einen kritischen Parameter darstellen; dies wurde in der vorliegenden Arbeit jedoch nicht analysiert. Insgesamt war die Anheftung der Zellen an die untersuchten eADF4(C16)-Filme jedoch nicht dauerhaft. Nach Erreichen einer gewissen Konfluenz lösten sich die Zellen als Verbund vom Untergrund ab, was auf die Präsenz stärkerer anziehender Kräfte zwischen den Zellen (über Zell-Zell-Kontakte) als zum Untergrund hindeutet. Diese schwache Adhäsionskraft in Kombination mit der dennoch vorhandenen Biokompatibiltät (bzw. fehlender cytotoxischer Wirkung) könnte für Anwendungen interessant sein, bei denen ein zu starkes Einwachsen von Zellen in ein Implantat nicht erwünscht ist, beispielsweise um einer Fibrosebildung vorzubeugen. Zusätzlich konnte die Adhäsion der Zellen an die Filme durch Anbringen eines zyklischen RGD-Peptids verbessert werden. Dieses Aminosäuremotiv (RGD) ist Bestandteil vieler Integrin-Erkennungsstellen in der ECM und wurde daher bereits erfolgreich zur Optimierung der Zelladhäsion durch spezifische Integrin-vermittelte Interaktion eingesetzt (Hersel et al., 2003; Ruoslahti, 1996). Kopplung des Peptids an gelöstes Protein mit anschließender Assemblierung in den Film erwies sich als effektiver für verbesserte Zelladhäsion als nachträgliche Kopplung an den Film. Die Wirksamkeit des Peptids hängt einerseits von seiner Erreichbarkeit und Flexibilität an der Oberfläche ab, um an die entsprechende Bindestelle im Integrin zu gelangen. Als zweiter entscheidender Faktor wurde die Menge bzw. Dichte des Peptids sowie seine räumliche Anordnung beschrieben (Hersel et al., 2003; Dunehoo et al., 2006). Ausgehend von der für die nachträgliche Kopplung von Nanogold ermittelten Dichte (185 fmol/cm2) liegt die Menge an RGD-Peptid im unteren Bereich der als effektiv beschriebenen Moleküldichte (Shin et al., 2003). Demnach spricht die stärker adhäsionsfördernde Wirkung des in Lösung gekoppelten RGD-Peptids für eine höhere Verfügbarkeit des Peptids an der Oberfläche. In weiterführenden Arbeiten sollte daher die optimale Dichte und Anordnung (z. B. über Mischungsverhältnisse des gekoppelten Proteins mit nicht- Diskussion 140 modifiziertem eADF4(C16)) untersucht werden. Dass auch die Kopplung von Fluorescein alleine die Zellanhaftung in gewissem Umfang begünstigte, kann vermutlich auf die dadurch erzeugte, stärkere Hydrophobizität der Filmoberfläche zurückgeführt werden (s. oben). 4.6 Eigenschaften und Potential der untersuchten Spinnenseidenfilme im Vergleich zu B. mori Seidenfibroin-Filmen bzw. anderen Materialien Die mechanischen Eigenschaften der hier untersuchten eADF4(C16)-Filme variierten in Abhängigkeit des verwendeten Lösungsmittels sowie der Nachbehandlung. Generell erwiesen sich die Filme mit einer Steifigkeit von 2-4 GPa und einer maximalen Zugfestigkeit im Bereich von 40-70 MPa als mechanisch belastbar, jedoch wenig dehnbar. Diese mechanischen Grundcharakteristika bleiben bis zu Temperaturen von 180-210 °C erhalten. Oberhalb dieser Temperatur steigt die Beweglichkeit der Moleküle und das Material erweicht. Die thermische Zersetzung der Filme schließlich beginnt etwas unterhalb von 300 °C und zeigt seinen maximalen Peak um 330 °C. Entscheidend für die hohe Temperatur-Beständigkeit der eADF4(C16)-Filme ist v. a. die charakteristische Sekundärstruktur der Proteine, da bei Protein-basierten Materialien mit einem hohen α-Helix-Anteil (z. B. Keratin) bereits ab 200 °C die Denaturierung der Helices beobachtet wird (Srinivasan et al., 2010). Mit diesen Eigenschaften liegen die eADF4(C16)-Filme im Bereich von Polylactonsäure (PLA) oder biologisch abbaubaren Polyamiden (PA6), wobei sie jedoch eine deutlich höhere Glasübergangstemperatur und somit unveränderte mechanische Integrität bis zu höheren Temperaturen besitzen (s. Tabelle 4.1). Verglichen zu Filmen aus Polylactid-co-Glycolid (PLGA) oder Proteinen wie Kollagen oder Soja, welche in der Medizin bzw. Nahrungsmittelindustrie Verwendung finden, sind sie deutlich zugfester, jedoch auch spröder (s. Tabelle 4.1). Diskussion 141 Tabelle 4.1: Mechanische und thermische Kennwerte ausgewählter Materialien. TZers.: Zersetzungstemperatur, Tg: Glasübergangstemperatur. n.a: nicht angegeben Material Zugfestigkeit Bruchdehnung E-Modul TZers. Tg Referenz MPa % GPa °C °C eADF4(C16) 40-71# 1,7-3 2,4-3,8 285-336 195-210 diese Arbeit eADF4(C16) + 40% Glycerin, nachbeh. mit 50% MeOH 12 100 0,04 n. a. n. a. (Lammel, 2010) B. mori Seidenfibroin (SF), regeneriert 24 -30 1,7-1,9 2,9-3,4 270-298 178 (Vasconcelos et al., 2008; Lawrence et al., 2010; Jin et al., 2005) SF/Keratin Blend (mit 40-50% Keratin-Anteil) 9,1-17,8 1,2-2,2 1,4-20 264-298 185 (Vasconcelos et al., 2008) Tropoelastin (rekombinant, human) n. a. n. a. 7,2 x 10-3 (Nanoindentation) 310 190 (Hu et al., 2010) Kollagen 0,5a-4,2b 45-56c 1,2-4,0 x 10-3 (a, c) n. a. n. a. a (Zorlutuna et al., 2009) c (Sheu et al., 2001; Charulatha & Rajaram, 2003) Keratin (Schwamm) 0,05 17-19 n. a. 200-250‡ n. a. (Vasconcelos et al., 2008; Srinivasan et al., 2010) Soja (Proteinisolat) 1,2-4,1 105-186 0,1 n. a. n. a. (Guerrero et al., 2010; Pruneda et al., 2008) PLA (Polylactonsäure) 65 6,7 1,5-2,7 173-178 (Schmelzen) 60-65 (Armentano et al., 2010; Cheung et al., 2008) PLGA (Polylactid-coGlycolid)† 0,5-5 43-56 1,4-2,8 n.b. 50-55 (Lammel et al., 2011; Armentano et al., 2010) PA6 (Polyamid6) 58 17 1,5 227 n.b. (Liu et al., 2003) † je nach Mischungsverhältnis:50/50, 85/15, 90/10; ‡ Denaturierung der α-Helix; # je nach Lösungsmittel und Nachbehandlung Verglichen mit Filmen aus regeneriertem B. mori Seidenfibroin ergeben sich ähnliche Charakteristika, wie z. B. mechanische Grundeigenschaften und molekulare Vorgänge unter thermischer Belastung. Allerdings weisen die hier untersuchten eADF4(C16)-Filme bei entsprechender Dehnbarkeit sowohl höhere Steifigkeit und Zugfestigkeit, als auch höhere Temperaturbeständigkeit auf. Ursachen dafür sind vermutlich in der Primärsowie Sekundärstruktur beider Proteinsysteme zu finden. eADF4(C16) besitzt weniger Ladungen (ausschließlich negative) und etwas geringere Hydropathizität als die schwere Kette des B. mori Seidenfibroins (SF), jedoch bei einem wesentlich geringeren Molekulargewicht. Dabei ist zu beachten, dass größere Kettenlängen prinzipiell mit höherer mechanischer Stabilität einhergehen. Auch bestehen Filme aus regeneriertem SF normalerweise aus einer Mischung der schweren und leichten Kette sowie P25, wohingegen in eADF4(C16)-Filmen nur eine Proteinkomponente vorliegt. Unterschiede finden sich zudem in der Aminosäuresequenz, insbesondere für die Ausbildung der hochgeordneten β-Faltblatt-Strukturen. Diese kristallinen Bereiche werden in SF durch das Aminosäuremotiv (GAGAGS)n gebildet, in ADF4 und dem rekombinanten eADF4(C16) Diskussion 142 hingegen v. a. durch An (Vepari, 2007; Heim et al., 2009; Bini et al., 2004; Huemmerich et al., 2004a). Zusätzliche hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den Alaninresten könnten dabei einen Zugewinn an Stabilität bewirken. In dem jeweiligen natürlichen Faden beider Seidentypen wurde zudem eine unterschiedliche Anordnung der β-Faltblätter beobachtet. So enthält B. mori Seide mehr kristalline Bereiche, während in dragline Seide ein höherer Anteil freier (nicht in kristallinen Bereichen angeordnet) β-Strukturen zu finden ist (Du et al., 2011). Neben den postulierten Auswirkungen auf mechanische Charakteristika der Fäden (Du et al., 2011) könnten ähnliche strukturelle Unterschiede auch bei Filmen deren Mechanik beeinflussen. Insgesamt zeichnen sich die hier untersuchten eADF4(C16)-Filme durch die rekombinante, und damit monodisperse Produktion der zugrunde liegenden Moleküle und ihre reproduzierbare Herstellung sowie variable Prozessierungsmöglichkeiten aus. Über die Wahl und Kombination verschiedener Parameter während der Filmbildung können dessen Eigenschaften gesteuert werden. Die Sekundärstruktur der Proteine im Film wird dabei stark vom verwendeten Lösungsmittel, der Nachbehandlung sowie Umgebungsparametern kontrolliert. Gerade das Lösungsmittel führt zu Unterschieden, welche auch nach Nachbehandlung noch Auswirkungen z. B. auf das mechanische Verhalten zeigen. Insofern ist ein Verständnis der molekularen Anordnung und Vorgänge ein wichtiges Kriterium zur Herstellung von Filmen mit passgenauen Eigenschaften. Während makroskopische Eigenschaften wie Oberflächentopographie oder die chemische Beständigkeit durch die Wahl des Lösungsmittels und der Nachbehandlungsmethode variiert werden können, lassen sich Faktoren wie die Dehnbarkeit der Filme nur innerhalb eines engen Fensters beeinflussen. Jedoch kann durch Zusatz von Weichmachern, wie Glycerin oder PEG, die Dehnbarkeit der Filme auf ≥ 100 % gesteigert werden (Lammel, 2010; Spiess et al., 2010a). Auch ist eine deutliche Änderung der mechanischen Eigenschaften bei höherer Luftfeuchtigkeit bzw. unter Wasser zu erwarten, was im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht ausführlich getestet wurde. Über verschiedene Methoden wie salt leaching oder Zusatz von PEG können zudem Poren einer definierten Größe in den Filmen erzeugt oder dreidimensionale Scaffolds (Gerüste) hergestellt werden (Spiess et al., 2010a; Lammel, 2010; Teßmar et al., 2005). Ein Einsatz solcher Strukturen oder der Filme selbst für direkten Zellkontakt und Geweberegenerierung scheint realisierbar, da sich in ersten Versuchen eine gute Biokompatibilität der Filme zeigte. Die Möglichkeit, Materialien mittels ausschließlich auf wässrigen Lösungsmitteln basierenden Prozessen herzustellen, ist ein weiterer entscheidender Vorteil. Spinnenseidenfilme konnten aus wässriger Lösung assembliert werden, und eine Diskussion 143 Nachbehandlung mit Kaliumphosphat führt zu einer Zunahme an β-Faltblatt-Struktur und damit zu einer höheren mechanischen und chemischen Stabilität. Allerdings zeigten die Filme – zumindest ab einer gewissen Größe – sowohl strukturelle als auch makroskopische Inhomogenität. Um bei diesem System reproduzierbar homogene Filme zu erhalten, sollte der Herstellungsprozess weiter optimiert werden. Schließlich bieten die Filme die Möglichkeit einer Vielfalt von Funktionalisierungen. Als rekombinant hergestelltes Protein kann eADF4(C16) gezielt genetisch und auch chemisch modifiziert werden, was in dieser Arbeit durch Kopplung diverser Molekülklassen an Cystein-Mutanten von eADF4(C16) demonstriert wurde. Mit diesen Eigenschaften stellen Spinnenseidenfilme basierend auf eADF4(C16) interessante Materialien dar, die sich einerseits durch inhärente Eigenschaften der Spinnenseide – wie mechanische und thermische Stabilität sowie Biokompatibilität – auszeichnen, andererseits durch ihre Flexibilität in der Prozessierung sowie vielfältige Funktionalisierbarkeit auf verschiedenste Anwendungen angepasst werden können.