Die chemische Ökologie von Kurzflügelkäfern der Gattungen Dianous und Stenus (Coleoptera, Staphylinidae)

Die chemische Ökologie von Kurzflügelkäfern der Gattungen Dianous und Stenus (Coleoptera, Staphylinidae) Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften der Universität Bayreuth vorgelegt von ANDREAS SCHIERLING aus Wunsiedel Bayreuth, im März 2013 Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum von Januar 2010 bis März 2013 am Lehrstuhl für Tierökologie II der Universität Bayreuth unter Betreuung von Herrn Prof. Dr. Konrad Dettner angefertigt. Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften der Universität Bayreuth genehmigten Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. Nat.). Dissertation eingereicht am: 05.03.2013 Zulassung durch die Prüfungskommission: 07.03.2013 Wissenschaftliches Kolloquium: 30.07.2013 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Beate Lohnert Prüfungsausschuss: Prof. Dr. K. Dettner (Erstgutachter) Prof. Dr. K. H. Hofmann (Zweitgutachter) Prof. Dr. Ch. Laforsch (Vorsitz) Prof. Dr. K. Seifert PD Dr. St. Geimer Inhalt INHALTSVERZEICHNIS TEIL I - SYNOPSIS 1. Einführung .............................................................................................................................. 1 1.1 Chemische Verteidigung bei Arthropoden .............................................................. 1 1.2 Chemische Abwehr der Staphylinidae .................................................................... 2 1.3 Chemische Ökologie der Steninae .......................................................................... 4 1.4 Zielsetzungen der Arbeit ......................................................................................... 6 2. Beschreibung der Teilprojekte .............................................................................................. 9 2.1 Morphologie und Ultrastruktur der Pygidialdrüsen der Steninae ........................... 9 2.1.1 Morphologie des Pygidialdrüsensystems von S. comma und S. biguttatus ...................................................................................................... 10 2.1.2 Ultrastruktur der großen Reservoire und des zugehörigen Drüsengewebes von S. comma und S. biguttatus ..................................................... 11 2.1.3 Ultrastruktur und Funktion der kleinen Reservoire und des zugehörigen Drüsengewebes von S. comma und S. biguttatus ........................... 13 2.1.4 Morphologie des Pygidialdrüsensystems weiterer Steninae ........................ 16 2.2 Zusammensetzung der Pygidialdrüsensekrete verschiedener Steninae................. 17 2.3 Biologische Wirkung der Pygidialdrüsensekrete der Steninae ............................. 19 2.3.1 Fraßhemmende Wirkung der Pygidialdrüsensekrete ................................... 20 2.3.2 Antimikrobielle Wirkung der Pygidialdrüsensekrete ................................... 23 2.3.3 Einfluss der Konfiguration der chiralen Sekretkomponenten Stenusin und Norstenusin auf deren biologische Wirkung ......................................... 26 2.4 Biosynthese der stickstoffhaltigen Sekretkomponenten ........................................ 28 2.5 Evolution der Pygidialdrüsensysteme und -sekrete der Steninae .......................... 34 3. Zusammenfassung ................................................................................................................ 38 4. Summary ............................................................................................................................... 40 5. Literaturverzeichnis ............................................................................................................. 42 Inhalt TEIL II - PUBLIKATIONEN Publikationen und Publikationsmanuskripte ........................................................................ 49 Darstellung des Eigenanteils ...................................................................................................... 50 Publ. I: The Pygidial Defense Gland System of the Steninae (Coleoptera, Staphylinidae): Morphology, Ultrastructure and Evolution. ..................... 53 Publ. II: The Multifunctional Pygidial Gland Secretion of the Steninae (Coleoptera: Staphylinidae): Ecological Significance and Evolution. .................................................................................................. 55 Publ. III: Biosynthesis of the Defensive Alkaloid (Z)-3-(2-Methyl-1butenyl)pyridine in Stenus similis Beetles. ............................................... 57 Publ. IV: Biosynthesis of the Defensive Alkaloid Cicindeloine in Stenus solutus Beetles. .......................................................................................... 59 Danksagung ............................................................................................................................... 61 Abbildungsund Tabellenverzeichnis ABBILDUNGSUND TABELLENVERZEICHNIS Abb. 1 Typischer Staphylinidenhabitus und ausgewählte Abwehrverbindungen der Staphylinidae ............................................................................................................ 3 Abb. 2 Bekannte Verbindungen aus den Pygidialdrüsen der Steninae ................................ 5 Abb. 3 Morphologie der Pygidialdrüsen der Steninae ....................................................... 10 Abb. 4 Morphologie und Ultrastruktur des Pygidialdrüsensystemteils R1/D1 von Stenus comma und S. biguttatus ............................................................................. 12 Abb. 5 Morphologie und Ultrastruktur des Pygidialdrüsensystemteils R2/D2 von Stenus comma und S. biguttatus ............................................................................. 15 Abb. 6 Abwandlungen und Reduktionen des Drüsensystems R2/D2 bei weiteren Steninen .................................................................................................................. 16 Abb. 7 Massenspektren von Stenusin und den Dehydroverbindungen aus S. scaber. ....... 18 Abb. 8 Two-Choice-Biotests zur Ermittlung der Deterrentaktivität der synthetischen Drüsensekretkomponenten und -sekrete gegen die Ameise Lasius flavus ............. 21 Abb. 9 Two-Choice-Biotests zur Ermittlung der Deterrentaktivität der synthetischen Drüsensekretkomponenten gegen den Fisch Xiphophorus helleri ......................... 23 Abb. 10 Einfluss der Konfiguration des Stenusins auf dessen biologische Wirkung .......... 26 Abb. 11 Elektroantennogramm. Veränderung des Summenpotentials aller Rezeptoren in einer Antenne von S. bimaculatus nach Aufblasen von Stenusin ............. 27 Abb. 12 Massenspektren von 3-(2-Methyl-1-butenyl)-pyridin aus dem Pygidialdrüsensekret von S. similis und Cicindeloin aus dem Sekret von S. solutus nach Vefüttern der markierten Aminosäuren L-[D9,15N2]-Lysin und L- [D10,15N]-Isoleucin ................................................................................................. 29 Abb. 13 Biosynthese der Hauptkomponenten-Alkaloide aus den Pygidialdrüsen der Steninae .................................................................................................................. 30 Abb. 14 Massenspektren von Vorläufermetaboliten der Alkaloid-Biosynthese in den Pygidialdrüsen der Steninae ................................................................................... 31 Abb. 15 Stereoselektive Biosynthese des Stenusins in S. similis und S. bimaculatus ......... 33 Abb. 16 Möglicher Stammbaum der Steninae basierend auf der Verteilung der Abwehrverbindungen im Pygidialdrüsensekret ..................................................... 36 Tabelle 1 Quantitative Zusammensetzung der Pygidialdrüsensekrete ausgewählter Steninae .................................................................................................................. 19 Tabelle 2 Agardiffusionstests zur Charakterisierung der antimikrobiellen Aktivitäten der Sekretkomponenten .......................................................................................... 24 Abkürzungsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS bzw. beziehungsweise CI chemische Ionisation D1 R1 bandförmig aufgelagertes Drüsengewebe, Ort der Alkaloid-Biosynthese D2 sekretorisch aktives Gewebe zu R2, Ort der Terpen-Biosynthese EI electron impact ionization, Elektronenstoßionisation et al. et alii/et alae („und andere“) GC Gaschromatograph bzw. Gaschromatographie GC/MS Gaschromatograph/Massenspektrometer-Kopplung incl. inklusive M+ Molekülion m1 Vorläufermetabolit 1 aus der Alkaloid-Biosynthese m2 Vorläufermetabolit 2 aus der Alkaloid-Biosynthese MS Massenspektrometer bzw. Massenspektrum m/z Masse durch Ladungszahl n.d. nicht durchgeführt Publ. Publikation R1 großes Pygidialdrüsenreservoir R2 kleines Pygidialdrüsenreservoir an der Basis des Großen s Sekunde TIC Totalionenstromchromatogramm u Unit (Masseneinheit) z.B. zum Beispiel Teil I Synopsis Einführung NEUMANN, 1993; LUSEBRINK et al., 2009). Weiterhin wird das Sekret mit den Hinterbeinen an der Abdominalspitze abgenommen und durch „Secretion Grooming“ („Sekretputzen“, KOVAC & MASCHWITZ, 1989) auf der Körperoberfläche verteilt, wo es dank seiner antimikrobiellen Eigenschaften den Käfer vor Infektionen durch Mikroorganismen schützt (BETZ, 1999; LUSEBRINK, 2007, LUSEBRINK et al., 2008b). Das wohl spektakulärste Einsatzgebiet der Pygidialdrüsensekrete der Steninae ist die Fortbewegung der Käfer auf der Wasseroberfläche durch Abgabe kleiner Sekretmengen, welche bereits Anfang des 20. Jahrhunderts von PIFFARD (1901) sowie BILLARD & BRUYANT (1905) beschrieben wurde. Mit ihren hydrophoben Tarsenunterseiten sind die Steninae in der Lage, sich auf der Oberfläche von Gewässern zu bewegen. Beim so genannten „Spreitungsschwimmen“ berührt der Käfer mit seinen an der Abdominalspitze ausgestülpten Pygidialdrüsen die Wasseroberfläche und gibt einen kleinen Sekrettopfen ab (LINSENMAIR, 1963; LINSENMAIR & JANDER, 1963; SCHILDKNECHT, 1970). Die nahezu wasserunlöslichen Sekretkomponenten spreiten auf der Wasseroberfläche augenblicklich auseinander und bilden einen sich rasch ausdehnenden, monomolekularen Film, an dessen Rand der Käfer vorangetrieben wird (SCHILDKNECHT, 1970; DETTNER, 1991; LANG et al., 2012). Bei kontinuierlicher Sekretabgabe können die Tiere so beeindruckende Geschwindigkeiten von über 40 cm/s erreichen und durch Krümmung des Abdomens aktiv ihre Bewegungsrichtung steuern (SCHILDKNECHT, 1976, SCHILDKNECHT et al., 1976, LANG et al. 2012). Das Phänomen des Spreitungsschwimmens auf der Wasseroberfläche ist außerhalb der Steninae nur bei semiaquatischen Wanzen der Gattungen Velia, Microvelia und Rhagivelia (Heteroptera, Gerromorpha) bekannt, wobei hier keine abdominal produzierten Sekrete zum Einsatz kommen, sondern spreitungsaktive Verbindungen im Speicheldrüsensekret über das Rostrum nach hinten abgegeben werden (LINSENMAIR & JANDER, 1963; ANDERSEN, 1976). 1.4 Zielsetzungen der Arbeit Die vorliegende Dissertationsschrift beschäftigt sich mit der chemischen Ökologie der Steninae. Vor allem für defensive Verhaltensweisen ist diesbezüglich das Pygidialdrüsensystem von zentraler Bedeutung, dessen Sekret von den Tieren sowohl zur Abwehr diverser Organismen, als auch zur Fortbewegung auf der Wasseroberfläche eingesetzt werden kann. Obwohl bereits einige Arbeiten über die Pygidialdrüsen und Wehrsekrete ausgewählter Vertreter der Steninae veröffentlicht wurden, sind nur wenige Daten bezüglich biologischer Wirkung und Biosynthese der Verbindungen aus dem 6 Einführung Drüsensekret sowie der Ultrastruktur und Funktionsmorphologie des SteninenPygidialdrüsensystems selbst vorhanden. Weiterhin erfolgte bisher keine Analyse der Drüsenmorphologie und Sekretzusammensetzung hinsichtlich potentiell phylogenetisch relevanter, artspezifischer Merkmale. Basierend auf den bislang publizierten Erkenntnissen über das Pygidialdrüsensystem der Steninae und dessen Sekretionsprodukte wurden als Grundlage für die vorliegende Arbeit folgende Hypothesen formuliert: 1. Innerhalb der Steninae existieren phylogenetisch relevante, artspezifische Unterschiede bezüglich Morphologie, Ultrastruktur und Funktionsmorphologie der Pygidialdrüsen. → licht-, transmissionselektronenund rasterelektronenmikroskopische Analyse des Pygidialdrüsensystems ausgewählter Steninae zur Ermittlung von Morphologie, Ultrastruktur und Funktion des Drüsensystems → vergleichende Analyse der Pygidialdrüsenmorphologie ausgewählter Arten aus der Gruppe der Steninae 2. Im Pygidialdrüsensekret der Steninae sind neben den bislang bekannten Verbindungen weitere Komponenten vorhanden. → GC/MS-Analyse der Pygidialdrüsensekrete diverser Steninae 3. Die multifunktionale Wirksamkeit des Pygidialdrüsensekrets der Steninae ist auf die spezifische Aktivität der Einzelkomponenten oder deren Mischungen gegen verschiedene Zielorganismen zurückzuführen. → Analyse der biologischen Wirkung bekannter Sekretkomponenten gegen unterschiedliche Organismengruppen 4. Die Biosynthese aller stickstoffhaltigen Komponenten im Pygidialdrüsensekret der Steninae folgt dem in LUSEBRINK et al. (2008a) für Stenusin vorgeschlagenen Mechanismus über identische Vorläufermetaboliten. → Fütterung von deuterierten Alkaloid-Vorstufen an ausgewählte Stenus-Arten → GC/MS-Analyse der Pygidialdrüsensekrete hinsichtlich des Einbaus der Deuterium-Markierung in die Sekret-Alkaloide 7 Einführung 5. Innerhalb der Steninae sind Trends bezüglich der Evolution des Pygidialdrüsensystems und dessen Sekrets erkennbar. → vergleichende Analyse der qualitativen und quantitativen Zusammensetzung der Sekrete diverser Steninae → Vergleich der Sekretzusammensetzung mit der Drüsenmorphologie der untersuchten Steninae und bereits publizierten phylogenetischen Literaturdaten 8 Beschreibung der Teilprojekte 2. Beschreibung der Teilprojekte In der vorliegenden Arbeit wurde die Chemische Ökologie der Steninae sowie das hierbei besonders relevante Pygidialwehrdrüsensystem der Käfer untersucht. Neben der qualitativen und quantitativen Analyse flüchtiger und verhaltensmodifizierender Verbindungen im Pygidialdrüsensekret erfolgte eine Untersuchung der biologischen Wirkung einzelner Sekretkomponenten und der Gesamtsekrete auf Wirbeltiere, Insekten und Mikroorganismen. Weiterhin wurde die Biosynthese der Sekret-Alkaloide aufgeklärt und eine biogenetische Verwandtschaft der Alkaloid-Komponenten ermittelt. Darüber hinaus erfolgte eine detaillierte Betrachtung der Ultrastruktur und Funktionsweise des Pygidialdrüsensystems und potentieller Evolutionstrends in Drüsenmorphologie und Wehrsekret-Zusammensetzung. Die durchgeführten Arbeiten der einzelnen Teilprojekte sind im folgenden Abschnitt im Detail dargestellt. Die Links zu den vollständigen Publikationen sind in Teil II angefügt. 2.1 Morphologie und Ultrastruktur der Pygidialdrüsen der Steninae Bereits 1957 beschäftigte sich M. F. JENKINS mit der Morphologie der Pygidialdrüsen der Steninae anhand von Dianous coerulescens GYLLENHAL, 1810 und Stenus comma LECONTE, 1863. In seiner Arbeit berichtet er von paarigen Drüsenreservoiren mit bandförmig aufgelagertem sekretorisch aktivem Gewebe. In weiteren Arbeiten wurden später für S. comma und S. biguttatus LINNÉ, 1758 zusätzliche, kleinere Reservoire grobmorphologisch beschrieben, die sich hinsichtlich ihrer Chemie von den großen unterschieden (SCHILDKNECHT, 1970; SCHILDKNECHT et al., 1976; DETTNER, 1993; LUSEBRINK, 2007). Der Ort der Biosynthese der Verbindungen in den zusätzlichen Reservoiren konnte allerdings in bisherigen Analysen noch nicht geklärt werden. Da das Pygidialdrüsensystem bei den Arten S. comma und S. biguttatus ohne jegliche Reduktion und in all seinen Einzelstrukturen funktionell quasi als Grundbauplan vorliegt, wird die Morphologie und Ultrastruktur der Drüsen und Reservoire zunächst ausführlich und erstmals für diese beiden Arten beschrieben. Im Anschluss daran werden die Modifikationen des Drüsensystems bei weiteren Steninae erläutert. 9 Beschreibung der Teilprojekte 2.1.1 Morphologie des Pygidialdrüsensystems von S. comma und S. biguttatus Das Pygidialdrüsensystem der Arten S. comma und S. biguttatus ist morphologisch weitgehend identisch ausgebildet. Es erstreckt sich dorsal der Geschlechtsorgane und lateral des Darmes über die letzten drei bis vier Abdominalsegmente (JENKINS, 1957). Das Drüsensystem besteht aus zwei großen Reservoiren (R1), denen das zugehörige sekretorische Gewebe (D1) in einer Einfaltung der Reservoirwand bandförmig aufgelagert ist. Die Ausführgänge der großen Reservoire münden in verbreiterte Membranstrukturen, die zur Sekretabgabe an der Abdominalspitze lateral des Afters ausgestülpt werden können (JENKINS, 1957) (Abb. 3). An der Basis der Ausführgänge von R1 befindet sich je ein weiteres, kleineres Reservoir (R2), das nicht von D1 befüllt wird (SCHILDKNECHT, 1970; SCHILDKNECHT et al., 1976). Das bisher unbekannte, zu R2 gehörige Drüsengewebe (D2) befindet sich als „blumenkohlartig“ strukturiertes Gebilde gegenüber der Mündung von R2 und umschließt dort den Ausführgang von R1 (Abb. 3). Die ausstülpbaren Membranbereiche können durch Erhöhung des Hämolymphdrucks nach außen gedrückt werden. Die Retraktion erfolgt über mehrere Muskelgruppen, die zentral zwischen den beiden Ausführgängen und im Bereich der Mündung von R2 ansetzen (JENKINS, 1957). R1 R2 Ma D1 D2 R1 R2 D2 D1 CBA Abb. 3 Morphologie der Pygidialdrüsen der Steninae. (A) S. comma mit in natürlicher Lage eingezeichneten Pygidialdrüsen. (B) Schematische Übersichtsdarstellung des Pygidialdrüsensystems von S. comma und S. biguttatus. (C) Lichtmikroskopische Aufnahme einer Hälfte des Pygidialdrüsensystems von S. comma nach Vitalfärbung mit Methylenblau. R1 große Drüsenreservoire, D1 bandförmiges, auf R1 aufgelagertes Drüsengewebe, R2 kleine Drüsenreservoire, D2 sekretorisches Gewebe zu R2, Ma ausstülpbare Membranbereiche der Reservoir-Ausführgänge. Messbalken: (A) 1 mm, (C) 200 µm. 10 Beschreibung der Teilprojekte 2.1.2 Ultrastruktur der großen Reservoire und des zugehörigen Drüsengewebes von S. comma und S. biguttatus Die großen Reservoire R1 des Pygidialdrüsensystems werden nach Öffnen des Abdomens von S. comma oder S. biguttatus als durchsichtige, flüssigkeitsgefüllte Blasen mit einer Länge von 1,3-1,5 mm sichtbar. In einer seitlichen Einfaltung der Reservoirwand liegen die etwa 1,2 mm langen zugehörigen sekretorischen Gewebe D1 (Abb. 3, 4A), die alle AlkaloidKomponenten des Pygidialdrüsensekrets produzieren (SCHILDKNECHT et al., 1975; KOHLER, 1979; LUSEBRINK et al., 2009; MÜLLER et al., 2012). Entfernt man die Weichteile eines präparierten Drüsensystems durch Mazeration in 10 % KOH (20 min, 90 °C), so bleiben im Bereich von D1 tubuläre Strukturen mit einer Länge von etwa 21 µm und einem Durchmesser von 0,3-0,7 µm zurück (Publ. I, Abb. 3A, B). Hierbei handelt es sich um cuticuläre Kanäle, die die im Drüsengewebe produzierten Sekrete aufnehmen und ins Reservoir R1 leiten (Abb. 4A, B). Die Kanäle lassen sich in einen fadenförmigen distalen und einen dickeren proximalen Abschnitt unterteilen (Abb. 4B). Betrachtet man Querschnitte durch das Gewebe von D1 im Transmissionselektronenmikroskop, so wird ersichtlich, dass der distale Kanalbereich im intakten Gewebe von einer lang gestreckten Drüsenzelle umgeben ist und eine ca. 50 nm dicke, poröse Wandung aus epicuticulärem Material aufweist (QUENNEDEY, 1998) (Abb. 4B, C). Die Drüsenzelle bildet um den Kanal eine extrazelluläre Höhle, deren Lumen durch eine Zellmembran vom Zellplasma getrennt ist. Über zahlreiche Mikrovilli kann von der Drüsenzelle produziertes Sekretmaterial durch Exocytose aus intrazellulären Vesikeln in den zentralen Extrazellulärraum abgegeben werden, wo es durch die poröse Epicuticula ins Innere des Kanals gelangt und zum Reservoir R1 geleitet wird. In Dünnschnitten ist eine um den Tubulus akkumulierende Masse sichtbar, welche nach HAPP et al. (1966) bei Terpenproduzierenden Phasmiden-Wehrdrüsen als Sekret oder Sekretvorstufe zu interpretieren ist (Abb. 4C; Publ. I, Abb. 3C, D). Die zur Synthese der Sekretkomponenten nötige Energie wird offensichtlich durch eine Vielzahl von Mitochondrien bereitgestellt, welche sowohl um die extrazelluläre Höhle als auch innerhalb der Mikrovilli angeordnet sind (Abb. 4B, C). Der proximale Teil der Tubuli stellt eine sekretableitende Verbindung zwischen der Drüsenzelle und dem Reservoir R1 her und endet in einer Pore in der Reservoirmembran. Diese Tubulusregion befindet sich innerhalb einer lang gestreckten Kanalzelle, die die Drüsenzelle penetriert und meist komplett von dieser umgeben ist (Abb. 4B). Da ein Austritt der bioaktiven Abwehrverbindungen aus dem Kanal in das Cytoplasma fatale Folgen für die umliegenden Zellen und Gewebe hätte, liegt hier eine 150-200 nm starke, epicuticuläre Wandung des Tubulus vor, die zusätzlich mit einer etwa 10 nm dicken Cuticulin-Auskleidung 11 Beschreibung der Teilprojekte verstärkt ist (QUENNEDEY, 1998). Die Verbindung zwischen Kanalund Drüsenzelle wird mittels septate junctions hergestellt. Bei dieser Form der Zell-Zell-Verknüpfung sind die beteiligten Zellen von Proteingürteln umgeben, welche über leiterförmig angeordnete Proteinbrücken („Septen“) verknüpft werden (LANE, 1982; Publ. I, Abb. 3E). Auch in der Kanalzelle liegt der Tubulus nicht frei im Zellplasma, sondern ist in einem schmalen Extrazellulärraum im Inneren der Zelle lokalisiert. Da die Kanalzelle keine sekretorische Aktivität aufweist, beinhaltet sie keine Mikrovilli und ist neben einem Zellkern und wenigen Mitochondrien generell arm an Zellstrukturen. Rw A C B Nu Tw Dz Et Kz Mv Ta Ez Mc Go Bl Dz Et R1 Ta Ec Se Dz Mc Mv Ve Ez Abb. 4 Morphologie und Ultrastruktur des Pygidialdrüsensystemteils R1/D1 von Stenus comma und S. biguttatus (Schematische Darstellung). (A) Querschnitt durch R1/D1. (B) Vergrößerung eines Teilausschnitts von (A). (C) Querschnitt durch eine D1-Drüsenzelle im Bereich der extrazellulären Höhlung und der sekretaufnehmenden Tubulusstruktur. Bl Basallamina, Dz Drüsenzelle, Ec innere Epicuticula, Ez Extrazellulärraum, Et schützende Epithelzellen, Go Golgi-Apparat, Kz Kanalzelle, Mc Mitochondrien, Mv Mikrovilli, Nu Nucleus, Rw Reservoirwand von R1, Se um den sekretaufnehmenden Tubulusteil akkumulierendes Sekret, Ta sekretaufnehmender Tubulusteil, Tw sekretweiterleitender Tubulusteil, Ve Sekretvesikel. Die schematischen Darstellungen der Strukturen geben die tatsächlichen Größenverhältnisse nicht maßstabsgetreu wieder. 12 Beschreibung der Teilprojekte Da das gebildete Sekret mittels eines cuticulären Kanals abgeleitet wird, und die sekretorische Zelle somit nicht in direktem Kontakt mit einer sekretspeichernden Struktur oder dem Ort der Sekretausscheidung steht, ist die Drüsenzelle als terminale Drüsenzelle des Typs III t nach NOIROT & QUENNEDEY (1974, 1991) sowie QUENNEDEY (1998) zu klassifizieren. Der Komplex aus Drüsenund Kanalzelle ist als Drüseneinheit zu bezeichnen (NOIROT & QUENNEDEY, 1991). Die Drüseneinheiten liegen der Reservoirmembran in einer Einfaltung einschichtig auf und werden zur Hämolymphe hin durch ein mehrschichtiges, nicht sekretorisch aktives Epithel mit aufgelagerter Basallamina abgegrenzt (Abb. 4A, B). Die Wandung der Reservoire selbst ist mit einer 70-100 nm dicken Intima aus epicuticulären Material ausgekleidet (Abb. 4B). In den nicht durch Drüsenzellen bedeckten Bereichen ist die Reservoirwand von einem dünnen, elastischen Muskelepithel mit quer und längs verlaufenden Myofibrillen umgeben (Publ. I, Abb. 3F). An ihrer Basis verjüngen sich die großen Reservoire R1 zunächst zu schmalen Ausführgängen, um sich kurz vor der Mündung nach außen wieder stark zu den ausstülpbaren Membranbereichen zu erweitern (Abb. 3). 2.1.3 Ultrastruktur und Funktion der kleinen Reservoire und des zugehörigen Drüsengewebes von S. comma und S. biguttatus Die bis zu 330 µm langen kleineren Reservoire R2 münden im Bereich der basalen Ausführgänge in die großen Reservoire R1 ein. Ihnen genau gegenüber liegen die in bisherigen Arbeiten stets übersehenen sekretorischen Gewebe D2 (Abb. 3, 5A), welche die Terpen-Komponenten des Pygidialdrüsensekrets produzieren (SCHILDKNECHT et al., 1975; NEUMANN, 1993). Das Drüsengewebe D2 ist in Funktion und Grundbauplan weitgehend identisch mit D1, feinstrukturell ergeben sich jedoch gravierende morphologische Unterschiede. D2 besteht aus zahlreichen einzelnen Drüseneinheiten, die je aus einer sekretorisch aktiven Zelle des Typs III t nach NOIROT & QUENNEDEY (1974, 1991) und QUENNEDEY (1998) sowie mindestens einer sekretableitenden Kanalzelle aufgebaut sind. Durch Zusammenballung vieler Drüseneinheiten entsteht eine „Blumenkohl-ähnliche“ Gesamtstruktur, die dem Ausführgang von R1 aufgelagert ist und diesen weitgehend umschließt (Abb. 5A). Nach Mazeration in 10 % KOH bleiben auch hier zahlreiche Kanalstrukturen zurück, die jedoch mit einer durchschnittlichen Gesamtlänge von etwa 60 µm deutlich länger als die in D1 beobachteten Tubuli ausfallen (Publ. I, Abb. 5). Auch hier kann zwischen einem proximalen und distalen Kanalbereich unterschieden werden. Der distale Tubulusteil liegt im D2-Gewebe 13 Beschreibung der Teilprojekte als verdickte, relativ kurze sekretaufnehmende Struktur vor (Abb. 5). Die Wandung dieses Tubusbereichs besteht aus einer etwa 60 nm dicken Epicuticula und ist mit zahlreichen Poren zur Sekretaufnahme ausgestattet (QUENNEDEY, 1998). Der distale Kanalabschnitt ist, wie auch in D1, in einer Drüsenzelle lokalisiert, die hier aber eine nahezu runde Form aufweist (Abb. 5B). Die produzierten Verbindungen werden via Exocytose über eine mit Mikrovilli ausgestattete Zellmembran in einen extrazellulären Hohlraum im Inneren der Drüsenzelle abgegeben und über den Tubulus abgeleitet (Abb. 5B). Die Drüsenzelle beinhaltet große Mengen an glattem Endoplasmatischen Reticulum sowie vereinzelt Golgi-Apparate, Ribosomen und Mitochondrien. Ähnlich wie in D1 ist der sekretaufnehmende Tubulusbereich auch in D2 von Filamenten umgeben (Abb. 5B; Publ. I, Abb. 6). Da hier jedoch statt einer mehr oder weniger homogenen Masse deutlich voneinander unterscheidbare Filamente in einer schwammartigen Struktur vorliegen, wird diesen Filamenten ein cuticulärer Ursprung unterstellt. Unterstützt wird diese Vermutung durch das Auftreten von Plaques an den Apizes vieler Mikrovilli, wie sie auch während der Neubildung der Epicuticula bei der Insektenhäutung zu beobachten sind (LOCKE & HUIE, 1979). Cuticuläre Filamente im Bereich des sekretaufnehmenden Tubulus sind bereits für diverse Arthropodendrüsen beschrieben worden (z.B. HAPP & HAPP, 1973; BIEMONT et al., 1992; DRILLING et al., 2010) und könnten das Sekret modifizierende Enzyme enthalten. Während der Passage von wenig bioaktiven Sekretvorstufen durch die Filamente würde hierbei die Toxizität der Verbindungen schrittweise erhöht und somit die volle Aktivität der Endprodukte erst außerhalb der sekretorischen Zellen hergestellt. Auf diese Weise könnte eine „Selbstvergiftung“ durch die produzierten Abwehrverbindungen und eine damit einhergehende Schädigung des Drüsengewebes verhindert werden (BIEMONT et al., 1992). Der proximale, sekretableitende Tubulusteil stellt mit ca. 50 µm Länge den größten Teil eines D2-Tubulus dar. Er weist eine 60 nm dicke, kompakte Epicuticula mit innen aufgelagerter Cuticulinschicht auf (QUENNEDEY, 1998). Über den gesamten proximalen Tubulusbereich verstreut befinden sich zahlreiche ovale Ausstülpungen, die ebenfalls modifizierende Enzyme beinhalten könnten (Abb. 5B) (EISNER et al., 1964). Der proximale Kanalteil ist von mindestens einer lang gestreckten, nicht sekretorisch aktiven Kanalzelle umgeben, und dort ebenfalls in einer schmalen extrazellulären Höhlung lokalisiert. Die Kanalzelle penetriert die Drüsenzelle, ist jedoch zum größten Teil nicht von dieser umschlossen (Abb. 5B). Beide Zellen sind über septate junctions fest miteinander verbunden. Die ableitenden Bereiche aller Tubuli münden auf einem Porenfeld gesammelt in den Ausführgang von R1 ein, welches sich exakt gegenüber der R2-Öffnung befindet (Abb. 5A). Da in R1 keine Terpen-Komponenten nachweisbar sind, muss ein zuverlässiger Sekrettransfer 14 Beschreibung der Teilprojekte über den Ausführgang zum Reservoir R2 erfolgen. Dieser ist vermutlich durch ein Kollabieren der R1-Ausführgänge im Ruhezustand gewährleistet, wodurch die Porenplatte mit den Mündungen der Tubuli direkt auf die Öffnung des Reservoirs R2 gepresst wird (Abb. 5A; Publ. I, Abb. 7E). Bei Erhöhung des Hämolymphdruckes strömt Sekret aus den Reservoiren aus, wodurch sich die R1-Ausführgänge öffnen und die Sekretabgabe aus beiden Reservoirtypen möglich wird. Die Reservoirwand der kleinen Reservoire R2 besteht aus einer inneren epicuticulären Intima, gefolgt von einer Schicht dicht gepackter, cuticulärer Filamente. Beide innere Schichten liegen bei nicht prall gefülltem Reservoir in Falten, wodurch eine gewisse Elastizität der Reservoirwand gewährleistet wird. Zur Hämolymphe hin wird die Reservoirwand durch ein einschichtiges Epithel mit Basallamina abgegrenzt (Publ. I, Abb. 7F). B Nu Nu D z K z Go Mc Ri gER Mv Ec Bl As Fi Tw Ez Ta A Pl Ag R1 Dz Kz D2 Pf R2 Abb. 5 Morphologie und Ultrastruktur des Pygidialdrüsensystemteils R2/D2 von Stenus comma und S. biguttatus (Schematische Darstellung). (A) Morphologie und Position von R2/D2 am Ausführgang von R1. (B) Ultrastruktur einer Drüseneinheit aus D2. Ag Ausführgang von R1, As Ausstülpungen des ableitenden Tubulusteils, Bl Basallamina, Dz Drüsenzelle, Ec innere Epicuticula, Ez Extrazellulärraum, Fi Schicht cuticulärer Filamente, gER glattes Endoplasmatisches Reticulum Go Golgi-Apparat, Kz Kanalzelle, Mc Mitochondrien, Mv Mikrovilli, Nu Nucleus, Pf Porenfeld, Pl Plaques an den Apizes der Mikrovilli Ri Ribosomen, Ta sekretaufnehmender Tubulusteil, Tw sekretweiterleitender Tubulusteil. Die schematischen Darstellungen der Strukturen geben die tatsächlichen Größenverhältnisse nicht maßstabsgetreu wieder. 15 Beschreibung der Teilprojekte S. solutus zeigte im Biotest eine höchst signifikant bessere Deterrent-Wirkung, als die Einzelkomponente Cicindeloin. Da das natürliche Sekret dieser Stenus-Art jedoch große Mengen des hochwirksamen 3-(2-Methyl-1-butenyl)-pyridin enthält, ist die bessere Wirkung des Sekrets wohl auf die Aktivität dieser Komponente zurückzuführen und ein Synergismus auch hier auszuschließen. Einige Arten der Steninae (z.B. S. comma, S. biguttatus, D. coerulescens) halten sich bisweilen auf der Oberfläche von durch Fische besiedelten Gewässern auf. Da sich die Tiere kraulend oder durch Spreitungsschwimmen auf der Wasseroberfläche fortbewegen, sind sie einer hohen Gefahr durch Fischprädation ausgesetzt. Bewegliche Objekte auf der Wasseroberfläche werden von Fischen meist als Beute interpretiert und sind deshalb für diese von hohem Interesse. Wasserkäfer der Familie der Gyrinidae können auf Fischteichen beispielsweise dabei beobachtet werden, wie sie oft mehrfach hintereinander von Fischen gepackt, jedoch dank ihrer potenten Wehrsekrete meist unversehrt wieder ausgespuckt werden (BENFIELD, 1972; DETTNER, 1985; EISNER & ANESHANSLEY, 2000). Obwohl eine derartige Situation für Steninae bislang nicht beschrieben wurde, scheint eine Konfrontation mit Fischen realistisch. Aus diesem Grund wurden die Sekretkomponenten der Steninae auf ihre Deterrenteigenschaften gegen Fische der Art Xiphophorus helleri HECKEL, 1848 (Cyprinodontiformes, Poeciliidae) überprüft. Hierzu wurden in fettarmer H-Milch emulgierte Sekretverbindungen mit kalt löslicher Gelatine verfestigt, die entstehende Masse in kleine Pellets geschnitten und den Fischen in einem Aquarium angeboten. Um die Attraktivität der Pellets für die Fische zu steigern wurde zusätzlich 0,1 g pulverisiertes Fischfutter/1 g Gelatine zugegeben. Als Kontrolle wurden gleichzeitig Pellets ohne Drüsensekretkomponenten verfüttert. Bei einer Substanz-Konzentration von 3,2 mg/ml unverfestigter Milchlösung konnte für alle eingesetzten Drüsenkomponenten auch beim Test mit X. helleri eine signifikant fraßhemmende Wirkung nachgewiesen werden (Abb. 9). Im Gegensatz zu den Ameisenbiotests wurden hier jedoch keine signifikanten Unterschiede in der Wirkung der Einzelkomponenten deutlich. Um Wirbeltiere wie Fische abzuwehren, scheint die qualitative Zusammensetzung des Sekrets weniger relevant zu sein, als die abgegebene Gesamtsekretmenge. Die für die Fischbiotests eingesetzte Substanzmenge liegt deutlich über der einem Käfer zur Verfügung stehenden (LUSEBRINK et al., 2008b). Da aber ein Großteil der Wirkstoffe im Inneren der Pellets festgesetzt und für die Fische nur der auf der Pelletoberfläche lokalisierte Anteil zugänglich war, ist davon auszugehen, dass ein Käfer bei 22 Beschreibung der Teilprojekte Abgabe des unverdünnten Sekrets durchaus in der Lage sein sollte, Angriffe durch Fische abzuwehren. Abb. 9 Two-Choice-Biotests zur Ermittlung der Deterrent-Aktivität der synthetischen Drüsensekretkomponenten gegen den Fisch Xiphophorus helleri. Dargestellt ist die Verteilung der gefressenen Kontroll- (dunkelblau) und Testpellets (hellblau) mit Standardabweichung. 1 Stenusin, 2 Norstenusin, 3 3-(2-Methyl-1-butenyl)-pyridin, 5 Cicindeloin, 6 1,8-Cineol, 7 α-Pinen, 8 6Methyl-5-hepten-2-on. Eingesetzte Substanzkonzentration: 3,2 mg/ml unverfestigter Milchlösung. 2.3.2 Antimikrobielle Wirkung der Pygidialdrüsensekrete Beobachtet man Steninae in ihrer natürlichen Umgebung, so fällt auf, dass die Tiere ein intensives Putzverhalten aufweisen. Hierbei wird mit den Hinterbeinen Pygidialdrüsensekret von der Hinterleibsspitze abgenommen, auf die Mittelund Vorderbeine übertragen und auf der gesamten Körperoberfläche verteilt (BETZ, 1999). Ein derartiges Verhalten ist als „Secretion Grooming“ („Sekretputzen“) bekannt und erstmals für Wasserinsekten (Coleoptera: Hydradephaga, Heteroptera: Pleidae) beschrieben worden (MASCHWITZ, 1967, KOVAC & MASCHWITZ, 1989, 1990). Durch das Einreiben mit Sekret sollen Bakterien, Pilze und anderer epibiontischer Aufwuchs entfernt und von der Besiedelung der Körperoberfläche abgehalten werden. Aus diesem Grund wurde dem Pygidialdrüsensekret der Steninae bereits in DETTNER (1985, 1993) und BETZ (1999) eine antimikrobielle Wirkung unterstellt, welche später für Stenusin, Norstenusin und 3-(2-Methyl-1-butenyl)-pyridin experimentell bestätigt werden konnte (LUSEBRINK, 2007; LUSEBRINK et al., 2008b, 2009). Die Einsatzmöglichkeit von 1,8-Cineol als Antiseptikum in der Humantherapie ist, unabhängig von den Drüsensekreten der Steninae, ebenfalls seit geraumer Zeit bekannt (SCHILDKNECHT, 1976). Um auch eine Aussage über die antimikrobiellen Eigenschaften der weiteren Verbindungen treffen zu können, wurden Agardiffusionstests mit den entomopathogenen Bakterien Bacillus sphaericus (Gram-positiv) und Serratia entomophila (Gram-negativ) sowie mit Escherichia coli (Gram-negativ), dem insektenparasitären Pilz Lecanicillium lecanii (ehemals Verticillium (1) (2) (3) (5) (6) (7) (8) gefressene Pekllets [%] 0 20 40 60 80 100 * * ***** 20 40 60 80 100 0 Gefressene Pellets [%] (1) (2) (3) (5) (6) (7) (8) (1) (2) (3) (5) (6) (7) (8) gefressene Pekllets [%] 0 20 40 60 80 100 * * ***** 20 40 60 80 100 0 Gefressene Pellets [%] (1) (2) (3) (5) (6) (7) (8) 23 Beschreibung der Teilprojekte lecanii) und der Hefe Saccharomyces cerevisiae durchgeführt. Hierbei wurde soweit möglich das Protokoll zur Durchführung von Agardiffusionstests nach LUSEBRINK (2008a) verwendet. Die Mikroorganismen wurden aus Dauerkulturen entnommen, in Flüssigkultur vermehrt und anschließend auf Agarplatten ausgestrichen. Direkt nach der Inokulation wurden kleine Baumwollplättchen auf die Agaroberfläche aufgelegt, welche in reinem Ethanol gelöste Pygidialdrüsen-Verbindungen oder naturidentische Sekrete enthielten (1,6 mg/Testplättchen). Als Kontrolle wurde ein Testplättchen mit reinem Ethanol hinzugefügt. Nach Inkubation der präparierten Platten wurden die erzeugten Hemmhöfe vermessen und die Ergebnisse auf den ganzen Millimeter gerundet notiert. Tabelle 2 Agardiffusionstests zur Charakterisierung der antimikrobiellen Aktivitäten von Sekretkomponenten und synthetischen Sekreten. Mittlere Hemmhofdurchmesser (MW) in Millimeter mit Standardabweichung (SA). Bei deutlicher Aktivität der Verbindungen gegen die Testorganismen sind die Hemmhofdurchmesser farblich hinterlegt. 1 Stenusin, 2 Norstenusin, 3 3-(2-Methyl-1-butenyl)-pyridin, 5 Cicindeloin, 6 1,8-Cineol, 7 αPinen, 8 6-Methyl-5-hepten-2-on, n.d. Test nicht durchgeführt. (n = 4, Durchmesser der Testplättchen: 9 mm, Eingesetzte Substanzmenge: 1,6 mg/Testplättchen). Im Gegensatz zu den Ergebnissen der Fraßbiotests, bei denen allen analysierten Verbindungen eine mehr oder weniger deutliche Deterrent-Wirkung nachgewiesen werden konnte, wurden in den Agardiffusionstests zum Teil massive Aktivitätsunterschiede sichtbar (Tabelle 2). Während die Alkaloide Stenusin, 3-(2-Methyl-1-butenyl)-pyridin und Cicindeloin das Wachstum der Testbakterien massiv hemmten, konnten um die Norstenusin-Plättchen nur Hemmzonen beobachtet werden, die kaum größer als die der Kontrollen ausfielen. Die Aktivität aller Sekret-Alkaloide gegen S. cerevisiae erwies sich als minimal, die von 3-(2Methyl-1-butenyl)-pyridin und Cicindeloin gegen L. lecanii jedoch als außerordentlich stark. Stenusin und Norstenusin zeigten hingegen auch gegen L. lecanii kaum Hemmwirkung. Den Terpen-Komponenten 1,8-Cineol und 6-Methyl-5-hepten-2-on konnte generell keine Verbindung/ Sekret E. coli S. entomophila B. sphaericus S. cerevisiae L. lecanii MW SA MW SA MW SA MW SA MW SA EtOH 11 1,29 10 1,50 13 0,50 9 0,00 9 0,00 1 21 1,41 18 0,96 20 1,00 13 0,58 12 0,50 2 12 0,82 12 0,82 13 0,82 11 0,58 12 0,50 3 18 0,82 20 3,50 20 2,38 12 0,00 23 1,89 5 20 0,21 22 0,12 21 0,08 12 0,82 30 1,26 6 11 0,50 11 0,00 13 0,82 11 0,58 10 0,58 7 15 1,15 13 2,00 17 0,96 43 0,82 42 1,91 8 11 0,82 11 0,96 12 0,96 11 0,96 10 0,50 S. comma 15 0,82 16 0,96 15 0,82 11 0,50 13 0,96 S. similis 16 0,58 16 0,96 16 0,82 12 0,00 13 0,00 S. solutus 17 0,96 n.d. - n.d. - 12 0,58 14 0,58 24 Beschreibung der Teilprojekte antimikrobielle Wirkung nachgewiesen werden. Dies ist verwunderlich, da 1,8-Cineol in der Literatur als antiseptische Verbindung geführt wird (SCHILDKNECHT, 1976). α-Pinen zeigte nur eine moderate Hemmung des Bakterienwachstums, erwies sich aber gegen S. cerevisiae und L. lecanii mit den größten, während der gesamten Versuchsreihe gemessenen, Hemmhöfen als sehr effizient. Wie auch bei den Biotest zur Aktivität als Feeding Deterrent stellten sich die synthetischen Sekrete von S. comma, S. similis und S. solutus als weniger effektiv heraus, als die entsprechenden Hauptkomponenten-Alkaloide (Tabelle 2). Auch bezüglich der antimikrobiellen Aktivität kann somit eine synergistische Wirkung der Sekretkomponenten in natürlicher Komposition ausgeschlossen werden. Die antimikrobielle Wirkung von Stenusin und Norstenusin gegen die hier verwendeten Bakterien und den Pilz L. lecanii wurde bereits in den Arbeiten von LUSEBRINK (2007) und LUSEBRINK et al. (2008b) untersucht. Hierbei wird von einer enormen Hemmwirkung berichtet, die der kommerziell erhältlicher Antibiotika oder Antimykotika nahe kommt. Gleichzeitig wird in LUSEBRINK (2007) berichtet, dass die beiden Alkaloide in Tests des Hans Knöll Instituts (HKI) in Jena gegen Krankenhauskeime keine nennenswerte Aktivität aufwiesen. Aufgrund dieses Befunds und der oben aufgeführten neuen Ergebnisse scheint das in LUSEBRINK (2007) und LUSEBRINK et al. (2008b) ermittelte enorme antimikrobielle Potential der Sekret-Alkaloide Stenusin und Norstenusin zweifelhaft. Um die beschriebenen Hemmhofdurchmesser zu erzeugen, musste bei unseren Analysen die 200-fache StenusinMenge eingesetzt werden, während zur Überprüfung der Ergebnisse aufgelegte, kommerziell gefertigte Testplättchen mit dem Antibiotikum Tygacil (15µg/Plättchen) vergleichbare Ergebnisse lieferten. Einzig die in den LUSEBRINK-Arbeiten ermittelte Tendenz der höheren antimikrobiellen Wirkung von Stenusin gegenüber Norstenusin konnte reproduziert werden. Obwohl die antimikrobielle Wirkung der Pygidialdrüsenkomponenten nicht derart ausgeprägt zu sein scheint, wie in der Literatur beschrieben, sollte das Sekret den Käfern einen zuverlässigen Schutz vor dem Befall durch Mikroorganismen bieten. Bedenkt man die Tatsache, dass das Sekret auf der Körperoberfläche der Tiere unverdünnt vorliegt und durch das häufige Putzverhalten ständig erneuert wird, so ist von einer zur effizienten Wachstumshemmung von Mikroorganismen ausreichenden Sekretmenge auszugehen. 25 Beschreibung der Teilprojekte 2.3.3 Einfluss der Konfiguration der chiralen Sekretkomponenten Stenusin und Norstenusin auf deren biologische Wirkung Das Alkaloid-Molekül Stenusin besitzt zwei stereogene Zentren und existiert somit in Form vier verschiedener Stereoisomere (Abb. 10A). Alle vier Isomere kommen in den natürlichen Pygidialdrüsensekreten von Steninen in einer artspezifisch konservierten prozentualen Verteilung vor (LUSEBRINK et al., 2007). Da die biologische Wirkung einer chiralen Verbindung stark mit deren Konfiguration variieren kann (MORGAN, 2004), wurden Ameisenund Agardiffusionsbiotests mit den reinen Diastereomeren (2'R,3S)- und (2'R,3R)- Stenusin sowie mit den Enantiomeren (3R)- und (3S)-Norstenusin durchgeführt. Während im Agardiffusionstest keine Unterschiede bezüglich der Wachstumshemmung der Bakterien durch die beiden Stenusin-Diastereomere ersichtlich waren, wurde das (2'R,3R)- Stenusin durch die Ameisen signifikant dem (2'R,3S)-Isomer vorgezogen (Abb. 10B, C). Die gleiche Tendenz war im Biotest mit Norstenusin in (3R)- und (3S)-Konfiguration erkennbar. Die (3S)-konfigurierten Verbindungen weisen somit eine höhere fraßhemmende Wirkung auf, als die (3R)-Isomere. Von 36 untersuchten Stenusin-produzierenden Arten enthalten nach LUSEBRINK et al. (2007) 24 das aktivere (3S)-konfigurierte Stenusin als Hauptkomponente. Unter Berücksichtigung dieser Stereoisomerenverteilung und der Ergebnisse der Ameisenbiotests erscheint die Konfiguration des Stenusins an Position 3 durchaus relevant für die Verteidigung gegen prädatorische Arthropoden. Bei einem Drittel der untersuchten Arten taucht jedoch das weniger aktive (3R)-Stenusin als häufigstes Isomer auf. mittl. Hemmhofdurchmesser [mm] 0 5 10 15 20 E. coli S. entomophila B. sphaericus Ameisenkontakte [%] 0 20 40 60 80 100 120 * A 2'R,3Svs 2'R,3R2'R,3R2'R,3S N N NN (2'R,3R)-Stenusin (2'R,3S)-Stenusin (2'S,3S)-Stenusin (2'S,3R)-Stenusin B Ameisenkontakte [%] 20 40 60 80 100 00 5 10 15 20 C Mittl. Hemmhofdurchmesser [mm] Abb. 10 Einfluss der Konfiguration des Stenusins auf dessen biologische Wirkung. (A) Stereoisomere des Stenusins. (B) Two-Choice-Biotests mit Lasius flavus (Verteilung der Ameisenkontakte an den Testund Kontrolltropfen mit Standardabweichung, 100 µg/ml Milch). (C) Agardiffusionstests (mittlere Hemmhofdurchmesser mit Standardabweichung, 1,6 mg/Testplättchen). 26 Beschreibung der Teilprojekte Die stereoselektive Synthese der Alkaloide erfordert mindestens ein spezifisches Enzym für jedes einzelne Stereoisomer (MORGAN, 2004). Darüber hinaus ist im Falle der artspezifisch konservierten Verteilung der einzelnen Stereoisomere des Stenusins im Käfersekret eine exakte Regulierung dieser Enzyme nötig. Trotzdem sind in den Sekreten der Steninae alle vier Stereoisomere zu finden. Dies wirft die Frage nach dem selektiven Vorteil einer derart aufwändig regulierten Stereoisomerenverteilung im Käfersekret auf, in der bei einigen Arten auch die zur Verteidigung weniger geeigneten Isomere signifikant vorkommen. Eine mögliche Erklärung dieses Phänomens wäre eine Wirkung des Pygidialdrüsensekrets oder einzelner Komponenten als Pheromon, da in diesem Falle die absolute Konfiguration einer Verbindung von großer Bedeutung für das Auslösen einer Reaktion beim Empfänger ist (MORI, 1999; MORGAN, 2004). Um eine potentielle Pheromonfunktion des Stenusins nachweisen zu können, wurden elektrophysiologische sowie Verhaltensuntersuchungen mit Stenus bimaculatus GYLLENHAL, 1810 durchgeführt. Mittels Elektroantennographie konnte nachgewiesen werden, dass Individuen beider Geschlechter von S. bimaculatus Stenusin wahrnehmen können. Während beim Aufblasen des Lösungsmittels Pentan auf eine amputierte, lebendige Antenne keine Reaktion zu beobachten war, wurde mit einer schwach konzentrierten Stenusinlösung (1% in Pentan) eine deutliche Depolarisation der Antenne messbar (Abb. 11). Eine Lockwirkung des Drüseninhalts von S. bimaculatus auf das jeweilige andere Geschlecht konnte jedoch sowohl während als auch außerhalb der Paarungszeit weder in einem Still Air Olfactometer noch über Barber-Fallen im Freiland festgestellt werden. Im Gegenteil, bei Two-Choice-Biotests in einem T-Rohr, das in einem Ast das zerquetschte Drüsensystem eines Käfers auf einem Baumwollplättchen und im anderen ein unbehandeltes Kontrollplättchen enthielt, wählten die Tiere fast ausschließlich den Ast ohne Drüsensekret. Eine Rolle der Sekrete als Sexuallockstoff kann damit, zumindest unter den überprüften Bedingungen, ausgeschlossen werden. Die Klärung der Frage, ob die konservierte Verteilung der Stenusin-Enantiomere im Pygidialdrüsensekret der Steninae einem bestimmten Zweck dient, oder sich lediglich zufällig entwickelte, bleibt somit weiteren Arbeiten vorbehalten. Abb. 11 Elektroantennogramm. Veränderung des Summenpotentials aller Rezeptoren in einer Antenne von S. bimaculatus nach Aufblasen von Stenusin (1 % in Pentan, 10 µl auf Filterpapierplättchen, Isomerenzusammensetzung Stenusin: (2'R,3R) 10 %; (2'S,3R) 29 %; (2'S,3S) 54 %; (2'R,3S) 7 %). ∆V 5s 0,5 mV 0,0 mV puff 27 Beschreibung der Teilprojekte 2.4 Biosynthese der stickstoffhaltigen Sekretkomponenten Betrachtet man die Molekülstruktur der Alkaloide aus den Pygidialdrüsensekreten der Steninae, so fällt bei allen Verbindungen eine ähnliche Grundstruktur auf (Abb. 2). Stets ist ein mehr oder weniger gesättigter, N-heterocyclischer Sechsring mit einer an Position 3 lokalisierten, 2'-verzweigten Seitenkette vorhanden. Aufgrund der strukturellen Übereinstimmungen dieser Alkaloid-Moleküle scheint die Biosynthese aus identischen Vorläuferverbindungen sehr wahrscheinlich. Von POUPON et al. (2000) wurde erstmals die Biosynthese von Stenusin durch Reaktion von Metaboliten der Aminosäuren L-Lysin und L-Isoleucin postuliert. Der Piperidin-Ring sei hierbei auf Lysin, die Seitenkette auf Isoleucin zurückzuführen. LUSEBRINK et al. (2008a) gelang einige Jahre später die experimentelle Bestätigung dieser Hypothese. Nach Fütterung von deuteriummarkiertem Lysin und Isoleucin an S. bimaculatus, konnte in den Pygidialdrüsen der Tiere deuteriertes Stenusin nachgewiesen werden. Um die Hypothese der biogenetischen Verwandtschaft aller Sekret-Alkaloide überprüfen zu können, wurden Fruchtfliegen (Drosophila melanogaster) nach einem modifizierten Protokoll aus LUSEBRINK et al. (2008a) kurz in gesättigte wässrige Lösungen von L-[D9,15N2]-Lysin oder L-[D10,15N]-Isoleucin getaucht und täglich an S. similis (Stenusinund 3-(2-Methyl-1butenyl)-pyridin-Produzent) sowie S. solutus (Cicindeloinund 3-(2-Methyl-1-butenyl)- pyridin-Produzent) verfüttert. Nach zweiwöchiger Fütterung der Käfer mit den präparierten Fliegen konnte durch eine massenspektrometrische Analyse der Pygidialdrüsensekrete sowohl bei S. similis, als auch bei S. solutus eindeutig der Einbau der markierten Aminosäuren in die Alkaloide belegt werden (Abb. 12). In beiden Arten war nach der L-[D9,15N2]-LysinVerfütterung eine Erhöhung der Masse des M+-Peaks von 3-(2-Methyl-1-butenyl)-pyridin um 5 u zu beobachten, was dem Einbau von einem 15Nund vier Deuterium-Atomen entspricht (Abb. 12A, B). Eine Verfütterung von L-[D10,15N]-Isoleucin lieferte einen um 8 u schwereren M+-Peak und weist somit auf den Einbau von acht Deuterium-Atomen hin (Abb. 12A, C). In den Fragmenten m/z 132 und 117 des (E)-3-(2-Methyl-1-butenyl)-pyridins ist der stabile Pyridin-Ring noch vollständig vorhanden, die Seitenkette jedoch teilweise abgespalten (Publ. III, Abb. 2). Die identische Massenerhöhung in Molekülion und beiden Fragmentionen nach L-[D9,15N2]-Lysin-Verfütterung belegt somit den Einbau der Markierung in den PyridinRing der Verbindung. Im Gegensatz dazu entstand nach L-[D10,15N]-Isoleucin-Verfütterung ein M+-Peak m/z 155 mit maximal erhöhtem Molekulargewicht, während die Massenzunahme in den Fragmentionen reduziert war. Der Deuteriumeinbau erfolgte hier nur in der Seitenkette des (E)-3-(2-Methyl-1-butenyl)-pyridins. 28 Beschreibung der Teilprojekte Abb. 12 Massenspektren von 3-(2-Methyl-1-butenyl)-pyridin aus dem Pygidialdrüsensekret von S. similis (A-C) und Cicindeloin aus dem Sekret von S. solutus (D-F) nach Verfüttern der markierten Aminosäuren L-[D9,15N2]-Lysin und L-[D10,15N]-Isoleucin. (A) (E)-3-(2-Methyl-1-butenyl)-pyridin nativ, (B) (E)-3-(2-Methyl-1-butenyl)-pyridin nach L-[D9,15N2]-Lysin-Einbau, (C) (E)-3-(2-Methyl-1-butenyl)- pyridin nach L-[D10,15N]-Isoleucin-Einbau, (D) Cicindeloin nativ, (E) Cicindeloin nach L-[D9,15N2]-LysinEinbau, (F) Cicindeloin nach L-[D10,15N]-Isoleucin-Einbau. (A-C) Elektronenstoßionisation, (E-F) chemische Ionisation (CH4). S Fragmentionen aus nativem Stenusin, Massen mit Sternchen [M+H]+, Massen in Klammern [M+C2H5] + , [M+C3H5]+. A-C: Reprinted with permission from Schierling A., Dettner K., Schott M. & K. Seifert (2011) Biosynthesis of the Defensive Alkaloid (Z)-3-(2-Methyl-1butenyl)pyridine in Stenus similis Beetles. Journal of Natural Products 74:2231-2234. Copyright (2011) American Chemical Society. Nach Verfütterung von L-[D9,15N2]-Lysin an S. solutus war für Cicindeloin im CIMS ein um 8 u schwereres [M+H]+-Ion nachweisbar, was den Einbau von sieben Deuterium-Atomen und einem 15N-Atom beweist (Abb. 12D, E). Da eine identische Massenerhöhung auch in den Fragmentionen mit intaktem Piperidein-Ring, jedoch vollständig abgespaltener Seitenkette zu 29 Beschreibung der Teilprojekte beobachten war (z.B. m/z 98, 112), muss der Einbau hier ebenfalls im Ring erfolgt sein (Publ. IV, Abb. 2). Nach L-[D10,15N]-Isoleucin-Aufnahme erhöhte sich die Masse des [M+H]+-Ions um 9 u, während die der Fragmentionen ohne Seitenkette nicht größer wurde (Abb. 12D, F). Somit müssen die neun Deuterium-Atome aus dem markierten Isoleucin in die Seitenkette des Cicindeloins eingebaut worden sein. Im Sekret von S. similis konnte darüber hinaus auch deuteriertes Stenusin identifiziert werden. Die L-[D9,15N2]-Lysin-Behandlung resultierte in dem Einbau von einem 15Nund sieben Deuterium-Atomen in den Piperidin-Ring, die L-[D10,15N]-Isoleucin-Verfütterung im Einbau von acht Deuterium-Atomen in die Seitenkette (Publ. III, Supplement Abb. S3). Abb. 13 Biosynthese der Hauptkomponenten-Alkaloide aus den Pygidialdrüsen der Steninae. Die Sekret-Alkaloide entstammen verschiedenen Arten und kommen in natürlichen Sekreten nur teilweise nebeneinander vor. Wie für Stenusin von LUSEBRINK et al. (2008a) bestätigt, geht somit auch in der Biosynthese von 3-(2-Methyl-1-butenyl)-pyridin und Cicindeloin die Ringstruktur auf L-Lysin und die 30 Beschreibung der Teilprojekte Seitenkette auf L-Isoleucin zurück. Mit hoher Wahrscheinlichkeit verläuft die Biosynthese der Alkaloide zu Beginn identisch, bis zu zwei Vorläufermetaboliten m1 und m2, die bereits durch POUPON et al. (2000) postuliert wurden (Abb. 13). Durch Decarboxylierung und oxidative Desaminierung von L-Lysin entsteht zunächst über das Intermediat 5-Aminopentanal der N-Heterocyclus Δ1-Piperidein (Abb. 13). Dieses reagiert nach Isomerisierung der Doppelbindung zum Δ2-Piperidein in einer aza-Aldol Reaktion mit dem aus L-Isoleucin analog gebildeten (S)-2-Methylbutanal zum protonierten Metaboliten m1. Aus den beiden im Gleichgewicht zueinander stehenden Metaboliten m1 und m2 können anschließend durch Oxidation, Reduktion, N-Ethylierung und Epoxidierung die Sekret-Alkaloide erzeugt werden. Die Bildung des 1',3-Dehydrostenusins aus S. scaber wurde nicht mittels Deuterierungs-Experiments überprüft, die Biosynthese aus L-Lysin und LIsoleucin erscheint jedoch auch hier wahrscheinlich. 160152144136128120112104968880726456 m/z 20 40 60 80 100 151 136 122 108 95 81 67 55 160152144136128120112104968880726456 m/z 20 40 60 80 100 150 136 122 108 94 82 67 55 A B N N H Relative Intensität [%] Relative Intensität [%] Abb. 14 Massenspektren von Vorläufermetaboliten der Alkaloid-Biosynthese in den Pygidialdrüsen der Steninae (Elektronenstoßionisation). (A) Metabolit m1, (B) Metabolit m2. Metabolit m1 ist nachweislich als Nebenkomponente in den Pygidialdrüsensekreten von S. similis, S. solutus und denen vieler weiterer Steninae enthalten. Die postulierte Struktur wurde durch die Synthese der Verbindung von Isabel Wittmann (AG Prof. Seifert, Organische 31 Zusammenfassung/Summary 3. Zusammenfassung Vertreter der Kurzflügelkäfer-Gattungen Stenus und Dianous weisen, wie die meisten Staphylinidae, einen schlanken Körperbau mit reduzierten Elytren auf. Dies führt zu einer erhöhten Beweglichkeit des Abdomens, wodurch Lückensysteme als Habitate erschlossen werden können. Da die reduzierten Elytren das Abdomen jedoch nur unzureichend schützen können, neigen die Käfer zu einer deutlich größeren Anfälligkeit gegen Prädation und Parasitierung. Um diesen Nachteil zu kompensieren, produzieren und speichern Steninae in abdominalen Wehrdrüsen hochgradig biologisch aktive Abwehrverbindungen, die sie auf vielfältige Art und Weise einsetzen. Um neue Einblicke in die komplexe chemische Ökologie der Steninae zu ermöglichen, wurden in der vorliegenden Dissertation die Morphologie, Ultrastruktur und Funktion der Pygidialdrüsen sowie die biologische Aktivität der Abwehrkomponenten und -sekrete untersucht. Durch Analyse der Biosynthese der stickstoffhaltigen Sekretkomponenten und deren Verteilung über verschiedene Arten wurden ferner Aussagen über potentielle evolutive Trends und phylogenetische Zusammenhänge innerhalb der Steninae möglich. Die paarig angelegten Pygidialwehrdrüsen der Steninae erstrecken sich lateral des Darmes und dorsal der Geschlechtsorgane über die letzten drei bis vier Abdominalsegmente. Sie bestehen aus zwei großen Reservoiren mit bandförmig aufgelagertem sekretorischen Gewebe sowie zwei weiteren kleinen Reservoiren mit zugehörigem Drüsengewebe an der Basis der Großen. In beiden sekretorisch aktiven Geweben erfolgt die Sekretproduktion in Drüsenzellen, die einen länglichen inneren Extrazellulärraum aufweisen. Die synthetisierten Produkte werden über zahlreiche Mikrovilli der Drüsenzellenmembran in den Extrazellulärraum abgegeben, wo sie von einem cuticulären Tubulus aufgenommen und zum entsprechenden Reservoir abgeleitet werden. Außerhalb der Drüsenzelle ist der sekretableitende Tubulus von einer Kanalzelle umgeben, die zusammen mit der Drüsenzelle eine Drüseneinheit bildet. Während die großen Reservoire mit den entsprechenden Drüsengeweben in Struktur und Funktion bei allen Steninen konserviert vorliegen, unterliegen die kleinen Reservoire und sekretorischen Gewebe meist starken Reduktionen, die bis hin zur Funktionslosigkeit einzelner Strukturen führen können. Die Sekrete in den großen Reservoiren bestehen aus den Alkaloiden Stenusin, 3-(2-Methyl-1butenyl)-pyridin und Cicindeloin sowie zum Teil aus deren Dehydrooder NorVerbindungen, wobei sowohl die qualitative, als auch die quantitative Zusammensetzung je nach Art unterschiedlich ausfallen kann. Die kleinen Reservoire enthalten Monoterpene, wie 38 Zusammenfassung/Summary unter anderem 1,8-Cineol, α-Pinen und 6-Methyl-5-hepten-2-on. In Biotests zeigten alle Sekretkomponenten eine signifikante Aktivität als Feeding Deterrent gegen die Ameise Lasius flavus und den Fisch Xiphophorus helleri. Weiterhin war bei den meisten Verbindungen eine deutliche wachstumshemmende Wirkung gegen Bakterien und Pilze feststellbar. Sowohl bezüglich der fraßhemmenden als auch der antimikrobiellen Wirkung zeigten sich hierbei die Alkaloid-Komponenten den Terpenen meist überlegen. In Tests mit zwei reinen Diastereomeren des in vier Stereoisomeren vorkommenden Stenusins zeigte sich über die biologische Aktivität eines Isomerengemisches hinaus, dass Ameisen zwischen verschiedenen Stereoisomeren diskriminieren, während bei Bakterien stets die gleiche Hemmwirkung zu beobachten ist. Die in den großen Reservoiren gespeicherten Alkaloide weisen alle ein identisches Grundgerüst mit N-heterocyclischem Sechsring und verzweigter Alkyl-Seitenkette auf. Über Verfütterung deuterierter Aminosäuren konnte die biogenetische Verwandtschaft der drei Alkaloid-Hauptkomponenten Stenusin, 3-(2-Methyl-1-butenyl)-pyridin und Cicindeloin nachgewiesen werden. In allen drei Fällen wird der N-Heterocyclus aus der Aminosäure LLysin, die Seitenkette aus L-Isoleucin gebildet. Die Biosynthese der Alkaloide erfolgt hierbei zunächst identisch, bis hin zu zwei Vorläuferverbindungen, die letztendlich durch wenige chemische Modifikationen in die Sekret-Alkaloide überführt werden können. Bezüglich der Morphologie der Pygidialdrüsen sowie der qualitativen und quantitativen Sekretkomposition sind evolutive Trends innerhalb der Steninae zu erkennen. In den phylogenetisch basalen Arten S. comma und S. biguttatus liegt ein stark ausgeprägtes, voll funktionsfähiges kleines Reservoir und Drüsengewebe an der Basis der großen Reservoire vor. Das Drüsensekret enthält Stenusin, Norstenusin und die im kleinen Reservoir gespeicherten Terpene. Im Laufe der Evolution der Steninae wurde sowohl das kleine Reservoir, als auch das entsprechende Drüsengewebe reduziert und der Terpen-Gehalt des Sekrets minimiert. Desweiteren wurde das Pygidialdrüsensekret zunächst um 3-(2-Methyl-1butenyl)-pyridin (z.B. S. similis) und später um Cicindeloin (z.B. S. solutus) erweitert, wobei Stenusin und Norstenusin mehr und mehr ersetzt wurden. 39 Zusammenfassung/Summary 4. Summary As typical Staphylinidae, rove beetles of the genera Stenus and Dianous possess a slim body shape and strongly reduced elytra. This body form enhances the flexibility of the abdomen that allows the beetles to better colonize habitats with small interstices, but also significantly increases the susceptibility to predation and parasitism due to the missing protection of the elytra. To compensate for this disadvantage, the Steninae synthesize and store several highly effective defensive compounds in abdominal defense glands. The aim of this dissertation was to gain further insights into the complex chemical ecology of the Steninae. The morphology, ultrastructure and function of the pygidial gland system as well as the biological activity of the defense compounds and secretions were analyzed. Furthermore, hypotheses concerning potential evolutionary trends and phylogenetic relationships within the Steninae were formulated based on analyses of the biosynthesis of the nitrogen containing secretion compounds and their distribution among different species. With regard to the chemical ecology of the Steninae, the pygidial glands are of greatest importance for these beetles. The paired defense glands are located lateral to the gut and dorsal to the genitals in the last three to four segments of the abdomen. They consist of two big reservoirs with a band of secretory tissue, located on the reservoir surface, together with two smaller reservoirs and the corresponding gland tissue situated at the base of the big reservoirs. In both secretory tissues the secretion is produced by gland cells containing an elongated extracellular cavity. The synthesized compounds are secreted via numerous microvilli in the gland cell membrane into the extracellular cavity, where it collects in a cuticular tubulus and is conducted to the corresponding reservoir. External to the gland cell, the tubulus is surrounded by a canal cell, forming together with the gland cell a glandular unit. The structure and function of the big reservoirs and the band of secretory tissue are identic in all Steninae. The small reservoirs, however, as well as their corresponding gland tissues are often more or less reduced and in many species even functionless. The secretions of the big reservoirs consist of the alkaloid compounds stenusine, 3-(2-methyl1-butenyl)pyridine and cicindeloine and sometimes the noror dehydro-derivates of these compounds, whereby the qualitative, as well as the quantitative composition of the secretion is species specific. The small reservoirs contain monoterpenes such as 1,8-cineole, α-pinene and 6-methyl-5-hepten-2-one and related compounds. In bioassays all secreted compounds revealed a significant deterrent activity against the ant Lasius flavus and the fish Xiphophorus helleri. Furthermore, an antimicrobial activity against bacteria and fungi was observed with 40 Zusammenfassung/Summary most secreted compounds. The deterrent, as well as the antimicrobial activity of the alkaloid compounds turned out to be for the most part more effective than the terpenes. In bioassays with two out of four stereoisomers of the chiral compound stenusine ants discriminated between the tested diastereomers, while antibacterial activity was identical with both stenusine isomers. All alkaloids stored in the big reservoirs exhibit the same molecular base structure consisting of an N-heterocyclic six-ring, substituted by a branched alkyl side chain. By feeding deuterated amino acids to the beetles, it was possible to demonstrate a biogenetical relationship between the alkaloids stenusine, 3-(2-methyl-1-butenyl)pyridine and Cicindeloine. In all three compounds the heterocyclic ring structure is synthesized out of Llysine and the side chain out of L-isoleucine. The biosynthesis of the compounds first follows an identical pathway up to two precursor molecules that can be transformed into the alkaloid products by a few chemical modifications. Concerning the morphology of the pygidial glands, as well as the qualitative and quantitative composition of the Steninae’s pygidial gland secretions, some evolutionary trends can be recognized. The phylogenetically primitive species S. comma and S. biguttatus both possess well developed and completely functional small reservoirs and gland tissue at the base of the big reservoirs. The secretion is made up by stenusine, norstenusine, as well as the terpenes stored in the small reservoirs. During evolution of the Steninae, the small reservoir and the corresponding secretory tissue were reduced and the terpene content of the secretion minimized. Subsequently, the alkaloid repertoire was first extended by 3-(2-methyl-1butenyl)pyridine and later by cicindeloine, whereas stenusine and norstenusine were step by step replaced by other alkaloids. 41 Literaturverzeichnis 5. Literaturverzeichnis ANDERSEN, N. M. (1976) A comparative study of locomotion on the water surface in semiaquatic bugs (Insecta, Hemiptera, Gerromorpha). Vidensk. Meddr. Dansk. Naturh. Foren 139: 337-396. ARAUJO, J. (1978) Anatomie compareé des systèmes glandulaires de défense chimique des Staphylinidae. Arch. Biol. Bruxelles 89:217-250. BENFIELD, E. F. (1972) A defensive secretion of Dineutes discolour (Coleoptera: Gyrinidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 65:1324-1327. BETZ, O. (1998) Life forms and hunting behavior of some Central European Stenus species (Coleoptera, Staphylinidae). Appl. Soil. Ecol. 9:96-74. BETZ, O. (1999) A behavioral inventory of adult Stenus species (Coleoptera: Staphylinidae). J. Nat. Hist. 33:1691-1712. BIEMONT, J. C., MAHAMADOU, C. & J. POUZAT (1992) Localization and fine structure of the female sex pheromone-producing glands in Bruchidius atrolineatus (Pic) (Coleoptera: Bruchidae). Int. J. Insect Morphol. 21:251-262. BILLARD, G. & C. BRUYANT (1905) Sur une mode particulier de locomotion de certains Stenus. C. R. Soc. Biol. 59:102-103. BLUM, M. R. (1981) Chemical defenses of arthropods. Academic Press, New York. 562 S. CARREL, J. E. & T. EISNER (1974) Cantharidin: a potent feeding deterrent to insects. Science 183:755-757. CONNERT, J. (1974) Zur Strukturaufklärung des Stenusins. Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaftlichen Gesamtfakultät der Rupprecht-KarlUniversität Heidelberg. DETTNER, K. (1983) Vergleichende Untersuchungen zur Wehrchemie und Drüsenmorphologie abdominaler Wehrdrüsen von Kurzflüglern aus dem Subtribus Philonthina (Coleoptera, Staphylinidae). Z. Naturforsch. 38c:319-328. DETTNER, K. (1985) Ecological and phylogenetic significance of defensive glands from pygidial glands of Hydradephaga (Coleoptera). Proc. Acad. Nat. Sci. Phil. 137:156-171. DETTNER, K. (1987) Chemosystematics and evolution of beetle chemical defense. Annu. Rev. Entomol. 32:17–48. DETTNER, K. (1991) Chemische Abwehrmechanismen bei Kurzflüglern (Coleoptera: Staphylinidae). Jber. naturwiss. Ver. Wuppertal 44:50-58. 42 Literaturverzeichnis DETTNER, K. (1993) Defensive secretions and exocrine glands in free-living Staphylinid beetles - their bearing on phylogeny (Coleoptera: Staphylinidae). Biochem. Syst. Ecol. 21:143-162. DETTNER, K. (1997) Interand intraspecific transfer of toxic insect compound cantharidin. In: DETTNER, K., BAUER, G. & W. VÖLKL (Hrsg.) Vertical food web interactions. Ecological Studies, Band 130. Springer, Heidelberg. DETTNER, K. (2003) Insekten als Nahrungsquelle, Abwehrmechanismen. In: DETTNER, K. & W. PETERS (Hrsg.) Lehrbuch der Entomologie. 2. Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg. S. 555-599. DETTNER, K. (2007) Gifte und Pharmaka aus Insekten - Ihre Herkunft, Wirkung und ökologische Bedeutung. Entomol. heute 19:3-28. DETTNER, K. & G. SCHWINGER (1982) Defensive secretions of three Oxytelinae rove beetles (Coleoptera: Staphylinidae). J. Chem. Ecol. 8:1411-1420. DETTNER, K., SCHWINGER, G. & P. WUNDERLE (1985) The sticky secretion from two pairs of defensive glands of rove beetle Deleaster dichrous (Grav.) (Coleoptera: Staphylinidae). Gland morphology, chemical constituents, defensive functions, and chemotaxonomy. J. Chem. Ecol. 11: 859-883. DETTNER, K. & G. SCHWINGER (1986) Volatiles from the defensive secretions of two rove beetle species (Coleoptera: Staphylinidae). Z. Naturforsch. C 41: 366-368. DETTNER, K. & F. REISSENWEBER (1991) The defensive secretion of Omaliinae and Proteininae (Coleoptera: Staphylinidae): its chemistry, biological and taxonomic significance. Biochem. Syst. Ecol. 19:291-303. DETTNER, K., SCHEUERLEIN, A., FABIAN, P., SCHULZ, S. & W. FRANCKE (1996) Chemical defense of a giant springtail Tetrodontophora bielanensis (Waga) (Insecta: Collembola). J. Chem. Ecol. 22:739 1051–1074. DRILLING, K., DETTNER, K. & K. KLASS (2010) Morphology of the pronotal compound glands in Tritoma bipustulata (Coleoptera: Erotylidae). Org. Divers. Evol. 10:205-214. EDMUNDS, M. (1974) Defence in Animals: a survey of anti-predator defences. Longman Inc., New York. 357 S. EISNER, T. (2003) For the love of insects. Belknap Press of Harvard University Press, Cambridge/London. 448 S. EISNER, T., MEINWALD, J., MONRO, A. & R. GHENT (1961) Defence mechanisms of arthropods - I. The composition and function of the spray of the whipscorpion, Mastigoproctus giganteus (Lucas) (Arachnida, Pedipalpida). J. Insect. Physiol. 6:272– 298. 43 Literaturverzeichnis EISNER, T., MCHENRY, F. & M. M. SALPETER (1964) Defense mechanisms of arthropods XV. Morphology of the quinine-producing glands of a Tenebrionid beetle (Eleodes longicollis Lec.). J. Morphol. 115:355-400. EISNER, T. & J. MEINWALD (1966) Defensive secretions of arthropods. Science 153:13511350. EISNER, T. & D. J. ANESHANSLEY (2000) Chemical defense: aquatic beetle (Dineutes hornii) vs. fish (Micropterus salmonides). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:11313-11318. EISNER, T., EISNER, M. & M. SIEGLER (2005) Secret weapons. Defenses of insects, spiders, scorpions and other many-legged creatures. Belknap Press of Harvard University Press, Cambridge/London. 372 S. FRANCKE, W. & K. DETTNER (2005) Chemical signaling in beetles. In: SCHULZ, S. (Hrsg.) Topics in current chemistry. Band 240. Springer, Heidelberg. S. 85–166. GREBENNIKOV, V. V. & A. F. NEWTON (2009) Good-bye Scydmaenidae, or why the ant-like stone beetles should become megadiverse Staphylinidae sensu latissimo (Coleoptera). Eur. J. Entomol. 106:275-301. GROSS, D. (1985) Alkaloids derived from nicotinic acid. In: MOTHES, K., SCHÜTTE, H. R. & M. LUCKNER (Hrsg.) Biochemistry of Alkaloids. VCH, Weinheim. S. 163-183. GUPTA, R. N. & I. D. SPENSER (1969) Biosynthesis of the Piperidine Nucleus. J. Biol. Chem. 244:88-94. HAPP, G. M. & T. EISNER (1961) Hemorrhage in a coccinellid beetle and its repellent effect on ants. Science 134:329-331. HAPP, G. M. & C. M. HAPP (1973). Fine structure of the pygidial glands of Bledius mandibularis (Coleoptera: Staphylinidae). Tissue Cell 5: 215-231. HAPP, G. M., STRANDBERG, J. D. & C. M. HAPP (1966) The terpene-producing glands of a phasmid insect cell morphology and histochemistry. J. Morphol. 119:143-160. HUTH, A. & K. DETTNER (1990) Defense chemicals from abdominal glands of 13 rove beetle species of subtribe Staphylinina (Coleoptera: Staphylinidae, Staphylininae). J. Chem. Ecol. 16:2691-2711. JEFSON, M., MEINWALD, J., NOWICKI, S., HICKS, K. & T. EISNER (1983) Defense Mechanisms of Arthropods 69 - Chemical defense of a rove beetle (Creophilus maxillosus). J. Chem. Ecol. 9:159-180. JENKINS, M. F. (1957) The morphology and anatomy of the pygidial glands of Dianous coerulescens Gyllenhal (Coleoptera: Staphylinidae). Proc. Roy. Entomol. Soc. Lond. 32:159-169. 44 Literaturverzeichnis KOCH, K. (1989) Die Käfer Mitteleuropas: Ökologie. Band 1. Goecke and Evers, Krefeld. S. 258-272. KOERNER, L., LAUMANN, M., BETZ, O. & M. HEETHOFF (2013). Loss of the sticky harpoon - COI sequences indicate paraphyly of Stenus with respect to Dianous (Staphylinidae, Steninae). Zool. Anz. 252:337-347. KOHLER, P. (1979) Die absolute Konfiguration des Stenusins und die Aufklärung weiterer Inhaltsstoffe des Spreitungsschwimmers Stenus comma. Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Naturwissenschaftlichen Gesamtfakultät der RupprechtKarl-Universität Heidelberg. KOVAC, D. & U. MASCHWITZ (1989) Secretion-grooming in the water bug Plea minutissima: a chemical defence against microorganisms interfering with the hydrofuge properties of the respiratory region. Ecol. Entomol. 14:403-411. KOVAC, D. & U. MASCHWITZ (1990) Secretion-grooming in aquatic beetles (Hydradephaga): a chemical protection against contamination of the hydrofuge respiratory region. Chemoecology 1:131–138. LANG, C., SEIFERT, K. & K. DETTNER (2012) Skimming behaviour and spreading potential of Stenus species and Dianous coerulescens (Coleoptera: Staphylinidae). Naturwissenschaften 99:937–947. LANE, N. J. (1982) Insect intercellular junctions: their structure and development. In: KING, R. & H. AKAI (Hrsg.) Insect ultrastructure. Band 1. Plenum Press, New York/London. S. 402-433. LEDERHAUSE, R. C. (1990) Avoiding the hunt: primary defenses of lepidopteran caterpillars. In: EVANS, D. L. & J. O. SCHMIDT (Hrsg.) Insect defenses: Adaptive mechanisms and strategies of prey and predators. State University of New York Press, New York. S. 175189. LESCHEN, R. A. B. & A. F. NEWTON (2003) Larval description, adult feeding behaviour, and phylogenetic placement of Megalopinus (Coleoptera: Staphylinidae). Coleopts. Bull. 57:469-493. LINSENMAIR, K. E. (1963) Eine bislang unbekannte Fortbewegungsart bei Insekten: Das Entspannungsschwimmen. Kosmos 59:331-334. LINSENMAIR, K. E. & R. JANDER (1963) Das Entspannungsschwimmen von Velia und Stenus. Naturwissenschaften 50:231. LOCKE, M. & P. HUIE (1979) Apolysis and the turnover of plasma membrane plaques during cuticle formation in an insect. Tissue Cell 11:277-291. 45 Literaturverzeichnis LUSEBRINK, I. (2007) Stereoisomerie, Biosynthese und biologische Wirkung des Stenusins sowie weitere Inhaltsstoffe der Pygidialdrüsen der Kurzflüglergattung Stenus (Staphylinidae, Coleoptera). Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät Biologie, Chemie und Geowissenschaften der Universität Bayreuth. LUSEBRINK, I., BURKHARDT, D., GEDIG, T., DETTNER, K., MOSANDL, A. & K. SEIFERT (2007) Intrageneric differences in the four stereoisomers of stenusine in the rove beetle genus, Stenus (Coleoptera, Staphylinidae). Naturwissenschaften 94:143–147. LUSEBRINK, I., DETTNER, K. & K. SEIFERT (2008a) Biosynthesis of stenusine. J. Nat. Prod. 71:743-745. LUSEBRINK, I., DETTNER, K. & K. SEIFERT (2008b) Stenusine, an antimicrobial agent in the rove beetle genus Stenus (Coleoptera, Staphylinidae). Naturwissenschaften 95:751-755. LUSEBRINK, I., DETTNER, K., SCHIERLING, A., MÜLLER, T., DAOLIO, C., SCHNEIDER, B., SCHMIDT, J., & K. SEIFERT (2009). New pyridine alkaloids from rove beetles of the genus Stenus (Coleoptera: Staphylinidae). Z. Naturforsch. C 64:271-278. MASCHWITZ, U. (1967) Eine neuartige Form der Abwehr von Mikroorganismen bei Insekten. Naturwissenschaften 54:649. MORGAN, E. D. (2004) Biosynthesis in insects. RSC, Cambridge. 199 S. MORI, K. (1999) Miscellaneous natural products including marine natural products, pheromones, plant hormones, and aspects of ecology. In: BARTON, D., NAKANISHI, K. & O. METH-COHN (Hrsg.) Comprehensive natural product chemistry. Band 8. Elsevier, Oxford. 749 S. MÜLLER, T. (2011) Isolierung, Strukturaufklärung und Totalsynthese von Alkaloiden aus Stenus Käfern und der Seeanemone Heteractis aurora. Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät Biologie, Chemie und Geowissenschaften der Universität Bayreuth. MÜLLER, T., GÖHL, M., LUSEBRINK, I., DETTNER, K. & K. SEIFERT (2012) Cicindeloine from Stenus cicindeloides - isolation, structure elucidation and total synthesis. Eur. J. Org. Chem. 2323-2330. NAOMI, S.-I. (1985) The phylogeny and higher classification of the Staphylinidae and their allied groups (Coleoptera, Staphylinoidae). Esakia 23:1-27. NEUMANN, S. (1993) Die Analdrüsen der Spreitungsschwimmer (Coleoptera: Staphylinidae). Chemie und biologische Bedeutung. Diplomarbeit an der Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften der Universität Bayreuth. NOIROT, C. & A. QUENNEDEY (1974) Fine structure of insect epidermal glands. Annu. Rev. Entomol. 19:61-80. 46 Literaturverzeichnis NOIROT, C. & A. QUENNEDEY (1991) Glands, gland cells, glandular units: some comments on terminology and classification. Ann. Soc. Entomol. Fr. 27:123-128. PAVAN, M. (1975) Sunto delle attualli conoscenze sulla pederina. Publ. Ist. Entomol. Univ. Pavia 1:1-35. PIFFARD, A. (1901) Steni gliding on the surface of water. Entomols. Month. Mag. 12:99. POUPON, E., KUNESCH, N. & H.-P. HUSSON (2000) An expeditious total synthesis of natural stereoisomeric mixture of stenusine following a possible biogenetic pathway. Angew. Chem. Int. Ed. 112:1553–1555. PUTHZ, V. (1971) Revision der afrikanischen Steninenfauna und Allgemeines über die Gattung Stenus Latreille (Coleoptera, Staphylinidae). Ann. Mus. Roy. Afr. Centr. 187:1376. PUTHZ, V. (1981) Was ist Dianous Leach, 1819, was ist Stenus Latreille, 1796? Oder: Die Aporie des Stenologen und ihre taxonomischen Konsequenzen (Coleoptera: Staphylinidae) 180. Beitrag zur Kenntnis der Steninen. Entomol. Abh. Mus. Tierkd. Dresd. 44: 87-132. PUTHZ, V. (2006) Revision der neotropischen Stenus (Tesnus) Arten (Coleoptera: Staphylinidae) 288. Beitrag zur Kenntnis der Steninen. Rev. Suisse Zool. 113: 617-674 (incl. persönlicher Kommentare von V. Puthz). PUTHZ, V. (2008) Stenus Latreille und die segenreiche Himmelstochter (Coleoptera, Staphylinidae). Linz. Biol. Beitr. 40:137-230. PUTHZ, V. (2010) Stenus Latreille, 1797 aus dem baltischen Bernstein nebst Bemerkungen über andere fossile Stenus-Arten (Coleoptera, Staphylinidae) 313. Beitrag zur Kenntnis der Steninen. Entomol. Bl. 106:265-287 (incl. persönlicher Kommentare von V. Puthz). PUTHZ, V. (2012) Unterfamilie Steninae. In: ASSING, V. & M. SCHÜLKE (Hrsg.) FreudeHarde-Lohse-Klausnitzer - Die Käfer Mitteleuropas. Band 4: Staphylinidae I, 2. Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg. S. 286-317. QUENNEDEY, A. (1998) Insect epidermal gland cells: ultrastructure and morphogenesis. In: HARRISON, F. W. & M. LOCKE (Hrsg.) Microscopic Anatomy of Invertebrates. Band 11A. Wiley-Liss, London. S. 177-207. ROBINSON, M. H. (1969) Defenses against visually hunting predators. Evol. Biol. 3:225-259. ROBINSON, T. (1981) The Biochemistry of Alkaloids. In: KLEINZELLER, A., SPRINGER, G. F. & H. G. WITTMANN (Hrsg.) Molecular Biology Biochemistry and Biophysics. Band 3. Springer, New York. S. 35-48. 47 The Pygidial Defense Gland System of the Steninae (Coleoptera, Staphylinidae): Morphology, Ultrastructure and Evolution. A. Schierling & K. Dettner Arthropod Structure & Development (2013) 42:197-208 Link: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1467803913000236 I 53 The Multifunctional Pygidial Gland Secretion of the Steninae (Coleoptera: Staphylinidae): Ecological Significance and Evolution. A. Schierling, K. Seifert, S. R. Sinterhauf, J. B. Rieß., J. C. Rupprecht & K. Dettner Chemoecology (2013) 23:45–57 Link: http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00049-012-0118-6 II 55 Biosynthesis of the Defensive Alkaloid (Z)-3-(2-Methyl-1butenyl)pyridine in Stenus similis Beetles. A. Schierling, M. Schott, K. Dettner & K. Seifert Journal of Natural Products (2011) 74:2231-2234 Link: http://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/np200621d III 57 Biosynthesis of the Defensive Alkaloid Cicindeloine in Stenus solutus Beetles. A. Schierling, K. Dettner, J. Schmidt & K. Seifert Naturwissenschaften (2012) 99:665-669 Link: http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00114-012-0945-x VI 59 Danksagung Mein herzlichster Dank gilt allen Personen, die zur Entstehung dieser Arbeit beigetragen oder diese überhaupt ermöglicht haben. Besonders bedanken möchte ich mich bei Prof. Dr. Konrad Dettner für die Überlassung des überaus interessanten Themas und die Unterstützung durch zahlreiche Diskussionen und fachliche Hilfen. Weiterhin sei Prof. Dr. Karlheinz Seifert vom Lehrstuhl der Organischen Chemie in Bayreuth für die hervorragende Kooperation und die große Hilfsbereitschaft bei der Lösung diverser chemischen Fragestellungen gedankt. Bedanken möchte ich mich auch bei allen Mitarbeitern des Lehrstuhls Tierökologie II, besonders bei Matthias Schott, Dr. Siegfried Kehl, Carolin Lang und Stefan Küchler für die stets hilfreichen wissenschaftlichen Diskussionen und die außerordentlich angenehme Arbeitsatmosphäre. Dr. Volker Puthz danke ich für viele wichtige Hinweise bezüglich der Steninen-Phylogenie und der Überlassung mehrerer hilfreicher Publikationen. Den Mitarbeitern des Lehrstuhls der Organischen Chemie Dr. Tobias Müller, Isabel Wittmann und Johannes Kaldun sei für die Synthese und Bereitstellung der authentischen Sekretverbindungen für Biotests und Strukturaufklärung gedankt. Den Technischen Angestellten Rita Grotjahn und Martina Heider danke ich für die Hilfe bei der Vorbereitung der Präparate zur Elektronenmikroskopie und der Bedienung der Anlagen. Größten Dank verdienen auch meine Familie und meine Freundin Martina Elsner, die mich stets bedingungslos unterstützt haben. 61